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特表2023-530712未処理Ｃ末端リジンを正確に測定するための重ペプチドアプローチ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-19
(54)【発明の名称】未処理Ｃ末端リジンを正確に測定するための重ペプチドアプローチ
(51)【国際特許分類】
G01N 27/62 20210101AFI20230711BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20230711BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20230711BHJP
C07K 1/13 20060101ALI20230711BHJP
【ＦＩ】
G01N27/62 V
G01N27/62 X
G01N33/50 U
G01N33/68
C07K1/13 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022577499
(86)(22)【出願日】2021-06-18
(85)【翻訳文提出日】2023-01-25
(86)【国際出願番号】 US2021038136
(87)【国際公開番号】W WO2021258017
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】63/041,015
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】グリーア タイラー
(72)【発明者】
【氏名】チェイコフ ミロス
(72)【発明者】
【氏名】オブライエン ジョンソン リード
(72)【発明者】
【氏名】ジェン シャオジン
(72)【発明者】
【氏名】リ ニン
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA05
2G041EA04
2G041EA12
2G041FA12
2G041FA22
2G041FA24
2G041GA03
2G041GA06
2G041GA09
2G041HA01
2G041JA02
2G041JA05
2G041LA09
2G045DA37
2G045FB06
2G045FB07
4H045AA30
4H045BA50
4H045EA65
(57)【要約】
本開示は、抗体などのタンパク質における翻訳後修飾を正確に測定するための方法を提供する。特に、本方法は、修飾ペプチドの正確な定量化を可能にする検量線を生成するための、重同位体標準物質の使用に関する。本方法は、質量分析を使用して抗体のＣ末端切断を正確に定量化するために使用することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化するための方法であって、（ａ）前記関心対象のタンパク質を含む試料を消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を得ることと、
（ｂ）前記ペプチド消化物に重ペプチド標準物質のセットを添加することであって、少なくとも１つの重ペプチド標準物質が、前記翻訳後修飾を含み、かつ少なくとも１つの重ペプチド標準物質が、前記翻訳後修飾を含まない、添加することと、
（ｃ）前記ペプチド消化物を、添加された前記重ペプチド標準物質とともに、液体クロマトグラフィ－質量分析を使用する分析に供して、前記ペプチド消化物及び重ペプチド標準物質の各ペプチドに対応するシグナルを取得することと、
（ｄ）前記翻訳後修飾を含まない前記少なくとも１つの重ペプチド標準物質と比較した、前記翻訳後修飾を含む前記少なくとも１つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することと、
（ｅ）前記翻訳後修飾を含まない前記関心対象のタンパク質からの少なくとも１つのペプチドと比較した、前記翻訳後修飾を含む前記関心対象のタンパク質からの少なくとも１つのペプチドの前記相対シグナルを使用して、前記関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することと、
（ｆ）前記（ｄ）の検量線を使用して（ｅ）の結果を正規化して、前記関心対象のタンパク質の前記翻訳後修飾を更に定量化することと
を含む、方法。
【請求項2】
前記関心対象のタンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記治療用タンパク質が、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、及び酵素からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記関心対象のタンパク質が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記関心対象のタンパク質が、二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記翻訳後修飾が、未処理Ｃ末端リジンの存在である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記重ペプチド標準物質が、少なくとも１つの他の重ペプチド標準物質に対して、約１：１～約１：１０００のモル比で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記重ペプチド標準物質が、約１～約１６個の重同位体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記重ペプチド標準物質が、Ｃ１３、Ｎ１５、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記消化酵素が、トリプシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記液体クロマトグラフィ法が、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、Ｑ－ＴＯＦ質量分析計、又はトリプル四重極質量分析計であり、前記質量分析計が、前記液体クロマトグラフィシステムに結合され、かつ前記質量分析計が、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ、及び／又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化するためのキットであって、（ａ）翻訳後修飾を含む少なくとも１つの重ペプチド標準物質を含む第１の組成物と、
（ｂ）前記翻訳後修飾を含まない少なくとも１つの重ペプチド標準物質を含む第２の組成物と
を含み、
前記第１及び第２の組成物は、ペプチド消化物に添加することができ、
質量分析によって分析した場合に、前記翻訳後修飾を含まない前記少なくとも１つの重ペプチド標準物質と比較した、前記翻訳後修飾を含む前記少なくとも１つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することができ、かつ
前記検量線を使用して、関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することができる、
キット。
【請求項14】
前記翻訳後修飾が、未処理Ｃ末端リジンの存在である、請求項１３に記載のキット。
【請求項15】
前記重ペプチド標準物質が、少なくとも１つの他の重ペプチド標準物質に対して、約１：１～約１：１０００のモル比で存在する、請求項１３に記載のキット。
【請求項16】
前記重ペプチド標準物質が、約１～約１６個の重同位体を含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項17】
前記重ペプチド標準物質が、Ｃ１３、Ｎ１５、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項18】
少なくとも１つの軽ペプチド標準物質を更に含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，０１５号の優先権及び恩典を主張し、これは、参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０４１，０１５号の優先権及び恩典を主張し、これは、参照により本明細書に援用される。
【0002】
分野
本出願は、液体クロマトグラフィ－質量分析における重同位体標準物質（ｈｅａｖｙ ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用して、関心対象のタンパク質における翻訳後修飾（ＰＴＭ）を同定及び定量化するための方法に関する。
本出願は、液体クロマトグラフィ－質量分析における重同位体標準物質（ｈｅａｖｙ ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｓｔａｎｄａｒｄ）を使用して、関心対象のタンパク質における翻訳後修飾（ＰＴＭ）を同定及び定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、多くの障害の治療において重要な役割を果たす。このクラスの薬物の利点は、広範囲にわたる様々な分子標的に対する高い特異性及び親和性を含み、これらの利点は、薬物の継続的な開発を保証し、中でも、喘息、関節リウマチ、及び低密度リポタンパク質コレステロール上昇などの健康状態の治療に対する承認につながってきている。治療用抗体の商業的及び科学的な成功は前例のないものであるが、それらの固有の利点は、それらの大きなサイズ、複雑性、及び化学的不均一性によって減じられ、それらの安全性及び有効性を評価するために多くの方法を使用する必要がある。
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、多くの障害の治療において重要な役割を果たす。このクラスの薬物の利点は、広範囲にわたる様々な分子標的に対する高い特異性及び親和性を含み、これらの利点は、薬物の継続的な開発を保証し、中でも、喘息、関節リウマチ、及び低密度リポタンパク質コレステロール上昇などの健康状態の治療に対する承認につながってきている。治療用抗体の商業的及び科学的な成功は前例のないものであるが、それらの固有の利点は、それらの大きなサイズ、複雑性、及び化学的不均一性によって減じられ、それらの安全性及び有効性を評価するために多くの方法を使用する必要がある。
【0004】
これらの方法のかなりの部分は、多くの場合、翻訳後修飾（ＰＴＭ）、製品の品質属性、並びに質量及び電荷の不均一性の主要な原因の評価に費やされる。高感度質量分析計検出器と、ますます多くの液体クロマトグラフィカラム化学及び酵素処理条件との統合により、一連の成熟したＰＴＭの特性評価法が得られた。質量分析（ＭＳ）ベースのペプチドマッピングアッセイは、全ての関連するＰＴＭの同定、局在化、及び定量化を可能にし、例えば、最適条件下で、０．１％未満の検出限界を有する。
【0005】
抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）によるＰＴＭ定量化の利点は、その方法の精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）に影響を与えるいくつかの課題を伴っている。これらの問題の多くは、非修飾ペプチドと修飾形態とのイオン化の違いに関連している。例えば、Ｃ末端Ｋ切断（ｄｅｓ－Ｋ）値は、特に、未処理形態（Ｋ、ｚ＝２＋）と比較して、イオン化効率の違いによる及びペプチドの優位な電荷状態の１＋への低減による影響を受ける可能性がある。未処理Ｃ末端Ｋのパーセント相対存在量は、典型的には、Ｋ及びｄｅｓ－Ｋの合計と関連して計算されるが、ペプチドマッピング定量化中ではＫのパーセンテージが過大に評価され得ることが、以前の取り組みで見出されている。これは、例えば、ペプチド配列のＣ末端上の追加のＫが、ｄｅｓ－Ｋペプチドに比べてイオン化効率を増加させるためである。
【0006】
この誤差を最小化するためのいくつかの試みは、各ペプチドについてのＸＩＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算するために最も豊富な電荷状態のみを使用すること、又は等モル量の各ペプチドをＬＣカラムに注入し、質量分析計の応答を測定することによって決定される補正係数を使用することを含む。しかしながら、第１の方法は、未処理Ｃ末端Ｋ値の大きさを減少させ得るが、この値をどの程度減少させるべきかについての経験的な知識がないか又はほとんどない状態で行われる。補正係数法は、補正係数が、未処理Ｃ末端Ｋの可能な濃度範囲にわたって、潜在的に共溶出するペプチドの存在下で、及び異なる質量分析計間で、静的なままであると仮定する。これらの因子の変動は、静的補正係数を使用した場合に補償されない可能性のある未処理Ｃ末端Ｋに対する処理Ｃ末端Ｋの測定値の、より大きな不正確さにつながるであろう。
【0007】
したがって、修飾及び非修飾ペプチドのイオン化効率の差を補正する、関心対象のタンパク質中のＰＴＭの存在を正確に定量化する方法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【0008】
概要
本発明は、重ペプチドアプローチを使用して、抗体などのタンパク質中のＰＴＭを正確かつ精密に特徴付けるための方法を提供する。より具体的には、本開示は、抗体における未処理Ｃ末端リジン（Ｋ）の定量化方法を提供する。重ペプチドアプローチを使用してＣ末端Ｋを定量化する方法が提供される。
