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特表2023-531380アルツハイマー病を治療するためのエンドソームエンハンサーのための薬物スクリーニングプラットフォーム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-24
(54)【発明の名称】アルツハイマー病を治療するためのエンドソームエンハンサーのための薬物スクリーニングプラットフォーム
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230714BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230714BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230714BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230714BHJP
C12N 15/85 20060101ALI20230714BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230714BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230714BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20230714BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20230714BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20230714BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20230714BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K14/705 ZNA
C07K19/00
C12N15/12
C12N15/85 Z
C12N5/10
C12Q1/02
C12N9/02
C12N9/16 B
C12N15/53
C12N15/55
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022574115
(86)(22)【出願日】2021-06-15
(85)【翻訳文提出日】2022-12-01
(86)【国際出願番号】 EP2021066116
(87)【国際公開番号】W WO2021255027
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】20180166.9
(32)【優先日】2020-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509168656
【氏名又は名称】オーフス ウニベルシテット
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アンデルセン，オラフ，マイケル
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ12
4B063QQ13
4B063QQ22
4B063QQ33
4B063QQ79
4B063QR51
4B063QR58
4B063QS05
4B063QS28
4B063QX02
4B065AA90Y
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA28
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列、もしくはそのバリアント配列を含むまたはそれからなるｓｏｒＬＡタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、前記バリアントが、配列番号１０と、少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９９％などの、少なくとも８０％同一である、第１のポリヌクレオチド；および（ｂ）レポーターフラグメントをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含むポリヌクレオチド構築物であって、
前記第１のおよび第２のポリヌクレオチドが、作動可能に連結される、
ポリヌクレオチド構築物。
【請求項2】
前記ｓｏｒＬＡタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一である、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項3】
前記バリアントが、アルツハイマー病（ＡＤ）に罹患している患者で広く見られる変異を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項4】
前記変異が、ミスセンス変異である、請求項３に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項5】
前記レポーターフラグメントが、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ；またはこれらの最適化バリアントからなる群より選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項6】
前記レポーターフラグメントが、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、またはその最適化バリアントである、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項7】
前記レポーターフラグメントが、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項8】
前記レポーターフラグメントが、配列番号１５のアミノ酸配列と１００％同一である、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項9】
前記レポーターフラグメントが、Ｇｌｕｃ－Ｍ４３１Ｉ、Ｇｌｕｃ－Ｍ１１０ＩおよびＧｌｕｃＭ４３Ｉからなる群より選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項10】
前記レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、またはその最適化バリアントである、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項11】
前記レポーターフラグメントが、配列番号１１のアミノ酸配列と１００％同一である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項12】
発現時に、前記レポーターフラグメントが、ｓｏｒＬＡのＮ末端でｓｏｒＬＡと融合される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項13】
リンカーをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、前記第１の、第２のおよび前記ポリヌクレオチドが、作動可能に連結される、請求項１～１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項14】
前記リンカーが、前記レポーターフラグメントに前記ｓｏｒＬＡタンパク質を連結する、請求項１～１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項15】
発現時に前記リンカーが、ｓｏｒＬＡのＮ末端でｓｏｒＬＡと融合される、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項16】
発現時に前記レポーターフラグメントが、リンカーのＮ末端で前記リンカーと融合される、請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項17】
前記リンカーが、少なくとも１アミノ酸、例えば２アミノ酸、３アミノ酸など、例えば４アミノ酸、５アミノ酸など、例えば６アミノ酸、７アミノ酸など、例えば８アミノ酸、９アミノ酸など、例えば１９アミノ酸、１１アミノ酸など、例えば１２アミノ酸、１３アミノ酸など、例えば１４アミノ酸、１５アミノ酸など、例えば１６アミノ酸、１７アミノ酸など、例えば１８アミノ酸、１９アミノ酸など、例えば２０アミノ酸、２５アミノ酸など、例えば３０アミノ酸、３５アミノ酸など、例えば４０アミノ酸、４５アミノ酸など、例えば５０アミノ酸、５５アミノ酸など、例えば６０アミノ酸、６５アミノ酸など、例えば７０アミノ酸、７５アミノ酸など、例えば８０アミノ酸、８５アミノ酸など、例えば９０アミノ酸、９５アミノ酸など、例えば１００アミノ酸からなる、請求項１～１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項18】
前記リンカーが、２アミノ酸からなる、請求項１～１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項19】
前記リンカーが、５アミノ酸からなる、請求項１～１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項20】
前記リンカーが、８アミノ酸からなる、請求項１～１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項21】
前記リンカーが、５３アミノ酸からなる、請求項１～２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項22】
前記リンカーが、ＬＥのアミノ酸配列からなる、請求項１～２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項23】
前記リンカーが、ＬＳＲＳＥ（配列番号１２）のアミノ酸配列からなる、請求項１～２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項24】
前記リンカーが、ＬＳＲＳＳＧＧＥ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる、請求項１～２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項25】
前記リンカーが、ＥＶＷＴＱＲＬＨＧＧＳＡＰＬＰＱＤＲＧＦＬＶＶＱＧＤＰＲＥＬＲＬＷＡＲＧＤＡＲＧＡＳＲＡＤＥＫＰＬＧＳＧＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列からなる、請求項１～２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項26】
