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特表2023-531066リポ多糖結合オリゴマータンパク質に関する使用、方法および製品
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-20
(54)【発明の名称】リポ多糖結合オリゴマータンパク質に関する使用、方法および製品
(51)【国際特許分類】
C07K 14/39 20060101AFI20230712BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230712BHJP
【ＦＩ】
C07K14/39 ZNA
G01N33/53 S
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580048
(86)(22)【出願日】2021-06-24
(85)【翻訳文提出日】2023-02-16
(86)【国際出願番号】 EP2021067413
(87)【国際公開番号】W WO2021260144
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】2009730.9
(32)【優先日】2020-06-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．トライトン
(71)【出願人】
【識別番号】510179537
【氏名又は名称】ウニヴァーシテテット イ オスロ
【住所又は居所原語表記】Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １０７２，Ｂｌｉｎｄｅｒｎ，０３１６ Ｏｓｌｏ Ｎｏｒｗａｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110001070
【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハットレム， ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】リンケ， ダーク
(72)【発明者】
【氏名】バーバーズ， ステファニー ブリジット
【テーマコード（参考）】
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA60
4H045BA70
4H045CA15
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明においては、リポ多糖（ＬＰＳ）に結合するための結合剤としてのオリゴマータンパク質の使用が提供され、記載され、このオリゴマータンパク質は、少なくとも２つのモノマーペプチドを含むコイルドコイル構造を有し、各モノマーペプチドは、同じであっても異なっていてもよく、α－ヘリックスを形成することができ、配列番号１のヘプタッド（７アミノ酸）繰り返し配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する少なくとも１つのコア配列を含む。本発明においてはまた、ＬＰＳに結合する方法、ＬＰＳを検出する方法およびＬＰＳを除去する方法と、このオリゴマータンパク質を含む製品とが提供され、記載される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リポ多糖（ＬＰＳ）に結合するための結合剤としてのオリゴマータンパク質の使用であって、前記オリゴマータンパク質は、少なくとも２つのモノマーペプチドを含むコイルドコイル構造を有し、各モノマーペプチドは同じであっても異なっていてもよく、α－ヘリックスを形成することができ、配列番号１のヘプタッド（７アミノ酸）繰り返し配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する少なくとも１つのコア配列を含む、オリゴマータンパク質の使用。
【請求項2】
前記コア配列は、少なくとも３つのヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇまたはそれらの変異形を含み、各変異形は、前記ヘプタッドモチーフに対する１つを超えない挿入または欠失を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記ヘプタッドモチーフまたはそれらの変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％は、疎水性残基である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項4】
前記コア配列は、一方の側または両方の側でフランキングアミノ酸配列と接している、請求項１～３の何れか一項に記載の使用。
【請求項5】
前記フランキング配列は、１つ以上のヘプタッドモチーフ、および／またはそれらの１つ以上の部分を含み、好ましくは、前記ヘプタッドモチーフ中のアミノ酸残基ａおよびｄの少なくとも１つは、疎水性残基であるという前提条件で、前記フランキング配列中の前記ヘプタッドモチーフは、配列番号１またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列において見いだされるヘプタッドモチーフに対応する、請求項４に記載の使用。
【請求項6】
前記フランキング配列は、配列番号１、またはその一部、またはそれと少なくとも５０％の配列同一性を有する配列を含み、配列番号１またはその変異形のヘプタッドモチーフの位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％は、疎水性残基である、請求項４または５に記載の使用。
【請求項7】
前記フランキング配列は、１つ以上のリンカー配列を含む、請求項３～６の何れか一項に記載の使用。
【請求項8】
前記モノマーペプチドは、それぞれが２つ以上のコア配列を含み、前記コア配列は、同じであっても異なっていてもよい、請求項１～７の何れか一項に記載の使用。
【請求項9】
前記オリゴマータンパク質は、二量体、三量体または四量体である、請求項１～８の何れか一項に記載の使用。
【請求項10】
前記オリゴマータンパク質は、三量体である、請求項１～９の何れか一項に記載の使用。
【請求項11】
前記モノマーペプチドは、別々の鎖として提供される、請求項１～１０の何れか一項に記載の使用。
【請求項12】
前記モノマーペプチドは、繋ぎ合わされている、請求項１～１０の何れか一項に記載の使用。
【請求項13】
前記モノマーペプチドは、繋がれて単一の鎖になっているか、または前記モノマーペプチドは、１つ以上の化学架橋によって繋がれている、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
前記ヘプタッドモチーフまたはその変異形の中の各疎水性残基は、独立に、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニンおよびそれらの化学誘導体からなる群から選ばれる、請求項１～１３の何れか一項に記載の使用。
【請求項15】
各疎水性残基は、独立に、ロイシンおよびイソロイシンあるいはそれらの化学誘導体から選ばれる、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記化学誘導体は、フルオロロイシンまたはフルオロイソロイシンである、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
前記疎水性残基の少なくとも５０％は、イソロイシンまたはフルオロイソロイシンである、請求項１～１６の何れか一項に記載の使用。
【請求項18】
（ｉ）前記ヘプタッド繰り返しまたはそれらの変異形の中の位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％は、極性残基であり；および／または（ｉｉ）前記ヘプタッド繰り返しまたはそれらの変異形の中の位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも５％は、脂肪族残基である、
請求項１～１７の何れか一項に記載の使用。
【請求項19】
各モノマーペプチドは、１８～４０アミノ酸を含む、請求項１～１８の何れか一項に記載の使用。
【請求項20】
各モノマーペプチドは、前記コア配列内に少なくとも４つの陽イオンアミノ酸を含む、請求項１～１９の何れか一項に記載の使用。
【請求項21】
前記オリゴマータンパク質は、ナノモル濃度以下の大きさ範囲のＫDでＬＰＳに結合する、請求項１～２０の何れか一項に記載の使用。
【請求項22】
前記オリゴマータンパク質は、（ｉ）１つ以上の追加の成分との接合体または融合体の形である；
（ｉｉ）固体基質上に固定されている；または
（ｉｉｉ）直接的に検出可能な検出用部分と接合されている、
請求項１～２１の何れか一項に記載の使用。
【請求項23】
（ｉ）前記タンパク質は、検出用部分、オリゴマー化用部分もしくは固定化用部分と接合されている、または融合相手との融合タンパク質の形である；（ｉｉ）前記タンパク質は、ビーズもしくは樹脂上に、またはウェル、容器、カラムもしくはフィルター材料の中もしくは上に、または検出装置の表面の上に固定される；あるいは、
（ｉｉｉ）前記検出用部分は、分光測光法的にまたは分光法的に検出可能な標識である、
請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記オリゴマータンパク質の使用は、試料中のまたは試料からのＬＰＳの検出および／または除去を含む、請求項１～２３の何れか一項に記載の使用。
【請求項25】
ＬＰＳに結合する方法であって、前記ＬＰＳ、または前記ＬＰＳを含有する試料を請求項１～２３の何れか一項において定義されるオリゴマータンパク質と接触させて前記タンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するように前記ＬＰＳに結合することを可能にするステップを含む方法。
【請求項26】
前記方法は、試料中のＬＰＳの存在を検出することをさらに含み、前記方法は、（ａ）前記試料を請求項１～２３の何れか一項において定義されるオリゴマータンパク質と接触させて前記タンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するように前記ＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）タンパク質－リポ多糖複合体の存在を検出するステップと、
を含む、請求項２５の方法。
【請求項27】
前記方法は、試料からＬＰＳを除去することをさらに含み、前記方法は、（ａ）前記試料を請求項１～２３の何れか一項において定義されるオリゴマータンパク質と接触させて前記タンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するように前記ＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）前記試料から前記ペプチド－リポ多糖複合体を分離するステップと、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
前記オリゴマータンパク質は、検出可能な標識を含む接合体の形であり、および／または前記オリゴマータンパク質は、固体基質上に固定化されている、請求項２５～２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記試料は、患者に由来する臨床試料またはエンドトキシン汚染を検査するための製品の試料である、請求項２５～２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記試料は、血液試料または血液試料に由来する試料である、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
（ｉ）請求項１～１７の何れか一項において定義されるオリゴマータンパク質と；（ｉｉ）少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と、
を含むキット。
【請求項32】
前記キットは、請求項１～２４の何れか一項に記載の使用または請求項２５～３０の何れか一項に記載の方法における使用のためである、請求項３１に記載のキット。
【請求項33】
固体基質上に固定化されたオリゴマータンパク質を含み、前記オリゴマータンパク質は、請求項１～２１の何れか一項において定義されている通りである、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書においては、コイルドコイル構造を有するオリゴマータンパク質の、リポ多糖（ＬＰＳ）に結合するための結合剤としての使用が記載される。本明細書においてはまた、ＬＰＳに結合する方法、ＬＰＳを検出する方法およびＬＰＳを除去する方法とこのオリゴマータンパク質を含む製品とが記載される。
【背景技術】
【0002】
リポ多糖、別名エンドトキシン（本明細書において用語「ＬＰＳ」と「エンドトキシン」とは区別なく用いられる）は、グラム陰性菌の外膜の必須成分である。リポ多糖は、リピドＡ部分と；コアオリゴ糖と；Ｏ抗原との３つの構造成分で構成される。リピドＡ成分は、Ｏで繋がれた４本のアシル鎖とＮで繋がれた２本のアシル鎖とを有する２つのホスホグルコサミン分子を含み、これらのアシル鎖が細菌の外膜中に埋め込まれ、従ってＬＰＳを細菌膜中に繋ぎ止めている。コアオリゴ糖（ＣＯＳ）は、様々な糖で構成される繰り返しのない構造体であり、グリコシド結合によってリピドＡに繋がっている。最後に、Ｏ抗原は、４～４０単位の間の４糖モノマー繰り返し構造で構成されるポリマーであり、平均３０の繰り返しが存在する（非特許文献１）。Ｏ抗原は、リピドＡと反対側の端においてＣＯＳの最後から２番目の糖に繋がっているが、ＬＰＳのいくつかの形ではＯ抗原がない。Ｏ抗原が欠けているＬＰＳは、慣習として、野生型『スムース』ＬＰＳとの対比で『ラフ』ＬＰＳと呼ばれる（非特許文献２）。
【0003】
ＬＰＳのリピドＡ構成要素およびそれにもっとも近位の糖は、グラム陰性細菌種全体にわたり高度に保存される一方、コアオリゴ糖の残りとＯ抗原とは保存の度合いが顕著に低く、細菌種の間で、および血清型の間でも変わり得る（非特許文献３）。
【0004】
エンドトキシンは、Ｔｏｌｌ様受容体４を活性化するリピドＡの傾向に起因して、動物、特にヒトへの毒性が極めて強く、従ってｋｇ体重あたり１μｇという低い用量で敗血症および毒性ショックを引き起こし得る極端な免疫反応を誘発する。生物環境におけるグラム陰性菌の遍在に起因して、エンドトキシンは、薬、ワクチンならびに実験装置および試薬の製造におけるありふれた不純物である。エンドトキシン汚染と関連する潜在的な健康影響を考慮すると、ヒトによる消費を目的とする製品中に存在することがあるあらゆるエンドトキシンを可能な限り使用前に除去することが重要である。
【0005】
現在、エンドトキシン除去のための様々な方法および製品が利用可能である。検査室使用の場合、これらの方法および製品は、１種類以上のエンドトキシン結合性分子に繋がれている樹脂を充填したスピンカラムフィルターまたはフローカラムを含む。これらのフィルターまたはカラムに試料がアプライされることが可能であり、エンドトキシン結合性分子は、存在するあらゆるエンドトキシンに結合し、従ってそれらを試料から除去する。これらの製品において用いることができる公知のエンドトキシン結合性分子は、リピドＡ結合性抗生物質ポリミキシンＢおよび静電相互作用によってエンドトキシンと結合するポリリジンポリマーを含む。しかし、現在利用可能なこれらのエンドトキシン結合性分子には課題がある。報告されているポリミキシンＢの結合親和力は、問題の菌株によってはマイクロモル濃度の範囲でしかなく、そのため低濃度のエンドトキシンに結合し試料から除去するには不適当である。その一方で、ポリリジンは、強い正電荷を有し、従ってリピドＡおよびコアオリゴ糖の負電荷を有するリン酸基と非特異的に相互作用する。従って、この作用機序は、すべてのｐＨ値においてまたはすべてのＬＰＳタイプでの使用に不適切である。そのうえ、ポリリジンは、試料中に存在し得る負電荷を有する他の分子とも相互作用し、従って除去することがある。
【0006】
他の方法は、イオン交換クロマトグラフィーを含む。イオン交換クロマトグラフィーは、医薬製品の精製のために医薬品産業において普通に用いられており、典型的には、負電荷を有するＬＰＳと正電荷を有する固定化されたリガンドとの間の静電相互作用に依拠している。しかし、強い電荷を有する試料からエンドトキシンを除去するためにイオン交換クロマトグラフィーを用いると問題を引き起こしかねない。例えば、試料が強い正電荷を有する粒子を含有する場合、これらの粒子は、ＬＰＳを捕捉しようとして固定化されたリガンドと競合するだろう。反対に、試料が強い負電荷を有する（ＬＰＳではない）粒子を含む場合、これらの粒子は、固定化されたリガンドと結合しようとしてＬＰＳと競合するだろう。両方の場合に、これらの望ましくない反応は、ＬＰＳ除去の効率を低下させる。イオン交換クロマトグラフィー法の土台である静電相互作用は、高いイオン強度を有する試料中であっても撹乱される可能性があり、従ってこれらの方法は、すべてのシナリオにおいて適切なものではない。
【0007】
試料からエンドトキシンを除去することに加えて、エンドトキシンを検出することができ、それによって治療用の製品、装置、試薬等を「エンドトキシンフリー」、従って治療用途の使用に安全であると保証することができることも望ましい。これに関して、エンドトキシンを検出するもっとも普通の方法は、現在、カブトガニ アメボサイト溶解液（ＬＡＬ：Ｌｕｍｕｌｕｓ ａｍｅｂｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）アッセイである。ＬＡＬアッセイは、ＦＤＡおよびＥＦＳＡによって医療用および治療用の製品中のエンドトキシンの検出用に承認され、検出範囲は１ピコモル濃度（０．１ＥＵ／ｍＬ）に達している。このアッセイは、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）属のカブトガニ（ｈｏｒｓｅｓｈｏｅ ｃｒａｂｓ）の血液中に見いだされるアメボサイト（ａｍｅｂｏｃｙｔｅ）の溶解液（ｌｙｓａｔｅ）を用い、この溶解液は、タンパク質と酵素との複雑な混合物を含有する。詳しくは、ＬＡＬアッセイは、ＬＰＳ結合すると始動される酵素「（カブトガニ凝固）Ｃ因子」（普通は単にＣ因子として知られる）の活性に基づく。Ｃ因子は、最終的にはＬＰＳの存在を示す、下流への酵素反応の複雑なカスケードを活性化するトリプシンタイプのセリンプロテアーゼである。しかし、この反応カスケードは、ある範囲の細菌、菌類および植物中に普通に見いだされるβ－グルカンによっても活性化され得る。よって、β－グルカンは、ＬＡＬアッセイにおいて偽陽性の結果を引き起こし得る。そのうえ、アメボサイト溶解液は、製造するのが非常に高価であり、現行の製造方法は、持続可能でない。
【0008】
カブトガニの乱獲から、エンドトキシン検出のための代替方法の開発が求められることになった。色素生成基質を開裂させるために、組み換え法によって発現されたＣ因子を用いる類似のアッセイが開発され、従ってＬＰＳがより直接的に検出されることが可能になった。しかしながら、組成の複雑さに起因して、依然として価格が高い。
【0009】
さらに、Ｃ因子の活性は、例えば温度またはｐＨの変動、有機溶媒、尿素または強い界面活性剤などの変性化合物および通常のプロテアーゼ阻害剤に起因して容易に撹乱され得る。異なるＣ因子調製物の間にはバッチ間変動もあり得る。このことは、この酵素を使いにくくし、Ｃ因子に依拠するＬＡＬアッセイを用いて得られる結果が多くの場合に特に一貫性または再現性が高くないことを意味する。
【0010】
すべての検出方法に影響を及ぼす、ＬＰＳの検出におけるさらなる課題は、ＬＰＳが凝集する傾向である。エンドトキシン分子には水溶液中で凝集体を形成する傾向があることは、当分野において公知である。この凝集は、溶液中の陽イオン（特にＣａ2+およびＭｇ2+などの２価陽イオン）の存在によって、またＬＰＳの周りにミセルを形成することができる界面活性剤の存在によって増大する。この凝集は、溶液中の測定可能なＬＰＳの量を減らす影響を及ぼし、従って低濃度のＬＰＳの検出を妨げる。この影響は、「ＬＰＳマスキング」として知られ、広い範囲の種々の薬剤が原因となり得る。例えば、血液試料中にはＬＰＳをマスクすることができるいくつかの化合物、例えばＬＰＳ結合タンパク質、抗ＬＰＳ抗体および２価陽イオンがある。さらに、異なる細菌源からのエンドトキシン分子は、異なる分子量を有することがあり、異なる凝集挙動を示すことがあり、そのことが異なる供給源由来の同じ濃度のＬＰＳを測定するときに変動し得る結果をもたらす結果を生む。よって、ＬＰＳを除去するかまたは検出するために用いることができる、改善されたＬＰＳ結合剤を提供すると有用な場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、Ａ．Ａ．およびマグローティ（ＭｃＧｒｏａｒｔｙ）、Ｅ．Ｊ．、「サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・ミネソタおよび大腸菌のリポ多糖中の高分子量成分（Ｈｉｇｈ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ－ｗｅｉｇｈｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｏｆ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ， ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１６２巻７３８～７４５頁（１９８５年）。
【非特許文献2】ヒッチコック（Ｈｉｔｃｈｃｏｃｋ）、Ｐ．Ｊ．ら、「リポ多糖命名法―過去、現在および未来（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ― ｐａｓｔ， ｐｒｅｓｅｎｔ， ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ）」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、ｄｏｉ：１０．１１２８／ｊｂ．１６６．３．６９９－７０５．１９８６。
