特表 2023-530874 インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-20

(54)【発明の名称】インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20230712BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20230712BHJP

   G01N 27/02 20060101ALI20230712BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 A

C12Q1/02

G01N27/02 D

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574454

(86)(22)【出願日】2021-06-15

(85)【翻訳文提出日】2022-12-16

(86)【国際出願番号】 KR2021007470

(87)【国際公開番号】W WO2022025421

(87)【国際公開日】2022-02-03

(31)【優先権主張番号】10-2020-0095263

(32)【優先日】2020-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】301040648

【氏名又は名称】コーリア リサーチ インスティテュート オブ ケミカル テクノロジー

(71)【出願人】

【識別番号】505448855

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】オ ジョンファ

(72)【発明者】

【氏名】アン ジェファン

(72)【発明者】

【氏名】ユン ソクジュ

(72)【発明者】

【氏名】ハン ヒョンユン

(72)【発明者】

【氏名】ソン ミヨン

(72)【発明者】

【氏名】チョン グァンボ

(72)【発明者】

【氏名】チョン チョロク

(72)【発明者】

【氏名】キム チャンファン

【テーマコード（参考）】

2G060

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G060AA15

2G060AA19

2G060AD06

2G060AF03

2G060AF06

2G060FA06

2G060HA02

2G060KA09

4B029AA07

4B029BB11

4B029BB20

4B029CC04

4B029FA15

4B029GB10

4B063QA01

4B063QQ08

4B063QS39

4B063QX04

(57)【要約】

本発明は、インピーダンスベースのオルガノイド評価システムであって、第１の管と、第１の管よりも直径が小さく、第１の管の一端に接続または挿入される複数の第２の管とを含むオルガノイド変形発生部と、オルガノイド変形発生部に接続され、オルガノイドのインピーダンスを測定するインピーダンスアナライザを含むインピーダンス測定部と、を備え、インピーダンス測定部によって測定されたインピーダンスからオルガノイドを評価する、インピーダンスベースのオルガノイド評価システムを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インピーダンスベースのオルガノイド評価システムであって、
第１の管と、前記第１の管よりも直径が小さく、前記第１の管の一端に接続または挿入される複数の第２の管とを含むオルガノイド変形発生部と、
前記オルガノイド変形発生部に接続され、オルガノイドのインピーダンスを測定するインピーダンスアナライザを含むインピーダンス測定部と、を備え、
前記インピーダンスベースのオルガノイド評価システムは、前記インピーダンス測定部によって測定された前記インピーダンスから前記オルガノイドを評価するように構成されている、インピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項2】

前記第２の管の前記直径が、前記第１の管の前記直径の５％～３０％である、請求項１に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項3】

前記オルガノイド変形発生部が少なくとも３本の第２の管を含む、請求項１に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項4】

前記オルガノイド変形発生部は、
前記第１の管の他端に接続された第３の管と、
前記第１の管の一端または前記少なくとも３つの第２の管の一端に接続された第４の管と、を含む、請求項１に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項5】

前記オルガノイド評価システムが、前記第３の管を介してリザーバに接続され、前記リザーバ内の材料を前記第１の管に導入する、請求項４に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項6】

前記リザーバは、生理食塩水、培養液、膜機能障害惹起液、および膜機能有効性惹起材のいずれかを収容している、請求項５に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項7】

前記第３の管は、内部に電極材料を含み、前記電極材料はコイル状のワイヤの形態である、請求項４に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項8】

前記第４の管がシリンジポンプに接続されている、請求項４に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項9】

前記シリンジポンプに接続された圧力センサをさらに備える、請求項８に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項10】

前記第４の管は、内部に電極材料を含み、前記電極材料はコイル状のワイヤの形態である、請求項８に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項11】

オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
請求項１に記載の前記インピーダンスベースのオルガノイド評価システムの前記第１の管の内部に生理食塩水または培養液を充填し、前記オルガノイドを前記第１の管に導入するステップと、
前記オルガノイドを前記第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
前記オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
前記第１のインピーダンスおよび前記第２のインピーダンスから前記オルガノイドの前記バリア完全性を評価するステップと、を含む、オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【請求項12】

前記オルガノイドの前記バリア完全性を評価する前記ステップは、前記第１のインピーダンスから得られる抵抗値と前記第２のインピーダンスから得られる抵抗値との差を用いて評価することである、請求項１１に記載のオルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【請求項13】

オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
請求項１に記載の前記インピーダンスベースのオルガノイド評価システムの前記第１の管の内部に、膜機能の損傷および有効性を惹起する物質を充填し、オルガノイドを前記第１の管に注入するステップと、
前記オルガノイドを前記第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
前記オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
前記負圧が安定した状態で第３のインピーダンスを一定の時間間隔で測定するステップと、
前記第１のインピーダンス、前記第２のインピーダンスおよび前記第３のインピーダンスから膜機能損傷および有効性を惹起する前記物質によって影響を受ける前記バリア完全性を評価するステップと、を含む、オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【請求項14】

前記バリア完全性を評価する前記ステップは、前記第１のインピーダンスから得られる前記抵抗値（Ｒ_０）と、前記第２のインピーダンスから得られる前記抵抗値（Ｒ_ｈｉｏ）と、時間ｔが経過したときの前記第３のインピーダンスから得られる前記抵抗値（Ｒ_ｔ）とを用いて、式１の前記値が５０％であるときの時間ｔの値を用いて、前記バリア完全性を評価することである、請求項１３に記載のオルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【数1】

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒトのオルガノイドモデル（ヒト腸管オルガノイド、ＨＩＯ）のうち、三次元的な内在性オルガノイドの成熟度およびバリア完全性を評価することができるインピーダンス測定システム、ならびに腸管オルガノイドの成熟度およびバリア完全性がインピーダンスの変化によって損傷されるかどうかを測定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

腸管では、消化吸収の際に、腸管粘膜が、微生物、抗原および毒素の血流への流入を阻止する免疫機能を行う。一次バリアとして作用する腸管粘膜細胞は、単一の細胞層によって細胞間に一定の間隙を維持しており、何らかの刺激や損傷が加えられると透過性が上昇し、種々の高分子物質が細胞間の間隙を通過できるようになる。これを介して血液中に侵入した抗原は、深刻な免疫応答を引き起こし、様々な慢性免疫疾患を引き起こす。

【0003】

このような腸管構造を模擬した腸管オルガノイドの研究が盛んに行われており、腸管オルガノイドの膜機能やバリア完全性を評価する技術が検討されている。

【0004】

代表的な例として、経上皮／経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の場合、細胞を多孔質構造でインキュベートし、それらを底から少し離して配置して、電極付き培地に浸漬することで、細胞間を流れる電流の抵抗変化を測定する方法がある。しかし、腸管オルガノイドの場合、これは三次元構造であり、分化と成熟を経て形成される。この成熟過程を経た腸管オルガノイドは、外観において不均一な折り畳みを伴うより複雑な三次元構造を形成するため、従来のＴＥＥＲ測定技術で腸管オルガノイドの膜損傷の程度やバリア完全性を評価することは困難である。

【0005】

これを補うために、細胞組織よりも小さい単一のマイクロチャネルを形成し、その内部に細胞組織を入れ、培地を満たし、交流電流を流すことで細胞外抵抗を測定する方法がある。しかしながら、この方法は、均一で完全な内部を有する球状の三次元構造のみを測定することができる。腸管オルガノイドは、成熟するにつれて外観が不均一になり、小さなマイクロチャネル内に配置することが困難になる中空のバルーン状の構造であり、不均一な外観が触れる領域の外側に電流が流れる。また、腸管オルガノイドは軟らかい構造であるため、狭い開口部を通過する際に裂けることが多い。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

