(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-19
(54)【発明の名称】ステロイド誘導体生産用遺伝子組換え生物
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20230711BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230711BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230711BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230711BHJP
C12P 33/00 20060101ALI20230711BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20230711BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20230711BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
C12P33/00
C12N15/53
C12N15/09 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022576400
(86)(22)【出願日】2021-06-08
(85)【翻訳文提出日】2023-02-02
(86)【国際出願番号】 US2021036287
(87)【国際公開番号】W WO2021252411
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】63/037,432
(32)【優先日】2020-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/162,229
(32)【優先日】2021-03-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522479991
【氏名又は名称】サンドヒル ワン，エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100103182
【弁理士】
【氏名又は名称】日野 真美
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100227008
【弁理士】
【氏名又は名称】大賀 沙央里
(72)【発明者】
【氏名】リード，ジェイ．グレゴリー
(72)【発明者】
【氏名】レッディ，ジャヤチャンドラ ピー．
(72)【発明者】
【氏名】ポール，バ－ナード ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】シェル，アースラ
(72)【発明者】
【氏名】リーマーマン，リチャード
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AH07
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
ステロール誘導体を産生するための生合成プロセス、およびステロール誘導体を産生することが可能な非天然起源生物が提供される。より具体的には、コレステロール、β－シトステロール、カンペステロールおよびそのアナログから、ＫＣＥＡ、ＫＣＤＡ、および関連化合物を産生するための遺伝子組換え非天然起源生物が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の酵素活性：好気性９，１０－ｓｅｃｏ分解活性および４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖分解活性が破壊されている、非天然起源ステロイド分解微生物。
【請求項2】
以下の酵素活性：ステロイド９－α－ヒドロキシル化活性および４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖分解活性が破壊されている、非天然起源ステロイド分解微生物。
【請求項3】
前記４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖分解活性が、２２，２３位の４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル脱水素化に対する活性を含む、請求項１または２に記載の非天然起源生物。
【請求項4】
以下のアイソザイムが破壊されていることを特徴とする非天然起源ステロイド分解微生物：ａ） オキシゲナーゼサブユニット、フェレドキシン還元酵素サブユニット、またはその組合せにおいて破壊された１つ以上の３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイム；および
ｂ） ５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用する、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム。
【請求項5】
以下の酵素活性が破壊されていることを特徴とする非天然起源ステロイド分解微生物：ａ） オキシゲナーゼサブユニット、フェレドキシン還元酵素サブユニット、またはその組合せにおいて破壊された１つ以上の３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイム；
ｂ） ５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用する１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム；および
ｃ） １つ以上の３－ケトステロイドδ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム。
【請求項6】
前記１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムが、ＦａｄＥ３４／ＣｈｓＥ３およびＣａｓＣアイソザイム、ならびにその組合せからなる群から選択される、請求項４または５に記載の非天然起源微生物。
【請求項7】
ロドコッカス（Rhodococcus）属に由来する、請求項１～６のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項8】
ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１に由来する、請求項１～７のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項9】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ １４４４またはＤＳＭ １４４５に由来する、請求項１～８のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項10】
ａ） ＲＨＡ１＿ＲＳ２１８４５、ｂ） ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３９５、
ｃ） ＲＨＡ１＿ＲＳ２２１２０、
ｄ） ＲＨＡ１＿ＲＳ１２１７５、
ｅ） ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３７０、
ｆ） ＲＨＡ１＿ＲＳ４００９０、
ｇ） またはその組合せ
において破壊された発現配列を有する、請求項７、８、または９に記載の非天然起源微生物。
【請求項11】
ａ） ＲＨＡ１＿ＲＳ２２０９０、ｂ） ＲＨＡ１＿ＲＳ１２１４０、
ｃ） ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３０５、
ｄ） ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３８０、
ｅ） ＲＨＡ１＿ＲＳ４０１８０、
ｆ） ＲＨＡ１＿ＲＳ４０２６０、
ｇ） またはその組合せ
において破壊された発現配列を有する、請求項７、８、または９に記載の非天然起源微生物。
【請求項12】
マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に由来する請求項１～６のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項13】
ＫｓｔＤ酵素活性が破壊されている、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に由来する、請求項１～６のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項14】
Ｋｓｈ酵素活性が破壊されている、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に由来する、請求項１～６のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項15】
ＫｓｔＤおよびＫｓｈの酵素活性が破壊されている、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属に由来する、請求項１～６のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項16】
前記１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムが、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイム、ならびにその組合せからなる群から選択される、請求項１～６または１２～１５のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項17】
前記１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムが、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムを含む、請求項１～６または１２～１５のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項18】
スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５に由来する、請求項１～６または１２～１７のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項19】
ａ） ＭＳＭＥＧ＿６０４１、ｂ） ＭＳＭＥＧ＿０６０３、
ｃ） ＭＳＭＥＧ＿６０３９、
ｄ） ＭＳＭＥＧ＿５９４１、
ｅ）またはその組合せ
において破壊された発現配列を有する、請求項１８に記載の非天然起源微生物。
【請求項20】
ａ） ＭＳＭＥＧ＿６０４１、ｂ） ＭＳＭＥＧ＿０６０３、
ｃ） ＭＳＭＥＧ＿６０３９、および
ｄ） ＭＳＭＥＧ＿５９４１
において破壊された発現配列を有する請求項１８に記載の非天然起源微生物。
【請求項21】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）属に由来する請求項１～６または１２～１７のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項22】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５属に由来する請求項１～６または１２～１７のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項23】
ａ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４２５０；ｂ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ０３６５５；
ｃ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２５；
ｄ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２０；または
ｅ）その組合せ
において破壊された発現配列を有する、請求項２１または２２のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項24】
ａ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４２５０；ｂ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ０３６５５；
ｃ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２５；および
ｄ） ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２０
において破壊された発現配列を有する、請求項２１または２２のいずれかに記載の非天然起源微生物。
【請求項25】
相同組換え、変異誘発、またはその組合せによって活性が破壊されている、請求項１～２４のいずれかに記載の生物。
【請求項26】
請求項１～２５のいずれかに記載の非天然起源微生物を１つ以上の植物ステロールの存在下で増殖させ、ＫＣＥＡおよび／またはＫＣＤＡを産生することを含む、ステロイドの作製方法。
【請求項27】
請求項１～２５のいずれかに記載の非天然起源微生物をβ－シトステロール、カンペステロール、コレステロール、またはその混合物の存在下で増殖させ、ＫＣＥＡおよび／またはＫＣＤＡを産生することを含む、ステロイドの作製方法。
【請求項28】
請求項１～２５のいずれかに記載の非天然起源微生物をβ－シトステロール、カンペステロール、コレステロール、またはその混合物の存在下で増殖させ、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％を超える収率でＫＣＥＡおよび／またはＫＣＤＡを産生することを含む、ステロイドの作製方法。
【請求項29】
前記増殖がシクロデキストリンの存在下で生じる、請求項２６～２８のいずれかに記載の方法。
【請求項30】
前記ＫＣＥＡまたはＫＣＤＡをＵＤＣＡに変換することをさらに含む、請求項２６～２９のいずれかに記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ステロール誘導体を産生するための生合成プロセス、およびステロール誘導体を産生することができる非天然起源の生物に関する。より具体的には、本発明は、コレステロール、β－シトステロールおよび関連化合物から、ＫＣＥＡ、ＫＣＤＡおよび関連化合物を産生するための遺伝子組換え非天然起源の生物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ステロイドは、以下の化学構造：
【0003】
【化1】
【0004】
ゴナンコアは、１つ以上のエチレン性不飽和度を有することができ；１つ以上の有機官能基部分によって改変することができ；そして、いくつかの異なる光学的配向で存在し得る。したがってステロイドスーパーファミリーは、ステロール（例えば、コレステロール、β－シトステロール、エルゴステロール）；胆汁酸；コルチコイド；心臓アグリコン；ホルモン；ビタミンＤ；および昆虫脱皮ホルモン等の様々な構造を含む。
【0005】
ステロイドは、動物界および植物界の生体内で多機能を果たしており、ステロイドの構造改変は生物活性に大きな影響を与える。ステロイドのシクロアルカン環ならびに側鎖のヒドロキシル基の位置およびそれらが結合している炭素の周囲の立体化学は非常に重要である。例えば、１１β位および１７α位にヒドロキシル官能基が存在することは抗炎症活性に必須であり（例えば、コルチゾール、プレドニゾロン）、１４β－ヒドロキシル基は典型的には心臓活性ステロイドに見られ、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）およびエピアンドロステロン（ＥｐｉＡ）の７－ヒドロキシル化誘導体は神経保護効果があり、１α－および２５α－ヒドロキシル官能基はビタミンＤ３活性に重要である。
【0006】
近年、代謝工学によって、新しいステロイド産生株の生産が可能になった。Fernandez-Cabezon et alの概説（Frontiers in Microbiology, Volume 9, Article 958）（May, 2018）で報告されているように、例えばGalanら（Microb. Biotechnol. 10, 138-150）（2017）はＡＤＤ（「１，４－アンドロスタジエン－３，１７－ジオン）およびＡＤ（「４－アンドロステン－３，１７－ジオン」）ステロール誘導体を産生するようにスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）の変異体株を産生した。Yao et al（Metab. Eng. 24, 181-191）（2014）は、９ＯＨ－ＡＤおよびＣ－２２ステロール誘導体を産生するようにマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）の複数の遺伝子欠失変異体を開発した。Wei et al(Appl. Environ. Microbiol. 76, 4578-4582)(2010)は、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮｗｌＢ－０１のＫｓｔＤ遺伝子を欠失させることによってＡＤ産生変異体を設計した。他の著者らは、ロドコッカス（Rhodococcus）属の種でステロールからステロイド中間体を産生する変異株の構築を試みている。しかし、複数のステロイド異化経路の存在および特定のアイソザイム（例えば、ＫｓｔＤ、ＫｓｈＡ、およびＫｓｈＢ）の基礎レベルの存在により、これらの種における安定な産生体の開発が妨げられている。
【0007】
必要なのは、重要な酵素の活性をノックアウトした、分解経路の特定の接合部でステロイド無機化を停止させ、それによって商業的に有用なステロイドおよびステロイド中間体を不要な副産物を最小限に抑えながら高収率で産生することが可能な新しい遺伝子組換え微生物である。
【0008】
特に必要とされているのは、コレステロール、β－シトステロール、カンペステロール、および少なくとも５個の炭素の長さのアルキル側鎖を有する他の同様のステロールから、ＫＣＥＡ、ＫＣＤＡ、および同様の化合物を産生することができる、重要な酵素の選択的活性がノックアウト、無効化、または他の方法で破壊された遺伝子組換え生物である。
【発明の概要】
【0009】
本発明者らは、β－シトステロール、コレステロール、およびカンペステロール等の市販のステロールから、ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡならびに関連ステロールを高収率で産生する予想外の能力を有するいくつかの遺伝子組換え生物を発見した。この生物は、好ましくは、相同組換えまたは誘導変異誘発によって、ネイティブな生物の染色体にコードされている必須の酵素活性が破壊されている。生物の９，１０－ｓｅｃｏ分解経路、特に９－α－ヒドロキシル化活性を破壊することによって、および４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイルＣｏＡ側鎖を、特に２２，２３位で分解する生物の能力を破壊することによって、ＫＣＤＡおよびＫＣＥＡ等の貴重なステロール誘導体が驚くほど高い収率で産生され得る。さらに３－ケトステロイドδ－１デヒドロゲナーゼ活性を破壊することによって、ＫＣＤＡに優先してＫＣＥＡを産生することができる。
【0010】
したがって、第１の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性：好気性９，１０－ｓｅｃｏ分解活性および４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖分解活性が破壊されている非天然起源のステロイド分解微生物を提供する。
【0011】
第２の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性：ステロイド９－α－ヒドロキシル化活性および４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖分解活性が破壊されている非天然起源のステロイド分解微生物を提供する。
【0012】
第３の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性が破壊されていることを特徴とする非天然起源のステロイド分解微生物を提供する：（ａ）１つ以上の３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイムが、オキシゲナーゼサブユニット、フェレドキシン還元酵素サブユニットまたはその組合せにおいて破壊されていること；および（ｂ）５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用する１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム。
【0013】
第４の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性が破壊されていることを特徴とする非天然起源のステロイド分解微生物を提供する：（ａ）１つ以上の３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイムがオキシゲナーゼサブユニット、フェレドキシン還元酵素サブユニット、またはその組合せにおいて破壊されていること；（ｂ）５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用する１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム；および（ｃ）１つ以上の３－ケトステロイドδ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム。
【0014】
本発明のさらなる利点は、一部は以下の説明に記載され、一部は説明から明らかであるか、または本発明の実施により学習することができる。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲に特に指摘された要素および組合せによって実現および達成されるであろう。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的および説明的なものであるに過ぎず、請求項に記載の本発明を限定するものではないことは理解されるべきである。
【0015】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を示し、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つものである。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】実施例１に記載されたロドコッカス（Rhodococcus）株ＳＡＮＤ００１～ＳＡＮＤ００６を作製する遺伝子ノックアウトの順序、および植物ステロールまたはコレステロールで増殖させた場合のこれらの株の産物を示すフローチャート図である。
【図2】実施例２に記載されたロドコッカス（Rhodococcus）株ＳＡＮＤ００７～ＳＡＮＤ０１２を作製する遺伝子ノックアウトの順序、および植物ステロールまたはコレステロールで増殖させた場合のこれらの株の産物を示すフローチャート図である。
【図3】実施例４および実施例５に記載されたロドコッカス（Rhodococcus）株ＳＡＮＤ０１３～ＳＡＮＤ０１５をもたらす遺伝子ノックアウトの順序、および植物ステロールまたはコレステロールで増殖させた場合のこれらの株の産物を示すフローチャート図である。
【図4】実施例７および実施例８に記載されたマイコバクテリウム（Mycobacterium）株ＳＡＮＤ０１６～ＳＡＮＤ０１９を作製する遺伝子ノックアウトの順序、および植物ステロールまたはコレステロールで増殖させた場合のこれらの株の産物を示すフローチャート図である。
【図5】実施例１４に記載された実験から得られたＨＰＬＣ／ＭＳトレースのグラフ描写である。Ａ：抽出ブロスサンプルのＵＶトレース、Ｂ：抽出ブロスサンプルのｍ／ｚ３７３．５５（ＫＣＥＡ）の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）、Ｃ：ＫＣＥＡ標準のＵＶトレース、ＫＣＥＡ標準のＴＩＣである。
【図6】実施例で報告された抽出ブロスサンプル（Ａ）およびＫＣＥＡ標準（Ｂ）のＫＣＥＡピークのＭＳスペクトル比較である。
【図7】実施例２１に記載されるように植物ステロール混合物を供給したマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９の解析である。Ａ）単離ＫＣＥＡ標準（上）および全ブロス抽出物（下）のＬＣＭＳトレース（２４６ｎｍにおけるＵＶ）、Ｂ）単離ＫＣＥＡ標準（上）および全ブロス抽出物（下）のＭＳスペクトルである。
【図8】実施例２３に記載されるようにコレステロールを供給したマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０３０の解析である。Ａ）単離ＫＣＥＡ標準（上）および全ブロス抽出物（下）のＬＣＭＳトレース（２４６ｎｍにおけるＵＶ）、Ｂ）単離ＫＣＥＡ標準（上）および全ブロス抽出物（下）のＭＳスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【0017】