前記リンカーが、配列番号６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１～２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項27】
配列番号７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項28】
配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項29】
配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～２８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項30】
配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項31】
配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項32】
配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項33】
配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項34】
配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする、請求項１～３３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項35】
請求項１～３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物を含むベクター。
【請求項36】
プラスミド、ウイルスベクターおよびコスミドからなる群より選択される、請求項３５に記載のベクター。
【請求項37】
プラスミドベクターである、請求項３５および３６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項38】
ウイルスベクターである、請求項３５～３７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項39】
哺乳動物細胞中で機能的である、請求項３５～３８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項40】
５’および３’末端反復をさらに含む、請求項３５～３９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項41】
プロモーターを含む、請求項３５～４０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項42】
前記プロモーターが、哺乳動物細胞に特異的である、請求項３５～４１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項43】
前記哺乳動物細胞が、神経細胞である、請求項３５～４２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項44】
ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項３５～４３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項45】
前記ヌクレオチド配列が、転写後調節エレメントに動作可能に連結される、請求項３５～４４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項46】
請求項１～３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物によりまたは請求項３５～４５のいずれか１項に記載のベクターによりコードされる融合タンパク質。
【請求項47】
前記融合タンパク質が、配列番号６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項48】
前記融合タンパク質が、配列番号７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項49】
前記融合タンパク質が、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項50】
前記融合タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項51】
前記融合タンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項52】
前記融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項53】
前記融合タンパク質が、配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項54】
前記融合タンパク質が、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項55】
前記融合タンパク質が、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項56】
請求項１～３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物を含む細胞および／または請求項３５～４５のいずれか１項に記載のベクターおよび／または請求項４６～５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む細胞。
【請求項57】
哺乳動物起源のものである、請求項５６に記載の細胞。
【請求項58】
ヒト起源のものである、請求項５６および５７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項59】
ＨｅＬａ、ＨＥＫおよびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞からなる群より選択される、請求項５６～５８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項60】
ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である、請求項５６～５９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項61】
エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類するための方法であって、（ａ）請求項５６～６０のいずれか１項に記載の細胞を用意するステップであって、
前記細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む請求項４６～５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現する、ステップ、
（ｂ）化合物を含む培地と（ａ）の細胞の第１の分割量を接触させる、および化合物を含まない培地と（ａ）の細胞の第２の分割量を接触させるステップ、
（ｃ）前記第１のおよび第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）前記化合物を、
ｉ．細胞の前記第２の分割量に比べて細胞の前記第１の分割量中でレポーターフラグメント活性の増大が観察される場合エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．細胞の前記第２の分割量に比べて細胞の前記第１の分割量中でレポーターフラグメント活性の低減が観察される場合エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む方法。
【請求項62】
前記細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を増大させる化合物を特定するために使用される、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を低減させる化合物を特定するために使用される、請求項６１に記載の方法。
【請求項64】
前記分類された化合物が、－前記化合物がエンドソームを強化すると分類される場合アルツハイマー病（ＡＤ）の治療での使用に好適である、または
－前記化合物がエンドソームを抑制すると分類される場合アルツハイマー病（ＡＤ）の治療での使用に好適でない、
請求項６１～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとしてｓｏｒＬＡ変異を分類するための方法であって、（ａ）請求項５６～６０のいずれか１項に記載の細胞を用意するステップであって、前記細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む請求項４６～５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現し、
かつ前記ｓｏｒＬＡタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一である、ステップ、および
（ｂ）請求項５６～６０のいずれか１項に記載の細胞を用意するステップであって、前記細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む請求項４６～５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現し、
かつ前記ｓｏｒＬＡタンパク質が、アルツハイマー病（ＡＤ）に罹患している患者で広く見られる変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の細胞を培養するステップ、
（ｄ）（ａ）および（ｂ）の細胞由来の培地中の前記ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｅ）前記ｓｏｒＬＡ変異を、
ｉ．（ａ）の細胞の培地に比べて（ｂ）の細胞の培地中でレポーターフラグメント活性の増大が観察される場合エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．（ａ）の細胞の培地に比べて（ｂ）の細胞の培地中でレポーターフラグメント活性の低減が観察される場合エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む方法。
【請求項66】
ＳＯＲＬ１変異を有すると特定された患者が化合物による治療から恩恵を受けるかどうかを試験するための方法であって、（ａ）請求項５６～６０のいずれか１項に記載の細胞を用意するステップであって、前記細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む請求項４６～５５のいずれか１項に記載の融合タンパク質を発現し、