一態様では、本発明の目的は、データの逸脱なしに空の不均一な構造のバリア完全性を評価することができるインピーダンスベースの測定システムを提供することである。幹細胞由来の腸管オルガノイドは、成熟関連遺伝子発現の増加、出芽構造のサイズおよび数の増加など、生体組織と同様の構造的複雑性を示すため、それらを逸脱することなく評価することが非常に重要である。特に、腸管オルガノイドは、オルガノイドのバリア完全性のリアルタイムモニタリングを単純かつ非侵襲的に可能にするという点で非常に有用である。腸管オルガノイドは、クローン病などの腸管疾患の治療剤開発のためのテストシステムとして用いることができ、腸管微生物叢の有効性を評価するためのモデルとして用いることもできる。したがって、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価することができるインピーダンス技術は、腸のバリア完全性に影響を及ぼし得る薬物、化学物質、毒素および微生物のスクリーニングおよび有効性研究にも使用することができる。さらに、それは、腸管オルガノイドならびに肝臓および肺オルガノイドなどの様々な生体組織を模倣する複雑な三次元オルガノイド構造の膜損傷の程度およびバリア完全性を評価するために使用することができる。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記目的を達成するために、本発明の一態様では、本発明は、インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムであって、
第１の管と、第１の管よりも直径が小さく、第１の管の一端に接続または挿入される少なくとも３つの第２の管とを含む腸管オルガノイド変形発生部と、
腸管オルガノイド変形発生部に接続され、腸管オルガノイドのインピーダンスを測定するインピーダンスアナライザを含むインピーダンス測定部と、を備え、
インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムは、腸管インピーダンス測定部によって測定されたインピーダンスからオルガノイドを評価するように構成されている、インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムを提供する。

【0008】

本発明の別の態様では、本発明は、オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
インピーダンスベースのオルガノイド評価システムの第１の管の内部に生理食塩水または培地を充填し、オルガノイドを第１の管に導入するステップと、
オルガノイドを第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
第１のインピーダンスおよび第２インピーダンスからオルガノイドのバリア完全性を評価するステップと、を含む、オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法を提供する。

【0009】

本発明の別の態様では、本発明は、オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
インピーダンスベースのオルガノイド評価システムの第１の管の内部に、膜機能の損傷および有効性を惹起する物質を充填し、オルガノイドを第１の管に注入するステップと、
オルガノイドを第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
負圧が安定した状態で第３のインピーダンスを一定の時間間隔で測定するステップと、
第１のインピーダンス、第２のインピーダンスおよび第３のインピーダンスから膜機能損傷および有効性を惹起する物質によって影響を受けるバリア完全性を評価するステップと、を含む、オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法を提供する。

【発明の効果】

【0010】

本発明の一態様で提供されるインピーダンスベースのオルガノイド評価システムは、中空で不均一な構造の膜特性に関するデータを逸脱することなく、膜損傷の程度などのバリア完全性を評価することができる。

【0011】

加えて、本発明の一態様で提供されるオルガノイドのバリア完全性を評価するための方法は、非常に簡単かつ非侵襲的な方法でリアルタイムで膜損傷の程度を監視することが可能であるという点で非常に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】インピーダンスベースのオルガノイド評価システムの例を示す概略図である。

【図2】インピーダンスベースのオルガノイド評価システムの例を示す概略図である。

【図3】三次元腸管オルガノイド評価インピーダンス装置を示す概略図である。

【図4】腸管オルガノイドの成熟によるバリア完全性の増加を示す画像およびグラフのセットである。

【図5】未成熟対照群と成熟腸管オルガノイドとの間のインピーダンス抵抗値の変化を示すグラフのセットである。

【図6】腸管オルガノイドを変形生成部（２００ｍＶ、５０Ｈｚ、ＡＣ、赤色；トリプシンあり、黒：トリプシンなし、黒の点線は抵抗値の変化が５０％になった時間（ｔ_５０％））に吸着させた後の１Ｘトリプシン（バリア完全性障害惹起物質）の有無による抵抗値の変化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0014】

本発明の一態様では、本発明は、インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムであって、
第１の管と、第１の管よりも直径が小さく、第１の管の一端に接続または挿入される少なくとも３つの第２の管とを含む腸管オルガノイド変形発生部と、
腸管オルガノイド変形発生部に接続され、腸管オルガノイドのインピーダンスを測定するインピーダンスアナライザを含むインピーダンス測定部と、を備え、
インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムは、腸管インピーダンス測定部によって測定されたインピーダンスからオルガノイドを評価するように構成されている、インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムを提供する。

【0015】

このインピーダンスベースのオルガノイド評価システムの利点は、単一チャネルと比較して腸管オルガノイドの物理的特性の変動が少ないことである。単一チャネルの場合、不均一な細胞組織を吸着すると、同じ負圧でも領域によってチャネル内への吸引の程度が異なる。チャネル内への吸引の程度は抵抗値に直接関係するため、その程度を一定に保つことが重要である。本発明では、オルガノイドにかかる分圧を単一チャネルではなくマルチチャネルを介して分散させることにより、吸引の程度を一定に維持する。この効果は、マルチチャネルの数を増やすことによって高めることができる。

