特表 2023-531324 キシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-21

(54)【発明の名称】キシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/18 20060101AFI20230713BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20230713BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230713BHJP

【ＦＩ】

C12P7/18

C12P19/02

C12N1/21

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023509790

(86)(22)【出願日】2021-11-30

(85)【翻訳文提出日】2023-02-10

(86)【国際出願番号】 CN2021134586

(87)【国際公開番号】W WO2022142969

(87)【国際公開日】2022-07-07

(31)【優先権主張番号】202011606471.9

(32)【優先日】2020-12-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520401745

【氏名又は名称】浙江▲華▼康葯▲業▼股▲フン▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＨＵＡＫＡＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(71)【出願人】

【識別番号】515126422

【氏名又は名称】浙江工▲業▼大学

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】曽 徐浩

(72)【発明者】

【氏名】羅 家星

(72)【発明者】

【氏名】王 静

(72)【発明者】

【氏名】胡 昌輝

(72)【発明者】

【氏名】方 順成

(72)【発明者】

【氏名】柳 志強

(72)【発明者】

【氏名】蔡 雪

(72)【発明者】

【氏名】張 曉健

(72)【発明者】

【氏名】鄭 裕国

(72)【発明者】

【氏名】李 勉

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AC05

4B064AF02

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC08

4B064CC24

4B064CD09

4B064CD22

4B064DA16

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065BB15

4B065BB26

4B065BB40

4B065BC10

4B065CA07

4B065CA60

(57)【要約】

本発明はキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法に関し、キシロース二次母液とキシロース濃縮液との混合液を発酵し、発酵過程で後続のグルコースの代わりにキシロース二次母液を流加することによって、発酵系中のグルコース含有量を安定にするとともに、一部のキシロースを提供し、このように、グルコースの使用量を減少させ、コストを低下させるだけではなく、系のキシロースを安定的に維持し、全転化率を向上させる。本発明では、混合発酵や流加などで添加されるキシロース二次母液によって発酵系中アラビノース、マンノースなどの不純物である糖の含有量を常に発酵菌株により代謝可能な範囲にし、後続の精製を容易にし、しかもキシリトールの純度を向上させることができる。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

キシロース加水分解液のイオン交換前液にアルカリ液を添加し、その後活性炭で脱色し、脱色終了後、濾過して精製キシロース液を得て、次に、濃縮液の光屈折が約６０％～６５％となるまで低温真空濃縮を行い、キシロース濃縮液を得る、キシロース濃縮液を製造するステップ１と、
組換え大腸菌株ＩＳ５－Ｍを利用して、ＬＢプレート及びＬＢ液体培地で菌株を活性化し、シード培地に接種し、ＯＤ_６００＝５～６となるまで培養し、シード液を得る、菌株を活性化しシード液を製造するステップ２と、
発酵タンクに殺菌後の発酵培地を添加して、シード液を加え、ＯＤ_６００＞２０となるまで培養する、発酵タンクによる拡大培養のステップ３と、
キシロース濃縮液とキシロース二次母液とを所定の割合で混合した混合液を発酵タンクに加えて、流加発酵を行い、発酵系中のキシロース濃度を８５ｇ／Ｌ～９０ｇ／Ｌに維持し、系中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌよりも小さくなると、キシロース二次母液を流加し、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌに維持され、グルコースの全添加量がキシロースの質量の３５％～４０％となるように制御し、１２０ｇ～１３０ｇのコーンスティープリカー乾燥粉末溶液を用いて調製した高濃度溶液０．２Ｌ～０．５Ｌを発酵過程で流加する、第１バッチの流加発酵のステップ４と、
第１バッチの発酵においてキシロース濃度＜３０ｇ／Ｌとなると、ステップ４の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、最終発酵液のキシリトール濃度が一定になると発酵を終了する、第２バッチの流加発酵のステップ５とを含む、ことを特徴とするキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項2】

ステップ１は、具体的には、キシロース加水分解液のイオン交換前液に０．４％～０．５％のＣａ（ＯＨ）_２を添加し、３０ｒｐｍ～５０ｒｐｍで１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ撹拌し、ｐＨ３．０～３．５に制御し、その後活性炭を０．３％～０．５％の質量比で添加して脱色し、温度を６０℃～７０℃に制御して、３０ｒｐｍ～６０ｒｐｍで６０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ撹拌することを含むことを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項3】

ステップ１では、低温真空濃縮の条件は、真空ポンプ圧－０．０８５ＭＰａ～－０．０９５ＭＰａ、水浴温度６０℃～７０℃、回転数５０ｒｐｍ～６０ｒｐｍ、凝縮水流速１５０ｍＬ／ｍｉｎ～２００ｍＬ／ｍｉｎであることを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項4】

ステップ２では、前記菌株は組換え大腸菌ＩＳ５－Ｍであることを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項5】

ステップ２では、ＬＢ液体培地の構成成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、固体寒天１．５％～２％であり、シード培地の構成成分は、ペプトン７．５ｇ／Ｌ、酵母粉７．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項6】

ステップ３では、前記発酵培地の構成成分はグルコース１０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー乾燥粉末２４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ３ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ９ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ １ｇ／Ｌであり、前記発酵タンクの培養条件は、３７℃、４００ｒｐｍ、ｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％であることを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項7】