【非特許文献3】ベルターニ（Ｂｅｒｔａｎｉ）、Ｂ．およびルイス（Ｒｕｉｚ）、Ｎ．、「リポ多糖の機能および生物発生説（Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）」、エコサル・プラス（ＥｃｏＳａｌ Ｐｌｕｓ）、８巻１号、ｄｏｉ：１０．１１２８／ｅｃｏｓａｌｐｌｕｓ．ｅｓｐ－０００１－２０１８。
【発明の概要】
【0012】
本発明者らは、α－ヘリックスコイルドコイル構造を有するオリゴマータンパク質の形の新規なＬＰＳ結合剤を開発した。
【0013】
本明細書において開示される新しいＬＰＳ結合剤は、酵母転写因子ＧＣＮ４中に見いだされ得るα－ヘリックスコイルドコイル構造に基づいており、このタンパク質の短いＣ末端区間（ｓｔｒｅｔｃｈ）がロイシンジッパーと呼ばれる、高度に安定な二量体コイルドコイル構造を形成する。
【0014】
よって、第１の側面では、本明細書において、リポ多糖（ＬＰＳ）に結合するための結合剤としてのオリゴマータンパク質の使用が提供され、該オリゴマータンパク質は、コイルドコイル構造を有し、少なくとも２つのモノマーペプチドを含み、各モノマーペプチドは同じであっても異なっていてもよく、α－ヘリックスを形成することができ、配列番号１のヘプタッド（７アミノ酸）繰り返し配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する少なくとも１つのコア配列を含む。
【0015】
両親媒性α－ヘリックス（もしくはα－ヘリックス鎖）を含むか、または両親媒性α－ヘリックス（もしくはα－ヘリックス鎖）で構成されたコイルドコイルタンパク質の特性に違わず、コイルドコイルオリゴマータンパク質は、疎水性コアを有する。疎水性コアは、疎水性コア構造中で互いに向かい合っている疎水性残基を含む。
【0016】
従って、詳しくは、ペプチドモノマーのコア配列は、少なくとも３つのヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇまたはその変異形を含むことがあり、各変異形は、ヘプタッドモチーフへの１つ以下の挿入または欠失を含む。さらに、一実施形態においてヘプタッドモチーフまたはその変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％は、疎水性残基である。別の実施形態において、ヘプタッドモチーフまたはその変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも７５％は、疎水性残基である。
【0017】
よって、この側面の一実施形態において、本明細書において、リポ多糖（ＬＰＳ）に結合するための結合剤としてのオリゴマータンパク質の使用が提供され、該オリゴマータンパク質は、コイルドコイル構造を有し、少なくとも２つのモノマーペプチドを含み、各モノマーペプチドは同じであっても異なっていてもよく、α－ヘリックスを形成することができ、配列番号１のヘプタッド繰り返し配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する少なくとも１つのコア配列を含み、該コア配列は、少なくとも３つのヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇまたはその変異形を含み、各変異形は、ヘプタッドモチーフへの１つ以下の挿入または欠失を含み、該ヘプタッドモチーフまたはその変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％は、疎水性残基である。
【0018】
コイルドコイルタンパク質の疎水性コアのアミノ酸残基の組成は、完全に疎水性残基であるかまたは疎水性残基だけである必要はなく、親水性残基、例えば極性残基を含む他の残基が存在してよい。従って、特定の実施形態において、ヘプタッドモチーフまたはその変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５２．５、５５、６０、６２．５、７０または７５％は、疎水性残基である。
【0019】
第２の側面では、本明細書において、ＬＰＳに結合する方法が提供され、該方法は、ＬＰＳまたはＬＰＳを含有する試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させて該タンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにＬＰＳに結合することを可能にするステップを含む。
【0020】
一実施形態において、本方法は、インビトロの方法である。
【0021】
第３の側面では、本明細書において、本明細書において定義される、ＬＰＳに結合するための結合剤として使用されるか、または本明細書において定義されるＬＰＳに結合する方法において使用されるキットであって、
（ｉ）本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と；
（ｉｉ）少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と、
を含むキットが提供される。
（ｉ）本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と；
（ｉｉ）少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と、
を含むキットが提供される。
【0022】
本明細書における使用および方法は、試料中のＬＰＳまたは試料からＬＰＳを検出および／または除去する際に使用されることがある。
【0023】
高い親和力で広い範囲のエンドトキシンに結合するその能力に起因して、本オリゴマータンパク質は、エンドトキシン結合、検出および除去を含む様々な用途において使用されるのに適している。これに関して、本オリゴマータンパク質は、固体基質上に固定化されることがある。例えば、このオリゴマータンパク質は、カラムまたはフィルター、例えばスピンカラムフィルターまたはフローカラムにおいて使用されるために樹脂上に固定され、上記で概略が示されたエンドトキシン除去方法におけるように前記フィルターまたはカラムにアプライされた試料からのエンドトキシンに結合し、除去することがある。本オリゴマータンパク質は、所定の試料中のエンドトキシンの存在を検出することと、また試料、試薬、製品等がエンドトキシンフリーであってエンドトキシンが検出されないことを保証することとの両方のために、エンドトキシン検出システム中でも用いられることがある。これに関して、オリゴマータンパク質は、エンドトキシンの検出を容易にするために第２の成分との接合体または融合体、例えば検出用部分との接合体または適当な融合相手との融合タンパク質の形で提供されることがある。
【0024】
第４の側面では、本明細書において、固体基質上に固定化された、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質を含む製品が提供される。
【0025】
上記のように、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、リピドＡ成分を介してＬＰＳと相互作用すると理解される。従って、第５の側面では、本明細書において、ＬＰＳのリピドＡに結合するための結合剤としての本明細書において定義されるオリゴマータンパク質の使用が提供される。
【0026】
同様に、第６の側面では、本明細書において、ＬＰＳのリピドＡに結合する方法が提供され、該方法は、リピドＡまたはリピドＡを含有する試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させて、該タンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにリピドＡと結合することを可能にするステップを含む。
【0027】
第７の側面では、本明細書において、本明細書において定義されるリピドＡに結合するための結合剤として使用される、または本明細書において定義されるリピドＡに結合する方法において使用されるキットが提供され、該キットは、
（ｉ）本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と；
（ｉｉ）少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と、
を含む。
（ｉ）本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と；
（ｉｉ）少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と、
を含む。
【0028】
本明細書に記載されるオリゴマータンパク質は、ＬＰＳに結合するための代替結合剤を提供する。一実施形態において、本明細書における開示は、ＬＰＳのための改善された結合剤を提供する。
【0029】
本明細書におけるＬＰＳ結合剤は、複数の利点を有する。さらに、本結合剤は、公知のＬＰＳ結合方法および検出方法と関連した、上記で概略が示された複数の課題に対処していることが分かる。
【0030】
ＬＰＳ検出の観点で、本明細書において記載されるオリゴマータンパク質は、カブトガニから採取される高価な溶解液を用いる必要をなくし、Ｃ因子の使用に依拠するＬＰＳ検出方法、例えばＬＡＬアッセイおよびその組み換え体変法の使用に関連する一貫性および再現性の課題を回避する。
【0031】
さらに、本明細書において記載されるオリゴマータンパク質は、ＬＰＳ凝集体を溶解させることができる。よって、本オリゴマータンパク質は、ＬＰＳマスキングを軽減し、そのようなＬＰＳ凝集体を含む試料中のＬＰＳの測定可能な濃度を効果的に増大させることができる。このことによって、試料中の低濃度のＬＰＳが検出されることが可能になる。
【0032】
本明細書において記載されるオリゴマータンパク質は、比較的短いペプチド配列を含み、従っていくつかの実施形態において、本オリゴマータンパク質は、合成的に製造され、生物発現システムをまったく必要としないことがある。
【0033】
次に、以下の図面を参照し、以下の記載および非限定的な実施例において本発明をより詳しく記載する。
【図面の簡単な説明】
【0034】
【図2】図２は、Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来ＬＰＳに基づく、ＬＰＳの一般的構造の概略版を示す。リピドＡ部分（挿入図）は、２つのホスホグルコサミンからなり、Ｏで繋がれた４つのアシル鎖とＮで繋がれた２つのアシル鎖が外膜に埋め込まれている。コアオリゴ糖（ＣＯＳ）は、グリコシド結合によってリピドＡに繋がれ、最後から２番目のＣＯＳ糖にＯ抗原が繋がれている。Ｏ抗原は、４～４０繰り返し単位の間で変わる数の４糖繰り返しからなり、平均は３０繰り返しである（ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）およびマグローティ（ＭｃＧｒｏａｒｔｙ）、１９８５年）。リピドＡおよび近位の２つの３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクタ－２－ウロソン酸（ＫＤＯ）糖は、グラム陰性種の中では高度に保存され、一方、ＣＯＳの残りおよびＯ抗原は、細菌種の間および血清型の間でそれぞれ保存されている。
【図3】図３Ａ～図３Ｄは、固定化されたＫ９－ＧＣＮ４－ＰＩＩへの種々のＬＰＳ成分の注入後のＳＰＲ結合曲線を示す。垂直な線は、注入の開始および終了を示す。図３Ａは、ＬＰＳ全体（ｗｈｏｌｅ ＬＰＳ）の注入を示す。図３Ｂは、Ｏ抗原を欠くラフＬＰＳの注入を示す。図３Ｃは、２つの近位ＫＤＯ以外のすべての糖を欠くディープラフＬＰＳの注入を示す。図３Ｄは、リピドＡを欠くＬＰＳ多糖の注入を示す。
【図7】図７は、産生されたコンストラクトの図式的な概観を示す。ＳａｄＡに由来するコンストラクトは、アルバレス（Ａｌｖａｒｅｚ）ら（アルバレスら、２００８年）およびハートマン（Ｈａｒｔｍａｎ）ら（ハートマンら、２０１２年）に初めて記載された。アンドレイＮルパス（ａｎｄｒｅｉｎｌｖｐａｓ）コンストラクトは、ダイス（Ｄｅｉｓｓ）ら（ダイスら、２０１４年）によって初めて記載された。ＧＣＮ４コンストラクトは、ジェンスクリプト（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）（ジェンスクリプトパイオテック社（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ））によって合成された。
【図8】図８Ａ～図８Ｄは、種々のＳ．ティフィムリウムＬＰＳ成分とともに固定化されたＫ９についてのＳＰＲ Ｆｃ１、Ｆｃ２およびＦｃ１－Ｆ２曲線を示す。図８Ａは、スムースＬＰＳの場合である。図８Ｂは、ラフＬＰＳの場合である。図８Ｃは、ディープラフＬＰＳの場合である。図８Ｄは、ＬＰＳに由来する多糖の場合である。
【図9】図９Ａ～図９Ｄは、種々のＳ．ティフィムリウムＬＰＳ成分とともに固定化されたＫ１４についてのＳＰＲ Ｆｃ１、Ｆｃ２およびＦｃ１－Ｆ２曲線を示す。図９Ａは、スムースＬＰＳの場合である。図９Ｂは、ラフＬＰＳの場合である。図９Ｃは、ディープラフＬＰＳの場合である。図９Ｄは、ＬＰＳに由来する多糖の場合である。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｄは、種々のＳ．ティフィムリウムＬＰＳ成分を有する固定化されたＫ３（Ｆｃ１チャンネル）およびＫ３－Ｈｉｓ（Ｆｃ２チャンネル）についてのＳＰＲ Ｆｃ１、Ｆｃ２およびＦｃ１－Ｆ２比較曲線を示す。図１０Ａは、スムースＬＰＳの場合である。図１０Ｂは、ラフＬＰＳの場合である。図１０Ｃは、ディープラフＬＰＳの場合である。図１０Ｄは、ＬＰＳに由来する多糖の場合である。
【図11】図１１は、Ｋ９およびＫ１４によるＥＬＩＴＡ実験の絶対値（上）ならびに構成および陰性対照（下）を示す。ＳａｄＡ＝サルモネラ成分Ｋ９またはＫ１４。ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン。ＴＳＰ＝ファージテールスパイクタンパク質。ＳＴ－ＨＲＰ＝セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ストレプトアクチン。
【図13】図１３は、０．５ＥＵ／ｍＬのＬＰＳでスパイクされた１０～０．１μＭの範囲の濃度のＧＣＮ４－ｐＩＩのマスキング効果を示すＬＡＬアッセイの結果のグラフを示す。１μＭ ＧＣＮ４－ｐＩＩにおいて最適なマスキングが観測され、マスキング効果は全信号の８９％であった。
【発明を実施するための形態】
【0035】
説明
本明細書において開示されるオリゴマータンパク質は、α－へリックスコイルドコイルオリゴマー構造を有する。コイルドコイルは、巻きとられてスーパーコイル型バンドルとなった２つ以上の両親媒性α－ヘリックスからなる（ルーパス（Ｌｕｐａｓ）およびグルーバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、２００５年）遍在性のタンパク質要素である。両親媒性α－ヘリックスコイルドコイルの主要な特性は、繰り返しヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇである。ここで、位置ａおよびｄは、主に疎水性親水性残基によって占められ、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇは、主に親水性残基によって占められている。α－ヘリックスは、１巻きあたり３．６残基を含み、そのことは、繰り返しヘプタッドモチーフが位置ａおよびｄの残基をヘリックス構造の同じ面に配置することを意味する。このことは、疎水性残基は、疎水性コアと呼ばれるものの中で互いに内向きに向かい合う一方で、親水性残基は、外側を向いている、高度に安定なスーパーコイルの形成を容易にする。なお、コイルドコイルタンパク質の疎水性コアは、典型的には主に疎水性残基を含むが、コア構造中の残基のすべてが疎水性である必要はなく、コア構造中に位置する他の残基、例えば極性残基を含むことがあるが、それでもコイルドコイル型構造を保持することができるコイルドコイルタンパク質が知られている。
本明細書において開示されるオリゴマータンパク質は、α－へリックスコイルドコイルオリゴマー構造を有する。コイルドコイルは、巻きとられてスーパーコイル型バンドルとなった２つ以上の両親媒性α－ヘリックスからなる（ルーパス（Ｌｕｐａｓ）およびグルーバー（Ｇｒｕｂｅｒ）、２００５年）遍在性のタンパク質要素である。両親媒性α－ヘリックスコイルドコイルの主要な特性は、繰り返しヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇである。ここで、位置ａおよびｄは、主に疎水性親水性残基によって占められ、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇは、主に親水性残基によって占められている。α－ヘリックスは、１巻きあたり３．６残基を含み、そのことは、繰り返しヘプタッドモチーフが位置ａおよびｄの残基をヘリックス構造の同じ面に配置することを意味する。このことは、疎水性残基は、疎水性コアと呼ばれるものの中で互いに内向きに向かい合う一方で、親水性残基は、外側を向いている、高度に安定なスーパーコイルの形成を容易にする。なお、コイルドコイルタンパク質の疎水性コアは、典型的には主に疎水性残基を含むが、コア構造中の残基のすべてが疎水性である必要はなく、コア構造中に位置する他の残基、例えば極性残基を含むことがあるが、それでもコイルドコイル型構造を保持することができるコイルドコイルタンパク質が知られている。
【0036】
本明細書におけるオリゴマータンパク質は、ＧＣＮ４－ｐＩＬとして知られているタンパク質ＧＣＮ４のロイシンジッパー配列の変異形に基づいている。ここで、ＧＣＮ４－ｐ'ａｄ’は、ヘプタッドモチーフ中の位置ａおよびｄに存在するアミノ酸を指す。位置ａおよびｄに存在する疎水性コア残基を、詳しくはこれらの位置に存在するロイシン残基とイソロイシン残基との比を変えることによって変異させると、タンパク質構造の好ましいオリゴマー状態を二量体から三量体（ＧＣＮ４－ｐＩＩ）および四量体（ＧＣＮ４－ｐＬＩ）に変えることが可能であることが実証された（ハーベリー（Ｈａｒｂｕｒｙ）ら、１９９３年；デラノ（Ｄｅｌａｎｏ）およびブリュンガー（Ｂｒｕｅｎｇｅｒ）、１９９４年）。
【0037】
これらのコイルドコイル要素の安定性とオリゴマーを形成するそれらの傾向とは、オリゴマー化を誘導し融合タンパク質中のオリゴマー構造を安定化すると同時にそのようなタンパク質の溶解性を増大させるキメラ拡張体（すなわち融合相手）としてのＧＣＮ４コイルドコイル構造の使用をもたらした。これに関して、本発明者らは、当初、ＬＰＳと三量体オートトランスポーターアドヘシンＳａｄＡに属する２つのドメインとの間で推定される相互作用を検討することを意図していた。このタンパク質を調べるために、２種類のＳａｄＡコンストラクト、Ｋ９およびＫ１４が調製され（下記実施例１参照）、両方とも隣接ＧＣＮ４－ｐＩＩセグメントによって安定化された。しかし、驚くべきことに、ＳａｄＡコンストラクトを安定化するために用いられていたＧＣＮ４－ｐＩＩアダプターは、ＬＰＳに対してナノモル濃度の範囲のＫDを有する極めて高い親和力を示すことが見いだされた。
【0038】
セレンディピティー的なこの発見の後に、本発明者らは、ＬＰＳに結合するための結合剤として用いることができる、ＧＣＮ４－ｐＩＩタンパク質に基づくコイルドコイル構造を有するオリゴマータンパク質を開発した。さらに実験を行い、このタンパク質とＬＰＳとの間の相互作用が、ＬＰＳのリピドＡ成分へのこのタンパク質の結合によって生じることを明らかにした。上記のように、リピドＡ成分の構造は、グラム陰性の細菌種の間で高度に保存され、従って本オリゴマータンパク質は、極めて高い親和力で広い範囲の細菌エンドトキシンに結合することができると理解される。さらに、本オリゴマータンパク質は、典型的な発現システムにおいて組み換え法により過剰発現させることができ、いかなる天然エンドトキシンとも相互作用することなく封入体から精製することができ、そのことが大規模で、持続可能でコスト効率のよい製造を可能にする。
【0039】
本明細書において記載されるオリゴマータンパク質は、少なくとも２つのモノマーペプチドを含む。これらのモノマーペプチドは、総体としてオリゴマータンパク質を構成する個々のサブユニットを代表する。各モノマーは、α－ヘリックスを形成することができる。これらのモノマーは、一緒になってオリゴマータンパク質を形成するように相互作用する別々のペプチド鎖または鎖という意味で、別々のペプチドとして提供されることがある。従って、そのような実施形態において、ペプチドモノマーは、タンパク質の個々のサブユニット、すなわち別々のモノマーペプチド単位とみなされることがある。従って、いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質中の各α－ヘリックスは、別々のモノマーに対応するとみなされることがある。
【0040】
他の実施形態において、モノマーペプチドは、繋ぎ合わされることがある。従って、モノマーペプチドは、リンカー配列によって繋がれるかまたは結合されることがある。そのような実施形態において、オリゴマータンパク質は、その一次構造または配列という観点で一本鎖形式を有するが、もちろんモノマーペプチドは、コイルドコイル構造を形成するように相互作用する「鎖」を有すると見ることができるオリゴマーコイルドコイル構造を形成するように相互作用する。そのような実施形態において、モノマーペプチドは、一本鎖タンパク質配列のドメインとみなされることがある。より詳しくは、オリゴマータンパク質は、モノマーペプチドドメインで構成された３Ｄ構造を有すると見られることがある。
【0041】
各モノマーペプチドは、配列番号１のヘプタッド繰り返し配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する少なくとも１つのコア配列を含む。配列番号１は、モデルペプチドＧＣＮ４－ｐＩＩの配列の変異形を表し、該変異形は、ＧＣＮ４タンパク質のＣ末端にある二量体化モチーフ由来の配列に基づき、かつモチーフ中の位置ａおよびｄには以下に示されるようにイソロイシン残基が存在する繰り返しヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇを含む。いくつかの実施形態において、コア配列は、配列番号１と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することがある。いくつかの実施形態において、コア配列は、配列番号１の配列を含むかまたは配列番号１の配列からなることがある。