かつ前記ｓｏｒＬＡタンパク質が、前記ＳＯＲＬ１変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｂ）化合物を含む培地と（ａ）の細胞の第１の分割量を接触させる、および化合物を含まない培地と（ａ）の細胞の第２の分割量を接触させるステップ、
（ｃ）前記第１のおよび第２の分割量中の前記ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）前記患者が、
ｉ．前記細胞の第２の分割量に比べて前記細胞の第１の分割量中でレポーターフラグメント活性の増大が観察される場合前記化合物での治療から恩恵を受ける、または
ｉｉ．前記細胞の第２の分割量に比べて前記細胞の第１の分割量中でレポーターフラグメント活性の低減が観察される場合前記化合物での治療から恩恵を受けない、
であろうと結論付けるステップ、
を含む、方法。
【請求項67】
前記基質の活性を決定することが、前記レポーターフラグメントの基質の添加を含む、請求項６１～６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類するためのスクリーニングアッセイを行うためのキットであって、－請求項１～３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド構築物、および／または
－請求項３５～４５のいずれか１項に記載のベクター、および／または
－請求項４６～５５のいずれか１項に記載の細胞、
および使用説明書、
を含む、キット。
【請求項69】
前記化合物が、小分子、ペプチド、ポリペプチド、高分子、脂質、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｃＤＮＡからなる群より選択される、請求項６１～６８のいずれか１項に記載の方法またはキット。
【請求項70】
前記化合物が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アレイライブラリー由来である、請求項６１～６９のいずれか１項に記載の方法またはキット。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、エンドソーム活性に対する影響について低分子化合物ライブラリーをスクリーニングすることにおける使用のためのｓｏｒＬＡベース薬物スクリーニングプラットフォームに関する。アッセイで特定される化合物は、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療に使用できる。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、世界中で数百万人に影響を与える不治の神経変性疾患である。その病状は、それぞれ、アミロイドβペプチドまたはＡｂｅｔａペプチド、およびタウとも呼ばれる、アミロイドプラークおよびアミロイドｂペプチドを含む神経原線維濃縮体を含む。いくつかの最近の報告は、エンドソーム機能不全が、ニューロンからのアミロイドおよびタウ分泌の増大に繋がる上流病態であることを示唆し（Ｓｍａｌｌ ２０１７，Ｓｍａｌｌ ２０２０）、ＡＤ患者由来の脳の最も早期の、よく研究された細胞病理の１つとしてのエンドソーム機能不全と一致する。しかし、エンドソームソーティングシステム（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）が、どのように影響され、例えば活性化されて、ＡＤにおけるエンドソーム機能不全を弱めることができるかを理解することは難しい。従って、エンドソームエンハンサーとして使用でき、従ってＡＤの治療に使用できる新規化合物を特定するという大きな未充足のニーズが存在する。同様に、既存のおよび将来の化合物、例えば、エンドソームソーティングシステムの追加の阻害により負に影響され得る全般集団および特に、ＡＤ患者の両方に対し、エンドソームリプレッサーとして機能しかつ治療での使用に有害であり得る化合物を、それらのエンドソームソーティングシステムに対する潜在的な負の副作用について評価するという大きな未充足のニーズが存在する。
【0003】
従って、薬物化合物などのＡＤに対する新規治療選択の進展を促進し、およびＡＤに対するこれらの治療選択の安全性を評価するために、エンドソームソーティングシステムに対するそれらの影響を評価する技術が必要である。
【発明の概要】
【0004】
ＳＯＲＬ１は、エンドソームソーティング受容体（ｓｏｒＬＡ）をコードする遺伝子であり、ＡＤ、例えば、散発性／晩期発症型ＡＤの発生に関連する主要リスクの１つである。本発明の発明者らは、例えば、ＡＤとの関連において、エンドソームソーティングシステムの状態および機能性を評価するための、およびエンドソームシステムが通常の状態にあるか、活性化状態（通常の状態より高い状態）にあるかまたは阻害状態（通常の状態より低い活性の状態）にあるかどうかを評価するためのｓｏｒＬＡの適合性を明確に理解した。これは、細胞膜から脱落したｓｏｒＬＡがエンドソームソーティングシステムを評価するための尺度として使用できるという本発明の発明者らの理解による。ｓｏｒＬＡ（ＳＯＲＬ１によりコードされる）は、ニューロン受容体であり、これは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の輸送およびプロセシングを決定する。ｓｏｒＬＡは、細胞表面への分泌経路を選り分け、初期／ソーティングエンドソームに取り込まれ、そこで、それは細胞膜に戻されるか、ゴルジ体および／またはトランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）へ戻る逆行輸送を受ける。それはまた、細胞外ドメインのシェディングを受け、可溶性型のｓｏｒＬＡが脳脊髄液中ならびに発現細胞の培地中で認められる。
【0005】
発明者らは、エンドソームからの逆行輸送が複合体型Ｎ－グリコシル化に影響を与えることを見出し、これは、ｓｏｒＬＡのシェディングの必要条件であると明らかにされた。発明者らは、ｓｏｒＬＡのシェディングがエンドソーム活性の尺度として使用できることに気付いた。増大されたｓｏｒＬＡのシェディングは、増大されたエンドソーム活性を反映し、一方、減少されたｓｏｒＬＡのシェディングは、減少されたエンドソーム活性を反映する。結論として、ｓｏｒＬＡのシェディングは、どのようにして薬物化合物がエンドソームソーティングシステムに影響を与えるか、例えばエンドソーム活性化化合物としてまたはエンドソームリプレッサーとして作用するかに関する尺度として使用できる。
【0006】
本発明は、レポーター（「ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント」）、例えば、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）または分泌型ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）と融合されたｓｏｒＬＡを含むタンパク質を開示する。この融合タンパク質は、細胞中で発現させることができ、これらの細胞は、エンドソーム活性を増大または低減できる化合物について低分子化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用できる。レポーター活性、例えば、ＳＥＡＰ活性またはＧｌｕｃ活性の増大はこの設定において、ｓｏｒＬＡのシェディングの増大を表し、これは、エンドソーム活性の増大を表す。レポーター活性、例えば、ＳＥＡＰ活性またはＧｌｕｃ活性の低減はこの設定では、ｓｏｒＬＡのシェディングの低減を表し、これは、エンドソーム活性の低減を表す。
【0007】
化合物、Ｒ５５は、エンドソーム活性に対する影響を有し、それによりＡＤの治療において効果を有する可能性があることが文献で示されている(Ｍｅｃｏｚｚｉ, ２０１４)。Ｒ５５は、本発明の概念の証拠として使用できるということが本発明者の理解である。
【0008】
本発明は、ｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質を発現している細胞の細胞培地中の脱落したｓｏｒＬＡの量を増大または低減させるそれらの能力に応じて、エンドソーム活性を強化するまたはエンドソーム活性を抑制するいずれかとして化合物を分類するための方法を記載する。本開示はさらに、上記ｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質、上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびこの融合タンパク質を発現するためのベクターおよび細胞にも関する。
【0009】
一態様では、本発明は：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列、もしくはそのバリアント配列を含むまたはそれからなるｓｏｒＬＡタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、バリアントは、配列番号１０と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％同一である、第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）レポーターフラグメントをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、
第１および第２のポリヌクレオチドはが作動可能に連結される、ポリヌクレオチド構築物に関する。
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列、もしくはそのバリアント配列を含むまたはそれからなるｓｏｒＬＡタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、バリアントは、配列番号１０と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％同一である、第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）レポーターフラグメントをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、
第１および第２のポリヌクレオチドはが作動可能に連結される、ポリヌクレオチド構築物に関する。
【0010】
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
【0011】
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチドにより、または上記ベクターによりコードされる融合タンパク質に関する。
【0012】
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチド構築物および／または上記ベクターおよび／または上記融合タンパク質を含む細胞に関する。
【0013】