用語の定義および使用
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に指示されない限り、複数形の参照語を含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのこの単語の変形は、「含むが限定されない」ことを意味し、例えば、他の添加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図していない。ある要素が複数の構成要素、ステップまたは条件を含むものと記載される場合、この要素は、そのような複数の任意の組合せを含む、または複数の構成要素、ステップまたは条件またはそれらの組合せから「なる」または「本質的になる」ことも記載できると理解されるであろう。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明確に指示されない限り、複数形の参照語を含む。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのこの単語の変形は、「含むが限定されない」ことを意味し、例えば、他の添加物、構成要素、整数またはステップを除外することを意図していない。ある要素が複数の構成要素、ステップまたは条件を含むものと記載される場合、この要素は、そのような複数の任意の組合せを含む、または複数の構成要素、ステップまたは条件またはそれらの組合せから「なる」または「本質的になる」ことも記載できると理解されるであろう。
【0018】
アルキルは、１つ以上のアシル、ヒドロキシ、またはカルボン酸によって任意に置換された、１～２０個の炭素を有する飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。好ましくは、アルキルは単に１～２０個の炭素を有する飽和直鎖または分岐炭化水素を指す。
【0019】
アイソザイム（ｉｓｏｚｙｍｅまたはｉｓｏｅｎｚｙｍｅ）は、アミノ酸配列が異なるが、同じ化学反応を触媒する酵素である。同じ活性を持つアイソザイムは、同じ微生物種内に存在することもあれば、異なる微生物種にまたがって存在することもある。
【0020】
生物の「ネイティブな状態」は、本発明の方法にしたがって、好ましくは組換え技術または変異誘発技術によって改変する前の、生物の天然起源の状態を指す。したがって、例えば、本明細書において、「前記活性は、そのネイティブな状態の前記生物の染色体にコードされている」と記載されている場合、これは、「前記活性は、誘導された改変前の染色体にコードされている」ことを意味する。
【0021】
ＦａｄＥ３４（すなわちＣｈｓＥ３）はコレステロール分解に関与する５－炭素ＡＣＡＤを、ＣａｓＣはコール酸分解に関与するホモログＡＣＡＤを表す。ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）は全てＦａｄＥ３４およびＣａｓＣの両方をコードしている。
【0022】
考察
本発明の概要で述べたように、本発明者らは、ステロイド分子を分解する能力を有する生物に由来する突変異微生物であって、ステロイド分解を重要な酵素的ステップで停止させ、それによって、不要な副産物をほとんどまたは全く産生することなく、所望のステロイド誘導体を高収率で産生できる突然変異微生物を発見した。
本発明の概要で述べたように、本発明者らは、ステロイド分子を分解する能力を有する生物に由来する突変異微生物であって、ステロイド分解を重要な酵素的ステップで停止させ、それによって、不要な副産物をほとんどまたは全く産生することなく、所望のステロイド誘導体を高収率で産生できる突然変異微生物を発見した。
【0023】
したがって、第１の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性：好気性９，１０－ｓｅｃｏ分解活性および４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖分解活性が破壊されている非天然起源のステロイド分解微生物を提供する。
【0024】
第２の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性：ステロイド９－α－ヒドロキシル化活性および４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖分解活性が破壊されている非天然起源ステロイド分解微生物を提供する。
【0025】
第３の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性が破壊されていることを特徴とする非天然起源のステロイド分解微生物を提供する：（ａ）１つ以上の３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイムが、オキシゲナーゼサブユニット、フェレドキシン還元酵素サブユニットまたはその組合せにおいて破壊されていること；および（ｂ）５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用する１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム。
【0026】
第４の主要な実施形態において、本発明は、以下の酵素活性が破壊されていることを特徴とする非天然起源のステロイド分解微生物を提供する：（ａ）１つ以上の３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイムがオキシゲナーゼサブユニット、フェレドキシン還元酵素サブユニット、またはその組合せにおいて破壊されていること；（ｂ）５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用する１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム；および（ｃ）１つ以上の３－ケトステロイドδ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム。
【0027】
遺伝子組換え生物において破壊されるべき正確な酵素活性は、３つの別個の要素：（ｉ）所望の最終産物、（ｉｉ）最終産物の産生のための出発物質、および（ｉｉｉ）遺伝子組換え生物のネイティブな酵素活性の関数である。本発明者らは、これら３つの要素に関する知見をもとに、微生物の増殖、およびその微生物からの所望の最終産物の採取および精製に関する公知の工業的技術を利用して、ステロイド分解産物を高収率で産生することができる遺伝子組換え生物を合理的に設計した。例えば、ロドコッカス（Rhodococcus）属またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属に由来する微生物を、コレステロール、β－シトステロール、またはカンペステロール等のステロール上で適切な増殖環境で増殖させることにより、ＫＣＥＡまたはＫＣＤＡ、またはＫＣＥＡとＫＣＤＡの組合せを２０％、３５％、または５０％さえをも超える変換収率で得ることが可能である。
【0028】
本発明の最終産物
本発明のプロセスの最終産物は、広義には、以下を含むステロイドと定義することができる：
ａ）インタクトなゴナンコア；
ｂ）Ａ環の３位におけるケトン；および
ｃ）ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡのような、Ｄ環の１７位における４－イル－ペンタン酸。
本発明のプロセスの最終産物は、広義には、以下を含むステロイドと定義することができる：
ａ）インタクトなゴナンコア；
ｂ）Ａ環の３位におけるケトン；および
ｃ）ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡのような、Ｄ環の１７位における４－イル－ペンタン酸。
【0029】
議論を容易にするために、このジャンルの最終産物を、本明細書において、４－（３－ケトステロイド－１７－イル）ペンタン酸と称する。
【0030】
より特定の実施形態において、４－（３－ケトステロイド－１７－イル）ペンタン酸は、ゴナンコアに対する以下の改変の１つまたは組合せによって特徴付けることができる：
ａ）ゴナンコア上の１０炭素におけるメチル置換；
ｂ）ゴナンコア上の１３炭素におけるメチル置換；および／または
ｃ）Ａ環上の１または２度のエチレン性不飽和。
ａ）ゴナンコア上の１０炭素におけるメチル置換；
ｂ）ゴナンコア上の１３炭素におけるメチル置換；および／または
ｃ）Ａ環上の１または２度のエチレン性不飽和。
【0031】
なおさらなる実施形態において、４－（３－ケトステロイド－１７－イル）ペンタン酸は、４－イル－ペンタン酸側鎖における（ｒ）立体化学によって特徴付けることができ、これはステロール出発物質におけるものと同じとなる。なおさらなる実施形態において、４－（３－ケトステロイド－１７－イル）ペンタン酸は、１７位および２０位における（ｒ）立体化学によって特徴付けられる。
【0032】
特に好ましい最終産物は、以下の化学構造：
【0033】
【化2】
【0034】
本発明における出発物質
本発明で使用するための出発物質は、広義には、以下を含む任意のステロイドとして定義することができる：
ａ）インタクトなゴナンコア；
ｂ）Ａ環の３位におけるヒドロキシ；および
ｃ）６～２０の炭素原子を含むＤ環の１７位のアルカン－２－イル。
本発明で使用するための出発物質は、広義には、以下を含む任意のステロイドとして定義することができる：
ａ）インタクトなゴナンコア；
ｂ）Ａ環の３位におけるヒドロキシ；および
ｃ）６～２０の炭素原子を含むＤ環の１７位のアルカン－２－イル。
【0035】
議論を容易にするために、このジャンルの出発物質を、本明細書において、３－ヒドロキシ、１７－（アルカン（６～２０）－２－イル）ステロイドと称する。
【0036】
より特定の実施形態において、３－ヒドロキシ、１７－（アルカン（６～２０）－２－イル）ステロイドは：
ａ） ゴナンコア上の１０炭素におけるメチル置換；
ｂ） ゴナンコア上の１３炭素におけるメチル置換；および
ｃ） Ｂ環の５－６結合における１度のエチレン性不飽和
を特徴とするであろう。
ａ） ゴナンコア上の１０炭素におけるメチル置換；
ｂ） ゴナンコア上の１３炭素におけるメチル置換；および
ｃ） Ｂ環の５－６結合における１度のエチレン性不飽和
を特徴とするであろう。
【0037】
他のより特定の実施形態において、Ｄ環の１７位のアルカン－２－イルは、６～１５個の炭素原子、７～１２個の炭素原子、または８～１０個の炭素原子を含む。好ましい実施形態において、Ｄ環の１７位のアルカン－２－イルは、コレステロールを特徴付ける８炭素側鎖、カンペステロールを特徴付ける９炭素側鎖、またはβ－シトステロールを特徴付ける１０炭素側鎖を含む。特に好ましい出発物質としては、以下の化学構造：
【0038】
【化3】
【0039】
ステロイド分解微生物
ステロイドを分解できるほとんどのネイティブな生物における前述の出発物質の完全な無機化は、典型的には、様々な活性を有する複数の酵素、および同じ生物内の共通の酵素活性を持つことが多い複数のアイソザイムに依存する。これらの酵素は一般的に、（１）Ａ環分解に関与するもの、（２）側鎖分解に関与するもの、（３）ＡＢ環分解に関与するもの、および（４）ＣＤ環分解に関与するものの４つの別個のカテゴリーに分類することができる。様々な微生物分類群の代表的な酵素活性としては、放線菌の以下の酵素およびそのアイソザイムが挙げられる（括弧内は例示種の略称と共に示す）。
ステロイドを分解できるほとんどのネイティブな生物における前述の出発物質の完全な無機化は、典型的には、様々な活性を有する複数の酵素、および同じ生物内の共通の酵素活性を持つことが多い複数のアイソザイムに依存する。これらの酵素は一般的に、（１）Ａ環分解に関与するもの、（２）側鎖分解に関与するもの、（３）ＡＢ環分解に関与するもの、および（４）ＣＤ環分解に関与するものの４つの別個のカテゴリーに分類することができる。様々な微生物分類群の代表的な酵素活性としては、放線菌の以下の酵素およびそのアイソザイムが挙げられる（括弧内は例示種の略称と共に示す）。
【0040】
Ａ環分解酵素
－ コレステロールオキシダーゼアイソザイム（ＣｈＯｘ）；
－ ３－ケトステロイド－δ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム（「ＫｓｔＤ」）；
側鎖分解酵素
－ ５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（「ＡＣＡＤ」）アイソザイム（ＦａｄＥ３４／ＣｈｓＥ３またはＣａｓＣ）；
－ ５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステル以外のステロイドＣｏＡエステルに作用するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）アイソザイム；
ＡＢ環分解酵素
－ オキシゲナーゼ活性（「ＫｓｈＡ」）およびフェレドキシン還元酵素活性（「ＫｓｈＢ」）を担うサブユニットを含む３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイム；
ＣＤ環分解酵素
－ ３－ヒドロキシ－９，１０－セコナンドロスト－１，３，５（１０）－トリエン－９，１７－ジオン－４－ヒドロキシラーゼ（オキシゲナーゼ）（「ＨｓａＡ」）アイソザイム；
－ ３，４－ジヒドロキシ－９，１０－セコアンドロスタ－１，３，５（１０）－トリエン－９，１７－ジオン－４，５－ジオキシゲナーゼ（「ＨｓａＣ」）アイソザイム；
－ ４，５－９，１０－ジセコ－３－ヒドロキシ－５，９，１７－トリオキソアンドロスタ－１（１０），２－ジエン－４－オエートヒドロラーゼ（「ＨｓａＤ」）アイソザイム；
－ ２－ヒドロキシヘキサ－２，４－ジエノエートヒドラターゼ（「ＨｓａＥ」）アイソザイム；
－ ４－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートアルドラーゼ（「ＨｓａＦ」）アイソザイム；および
－ プロパノールデヒドロゲナーゼ（「ＨｓａＧ」）アイソザイム。
－ コレステロールオキシダーゼアイソザイム（ＣｈＯｘ）；
－ ３－ケトステロイド－δ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム（「ＫｓｔＤ」）；
側鎖分解酵素
－ ５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（「ＡＣＡＤ」）アイソザイム（ＦａｄＥ３４／ＣｈｓＥ３またはＣａｓＣ）；
－ ５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステル以外のステロイドＣｏＡエステルに作用するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＡＣＡＤ）アイソザイム；
ＡＢ環分解酵素
－ オキシゲナーゼ活性（「ＫｓｈＡ」）およびフェレドキシン還元酵素活性（「ＫｓｈＢ」）を担うサブユニットを含む３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼアイソザイム；
ＣＤ環分解酵素
－ ３－ヒドロキシ－９，１０－セコナンドロスト－１，３，５（１０）－トリエン－９，１７－ジオン－４－ヒドロキシラーゼ（オキシゲナーゼ）（「ＨｓａＡ」）アイソザイム；
－ ３，４－ジヒドロキシ－９，１０－セコアンドロスタ－１，３，５（１０）－トリエン－９，１７－ジオン－４，５－ジオキシゲナーゼ（「ＨｓａＣ」）アイソザイム；
－ ４，５－９，１０－ジセコ－３－ヒドロキシ－５，９，１７－トリオキソアンドロスタ－１（１０），２－ジエン－４－オエートヒドロラーゼ（「ＨｓａＤ」）アイソザイム；
－ ２－ヒドロキシヘキサ－２，４－ジエノエートヒドラターゼ（「ＨｓａＥ」）アイソザイム；
－ ４－ヒドロキシ－２－オキソヘキサノエートアルドラーゼ（「ＨｓａＦ」）アイソザイム；および
－ プロパノールデヒドロゲナーゼ（「ＨｓａＧ」）アイソザイム。
【0041】
本発明の目的のために、本明細書に記載の「必須破壊酵素」および本明細書に記載の「必須維持酵素」をそのネイティブな状態で含む任意のステロイド分解微生物は、本発明の方法の実施に適しているであろう。必須破壊酵素は、本発明の方法を実施するためにその活性を破壊する必要がある、本発明のネイティブな生物に存在するステロイド分解酵素である。
【0042】
したがって、必須破壊酵素としては、５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム（例えば、ＦａｄＥ３４／ＣｈｓＥ３またはＣａｓＣ）が含まれる。特に好ましい実施形態において、生物は、４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖の分解を担う酵素活性が破壊されている。４－（ステロイド－１７－イル）ペンタノイル側鎖は、ＣｏＡエステル、カルボン酸、またはアルコールとして生物に蓄積することができ、その分解を担うアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（「ＡＣＡＤ」）アイソザイムが破壊されている限り、側鎖の正確な構造は本発明に重要ではないことは理解されるであろう。
【0043】
破壊しておくべき他の必須酵素活性は、２構成要素３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼ（「Ｋｓｈ」）酵素系に関連する酵素活性である。Ｋｓｈ酵素系は、オキシゲナーゼ（「ＫｓｈＡ」）活性およびフェレドキシン還元酵素（「ＫｓｈＢ」）活性を含み、本発明は、いずれかの活性または両方、ならびにかかる活性を担う１つ以上のアイソザイムを破壊することにより実施し得る。言い換えれば、本発明はＫｓｈ酵素系の３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼ、オキシゲナーゼサブユニット、および／または３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼ、フェレドキシン還元酵素サブユニットを破壊することによって実施し得る。
【0044】
上記２つの活性が破壊された生物は、適切なステロイド出発物質からＫＣＥＡおよびＫＣＤＡを産生することができる。Ａ環のＣ１～２位の二重結合が望ましくない実施形態においては、第３のクラスとして３－ケトステロイド－δ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム（「ＫｓｔＤ」）活性を破壊することも必須である。したがって、ＫｓｔＤ活性も破壊することによって、ＫＣＤＡに優先してＫＣＥＡを産生することが可能である。
【0045】
本発明のネイティブな生物は、上述の各活性を担う１つ以上のアイソザイムを含み得ること、およびネイティブな微生物に存在するアイソザイムの１つまたは任意の組合せの活性を、本発明の実施において破壊し得ることは理解されるであろう。また、本発明にしたがって破壊される活性は、ネイティブな生物の染色体にコードされていることも理解されるであろう。したがって、本発明の好ましい生物は、相同組換えまたは誘導変異誘発による関連活性の遺伝的ノックアウトによって改変される。
【0046】
本発明を実施するための好ましい生物はただ１つの染色体を有するが、他の適切な生物は複数の染色体を含むことに留意すべきである。「染色体」という用語は、生物を複数の染色体を有する生物に限定することを意味するものではなく、単に、明確に反対のことを述べない限り、単一および複数の染色体を有する生物が本発明によって意図されるという事実を指す。
【0047】
必須維持酵素は、本発明の方法を実施するためにその活性が維持されなければならない、本発明のネイティブな生物に存在するステロイド分解酵素である。本発明の目的のために、必須維持酵素は、５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステル以外のステロイドＣｏＡエステルに作用する１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（「ＡＣＡＤ」）アイソザイム、例えば、天然起源のＣ８～Ｃ１０側鎖を、側鎖の末端２４位でＣｏＡエステルまたはカルボン酸を有するＣ５側鎖に変換するために必要な酵素およびアイソザイムを含む。繰り返しになるが、生物が側鎖のＣｏＡエステル、カルボン酸、またはアルコールを蓄積しているかどうかは重要ではない。
【0048】
他の必須維持酵素としては、３－β－ヒドロキシ－５－エンステロイドを３－ケト－４－エンステロイドに変換することができる酵素が挙げられる。
【0049】
本発明の方法を実施するのに有用な変異体ステロイド分解微生物は、本明細書に定義される必須破壊酵素および必須維持酵素を有するネイティブな生物に由来し、ここで、必須破壊酵素の活性は、相同組換えまたは誘導変異誘発によるように、除去、破壊または分解されている。
【0050】
したがって、一実施形態において、本発明を実施するための変異体生物は、以下のアイソザイム：
５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム（例えばＦａｄＥ３４／ＣｈｓＥ３またはＣａｓＣ；３－ケトステロイド－９－αヒドロキシラーゼ、オキシゲナーゼサブユニット、および／または３－ケトステロイド－９－αヒドロキシラーゼ、フェレドキシン還元酵素サブユニットで破壊された活性を有するＫｓｈ酵素系のアイソザイム；および任意に３－ケトステロイド－δ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム（「ＫｓｔＤ」）によって；５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用しない１つ以上のインタクトなアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（「ＡＣＡＤ」）アイソザイムおよび３－β－ヒドロキシ－５－エンステロイドを３－ケト－４－エンステロイドに変換できる１つ以上の酵素（複数可）と組み合わせて活性が損なわれているかまたは分解されている生物を指す。
５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用するアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイム（例えばＦａｄＥ３４／ＣｈｓＥ３またはＣａｓＣ；３－ケトステロイド－９－αヒドロキシラーゼ、オキシゲナーゼサブユニット、および／または３－ケトステロイド－９－αヒドロキシラーゼ、フェレドキシン還元酵素サブユニットで破壊された活性を有するＫｓｈ酵素系のアイソザイム；および任意に３－ケトステロイド－δ－１デヒドロゲナーゼアイソザイム（「ＫｓｔＤ」）によって；５炭素側鎖を有するステロイドＣｏＡエステルに作用しない１つ以上のインタクトなアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（「ＡＣＡＤ」）アイソザイムおよび３－β－ヒドロキシ－５－エンステロイドを３－ケト－４－エンステロイドに変換できる１つ以上の酵素（複数可）と組み合わせて活性が損なわれているかまたは分解されている生物を指す。
【0051】
好ましい生物としては、Bergstrand et al.（mBio Volume 7 Issue 2 e00166-16）（American Society of Microbiology）（2016）により全て記載された、アクチノバクテリア属（Actinobacteria spp.）、ならびにα－、β－およびγプロテオバクテリアを含む。アクチノバクテリア（Ａctinobacteria）は、好ましくは、コリネバクテリウム（Corynebacterineae）亜目の属（アミコリシコッカス（Amycolicicoccus）、ディエツィア（Dietzia）、ゴルドニア（Gordonia）、マイコバクテリウム（Mycobacterium）、ノカルジア（Nocardia）、ロドコッカス（Rhodococcus）、およびツカムレラ（Tsukamurella））、ならびにアクチノプラネス（Actinoplanes）属、アエロミクロビウム（Aeromicrobium）属、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属、アルスロバクター（Arthrobacter）属、ノカルジオイデス（Nocardioides）属、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）属、サリニスポラ（Salinispora）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属およびサーモモノスポラ（Thermomonospora）属を含む。プロテオバクテリア（Proteobacteria）生物は、好ましくは、バークホルデリア（Burkholderia）属、コマモナス（Comamonas）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、グラシエコラ（Glaciecola）属、ヒドロカーボニファーガ（Hydrocarboniphaga）属、マリノバクテリウム（Marinobacterium）属、ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）属、シュードアルテロモナス（Pseudoalteromonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュワネラ（Shewanella）属およびスフィンゴモナス（Sphingomonas）属内の個々の種を含む。