【0042】
配列同一性は、当分野において公知の何れかの適当な手段、例えば、可変のｐａｍｆａｃｔｏｒでギャップクリエーションペナルティーを１２．０に設定し、ギャップエクステンションペナルティーを４．０に設定し、２アミノ酸のｗｉｎｄｏｗでＦＡＳＴＡ ｐｅｐ－ｃｍｐを使用し、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴタンパク質配列データバンクを用いることによって決定されることがある。アミノ酸配列同一性を決定するための他のプログラムは、ウィスコンシン大学（ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）からのジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のベストフィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）プログラム、バージョン１０ソフトウエアパッケージを含む。このプログラムは、スミス（Ｓｍｉｔｈ）およびウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）の局所相同性アルゴリズムを使用し、既定値は、ギャップクリエーションペナルティー－８、ギャップエクステンションペナルティー＝２、平均マッチ＝２．９１２、平均ミスマッチ＝－２．００３である。一実施形態において、前記比較は、コア配列の全長にわたって行われる。
【0043】
【表1】
【0044】
配列番号１は、いくつかのａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇヘプタッドモチーフの繰り返しを含むことが分かる。上記で示されるように、ａ残基およびｄ残基は、Ｉである。しかし、下記でもっと詳しく考察されるように、ａ残基およびｄ残基は、変わることがあり、一実施形態において、ａ残基およびｄ残基は、ＩもしくはＬ、またはそれらの誘導体、あるいは他の疎水性残基のことがある。上記のように、ヘプタッドモチーフ中のａ残基とｄ残基とのすべてが疎水性である必要はない。オリゴマーコイルドコイル構造が形成するのに十分な疎水性残基があれば十分である。このことは、配列の状況とモノマーペプチドの配列中に存在する他の残基とによって決まる。
【0045】
実施形態において、各モノマーペプチドのコア配列は、少なくとも３つのヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇまたはそれらの変異形を含む。ヘプタッドモチーフは、便宜的にａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇと書かれるが、実際にはコア配列中のヘプタッド繰り返し配列が位置ａで始まるという要件はない。このモチーフは、位置ａが位置ｇの後になって繰り返し、従って、ヘプタッドモチーフは、７つの位置ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇすべてを連続する順序で含むことを前提として、何れの位置から始まってもよい。よって、例えばモチーフｄ－ｅ－ｆ－ｇ－ａ－ｂ－ｃは、正しいヘプタッドモチーフである。
【0046】
いくつかの実施形態において、コア配列は、ヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇの１種類以上の変異形を含むことがあり、各変異形は、ヘプタッドモチーフへの１つ以下の挿入または欠失を含む。挿入または欠失を含むヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇのこれらの変異形は、まとめて「変異形モチーフ」と呼ばれる。この状況において、用語「挿入」および「欠失」は、ヘプタッドモチーフへの単一の残基の追加およびヘプタッドモチーフからの単一の残基の欠失をそれぞれ指している。
【0047】
挿入または欠失は、ヘプタッドモチーフのどちらの端も含むヘプタッドモチーフ内のあらゆる位置において行われることがある。例えば、モチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇへの残基Ｘの挿入を考えると、得られるモチーフは、Ｘ－ａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇ、ａ－Ｘ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇ、ａ－ｂ－Ｘ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇ等のことがある。重要な点として、モチーフ内の残りの位置の表示の仕方は変らないままであることが分かる。このことは、挿入と欠失との両方の場合にあてはまる。従って、例えば位置ｂにある残基が欠失される場合、残りのモチーフは、配列ａ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇを含む。
【0048】
連続するいくつかの残基の挿入または欠失は、１つの挿入または欠失であるとはみなされない。よって、各コア配列中に存在する少なくとも３つのヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフは、存在する変異形モチーフの総数より多いヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇへの挿入および欠失を含んではならない。コア配列中で互いに隣接している挿入または欠失は、連続する変異形モチーフの隣接している端にあり、かつ連続する変異形モチーフがそれぞれただ１つの挿入または欠失を含む場合にだけ許容される。そのような場合、隣接している挿入／欠失は、２つの別々の変異形モチーフ中の２つの別々の挿入／欠失の産物であると見ることができる。
【0049】
いくつかの実施形態において、コア配列は、少なくとも４つのヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフを含む。いくつかの実施形態において、コア配列は、３～５のヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフを含む。例えば、コア配列は、３、４または５のヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフを含むことがある。いくつかの実施形態において、コア配列は、少なくとも３つのヘプタッドモチーフを含み、変異形モチーフを含まないことがある。他の実施形態において、コア配列は、少なくとも３つの変異形モチーフを含み、ヘプタッドモチーフを含まないことがある。さらに、コア配列は、少なくとも３つのヘプタッドモチーフと変異形モチーフとの何れかの組み合わせを含むことがあり、これらのヘプタッドモチーフおよび変異形モチーフはあらゆる順に配置されることがある。
【0050】
上記で考察されたように、コイルドコイルタンパク質構造は、各α－ヘリックス中に存在する繰り返しヘプタッドモチーフ内の疎水性残基の組織的な配置に依存する。各αヘリックス内の疎水性残基は、主にそのαヘリックスの単一の面において提示されるように配置される。表現を換えると、各αヘリックス内の残基は、そのαヘリックスの一つの面に提示される残基が主に疎水性であるように配置される。このことは、オリゴマータンパク質中の各αヘリックスの疎水性の面がタンパク質構造の中心において安定な疎水性コアを形成することを可能にする。ヘプタッドモチーフのあらゆる繰り返し内の位置ａと位置ｂとの両方に疎水性残基が存在することは必須ではないが、典型的には、これらの位置の大部分は疎水性残基によって占められている。本明細書において定義されるコイルドコイルオリゴマータンパク質中のこの構造を容易にするために、一実施形態において、コア配列内でヘプタッドモチーフまたはその変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％は、疎水性残基である。上記の構成に示されるように、配列番号１におけるヘプタッドモチーフの位置ａおよびｄは、配列の位置４、８、１１、１５、１８、２２、２５および２９によって表される。従って、代りの定義として、配列番号１の位置４、８、１１、１５、１８、２２、２５および２９に対応する位置におけるアミノ酸残基の少なくとも５０％は疎水性残基であることが分かる。従って、一実施形態において、配列番号１のヘプタッド繰り返し配列中の８つの「ａ」または「ｄ」位置のうち少なくとも４つは、疎水性残基である。
【0051】
より詳しくは、配列番号１のヘプタッド繰り返し配列中のヘプタッドモチーフの位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５２．５％、５５％、６０％、６２．５％または７０％は、疎水性である。しかし、代表的な一実施形態において、配列番号１のヘプタッド繰り返し配列中のヘプタッドモチーフの位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも７５％は、疎水性である。従って、一実施形態において、配列番号１のヘプタッド繰り返し配列中の８つの「ａ」または「ｄ」位置のうち少なくとも６つは、疎水性残基である。
【0052】
代表的な例として、配列番号１の配列においてａ残基またはｄ残基、すなわち配列番号１の位置４、８、１１、１５、１８、２２、２５および２９に対応する残基のうち、少なくとも４つ、５つ、６つまたは７つは、疎水性残基のことがある。
【0053】
コイルドコイルタンパク質構造および配列の知識に基づけば、配列番号１の改変されたペプチドまたは変異形ペプチドに基づくコイルドコイル構造を得るために配列改変を行うことは、ヘプタッドモチーフ中の他の位置に対して位置ａおよびｄにおける残基の置換を含めて当業者の日常的な知識の範囲内であろう。
【0054】
本明細書において用いられる用語「疎水性残基」は、当分野において疎水性であると認識または特定されるあらゆるアミノ酸の残基を含む。そのようなアミノ酸は、以下のタンパク質構成アミノ酸；ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリンおよびグリシンを含む。しかし、実施形態において、疎水性残基は、アミノ酸ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン、フェニルアラニン、あるいはそれらの化学誘導体から選ばれる。別の実施形態において、疎水性残基は、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニンおよびメチオニンならびにこれらのアミノ酸の化学誘導体から選ばれる。コア配列中に存在する疎水性残基は、非従来型疎水性アミノ酸、すなわち標準的な遺伝コードによってコードされない側鎖を有する疎水性アミノ酸も含むことがある。詳しくは、これらのアミノ酸のフルオロ誘導体、例えばフルオロイソロイシンおよびフルオロロイシンが含まれる。他の公知の誘導体は、セレノ誘導体、例えばセレノメチオニンを含む。そのような非従来型疎水性アミノ酸のさらなる例が、上記で定義された従来型疎水性アミノ酸のＤ－アミノ酸変異形（Ｄ－アミノ酸が含まれる場合、すべてのアミノ酸がＤ－アミノ酸のことがある）、Ｌ－Ｎ－メチルアミノ酸変異形、Ｄ－αメチルアミノ酸変異形およびＤ－Ｎ－メチルアミノ酸変異形を含めて下表１に列挙されている。
【0055】
【表2-1】
【0056】
【表2-2】
【0057】
いくつかの実施形態において、ヘプタッドモチーフまたはそれらの変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％は、疎水性残基である。表現を換えると、配列番号１の位置４、８、１１、１５、１８、２２、２５および２９に対応する位置におけるアミノ酸残基の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％は、疎水性残基である。
【0058】
いくつかの実施形態において、ヘプタッドモチーフまたはそれらの変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の１００％は、疎水性残基である。表現を換えると、配列番号１の位置４、８、１１、１５、１８、２２、２５および２９に対応する位置におけるアミノ酸残基の１００％は、疎水性残基である。
【0059】
コア配列内の疎水性残基は、すべてが同じであるか、または互いに異なることがある。いくつかの実施形態において、ヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ中の各疎水性残基は、独立に、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニンならびにそれらのフルオロ誘導体を含むそれらの化学誘導体からなる群から選ばれる。一実施形態において、ヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ中の各疎水性残基は、独立に、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニンならびにそれらのフルオロ誘導体またはセレノ誘導体を含むそれらの化学誘導体からなる群から選ばれる。一実施形態において、ヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ中の各疎水性残基は、独立に、ロイシン、イソロイシンならびにそれらの化学誘導体、例えばフルオロロイシンおよびフルオロイソロイシンからなる群から選ばれる。
【0060】
いくつかの実施形態において、ヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ中の疎水性残基の少なくとも５０％は、イソロイシンまたはフルオロイソロイシンである。いくつかの実施形態において、ヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ中の疎水性残基の少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％は、イソロイシンまたはフルオロイソロイシンである。いくつかの実施形態において、ヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ中の疎水性残基の１００％は、イソロイシンまたはフルオロイソロイシンである。
【0061】
コイルドコイル構造の疎水性コアの一部を形成しない残基、すなわち位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇにおける残基は、一般にタンパク質の表面により近く、従って環境に露出されている。これらの残基が何であるかは重要ではなく、これらの残基は、変ってよい。いくつかの実施形態において、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％は、極性残基である。いくつかの実施形態において、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％は、極性残基である。いくつかの実施形態において、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の１００％は、極性残基である。
【0062】
本明細書において用いられる用語「極性残基」は、当分野において極性と認識または特定されているあらゆるアミノ酸の残基を含む。この用語は、電荷を有するアミノ酸を含む。極性アミノ酸残基は、アミノ酸セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リジン、チロシン、システイン、トリプトファン、メチオニンならびにこれらのアミノ酸の化学誘導体の残基から選ばれることがある。一実施形態において、極性アミノ酸残基は、アミノ酸セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リジン、チロシンの残基から選ばれることがある。さらに、コア配列中に存在する極性残基は、非従来型極性アミノ酸、すなわち標準的な遺伝コードによってコードされない側鎖を有する極性アミノ酸も含むことがある。そのような非従来型極性アミノ酸の例が、上記で定義された従来型極性アミノ酸のＤアミノ酸変化形、アミドイソスター変化形（Ｎ－メチルアミド、レトロ－インバースアミド、チオアミド、チオエステル、ホスホネート、ケトメチレン、ヒドロキシメチレン、フルオロビニル、（Ｅ）－ビニル、メチレンアミノ、メチレンチオまたはアルカンなど）、Ｌ－Ｎ－メチルアミノ酸変化形、Ｄ－αメチルアミノ酸変化形およびＤ－Ｎ－メチルアミノ酸変化形を含めて、下表２に列挙されている。上記のように、Ｄ－アミノ酸が用いられる場合、モノマーペプチド中のすべてのアミノ酸がＤ－アミノ酸のことがある。
【0063】
【表3-1】
【0064】
【表3-2】
【0065】
ヘプタッドモチーフ内の疎水性アミノ酸と極性アミノ酸との首尾一貫した配置がコイルドコイルタンパク質の構造の原因であるが、残基の位置に関する一般的な規則は、不変というわけではない。すなわち、コア配列のヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ内の位置ａまたはｄに対応する残基は、すべてが疎水性というわけではないのと同様に、コア配列のヘプタッドモチーフまたは変異形モチーフ内の位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆまたはｇに対応する残基は、すべてが極性でなければならないわけではない。いくつかの実施形態において、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも５％は、脂肪族残基のことがある。いくつかの実施形態において、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも１０％または少なくとも１５％は、脂肪族残基のことがある。
【0066】
本明細書において用いられる用語「脂肪族残基」は、アミノ酸グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、バリンおよびメチオニンならびにこれらのアミノ酸の化学誘導体、特にフルオロロイシンおよびフルオロイソロイシンを含むそれらのフルオロ誘導体を含む。さらに、コア配列中に存在する脂肪族残基は、非従来型脂肪族アミノ酸、すなわち標準的な遺伝コードによってコードされない側鎖を有する脂肪族アミノ酸、例えばＤアミノ酸変化形およびその他の非従来型脂肪族アミノ酸も含むことがある。
【0067】
コア配列は、上記で定義された特定の百分率の極性残基と、上記で定義された特定の百分率の脂肪族残基とを含むことがある。例えば、いくつかの実施形態において、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％（または上記で定義された５０％超）は、極性残基のことがあり、位置ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇに対応するアミノ酸残基の少なくとも５％（または上記で定義された５％超）は、脂肪族極性残基のことがある。しかし、このことは、不可欠ではなく、上記のように変ってよい。
【0068】
いくつかの実施形態において、本明細書において定義されるコア配列は、一方の側または両方の側でフランキングアミノ酸配列と接していることがある。コア配列が両方の側で挟まれている場合、コア配列の一方の側のフランキング配列は、コア配列の他方の側のフランキング配列と同じであることも異なることもある。フランキング配列は、オリゴマータンパク質のコイルドコイル構造の一部を形成することも形成しないこともある。従って、フランキング配列は、モノマーペプチドのα－ヘリックス構造に寄与するかまたはα－ヘリックス構造の一部となることがあり、ならびに／あるいは別の面でコイルドコイル構造に寄与するかまたはコイルドコイル構造の一部を形成することがあり、あるいは、モノマーペプチド配列の別の一部になることがある。フランキング配列は、様々な機能を実行するかまたはオリゴマータンパク質に特性を付与するために用いられることがある。フランキング配列は、例えば、モノマーペプチドのヘプタッド繰り返し配列を延ばすために、モノマーペプチドのオリゴマー化を支援するために、モノマーペプチドを繋ぐ（例えば一本鎖コンストラクト内で）ために、またはオリゴマータンパク質に個別の機能部分を提供するために用いられることがある。
【0069】
フランキング配列の長さは、重要ではなく、フランキング配列の必要および所望、あるいは性質および／またはその目的によって変わることがある。例えば、フランキング配列の長さは、１～３００アミノ酸、例えば２、３、４、５、６または７アミノ酸の何れか１つ～２７０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０または２００アミノ酸の何れか１つのことがある。これらの範囲は、例としてだけ示され、フランキング配列の長さに対する制限はない。実施されるいくつかの実施形態において、フランキング配列は、最高１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０アミノ酸のことがある。いくつかの実施形態において、例えば最大２０、１５、１２、１０、８、７または６の短いフランキング配列が好ましい。
【0070】