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類する方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、
細胞がｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現する、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させ、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１および第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）化合物を、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量において、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量において、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、
細胞がｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現する、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させ、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１および第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）化合物を、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量において、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量において、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
【0014】
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとしてｓｏｒＬＡ変異を分類するための方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一である、ステップ、および
（ｂ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、アルツハイマー病に罹患している患者で広く見られる変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の細胞を培養するステップ、
（ｄ）（ａ）および（ｂ）の細胞由来の培地中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｅ）ｓｏｒＬＡ変異を、
ｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一である、ステップ、および
（ｂ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、アルツハイマー病に罹患している患者で広く見られる変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の細胞を培養するステップ、
（ｄ）（ａ）および（ｂ）の細胞由来の培地中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｅ）ｓｏｒＬＡ変異を、
ｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
【0015】
別の態様では、本発明は、ＳＯＲＬ１変異を有すると特定された患者が、化合物による治療から恩恵を受けるかどうかを試験するための方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、前記ＳＯＲＬ１変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させる、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１のおよび第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）患者は、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量においてレポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受ける、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量においてレポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受けない、
であろうと結論付けるステップ、
を含む。
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、前記ＳＯＲＬ１変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させる、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１のおよび第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）患者は、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量においてレポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受ける、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量においてレポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受けない、
であろうと結論付けるステップ、
を含む。
【0016】
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類するためのスクリーニングアッセイを行うためのキットに関し、キットは、
－上記ポリヌクレオチド構築物、および／または
－上記ベクター、および／または
－上記細胞、および
使用説明書、
を含む。
－上記ポリヌクレオチド構築物、および／または
－上記ベクター、および／または
－上記細胞、および
使用説明書、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ＷＴ－ｓｏｒＬＡおよび種々のレポーター構築物の概略図。 Ａ）ＷＴ－ｓｏｒＬＡの概略図（Ａ）。番号は、ｓｏｒＬＡドメインを示す：１＝シグナルペプチドおよび／またはプロペプチド、２＝ＶＰＳ １０ｐ－β－プロペラドメイン、３＝１０ＣＣドメイン、４＝ＹＷＴＤ－β－プロペラドメイン、５＝ＥＧＦドメイン、６＝ＣＲ－クラスタードメイン、７＝３Ｆｎ－クラスタードメイン、８＝膜貫通ドメイン、９＝尾部ドメイン。ハサミ記号は、シグナルペプチドおよび／またはプロペプチドドメインがレポーター分子のＮ末端付加により置換される場所を表す（Ｂ～Ｆでのように）。 Ｂ）ＳＥＡＰがＮ末端に付加されプロペプチドを置換するＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ。 Ｃ）ＳＥＡＰおよび２、５または８アミノ酸リンカーがＮ末端に付加されプロペプチドを置換するＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ。 Ｄ）ＳＥＡＰおよび５３アミノ酸リンカーがＮ末端に付加されプロペプチドを置換するＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ。 Ｅ）ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）および２、５または８アミノ酸リンカーがＮ末端に付加されプロペプチドを置換するＧｌｕｃ－ｓｏｒＬＡ。 Ｆ）Ｇｌｕｃおよび５３アミノ酸リンカーがＮ末端に付加されプロペプチドを置換するＧｌｕｃ－ｓｏｒＬＡ。
【図2】クローニング戦略 ＰＣＲによるＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡをコードするポリヌクレオチドの構築の概略図。 ＡおよびＢ：ｓｏｒＬＡ ｃＤＮＡの残基５４～内部ＮｈｅＩ部位にわたる、および内部ＮｓｉＩ部位～残基２２１４、停止コドンの２つのフラグメントを、単純ＰＣＲにより増幅し、その後ネステッドＰＣＲのテンプレートとして使用して、それらの「合計」を増幅し、隣接ＸｂａＩ、およびＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ認識部位を設けた。 Ｃ）このフラグメントを、ＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、その後、同じ２つの酵素で消化したｐＢＳ－ＫＳクローニングベクターに連結した。 Ｄ）ｓｏｒＬＡ ｃＤＮＡの長い内部ＮｈｅＩ－ＮｓｉＩフラグメントを、単離し、隣接ｓｏｒＬＡ配列を含むｐＢＫ－ＫＳプラスミドに連結した。産物は、この時点で、５４～２２１４、停止コドンにわたる、ＸｂａＩとＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ部位に挟まれたｓｏｒＬＡコード領域を含んだ。 Ｅ）ＡＰＰに融合されたＳＥＡＰを含むプラスミド（バックボーンベクターｐ１２）は、Ｓｔｅｆａｎ Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒからの贈与であり、ここでＡＰＰ挿入断片の読み枠は、ＸｂａＩ（インフレーム）およびＮｏｔＩフラグメントにより置換できる。この構築物は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＳＥＡＰ－ＡＰＰを発現する。 Ｆ）残基５４～２２１４、停止コドンにわたるｓｏｒＬＡフラグメントを、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ消化後に単離し、最終的にｐ１２ベクターに連結し、ここでＡＰＰ挿入断片は、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ消化後に除去された。 最終ポリヌクレオチド構築物はこの時点で、ｐ１２プラスミド中でＳＥＡＰとインフレームで、ｓｏｒＬＡ ５４～２２１４、停止コドンを含み、ＥＦ１αプロモーターの制御下で発現される。
