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特表2023-530671ブタの健康及び発育成績を向上させるブタ由来のプロバイオティクス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-19
(54)【発明の名称】ブタの健康及び発育成績を向上させるブタ由来のプロバイオティクス
(51)【国際特許分類】
C12N 1/20 20060101AFI20230711BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20230711BHJP
A23K 50/30 20160101ALI20230711BHJP
A23K 10/18 20160101ALI20230711BHJP
A23K 10/16 20160101ALI20230711BHJP
A23K 20/179 20160101ALI20230711BHJP
A23K 20/174 20160101ALI20230711BHJP
【ＦＩ】
C12N1/20 E ZNA
A23L33/135
A23K50/30
A23K10/18
A23K10/16
A23K20/179
A23K20/174
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022576415
(86)(22)【出願日】2021-06-10
(85)【翻訳文提出日】2023-02-13
(86)【国際出願番号】 US2021036804
(87)【国際公開番号】W WO2021252760
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】63/037,435
(32)【優先日】2020-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500467264
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ アーカンソー
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100218578
【弁理士】
【氏名又は名称】河井 愛美
(72)【発明者】
【氏名】ザオ ジャンチャオ
(72)【発明者】
【氏名】ワン シャオファン
(72)【発明者】
【氏名】ツァイ ツォンチェン
(72)【発明者】
【氏名】マックスウェル チャールズ ヴイ
【テーマコード（参考）】
2B005
2B150
4B018
4B065
【Ｆターム（参考）】
2B005EA11
2B005EA12
2B150AA03
2B150AA04
2B150AB03
2B150AC06
2B150AC07
2B150AE05
2B150AE12
2B150AE16
2B150DE01
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE04
4B018LE05
4B018MD85
4B018MD86
4B018ME14
4B018MF06
4B065AA30X
4B065AA49X
4B065BD06
4B065BD10
4B065BD11
4B065CA43
(57)【要約】
本発明は、本明細書においてＬａｃｔＸ、ＳｔｒｅｐＸ１及びＳｔｒｅｐＸ３と称される単離された細菌株を含むプロバイオティクス組成物を提供する。ブタの発育速度を増加させるため、及びブタの生産を向上させるために、組成物を使用する方法も提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１以上の単離された細菌株を含む組成物であって、前記細菌株の少なくとも１つが、ａ）配列番号４の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有するラクトバチルス株ＬａｃｔＸ；及び
ｂ）配列番号２の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有するストレプトコッカス株ＳｔｒｅｐＸ３又はＳｔｒｅｐＸ１
から選択される、組成物。
【請求項2】
ＬａｃｔＸを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ＳｔｒｅｐＸ３又はＳｔｒｅｐＸ１を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
ＬａｃｔＸ、ＳｔｒｅｐＸ１及びＳｔｒｅｐＸ３の少なくとも２つを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
ＬａｃｔＸが受託番号ＮＲＲＬ ＸＸＸＸＸとして寄託された細菌であり、ＳｔｒｅｐＸ１が受託番号ＡＴＣＣ ＸＸＸＸとして寄託された細菌であり、及びＳｔｒｅｐＸ３が受託番号ＡＴＣＣ ＸＸＸＸＸとして寄託された細菌である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
凍結乾燥形態又は乾燥形態である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
液体形態である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
ペースト、ゲル、カプセル、エアゾールスプレー、又は錠剤の形態である、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記細菌の少なくとも一部が、消化管内での放出のために処方されたコーティングで被覆されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
担体、保存剤、安定剤、界面活性剤、香味増強剤、着色剤、ビタミン、栄養素、プレバイオティクス、又は付加的なプロバイオティクスを更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
直接給与生菌組成物である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
ブタの発育速度を増加させる方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物をブタに投与することを含む、方法。
【請求項13】
発育速度の増加が、対照ブタと比較した場合の前記ブタの体重の増加を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ブタの体重が、前記対照ブタと比較して、少なくとも約２％、３％、４％、５％、１０％、１２％、１５％、２０％、又は２５％増加する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ブタの体重が、育成期、肥育前期、及び肥育後期のうちの１つ以上において測定される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項16】
ブタの離乳が発育に及ぼす悪影響を緩和するための方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を前記ブタに投与することを含む、方法。
【請求項17】
ブタの出生から市場出荷可能体重までの時間を短縮するための方法であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を前記ブタに投与することを含む、方法。
【請求項18】
前記組成物が経口投与される、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記経口投与が以下：ａ）前記ブタによって消費される飼料製品中に前記組成物を提供すること、
ｂ）前記ブタによって消費される水の中に前記組成物を提供すること、
ｃ）前記ブタを養育している母ブタの乳首上に前記組成物を提供すること、又は
ｄ）強制経口投与により組成物を提供すること
の１以上を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記組成物が、単回投与で前記ブタに投与される、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記組成物が、初回投与及び１以上の付加的投与として前記ブタに投与される、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ブタが、ａ）離乳期前、
ｂ）離乳期、又は
ｃ）育成期
にある際に前記単回投与又は前記初回投与が行われる、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ブタが、ａ）約１～約６１日齢の間、
ｂ）約１８～約２８日齢の間、又は
ｃ）約１８～約２２日齢の間
である際に前記単回投与又は前記初回投与が行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記ブタが、ａ）育成期、又は
ｂ）育成期２の終了時
にある際に少なくとも１回の前記付加的投与が行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
前記ブタが、ａ）約４５～約６０日齢の間、又は
ｂ）約４８～約５２日齢の間
である際に少なくとも１回の前記付加的投与が行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ブタに投与される前記組成物が、１０7～１０10コロニー形成単位の前記細菌株を含む、請求項１２～２５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
先行出願の相互参照
本願は、２０２０年６月１０日出願の米国仮出願第６３／０３７，４３５号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書の一部として援用される。
配列表
配列表が本願に添付され、２０２１年５月２６日に作成された４．２９ＫＢサイズの「169946_00625_ST25.txt」という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された。この配列表は本願と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、その全体が参照により本明細書の一部として援用される。
本願は、２０２０年６月１０日出願の米国仮出願第６３／０３７，４３５号の優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書の一部として援用される。
配列表
配列表が本願に添付され、２０２１年５月２６日に作成された４．２９ＫＢサイズの「169946_00625_ST25.txt」という名称の配列表のＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された。この配列表は本願と共にＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、その全体が参照により本明細書の一部として援用される。
【背景技術】
【0002】
緒言
養豚業において、離乳期とそれに続く育成期は、ブタの消化管及び免疫力が不安定になる時期である。飼料は、離乳前の乳飼料から、育成期の終わりまでに、複合糖質を含有するトウモロコシ－ダイズミール系飼料に迅速に変更される。この急激な飼料の変更に対して、ブタの消化管は新たに利用可能になった基質に迅速に適応する必要があり、これは離乳初期の飼料摂取量の減少を伴う。これらのストレス要因は、病原性細菌が消化管に定着するのに最適な環境を提供し、消化管バリアの完全性の破壊及び感染性疾患に対する感受性の増大を招く。肥育前期及び肥育後期において、腸内マイクロバイオームの異常、病原体の感染、及び飼料効率は、ブタの健康及び発育成績にとって大きな脅威となる。
有害な病原性微生物の定着を防ぐため、育成期のブタには発育成績を向上させるための抗生物質が日常的に給与されている。しかしながら、抗生物質に対する耐性の懸念から、抗生物質の使用は社会的に厳しくなってきており、畜産業界は代替となるものを見つける必要に迫られている。
養豚業において、離乳期とそれに続く育成期は、ブタの消化管及び免疫力が不安定になる時期である。飼料は、離乳前の乳飼料から、育成期の終わりまでに、複合糖質を含有するトウモロコシ－ダイズミール系飼料に迅速に変更される。この急激な飼料の変更に対して、ブタの消化管は新たに利用可能になった基質に迅速に適応する必要があり、これは離乳初期の飼料摂取量の減少を伴う。これらのストレス要因は、病原性細菌が消化管に定着するのに最適な環境を提供し、消化管バリアの完全性の破壊及び感染性疾患に対する感受性の増大を招く。肥育前期及び肥育後期において、腸内マイクロバイオームの異常、病原体の感染、及び飼料効率は、ブタの健康及び発育成績にとって大きな脅威となる。
有害な病原性微生物の定着を防ぐため、育成期のブタには発育成績を向上させるための抗生物質が日常的に給与されている。しかしながら、抗生物質に対する耐性の懸念から、抗生物質の使用は社会的に厳しくなってきており、畜産業界は代替となるものを見つける必要に迫られている。
【発明の概要】
【0003】
腸内マイクロバイオームは、宿主の免疫系の恒常性、栄養利用、及び消化管バリアの完全性に重要な影響を及ぼしている。このように、プロバイオティクス又はプレバイオティクスを用いてブタの腸内マイクロバイオームを調節することは、病原体の侵入を防ぎ、有益な細菌の定着を促進するための有望な手段となっている。しかしながら、プロバイオティクスが健康及び発育成績を向上させる能力を検討した研究では、一貫性のない結果が報告されている。従って、養豚業では、ブタの発育成績を向上させることができる、プロバイオティクスサプリメントに対するニーズが依然として存在する。
【0004】
要約
本発明は、１以上の単離された細菌株を含む組成物を提供し、これらの細菌株のうち少なくとも１つは、（ａ）ラクトバチルス（Lactobacillus）株ＬａｃｔＸ、（ｂ）ストレプトコッカス（Streptococcus）株ＳｔｒｅｐＸ３及び（ｃ）ストレプトコッカス株ＳｔｒｅｐＸ１から選択される。
第２の態様において、本発明は、ブタの発育速度を増加させるための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示される組成物をブタに投与することを含む。
第３の態様において、本発明は、ブタの離乳が発育に及ぼす悪影響を緩和するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示される組成物をブタに投与することを含む。
第４の態様において、本発明は、ブタの出生から市場出荷可能体重までの時間を短縮するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示される組成物をブタに投与することを含む。
本発明は、１以上の単離された細菌株を含む組成物を提供し、これらの細菌株のうち少なくとも１つは、（ａ）ラクトバチルス（Lactobacillus）株ＬａｃｔＸ、（ｂ）ストレプトコッカス（Streptococcus）株ＳｔｒｅｐＸ３及び（ｃ）ストレプトコッカス株ＳｔｒｅｐＸ１から選択される。
第２の態様において、本発明は、ブタの発育速度を増加させるための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示される組成物をブタに投与することを含む。
第３の態様において、本発明は、ブタの離乳が発育に及ぼす悪影響を緩和するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示される組成物をブタに投与することを含む。
第４の態様において、本発明は、ブタの出生から市場出荷可能体重までの時間を短縮するための方法を提供する。本方法は、本明細書に開示される組成物をブタに投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】ブタの腸内マイクロバイオーム群集の多様性（ａ、ｃ、ｅ）及び豊富さ（ｂ、ｄ、ｆ）の、テスト試験（ａ及びｂ）、並びに検証試験の対照群（ｃ及びｄ）及び糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）群（ｅ及びｆ）の、出生から市場までの経時的変化を示す。哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期は、それぞれ青（１～２０日）、紫（２７～６１日）、緑（７６～１１６日）及び赤（１３０～１７４日）で表される。
【図2】異なる発育段階のブタの腸内マイクロバイオーム菌種構成の経時的変化を示す。ブレイ－カーティス距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）プロットは、テスト試験（ａ）、並びに検証試験の対照群（ｂ）及び糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）群（ｃ）、及び全ての群を合わせたもの（ｄ）において明確なクラスターを示した。哺乳期、育成期、肥育前期及び肥育後期は色（それぞれ青、紫、緑及び赤）並びに形（それぞれ四角、丸、菱形、及び三角）で区別されている。ＦＭＴ群のブタドナーは黄色の菱形で表示されている。同じ色の濃さのサンプルは、同じ日に採取されたものである。
【図3】テスト試験（ａ）だけではなく検証試験の対照群（ｂ）、及びＦＭＴ群（ｃ）において同定された上位３０の特徴量を示す。各色は、積み上げ棒グラフ上の細菌分類群の相対存在量を表している。
【図4】ブタの腸内マイクロバイオームの経時的な出現パターンを示す。各日の平均相対存在量に基づく上位７００の特徴量を用いて出現パターンをまとめた。青丸は細菌分類群の存在を示し、黄丸は不在を示す。混色の丸は、各段階又は期間における「存在」と「不在」の間の移行を意味する。
【図5】テスト試験において、線形判別分析の効果量（ＬＥｆＳｅ；ＬＤＡ＞２）により特定された９１の段階に関連する細菌分類群を示すヒートマップである。上位１０００の特徴量（ｄ０のサンプルを除く）をＬＥｆＳｅ分析に使用した。ヒートマップは、対数スケール上の平均相対存在量を示す。
【図6】異なる発育段階における細菌分類群間の相互作用のネットワーク解析を示す。細菌分類群間の関係を計算するために、ＳｐａｒＣＣを使用した。ネットワークの描画には、Ｒパッケージのｉｇｒａｐｈを使用した。
【図7】糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ；各フェーズの右側のバー）が、（ａ）離乳時及びその後の発育段階における平均日増体重（ＡＤＧ）、及び（ｂ）ブタの最終体重及び温枝肉質量（ＨＣＷ）に及ぼす影響を、対照（ＣＯＮ；各フェーズのグラフの左側のバー）と比較して示したものである。全てのブタの体重を各フェーズの開始時と終了時に測定し、ＡＤＧ及び市場体重を決定した。この試験の終わりに、全てのブタは、枝肉特性データを収集する工場に移された。１個のアスタリスク（*）は、有意差がある傾向を示す（０．０５＜Ｐ＜０．１０）；２個のアスタリスク（**）は有意差を示す（Ｐ≦０．０５）。
【図8】テスト試験で特定された発育成績関連の特徴量を示す。哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期で特定された上位５０の発育関連細菌が示されている。最後の列は、段階全体（Ｏｖｅｒａｌｌ）の上位５０の特徴量を示している。上位５０の特徴量は、各段階（哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期）又は段階全体（Ｏｖｅｒａｌｌ）の上位５００の特徴量からＲの回帰ベースのランダムフォレストアルゴリズムを用いて選択されたものである。
【図9】テスト試験で出生から市場まで追跡した母ブタ及び屠蓄前ブタにおけるブタの腸内マイクロバイオーム群集の多様性（ａ）及び豊富さ（ｂ）、並びに群集の均等度（シャノンの均等度）（ｃ）の経時的変化を示す。哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期は、飼料の構成及び生理的な発達に基づき、それぞれ青（１～２０日）、紫（２７～６１日）、緑（７６～１１６日）、及び赤（１３０～１７４日）に色分けされている。他の飼育群から分娩日に採取された母ブタの直腸スワブは黄色で表示されている。
【図10】ブタの腸内マイクロバイオーム菌種構成の異なる発育段階における経時的変化を示す。ジャッカード距離に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）プロットは、テスト試験（ａ）、検証試験の対照群（ｂ）、ＦＭＴ群（ｃ）、及び３つの群を合わせた全てのサンプル（ｄ）において、明確なクラスターを示した。哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期は色（それぞれ青、紫、緑及び赤）並びに形（それぞれ四角、丸、菱形、及び三角）で区別されている。同じ色の濃さのサンプルは、同じ日に採取されたものである。ＦＭＴ群のブタドナーは黄色の菱形で表示されている。
【図11】テスト試験（ａ）、検証試験の対照群（ｂ）及び糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）群（ｃ）における、ブタの腸内マイクロバイオーム組成物の門レベルでの経時的変化を示す積み上げ棒グラフである。
【図12】テスト試験のブタの腸内マイクロバイオームの、上位１０種のうちの８種の細菌の特徴量の出生から市場までの動態を示す箱ひげ図である。
【図13】検証試験における対照群及びＦＭＴ群のブタの腸内マイクロバイオームを示すＰＣｏＡプロットである。哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期は色（それぞれ青、紫、緑及び赤）で区別されている。同じ色の濃さのサンプルは、同じ日に採取されたものである。対照群（Ｃｏｎ）及び糞便マイクロバイオータ移植群（ＦＭＴ）は、それぞれ三角、及び丸で示す。ブタドナーは黄色で表示されている。
【図14】テスト試験群、検証試験－対照群、検証試験－ＦＭＴ群に共通する屠蓄前の定住菌として特定された「コア」マイクロバイオームを示すベン図である。
【図15】検証試験の対照群（ａ）及びＦＭＴ群（ｂ）において、上位１０００の特徴量（ｄ２２及び２３のサンプルを除く）に基づき、ＬＥｆＳｅが特定した段階において豊富な特徴量を示す。ヒートマップは、対照群（ｃ）及びＦＭＴ群（ｄ）における、段階において豊富な特徴量（ＬＤＡ＞２）の対数スケールでの平均相対存在量を反映し、赤は存在量が多いことを、青は存在量が少ないことを示している。
【図16】テスト試験における、経時的な腸内マイクロバイオーム群集のＰＣｏＡプロットであり、飼料、母ブタ、性別により区別されている。哺乳期、育成期、肥育前期及び肥育後期は、形（それぞれ四角、丸、菱形、及び三角）により区別されている。