よって、いくつかの実施形態において、フランキング配列は、１つ以上のヘプタッドモチーフおよび／または１つ以上のヘプタッドモチーフの一部を含むことがある。この状況において、ヘプタッドモチーフの一部は、ヘプタッドモチーフの連続する部分を構成する１、２、３、４または５つの残基を含むことがある。いくつかの実施形態において、フランキング配列中のヘプタッドモチーフは、ヘプタッドモチーフの位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも１つが疎水性残基であるという前提で、配列番号１またはそれと少なくとも６０％（例えば少なくとも７０％、８０％、９０％）の配列同一性を有する配列において見いだされるヘプタッドモチーフに対応する。いくつかの実施形態において、フランキング配列は、配列番号１、またはその一部、またはそれと少なくとも６０％（例えば少なくとも７０％、８０％、９０％）の配列同一性を有する配列を含むことがある。さらに、そのような実施形態において配列番号１のヘプタッドモチーフまたはその変異形の位置ａおよびｄに対応するアミノ酸残基の少なくとも５０％（例えば少なくとも７５％）は、疎水性残基である。
【0071】
フランキング配列が１つ以上のヘプタッドモチーフ、または１つ以上のヘプタッドモチーフの一部を含むとき、そのような部分をコア配列のヘプタッドモチーフの続きとして見ることがある。その結果、オリゴマータンパク質のコイルドコイル構造の一部を形成するモノマータンパク質のα－ヘリックスは、コア配列の端を超えて延びることがある。
【0072】
いくつかの実施形態において、コア配列のヘプタッドモチーフとフランキング配列のヘプタッドモチーフとは、連続している。すなわち、フランキング配列の第１の残基（すなわちコア配列の端に直接隣接する残基）は、コア配列の隣接する末端残基に対応する位置の次のヘプタッドモチーフの位置に対応する。このようにして、繰り返しヘプタッドモチーフａ－ｂ－ｃ－ｄ－ｅ－ｆ－ｇは維持され、コア配列のヘプタッドモチーフとフランキング配列のヘプタッドモチーフとの間には隙間がない。
【0073】
他の実施形態において、フランキング配列は、コア配列のヘプタッドモチーフと完全に連続してはいない１つ以上のヘプタッドモチーフを含むことがある。すなわち、コア配列中のヘプタッド繰り返しと、連続する繰り返しヘプタッドモチーフの一部を形成しないフランキング配列中のヘプタッド繰り返しと、の間に１つ以上の残基がある場合がある。
【0074】
いくつかの実施形態において、コア配列とフランキング配列とは、各モノマーペプチドがヘプタッドモチーフの８より多い繰り返しを含まないように配置されることがある。いくつかの実施形態において、モノマーペプチドは、ヘプタッドモチーフの７より多い繰り返し、６より多い繰り返しまたは５より多い繰り返しを含まない。言い換えると、オリゴマータンパク質のモノマーペプチドは、最大８、７、６または５のヘプタッド繰り返しを含むことがある。
【0075】
いくつかの実施形態において、モノマーペプチドのフランキング配列は、コア配列と、連続するα－ヘリックスを完全には形成しないことがあり、従って完全にはオリゴマーペプチドのコイルドコイル構造の一部でないことがある。
【0076】
いくつかの実施形態において、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、１つ以上の追加の成分または部分との接合体または融合体の形のことがある。下記でより詳しく示されるように、オリゴマータンパク質は、検出用部分、オリゴマー化用部分または固定化用部分、あるいは実際に何れかの所望の成分または部分、例えば機能用または構造用の成分または部分との接合体の形のことがある。接合された部分は、あらゆる化学的または物理的な性質、例えば小分子または高分子のことがある。オリゴマータンパク質は、融合相手との融合タンパク質の形のことがある。従って、検出用部分または固定化用部分、あるいは他の追加部分は、事実上、タンパク質性のことがある。すなわち、そのような部分は、ポリペプチド成分であることもないこともある（本明細書において用語「ポリペプチド」は、長さに関わらずあらゆるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含むために用いられる）。オリゴマー化用部分は、ポリペプチドのことがある。さらに、オリゴマータンパク質は、固体基質上に固定化されることがある。よって、いくつかの実施形態において、１つ以上の追加の成分は、検出用部分、オリゴマー化用部分、固定化用部分または融合相手のことがある。
【0077】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質が接合または融合される相手の１つ以上の追加成分は、オリゴマータンパク質を構成するモノマーペプチドの１つ以上の中のフランキング配列の全部または一部を形成することがある。他の実施形態において、接合される部分は、別個の成分（すなわちオリゴマータンパク質またはそのモノマーペプチドとは別個）のことがある。
【0078】
フランキング配列内の追加の成分の存在は、同じフランキング配列の中の１つ以上のヘプタッドモチーフの存在に加えて、または同じフランキング配列の中の１つ以上のヘプタッドモチーフに代り得ることが理解されよう。すなわち、所定のフランキング配列は、１つ以上のヘプタッドモチーフまたはそれらの一部と、１つ以上の追加の成分と、の両方を含むことがある。フランキング配列が１つ以上のヘプタッドモチーフまたはそれらの一部と、１つ以上の追加の成分と、を実際に含む場合、フランキング配列は、１つ以上のヘプタッドモチーフまたはそれらの一部が１つ以上の追加の成分よりコア配列に近くなるように配置されることがある。
【0079】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、単一の追加の成分との融合体または接合体の形である。追加の成分は、モノマーペプチドの１つの中のフランキング配列の全部または一部を形成することがある。あるいは、オリゴマータンパク質は、２つ以上の追加の成分との融合体または接合体の形のことがある。いくつかの実施形態において、追加の成分は、同じモノマーペプチド内の同じフランキング配列の全部または一部を形成することがある。いくつかの実施形態において、単一のモノマーペプチドは、両方の側でフランキング配列によって挟まれ、各フランキング配列が１つ以上の追加の成分を含む、コア配列を含むことがある。さらに、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、上記で示された配置の何れにおいても１つ以上追加の成分をそれぞれが含むいくつかのモノマーペプチドを含むことがある。
【0080】
オリゴマー化用部分との接合体の形のオリゴマータンパク質の場合、オリゴマー化用部分は、いくつかのオリゴマー化用配列で構成されることがあり、各モノマーペプチドは、オリゴマー化用配列を含む。よって、オリゴマータンパク質は、少なくとも２つのモノマーペプチドで構成されることがあり、各モノマーペプチドは、フランキング配列中にオリゴマー化用配列を含む。
【0081】
本明細書において開示されるオリゴマータンパク質のコイルドコイル構造は、モノマーペプチドが互いに接触させられるとき自発的に形成することがある。あるいは、オリゴマー構造の形成は、速度論的障壁を乗り越えるためおよびモノマーペプチド同士を一緒にするために『トリガー』を必要とすることがある。さらに、いくつかの実施形態において、タンパク質のオリゴマーコイルドコイル構造を安定化させることが必要な場合がある。オリゴマーコイルドコイル構造のこの始動および安定化は、オリゴマー化用配列によって実現されることがある。オリゴマー化用配列とは、オリゴマー化する、すなわちオリゴマーを形成するためにそれ自体の他のコピーと相互作用することができるタンパク質配列である。オリゴマー化は、協同的である、すなわち、より大きなタンパク質の特定の部分が容易におよび安定的にオリゴマー化することができる場合、このことは、そうでない場合には起こらない、タンパク質構造の残りの中でのオリゴマー化を誘導する助けとなり得ることが理解されよう。例えば、付着タンパク質の頭部ドメイン、例えばＹａｄＡ頭部ドメインは、他のドメインでは形成するのに十分なほど安定ではないコイルドコイル構造の形成を誘導することができることが当分野において公知である。ＧＣＮ４タンパク質も三量体自己輸送体付着因子を安定化させるために同様な方法で用いられた（ハートマン（Ｈａｒｔｍａｎｎ）ら、２０１２年）。従って、このドメインまたは当分野において公知の他の同等なドメインがオリゴマー配列として用いられることがある。上記のように、オリゴマータンパク質がオリゴマー化用部分と接合されるとき、オリゴマータンパク質内の各モノマーペプチドは、オリゴマー化用配列を含むことがある。
【0082】
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態において、コイルドコイル構造の始動および安定化は、モノマーペプチドを繋ぎ合わせることによって実行されることがある。
【0083】
本明細書において定義されるモノマーペプチドは、ある程度孤立状態において考えることができるが、いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるオリゴマータンパク質内のモノマーペプチドの２つ以上が繋ぎ合されることがある。よって、フランキング配列は、１つ以上のリンカー配列を含むことがある。フランキング配列は、１つ以上のヘプタッドモチーフまたはそれらの一部ならびにフランキング配列の中に含まれることがある１つ以上の追加の成分に加わるか、またはそれに代わることがある。フランキング配列は、ヘプタッドモチーフおよび／またはそれらの一部、１つ以上の追加の成分および／または１つ以上のリンカー配列のあらゆる組み合わせを含むことがあることが理解されよう。
【0084】
リンカー配列は、オリゴマータンパク質の少なくとも一部分内の単一のペプチド鎖を形成するように、１つのモノマーペプチドを別のモノマーペプチドに繋ぐことができる。２つのモノマーペプチドがリンカー配列を介して繋がれる場合、モノマーペプチドの一方（すなわち第１のモノマーペプチド）は、リンカー配列全体を含むフランキング配列を含み、リンカー配列は、他方のモノマーペプチドのコア配列に直接接合する（すなわちコア配列のその端にフランキング配列を有する第２のモノマーペプチドはない）と考えられることがある。あるいは、２つのモノマーペプチドの間の繋がりは、一部は第１のモノマーペプチドのフランキング配列で、一部は第２のモノマーペプチドのフランキング配列で構成されている（すなわち両方のモノマーペプチドがリンカー配列を含むフランキング配列を含んでいる）と考えられることがある。
【0085】
モノマーペプチドの中にそのモノマーペプチドを繋ぎ合せるためにリンカー配列が含まれる場合、２つのモノマーペプチドの間のフランキング配列がリンカー配列および任意選択としてヘプタッド繰り返しモチーフまたはそれらの一部以外に何も含まないと好都合なことがある。しかし、繋がれたモノマーペプチドの鎖のどちらかの端におけるフランキング配列は、追加の配列（例えば上記で考察された）を含むことがある。表現を換えると、そのような、繋がれた、例えば単一鎖コンストラクトにおいて、オリゴマータンパク質は、追加の部分との接合体の形のことがある。言い換えると、追加の部分は、モノマーペプチドの一部ではなく、それに接合されていることがある。
【0086】
リンカー配列は、可変長さおよび／または配列のことがある。リンカー配列は、モノマーペプチドによって形成されたヘリックスが集ってコイルドコイルになることを可能にするのに十分な長さでなければならないことが理解され得る。しかし、リンカー配列の最大長さについて機能上の制約はない。よって、リンカー配列は、長さが少なくとも２残基、例えば長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５または３０残基のことがある。
【0087】
例えば、他の実施形態において、リンカー配列は、２～６０残基、特に５～５５、１０～５０、１５～４５または２０～４０残基を含むことがある。一実施形態において、リンカー配列は、２～５０、３～４０、４～３０、５～２０または６～１５残基を含むことがある。リンカー配列の中に存在する残基の性質は、重要ではない。残基は、あらゆるアミノ酸、例えば中性アミノ酸または脂肪族アミノ酸のことがあり、あるいは、極性アミノ酸または電荷を有するアミノ酸または構造形成アミノ酸、例えばプロリンのことがある。実施形態において、リンカー配列は、柔軟なリンカー配列である。用いられる可能性がある種々の柔軟なリンカーが公知であり、当分野において広く記載されている。代表的な例として、リンカー配列中のアミノ酸の少なくとも７０％は、グリシン、セリン、トレオニン、アラニン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、リジン、アルギニンあるいはそれらの誘導体から選ばれることがある。いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシンの多い配列またはグリシン－セリンの多い配列である。
【0088】
各モノマーペプチドは、上記において定義されたように、少なくとも１つのコア配列を含む。いくつかの実施形態において、モノマーペプチドの１つ以上は、同じであることも互いに異なることもある２つ以上のコア配列を含むことがある。上記で示されたように、各コア配列は、一方の側または両方の側でフランキング配列と接していることがある。コア配列が両方の側で挟まれている場合、２つのフランキング配列は、同じであることも異なることもある。従って、各モノマーペプチドは、２つ以上のコア配列を含むことがあり、各コア配列は、一方の側または両方の側でフランキング配列によって挟まれている。よって、モノマーペプチドが２つ以上のコア配列を含む場合、モノマーペプチドは各コア配列あたり最大２つのフランキング配列をさらに含むことがあることが理解されよう。従って、２つのコア配列を含むモノマーペプチドは、最大４つのフランキング配列を含むことがある。例えば、モノマーペプチドは、Ｆ－Ｃ－Ｆ－Ｆ－Ｃ－Ｆと配置されることがある。Ｆは、フランキング配列を表し、Ｃはコア配列を表す。
【0089】
いくつかの実施形態において、モノマーペプチドは、２つのコア配列と３つのフランキング配列とをＦ－Ｃ－Ｆ－Ｃ－Ｆの配置で含むことがある。他の実施形態において、モノマーペプチドは、２つのコア配列と２つのフランキング配列とをＦ－Ｃ－Ｃ－Ｆの配置で含むことがある。他の実施形態において、モノマーペプチドは、２つのコア配列と単一のフランキング配列とをＣ－Ｃ－Ｆの配置で含むことがある。いくつかの実施形態において、モノマーペプチドは、両方の側でＦ－Ｃ－Ｆの配置でフランキング配列によって挟まれている単一のコア配列、または単一のコア配列および単一のフランキング配列を含むことがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、フランキング配列を含むただ１つのモノマーペプチドを含むことがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質中のモノマーペプチドのそれぞれは、１つのコア配列だけからなる。
【0090】
本明細書において定義される各コア配列は、３０残基を含む配列番号１と少なくとも６０％の同一性を有し、従って各コア配列は、１８～４２残基の長さを有することがあることが理解されよう。いくつかの実施形態において、モノマーペプチド中のコア配列は、１９～４１残基、例えば２０～４０、２１～３９、２２～３８、２３～３７、２４～３６、２５～３５、２６～３４、２７～３３、２８～３２または２９～３１残基の長さを有することがある。いくつかの実施形態において、コア配列は、３０残基を含むことがある。２つ以上のコア配列がある場合がある。各コア配列は、一方の側または両方の側でフランキング配列と接していることがある。上記のように、前記フランキング配列は、１つ以上のヘプタッドモチーフまたはそれらの一部、１つ以上の追加の成分、および／または１つ以上のリンカー配列を含むことがある。よって、いくつかの実施形態において、全体としてのモノマーペプチドは、コア配列より顕著に長いことがある。いくつかの実施形態において、モノマーペプチドは、２４～１０００残基、例えば２４～９００、２４～８００、２４～７００、２４～６００、２４～６００、２４～５００、２４～４００、２４～３００、２４～２５０、２４～２００、２４～１５０、２４～１００、２４～７５、２４～５０または２４～４０残基を含むことがある。
【0091】
本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、少なくとも２つのモノマーペプチドを含むコイルドコイル構造を有する。上記のように、このオリゴマータンパク質は、ＧＣＮ４転写因子のＣ末端区間に基づいている。野生型のＣ末端ＧＣＮ４配列は、二量体コイルドコイル構造、すなわち２つのモノマーペプチドを含む構造を形成する。しかし、個々のモノマーペプチド中のヘプタッドモチーフ内の位置ａおよびｄにおける残基を変えることによって、全体としてのタンパク質のオリゴマー状態を、三量体構造または四量体構造を形成するように変えることができることが観察された。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、二量体、三量体または四量体である。すなわち、オリゴマータンパク質は、２つ、３つまたは４つのモノマーペプチドを含む。好ましい実施形態において、オリゴマータンパク質は、三量体である。
【0092】
オリゴマータンパク質内の各モノマーペプチドは、同じであることも異なることもある。このことは、コア配列の配列だけでなく１つ以上のフランキング配列（の配列）の有無も含む。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、同一のコア配列を有する２つ以上のモノマーペプチドを含むことがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、２つ以上の完全に同一のモノマーペプチドを含むことがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質中のモノマーペプチドのすべてが同一のことがある。オリゴマータンパク質内のモノマーペプチドが互いに同一である必要はないが、モノマーペプチドの間に最小限の変動だけが存在することが好ましい。
【0093】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質内の各モノマーペプチドは、別々のペプチド鎖として提供されることがある。この場合、各モノマーペプチドは、オリゴマータンパク質複合体の物理的に別々のサブユニットであると見られることがある。あるいは、いくつかの実施形態において、モノマーペプチドのうち２つ以上が繋ぎ合わされることがある。上記に概略が示されるように、個々のモノマーペプチドが１つ以上のリンカー配列によって繋ぎ合わされて単一のペプチド鎖となる、すなわち第１のモノマーペプチドの一端が第２のモノマーペプチドの一端に繋がれることがある。いくつかの実施形態において、モノマーペプチドのすべてが繋がれて単一のペプチド鎖となることがある。この場合、モノマーペプチドは、単一鎖、複数ドメインタンパク質コンストラクトの個別のドメインであるとみなされることがある。
【0094】
さらにまたはあるいは、化学架橋によってモノマーペプチド間の１箇所以上の化学架橋の形でモノマーペプチドが繋ぎ合わされることがある。個々のペプチド間に共有結合を形成して繋ぎ合わせるための複数の方法が当分野において公知であり、オリゴマータンパク質内の２つ以上のモノマーペプチドを繋ぎ合わせるためにそのようなあらゆる適当な化学架橋方法が使用されることがある。例えば、モノマーペプチド中の特定のシステイン残基の間の１つ以上のジスルフィド結合によって２つ以上のモノマーペプチドが繋がれることがある。あるいは、モノマーペプチド中に存在するリジン残基との共有結合の形成を促進することができる、ホルムアルデヒドなどの架橋剤を用いることによって、２つ以上のモノマーペプチドが確率論的に繋がれることがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、単一のペプチド鎖の形でおよび／または化学架橋によって繋ぎ合されているモノマーペプチドと、別々のペプチド鎖上に提供され、繋がれていないいくつかのモノマーとの組み合わせを含むことがある。
【0095】
本明細書において開示されるオリゴマータンパク質は、合成的に、例えばアミノ酸または合成的に生成された小ペプチドの連結により、あるいは前記タンパク質またはその１つ以上のモノマーペプチドをコードする核酸分子の組み換え発現によって生成されることがある。そのような核酸分子は、当分野において公知の適当なあらゆる手段によって合成的に生成されることがある。従って、オリゴマータンパク質は、組み換えまたは合成または人工オリゴマータンパク質のことがある。
【0096】
本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、ＬＰＳに結合するための結合剤として提供される。上記のように、リポ多糖は、すべてのグラム陰性細菌の外膜中の必要不可欠な成分である。しかし、すべてのグラム陰性細菌が厳密に同じリポ多糖を外膜中に有するわけではない。本明細書において用いられる用語「ＬＰＳ」または用語「エンドトキシン」（上記のように「ＬＰＳ」と区別なく用いられる）は、グラム陰性細菌の外膜中に存在するあらゆるリポ多糖を指す。
【0097】
有利な点として、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、極めて高い親和力でＬＰＳに結合することができる。この高い親和力は、ＬＰＳが非常に低い濃度で存在するときでもオリゴマータンパク質がＬＰＳに効果的に結合することを可能にし、その結果、ＬＰＳは、検出および／または除去され得る。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、ナノモル濃度またはピコモル濃度、またはさらに低い範囲のＫDでＬＰＳに結合する。例えば、いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、１０ｎＭ以下、例えば５ｎＭ以下、１０００ｐＭ以下、７５０ｐＭ以下、５００ｐＭ以下、２５０ｐＭ以下、１００ｐＭ以下、５０ｐＭ以下、１０ｐＭ以下、５ｐＭ以下、１ｐＭ以下または５００ｆＭ以下のＫDでＬＰＳに結合する。よって、本明細書において定義されるオリゴマーペプチドは、ＬＰＳが少なくとも１００ｐＭの濃度で存在する試料中のＬＰＳを検出することができる場合がある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、ＬＰＳが少なくとも７５ｐＭの濃度で、より詳しくは少なくとも５０ｐＭ、少なくとも２５ｐＭ、少なくとも１０ｐＭ、少なくとも５ｐＭ、少なくとも３ｐＭ、少なくとも１ｐＭ、少なくとも７５０ｆＭ、少なくとも５００ｆＭ、少なくとも２５０ｆＭまたは少なくとも１００ｆＭの濃度で存在する試料中のＬＰＳを検出することができる。
