特表 2023-530890 発酵プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-20

(54)【発明の名称】発酵プロセス

(51)【国際特許分類】

   C12P 1/04 20060101AFI20230712BHJP

   C12P 19/42 20060101ALI20230712BHJP

   A23L 33/15 20160101ALI20230712BHJP

【ＦＩ】

C12P1/04

C12P19/42

A23L33/15

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022575777

(86)(22)【出願日】2021-06-23

(85)【翻訳文提出日】2023-01-23

(86)【国際出願番号】 EP2021067231

(87)【国際公開番号】W WO2021260057

(87)【国際公開日】2021-12-30

(31)【優先権主張番号】20181523.0

(32)【優先日】2020-06-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】503220392

【氏名又は名称】ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．

【氏名又は名称原語表記】ＤＳＭ ＩＰ ＡＳＳＥＴＳ Ｂ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】Ｈｅｔ Ｏｖｅｒｌｏｏｎ １， ＮＬ－６４１１ ＴＥ Ｈｅｅｒｌｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(72)【発明者】

【氏名】パイロン， エリック

(72)【発明者】

【氏名】ハンス， マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ファン デ グラーフ， マールテン， ヨブ

【テーマコード（参考）】

4B018

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B018LB10

4B018LE02

4B018MD23

4B018ME02

4B018MF01

4B018MF14

4B064AE01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA10

(57)【要約】

本発明は、効率が良く且つ環境への影響が少ない持続可能な発酵プロセスに関する。特に、本発明は、１つの発酵プロセスにおいて、２つ以上の発酵産物、すなわち「一次」発酵産物及び「二次」発酵産物を生成し単離することができる方法、特に１つは水溶性有機化合物であり、１つは脂溶性有機化合物、特に脂溶性ビタミン、好ましくはビタミンＫ２である方法に関する。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

一次発酵産物及び二次発酵産物を共産生することができる宿主細胞における少なくとも２つの発酵産物を共産生するための方法であって、１つの発酵産物は水溶性化合物であり、１つの発酵産物は脂溶性化合物であり、脂溶性発酵産物は、好ましくは脂溶性ビタミンであり、より好ましくはビタミンＫであり、最も好ましくはビタミンＫ２である方法。

【請求項2】

前記一次発酵産物は水溶性であり、前記二次発酵産物は脂溶性である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記一次発酵産物及び前記二次発酵産物は、ビタミンから選択される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記一次発酵産物は、ビタミンＢ２、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ１、ビタミンＢ７、好ましくはビタミンＢ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、より好ましくはビタミンＢ２からなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記二次発酵産物は、前記一次発酵産物の発酵産生中に生成されるバイオマスから抽出される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記二次発酵産物は、ビタミンＫ２、好ましくは少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の割合のＭＫ－７を含むビタミンＫ２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記二次発酵産物は、発酵産物１ｇ当たり、好ましくはビタミンＫ２ １ｇ当たり、約１０ｎｇ以下の割合のＤＮＡを含むビタミンＫ２である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記二次発酵産物は、発酵産物１ｇ当たり、好ましくはビタミンＫ２ １ｇ当たり、１コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満の割合の産生株を含むビタミンＫ２である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリザベトインギア属（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ）及びエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、好ましくは、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．サブティリス・ナットー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）、Ｂ．ポリミクサ（Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｂ．フィルミス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、より好ましくは、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、エイザベトインギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモニス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｃｒｅｍｏｎｉｓ）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、又はＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、最も好ましくは、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択される宿主細胞における、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

（ａ）前記一次発酵産物、好ましくは水溶性ビタミンの産生に好適である、好適な条件下及び好適な培養培地中で前記宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの前記一次発酵産物を産生流から単離する工程、
（ｃ）工程（ａ）中に生成されたバイオマスから、前記二次発酵産物、好ましくはビタミンＫ２を回収する工程、並びに、任意選択による
（ｄ）前記一次及び／又は二次発酵産物を精製する工程
を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

遺伝子操作されたバイオマスから回収／抽出を行う工程を含み、前記回収されたビタミンＫ２は、少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲のＭＫ－７の含有量を有し、且つ、ＰＣＲによる測定で、ビタミンＫ２ １ｇ当たり約１０ｎｇのＤＮＡ、好ましくは組換えＤＮＡの最大含有量を有する、バイオベースのビタミンＫ２を製造するための方法である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

ヘキサンを含まない溶媒、好ましくは、少なくともエタノールを約８０％（ｗｔ／ｗｔ）含む水溶液中で、二次発酵産物としてビタミンＫ２を抽出することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

バイオベースの発酵産物を、カプセル化剤、有機溶媒、油、超臨界流体、抗酸化剤、糖、共結晶化剤、コアセルベート、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成分と混合することを含み、栄養製品を製造することをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法によって得られるビタミンＫ２ １ｇ当たり約１ＣＦＵ未満の含有量の産生株を含むバイオベースのビタミンＫ２。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、効率が良く且つ環境への影響が少ない持続可能な発酵プロセスに関する。特に、本発明は、１つの発酵プロセスにおいて、２つ以上の発酵産物、すなわち「一次」発酵産物及び「二次」発酵産物を生成し単離することができる方法、特に１つは水溶性有機化合物であり、１つは脂溶性有機化合物、特に脂溶性ビタミン、好ましくはビタミンＫ２である方法に関する。

【0002】

ビタミン、酵素、抗生物質、アミノ酸、燃料を含む多くの製品は、今日では化学合成によって製造されるよりはむしろ、大規模発酵によって生成されている。バイオテクノロジーの多くの利点のうちのいくつかは、毒性の低い成分の使用であり、健康に良く天然又はバイオベースの製品につながる。このような発酵プロセスにおいては、通常、宿主細胞（発酵産物の産生を可能にする異種遺伝子を発現する遺伝子改変宿主細胞を含む）を好適な条件下で培養し、発酵産物をバイオマスから抽出／単離する。バイオマスは、依然として存在し、環境に有害である組換えＤＮＡを排除する特別の処理を前記バイオマスに対し行った後、そのほとんどが最終的に「処分」又は廃棄されている。