【図17】個々のブタの経時的な腸内マイクロバイオームのＰＣｏＡプロット（ブレイ－カーティス）であり、各プロットに耳刻番号が示されている。哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期は、形（それぞれ四角、丸、菱形、及び三角）により区別されている。同じ色の濃さのサンプルは、同じ日に採取されたものである。欠測データ又は特定のブタのｄ０からのサンプルは示していない。
【図18】初期段階の腸内マイクロバイオームの後期段階への寄与のＳｏｕｒｃｅＴｒａｃｋｅｒ分析を示す。４つの箱ひげ図は、ｄ０サンプル～ｄ１１（哺乳期）、ｄ２０（離乳期）～ｄ２７（育成期フェーズ１）、ｄ６１（育成期終了）～ｄ７６（肥育前期フェーズ１）、及びｄ１１６（肥育前期フェーズ２終了）～ｄ１３４（肥育後期フェーズ１）の寄与率を示している。
【図19】検証試験におけるｄ４２（ａ）及びｄ６１（ｂ）で、ＬＥｆＳｅにより、対照群と糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）群の間で差異があることが確認された特徴量と、（ｃ）異なる時点における対照群（明）及びＦＭＴ群（暗）の特徴量２の相対存在量（右Ｙ軸）及び体重（左Ｙ軸）である。
【図20】検証試験の異なる時点における糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）群において豊富な細菌分類群を示す。各日における青（左）及び赤（右）のバーは、それぞれ対照群及びＦＭＴ群におけるこれらの細菌の特徴量の相対存在量を示す。
【図21】検証試験で特定された発育成績関連の特徴量を示したものである。哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期に特定された上位５０の有益な細菌が示されている。最後の列は、段階全体（ｏｖｅｒａｌｌ）の上位５０の特徴量を示している。上位５０の特徴量は、各段階及び段階全体（Ｏｖｅｒａｌｌ）の上位５００の特徴量からＲの回帰ベースのランダムフォレストアルゴリズムを用いて選択されたものである。
【図22】テスト試験の陰性対照、模擬群集、及びｄ０の子ブタの腸内マイクロバイオームのＰＣｏＡプロットを示したものである。
【図23】対照群（Ｃｏｎ）及び単離群（ＩＳＯ）のｄ２１、６４、及び７８のＦ２の相対存在量を示したものである。
【図24】対照ブタ（Ｃｏｎ）及び異なる細菌株（Ｆ２＿Ｓｔｒ１、Ｆ２＿Ｓｔｒ３、及びＬａｃｔ＿Ｓｔｒ４）を給与したブタの発育成績を示す。体重は、育成期の３時点：ｄ３４、ｄ５３、及びｄ６６、並びに肥育前期フェーズの１時点：ｄ９４で測定した。細菌株ＳｔｒｅｐＸ＿３（Ｆ２＿Ｓｔｒ３）及びＬａｃｔＸ（Ｌａｃｔ＿Ｓｔｒ４）は、ブタの体重を有意に増加させた。
【図25】第３の動物試験（即ち、Ｆ２＿Ｓｔｒ３の検証試験）において離乳から市場出荷までのブタの平均日増体重（ＡＤＧ）に及ぼすＦ２補給及び抗生物質の影響を示したものである。Ｆ２処置群に割り当てられたブタは、離乳日（ｄ０）、ｄ１、及び育成期２フェーズの終わり（ｄ２８）に再びＦ２を投与された。抗生物質処置群には、フェーズ１にカルバドックス（Ｍｅｃａｄｏｘ（登録商標）１０、Ｐｈｉｂｒｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ティーネック、ＮＪ）、及びフェーズ２にチアムリンフマル酸水素塩（Ｄｅｎａｇａｒｄ（登録商標））＋クロルテトラサイクリン塩酸塩（ＣＴＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ ＵＳ Ｉｎｃ、グリーンズボロ、ＮＣ）を追加した。ａ．ｂ．共通の上付き文字を持たない最小二乗平均は、ｐ≦０．０５で有意に異なる。
【発明を実施するための形態】
【0006】
発明の詳細な説明
ブタの腸内マイクロバイオームと動物の健康及び生産との関係は、いくつかの研究において特徴付けられている［１～６］。腸内マイクロバイオームのバランスが崩れた状態（ディスバイオーシス）は、離乳期の高い死亡率、腸管バリア機能の低下、及び病原体感染の増加などと関連し、養豚業における大きな損失の一因とされている。プロバイオティクス又はプレバイオティクスを用いてブタの腸内マイクロバイオームを調節することは、病原体感染を防ぎ、有益な細菌の定着を促進する有望な手段である［７］。最近の研究では、ブタの腸内マイクロバイオームが消化管の生物地理学的特徴［５］、肥満症［３］、栄養素消化率［４］、及び発育成績［６］と関連していることが明らかになり、その理解が深まっている。特に、クリステンセネラ(Christensenellaceae)、オシリバクタ―(Oscillibacter)、デフルビタレア・インケルタエ・セディス (Defluviitaleaceae incertae sedis)、セルロシライティカム(Cellulosilyticum)、及びコリネバクテリウム(Corynebacterium)などの細菌分類群の存在は、養豚業にとって重要な指標である飼料効率と正の相関がある［８］。
ブタの腸内マイクロバイオームと動物の健康及び生産との関係は、いくつかの研究において特徴付けられている［１～６］。腸内マイクロバイオームのバランスが崩れた状態（ディスバイオーシス）は、離乳期の高い死亡率、腸管バリア機能の低下、及び病原体感染の増加などと関連し、養豚業における大きな損失の一因とされている。プロバイオティクス又はプレバイオティクスを用いてブタの腸内マイクロバイオームを調節することは、病原体感染を防ぎ、有益な細菌の定着を促進する有望な手段である［７］。最近の研究では、ブタの腸内マイクロバイオームが消化管の生物地理学的特徴［５］、肥満症［３］、栄養素消化率［４］、及び発育成績［６］と関連していることが明らかになり、その理解が深まっている。特に、クリステンセネラ(Christensenellaceae)、オシリバクタ―(Oscillibacter)、デフルビタレア・インケルタエ・セディス (Defluviitaleaceae incertae sedis)、セルロシライティカム(Cellulosilyticum)、及びコリネバクテリウム(Corynebacterium)などの細菌分類群の存在は、養豚業にとって重要な指標である飼料効率と正の相関がある［８］。
【0007】
本願において、本発明者らは、発育の哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期を対象として、出生から市場までのブタの腸内マイクロバイオームの経時的変化を特徴付けた。彼らはこれらの段階間でブタの腸内マイクロバイオームが大きく変化していることを確認し、段階及び発育に関連する細菌を特定した。この発見を検証するため、本発明者らは、離乳期のブタに、成熟した肥育前期のブタの腸内マイクロバイオータを接種した。糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）は離乳期のブタの発育成績を有意に向上させたが、腸内マイクロバイオームの菌種の組成全体には変化が見られなかった。しかしながら、ストレプトコッカス及びクロストリジウム(Clostridiaceae)に関連する細菌を含む少数の分類群がＦＭＴブタにおいて豊富であり、これらの細菌が動物の発育成績を促進する役割を担っている可能性が示唆された。
次に、本発明者らは、ランダムフォレスト機械学習を用いて、異なる段階のブタの発育成績と正の相関がある細菌株を特定した。カルチャロミクスアプローチを用いて、特定された細菌株のうち１５株をブタから単離した。これらの細菌株の酸性ｐＨ及び胆汁酸に対する耐性をスクリーニングした結果、本発明者らは３つの細菌株をプロバイオティクス候補として選択した。選択した細菌株をブタに給与することにより、本明細書においてＬａｃｔＸ及びＳｔｒｅｐＸ３と称される２つの細菌株が、ブタの体重を有意に増加させることを見出した。
次に、本発明者らは、ランダムフォレスト機械学習を用いて、異なる段階のブタの発育成績と正の相関がある細菌株を特定した。カルチャロミクスアプローチを用いて、特定された細菌株のうち１５株をブタから単離した。これらの細菌株の酸性ｐＨ及び胆汁酸に対する耐性をスクリーニングした結果、本発明者らは３つの細菌株をプロバイオティクス候補として選択した。選択した細菌株をブタに給与することにより、本明細書においてＬａｃｔＸ及びＳｔｒｅｐＸ３と称される２つの細菌株が、ブタの体重を有意に増加させることを見出した。
【0008】
定義：
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で定義され使用される全ての定義は、辞書の定義、本明細書の一部として援用される文献における定義、及び／又は定義された用語の通常の意味に優先すると理解すべきである。
本明細書及び請求項で使用される不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、別段の明示がない限り、「少なくとも１つの」を意味すると理解すべきである。
範囲は、各個のメンバーを含む。従って、例えば、１～３のメンバーを持つ群とは、１、２、又は３のメンバーを持つ群を指す。
別段の明示がない限り、２つ以上のステップ又は行為を含む、本明細書で請求される任意の方法において、本方法のステップ又は行為の順序は、本方法のステップ又は行為が記載された順序に必ずしも限定されるものではないことも理解すべきである。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で定義され使用される全ての定義は、辞書の定義、本明細書の一部として援用される文献における定義、及び／又は定義された用語の通常の意味に優先すると理解すべきである。
本明細書及び請求項で使用される不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、別段の明示がない限り、「少なくとも１つの」を意味すると理解すべきである。
範囲は、各個のメンバーを含む。従って、例えば、１～３のメンバーを持つ群とは、１、２、又は３のメンバーを持つ群を指す。
別段の明示がない限り、２つ以上のステップ又は行為を含む、本明細書で請求される任意の方法において、本方法のステップ又は行為の順序は、本方法のステップ又は行為が記載された順序に必ずしも限定されるものではないことも理解すべきである。
【0009】
修飾動詞「してもよい(may)」は、複数の記載された実施形態又はその中に含まれる特徴のうち、１以上の任意選択肢又は選択肢の好ましい使用又は選択を意味する。特定の実施形態又はその中に含まれる特徴に関して任意選択肢又は選択肢が開示されていない場合、修飾動詞「してもよい(may)」は、記載された実施形態又はその中に含まれる特徴の態様の作り方又は使用に関する肯定的な行為、又は記載された実施形態又はその中に含まれる特徴に関する特定の技能を使用する最終的な決定を意味する。この後者の文脈では、修飾動詞「してもよい(may)」は助動詞「できる(can)」と同じ意味と含意を持つ。
請求項並びにその上記の明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing）」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」、などの全ての移行句は、オープンエンドである、即ち、含むがこれに限定されないことを意味すると理解されるものである。「からなる(consisting of)」及び「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句だけが、それぞれクローズド又はセミクローズドの移行句であるものとする。
請求項並びにその上記の明細書において、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「有する(carrying)」、「有する(having)」、「含有する(containing）」、「伴う(involving)」、「保持する(holding)」、「から構成される(composed of)」、などの全ての移行句は、オープンエンドである、即ち、含むがこれに限定されないことを意味すると理解されるものである。「からなる(consisting of)」及び「から本質的になる(consisting essentially of)」という移行句だけが、それぞれクローズド又はセミクローズドの移行句であるものとする。
【0010】
本明細書で使用される場合、用語「プロバイオティクス」は、腸内微生物のバランスを改善することによって宿主動物に有益な影響を与える生きた微生物飼料サプリメントを指す。一般に、プロバイオティクスは生きた微生物である。異なるプロバイオティクスは消化管内で異なる作用を有する可能性があり、そのため異なるプロバイオティクスが個別に、又は相乗的に作用して有益な効果をもたらし得る。プロバイオティクスに関連する有益な効果は好ましいものであるにもかかわらず、研究者らは一般的な結論を出すことに慎重である。なぜなら、摂取するプロバイオティクスの種類や量、並びに特定のプロバイオティクスの組合せによって有益な効果は異なるからである。従って、プロバイオティクス細菌の特定の菌株、又は菌株の特定の組合せは、哺乳類に重要な健康上の利益をもたらし得る。本発明のプロバイオティクス組成物は、単離された細菌株ＬａｃｔＸ、ＳｔｒｅｐＸ３、ＳｔｒｅｐＸ１及びこれらの組合せを含む。
本明細書で使用される場合、用語「プレバイオティクス」は消化管内の特定の微生物の増殖を増大させる非消化性の食品成分を指す。「シンバイオティクス」は、少なくとも１つのプロバイオティクスと少なくとも１つのプレバイオティクスを含む組成物である。そのような組成物は、有益な細菌（例えば、プロバイオティクス）の増殖を促進すると理解される。例示的な実施例として、発酵乳製品は、生きた細菌とその餌を含んでいるため、しばしばシンバイオティクスとみなされる。
本明細書で使用される場合、用語「プレバイオティクス」は消化管内の特定の微生物の増殖を増大させる非消化性の食品成分を指す。「シンバイオティクス」は、少なくとも１つのプロバイオティクスと少なくとも１つのプレバイオティクスを含む組成物である。そのような組成物は、有益な細菌（例えば、プロバイオティクス）の増殖を促進すると理解される。例示的な実施例として、発酵乳製品は、生きた細菌とその餌を含んでいるため、しばしばシンバイオティクスとみなされる。
【0011】
本発明は、細菌を用いて、動物、特に農用動物の健康を増進するものである。好ましくは、動物は、家畜、家畜化された動物又はそれ自体は家畜ではない若しくは家畜化されていないが（即ち、野生）家畜動物と同じ種又は属に属する動物である。例えば野性のブタは、家畜のブタと同じ種に属するので、この定義に含まれることになる。処置され得る家畜動物の例としては、限定されるものではないが、イヌ、ネコ及びそれ以外の愛玩動物、ウマ、ウシ、ニワトリ及びそれ以外の家禽、ブタ、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。動物は、農場又は農業用動物であってもよく、これらの動物には、限定されるものではないが、ウマ、ウシ、ニワトリ及びそれ以外の家禽、ブタ、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。より好ましくは、動物は猪豚亜目である。猪豚(Suina)亜目（Suiformesとしても知られる）は、哺乳類の系統であり、イノシシ科及びペッカリー科のブタ及びペッカリーを含む。ブタ(Swine)又はブタ(pig)は、野生又は家畜のいずれでも、特に好ましい。
【0012】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、本来の状態ならば通常付随する成分を実質的又は本質的に含まない材料を指す。例えば、単離された細菌株は、その天然に存在する環境に存在する、天然又は非天然に存在する成分を精製又は除去された細菌株を指す場合がある。
本明細書で使用される場合、用語「体重」（ＢＷ）は、ブタの質量(mass)又は質量(weight)を表し、用語「体重増加」（ＢＷＧ）は、ブタの体重の増加を表す。ブタの体重又は体重増加は、ポンド（ｌｂｓ）で測定され得る。プロバイオティクス組成物を投与されたブタは、プロバイオティクス組成物を投与されなかったブタの体重又は体重増加と比較して、体重又は体重増加の増加を示し得る。
本明細書で使用される場合、用語「飼料要求率(feed conversion ratio)」又は「飼料要求率(feed conversion rate)」は、飼料の体重への変換の測定値である。飼料要求率は、例えば、グラム単位の飼料摂取量をグラム単位のブタの体重増加量で割った商として測定することができる。改善は、飼料要求率の低下として測定される。理論に縛られるものではないが、飼料要求率が改善されたブタは、ブタの吸収能力の変化及び／又はブタの消化管内でより多くの栄養素を利用できることにより、多くの栄養素をより効果的に吸収することができる可能性がある。
本明細書で使用される場合、用語「飼料摂取量」は、定期的な給餌間隔の間に動物によって摂取された飼料の量を含んでもよい。動物の飼料摂取量は、動物によって摂取された飼料の量（例えばグラム単位）として測定されてもよい。動物の飼料摂取量は、動物の体重又は体重増加に対して否定的な影響又は悪影響を及ぼすことなく、プロバイオティクス組成物を含む飼料を提供された動物において減少し得る。飼料摂取量の減少は、プロバイオティクス組成物を含む飼料を提供された動物における体重又は体重増加の増加に対応し得る。
用語「発育速度の増加」、「発育生産の増加」、及び「発育の増大」は、対照ブタ（即ち、同じ条件下で飼育されたが、本発明のプロバイオティクス組成物を投与されなかった比較対象のブタ）の反応と比較して、ブタの体重、体重増加、又は飼料摂取量の増加、若しくは飼料要求率の減少をもたらすプロバイオティクス組成物の能力を指す。「増加」量は、一般に、統計的に有意な量である。
本明細書で使用される場合、用語「体重」（ＢＷ）は、ブタの質量(mass)又は質量(weight)を表し、用語「体重増加」（ＢＷＧ）は、ブタの体重の増加を表す。ブタの体重又は体重増加は、ポンド（ｌｂｓ）で測定され得る。プロバイオティクス組成物を投与されたブタは、プロバイオティクス組成物を投与されなかったブタの体重又は体重増加と比較して、体重又は体重増加の増加を示し得る。
本明細書で使用される場合、用語「飼料要求率(feed conversion ratio)」又は「飼料要求率(feed conversion rate)」は、飼料の体重への変換の測定値である。飼料要求率は、例えば、グラム単位の飼料摂取量をグラム単位のブタの体重増加量で割った商として測定することができる。改善は、飼料要求率の低下として測定される。理論に縛られるものではないが、飼料要求率が改善されたブタは、ブタの吸収能力の変化及び／又はブタの消化管内でより多くの栄養素を利用できることにより、多くの栄養素をより効果的に吸収することができる可能性がある。
本明細書で使用される場合、用語「飼料摂取量」は、定期的な給餌間隔の間に動物によって摂取された飼料の量を含んでもよい。動物の飼料摂取量は、動物によって摂取された飼料の量（例えばグラム単位）として測定されてもよい。動物の飼料摂取量は、動物の体重又は体重増加に対して否定的な影響又は悪影響を及ぼすことなく、プロバイオティクス組成物を含む飼料を提供された動物において減少し得る。飼料摂取量の減少は、プロバイオティクス組成物を含む飼料を提供された動物における体重又は体重増加の増加に対応し得る。
用語「発育速度の増加」、「発育生産の増加」、及び「発育の増大」は、対照ブタ（即ち、同じ条件下で飼育されたが、本発明のプロバイオティクス組成物を投与されなかった比較対象のブタ）の反応と比較して、ブタの体重、体重増加、又は飼料摂取量の増加、若しくは飼料要求率の減少をもたらすプロバイオティクス組成物の能力を指す。「増加」量は、一般に、統計的に有意な量である。
【0013】
ブタの生産を高めるための方法：
本発明は、ブタの発育速度を増加させるための方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載のプロバイオティクス組成物をブタに投与することを含む。
いくつかの実施形態では、発育速度の増加は、対照ブタと比較した場合のブタの体重の増加を含む。本明細書で使用される場合、用語「対照ブタ」は同じ又は同等の条件（例えば飼料、離乳プロトコールなど）下で飼育されたが、本発明のプロバイオティクス組成物を投与されなかった同等のブタ（例えば、同じ品種、性別、及び日齢）を指す。いくつかの実施形態では、ブタの体重が、対照ブタと比較して少なくとも約２％、３％、４％、５％、１０％、１２％、１５％、２０％、又は２５％増加する。
本発明は、ブタの発育速度を増加させるための方法を提供する。これらの方法は、本明細書に記載のプロバイオティクス組成物をブタに投与することを含む。
いくつかの実施形態では、発育速度の増加は、対照ブタと比較した場合のブタの体重の増加を含む。本明細書で使用される場合、用語「対照ブタ」は同じ又は同等の条件（例えば飼料、離乳プロトコールなど）下で飼育されたが、本発明のプロバイオティクス組成物を投与されなかった同等のブタ（例えば、同じ品種、性別、及び日齢）を指す。いくつかの実施形態では、ブタの体重が、対照ブタと比較して少なくとも約２％、３％、４％、５％、１０％、１２％、１５％、２０％、又は２５％増加する。
【0014】
本発明は、ブタの離乳が発育に及ぼす悪影響を緩和するための方法も提供する。本方法は、本明細書に記載のプロバイオティクス組成物をブタに投与することを含む。離乳は、飼料、母体環境、及び収容施設の移行を含む、突然の移行によって特徴付けられる。これらの障害は、しばしば子ブタの下痢、ストレス、飼料摂取量の減少、発育の遅れ、腸内バリア機能の低下、及び病原体に対する感受性増大などを招く。本発明の細菌株は、ブタにおける発育成績を向上させる能力に基づいて選択された。特定の理論に縛られることを望むものではないが、本開示のプロバイオティクス組成物は、機能の中でも消化管機能を改善することによって（例えば、栄養利用率及び／又は飼料要求率の改善を通じて）、発育成績を向上させ得ると考えられる。従って、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、日和見病原菌の過度の増殖を低減し、腸管の炎症を低減し、消化管バリアを越えた細菌の漏出を低減し、下痢を低減し、及び／又は免疫機能を向上させる。腸管機能のこれらの測定は、当技術分野で公知の標準的な技術を用いて評価することができる。実施例で議論されているように、日和見病原菌の増殖は、糞便スワブからＤＮＡを抽出し配列決定（例えば、１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定）を行うことによってモニタリングすることができる。腸管の炎症は、例えば、免疫細胞の浸潤（例えば、Ｔ細胞を標識する免疫組織化学を用いる）又は炎症誘発性サイトカイン遺伝子の発現（例えば、ｑＰＣＲを用いる）を見ることによって評価することができる。バリア機能は、色素浸透アッセイ（例えば、腸漿膜側のＦＩＴＣ－デキストラン濃度の測定）、経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）の測定、密着結合タンパク質の発現レベルの測定、又はグルコース若しくはマンニトールの傍細胞移行性の評価によって評価することができる。