【0098】
理論に縛られることは望まないが、本発明者らは、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質のＬＰＳへの結合は、全体としてのタンパク質のコイルドコイル構造と、ＬＰＳとタンパク質内の個々の残基との間の相互作用と、の両方に依拠すると考える。これに関して、オリゴマータンパク質内の正電荷を有する残基の存在は、結合の親和力を増大させる助けとなることがあると思われる。ここでも、理論に縛られることは望まないが、正電荷を有する残基は、ＬＰＳのリピドＡ領域中の負電荷を有するリン酸基との静電相互作用に関与することがあると仮定される。よって、いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、モノマーペプチドのコア配列内に合計少なくとも６つの陽イオン残基を含む。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、モノマーペプチドのコア配列内に合計少なくとも７つの陽イオン残基、例えば少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１２または少なくとも１５の陽イオン残基を含むことがある。
【0099】
本明細書において用いられる用語「陽イオン残基」は、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびｐＨ７．０において正電荷を帯びる、遺伝的にコードされていないかまたは改変されたあらゆるアミノ酸残基を含む。遺伝的にコードされていないかまたは改変された適当な陽イオン残基は、リジン、アルギニンおよびヒスチジンの類縁体、例えばホモリジン、オルニチン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、ホモアルギニン、トリメチルリジン、トリメチルオルニチン、４－アミノピペリジン－４－カルボン酸、４－アミノ－１－カルバムイミドイルピペリジン－４－カルボン酸および４－グアニジノフェニルアラニンを含む。
【0100】
前述の陽イオン残基は、単一のモノマーペプチドの少なくとも１つのコア配列内に存在することがあるか、またはオリゴマータンパク質中のいくつかのモノマーペプチドのコア配列にわたって分散していることがある。いくつかの実施形態において、各モノマーペプチドは、コア配列中に少なくとも２つの陽イオン残基を含む。いくつかの実施形態において、各モノマーペプチドは、コア配列中に少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの陽イオン残基を含む。
【0101】
上記で考察されたように、オリゴマータンパク質は、リピドＡ成分を介してＬＰＳと相互作用する。従って、本明細書においては、リピドＡに結合するための結合剤として本明細書において定義されるオリゴマータンパク質の使用も提供される。本明細書において用いられる用語「リピドＡ」は、β－１，６－結合によって結ばれ、Ｏで繋がれた４つのアシル鎖とＮで繋がれた２つのアシル鎖とを併せて有する２つのホスホグルコサミン糖分子を含み、グラム陰性細菌の外膜と相互作用することができるＬＰＳのリピドＡ成分を指す。
【0102】
いくつかの実施形態において、上記のように、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、１つ以上の追加の成分または部分との接合体または融合体の形になることがある。特に、オリゴマータンパク質は、検出用部分または固定化用部分と接合されることがある。追加の部分は、ポリペプチドの形のことがあり、従って、オリゴマータンパク質は、融合相手との融合タンパク質の形になることがある。融合相手は、オリゴマータンパク質とは別の、融合タンパク質のポリペプチド成分である。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、固体基質上に固定化されることがある。
【0103】
オリゴマータンパク質は、適当なあらゆる検出用部分、すなわち検出することができる信号を提供することができるあらゆる部分と接合されることがある。検出用部分は、標識であるとみなされることがあり、直接的にまたは間接的に検出可能のことがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、直接的に検出可能である検出用部分と接合されることがある。直接的に検出可能である部分とは、追加の試薬を使わずに直接検出することができるものである。例えば、直接的に検出可能である適当な検出用部分は、蛍光分子（例えば蛍光タンパク質または有機蛍光物質)、発色部分（例えば色のある分子またはナノ粒子）、粒子、例えば金粒子または銀粒子、量子ドット、放射性同位体標識、化学発光分子などを含むことがある。特に、直接的に検出可能な部分においては分光測光法的にまたは分光法的に検出可能なあらゆるラベルが用いられることがある。検出可能な標識は、色によって区別可能なことがあるが、他のあらゆるパラメータ、例えばサイズ、電荷等が用いられることがある。
【0104】
間接的に検出可能な部分とは、１種類以上の追加の試薬を使用することによって検出可能である、例えば、その部分が２つ以上の成分で構成された信号発生システムの一部であるものである。例えば、検出用部分は、検出可能な信号、例えば色変化を作り出す反応を触媒することができるセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素を含むことがある。よって、検出用部分を酵素にとっての基質と接触させると、反応が進み、検出可能な信号が生成される。
【0105】
オリゴマータンパク質は、融合相手との融合タンパク質の形のことがある。いくつかの実施形態において、融合相手は、検出可能部分のことがある。すなわち、検出可能部分との接合体の形のオリゴマータンパク質は、検出可能な融合相手との融合タンパク質の形のオリゴマータンパク質と同等であるとみなされることがある。しかし、オリゴマータンパク質は、検出可能部分以外の融合相手との融合タンパク質の形のことがある。原則として、オリゴマータンパク質が依然としてＬＰＳに結合するための結合剤として機能することができるという前提で、融合相手は、あらゆるポリペプチドのことがある。
【0106】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、固体基質（すなわち固相担体または固体担体）上に固定化されることがある。この固定化は、あらゆる簡便な方法で実現されることがある。従って、固定化の方法または手段と固体基質とは、選択に従って、当分野において広く知られ、文献に記載されているあらゆる数の固定化手段と固体基質とから選ばれることがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、固定化を促進するために固定化用部分と接合されることがある。固定化用部分は、固体基質に直接結合される（例えば化学的に架橋される）ことがある。例えば、いくつかの実施形態において、固定化用部分は、ジスルフィド架橋の形で基質上のシステイン残基にカップリングされることができるシステイン残基を含むことがある。いくつかの実施形態において、固定化用部分は、リンカー基によるかまたは１つ以上の仲介結合基によって、より間接的に基質に結合されることがある。いくつかの実施形態において、固定化用部分は、例えば、その結合相手、すなわち固体基質上に提供されている同族結合相手、例えばストレプトアビジンまたは抗体に結合することができる親和力結合相手、例えばビオチンまたはハプテンのことがある。従って、オリゴマータンパク質は、固定化用部分を介して固体基質に共有結合によりまたは非共有結合により繋がれることがある。繋がりは、可逆的な（例えば開裂可能な）繋がりのことも不可逆的な繋がりのこともある。いくつかの実施形態において、繋がりは、酵素的に、化学的にまたは光で開裂されることがあり、例えば、繋がりは、感光性の繋がりのことがある。
【0107】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質と固体基質との間の相互作用は、洗浄ステップを可能にするのに十分なほど強固でなければならない。すなわち、オリゴマータンパク質と固体基質との間の相互作用は、洗浄ステップによって撹乱されない（あまり撹乱されない）。例えば、一実施形態において、オリゴマータンパク質の５％未満が各洗浄ステップで固体基質から除去または溶出される。一実施形態において、オリゴマータンパク質の４、３、２、１、０．５または０．１％未満が各洗浄ステップで固体基質から除去または溶出される。
【0108】
固体基質は、固定化、分離等のために現在広く用いられているかまたは提案されている周知の基質またはマトリックスの何れかのことがある。これらは、粒子（例えば、磁性、常磁性または非磁性のことがあるビーズ）、シート、ゲル、フィルター、膜、繊維、毛管、スライド、アレイ、チップまたはマイクロタイターストリップ、チューブ、プレートまたはウェル等の形のことがある。
【0109】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、ビーズもしくは樹脂上に、あるいはウェルもしくは容器またはカラムもしくはフィルター材料の中または上に、あるいは検出用装置の表面に固定化される。
【0110】
基質は、ガラス、シリカ、ラテックス、アパタイトまたはポリマー材料でできていることがある。いくつかの状況において、高い表面積を有する材料が特に適していることがある。そのような基質は、不規則な表面を有することがあり、例えば多孔性または粒状、例えば粒子、繊維、ウェブ、シンターまたはシーブのことがある。粒状材料、例えばビーズ、特にポリマービーズは、それらのより大きな結合容量に起因して有用である。これらのビーズは、当分野において公知であるように、あらゆる適当な構成で提供されることがあることが理解されよう。例えば、ビーズは、カラム、例えば濾過用カラムに充填されることがある。
【0111】
都合の良いことに、本開示によって用いられる粒状固体基質は、球状ビーズを含むことがある。ビーズのサイズは、重要ではないが、ビーズは、例えば少なくとも１μｍのオーダーの直径のことがある。一実施形態において、ビーズは、少なくとも２μｍの直径を有することがある。一実施形態において、ビーズは、１０μｍより大きくない、例えば６μｍより大きくない最大直径を有することがある。単分散粒子、すなわちサイズが実質的に均一（例えば５％未満の直径標準偏差を有するサイズ）であるものは、非常に均一な反応再現性を提供するという利点を有する。代表的な単分散ポリマー粒子は、米国特許出願公開第４３３６１７３号に記載されている技法によって製造されることがある。
【0112】
いくつかの実施形態において、固体基質は、樹脂、例えばアミロース樹脂のことがある。樹脂は、適当なあらゆる形、例えばスピンカラムフィルターまたはフローカラムで提供されることがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、ウェルまたは容器、例えばマルチウェルプレートの中または上に固定化されることがある。
【0113】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、検出用装置、例えばチップまたはマイクロアレイの表面に固定化されることがある。これに関して、オリゴマータンパク質は、ＬＰＳに結合し、ＬＰＳを検出することができるキャプチャーアレイまたはバイオセンサーを形成することがある。いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）チップ上に固定化されることがある。固定化されたキャプチャータンパク質への標的の結合に対応する信号を測定することができるバイオセンサーは、当分野において周知であり、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質は、そのような適当なあらゆる装置において提供されることがある。
【0114】
従って、本明細書において定義されるオリゴマータンパク質の、ＬＰＳに結合するための結合剤としての使用は、試料中のＬＰＳまたは試料からのＬＰＳを検出および／または除去するオリゴマータンパク質の使用を含むことがあることが分かる。
【0115】
よって、本明細書において定義され、記載されるオリゴマータンパク質の使用は、特にインビトロの、すなわちＬＰＳがインビトロで結合され、検出され、または除去される、使用を含む。
【0116】
これに関して、本明細書においては、ＬＰＳに結合する方法であって、ＬＰＳまたはＬＰＳを含有する試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させてタンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにＬＰＳに結合することを可能にすることを含む方法が提供される。ＬＰＳに結合する際に使用されるオリゴマータンパク質に関する上記の開示は、同じオリゴマータンパク質が関与するＬＰＳに結合するための方法に等しく適用されることが理解されよう。
【0117】
一実施形態において、本方法は、インビトロ方法である。
【0118】
本明細書において用いられる用語「試料」は、ＬＰＳを含むことがあるかまたはＬＰＳで汚染されることがある、あるいは検査することが望まれるあらゆる試料を含む。そのような試料は、患者またはより一般的には被験者に由来する臨床試料、環境試料、およびエンドトキシン汚染を検査される製品の試料を含む。患者に由来する臨床試料は、体液または組織のあらゆる試料、例えば患者から採取された、血液試料、リンパ試料、唾液試料、尿試料、糞便試料、脳脊髄液試料または他の適切なあらゆる生体試料のことがある。好ましい実施形態において、臨床試料は、血液試料である。
【0119】
エンドトキシン汚染について検査されるべき製品の試料は、エンドトキシンによる汚染が疑われるあらゆる製品、特にヒトの消費またはヒトとの相互作用を目的とするような製品に由来する試料のことがある。そのような製品は、例えば、医薬産業および医療産業からの製品、例えば試薬、医療用具、装置、消耗品、薬、ワクチン等を含む。同様に、試料は、食品産業および飲料産業における製品または環境試料、例えば飲料水、地下水等に由来することもある。
【0120】
一実施形態において、試料は、検査されるべき製品の一部分を含む液体試料のことがあるが、固体製品、例えば医療用具、または表面、例えば手術室もしくは別の滅菌環境における表面のエンドトキシン汚染を検査することが望ましい、製品の表面に由来する試料のこともある。そのような試料は、例えば、製品の表面から採取されたスワブまたは洗浄液を含むことがある。
【0121】
いくつかの実施形態において、ＬＰＳに結合する方法は、試料中のＬＰＳの存在を検出する方法であり、この方法は、
（ａ）試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させてタンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）タンパク質－リポ多糖複合体の存在を検出するステップと、
を含む。
（ａ）試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させてタンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）タンパク質－リポ多糖複合体の存在を検出するステップと、
を含む。
【0122】
いくつかの実施形態において、ＬＰＳに結合する方法は、グラム陰性細菌を含有することが疑われる試料中のグラム陰性細菌の存在を検出する方法のことがあり、この方法は、
（ａ）試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させてタンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにグラム陰性細菌の外膜中のＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）タンパク質－リポ多糖複合体の存在を検出するステップと、
を含む。
（ａ）試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させてタンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにグラム陰性細菌の外膜中のＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）タンパク質－リポ多糖複合体の存在を検出するステップと、
を含む。
【0123】
タンパク質－リポ多糖複合体を検出するステップは、当分野において公知の適当なあらゆる手段によって実行されることがあると理解されよう。タンパク質－リポ多糖複合体は、直接的にまたは間接的に検出されることがある。タンパク質－リポ多糖複合体を検出する適切な方法は、試料がオリゴマータンパク質と接触させられる方法に応じて選ばれることがある。
【0124】
試料をオリゴマータンパク質と接触させるステップは、上記で概略が示されたように、オリゴマータンパク質が固定化されている基質に試料をアプライすることを含むことがあり、基質は、オリゴマータンパク質への試料の結合を測定することができるように構成される。いくつかの実施形態において、例えば、オリゴマータンパク質は、上記で概略が示された試料とオリゴマータンパク質との間の相互作用を検出することができる検出装置、例えばＳＰＲチップまたは適当な別のバイオセンサーの表面に固定化されることがある。よって、試料をオリゴマータンパク質と接触させるステップは、オリゴマータンパク質が固定化された固体基質に試料をアプライすることを含むことがある。
【0125】
他の実施形態において、例えば、オリゴマータンパク質は、ＬＰＳアッセイを形成するためにマルチウェルプレートのウェル中に固定化されることがある。そのようなアッセイは、当分野において周知である。固定化されたオリゴマータンパク質を含むプレートに試料がアプライされると、試料中に存在するあらゆるＬＰＳは、オリゴマータンパク質によって結合され、試料中の他の成分は、洗い流され得る。よって、試料をオリゴマータンパク質と接触させるステップは、オリゴマータンパク質が固定化されたマルチウェルプレートに試料をアプライすることを含む。さらに、試料中のＬＰＳの存在を検出する方法は、結合していない試料の成分を除去し、従って本方法の正確さを向上させるために、検出のステップの前にタンパク質－リポ多糖複合体を洗浄するステップをさらに含むことがある。そのような洗浄ステップのための適当な試薬およびプロトコルは、当分野において周知である。次に、プレート中に保持されているタンパク質－リポ多糖複合体は、ＬＰＳに結合することができる適当なあらゆる検出用部分を用いて検出され得る。検出用部分は、直接的にまたは間接的に検出可能なことがある。下記でより詳細に概略が示されるように、本発明者らは、シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、２０１６年によって最初に報告されたサルモネラファージのテールスパイクタンパク質を用いるＥＬＩＳＡ様アッセイ（ＥＬＩＴＡ）を、ＬＰＳを検出するように適応させた。このアッセイは、タンパク質－リポ多糖複合体を検出するために、ＬＰＳに結合することができ、Ｎ末端ストレプタグ（ＳｔｒｅｐＴａｇ）を含むテールスパイクタンパク質とストレプトアビジン接合セイヨウワサビペルオキシダーゼとを用いる。酵素基質２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）がプレートに加えられると検出可能な色変化が誘導される。よって、タンパク質－リポ多糖複合体の存在を検出するステップは、タンパク質－リポ多糖複合体を、ＬＰＳに結合することができ、かつ検出可能な信号を発生する反応を触媒することができる酵素を含む検出用部分ならびにそのような検出可能な信号を誘導する適切な基質と、接触させることを含む場合があることが分かる。
【0126】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、上記で概略が示されたように、検出用部分それ自体を含む接合体の形のことがある。よって、タンパク質－リポ多糖複合体は、オリゴマータンパク質と接合している検出用部分からの信号を検出することによって検出されることがある。この検出は、問題の検出用部分からの信号を検出するために適切であるあらゆる方法によって、例えばオリゴマータンパク質と接合されている蛍光標識を観測するために蛍光顕微鏡法を用いて、実行されることがある。
【0127】
いくつかの実施形態において、ＬＰＳに結合する方法は、試料からＬＰＳを除去する方法であり、この方法は、
（ａ）試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させてタンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）試料からタンパク質－リポ多糖複合体を分離するステップと、
を含む。
（ａ）試料を本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と接触させてタンパク質がタンパク質－リポ多糖複合体を形成するようにＬＰＳに結合することを可能にするステップと；
（ｂ）試料からタンパク質－リポ多糖複合体を分離するステップと、
を含む。
【0128】
ここでも、試料からタンパク質－リポ多糖複合体を分離するステップは、当分野において公知の適当なあらゆる手段によって実行される場合があること、およびこの手段は、試料がオリゴマータンパク質と接触させられる方法に依存することが理解されよう。
【0129】