本発明は、重ペプチドアプローチを使用して、抗体などのタンパク質中のＰＴＭを正確かつ精密に特徴付けるための方法を提供する。より具体的には、本開示は、抗体における未処理Ｃ末端リジン（Ｋ）の定量化方法を提供する。重ペプチドアプローチを使用してＣ末端Ｋを定量化する方法が提供される。
【0009】
一部の例示的な実施形態では、本方法は、（ａ）当該関心対象のタンパク質を含む試料を消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を得ることと、（ｂ）当該ペプチド消化物に重ペプチド標準物質のセットを添加することであって、少なくとも１つの重ペプチド標準物質が、当該翻訳後修飾を含み、かつ少なくとも１つの重ペプチド標準物質が、当該翻訳後修飾を含まない、添加することと、（ｃ）当該ペプチド消化物を、当該添加した重ペプチド標準物質とともに、液体クロマトグラフィ－質量分析を使用する分析に供して、ペプチド消化物及び重ペプチド標準物質の各ペプチドに対応するシグナルを取得することと、（ｄ）当該翻訳後修飾を含まない少なくとも１つの重ペプチド標準物質と比較した、当該翻訳後修飾を含む少なくとも１つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することと、（ｅ）当該翻訳後修飾を含まない当該関心対象のタンパク質からの少なくとも１つのペプチドと比較した、当該翻訳後修飾を含む当該関心対象のタンパク質からの少なくとも１つのペプチドの相対シグナルを使用して、当該関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することと、（ｆ）（ｄ）の検量線を使用して（ｅ）の結果を補正して、当該関心対象のタンパク質の当該翻訳後修飾を更に定量化することと、を含む。
【0010】
一態様では、関心対象のタンパク質は、治療用タンパク質である。特定の態様では、当該治療用タンパク質は、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、及び酵素からなる群から選択される。
【0011】
一態様では、当該関心対象のタンパク質は、モノクローナル抗体である。別の態様では、当該関心対象のタンパク質は、二重特異性抗体である。
【0012】
一態様では、当該翻訳後修飾は、未処理Ｃ末端リジンの存在である。
【0013】
一態様では、当該重ペプチド標準物質は、少なくとも１つの他の重ペプチド標準物質に対して、約１：１～約１：１０００のモル比で存在する。別の態様では、当該重ペプチド標準物質は、約１～約１６個の重同位体を含む。更なる態様では、当該重ペプチド標準物質は、Ｃ１３、Ｎ１５、又はそれらの組み合わせを含む。
【0014】
一態様では、当該消化酵素は、トリプシンである。
【0015】
一態様では、当該液体クロマトグラフィ法は、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、又はそれらの組み合わせを含む。
【0016】
一態様では、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、Ｑ－ＴＯＦ質量分析計、又はトリプル四重極質量分析計であり、当該質量分析計は、当該液体クロマトグラフィシステムに結合され、かつ当該質量分析計は、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ、及び／又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することができる。
【0017】
本開示は、本発明の方法を実施するためのキットを更に提供する。一部の例示的な実施形態では、キットは、翻訳後修飾を含む少なくとも１つの重ペプチド標準物質を含む第１の組成物と、当該翻訳後修飾を含まない少なくとも１つの重ペプチド標準物質を含む第２の組成物と、を含み、質量分析によって分析した場合に、当該翻訳後修飾を含まない少なくとも１つの重ペプチド標準物質と比較した、当該翻訳後修飾を含む少なくとも１つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することができ、かつ当該検量線を使用して、関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することができる。
【0018】
一態様では、当該翻訳後修飾は、未処理Ｃ末端リジンの存在である。
【0019】
一態様では、当該重ペプチド標準物質は、少なくとも１つの他の重ペプチド標準物質に対して、約１：１～約１：１０００のモル比で存在する。別の態様では、当該重ペプチド標準物質は、約１～約１６個の重同位体を含む。更なる態様では、当該重ペプチド標準物質は、Ｃ１３、Ｎ１５、又はそれらの組み合わせを含む。
【0020】
一態様では、キットは、少なくとも１つの軽ペプチド標準物質（ｌｉｇｈｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｔａｎｄａｒｄ）を更に含む。
【0021】
一態様では、キットの組成物は、水性媒体又は凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。
【0022】
一態様では、組成物は、容器内に提供され得る。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、又は他の容器手段を含み、構成要素が、その中に配置され得、好適には、アリコートされ得る。別の態様では、キットの組成物は、乾燥粉末として提供され得る。試薬及び／又は構成要素が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、好適な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒はまた、別の容器手段でも提供され得ることが想定される。
【0023】
本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修飾、追加、又は再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】図１Ａは、例示的な実施形態による、本発明のアッセイの概略図を示す。「クリップされた（ｃｌｉｐｐｅｄ）」ペプチド（Ｃ末端リジンを欠くタンパク質のＣ末端に対応する）を、４つの「クリップされていない（ｕｎｃｌｉｐｐｅｄ）」ペプチド（Ｃ末端リジンを有するタンパク質のＣ末端に対応する）と混合して、ペプチド混合物の応答曲線（検量線）を形成する。次いで、この応答曲線ペプチド混合物を、潜在的な抗体製造試料（ｍＡｂ消化物）を表す試料と混合して、抗体試料中に存在するＣ末端リジンの量を正確に定量化する。図１Ｂは、例示的な実施形態による、液体クロマトグラフィ－質量分析に供したときのペプチド種の各々について観察される分析ピークを示す。
【図2】図２Ａ～２Ｅは、例示的な実施形態による、１３Ｃ及び１５Ｎの同位体（●で示されている）を含有する４つのＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１）の「クリップされていない」重ペプチド標準物質の構造を示す。図２Ａ～２Ｄに示される同位体重鎖（ＨＣ）Ｃ末端ペプチド標準物質は、それぞれ、Δ４、Δ８、Δ１２、及びΔ１６Ｋペプチドである。図２Ｅは、１３Ｃ及び１５Ｎの同位体（●で示されている）を含有する重ＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１）標準物質Δ４ ｄｅｓ－Ｋを示す。
【図3】例示的な実施形態による、「クリップされた」ペプチドと「クリップされていない」ペプチドとの間の比例関係を示す検量線（ＣＣ）を示す。
【図4】例示的な実施形態による、重鎖（ＨＣ）Ｃ末端ペプチドを使用した例示的な応答曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
詳細な説明
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、多くの障害の治療において重要な役割を果たす。このクラスの薬物の利点は、広範囲にわたる様々な分子標的に対する高い特異性及び親和性を含み、これらの利点は、薬物の継続的な開発を保証し、中でも、喘息、関節リウマチ、及び低密度リポタンパク質コレステロール上昇などの健康状態の治療に対する承認につながってきている。治療用抗体の商業的及び科学的な成功は前例のないものであるが、それらの固有の利点は、それらの大きなサイズ、複雑性、及び化学的不均一性によって減じられ、それらの安全性及び有効性を評価するために多くの方法を使用する必要がある。
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）は、多くの障害の治療において重要な役割を果たす。このクラスの薬物の利点は、広範囲にわたる様々な分子標的に対する高い特異性及び親和性を含み、これらの利点は、薬物の継続的な開発を保証し、中でも、喘息、関節リウマチ、及び低密度リポタンパク質コレステロール上昇などの健康状態の治療に対する承認につながってきている。治療用抗体の商業的及び科学的な成功は前例のないものであるが、それらの固有の利点は、それらの大きなサイズ、複雑性、及び化学的不均一性によって減じられ、それらの安全性及び有効性を評価するために多くの方法を使用する必要がある。
【0026】
これらの方法のかなりの部分は、ＰＴＭ、製品の品質属性、並びに質量及び電荷の不均一性の主要な原因の評価に費やされる。単一抗体のＰＴＭ補体は多様であるが、ほぼ全てのｍＡｂ及びｂｓＡｂ間で、共通の修飾（例えば、Ｃ末端リジン切断、グリコシル化、Ｎ末端ピログルタミン酸形成、酸化、アミド化、脱アミド化、スクシンイミド中間体形成、糖化、異性化、システイニル化、及びトリスルフィド結合）が共有されている。
【0027】
これらのＰＴＭレベルを慎重に監視することで、所定の受け入れ基準を通してそれらを管理することが可能になり、２つの異なる理由で共通の戦略となっている。第一に、多くの報告は、ＰＴＭが、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置する場合、抗体の安定性及び生物活性に影響を及ぼす可能性があることを示している。第二に、ＰＴＭレベルのばらつきは、プロセス制御の欠如を示す可能性がある。
【0028】
翻訳後修飾は、クロマトグラフィ及び電気泳動技術を用いてグローバルレベルでアッセイされ、これには、サイズ排除クロマトグラフィ－多角度レーザー光走査（ｍｕｌｔｉ ａｎｇｌｅ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｎｎｉｎｇ）（ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳ）、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）、イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）、及びカチオン交換クロマトグラフィ（ＣＥＸ）などの方法が含まれる。そのような方法は、広く受け入れられているが、典型的には、アミノ酸配列内のそれらの特定の位置を決定することなく、最も豊富な修飾のみを同定する。
【0029】
例えば、ＣＥＸクロマトグラムにおける酸性種は、脱アミド化、糖化、及びシステイニル化のようなＰＴＭを含む可能性が最も高く、塩基性種は、未処理Ｃ末端Ｋ、酸化、及び異性化のような修飾からなるであろう。しかしながら、これらのＰＴＭのアミノ酸位置は、グローバル分析において決定不能であるため、それらがＣＤＲ内に位置しているか、及びどの程度存在しているかを決定することは困難である。
【0030】
高感度質量分析計検出器と、ますます多くの液体クロマトグラフィカラム化学及び酵素処理条件との統合により、一連の成熟したＰＴＭの特性評価法が得られた。液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を介した抗体のインタクト質量分析は、部位特異的ＰＴＭデータをもたらさないが、最小限の試料調製を必要とし、質量同定の追加の利点を有するより大きなＰＴＭの分析を提供することができる。
【0031】
ＩｄｅＳ、パパイン、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ（登録商標）、及びＦａｂＡＬＡＣＴＩＣＡ（登録商標）などの酵素によるジスルフィド結合還元及び／又は限定的な消化は、試料調製の時間がわずかに増えるが、ＰＴＭ局在化のサブユニットレベルの分解能が可能になり、これは、電子移動解離（ＥＴＤ）又は別のタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ２）アプローチを使用して各サブユニットを断片化することによって更に増加され得る。しかしながら、広いダイナミックレンジにわたるＰＴＭの部位特異的局在化及び定量化は、ペプチドマッピングと呼ばれる技術を使用して「ボトムアップ」で行われるのが最も一般的である。
【0032】
ペプチドマッピングの方法は、抗体の酵素消化を必要とし、ペプチド混合物が生成され、これを、液体クロマトグラフィで分離し、紫外線／可視（ＵＶ／Ｖｉｓ）吸光度で検出した後、イオン化し、質量分析計に注入する。完全なＭＳスペクトルを取得し、ペプチドを選択し、断片化して、ＭＳ／ＭＳスペクトルを生成させ、これらを使用して、ペプチドの同一性を検証するか、又は１つより多くの潜在的な修飾部位を含有するペプチド上のＰＴＭを局在化する。ペプチドマッピングは、潜在的に、抗体配列への調製関連アーチファクトに寄与し、実験の時間及び複雑性を著しく増加させることができるが、一般に、部位特異的であるだけでなく、最も感度の高いＰＴＭの特性評価法でもある。
【0033】