【0015】
更に、本発明は、本明細書に開示される組成物を投与することにより、ブタの出生から市場出荷可能体重までの時間を短縮する方法を提供する。ブタは、飼料が効率的に筋肉に変換されなくなるポイントに到達するまで（即ち、飼料要求率が底値になる）、かなり一貫した速度で飼料を肉に変換する。この時点で、飼料の投下に対するリターンは劇的に低下する。このように、ブタは代謝が変化し、肉の筋肉が迅速につかなくなった時点で理想的な市場体重に達する。ブタの最高体重は市場の需要によって大きく変動し、一般に、１１４～１３１ｋｇ（２５０～３００ポンド）である。いくつかの実施形態では、ブタの最高体重は、約２～５％、約５～１０％、約１０～１５％、約１５～２０％、約２０～２５％、約２５～３０％、約３０～３５％、約３５～４０％、又は４０％より大きく増加する。他の実施形態では、出生から市場出荷可能体重までの時間は、約１～３日、約３～５日、約１週間、約２週間、又は約３週間短縮される。
【0016】
例示的な発育フェーズ又は発育段階の区分及び給餌レジメンは、下記及び実施例に示されている。給餌レジメン及び発育速度はブタの種及び農業条件によって異なることが理解されるが、当業者ならば、本明細書に概説した発育フェーズ及び給餌レジメンと、他の特定の条件との間に類似性を見出し比較することができるであろう。
ブタの生産は、業界では大まかに４つの段階に区分されている。まず、妊娠中の母ブタが妊娠１１０日目頃になると、およそ３～４週間、分娩クレートに移され、そこで母ブタは出産（分娩）し、保護された環境の中で子ブタを育てる。この期間（即ち、誕生から離乳まで）、子ブタは泌乳中の母ブタから母乳を与えられ、「哺乳期フェーズ」にあると言われる。子ブタは約２０日齢（ｄ２０）で離乳（即ち、母ブタから離し、固形飼料を給餌）する。離乳後、子ブタは育成施設に移され、８～１０週間の「育成期フェーズ」で体重は８～２５ｋｇになる。肥育前期（２５～７１ｋｇ）及び肥育後期（７１～１３０ｋｇ）と呼ばれる、ブタの生産の最後の２段階において、ブタは市場体重に達するまで給餌される。通常、ブタは生後約６ヵ月齢で市場体重に達する。「屠蓄前の期間」には、これらの４つの段階（即ち、哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期）が全て含まれる。
ブタの生産は、業界では大まかに４つの段階に区分されている。まず、妊娠中の母ブタが妊娠１１０日目頃になると、およそ３～４週間、分娩クレートに移され、そこで母ブタは出産（分娩）し、保護された環境の中で子ブタを育てる。この期間（即ち、誕生から離乳まで）、子ブタは泌乳中の母ブタから母乳を与えられ、「哺乳期フェーズ」にあると言われる。子ブタは約２０日齢（ｄ２０）で離乳（即ち、母ブタから離し、固形飼料を給餌）する。離乳後、子ブタは育成施設に移され、８～１０週間の「育成期フェーズ」で体重は８～２５ｋｇになる。肥育前期（２５～７１ｋｇ）及び肥育後期（７１～１３０ｋｇ）と呼ばれる、ブタの生産の最後の２段階において、ブタは市場体重に達するまで給餌される。通常、ブタは生後約６ヵ月齢で市場体重に達する。「屠蓄前の期間」には、これらの４つの段階（即ち、哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期）が全て含まれる。
【0017】
実施例１において、本発明者らは動物試験１及び２において、それぞれ７段階及び８段階の給餌レジメンを実施した。動物試験１において用いた７段階のレジメンは、３つの育成期フェーズ（ＮＰ１：ｄ２０～３３；ＮＰ２：ｄ３３～５０；ＮＰ３：ｄ５０～６１）を含む育成期、２つの肥育前期フェーズ（ＧＰ１：ｄ６１～９０；ＧＰ２：ｄ９０～１１６）を含む肥育前期、及び２つの肥育後期フェーズ（ＦＰ１：ｄ１１６～１４６；ＦＰ２：ｄ１４６～１７４）を含む肥育後期からなる。個々のブタの体重（ＢＷ）及び直腸スワブは、哺乳期フェーズの３時点（ｄ０、ｄ１１、及びｄ２０）、育成期の各フェーズの終了時（ｄ２７、ｄ３３、ｄ４１、ｄ５０、及びｄ６１）、肥育前期の各フェーズの中間及び終了時（ｄ７６、ｄ９０、ｄ１０４、及びｄ１１６）、及び肥育後期の各フェーズの中間及び終了時（ｄ１３０、ｄ１４６、ｄ１５９、及びｄ１７４）に採取した。
動物試験２において用いた８段階のレジメンは、３つの育成期フェーズ（ＮＰ１：ｄ２１～２９；ＮＰ２：ｄ２９～４２；ＮＰ３：ｄ４２～６１）を含む育成期、２つの肥育前期フェーズ（ＧＰ１：ｄ６１～８４；ＧＰ２：ｄ８４～９９）を含む肥育前期、及び３つの肥育後期フェーズ（ＦＰ１：ｄ９９～１３８；ＦＰ２：ｄ１３８～１５９；ＦＰ３：１５９～１８７）を含む肥育後期からなる。この試験では、各ブタに、健康な肥育前期フェーズ２のブタの糞便マイクロバイオータ混合物（ＦＭＴ）を連続２日間（ｄ２１及びｄ２２）、強制経口投与した。個々のブタのＢＷ及び直腸スワブは、離乳時（ｄ２１）及び各フェーズの終了時、具体的には、育成期の付加的な４時点（ｄ２２、ｄ２３、ｄ２９、ｄ４２、及びｄ６１）、肥育前期の２時点（ｄ８４及びｄ９９）、及び肥育後期の３時点（ｄ１３８、ｄ１５９、及びｄ１８３）に採取した。
第３の試験は、動物試験２で発育成績の向上と関連した特定の細菌株（即ち、ＳｔｒｅｐＸ及びＬａｃｔＸ）をブタのプロバイオティクスとして使用する能力を評価するために実施した。この試験では、動物試験１で用いたものと同じ７段階給餌レジメンを用いてブタに給餌した。本試験において、本発明者らは、離乳時、各育成期終了時、及び肥育前期フェーズの２時点（ｄ６６、及びｄ９４）のブタの体重を測定した。実施例２において、本発明者らはこの試験を継続し、屠蓄前の全期間にわたってＳｔｒｅｐＸで処置したブタの発育を評価した。彼らは、離乳時にＳｔｒｅｐＸで処置すると、枝肉特性に影響を及ぼすことなく、抗生物質を投与した場合と比較してブタの発育速度が増加することを実証している。従って、いくつかの実施形態では、ブタの体重が、育成期、肥育前期、及び肥育後期のうちの１つ以上において測定される。
動物試験２において用いた８段階のレジメンは、３つの育成期フェーズ（ＮＰ１：ｄ２１～２９；ＮＰ２：ｄ２９～４２；ＮＰ３：ｄ４２～６１）を含む育成期、２つの肥育前期フェーズ（ＧＰ１：ｄ６１～８４；ＧＰ２：ｄ８４～９９）を含む肥育前期、及び３つの肥育後期フェーズ（ＦＰ１：ｄ９９～１３８；ＦＰ２：ｄ１３８～１５９；ＦＰ３：１５９～１８７）を含む肥育後期からなる。この試験では、各ブタに、健康な肥育前期フェーズ２のブタの糞便マイクロバイオータ混合物（ＦＭＴ）を連続２日間（ｄ２１及びｄ２２）、強制経口投与した。個々のブタのＢＷ及び直腸スワブは、離乳時（ｄ２１）及び各フェーズの終了時、具体的には、育成期の付加的な４時点（ｄ２２、ｄ２３、ｄ２９、ｄ４２、及びｄ６１）、肥育前期の２時点（ｄ８４及びｄ９９）、及び肥育後期の３時点（ｄ１３８、ｄ１５９、及びｄ１８３）に採取した。
第３の試験は、動物試験２で発育成績の向上と関連した特定の細菌株（即ち、ＳｔｒｅｐＸ及びＬａｃｔＸ）をブタのプロバイオティクスとして使用する能力を評価するために実施した。この試験では、動物試験１で用いたものと同じ７段階給餌レジメンを用いてブタに給餌した。本試験において、本発明者らは、離乳時、各育成期終了時、及び肥育前期フェーズの２時点（ｄ６６、及びｄ９４）のブタの体重を測定した。実施例２において、本発明者らはこの試験を継続し、屠蓄前の全期間にわたってＳｔｒｅｐＸで処置したブタの発育を評価した。彼らは、離乳時にＳｔｒｅｐＸで処置すると、枝肉特性に影響を及ぼすことなく、抗生物質を投与した場合と比較してブタの発育速度が増加することを実証している。従って、いくつかの実施形態では、ブタの体重が、育成期、肥育前期、及び肥育後期のうちの１つ以上において測定される。
【0018】
離乳前及び育成期は、ブタの生産にとって重要な時期であり、特に離乳後の最初の２～３週間は重要である。離乳によるストレスは、育成期初期にしばしば発育の遅れをもたらし、それが肥育前期にも及ぶ可能性がある。従って、いくつかの実施形態では、本発明のプロバイオティクス組成物は、この重要なフェーズに観察される発育ラグを緩和、軽減、又は取り除くために投与される。
いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、単回投与でブタに投与される。他の実施形態では、プロバイオティクス組成物のブースター補給は、最初の投与の後に提供される。他の実施形態では、ブースター補給は、追加で１回以上投与される。いくつかの実施形態では、ブタは、プロバイオティクス組成物を継続的に補給される。
いくつかの実施形態では、単回又は最初の投与は、ブタが離乳前の段階、離乳時、又は育成期にある時に行われる。特定の実施形態では、単回又は最初の投与は、ブタが約１～約６１日齢、約１８～約２８日齢、又は約１８～約２２日齢の間にある時に行われる。
いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、単回投与でブタに投与される。他の実施形態では、プロバイオティクス組成物のブースター補給は、最初の投与の後に提供される。他の実施形態では、ブースター補給は、追加で１回以上投与される。いくつかの実施形態では、ブタは、プロバイオティクス組成物を継続的に補給される。
いくつかの実施形態では、単回又は最初の投与は、ブタが離乳前の段階、離乳時、又は育成期にある時に行われる。特定の実施形態では、単回又は最初の投与は、ブタが約１～約６１日齢、約１８～約２８日齢、又は約１８～約２２日齢の間にある時に行われる。
【0019】
上述のように、場合によっては、複数回の投与を介してプロバイオティクス組成物を提供することが有利であろう。実施例において、本発明者らは離乳時（即ち、ブタが約２１日齢の時）にＬａｃｔＸ又はＳｔｒｅｐＸ３を子ブタに連続２日間、強制経口投与し、育成期フェーズ２の終わりに（ｄ５０）最終ブースターを投与した。従って、いくつかの実施形態では、少なくとも１回の付加的な投与は、ブタが育成期又は育成期２の終わりにある時に行われる。特定の実施形態では、少なくとも１回の付加的な投与は、ブタが約４５～約６０日齢の間、又は約４８～約５２日齢の間にある時に行われる。
【0020】
いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物の単回投与後１３～７３日で、又は複数回投与レジメン後１２～７２日で測定可能な改善（即ち、発育速度の増加、日和見病原菌の増殖の低減、腸管の炎症の低減、消化管バリアを越えた細菌の漏出の低減、下痢の低減、及び／又は免疫機能の向上）が認められる。例えば、離乳時に単回投与又は初めての投与を行う場合、育成期フェーズのｄ３４及びｄ５３、及び肥育前期フェーズのｄ６６、及びｄ９４に測定可能な改善を認めることができる。しかしながら、単回投与又は初めての投与が離乳前の段階で行われた場合には、測定可能な改善が発達の早い時点で認められる場合があり、一方、育成期の段階で行われた場合には、測定可能な(measureable)改善が発達の明らかに遅い段階で認められる場合がある。他の実施形態では、測定可能な改善は、出生から市場出荷可能体重までの時間の短縮又はブタの最高体重の増加であり、それは、ブタが最高体重に到達する肥育後期段階に必ず測定される。図２６に示されるように、体重の測定可能な改善は、１０４～１３４日目の間、又は１６２日目までといった発達の後期段階で生じることがある。
【0021】
組成物：
本発明は、１以上の単離された細菌株を含む組成物を提供し、細菌株の少なくとも１つは、ラクトバチルス細菌ＬａｃｔＸ及びストレプトコッカス細菌ＳｔｒｅｐＸ３又はＳｔｒｅｐＸ１から選択される。細菌は、例えば、生きた細菌、死んだ又は不活化された細菌、又は複製能力のない細菌としてなど、いくつかの形態でこれらの組成物に含まれ得る。これらの組成物は、本明細書において「プロバイオティクス組成物」又は「プロバイオティクス製剤」と称される。
本明細書に記載された細菌、即ちＬａｃｔＸ、ＳｔｒｅｐＸ３及びＳｔｒｅｐＸ１は、リボソームＲＮＡ遺伝子配列決定データを用いたＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ［１７］の現在の細菌の分類に基づいて分類された。１６Ｓ ｒＲＮＡ及び２３Ｓ ｒＲＮＡなどのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の配列は、ほぼ全ての生命体に存在するため、試料内に存在する細菌や真菌の、特定や比較によく利用される。細菌の名称や菌株の表示は、より多くの情報が得られるにつれて、時と共に変化することがあることを当業者ならば理解するであろう。従って、本願はこれらの実験が完了した時点でこれらの配列に関連する細菌株の名称に加えて、試料中に検出された特定のリボソーム配列（即ち、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域の配列）も提供するものである。注目すべきは、特徴量２（Ｆ２；配列番号１）として特定された１６ｓ ｒＤＮＡ ｖ４領域が細菌株ＳｔｒｅｐＸ（配列番号２）と関連しており、及び特徴量３５４６（Ｆ３５４６；配列番号３）として特定された１６ｓ ｒＤＮＡ ｖ４領域が細菌株ＬａｃｔＸ（配列番号４）と関連していたことである。
本発明は、１以上の単離された細菌株を含む組成物を提供し、細菌株の少なくとも１つは、ラクトバチルス細菌ＬａｃｔＸ及びストレプトコッカス細菌ＳｔｒｅｐＸ３又はＳｔｒｅｐＸ１から選択される。細菌は、例えば、生きた細菌、死んだ又は不活化された細菌、又は複製能力のない細菌としてなど、いくつかの形態でこれらの組成物に含まれ得る。これらの組成物は、本明細書において「プロバイオティクス組成物」又は「プロバイオティクス製剤」と称される。
本明細書に記載された細菌、即ちＬａｃｔＸ、ＳｔｒｅｐＸ３及びＳｔｒｅｐＸ１は、リボソームＲＮＡ遺伝子配列決定データを用いたＲｉｂｏｓｏｍａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ［１７］の現在の細菌の分類に基づいて分類された。１６Ｓ ｒＲＮＡ及び２３Ｓ ｒＲＮＡなどのリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子の配列は、ほぼ全ての生命体に存在するため、試料内に存在する細菌や真菌の、特定や比較によく利用される。細菌の名称や菌株の表示は、より多くの情報が得られるにつれて、時と共に変化することがあることを当業者ならば理解するであろう。従って、本願はこれらの実験が完了した時点でこれらの配列に関連する細菌株の名称に加えて、試料中に検出された特定のリボソーム配列（即ち、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域の配列）も提供するものである。注目すべきは、特徴量２（Ｆ２；配列番号１）として特定された１６ｓ ｒＤＮＡ ｖ４領域が細菌株ＳｔｒｅｐＸ（配列番号２）と関連しており、及び特徴量３５４６（Ｆ３５４６；配列番号３）として特定された１６ｓ ｒＤＮＡ ｖ４領域が細菌株ＬａｃｔＸ（配列番号４）と関連していたことである。
【0022】
ラクトバチルスは、グラム陽性で通性嫌気性菌又は微好気性菌、桿菌、無芽胞性菌、乳酸菌属を指す。ラクトバチルスは腸管内でバイオフィルムを形成し、厳しい環境条件下でも生存することができる。本明細書で使用される場合、「ＬａｃｔＸ」は１以上の以下の特徴を有するラクトバチルス菌を指す：（ａ）配列番号４の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列；又は（ｂ）寄託受託番号ＮＲＲＬ ＸＸＸＸＸ。
ストレプトコッカスは、グラム陽性の球菌又は球形細菌の属を指す。多くのストレプトコッカスは通性嫌気性菌であり、好気的、嫌気的の両方での生育が可能である。本明細書で使用される場合、「ＳｔｒｅｐＸ３」及び「ＳｔｒｅｐＸ１」は以下の特徴を有するストレプトコッカス細菌を指す：（ａ）配列番号２の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列；又は（ｂ）それぞれ寄託受託番号ＮＲＲＬ ＸＸＸＸＸ又はＮＲＲＬ ＸＸＸＸ。
ストレプトコッカスは、グラム陽性の球菌又は球形細菌の属を指す。多くのストレプトコッカスは通性嫌気性菌であり、好気的、嫌気的の両方での生育が可能である。本明細書で使用される場合、「ＳｔｒｅｐＸ３」及び「ＳｔｒｅｐＸ１」は以下の特徴を有するストレプトコッカス細菌を指す：（ａ）配列番号２の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列；又は（ｂ）それぞれ寄託受託番号ＮＲＲＬ ＸＸＸＸＸ又はＮＲＲＬ ＸＸＸＸ。
【0023】
いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、約１０7～１０10コロニー形成単位（ｃｆｕ）の間の細菌（例えば、１０7～１０10ｃｆｕのＬａｃｔＸ、１０7～１０10ｃｆｕのＳｔｒｅｐＸ３又はＳｔｒｅｐＸ１、又は１０7～１０10ｃｆｕの３つの細菌単離株の組合せ）、約１０8～１０10ｃｆｕの間の細菌、又は約１０8～１０9ｃｆｕの間の細菌を含有する。細菌が動物飼料に含まれる実施形態では、動物飼料は動物飼料１グラム当たり約１×１０7、約１×１０8、約１×１０9又は約１×１０10ｃｆｕの細菌を含み得る。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、１用量当たり約１×１０7、約１×１０8、約１×１０9又は約１×１０10ｃｆｕの細菌を含むように処方されている。１つの特定の実施形態では、プロバイオティクス組成物は１用量当たり約３×１０8ｃｆｕを含むように処方されている。動物飼料は、１つの細菌株又は２つ以上の細菌株の組合せを含むプロバイオティクス組成物を含んでもよい。
本明細書に開示されるプロバイオティクス組成物は、１以上のＬａｃｔＸ、ＳｔｒｅｐＸ１及びＳｔｒｅｐＸ３に加えて、１以上の薬学上許容される賦形剤を含んでもよい。「薬学上許容される」という語句は、本明細書において、健全な農業及び／又は畜産業の基準及び／又は医学／獣医学の判断の範囲内で、毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴う対象の組織と接触して使用するために、妥当なベネフィット／リスク比に相応して適している、それらの化合物、材料、組成物、及び／又は投与形について使用するために採用される。
本明細書に開示されるプロバイオティクス組成物は、１以上のＬａｃｔＸ、ＳｔｒｅｐＸ１及びＳｔｒｅｐＸ３に加えて、１以上の薬学上許容される賦形剤を含んでもよい。「薬学上許容される」という語句は、本明細書において、健全な農業及び／又は畜産業の基準及び／又は医学／獣医学の判断の範囲内で、毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴う対象の組織と接触して使用するために、妥当なベネフィット／リスク比に相応して適している、それらの化合物、材料、組成物、及び／又は投与形について使用するために採用される。
【0024】
本明細書で使用される場合、「薬学上許容される賦形剤」という語句は、対象への投与のために治療用化合物を担持する又は輸送することに関与する、界面活性剤、保存剤、安定剤、香味増強剤、着色剤、ビタミン、栄養素、プレバイオティクス、付加的なプロバイオティクス、液体又は固体増量剤、希釈剤、製造補助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、カルシウム又はステアリン酸亜鉛、又はステアリン酸(steric acid)）、溶媒又は封入剤などの許容される材料、組成物又はビヒクルを指す。各賦形剤は、製剤の他の成分と適合し、対象に害を与えないという意味で「許容される」べきである。農業上許容される担体としては、例えば、鉱物質土類（例えば、シリカ、石灰、炭酸カルシウム、チョーク、粘土など）、及び植物由来の粉砕物（例えば、穀粉、木粉、籾殻、小麦ふすま、セルロース粉末など）が含まれる。好適な界面活性剤は、配合される有効成分の性質に応じて、元より非イオン性、陽イオン性及び／又は陰イオン性のもの、並びに乳化、分散及び湿潤特性を有する界面活性剤混合物であってよい。プロバイオティクス製剤は油（例えば、鉱油）も含んでもよい。薬学上許容される賦形剤として供することができる材料の付加的な例としては：糖類、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；ゼラチン；タルク；蝋；油、例えば、落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及びダイズ油；グリコール類、例えば、エチレングリコール及びプロピレングリコール；ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤；水；等張生理食塩水；ｐＨ緩衝溶液；及び医薬製剤で用いられる他の無毒性適合物質などが挙げられる。所望により、特定の香料及び／又は着色剤を添加することができる。
【0025】
当業者であれば、プロバイオティクス組成物は、その意図された使用、即ち投与経路に従って、日常的に処方されることを認識するであろう。本明細書に開示されるプロバイオティクス組成物、即ち１以上のＬａｃｔＸ及びＳｔｒｅｐＸ３を含む組成物は、乾燥又は液体の形態、経口投与のために処方することができる。例として、本発明の経口プロバイオティクス組成物は、チュアブル製剤、溶解する又は溶解した製剤、カプセル化／コーティング製剤、多層トローチ剤（有効成分及び／又は有効成分と賦形剤を分離するため）、緩徐放出／時限放出製剤の形態、又は当技術分野で公知の経口送達に適した他の形態であってよい。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、及び水性又は非水性溶液又は懸濁液、スプレー、水薬、又はシロップ、冷凍、又は凍結乾燥の形態であってよい。プロバイオティクス製剤はフレーバー付きであってもよく、様々な形状又は色であってもよい。
経口投与のためには、いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は凍結乾燥又は乾燥された形態、例えば、乾燥粉末である。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、水又は有機溶媒に可溶な乾燥粉末として処方されるか、又は加工若しくは製造中に動物飼料に直接添加されてもよい。他の実施形態では、プロバイオティクス組成物は、液体形態、例えば、懸濁液又は溶液である。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、例えば、ペースト、クリーム、ゲル、カプセル、エアゾールスプレー、又は錠剤の形態で処方される。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、強制経口投与又は水薬により送達されるよう処方される。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、消化管内で放出されるように処方されたコーティングで被覆される。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、ブタによって消費される水の中に提供される。