【0003】

バイオテクノロジープロセスは多くのバイオ製品をもたらし得るが、それでも培養培地からの発酵産物の抽出が、経済的及び生態学的側面で、いくらかマイナスの影響を有する可能性がある。例えば、多くの発酵産物、例えばビタミンＫ２の単離は、効率的な抽出の前に、例えば、当該技術分野で知られる超臨界ＣＯ_２によるなど、したがって、一般に非常に高価な手順である、バイオマスの乾燥を必要とする。この分野で一般的に使用されているヘキサン又はヘプタンを含む溶媒の使用もまた、環境及び健康にいくらかの悪影響を及ぼす可能性があり（食品用途ではノーゴーである）、したがって避けるべきである。

【0004】

これに加えて、特に国連の持続可能な開発目標に到達するためには、廃棄物及び温室効果ガスの排出を削減すること、すなわち、既知のプロセスと比較して、毒性のない又は毒性の低い手順を用いて、持続可能な方法でバイオマスをリサイクルし、且つ／又は前記バイオマスから有益な化合物を抽出することを含む、より環境に優しく持続可能な生産プロセスを探すことが強く求められている。

【0005】

驚くべきことに、本発明者らは、有機化合物の発酵生産を最適化する方法を見出した。１つの（共通の）宿主細胞を使用する１つの発酵プロセスを用いて、少なくとも２つの有益な発酵産物、すなわち、「一次」発酵産物及び「二次」発酵産物を得ることができ、特に、発酵産物の１つは水溶性であり、１つの発酵産物は脂溶性である方法である。

【0006】

特に、本発明は、好適な宿主細胞における共発酵プロセスであって、前記宿主細胞は少なくとも２つの発酵産物を共産生することができ、１つの発酵産物は水溶性であり、１つの発酵産物は脂溶性であり、特に脂溶性ビタミン、好ましくはビタミンＫ、より好ましくはビタミンＫ２であるプロセスを対象としている。好ましくは、一次発酵産物は水溶性であり、二次発酵産物は脂溶性である。

【0007】

本明細書で使用される場合、用語「１つの発酵プロセス」は、適切な培養条件下、一次発酵産物が形成され、前記一次発酵産物が産生流から単離され、すなわちバイオマスから分離され、さらに、第２の発酵産物が前記バイオマスから抽出される方法で行われる、好適な宿主細胞の培養を意味する。「１つの発酵プロセス」及び「共発酵プロセス」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これにはまた、両発酵産物が同時に抽出又は単離され、その後分離される、１つの宿主細胞を使用する少なくとも２つの発酵産物の共産生が含まれ得る。

【0008】

本明細書で使用される場合、「有益な発酵産物」は、ビタミン、酵素、オリゴ糖又はアミノ酸から選択される水溶性及び／又は脂溶性有機化合物の両方から選択され得、特に、１つのそのような発酵産物は水溶性化合物であり、１つのそのような発酵産物は脂溶性化合物である。本発明の範囲内の好適な酵素は、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼなどから選択され得る。本発明の範囲内の適切好適なアミノ酸は、リシン、トリプトファン又はグルタミン酸一ナトリウムから選択され得る。本発明の範囲内の好適なビタミンは、水溶性又は脂溶性ビタミン、例えばビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ１、ビタミンＤ、ビタミンＫ又はビタミンＢ７、特にビタミンＢ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＫ、特にビタミンＫ２、より特にはビタミンＢ２及びビタミンＫ２から選択され得る。

【0009】

一実施形態では、本発明は、少なくとも１種又は２種のビタミンが共産生される、特に、発酵産物の少なくとも１種が水溶性ビタミンであり、発酵産物の１種が脂溶性ビタミン、特にビタミンＫ、好ましくはビタミンＫ２である、共発酵プロセスを対象としている。特に、一次発酵産物は、水溶性ビタミン、例えば、ビタミンＢ２、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ１又はビタミンＢ７、特にはビタミンＢ２、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１２、より特にはビタミンＢ２からなる群から選択されるビタミンから選択される。好ましい実施形態では、一次発酵産物は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、Ｂ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などにおいて産生されるビタミンＢ２である（ビタミンＢ２の生合成については、例えばＥＰ４０５３７０号明細書、ＥＰ１１８６６６４号明細書中の図２又はＵｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，２００７，Ｃｈａｐｔｅｒ Ｖｉｔａｍｉｎｓを参照されたい）。

【0010】

したがって、好ましい実施形態では、一次発酵産物が水溶性ビタミン、より好ましくはビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、Ｂ１２から選択されるビタミン、最も好ましくはビタミンＢ２である。

【0011】

さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１つ又は２つのビタミンが共生産される共発酵プロセス、特に、発酵産物の少なくとも１つが脂溶性ビタミンであり、特に、脂溶性ビタミンが二次発酵産物として産生され、前記二次発酵産物が一次発酵産物のバイオマス又は「産生流」から抽出される、すなわち、一次発酵産物の発酵産生中に生成される二次発酵産物がバイオマスから抽出され、特に、一次発酵産物が上記で定義された水溶性ビタミンから選択される共発酵プロセスを対象としている。そのような脂溶性ビタミンの例はビタミンＫであり、天然型の１つとしてメナキノンとしても知られるビタミンＫ２が好ましく、より好ましくは、アイソフォームとしてＭＫ－７、ＭＫ－４、ＭＫ－６、ＭＫ－３を含み、ＭＫ－７の割合が他のアイソフォームと比較して少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）であるビタミンＫ２である。

【0012】

本明細書で使用される場合、発酵プロセスの文脈における「産生流」という用語は、所望の発酵産物（複数可）、すなわち、少なくとも本明細書で定義される一次及び二次発酵産物を含むマス流を意味する。

【0013】

したがって、本発明は、少なくとも２つの発酵産物の共産生であって、発酵産物のうちの１つは、例えば、本明細書に定義される一次発酵プロセスの産生流からの抽出又は単離により、二次発酵産物として生産されるビタミンＫ２であり、前記ビタミンＫ２は、少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の割合のＭＫ－７、例えば、少なくとも約８５、９０、９２、９５、９６、９８、９９又は１００％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲のＭＫ－７を含む、共産生を対象としている。

【0014】

さらなる態様においては、本発明は、少なくとも２つの発酵産物の共産生であって、発酵産物のうちの１つは、例えば、本明細書で定義される一次発酵プロセスの産生流からの抽出又は単離により、二次発酵産物として生産されるビタミンＫ２であり、前記ビタミンＫ２は、ビタミンＫ２などの発酵産物１ｇ当たり１０ｎｇ以下の割合のＤＮＡ、特に組換えＤＮＡを含み、好ましくは、前記ビタミンＫ２は、少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の割合のＭＫ－７、例えば、少なくとも約８５、９０、９２、９５、９６、９８、９９又は１００％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲のＭＫ－７を含む、共産生を対象としている。