各修飾の定量化は、ＵＶを使用して、又は質量分析からの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を使用して、行うことができる。ＵＶ定量化は、共溶出ペプチドによって難読化され、現代の質量分析計よりも本質的に感度が低い。このため、ＸＩＣベースの定量化が日常的に行われ、ＭＳベースのペプチドマッピングアッセイは、最適な条件下、約０．１％未満の検出限界で、全ての関連するＰＴＭの同定、局在化、及び定量化を可能にする。
【0034】
ＸＩＣによるＰＴＭ定量化の利点は、その方法の精度（ａｃｃｕｒａｃｙ）及び精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）に影響を与えるいくつかの固有の課題を伴っている。これらの問題の多くは、いくつかの潜在的な理由による、非修飾ペプチドと修飾形態とのイオン化の違いに関連している。共溶出ペプチドピークからの一方又は両方のペプチド形態のイオン抑制があり得る。溶媒環境には、別々の保持時間で溶出する２つのペプチド形態間に差があり得る。修飾ペプチドと非修飾ペプチドとの間には、イオン化効率の差があり得る。そして、最後に、質量分析計間には変動があり得る。全てのＰＴＭのペプチドマッピング定量化は、これらの要因に影響を受けるが、Ｃ末端Ｋ切断（ｄｅｓ－Ｋ）の定量化は、特に、２＋の優位な電荷状態を有する未処理形態（Ｋ）と比較して、イオン化効率の違いによる及びペプチドの優位な電荷状態の１＋への低減による影響を受ける可能性がある。
【0035】
Ｃ末端Ｋ切断は、哺乳類組織培養細胞からの産生中に、カルボキシペプチダーゼ活性のために容易に生じる。結果として、組換えｍＡｂ又はｂｓＡｂにおける優位な形態は、ｄｅｓ－Ｋである。未処理Ｃ末端Ｋのパーセント相対存在量は、典型的には、Ｋ及びｄｅｓ－Ｋの合計と関連して計算される。未処理Ｃ末端Ｋは、ＣＤＲには存在せず、およそ１時間の半減期で注射時に急速に失われることが示されているため、抗体における有効性又は安全性の懸念であるとは考えられない。しかしながら、このＰＴＭの慎重なモニタリングは、プロセス制御を示し、より塩基性のｐＩ値を有する抗体はまた、組織への取り込み及び血液でのクリアランスの増加を有する可能性が報告されている。
【0036】
これらの理由から、未処理Ｃ末端Ｋ測定は依然として重要であり、ペプチドマッピング定量化中ではＫのパーセンテージが過大に評価され得ることが、以前の取り組みで見出されている。これは、ペプチド配列のＣ末端上の追加のＫが、ｄｅｓ－Ｋペプチドに比べてイオン化効率を増加させるためである。
【0037】
この誤差を最小化するためのいくつかの試みは、各ペプチドについてのＸＩＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を計算するために最も豊富な電荷状態のみを使用すること、又は等モル量の各ペプチドをＬＣカラムに注入し、質量分析計の応答を測定することによって決定される補正係数を使用することを含む。しかしながら、第１の方法は、未処理Ｃ末端Ｋ値の大きさを減少させるが、この値がどの程度減少されるべきかについての経験的な知識がないか、又はほとんどない状態で行われる。補正係数法は、補正係数が、未処理Ｃ末端Ｋの可能な濃度範囲にわたって、潜在的に共溶出するペプチドの存在下で、及び異なる質量分析計間で、静的なままであると仮定する。これらの因子の変動は、静的補正係数を使用した場合に補償されない可能性のある未処理Ｃ末端Ｋに対する処理Ｃ末端Ｋの測定値の、より大きな不正確さにつながるであろう。
【0038】
組換えタンパク質、例えば、組換え抗体の未処理Ｃ末端リジンにおけるＰＴＭを正確に定量化する課題に対処するために、重同位体ペプチド標準物質を使用して、修飾ペプチドと非修飾ペプチドとの間の検出差を正規化する検量線を生成するための方法及びキットが、本明細書に記載される。
【0039】
図１Ａ及び図１Ｂに、本発明の例示的な実施形態が示されており、５つの重ペプチドは、抗体消化物の存在下で共インキュベートされて、検出可能なシグナルを生成する。検出可能なシグナルは、「クリップされた」及び「クリップされていない」Ｃ末端リジン（Ｋ）の正確な測定値を示すことができる。
【0040】
重ペプチドの新規のセット及び分析化学（例えば、液体クロマトグラフィ及び質量分析）を使用した本発明のアッセイを較正して、非常に正確な測定値を提供することができる。このアッセイの忠実性は、複合タンパク質分子（例えば、ヒト患者に導入されるように設計された治療用抗体）の製造にとって重要である。
【0041】
本発明は、本発明のアッセイを実施するためのキットも提供する。例示的な実施形態では、ＰＴＭ、例えば、Ｃ末端リジン（Ｋ）の存在の正確かつ真の測定値を決定するためのアッセイにおける重要なステップは、適切な標準物質及び試料と混合した場合に読み取り可能なシグナルを提供するような、複数の十分な１つ以上の重ペプチドを使用することである。シグナルは、典型的には、分析化学、例えば、液体クロマトグラフィ－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）を使用して測定される。
【0042】
したがって、本発明の方法を実施するためのキットの例示的な構成要素は、関心対象のＰＴＭを含まない標準的なペプチド（例えば、Ｃ末端リジンの「クリップされた」ペプチド）、関心対象のＰＴＭを有する標準的なペプチド（例えば、「クリップされていない」ペプチド）、例えば、本明細書に開示される以下の例示的なペプチドのうちの１つ以上を含む（「クリップされた」及び「クリップされていない」）標準的な重ペプチド、並びに、例えば、較正、データ抽出、分析、及び解釈のための説明を含む使用説明書を含み得る。
【0043】
したがって、本発明は、重要な抗体製造の化学、製造、及び品質管理（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＣＭＣ）エンドポイントを改善するための便利な検査キット及び説明書を提供する。
【0044】
本発明は、治療用抗体などの治療用タンパク質の微細構造及び正確なアミノ酸配列の正確な決定を提供することを理解されたい。したがって、本発明は、治療用抗体などの任意の市販の治療用タンパク質のＣＭＣ（化学、製造、及び品質管理）を補完及び改善する。
【0045】
例えば、本発明は、いくつかの抗体療法の製造及び保護の改善を可能にする。かかる抗体療法には、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、ａｄｏ－トラスツズマブ、エムタンシン、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カプロマブ・ペンデチド、セルトリズマブ・ペゴル、セツキシマブ、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ）、ダクリズマブ（Ｚｉｎｂｒｙｔａ）、ダラツムマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エボロクマブ、ゴリムマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ａｂｄａ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ、イピリムマブ・イキセキズマブ、メポリズマブ、ナタリズマブ、ネシツムマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、サリルマブ、リツキシマブ、ヒアルロニダーゼ・グセルクマブ、イノツズマブ・オゾガマイシン、アダリムマブ－ａｄｂｍ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ベバシズマブ－ａｗｗｂ、ベンラリズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、トラスツズマブ－ｄｋｓｔ、インフリキシマブ－ｑｂｔｘ、イバリズマブ－ｕｉｙｋ、チルドラキズマブ－ａｓｍｎ、ブロスマブ－ｔｗｚａ、及びエレヌマブ－ａｏｏｅが含まれる。
【0046】
本発明の対象となる様々な適応症のための他の関心対象の治療用抗体としては、眼障害を治療するためのアフリベルセプト、失明及び転移性大腸がんを治療するためのリロナセプト、家族性高コレステロール血症又は臨床的アテローム動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）を治療するためのアリロクマブ、アトピー性皮膚炎を治療するためのデュピルマブ、関節リウマチ及びＣＯＶＩＤ－１９を治療するためのサリルマブ、ＰＤ－１関連疾患を治療するためのセミプリマブ、並びにエボラを治療するための抗体が挙げられる。
【0047】
別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。当業者に既知の本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を、本明細書に記載の特定の実施形態の実施に使用することができる。言及される全ての刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【0048】
「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。「約」及び「およそ」という用語は、当業者に理解されるように標準的な変形例を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることが意図され、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味することが理解される。
【0049】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」又は「関心対象のタンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含むことができる。タンパク質は、一般に「ポリペプチド」として当該技術分野で既知の１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連した天然に存在する構造バリアント、及びペプチド結合を介して連結された合成の天然に存在しないそれらの類似体、関連した天然に存在する構造バリアント、及び合成の天然に存在しないそれらの類似体からなるポリマーを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、天然に存在しないペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が、当業者に既知である。タンパク質は、単一の機能的生体分子を形成する、１つ又は複数のポリペプチドを含み得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。関心対象のタンパク質は、バイオ治療用タンパク質、研究又は療法で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のうちのいずれかを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルスシステム、酵母システム（例えば、ピキア属の種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、又は哺乳類システム（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞などのＣＨＯ派生物）などの組換え細胞ベースの産生システムを使用して産生され得る。バイオ治療用タンパク質とその産生を論じる最近の総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ １４７－１７６（２０１２）を参照されたい（その教示の全体が参照により本明細書に援用される）。タンパク質は、組成物及び溶解度に基づいて分類され得、したがって、単純タンパク質（例えば、球状タンパク質及び線維性タンパク質）、複合タンパク質（例えば、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リン酸化タンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質）、並びに誘導タンパク質（例えば、一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質）を含むことができる。
【0050】
一部の例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質は、組換えタンパク質、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせであり得る。
【0051】
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、好適な宿主細胞に導入された組換え発現ベクター上に担持された遺伝子の転写及び翻訳の結果として産生されるタンパク質を指す。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体）であり得る。特定の例示的な実施形態では、組換えタンパク質は、以下からなる群から選択されるアイソタイプの抗体であり得る：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、又はＩｇＥ。
【0052】