【0052】
本発明を実施するための例示的な生物は、ロドコッカス（Rhodococcus）またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属の微生物、例えばロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ １４４４またはＤＳＭ １４４５、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５を含む。マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５は、ＫｓｔＤ、Ｋｓｈ等のいくつかのアイソザイムをコードする遺伝子クラスター（スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）に記載のいわゆるＣ－１９＋クラスター）を欠く他のマイコバクテリウム（Mycobacterium）株と共に好ましい（スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）酵素名：ＫｓｔＤ２、ＫｓｔＤ３、ＫｓｈＡ２、ＫｓｈＢ２、ＨｓａＡ２、ＨｓａＣ２およびＨｓａＤ２。Fernandez-Cabezon et al（Environ Microbiol. 2018 May;20(5):1815-1827）を参照されたい。マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５の遺伝子は、相同組換えによって破壊されたのではなく；その活性は誘導変異誘発およびＡＤ産生改善のための選択によって破壊された。Fernandez-Cabezon et al. (Front. Microbiol., 15 May 2018 https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00958)およびLorraine and Smith（Methods Mol Biol. 2017;1645:93-108. doi: 10.1007/978-1-4939-7183-1_7）を参照されたい。
【0053】
酵素活性の破壊
標的とするアイソザイムの発現を変化させるために、任意の公知の遺伝子技術を用いることができるが、好ましい方法は、プラスミド、バクテリオファージ（ファージλ等）、コスミド、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）等のクローニングベクターを挿入し、これがその後複製されて宿主生物の染色体遺伝子機構に不可欠となることを含む。
標的とするアイソザイムの発現を変化させるために、任意の公知の遺伝子技術を用いることができるが、好ましい方法は、プラスミド、バクテリオファージ（ファージλ等）、コスミド、または細菌人工染色体（ＢＡＣ）等のクローニングベクターを挿入し、これがその後複製されて宿主生物の染色体遺伝子機構に不可欠となることを含む。
【0054】
相同組換えまたは誘導突然変異誘発による株操作に好ましいプラスミドは、一般的な大腸菌（Escherichia coli）クローニングベクターをベースとしている。プラスミドの生物への侵入は、一般的に、形質転換（例えば、化学的または電気穿孔法）またはコンジュゲーションによって促進されるであろう。適切なプラスミドは、周知のバイオテクノロジー技術を使用して設計および構築することができ、これは一般的に、プラスミドへのまたはプラスミドからのＤＮＡ断片の挿入または除去を伴う。最も早期から一般的に使用されているクローニングベクターの１つはｐＢＲ３２２プラスミドである。他のクローニングベクターとしてはｐＵＣシリーズのプラスミドが挙げられるが、現在では多数の異なるクローニングプラスミドベクターが利用可能である。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは、広範囲のグラム－およびグラム＋細菌へ動員することを可能にする例示的なクローニングベクターである。
【0055】
好ましい方法は、相同組換えによる遺伝子欠失の導入を伴う。この方法では、欠失させる領域の近傍配列を含むＤＮＡ断片を所望の株に移入し、２回の組換え事象またはクロスオーバー事象によって所望の株の染色体に組み込むか、または関連株に存在する遺伝子の配列を、欠失を有する遺伝子に交換するか、または完全に欠失させる。この方法において、ＤＮＡ断片は、典型的にはベクター、特にプラスミド中に存在し、好ましくは欠失を提供されるべき株中で複製されない。一般的に、エシェリヒア（Escherichia）属の細菌、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）種の細菌を、ベクターが複製され得る補助宿主または中間宿主として使用することができる。
【0056】
このようなプラスミドベクターの例は、例えば、Schafer et al.（Gene 145, 69-73 (1994)）によって記載されているｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ等のｐＫ ｍｏｂおよびｐＫ＊ｍｏｂｓａｃＢベクターである。これらは、大腸菌（Escherichia coli）では複製可能であるが、例えばロドコッカス（Rhodococcus）またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）では複製不可能である。これらは、形質転換、またはｍｏｂ遺伝子の存在によるコンジュゲーションのいずれかによって、標的生物に導入され得る。特に好適なベクターは、例えば、バチルス（Bacillus）のｓａｃＢ遺伝子（レバンスクラーゼ遺伝子）等の条件付きに負の優性作用を有する遺伝子を含むものである。ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢの場合、本実施例でより詳細に説明するように、１０％スクロースを含む培地上で選択することにより、第２のクロスオーバー事象を促進させることができる。
【0057】
組込みをもたらす第１のクロスオーバー事象、および標的遺伝子または標的配列における切除をもたらす適切な第２のクロスオーバー事象で起こる相同組換えは、欠失の組込みを達成し、組換え細菌をもたらす。所望の欠失が起こるべき遺伝子を、標的遺伝子と称する。
【0058】
ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１における好ましい必須破壊酵素は、例えば、ＲＨＡ１＿ＲＳ２１８４５（アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３９５（アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ２２１２０（３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼサブユニットＡをコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ１２１７５（３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼサブユニットＡをコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３７０（３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼサブユニットＡをコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ４００９０（３－ケトステロイド－９－α－ヒドロキシラーゼサブユニットＡをコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ２２０９０（３－ケトステロイド－δ－１－デヒドロゲナーゼ（ＫｓｔＤ）をコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ１２１４０（ＦＡＤ結合タンパク質（ＫｓｔＤ２）をコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３０５（ＦＡＤ結合タンパク質（ＫｓｔＤ３）をコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３８０（ＦＡＤ結合タンパク質（ＫｓｔＤ３ｂ）をコードする）、ＲＨＡ１＿ＲＳ４０１８０（３－ケトステロイド－δ－１－デヒドロゲナーゼ（ＫｓｔＤ４）をコードする）、およびＲＨＡ１＿ＲＳ４０２６０（３－ケトステロイド－δ－１－デヒドロゲナーゼ（ＫｓｔＤ４ｂ）をコードする）である。
【0059】
一実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のＫｓｔＤアイソザイムが破壊されている。すなわち、マイコバクテリウム（Mycobacterium）は、破壊されたＫｓｔＤ酵素活性を含む。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0060】
他の実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のＫｓｈアイソザイムが破壊されている。すなわち、マイコバクテリウム（Mycobacterium）は、破壊されたＫｓｈ酵素活性を含む。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0061】
他の実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のＫｓｔＤアイソザイムおよび１つ以上のＫｓｈアイソザイムが破壊されている。すなわち、マイコバクテリウム（Mycobacterium）は、破壊されたＫｓｔＤ活性および破壊されたＫｓｈ酵素活性を含む。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0062】
他の実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムならびにその組合せからなる群から選択される。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0063】
他の実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムの組合せを含む。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0064】
一実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムならびにその組合せからなる群から選択され、１つ以上のＫｓｔＤアイソザイムが破壊されている。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0065】
一実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムならびにその組合せからなる群から選択され、１つ以上のＫｓｈアイソザイムが破壊されている。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0066】
一実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムならびにその組合せからなる群から選択され、１つ以上のＫｓｈアイソザイムが破壊されている。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0067】
一実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムの組合せならびにその組合せを含み、１つ以上のＫｓｔＤアイソザイムが破壊されている。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0068】
一実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムの組合せならびにその組合せを含み、１つ以上のＫｓｈアイソザイムが破壊されている。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0069】
一実施形態において、生物はマイコバクテリウム（Mycobacterium）であり、１つ以上のアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼアイソザイムは、ＣｈｓＥ１、ＣｈｓＥ２、ＣｈｓＥ３、およびＣａｓＣアイソザイムの組合せならびにその組合せを含み、１つ以上のＫｓｈアイソザイムが破壊されている。特に好ましいのは、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５である。
【0070】
スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＭＣ（２）１５５の１つの特定の実施形態において、好ましい必須破壊酵素は、ＭＳＭＥＧ＿６０４１（アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＭＳＭＥＧ＿０６０３（アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＭＳＭＥＧ＿６０３９（フェレドキシン－－ＮＡＤＰ還元酵素）、またはＭＳＭＥＧ＿５９４１（３－ケトステロイド－δ－１－デヒドロゲナーゼ）またはその組合せによってコードされている。
【0071】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）またはマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５の１つの特定の実施形態において、好ましい必須破壊酵素は、ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４２５０；ＭｙＡＤ＿ＲＳ０３６５５；ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２５；ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２０；またはその組合せによってコードされている。
【0072】
ステロイドの作製方法
本発明はさらに、本発明の新規な生物を用いて、ＵＤＣＡおよび他の下流産物に加えて、ステロイド、特にＫＣＥＡ、ＫＣＤＡを作製する方法に関する。したがって、一実施形態において、本発明は、請求項１～２５のいずれかに記載の非天然起源の微生物を１つ以上の植物ステロールの存在下で増殖させてＫＣＥＡおよび／またはＫＣＤＡを産生することを含む、ステロイドの作製方法を提供する。
本発明はさらに、本発明の新規な生物を用いて、ＵＤＣＡおよび他の下流産物に加えて、ステロイド、特にＫＣＥＡ、ＫＣＤＡを作製する方法に関する。したがって、一実施形態において、本発明は、請求項１～２５のいずれかに記載の非天然起源の微生物を１つ以上の植物ステロールの存在下で増殖させてＫＣＥＡおよび／またはＫＣＤＡを産生することを含む、ステロイドの作製方法を提供する。
【0073】
他の実施形態において、本発明は、請求項１～２５のいずれかに記載の非天然起源の微生物をβ－シトステロール、カンペステロール、コレステロール、またはその混合物の存在下で増殖させて、ＫＣＥＡおよび／またはＫＣＤＡを産生することを含む、ステロイドの作製方法を提供する。
【0074】
さらに他の実施形態において、本発明は、請求項１～２５のいずれかに記載の非天然起源の微生物をβ－シトステロール、カンペステロール、コレステロール、またはその混合物の存在下で増殖させ、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％よりも高い収率でＫＣＥＡおよび／またはＫＣＤＡを産生することを含む、ステロイドの作製方法を提供する。
【0075】
増殖を支援するために他の増殖培地を添加することができるが、特に注目すべき添加物は、実施例でさらに説明するように、シクロデキストリンである。
【0076】
上述の方法の実施形態のいずれかにおいて、ＫＣＥＡは、好ましくは、ＡＤに対して０．１：１、０．２：１、０．３：１． ０．４：１、０．５：１、または０．６：１を超える比率で産生される。同様に、上述の方法の実施形態のいずれかにおいて、ＫＣＥＡは、好ましくは、他の主要異化産物（すなわち、ＡＤ、ＢＡ、およびＫＣＥＡ－アルコール）に対して０．１：１、０．２：１、０．３：１、０．４：１、または０．５：１を超える比率で産生される。
【0077】
上述の方法の実施形態のいずれかにおいて、本方法は、任意に、前記ＫＣＥＡまたはＫＣＤＡをＵＤＣＡに変換することをさらに含むことができる。ＫＣＥＡ、ＫＣＤＡ、または２つの化合物の混合物は、以下の３ステップ変換を含む様々な先行技術の方法を使用してＵＤＣＡに変換されてもよい。まず、Ａ環の二重結合（複数可）を水素化して、優先的に３－ケト－５β－コラン酸を得る。Tsuji Natsuko, et al, Journal of Organic Chemistry, 1980, vol. 45, p. 2729（３－ケト－４－エンステロイドおよび３－ケト－１，４－ジエンステロイドの両方から出発する５β－産物の高い選択性を示す）を参照のこと。その後、３－ケト－５β－コラン酸を、水性ＴＨＦ中で、水素化ホウ素ナトリウムで処理し、リトコール酸を得ることができる。中国特許第１１２３７５１１７号（２０２１）（水性ＴＨＦ中で水素化ホウ素ナトリウムを用いた反応を例示）を参照のこと。リトコール酸はその後、７β－水酸化を経て変換し、フザリウム・エクイセチ（Fusarium equiseti）Ｍ－４１を用いた生物変換によりＵＤＣＡを得ることができる。米国特許第４，５７９，８１９号（１９８６）（フザリウム・エクイセチ（Fusarium equiseti）Ｍ－４１を用いた同反応を例示）を参照のこと。
【0078】
したがって、ＵＤＣＡへの変換は、以下のステップを含むことができる：（ａ）ＫＣＤＡまたはＫＣＥＡの３－ケト－５β－コラン酸への触媒的水素化、（ｂ）水性ＴＨＦ中の水素化ホウ素ナトリウム処理による３－ケト－５β－コラン酸のリトコール酸への還元、および（ｃ）フザリウム・エクイセチ（Fusarium equiseti）Ｍ－４１への曝露による酵素的７－β－ヒドロキシル化によるリトコール酸のウルソデオキシコール酸への変換。
【実施例】
【0079】
以下の実施例では、数値（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保するよう努めたが、多少の誤差および逸脱は考慮されるべきである。以下の実施例は、本明細書で特許請求される方法がどのように作成および評価されるかの完全な開示および説明を当技術分野の当業者に提供するために提示され、本発明の純粋な例示であることを意図し、本発明者が本発明と考える範囲を限定することを意図するものではない。
【0080】
一般的な方法
ＤＮＡの単離、取り扱いおよび操作は、制限酵素による消化、ＰＣＲ、クローニング技術および細菌細胞の形質転換を含む標準的な方法（Green and Sambrook, 2012）を用いて実施される。
ＤＮＡの単離、取り扱いおよび操作は、制限酵素による消化、ＰＣＲ、クローニング技術および細菌細胞の形質転換を含む標準的な方法（Green and Sambrook, 2012）を用いて実施される。
【0081】
配列決定用のゲノムＤＮＡは、塩析法（Ｐｏｓｐｉｅｃｈ ａｎｄ Ｎｅｕｍａｎｎ， １９９５）等の確立された方法を用いて単離する。ＰＣＲが容易なゲノムＤＮＡの調製には、ＦａｓｔＤＮＡ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を製造者のプロトコールにしたがって使用する。
【0082】
培地
培地は、特に断りのない限り、以下のように作製する。１リットルを作製するために、全ての成分を８００ｍＬの脱イオン水に示す順序で溶解させる。その後、脱イオン水を加えて最終体積を１リットルにした後、液体を１２１℃で２０分間オートクレーブすることによって滅菌する。
培地は、特に断りのない限り、以下のように作製する。１リットルを作製するために、全ての成分を８００ｍＬの脱イオン水に示す順序で溶解させる。その後、脱イオン水を加えて最終体積を１リットルにした後、液体を１２１℃で２０分間オートクレーブすることによって滅菌する。
【0083】
ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）は、１０ｇ／Ｌ トリプトン、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、および５ｇ／Ｌ 酵母エキスを含む。ＬＢ寒天プレートを作製するためには、滅菌前に１５ｇ／Ｌの寒天を添加する。
【0084】
ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号２２０９２）からプレミックス粉末として供給され、１７ｇ／Ｌ トリプトン、３ｇ／Ｌ ソイトーン、２．５ｇ／Ｌ グルコース、５ｇ／Ｌ 塩化ナトリウムおよび２．５ｇ／Ｌ リン酸二カリウムを含む。製造者の指示にしたがって調製する。
【0085】
トリプティカーゼ大豆寒天（ＴＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号２２０９１）からプレミックス粉末として供給され、１７ｇ／Ｌトリプトン、３ｇ／Ｌソイトーン、２．５ｇ／Ｌグルコース、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、２．５ｇ／Ｌリン酸二カリウムおよび１５ｇ／Ｌ寒天を含む。製造者の指示にしたがって調製する。
【0086】
Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９ブロスは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（カタログ番号：Ｍ０１７８）からプレミックス粉末として供給され、製造者の指示にしたがって作製される。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ８０を滅菌前に添加し、ＡＤＣ増殖補助剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｍ０５５３）を添加して複合Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９を作製する。Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ ７Ｈ９最小培地を作製するために、ＡＤＣ増殖補助剤は省略され、１４ｍＭグリセロールは上記のレシピまたは実施例に示されるようにＴｗｅｅｎ ８０に置き換えられている。
【0087】
Ｍ３培地は、０．５ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、１．５ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．００５ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ 酵母エキスおよび５ｇ／Ｌ グリセロールを含む。
【0088】
Ｍ３－Ｔｗ培地はＭ３と同様だが、０．０５％（ｖ／ｖ）濾過滅菌Ｔｗｅｅｎ ８０が補足されている。
【0089】
Ｍ３およびＭ３－Ｔｗ寒天プレートは、上記と同様であるが、１８ｇ／Ｌ寒天を用いて調製する。
【0090】
培地Ａは、８ｇ／Ｌ Ｄｉｆｃｏ栄養ブロスおよび１ｇ／Ｌ 酵母エキスを含む。滅菌前にｐＨは７．０に設定される。
【0091】
マイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地は、０．５ｇ／Ｌ尿素、３ｇ／Ｌ （ＮＨ４）２ＰＯ４、４ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｋ Ｋ２ＨＰＯ４、０．２ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／Ｌ ＦｅＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ、０．００２ｇ／Ｌ ＺｎＳＯ４ ７Ｈ２Ｏを含む。滅菌前にｐＨを７．０に設定する。
【0092】
材料
制限酵素は Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）またはＰｒｏｍｅｇａから購入する。培地構成要素、化学物質、およびＰＣＲプライマーはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ）から入手する。
制限酵素は Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）またはＰｒｏｍｅｇａから購入する。培地構成要素、化学物質、およびＰＣＲプライマーはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｅｒｃｋ）から入手する。
【0093】
欠失変異導入