ステップ３では、９．５ｈ～１１ｈ培養することを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項8】

ステップ４では、前記キシロース濃縮液とキシロース二次母液との混合比が７～９：１～３であることを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項9】

ステップ４では、前記第１バッチの流加発酵の発酵条件は３０℃、ｐＨ７、溶存酸素２０％～２５％であることを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【請求項10】

総発酵時間が約７５ｈ～８５ｈであることを特徴とする請求項１に記載のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は糖アルコール製造の技術分野に関し、特にキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

キシロースを製造する過程で、トウモロコシ穂軸などの原料から、酸加水分解、脱色、イオン交換、濃縮、結晶化、遠心分離、乾燥などの工程を経て結晶キシロースが得られ、遠心分離では、大量のキシロース母液が得られ、この母液はクロマトグラフィーにより再びキシロースを抽出することができ、クロマトグラフィー分離過程で抽出残液、すなわちキシロース二次母液が同時に得られる。キシロース二次母液はグルコース、アラビノース、ガラクトース、マンノース、キシロースなどの多種類の単糖を含み、生産条件、バッチによって含有量が変動するため、合理的に利用することが困難である。現在、キシロース二次母液の多くは混合シロップとしてカラメル色素の生産に用いられており、付加価値が低い。

【0003】

現在、生物発酵法を用いてキシリトールを製造する方法は通常、ヘミセルロース加水分解液又はグルコースなどを発酵原料とし、効率の高い酵母菌又は大腸菌の遺伝子操作菌を用いて発酵を行うものであり、例えば開示番号がＣＮ１０５６７１０１３Ａ、ＣＮ１１０８３５６２１Ａ、ＣＮ１０６６６１５４０Ａの特許である。現在の発酵技術では、発酵の生産効率を満たすために、多くの場合、過程中に材料を補充する必要があり、その中の多くはグルコースを添加し、菌株の生産と発酵に必要な炭素源を提供し、これによって、発酵コストと発酵過程の制御の難度が増加し、多くの場合に発酵終点にグルコースが残留するため、発酵液の還元糖が高くなり、後続の発酵液の精製に不利である。

【0004】

開示番号ＣＮ１０１９２１８１０Ａの特許は、Ｌ－アラビノースを炭素源とすることができないカンジダを用いてキシロース母液を発酵することで、母液中のグルコース及びガラクトースを消費し、脱色、イオン交換、濃縮、結晶化などの工程により、キシリトール、Ｌ－アラビノースの混合結晶を得る。開示番号ＣＮ１０１７０５２５３Ａの特許は、アルコール酵母及びキシリトール酵母を用いてキシロース母液を順次発酵させ、エタノール、キシリトール及びアラビノース製品をそれぞれ得る。開示番号ＣＮ１０１８５７５２３Ａの特許は、キシロース母液を用いてキシリトールとアラビトールを同時に生産する。これらの研究はいずれもキシリトールの母液発酵を利用してキシリトールを調製し、キシリトールの二次母液はキシリトール母液に比べて、キシリトールの含有量が低く、約１０％（キシリトール母液は約５０％～６０％）であり、キシリトールの転化を直接に行うのに適しておらず、また、キシリトールの二次母液中の母液の固形分含有量は高く、希釈してから発酵に用いる必要があり、これによって、キシリトールの濃度をさらに下げたため、発酵液中のキシリトール濃度が低すぎて、抽出、精製の価値がない。

【0005】

以上の研究に共通の問題は、キシロース母液だけを炭素源と発酵原料とするため、発酵効率が低く、いずれもキシロース二次母液の発酵利用には適さないことである。キシロース二次母液を用いてキシリトールを製造するには、従来技術の更なる改良と向上が必要である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明が解決しようとする技術的課題は、キシロース二次母液とキシロース濃縮液を所定の割合で混合して発酵することによって、材料の初期グルコース含有量を向上させて後続のグルコース流加量を減少させ、後続のグルコースの代わりにキシロース二次母液を流加することによって、キシロース二次母液中のキシロース含有量が低く、キシリトール転化率が低く、発酵操作のステップが複雑であり、生産コストが高いという問題を解決し、これによって、キシロース二次母液の付加価値を高めるという目的を達成させるキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は以下のように達成される。

【0008】

キシロース加水分解液のイオン交換前液にアルカリ液を添加し、その後活性炭で脱色し、脱色終了後、濾過して精製キシロース液を得て、次に低温真空濃縮を行い、濃縮液の光屈折が約６０％～６５％となるまで、キシロース濃縮液を得る、キシロース濃縮液を製造するステップ１と、
組換え大腸菌株ＩＳ５－Ｍを利用して、ＬＢプレート及びＬＢ液体培地で菌株を活性化し、シード培地に接種し、ＯＤ_６００＝５～６となるまで培養し、シード液を得る、菌株を活性化しシード液を製造するステップ２と、
発酵タンクに殺菌後の発酵培地を添加して、シード液を加えて、ＯＤ_６００＞２０となるまで培養する、発酵タンクによる拡大培養のステップ３と、
キシロース濃縮液とキシロース二次母液とを所定の割合で混合した混合液を発酵タンクに加えて、流加発酵を行い、発酵系中のキシロース濃度を８５ｇ／Ｌ～９０ｇ／Ｌに維持し、系中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌよりも小さくなると、キシロース二次母液を流加し、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌに維持され、グルコースの全添加量がキシロースの質量の３５％～４０％となるように制御し、コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度の溶液０．２Ｌ～０．５Ｌを発酵過程で流加する、第１バッチの流加発酵のステップ４と、
第１バッチの発酵においてキシロース濃度＜３０ｇ／Ｌとなると、ステップ４の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、最終発酵液のキシリトール濃度が一定になると発酵を終了する、第２バッチの流加発酵のステップ５と、を含むキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法を提供する。