本明細書で使用される「抗体」という用語には、免疫グロブリン分子が含まれ、これは、ジスルフィド結合によって相互接続された４本のポリペプチド鎖である２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖、並びにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲ又はＶＨと略記される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、以下の３つのドメインを含む：ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲ又はＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、以下の１つのドメインを含む：ＣＬ１。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域により散在する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。本発明の異なる実施形態では、抗ビッグＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、又は天然であり得るか、若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの対比分析（ｓｉｄｅ－ｂｙ－ｓｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づいて定義され得る。本明細書で使用される「抗体」という用語には、完全な抗体分子の抗原結合断片も含まれる。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成若しくは遺伝子操作ポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質消化などの任意の好適な標準技術、又は抗体の可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う組換え遺伝子操作技術を使用して、完全な抗体分子に由来し得る。かかるＤＮＡは既知であり、かつ／又は、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、若しくは合成することができる。ＤＮＡを、配列決定し、化学的に又は分子生物学的技術を使用すること（例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／若しくは定常ドメインを好適な構成に配置するか、又はコドンを導入するか、システイン残基を作製するか、アミノ酸を改変するか、付加するか、若しくは欠失させるかなど）によって操作してもよい。
【0053】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などを含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びに抗体断片から形成されるトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、並びに多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせである。ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって連結された組換え単鎖ポリペプチド分子である。一部の例示的な実施形態では、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、一部の例示的な実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、かつ／又は抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的又は化学的に産生されてもよく、かつ／又は部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生されてもよい。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、完全に又は部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、単鎖抗体断片を含んでもよい。代替的に、又は追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結される複数の鎖を含んでもよい。抗体断片は、任意選択的に、多分子複合体を含んでもよい。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。
【0054】
「二重特異性抗体」という用語は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖が、２つの異なる分子（例えば、抗原）上又は同じ分子（例えば、同じ抗原）上のいずれかで、異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープ及び第２のエピトープ）に選択的に結合することができる場合、第１の重鎖の第１のエピトープに対する親和性は、概して、第１の重鎖の第２のエピトープに対する親和性よりも少なくとも１～２桁又は３桁若しくは４桁低くなるであろうし、逆もまた同様である。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。
【0055】
典型的な二重特異性抗体は、２つの重鎖を有し、その各々が、３つの重鎖ＣＤＲを有し、続いて、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを有し、並びに免疫グロブリン軽鎖であって、抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合することができるか、又は各重鎖と会合することができ、かつ重鎖抗原結合領域が結合するエピトープのうちの１つ以上と結合することができるか、又は各重鎖と会合することができ、かつ一方若しくは両方の重鎖が一方若しくは両方のエピトープと結合することを可能にする、免疫グロブリン軽鎖を有する。ＢｓＡｂは、Ｆｃ領域（ＩｇＧ様）を有するものとＦｃ領域を欠くものとの２つの主要なクラスに分類することができ、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧ及びＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、異なる形式、例えば、限定されないが、トリオマブ、ノブ・イントゥ・ホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、クロスＭａｂ、オルト－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツー・イン・ワンＦａｂ若しくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－単鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、又はκλボディを有することができる。非ＩｇＧ様の異なる形式としては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、又はドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）法によって産生される抗体（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ Ｍｉｎｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ １３０；Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ２６５－３１０（２０１４）、これらの教示全体は、参照により本明細書に援用される）が挙げられる。ｂｓＡｂを産生する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を伴う化学的コンジュゲーション、及び組換えＤＮＡ技術を利用した遺伝的アプローチに限定されない。ｂｓＡｂの例としては、以下の特許出願に開示されているものが挙げられる（参照により本明細書に援用される）：２０１０年６月２５日に出願された米国特許第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に出願された米国特許第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に出願された米国特許第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に出願された米国特許第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９日に出願された米国特許第１５／２２３４３号、及び２０１７年１１月１５日に出願された米国特許第１５８１４０９５号。低レベルのホモ二量体不純物は、二重特異性抗体の製造中のいくつかのステップで存在し得る。かかるホモ二量体不純物の検出は、インタクト質量分析を使用して実施した場合、困難である可能性があり、通常の液体クロマトグラフィ法を使用して実施した場合、ホモ二量体不純物の存在量が少なく、これらの不純物と主要種とが共溶出するためである。
【0056】
本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原に対する特異性を有する抗体を指す。かかる分子は、通常、２つの抗原のみに結合するが（すなわち、二重特異性抗体、ｂｓＡｂ）、三重特異性抗体及びＫＩＨ三重特異性抗体などの追加の特異性を有する抗体は、本明細書に開示されるシステム及び方法によっても対処することができる。
【0057】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能又は既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一のクローンに由来し得る。本開示に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で既知の多種多様な技法を使用して調製することができる。
【0058】
「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という語句は、関心対象のタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入された細胞を含む。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫も指すことが意図されていることが理解されるべきである。特定の修飾は、変異又は環境の影響のいずれかにより後の世代で生じ得るため、かかる子孫は、実際には、親細胞と同一ではないが、依然として本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。一実施形態では、宿主細胞は、生物界のいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞を含む。一態様では、真核細胞は、原生生物、真菌、植物、及び動物細胞を含む。更なる態様では、宿主細胞は、植物細胞及び／又は動物細胞などの真核細胞を含む。細胞は、哺乳動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、両生類細胞、又は鳥類細胞であり得る。特定の態様では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。培養物中での増殖に好適な多種多様な哺乳動物細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）及び他の保管所貯蔵所並びに商業ベンダーから入手可能である。本発明のプロセスで使用することができる細胞としては、ＭＫ２．