いくつかの実施形態において、オリゴマータンパク質は、固体基質上に固定化されることがあり、従って試料をオリゴマータンパク質と接触させるステップは、オリゴマータンパク質が固定化されている固体基質に試料をアプライするステップを含むことがある。上記のように、オリゴマータンパク質は、当分野において公知の適当なあらゆる基質上に固定化されることがある。詳しくは、固体基質は、粒子（例えばビーズ）、フィルターまたはカラムの形のことがある。ここでも、結合された標的分子を試料から分離するためにそのような基質を用いるための適当な試薬およびプロトコルが当分野において周知である。
【0130】
上記のように、オリゴマータンパク質は、ビーズに固定化されることがあり、ビーズは、磁性のことがある。本明細書において用いられる用語「磁性」は、基質が、磁場に置かれたとき付与される磁気モーメントを有することができ、従ってその磁場の作用を受けて移動可能であることを意味する。言い換えると、磁性粉子を含む基質は、磁性凝集によって容易に除去されることがあり、そのことは、試料からタンパク質－リポ多糖複合体を、複合体が形成されたら分離する迅速、簡単かつ効率的な方法を提供する。
【0131】
別の実施形態において、例えば、オリゴマータンパク質は、カラムに充填される樹脂上に固定化されることがある。この例において、試料がオリゴマータンパク質と接触させられると、すなわち試料がカラムにアプライされると、ＬＰＳは、オリゴマータンパク質によって結合され、カラムの中に保持され、試料の残りは、カラムを通り抜ける。いくつかの実施形態において、本方法は、ＬＰＳのすべてが結合されることを確実にするために試料をオリゴマータンパク質と接触させるいくつかのステップを含むことがある。すなわち、試料は、カラムに数回アプライされることがある。さらに、本方法は、ＬＰＳに加えて他の成分をうっかり試料から除去することを避けるために、分離のステップの前にタンパク質－リポ多糖複合体を洗うステップを含むことがある。すなわちカラムは、適切な試薬で洗浄されることがある。
【0132】
ＬＰＳに結合するとき、試料中のＬＰＳの存在を検出するとき、または試料からＬＰＳを除去するとき、結合するステップ、検出するステップまたは除去するステップに関与する試薬、特にオリゴマータンパク質を再使用することができれば有利である。よって、本明細書において開示される方法は、オリゴマータンパク質からＬＰＳを除去するために、すなわち、タンパク質－リポ多糖複合体を分裂させ、それによってオリゴマータンパク質を再使用することができるように、タンパク質－リポ多糖複合体を少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と接触させるステップをさらに含むことがある。
【0133】
これに関して、本明細書においては、本明細書において定義されるＬＰＳのための結合剤として使用されるか、または本明細書において定義される方法において使用されるキットが提供され、前記キットは、
（ｉ）本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と；
（ｉｉ）少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と、
を含む。
（ｉ）本明細書において定義されるオリゴマータンパク質と；
（ｉｉ）少なくとも１種類の非変性型界面活性剤と、
を含む。
【0134】
非変性型界面活性剤は、当分野において周知であり、当業者は、適当なあらゆる非変性型界面活性剤を用いることがある。例えば、少なくとも１種類の非変性型界面活性剤は、非イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤または双性イオン界面活性剤あるいはそれらのあらゆる組み合わせから選ばれることがある。これに関して、少なくとも１種類の非変性型界面活性剤は、直鎖ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、ポリソルベート基、β－グリコシド糖基、Ｎ－メチルグルカミン基、Ｎ－オキシド基、ジメチルアンモニウム－１－プロパンスルホネート基、カルボン酸基、スルフェート基または第四アミン基から選ばれた頭基を有することがある。少なくとも１種類の非変性型界面活性剤は、ＣＨＡＰＳ、ツゥイッタージェント（ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３－１２、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、トライトンＸ－１００またはそれらのあらゆる組み合わせから選ばれることがある。いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の非変性型界面活性剤は、非変性型界面活性剤の混合物のことがある。いくつかの実施形態において、非変性型界面活性剤の混合物は、ＣＨＡＰＳ、ツゥイッタージェント３－１２、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０およびトライトンＸ－１００を含むかまたはからなる。
【0135】
界面活性剤は、オリゴマータンパク質の機能が恒久的に弱められるような高い濃度になることなく、タンパク質－リポ多糖複合体を分裂させるのに十分な濃度で存在しなければならないことが理解されよう。いくつかの実施形態において、界面活性剤は、少なくとも０．１％（重量／重量）または０．１％（体積／体積）の総濃度、すなわち存在するすべての界面活性剤の濃度で存在することがある。いくつかの実施形態において、界面活性剤の濃度は、少なくとも０．１５％（重量／重量）もしくは少なくとも０．１５％（体積／体積）、例えば少なくとも０．２％（重量／重量）もしくは少なくとも０．２％（体積／体積）、少なくとも０．２５％（重量／重量）もしくは少なくとも０．２５％（体積／体積）または少なくとも０．５％（重量／重量）もしくは少なくとも０．５％（体積／体積）のことがある。一実施形態において、少なくとも１種類の非変性型界面活性剤は、０．０５％（重量／重量）ＣＨＡＰＳ、０．０５％（重量／重量）ツゥイッタージェント３－１２、０．０５％（体積／体積）トゥイーン８０、０．０５％（体積／体積）トゥイーン２０および０．０５％（体積／体積）トライトンＸ－１００の組み合わせを含む。
【0136】
さらなる実施形態では、本明細書において、固体基質上に固定化されたオリゴマータンパク質を含む製品であって、オリゴマータンパク質は、本明細書において定義された通りである製品が提供される。固体基質は、本明細書において開示されるあらゆる固体基質のことがある。すなわち、オリゴマータンパク質が固体基質上に固定化されているオリゴマータンパク質の使用に関する上記の開示は、固体基質上に固定化されているオリゴマータンパク質を含む製品の状況において同等に適用される。これに関して、固体基質は、シート、ゲル、フィルター、膜、繊維、毛管、スライド、アレイ、チップ、マイクロタイターストリップ、チューブ、プレートまたはウェルのことがある。特に、オリゴマータンパク質は、検出装置、例えばＳＰＲチップまたはバイオセンサーの表面に固定化されることがある。
【0137】
本明細書において記載されるオリゴマータンパク質は、ＬＰＳに結合するためおよびＬＰＳを検出するための公知の方法に伴う複数の問題に対処し得る、ＬＰＳに結合するための代替結合剤を提供することが上記開示から了解されよう。詳しくは、本明細書において記載されるオリゴマータンパク質は、ＬＰＳ凝集体を分解させることができる。よって、本オリゴマータンパク質は、凝集によって引き起こされるＬＰＳマスキングの影響を減らし、従って試料中の測定可能なＬＰＳの濃度を効果的に増大させることができる。従って、このオリゴマータンパク質は、低濃度のＬＰＳを検出することができるＬＰＳの検出方法を支援する。
【0138】
さらに、この検出方法は、ＬＡＬアッセイに関連する課題、例えばアメボサイト溶解物の高価かつ非持続可能な採収を回避する。そのうえ、この方法は、Ｃ因子の使用に関連するあらゆる潜在的な問題を回避する。潜在的な問題は、ＬＡＬアッセイの組み換え型変化形の場合にも存在することがある。
【実施例】
【0139】
方法
タンパク質の発現および精製
ＧＣＮ４アダプターによって挟まれたサルモネラアドヘシンＡ（ＳａｄＡ）コンストラクト（図７に示される）を、既に記載されている（アルバレスら、２００８年；ハートマンら、２０１２年）通りに産生させた。形質転換されたＢＬ２１－ゴールド（ＤＥ３）を２ＬのＺＹＰ－５０５２自己誘導培地（ストゥディアー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）、２００５年）中で増殖させ、２００ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＨＴＣ）をＯＤ６００＝０．６で加えた後に３０℃で一晩発現させることによって過剰発現を誘導した。細胞を６０００×ｇ（ベックマンＪＬＡ８．１０００ローター）３０分間でペレット化させ、２００μＬのＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル（メルク）およびＤＮＩを含有する２０ｍＬのトリス／ＨＣｌ ｐＨ ７．４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2中で再懸濁させた。再懸濁後、フレンチプレスによって細胞を溶解させ、得られた溶解液を５０ｍＬ平衡バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．９、５Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中に希釈し、撹拌しながら室温で１時間をインキュベートした後に、溶解していない粒状物をすべて除去するために７５，０００×ｇで１時間遠心分離（ベックマンＴｉ７０ローター）した。得られた溶液を、平衡バッファーで前もって平衡化した２０ｍＬ Ｎｉセファロースエクセルカラム（ＧＥライフサイエンセズ）に載せた。試料のアプライ後、カラムの４倍の体積の平衡化バッファーでカラムを洗い、０～１００％のグラジエント溶出バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール）を用いて溶出させた。溶出した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、２Ｌのリフォールディング用バッファー（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）に対して一晩透析を２回することによってリフォールドさせた。
タンパク質の発現および精製
ＧＣＮ４アダプターによって挟まれたサルモネラアドヘシンＡ（ＳａｄＡ）コンストラクト（図７に示される）を、既に記載されている（アルバレスら、２００８年；ハートマンら、２０１２年）通りに産生させた。形質転換されたＢＬ２１－ゴールド（ＤＥ３）を２ＬのＺＹＰ－５０５２自己誘導培地（ストゥディアー（Ｓｔｕｄｉｅｒ）、２００５年）中で増殖させ、２００ｎｇ／ｍＬのアンヒドロテトラサイクリン（ＡＨＴＣ）をＯＤ６００＝０．６で加えた後に３０℃で一晩発現させることによって過剰発現を誘導した。細胞を６０００×ｇ（ベックマンＪＬＡ８．１０００ローター）３０分間でペレット化させ、２００μＬのＥＤＴＡフリープロテアーゼインヒビターカクテル（メルク）およびＤＮＩを含有する２０ｍＬのトリス／ＨＣｌ ｐＨ ７．４、４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2中で再懸濁させた。再懸濁後、フレンチプレスによって細胞を溶解させ、得られた溶解液を５０ｍＬ平衡バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ ｐＨ７．９、５Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中に希釈し、撹拌しながら室温で１時間をインキュベートした後に、溶解していない粒状物をすべて除去するために７５，０００×ｇで１時間遠心分離（ベックマンＴｉ７０ローター）した。得られた溶液を、平衡バッファーで前もって平衡化した２０ｍＬ Ｎｉセファロースエクセルカラム（ＧＥライフサイエンセズ）に載せた。試料のアプライ後、カラムの４倍の体積の平衡化バッファーでカラムを洗い、０～１００％のグラジエント溶出バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５Ｍ塩酸グアニジン、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール）を用いて溶出させた。溶出した画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、目的のタンパク質を含有する画分をプールし、２Ｌのリフォールディング用バッファー（２０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、３５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール）に対して一晩透析を２回することによってリフォールドさせた。
【0140】
ＬＰＳ産生および精製
単一細菌コロニー（使用された菌株については下表３参照）から２０ｍＬ溶原ブロス（ＬＢ）前培養を接種することによってＬＰＳを産生させ、３７℃で一晩増殖させた。
単一細菌コロニー（使用された菌株については下表３参照）から２０ｍＬ溶原ブロス（ＬＢ）前培養を接種することによってＬＰＳを産生させ、３７℃で一晩増殖させた。
【0141】
【表4】
【0142】
前培養からバッフル付き２Ｌフラスコ中の１Ｌ培養物６組に接種し、振盪機上３７℃で一晩増殖させた。６０００×ｇで３０分間遠心分離（ベックマンＪＬＡ ８．１０００ロータ）することによって細菌を採収した。その後の精製は、ＬＰＳのタイプに応じて２つの異なる方法に従った。
【0143】
ガラノス（Ｇａｌａｎｏｓ）らによって記載されているプロトコル（ガラノス（Ｇａｌａｎｏｓ）、リューデリッツ（Ｌｕｅｄｅｒｉｔｚ）およびヴェストファール（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）、１９６９年）に従い、フェノール－クロロホルム－石油エーテル抽出を用いてラフＬＰＳを精製した。採収後、細菌ペレットを４０ｍＬエタノールで３回およびアセトンで１回洗浄し、次に空気流下に一晩置いた。乳鉢および乳棒を用いて乾燥ペレットをホモジナイズし、９０％（重量／体積）液体フェノール、クロロホルムおよび石油エーテルの２：５：８の比の４０ｍｌ混合物に溶解させた。振盪機上１時間のインキュベーション後、未溶解物質を４２００×ｇ１５分間でペレット化し、上清を集めた。空気流下で４時間またはフェノールが結晶化し始めるまでクロロホルムおよび石油エーテルを除去した。溶液を４０℃に熱することによって再懸濁させ、ＬＰＳが沈殿するまで撹拌しながら水を滴下して加えた（５滴×３回）。ＬＰＳを４２００×ｇ１５分間でペレット化させ、残りのＬＰＳをすべて集めるために上清にさらに水を加えた。ペレットを１０ｍＬの８０％（重量／体積）フェノールで２回洗浄し、２０ｍＬのミリＱ水に取り込んだ後に１００，０００×ｇで１時間遠心分離した（ベックマン、ＭＬＡ－５０ローター）。最終的なペレットを５０ｍＬのミリＱ水に取り込み、純ＬＰＳを得るために凍結乾燥した。
【0144】
スムースＬＰＳは、ダルボー（Ｄａｒｖｅａｕ）らによって記載されているプロトコル（ダルボー（Ｄａｒｖｅａｕ）およびハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）、１９８３年）に従って精製した。細菌を２回洗浄し、４０ｍＬの１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ2に再懸濁させ、フレンチプレスによって溶解した後に超音波処理によってさらに破壊した。得られた懸濁液を２００μｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ、５０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡとともに撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。１５ｍＬの懸濁液に、０．５Ｍ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス－ＨＣＬ ｐＨ８．０を５ｍＬ、２０％ＳＤＳを含む１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０を２．５ｍＬ、および１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ８．０を２．５ｍＬを加え、超音波処理によってＬＰＳミセルをさらに破壊した。未溶解の細胞成分をペレット化するために溶液を２０℃において３９ ０００×ｇで３０分間遠心分離し（ソーバル（Ｓｏｒｖａｌｌ）、ＳＳ－３４ローター）、上清を凍結乾燥させた。凍結乾燥した粗抽出物を少量の水に溶解させ、２倍体積の氷冷エタノールおよび０．３７５Ｍ ＭｇＣｌ２を用いて－４０℃で一晩ＬＰＳを沈殿させた。沈殿したＬＰＳを４℃において１１ ０００×ｇで１５分間遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ、ＳＬＡ３０００ローター）させ、得られたペレットを同じ体積の９０％（重量／体積）フェノール中に６５℃で３０分間撹拌しながら再懸濁させた。相分離を速めるために、混合物を４０００×ｇで１０分間遠心分離した。水相を集め、フェノール相をもう一度水で抽出した。分離した水相をプールし、１／４体積のクロロホルムを用いてフェノールを抽出した。残っている有機溶媒をすべて蒸発させるために水相を空気流下に一晩置き、ＭＷＣＯ５００の透析膜を用いてＭＱ水に対して３日間透析した。純ＬＰＳを得るために、透析したＬＰＳを凍結乾燥した。
【0145】
単離したＬＰＳ製品の純度をトリシン－ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（マロルダ（Ｍａｒｏｌｄａ）ら、２００６年）によって管理した。
【0146】
Ｏ抗原多糖の調製
リピドＡを近位ＫＤＯ糖に繋いでいるグリコシド結合の穏やかな酸加水分解（ラエツ（Ｒａｅｔｚ）およびホイットフィールド（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ）、２００２年ａ）によって野生型Ｓ．ティフィムリウム（スムース）ＬＰＳから多糖を単離した。４～５ｍｇ／ｍＬのＳ．ティフィムリウムＬＰＳを１０％酢酸に溶解させ、１００℃で１時間インキュベートした。得られたリピドＡを４℃における１０ ０００×ｇで３０分間の遠心分離によって溶液から除去し、多糖を含有する上清を一晩凍結乾燥した。
リピドＡを近位ＫＤＯ糖に繋いでいるグリコシド結合の穏やかな酸加水分解（ラエツ（Ｒａｅｔｚ）およびホイットフィールド（Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ）、２００２年ａ）によって野生型Ｓ．ティフィムリウム（スムース）ＬＰＳから多糖を単離した。４～５ｍｇ／ｍＬのＳ．ティフィムリウムＬＰＳを１０％酢酸に溶解させ、１００℃で１時間インキュベートした。得られたリピドＡを４℃における１０ ０００×ｇで３０分間の遠心分離によって溶液から除去し、多糖を含有する上清を一晩凍結乾燥した。
【0147】
ＥＬＩＳＡ様テールスパイク吸着（ＥＬＩＴＡ）アッセイ
ＥＬＩＴＡアッセイは、細菌全体を用いてシュミットらにより初めて記載された（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、２０１６年）。本発明においては、ヌンクマキシソープ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）９６ウェルフラットウェルプレート中の精製タンパク質でこのアッセイを用いるために改変した（図１１に示す）。ＰＢＳ－バッファー中１０μｇ／ｍＬのＫ９－ＨｉｓまたはＫ１４－Ｈｉｓのどちらか１００μｌとともに一晩インキュベートすることによってウェルを飽和させた。ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による２時間のブロッキングステップ後、サルモネラ・ティフィムリウムＬＰＳの２００μｇ／ｍＬ～０．００２３μｇ／ｍＬの範囲の希釈液１００μＬを結合相手として加え、１時間インキュベートした。Ｎ末端ストレプ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ）（登録商標）ＩＩ（ＩＢＡ）を有するＰ２２テールスパイクタンパク質（Ｐ２２ＴＳＰ）１００μＬを１時間加えた後、最後にウェルを１００μＬの１：１０ ０００ストレプタクチン（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ）接合セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＩＢＡ、ゲッチンゲン）とともに１時間インキュベートし、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ、シグマ‐アルドリッチ）で３０～６０分間現像し、プレートリーダーを用いて４０７ｎｍで読み取った。上記ステップのそれぞれの間に０．１％ＢＳＡを含有する１５０μＬのＰＢＳバッファーでウェルを３回洗浄した（トゥイーン－２０は、このアッセイに干渉するのでこれらの実験では除いた）。各平均信号から平均バックグラウンド信号（０μｇ／ｍＬ ＬＰＳ）を減じ、３つ組についての個々の標準偏差を直交座標のベースラインに加えることによって誤差伝播を計算した（