【0015】

したがって、本発明は、既知のＰＣＲ法による測定で、例えば、本明細書に定義される二次発酵産物としてのバイオベースのビタミンＫ２などの発酵産物、約１ｇ当たり約１０ｎｇの範囲の最終濃度まで組換えＤＮＡを除去する、遺伝子改変又は組換え微生物を使用する発酵プロセスにおいて特に有用である。

【0016】

一実施形態では、少なくとも２つの発酵産物の共産生であって、発酵産物のうちの１つは、例えば、本明細書で定義される一次発酵プロセスの産生流からの抽出又は単離により、二次発酵産物として生産されるビタミンＫ２であり、前記ビタミンＫ２は、発酵産物１ｇ当たり１コロニー形成単位（ＣＦＵ）の割合の産生株、特に組換え産生株を含み、好ましくは、前記ビタミンＫ２は、発酵産物１ｇ当たり１０ｎｇ以下の割合のＤＮＡ、特に組換えＤＮＡを含み、且つ／又は少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の割合のＭＫ－７、例えば、少なくとも約８５、９０、９２、９５、９６、９８、９９又は１００％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲のＭＫ－７を含む、共産生を対象としている。

【0017】

ＣＦＵは、通常、当該技術分野で知られるように測定され、例えば、寒天プレート上に産物をプレートアウトし、産生株を増殖させる代表的な条件下で寒天プレートをインキュベートし、続いて、プレート上のコロニーが産生株であることを確認する（ＤＮＡシークエンシングによる）と共に、プレート上のコロニーの量を計数することによって視覚的に計数される。

【0018】

好適な宿主細胞は、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリザベトインギア属（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ）又はエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の株から選択され、好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）から選択され、より好ましくは、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．サブティリス・ナットー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）、Ｂ．ポリミクサ（Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｂ．フィルミス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）から、又はフラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｏ．）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、エイザベトインギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモニス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｃｒｅｍｏｎｉｓ）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、若しくはＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から選択される株から選択される。宿主細胞は、最も好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、特にＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択される。

【0019】

したがって、本発明は、上述の共発酵であって、少なくとも一次及び二次発酵産物が、特に、例えばビタミンＢ２などの水溶性ビタミンが、例えば本明細書で定義されるビタミンＫ２などの脂溶性ビタミンと一緒に生成される共発酵を対象としており、前記共発酵は、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリザベトインギア属（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ）及びエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、好ましくは、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．サブティリス・ナットー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）、Ｂ．ポリミクサ（Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｂ．フィルミス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、例えばフラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、エイザベトインギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモニス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｃｒｅｍｏｎｉｓ）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、又はフラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、又はＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から選択される好適な宿主細胞において行われる。宿主細胞は、最も好ましくは、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

【0020】

好ましい実施形態では、本発明は、例えば、複数の（ｎ）、ｒｉｂ遺伝子の転写を増強する強力なプロモーターＰ_{ｓｐｏ１５}で改変されたｒｉｂオペロンをコードするｐＲＦ６９のコピー（例えば、約５～約２０コピー）を含有するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］_ｎなどのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）における一次発酵産物としてのビタミンＢ２の発酵生産を含む（ビタミンＢ２を産生する株の構築及び培養条件について、例えば、ＥＰ４０５３７０号明細書、又はＰｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：８－１８，１９９９を参照）。ビタミンＢ２の産生を増加させるために、株に対し、例えば１つ以上のリボフラビン生合成遺伝子、特にｒｉｂＡの過剰発現、例えばＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＲＢ５０（例えば、ＥＰ４０５３７０号明細書を参照）において実施されるような宿主細胞におけるｒｉｂオペロンの複数のコピーの導入、強力なプロモーターへのｒｉｂオペロンの融合、ピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ ３．１．３．７４］の異種発現、例えばビオチンについてＥＰ１１８６６６４号明細書に記載されているような栄養要求性の導入によるなどのリボフラビンの産生からの増殖の分離などの改変を行い、且つ／又は、例えば国際公開第２００７／０５１５５２号パンフレットに記載されているような改変トランスケトラーゼ遺伝子の導入をさらに組み合わせ、且つ／又は、例えば国際公開第２０１０／０５２３１９な改変ｒｉｂリーダー配列の使用をさらに組み合わせることができる。当業者は、それぞれの発酵産物、特に一次発酵産物であるビタミンＢ２の産生を増加させるために産生株を操作する方法、及び本明細書に記載の共発酵、特に二次発酵産物としてビタミンＫ２を用いる共発酵においてこれを使用する方法を知っている。

【0021】

用語「廃棄バイオマス」又は「価値のない廃棄物流」は、本明細書で使用される場合、少なくとも一次及び二次発酵産物を回収した後の残りのバイオマスを定義し、これは、処分するか、又は肥料として、若しくはさらなる価値のある有機化合物の抽出のためにさらに使用し得る。

【0022】

１つの特定の実施形態では、本発明は、本明細書で定義される一次及び二次発酵産物の共発酵であって、両方の発酵産物又は一方の発酵産物のみが、細胞内若しくは細胞膜内で産生されるか、又は発酵産物の少なくとも１つ、特に一次発酵産物が、結晶の形態で宿主細胞外に分泌される共発酵を対象としている。特に、例えばビタミンＢ２などの一次発酵産物が細胞外に分泌され、一方、二次発酵産物は細胞膜で産生され、したがって、例えばビタミンＫ２などの二次発酵産物としてバイオマスから（すなわち、本明細書で定義される発酵プロセスの産生流から）回収される。

【0023】

特定の一実施形態では、本発明による方法は、以下を含むがこれらに限定されないいくつかの工程を含む：
（ａ）一次発酵産物に応じて好適な条件下及び好適な培養培地中で宿主細胞を培養する工程、特に、一次発酵産物がビタミン、アミノ酸、酵素又はオリゴ糖から、好ましくは水溶性ビタミンから、より好ましくはビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７又はＢ１２から、最も好ましくはビタミンＢ２から選択される工程、
（ｂ）産生流から前記一次発酵産物の単離する工程、すなわちバイオマスから一次発酵産物を分離する工程、
（ｃ）二次発酵産物、特に、ビタミンＫ、特に本明細書で定義されるビタミンＫ２などの脂溶性ビタミンを、発酵プロセスの産生流から回収する工程、すなわち第１の発酵産物の発酵／産生中に生成されたバイオマスから回収する工程、及び、任意選択により
（ｄ）発酵産物を精製する工程。