７細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１）、ＤＧ４４（Ｃｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１２：５５５－５５６、Ｋｏｌｋｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：１０９０１－１０９０９、及びＷＯ０１／９２３３７Ａ２）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６）、及びｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（米国特許第５，７２１，１２１号）、サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７０）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６５１）、ＨＥＫ２９３細胞、及びＳｐ２／０細胞、５Ｌ８ハイブリドーマ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、ＥＬ４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｋ５６２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ－１細胞、Ｓｐ２／０細胞、初代上皮細胞（例えば、ケラチノサイト、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞、及び網膜上皮細胞）、並びに樹立細胞株及びそれらの株（例えば、ヒト胎児腎臓細胞、２９３細胞、又は浮遊培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，１９８０，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７５）、ヒト肝細胞がん細胞（ＨＥＰ－Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－５１）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４４２）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，１９８２，Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８）、ＭＣＲ５細胞、ＦＳ４細胞、ＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞，ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳ１８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－１細胞、ＬＬＣ－ＰＫ１細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨ１細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨ１Ｃ１細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、及びＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、若しくはそれらの誘導体）、任意の組織若しくは臓器（心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃、扁桃、骨髄、及び血液）、脾臓を含むが、これらに限定されない）からの線維芽細胞、並びに線維芽細胞及び線維芽細胞様細胞株（例えば、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、デンプシー細胞、デトロイト５５１細胞、デトロイト５１０細胞、デトロイト５２５細胞、デトロイト５２９細胞、デトロイト５３２細胞、デトロイト５３９細胞、デトロイト５４８細胞、デトロイト５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、ＭｉＣｌ１細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７；ＶＥＲＯ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭ１Ｃ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、Ｓｔｒａｉｎ２０７１（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２及び２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、インドキョン細胞、ＳＩＲＣ細胞、ＣＩＩ細胞、及びＪｅｎｓｅｎ細胞、若しくはそれらの誘導体）、又は当業者に既知の任意の他の細胞型が挙げられるが、これらに限定されない。
【0059】
本明細書で使用される場合、「治療用タンパク質」という用語は、疾患又は障害の治療のために対象に投与され得る任意のタンパク質を指す。治療用タンパク質は、薬理学的効果を有する任意のタンパク質（例えば、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、又は酵素）であり得る。
【0060】
本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィ」という用語は、液体によって担持される生体／化学混合物が、静止した液体又は固相を通って（又はその中に）流れる成分の差次的分布の結果として、成分に分離され得るプロセスを指す。液体クロマトグラフィの非限定的な例としては、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、又は混合モードクロマトグラフィが挙げられる。
【0061】
本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し、それらの正確な質量を測定することができるデバイスを含む。この用語は、ポリペプチド又はペプチドを特徴付けることができる任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、３つの主要な部分であるイオン源、質量分析器、及び検出器を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析物の原子、分子、又はクラスターを、同時に（エレクトロスプレーイオン化のように）又は別々のプロセスを介してのいずれかで、気相に移し、イオン化することができる。イオン源の選択は、用途に依存する。
【0062】
一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、複数の段階の質量選択及び質量分離を使用することによって、試料分子に関する構造情報が得られる技術を含む。前提条件は、第１の質量選択ステップの後、断片が予測可能かつ制御可能な様式で形成されるように、試料分子を気相に移し、イオン化することである。多段階ＭＳ／ＭＳ（すなわち、ＭＳｎ）は、まず、前駆体イオン（ＭＳ２）を選択し、単離し、断片化し、一次断片イオン（ＭＳ３）を単離し、断片化し、二次断片イオン（ＭＳ４）を単離するなど、有意義な情報を得ることができるか又は断片イオンのシグナルが検出可能である限り、実施することができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせで成功裏に実行されている。特定の用途のために組み合わせる分析器は、感度、選択性、及び速度などの多くの異なる要因によって決定することができるが、サイズ、コスト、及び可用性も同様である。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリは、タンデム・イン・スペース（ｔａｎｄｅｍ－ｉｎ－ｓｐａｃｅ）及びタンデム・イン・タイム（ｔａｎｄｅｍ－ｉｎ－ｔｉｍｅ）であるが、タンデム・イン・タイム分析器が空間的に結合されるか、又はタンデム・イン・スペース分析器と結合されるハイブリッドも存在する。タンデム・イン・スペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化デバイス、及び少なくとも２つの非捕捉型質量分析器を含む。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器のあるセクションでイオンが選択され、中間領域で解離され、次いで、プロダクトイオンが、ｍ／ｚ分離及びデータ収集のために別の分析器に伝送されるように設計することができる。タンデム・イン・タイム質量分析計では、イオン源で生成されたイオンを、同じ物理デバイスで捕捉、単離、断片化、及びｍ／ｚ分離することができる。質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理代表として使用することができる。これらは、実験データと理論的ＭＳ／ＭＳデータとを相関させることによって、タンパク質の特徴付けに使用することができ、後者は、タンパク質配列データベース内の可能性のあるペプチドから生成される。この特徴付けには、限定されないが、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質配列の決定、タンパク質デノボ配列決定、翻訳後修飾の位置決定、若しくは翻訳後修飾の同定、若しくは比較可能性分析、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【0063】
本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、例えば、ＦＡＳＴＡ形式のファイルの形態で、試料中に存在し得るタンパク質配列のコレクションを指す。関連するタンパク質配列は、研究対象の種のｃＤＮＡ配列に由来し得る。関連するタンパク質配列を検索するために使用され得る公開データベースには、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔによってホストされているデータベースが含まれた。データベースは、本明細書で「バイオインフォマティクスツール」と称されるデータベースを使用して検索され得る。バイオインフォマティクスツールは、データベース内の全ての可能な配列に対して解釈されていないＭＳ／ＭＳスペクトルを検索する能力を提供し、解釈された（注釈付けられた）ＭＳ／ＭＳスペクトルを出力として提供する。そのようなツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、又はＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。
【0064】
一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、液体クロマトグラフィシステムに結合することができる。一部の例示的な実施形態では、質量分析計は、液体クロマトグラフィ－多重反応モニタリングシステムに結合することができる。より一般的には、質量分析計は、連続反応モニタリング（ＣＲＭ）及び並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）による分析が可能であり得る。
【0065】
本明細書で使用される場合、「多重反応モニタリング」又は「ＭＲＭ」は、質量分析ベースの技術を指し、これは、高感度、高特異性、及び幅広いダイナミックレンジで複雑なマトリックス内の低分子、ペプチド、及びタンパク質を正確に定量化することができる（Ｐａｏｌａ Ｐｉｃｏｔｔｉ ＆ Ｒｕｅｄｉ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｗｏｒｋｆｌｏｗｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｐｉｔｆａｌｌｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，９ ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ ５５５－５６６（２０１２））。ＭＲＭは、典型的には、トリプル四重極質量分析計を用いて実施することができ、選択された小分子／ペプチドに対応する前駆体イオンが第１の四重極内で選択され、前駆体イオンの断片イオンが第３の四重極内でモニタリングするために選択される（Ｙｏｎｇ Ｓｅｏｋ Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，９３０ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ｂ １２９－１３５（２０１３））。
【0066】
一部の態様では、本出願の方法又はシステムにおける質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又はトリプル四重極質量分析計であってもよく、質量分析計を、液体クロマトグラフィシステムに結合することができ、質量分析計が、ＬＣ－ＭＳ（液体クロマトグラフィ－質量分析）又はＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ（液体クロマトグラフィ－多重反応モニタリング－質量分析）分析を実行することができる。
【0067】
本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤（例えば、酵素消化又は非酵素消化）を使用して、試料中のタンパク質の消化を行うためのいくつかのアプローチがある。
【0068】
本明細書で使用される場合、「消化酵素」という用語は、タンパク質の消化を行うことができる多数の異なる薬剤のうちのいずれかを指す。酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓａｉｔｏｉ由来プロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）、又は外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）のプロテアーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、若しくは生物活性断片、若しくはそれらのホモログ、又はそれらの組み合わせが挙げられる。タンパク質消化のための利用可能な技術を論じる最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ ＆ Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。
【0069】
消化酵素の量及び消化に要する時間を適切に選択することができる。酵素対基質比が不適切に高い場合、これに対応して、高い消化率により、ペプチドが質量分析計によって分析されるのに十分な時間が得られず、配列カバレッジが損なわれる。その一方、酵素対基質の比率が低いと、消化時間を長くする必要があるため、データ取得時間が長くなる。酵素対基質の比率は、約１：０．５～約１：２００の範囲であり得る。
【0070】