ＥＬＩＴＡアッセイは、細菌全体を用いてシュミットらにより初めて記載された（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、２０１６年）。本発明においては、ヌンクマキシソープ（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ）９６ウェルフラットウェルプレート中の精製タンパク質でこのアッセイを用いるために改変した（図１１に示す）。ＰＢＳ－バッファー中１０μｇ／ｍＬのＫ９－ＨｉｓまたはＫ１４－Ｈｉｓのどちらか１００μｌとともに一晩インキュベートすることによってウェルを飽和させた。ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による２時間のブロッキングステップ後、サルモネラ・ティフィムリウムＬＰＳの２００μｇ／ｍＬ～０．００２３μｇ／ｍＬの範囲の希釈液１００μＬを結合相手として加え、１時間インキュベートした。Ｎ末端ストレプ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｇ）（登録商標）ＩＩ（ＩＢＡ）を有するＰ２２テールスパイクタンパク質（Ｐ２２ＴＳＰ）１００μＬを１時間加えた後、最後にウェルを１００μＬの１：１０ ０００ストレプタクチン（ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ）接合セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＩＢＡ、ゲッチンゲン）とともに１時間インキュベートし、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ、シグマ‐アルドリッチ）で３０～６０分間現像し、プレートリーダーを用いて４０７ｎｍで読み取った。上記ステップのそれぞれの間に０．１％ＢＳＡを含有する１５０μＬのＰＢＳバッファーでウェルを３回洗浄した（トゥイーン－２０は、このアッセイに干渉するのでこれらの実験では除いた）。各平均信号から平均バックグラウンド信号（０μｇ／ｍＬ ＬＰＳ）を減じ、３つ組についての個々の標準偏差を直交座標のベースラインに加えることによって誤差伝播を計算した（
【0148】
【数1】
【0149】
、ここでδＱは、和Ｑの組み合わせの不確定性である）。データを以下のヒル式
【0150】
【数2】
【0151】
、ここで、Ｙは占有された受容体結合部位の割合、Ｙｍａｘは最大結合、［Ｌ］は遊離リガンドの濃度、ｎは結合部位の数である、に曲線フィッティングすることによって用量－応答曲線および解離定数ＫDを計算した。各コンストラクトは２つのＧＣＮ４－ＰＩＩモチーフを有するが、それらのモチーフはこのタンパク質の相対する末端に位置し、従って協同するとは予測されないので、ｎは１に等しいとして取り扱った。スムースＳ．ティフィムリウムＬＰＳの平均分子量は、報告（ピーターソンおよびマグローティ、１９８５年；ラエツおよびホイットフィールド、２００２年ｂ；シュミットら、２０１６年）にあるように平均３０のＯ抗原繰り返し多糖構造を仮定して、２２ｋＤａと計算した。
【0152】
表面プラズモン共鳴実験（実施例１～３）
すべてのＳＰＲ実験は、ライヘルト２ＳＰＲシステムにおいてＰＢＳ－Ｅ（ＰＢＳ ｐＨ ７．４＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）ランニングバッファーを用いて周囲温度で行なった。タンパク質を２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ ４．５中で５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＮＨＳ－ＥＤＣアミンカップリング（フィッシャー、２０１０）を用いてＣＭＤ２００センサーチップ（ザンテック・バイオアナリティックス（Ｘａｎｔｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ）、デュッセルドルフ、ドイツ）に２０００～９０００μＲＩＵの応答となるように固定化した。種々の参照化合物（エタノールアミン、ＢＳＡ、カゼインおよびスキムミルク）の比較（ペテルフィ（Ｐｅｔｅｒｆｉ）ら、２０００）の後に、すべての実験のための参照チャンネル用の標準コーティングとしてエタノールアミンを選んだ。
すべてのＳＰＲ実験は、ライヘルト２ＳＰＲシステムにおいてＰＢＳ－Ｅ（ＰＢＳ ｐＨ ７．４＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）ランニングバッファーを用いて周囲温度で行なった。タンパク質を２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ ４．５中で５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＮＨＳ－ＥＤＣアミンカップリング（フィッシャー、２０１０）を用いてＣＭＤ２００センサーチップ（ザンテック・バイオアナリティックス（Ｘａｎｔｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ）、デュッセルドルフ、ドイツ）に２０００～９０００μＲＩＵの応答となるように固定化した。種々の参照化合物（エタノールアミン、ＢＳＡ、カゼインおよびスキムミルク）の比較（ペテルフィ（Ｐｅｔｅｒｆｉ）ら、２０００）の後に、すべての実験のための参照チャンネル用の標準コーティングとしてエタノールアミンを選んだ。
【0153】
押し出し（７０℃で１００μｍフィルターを通る２１回の通過）によってすべてのリガンドをランニングバッファー中１ｍｇ／ｍＬに溶解させた。５０μＬ／分の流速で３回１組の実験を行った。各試料を測定チャンネルと参照チャンネルとの両方に９０秒間注入した後、３００秒間解離させた。再生用バッファー（０．０５％（重量／重量）ＣＨＡＰＳ、０．０５％（重量／重量）ツイッタージェント（ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３－１２、０．０５％（体積／体積）トゥイーン８０、０．０５％（体積／体積）トゥイーン２０および０．０５％（体積／体積）トライトンＸ－１００）の３０秒間の注入を２回行うことによってチップを再生した（アンデルスゾーン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）、アレスコウグ（Ａｒｅｓｋｏｕｇ）およびハーデンボルグ（Ｈａｒｄｅｎｂｏｒｇ）、１９９９年）。測定データを処理のためにトレースドローワー（ＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒ）（リッジビュー（ＲｉｄｇｅＶｉｅｗ）インストルメンツラブ（ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌａｂ））にエクスポートし、オリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）（オリジンラブ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）コーポレーション）を用いて最終的な曲線を発生させた。次式
【0154】
【数3】
【0155】
ここで、Ｓは、規格化された信号Ｓ０である、を用いて各コンストラクトについての信号をＫ９に規格化した。
【0156】
表面プラズモン共鳴実験（実施例４および５）
ＰＢＳ－Ｅ（ＰＢＳ ｐＨ７．４＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）ランニングバッファーを用いてニコヤ（Ｎｉｃｏｙａ）オープンＳＰＲ（ＯｐｅｎＳＰＲ）システム上、周囲温度でＳＰＲ実験を行なった。ＳａｄＡ Ｋ９を１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５中で５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＮＨＳ－ＥＤＣアミンカップリング（フィッシャー、２０１０年）を用いて７００ＲＵの応答となるようにカルボキシセンサー（オープンＳＰＲ）に固定化した。
ＰＢＳ－Ｅ（ＰＢＳ ｐＨ７．４＋５ｍＭ ＥＤＴＡ）ランニングバッファーを用いてニコヤ（Ｎｉｃｏｙａ）オープンＳＰＲ（ＯｐｅｎＳＰＲ）システム上、周囲温度でＳＰＲ実験を行なった。ＳａｄＡ Ｋ９を１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５中で５０μｇ／ｍＬに希釈し、ＮＨＳ－ＥＤＣアミンカップリング（フィッシャー、２０１０年）を用いて７００ＲＵの応答となるようにカルボキシセンサー（オープンＳＰＲ）に固定化した。
【0157】
押し出し（７０℃で１００μｍフィルターを通る２１回の通過）によってすべてのリガンドをランニングバッファー中１ｍｇ／ｍＬに溶解させた。３５μＬ／分の流速で３回１組の実験を行った。各試料を測定チャンネルと参照チャンネルとの両方に１２５秒間注入した後、３００秒間解離させた。再生用バッファー（０．０５％（重量／重量）ＣＨＡＰＳ、０．０５％（重量／重量）ツイッタージェント３－１２、０．０５％（体積／体積）トゥイーン８０、０．０５％（体積／体積）トゥイーン２０および０．０５％（体積／体積）トライトンＸ－１００）（アンデルスゾーンら、１９９９）の１２５秒間の注入によってチップを再生させた。測定データを処理のためにトレースドローワー（リッジビューインスツルメンツラブ）にエクスポートし、オリジン（オリジンラブコーポレーション）を用いて最終的なグラフを発生させた。
【0158】
電子顕微鏡法
測定用グリッドに試料を付着させ、１％酢酸ウラニルで１分間染色し、１．８％メチルセルロース／０．４％酢酸ウラニル中に埋め込んだ。オリンパスクエメサ（Ｑｕｅｍｅｓａ）カメラを用いてフィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＣＭ１００透過型電子顕微鏡における８０ｋＶでの像を記録した。
測定用グリッドに試料を付着させ、１％酢酸ウラニルで１分間染色し、１．８％メチルセルロース／０．４％酢酸ウラニル中に埋め込んだ。オリンパスクエメサ（Ｑｕｅｍｅｓａ）カメラを用いてフィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）ＣＭ１００透過型電子顕微鏡における８０ｋＶでの像を記録した。
【0159】
リムルスアメボサイト溶解液（ＬＡＬ）アッセイ
ＬＡＬ－アッセイ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））を用いてＬＰＳに対するＧＣＮ４－ＰＩＩのマスキング効果を試験した。２００μｇ／ｍＬ～２０ｐｇ／ｍＬの範囲のＧＣＮ４－ＰＩＩ濃度にｍＬ ＬＰＳあたり０．５エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍＬ）をスパイクし、提供されたプロトコルに従って現像した。
ＬＡＬ－アッセイ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、サーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））を用いてＬＰＳに対するＧＣＮ４－ＰＩＩのマスキング効果を試験した。２００μｇ／ｍＬ～２０ｐｇ／ｍＬの範囲のＧＣＮ４－ＰＩＩ濃度にｍＬ ＬＰＳあたり０．５エンドトキシン単位（ＥＵ／ｍＬ）をスパイクし、提供されたプロトコルに従って現像した。
【0160】
円偏光二色性
ジャスコＪ－８１０分光旋光計（ジャスコインタナショナル株式会社）を用いてスペクトルを記録した。１．０ｃｍ光路長石英セルを用いて測定を行った。０．５ｎｍのバンド幅で５０ｎｍ／分のスキャン速度を用い、１９０～２５０ｎｍの範囲で各試料を５回スキャンした。１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中３７℃において、ＬＰＳに対するＧＣＮ４－ｐＩＩの比０、０．５、１、３および９でスペクトルを記録した。Ｋ２Ｄ２を用いてペプチドの近似的なα－ヘリックス含量を計算した。
ジャスコＪ－８１０分光旋光計（ジャスコインタナショナル株式会社）を用いてスペクトルを記録した。１．０ｃｍ光路長石英セルを用いて測定を行った。０．５ｎｍのバンド幅で５０ｎｍ／分のスキャン速度を用い、１９０～２５０ｎｍの範囲で各試料を５回スキャンした。１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４中３７℃において、ＬＰＳに対するＧＣＮ４－ｐＩＩの比０、０．５、１、３および９でスペクトルを記録した。Ｋ２Ｄ２を用いてペプチドの近似的なα－ヘリックス含量を計算した。
【0161】
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法
５０ｍＭ ＮａＣｌ中１．５ｍＭ合成ＦＭｅｔ－ＧＣＮ４－ＰＩＩ（ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、中国）、７％Ｄ２Ｏおよび０．２ｍＭの４，４－ジメチル－４－シラペンタン－スルホン酸（ＤＳＳ）４５０μＬを収容するベル－アート（Ｂｅｌ－Ａｒｔ）（商標）ＳＰサイエンスウェア（Ｓｃｉｅｎｃｗａｒｅ）（商標）５ｍｍ外径シンウォールドプレシジョンＮＭＲチューブ中で帰属のためのＮＭＲ実験を行った。５ｍｍ １Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ－クライオプローブ（ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ）を備えたブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）アバンス（Ａｖａｎｃｅ）ＩＩ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計上３０８Ｋでスペクトルを取得した。ＤＳＳを内部化学シフト標準として用い、記載されている周波数比（ウィシャート（Ｗｉｓｈａｒｔ）ら、１９９５年）を用いて１３Ｃおよび１５Ｎを参照した。帰属を目的として以下のスペクトルを集めた。６０および８０ｍｓのミキシングタイムを用いる１３Ｃ－１Ｈ－ＨＳＱＣ、１５Ｎ－１Ｈ－ＨＳＱＣ、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ、１Ｈ－１Ｈ ＴＯＣＳＹならびに８０および１００ｍｓのミキシングタイムを用いる１Ｈ－１Ｈ ＮＯＥＳＹ。トップスピン（Ｔｏｐｓｐｉｎ）４．０を用いてすべてのスペクトルを処理し、カラ（ＣＡＲＡ）１．９．１（ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）、２００４年）を用いてピークを選択した。
５０ｍＭ ＮａＣｌ中１．５ｍＭ合成ＦＭｅｔ－ＧＣＮ４－ＰＩＩ（ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、中国）、７％Ｄ２Ｏおよび０．２ｍＭの４，４－ジメチル－４－シラペンタン－スルホン酸（ＤＳＳ）４５０μＬを収容するベル－アート（Ｂｅｌ－Ａｒｔ）（商標）ＳＰサイエンスウェア（Ｓｃｉｅｎｃｗａｒｅ）（商標）５ｍｍ外径シンウォールドプレシジョンＮＭＲチューブ中で帰属のためのＮＭＲ実験を行った。５ｍｍ １Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ－クライオプローブ（ｃｒｙｏｐｒｏｂｅ）を備えたブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）アバンス（Ａｖａｎｃｅ）ＩＩ ６００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計上３０８Ｋでスペクトルを取得した。ＤＳＳを内部化学シフト標準として用い、記載されている周波数比（ウィシャート（Ｗｉｓｈａｒｔ）ら、１９９５年）を用いて１３Ｃおよび１５Ｎを参照した。帰属を目的として以下のスペクトルを集めた。６０および８０ｍｓのミキシングタイムを用いる１３Ｃ－１Ｈ－ＨＳＱＣ、１５Ｎ－１Ｈ－ＨＳＱＣ、１Ｈ－１Ｈ ＣＯＳＹ、１Ｈ－１Ｈ ＴＯＣＳＹならびに８０および１００ｍｓのミキシングタイムを用いる１Ｈ－１Ｈ ＮＯＥＳＹ。トップスピン（Ｔｏｐｓｐｉｎ）４．０を用いてすべてのスペクトルを処理し、カラ（ＣＡＲＡ）１．９．１（ケラー（Ｋｅｌｌｅｒ）、２００４年）を用いてピークを選択した。
【0162】
ビオチン－ＬＰＳ（Ｂ－ＬＰＳ）利用ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳバッファー中１０μｇ／ｍＬ ＳａｄＡ Ｋ９（コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ））１００μｌを４℃で一晩インキュベートすることによってブラック９６ウェルグレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）マイクロプレートにコートした。翌日、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１５０μＬをインキュベートすることによってウェルをブロックした。４ｎｇ／ｍＬ～０．０６ｎｇ／ｍＬの範囲のビオチン化ＬＰＳの希釈液１００μＬを結合相手として加え、１時間インキュベートした。プレートを１５０μＬのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回、１００μＬの１：１０ ０００ストレプタクチン接合セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＩＢＡ）で１時間洗い、クァンタレッド（ＱｕａｎｔａＲｅｄ）蛍光基質（サーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）で１５分間現像し、Ｅｘ：５５０ｎｍ、Ｅｍ：６１０ｎｍで蛍光を読み取った。
ＰＢＳバッファー中１０μｇ／ｍＬ ＳａｄＡ Ｋ９（コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ））１００μｌを４℃で一晩インキュベートすることによってブラック９６ウェルグレイナー（Ｇｒｅｉｎｅｒ）マイクロプレートにコートした。翌日、ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１５０μＬをインキュベートすることによってウェルをブロックした。４ｎｇ／ｍＬ～０．０６ｎｇ／ｍＬの範囲のビオチン化ＬＰＳの希釈液１００μＬを結合相手として加え、１時間インキュベートした。プレートを１５０μＬのＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで３回、１００μＬの１：１０ ０００ストレプタクチン接合セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＩＢＡ）で１時間洗い、クァンタレッド（ＱｕａｎｔａＲｅｄ）蛍光基質（サーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）で１５分間現像し、Ｅｘ：５５０ｎｍ、Ｅｍ：６１０ｎｍで蛍光を読み取った。
【0163】
プロトコル
１．１０μｇ／ｍＬ ＳａｄＡフラグメント溶液１００μＬを加え、４℃で一晩置くことによって９６ウェルブラックグレイナー／ヌンクマキシソーププレートにコートする。
２．ウェルを空にし、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ １５０μＬで２時間ブロックする。
３．ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ １５０μＬで３回洗う。
４．ウェルを空にし、ビオチン化ＬＰＳ希釈液１００μＬを加える。
５．ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ １５０μｌで３回洗う。
６．６０分間１００μＬ ストレプ－タクチン接合ＨＲＰ（ＩＢＡ）（ＰＢＳ＋０．３５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＢＳＡ中の１：２０，０００希釈物）を加える。
７．ＰＢＳ＋０．３５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＢＳＡ １５０μＬで４回、次にＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで１回洗う。
８．クァンタレッドＨＲＰ－基質とともにインキュベートし、１５分後に反応停止する。
９．励起波長：５５０ｎｍ、発光波長：６１０ｎｍで蛍光を読み取る。
１．１０μｇ／ｍＬ ＳａｄＡフラグメント溶液１００μＬを加え、４℃で一晩置くことによって９６ウェルブラックグレイナー／ヌンクマキシソーププレートにコートする。
２．ウェルを空にし、ＰＢＳ中５％ＢＳＡ １５０μＬで２時間ブロックする。
３．ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ １５０μＬで３回洗う。
４．ウェルを空にし、ビオチン化ＬＰＳ希釈液１００μＬを加える。
５．ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ １５０μｌで３回洗う。
６．６０分間１００μＬ ストレプ－タクチン接合ＨＲＰ（ＩＢＡ）（ＰＢＳ＋０．３５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＢＳＡ中の１：２０，０００希釈物）を加える。
７．ＰＢＳ＋０．３５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％ＢＳＡ １５０μＬで４回、次にＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡで１回洗う。
８．クァンタレッドＨＲＰ－基質とともにインキュベートし、１５分後に反応停止する。
９．励起波長：５５０ｎｍ、発光波長：６１０ｎｍで蛍光を読み取る。
【0164】
すべての基質を売り手の指示に従って調製した。信号からバックグラウンドを減じる場合、繰り返しについての個々の標準偏差を直交座標のベースラインに加えることによって誤差の伝播率を計算した（δＱ＝√（δａ2＋δｂ2＋・・・＋δｚ2）、ここで、δＱは、和Ｑの組み合わせの不確定性である）。エラーバーは、１つの標準偏差を表す。
【0165】
実施例１ ― ＧＣＮ４－ＰＩＩはリピドＡと結合する
ＬＰＳと三量体オートトランスポーターアドヘシンＳａｄＡに属する２つのドメインとの間で推定される相互作用を調べることを意図した。既に記載されている２種類のＳａｄＡコンストラクト（アルバレスら、２００８年；ハートマンら、２０１２年）であって、ともにフランキングＧＣＮ４－ＰＩＩセグメントによって安定化されているＫ９およびＫ１４を用いた。Ｋ９またはＫ１４を共有結合によってＳＰＲチップに繋ぎ、様々なＬＰＳ成分を注入した。参照用にＬＰＳの構造の概略版を図２において提供する。