【0009】

さらに、ステップ１では、具体的には、キシロース加水分解液のイオン交換前液に０．４％～０．５％のＣａ（ＯＨ）_２を添加し、３０ｒｐｍ～５０ｒｐｍで１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ撹拌し、ｐＨ３．０～３．５に制御し、その後活性炭を０．３％～０．５％の質量比で添加して脱色し、温度を６０℃～７０℃に制御して、３０ｒｐｍ～６０ｒｐｍで６０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ撹拌することを含む。さらに、ステップ１では、低温真空濃縮の条件は、真空ポンプ圧－０．０８５ＭＰａ～－０．０９５ＭＰａ、水浴温度６０℃～７０℃、回転数５０ｒｐｍ～６０ｒｐｍ、凝縮水流速１５０ｍＬ／ｍｉｎ～２００ｍＬ／ｍｉｎを含む。

【0010】

さらに、ステップ２では、前記菌株は組換え大腸菌ＩＳ５－Ｍである。該菌株は開示番号ＣＮ１０５６７１０１３Ａの特許に記載されている。

【0011】

さらに、ステップ２では、ＬＢ液体培地の構成成分は、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、固体寒天１．５％～２％であり、シード培地の構成成分はペプトン７．５ｇ／Ｌ、酵母粉７．５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌである。

【0012】

さらに、ステップ３では、前記発酵培地の構成成分は、グルコース１０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー乾燥粉末２４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ３ｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ ９ｇ／Ｌ、ＮＨ_４Ｃｌ １ｇ／Ｌであり、前記発酵タンクの培養条件は、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整された後のｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％である。

【0013】

さらに、ステップ３では、９．５ｈ～１１ｈ培養する。

【0014】

さらに、ステップ４では、前記キシロース濃縮液とキシロース二次母液との混合比が７～９：１～３である。

【0015】

さらに、ステップ４では、前記第１バッチの流加発酵の発酵条件は３０℃、ｐＨ７、溶存酸素２０％～２５％である。

【0016】

さらに、総発酵時間が約７５ｈ～８５ｈである。

【発明の効果】

【0017】

従来技術と比べ、本発明のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法は以下の特徴を有する。

【0018】

（１）キシロース二次母液とキシロース濃縮液を所定の割合で混合することによって、発酵前期の利用可能な炭素源の含有量を向上させることができ、菌株初期の成長増殖に有利であり、これにより、キシリトール転化率を向上させる。

【0019】

（２）グルコースの代わりにキシロース二次母液を流加することによって、発酵系中のグルコース含有量を安定にしながら、一部のキシロースを提供し、これにより、グルコースの使用量を減少させ、コストを低下させるだけではなく、系のキシロースを安定的に維持し、全転化率を向上させる。

【0020】

（３）キシロース二次母液は、抑制物が少なく、菌株の成長発達に影響を与えず、また、殺菌しないままで使用することができる。

【0021】

（４）２バッチで流加して発酵することにより、発酵系中のキシロース含有量を安定的に維持することができ、菌株の形質転換に有利であり、発酵液中のキシリトール濃度を高め、また、発酵初期においてキシロースなどの糖の濃度が高すぎて、菌株の高浸透圧条件での成長抑制をもたらし、転化率低下を招くということを回避する。

【0022】

（５）混合発酵や流加などで添加されるキシロース二次母液によって発酵系中のアラビノース、マンノースなどの不純物である糖の含有量を常に発酵菌株により代謝可能な範囲にし、後続の精製を容易にし、キシリトールの純度を向上させる。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本発明が解決しようとする技術的課題、技術的解決手段及び有益な効果をより明確にするために、以下、実施例を参照して本発明をさらに詳細に説明する。なお、ここで説明される特定実施例は本発明を解釈するために過ぎず、本発明を限定するものではない。

【0024】

本発明のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法の好適な実施例は、ステップ１～ステップ５を含む。

【0025】

ステップ１、キシロース濃縮液を製造した：キシロース加水分解液のイオン交換前液にアルカリ液を添加し、その後活性炭で脱色し、脱色終了後、濾過して精製キシロース液を得て、次に低温真空濃縮を行い、濃縮液の光屈折が約６０％～６５％となるまで、キシロース濃縮液を得た。

【0026】

ステップ２、菌株活性化及びシード液製造：組換え大腸菌株ＩＳ５－Ｍを利用して、ＬＢプレート及びＬＢ液体培地で菌株を活性化し、シード培地に接種し、ＯＤ_６００＝５～６となるまで培養し、シード液を得た。