本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」又は「ＰＴＭ」という一般用語は、ポリペプチドがリボソーム合成中（翻訳時修飾）又は合成後（翻訳後修飾）のいずれかで受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは、一般に、特定の酵素又は酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（シグネチャー配列）の部位で生じる。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は必然的に、タンパク質の構造又は機能の一部の態様に影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾には、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンによるリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（アセチル基の付加、通常はタンパク質のＮ末端）、アルキル化（通常はリジン又はアルギニン残基におけるアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内又は間の共有結合架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリジンのヒドロキシル化及びカルボキシ末端のアミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ビタミンＫがグルタミン酸残基のカルボキシル化における補因子であり、γ－カルボキシグルタミン酸（グルタミン酸残基）の形成をもたらす）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（グリシン残基の共有結合）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン、又はスレオニンのいずれかへのグリコシル基の付加、糖タンパク質をもたらす）、イソプレニル化（ファルネソール及びゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポ酸官能基の付加）、ホスホパンテテイン化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、及びロイシン生合成における、補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常はセリン、チロシン、スレオニン、又はヒスチジンへのリン酸基の付加）、並びに硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾には、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸へ又はアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が含まれるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾には、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）及びタンパク質分解切断（タンパク質のペプチド結合における切断）が含まれるが、これらに限定されない。例示的な一実施形態では、翻訳後修飾は、タンパク質Ｃ末端におけるリジンの切断である。特定の翻訳後修飾は、他のタンパク質又はペプチドの付加、例えば、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質への共有結合（インターフェロン刺激遺伝子））、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質への共有結合（低分子ユビキチン様修飾因子））、及びユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）を伴う。ＵｎｉＰｒｏｔによって精選されたＰＴＭのより詳細な統制語彙については、欧州バイオインフォマティクス研究所のタンパク質情報リソースＳＩＢスイスバイオインフォマティクス研究所、ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＤＲＳ－ＤＲＯＳＯＭＹＣＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ－ＤＲＯＳＯＰＨＩＬＡ ＭＥＬＡＮＯＧＡＳＴＥＲ（ＦＲＵＩＴ ＦＬＹ）－ＤＲＳ ＧＥＮＥ＆ＰＲＯＴＥＩＮ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔを参照されたい。
【0071】
本明細書で使用される場合、「Ｃ末端リジン（Ｋ）」又は「Ｋペプチド」という用語は、アミノ酸配列の末端に存在し得るか又は存在しないアミノ酸リジン残基又は「Ｋ」残基を指す。例示的な実施形態では、Ｃ末端リジンは、抗体の重鎖上にある。「切断ペプチド」又は「（ｄｅｓ－Ｋ）」という用語は、Ｃ末端リジン（Ｋ）を欠くＣ末端アミノ酸配列を有するタンパク質の代表的な部分を指す。
【0072】
本明細書で使用される場合、「クリップされていない」という用語は、Ｃ末端配列が末端リジン（Ｋ）アミノ酸残基を有するタンパク質のＣ末端配列を指す。本明細書で使用される場合、「クリップされた」という用語は、Ｃ末端配列が末端リジン（Ｋ）アミノ酸残基を欠くタンパク質のＣ末端配列を指す。
【0073】
本明細書で使用される場合、「Ｋペプチドのパーセンテージを分析及び定量化する」という用語は、タンパク質配列のＣ末端リジンの相対的な存在又は不在を確認するのに十分な第１のアッセイシグナルと第２のアッセイシグナルとの間の差を比較することを指す。例示的な一実施形態では、タンパク質配列は、抗体重鎖である。
【0074】
本明細書で使用される場合、「重ペプチド」という用語は、本発明の任意のペプチド又はその等価物を指し、ペプチドの少なくとも１つ以上の炭素原子又は窒素原子は、その重同位体、例えば、１３Ｃ及び１５Ｎの同位体である。
【0075】
本明細書で使用される場合、「ペプチド消化物」という用語は、タンパク質を、タンパク質配列を消化することができる１つ以上の酵素と接触させることによって生じるペプチドの混合物を指す。例示的な一実施形態では、ペプチド消化物は、消化したタンパク質のＣ末端を表すポリペプチド配列を含む。
【0076】
本発明は、前述の関心対象のタンパク質、治療用タンパク質、組換えタンパク質、組換え宿主細胞、抗体、液体クロマトグラフィシステム、質量分析計、データベース、バイオインフォマティクスツール、消化酵素、翻訳後修飾、又は重ペプチドのうちのいずれかに限定されず、任意の関心対象のタンパク質、治療用タンパク質、組換えタンパク質、組換え宿主細胞、抗体、液体クロマトグラフィシステム、質量分析計、データベース、バイオインフォマティクスツール、消化酵素、翻訳後修飾、又は重ペプチドは、任意の好適な手段によって選択することができることが理解されよう。
【0077】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0078】
材料及び方法。本発明は、当業者によって実施される場合、薬化学、免疫学、分子生物学、細胞生物学、組換えＤＮＡ技術、及びアッセイ技術の分野における従来の技術を利用することができ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，３ｒｄ ｅｄ．２００１、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．“Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，５ｔｈ ｅｄ．１９９５、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ（ｅｄｓ．）．“ＰＣＲ ２：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，１９９５、“Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．）“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”１９８８、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ｅｄ．）“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ”，４ｔｈ ｅｄ．２０００、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”ｖｏｌ．１４９（“Ｔｈｅ ＥＬＩＳＡ Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ”ｂｙ Ｊｏｈｎ Ｃｒｏｗｔｈｅｒ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００１、及びこれらの専門書の以降の版（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｇｒｅｅｎ（４ｔｈ Ｅｄ．２０１２）及び“Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ”ｂｙ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（７ｔｈ Ｅｄ．，２０１５）、並びに現在の電子版に記載されている。
【0079】
タンパク質のＰＴＭを定量化及び分析するのに有用な方法が、本開示内に提供される。より具体的には、本開示は、タンパク質、例えば、抗体のＣ末端リジン（Ｋ）を定量化及び分析するための方法を提供する。本方法は、重Ｃ末端ペプチド標準物質のセットを、消化したタンパク質に適用することを含む。タンパク質は、トリプシンなどのプロテアーゼ及び他の好適な酵素によって消化され得る。
【0080】
本発明の方法は、検量線を抗体消化物にスパイクすることと、各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実行において、およそ等モル量の重ｄｅｓ－Ｋペプチドと消化したｄｅｓ－Ｋペプチドをカラムに注入することと、を含み得る。未処理Ｃ末端Ｋは、１回のＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピング実験で定量化することができる。
【0081】
本発明の方法は、約１：１０００～１：１のＫ対ｄｅｓ－Ｋペプチドの比率範囲にわたって検量線を生成することを含み得る。検量線は、約１０％未満、約９％未満、又は約８％未満の誤差を有し得る。
【0082】
質量スペクトルは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ３、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ４、又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計などの様々な分光計を使用して定量化することができる。
【0083】
以下の実施例は、組換えタンパク質におけるＰＴＭを同定及び定量化するための例示的な方法を示す。
【0084】
実施例１．アッセイ設計及び較正方法
本実施例は、ＰＴＭで修飾されたペプチドと、当該ＰＴＭを含まない同じペプチドとの比率を正確に評価するための検量線を生成するための、本発明のアッセイの実験設計を示す。
本実施例は、ＰＴＭで修飾されたペプチドと、当該ＰＴＭを含まない同じペプチドとの比率を正確に評価するための検量線を生成するための、本発明のアッセイの実験設計を示す。
【0085】
全ての軽及び重同位体ペプチド標準物質は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｇａｒｄｎｅｒ，ＭＡ）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸（ＦＡ）、トリス［２－カルボキシルエチル］ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、及びＯｐｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳグレードアセトニトリル（ＡＣＮ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手し、氷酢酸及びヨードアセトアミド（ＩＡＭ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。配列決定グレード修飾トリプシン、超高純度尿素、及び超高純度１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）は、それぞれ、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｈａｖｅｒｈｉｌｌ，ＭＡ）、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０水精製システムによって精製した。
【0086】
同位体ＨＣ Ｃ末端ペプチド標準物質を使用して、対応する光未処理ペプチドと処理ペプチドとの間の質量分析計応答を正規化した。ペプチド標準物質には、ＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１）、ＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２）、ＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３）、及びＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４）が含まれた。