【0024】

工程（ｄ）からの廃棄バイオマスは、任意選択により、処分されるか、又はさらなる有益な有機化合物の抽出に使用され得る。

【0025】

一実施形態では、本発明による方法は、両方が固体形態の、例えば結晶形態の発酵産物（すなわち、一次及び二次発酵産物）を提供する。１つの例においては、本発明は、ビタミンＢ２（一次固体発酵産物として）及びビタミンＫ２（二次固体発酵産物として）の共生産、すなわち、両方の生産物が固体であり、１つの発酵産物が宿主細胞外に排出され、１つの発酵産物が細胞内に蓄積される共生産を対象としている。

【0026】

さらなる実施形態では、本発明による方法は、発酵産物（すなわち、一次及び二次発酵産物）を提供し、産物の一方は固体形態であり、他方の産物は液体形態であり、液体画分はバイオマス／産生流から分離され得る。

【0027】

上記で定義される共発酵プロセスは、バッチ、フェドバッチ又は連続モードで、例えば、ビタミンＢ２の産生を含むがこれに限定されない一次発酵産物に応じて、より好ましくはＥＰ４０５３７０号明細書又は国際公開第２００７／０５１５５２号パンフレットに記載の宿主細胞としてバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を使用するプロセスで実施され得る。

【0028】

上記で定義される好適な宿主細胞の培養は、例えば、使用する宿主、一次発酵産物、ｐＨ、温度、及び栄養培地に応じて変動し得る。宿主細胞としてＢ．サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を用いてリボフラビンを生産する場合、本プロセスは、微生物に応じて、約１０時間～約１０日間、好ましくは約４～約７日間、より好ましくは約２～約６日間実施することができる。当業者は、本発明に関して使用すべき好適な微生物／宿主細胞の最適培養条件がわかるであろう。

【0029】

特定の実施形態では、本発明による共発酵プロセスは、例えば、約７．０、好ましくは約６～約８、より好ましくは約６．５～７．５の範囲のｐＨで実施することができる。培養を行うための好適な温度範囲は、例えば、約１３℃～約７０℃、好ましくは約３０℃～約３９℃、より好ましくは約３５℃～約３９℃、最も好ましくは約３６℃～約３９℃とすることができる。増殖用の培養培地は、通常、同化性炭素源、例えば、Ｄ－グルコース、グリセロール、シックジュース、デキストロース、デンプン、スクロース又はリボースなどの３，５又は６個の炭素原子からなる化合物；及び可消化窒素源、例えば、有機物、例えば、ペプトン、酵母エキス及びアミノ酸のような栄養素を含有することができる。培地は、尿素及び／又はコーンスティープリカー及び／又はパン酵母を含んでもよく、含まなくてもよい。様々な無機物、例えば、ナイトレート及びアンモニウム塩もまた、窒素源として使用することができる。さらに、増殖培地は、通常、無機塩、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウム、及び炭酸カルシウムを含有することができる。次いで、上記の手順を用いて得られた細胞を、上記のような基質の存在下で、これらの基質を、ビタミン、オリゴ糖、アミノ酸又は酵素、例えば、水溶性ビタミン、好ましくはビタミンＢ２を含む所望の（一次）発酵産物に変換するような方法で、上記のような実質的に同じモード、温度及びｐＨ条件でさらにインキュベートすることができる。インキュベートは、例えば、有機窒素源、例えば、ペプトン、酵母エキス、パン酵母、尿素、アミノ酸、及びコーンスティープリカー、又は無機窒素源、例えば、ナイトレート及びアンモニウム塩を含有する、窒素に富んだ培地中で行うことができ、この場合、細胞は、所望の一次発酵産物を産生しながらさらに増殖することが可能である。或いは、インキュベートは、窒素に乏しい培地中で行うことができ、この場合、細胞は実質的に増殖せず、休止細胞モード、又は生体内変化モードにある。全ての場合において、培養培地はまた、無機塩、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウム、及び塩化カルシウムを含有することができる。当業者であれば、宿主細胞及び産生された発酵産物に応じて、どの条件を適用すべきかを知っているであろう。リボフラビンの発酵産生に好適な培地の例は、国際公開第２００４／１１３５１０号パンフレットに記載されており（ＶＦ－培地）、これはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に関して特に有用であり、本発明の目的のために使用することができる。

【0030】

上記で定義されるようなバイオマスからの一次発酵産物の分離（すなわち、生産流からの産物の抽出）は、発酵産物に応じて、種々の方法で実施することができ、ビタミンＢ２を含むがこれに限定されない一次発酵産物が、例えば結晶の形態で、細胞外に排出される場合、分離は、例えば、７０℃で４時間加熱することによるなどの低温殺菌工程、続いて、遠心分離による回収を含む、デカンテーションを含むがこれに限定されない１つ以上の固液分離工程（複数可）を含み得る（例えば、国際公開第２００５／０１４５９４号パンフレットを参照）。低温殺菌されたブロスの処理は、例えば、一次発酵産物がビタミンＢ２の場合に好ましいように、デカンテーションによって行うことができる。リボフラビン結晶などの結晶は、任意選択により、知られた方法でさらに精製することができる。任意のさらなる精製工程の後、物質は、食品／飼料／製薬又は化粧品産業における成分として使用され得る。１つの非常に具体的な実施形態では、発酵ブロス１ｌ当たり少なくとも約２８０ｍｇの量のリボフラビンを得ることができる。

【0031】

二次発酵産物の回収は、一次発酵産物の発酵から得られるバイオマス又は産生流からの抽出／回収によって行うことができ、前記抽出／回収は、持続可能な方法で、特に抽出プロセスは例えばヘキサンなどの環境問題のある溶媒を含まない方法で行われる。