ＬＰＳと三量体オートトランスポーターアドヘシンＳａｄＡに属する２つのドメインとの間で推定される相互作用を調べることを意図した。既に記載されている２種類のＳａｄＡコンストラクト（アルバレスら、２００８年；ハートマンら、２０１２年）であって、ともにフランキングＧＣＮ４－ＰＩＩセグメントによって安定化されているＫ９およびＫ１４を用いた。Ｋ９またはＫ１４を共有結合によってＳＰＲチップに繋ぎ、様々なＬＰＳ成分を注入した。参照用にＬＰＳの構造の概略版を図２において提供する。
【0166】
スムースＬＰＳの注入は直ちに応答を生じ、応答は、注入の終了に向かって定常状態に近づいた（図３ａ）。次の解離段階時に、信号は、プラトーにとどまり、オフ速度がないことを示した。ラフＬＰＳ変異形およびディープラフＬＰＳ変異形の注入（図３ｂおよび３ｃ）は、解離段階時の信号の若干の上昇を除いて同様な結合曲線を示し、その一方で精製された多糖は、結合特性を示さなかった（図３ｄ）。
【0167】
これらの結果は、リピドＡ部分を含有するすべての変異形がＧＣＮ４－ＰＩＩに強く結合するが、純多糖は結合せず、従って相互作用をリピドＡ部分に局所化することを示した。しかし、オフ速度がないことと、溶液中で凝集体を形成するＬＰＳの傾向（ササキ（Ｓａｓａｋｉ）およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ）、２００８年；リヒター（Ｒｉｃｈｔｅｒ）ら、２０１１年）とは、この相互作用の生物物理特性のキャラクタリゼーションが潜在的に複雑であり、これらの結果を定性的にしか解釈することができないことを意味した。ＬＰＳのラフ変異形およびディープラフ変異形の注入後の信号の増加は、各変異形中に存在する糖残基の数に反比例すると考えられる。特に、ディープラフＬＰＳは、顕著により高い疎水性対親水性の比を有し、より長い糖部分を有するＬＰＳと比較してより大きな、流動性のより少ない形態となる（リヒターら、２０１１年）。従って、注入後の信号増大は、スムース変異形と比較してより遅いディープラフ凝集体の再組織化および分解に起因すると解釈された。
【0168】
非特異的結合に起因して精製時にエンドトキシン欠乏効果を有することが暗に示された（マック（Ｍａｃｋ）ら、２０１４年）６×Ｈｉｓ－タグを用いてコンストラクトを精製した。結合に対するＨｉｓ－タグの効果を評価するために、Ｈｉｓ－タグを除けば同一である、ＧＣＮ４－ｐＩＩで挟まれた２種類のＳａｄＡコンストラクト（Ｋ３およびＫ３－Ｈｉｓ）を比較した。これらのコンストラクトは、互いに、かつ従来のコンストラクトに対してほとんど同一の曲線を示し、Ｈｉｓ－タグが結合に影響を及ぼさないことを示した（図１０）。
【0169】
ＧｃＮ４－ＰＩＩとＬＰＳとの間の相互作用の性質は、疎水的であるか、静電的であるか、または両方の組み合わせであるかを考えた。再生溶液の選択がこれを決定する助けとなった。実験の前に適当な再生用バッファーを試験する過程において、１Ｍ ＮａＣｌは効果がないが、０．３％までの非変性型界面活性剤の混合物は６０秒未満で試料を再生させることが見いだされた。この結果は、相互作用の中に強い疎水的な因子が含まれることを示した。
【0170】
実施例２ ― ＧＣＮ４－ＰＩＩは高い親和力で結合する
ＳＰＲ結果は、ＧＣＮ４－ｐＩＩ／ＬＰＳ相互作用の結合速度を決定するには適していなかった。親和力を定量するために、精製されたタンパク質を細菌全体の代りに用いることによって既に記載されているＥＬＩＳＡ様テールスパイク吸着（ＥＬＩＴＡ）アッセイ（シュミットら、２０１６年）を修正した。このアッセイは、ＬＰＳのＯ抗原を認識するファージテールスパイクタンパク質で抗体を置き換えたことを除けば従来法のＥＬＩＳＡと同様であった（図１１）。結果は、両方のコンストラクトが低ｐＭ範囲において、極めて高い結合親和力を示すことを示し、これは、ＳＰＲ実験において観測されたオフ速度なしと一致する（図５）。この構成は、修正しなかったら解釈を複雑にしただろうスムースＬＰＳの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満のＬＰＳ濃度の使用（ユウ（Ｙｕ）ら、２００６；ササキおよびホワイト、２００８年）を可能にするので有利であることが証明された。しかし、ブロッキングの前にマイクロタイターウェルをコートするＬＰＳの傾向に起因して、間接的なリガンド－受容体相互作用構成は、可能でなかった。
ＳＰＲ結果は、ＧＣＮ４－ｐＩＩ／ＬＰＳ相互作用の結合速度を決定するには適していなかった。親和力を定量するために、精製されたタンパク質を細菌全体の代りに用いることによって既に記載されているＥＬＩＳＡ様テールスパイク吸着（ＥＬＩＴＡ）アッセイ（シュミットら、２０１６年）を修正した。このアッセイは、ＬＰＳのＯ抗原を認識するファージテールスパイクタンパク質で抗体を置き換えたことを除けば従来法のＥＬＩＳＡと同様であった（図１１）。結果は、両方のコンストラクトが低ｐＭ範囲において、極めて高い結合親和力を示すことを示し、これは、ＳＰＲ実験において観測されたオフ速度なしと一致する（図５）。この構成は、修正しなかったら解釈を複雑にしただろうスムースＬＰＳの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満のＬＰＳ濃度の使用（ユウ（Ｙｕ）ら、２００６；ササキおよびホワイト、２００８年）を可能にするので有利であることが証明された。しかし、ブロッキングの前にマイクロタイターウェルをコートするＬＰＳの傾向に起因して、間接的なリガンド－受容体相互作用構成は、可能でなかった。
【0171】
実施例３ ― ＧＣＮ４－ｐＩＩはＬＰＳ凝集体を溶解させる
ＧＣＮ４－ＰＩＩをＬＰＳに加えるとＬＰＳ凝集体の目に見える分解を引き起こすことが観測された。透過型電子顕微鏡を用いて種々のＧＣＮ４－ｐＩＩ比におけるラフＬＰＳの構造を比較することによってこの現象を調べた（図６）。実験の前に、ＬＡＬマスキングアッセイ（シュヴァルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら、２０１７年）、円偏光二色性およびＮＭＲを用いて、合成ＧＣＮ４－ｐＩＩはＬＰＳに結合し、そのα－ヘリックス構造を保持することを確認した。ＮＭＲスペクトルは、このペプチドが相同なα－ヘリックス状態（図１４）で存在し、この状態がＬＰＳ結合しても保持され（図１２）、１μＭのＧＣＮ４－ｐＩＩ濃度においてＬＰＳに対して少なくとも８９％の中和化効果（結合）を示す（図１３）ことを確認した。
ＧＣＮ４－ＰＩＩをＬＰＳに加えるとＬＰＳ凝集体の目に見える分解を引き起こすことが観測された。透過型電子顕微鏡を用いて種々のＧＣＮ４－ｐＩＩ比におけるラフＬＰＳの構造を比較することによってこの現象を調べた（図６）。実験の前に、ＬＡＬマスキングアッセイ（シュヴァルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）ら、２０１７年）、円偏光二色性およびＮＭＲを用いて、合成ＧＣＮ４－ｐＩＩはＬＰＳに結合し、そのα－ヘリックス構造を保持することを確認した。ＮＭＲスペクトルは、このペプチドが相同なα－ヘリックス状態（図１４）で存在し、この状態がＬＰＳ結合しても保持され（図１２）、１μＭのＧＣＮ４－ｐＩＩ濃度においてＬＰＳに対して少なくとも８９％の中和化効果（結合）を示す（図１３）ことを確認した。
【0172】
ラフＬＰＳは、既にクライオ‐ＥＭによって報告された（リヒター（Ｒｉｃｈｔｅｒ）ら、２０１１年；ブレーカー（Ｂｒｏｅｋｅｒ）ら、２０１８年）ように、１０ｎｍ前後の半径と最大数１００ｎｍの範囲の長さとを有する管状ミセル（図６、上）を形成することがＴＥＭによって観測された。等モル濃度のＧＣＮ４－ＰＩＩとのインキュベーション後に、ミセル構造は完全に消失し、おそらくペプチド－ＬＰＳ複合体の若干の凝集によって引き起こされる時折の凝集体が残った（図６、下）。
【0173】
結果の考察（実施例１～３）
三量体ＳａｄＡドメインとＬＰＳとの間で推定される相互作用を調べることを初めて試みた。しかしながら、本発明者らの結果は、本発明者らのコンストラクトを安定化するために用いたＧＣＮ４－ｐＩＩアダプターが極めて高いＬＰＳへの親和力を表すことを示している。興味深いことに、ピコモル濃度の範囲のＫDを有するＧＣＮ４－ｐＩＩの親和力は、ヒトＬＰＳ免疫受容体ＴＬＲ４（１４１μＭ）、ＣＤ１４（７４ｎＭ）、ＭＤ－２（２．３３μＭ）およびＬＰＳ結合タンパク質（３．５ｎＭ）より３～５桁高い。本発明者らがＧＣＮ４－ｐＩＩで得た解離定数もポリミキシンＢ（４８μＭ）や、達成可能な最も高い親和力を目的として特に設計されたペプチドアビボディと比べても１～６桁高い。そのうえ、上述の結合相手のいくつかとは対照的に、本発明者らは、ＧＣＮ４－ｐＩＩがリピドＡに特異的であることを示した。本発明者らは、界面活性剤を用いてこの相互作用が可逆的であることと、ＧＣＮ４－ｐＩＩが溶液中でＬＰＳ凝集体を容易に分解させることとを実証し、相互作用は大部分が疎水的であることを示した。本発明者らが知る限り、本出願は、ＬＰＳに結合する三量体コイルドコイルモチーフの初めての報告である。既に報告されたＧＣＮ４－ｐＩＩ含有結晶構造（ハートマンら、２０１２年）は、コアイソロイシンに属するγ２およびδ－炭素がコアから突き出し、コイルドコイルグルーブに沿って疎水性表面を形成することを示している。リピドＡアシル鎖の１つ以上が極めて強い相互作用を形成するようにこれらのグルーブに沿って並ぶことができるという、ＧＣＮ４－ｐＩＩがどのようにＬＰＳ凝集体を分解することができるかも説明するモデルが想定可能である。しかし、ＧＣＮ４－ｐＩＩは、陽イオン残基のＣ末端パッチも有し、これらも相互作用に寄与し得る。
三量体ＳａｄＡドメインとＬＰＳとの間で推定される相互作用を調べることを初めて試みた。しかしながら、本発明者らの結果は、本発明者らのコンストラクトを安定化するために用いたＧＣＮ４－ｐＩＩアダプターが極めて高いＬＰＳへの親和力を表すことを示している。興味深いことに、ピコモル濃度の範囲のＫDを有するＧＣＮ４－ｐＩＩの親和力は、ヒトＬＰＳ免疫受容体ＴＬＲ４（１４１μＭ）、ＣＤ１４（７４ｎＭ）、ＭＤ－２（２．３３μＭ）およびＬＰＳ結合タンパク質（３．５ｎＭ）より３～５桁高い。本発明者らがＧＣＮ４－ｐＩＩで得た解離定数もポリミキシンＢ（４８μＭ）や、達成可能な最も高い親和力を目的として特に設計されたペプチドアビボディと比べても１～６桁高い。そのうえ、上述の結合相手のいくつかとは対照的に、本発明者らは、ＧＣＮ４－ｐＩＩがリピドＡに特異的であることを示した。本発明者らは、界面活性剤を用いてこの相互作用が可逆的であることと、ＧＣＮ４－ｐＩＩが溶液中でＬＰＳ凝集体を容易に分解させることとを実証し、相互作用は大部分が疎水的であることを示した。本発明者らが知る限り、本出願は、ＬＰＳに結合する三量体コイルドコイルモチーフの初めての報告である。既に報告されたＧＣＮ４－ｐＩＩ含有結晶構造（ハートマンら、２０１２年）は、コアイソロイシンに属するγ２およびδ－炭素がコアから突き出し、コイルドコイルグルーブに沿って疎水性表面を形成することを示している。リピドＡアシル鎖の１つ以上が極めて強い相互作用を形成するようにこれらのグルーブに沿って並ぶことができるという、ＧＣＮ４－ｐＩＩがどのようにＬＰＳ凝集体を分解することができるかも説明するモデルが想定可能である。しかし、ＧＣＮ４－ｐＩＩは、陽イオン残基のＣ末端パッチも有し、これらも相互作用に寄与し得る。
【0174】
実施例４ ― ＧＣＮ４－ｐＩＩ利用ＥＬＩＳＡの感度
この実施例の目的は、原理的に、本出願においてＧＣＮ４－ｐＩＩで示される、ＬＰＳへのオリゴマータンパク質の結合は、ＬＡＬアッセイと同等また同様な感度でＬＰＳ量を検出することができることを示すことであった。実施例１～３におけるように、ＳａｄＡ利用コンストラクト、特に上記に記載のＫ９コンストラクトを用いた。
この実施例の目的は、原理的に、本出願においてＧＣＮ４－ｐＩＩで示される、ＬＰＳへのオリゴマータンパク質の結合は、ＬＡＬアッセイと同等また同様な感度でＬＰＳ量を検出することができることを示すことであった。実施例１～３におけるように、ＳａｄＡ利用コンストラクト、特に上記に記載のＫ９コンストラクトを用いた。
【0175】
このアッセイの完全な再現性を確実にするために、最適化された最終的な条件を用いて４回繰り返しで感度実験を行なった。エッジ効果を打ち消すために、内部のランダム化したウェルだけを用いた。唯一の例外は、もっとも高い濃度の試料用に確保したＡ３：Ａ１０であった。比較のために、続いて同じ試料をＬＡＬアッセイで測定した。繰り返しの１つだけを結果に含めた。
【0176】
ビオチン化ＬＰＳ（Ｂ－ＬＰＳ）を検出のために用いるＧＣＮ４－ｐＩＩ利用ＥＬＩＳＡ（図１５）において、０．０６～１ｎｇ／ｍＬのＬＰＳ濃度範囲内で線形の信号応答が観測された。これは、このアッセイが最も低濃度の希釈物（０．０６ｎｇ／ｍＬ）まで一貫してＢ－ＬＰＳを検出することができることを意味する。
【0177】
比較のためにＬＡＬアッセイも行なった。ＬＡＬアッセイにおいて用いたＬＰＳの濃度範囲は、０．０１～０．１ＥＵ／ｍＬであった。明確な信号を与えた最も低い濃度の希釈液は、０，１３ｎｇ／ｍＬ（図１６）であった。これは、ＧＮＣ４－ｐＩＩ利用アッセイがＬＡＬアッセイと同程度の感度を有することを意味する。これら２つのアッセイの結果の比較を図１７に示す。
【0178】
実施例５ ― ＧＣＮ４－ｐＩＩとＬＰＳとの間の結合の強さ
ＧＣＮ４－ｐＩＩと種々のＬＰＳタイプとの間の結合の強さを検討するために、様々な病原体およびプロテオバクテリア（表４）から集めた広範な選択のＬＰＳ－変異形をチェックするべくＳＰＲを用いた。要約すると、ＥＤＣ－ＮＨＳ利用アミンカップリングを用いてＳＰＲチップ上のカルボキシルマトリックスにＫ９を固定化した。信号を観測するために０．５ｍｇ／ｍＬで種々のＬＰＳタイプを３回繰り返しで注入した。
ＧＣＮ４－ｐＩＩと種々のＬＰＳタイプとの間の結合の強さを検討するために、様々な病原体およびプロテオバクテリア（表４）から集めた広範な選択のＬＰＳ－変異形をチェックするべくＳＰＲを用いた。要約すると、ＥＤＣ－ＮＨＳ利用アミンカップリングを用いてＳＰＲチップ上のカルボキシルマトリックスにＫ９を固定化した。信号を観測するために０．５ｍｇ／ｍＬで種々のＬＰＳタイプを３回繰り返しで注入した。
【0179】
【表5】
【0180】
以前の検討において、本発明者らは、γ－プロテオバクテリア、すなわちＳ．エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）、Ｓ．アナツム（Ｓ．ａｎａｔｕｍ）および大腸菌ＢＬ２１から供給されるＬＰＳの結合を比較した。ＬＰＳの注入は、即座に応答を与え、この応答は、注入の終了に向かって定常状態に近づいた。それに続く解離段階時に、信号は、プラトーにとどまり、測定可能なオフ速度がないことを示した。種々の曲線の形状は非常に類似していたが、最終的な応答（μＲＩＵ）は、互いの間でＬＰＳ分子あたりの糖部分の量と逆相関して変化した。これは、ラフＬＰＳタイプ（Ｏ抗原が欠けている）は、典型的にはスムースな対応物（Ｏ抗原繰り返しを有する）と比較して顕著に強い信号を与えたことを意味する。すべてのＬＰＳタイプを同じ重量濃度（ｍｇ／ｍＬ）で注入したので、応答の差は、おそらく高分子量変異形のより低いモル濃度を反映していた。
【0181】
本発明者らが本発明の検討においてチェックしたＬＰＳタイプの結合曲線（図１８）はすべて、オフ速度のない同様な結合曲線を共有して、強い結合を示す。Ｓ．ティフィムリウムＷａａＬ ＬＰＳは、ラフタイプであり、注入されるとやや高い応答を与えると予測される。Ｎ．ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）およびＢ．ヘンセラ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ）は、両方が大きなラフ変異形であり、ＷａａＬと同じ範囲の応答を与えると予測されたが、Ｎ．ラクタミカは、ほとんど２倍であった大きさの応答を与え、これはコア糖への大量のシアル酸修飾形によって説明することができる。Ｖ．コレラエ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）は、ラフＬＰＳと低分子量スムースＬＰＳとの混合物を有する。従って、ＷａａＬ信号の１／３前後の応答は意外であった。Ｐ．ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）ＬＰＳの応答は低く、中から大のスムースＬＰＳタイプを示唆した。市販のＰ．ジンジバリスＬＰＳに添付されている書類は、菌株または変異形の名称を掲げていなかったので、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって重量を確かめなければならない。
【0182】
結論として、ＧＣＮ４－ｐＩＩは試験したすべてのＬＰＳタイプに結合した。
【0183】
結果の考察（実施例４および５）
ＬＡＬアッセイは、少量のＬＰＳに対して高感度であるカブトガニの血液中の酵素カスケードを使用する（リー（Ｌｅｅ）、２００７年）。直接の比較においてＬＡＬアッセイを用いて、本発明者らは、ＧＣＮ４－ｐＩＩペプチドがＬＡＬアッセイでかろうじて検出可能な濃度のビオチン化ＬＰＳに結合することができることと、それでも、蛍光酵素基質とカップリングされたビオチンのための日常的な検出方法を用いたとき、この結合が結果として目に見える信号を生むことと、を示すことができた。重要な点として、この検出方法は、種々のバッファーバックグラウンドで、また、注射可能な薬物バックグラウンドで機能した。本発明は、ＬＡＬアッセイと同程度である０．０１ ＥＵ／ｍＬ ＬＰＳの感度を実現し、本発明のデータは、例えば洗浄用バッファー条件を微調整することによって、本発明のＥＬＩＳＡ様アッセイでもっと高い感度さえ実現することができることを示唆している。
ＬＡＬアッセイは、少量のＬＰＳに対して高感度であるカブトガニの血液中の酵素カスケードを使用する（リー（Ｌｅｅ）、２００７年）。直接の比較においてＬＡＬアッセイを用いて、本発明者らは、ＧＣＮ４－ｐＩＩペプチドがＬＡＬアッセイでかろうじて検出可能な濃度のビオチン化ＬＰＳに結合することができることと、それでも、蛍光酵素基質とカップリングされたビオチンのための日常的な検出方法を用いたとき、この結合が結果として目に見える信号を生むことと、を示すことができた。重要な点として、この検出方法は、種々のバッファーバックグラウンドで、また、注射可能な薬物バックグラウンドで機能した。本発明は、ＬＡＬアッセイと同程度である０．０１ ＥＵ／ｍＬ ＬＰＳの感度を実現し、本発明のデータは、例えば洗浄用バッファー条件を微調整することによって、本発明のＥＬＩＳＡ様アッセイでもっと高い感度さえ実現することができることを示唆している。
【0184】
本発明は、α－プロテオバクテリア～γ－プロテオバクテリアの範囲のプロテオバクテリアの種々の系統群ならびにバクテロイデテス門（図１９）由来のＬＰＳ変異形を使用した。本発明の選択細菌は、腸管病原体（ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ属、大腸菌）、細胞内病原体（バルトネラ・ヘンセラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ））および口腔病原体（ポルフィノモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ））ならびに共生細菌（ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ））を包含する。使用される種の１つは、強い免疫応答を誘発しないＬＰＳ変異形を有することが知られている（バルトネラ・ヘンセラ）（ツェーリンガー（Ｚａｅｈｒｉｎｇｅｒ）ら、２００４年）。
【0185】
図１９に示されるツリーにおいてサルモネラ属は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属とともに配置され、別々には示されていない。なお、この図において、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）属は、表示されたブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）に最も近く、ポルフィノモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）は、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の一部である。さらに、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、アクチノバクテリア門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）およびスピロヘータ門（Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ）の大きな群は、膜成分の一部としてのＬＰＳを有しない。
【0186】
まとめると、ＳＰＲを使用して、本発明は、使用したすべてのＬＰＳ変異形がＧＣＮ４－ｐＩＩペプチドに強く結合することを示すことができた。ＬＰＳ変異形の何れについても結合の「オン速度」には目に見える差があったが、検出可能な「オフ速度」がなく、このペプチドは、これらの変異形のすべてを同じように（結合速度にわずかな差はあったが）検出することができることを示唆した。
【0187】
参考文献
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Alvarez, B. H. et al. (2008) 'A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors', Protein Engineering Design & Selection, 21(1), pp. 11－18. doi: DOI 10.1093/protein/gzm071.
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】