無印の遺伝子欠失変異導入を用いて、全ての遺伝子を欠失させる。簡潔に言えば、上流の相同配列と下流の相同配列を、標準的な方法を用いて、ゲノムＤＮＡテンプレートからＰＣＲによって増幅させる。特定の標的遺伝子の近傍相同配列は、以前に破壊された標的遺伝子と重複しているため、正しい株からのゲノムＤＮＡを使用するように注意する必要がある。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（ＡＴＣＣ ８７０９７）を制限消化により直鎖化し、ＰＣＲ産物をＩｎＦｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて製造者の指示にしたがって挿入する。相同性配列の挿入は、制限消化および配列決定によって確認する。得られたプラスミドを、標準的な方法（Bibb and Hatfull, 2002; van der Geize et al, 2000; Lorraine and Smith, 2017）にしたがって電気穿孔法によりロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ１４４４またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）またはマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５に導入する。最初に、クロスオーバーコロニーは、カナマイシン耐性および１０％スクロースに対する感受性を用いて選択され（Geize et al., 2001；Pelicic et al., 1996）、次に、二次組換えコロニーは、カナマイシン感受性およびスクロース耐性を用いて選択される。
無印の遺伝子欠失変異導入を用いて、全ての遺伝子を欠失させる。簡潔に言えば、上流の相同配列と下流の相同配列を、標準的な方法を用いて、ゲノムＤＮＡテンプレートからＰＣＲによって増幅させる。特定の標的遺伝子の近傍相同配列は、以前に破壊された標的遺伝子と重複しているため、正しい株からのゲノムＤＮＡを使用するように注意する必要がある。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ（ＡＴＣＣ ８７０９７）を制限消化により直鎖化し、ＰＣＲ産物をＩｎＦｕｓｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて製造者の指示にしたがって挿入する。相同性配列の挿入は、制限消化および配列決定によって確認する。得られたプラスミドを、標準的な方法（Bibb and Hatfull, 2002; van der Geize et al, 2000; Lorraine and Smith, 2017）にしたがって電気穿孔法によりロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ１４４４またはスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）またはマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５に導入する。最初に、クロスオーバーコロニーは、カナマイシン耐性および１０％スクロースに対する感受性を用いて選択され（Geize et al., 2001；Pelicic et al., 1996）、次に、二次組換えコロニーは、カナマイシン感受性およびスクロース耐性を用いて選択される。
【0094】
欠失変異体は、実施例に示すプライマーを用いたＰＣＲおよび配列決定によって確認される。実施例で用いた遺伝子ＩＤは、ＮＣＢＩ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）から入手可能な公開ゲノム配列から取ったものである：ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１のアクセッション番号ＮＣ＿００８２６８、およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ｍｃ（２） １５５のアクセッション番号ＮＣ＿００８５９６、およびマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５のアクセッション番号ＮＺ＿ＣＰ０１１０２２。遺伝子名は、ゲノム配列中または文献のいずれかで使用されているものである。
【0095】
全ゲノム配列決定
細菌ゲノムは、ｈｉＳｅｑ ＰＣＲ－フリーペアードエンドデータおよびメイトペアを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定を用いて配列決定する。アセンブリ、アノテーション、および解析は、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ、ＢＬＡＳＴ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＡＣＴ、Ｍａｕｖｅ、Ｐｈｙｒｅ ２、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ等の標準的なソフトウェアを用いて行う。
細菌ゲノムは、ｈｉＳｅｑ ＰＣＲ－フリーペアードエンドデータおよびメイトペアを用いたＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定を用いて配列決定する。アセンブリ、アノテーション、および解析は、Ｂｉｏｐｙｔｈｏｎ、ＢＬＡＳＴ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＡＣＴ、Ｍａｕｖｅ、Ｐｈｙｒｅ ２、Ｉｎｔｅｒｐｒｏ等の標準的なソフトウェアを用いて行う。
【0096】
培養抽出物の解析
実施例に記載の液体培養物の溶媒抽出後、サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ ＶａｎＧｕａｒｄおよびＡｃｑｕｉｔｙインラインカラムフィルターを取り付け、６０℃で操作したＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ×３．５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣでのＫＣＥＡおよびＫＣＤＡの生成について解析した。移動相は溶媒Ａ（０．００５Ｍ酢酸アンモニウム、０．０１２％ ギ酸）および溶媒Ｂ（９５％ メタノール、５％ 水、０．０１２％ ギ酸）からなり、流速は１．０ｍＬ／分であった。勾配は５０％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂに９．５分間にわたってランした。サンプルは、２０４ｎｍおよび２４６ｎｍのＵＶ、ならびに質量範囲ｍ／ｚが２００～８００のエレクトロスプレーポジティブイオンモードでランするＷａｔｅｒｓ ＺＱシングル四重極ＭＳを用いたＭＳによって解析した）。
実施例に記載の液体培養物の溶媒抽出後、サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ ＶａｎＧｕａｒｄおよびＡｃｑｕｉｔｙインラインカラムフィルターを取り付け、６０℃で操作したＷａｔｅｒｓ ＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ×３．５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣでのＫＣＥＡおよびＫＣＤＡの生成について解析した。移動相は溶媒Ａ（０．００５Ｍ酢酸アンモニウム、０．０１２％ ギ酸）および溶媒Ｂ（９５％ メタノール、５％ 水、０．０１２％ ギ酸）からなり、流速は１．０ｍＬ／分であった。勾配は５０％溶媒Ｂから１００％溶媒Ｂに９．５分間にわたってランした。サンプルは、２０４ｎｍおよび２４６ｎｍのＵＶ、ならびに質量範囲ｍ／ｚが２００～８００のエレクトロスプレーポジティブイオンモードでランするＷａｔｅｒｓ ＺＱシングル四重極ＭＳを用いたＭＳによって解析した）。
【0097】
[実施例１] ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１におけるＦａｄＥ３４／ＣｈｓＥ３、ＣａｓＣ、ＫｓｈＡホモログの不活性化
ΔＦａｄＥ３４（ＲＨＡ１＿ＲＳ２１８４５）変異体を作製するために、プラスミドｐＳＡＮＤ００１は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断する。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１および配列番号２を用いてゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅される（１５２５ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号３および配列番号４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅される（１５３０ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、製造者の指示にしたがって切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、プライマー配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８を用いた制限消化および配列決定により確認される。
ΔＦａｄＥ３４（ＲＨＡ１＿ＲＳ２１８４５）変異体を作製するために、プラスミドｐＳＡＮＤ００１は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断する。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１および配列番号２を用いてゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅される（１５２５ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号３および配列番号４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅される（１５３０ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、製造者の指示にしたがって切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、プライマー配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８を用いた制限消化および配列決定により確認される。
【0098】
ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００１で形質転換し、その後、細胞懸濁液を、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号６および配列番号７を用いたＰＣＲによってＦａｄＥ３４の破壊が成功したかどうかを確認し、ここで、１４０７ｂｐのＰＣＲ産物の存在および３４６５ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００１と命名する。
【0099】
ΔＣａｓＣ（ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３９５）変異体を作製するために、プラスミドｐＳＡＮＤ００２は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断する。上流の相同配列は、プライマー対配列番号９および配列番号１０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２８ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１１および配列番号１２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３０ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、製造者の指示にしたがって切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、プライマー配列番号５、配列番号１３、配列番号１４および配列番号８を用いた制限消化および配列決定によって確認される。
【0100】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００１を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００２で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１３および配列番号１４を用いたＰＣＲによって、ＣａｓＣの破壊が成功したかどうか確認され、ここで、１３７６ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２８２８ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示している。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００２と命名する。
【0101】
ΔＫｓｈＡ１（ＲＨＡ１＿ＲＳ２２１２０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００３は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１５および配列番号１６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３４ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１７および配列番号１８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５６８ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１９、配列番号２０および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0102】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００２を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００３で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１９および配列番号２０を用いたＰＣＲによってＫｓｈＡ１の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１４２２ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２４９０ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００３と命名する。
【0103】
ΔＫｓｈＡ２（ＲＨＡ１＿ＲＳ１２１７５）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００４は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号２１および配列番号２２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３０ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号２３および配列番号２４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２８ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号２５、配列番号２６および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0104】
上述のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００３を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００４で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号２５および配列番号２６を用いたＰＣＲによってＫｓｈＡ２の破壊が成功したかどうかを確認し、１３８０ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２４３６ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００４と命名する。
【0105】
ΔＫｓｈＡ３（ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３７０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００５は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号２７および配列番号２８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２６ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号２９および配列番号３０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３２ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号３１、配列番号３２および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0106】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００４を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００５で形質転換し、その後、細胞懸濁液を、カナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号３１および配列番号３２を用いたＰＣＲによってＫｓｈＡ３の破壊が成功したかどうかを確認し、ここで、１３７４ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２４２７ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００５と命名する。
【0107】
ΔＫｓｈＡ４（ＲＨＡ１＿ＲＳ４００９０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００６は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号３３および配列番号３４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲにより増幅する（１５３５ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号３５および配列番号３６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲにより増幅する（１５３２ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号３７、配列番号３８および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0108】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００５を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００６で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号３７および配列番号３８を用いたＰＣＲによってＫｓｈＡ４の破壊が成功したかどうかを確認し、ここで、１４０１ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２４５７ｂｐのＰＣＲ産物の不在は破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００６と命名する。
【0109】
[実施例２] ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００６におけるＫｓｔＤホモログの不活性化
ΔＫｓｔＤ（ＲＨＡ１＿ＲＳ２２０９０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００７は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断する。上流の相同配列は、プライマー対配列番号３９および配列番号４０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３３ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号４１および配列番号４２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２８ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号４３、配列番号４４および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
ΔＫｓｔＤ（ＲＨＡ１＿ＲＳ２２０９０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００７は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断する。上流の相同配列は、プライマー対配列番号３９および配列番号４０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３３ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号４１および配列番号４２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２８ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号４３、配列番号４４および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0110】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００６を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００７で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号４３および配列番号４４を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤの破壊が成功したかどうかを確認し、ここで、１３８７ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２８５１ｂｐのＰＣＲ産物の不在は破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００７と命名する。
【0111】
ΔＫｓｔＤ２（ＲＨＡ１＿ＲＳ１２１４０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００８は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号４５および配列番号４６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲで増幅する（１５２７ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号４７および配列番号４８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２６ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号４９、配列番号５０および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0112】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００７を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００８で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号４９および配列番号５０を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤ２の破壊が成功したかどうか確認され、ここで、１３５０ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２８６２ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００８と命名する。
【0113】