【0032】

したがって、本発明は、二次発酵産物が、ヘキサンを含まない溶媒、好ましくは、特に少なくともエタノールを約８０％（ｗｔ／ｗｔ）、例えばエタノールを少なくとも約８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、又は１００％（ｗｔ／ｗｔ）の割合で含む水溶液（エタノール水溶液）から選択される溶媒を用いて、一次発酵産物の産生中に得られたバイオマスから抽出されるなど、産生流から単離される、共発酵プロセスを対象としている。前記工程に使用されるさらなる好適な溶媒は、イソプロパノール又はアセトンを含む水溶液から選択することができる。

【0033】

１つの特定の実施形態では、回収された一次／二次発酵産物は、例えば、精密濾過、限外濾過及び／又はナノ濾過を含む、例えば１つ又はいくつかの濾過工程を実施することによってさらに精製することができる。好ましい実施形態では、濾過は、カットオフが例えば１０ｋＤＡ未満の範囲にある、低カットオフの膜を使用して実施される。任意選択により、溶媒をさらに蒸発させ、冷却工程の後に／一次第２発酵産物の結晶を単離する。非常に好ましい一実施形態では、本明細書で定義される二次発酵産物としてのバイオベースのビタミンＫ２の結晶を、ＭＫ－７の割合が少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）で単離する。

【0034】

一次発酵産物、例えばビタミンＢ２、及び二次発酵産物、例えばビタミンＫ２、すなわち両バイオベースの産物は、そのような本発明により生成されるビタミンＢ２結晶及び／又はビタミンＫ２結晶を含む栄養製品、例えば食品、飼料、化粧品として使用される組成物としてさらに使用され得る。

【0035】

本発明は、組換えＤＮＡの量が、例えば、当該技術分野で知られるＰＣＲ法により測定され得る、発酵産物１ｇ当たりＤＮＡ約１０ｎｇ以下の範囲にまで低減される、発酵産物、特にビタミンＫ２に関する。

【0036】

本発明はさらに、産生株に由来するＤＮＡの量が、例えば、生産物の希釈、インキュベーション及びプレーティングにより測定することができ、且つ当該技術分野で知られる、産物１ｇ当たり約１ＣＦＵ未満の範囲にまで低減される、発酵産物、特にビタミンＫ２に関する。

【0037】

別の態様では、本発明は、発酵産物、特に、ＭＫ－７を少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲、好ましくは少なくとも約８５、９０、９２、９５、９６、９８、９９又は１００％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲の割合で含み、特に、ＤＮＡ、好ましくは組換えＤＮＡの最大含有量が、ＰＣＲによる測定で、例えば、ビタミンＫ２の１ｇ当たりＤＮＡ約１０ｎｇの範囲にある、ビタミンＫ２に関する。ビタミンＫ２などの二次発酵産物は、例えば、ＭＫ－４、ＭＫ－５、ＭＫ－６などの微量に存在するさらなるアイソフォームを、約２０、１５、１０、５、４、３、２又は１％（ｗｔ／ｗｔ）未満の量で含み得る。ビタミンＫ２及びそのアイソフォームの分析は、当該技術分野において知られるように、又は実施例においてさらに記載されるように、ＨＰＬＣによって行うことができる。

【0038】

一態様では、本発明は、例えば、少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）のＭＫ－７を有し、約２０、１５、１０、５、４、３、２又は１％（ｗｔ／ｗｔ）以下の本明細書で定義されるＭＫ－４、ＭＫ－５、及びＭＫ－６を有する結晶などのバイオベースのビタミンＫ２を含む栄養製品の製造、特に、本発明により生産されるバイオベースのビタミンＫ２を含む固体又は液体製剤、例えば固体粒子を含む食品、飼料又は化粧品として／において使用される組成物の調製に関する。

【0039】

食品、飼料又は化粧品製剤に使用される本発明により製造されるバイオベースのビタミンＫ２は、食品、飼料又は化粧品産業における最終用途に応じて、且つ当該技術分野で知られているように、カプセル化剤、有機溶媒、油、超臨界流体、抗酸化剤、糖、共結晶化剤、コアセルベート、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成分と混合することができる。

【0040】

本明細書で定義されるバイオベースのビタミンＫ２を含む製剤で使用される好適なカプセル化剤としては、改質（食品用）デンプン、パルミチン酸アスコルビル、ペクチン、アルギン酸塩、カラゲナン、ファーセレラン、デキストリン誘導体、セルロース及びセルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、リグノスルホン酸塩、多糖類ガム（例えば、アカシアゴム／アラビアゴム、変性アカシアゴム、ＴＩＣゴム、亜麻仁ゴム、ギャッティ（ｇｈａｔｔｉ）ゴム、タマリンドゴム及びアラビノガラクタン）、ゼラチン（ウシ、魚、ブタ、家禽）、植物タンパク質（例えば、エンドウ、ダイズ、ヒマシ、ワタ、ジャガイモ、サツマイモ、マニオック、ナタネ、ヒマワリ、ゴマ、亜麻仁、ベニバナ、レンズマメ、ナッツ、コムギ、イネ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、ルーピン、及びソルガムなど）、乳又はホエータンパク質を含む動物タンパク質、レシチン、脂肪酸のポリグリセロールエステル、脂肪酸のモノグリセリド、脂肪酸のジグリセリド、ソルビタンエステル、及び糖エステル（並びに、これらの誘導体）、特に、マルトデキストリン、食品用改質デンプン、又はゴム類、例えばアカシアゴムが挙げられるが、これらに限定されない。

【0041】

本明細書で定義されるビタミンＫ２を含む製剤に使用される好適な有機溶媒としては、ハロゲン化脂肪族炭化水素、脂肪族エーテル、脂肪族及び環状カーボネート、脂肪族及び環状エステル（ラクトン）、脂肪族及び環状ケトン、脂肪族アルコール、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ハロゲン化脂肪族炭化水素の有用な例としては、モノハロゲン化又はポリハロゲン化直鎖、分岐又は環状Ｃ１～Ｃ１５－アルカン、特にモノ－又はポリ塩化又はポリ臭素化直鎖、分岐又は環状Ｃ１～Ｃ１５－アルカン、好ましくはモノ－又はポリ塩化直鎖、分岐又は環状Ｃ１～Ｃ１５－アルカン、最も好ましくは塩化メチレン又はクロロホルムが挙げられる。脂肪族又は環状エステルの有用な例としては、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ－ブチル、又はγ－ブチロラクトンが挙げられる。有用な脂肪族又は環状ケトンの例としては、アセトン、ジエチルケトン若しくはイソブチルメチルケトン、又はシクロペンタノン若しくはイソホロンを挙げることができる。環状カーボネートの例としては、エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート、又はこれらの混合物が挙げられる。脂肪族エーテルの例としては、アルキル部分が１～４個の炭素原子を有するジアルキルエーテルを挙げることができる。１つの好ましい例は、ジメチルエーテルである。好適な脂肪族アルコールの例は、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、又はブタノールである。