【図3】ウェスタンブロット分析 溶解物のウェスタンブロット分析（上段の図）：ＷＴ－ｓｏｒＬＡ（レーン１）またはＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ（レーン２～４）の発現のために構築物を遺伝子導入した細胞由来の溶解物のウェスタンブロットは、両タンパク質の発現を確認した（上段）。融合タンパク質の遊走（矢印）は、ＷＴプロテイン（アスタリスク＊）より遅かった。これは、ＷＴと比較して融合タンパク質のより長いポリペプチドとよく関連する。一般に、溶解物中でＷＴ－ｓｏｒＬＡに比べてＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡのより少ない発現が観察でき、これは、内在性の状況により類似する発現レベルを目指すＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物の活性の低いプロモーターに起因する。 培地のウェスタンブロット分析（下段の図）：培地中の脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの存在は、融合タンパク質が、ＷＴ－ｓｏｒＬＡに類似のＡＤＡＭ１７依存性プロセスでのように、切断され脱落されることを示す。異なるレベルの培地のローディングは、どのようにしてエンドソームエンハンサー（矢頭）の存在下で成長した細胞が脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの増大された産生に至ると予測され得るかを示す。
【図4】輸送経路の概略図 Ａ）ｓｏｒＬＡ輸送経路および成熟の概略図。 Ｂ）パネルは、どのようにしてＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡが類似の輸送経路を追従し、例えば、ソーティング行程ステップ（７－８－９）、のエンドソームエンハンサーの存在下の細胞成長において、輸送が高められ、脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの増大された産生に至るかを示す。 ａ：細胞外間隙、ｂ：サイトゾル、ｃ：トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ）、ｄ：ゴルジ体、ｅ：核、ｆ：小胞体（ＥＲ）、ｇ：初期エンドソーム、ｈ：管状エンドソームネットワーク（ＴＥＮ）、ｉ：ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）。 番号は、ｓｏｒＬＡ輸送、Ｎ－グリコシル化およびシェディングのモデルを表す。新しく合成されたｓｏｒＬＡは、ＥＲ中でおよびシスゴルジ体への移行後グリコシル化を受け（１）、未成熟ｓｏｒＬＡは、高マンノース（ｓｏｒＬＡ表記中の白色Ｈ）Ｎ－グリカンの成熟を回避でき（２）、細胞表面へ通過できる（３、４）。未成熟Ｎ－グリカンを有するｓｏｒＬＡは、ＴＡＣＥの基質ではない（５）が、クラスリンコートピットを介して初期エンドソームに内部移行でき（６）、そこから、それは、ゴルジ体へとレトロマー依存性経路で逆方向輸送を受ける（７）。ここでＮ－グリカンは、細胞表面に戻る複合体型（ｓｏｒＬＡ表記中の白色Ｃ）に成熟でき（８、９）、成熟ｓｏｒＬＡはその後、ＴＡＣＥ切断およびシェディングを受けやすい。
【図5】アッセイ ９６／３８４ウェルフォーマットで増殖されたＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡを発現する細胞を使用して、化合物ｓｉＲＮＡまたはｃＤＮＡの提示されたライブラリーをスクリーニングするためのアッセイ（Ａ）。細胞由来の培地中の酵素活性が、定量化され（Ｂ、Ｃ）、エンドソーム活性のエンハンサー（灰色矢頭）が、特定され、ここで相対的活性は、ビークル処理細胞（非処理細胞（Ｃ））に比べて、化合物処理細胞由来の培地中でより高い。あるいは、エンドソーム活性のリプレッサーが特定され、ここで化合物処理細胞由来の培地中の相対的活性は、ビークル処理細胞（非処理細胞）由来の培地よりも低い。まとめると、増大されたエンドソームプロセシングおよびｓｏｒＬＡシェディングを反映する、増大されたレポーターシグナルは、エンドソーム活性化剤またはエンハンサーの作用を反映する（Ｄ）。低減されたエンドソームプロセシングおよびｓｏｒＬＡシェディングを反映する、低減されたレポーターシグナルは、エンドソーム活性化剤またはエンハンサーの作用を反映する。
【発明を実施するための形態】
【0018】
定義
本明細書中で使用される場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。
本明細書中で使用される場合、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。
【0019】
用語「いくつかの実施形態」は、１つ、または２つ以上の実施形態を含み得る。
【0020】
本文全体を通して、特許請求の範囲および／または明細書中の用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用される場合、単語の「ａ」または「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味してよいが、これはまた、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは２つ以上」の意味と一致する。従って、例えば、「ｓｏｒＬＡ受容体構築物」への言及は、１種または複数のｓｏｒＬＡ受容体構築物、少なくとも１つのｓｏｒＬＡ受容体構築物、または２つ以上のｓｏｒＬＡ受容体構築物などの、複数のこのようなｓｏｒＬＡ受容体構築物を含む。
【0021】
本明細書で使用される場合、用語「ｓｏｒＬＡ」は、用語ＳＯＲＬＡ、ソーティリン関連受容体、ソーティリン関連受容体１、１１リガンド結合反復を有する低密度リポタンパク質受容体関連物（Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｗｉｔｈ １１ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ）、１１リガンド結合反復を有するＬＤＬＲ関連物（ＬＤＬＲ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｗｉｔｈ １１ ｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｐｅａｔｓ）、ＬＲ１１、ｓｏｒＬＡ－１、ＬＤＬＲ種類Ａ反復を含むソーティングタンパク関連受容体およびｇｐ２５０と同義である。ヒトｓｏｒＬＡは、ユニプロットの受入番号Ｑ９２６７３でアノーテートされる。
【0022】
本明細書で使用される場合、用語「野生型」および省略形「ｗｔ」は、天然起源タンパク質、すなわち、天然起源ｓｏｒＬＡを述べると理解される。
【0023】
本明細書で使用される場合、用語「化合物」は、本明細書に記載の方法で試験されるまたは分類される任意の化合物を含む。これは例えば、限定されないが、小分子、ペプチド、ポリペプチド、高分子、脂質、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｃＤＮＡを含む。アッセイで試験される化合物は原理的には、天然起源化合物、または天然起源化合物であると特定されたまたはそれに類似の化学的に合成された化合物、または任意の化学的に合成された天然では発生しない化合物などの、任意の化学的化合物であり得る。天然起源化合物は、多細胞または単細胞生物で検出され得るまたはそれから単離され得る化合物、特に、動物、植物、真菌、酵母、または任意の他の細胞含有生物中で、またはウィルス中で検出され得る化合物であり得る。天然では発生しない化学的に合成される化合物は、コンビナトリアルケミストリーにより合成され得る。
【0024】
本明細書で使用される場合、用語「レポーターフラグメント」は、用語「レポーター」と同義であり、細胞プロセスを測定する、および好ましくは定量化するために使用できる部分を指す。本開示の意味では、ｓｏｒＬＡタンパク質に融合されるレポーターフラグメントは、細胞表面から培地中に脱落したｓｏｒＬＡを「報告（ｒｅｐｏｒｔ）」（指し示すことを意味する）でき、その結果、脱落したｓｏｒＬＡ（ｓｓｏｒＬＡ）は、培地中で測定されおよび定量化され得る。好適なレポーターは、高感度で正確な、好ましくは定量化可能な測定を可能にする。本発明は、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）または分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）などの、レポーター酵素の使用法に注力する。これらのレポーター酵素の活性は、測定でき、その結果レポーターの活性は、培地中にシェディングされたｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量に関係付けることができる。本発明の発明者らは、脱落したｓｏｒＬＡがエンドソームプロセッシング／機能の尺度であることに気付いた。「レポーターフラグメントの活性」を測定するまたは特定することは、そのレポーター酵素による基質の反応が測定されるまたは特定されることを意味する。それらのそれぞれの基質とのインキュベーション時に、レポーター酵素は、測定可能な反応、例えば、発光または比色分析変化により測定可能な反応を触媒する。例えば、ガウシアルシフェラーゼなどのルシフェラーゼは、測定され得るそれらの基質（「ルシフェリン」）の存在下で発光を触媒する。
本明細書で開示のポリヌクレオチド構築物、ベクター、融合タンパク質、細胞または方法が使用できる高スループットアッセイの場合、最適なレポーター酵素は、次の特性：感度のための高い光出力、酵素活性の非侵襲的モニタリング、種々の条件にわたる酵素安定性、多数のスクリーニング試料間の最小限の変動のための安定な発光の触媒作用、の１つまたは理想的には、より多くを示す。
別の例として、ＳＥＡＰなどのアルカリフォスファターゼは、測定され得るそれらの基質の存在下で比色分析的変化を触媒する。
本明細書で開示のポリヌクレオチド構築物、ベクター、融合タンパク質、細胞または方法が使用できる高スループットアッセイの場合、最適なレポーター酵素は、次の特性：感度のための高い光出力、酵素活性の非侵襲的モニタリング、種々の条件にわたる酵素安定性、多数のスクリーニング試料間の最小限の変動のための安定な発光の触媒作用、の１つまたは理想的には、より多くを示す。
別の例として、ＳＥＡＰなどのアルカリフォスファターゼは、測定され得るそれらの基質の存在下で比色分析的変化を触媒する。
【0025】
本明細書で使用される場合、用語「ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント」は、直接にまたは本明細書で開示のリンカーを介してタンパク質ｓｏｒＬＡに融合される、本明細書で開示のレポーターフラグメントを含むまたはそれからなる融合タンパク質を指す。
【0026】
ポリヌクレオチド構築物