【0016】

図１～図３は、本発明の一態様で提供されるインピーダンスベースのオルガノイド評価システムの例を示す概略図である。

【0017】

本発明の一態様で提供されるインピーダンスベースのオルガノイド評価システムは、第１の管と、第１の管の直径よりも小さい直径を有し、第１の管の一端に接続されるかまたはその中に挿入される複数の第２の管とを含むオルガノイド変形発生部を含む。

【0018】

第１の管は、中空の円筒形状であってもよいし、円筒形状であってもよい。第２の管はまた、中空円筒形状または円筒形状を有してもよい。

【0019】

第１の管は単一チャネルとして一次チャネルを構成することができ、第２の管はマルチチャネルとして二次マルチチャネルを構成することができる。

【0020】

複数の第２の管は、図１に示すように第１の管の一端に接続することができ、図２に示すようにその中に挿入および設置することができる。第２の管が第１の管の一端に接続される場合、第２の管は、第１の管の単一のチャネルに接続されてマルチチャネルを形成することができ、この場合、第１の管および第２の管が接続される端部は、第２の管のチャネル部分を除いて封止することができる。また、第２の管を第１の管の内部に挿入して設置する際に、第１の管を第２の管よりも長くし、複数の第２の管をモジュール化して第１の管の内部に装着することができる。

【0021】

第２の管の直径は、第１の管の直径の５％～３０％の直径を有することが好ましく、第１の管の直径の１０％～２８％、１５％～２５％、および２０％～２４％の直径を有することができる。また、第２の管は、少なくとも３本以上であることが好ましく、これによりマルチチャネルを構成することができる。このようなマルチチャネルを構成することにより、オルガノイドの物性の変化が著しく小さく、一定の負圧でもチャネルへの吸引の程度が一定で維持されるため、オルガノイドの成熟度やバリア完全性を正確に評価することができる。

【0022】

さらに、オルガノイド変形発生部は、第１の管の他端に接続された第３の管と、第１の管の一端または複数の第２の管の一端に接続された第４の管と、を備える。

【0023】

第３の管はＹ字形を有することができ、Ｙ字形の第３の管は、第１の管の一端に接続された管ｉと、リザーバ内の材料を第１の管に入れるためにリザーバに接続された管ｉｉと、電極材料を含む管ｉｉｉとを含み得る。

【0024】

リザーバは、生理食塩水、培養液、膜機能障害惹起液および膜機能有効性惹起材のいずれかを収容することができる。

【0025】

管ｉｉｉの内部に配置される電極材料は、コイル状のワイヤの形態とすることができ、管ｉ内に延びるように形成することができる。

【0026】

第４の管は、Ｙ字形状を有し、Ｙ字形状を有する第４の管は、第１の管の一端または複数の第２の管の一端に接続された管Ｉ、およびシリンジポンプに接続された管ＩＩ、および電極材料を含む管ＩＩＩを含む。

【0027】

シリンジポンプは、圧力センサに接続することができる。

【0028】

管ＩＩＩ内に配置される電極材料は、コイル状のワイヤの形態とすることができ、管Ｉ内に延びるように形成することができる。

【0029】

例えば、管ｉｉｉの内部に配置されたコイル状の金（Ａｕ）ワイヤを管ｉの内部に延在させ、管ＩＩＩの内部に配置されたコイル状の白金（Ｐｔ）ワイヤを管Ｉの内部に延在させることができる。このように金ワイヤおよび白金ワイヤを延在させるとき、第１、第２、第３および第４の管内に充填された材料を金ワイヤおよび白金ワイヤでより容易に共有することができ、そのため、インピーダンス値の変化を正確かつ確実に測定することができる。

【0030】

本発明の一態様で提供されるインピーダンスベースのオルガノイド評価システムは、オルガノイド変形発生部に接続され、オルガノイドのインピーダンスを測定するためのインピーダンスアナライザを含むインピーダンス測定部を備える。インピーダンスアナライザは、作用電極と対極とを備えることができ、オルガノイド変形発生部に接続することができる。具体的な例として、インピーダンスアナライザの作用電極は、オルガノイド変形発生部の電極材料を含む管ｉｉｉの電極材料に接続することができ、好ましくは、電極材料はコイル状の金線からなり、外部に突出した金線に接続することができる。さらに、インピーダンスアナライザの対極は、オルガノイド変形発生部の電極材料を含む管ＩＩＩの電極材料に接続することができ、好ましくは、電極材料はコイル状の白金線からなり、外部に突出した白金線に接続することができる。