【0027】

ステップ３、発酵タンクによる拡大培養：発酵タンクに殺菌後の発酵培地を添加して、ステップ２で得られたシード液を加え、ＯＤ_６００＞２０となるまで培養した。

【0028】

ステップ４、第１バッチの流加発酵：ステップ１で製造されたキシロース濃縮液とキシロース二次母液とを所定の割合で混合した混合液を発酵タンクに加えて、流加発酵を行い、発酵系中のキシロース濃度を８５ｇ／Ｌ～９０ｇ／Ｌに維持し、系中のグルコース濃度が１０ｇ／Ｌよりも小さくなると、キシロース二次母液を流加し、グルコース濃度が１０ｇ／Ｌに維持され、グルコースの全添加量がキシロースの質量の３５％～４０％となるように制御し、コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度の溶液０．２Ｌ～０．５Ｌを発酵過程で流加した。

【0029】

ステップ５、第２バッチの流加発酵：第１バッチの発酵においてキシロース濃度＜３０ｇ／Ｌとなると、ステップ４の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、最終発酵液のキシリトール濃度が一定になると発酵を終了した。

【0030】

キシロース母液及びキシロース二次母液の成分含有量を検出し、結果を以下の表１に示す。

【0031】

【表1】

【0032】

上記の表から分かるように、キシロース母液はキシロース濃度が高く、他の糖の含有量が低く、キシロース二次母液はキシロース濃度が低く、グルコース含有量が高く、しかも、酢酸、フルフラール、ＨＭＦなどの抑制物が小さく、キシロース母液よりもキシリトール発酵に適しており、グルコースの代わりとして好適な発酵原料である。

【0033】

キシロース濃縮液とキシロース二次母液を所定の割合で混合し、発酵に利用可能な一連の原料液を得た。混合原料液を検出し、混合原料液中の各糖アルコール成分の含有量を取得し、具体的には、以下の表２に示す。

【0034】

【表2】

【0035】

他の割合も本系の発酵に利用できるが、キシロース濃度が低いので、発酵のために占有する空間が大きくなり、経済的利益が低いので、詳しく説明しないが、本発明の特許範囲内である。

【0036】

本発明に使用されるキシロース濃縮液はトウモロコシ穂軸の加水分解液であってもよく、半セルロースを豊富に含む他のバイオマス原料、例えばバガス、製紙廃材などであってもよい。本発明では、キシロース二次母液はグルコースを豊富に含む他の白下（ｍａｓｓｅｃｕｉｔｅ）液の代わりとして利用できる。

【0037】

以下、特定実施例を参照して本発明の方法をさらに説明する。

【0038】

＜実施例１＞
本発明のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法の第１実施例は、ステップ１１～ステップ１５を含む。

【0039】

ステップ１１、キシロース濃縮液を製造した：キシロース加水分解液のイオン交換前液に０．４％のＣａ（ＯＨ）_２を添加し、５０ｒｐｍで１５ｍｉｎ撹拌し、ｐＨを３．２に制御し、その後活性炭を０．４％の質量比で添加して脱色し、温度を６０℃に制御して、６０ｒｐｍで９０ｍｉｎ撹拌した。脱色終了後、濾過して精製キシロース液を得て低温真空濃縮を行い、真空ポンプ圧－０．０９５ＭＰａ、水浴温度６０℃、回転数６０ｒｐｍ、凝縮水流速約２００ｍＬ／ｍｉｎに設定して、濃縮液の光屈折が約６５％となると、発酵に適しているキシロース濃縮液を得た。

【0040】

ステップ１２、菌株活性化及びシード液製造：組換え大腸菌株ＩＳ５－Ｍを利用して、ＬＢプレート及びＬＢ液体培地で菌株を活性化し、シード培地に接種し、培養して、ＯＤ_６００＝５のシード液を得た。

【0041】

ステップ１３、発酵タンクによる拡大培養：１５Ｌ発酵タンクに殺菌後の発酵培地３．５Ｌを添加し、ステップ１２で製造したシード液０．５Ｌを加えて、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整されたｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％、作動体積４．５Ｌ、培養時間約１０ｈの条件で、ＯＤ_６００＝２１となるまで培養した。

【0042】

ステップ１４、第１バッチの流加発酵：ステップ１１で製造されたキシロース濃縮液とキシロース二次母液を９：１の割合で混合した混合液１Ｌを発酵タンクに加えて、流加発酵を行い、発酵系中のキシロース濃度を９０ｇ／Ｌとした。発酵条件：３０℃、ｐＨ７、溶存酸素２０％～２５％。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース２００ｇを添加する必要がある。混合液中にグルコースが既に存在しているので、キシロース二次母液を流加することで残りのグルコースを補充する必要があり、合計で１．１Ｌのキシロース二次母液の補充が必要とされる。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液約０．４Ｌを発酵過程で流加し、発酵終了後作動体積は約７Ｌになった。