一態様では、本発明は、ポリヌクレオチド構築物に関し、構築物は、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列、もしくはそのバリアント配列を含むまたはそれからなるｓｏｒＬＡタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、バリアントは、配列番号１０と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％同一である、第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）レポーターフラグメントをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、第１および第２のポリヌクレオチドは、作動可能に連結される。
一態様では、本発明は、ポリヌクレオチド構築物に関し、構築物は、
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列、もしくはそのバリアント配列を含むまたはそれからなるｓｏｒＬＡタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドであって、バリアントは、配列番号１０と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９９％同一である、第１のポリヌクレオチド；および
（ｂ）レポーターフラグメントをコードする第２のポリヌクレオチド、
を含み、第１および第２のポリヌクレオチドは、作動可能に連結される。
【0027】
本開示のいくつかの実施形態では、ｓｏｒＬＡタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一である。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ｓｏｒＬＡバリアントは、アルツハイマー病に罹患している患者において広く見られる変異を含む。
当業者は、アルツハイマー病において広く見られる上記変異を特定する方法をわかるであろう。いくつかの変異は、現在までに既知であり、他の変異は、例えば、ゲノムワイド研究により、将来、特定されるであろう。
本開示のいくつかの実施形態では、上記変異は、ミスセンス変異である。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ｓｏｒＬＡバリアントは、アルツハイマー病に罹患している患者において広く見られる変異を含む。
当業者は、アルツハイマー病において広く見られる上記変異を特定する方法をわかるであろう。いくつかの変異は、現在までに既知であり、他の変異は、例えば、ゲノムワイド研究により、将来、特定されるであろう。
本開示のいくつかの実施形態では、上記変異は、ミスセンス変異である。
【0028】
レポーター
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ；またはこれらの最適化バリアントからなる群より選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントはガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、またはその最適化バリアントである。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）である。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列と１００％同一である。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、Ｇｌｕｃ－Ｍ４３１Ｉ、Ｇｌｕｃ－Ｍ１１０ＩおよびＧｌｕｃＭ４３Ｉから選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、分泌型アルカリフォスファターゼ、またはその最適化バリアントである。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、配列番号１１のアミノ酸配列と１００％同一である。
本開示のいくつかの実施形態では、発現時にレポーターフラグメントは、ｓｏｒＬＡのＮ末端でｓｏｒＬＡと融合される。
一実施形態では、レポーターフラグメントは、ｓｏｒＬＡ構築物中の任意の位置で融合される。
好ましい実施形態では、レポーターフラグメントは、Ｎ末端でｓｏｒＬＡと融合される。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ；またはこれらの最適化バリアントからなる群より選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントはガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、またはその最適化バリアントである。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）である。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、配列番号１５のアミノ酸配列と１００％同一である。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、Ｇｌｕｃ－Ｍ４３１Ｉ、Ｇｌｕｃ－Ｍ１１０ＩおよびＧｌｕｃＭ４３Ｉから選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、分泌型アルカリフォスファターゼ、またはその最適化バリアントである。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントは、配列番号１１のアミノ酸配列と１００％同一である。
本開示のいくつかの実施形態では、発現時にレポーターフラグメントは、ｓｏｒＬＡのＮ末端でｓｏｒＬＡと融合される。
一実施形態では、レポーターフラグメントは、ｓｏｒＬＡ構築物中の任意の位置で融合される。
好ましい実施形態では、レポーターフラグメントは、Ｎ末端でｓｏｒＬＡと融合される。
【0029】
ｓｏｒＬＡがレポーターフラグメントに融合される融合タンパク質の使用は、ｓｓｏｒＬＡの容易な定量化を可能にする。レポーターフラグメントの例は、アルカリフォスファターゼまたはルシフェラーゼである。このようなｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質は、エンドソーム活性に影響を与える化合物を特定するための、高スループットスクリーニングプロトコルの構成にとって理想的である。アルカリフォスファターゼおよびルシフェラーゼレポーター構築物は、高感度であり、それらは広いダイナミックレンジおよび高飽和閾値を示す。最終的に、それらは、極めてわずかなハンズオン時間を必要とする。全てのこれらのパラメーターは、高スループットスクリーニングの構成を可能にする。
【0030】
本発明はまた、上述の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。ポリヌクレオチドは、二本鎖または一本鎖のゲノムＤＮＡのいずれかの、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ配列などの、ＤＮＡヌクレオチド配列またはＲＮＡヌクレオチド配列を含み得る。
従って、一実施形態では、本発明は、ｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。
従って、一実施形態では、本発明は、ｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチドに関する。
【0031】
リンカー
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、リンカーをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、第１の、第２の、およびポリヌクレオチドは、作動可能に連結される。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、リンカーをコードする第３のポリヌクレオチドをさらに含み、第１の、第２の、およびポリヌクレオチドは、作動可能に連結される。
【0032】
当業者は、リンカーを使用して融合タンパク質の機能を強化または確実にし得ることを理解するであろう。いくつかの融合タンパク質は、融合タンパク質の要素を連結するリンカーの付加により機能的である。いくつかの融合タンパク質は、融合タンパク質の要素を連結するリンカーの付加を必要とする。
【0033】
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、発現産物の溶解度および／または適切なフォールディングおよび／または機能的３Ｄ構造を確実にする。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ｓｏｒＬＡタンパク質をレポーターフラグメントに連結する。
本開示のいくつかの実施形態では、発現時にリンカーは、ｓｏｒＬＡのＮ末端でｓｏｒＬＡと融合される。
本開示のいくつかの実施形態では、発現時にレポーターフラグメントは、リンカーのＮ末端でリンカーと融合される。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１アミノ酸、例えば２アミノ酸、３アミノ酸など、例えば４アミノ酸、５アミノ酸など、例えば６アミノ酸、７アミノ酸など、例えば８アミノ酸、９アミノ酸など、例えば１９アミノ酸、１１アミノ酸など、例えば１２アミノ酸、１３アミノ酸など、例えば１４アミノ酸、１５アミノ酸など、例えば１６アミノ酸、１７アミノ酸など、例えば１８アミノ酸、１９アミノ酸など、例えば２０アミノ酸、２５アミノ酸など、例えば３０アミノ酸、３５アミノ酸など、例えば４０アミノ酸、４５アミノ酸など、例えば５０アミノ酸、５５アミノ酸など、例えば６０アミノ酸、６５アミノ酸など、例えば７０アミノ酸、７５アミノ酸など、例えば８０アミノ酸、８５アミノ酸など、例えば９０アミノ酸、９５アミノ酸など、例えば１００アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、２アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、５アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、８アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、５３アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＬＥのアミノ酸配列からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ｓｏｒＬＡタンパク質をレポーターフラグメントに連結する。
本開示のいくつかの実施形態では、発現時にリンカーは、ｓｏｒＬＡのＮ末端でｓｏｒＬＡと融合される。