【0042】

本明細書において定義されるバイオベースのビタミンＫ２を含む製剤において使用される好適な油（すなわち、トリグリセリド）としては、オレンジ油、リモネンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0043】

本明細書で定義されるビタミンＫ２を含む製剤において使用される好適な抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、アスコルビン酸、及び／又は当該技術分野で知られるそれらの誘導体から選択される、水溶性又は脂溶性抗酸化剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0044】

本明細書において定義されるビタミンＫ２を含む製剤において使用される好適な共結晶化剤としては、当該技術分野において知られるアミノ酸、可用性エンハンサー、及び小分子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0045】

本明細書において定義されるビタミンＫ２を含む製剤において使用される好適なコアセルベートとしては、例えば、酵素結合触媒作用により達成される、酵素による架橋工程が挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

本明細書で定義されるバイオベースのビタミンＫ２を含む固体組成物、例えば固体粒子又はマイクロカプセルの調製方法は知られており、例えば、ＣＮ１０１４２２４４６号明細書、国際公開第２００７／０４５４８８号パンフレット、又は国際公開第２０１５／１６９８１６号パンフレットに開示されている。本明細書で定義されるような固体ビタミンＫ２組成物の調製に特に有用な成分は、キサンタン、アラビアゴム、グアーガム、ゼラチン、スクロース、ゼラチン／スクロース及び／又はデキストリンの混合物、デンプン、食品用改質デンプン、グルコースシロップ、パーム油、ナタネ油からなる群から選択される。

【0047】

本発明に関して、生物、例えば微生物、真菌、藻類又は植物などはまた、国際原核生物命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）又は国際藻類・菌類・植物命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ａｌｇａｅ，ｆｕｎｇｉ，ａｎｄ ｐｌａｎｔｓ）（メルボルン規約）により定義されている、同じ生理学的性質を有するそのような種のシノニム又はバソニムも含むと理解される。

【0048】

本明細書で使用される場合、「リボフラビン」という用語には、リボフラビン前駆体、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、及びこれらの誘導体も含まれる。リボフラビン前駆体、及びリボフラビン、ＦＭＮ又はＦＡＤの誘導体としては、２，５－ジアミノ－６－リボシルアミノ－４（３Ｈ）－ピリミジノン－５’－ホスフェート（ＤＲＡＰＰ）；５－アミノ－６－リボシルアミノ－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン－５’－ホスフェート；２，５－ジアミノ－６－リビチルアミノ－４（３Ｈ）－ピリミジノン－５’－ホスフェート；５－アミノ－６－リビチルアミノ－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン－５’－ホスフェート；５－アミノ－６－リビチルアミノ－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン；６，７－ジメチル－８－リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）；及びフラボタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。リボフラビンの誘導体としては、リボフラビン－５－リン酸及びその塩、例えばリボフラビン－５－リン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。

【0049】

「リボフラビン」及び「ビタミンＢ２」という用語は、本明細書において互換的に使用される。リボフラビンの生合成に必要とされる遺伝子、及びリボフラビンの発酵産生、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株を使用する発酵産生の方法は知られている（例えば、ＥＰ４０５３７０号明細書、又はＵｌｌｍａｎ’ｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００７，Ｃｈａｐｔｅｒ Ｖｉｔａｍｉｎｓを参照）。これらの方法は、本明細書に記載されるような改変宿主細胞、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などを使用するリボフラビンの産生にも適用することができる。

【0050】

本明細書で使用される場合、「ビタミンＫ２」及び「メナキノン」（ＭＫ－ｎ；ここで、「ｎ」は鎖の長さである）という用語は、本明細書において互換的に使用される。それには、ＭＫ－４、ＭＫ－５、ＭＫ－６、ＭＫ－７、ＭＫ－９、ＭＫ－１０、ＭＫ－１１、ＭＫ－１２、ＭＫ－１３及びＭＫ－１４が含まれ、ＭＫ－７が最も重要で好ましいアイソフォームである。

【0051】

「発酵」又は「産生」又は「発酵プロセス」は、本明細書で使用される場合、当業者に知られた培地、条件及び手順を使用する増殖細胞の使用、又は、当業者に知られる培地、条件及び手順を使用することにより培養された後の非増殖のいわゆる休止細胞の使用を、好適な基質のリボフラビンへの変換に適切な条件下で行うことであり得る。

【0052】

本発明に関連した「バイオベースの」という用語は、産物、すなわちビタミン、酵素、オリゴ糖及び／又はアミノ酸を含む本明細書で定義される発酵産物が、化学合成によらず、生物工学的手段によって生成されることを示す。

【0053】

「産生」又は「産生力」という用語は当該技術分野において認識されており、所与の時間内及び所与の発酵体積内に形成されるリボフラビンの濃度（例えば、１時間当たり、１リットル当たりの産物ｋｇ）が含まれる。「産生の効率」という用語には、得られるべき特定の産生レベルに必要な時間（例えば、細胞が発酵産物の特定の産出率を達成するのにかかる時間）が含まれる。「収率」という用語は当該技術分野において認識されており、炭素源を産物（すなわち、リボフラビン）に変換する効率が含まれる。これは一般に、例えば、炭素源１ｋｇ当たりの産物のｋｇとして記述される。化合物の「収率及び／又は産生／産生力の増加」とは、所与の培養量で、所与の時間にわたって、その化合物の、回収された分子の、又は回収された有用な分子の量を増加させることを意味する。

【0054】

リボフラビン又はビタミンＫ２の収率／産生力を決定するための分析方法は当該技術分野において知られている。そのような方法としては、ＨＰＬＣ又は指示菌株の使用を挙げ得るが、これに限定されない（例えば、Ｂｒｅｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１９－２６，１９９９を参照）。