【0043】

ステップ１５、第２バッチの流加発酵：第１バッチの発酵においてキシロース濃度＜３０ｇ／Ｌとなると、ステップ１４の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、キシロース濃縮液とキシロース二次母液の混合液（キシロース濃縮液とキシロース二次母液との混合比は９：１）１．５Ｌを発酵タンクに加え、このときの系のキシロース濃度は約８８ｇ／Ｌであった。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース３００ｇを添加する必要がある。グルコースの代わりとしてキシロース二次母液を提供し、キシロース二次母液１．６Ｌを流加して補充した。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液０．４Ｌを発酵過程で流加し、キシリトール濃度が一定になると、発酵を終了した。発酵終了後作動体積は約１０．５Ｌになった。

【0044】

合計でキシロース１４６５ｇは発酵系に添加され、グルコースは計５００ｇ節約された。

【0045】

該実施例で発酵が終了した発酵液についてＨＰＬＣ検出を行ったところ、発酵液中のキシリトール濃度は１２１．４ｇ／Ｌ、転化率は８７％であり、アラビノースは５．５ｇ／Ｌ残留され、グルコースやマンノースなど、不純物である糖は検出されなかった。

【0046】

＜実施例２＞
本発明のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法の第２実施例は、ステップ２１～ステップ２５を含む。

【0047】

ステップ２１、キシロース濃縮液を製造した：キシロース加水分解液のイオン交換前液に０．５％のＣａ（ＯＨ）_２を添加し、３０ｒｐｍで３０ｍｉｎ撹拌し、ｐＨを３．０に制御し、その後活性炭を０．５％質量比で添加して脱色し、温度を７０℃に制御して、３０ｒｐｍで６０ｍｉｎ撹拌した。脱色終了後、濾過して精製キシロース液を得て低温真空濃縮を行い、真空ポンプ圧－０．０８５ＭＰａ、水浴温度７０℃、回転数５０ｒｐｍ、凝縮水流速約１５０ｍＬ／ｍｉｎに設定して、濃縮液の光屈折が約６０％となると、発酵に適しているキシロース濃縮液を得た。

【0048】

ステップ２２、菌株活性化及びシード液製造：組換え大腸菌株ＩＳ５－Ｍを利用して、ＬＢプレート及びＬＢ液体培地で菌株を活性化し、シード培地に接種し、培養して、ＯＤ_６００＝５．５のシード液を得た。

【0049】

ステップ２３、発酵タンクによる拡大培養：１５Ｌ発酵タンクに殺菌後の発酵培地４．０Ｌを添加し、ステップ２２で製造したシード液０．５Ｌを加えて、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整されたｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％、作動体積５．０Ｌ、培養時間約１０ｈの条件で、ＯＤ_６００＝２３となるまで培養した。

【0050】

ステップ２４、第１バッチの流加発酵：ステップ２１で製造されたキシロース濃縮液とキシロース二次母液を７：３の割合で混合した混合液１．４Ｌを発酵タンクに加えて、流加発酵を行い、発酵系中のキシロース濃度を８９ｇ／Ｌとした。発酵条件：３０℃、ｐＨ７、溶存酸素２０％～２５％。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース２３０ｇを添加する必要がある。混合液中にグルコースが既に存在しているので、キシロース二次母液を流加することで残りのグルコースを補充する必要があり、合計で０．９５Ｌのキシロース二次母液の補充が必要とされる。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液約０．５Ｌを発酵過程で流加し、発酵終了後作動体積は約８Ｌになった。

【0051】

ステップ２５、第２バッチの流加発酵：第１バッチの発酵においてキシロース濃度＜３０ｇ／Ｌとなると、ステップ２４の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、キシロース濃縮液とキシロース二次母液の混合液（キシロース濃縮液とキシロース二次母液との混合比は７：３）２．２Ｌを発酵タンクに加え、このときの系のキシロース濃度は約８８ｇ／Ｌであった。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース３６０ｇを添加する必要がある。グルコースの代わりとしてキシロース二次母液を提供し、キシロース二次母液１．５Ｌを流加して補充した。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液０．５Ｌを発酵過程で流加し、キシリトール濃度が一定になると、発酵を終了し、発酵終了後作動体積は約１２．５Ｌになった。

【0052】

合計でキシロース１６５７ｇは発酵系に添加され、グルコースは計５９０ｇ節約された。

【0053】

該実施例で発酵が終了した発酵液についてＨＰＬＣ検出を行ったところ、発酵液中のキシリトール濃度は１１４．１ｇ／Ｌ、転化率は８６％であり、アラビノースは５．４ｇ／Ｌ残留され、グルコースやマンノースなど、不純物である糖は検出されなかった。

【0054】

＜実施例３＞
本発明のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法の第３実施例は、ステップ３１～ステップ３５を含む。

【0055】

ステップ３１、キシロース濃縮液を製造した：キシロース加水分解液のイオン交換前液に０．４％のＣａ（ＯＨ）_２を添加し、５０ｒｐｍで１５ｍｉｎ撹拌し、ｐＨを３．５に制御し、その後活性炭を０．３％の質量比で添加して脱色し、温度を６０℃に制御して、６０ｒｐｍで９０ｍｉｎ撹拌した。脱色終了後、濾過して精製キシロース液を得て低温真空濃縮を行い、真空ポンプ圧－０．０９５ＭＰａ、水浴温度６０℃、回転数６０ｒｐｍ、凝縮水流速約２００ｍＬ／ｍｉｎに設定して、濃縮液の光屈折が約６５％となると、発酵に適しているキシロース濃縮液を得た。