経口投与のためには、いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は凍結乾燥又は乾燥された形態、例えば、乾燥粉末である。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、水又は有機溶媒に可溶な乾燥粉末として処方されるか、又は加工若しくは製造中に動物飼料に直接添加されてもよい。他の実施形態では、プロバイオティクス組成物は、液体形態、例えば、懸濁液又は溶液である。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、例えば、ペースト、クリーム、ゲル、カプセル、エアゾールスプレー、又は錠剤の形態で処方される。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、強制経口投与又は水薬により送達されるよう処方される。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、消化管内で放出されるように処方されたコーティングで被覆される。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、ブタによって消費される水の中に提供される。
【0026】
いくつかの実施形態では、プロバイオティクス組成物は、直接給与生菌組成物を含む。本明細書で使用される場合、「直接給与生菌（ＤＦＭ）」は、飼料を通して供給される生きた（生育可能な）微生物を指す。ＤＦＭ組成物は、動物の飼料に継続的に添加してもよく、特定の発達段階（例えば、離乳時）にボーラス投与してもよい。
プロバイオティクス組成物は、飼料加工前、加工中、又は加工後に、ブタの飼料中に取り入れてもよい。例えば、組成物はペレット化段階の後に飼料製品にまぶされてもよい。重要なことは、飼料に添加される細菌の少なくとも一部は、それらが受ける飼料加工及び調製のあらゆる局面において（例えば、ペレット化段階で用いられる高温への曝露）生き延びることができなければならないことである。
更なる実施形態では、組成物はブタに授乳する母ブタの乳首に適用されるように処方される（例えば、スプレー、クリーム、ペースト、ゲル、液体などとして）。
プロバイオティクス組成物は、飼料加工前、加工中、又は加工後に、ブタの飼料中に取り入れてもよい。例えば、組成物はペレット化段階の後に飼料製品にまぶされてもよい。重要なことは、飼料に添加される細菌の少なくとも一部は、それらが受ける飼料加工及び調製のあらゆる局面において（例えば、ペレット化段階で用いられる高温への曝露）生き延びることができなければならないことである。
更なる実施形態では、組成物はブタに授乳する母ブタの乳首に適用されるように処方される（例えば、スプレー、クリーム、ペースト、ゲル、液体などとして）。
【0027】
本発明の組成物の利点：
子ブタ用として市販されているプロバイオティクス製品はいくつか存在する（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｖ社のＳｙｎＧｅｎＸ（登録商標））。しかし、これらの市販品の多くは、免疫機能及び腸内の健康の向上を目的として設計されており、発育成績を直接的に向上させる能力はまだ実証されていない。更に、ほとんどのプロバイオティクス製品は完全な特徴付けを欠いており、それらの最適な送達時間及び発育成績に対する効果が不明のままである。対照的に、本発明の組成物及び方法は、いくつかの、例示的な、非限定的な利点を提供する：（１）発育成績を向上させ、業界の利益に直接影響する；（２）選択された菌株（例えば、ＳｔｒｅｐＸ）は、ブタの腸内マイクロバイオームの優勢種であり（即ち、ブタの生涯を通じて４番目に多い菌株とされる）、ブタの腸に定着できる可能性が高い；（３）選択された菌株は丈夫で（例えば、胆汁酸及び塩酸に耐えられる）、好気性であり培養が簡単で、製造及び経口投与が比較的容易である。
子ブタ用として市販されているプロバイオティクス製品はいくつか存在する（例えば、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｖ社のＳｙｎＧｅｎＸ（登録商標））。しかし、これらの市販品の多くは、免疫機能及び腸内の健康の向上を目的として設計されており、発育成績を直接的に向上させる能力はまだ実証されていない。更に、ほとんどのプロバイオティクス製品は完全な特徴付けを欠いており、それらの最適な送達時間及び発育成績に対する効果が不明のままである。対照的に、本発明の組成物及び方法は、いくつかの、例示的な、非限定的な利点を提供する：（１）発育成績を向上させ、業界の利益に直接影響する；（２）選択された菌株（例えば、ＳｔｒｅｐＸ）は、ブタの腸内マイクロバイオームの優勢種であり（即ち、ブタの生涯を通じて４番目に多い菌株とされる）、ブタの腸に定着できる可能性が高い；（３）選択された菌株は丈夫で（例えば、胆汁酸及び塩酸に耐えられる）、好気性であり培養が簡単で、製造及び経口投与が比較的容易である。
【実施例】
【0028】
実施例１.発育成績を予測するブタのマイクロバイオーム内細菌の特定
近年、様々な発育段階におけるブタの腸内マイクロバイオームに関する理解が進んでいるにもかかわらず、ブタの生涯（出生から市場まで）にわたる腸内マイクロバイオームの動態に関する包括的な長期的研究は不足している。
この知見のギャップを埋めるために、本発明者らは、哺乳期（０、１１、２０日目）、育成期（２７、３３、４１、５０、６１日目）、肥育前期（７６、９０、１０４、１１６日目）、及び肥育後期（１３０、１４６、１５９、１７４日目）の発達段階にある１８頭のブタから合計２７３本の直腸スワブを採取した。ＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域をターゲットとしたＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑシークエンサーを用いた配列決定に供した。配列はＱＩＩＭＥ２パッケージのＤｅｂｌｕｒアルゴリズムで解析された。ブタの腸内マイクロバイオームには、試験した発達段階を通じて１７の門が検出され、ファーミキューテス門（Firmicutes）及びバクテロイデス門（Bacteroidetes）が最も豊富であった。α多様性は、群集の豊富さ（例えば、観察された特徴量の数）及び多様性（例えば、シャノン指数）として測定され、ブタの生涯を通じて全体的に増加した。異なる発育段階ごとにマイクロバイオーム菌種構成の明確なシフトが観察され、ＬＥｆＳｅ分析により段階特異的な９１の細菌の特徴量が明らかとなった。そこで、本発明者らは有望なプロバイオティクスとして利用可能な発育成績に関連した細菌分類群を特定しようとした。
近年、様々な発育段階におけるブタの腸内マイクロバイオームに関する理解が進んでいるにもかかわらず、ブタの生涯（出生から市場まで）にわたる腸内マイクロバイオームの動態に関する包括的な長期的研究は不足している。
この知見のギャップを埋めるために、本発明者らは、哺乳期（０、１１、２０日目）、育成期（２７、３３、４１、５０、６１日目）、肥育前期（７６、９０、１０４、１１６日目）、及び肥育後期（１３０、１４６、１５９、１７４日目）の発達段階にある１８頭のブタから合計２７３本の直腸スワブを採取した。ＤＮＡを抽出し、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域をターゲットとしたＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑシークエンサーを用いた配列決定に供した。配列はＱＩＩＭＥ２パッケージのＤｅｂｌｕｒアルゴリズムで解析された。ブタの腸内マイクロバイオームには、試験した発達段階を通じて１７の門が検出され、ファーミキューテス門（Firmicutes）及びバクテロイデス門（Bacteroidetes）が最も豊富であった。α多様性は、群集の豊富さ（例えば、観察された特徴量の数）及び多様性（例えば、シャノン指数）として測定され、ブタの生涯を通じて全体的に増加した。異なる発育段階ごとにマイクロバイオーム菌種構成の明確なシフトが観察され、ＬＥｆＳｅ分析により段階特異的な９１の細菌の特徴量が明らかとなった。そこで、本発明者らは有望なプロバイオティクスとして利用可能な発育成績に関連した細菌分類群を特定しようとした。
【0029】
このため、本発明者らはまず、回帰ベースのランダムフォレスト解析を行い、各段階における発育成績を予測する上位５０の細菌特徴量を特定した。これらの発見を検証するために、肥育前期のブタの成熟した糞便マイクロバイオータを離乳期のブタに接種して、糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）を行った。ＦＭＴは発育成績を著しく向上させたが、ブタの腸内マイクロバイオーム全体には変化はなかった。ＦＭＴブタ及びその同腹子において、マイクロバイオームの多様性及び菌種構成における同様の段階特異的パターンが観察され、ブタの腸内マイクロバイオームのより重要な決定要因は飼料（特にトウモロコシ由来の粗繊維）であることも示された。しかし、ストレプトコッカス及びクロストリジウムに関連する細菌を含むいくつかの分類群がＦＭＴブタにおいて豊富であり、これらの細菌が動物の発育成績を促進する役割を担っている可能性が示唆された。従って、この試験は、動物の健康と生産を向上させるために、段階特異的なプロバイオティクスを最適化することの重要性を強調している。
【0030】
材料及び方法：
試験デザイン及び動物
動物試験１（テスト試験）：
ブタは、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）承認のプロトコール＃１９０１７に従って管理した。３頭の母ブタ（経産回数２回）から生まれた１８頭のブタ（ＰＩＣ２９*３８０）より直腸スワブを採取した。これらのブタのうち、１７頭は全ての異なる発育段階を通して追跡調査した。子ブタは、哺乳期には２０日目（ｄ２０）の離乳まで母ブタから母乳を与えられ、その後、敷地外の育成施設に移された。子ブタは、母ブタごとに層別化し、１つの囲いに２頭の同腹の子ブタを収容した。ｄ６１において、同じ囲いにいたブタと共に肥育前期・肥育後期施設にブタを移した。全てのブタに、３つの育成期フェーズ（ＮＰ１：ｄ２０～３３；ＮＰ２：ｄ３３～５０；ＮＰ３：ｄ５０～６１）、２つの肥育前期フェーズ（ＧＰ１：ｄ６１～９０；ＧＰ２：ｄ９０～１１６）、及び２つの肥育後期フェーズ（ＦＰ１：ｄ１１６～１４６；ＦＰ２：ｄ１４６～１７４）の７給餌フェーズレジメンで給餌した。全ての飼料は抗生物質不使用で、飼料中の栄養素はＮＲＣ（２０１２年）の推奨を満たしているか、それ以上であった。個々のブタの体重（ＢＷ）及び直腸スワブは、哺乳期のｄ０、１１、及び２０、育成期の各フェーズの終了時、肥育前期／肥育後期の各フェーズの中間及び終了時に収集した（表１）。
試験デザイン及び動物
動物試験１（テスト試験）：
ブタは、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）承認のプロトコール＃１９０１７に従って管理した。３頭の母ブタ（経産回数２回）から生まれた１８頭のブタ（ＰＩＣ２９*３８０）より直腸スワブを採取した。これらのブタのうち、１７頭は全ての異なる発育段階を通して追跡調査した。子ブタは、哺乳期には２０日目（ｄ２０）の離乳まで母ブタから母乳を与えられ、その後、敷地外の育成施設に移された。子ブタは、母ブタごとに層別化し、１つの囲いに２頭の同腹の子ブタを収容した。ｄ６１において、同じ囲いにいたブタと共に肥育前期・肥育後期施設にブタを移した。全てのブタに、３つの育成期フェーズ（ＮＰ１：ｄ２０～３３；ＮＰ２：ｄ３３～５０；ＮＰ３：ｄ５０～６１）、２つの肥育前期フェーズ（ＧＰ１：ｄ６１～９０；ＧＰ２：ｄ９０～１１６）、及び２つの肥育後期フェーズ（ＦＰ１：ｄ１１６～１４６；ＦＰ２：ｄ１４６～１７４）の７給餌フェーズレジメンで給餌した。全ての飼料は抗生物質不使用で、飼料中の栄養素はＮＲＣ（２０１２年）の推奨を満たしているか、それ以上であった。個々のブタの体重（ＢＷ）及び直腸スワブは、哺乳期のｄ０、１１、及び２０、育成期の各フェーズの終了時、肥育前期／肥育後期の各フェーズの中間及び終了時に収集した（表１）。
【表1】
【0031】
動物試験２（検証試験）：
試験１の発見を検証するため、合計２４頭の離乳ブタ（ＰＩＣ２９*３８０）を選択した。ブタは、母ブタごとにブロック化し、敷地内の育成施設にある４つの囲いのうちの１つに割り当てた（１つの囲いあたりブタ６頭）。離乳日（生後２１日目）に、ブタの半数（ｎ＝１２）に糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）を実施した。ＦＭＴは、肥育前期フェーズ２の成熟健常ブタの直腸マッサージ後に排便された新鮮な糞便を肛門から採取し、その後、ＰＢＳ中２０％グリセロールを入れた孔径０．３３ｍｍの滅菌Ｗｈｉｒｌ－Ｐａｋ（登録商標）フィルターバッグ（Ｎａｓｃｏ Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ）に移し替えた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（商標）４００（Ｓｅｗａｒｄ Ｌｔｄ、ウエストサセックス、ＵＫ）を用いて高速で２分間振盪した後、糞便から細菌細胞を分離した。次に、濾液を５０ｍｌコニカルチューブに移し、－８０℃のフリーザーで保存した。各ブタに３ｍｌの濾液を連続２日間（ｄ２１及びｄ２２）強制経口投与した。本試験では、ブタには合計８つの給餌フェーズレジメンで給餌した：３つの育成期フェーズ（ＮＰ１：ｄ２１～２９；ＮＰ２：ｄ２９～４２；ＮＰ３：ｄ４２～６１）、２つの肥育後期フェーズ（ＧＰ１：ｄ６１～８４；ＧＰ２：ｄ８４～９９）、及び３つの肥育後期フェーズ（ＦＰ１：９９～１３８；ＦＰ２：ｄ１３８～１５９；ＦＰ３：１５９～１８７）。全ての飼料は抗生物質不使用で、ブタの各段階の栄養要求量に関するＮＲＣ（２０１２年）の推奨を満たしているか、それ以上であった。個々のブタの体重（ＢＷ）及び直腸スワブは離乳時及び各フェーズの終了時に収集した（表２）。
試験１の発見を検証するため、合計２４頭の離乳ブタ（ＰＩＣ２９*３８０）を選択した。ブタは、母ブタごとにブロック化し、敷地内の育成施設にある４つの囲いのうちの１つに割り当てた（１つの囲いあたりブタ６頭）。離乳日（生後２１日目）に、ブタの半数（ｎ＝１２）に糞便マイクロバイオータ移植（ＦＭＴ）を実施した。ＦＭＴは、肥育前期フェーズ２の成熟健常ブタの直腸マッサージ後に排便された新鮮な糞便を肛門から採取し、その後、ＰＢＳ中２０％グリセロールを入れた孔径０．３３ｍｍの滅菌Ｗｈｉｒｌ－Ｐａｋ（登録商標）フィルターバッグ（Ｎａｓｃｏ Ｆｏｒｔ Ａｔｋｉｎｓｏｎ、ＷＩ）に移し替えた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（商標）４００（Ｓｅｗａｒｄ Ｌｔｄ、ウエストサセックス、ＵＫ）を用いて高速で２分間振盪した後、糞便から細菌細胞を分離した。次に、濾液を５０ｍｌコニカルチューブに移し、－８０℃のフリーザーで保存した。各ブタに３ｍｌの濾液を連続２日間（ｄ２１及びｄ２２）強制経口投与した。本試験では、ブタには合計８つの給餌フェーズレジメンで給餌した：３つの育成期フェーズ（ＮＰ１：ｄ２１～２９；ＮＰ２：ｄ２９～４２；ＮＰ３：ｄ４２～６１）、２つの肥育後期フェーズ（ＧＰ１：ｄ６１～８４；ＧＰ２：ｄ８４～９９）、及び３つの肥育後期フェーズ（ＦＰ１：９９～１３８；ＦＰ２：ｄ１３８～１５９；ＦＰ３：１５９～１８７）。全ての飼料は抗生物質不使用で、ブタの各段階の栄養要求量に関するＮＲＣ（２０１２年）の推奨を満たしているか、それ以上であった。個々のブタの体重（ＢＷ）及び直腸スワブは離乳時及び各フェーズの終了時に収集した（表２）。
【表2】
【0032】
サンプル採取、ＤＮＡ抽出、及び配列決定
動物試験１において、哺乳期（ｄ０、１１、２０）、育成期（ｄ２７、３３、４１、５０、６１）、肥育前期（ｄ７６、９０、１０４、１１６）、及び肥育後期（ｄ１３０、１４６、１５９、及び１７４）に１７頭のブタから合計２７３本の直腸スワブ（Ｐｕｒｉｔａｎ（登録商標）Ｏｐｔｉ－Ｓｗａｂ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｄ Ａｍｉｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＆ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｕｒｉｔａｎ ＬＬＣ、ギルフォード、ＭＥ）を繰り返し採取し、更に哺乳期段階で死亡した１８頭目のブタからサンプル２本を追加採取した。試験２では、試験１で得られた知見を検証するために、哺乳期終了時（ｄ２１）、育成期（ｄ２２、２３、２９、４２、及び６１）、肥育前期（ｄ８４及び９９）、及び肥育後期（ｄ１３８、１５９及び１８３）に、２４頭のブタから合計２４６本の直腸スワブを繰り返し採取した（表２）。これらのスワブは、ＤＮＡ抽出を行うまで－８０℃で保存した。
動物試験１において、哺乳期（ｄ０、１１、２０）、育成期（ｄ２７、３３、４１、５０、６１）、肥育前期（ｄ７６、９０、１０４、１１６）、及び肥育後期（ｄ１３０、１４６、１５９、及び１７４）に１７頭のブタから合計２７３本の直腸スワブ（Ｐｕｒｉｔａｎ（登録商標）Ｏｐｔｉ－Ｓｗａｂ（登録商標）Ｌｉｑｕｉｄ Ａｍｉｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＆ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｕｒｉｔａｎ ＬＬＣ、ギルフォード、ＭＥ）を繰り返し採取し、更に哺乳期段階で死亡した１８頭目のブタからサンプル２本を追加採取した。試験２では、試験１で得られた知見を検証するために、哺乳期終了時（ｄ２１）、育成期（ｄ２２、２３、２９、４２、及び６１）、肥育前期（ｄ８４及び９９）、及び肥育後期（ｄ１３８、１５９及び１８３）に、２４頭のブタから合計２４６本の直腸スワブを繰り返し採取した（表２）。これらのスワブは、ＤＮＡ抽出を行うまで－８０℃で保存した。
【0033】
合計２００μＬの糞便スワブ溶液を使用し、ＰｏｗｅｒＬｙｚｅｒ ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用い、製造業者のプロトコールに従ってＤＮＡ抽出を行った。抽出したＤＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウィルミントン、ＤＥ、ＵＳＡ）を用いて定量し、ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼフリー水を用いて１０ｎｇ／μＬに希釈した。ライブラリーは、公開されたプロトコールに従って構築した［１４］。簡単に述べれば、細菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域を、ユニバーサルプライマー（Ｆ：５’－ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ－３’（配列番号５）及びＲ：５’－ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ－３’（配列番号６））を用いて増幅した。アガロースゲル電気泳動を行いアンプリコンの大きさを確認した。ＰＣＲ産物のクリーンアップと正規化には、ＳｅｑｕａｌＰｒｅｐ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用した。正規化したアンプリコンを等量ずつプールし、それらの質及び量をＡｇｉｌｅｎｔ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）及び定量ＲＴ－ＰＣＲでそれぞれ測定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ２×２５０ｂｐペアードエンドシークエンシング（ＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ｖ２、５００サイクル、２０％ＰｈｉＸ）を使用して、プールしたアンプリコンの配列決定を行った。品質管理のために、ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ増幅の陰性対照、模擬群集（ＺｙｍｏＢＩＯＭＩＣＳ（商標）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｚｙｍｏ、アーバイン、ＣＡ、ＵＳＡ））及び多くのドナーが、各ＭｉＳｅｑの実施に含められた。
【0034】
マイクロバイオームデータの解析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｆａｓｔｑリードをＱＩＩＭＥ２プラットフォーム（バージョン２．４）に取り込み、サンプル内のエラープロファイルに基づき１塩基分解能を得るＤｅｂｌｕｒプログラム［１５］で処理した。Ｄｅｂｌｕｒがノイズ除去した配列は通常、アンプリコンシーケンスバリアント（ＡＳＶ）、完全シーケンスバリアント(exact sequence variants)（ＥＳＶ）、又は準操作的分類単位(sub-operational taxonomic units)（ｓｕｂ－ＯＴＵ）と呼ばれる。本試験において、これらの配列をＡＳＶ、ＥＳＶ、及びｓｕｂ－ＯＴＵと同義である細菌の特徴量に割り当て、異なる特徴量間の配列は１塩基レベルで異なっていた。Ｄｅｂｌｕｒは、異なる試験間で比較できるようなユニークな特徴量を生成する。α及びβ多様性測定におけるシークエンシング深度の影響を最小化するために、各サンプルからのリード数を４，０００に希釈し、それでも平均９７．９０％というＧｏｏｄのカバレッジが得られた。これらの特徴量の分類は、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ参照データベース（１３－８版）の分類器に９９％の類似度で割り当てられた。Ｑｉｉｍｅ２のｑｉｉｍｅ ｖｓｅａｒｃｈ ｃｌｕｓｔｅｒ－ｆｅａｔｕｒｅｓ－ｃｌｏｓｅｄ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅコマンドを用いて特徴量テーブルを作成した。α及びβ多様性の決定と類似性解析（ＡＮＯＳＩＭ）もｑｉｉｍｅ２で実施した。このデータ解析パイプラインは、模擬群集の８つの細菌分類群が各実施で予想通り一貫した相対存在量で検出されたことから示唆されるように、高品質の配列をもたらした。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｆａｓｔｑリードをＱＩＩＭＥ２プラットフォーム（バージョン２．４）に取り込み、サンプル内のエラープロファイルに基づき１塩基分解能を得るＤｅｂｌｕｒプログラム［１５］で処理した。Ｄｅｂｌｕｒがノイズ除去した配列は通常、アンプリコンシーケンスバリアント（ＡＳＶ）、完全シーケンスバリアント(exact sequence variants)（ＥＳＶ）、又は準操作的分類単位(sub-operational taxonomic units)（ｓｕｂ－ＯＴＵ）と呼ばれる。本試験において、これらの配列をＡＳＶ、ＥＳＶ、及びｓｕｂ－ＯＴＵと同義である細菌の特徴量に割り当て、異なる特徴量間の配列は１塩基レベルで異なっていた。Ｄｅｂｌｕｒは、異なる試験間で比較できるようなユニークな特徴量を生成する。α及びβ多様性測定におけるシークエンシング深度の影響を最小化するために、各サンプルからのリード数を４，０００に希釈し、それでも平均９７．９０％というＧｏｏｄのカバレッジが得られた。これらの特徴量の分類は、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ参照データベース（１３－８版）の分類器に９９％の類似度で割り当てられた。Ｑｉｉｍｅ２のｑｉｉｍｅ ｖｓｅａｒｃｈ ｃｌｕｓｔｅｒ－ｆｅａｔｕｒｅｓ－ｃｌｏｓｅｄ－ｒｅｆｅｒｅｎｃｅコマンドを用いて特徴量テーブルを作成した。α及びβ多様性の決定と類似性解析（ＡＮＯＳＩＭ）もｑｉｉｍｅ２で実施した。このデータ解析パイプラインは、模擬群集の８つの細菌分類群が各実施で予想通り一貫した相対存在量で検出されたことから示唆されるように、高品質の配列をもたらした。