【0055】

本発明の特定の実施形態は以下の通りである。
（１）酵素、アミノ酸、オリゴ糖又はビタミンの発酵産物における廃棄物流からの資源回収のための方法であって、発酵廃棄物流からのビタミンＫ２の回収を含む方法。
（２）回収されたビタミンＫ２は、少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の割合のアイソフォームＭＫ－７を含む、実施形態（１）の方法。
（３）ビタミン、アミノ酸、オリゴ糖又は酵素から選択される発酵産物中のＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの割合は、発酵産物１ｇ当たりＤＮＡが約１０ｎｇ以下の範囲にあり、その発酵産物はビタミンＫ２を含む、実施形態（１）又は（２）の方法。
（４）発酵産物１ｇ当たりの産生株、特に組換え産生株のコロニー形成単位（ＣＦＵ）は。発酵産物１ｇ当たり約１ＣＦＵ以下の範囲にあり、その発酵産物はビタミンＫ２を含む、実施形態（１）、（２）又は（３）の方法。
（５）プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リシン、トリプトファン、グルタミン酸一ナトリウム、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ１、ビタミンＤ、及びビタミンＢ７からなる群から選択される１つ以上の発酵産物の発酵産生、好ましくはビタミンＢ２の発酵産生を含む、実施形態（１）、（２）、（３）又は（４）の方法。
（６）ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリザベトインギア属（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ）及びエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）からなる群から選択される、好ましくは、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）若しくはＢ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．サブティリス・ナットー（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）、Ｂ．ポリミクサ（Ｂ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）、Ｂ．フィルミス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、フラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｏ．）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、エイザベトインギア・メニンゴセプティカ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクティス亜種クレモニス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｓｐ．Ｃｒｅｍｏｎｉｓ）、フラボバクテリウム・メニンゴセプティカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、又はフラボバクテリウム種（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、又はＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）から選択される宿主細胞における実施形態（１）、（２）、（３）、（４）又は（５）の方法。
（７）ビタミン、酵素、オリゴ糖又はアミノ酸から選択される１種以上の一次発酵産物と共産生されるビタミンＫ２の発酵産物を含む２種以上の発酵産物の同時産生のための方法であって、好ましくは、一次発酵産物は、プロテアーゼ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リシン、トリプトファン、グルタミン酸一ナトリウム、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ１、ビタミンＤ、及びビタミンＢ７からなる群から選択され、より好ましくはビタミンＢ２から選択される方法。
（８）
（ａ）ビタミン、オリゴ糖、アミノ酸又は酵素から選択される発酵産物の産生に好適である、好適な条件下及び好適な培養培地中で宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの発酵産物をバイオマスから分離する工程、
（ｃ）バイオマスからビタミンＫ２を回収する工程、並びに、任意選択による
（ｄ）廃棄バイオマスを処理する工程
を含む、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）の方法。
（９）遺伝子操作されたバイオマスから回収／抽出を行う工程を含むバイオベースのビタミンＫ２の製造であって、回収されたビタミンＫ２は、少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の範囲のＭＫ－７の含有量を有し、且つ、ＰＣＲによる測定で、ビタミンＫ２ １ｇ当たり約１０ｎｇのＤＮＡ、好ましくは組換えＤＮＡの最大含有量を有する、製造。
（１０）最大含有量がビタミンＫ２ １ｇ当たり最大約１ＣＦＵで実施形態（９）の方法により得られたバイオベースのビタミンＫ２産物。
（１１）発酵産物は結晶形態で産生され、好ましくは、発酵産物はビタミンＢ２である、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）の方法であって、
（ａ）結晶形態の発酵産物を蓄積させる好適な培養条件下で、好適な宿主細胞、好ましくは組換え宿主細胞による発酵を行う工程、
（ｂ）ビタミンＫ２を含有する液体画分から結晶画分を分離する工程、
（ｃ）バイオマスからビタミンＫ２を抽出する工程、及び、任意選択による
（ｄ）バイオマスを廃棄、又は肥料としてさらに使用する工程
を含む方法。
（１２）発酵産物は宿主細胞の外で産生され、好ましくは、発酵産物は酵素、アミノ酸、オリゴ糖である方法である、実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）の方法であって、
（ａ）宿主細胞の外に発酵産物を蓄積させる好適な培養条件下で、好適な宿主細胞、好ましくは組換え宿主細胞による発酵を行う工程、
（ｂ）ビタミンＫ２を含有するバイオマスから結晶画分を分離する工程、
（ｃ）バイオマスからビタミンＫ２を抽出する工程、及び、任意選択による
（ｄ）バイオマスを廃棄、又は肥料としてさらに使用する工程
を含む方法。
（１３）工程（ｃ）は、少なくとも約８０％（ｗｔ／ｗｔ）の割合のＥｔＯＨを有するＥｔＯＨ水溶液の存在下で行われる、実施形態（１１）又は（１２）の方法。
（１４）実施形態（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１１）又は（１３）の方法によって得られるバイオベースのビタミンＫ２を、カプセル化剤、有機溶媒、油、超臨界流体、抗酸化剤、糖、共結晶化剤、コアセルベート、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の成分と混合する工程を含む、栄養製品の製造方法。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1】Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるビタミンＫ２とリボフラビンの共抽出。点線のボックスはビタミンＫ２の回収を示し、実線のボックスはビタミンＢ２の回収を示す。

【0057】

以下の実施例は単に説明のためのものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許出願、特許、及び公開された特許出願、特にＥＰ４０５３７０号明細書、ＥＰ１１８６６６４号明細書、国際公開第２０１０／０５２３１９号パンフレット、国際公開第２００４／１１３５１０号パンフレット、国際公開第２００５／０１４５９４号パンフレット、国際公開第２０１／７０３６９０３号パンフレット、国際公開第２００７／０５１５５２号パンフレット、国際公開第２００５／０１４５９４９号パンフレット、国際公開第２０１３／１２４３５１号パンフレット、ＥＰ１８１４９８７号明細書、ＣＮ１０１４２２４４６号明細書、国際公開第２００７／０４５４８８号パンフレット、国際公開第２０１５／１６９８１６号パンフレットの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0058】

［実施例］
［実施例１：一般的方法］
別段の記載がない限り、全ての培地及び一般的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）又は国際公開第２０１７／０３６９０３号パンフレットに開示されている。