ΔＫｓｔＤ３（ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３０５）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ００９は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号５１および配列番号５２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲで増幅する（１５２９ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号５３および配列番号５４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３１ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号５５、配列番号５６および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0114】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００８を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ００９で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号５５および配列番号５６を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤ３の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１３６１ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２９２７ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００９と命名する。
【0115】
ΔＫｓｔＤ３ｂ（ＲＨＡ１＿ＲＳ２８３８０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１０は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号５７および配列番号５８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲで増幅する（１５４５ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号５９および配列番号６０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５００ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号６１、配列番号６２および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0116】
上述のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００９を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１０で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号６１および配列番号６２を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤ３ｂの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１３８１ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２７８５ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１０と命名する。
【0117】
ΔＫｓｔＤ４（ＲＨＡ１＿ＲＳ４０１８０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１１は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号６３および配列番号６４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５４８ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号６５および配列番号６６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５４２ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号６７、配列番号６８および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0118】
上述のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１０を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１１で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号６７および配列番号６８を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤ４の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１４１３ｂｐのＰＣＲ産物の存在および３０２７ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１１と命名する。
【0119】
ΔＫｓｔＤ４ｂ（ＲＨＡ１＿ＲＳ４０２６０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１２は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号６９および配列番号７０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲで増幅する（１５９０ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号７１および配列番号７２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２３ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがって、ＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号７３、配列番号７４および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0120】
上記のロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１１を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１２で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートに移す。シングルコロニーを、プライマー対配列番号７３および配列番号７４を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤ４ｂの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１４５１ｂｐのＰＣＲ産物の存在および３００２ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１２と命名する。
【0121】
[実施例３] ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００１～ＳＡＮＤ０１２の発酵およびＫＣＤＡ／ＫＣＥＡの単離
株ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００１、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００２、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００３、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００４、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００５、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００６、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００７、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００８、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００９、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１０、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１１、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１２を米国特許第４３６２８１５号に記載の方法等にしたがってそれぞれ独立に培養する。１つの方法において、１００ｍＬの滅菌培養培地（０．０６％コレステロールまたはβ－シトステロール等の植物ステロール、０．０６％Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、水を補充およびｐＨ７．２に調整）を含む５００ｍＬアーレンマイヤーフラスコに変異体株を接種する。これを３０℃で６２時間、１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。次に、フラスコに滅菌したＢＲＩＪ（登録商標）３５（ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル）を最終濃度０．１％になるように添加し、さらなる量のコレステロールまたは植物ステロール等のステロール供給を最終量０．１％になるように添加する。その後、フラスコを１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でさらに１２０時間インキュベートする。
株ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００１、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００２、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００３、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００４、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００５、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００６、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００７、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００８、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ００９、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１０、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１１、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＳＡＮＤ０１２を米国特許第４３６２８１５号に記載の方法等にしたがってそれぞれ独立に培養する。１つの方法において、１００ｍＬの滅菌培養培地（０．０６％コレステロールまたはβ－シトステロール等の植物ステロール、０．０６％Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、水を補充およびｐＨ７．２に調整）を含む５００ｍＬアーレンマイヤーフラスコに変異体株を接種する。これを３０℃で６２時間、１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。次に、フラスコに滅菌したＢＲＩＪ（登録商標）３５（ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル）を最終濃度０．１％になるように添加し、さらなる量のコレステロールまたは植物ステロール等のステロール供給を最終量０．１％になるように添加する。その後、フラスコを１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でさらに１２０時間インキュベートする。
【0122】
ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡを含む産物は、Ahmad et al., 1991およびMcDonald et al. 2012に記載されているような標準的な方法を用いてブロスから抽出される。１つの方法において、培養物を等体積の酢酸エチル中に抽出し、次いで蒸発させ、次いで、クロマトグラフィーを用いて目的のステロールを精製する。
【0123】
[実施例４] ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）のＤＳＭ１４４４またはＤＳＭ１４４５’におけるＦａｄＥ３４／ＣａｓＣホモログのノックアウト変異体の作製
ゲノムＤＮＡを一般的な方法に記載されたように単離し、ｈｉＳｅｑ ＰＣＲ－フリーペアードエンドデータおよびメイトペアでＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定を用いて配列決定する。アセンブリアノテーションおよび解析は、一般的な方法に記載されているように行われる。
ゲノムＤＮＡを一般的な方法に記載されたように単離し、ｈｉＳｅｑ ＰＣＲ－フリーペアードエンドデータおよびメイトペアでＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定を用いて配列決定する。アセンブリアノテーションおよび解析は、一般的な方法に記載されているように行われる。
【0124】
ＦａｄＥ３４およびＣａｓＣをコードする遺伝子のホモログは、アセンブリした、アノテーションされたゲノムに対するタンパク質ＢＬＡＳＴ検索、または検索クエリとして配列番号７５および配列番号７６を用いる、得られた塩基配列に対するｔｂｌａｓｔｎ検索のいずれかにより同定される。
【0125】
得られたＢＬＡＳＴヒットのうち、最も高いビットスコアを有するものが破壊の標的となる。各変異体は、実施例６に記載の方法にしたがって、コレステロールまたは植物ステロール側鎖分解の中断、ＫＣＤＡおよびＫＣＥＡならびに形成し得る任意の代替分解産物のスクリーニングについて試験する（Ruprecht et al., 2015）。ブロス中に何も存在しない場合、配列番号７５および配列番号７６に対して次に高い相同性を有するＢＬＡＳＴヒットが、破壊の標的となる。標的遺伝子を破壊するために使用されるプラスミドは、以下に記載されるように構築される。
【0126】
ΔＦａｄＥ３４変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１３は、以下のように構築される。アノテーション付きゲノム配列をガイドとして、インフレーム欠失を意図してＦａｄＥ３４ホモログ開始コドンの１～２ｋｂ上流から開始し、ＦａｄＥ３４ホモログ開始コドンの下流の少数コドン（例えば１０～２５コドン）で終了する配列を増幅するようにプライマー対を設計する。
【0127】
アノテーション付きゲノム配列をガイドとして使用し、インフレーム欠失を意図して、ＦａｄＥ３４ホモログ停止コドンの上流にある少数のコドン、例えば１０～２５コドンから始まり、ＦａｄＥ３４ホモログ停止コドンの下流１～２ｋｂで終了する配列を増幅するようにプライマー対が設計される。
【0128】
さらに、プライマーセットは両方、ライゲーション、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニング、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリまたは他の選択された方法のいずれかによって、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢまたは他の適切なベクターに好都合にクローニングできるように設計されている。プラスミドは、上流と下流のホモロジー配列を一般的なＰＣＲ法で増幅し、その後、選択したベクターにクローニングすることにより構築される。ベクターの正しいアセンブリおよび挿入物の同一性は、制限消化および適切なプライマーを用いた配列決定によって確認される。
【0129】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ１４４４（ＡＴＣＣ３１４５９）またはＤＳＭ１４４５（ＡＴＣＣ３１４６０）、３－オキソ－プレグナ－１，４－ジエン－２０－カルボキシル酸（１，４－ＢＮＣとしても知られる；３－オキソ－２３，２４－ビスノルコラ－１，４－ジエン－２２－オン酸）、３－オキソ－プレグナ－４－エン－２０－カルボキシル酸（４－ＢＮＣとしても知られる；２３，２４－ビス－ノル－コレスタ－４－エン－２２－オン酸）、４－アンドロステン－３，１７－ジオン（ＡＤ）および１，４－アンドロスタジエン－３，１７－ジオン（ＡＤＤ）を産生できる微生物株は、標準的な方法を用いて電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１３で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンまたはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ以外のプラスミドが用いられる場合には他の適切な抗生物質を含むＴＳＡプレート上に広げる。次に、シングルコロニーを新鮮なＴＳＡプレートに移し、適切な方法、例えば１０％スクロースによるｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに対するカウンター選択によって、二次組換え体が選択される。シングルコロニーを、適切なプライマー対を用いたＰＣＲによって、ＦａｄＥ３４の破壊が成功しているかどうか確認する。得られた株をロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０１３と命名する。
【0130】
ΔＣａｓＣ変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１４は、以下のように構築される。アノテーション付きゲノム配列をガイドとして使用して、インフレーム欠失を意図してＣａｓＣホモログ開始コドンの１～２ｋｂ上流から開始し、ＣａｓＣホモログ開始コドンの下流の少数コドン（例えば１０～２５コドン）で終了する配列を増幅するようにプライマー対が設計される。
【0131】
アノテーション付きゲノム配列をガイドとして使用して、インフレーム欠失を意図して、ＣａｓＣホモログ停止コドンの上流の少数のコドン、例えば１０～２５コドンで開始し、ＣａｓＣホモログ停止コドンの下流１～２ｋｂで終了する配列を増幅するようにプライマー対を設計した。
【0132】
さらに、プライマーセットは共に、ライゲーション、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニング、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、または他の選択した方法のいずれかによって、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢまたは他の適切なベクターに好都合にクローニングできるように設計されている。プラスミドは、上流および下流の相同配列を一般的なＰＣＲ法によって増幅し、その後、選択したベクターにクローニングすることにより構築される。ベクターの正しいアセンブリおよび挿入物の同一性は、制限消化および適切なプライマーを用いた配列決定によって確認される。
【0133】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０１３を、標準的な方法を用いて電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１４で形質転換し、その後、細胞懸濁液を、カナマイシンまたはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ以外のプラスミドを使用する場合には他の適切な抗生物質を含むＴＳＡプレート上に広げる。次に、シングルコロニーを新鮮なＴＳＡプレートに移し、適切な方法、例えば１０％スクロースによるｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに対するカウンター選択によって、二次組換え体が選択される。シングルコロニーを、適切なプライマー対を用いたＰＣＲによって、ＣａｓＣの破壊が成功しているかどうか確認する。得られた株をロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＳＡＮＤ０１４と命名する。
【0134】
[実施例５] ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０１４におけるＫｓｔＤホモログのノックアウト変異体の作製
ＫｓｔＤをコードする遺伝子のホモログは、アノテーション付きゲノムに対するタンパク質ＢＬＡＳＴ検索、または検索クエリとして配列番号１０１を使用する、得られたヌクレオチド配列に対するｔｂｌａｓｔｎ検索のいずれかによって同定される。以下の手順が一例となり、ノックアウトする各ホモログについて実施される。
ＫｓｔＤをコードする遺伝子のホモログは、アノテーション付きゲノムに対するタンパク質ＢＬＡＳＴ検索、または検索クエリとして配列番号１０１を使用する、得られたヌクレオチド配列に対するｔｂｌａｓｔｎ検索のいずれかによって同定される。以下の手順が一例となり、ノックアウトする各ホモログについて実施される。
【0135】
ΔＫｓｔＤ変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１９は、以下のように構築される。アノテーション付きゲノム配列をガイドとして使用して、インフレーム欠失を意図して、ＫｓｔＤ開始コドンの上流１～２ｋｂから始まり、ＫｓｔＤ開始コドンの下流にある少数のコドン、例えば１０～２５コドンで終了する配列を増幅するようにプライマー対を設計する。
【0136】
アノテーション付きゲノム配列をガイドとして使用して、インフレーム欠失を意図して、ＫｓｔＤ停止コドンの上流にある少数のコドン、例えば１０～２５コドンで始まり、ＫｓｔＤ停止コドンの下流１～２ｋｂで終了する配列を増幅するようにプライマー対を設計した。
【0137】
さらに、プライマーセットは共に、ライゲーション、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニング、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ、または他の選択した方法のいずれかによって、ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢまたは他の適切なベクターに好都合にクローニングできるように設計されている。プラスミドは、上流と下流の相同配列を一般的なＰＣＲ法によって増幅し、その後、選択したベクターにクローニングすることにより構築される。ベクターの正しいアセンブリおよび挿入物の同一性は、制限消化および適切なプライマーを用いた配列決定によって確認される。
【0138】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０１４またはその誘導体を、標準的な方法を用いて電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１９で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンまたはｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ以外のプラスミドを使用する場合は他の適当な抗生物質を含むＴＳＡプレート上に広げる。次に、シングルコロニーを新鮮なＴＳＡプレートに移し、適切な方法、例えば１０％スクロースによるｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに対するカウンター選択によって、二次組換え体が選択される。シングルコロニーを、アノテーション付きゲノム配列をガイドとして使用して、適切なプライマー対を用いたＰＣＲによって、ＫｓｔＤの破壊が成功しているかどうか確認する。得られた株をロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０１５と命名する。
【0139】
[実施例６] ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０１３～ＳＡＮＤ０１５の発酵およびＫＣＤＡ／ＫＣＥＡの単離