本開示のいくつかの実施形態では、発現時にレポーターフラグメントは、リンカーのＮ末端でリンカーと融合される。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１アミノ酸、例えば２アミノ酸、３アミノ酸など、例えば４アミノ酸、５アミノ酸など、例えば６アミノ酸、７アミノ酸など、例えば８アミノ酸、９アミノ酸など、例えば１９アミノ酸、１１アミノ酸など、例えば１２アミノ酸、１３アミノ酸など、例えば１４アミノ酸、１５アミノ酸など、例えば１６アミノ酸、１７アミノ酸など、例えば１８アミノ酸、１９アミノ酸など、例えば２０アミノ酸、２５アミノ酸など、例えば３０アミノ酸、３５アミノ酸など、例えば４０アミノ酸、４５アミノ酸など、例えば５０アミノ酸、５５アミノ酸など、例えば６０アミノ酸、６５アミノ酸など、例えば７０アミノ酸、７５アミノ酸など、例えば８０アミノ酸、８５アミノ酸など、例えば９０アミノ酸、９５アミノ酸など、例えば１００アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、２アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、５アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、８アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、５３アミノ酸からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＬＥのアミノ酸配列からなる。
【0034】
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＬＳＲＳＥ（配列番号１２）のアミノ酸配列からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＬＳＲＳＳＧＧＥ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＥＶＷＴＱＲＬＨＧＧＳＡＰＬＰＱＤＲＧＦＬＶＶＱＧＤＰＲＥＬＲＬＷＡＲＧＤＡＲＧＡＳＲＡＤＥＫＰＬＧＳＧＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＬＳＲＳＳＧＧＥ（配列番号１３）のアミノ酸配列からなる。
本開示のいくつかの実施形態では、リンカーは、ＥＶＷＴＱＲＬＨＧＧＳＡＰＬＰＱＤＲＧＦＬＶＶＱＧＤＰＲＥＬＲＬＷＡＲＧＤＡＲＧＡＳＲＡＤＥＫＰＬＧＳＧＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列からなる。
【0035】
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ポリヌクレオチド構築物は、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる融合タンパク質をコードする。
【0036】
ベクター
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、およびコスミドからなる群より選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターである。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞中で機能的である。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、５’および３’末端反復をさらに含む。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、上記プロモーターは、哺乳動物細胞に特異的である。
本開示のいくつかの実施形態では、上記哺乳動物細胞は、神経細胞である。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化配列をさらに含む。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、転写後調節エレメントに動作可能に連結される。
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、およびコスミドからなる群より選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターである。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物細胞中で機能的である。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、５’および３’末端反復をさらに含む。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーターを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、上記プロモーターは、哺乳動物細胞に特異的である。
本開示のいくつかの実施形態では、上記哺乳動物細胞は、神経細胞である。
本開示のいくつかの実施形態では、ベクターは、ポリアデニル化配列をさらに含む。
本開示のいくつかの実施形態では、上記ヌクレオチド配列は、転写後調節エレメントに動作可能に連結される。
【0037】
本発明の別の態様は、上述の単離ポリヌクレオチドを含む構築物またはベクターに関する。
ベクターは、宿主細胞に遺伝子導入するためおよび上記ポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質を発現するためであり、すなわち、発現ベクターである。
ベクターは、宿主細胞に遺伝子導入するためおよび上記ポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質を発現するためであり、すなわち、発現ベクターである。
【0038】
融合タンパク質
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチドにより、または上記ベクターによりコードされる融合タンパク質に関する。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチドにより、または上記ベクターによりコードされる融合タンパク質に関する。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【0039】
このようなｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質は、高スループットスクリーニングプロトコルの構成にとって理想的である。さらに、ｓｏｒＬＡおよびレポーターフラグメントを含む融合タンパク質は、異常なエンドソーム活性と神経変性疾患の間の関連の根底にある分子機序をさらに明らかにするために使用され得る。
当業者は、融合タンパク質はポリペプチドとして理解できることを理解するであろう。
当業者は、融合タンパク質はポリペプチドとして理解できることを理解するであろう。
【0040】
細胞
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチド構築物および／または上記ベクターおよび／または上記融合タンパク質を含む細胞に関する。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、哺乳動物起源のものである。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、ヒト起源のものである。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫおよびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞からなる群より選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である。
さらなる態様では、本発明は、上記ポリヌクレオチド構築物および／または上記ベクターおよび／または上記融合タンパク質を含む細胞に関する。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、哺乳動物起源のものである。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、ヒト起源のものである。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫおよびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞からなる群より選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、上記細胞は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である。
【0041】
化合物を評価する方法
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類するための方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、
細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現する、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させ、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１のおよび第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）化合物を、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
当業者は、本明細書で開示される方法で採用される細胞のための好適な培地を選択できるであろう。
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類するための方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、
細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現する、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させ、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１のおよび第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）化合物を、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
当業者は、本明細書で開示される方法で採用される細胞のための好適な培地を選択できるであろう。
【0042】
本開示のいくつかの実施形態では、上記方法は、細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を増大させる化合物を特定するために使用される。