【0087】
図１に、重同位体ＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２）標準物質を示す。１３Ｃ及び１５Ｎは、●で示されている。Δ４（例えば、炭素又は窒素の４つの重同位体を含む）、Δ８、Δ１２、及びΔ１６Ｋペプチドを、それぞれ図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄに示す。図２に、重同位体ＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１）標準物質、Δ４ ｄｅｓ－Ｋを示す。１３Ｃ及び１５Ｎは、●で示されている。
【0088】
ペプチド標準物質を、１０％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡに溶解し、Ｃ末端配列（ＬＧＫ又はＰＧＫ）に従って２つの検量線セットへと組み合わせた。各セットは、等モル濃度のΔ４ ｄｅｓ－Ｋ及びＫペプチド、並びにそれぞれ１：１０、１：１００、及び１：１０００のＫ対ｄｅｓ－Ｋのモル比でΔ８、Δ１２、及びΔ１６Ｋペプチドを含有した。図３に示すように、混合物をＸＩＣによって分析した。
【0089】
図４Ａに示すように、ＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４）及びＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３）の等モル混合物を、ＵＶクロマトグラフィによって定量化した。ＰＧＫペプチドの対応するＫ ＡＵＣ値／ｄｅｓ－Ｋ ＡＵＣ値は、１．０８であった。同様に、ＬＧＫペプチドのＫ ＡＵＣ値／ｄｅｓ－Ｋ ＡＵＣ値は、１．０７であった。図４Ｂに示すように、等モル量のＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４）及びＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号３）の試薬セットを、ＸＩＣによって定量化した。表１に、ＰＧＫ及びＬＧＫペプチドの重ＡＵＣ／軽ＡＵＣ値を示す。
【0090】
【表1】
【0091】
表１に示すように、重ペプチドのシグナルは、対応する軽ペプチドとほぼ等しく、軽ペプチドに適用可能な検量線を生成する際の、重ペプチドの使用を検証した。
【0092】
本方法の精度を測定するために、既知の量の軽ｄｅｓ－Ｋ及びＫを、１：１０～１：１０００のＫペプチド対ｄｅｓ－Ｋペプチドの比率範囲にわたって試薬セットにスパイクし、検量線補正法を使用して測定した。表２に示すように、検量線補正値（又は「正規化」値）は、予想されるリジンの割合（％）とほぼ一致した。
【0093】
【表2】
【0094】
実施例２．ｍＡｂの未処理Ｃ末端リジンの定量化
この実施例は、組換えタンパク質のＣ末端リジン（Ｋ）を正確に定量化するための本発明のアッセイの実験設計を示す。
この実施例は、組換えタンパク質のＣ末端リジン（Ｋ）を正確に定量化するための本発明のアッセイの実験設計を示す。
【0095】
抗体分析のために、検量線を抗体消化物にスパイクし、各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実行において、およそ等モル量の重ｄｅｓ－Ｋペプチドと消化したｄｅｓ－Ｋペプチドをカラムに注入した。
【0096】
抗体の消化。等重量の５つのＩｇＧ４ ｍＡｂ試料を、５ｍＭの酢酸及び５ｍＭのＴＣＥＰ－ＨＣｌに緩衝液交換し、その後８０℃で１０分間の変性及び還元を行った。試料を、４Ｍの尿素／０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で更に変性させ、暗所で室温で３０分間５ｍＭのＩＡＭでアルキル化した。０．１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を添加することによって、尿素濃度を１Ｍに低下させ、１：２０の抗体対トリプシンの比率で、抗体を３７℃で４時間消化した。試料を０．２％のＴＦＡ中で酸性化することによって、酵素活性をクエンチした。
【0097】
ＬＣ－ＭＳ及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳのパラメータ。５μｇの抗体消化物のアリコートを、１．７μｍの粒子を含む２．１ｍｍ×１５０ｍｍのＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ超高性能液体クロマトグラフィ（ＵＰＬＣ）荷電表面ハイブリッド（ＣＳＨ）Ｃ１８カラムに注入した。ペプチドを、２５０μＬ／分の流速及び４０℃のカラム温度に設定したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣで、このカラム上で分離した。勾配は、有機移動相（ＡＣＮ及び０．１％のＦＡ）を水及び０．１％のＦＡに対して９５分間にわたって０．１％から３５％に増加させることから構成された。
【0098】
ＱＥ Ｐｌｕｓ３及び４システム及び／又はＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計を使用して、Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓを使用して質量データを得た。Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓで完全質量スキャンを行い、自動ゲイン制御（ＡＧＣ）目標を１×１０６に、又は最大イオン注入時間（最大ＩＴ）を５０ｍｓに設定することよって制限されたイオン集団に対して、分解能１４０，０００（ｍ／ｚ ２００）で３００～２０００のｍ／ｚ範囲を取得した。
【0099】
データ依存的取得（ＤＤＡ）によるＭＳ／ＭＳ同定を必要とする実験の場合、単一のｄｄ－ＭＳ／ＭＳループは、正規化衝突エネルギーが３０で高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を使用して、５つの最も強いペプチドイオンの各々を、１．５Ｔｈウインドウで単離し、断片化することによって開始した。
【0100】
断片イオン集団データを、１×１０５のＡＧＣ標的又は１００ｍｓの最大ＩＴを使用して収集し、次いで、１７，５００の分解能でスキャンし、その時点で、サンプリングされた前駆体を除外リストに１０秒間配置して、強度の低いイオンの分析を確実にした。
【0101】
ＭＳ取得のためのＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓパラメータは、ＱＥ－Ｐｌｕｓと同じであったが、分解能を１２０，０００（ｍ／ｚ ２００）に設定し、ＡＣＧ目標を５×１０５に設定した点で異なった。ＭＳ／ＭＳ設定の違いは以下のとおりであった：前駆体の数ではなく１秒のサイクル時間でＤＤＡを制限すること、ＡＧＣ標的を２×１０４に設定すること、最大ＩＴを５０ｍｓで制御するが、並列化可能な時間がある場合は連続注入を可能にすること、及び分解能１５，０００（ｍ／ｚ ２００）でスキャンすること。
【0102】
関連するＬＣ－ＭＳ／ＭＳの生ファイルを、以下のパラメータに従って、各抗体についてカスタムｆａｓｔａファイルを使用してＢｙｏｎｉｃ ３．０で分析した。（１）切断部位：Ｒ，Ｋ、（２）切断側：Ｃ末端、（３）消化特異性：完全に特異的、（４）前駆体質量許容差：１０ｐｐｍ、（５）断片化の種類：ＱＴＯＦ／ＨＣＤ、（６）断片質量許容差：２０ｐｐｍ、（７）固定修飾及び可変修飾：（固定）Ｃカルバミドメチル、（可変）Ｍ酸化、（可変）Ｅ／ＱからｐＥ、及び（可変）Ｃ末端Ｋ欠失、並びに（８）グリカン修飾：５０の一般的な二分岐Ｎ－グリカン。軽Ｃ末端ペプチド及び重Ｃ末端ペプチドの１＋及び２＋電荷状態のイオンクロマトグラムを、Ｇｅｎｅｓｉｓアルゴリズムによって、ｍ／ｚ許容差を１０ｐｐｍに設定することによって、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ ３．１で抽出した。定量的なＡＵＣ測定値を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌにエクスポートし、１：１０００～１：１のＫ対Ｋ－ｄｅｓの範囲の検量線を構築して、各試料中の未処理Ｃ末端Ｋの割合（％）を計算した。
【0103】
表３は、通常の未補正ペプチドマッピングと比較した、検量線補正法を使用して得られた結果を示す。表３に示すように、Ｃ末端リジンの割合（％）は、本開示の検量線（ＣＣ）補正法と比較して、未補正ペプチドマッピングを使用したペプチドの定量中では過大に評価される。したがって、本発明の方法は、組換えタンパク質のＰＴＭ、例えば、抗体のＣ末端リジンの定量化のための重要な補正を提供する。
【0104】
【表3】
【0105】
実施例３．二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）の未処理Ｃ末端リジンの定量化
本実施例は、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）のＰＴＭを正確に定量化するための本発明のアッセイの実験設計を示す。
本実施例は、二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）のＰＴＭを正確に定量化するための本発明のアッセイの実験設計を示す。
【0106】
上記のように、ＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２）及びＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４）のＣ末端配列の両方を含有する７つのＩｇＧ４ベースのｂｓＡｂを消化した。検量線を抗体消化物にスパイクし、各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実行において、およそ等モル量の重ｄｅｓ－Ｋペプチドと消化したｄｅｓ－Ｋペプチドをカラムに注入した。対照ｂｓＡｂ消化物を、従来の未補正ペプチドマッピングに供した。
【0107】
表４は、ＰＧＫのＣ末端配列の通常の未補正ペプチドマッピングと比較した、検量線補正法を使用して得られた結果を示す。表４に示すように、Ｃ末端リジンの割合（％）は、本開示のＣＣ補正方法と比較して、未補正ペプチドマッピングを使用したペプチド定量中では有意に過大に評価される。
【0108】
【表4】
【0109】
表５は、ＬＧＫのＣ末端配列の未補正ペプチドマッピングと比較した、検量線補正法を使用して得られた結果を示す。表５に示すように、Ｃ末端リジンの割合（％）は、本開示のＣＣ補正方法と比較して、未補正ペプチドマッピングを使用したペプチド定量中では有意に過大に評価される。
【0110】
【表5】
【0111】
更なる実験を実施して、本発明の方法を用いた場合の機器間の定量の変動を調べた。上記のように、５つのＩｇＧ４ ｍＡｂ及び１つのＩｇＧ１ ｍＡｂを消化した。検量線を抗体消化物にスパイクし、各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実行において、およそ等モル量の重ｄｅｓ－Ｋペプチドと消化したｄｅｓ－Ｋペプチドをカラムに注入した。対照ｍＡｂ消化物を、従来の未補正ペプチドマッピングに供した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計を使用して、質量データを得た。
【0112】
表６に示すように、ＣＣ補正法を使用した場合、ＱＥ－Ｐｌｕｓ又はＦｕｓｉｏｎ質量分析計のいずれかを使用して定量化した場合、リジンの割合（％）における差はゼロから僅かであった。しかしながら、未補正ペプチドマッピングを使用した場合、機器間で、リジンの割合（％）により大きな変動が見られた。
【0113】
【表6】
【0114】
本発明の方法を使用して、ｂｓＡｂに適用したときに機器に起因するシグナルの変動を調べるために追加の実験を行った。上記のように、７つのＩｇＧ４ベースのｂｓＡｂ（ＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２）及びＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４）のＣ末端配列の両方を含有する）を消化した。検量線を抗体消化物にスパイクし、各ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実行において、およそ等モル量の重ｄｅｓ－Ｋペプチドと消化したｄｅｓ－Ｋペプチドをカラムに注入した。対照ｂｓＡｂ消化物を、従来の未補正ペプチドマッピングに供した。
【0115】
Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ質量分析計を使用して、質量データを得た。表７に示すように、ＣＣ補正法を使用した場合、ＱＥ－Ｐｌｕｓ又はＦｕｓｉｏｎ質量分析計のいずれかを使用して定量化した場合、リジンの割合（％）における差はゼロから僅かであった。しかしながら、未補正ペプチドマッピングを使用した場合、機器間で、リジンの割合（％）により大きな変動が見られた。
【0116】
【表7】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【手続補正書】
【提出日】2023-04-03
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0023】
[本発明1001]
関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化するための方法であって、