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）株ＳＡＮＤ０１３、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）株ＳＡＮＤ０１４およびロドコッカス属（Rhodococcus sp.）株ＳＡＮＤ０１５を、米国特許第４３６２８１５号に記載の方法等の標準的な方法にしたがって独立に培養する。１つの方法では、１００ｍＬの滅菌培養培地（０．０６％コレステロールまたはβ－シトステロール等の植物ステロール、０．０６％Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、水を補充、ｐＨ７．２に調整）を含む５００ｍＬアーレンマイヤーフラスコに変異体株を接種する。これを３０℃で６２時間、１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。次に、フラスコに滅菌したＢＲＩＪ（登録商標）３５（ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル）を最終濃度０．１％まで添加し、さらなる量のコレステロールまたは植物ステロール等のステロール供給を最終量０．１％となるように添加する。その後、フラスコを１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でさらに１２０時間インキュベートする。
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）株ＳＡＮＤ０１３、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）株ＳＡＮＤ０１４およびロドコッカス属（Rhodococcus sp.）株ＳＡＮＤ０１５を、米国特許第４３６２８１５号に記載の方法等の標準的な方法にしたがって独立に培養する。１つの方法では、１００ｍＬの滅菌培養培地（０．０６％コレステロールまたはβ－シトステロール等の植物ステロール、０．０６％Ｔｗｅｅｎ ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、水を補充、ｐＨ７．２に調整）を含む５００ｍＬアーレンマイヤーフラスコに変異体株を接種する。これを３０℃で６２時間、１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートする。次に、フラスコに滅菌したＢＲＩＪ（登録商標）３５（ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル）を最終濃度０．１％まで添加し、さらなる量のコレステロールまたは植物ステロール等のステロール供給を最終量０．１％となるように添加する。その後、フラスコを１５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃でさらに１２０時間インキュベートする。
【0140】
ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡを含む産物は、Ahmad et al., 1991およびMcDonald et al., 2012に記載されているような標準的な方法を用いてブロスから抽出される。１つの方法において、培養物を等体積の酢酸エチルで抽出し、次いで蒸発させ、次いで、クロマトグラフィーを用いて目的のステロールを精製する。
【0141】
[実施例７] スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ｍｃ（２）１５５におけるＦａｄＥ３４／ＣａｓＣおよびＫｓｈＢのノックアウト変異体の作製
ΔＦａｄＥ３４（ＭＳＭＥＧ＿６０４１）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１５は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。プライマー対配列番号７７および配列番号７８を用いる、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用する、ＰＣＲによって上流の相同配列を増幅する（１５３０ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号７９および配列番号８０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３６ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号８１、配列番号８２および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
ΔＦａｄＥ３４（ＭＳＭＥＧ＿６０４１）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１５は、以下のように構築される。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。プライマー対配列番号７７および配列番号７８を用いる、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用する、ＰＣＲによって上流の相同配列を増幅する（１５３０ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号７９および配列番号８０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３６ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号８１、配列番号８２および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0142】
スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ｍｃ（２）１５５（ＡＴＣＣ ７０００８４）を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１５で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含む複合７Ｈ９寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを１０％スクロースを含む複合７Ｈ９寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号８１および配列番号８２を用いたＰＣＲによってＦａｄＥ３４の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１３４１ｂｐのＰＣＲ産物の存在および３３６９ｂｐのＰＣＲ産物の非存在が破壊の成功を示す。得られた株をスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１６と命名する。
【0143】
ΔＣａｓＣ（ＭＳＭＥＧ＿０６０３）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１６は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流相同配列は、プライマー対配列番号８３および配列番号８４を用いる、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅する（１５３６ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号８５および配列番号８６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３７ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を使用して、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号８７、配列番号８８および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0144】
上記のスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１６を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１６で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含む複合７Ｈ９寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含む複合７Ｈ９寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号８７および配列番号８８を用いたＰＣＲによってＣａｓＣの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１３４６ｂｐのＰＣＲ産物の存在および３４２８ｂｐのＰＣＲ産物の不在が、破壊の成功を示す。得られた株をスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１７と命名する。
【0145】
ΔＫｓｈＢ（ＭＳＭＥＧ＿６０３９）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１７は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列を、プライマー対配列番号８９および配列番号９０を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅する（１５２６ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号９１および配列番号９２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５３９ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号９３、配列番号９４および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0146】
上記のスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１７を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１７で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含む複合７Ｈ９寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含む複合７Ｈ９寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号９３および配列番号９４を用いたＰＣＲによってＫｓｈＢの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１３９５ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２２６８ｂｐのＰＣＲ産物の不在が、破壊の成功を示す。得られた株をスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１８と命名する。
【0147】
[実施例８] スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１８におけるΔＫｓｔＤノックアウト変異体の作製
ΔＫｓｔＤ（ＭＳＭＥＧ＿５９４１）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１８は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号９５および配列番号９６を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２２ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号９７および配列番号９８を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２７ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号９９、配列番号１００および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
ΔＫｓｔＤ（ＭＳＭＥＧ＿５９４１）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１８は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号９５および配列番号９６を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２２ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号９７および配列番号９８を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（１５２７ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号９９、配列番号１００および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0148】
スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１８を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１８で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含む複合７Ｈ９寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、１０％スクロースを含む複合７Ｈ９寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号９９および配列番号１００を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、１３５４ｂｐのＰＣＲ産物の存在および２９２９ｂｐのＰＣＲ産物の不在が、破壊の成功を示す。得られた株をスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１９と命名する。
【0149】
[実施例９] スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）ＳＡＮＤ０１６～ＳＡＮＤ０１９の発酵およびＫＣＤＡ／ＫＣＥＡの単離
スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１６、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１７、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１８およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１９を、（Galan et al., 2017）に記載の方法等にしたがって独立して培養する。
スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１６、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１７、スメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１８およびスメグマ菌（Mycobacterium smegmatis）株ＳＡＮＤ０１９を、（Galan et al., 2017）に記載の方法等にしたがって独立して培養する。
【0150】
１つの方法において、９ｍＭグリセロールおよび０．４ｇ／Ｌコレステロールまたはβ－シトステロール等の植物ステロールを含むアルブミン－デキストロース－カタラーゼ補助剤なしの滅菌Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９ブロス培地を１００ｍＬ含む５００ｍＬアーレンマイヤーフラスコに変異体株を接種する。これらを２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で１００時間インキュベートする。
【0151】
ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡを含む産物は、Ahmad et al., 1991およびMcDonald et al. 2012に記載されるような標準的な方法を用いてブロスから抽出される。１つの方法において、培養物を等体積の酢酸エチルで抽出し、次いで蒸発させ、次いで、クロマトグラフィーを用いて目的のステロールを精製する。
【0152】
[実施例１０] マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５におけるΔＣｈｓＥ３およびΔＣａｓＣノックアウト変異体の作製
ΔＣｈｓＥ３（ＧＥＮＥ ＩＤ ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４２５０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１９は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断される。上流の相同配列を、プライマー対配列番号１２１および配列番号１０２を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０３４ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１０３および配列番号１０４を用いる、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０３４ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
ΔＣｈｓＥ３（ＧＥＮＥ ＩＤ ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４２５０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０１９は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断される。上流の相同配列を、プライマー対配列番号１２１および配列番号１０２を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０３４ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１０３および配列番号１０４を用いる、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０３４ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0153】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０１９で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＭ３寒天プレートに広げる。その後、シングルコロニーを、５％スクロースを含むＭ３寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１０５および配列番号１０７を用いたＰＣＲによってＣｈｓＥ３の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、２３５２ｂｐのＰＣＲ産物の存在および４４３４ｂｐのＰＣＲ産物の不在は、破壊の成功を示す。得られた株をマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２０と命名する。
【0154】
ΔＣａｓＣ（ＧＥＮＥ ＩＤ ＭｙＡＤ＿ＲＳ０３６５５）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２０は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断される。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１０８および配列番号１０９を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅される（１９９６ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１１０および配列番号１１１を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２００４ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0155】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２０を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２０で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＭ３寒天プレートに広げる。その後、シングルコロニーを５％スクロースを含むＭ３寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１１２および配列番号１１４を用いたＰＣＲによって、ＣａｓＣの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、２２８１ｂｐのＰＣＲ産物の存在および４３９９ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２１と命名する。
【0156】
[実施例１１]：マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２０～ＳＡＮＤ０２１におけるＫｓｔＤホモログのノックアウト変異体の作製
ΔＫｓｔＤ（ＧＥＮＥ ＩＤ ＭｙＡＤ＿ＲＳ２３８１０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２１は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断される。上流の相同配列を、プライマー対配列番号１１５および配列番号１１６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０３７ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１１７および配列番号１１８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０２２ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
ΔＫｓｔＤ（ＧＥＮＥ ＩＤ ＭｙＡＤ＿ＲＳ２３８１０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２１は、以下のように構築されている。プラスミドｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢは制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断される。上流の相同配列を、プライマー対配列番号１１５および配列番号１１６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０３７ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１１７および配列番号１１８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅する（２０２２ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入する。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１および配列番号８を用いた配列決定により確認される。
【0157】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２０を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２１で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＭ３寒天プレートに広げる。次に、シングルコロニーを、５％スクロースを含むＭ３寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１１９および配列番号１２１を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、２５７２ｂｐのＰＣＲ産物の存在および４０８１ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２２と命名する。