【0031】

具体例として、インピーダンスベースのオルガノイド評価システムは、概ね腸管オルガノイドの直径（約９００μｍ）の一次チャネルを形成する第１の管と、少なくとも３つ以上の直径を有し、約２００μｍの直径を有するマルチチャネルを構成する第２の管とで構成することができる。第１および第２の管は垂直に構築され、内部は培地または生理食塩水で満たされ、チャネルの両端（第１の管の一端および第２の管の一端）はそれぞれＹ字型管（第３の管および前方管）に接続することができる。腸管オルガノイドは上部入口から第１の管の上部に進入し、再び入口を封止する。第２の管の下部は、シリンジポンプおよび気圧計に接続されて気圧を設定し、上部チャネル入口は、空気がチャネルに入るのを防ぐためにバレル内にロックされる。白金線はまた、両方のチャネルの端部に配置され、ワニ口クリップを介してオルタネータおよび抵抗計に接続される。一次チャネルを形成する第１の管とマルチチャネルを形成する第２の管とが重力で交わる点に腸管オルガノイドが位置するとき、マルチチャネル入口で腸管オルガノイドを吸収するように一定の負圧（約－１０ｈｐａ）を設定する。設定された負圧に達した時点で、交流周波数（約５０Ｈｚ）を流して抵抗値を測定することができる。

【0032】

本発明はまた、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
請求項１に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムの第１の管の内部に生理食塩水または培養液を充填し、腸管オルガノイドを第１の管に導入するステップと、
腸管オルガノイドを第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
腸管オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
第１のインピーダンスおよび第２インピーダンスから腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するステップと、を含む、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法を提供する。

【0033】

オルガノイドのバリア完全性を評価するステップは、第１のインピーダンスから得られた抵抗値と第２のインピーダンスから得られた抵抗値との差を評価することであり得る。オルガノイドのＴＪ機能は、負圧を設定する前の抵抗値と、負圧が安定したときの抵抗値との差によって評価することができる。

【0034】

さらに、本発明は、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
請求項１に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムの第１の管の内部に、膜機能の損傷および有効性を惹起する物質を充填し、腸管オルガノイドを第１の管に注入するステップと、
腸管オルガノイドを第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
腸管オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
負圧が安定した状態で第３のインピーダンスを一定の時間間隔で測定するステップと、
第１のインピーダンス、第２のインピーダンスおよび第３のインピーダンスから膜機能損傷および有効性を惹起する物質によって影響を受けるバリア完全性を評価するステップと、を含む、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法を提供する。

【0035】

バリア完全性を評価するステップは、第１のインピーダンスから得られた抵抗値（Ｒ_０）と、第２のインピーダンスから得られた抵抗値（Ｒ_ＨＩＯ）と、時間ｔが経過したときの第３のインピーダンスから得られた抵抗値（Ｒ_ｔ）とを用いて式１の値が５０％であるときの時間ｔの値を用いて、バリア完全性を評価することであり得る。オルガノイド吸着時の抵抗値をＲ_ＨＩＯとし、オルガノイド除去時の抵抗値をＲ_０とし、時間ｔを経過したときの抵抗値をＲ_ｔとすると、１００％を基準としたＲ_ＨＩＯ－Ｒ_０抵抗値を比較することにより式１の値が５０％となる時間ｔ値において、実験薬剤によるバリア完全性の損傷率を測定することができる。

【数1】

【実施例】

【0036】

１．腸管オルガノイド形成
３５ｍｍ組織培養ディッシュに、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で希釈した５％マトリゲルのコーティング溶液１ｍｌを塗布した後、３７℃のインキュベータ内で１時間コーティングした。