【0056】

ステップ３２、菌株活性化及びシード液製造：組換え大腸菌株ＩＳ５－Ｍを利用して、ＬＢプレート及びＬＢ液体培地で菌株を活性化し、シード培地に接種し、培養して、ＯＤ_６００＝６のシード液を得た。

【0057】

ステップ３３、発酵タンクによる拡大培養：１５Ｌ発酵タンクに殺菌後の発酵培地３．５Ｌを添加し、ステップ３２で製造したシード液０．５Ｌを加え、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整されたｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％、作動体積４．５Ｌ、培養時間約９．５ｈの条件で、ＯＤ_６００＝２１となるまで培養した。

【0058】

ステップ３４、第１バッチの流加発酵：ステップ３１で製造されたキシロース濃縮液とキシロース二次母液とを９：１の割合で混合した混合液１Ｌを発酵タンクに加えて、流加発酵を行い、発酵系中のキシロース濃度を９０ｇ／Ｌとした。発酵条件：３０℃、ｐＨ７、溶存酸素２０％～２５％。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース２００ｇを添加する必要がある。混合液中にグルコースが既に存在しているので、キシロース二次母液を流加することで残りのグルコースを補充する必要があり、合計で１．１Ｌのキシロース二次母液の補充が必要とされる。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液約０．４Ｌを発酵過程で流加し、発酵終了後作動体積は約７Ｌになった。

【0059】

ステップ３５、第２バッチの流加発酵：第１バッチの発酵においてキシロース濃度＜３０ｇ／Ｌとなると、ステップ３４の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、キシロース濃縮液とキシロース二次母液の混合液（キシロース濃縮液とキシロース二次母液との混合比は７：３）２．０Ｌを発酵タンクに加え、このときの系のキシロース濃度は約９０ｇ／Ｌであった。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース３３０ｇを添加する必要がある。グルコースの代わりとしてキシロース二次母液を提供し、キシロース二次母液１．４Ｌを流加して補充した。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液０．５Ｌを発酵過程で流加し、キシリトール濃度が一定になると、発酵を終了し、発酵終了後作動体積は約１１Ｌになった。

【0060】

合計でキシロース１５１１ｇは発酵系に添加され、グルコースは計５３０ｇ節約された。

【0061】

該実施例で発酵が終了した発酵液についてＨＰＬＣ検出を行ったところ、発酵液中のキシリトール濃度は１２２．４ｇ／Ｌ、転化率は８９％であり、アラビノースは５．６ｇ／Ｌ残留され、グルコースやマンノースなど、不純物である糖は検出されなかった。

【0062】

＜実施例４＞
本発明のキシロース二次母液の発酵を用いたキシリトールの製造方法の第４実施例は、ステップ４１～ステップ４５を含む。

【0063】

ステップ４１、キシロース濃縮液を製造した：キシロース加水分解液のイオン交換前液に０．４％のＣａ（ＯＨ）_２を添加し、５０ｒｐｍで１５ｍｉｎ撹拌し、ｐＨを３．３に制御し、その後活性炭を０．３％の質量比で添加して脱色し、温度を６０℃に制御して、６０ｒｐｍで９０ｍｉｎ撹拌した。脱色終了後、濾過して精製キシロース液を得て低温真空濃縮を行い、真空ポンプ圧－０．０９５ＭＰａ、水浴温度６０℃、回転数６０ｒｐｍ、凝縮水流速約１８０ｍＬ／ｍｉｎに設定して、濃縮液の光屈折が約６５％となると、発酵に適しているキシロース濃縮液を得た。

【0064】

ステップ４２、菌株活性化及びシード液製造：組換え大腸菌株ＩＳ５－Ｍを利用して、ＬＢプレート及びＬＢ液体培地で菌株を活性化し、シード培地に接種し、培養して、ＯＤ_６００＝５のシード液を得た。

【0065】

ステップ４３、発酵タンクによる拡大培養：１５Ｌ発酵タンクに殺菌後の発酵培地４．０Ｌを添加し、ステップ４２で製造したシード液０．５Ｌを加えて、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整されたｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％、作動体積４．５Ｌ、培養時間約１１ｈの条件で、ＯＤ_６００＝２４となるまで培養した。

【0066】

ステップ４４、第１バッチの流加発酵：ステップ３１で製造されたキシロース濃縮液とキシロース二次母液とを９：１割合で混合した混合液１．１Ｌを発酵タンクに加えて、流加発酵を行い、発酵系中のキシロース濃度を９０ｇ／Ｌとした。発酵条件：３０℃、ｐＨ７、溶存酸素２０％～２５％。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース２２０ｇを添加する必要がある。混合液中にグルコースが既に存在しているので、キシロース二次母液を流加することで残りのグルコースを補充する必要があり、合計で１．２Ｌのキシロース二次母液の補充が必要とされる。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液０．２Ｌを発酵過程で流加し、発酵終了後作動体積は約７．５Ｌになった。