【0035】
ブタの腸内マイクロバイオームの動態を形成する因子を特定するために、並べ替え多変量分散分析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）を実施した。ＰＥＲＭＡＮＯＶＡは、分布のないアルゴリズムで、ランダム効果、反復測定、及びアンバランスなデータセットに対応する［１６］。ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ分析には、デフォルト設定（ブレイ－カーティス距離と９９９個の並べ替え）で、異なる独立変数（例えば、日齢、性別、飼料）を含むＲのｖｅｇａｎパッケージのａｄｏｎｉｓ関数を使用した。反復測定のためのブタのランダム効果を考慮して、ｓｔｒａｔａ＝ブタＩＤを使用した。段階依存性の特徴量は、デフォルト設定（例えば、ＬＤＡスコア＞２）の線形判別分析（ＬＤＡ）効果量（ＬＥｆＳｅ）を用いて特定した［１７］。発育成績（体重）と相関する細菌の特徴量を特定するために、ランダムフォレストパッケージＲプロジェクトのデフォルト設定を用いて、回帰ベースのランダムフォレストモデルを開発した［１８］。ＬＥｆＳｅは、検証試験において対照群とＦＭＴ群の間で異なる表現を示す細菌の特徴量を特定するためにも使用した。
ネットワーク解析には、組成ネットワークから相関関係を推定することができるＳｐａｒＣＣアルゴリズムを用いた。ネットワークは、Ｒのｉｇｒａｐｈパッケージを用いて、相関係数が０．６を超える、又は－０．６未満のノード（細菌分類群）間を結ぶエッジで示された。クラスターは、Ｇｉｒｖａｎ－Ｎｅｗｍａｎアルゴリズムで算出した媒介中心性に基づいて生成した［１９］。
ネットワーク解析には、組成ネットワークから相関関係を推定することができるＳｐａｒＣＣアルゴリズムを用いた。ネットワークは、Ｒのｉｇｒａｐｈパッケージを用いて、相関係数が０．６を超える、又は－０．６未満のノード（細菌分類群）間を結ぶエッジで示された。クラスターは、Ｇｉｒｖａｎ－Ｎｅｗｍａｎアルゴリズムで算出した媒介中心性に基づいて生成した［１９］。
【0036】
発育成績のデータ解析
データは、ＳＡＳ（Ｃａｒｙ、ＮＣ）の一般線形モデルを用いて、処置を固定効果とする完全ブロックデザインとして解析した。各個のブタを実験単位として用いた。因子レベルの最小二乗平均間の差異を検定するためにＰＤＩＦＦオプションを使用した。
データの利用可能性
本試験で生成及び解析したデータセットは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）リポジトリ、www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/531671（ＳＲＡ受託番号：ＰＲＪＮＡ５３１６７１、２０１９年５月３０日より利用可能）にて公開されている。
データは、ＳＡＳ（Ｃａｒｙ、ＮＣ）の一般線形モデルを用いて、処置を固定効果とする完全ブロックデザインとして解析した。各個のブタを実験単位として用いた。因子レベルの最小二乗平均間の差異を検定するためにＰＤＩＦＦオプションを使用した。
データの利用可能性
本試験で生成及び解析したデータセットは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅａｄ Ａｒｃｈｉｖｅ（ＳＲＡ）リポジトリ、www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/531671（ＳＲＡ受託番号：ＰＲＪＮＡ５３１６７１、２０１９年５月３０日より利用可能）にて公開されている。
【0037】
結果：
出生から市場出荷までのブタの腸内マイクロバイオームの動態
本発明者らはまず、テスト試験において、出生時（ｄ０）から市場出荷時（ｄ１７４）までに採取した合計２７３本の直腸スワブを分析することで、ブタの腸内マイクロバイオームの動態を特徴付けた。１塩基分解能で３，３５８の特徴量から１サンプルあたり平均１０，９１６のリードで、合計２，９８０，３０３の高品質リードを生成した。サンプルリードを４，０００に希釈した後、２７０サンプルからの合計３，２５４の特徴量（合計１，０８０，０００リード）を、ブタ腸内微生物群集動態の下流解析に含めた。配列リード数が４，０００以下の他の３つのサンプルは更なる解析から除外した。
胎便（ｄ０）において、観察された細菌の特徴量の数及びシャノン指数を含む高い微生物多様性が観察され、これは本試験の成ブタの多様性（図１ａ及びｂ）並びに他の試験の母ブタの多様性（図９）と同等であった。高い微生物多様性は１１日目に急激に低下し、離乳前の２０日目に増加した。離乳後に固形飼料を与えたにもかかわらず、育成期の最初の４週間はα多様性に大きな変化は見られなかった。観察期間中（ｄ０を除く）のシャノン指数（Ｈ’、図１ａ）及び観察された特徴量の数（図１ｂ）で示されたように、全体的なα多様性は、育成期の終わりから経時的に増加した。肥育後期においてわずかに増加したにもかかわらず、群集の均等度に大きな変化は見られなかった（図９ｃ）。
ブレイ－カーティス距離（図２ａ）及びジャッカード距離（図１０ａ）に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）プロットでは、哺乳期、育成期、肥育前期及び肥育後期に群集メンバー及び菌種構成の著しいシフトが観察された。０日目のサンプルは、哺乳期の他の２時点（１１日目及び２０日目）のサンプルとは異なっていた。ブタに固形飼料を給餌した場合、育成期、肥育前期及び肥育後期でブタの腸内マイクロバイオームが異なっていた（表３及び４）が、ブタが母ブタから母乳を与えられた哺乳期マイクロバイオーム（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＞０．９７、全ての固形飼料段階と哺乳期の比較でＰ＝０．００１；表３及び図１０ａ）よりも、互いにより類似していた（ＡＮＯＳＩＭ、育成期と肥育前期の比較：Ｒ＝０．４２５；肥育前期と肥育後期の比較：Ｒ＝０．５５４、共にＰ＝０．００１）。
出生から市場出荷までのブタの腸内マイクロバイオームの動態
本発明者らはまず、テスト試験において、出生時（ｄ０）から市場出荷時（ｄ１７４）までに採取した合計２７３本の直腸スワブを分析することで、ブタの腸内マイクロバイオームの動態を特徴付けた。１塩基分解能で３，３５８の特徴量から１サンプルあたり平均１０，９１６のリードで、合計２，９８０，３０３の高品質リードを生成した。サンプルリードを４，０００に希釈した後、２７０サンプルからの合計３，２５４の特徴量（合計１，０８０，０００リード）を、ブタ腸内微生物群集動態の下流解析に含めた。配列リード数が４，０００以下の他の３つのサンプルは更なる解析から除外した。
胎便（ｄ０）において、観察された細菌の特徴量の数及びシャノン指数を含む高い微生物多様性が観察され、これは本試験の成ブタの多様性（図１ａ及びｂ）並びに他の試験の母ブタの多様性（図９）と同等であった。高い微生物多様性は１１日目に急激に低下し、離乳前の２０日目に増加した。離乳後に固形飼料を与えたにもかかわらず、育成期の最初の４週間はα多様性に大きな変化は見られなかった。観察期間中（ｄ０を除く）のシャノン指数（Ｈ’、図１ａ）及び観察された特徴量の数（図１ｂ）で示されたように、全体的なα多様性は、育成期の終わりから経時的に増加した。肥育後期においてわずかに増加したにもかかわらず、群集の均等度に大きな変化は見られなかった（図９ｃ）。
ブレイ－カーティス距離（図２ａ）及びジャッカード距離（図１０ａ）に基づく主座標分析（ＰＣｏＡ）プロットでは、哺乳期、育成期、肥育前期及び肥育後期に群集メンバー及び菌種構成の著しいシフトが観察された。０日目のサンプルは、哺乳期の他の２時点（１１日目及び２０日目）のサンプルとは異なっていた。ブタに固形飼料を給餌した場合、育成期、肥育前期及び肥育後期でブタの腸内マイクロバイオームが異なっていた（表３及び４）が、ブタが母ブタから母乳を与えられた哺乳期マイクロバイオーム（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＞０．９７、全ての固形飼料段階と哺乳期の比較でＰ＝０．００１；表３及び図１０ａ）よりも、互いにより類似していた（ＡＮＯＳＩＭ、育成期と肥育前期の比較：Ｒ＝０．４２５；肥育前期と肥育後期の比較：Ｒ＝０．５５４、共にＰ＝０．００１）。
【表3】
【表4】
【0038】
「コア」及び段階関連マイクロバイオーム
次に、屠蓄前セクションの異なる段階での細菌分類群の到達順序及び時期を検討した。門レベルでは、ファーミキューテス門(Firmicutes)、バクテロイデス門(Bacteroidetes)、プロテオバクテリア門(Proteobacteria)、アクチノバクテリア門(Actinobacteria)を含む合計１９門が観察され、各段階でファーミキューテス門が最も多く、バクテロイデス門がそれに続いた（図１１ａ）。これらの２つの門は、全配列の７０％を占めた。ｓｕｂ－ＯＴＵレベルでは、上位３０種の最も豊富な細菌の特徴量が積み上げ棒グラフで表示されている。これらの上位３０の分類群のうち、１１分類群はプレボテラ(Prevotella)属に属し、ほとんどの段階、特に固形飼料導入後の段階で最も多様で優勢な属であった（図３ａ）。
ブタの腸内マイクロバイオームのメンバーの出現順序と出現時間を図４にまとめた。上位７００の特徴量のうち、１２５の特徴量は、平均相対存在量に基づいて、屠蓄前の生涯を通じて存在し、ブタ消化管の「コア」マイクロバイオーム又は定住菌と定義される。特定の段階のみに出現する特徴量は「段階に関連する」と言われる。例えば、Ｆ２５０（アシネトバクター(Acinetobacter)）は、出生時（ｄ０）のみ観察された。特徴量２０（プレボテラ・ステルコレア(Prevotella stercorea)）は哺乳期に多く見られたが、それ以降の段階では著しく減少した。特徴量７（大腸菌(Escherichia coli)）は、哺乳期に存在し、育成期の終わりまで持続した後、段階的に減少した。他方、プレボテラ・コプリ(Prevotella copri)に関連するＦ３は、固形飼料導入後の最初の育成期終了後に急激に増加した。それ以外の特徴量、例えばＦ４（未分類クロストリジウム）、１０（バクテロイデス ＹＲＣ２２）、及び２７（クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)）など、哺乳期及び育成期にはほとんど見られなかった特徴量が、肥育前期及び肥育後期に急速に増加した（図３ａ）。メガスファエラ(Megaphaera)属、ラクトバチルス属、及びストレプトコッカス属など他の優勢属に属する細菌の特徴量の相対存在量も、様々な時点で変動が見られた（図３ａ及び図１２）。最後に、ある段階で散発的に出現し、後に消失する特徴量を「パッセンジャー」と呼ぶ（図４ｂ）。
次に、屠蓄前セクションの異なる段階での細菌分類群の到達順序及び時期を検討した。門レベルでは、ファーミキューテス門(Firmicutes)、バクテロイデス門(Bacteroidetes)、プロテオバクテリア門(Proteobacteria)、アクチノバクテリア門(Actinobacteria)を含む合計１９門が観察され、各段階でファーミキューテス門が最も多く、バクテロイデス門がそれに続いた（図１１ａ）。これらの２つの門は、全配列の７０％を占めた。ｓｕｂ－ＯＴＵレベルでは、上位３０種の最も豊富な細菌の特徴量が積み上げ棒グラフで表示されている。これらの上位３０の分類群のうち、１１分類群はプレボテラ(Prevotella)属に属し、ほとんどの段階、特に固形飼料導入後の段階で最も多様で優勢な属であった（図３ａ）。
ブタの腸内マイクロバイオームのメンバーの出現順序と出現時間を図４にまとめた。上位７００の特徴量のうち、１２５の特徴量は、平均相対存在量に基づいて、屠蓄前の生涯を通じて存在し、ブタ消化管の「コア」マイクロバイオーム又は定住菌と定義される。特定の段階のみに出現する特徴量は「段階に関連する」と言われる。例えば、Ｆ２５０（アシネトバクター(Acinetobacter)）は、出生時（ｄ０）のみ観察された。特徴量２０（プレボテラ・ステルコレア(Prevotella stercorea)）は哺乳期に多く見られたが、それ以降の段階では著しく減少した。特徴量７（大腸菌(Escherichia coli)）は、哺乳期に存在し、育成期の終わりまで持続した後、段階的に減少した。他方、プレボテラ・コプリ(Prevotella copri)に関連するＦ３は、固形飼料導入後の最初の育成期終了後に急激に増加した。それ以外の特徴量、例えばＦ４（未分類クロストリジウム）、１０（バクテロイデス ＹＲＣ２２）、及び２７（クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)）など、哺乳期及び育成期にはほとんど見られなかった特徴量が、肥育前期及び肥育後期に急速に増加した（図３ａ）。メガスファエラ(Megaphaera)属、ラクトバチルス属、及びストレプトコッカス属など他の優勢属に属する細菌の特徴量の相対存在量も、様々な時点で変動が見られた（図３ａ及び図１２）。最後に、ある段階で散発的に出現し、後に消失する特徴量を「パッセンジャー」と呼ぶ（図４ｂ）。
【0039】
段階に関連する細菌の特徴量は、統計的有意性のみならず生物学的整合性にも注目したアルゴリズムであるＬＥｆＳｅにより特定された［１７］。これらの特徴量の存在量を、ヒートマップで可視化した（図５）。なお、０日目のサンプルはＬＥｆＳｅ分析に含めなかったが、これは、胎便マイクロバイオームは１１日目及び２０日目の典型的な哺乳期マイクロバイオームと著しく異なり、段階特異的なデータに偏りが生じる可能性があるためである。ＬＥｆＳｅ分析により、上記の観測結果のほとんどが確認された。例えば、いずれの分類群もプレボテラ属に属すにも関わらず、Ｆ２０は哺乳期に関連する細菌と分類されたのに対し、Ｆ３は育成期に特異的であった。注目すべきは、コアマイクロバイオームメンバーは屠蓄前セクション全体を通じて存続しているものの、その存在は段階特異的なパターンも示していることである。例えば、メガスファエラ（Ｆ１）及びストレプトコッカス・ルテシア(Streptococcus luteciae)（Ｆ２）はｄ０から試験終了まで検出されたが、その存在量は哺乳期段階には相対的に少なかった。その存在量は、育成期フェーズ１から増加し始め、育成期３終了時及び肥育前期にピークとなり、その後減少し始めるという単峰性のパターンを示した（図５及び図１２）。
ＳｐａｒＣＣアルゴリズムを用いたネットワーク解析でも、細菌の特徴量間の、段階に関連する相互作用が示された（図６）。ネットワーク内には、段階に関連する特徴量が互いに結びつけられた３つの大きなクラスターが観察された。黄色と緑色のクラスターは、それぞれ哺乳期及び肥育後期に関連するノード（細菌の特徴量）を結び、ピンク色のクラスターは、Ｆ３（プレボテラ・コプリ）及び２２（ペプトストレプトコッカス科(Peptostreptococcaceae)）の２つのハブノードによってこれら２つのクラスターをつなぐ橋渡し役となっている。育成期及び肥育前期において豊富な細菌の特徴量は、このクラスターに分類された。
ＳｐａｒＣＣアルゴリズムを用いたネットワーク解析でも、細菌の特徴量間の、段階に関連する相互作用が示された（図６）。ネットワーク内には、段階に関連する特徴量が互いに結びつけられた３つの大きなクラスターが観察された。黄色と緑色のクラスターは、それぞれ哺乳期及び肥育後期に関連するノード（細菌の特徴量）を結び、ピンク色のクラスターは、Ｆ３（プレボテラ・コプリ）及び２２（ペプトストレプトコッカス科(Peptostreptococcaceae)）の２つのハブノードによってこれら２つのクラスターをつなぐ橋渡し役となっている。育成期及び肥育前期において豊富な細菌の特徴量は、このクラスターに分類された。
【0040】
段階に関連するブタの腸内マイクロバイオームの検証
次に、第２の動物試験（即ち、検証試験；動物試験２）で、段階に関連するブタの腸内マイクロバイオームを検証した。離乳時に１２頭のブタに、肥育前期ブタ（肥育前期フェーズ２）から単離した成熟腸内マイクロバイオータを接種した。対照群の同腹子と比較すると、ＦＭＴレシピエントは、育成期フェーズ２（０．３０対０．２５ｋｇ、Ｐ＝０．０８７）、肥育前期フェーズ１（０．６０対０．５３ｋｇ、Ｐ＝０．０４２）、肥育後期フェーズ１（１．０５対０．９ｋｇ、Ｐ＝０．０６８）、及び肥育後期フェーズ２（０．９８対０．８１ｋｇ、Ｐ＝０．０１８）で、平均日増体重（ＡＤＧ）が大きかったが、肥育前期フェーズ２（０．７５対０．９６ｋｇ、Ｐ＝０．０４２）ではそうではなかった。統計的に有意ではなかったが、ＦＭＴブタは２回目の試験終了時に２．３ｋｇ重く、その温枝肉質量（ＨＣＷ）は同腹のブタより３．５ｋｇ重かった（Ｐ＝０．０９、図７）。
腸内マイクロバイオームの発達における同様のパターンは、検証試験においても対照群及びＦＭＴ群の両方で観察された。α多様性は、両群とも離乳時（ｄ２１）から肥育後期終了まで増加傾向を維持した（図１ｃ～ｆ）。固形飼料の導入は、ブタの腸内マイクロバイオームをすぐには変化させなかった。育成期の最初の２日間（ｄ２２及び２３）のマイクロバイオータは、離乳期に採取したものと共になおクラスター化していた（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＜０．１、Ｐ＞０．０５；表５）。固形飼料摂取８日後の、育成期フェーズ１終了時のｄ２９に群集の菌種構成の有意な変化が観察され（表５、図２ｂ及びｃ）、動物試験１と一致した（図２ａ）。一般に、ブタの腸内マイクロバイオームには、個々の動物試験でも、それらを組み合わせた場合でも、明確なクラスターが観察された（図２ｄ及び図１０ｄ）。ＦＭＴは動物の発育成績を向上させたが、ブタの腸内マイクロバイオームを劇的に変化させることはなかった（図１３）。ｄ４２（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＝０．２４、Ｐ＜０．０５）及びｄ６１（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＝０．１６、Ｐ＜０．０５）には、ブタの腸内マイクロバイオームのわずかな変化しか観察されなかった。
次に、第２の動物試験（即ち、検証試験；動物試験２）で、段階に関連するブタの腸内マイクロバイオームを検証した。離乳時に１２頭のブタに、肥育前期ブタ（肥育前期フェーズ２）から単離した成熟腸内マイクロバイオータを接種した。対照群の同腹子と比較すると、ＦＭＴレシピエントは、育成期フェーズ２（０．３０対０．２５ｋｇ、Ｐ＝０．０８７）、肥育前期フェーズ１（０．６０対０．５３ｋｇ、Ｐ＝０．０４２）、肥育後期フェーズ１（１．０５対０．９ｋｇ、Ｐ＝０．０６８）、及び肥育後期フェーズ２（０．９８対０．８１ｋｇ、Ｐ＝０．０１８）で、平均日増体重（ＡＤＧ）が大きかったが、肥育前期フェーズ２（０．７５対０．９６ｋｇ、Ｐ＝０．０４２）ではそうではなかった。統計的に有意ではなかったが、ＦＭＴブタは２回目の試験終了時に２．３ｋｇ重く、その温枝肉質量（ＨＣＷ）は同腹のブタより３．５ｋｇ重かった（Ｐ＝０．０９、図７）。
腸内マイクロバイオームの発達における同様のパターンは、検証試験においても対照群及びＦＭＴ群の両方で観察された。α多様性は、両群とも離乳時（ｄ２１）から肥育後期終了まで増加傾向を維持した（図１ｃ～ｆ）。固形飼料の導入は、ブタの腸内マイクロバイオームをすぐには変化させなかった。育成期の最初の２日間（ｄ２２及び２３）のマイクロバイオータは、離乳期に採取したものと共になおクラスター化していた（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＜０．１、Ｐ＞０．０５；表５）。固形飼料摂取８日後の、育成期フェーズ１終了時のｄ２９に群集の菌種構成の有意な変化が観察され（表５、図２ｂ及びｃ）、動物試験１と一致した（図２ａ）。一般に、ブタの腸内マイクロバイオームには、個々の動物試験でも、それらを組み合わせた場合でも、明確なクラスターが観察された（図２ｄ及び図１０ｄ）。ＦＭＴは動物の発育成績を向上させたが、ブタの腸内マイクロバイオームを劇的に変化させることはなかった（図１３）。ｄ４２（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＝０．２４、Ｐ＜０．０５）及びｄ６１（ＡＮＯＳＩＭ、Ｒ＝０．１６、Ｐ＜０．０５）には、ブタの腸内マイクロバイオームのわずかな変化しか観察されなかった。
【表5】
【0041】
コアマイクロバイオームについては、上位７００の特徴量のうち、動物試験２の対照群及びＦＭＴ群から、それぞれ１４７及び１２５の特徴量が特定された。更に、これらのコアマイクロバイオームの特徴量のうち６９は、３群のブタ（試験１、試験２－対照群、及び試験２－ＦＭＴ群（図１４））で共有されていた。更に、対照群（Ｎ＝３１）及びＦＭＴ群（Ｎ＝３２）共に、第２の試験でも段階に関連するブタの腸内マイクロバイオームの特徴量を示した（図１５）。これらの特徴量のうち、２つ（Ｆ８７及びＦ１０１）、６つ（Ｆ１６、Ｆ４０、Ｆ５９、Ｆ１１７、Ｆ１２８及びＦ１４３）、４つ（Ｆ１７０、Ｆ１１４、Ｆ３８８及びＦ４５３）、並びに３つ（Ｆ１８、Ｆ１９５、及びＦ３３３）の特徴量が、それぞれ哺乳期、育成期、肥育前期、及び肥育後期においてテスト試験群と検証試験対照群の間で共有されていた。
【0042】
飼料がブタの段階特異的腸内マイクロバイオームを形成する