【0037】

培養したヒト多能性幹細胞コロニーを２５０×２５０（μｍ）の大きさに切断した後、ＩＶ型コラゲナーゼを処理して培養容器から分離する。

【0038】

コーティングされた３５ｍｍ組織培養ディッシュ内のコーティング溶液を除去し、分離したヒト多能性幹細胞およびｍＴｅＳＲ１培地を当該培養ディッシュに添加して、その後培養した。３日間の培養の間に、培養した多能性幹細胞の細胞密度が全表面の７０％以上になったところで、胚体内胚葉（ＤＥ）分化誘導を行った。

【0039】

培養したヒト多能性幹細胞を胚体内胚葉に分化誘導するために、それらを０％、０．２％および２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１００ｎｇ／ｍｌのＡｃｔｉｖｉｎ Ａを含むＲＰＭＩ１６４０培地で３日間培養した。

【0040】

細胞を三次元後腸（ＨＧ）スフェロイドに分化させるために、２％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地に５００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ４および３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を添加し、その後４日間培養した。

【0041】

その後、自然発生した三次元後腸スフェロイドをマトリゲルドームに挿入し、１Ｘ Ｂ２７サプリメント、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ、および５００ｎｇ／ｍｌのＲ－ｓｐｏｎｄｉｎ１を含む進化型ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地で三次元培養することでヒト腸管オルガノイドに分化させた。

【0042】

形成されたヒト腸管オルガノイド（未成熟対照、対照ＨＩＯ）を、２日に１回培地交換しながら１４日に１回継代培養することで維持した。また、成熟腸管オルガノイド（成熟ＨＩＯ）を１ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２で処理して少なくとも２回継代培養した。

【0043】

２．腸管オルガノイドの成熟
図４に示すように、ヒト多能性幹細胞を、上述の腸管オルガノイド形成プロトコルにより胚体内胚葉および後腸スフェロイドの段階を経て腸管オルガノイドに分化させたところ、段階特異的な形態学的解析により腸管オルガノイドが効率的に分化していることが確認された。

【0044】

また、各分化段階の細胞に特異的に発現するマーカー遺伝子として、腸管転写因子（ＣＤＸ２、ＳＯＸ９、ＩＳＸ）、間葉系組織（ＶＩＭ）、飲細胞（ＶＩＬ１）、腸内分泌細胞（ＣＨＧＡ）、杯細胞（ＭＵＣ２）および癌細胞（ＬＹＺ）のマーカー遺伝子の発現をｑＲＴ－ＰＣＲで解析したところ、未分化多能性幹細胞と比較して、腸管オルガノイドの分化中に有意に発現上昇することが確認された（図４ａ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析のために、ヒト多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、後腸細胞、対照腸管オルガノイドおよび成熟腸管オルガノイドを回収し、ＲＮｅａｓｙキットを用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いてｃＤＮＡを合成した。その後、腸管細胞特異的マーカー遺伝子を標的とするプライマーと７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて解析を行った。ヒト小腸全ＲＮＡ（ＨＳＩ）を購入し、陽性対照として使用した。腸管オルガノイド成熟（図４ｂ上部パネル）による形態変化を調べた。その結果、ＩＬ－２で処理した成熟腸管オルガノイド（Ｍａｔｕｒｅ ＨＩＯ）では、対照腸管オルガノイド（Ｃｏｎｔｒｏｌ ＨＩＯ）と比較して、腸管オルガノイドの大きさ（図４ｂ左下パネル）および腸管オルガノイドの出芽構造の数（図４ｂ右下パネル）が増加していることが確認された。成熟腸管マーカー遺伝子の発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより確認し、対照と比較した。その結果、ヒト小腸（ＨＳＩ）と同様に成熟腸管オルガノイドの発現が増加していることが確認された（図４ｃ）。免疫染色分析の結果、対照の腸管オルガノイドと比較して、成熟腸管オルガノイドではコンジュゲートタンパク質（ＺＯ－１）が高発現していることが確認された（図４ｄ）。免疫蛍光染色分析のために、腸管オルガノイドを収集し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、次いで、１０％、２０％および３０％スクロース溶液で凍結保護し、次いで、Ｏ．Ｃ．Ｔ化合物を使用して凍結した。凍結した腸管オルガノイド試料をミクロトームを用いて１０μｍ厚にスライスし、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳ溶液を透過させた。４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳで１時間ブロッキングした後、それを抗ＣＤＸ２抗体および抗ＺＯ－１抗体と４℃で一晩反応させた。二次抗体と室温で１時間反応させた後、核を室温で１５分間ＤＡＰＩで染色し、共焦点顕微鏡で観察した。膜機能に関与するコンジュゲートタンパク質（ＺＯ－１、ＯＣＬＮ、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ３、およびＣＬＤＮ５）の遺伝子発現を分析した。その結果、成熟腸管オルガノイドでは、対照腸管オルガノイドと比較して、ヒト小腸（ＨＳＩ）に相当するレベルで、コンジュゲートしたタンパク質遺伝子が高発現していることが確認された（図４ｅ）。（＊：ｔ検定による実験群に対する対照群、ｐ＜０．０５、＊＊：ｔ検定による実験群に対する対照群、ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｔ検定による実験群に対する対照群、ｐ＜０．００１）