（ａ）前記関心対象のタンパク質を含む試料を消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を得ることと、
（ｂ）前記ペプチド消化物に重ペプチド標準物質のセットを添加することであって、少なくとも1つの重ペプチド標準物質が、前記翻訳後修飾を含み、かつ少なくとも1つの重ペプチド標準物質が、前記翻訳後修飾を含まない、添加することと、
（ｃ）前記ペプチド消化物を、添加された前記重ペプチド標準物質とともに、液体クロマトグラフィ－質量分析を使用する分析に供して、前記ペプチド消化物及び重ペプチド標準物質の各ペプチドに対応するシグナルを取得することと、
（ｄ）前記翻訳後修飾を含まない前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質と比較した、前記翻訳後修飾を含む前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することと、
（ｅ）前記翻訳後修飾を含まない前記関心対象のタンパク質からの少なくとも1つのペプチドと比較した、前記翻訳後修飾を含む前記関心対象のタンパク質からの少なくとも1つのペプチドの前記相対シグナルを使用して、前記関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することと、
（ｆ）前記（ｄ）の検量線を使用して（ｅ）の結果を正規化して、前記関心対象のタンパク質の前記翻訳後修飾を更に定量化することと
を含む、方法。
[本発明1002]
前記関心対象のタンパク質が、治療用タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記治療用タンパク質が、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、及び酵素からなる群から選択される、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記関心対象のタンパク質が、モノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記関心対象のタンパク質が、二重特異性抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記翻訳後修飾が、未処理Ｃ末端リジンの存在である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記重ペプチド標準物質が、少なくとも1つの他の重ペプチド標準物質に対して、約1：1～約1：1000のモル比で存在する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記重ペプチド標準物質が、約1～約16個の重同位体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記重ペプチド標準物質が、Ｃ 13 、Ｎ 15 、又はそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記消化酵素が、トリプシンである、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記液体クロマトグラフィ法が、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、又はそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、Ｑ－ＴＯＦ質量分析計、又はトリプル四重極質量分析計であり、前記質量分析計が、前記液体クロマトグラフィシステムに結合され、かつ前記質量分析計が、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ、及び／又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することができる、本発明1001の方法。
[本発明1013]
関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化するためのキットであって、
（ａ）翻訳後修飾を含む少なくとも1つの重ペプチド標準物質を含む第1の組成物と、
（ｂ）前記翻訳後修飾を含まない少なくとも1つの重ペプチド標準物質を含む第2の組成物と
を含み、
前記第1及び第2の組成物は、ペプチド消化物に添加することができ、
質量分析によって分析した場合に、前記翻訳後修飾を含まない前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質と比較した、前記翻訳後修飾を含む前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することができ、かつ
前記検量線を使用して、関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することができる、
キット。
[本発明1014]
前記翻訳後修飾が、未処理Ｃ末端リジンの存在である、本発明1013のキット。
[本発明1015]
前記重ペプチド標準物質が、少なくとも1つの他の重ペプチド標準物質に対して、約1：1～約1：1000のモル比で存在する、本発明1013のキット。
[本発明1016]
前記重ペプチド標準物質が、約1～約16個の重同位体を含む、本発明1013のキット。
[本発明1017]
前記重ペプチド標準物質が、Ｃ 13 、Ｎ 15 、又はそれらの組み合わせを含む、本発明1013のキット。
[本発明1018]
少なくとも1つの軽ペプチド標準物質を更に含む、本発明1013のキット。
本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修飾、追加、又は再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化するための方法であって、
（ａ）前記関心対象のタンパク質を含む試料を消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を得ることと、
（ｂ）前記ペプチド消化物に重ペプチド標準物質のセットを添加することであって、少なくとも1つの重ペプチド標準物質が、前記翻訳後修飾を含み、かつ少なくとも1つの重ペプチド標準物質が、前記翻訳後修飾を含まない、添加することと、
（ｃ）前記ペプチド消化物を、添加された前記重ペプチド標準物質とともに、液体クロマトグラフィ－質量分析を使用する分析に供して、前記ペプチド消化物及び重ペプチド標準物質の各ペプチドに対応するシグナルを取得することと、
（ｄ）前記翻訳後修飾を含まない前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質と比較した、前記翻訳後修飾を含む前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することと、
（ｅ）前記翻訳後修飾を含まない前記関心対象のタンパク質からの少なくとも1つのペプチドと比較した、前記翻訳後修飾を含む前記関心対象のタンパク質からの少なくとも1つのペプチドの前記相対シグナルを使用して、前記関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することと、
（ｆ）前記（ｄ）の検量線を使用して（ｅ）の結果を正規化して、前記関心対象のタンパク質の前記翻訳後修飾を更に定量化することと
を含む、方法。
[本発明1002]
前記関心対象のタンパク質が、治療用タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記治療用タンパク質が、抗体、可溶性受容体、抗体－薬物コンジュゲート、及び酵素からなる群から選択される、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記関心対象のタンパク質が、モノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記関心対象のタンパク質が、二重特異性抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記翻訳後修飾が、未処理Ｃ末端リジンの存在である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記重ペプチド標準物質が、少なくとも1つの他の重ペプチド標準物質に対して、約1：1～約1：1000のモル比で存在する、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記重ペプチド標準物質が、約1～約16個の重同位体を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記重ペプチド標準物質が、Ｃ 13 、Ｎ 15 、又はそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記消化酵素が、トリプシンである、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記液体クロマトグラフィ法が、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、混合モードクロマトグラフィ、又はそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記質量分析計が、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、Ｑ－ＴＯＦ質量分析計、又はトリプル四重極質量分析計であり、前記質量分析計が、前記液体クロマトグラフィシステムに結合され、かつ前記質量分析計が、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＲＭ－ＭＳ、及び／又はＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実行することができる、本発明1001の方法。
[本発明1013]
関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化するためのキットであって、
（ａ）翻訳後修飾を含む少なくとも1つの重ペプチド標準物質を含む第1の組成物と、
（ｂ）前記翻訳後修飾を含まない少なくとも1つの重ペプチド標準物質を含む第2の組成物と
を含み、
前記第1及び第2の組成物は、ペプチド消化物に添加することができ、
質量分析によって分析した場合に、前記翻訳後修飾を含まない前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質と比較した、前記翻訳後修飾を含む前記少なくとも1つの重ペプチド標準物質の相対シグナルを使用して、検量線を生成することができ、かつ
前記検量線を使用して、関心対象のタンパク質の翻訳後修飾を定量化することができる、
キット。
[本発明1014]
前記翻訳後修飾が、未処理Ｃ末端リジンの存在である、本発明1013のキット。
[本発明1015]
前記重ペプチド標準物質が、少なくとも1つの他の重ペプチド標準物質に対して、約1：1～約1：1000のモル比で存在する、本発明1013のキット。
[本発明1016]
前記重ペプチド標準物質が、約1～約16個の重同位体を含む、本発明1013のキット。
[本発明1017]
前記重ペプチド標準物質が、Ｃ 13 、Ｎ 15 、又はそれらの組み合わせを含む、本発明1013のキット。
[本発明1018]
少なくとも1つの軽ペプチド標準物質を更に含む、本発明1013のキット。
本発明のこれら及び他の態様は、以下の説明及び添付の図面と併せて考慮すると、よりよく認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態及び多数の具体的な詳細を示すが、限定ではなく、例証として与えられる。多くの置換、修飾、追加、又は再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0024】
【図1】図１Ａは、例示的な実施形態による、本発明のアッセイの概略図を示す。「クリップされた（ｃｌｉｐｐｅｄ）」ペプチド（Ｃ末端リジンを欠くタンパク質のＣ末端に対応する）を、４つの「クリップされていない（ｕｎｃｌｉｐｐｅｄ）」ペプチド（Ｃ末端リジンを有するタンパク質のＣ末端に対応する）と混合して、ペプチド混合物の応答曲線（検量線）を形成する。次いで、この応答曲線ペプチド混合物を、潜在的な抗体製造試料（ｍＡｂ消化物）を表す試料と混合して、抗体試料中に存在するＣ末端リジンの量を正確に定量化する。図１Ｂは、例示的な実施形態による、液体クロマトグラフィ－質量分析に供したときのペプチド種の各々について観察される分析ピークを示す。
【図2】図２Ａ～２Ｅは、例示的な実施形態による、１３Ｃ及び１５Ｎの同位体（●で示されている）を含有する４つのＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２）の「クリップされていない」重ペプチド標準物質の構造を示す。図２Ａ～２Ｄに示される同位体重鎖（ＨＣ）Ｃ末端ペプチド標準物質は、それぞれ、Δ４、Δ８、Δ１２、及びΔ１６Ｋペプチドである。図２Ｅは、１３Ｃ及び１５Ｎの同位体（●で示されている）を含有する重ＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１）標準物質Δ４ ｄｅｓ－Ｋを示す。
【図3】例示的な実施形態による、「クリップされた」ペプチドと「クリップされていない」ペプチドとの間の比例関係を示す検量線（ＣＣ）を示す。
【図4】例示的な実施形態による、重鎖（ＨＣ）Ｃ末端ペプチドを使用した例示的な応答曲線を示す。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】