【0158】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２１を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２１で形質転換し、その後、細胞懸濁液をカナマイシンを含むＭ３寒天プレートに広げる。その後、シングルコロニーを５％スクロースを含むＭ３寒天プレートに移す。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１１９および配列番号１２１を用いたＰＣＲによってＫｓｔＤの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、２５７２ｂｐのＰＣＲ産物の存在および４０８１ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示す。得られた株をマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２３と命名する。
【0159】
[実施例１２]：マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２０～ＳＡＮＤ０２３の発酵およびＫＣＤＡ／ＫＣＥＡの単離
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２０、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２１、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２２およびマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２３を、文献（例えばMarsheck et al., 1972）に記載の方法等にしたがって独立に培養する。１つの方法において、２５０ｍｌの培地Ａを含む１リットルアーレンマイヤーフラスコに、株の４８時間液体培養物を接種し、２５０ＲＰＭ（２．５ｃｍスロー）で振盪しながら３１℃で培養した。４８時間後、各フラスコに粉末ステロール（コレステロールまたはβ－シトステロール等の植物ステロール等）１００ｍｇを添加し、７２～９６時間インキュベーションを継続した。
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２０、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２１、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２２およびマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）株ＳＡＮＤ０２３を、文献（例えばMarsheck et al., 1972）に記載の方法等にしたがって独立に培養する。１つの方法において、２５０ｍｌの培地Ａを含む１リットルアーレンマイヤーフラスコに、株の４８時間液体培養物を接種し、２５０ＲＰＭ（２．５ｃｍスロー）で振盪しながら３１℃で培養した。４８時間後、各フラスコに粉末ステロール（コレステロールまたはβ－シトステロール等の植物ステロール等）１００ｍｇを添加し、７２～９６時間インキュベーションを継続した。
【0160】
ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡを含む産物は、Ahmad et al., 1991およびMcDonald et al. 2012に記載されるような標準的な方法を用いてブロスから抽出される。１つの方法において、培養物を等体積の酢酸エチル中に抽出し、次いで蒸発させ、次いで、クロマトグラフィーを用いて目的のステロールを精製する。
【0161】
[実施例１３]：ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ１４４４におけるＦａｄＥ３４ホモログのノックアウト変異体の作製
遺伝子ノックアウトプラスミドの骨格として使用するプラスミドｐＳＡＮＤ０２２は以下のように構築された。プラスミドｐＫＣ１１３２（Bierman et al.,1992）を制限酵素ＰｃｉＩで直鎖化した。枯草菌（Bacillus subtilis）遺伝子ｓａｃＢ（配列番号１２２）をコードする配列を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、標準的な方法にしたがったライゲーションにより、切断されたｐＫＣ１１３２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は制限消化により確認した。得られたプラスミドをｐＳＡＮＤ０２２と標識した。
遺伝子ノックアウトプラスミドの骨格として使用するプラスミドｐＳＡＮＤ０２２は以下のように構築された。プラスミドｐＫＣ１１３２（Bierman et al.,1992）を制限酵素ＰｃｉＩで直鎖化した。枯草菌（Bacillus subtilis）遺伝子ｓａｃＢ（配列番号１２２）をコードする配列を制限酵素ＮｃｏＩで消化し、標準的な方法にしたがったライゲーションにより、切断されたｐＫＣ１１３２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は制限消化により確認した。得られたプラスミドをｐＳＡＮＤ０２２と標識した。
【0162】
ΔＦａｄＥ３４ホモログ変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２３は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。上流の相同配列を、プライマー対配列番号１２３および配列番号１２４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５４９ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化した。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１２５および配列番号１２６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５７９ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで消化した。両方の消化されたＰＣＲ産物を、標準的な方法にしたがってライゲーションにより、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１２７、配列番号１２８および配列番号８を用いた配列決定により確認された。
【0163】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＤＳＭ１４４４を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２３で形質転換し、その後、細胞懸濁液をアプラマイシンを含むＴＳＡ寒天プレートに広げた。シングルコロニーを２５０ＲＰＭで振盪しながら、２５０ｍｌアーレンマイヤーフラスコ中の５０ｍｌ ＴＳＢ中、３０℃で２日間増殖させた。この培養物の希釈物を１０％スクロースを含むＴＳＡ寒天プレート上にプレーティングした。シングルコロニーを、プライマー対配列番号１２９および配列番号１３０を用いたＰＣＲによって、ＦａｄＥ３４ホモログの破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、３２１３ｂｐのＰＣＲ産物の存在および５２２３ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示した。３２１３ｂｐのＰＣＲ産物の同一性は、プライマー配列番号１２７および配列番号１２８を用いた配列決定により確認された。得られた株をロドコッカス・ネオアウルム（Rhodococcus neoaurum）ＳＡＮＤ０２４と命名した。
【0164】
[実施例１４]：ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２４の発酵および培養抽出物の解析
５０ｍＬファルコンチューブ中の５ｍＬの滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ ８０、水を補充し、滅菌前にｐＨ７．２に調整）にロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２４を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で２４時間インキュベートし、これを種培養物とて使用する。２５０ｍＬコニカル振盪フラスコに０．０６％コレステロールを含む滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ８０、水を補充し滅菌前にｐＨ７．２に調整）４０ｍＬに種培養物０．７０９ｍＬを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２日インキュベートした。４０ｍｇのコレステロールを２ｍＬのエタノールに溶解し、この溶液に０．１３ｍＬのＢＲＩＪ（登録商標）－３５（水中３０ｗ／ｖ％溶液）を添加し、懸濁液を培養物に添加した。この培養物を２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で５日間インキュベートした。培養物から０．８ｍＬのブロスを抜き取り、０．８ｍＬの酢酸エチルを用いて１時間振盪して抽出した。遠心分離により相を分離し、０．３ｍＬの溶媒相を清浄なチューブに移し、蒸発させた。ペレットを０．１５ｍＬのメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ－ＭＳで解析した（一般的な方法を参照）。ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡの産生を単離標準との比較で確認した（図１および図２参照）。
５０ｍＬファルコンチューブ中の５ｍＬの滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ ８０、水を補充し、滅菌前にｐＨ７．２に調整）にロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２４を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で２４時間インキュベートし、これを種培養物とて使用する。２５０ｍＬコニカル振盪フラスコに０．０６％コレステロールを含む滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ８０、水を補充し滅菌前にｐＨ７．２に調整）４０ｍＬに種培養物０．７０９ｍＬを接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で２日インキュベートした。４０ｍｇのコレステロールを２ｍＬのエタノールに溶解し、この溶液に０．１３ｍＬのＢＲＩＪ（登録商標）－３５（水中３０ｗ／ｖ％溶液）を添加し、懸濁液を培養物に添加した。この培養物を２５０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で５日間インキュベートした。培養物から０．８ｍＬのブロスを抜き取り、０．８ｍＬの酢酸エチルを用いて１時間振盪して抽出した。遠心分離により相を分離し、０．３ｍＬの溶媒相を清浄なチューブに移し、蒸発させた。ペレットを０．１５ｍＬのメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ－ＭＳで解析した（一般的な方法を参照）。ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡの産生を単離標準との比較で確認した（図１および図２参照）。
【0165】
[実施例１５]：ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１におけるＫｓｈＡ１のノックアウト変異体の作製
ΔＫｓｈＡ１変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２４は、以下のように構築された。プラスミドｐＵＣ１９は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。上流の相同配列をプライマー対配列番号１３１および配列番号１３２を用いてゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１５４４ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化した。下流の相同配列を、プライマー対配列番号１３３および配列番号１３４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５７８ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで消化した。両方の消化されたＰＣＲ産物を、標準的な方法にしたがってライゲーションにより、切断されたｐＵＣ１９に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１９および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。続いて、得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、上流相同領域および下流相同領域を含む２９４１ｂｐの断片を、製造者の指示にしたがってＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ およびＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔを用いて単離した。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、５４２９ｂｐの断片をＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔを製造者の指示にしたがって使用して、単離した。消化されたｐＳＡＮＤ０２２は、標準的な方法にしたがって上流相同領域および下流相同領域を含む２９４１ｂｐのＤＮＡ断片とライゲーションされた。
ΔＫｓｈＡ１変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２４は、以下のように構築された。プラスミドｐＵＣ１９は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。上流の相同配列をプライマー対配列番号１３１および配列番号１３２を用いてゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１５４４ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化した。下流の相同配列を、プライマー対配列番号１３３および配列番号１３４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５７８ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで消化した。両方の消化されたＰＣＲ産物を、標準的な方法にしたがってライゲーションにより、切断されたｐＵＣ１９に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１９および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。続いて、得られたプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、上流相同領域および下流相同領域を含む２９４１ｂｐの断片を、製造者の指示にしたがってＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｇｅｌ およびＰＣＲ ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔを用いて単離した。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにより消化した。断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、５４２９ｂｐの断片をＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔを製造者の指示にしたがって使用して、単離した。消化されたｐＳＡＮＤ０２２は、標準的な方法にしたがって上流相同領域および下流相同領域を含む２９４１ｂｐのＤＮＡ断片とライゲーションされた。
【0166】
ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）ＲＨＡ１を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２４で形質転換し、その後、細胞懸濁液をアプラマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げた。シングルコロニーを５０ｍｌファルコンチューブ中の３ｍｌ ＬＢで、２５０ＲＰＭで振盪させながら、２８℃で２４時間増殖させた。この培養物の希釈物を、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした。シングルコロニーを、プライマー対配列番号１３５および配列番号１３６を用いたＰＣＲによってＫｓｈＡ１の破壊が成功しているかどうか確認し、ここで、３１４７ｂｐのＰＣＲ産物の存在および４２０９ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示した。３１４７ｂｐのＰＣＲ産物の同一性は、プライマー配列番号１９および配列番号２０を用いた配列決定により確認された。得られた株をロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２５と命名した。
【0167】
[実施例１６]：ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２５におけるＦａｄＥ３４のノックアウト変異体の作製
ΔＦａｄＥ３４変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２５は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１および配列番号１３７を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５３５ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化した。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１３８および配列番号４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５４０ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩによって消化した。両方の消化されたＰＣＲ産物を、標準的な方法にしたがったライゲーションにより、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。
ΔＦａｄＥ３４変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２５は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１および配列番号１３７を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５３５ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｐｅＩで消化した。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１３８および配列番号４を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１５４０ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物は制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩによって消化した。両方の消化されたＰＣＲ産物を、標準的な方法にしたがったライゲーションにより、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。
【0168】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２５を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２５で形質転換し、その後、細胞懸濁液をアプラマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げた。シングルコロニーを５０ｍｌファルコンチューブ中の３ｍｌ ＬＢ中で、２５０ＲＰＭで振盪しながら、２８℃で２４時間増殖させた。この培養物の希釈物を、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１３９および配列番号１４０を用いたＰＣＲによってＦａｄＥ３４の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、３２０３ｂｐのＰＣＲ産物の存在および５２５５ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示した。３２０３ｂｐのＰＣＲ産物の同一性は、プライマー配列番号６および配列番号７を用いた配列決定によって確認された。得られた株をロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２６と命名した。
【0169】
[実施例１７]：ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２６におけるＣａｓＣのノックアウト変異体の作製
ΔＣａｓＣ変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２６は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。上流の相同配列を、プライマー対配列番号９および配列番号１４１を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１５４３ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩによって消化した。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１２および配列番号１４２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１５４１ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで消化した。両方の消化されたＰＣＲ産物を、標準的な方法にしたがったライゲーションにより、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１３、配列番号１４および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。
ΔＣａｓＣ変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２６は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断された。上流の相同配列を、プライマー対配列番号９および配列番号１４１を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１５４３ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩによって消化した。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１２および配列番号１４２を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１５４１ｂｐの産物を生成する）。このＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｅＩで消化した。両方の消化されたＰＣＲ産物を、標準的な方法にしたがったライゲーションにより、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１３、配列番号１４および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。