段階に関連するブタの腸内マイクロバイオーム構築の基礎にあるメカニズムを解明するために、並べ替え多変量分散分析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）を実施した。日齢、体重、飼料、性別、個々のブタ、及び母ブタなどの因子を検討した。飼料は、テスト試験の哺乳期（母乳）、育成期（ＮＰ１、ＮＰ２、及びＮＰ３）、肥育前期（ＧＰ１及びＧＰ２）、及び肥育後期（ＦＰ１及びＦＰ２）の飼料の８つのカテゴリーを含むカテゴリー変数として使用した。本発明者らは、ブタの腸内マイクロバイオームの形成に最も重要な因子を決定するため、一連のモデルを開発した。まず、単変量モデルを用いてＰＥＲＭＡＮＯＶＡを施行した。飼料、日齢、及び体重は全て、ブタの腸内マイクロバイオームを形成する重要な因子であり、約３５％の変動は飼料に起因した。ブタの個体差（ブタＩＤ）もブタの腸内マイクロバイオームの変動の約１２％を説明したが、性別及び母ブタはブタの腸内マイクロバイオームにほとんど影響を与えなかった（表６ａ）。日齢と体重は高い相関があったことから、以降の多変量モデルではＢＷを除外した。飼料は多変量モデルにおいて最も重要な因子であり、Ｆ値は２２．２であり、変動の約３５％を説明した（表６ｂ）。
飼料中のどの栄養素がブタの腸内マイクロバイオームに最も寄与しているかを調べるための別の多変量モデルで、飼料を中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、粗繊維、粗タンパク質、及び粗脂肪を含む異なる成分に分解した（表６ｃ）。母乳中の栄養素は測定しなかったため、哺乳期のサンプルは以降のモデルから除外した。飼料は新しいモデルでも最も重要な変数であり、変動の約３４％を説明した（表７ａ）。ＮＤＦはブタの腸内マイクロバイオームの形成において最も重要な飼料栄養素であった。具体的には、トウモロコシ由来のＮＤＦが最も強い効果を示し、擬似Ｆ値は６６で変動の約１９％を説明し、次いでダイズ由来のＮＤＦ（Ｆ＝２０、Ｒ2＝０．０６）及びＤＤＧＳ（Ｆ＝１０、Ｒ2＝０．０３）であった（表７ｂ）。
段階に関連するブタの腸内マイクロバイオーム構築の基礎にあるメカニズムを解明するために、並べ替え多変量分散分析（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ）を実施した。日齢、体重、飼料、性別、個々のブタ、及び母ブタなどの因子を検討した。飼料は、テスト試験の哺乳期（母乳）、育成期（ＮＰ１、ＮＰ２、及びＮＰ３）、肥育前期（ＧＰ１及びＧＰ２）、及び肥育後期（ＦＰ１及びＦＰ２）の飼料の８つのカテゴリーを含むカテゴリー変数として使用した。本発明者らは、ブタの腸内マイクロバイオームの形成に最も重要な因子を決定するため、一連のモデルを開発した。まず、単変量モデルを用いてＰＥＲＭＡＮＯＶＡを施行した。飼料、日齢、及び体重は全て、ブタの腸内マイクロバイオームを形成する重要な因子であり、約３５％の変動は飼料に起因した。ブタの個体差（ブタＩＤ）もブタの腸内マイクロバイオームの変動の約１２％を説明したが、性別及び母ブタはブタの腸内マイクロバイオームにほとんど影響を与えなかった（表６ａ）。日齢と体重は高い相関があったことから、以降の多変量モデルではＢＷを除外した。飼料は多変量モデルにおいて最も重要な因子であり、Ｆ値は２２．２であり、変動の約３５％を説明した（表６ｂ）。
飼料中のどの栄養素がブタの腸内マイクロバイオームに最も寄与しているかを調べるための別の多変量モデルで、飼料を中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、粗繊維、粗タンパク質、及び粗脂肪を含む異なる成分に分解した（表６ｃ）。母乳中の栄養素は測定しなかったため、哺乳期のサンプルは以降のモデルから除外した。飼料は新しいモデルでも最も重要な変数であり、変動の約３４％を説明した（表７ａ）。ＮＤＦはブタの腸内マイクロバイオームの形成において最も重要な飼料栄養素であった。具体的には、トウモロコシ由来のＮＤＦが最も強い効果を示し、擬似Ｆ値は６６で変動の約１９％を説明し、次いでダイズ由来のＮＤＦ（Ｆ＝２０、Ｒ2＝０．０６）及びＤＤＧＳ（Ｆ＝１０、Ｒ2＝０．０３）であった（表７ｂ）。
【表6-1】
【表6-2】
【表6-3】
【表7】
【0043】
ＰＣｏＡプロットはブタの腸内マイクロバイオームに対するこれらの因子の影響も一貫して示している。ブレイ－カーティス距離に基づくＰＣｏＡプロットでは、飼料による８つの明確なクラスターが形成された。ＰＣｏＡプロットでは性別又は母ブタによる明らかなクラスター化は観察されなかった（図１６）。腸内マイクロバイオームの一般的な遷移パターンが個々のブタで観察されたが、異なる段階で群集菌種構成の顕著なブタ間差が示された（図１７）。
更に、ブタの腸内マイクロバイオータの構築に優先効果、即ち、種の到来の順番及びタイミングが何らかの役割を果たすかどうかを評価するため、初期段階のマイクロバイオームメンバーの後期段階への寄与を測定するｓｏｕｒｃｅｔｒａｃｋｅｒを実施した。ブタの腸内マイクロバイオームのうち、初期の時点に由来するものはごくわずかであり、哺乳期のマイクロバイオームのうち、ｄ０サンプルに由来するものはわずか３％であった。更に、ブタに固形飼料を導入した場合、哺乳期のマイクロバイオームは育成期の腸内マイクロバイオームに対して８％しか寄与していなかった。一方、固形飼料を摂取した場合、育成期及び肥育前期のマイクロバイオームは後期段階のマイクロバイオームに大きく寄与した。肥育前期のマイクロバイオームは、８９％がその後の肥育後期に寄与し、そのメンバーの８１％が育成期に由来していた（図１８）。
更に、ブタの腸内マイクロバイオータの構築に優先効果、即ち、種の到来の順番及びタイミングが何らかの役割を果たすかどうかを評価するため、初期段階のマイクロバイオームメンバーの後期段階への寄与を測定するｓｏｕｒｃｅｔｒａｃｋｅｒを実施した。ブタの腸内マイクロバイオームのうち、初期の時点に由来するものはごくわずかであり、哺乳期のマイクロバイオームのうち、ｄ０サンプルに由来するものはわずか３％であった。更に、ブタに固形飼料を導入した場合、哺乳期のマイクロバイオームは育成期の腸内マイクロバイオームに対して８％しか寄与していなかった。一方、固形飼料を摂取した場合、育成期及び肥育前期のマイクロバイオームは後期段階のマイクロバイオームに大きく寄与した。肥育前期のマイクロバイオームは、８９％がその後の肥育後期に寄与し、そのメンバーの８１％が育成期に由来していた（図１８）。
【0044】
各段階における発育成績に関連する細菌分類群
次に、潜在的プロバイオティクスとして使用される発育成績に関連する細菌分類群を同定することを目指した。この目的のために、まず体重（ＢＷ）を結果とし、テスト試験の各発育段階の上位５００の細菌の特徴量を予測因子として、回帰ベースのランダムフォレストを施行した。各段階での発育成績を予測する細菌の特徴量上位５０を図８に示す。これらの特徴量には、コアマイクロバイオームと段階特異的マイクロバイオームの両方のメンバーが含まれる。例えば、Ｆ１及びＦ２は哺乳期及び育成期の発育成績関連の特徴量として挙げられ、一方、Ｆ４は肥育前期の細菌であった。酪酸産生菌である特徴量２７（クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum））は、Ｆ４及びＦ２６と共に肥育前期及び肥育後期においてＢＷと正の相関を示した（ｄ１４６を除く）。さらに、Ｆ１８及びＦ１９は日齢の高いブタ（それぞれｄ９０～１７４及びｄ１１６～１７４）においてＢＷと正の相関があった。
興味深いことに、肥育前期ドナーからのＦＭＴは、育成期のブタの腸内マイクロバイオームを変化させなかったが、即ち、ドナーの腸内マイクロバイオームの大部分はレシピエントに定着しなかったが、発育成績は向上させた。ＬＥｆＳｅによる個々の細菌の特徴量のより深い分析により、ｄ４２及びｄ６１で、ＦＭＴによって濃縮された、Ｆ２（ｄ４２のみ）、Ｆ４１、Ｆ４５４、Ｆ３０９及びＦ３４８を含むいくつかの特徴量が同定された（図１９）。これらの特徴量の相対存在量は、その後ＦＭＴ後の時点で増加した（図２０）。特に、Ｆ２及びＦ４５４はそれぞれ肥育前期と育成期のＢＷと相関のある上位の特徴量に挙げられている（図２１）。
次に、潜在的プロバイオティクスとして使用される発育成績に関連する細菌分類群を同定することを目指した。この目的のために、まず体重（ＢＷ）を結果とし、テスト試験の各発育段階の上位５００の細菌の特徴量を予測因子として、回帰ベースのランダムフォレストを施行した。各段階での発育成績を予測する細菌の特徴量上位５０を図８に示す。これらの特徴量には、コアマイクロバイオームと段階特異的マイクロバイオームの両方のメンバーが含まれる。例えば、Ｆ１及びＦ２は哺乳期及び育成期の発育成績関連の特徴量として挙げられ、一方、Ｆ４は肥育前期の細菌であった。酪酸産生菌である特徴量２７（クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum））は、Ｆ４及びＦ２６と共に肥育前期及び肥育後期においてＢＷと正の相関を示した（ｄ１４６を除く）。さらに、Ｆ１８及びＦ１９は日齢の高いブタ（それぞれｄ９０～１７４及びｄ１１６～１７４）においてＢＷと正の相関があった。
興味深いことに、肥育前期ドナーからのＦＭＴは、育成期のブタの腸内マイクロバイオームを変化させなかったが、即ち、ドナーの腸内マイクロバイオームの大部分はレシピエントに定着しなかったが、発育成績は向上させた。ＬＥｆＳｅによる個々の細菌の特徴量のより深い分析により、ｄ４２及びｄ６１で、ＦＭＴによって濃縮された、Ｆ２（ｄ４２のみ）、Ｆ４１、Ｆ４５４、Ｆ３０９及びＦ３４８を含むいくつかの特徴量が同定された（図１９）。これらの特徴量の相対存在量は、その後ＦＭＴ後の時点で増加した（図２０）。特に、Ｆ２及びＦ４５４はそれぞれ肥育前期と育成期のＢＷと相関のある上位の特徴量に挙げられている（図２１）。
【0045】
発育成績を向上させるブタプロバイオティクスの単離及び検証
本試験で同定された、段階特異的な、成長を促進する細菌には、養豚業で使用できる有望なプロバイオティクス候補となる菌株がいくつか含まれている。例えば、有望な候補の一つであるＳｔｒｅｐＸは（その関連する特徴量から、本明細書では「Ｆ２」とも呼ばれる）、１６Ｓ リボソームＲＮＡのＶ４領域の配列決定及びＧｒｅｅｎｇｅｎｅデータベースに基づき、ファーミキューテス門、ストレプトコッカス属、ルテシア(luteciae)種に属す菌株である。ＳｔｒｅｐＸはＦＭＴにより濃縮されるだけではなく、ブタの腸管内で４番目に多い特徴量としてもランク付けされている。更に、ＳｔｒｅｐＸは、本発明者らのこれまでの異なる条件下での研究のうち４つにおいて同定された。例えば、ＳｔｒｅｐＸは、ブタをアイソレーターで飼育し、代用乳とクリープフィードを与えた研究の発育成績良好群において豊富に認められた。
本試験で同定された、段階特異的な、成長を促進する細菌には、養豚業で使用できる有望なプロバイオティクス候補となる菌株がいくつか含まれている。例えば、有望な候補の一つであるＳｔｒｅｐＸは（その関連する特徴量から、本明細書では「Ｆ２」とも呼ばれる）、１６Ｓ リボソームＲＮＡのＶ４領域の配列決定及びＧｒｅｅｎｇｅｎｅデータベースに基づき、ファーミキューテス門、ストレプトコッカス属、ルテシア(luteciae)種に属す菌株である。ＳｔｒｅｐＸはＦＭＴにより濃縮されるだけではなく、ブタの腸管内で４番目に多い特徴量としてもランク付けされている。更に、ＳｔｒｅｐＸは、本発明者らのこれまでの異なる条件下での研究のうち４つにおいて同定された。例えば、ＳｔｒｅｐＸは、ブタをアイソレーターで飼育し、代用乳とクリープフィードを与えた研究の発育成績良好群において豊富に認められた。
【0046】
将来のプロバイオティクス単離に向けて、ブタ腸内細菌の大部分を保存するため、４つの異なる日齢（ｄ２０、６１、１１６及び１７４）のブタ３頭から、培地、酸素、及び血液瓶のプレインキュベーションの組合せを変えた計７６種類の培養方法を用いて、繰り返し糞便マイクロバイオームの培養を行った。３～５日間の培養後、各プレートから全てのコロニーを集め、２０％グリセロールで個別に－８０℃で保存した。各培養細胞液の５０μＬのアリコートを、Ｍｉｓｅｑを用いて配列決定し、培養可能な細菌のカタログを作成した。この方法を用いて、ｄ１１６又はｄ１７４のブタから３株のＳｔｒｅｐＸ菌株及び２株のラクトバチルス（ＬａｃｔＸ）菌株を、改変Ｇｉｆｕ嫌気性培地（ＭＧＡＭ；ＨｙＳｅｒｖｅ社製）寒天平板を用いて３７℃好気性条件下で培養して単離し、ＳａｎｇｅｒＤＮＡシークエンシングを用いて１６ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を決定することにより菌株の同一性を検証した。
次に、２つのＳｔｒｅｐＸ菌株及び１つのラクトバチルス（ＬａｃｔＸ）菌株が２％ｗ／ｖのブタ胆汁中で３時間のインキュベーションに耐えられることを明らかにした。この能力は、これらの菌株が消化管内で生存するのに役立ち、直接給与プロバイオティクスの良い候補となる。
次に、２つのＳｔｒｅｐＸ菌株及び１つのラクトバチルス（ＬａｃｔＸ）菌株が２％ｗ／ｖのブタ胆汁中で３時間のインキュベーションに耐えられることを明らかにした。この能力は、これらの菌株が消化管内で生存するのに役立ち、直接給与プロバイオティクスの良い候補となる。
【0047】
ブタプロバイオティクスのｉｎ ｖｉｖｏ検証
次に、２つのＳｔｒｅｐＸ菌株及び１つのＬａｃｔＸ株を、動物試験１で使用したのと同じ７段階給餌レジメンを用いて給餌した生存ブタで評価した。ＭＧＡＭ培養液中で保存した各単離菌株の純粋培養物を遠心分離し、２０％グリセロールを含むＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液をＯＤ０．２５に調整し、およそ１０8細胞／ｍＬの密度とした。これらの純粋培養物は使用するまで－８０℃で保存した。離乳期のブタを合計４８頭選択し、対照、ＳｔｒｅｐＸ１、ＳｔｒｅｐＸ３又はＬａｃｔＸのいずれか（処置／菌株あたり１２頭）を、各菌株溶液又はビヒクル（２０％グリセロールを含むＰＢＳ）３ｍＬとして連続２日間、強制経口投与した。ブースターの水薬は、育成期２の終了時に投与した。離乳時から肥育前期のフェーズ１までの、個々のブタの体重及び囲いでの飼料摂取量をモニタリングした。注目すべきは、離乳時にＳｔｒｅｐＸ３又はＬａｃｔＸのいずれかを強制経口投与した子ブタは、育成期及び肥育前期フェーズ１を通じて、対照群のブタよりも体重が重かったことである（表８及び図２４）。具体的には、ＳｔｒｅｐＸ３を強制経口投与した子ブタは、育成期フェーズの３４、５３、及び６６日目に体重が０．８３キログラム（１．８４ポンド）（１５．３％）、２．８９キログラム（６．３７ポンド）（２５．８％）、及び３．１３キログラム（６．８９ポンド）（１５．９％）増加し、肥育前期フェーズ１終了時には体重が約１０．４０キログラム（約２２．９２ポンド）（２６．２％）増加しており、一方、ＬａｃｔＸを強制経口投与した子ブタは、育成期フェーズの３４、５３、及び６６日目に体重が１．１３キログラム（２．５ポンド）（２０．９％）、３．５８キログラム（７．８９ポンド）（３２．０％）、及び４．２５キログラム（９．３８ポンド）（２１．６％）増加し、肥育前期フェーズ１の終了時には体重が約６．００キログラム（約１３．２２ポンド）（１５．１％）増加した。
次に、２つのＳｔｒｅｐＸ菌株及び１つのＬａｃｔＸ株を、動物試験１で使用したのと同じ７段階給餌レジメンを用いて給餌した生存ブタで評価した。ＭＧＡＭ培養液中で保存した各単離菌株の純粋培養物を遠心分離し、２０％グリセロールを含むＰＢＳに再懸濁させた。この細胞懸濁液をＯＤ０．２５に調整し、およそ１０8細胞／ｍＬの密度とした。これらの純粋培養物は使用するまで－８０℃で保存した。離乳期のブタを合計４８頭選択し、対照、ＳｔｒｅｐＸ１、ＳｔｒｅｐＸ３又はＬａｃｔＸのいずれか（処置／菌株あたり１２頭）を、各菌株溶液又はビヒクル（２０％グリセロールを含むＰＢＳ）３ｍＬとして連続２日間、強制経口投与した。ブースターの水薬は、育成期２の終了時に投与した。離乳時から肥育前期のフェーズ１までの、個々のブタの体重及び囲いでの飼料摂取量をモニタリングした。注目すべきは、離乳時にＳｔｒｅｐＸ３又はＬａｃｔＸのいずれかを強制経口投与した子ブタは、育成期及び肥育前期フェーズ１を通じて、対照群のブタよりも体重が重かったことである（表８及び図２４）。具体的には、ＳｔｒｅｐＸ３を強制経口投与した子ブタは、育成期フェーズの３４、５３、及び６６日目に体重が０．８３キログラム（１．８４ポンド）（１５．３％）、２．８９キログラム（６．３７ポンド）（２５．８％）、及び３．１３キログラム（６．８９ポンド）（１５．９％）増加し、肥育前期フェーズ１終了時には体重が約１０．４０キログラム（約２２．９２ポンド）（２６．２％）増加しており、一方、ＬａｃｔＸを強制経口投与した子ブタは、育成期フェーズの３４、５３、及び６６日目に体重が１．１３キログラム（２．５ポンド）（２０．９％）、３．５８キログラム（７．８９ポンド）（３２．０％）、及び４．２５キログラム（９．３８ポンド）（２１．６％）増加し、肥育前期フェーズ１の終了時には体重が約６．００キログラム（約１３．２２ポンド）（１５．１％）増加した。
【表8】
【0048】
α多様性
ブタの屠蓄前の生存期間中に、腸内マイクロバイオームのα群集多様性及び豊富さが全体的に増加する傾向が観察され、以前の研究と一致していた［１０、１２］。商業用ブタにおいて、離乳前の１０日目から離乳後の２１日目にかけての豊富さと多様性の増加が示された［１２］。群集の多様性（シャノン指数）はｄ１４６でプラトーに達したが、豊富さ指数（観察された特徴量の数）は、ブタが食肉処理に出荷される実験終了まで増加し続けた。ｄ１７４の高いα多様性は、母ブタのそれと極めて類似しており、市場出荷前にブタの腸内マイクロバイオームが完全に発達していることを示している。本発明者らの研究では、市場出荷前の最終サンプル採取日に腸内マイクロバイオームの多様性の低下は観察されなかったが、これは過去の報告と矛盾する。Ｈａｎ（２０１８）は、飼料に抗生物質を補給した場合、ｄ６３からα多様性の低下が始まることを観察した［１３］。最近の研究では、Ｄｅ Ｒｏｄａｓら（２０１８）が、出生時からｄ８４まで、消化管に沿った異なる場所でα多様性が増加したことを報告した。興味深いことに、彼らは市場出荷サンプルにおいても多様性の低下を観察していた［１１］。なお、彼らの研究では、本発明者らの研究と同様に、ブタに抗生物質を含まない飼料を給餌しているが、育成期には医薬品レベルの亜鉛を補給していた。従って、α多様性に関するこれらの研究間の違いは、亜鉛レベルが高いことに起因している可能性がある。ヒトのマイクロバイオームの多様性は、幼年期から群集が成熟する成人期にかけて増加し、その後安定した状態を保つが、加齢と共に減少する。これはおそらく、食事、歯列、投薬、及び腸内生態系の生理学の変化によるものであろう［２０］。家畜ブタの寿命は２０年にも及ぶが、本研究及び多くの商業農場で飼育されている屠蓄前のブタは、主に食用として育てられ、屠殺前の６～７か月間のみ飼育されている。そのため、ブタの腸内マイクロバイオームがいつプラトー状態になるのか、ブタの腸内マイクロバイオームが加齢に伴ってどのように変化するのかを見極めることは困難である。それでも、エンドポイントのブタの腸内マイクロバイオームの多様性は母ブタのそれと同等であり、ブタの腸内マイクロバイオームは、肥育後期の後に成熟することを示唆している。
ブタの屠蓄前の生存期間中に、腸内マイクロバイオームのα群集多様性及び豊富さが全体的に増加する傾向が観察され、以前の研究と一致していた［１０、１２］。商業用ブタにおいて、離乳前の１０日目から離乳後の２１日目にかけての豊富さと多様性の増加が示された［１２］。群集の多様性（シャノン指数）はｄ１４６でプラトーに達したが、豊富さ指数（観察された特徴量の数）は、ブタが食肉処理に出荷される実験終了まで増加し続けた。ｄ１７４の高いα多様性は、母ブタのそれと極めて類似しており、市場出荷前にブタの腸内マイクロバイオームが完全に発達していることを示している。本発明者らの研究では、市場出荷前の最終サンプル採取日に腸内マイクロバイオームの多様性の低下は観察されなかったが、これは過去の報告と矛盾する。Ｈａｎ（２０１８）は、飼料に抗生物質を補給した場合、ｄ６３からα多様性の低下が始まることを観察した［１３］。最近の研究では、Ｄｅ Ｒｏｄａｓら（２０１８）が、出生時からｄ８４まで、消化管に沿った異なる場所でα多様性が増加したことを報告した。興味深いことに、彼らは市場出荷サンプルにおいても多様性の低下を観察していた［１１］。なお、彼らの研究では、本発明者らの研究と同様に、ブタに抗生物質を含まない飼料を給餌しているが、育成期には医薬品レベルの亜鉛を補給していた。従って、α多様性に関するこれらの研究間の違いは、亜鉛レベルが高いことに起因している可能性がある。ヒトのマイクロバイオームの多様性は、幼年期から群集が成熟する成人期にかけて増加し、その後安定した状態を保つが、加齢と共に減少する。これはおそらく、食事、歯列、投薬、及び腸内生態系の生理学の変化によるものであろう［２０］。家畜ブタの寿命は２０年にも及ぶが、本研究及び多くの商業農場で飼育されている屠蓄前のブタは、主に食用として育てられ、屠殺前の６～７か月間のみ飼育されている。そのため、ブタの腸内マイクロバイオームがいつプラトー状態になるのか、ブタの腸内マイクロバイオームが加齢に伴ってどのように変化するのかを見極めることは困難である。それでも、エンドポイントのブタの腸内マイクロバイオームの多様性は母ブタのそれと同等であり、ブタの腸内マイクロバイオームは、肥育後期の後に成熟することを示唆している。
【0049】
β多様性：ブタの腸内マイクロバイオームを形成する因子
本研究は、異なる発育段階にある同一セットのブタから経時的に糞便サンプルを採取することにより、ブタの出生から市場出荷までの腸内マイクロバイオームの包括的な遷移像を示す。このような研究デザインにより、ブタの腸内マイクロバイオームに関する、１）ブタの腸内マイクロバイオームは異なる発育段階において経時的にどのように変化するのか、２）これらの変化の根本的な決定要因は何かという、いくつかの重要な生態学的疑問点を解決することができた。
本研究は、異なる発育段階にある同一セットのブタから経時的に糞便サンプルを採取することにより、ブタの出生から市場出荷までの腸内マイクロバイオームの包括的な遷移像を示す。このような研究デザインにより、ブタの腸内マイクロバイオームに関する、１）ブタの腸内マイクロバイオームは異なる発育段階において経時的にどのように変化するのか、２）これらの変化の根本的な決定要因は何かという、いくつかの重要な生態学的疑問点を解決することができた。
【0050】