【0045】

３．腸管オルガノイドのバリア完全性の評価
インピーダンスベースのオルガノイド評価システムを図３に示すように構成して、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価した。

【0046】

１）オルガノイド評価システムの内部の、直径９００μｍ、長さ４．５ｍｍの第１の管と、直径２００μｍ、長さ６ｍｍのマルチチャネルを形成するための複数の第２の管とが垂直に配置された構造の流路。

【0047】

２）Ｙ字管（第３および前方管）を２本準備した後、直径０．５ｍｍ、長さ５ｃｍの純度９９％以上の白金線をコイル状にＹ字管の片側に配置し、線の端部をＹ字管の外側に露出させて封止し、空気や水が漏れないようにした。Ｙ字型管の上端をＰＢＳ（生理食塩水）の入ったリザーバに管を介して接続し、Ｙ字型管の下端をシリンジポンプおよび気圧計にそれぞれ管を介して接続した。

【0048】

３）内部をＰＢＳで満たした。

【0049】

４）培養した腸管オルガノイドを上部Ｙ字型管の端部に注入し、第１および第２の管が接続してマルチチャネルが始まる側に置いた。

【0050】

５）Ｙ字管から突出した白金線に、インピーダンスアナライザ（ポテンショスタットまたはインピーダンスアナライザ）の作用電極／検知電極および参照電極／対極を接続した。

【0051】

６）抵抗値は、２００ｍＶおよび５０Ｈｚの交流電流を印加することで、１０秒間隔で測定した。

【0052】

７）負圧（約－１０ｈｐａ）に設定した。

【0053】

８）負圧が安定した時点で実験を終了した。

【0054】

９）負圧設定前の抵抗値と、負圧が安定したときの抵抗値との差により、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価した。結果を図５に示す。

【0055】

４．腸管オルガノイドの膜損傷耐性の評価
１）オルガノイド評価システムの内部の、直径９００μｍ、長さ４．５ｍｍの第１の管と、直径２００μｍ、長さ６ｍｍのマルチチャネルを形成するための複数の第２の管とが垂直に配置された構造の流路。

【0056】

２）Ｙ字管（第３および前方管）を２本準備した後、直径０．５ｍｍ、長さ５ｃｍの純度９９％以上の白金線をコイル状にＹ字管の片側に配置し、線の端部をＹ字管の外側に露出させて封止し、空気や水が漏れないようにした。Ｙ字型管の上端を膜損傷惹起薬の入ったリザーバに管を介して接続し、Ｙ字型管の下端をシリンジポンプおよび気圧計にそれぞれ管を介して接続した。

【0057】

３）内部には膜損傷惹起薬を充填した。

【0058】

４）培養した腸管オルガノイドを上部Ｙ字型管の端部に注入し、第１および第２の管が接続してマルチチャネルが始まる側に置いた。

【0059】

５）Ｙ字管から突出した白金線に、インピーダンスアナライザ（ポテンショスタットまたはインピーダンスアナライザ）の作用電極／検知電極および参照電極／対極を接続した。

【0060】

６）抵抗値は、２００ｍＶおよび５０Ｈｚの交流電流を印加することで、１０秒間隔で測定した。

【0061】

７）負圧（約－１０ｈｐａ）に設定した。

【0062】

８）負圧が安定した状態で、１０秒ごとに１時間抵抗を測定した。

【0063】

９）オルガノイド吸着時の抵抗値をＲ_ｈｉｏとし、オルガノイド除去時の抵抗値をＲ_０とし、時間ｔを経過したときの抵抗値をＲ_ｔとすると、１００％を基準としたＲ_ｈｉｏ－Ｒ_０抵抗値を比較することにより、Ｒ_ｔ－Ｒ_０／Ｒ_ｈｉｏ－Ｒ_０の値が５０％となる時間ｔ値において、実験薬剤によるバリア完全性の損傷率を測定することができる。結果を図６に示す。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【手続補正書】