【0067】

ステップ４５、第２バッチの流加発酵：第１バッチの発酵においてキシロース濃度＜３０ｇ／Ｌとなると、ステップ４４の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、キシロース濃縮液とキシロース二次母液の混合液（キシロース濃縮液とキシロース二次母液との混合比は８：２）１．８Ｌを発酵タンクに加え、このときの系のキシロース濃度は約８８ｇ／Ｌであった。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース３３０ｇを添加する必要がある。グルコースの代わりとしてキシロース二次母液を提供し、キシロース二次母液１．６Ｌを流加して補充した。キシロース二次母液を流加して、グルコース含有量を約１０ｇ／Ｌに制御した。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液１２０ｇ～１３０ｇを用いて調製した高濃度溶液０．４Ｌを発酵過程で流加し、キシリトール濃度が一定になると、発酵を終了し、発酵終了後作動体積は約１１Ｌになった。
合計でキシロース１５８８ｇは発酵系に添加され、グルコースは計５５０ｇ節約された。

【0068】

該実施例で発酵が終了した発酵液についてＨＰＬＣ検出を行ったところ、発酵液中のキシリトール濃度は１２５．６ｇ／Ｌ、転化率は８７％であり、アラビノースは５．８ｇ／Ｌ残留され、グルコースやマンノースなど、不純物である糖は検出されなかった。

【0069】

上記の例から明らかなに、この各割合のキシロース濃縮液とキシロース二次母液は発酵系に適用でき、また、キシロース二次母液の流加はグルコースの使用量をさらに減少できる。

【0070】

（比較例１）
該比較例は、ステップ（Ｄ１１）～ステップ（Ｄ１５）を含む。

【0071】

ステップ（Ｄ１１）、キシロース濃縮液を製造した：実施例１のステップ１１の製造方法と同様であるので、詳しく説明しない。

【0072】

ステップ（Ｄ１２）、菌株活性化及びシード液製造：実施例１のステップ１２の製造方法と同様であるので、詳しく説明しない。

【0073】

ステップ（Ｄ１３）、発酵タンクによる拡大培養：１５Ｌ発酵タンクに殺菌後の発酵培地５．５Ｌを添加し、ステップ（Ｄ１２）で製造したシード液０．６Ｌを加えて、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整されたｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％、作動体積６．５Ｌ、培養時間約９．５ｈの条件で、ＯＤ_６００＝２１となるまで培養した。

【0074】

ステップ（Ｄ１４）、第１バッチの流加発酵：ステップ（Ｄ１１）で製造されたキシロース濃縮液をそのまま流加発酵を行った。発酵タンクにキシロース濃縮液１．２Ｌを加え、発酵系中のキシロース濃度を８５ｇ／Ｌとし、グルコース２６０ｇを添加して十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供し、コーンスティープリカー乾燥粉末溶液０．５Ｌを発酵過程で流加し、発酵終了後作動体積は約８．４Ｌになった。

【0075】

ステップ（Ｄ１５）、第２バッチの流加発酵：ステップ（Ｄ１４）の方法によって発酵タンクにキシロース濃縮液１．７Ｌを加えて、発酵系中のキシロース濃度を８８ｇ／Ｌとし、グルコース３８０ｇを添加して十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供し、コーンスティープリカー乾燥粉末溶液０．４Ｌを発酵過程で流加し、発酵終了後作動体積は約１０．５Ｌになった。

【0076】

合計でキシロース１６００ｇは発酵系に添加され、グルコースを節約するどころか、グルコース６４０ｇは消費された。

【0077】

該比較例で発酵終了後の発酵液についてＨＰＬＣ検出を行ったところ、発酵液中のキシリトール濃度は１２４．９ｇ／Ｌ、転化率は８２％であり、アラビノースは３．８ｇ／Ｌ残留され、グルコースやマンノースなど、不純物である糖は検出されなかった。

【0078】

（比較例２）
該比較例はステップ（Ｄ２１）～ステップ（Ｄ２５）を含む。

【0079】

ステップ（Ｄ２１）、キシロース濃縮液を製造した：実施例２のステップ２１の製造方法と同様であるので、詳しく説明しない。

【0080】

ステップ（Ｄ２２）、菌株活性化及びシード液製造：実施例２のステップ２２の製造方法と同様であるので、詳しく説明しない。

【0081】

ステップ（Ｄ２３）、発酵タンクによる拡大培養：１５Ｌ発酵タンクに殺菌後の発酵培地４．５Ｌを添加し、ステップ（Ｄ２２）で製造したシード液０．６Ｌを加えて、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整されたｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％、作動体積５．５Ｌ、培養時間約１０ｈの条件で、ＯＤ_６００＝２２となるように培養した。

【0082】

ステップ（Ｄ２４）、第１バッチの流加発酵：ステップ（Ｄ２１）で製造されたキシロース濃縮液とキシロース二次母液とを９：１割合で混合した混合液１．２Ｌを発酵タンクに加え、発酵系中のキシロース濃度を９０ｇ／Ｌとした。後ではいずれのグルコース及びグルコース含有材料も補充されなかった。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液０．５Ｌを発酵過程で流加し、系の体積を約７．２Ｌとした。系にはグルコースは７．７ｇ／Ｌしか含有されず、このとき、ＮＡＤＰＨを転化するのにグルコースが十分ではなく、キシリトール転化率は低く、キシロース濃度は低下できなかった。