本研究では、２つの異なる動物試験で得られた３群のブタの間で、異なる発育段階に沿ったブタの腸内マイクロバイオームの一貫した遷移パターンが示された。出生時、胎便サンプルは、他の２つの哺乳期サンプルよりも幅広い群集の多様性を示した。ブタに母乳を与えた場合、ｄ１１及びｄ２０に、群集多様性の劇的な低下と群集菌種構成の著しい変化が観察された。子宮内環境が無菌状態であるかどうかは、ヒトのマイクロバイオーム領域で議論のある問題となっている。ブタが初乳を吸う可能性のある分娩後６時間以内に胎便サンプルを採取した。従って、初乳や、母ブタの乳首の皮膚又は環境からの細菌が生後に定着する可能性は除外できない。しかしながら、胎便サンプルが黒色で粘着性があり、他の哺乳期糞便サンプルと大きく異なっていたこと、及び胎便マイクロバイオームが１１及び２０日目の糞便マイクロバイオームと著しく異なっていたことから、胎便マイクロバイオームは、他のソースからの細菌によって急速に定着したというよりも、母ブタから垂直伝播した可能性が高い。本発明者らの研究では、胎便の細菌バイオマスは低く、ＤＮＡ濃度も非常に低い（１０ｎｇ／μｌ以下）ものの、胎便マイクロバイオームは、陰性対照、及び模擬群集とは異なることから、汚染の結果とは考えにくいことが示される（図２２）。従って、本発明者らのデータは、胎便サンプルが、その後の時点におけるブタの腸内マイクロバイオームの発達を促す、又は生後の自然免疫応答及び適応免疫応答を教育するための播種菌として機能し得る多様な微生物を（低菌量ながら）保有していることを示している［２１］。初乳及び母乳の摂取は、消化管の形態、免疫機能、及び腸内マイクロバイオームの発達には不可欠である。母乳中のオリゴ糖、アミノ酸、及び脂肪などの栄養素は、消化酵素及び化学物質の分泌を活性化し、マイクロバイオーム定着のために腸管の生態系を変化させる［２２］。ｄ１１の群集の多様性の劇的な減少は、生後１０日間の腸管の生態系は、高度に多様な微生物定着に対応していないことを示す。
【0051】
ｄ２０（哺乳期終了時）及びｄ２７（離乳後７日）の間にも群集の菌種構成に大きな変化が見られたが、これは離乳期のストレス及び／又は固形飼料の導入に起因すると思われる。離乳期のストレスには、飼料や及び環境の変化、母ブタからの分離などがあり、一般に飼料摂取量及び発育成績の低下、並びに下痢の高い発生率をもたらす［２３］。ストレスは、免疫及び内分泌系に影響を与える様々な程度の微生物異常の一因となることが報告されている［２４］。離乳移行期には飼料が大きな課題となり、消化管の物理的及び代謝的の両方の再構築を引き起こす。母乳は非常に口当たりが良く、消化が良いのに対し、飼料は粗く、固形で味が劣り、消化もあまり良くない［２５］。固形飼料への急激な移行は、短期間の絨毛委縮及び陰窩の過形成を誘発し、その結果、消化効率及び腸の完全性が損なわれる。「漏出しやすい」腸管は、病原体の侵入及び栄養素の損失を増加させる可能性がある。
離乳後７日目には、群集の菌種構成及び組成の両方に劇的な変化が観察された。ブレイ－カーティス及びジャッカードに基づくＰＣｏＡプロットでは、哺乳期と育成期のマイクロバイオームが完全に分離された明確なクラスターが示された。興味深いことに、このようなマイクロバイオームの大きな変化は１日では起きなかった。本発明者らの検証試験では、最初の２日間（ｄ２２及び２３）に採取したマイクロバイオームは哺乳期終了期（ｄ２１）のサンプルと区別がつかなかった。試験１のｄ２７のサンプルと試験２のｄ２９のサンプルが哺乳期終了時のｄ２０のサンプルと区別できたことから、ブタの腸内マイクロバイオームが新たな飼料と腸内生理に適応するには７～９日間かかると推測される。
離乳後７日目には、群集の菌種構成及び組成の両方に劇的な変化が観察された。ブレイ－カーティス及びジャッカードに基づくＰＣｏＡプロットでは、哺乳期と育成期のマイクロバイオームが完全に分離された明確なクラスターが示された。興味深いことに、このようなマイクロバイオームの大きな変化は１日では起きなかった。本発明者らの検証試験では、最初の２日間（ｄ２２及び２３）に採取したマイクロバイオームは哺乳期終了期（ｄ２１）のサンプルと区別がつかなかった。試験１のｄ２７のサンプルと試験２のｄ２９のサンプルが哺乳期終了時のｄ２０のサンプルと区別できたことから、ブタの腸内マイクロバイオームが新たな飼料と腸内生理に適応するには７～９日間かかると推測される。
【0052】
ブタの腸内マイクロバイオームは、宿主の遺伝的特徴、日齢、飼料、環境、体重、健康状態、及び抗生物質などの複数の因子によって左右される。経時的な研究は、動物が自身の対照として機能し、多くの交絡因子が考慮されることを考えれば、強力である。しかしながら、ブタの腸内マイクロバイオームではこれらの因子の多くが相関関係にあることを考えれば、こうした研究では、どれが主要なドライバーなのかを特定することは困難である。例えば、ブタの日齢が上がると、体重、飼育環境、及び飼料の種類もそれに応じて変化する。従って、ＰＥＲＭＡＮＯＶＡモデルでは、飼料、性別、母ブタの由来、ブタＩＤと共に日齢のみを変数として選択した。飼料は、間違いなく、ブタの腸内マイクロバイオームを形成する最も重要な因子であった。特にトウモロコシＮＤＦは、ブタの腸内マイクロバイオーム形成に最も強い影響を及ぼした。ＮＤＦにはリグニン、ヘミセルロース、及びセルロースなど、植物細胞内の構造成分の大半が含まれているが、これらはブタでは消化できず、結果としてブタの腸内マイクロバイオータによる発酵のために結腸に送られることになる。本発明者らのデータは、先行研究と一致している。Ｆｒｅｓｅら（２０１５）は、ブタに固形飼料を導入した後、消化管の異化経路が母乳由来のグリカン代謝から植物のグリカン分解と消費に移行したことを報告した［２６］。本発明者らの以前の知見では、哺乳期に固形飼料と共に代用乳を与えられた新生ブタは、母ブタの母乳を与えられた同腹子とは異なる微生物群集菌種構成を有することが示されており、同齢のブタの腸内マイクロバイオームに飼料が大きく影響することが示唆された［６］。同様に、Ｂｉａｎら（２０１６）も、日齢及び飼料が腸内マイクロバイオームの遷移に与える影響が母ブタの遺伝的特徴を上回ることを指摘している［２７］。
日齢はブタの腸内マイクロバイオームに影響を与えるもう１つの因子である。日齢は身体的成熟の指標であり、代謝、免疫、ホルモン分泌、筋肉や骨の発達、及び神経系における包括的な機能的変化を伴う［２８、２９］。これらの日齢に依存する生物学的変化は全て、マイクロバイオーム菌種構成の変化を生じさせる［３０～３２］。
日齢はブタの腸内マイクロバイオームに影響を与えるもう１つの因子である。日齢は身体的成熟の指標であり、代謝、免疫、ホルモン分泌、筋肉や骨の発達、及び神経系における包括的な機能的変化を伴う［２８、２９］。これらの日齢に依存する生物学的変化は全て、マイクロバイオーム菌種構成の変化を生じさせる［３０～３２］。
【0053】
ブタの腸内マイクロバイオームの「コア」メンバー、定住菌、パッセンジャー、及び起源
この研究により、１）コアとなる腸内マイクロバイオームは何か、２）どの細菌分類群が、出生から市場出荷までの屠蓄前の全期間に持続して存続する定住菌であるか、３）どの細菌が、ある時点にのみ存在するパッセンジャーであるか、４）ブタの腸内マイクロバイオームの起源は何か（例えば、母ブタ、飼料、環境など）を含む、ブタの腸内マイクロバイオームに関連するいくつかの他の重要な生物学的疑問にも取り組むことができた。
２つの動物試験で、これらの細菌分類群は全ての時点で各群の少なくとも１頭のブタに存在していたという定義に基づき、合計６９のコアマイクロバイオームのメンバーが３群のブタの間で共有されていた。注目すべきは、これらのメンバーのサブセット（６９のうち１３）が、出生から市場出荷までの少なくとも１５０日間、ブタの少なくとも５０％に存在していたことである。これらのメンバーには、特徴量１、５、８、９、１３、１７、２３、４６、５０、６２、７７、１１２、及び１３２が含まれる。これらの特徴量のうち、５つ（特徴量１、５、１７、６２、及び１３２）はｄ０（胎便）を含む全ての時点で検出され、これらの細菌分類群が母ブタから垂直伝播していることが示された。これらの特徴量は、ブタの腸内に早期に定着した菌株であり、母ブタの母乳に基づく哺乳期から固形飼料に基づく育成期、肥育前期及び肥育後期まで、屠蓄前の全生涯を通じて存続した。
この研究により、１）コアとなる腸内マイクロバイオームは何か、２）どの細菌分類群が、出生から市場出荷までの屠蓄前の全期間に持続して存続する定住菌であるか、３）どの細菌が、ある時点にのみ存在するパッセンジャーであるか、４）ブタの腸内マイクロバイオームの起源は何か（例えば、母ブタ、飼料、環境など）を含む、ブタの腸内マイクロバイオームに関連するいくつかの他の重要な生物学的疑問にも取り組むことができた。
２つの動物試験で、これらの細菌分類群は全ての時点で各群の少なくとも１頭のブタに存在していたという定義に基づき、合計６９のコアマイクロバイオームのメンバーが３群のブタの間で共有されていた。注目すべきは、これらのメンバーのサブセット（６９のうち１３）が、出生から市場出荷までの少なくとも１５０日間、ブタの少なくとも５０％に存在していたことである。これらのメンバーには、特徴量１、５、８、９、１３、１７、２３、４６、５０、６２、７７、１１２、及び１３２が含まれる。これらの特徴量のうち、５つ（特徴量１、５、１７、６２、及び１３２）はｄ０（胎便）を含む全ての時点で検出され、これらの細菌分類群が母ブタから垂直伝播していることが示された。これらの特徴量は、ブタの腸内に早期に定着した菌株であり、母ブタの母乳に基づく哺乳期から固形飼料に基づく育成期、肥育前期及び肥育後期まで、屠蓄前の全生涯を通じて存続した。
【0054】
固形飼料導入後、いくつかの新たに定着する菌株が出現し、存続した。これらの特徴量には、特徴量３、６、１２、５２、６３、及び１５３が含まれる。特に、Ｆ３及びＦ５２はｄ０サンプルでも検出され、哺乳期には消失し、その後、育成期に固形飼料を補給した後に再出現した。従って、これらの分類群も同様に垂直伝播していたと考えられるが、哺乳期には検出できないレベルまで抑制され、栄養素及び環境がより有利になると増殖した。これらの特徴量の多くはプレボテラ属に属し、これは固形飼料段階のほとんどの時点でブタの腸内マイクロバイオームで最大の属であった。プレボテラ属のメンバーは、植物性食品に基づく飼料及び繊維の消化に関連している［３３］。興味深いことに、この属の中の存在量と動態には、ｓｕｂ－ＯＴＵレベルの有意な差が観察された。例えば、プレボテラ・コプリのメンバー（特徴量３、６、１４、及び３６）は、育成期に増殖し、その後の段階では漸減したが、未分類のプレボテラの特徴量（例えば、Ｆ９）はブタの消化管の定住菌の１つであり、哺乳期から肥育後期終了時まで存在した。Ｐ．コプリがヒトの健康において果たす役割については議論の余地があった。最近の研究では、Ｄｅ Ｆｉｌｉｐｐｉｓら（２０１９）がメタゲノム研究によってＰ．コプリの特徴的な株を検出し、食事が特徴的なＰ．コプリ集団を選択する可能性を示した［３４］。欧米型の食生活をしている人で薬物代謝に関わる遺伝子が豊富であったのに対し、繊維が豊富な食事をとっている人では複合糖質分解に関わる遺伝子が豊富であった［３４］。育成期の繊維質を多く含む固形飼料の導入により、Ｐ．コプリの存在量の増加を少なくとも部分的に説明することができる。Ｐ．コプリと同様に、メガスファエラ(Megaspheara)（Ｆ１）、及びブラウティア(Blautia)（Ｆ１６）のメンバーも離乳後に増加し、これは以前の報告とも一致する［１２］。プレボテラと同様に、メガスファエラ(Megaspheara)、及びブラウティアのメンバーも、炭水化物を効率的に分解することができる［３５～３７］。このため、離乳後のブタに植物性炭水化物飼料を与えると、これらの微生物が増殖した。
【0055】
肥育前期の後半には、後期定着菌が出現し、肥育後期全体を通じて存続した。これらの後期定着菌には、特徴量４、１０、１８、及び１９が含まれる。パッセンジャーとは、屠蓄前セクションの初期又は中期に出現し、後期段階には消失又はフェードアウトした細菌分類群を指す。大腸菌（Ｆ７）に関連するメンバーは、パッセンジャーのカテゴリーに属す。これまでのブタの離乳期［３８～４０］及びヒトの乳幼児の腸内マイクロバイオーム研究［４１、４２］と同様に、大腸菌は出生時（ｄ０）及び哺乳期に多かったが、離乳以降は段階的に減少し、これは免疫系の成熟又は他の細菌による抑制によるものである可能性があった。粘液は食物媒介性病原体を結合し、宿主から遠ざけるという重要な役割を担っており、粘膜の物理的構造は年齢に依存している［４３、４４］。未熟な動物における粘液の病原体結合親和性は、成熟動物よりも低い［４５］。
【0056】
有望なプロバイオティクス
細菌の代謝特性は飼料変換率に直接相関し、宿主の栄養供給に寄与する。飼料効率を向上させるために腸内マイクロバイオームを調節することは、畜産業における新たな戦略となっている。本発明者らの研究では、成ブタのＢＷと最も正の相関を示す上位の細菌分類群を特定した。特徴量２６はツリシバクター(Turicibacter)と関連しており、ｄ９０、１０４、１１６、１３０、１５９、及び１７４のＢＷと正の相関が認められた。特に、ツリシバクターは宿主の免疫に関係し、宿主の消化管の生理的条件に敏感であることが注目される。免疫不全マウスでは、野生型対応マウスに比べてツリシバクターの個体数が少なかった［４６、４７］。更に、ツリシバクターは、血液抗原の合成を担う血液群糖転移酵素β－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ｇａｌｎｔ２）の発現が欠損したマウスにおいて、サルモネラ感染症に対する感受性を低下させることができた。従って、ツリシバクターはブタのマイクロバイオーム免疫相互作用において何らかのプラスの役割を果たし、その結果、発育成績の向上を促進している可能性がある。
細菌の代謝特性は飼料変換率に直接相関し、宿主の栄養供給に寄与する。飼料効率を向上させるために腸内マイクロバイオームを調節することは、畜産業における新たな戦略となっている。本発明者らの研究では、成ブタのＢＷと最も正の相関を示す上位の細菌分類群を特定した。特徴量２６はツリシバクター(Turicibacter)と関連しており、ｄ９０、１０４、１１６、１３０、１５９、及び１７４のＢＷと正の相関が認められた。特に、ツリシバクターは宿主の免疫に関係し、宿主の消化管の生理的条件に敏感であることが注目される。免疫不全マウスでは、野生型対応マウスに比べてツリシバクターの個体数が少なかった［４６、４７］。更に、ツリシバクターは、血液抗原の合成を担う血液群糖転移酵素β－１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ４ｇａｌｎｔ２）の発現が欠損したマウスにおいて、サルモネラ感染症に対する感受性を低下させることができた。従って、ツリシバクターはブタのマイクロバイオーム免疫相互作用において何らかのプラスの役割を果たし、その結果、発育成績の向上を促進している可能性がある。
【0057】
特徴量２７は、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃ．ブチリカム）のメンバーで、ｄ１３０、１５９、及び１７４でＢＷと正の相関があり、Ｃ．ブチリカムは、家畜及び消化管上皮維持に最も有効なエネルギー源となる酪酸を産生する。離乳期の子ブタの飼料へのＣ．ブチリカムの補給は、下痢スコアを低下させ、腸絨毛の高さが増すことが報告されている［４８］。肥育前期－肥育後期のブタにブチリカムを補給すると、エネルギー変換率が向上することが示された［４９］。更に、Ｃ．ブチリカムは、消化管の免疫抑制の調節にも関与している。Ｃｈｅｎら［４８］は、離乳期のＣ．ブチリカムの補給が、粘膜ＩＬ－１０の増加及び血漿中腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αの減少によって示される炎症誘発性応答を抑制することを示した［４８］。従って、Ｃ．ブチリカムは、より多くのエネルギーを供給すること、及び／又は免疫系を改善することによって発育成績を向上させ得る。特徴量４及び１８は、全てクロストリジウムに関連している。これらの分類群は後期段階（肥育前期－肥育後期）に増殖し、ＢＷと正の相関があった。特に、Ｆ４はこれらの段階で顕著に多かったことに注目される（ｄ１７４で約８％）。特徴量４及び１８は、最後７回のサンプル採取日のほぼ全てで、ＢＷと正の相関が認められた。
【0058】
特徴量２（ストレプトコッカス）及び４５４（ラクトバチルス・ムコーサエ(Lactobacillus mucosae)）は、最初の動物試験において育成期フェーズの発育関連分類群として特定された。第２の検証試験では、ＦＭＴは全体の群集の菌種構成を大きく変化させることはなかったが、動物の発育成績は改善された。興味深いことに、これらの２つの特徴量の両方の存在量がＦＭＴによって増加したことから、これらの特徴量が定着し、動物の発育を促進する役割を担っている可能性が示唆された。ラクトバチルス・ムコーサエはブタから粘液結合活性を有するものが初めて単離された［５０］。この群のメンバーは、上皮の透過性を低下させ、バリア機能を改善することが報告されている。別の独立した研究では、アイソレーターでクリープ飼料を用いて飼育したブタの群において、発育成績の向上が認められた。その研究では、Ｆ２は高成績群においても豊富であった（図２３）［６］。発育成績における機能を証明するためには、これらのＦ２菌株を単離してブタにフィードバックする試験が必要であるが、これら３つの試験の全てで本発明者らのデータは、Ｆ２が強力なプロバイオティクス候補であることを裏付けている。
【0059】
結論
ブタは最も重要なタンパク源であると同時に、ヒトの疾患の優れた生物医学的モデルであることから、ブタの腸内マイクロバイオームはますます注目を集めている。近年の研究により、ブタの腸内マイクロバイオームに関する我々の理解は目覚ましく進んでいるが、多くの重要な生態学上の疑問がまだ残されている。本研究において、本発明者らはテスト動物試験でブタの全ての異なる発育段階にわたる経時的な動態を特徴づけ、検証試験でこれらの発見を検証した。
本発明者らは、両方の動物試験において、異なる発育段階に沿ったブタの腸内マイクロバイオーム菌種構成の変化について、一貫したパターンを観察した。飼料、特にトウモロコシのＮＤＧは、ブタの腸内マイクロバイオームの主要な推進因子であった。本発明者らは、２つの動物試験に共通する６９のコアマイクロバイオームメンバーを特定し、ブタ腸管の定住菌、パッセンジャー、早期定着菌及び後期定着菌も特定した。菌種の到来の順序と時期、即ち優先効果は、固形飼料を導入した後期発育段階においてより顕著であった。ＦＭＴはレシピエントの腸内マイクロバイオームを有意に変化させなかったが、少数の細菌分類群を富化させ、発育成績の向上と相関があった。
本発明者らの研究は、ブタの腸内マイクロバイオームにおける重要な生態学的疑問のいくつかに答え、動物の健康と生産の向上を目指した研究の基礎となる。
ブタは最も重要なタンパク源であると同時に、ヒトの疾患の優れた生物医学的モデルであることから、ブタの腸内マイクロバイオームはますます注目を集めている。近年の研究により、ブタの腸内マイクロバイオームに関する我々の理解は目覚ましく進んでいるが、多くの重要な生態学上の疑問がまだ残されている。本研究において、本発明者らはテスト動物試験でブタの全ての異なる発育段階にわたる経時的な動態を特徴づけ、検証試験でこれらの発見を検証した。
本発明者らは、両方の動物試験において、異なる発育段階に沿ったブタの腸内マイクロバイオーム菌種構成の変化について、一貫したパターンを観察した。飼料、特にトウモロコシのＮＤＧは、ブタの腸内マイクロバイオームの主要な推進因子であった。本発明者らは、２つの動物試験に共通する６９のコアマイクロバイオームメンバーを特定し、ブタ腸管の定住菌、パッセンジャー、早期定着菌及び後期定着菌も特定した。菌種の到来の順序と時期、即ち優先効果は、固形飼料を導入した後期発育段階においてより顕著であった。ＦＭＴはレシピエントの腸内マイクロバイオームを有意に変化させなかったが、少数の細菌分類群を富化させ、発育成績の向上と相関があった。
本発明者らの研究は、ブタの腸内マイクロバイオームにおける重要な生態学的疑問のいくつかに答え、動物の健康と生産の向上を目指した研究の基礎となる。
【0060】
参照文献
【0061】
実施例２．肥育前期／肥育後期のブタの発育成績及び枝肉品質に及ぼす細菌の特徴量Ｆ２の影響の評価
実施例１において、本発明者らは、細菌株ＳｔｒｅｐＸ（配列番号２）に関連する細菌の特徴量２（Ｆ２；配列番号１）が、ブタの体重と相関することを発見した（Ｗａｎｇら、２０１９）。この相関関係は、複数の独立した試験での相互検討により検証した。しかし、この細菌が肥育前期／肥育後期のブタの発育成績及び枝肉品質に及ぼす影響は、不明なままであった。
ブタの発育成績に対する直接給与微生物の影響を調べたこれまでの研究では、飼料添加物が発育成績を、抗生物質で達成したものと同等のレベルまで改善する能力に関して、一貫性のない結果が得られている（Ｌｉｕら、２０１８）。発育成績の向上を促すことに加えて、選択したプロバイオティクスが肉質及び食品の安全性に及ぼす影響を理解することは不可欠である（Ｍａｒｋｏｗｉａｋ及びＳｌｉｚｅｗｓｋａ、２０１８）。
Ｆ２の有益な効果をより良く理解するために、実施例１で開始した、育成期のブタにＦ２を補給する試験を継続した。ここでは、Ｆ２補給の発育成績に及ぼす影響を屠蓄前期間全体にわたって評価する。本発明者らは、離乳時のＦ２投与が枝肉特性に影響を与えることなく、抗生物質投与と同程度にブタの発育速度を増加させることを実証した。
実施例１において、本発明者らは、細菌株ＳｔｒｅｐＸ（配列番号２）に関連する細菌の特徴量２（Ｆ２；配列番号１）が、ブタの体重と相関することを発見した（Ｗａｎｇら、２０１９）。この相関関係は、複数の独立した試験での相互検討により検証した。しかし、この細菌が肥育前期／肥育後期のブタの発育成績及び枝肉品質に及ぼす影響は、不明なままであった。
ブタの発育成績に対する直接給与微生物の影響を調べたこれまでの研究では、飼料添加物が発育成績を、抗生物質で達成したものと同等のレベルまで改善する能力に関して、一貫性のない結果が得られている（Ｌｉｕら、２０１８）。発育成績の向上を促すことに加えて、選択したプロバイオティクスが肉質及び食品の安全性に及ぼす影響を理解することは不可欠である（Ｍａｒｋｏｗｉａｋ及びＳｌｉｚｅｗｓｋａ、２０１８）。
Ｆ２の有益な効果をより良く理解するために、実施例１で開始した、育成期のブタにＦ２を補給する試験を継続した。ここでは、Ｆ２補給の発育成績に及ぼす影響を屠蓄前期間全体にわたって評価する。本発明者らは、離乳時のＦ２投与が枝肉特性に影響を与えることなく、抗生物質投与と同程度にブタの発育速度を増加させることを実証した。
【0062】
材料及び方法
動物の管理及び給餌
離乳日に、初期体重６．１９±０．３ｋｇのブタ９６頭（ＰＩＣ１０５０×ＤＮＡ６００）を選抜し、４０日間の育成期試験のために育成施設へ移した。新施設には、カップ式給水器と２穴式給餌器を備えた金網床の囲いが２４基設置されている。子ブタは育成期試験を通じて１つの囲い（サイズ：１．５×１．２ｍ2）あたり４頭ずつ収容し、飼料及び水を自由に摂らせた。子ブタは、性別内の離乳時体重に基づいて８つのブロックに群分けし、次に、各ブロック内のブタを、３つの処置に無作為に割り付けた３つの囲いのうちの１つに割り当てた。各囲いには、未経産の雌ブタ２頭と去勢した雄ブタ２頭を収容した。従って、合計３２頭のブタを各処置に割り当てた。離乳時、ブタを各性別の離乳時体重で層別化し、次に、フェーズ１及びフェーズ２の３つの処置のうち１つに割り当てた：１）対照：トウモロコシ－ＳＢＭに基づく飼料；２）Ｆ２：対照飼料＋Ｆ２強制経口投与；３）抗生物質：対照飼料＋抗生物質。全ての子ブタに共通のフェーズ３飼料を給餌した。Ｆ２処置群に割り当てたブタに、離乳日（ｄ０）、１日目（ｄ１）及び育成期フェーズ２の終わり（ｄ２８）に再びＦ２（およそ１０9ＣＦＵ／ブタ）を投与した。抗生物質処置群には、フェーズ１及びフェーズ２にそれぞれ、カルバドックス（メカドックス（登録商標）１０、Ｐｈｉｂｒｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ティーネック、ＮＪ）及びチアムリンフマル酸水素塩（Ｄｅｎａｇａｒｄ（登録商標））＋クロルテトラサイクリン塩酸塩（ＣＴＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ ＵＳ Ｉｎｃ、グリーンズボロ、ＮＣ）を追加した。