【提出日】2021-11-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムであって、
第１の管と、前記第１の管よりも直径が小さく、前記第１の管の一端に接続または挿入される少なくとも３本の第２の管とを含む腸管オルガノイド変形発生部と、
前記腸管オルガノイド変形発生部に接続され、腸管オルガノイドのインピーダンスを測定するインピーダンスアナライザを含むインピーダンス測定部と、を備え、
前記インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムは、前記インピーダンス測定部によって測定された前記インピーダンスから前記腸管オルガノイドを評価するように構成されている、インピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項2】

前記第２の管の前記直径が、前記第１の管の前記直径の５％～３０％である、請求項１に記載のインピーダンスベースのオルガノイド評価システム。

【請求項3】

前記腸管オルガノイド変形発生部は、
前記第１の管の他端に接続された第３の管と、
前記第１の管の一端または前記少なくとも３つの第２の管の一端に接続された第４の管と、を含む、請求項１に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム。

【請求項4】

前記腸管オルガノイド評価システムが、前記第３の管を介してリザーバに接続され、前記リザーバ内の材料を前記第１の管に導入する、請求項３に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム。

【請求項5】

前記リザーバは、生理食塩水、培養液、膜機能障害惹起液、および膜機能有効性惹起材のいずれかを収容している、請求項４に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム。

【請求項6】

前記第３の管は、内部に電極材料を含み、前記電極材料はコイル状のワイヤの形態である、請求項３に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム。

【請求項7】

前記第４の管がシリンジポンプに接続されている、請求項３に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム。

【請求項8】

前記シリンジポンプに接続された圧力センサをさらに備える、請求項７に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム。

【請求項9】

前記第４の管は、内部に電極材料を含み、前記電極材料はコイル状のワイヤの形態である、請求項７に記載のインピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システム。

【請求項10】

腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
請求項１に記載の前記インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムの前記第１の管の内部に生理食塩水または培養液を充填し、前記腸管オルガノイドを前記第１の管に導入するステップと、
前記腸管オルガノイドを前記第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
前記腸管オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
前記第１のインピーダンスおよび前記第２のインピーダンスから前記腸管オルガノイドの前記バリア完全性を評価するステップと、を含む、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【請求項11】

前記腸管オルガノイドの前記バリア完全性を評価する前記ステップは、前記第１のインピーダンスから得られる抵抗値と前記第２のインピーダンスから得られる抵抗値との差を用いて評価することである、請求項１０に記載の腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【請求項12】

腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法であって、以下の、
請求項１に記載の前記インピーダンスベースの腸管オルガノイド評価システムの前記第１の管の内部に、膜機能の損傷および有効性を惹起する物質を充填し、腸管オルガノイドを前記第１の管に注入するステップと、
前記腸管オルガノイドを前記第２の管の一端に接触するように位置決めし、インピーダンスアナライザを用いて第１のインピーダンスを測定するステップと、
前記腸管オルガノイド変形発生部に負圧を形成し、第２のインピーダンスを測定するステップと、
前記負圧が安定した状態で第３のインピーダンスを一定の時間間隔で測定するステップと、
前記第１のインピーダンス、前記第２のインピーダンスおよび前記第３のインピーダンスから膜機能損傷および有効性を惹起する前記物質によって影響を受ける前記バリア完全性を評価するステップと、を含む、腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【請求項13】

前記バリア完全性を評価する前記ステップは、前記第１のインピーダンスから得られる前記抵抗値（Ｒ_０）と、前記第２のインピーダンスから得られる前記抵抗値（Ｒ _ＨＩＯ ）と、時間ｔが経過したときの前記第３のインピーダンスから得られる前記抵抗値（Ｒ_ｔ）とを用いて、式１の前記値が５０％であるときの時間ｔの値を用いて、前記バリア完全性を評価することである、請求項１２に記載の腸管オルガノイドのバリア完全性を評価するための方法。

【数1】

【国際調査報告】