【0059】

ディープウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中でのリボフラビン産生のアッセイを、次のように実行した：必要に応じて選択抗生物質を含有する３ｍｌのＶＹ中に、単一コロニーから終夜培養物を作製した。事前培養物を、３９℃、５５０ｒｐｍ、湿度８０％でインキュベートした。翌日、３ｍｌのＲＳＭに、事前培養物を、出発ＯＤ_{６００ｎｍ}約０．０５で播種した。ＭＴＰ中の培養物を三重反復で作製し、ウェルをブレスシールでカバーした。ＭＴＰを、３９℃、５５０ｒｐｍ、湿度８０％で４８時間インキュベートした。２５０μｌの４８時間培養物を２０μｌの４Ｍ ＮａＯＨ溶液で処理して、リボフラビンの結晶を可溶化した（３００ｒｐｍで１分間振盪）。２３０μｌの１Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．８を加えた（３００ｒｐｍで１分間振盪）。クォータナリポンプ、オートサンプラー、ＵＶ検出器及び蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して、ＨＰＬＣによりリボフラビンをアッセイした。Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ－８ ＤＢ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ×５μｍ）を使用して分離した。最適カラム温度は２０℃とした。移動相は、０．１Ｍ酢酸が１００％から、分析１回につき全３３分間の１５分時点で０．１Ｍ酢酸／メタノールが５０／５０への勾配とした。流量は１．０ｍｌ／分とし、注入量を５μｌに設定した。ＵＶシグナルをモニターし、検出のために使用した。０．１μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌの較正範囲。加えて、培養ブロス中のグルコースの蓄積の可能性を、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムにより、バイナリポンプ、オートサンプラー、ＵＶ検出器及び屈折率検出器を使用して分析した。ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＮＨ２ ＵＧ８０カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ；株式会社資生堂）で分離した。最適カラム温度は４０℃とした。移動相は、アセトニトリルと脱イオン水との６５：３５の比での混合物とした。流量は１．０ｍｌ／分とし、注入量を５μｌ又は１０μｌに設定した。屈折率シグナルをモニターし、検出のために使用した。各化合物の較正範囲を０．３ｍｇ／ｍｌ～３ｍｇ／ｍｌとした。

【0060】

Ｋ２ビタマーの分析は、乾燥バイオマスから分析物を抽出した後、ＨＰＬＣによって行った。バイオマスを凍結乾燥し、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓホモジナイザーを用いて抽出を行った。２つの破壊サイクルを適用した。分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＨＰＬＣシステム（又は同様のもの）で、クォータナリポンプ、オートサンプラー及びＵＶ検出器を用いて行った。分離はＣ１８カラム、１５０×４．６ｍｍ、３μｍで行った。最適カラム温度は１５℃とした。移動相はメタノールとエタノールの混合物（６０：４０の比）とした。１５分間でＭｅＯＨ：ＥｔＯＨが６０：４０から４０：６０の範囲の勾配溶出を適用した。流量は１．０ｍｌ／分とした。２７０ｎｍのＵＶシグナルをモニターし、定量に使用した。

【0061】

［実施例２：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）又はコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株における一次発酵産物の発酵産生及びビタミンＫ２の回収］
一次発酵産物であるリボフラビンを製造するために、国際公開第２００７／０５１５５２号パンフレットによるプロトコルを実施した。発酵の終わりに、ブロスを低温殺菌し、デカントしたビタミンＢ２結晶（Ｓｅｄｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）：Ｆｌｏｔｔｗｅｇ、ドイツ）をさらに処理した（例えば、国際公開第２００５／０１４５９４９号パンフレットを参照）。

【0062】

医薬品グレードのリボフラビンを製造するために、結晶を濃ＨＣＬに溶解し、続いて濾過し、水を逆溶媒として再結晶化した。

【0063】

バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における一次発酵産物として酵素を発酵生産する場合、国際公開第２０１３／１２４３５１号パンフレットによるプロトコルを使用することができる。

【0064】

コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）における一次発酵産物としてアミノ酸を発酵生産する場合、ＥＰ１８１４９８７号明細書によるプロトコルを使用することができる。

【0065】

発酵プロセスの終わりに、ビタミンＫ２を含む、上記のＳｅｄｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）を用いた第１のデカンテーション工程からの上清（バイオマススラリー）を、単一抽出溶媒としてのエタノールで処理し、続いて、精密濾過膜を通過させて、ＥｔＯＨ及び廃棄バイオマスの大部分を除去した。溶液中になお存在する残存ｒＤＮＡ、タンパク質又は脂質の一部を除去するために、限外濾過及び／又はナノ濾過を含むさらなる精製工程を適用し、廃棄バイオマス及びＥｔＯＨをさらに除去した。さらなる蒸発及び冷却結晶化を行った後、さらなる濾過及び乾燥工程を実施し、上記の処理の開始時の１％未満のＭＫ－７（ｗｔ／ｗｔ）と比較して、少なくとも８０％（ｗｔ／ｗｔ）のＭＫ－７を有する精製ビタミンＫ２結晶を得た。メナキノン画分（特に、ＭＫ－４、ＭＫ－５及びＭＫ－６を含有）の純度もまた、処理開始時の８７～８８％から９７～９８に上昇した。ビタミンＫ２結晶のｒＤＮＡ含量を分析したところ、ＰＣＲにより１０ｎｇ／ｇ製品未満と測定された。

【0066】

上記のような手順で得られたリボフラビン：ビタミンＫ２（ＭＫ－７）の比は、１０００：１の範囲であった。

【0067】

［実施例３：固体ビタミンＫ２製剤］
少なくとも８０％（ｗｔ／ｗｔ）のＭＫ－７を有するビタミンＫ２結晶を、６２℃で中鎖脂肪酸トリグリセリド油に溶解する。アカシアゴム及び糖を水に溶解し、ビタミンＫ２を含む油相を６２℃で添加する。

【0068】

均質化（例えば、ローター／ステーター又は高圧均質化）後、得られた分散液を、薄いデンプンコーティングを含めて噴霧乾燥することができる。理想的には、液滴の最終サイズは１００～８００ｎｍである。

【0069】

このようにして生成されたビタミンＫ２マイクロカプセルは、国際公開第２０１５／１６９８１６号パンフレット（実施例１～７）に例示されているように、固形錠剤を製造するために、食物ミネラル（例えば、ＭｇＯ、ＣａＣＯ_３）微結晶セルロース粉末、ステアリン酸Ｍｇなどとさらに混合することができる。

【図1】

【国際調査報告】