【0083】

ステップ（Ｄ２５）、第２バッチの流加発酵：約３５ｈ後（正常状態では第１バッチの流加発酵の終了時間）、ステップ（Ｄ２４）の方法によって第２バッチの流加発酵を行い、キシロース濃縮液とキシロース二次母液の混合液（キシロース濃縮液とキシロース二次母液との混合比は９：１）１．５Ｌを発酵タンクに加え、このとき、発酵系中のキシロース濃度は８６ｇ／Ｌになり、コーンスティープリカー乾燥粉末溶液０．５Ｌを発酵過程で流加し、系の体積を約９．５Ｌとした。系にはグルコースは７．２ｇ／Ｌしか含有されず、後ではいずれのグルコース及びグルコース含有材料も補充されなかった。約４０ｈ発酵後、発酵を手動で停止した。

【0084】

合計でキシロース１３５８ｇは発酵系添加され、グルコースが補充されないことにより、キシリトール転化率は大幅に低下した。

【0085】

該比較例で発酵を終了した発酵液についてＨＰＬＣ検出を行ったところ、発酵液中のキシリトール濃度は５８．６ｇ／Ｌ、転化率は４１％であり、アラビノースは２．２ｇ／Ｌ残留され、グルコースやマンノースなど、不純物である糖は検出されなかった。

【0086】

（比較例３）
該比較例は、ステップ（Ｄ３１）～ステップ（Ｄ３４）を含む。

【0087】

ステップ（Ｄ３１）、キシロース濃縮液を製造した：実施例４のステップ４１の製造方法と同様であるので、詳しく説明しない。

【0088】

ステップ（Ｄ３２）、菌株活性化及びシード液製造：実施例４のステップ４２の製造方法と同様であるので、詳しく説明しない。

【0089】

ステップ（Ｄ３３）、発酵タンクによる拡大培養：１５Ｌ発酵タンクに殺菌後の発酵培地３．５Ｌを添加し、ステップ（Ｄ３２）で製造したシード液０．５Ｌを加えて、３７℃、４００ｒｐｍ、アンモニア水で調整されたｐＨ６．５～７、溶存酸素３０％～３５％、作動体積４．５Ｌ、培養時間約１０．５ｈの条件で、ＯＤ_６００＝２２となるまで培養した。

【0090】

ステップ（Ｄ３４）、完全流加発酵：キシロース濃縮液とキシロース二次母液とを９：１割合で混合した混合液を発酵させた。混合液２．５Ｌを発酵タンクに直接添加し、このとき、キシロース濃度は約１８０ｇ／Ｌであった。以上に基づいて計算したところ、十分の補酵素ＮＡＤＰＨを提供するために、理論的にはグルコース５００ｇを添加する必要がある。混合液中にグルコースが既に存在しているので、キシロース二次母液を流加することで残りのグルコースを補充する必要があり、合計で２．７Ｌのキシロース二次母液の補充が必要とされる。コーンスティープリカー乾燥粉末溶液約０．８Ｌを流加し、発酵終了後作動体積は約１０．５Ｌになった。

【0091】

合計でキシロース１４６５ｇは発酵系に添加され、グルコースは５００ｇ節約された。

【0092】

該比較例で発酵を終了した発酵液についてＨＰＬＣ検出を行ったところ、発酵液中のキシリトール濃度は１０８．２ｇ／Ｌ、転化率は７８％であり、アラビノースは５．３ｇ／Ｌ残留され、キシロースは６．４ｇ／Ｌ残留され、グルコースやマンノースなど、不純物である糖は検出されなかった。

【0093】

上記の各実施例及び各比較例の実験データを表にまとめて、比較結果を以下の表３に示す。

【0094】

【表3】

【0095】

比較例１と実施例１の比較から分かるように、発酵タンクにてキシリトール発酵を行うのには、大量のグルコースが消費され、キシロース二次母液を流加することによって、グルコースを添加せずにキシリトールの転化を達成でき、また、キシロース二次母液を殺菌処理する必要もなく、このため、操作が簡単で、実施されやすい。

【0096】

比較例２と実施例２の比較から明らかに、キシリトール発酵において、グルコースの流加が不可欠なことであり、グルコースが不足すると、キシリトール転化率は低下してしまう。キシロース二次母液の流加は、グルコースの添加と類似の作用を果たし、グルコースの消費量を減少させ、コストを低下させる一方、補充したキシロースは系中のキシロース濃度を向上させ、転化率をさらに向上させる。

【0097】

比較例３と実施例３の比較から明らかに、キシリトール発酵において、一次流加によりキシロースなどの初期の含有量が高すぎ、菌株の成長が抑制され、転化率が悪影響を受け、また、発酵液にはキシロース残留が検出されるので、これは後続の精製に悪影響を及ぼす。

【0098】

以上は本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を制限するものではなく、本発明の趣旨及び原則を逸脱することなく行われる全ての修正、等同置換や改良などは本発明の特許範囲に含まれるものとする。

【国際調査報告】