動物の管理及び給餌
離乳日に、初期体重６．１９±０．３ｋｇのブタ９６頭（ＰＩＣ１０５０×ＤＮＡ６００）を選抜し、４０日間の育成期試験のために育成施設へ移した。新施設には、カップ式給水器と２穴式給餌器を備えた金網床の囲いが２４基設置されている。子ブタは育成期試験を通じて１つの囲い（サイズ：１．５×１．２ｍ2）あたり４頭ずつ収容し、飼料及び水を自由に摂らせた。子ブタは、性別内の離乳時体重に基づいて８つのブロックに群分けし、次に、各ブロック内のブタを、３つの処置に無作為に割り付けた３つの囲いのうちの１つに割り当てた。各囲いには、未経産の雌ブタ２頭と去勢した雄ブタ２頭を収容した。従って、合計３２頭のブタを各処置に割り当てた。離乳時、ブタを各性別の離乳時体重で層別化し、次に、フェーズ１及びフェーズ２の３つの処置のうち１つに割り当てた：１）対照：トウモロコシ－ＳＢＭに基づく飼料；２）Ｆ２：対照飼料＋Ｆ２強制経口投与；３）抗生物質：対照飼料＋抗生物質。全ての子ブタに共通のフェーズ３飼料を給餌した。Ｆ２処置群に割り当てたブタに、離乳日（ｄ０）、１日目（ｄ１）及び育成期フェーズ２の終わり（ｄ２８）に再びＦ２（およそ１０9ＣＦＵ／ブタ）を投与した。抗生物質処置群には、フェーズ１及びフェーズ２にそれぞれ、カルバドックス（メカドックス（登録商標）１０、Ｐｈｉｂｒｏ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ティーネック、ＮＪ）及びチアムリンフマル酸水素塩（Ｄｅｎａｇａｒｄ（登録商標））＋クロルテトラサイクリン塩酸塩（ＣＴＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ ＵＳ Ｉｎｃ、グリーンズボロ、ＮＣ）を追加した。
【0063】
飼料は、育成期のブタに対するＮＲＣ（２０１２年）の推奨を満たすかそれ以上になるように調製した。全ての飼料はマッシュ状であった。飼料を調製し、将来の栄養分析に備えて各飼料のサブサンプルを－２０℃で保存した。育成期には、フェーズ１（ｄ０～１４）、フェーズ２（ｄ１４～２８）、及びフェーズ３（ｄ２８～４０）の３フェーズの食餌レジメンを用いた。実験用飼料はフェーズ１及び２で与えられ、フェーズ３では全てのブタに共通の抗生物質不使用の飼料が給餌された。育成期フェーズ１、育成期フェーズ２、育成期フェーズ３、及び肥育前期／肥育後期に与えた飼料の組成を以下の表９～１２に示す。
【表9】
【表10】
【表11】
【表12】
【0064】
育成期終了時に、全てのブタを育成施設から肥育後期施設に移した。ブタを肥育後期施設に移す際、育成期施設から同じ囲いの個体の組合せを維持した。ブタには、５フェーズの肥育前期／肥育後期レジメンで給餌した。フェーズは体重に応じて変更した：肥育前期フェーズ１（２３～４１キログラム（５０～９０ポンド））、肥育前期フェーズ２（４１～６４キログラム（９０～１４０ポンド））、肥育後期フェーズ１（６４～８４キログラム（１４０～１８５ポンド））、肥育後期フェーズ２（８４～１０３キログラム（１８５～２３０ポンド））、及び肥育後期フェーズ３（１０３～１２７キログラム（２３０～２８０ポンド）。一般に、ブタには各フェーズの飼料をおよそ３週間給餌した。試験期間中、全てのブタに飼料及び水を自由に摂らせた。ブタは、スノコ床のサイドカーテン式の建物に収容し、各１．５×３．０メートル（４．９×９．８フィート）の囲いには、飼料及び水を自由に摂取できるように、単穴式給餌器と離乳期－肥育後期までのカップ式給水器を取り付けた。周囲温度はＳＯＰ番号３０２．０１に従って維持した。毎日の温度（最低温度及び最高温度）を記録し、投薬が必要な場合は記録し、報告した。コンピュータ制御の最低温度を、以下の表１３に示す。
【表13】
【0065】
サンプル採取
各フェーズ終了時に体重及び飼料摂取量を記録し、各フェーズにおける平均日増体重（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）、及び増体／飼料比（Ｇ：Ｆ）を計算した。
直腸スワブ及び糞便は、育成期フェーズ２及び肥育前期フェーズ２の終了時に、全ての囲いで囲いの平均体重に近い子ブタ２頭、合計４８頭の子ブタから採取し、最終的に合計９６スワブと９６の糞便サンプルとした。スワブのサンプル採取には、Ｐｕｒｉｔａｎ Ｏｐｔｉ－Ｓｗａｂ Ｌｉｑｕｉｄ Ａｍｉｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｕｒｉｔａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ギルフォード、メーン州）を使用した。スワブはマイクロバイオーム解析に、糞便サンプルはメタゲノム解析とメタボローム解析に使用した。
離乳時（ｄ０）、育成期フェーズ２終了時、育成期終了時（ｄ４０）、及び肥育前期フェーズ２終了時（ｄ１０４）に、全ての囲いで囲いの平均体重に近い子ブタ１頭から頸静脈穿刺によりＥＤＴＡ含有真空チューブに血液サンプルを採取し、合計９６サンプルとした。血液サンプルは３０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。血漿を５ｍｌのポリプロピレンサンプルチューブに吸引し、メタボローム解析のために－８０℃で保存した。
試験終了後、合計２４頭のブタ（１つの囲いあたり１頭）を屠畜し、枝肉品質を分析した。最長筋（ＬＭ）及び第１０肋骨の脂肪の深さをＦａｔ－Ｏ－Ｍｅａｔｅｒ探針でオンライン測定し、各ブタ／枝肉について温枝肉質量を記録した。屠蓄後、更なる枝肉品質分析のために、ロイン及びバラ肉を片側ずつ取り除いた。
各フェーズ終了時に体重及び飼料摂取量を記録し、各フェーズにおける平均日増体重（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）、及び増体／飼料比（Ｇ：Ｆ）を計算した。
直腸スワブ及び糞便は、育成期フェーズ２及び肥育前期フェーズ２の終了時に、全ての囲いで囲いの平均体重に近い子ブタ２頭、合計４８頭の子ブタから採取し、最終的に合計９６スワブと９６の糞便サンプルとした。スワブのサンプル採取には、Ｐｕｒｉｔａｎ Ｏｐｔｉ－Ｓｗａｂ Ｌｉｑｕｉｄ Ａｍｉｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｕｒｉｔａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ギルフォード、メーン州）を使用した。スワブはマイクロバイオーム解析に、糞便サンプルはメタゲノム解析とメタボローム解析に使用した。
離乳時（ｄ０）、育成期フェーズ２終了時、育成期終了時（ｄ４０）、及び肥育前期フェーズ２終了時（ｄ１０４）に、全ての囲いで囲いの平均体重に近い子ブタ１頭から頸静脈穿刺によりＥＤＴＡ含有真空チューブに血液サンプルを採取し、合計９６サンプルとした。血液サンプルは３０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。血漿を５ｍｌのポリプロピレンサンプルチューブに吸引し、メタボローム解析のために－８０℃で保存した。
試験終了後、合計２４頭のブタ（１つの囲いあたり１頭）を屠畜し、枝肉品質を分析した。最長筋（ＬＭ）及び第１０肋骨の脂肪の深さをＦａｔ－Ｏ－Ｍｅａｔｅｒ探針でオンライン測定し、各ブタ／枝肉について温枝肉質量を記録した。屠蓄後、更なる枝肉品質分析のために、ロイン及びバラ肉を片側ずつ取り除いた。
【0066】
枝肉品質
枝肉品質評価には、最長筋（ＬＭ）及び脂肪の深さ、温枝肉質量、ロインの肉質（色調及びマーブリングスコア、柔らかさ、剪断力、調理損失、及び一般分析）及びブタバラ肉品質（脂肪酸プロファイル分析、ヨウ素価、バラ肉厚、及びバラ肉硬度）の評価が含まれる。
ロイン及びバラ肉を採取した後、ロインは２０分間のブルーム期間の後、全米豚肉委員会のガイドラインに従って、色調及びマーブリングスコアを分析した。色調はＡＭＳＡ色調ガイドラインに従い、ＨｕｎｔｅｒＬａｂ ＭｉｎｉＳｃａｎ ＥＺ分光光度計を使用して客観的に分析した。色調分析後、ロインを厚さ２．５４ｃｍのチョップに切断した。加工後、チョップ対を１０日間熟成させ、以下の分析に無作為に割り当てた：柔らかさ、調理損失、及び一般分析。機器による柔らかさの測定は、ＡＭＳＡセンサリーガイドラインに概説されたプロトコールに従い、Ｗａｒｎｅｒ－Ｂｒａｔｚｌｅｒ剪断力を用いて測定した。簡単に述べれば、チョップを内部温度が７１℃になるまで加熱した後、一晩冷却した。筋線維の方向に平行な１．２７ｃｍコアを６本取り出し、垂直に剪断した。チョップのコアの長さの平均をとって各ロインの値を算出した。同じチョップについて、調理損失の評価を行った。調理前の生重及びその後、調理後量を測定し（生量－調理後量）／生重×１００として算出した。一般分析では、サンプルを液体窒素でホモジナイズし、均質な粉末とした。その後、ＡＯＡＣに承認された水分及び脂質の分析法によりサンプルを分析した。
枝肉品質評価には、最長筋（ＬＭ）及び脂肪の深さ、温枝肉質量、ロインの肉質（色調及びマーブリングスコア、柔らかさ、剪断力、調理損失、及び一般分析）及びブタバラ肉品質（脂肪酸プロファイル分析、ヨウ素価、バラ肉厚、及びバラ肉硬度）の評価が含まれる。
ロイン及びバラ肉を採取した後、ロインは２０分間のブルーム期間の後、全米豚肉委員会のガイドラインに従って、色調及びマーブリングスコアを分析した。色調はＡＭＳＡ色調ガイドラインに従い、ＨｕｎｔｅｒＬａｂ ＭｉｎｉＳｃａｎ ＥＺ分光光度計を使用して客観的に分析した。色調分析後、ロインを厚さ２．５４ｃｍのチョップに切断した。加工後、チョップ対を１０日間熟成させ、以下の分析に無作為に割り当てた：柔らかさ、調理損失、及び一般分析。機器による柔らかさの測定は、ＡＭＳＡセンサリーガイドラインに概説されたプロトコールに従い、Ｗａｒｎｅｒ－Ｂｒａｔｚｌｅｒ剪断力を用いて測定した。簡単に述べれば、チョップを内部温度が７１℃になるまで加熱した後、一晩冷却した。筋線維の方向に平行な１．２７ｃｍコアを６本取り出し、垂直に剪断した。チョップのコアの長さの平均をとって各ロインの値を算出した。同じチョップについて、調理損失の評価を行った。調理前の生重及びその後、調理後量を測定し（生量－調理後量）／生重×１００として算出した。一般分析では、サンプルを液体窒素でホモジナイズし、均質な粉末とした。その後、ＡＯＡＣに承認された水分及び脂質の分析法によりサンプルを分析した。
【0067】
バラ肉は、脂肪酸プロファイル分析、ヨウ素価、バラ肉の厚さ、及びバラ肉の硬さを通じた豚肉品質分析に供した。バラ肉は、Ｂｒｏｗｎｅら（２０１３）により記載された厚さ及び硬さの測定に供した。脂肪酸分析には、Ｏ’Ｆａｌｌｏｎら（２００７）により記載されたプロトコールを用いる。簡単に述べれば、バラ肉の切片を液体窒素でホモジナイズする。粉末試料１グラムを２０ｍｌのガラス製バイアルに秤量した後、内部標準物質として１ｍＬのＣ１３：０を試料に添加する。内部標準物質を添加した後、０．７ｍＬの１０Ｎの水酸化カリウム及び５．３ｍＬのメタノールをチューブに加えて誘導体化し、そのチューブを５５℃で１．５時間インキュベートする。温水浴の後、チューブを冷水に２０分間浸漬する。０．５８ｍＬの２４Ｎ硫酸をチューブに加えた後、前の条件下で再インキュベートする。最終インキュベーション後、３ｍＬのヘキサンをチューブに加え、５分間ボルテックスで撹拌した後、３５００ＲＰＭで５分間遠心分離する。ＦＡＭＥＳを含むヘキサン層をラベル付きのガスクロマトグラフィーバイアルに入れる。脂肪酸濃度の検出には、ガスクロマトグラフィー－水素炎イオン化検出器を使用する。分離後、外部標準物質を用いて脂肪酸の同一性と量を確認し、質量ベースで算出する。観測された脂肪酸濃度は、Ｂｒｏｗｎｅら（２０１３）の記載に従ってヨウ素価を計算するために使用する。
【0068】
統計解析
量的形質は、処置を固定効果として、体重ブロックをランダム効果として、ＳＡＳプロシージャのＰＲＯＣ Ｍｉｘｅｄ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、カリー、ＮＣ）を用いて解析した。各囲いは、ＡＮＯＶＡのための試験単位とした。処置間の比較は、ｐ値≦０．０５の時に有意差ありと見なした。
量的形質は、処置を固定効果として、体重ブロックをランダム効果として、ＳＡＳプロシージャのＰＲＯＣ Ｍｉｘｅｄ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、カリー、ＮＣ）を用いて解析した。各囲いは、ＡＮＯＶＡのための試験単位とした。処置間の比較は、ｐ値≦０．０５の時に有意差ありと見なした。
【0069】
結果：
全試験期間中、育成期に抗生物質処置群から１頭（死亡）のブタが失われ、一方、肥育前期及び肥育後期には、抗生物質処置群からは２頭（器官脱出）、対照群からは３頭（死亡１、器官脱出１、股関節脱臼１）、及びＦ２処置群からは３頭（死亡１、器官脱出１、血便１）のブタが失われた。発育成績は表１４～１７に示した。
抗生物質を給与されたブタは、対照飼料を給与されたブタに比べて平均日増体重（ＡＤＧ）が増加したが、Ｆ２の水薬をｄ０及びｄ１に投与されたブタはｄ０からｄ７まで中間のＡＤＧ（ｐ＝０．０５２８）を示した（表１４）。ｄ７以降、Ｆ２処置ブタは、育成期フェーズ２（ｄ１４～２８、ｐ＝０．０２３７）、肥育前期フェーズ１（ｄ７７～１０４、ｐ＝０．０１３４）、肥育前期－肥育後期全体（ｄ４０～１６２、ｐ＝０．０４７、図２５）及び試験期間全体（ｄ０～１６２、ｐ＝０．０３３、図２５）で、抗生物質処置ブタで見られたものと同様のＡＤＧ増加を示した。肥育後期フェーズ２では、Ｆ２処置ブタにおいてＡＤＧの有意な減少が観察された（ｄ１２６～１３４、ｐ＝０．００８２）。これは、回腸炎の発生によりタイラン水薬が投与されたためと考えられる。Ｆ２処置ブタではその後のフェーズで代償性の体重増加が認められ、このため肥育後期フェーズ３では対照ブタ及び抗生物質処置ブタと比較して優れた体重増加を示した（ｐ＝０．０２８）。
全試験期間中、育成期に抗生物質処置群から１頭（死亡）のブタが失われ、一方、肥育前期及び肥育後期には、抗生物質処置群からは２頭（器官脱出）、対照群からは３頭（死亡１、器官脱出１、股関節脱臼１）、及びＦ２処置群からは３頭（死亡１、器官脱出１、血便１）のブタが失われた。発育成績は表１４～１７に示した。
抗生物質を給与されたブタは、対照飼料を給与されたブタに比べて平均日増体重（ＡＤＧ）が増加したが、Ｆ２の水薬をｄ０及びｄ１に投与されたブタはｄ０からｄ７まで中間のＡＤＧ（ｐ＝０．０５２８）を示した（表１４）。ｄ７以降、Ｆ２処置ブタは、育成期フェーズ２（ｄ１４～２８、ｐ＝０．０２３７）、肥育前期フェーズ１（ｄ７７～１０４、ｐ＝０．０１３４）、肥育前期－肥育後期全体（ｄ４０～１６２、ｐ＝０．０４７、図２５）及び試験期間全体（ｄ０～１６２、ｐ＝０．０３３、図２５）で、抗生物質処置ブタで見られたものと同様のＡＤＧ増加を示した。肥育後期フェーズ２では、Ｆ２処置ブタにおいてＡＤＧの有意な減少が観察された（ｄ１２６～１３４、ｐ＝０．００８２）。これは、回腸炎の発生によりタイラン水薬が投与されたためと考えられる。Ｆ２処置ブタではその後のフェーズで代償性の体重増加が認められ、このため肥育後期フェーズ３では対照ブタ及び抗生物質処置ブタと比較して優れた体重増加を示した（ｐ＝０．０２８）。
【表14】
【0070】
育成期における体重（ＢＷ）は、処置群間で差がなかった（表１５）。抗生物質処置ブタ及びＦ２処置ブタのＡＤＧの改善により、Ｇ２（ｐ＝０．０１２８）及びＦ１（ｐ＝０．０５０５）終了時のＢＷはより大きな増加を示した。試験終了時に、抗生物質処置ブタ及びＦ２処置ブタは、対照飼料を与えたブタと比較して、それぞれ５．７７ｋｇ及び６．３７ｋｇ重かった（図２６、ｐ＝０．０５７５）。
【表15】
【0071】
ＡＤＧ及びＢＷとは異なり、平均１日飼料摂取量は試験期間中、処置間で有意に異なることはなかった（表１６）。しかしながら、ｄ１２６～１３４及びｄ１３４～１６２の飼料効率（増体／飼料比、Ｇ：Ｆとして表される）には、処置が有意に影響した（表１７）。対照飼料を給与したブタ及び抗生物質を給与したブタは、ｄ１２６～１３４にＦ２を給与したブタよりもＧ：Ｆが高く（ｐ＝０．００５８）、一方、ｄ１３４～１６２に対照飼料を給与したブタと比較して、抗生物質又はＦ２を給与したブタでは、より大きなＧ：Ｆが観察された（ｐ＝０．００９１）。Ｆ２処置ブタのＧ：Ｆにおける一貫性のない影響は、上述の水薬投与後の体重増加反応と関連している。
【表16】
【表17】
【0072】
枝肉特性の結果を表１８に示す。処置ごとの反復数が少ないため（ｎ＝８）、腹背部の厚さを除いて処置間の枝肉特性に差は認められず、腹背部の厚さは、対照飼料を給与されたブタと比較してＦ２処置ブタでは厚く、抗生物質処置ブタは中間であった（ｐ＝０．０３５）。枝肉品質を決定するために選択されたブタは、元の同じ囲いの個体と類似した発育速度及び最終体重を示していた。抗生物質処置ブタ及びＦ２処置ブタの体重は、対照ブタと比較して４．７ｋｇ及び５．７ｋｇ重く、温枝肉重量は４ｋｇ及び３ｋｇ重かった（それぞれｐ＝０．３９４及び０．４６６）。
【表18】
【0073】
要約すると、離乳時のＦ２処置により、抗生物質処置時と同等の、対照ブタを上回る発育速度の向上が確認された。抗生物質処置と同様に、Ｆ２処置は飼料効率にほとんど又は全く影響を及ぼさない。さらに、Ｆ２処置ブタは、対照ブタ及び抗生物質処置ブタと同等の枝肉特性を示した。これらの結果は、Ｆ２補給が豚肉の品質に有害な影響を与えることなく、抗生物質の代替物として使用できるという強い証拠を与えるものである。
【0074】
今後の研究：
現在進行中の研究では、１６Ｓ ｒＲＮＡシークエンシングと組み合わせたメタゲノミクス及びメタボロミクスを使用して、育成期(nursey)のＦ２補給により、屠蓄前期間を通じて子ブタの腸内マイクロバイオームがどのように変化するかが明らかにされるであろう。具体的には、マイクロバイオームの多様性、メンバー構成、菌種構成、組成、安定性、機能だけでなく、ブタの糞便及び血液中に見られる代謝産物、及びＦ２とそれ以外の、有益な細菌及び病原菌の両方を含む細菌分類群との相互作用の可能性が評価される。ＰｏｗｅｒＳｏｉｌキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて糞便からＤＮＡを抽出し、濃度を１０ｎｇ／μｌに正規化する。マイクロバイオームは、次世代シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ）を用いて特性決定を行う。配列はＱＩＩＭＥ２ソフトウエアパッケージを用いて解析する。有益な細菌ＯＴＵは、機械学習アプローチであるランダムフォレストを用いて同定する。糞便から抽出したＤＮＡは、種レベルの解明及び機能アノテーションのためのメタゲノムツールも用いて解析する。血漿サンプル及び糞便サンプルに対してもメタボロミクス解析を行う。
現在進行中の研究では、１６Ｓ ｒＲＮＡシークエンシングと組み合わせたメタゲノミクス及びメタボロミクスを使用して、育成期(nursey)のＦ２補給により、屠蓄前期間を通じて子ブタの腸内マイクロバイオームがどのように変化するかが明らかにされるであろう。具体的には、マイクロバイオームの多様性、メンバー構成、菌種構成、組成、安定性、機能だけでなく、ブタの糞便及び血液中に見られる代謝産物、及びＦ２とそれ以外の、有益な細菌及び病原菌の両方を含む細菌分類群との相互作用の可能性が評価される。ＰｏｗｅｒＳｏｉｌキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて糞便からＤＮＡを抽出し、濃度を１０ｎｇ／μｌに正規化する。マイクロバイオームは、次世代シークエンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑ）を用いて特性決定を行う。配列はＱＩＩＭＥ２ソフトウエアパッケージを用いて解析する。有益な細菌ＯＴＵは、機械学習アプローチであるランダムフォレストを用いて同定する。糞便から抽出したＤＮＡは、種レベルの解明及び機能アノテーションのためのメタゲノムツールも用いて解析する。血漿サンプル及び糞便サンプルに対してもメタボロミクス解析を行う。
【0075】
参照文献
【0076】
寄託情報
上記に開示され、添付の特許請求の範囲に列挙されたアーカンソー大学農学部独自の細菌単離株は、ＡＲＳ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）（１８１５ Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、ピオリア、ＩＬ ６１６０４）又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア）に寄託されている。具体的には、１つのラクトバチルス（ＬａｃｔＸ）及び２つのストレプトコッカス（ＳｔｒｅｐＸ１及びＳｔｒｅｐＸ３）単離株が寄託されている。寄託日は２０２１年６月Ｘ日である。寄託は、２０２１年６月Ｘ日に生存が確認された各単離株の５つの液体窒素保存株を含む。全ての制限は、特許が付与された時点で変更不可で除去され、寄託は、連邦規則集第３７編第１．８０１条～第１．８０９条の全ての要件を満たすことが意図される。受託番号はＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＸ、及びＸＸＸＸＸである。寄託は、３０年間、又は最後の請求から５年間、又は特許の実施可能期間のうち長いほうの寄託期間だけ維持され、その期間中に必要に応じて交換される。
上記に開示され、添付の特許請求の範囲に列挙されたアーカンソー大学農学部独自の細菌単離株は、ＡＲＳ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）（１８１５ Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、ピオリア、ＩＬ ６１６０４）又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア）に寄託されている。具体的には、１つのラクトバチルス（ＬａｃｔＸ）及び２つのストレプトコッカス（ＳｔｒｅｐＸ１及びＳｔｒｅｐＸ３）単離株が寄託されている。寄託日は２０２１年６月Ｘ日である。寄託は、２０２１年６月Ｘ日に生存が確認された各単離株の５つの液体窒素保存株を含む。全ての制限は、特許が付与された時点で変更不可で除去され、寄託は、連邦規則集第３７編第１．８０１条～第１．８０９条の全ての要件を満たすことが意図される。受託番号はＸＸＸＸＸ、ＸＸＸＸＸ、及びＸＸＸＸＸである。寄託は、３０年間、又は最後の請求から５年間、又は特許の実施可能期間のうち長いほうの寄託期間だけ維持され、その期間中に必要に応じて交換される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26A】
【図26B】
【配列表】
【国際調査報告】