【0170】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２６を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２６で形質転換し、その後、細胞懸濁液をアプラマイシンを含むＬＢ寒天プレートに広げた。シングルコロニーを５０ｍｌファルコンチューブ中の３ｍｌ ＬＢ中で、２５０ＲＰＭで振盪しながら、２８℃で２４時間増殖させた。この培養物の希釈物を、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした。シングルコロニーを、プライマー対配列番号１４３および配列番号１４４を用いたＰＣＲによってＣａｓＣの破壊が成功しているかどうか確認し、ここで、３０６６ｂｐのＰＣＲ産物の存在および４５０６ｂｐのＰＣＲ産物の不在が破壊の成功を示した。３０６６ｂｐのＰＣＲ産物の同一性は、プライマー配列番号１３を用いた配列決定によって確認された。得られた株をロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２７と命名した。
【0171】
[実施例１８]：ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２７の発酵および培養抽出物の解析
５０ｍＬファルコンチューブ中の５０μｇ／ｍＬコレステロールを含む５ｍＬの滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ８０、水を補充し、滅菌前にｐＨ７．２に調整）にロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２７を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら２８℃で４８時間インキュベートし、これを種培養物として使用した。５０ｍＬファルコンチューブ中の０．０６％コレステロールを含む滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ８０、水を補充し、滅菌前にｐＨ７．２に調整）７ｍＬに、６００ｎｍにおける光学濃度が０．０５になるまで種培養物を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら、２８℃で４８時間インキュベートを行った。７ｍｇのコレステロールを小体積の滅菌培養培地に懸濁し、０．２３μＬのＢＲＩＪ（登録商標）－３５（水中３０％ｗ／ｖ溶液）と混合して培養物に添加した。この培養物を２５０ＲＰＭで振盪しながら２８℃で５日間インキュベートした。培養物から０．８ｍＬのブロスを抜き取り、これを０．８ｍＬの酢酸エチルによって１時間振盪して抽出した。遠心分離により相を分離し、０．３ｍＬの溶媒相を清浄なチューブに移し、蒸発させた。ペレットを０．１５ｍＬのメタノールに溶かし、ＨＰＬＣ－ＭＳで解析した（一般的な方法を参照）。ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡの生成は、単離標準との比較において確認された。
５０ｍＬファルコンチューブ中の５０μｇ／ｍＬコレステロールを含む５ｍＬの滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ８０、水を補充し、滅菌前にｐＨ７．２に調整）にロドコッカス属（Rhodococcus sp.）ＳＡＮＤ０２７を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら２８℃で４８時間インキュベートし、これを種培養物として使用した。５０ｍＬファルコンチューブ中の０．０６％コレステロールを含む滅菌培養培地（０．８％ペプトン、０．９％酵母エキス、０．３％グルコース、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ８０、水を補充し、滅菌前にｐＨ７．２に調整）７ｍＬに、６００ｎｍにおける光学濃度が０．０５になるまで種培養物を接種し、２５０ＲＰＭで振盪しながら、２８℃で４８時間インキュベートを行った。７ｍｇのコレステロールを小体積の滅菌培養培地に懸濁し、０．２３μＬのＢＲＩＪ（登録商標）－３５（水中３０％ｗ／ｖ溶液）と混合して培養物に添加した。この培養物を２５０ＲＰＭで振盪しながら２８℃で５日間インキュベートした。培養物から０．８ｍＬのブロスを抜き取り、これを０．８ｍＬの酢酸エチルによって１時間振盪して抽出した。遠心分離により相を分離し、０．３ｍＬの溶媒相を清浄なチューブに移し、蒸発させた。ペレットを０．１５ｍＬのメタノールに溶かし、ＨＰＬＣ－ＭＳで解析した（一般的な方法を参照）。ＫＣＥＡおよびＫＣＤＡの生成は、単離標準との比較において確認された。
【0172】
[実施例１９]：マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５におけるＣｈｓＥ３ノックアウト変異体の作製
ΔＣｈｓＥ３（ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４２５０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２７は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１４５および配列番号１４６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（２０３４ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１４７および配列番号１４８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（２０３４ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。
ΔＣｈｓＥ３（ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４２５０）変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２７は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。上流の相同配列は、プライマー対配列番号１４５および配列番号１４６を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（２０３４ｂｐの産物を生成する）。下流の相同配列は、プライマー対配列番号１４７および配列番号１４８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（２０３４ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号８を用いた配列決定によって確認された。
【0173】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２７で形質転換し、その後、細胞懸濁液をアプラマイシンを含むＭ３寒天プレートに広げた。単一コロニーを、アプラマイシンを含む新鮮なＭ３寒天プレートに移した。パッチからの細胞は、５０ｍＬファルコンチューブ中の５ｍＬ Ｍ３－Ｔｗ培地中で、２２０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で４８時間増殖させた。この培養物を少量、５％スクロースを含むＭ３寒天プレートにプレーティングした。シングルコロニーを、プライマー対配列番号１４９および配列番号１５０を用いたＰＣＲによってＣｈｓＥ３の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、６．２ｋｂのバンドの不在および４．１ｋｂのバンドの存在が破壊の成功を示す。得られた株をマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２８と命名する。
【0174】
[実施例２０]：マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２８におけるＣａｓＣノックアウト変異体の作製
ΔＣａｓＣ（ＭｙＡＤ＿ＲＳ０３６５５）変異体を作製するための、プラスミドｐＳＡＮＤ０２８は以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。上流相同配列は、プライマー対配列番号１５１および配列番号１５２を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１９９６ｂｐの産物を生成する）。下流相同配列は、プライマー対配列番号１５３および配列番号１５４を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（２００７ｂｐの産物を生成）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４および配列番号８を用いた配列決定により確認した。
ΔＣａｓＣ（ＭｙＡＤ＿ＲＳ０３６５５）変異体を作製するための、プラスミドｐＳＡＮＤ０２８は以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。上流相同配列は、プライマー対配列番号１５１および配列番号１５２を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１９９６ｂｐの産物を生成する）。下流相同配列は、プライマー対配列番号１５３および配列番号１５４を用いた、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（２００７ｂｐの産物を生成）。両方のＰＣＲ産物を、製造者の指示にしたがってＩｎＦｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ．）を用いて、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化およびプライマー配列番号５、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４および配列番号８を用いた配列決定により確認した。
【0175】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２８を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２８で形質転換し、その後、細胞懸濁液をアプラマイシンを含むＭ３寒天プレートに広げた。シングルコロニーを、アプラマイシンを含む新鮮なＭ３寒天プレートに移した。パッチからの細胞を５０ｍＬファルコンチューブ中の３ｍＬ Ｍ３－Ｔｗ培地中で、２２０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で４８時間増殖させた。この培養物２０μＬを、５％スクロースを含むＭ３寒天プレートにプレーティングした。シングルコロニーは、プライマー対配列番号１５５および配列番号１５６を用いたＰＣＲによって、ＣａｓＣの破壊が成功しているかどうか確認し、ここで、６．２ｋｂバンドの不在および４．１ｋｂバンドの存在が、破壊の成功を示す。得られた株をマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９と命名した。
【0176】
[実施例２１] マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９によるコレステロールおよびβ－シトステロールのＫＣＥＡへの生物変換
５０ｍＬファルコンチューブ中の５ｍＬ Ｍ３－Ｔｗ培地にマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９を接種し、２２０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートし、これを種培養物として使用した。３日後、種培養物から遠心分離（２０００×ｇ、５分間）によって細胞を採取し、５ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地に懸濁し、接種物として使用した。４０ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地を含むフラスコ２本に、この接種物１ｍＬを接種し、生物変換培養物として使用した。
５０ｍＬファルコンチューブ中の５ｍＬ Ｍ３－Ｔｗ培地にマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９を接種し、２２０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートし、これを種培養物として使用した。３日後、種培養物から遠心分離（２０００×ｇ、５分間）によって細胞を採取し、５ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地に懸濁し、接種物として使用した。４０ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地を含むフラスコ２本に、この接種物１ｍＬを接種し、生物変換培養物として使用した。
【0177】
ステロール製剤を以下のように調製した。２．１ｇのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを秤量し、ソニケーターバス、ボルテックスミキサーの助けを借りて２．１ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解し、６０℃に設定したオーブンで最大３０分間インキュベートした。４５ｍｇのコレステロールおよび植物ステロール混合物（７５％β－シトステロール、１０％カンペステロール）（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）を秤量し、それぞれ１．９３ｍＬのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン溶液（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）中にソニケーターバス、ボルテックスミキサーの助けを借りて溶解し、６０℃に設定したオーブンで最大３０分間インキュベートした。
【0178】
１．７２ｍＬのコレステロール製剤を生物変換培養物の１つに添加し、１．７２ｍＬのβ－シトステロール／カンペステロール製剤を他方の生物変換培養物に添加した。両方の生物変換培養物を２２０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で２日または３日間インキュベートした。０．８ｍＬのサンプルを一定間隔で採取し、以下のように抽出した。１５μＬのギ酸をサンプルに混合し、その後、等量の酢酸エチルで抽出した。溶媒層を減圧下で蒸発させ、残ったペレットを元の半分の体積のメタノールに溶解した。このメタノール溶液をＬＣＭＳで解析したところ（一般的な方法を参照）、並行してランを行ったＫＣＥＡ標準と同じ保持時間およびマススペクトルプロファイルを有するピークが見られた（図７を参照）。また、ＫＣＥＡ－アルコール標準で見られるものと同一の保持時間およびマススペクトルプロファイルを有するピークが見られた。
【0179】
[実施例２２] マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９におけるＣｈｓＥ１／２ノックアウト変異体の作製
ΔＣｈｓＥ１－ＣｈｓＥ２（ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２５およびＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２０）二重変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２９は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＮｏｔＩで切断された。上流相同配列は、プライマー対配列番号１５７および配列番号１５８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１８３１ｂｐの産物を生成する）。下流相同配列は、プライマー対配列番号１５９および配列番号１６０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１９７４ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、全ての断片を混合し、３７℃で１５分間インキュベートすることにより、ＳＬｉＣＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ（Zhang et al., 2014）を使用して、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化によって確認した。続いて、プライマー配列番号５、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３および配列番号８を用いて挿入物を配列決定した。
ΔＣｈｓＥ１－ＣｈｓＥ２（ＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２５およびＭｙＡＤ＿ＲＳ２４０２０）二重変異体を作製するためのプラスミドｐＳＡＮＤ０２９は、以下のように構築された。プラスミドｐＳＡＮＤ０２２は制限酵素ＮｏｔＩで切断された。上流相同配列は、プライマー対配列番号１５７および配列番号１５８を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲによって増幅した（１８３１ｂｐの産物を生成する）。下流相同配列は、プライマー対配列番号１５９および配列番号１６０を用いて、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＰＣＲにより増幅した（１９７４ｂｐの産物を生成する）。両方のＰＣＲ産物を、全ての断片を混合し、３７℃で１５分間インキュベートすることにより、ＳＬｉＣＥ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ（Zhang et al., 2014）を使用して、切断されたｐＳＡＮＤ０２２に挿入した。挿入物の挿入および同一性は、制限消化によって確認した。続いて、プライマー配列番号５、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３および配列番号８を用いて挿入物を配列決定した。
【0180】
マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９を、標準的な方法を用いて、電気穿孔法によりプラスミドｐＳＡＮＤ０２９で形質転換し、その後、細胞懸濁液をアプラマイシンを含むＭ３寒天プレートに広げた。シングルコロニーを、アプラマイシンを含む新鮮なＭ３寒天プレートに移した。パッチからの細胞を５０ｍＬファルコンチューブ中の３ｍＬ Ｍ３－Ｔｗ培地中で、２２０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で４８時間増殖させた。この培養物２０μＬを、５％スクロースを含むＭ３寒天プレートにプレーティングした。シングルコロニーを、プライマー対配列番号１６４および配列番号１６５を用いたＰＣＲによってＣｈｓＥ３の破壊が成功しているかどうかを確認し、ここで、６．０ｋｂバンドの不在および３．９ｋｂバンドの存在が破壊の成功を示す。変異した配列の組込みは、配列決定プライマー配列番号１６０、配列番号１６１および配列番号１６２を用いた３．９ｋｂのＰＣＲ産物の配列決定により確認した。得られた株を、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０３０と命名した。
【0181】
[実施例２３] マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０３０によるコレステロールのＫＣＥＡへの生物変換。
５０ｍＬファルコンチューブ中の５ｍＬのＭ３－Ｔｗ培地にマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０３０を接種し、２２０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートし、これを種培養物として使用した。３日後、この種培養物３．５ｍＬから細胞を遠心分離（２０００×ｇ、５分間）により採取し、３．５ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地に懸濁し、これを接種物として使用した。４０ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地を含むフラスコ３本に、接種物１ｍＬを接種し、これを生物変換培養物として使用した。ステロール製剤を、各生物変換培養物について、以下のように調製した。２．１ｇのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを秤量し、ソニケーターバス、ボルテックスミキサーの助けを借りて２．１ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解し、６０℃に設定したオーブンで最大３０分間インキュベートした。４５ｍｇのコレステロールを秤量し、ソニケーターバス、ボルテックスミキサーの助けを借りて１．９３ｍＬのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン溶液に溶解し、６０℃に設定したオーブン内で最大３０分間インキュベートした。
５０ｍＬファルコンチューブ中の５ｍＬのＭ３－Ｔｗ培地にマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０３０を接種し、２２０ＲＰＭで振盪しながら３０℃で３日間インキュベートし、これを種培養物として使用した。３日後、この種培養物３．５ｍＬから細胞を遠心分離（２０００×ｇ、５分間）により採取し、３．５ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地に懸濁し、これを接種物として使用した。４０ｍＬのマイコバクテリウム（Mycobacterium）最小生物変換培地を含むフラスコ３本に、接種物１ｍＬを接種し、これを生物変換培養物として使用した。ステロール製剤を、各生物変換培養物について、以下のように調製した。２．１ｇのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを秤量し、ソニケーターバス、ボルテックスミキサーの助けを借りて２．１ｍＬのｄＨ２Ｏに溶解し、６０℃に設定したオーブンで最大３０分間インキュベートした。４５ｍｇのコレステロールを秤量し、ソニケーターバス、ボルテックスミキサーの助けを借りて１．９３ｍＬのヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン溶液に溶解し、６０℃に設定したオーブン内で最大３０分間インキュベートした。
【0182】
１．７２ｍＬのコレステロール製剤を、それぞれの生物変換培養物に添加した。両方の生物変換培養物を、２２０ＲＰＭで振盪しながら、３０℃で７日間インキュベートした。０．５ｍＬのサンプルを一定間隔で採取し、以下のように抽出した。１０μＬのギ酸をサンプルに混合し、その後、等体積の酢酸エチルで抽出した。溶媒層を減圧下で蒸発させ、残ったペレットを元の半分の体積のメタノールに溶解した。このメタノール溶液をＨＰＬＣ－ＭＳで解析したところ（一般的な方法を参照）、並行してランを行ったＫＣＥＡ標準と同じ保持時間およびマススペクトルプロファイルを有するピークが見られた（図８参照）。また、ＫＣＥＡ－アルコール標準と同一の保持時間およびマススペクトルプロファイルを有するピークが見られた。
【0183】
異なる株間のＫＣＥＡへの変換のレベルおよび効率を経時的に比較するために、ＫＣＥＡおよびＡＤ（アンドロステン－３，１７－ジオン）のレベルを試験期間中に測定した。表１に最大濃度およびＫＣＥＡとＡＤの最大濃度の比率の解析を示す。この解析により、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＮＲＲＬ Ｂ－３８０５よりも効率的であったマイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０２９よりも、最大測定濃度およびＡＤに対するＫＣＥＡの比率が高いことからわかるように、マイコバクテリウム・ネオアウルム（Mycobacterium neoaurum）ＳＡＮＤ０３０はコレステロールをＫＣＥＡへ変換する効率がより高いことが明らかになった。また、ＫＣＥＡ濃度と他の主要異化産物（ＡＤ、ＢＡ（ビスノラルコール）、ＫＣＥＡ－アルコール）の総量を比較すると、同様の傾向が見られた。
【0184】
【表1】
【0185】
引用文献
【0186】
【表2】
【0187】
本出願を通じて、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示は、その全体が、本発明が属する技術の状態をより完全に記載するために、参照により本願に組み込まれる。本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明において様々な修正および変形を行うことができることは、当技術分野の当業者にとって明らかであろう。本発明の他の実施形態は、本明細書に開示された発明の明細書および実施の検討から当技術分野の当業者には明らかであろう。本明細書および実施例は、例示的なものとしてのみ考慮されることが意図され、本発明の真の範囲および精神は、以下の特許請求の範囲によって示される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】