本開示のいくつかの実施形態では、上記方法は、細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を低減させる化合物を特定するために使用される。
本開示のいくつかの実施形態では、上記方法は、細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を低減させる化合物を特定するために使用される。
【0043】
本開示のいくつかの実施形態では、上記分類された化合物は、
－化合物がエンドソームを強化するとして分類される場合、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療での使用に好適である、または
－化合物がエンドソームを抑制するとして分類される場合、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療での使用に好適でない。
当業者は、ＡＤの治療での使用に好適な化合物は、エンドソームプロセシングを強化し、従って、ＡＤ患者が有し得るエンドソーム欠乏を弱めることができることを理解するであろう。ＡＤの治療での使用に好適でない化合物は、エンドソームプロセシングを強化しないであろう。あるいは、ＡＤの治療での使用に好適でない化合物は、エンドソームプロセシングを低減し、エンドソームリプレッサーとして作用し、従ってＡＤ患者が有し得るエンドソーム欠乏を悪化させるであろう。
－化合物がエンドソームを強化するとして分類される場合、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療での使用に好適である、または
－化合物がエンドソームを抑制するとして分類される場合、アルツハイマー病（ＡＤ）の治療での使用に好適でない。
当業者は、ＡＤの治療での使用に好適な化合物は、エンドソームプロセシングを強化し、従って、ＡＤ患者が有し得るエンドソーム欠乏を弱めることができることを理解するであろう。ＡＤの治療での使用に好適でない化合物は、エンドソームプロセシングを強化しないであろう。あるいは、ＡＤの治療での使用に好適でない化合物は、エンドソームプロセシングを低減し、エンドソームリプレッサーとして作用し、従ってＡＤ患者が有し得るエンドソーム欠乏を悪化させるであろう。
【0044】
ＳＯＲＬ１変異を評価する方法
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとしてｓｏｒＬＡ変異を分類する方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一である、ステップ、および
（ｂ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、アルツハイマー病に罹患している患者で広く見られる変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の細胞を培養するステップ、
（ｄ）細胞（ａ）および（ｂ）由来の培地中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｅ）ｓｏｒＬＡ変異を、
ｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとしてｓｏｒＬＡ変異を分類する方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列と１００％同一である、ステップ、および
（ｂ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、アルツハイマー病に罹患している患者で広く見られる変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の細胞を培養するステップ、
（ｄ）細胞（ａ）および（ｂ）由来の培地中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｅ）ｓｏｒＬＡ変異を、
ｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、エンドソームを強化するとして、または
ｉｉ．（ａ）の細胞の培地中に比べて（ｂ）の細胞の培地中で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、エンドソームを抑制するとして、
分類するステップ、
を含む。
【0045】
別の態様では、本発明は、ＳＯＲＬ１変異を有すると特定された患者が化合物による治療から恩恵を受けるかどうかを試験するための方法に関し、方法は、
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、上記ＳＯＲＬ１変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させ、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１および第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）患者は、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受ける、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受けない、
であろうと結論付けるステップ、
を含む。
（ａ）上記細胞を用意するステップであって、細胞が、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントからなるまたはそれを含む上記融合タンパク質を発現し、
ｓｏｒＬＡタンパク質が、上記ＳＯＲＬ１変異を含むバリアントである、ステップ、
（ｂ）（ａ）の細胞の第１の分割量を、化合物を含む培地と接触させ、および（ａ）の細胞の第２の分割量を、化合物を含まない培地と接触させるステップ、
（ｃ）第１および第２の分割量中のｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの活性を測定するおよび比較するステップ、および
（ｄ）患者は、
ｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受ける、または
ｉｉ．細胞の第２の分割量に比べて細胞の第１の分割量で、レポーターフラグメント活性の低減が観察される場合、化合物での治療から恩恵を受けない、
であろうと結論付けるステップ、
を含む。
【0046】
本開示のいくつかの実施形態では、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントは、直接にまたは本明細書で開示のリンカーを介してタンパク質ｓｏｒＬＡに融合されたレポーターフラグメントからなる。
本開示のいくつかの実施形態では、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントは、直接にまたは本明細書で開示のリンカーを介してタンパク質ｓｏｒＬＡに融合されたレポーターフラグメントを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、基質の活性を決定することは、レポーターフラグメントの基質の添加を含む。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントの基質は、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ；またはこれらの最適化バリアントに好適な基質である。
本開示のいくつかの実施形態では、基質の活性を決定することは、レポーターフラグメントの基質の添加、および一定期間にわたり基質と共にインキュベートすることを含む。
当業者は、本明細書で開示の酵素レポーターフラグメントなどのレポーターフラグメント活性を決定するための標準的な手順を理解し、好適なインキュベーション期間の長さおよび出力パラメーターを決定できるであろう。
本開示のいくつかの実施形態では、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントは、直接にまたは本明細書で開示のリンカーを介してタンパク質ｓｏｒＬＡに融合されたレポーターフラグメントを含む。
本開示のいくつかの実施形態では、基質の活性を決定することは、レポーターフラグメントの基質の添加を含む。
本開示のいくつかの実施形態では、レポーターフラグメントの基質は、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）、強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ；またはこれらの最適化バリアントに好適な基質である。
本開示のいくつかの実施形態では、基質の活性を決定することは、レポーターフラグメントの基質の添加、および一定期間にわたり基質と共にインキュベートすることを含む。
当業者は、本明細書で開示の酵素レポーターフラグメントなどのレポーターフラグメント活性を決定するための標準的な手順を理解し、好適なインキュベーション期間の長さおよび出力パラメーターを決定できるであろう。
【0047】
当業者は、本明細書で開示の方法を、アッセイ、例えば、スクリーニングアッセイで使用して、エンドソーム活性化またはエンドソーム抑制機能を有する化合物を特定できることを理解するであろう。本明細書で開示の方法は、例えば、アルツハイマー病を治療するエンドソームエンハンサーを特定するための薬物スクリーニングプラットフォームとして使用できる。
【0048】
本明細書で開示の方法、またはこれらの方法を用いるアッセイは、ｓｏｒＬＡが、散発型ＡＤに関連付けられるニューロンソーティング受容体であるという知見を利用する。それは、アミロイド前駆体タンパク質のアミロイド形成的切断を低減する。ＡＤ患者は、ニューロン中のｓｏｒＬＡの発現の低減を示し、不活化変異を有するｓｏｒＬＡバリアントは、ＡＤリスクと関連する。従って、脳脊髄液中の可溶性ｓｏｒＬＡ（ｓｓｏｒＬＡ）レベルは、ＡＤリスクのバイオマーカーとて機能し得る。ｓｓｏｒＬＡのレベルが（健康な）母集団でより低い場合、ＡＤを確立するまたは発症するリスクが示される。本明細書で開示の発明の根底にある研究は、どのように、細胞膜からのｓｏｒＬＡのＴＡＣＥ媒介シェディングが複合体型Ｎ－グリコシル化を必要とし、ｓｏｒＬＡ高いマンノースグリコフォームの複合体型グリコフォームへの変換が細胞膜への輸送後および逆方向輸送中のみに起こるのかを、さらに示す。それにより、我々は、ｓｏｒＬＡが細胞表面に２つの別個のＮ－グリコフォーム、すなわち、排他的な高マンノース型および部分的複合体型、として存在し、複合体型グリコフォームのみが脱落されることを明らかにした。
【0049】
実施例２および３は、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント構築物が野生型機能を呈することを示す。これにより、レポーターフラグメントの細胞外の活性は、脱落したｓｏｒＬＡ（ｓｓｏｒＬＡ）のレベルを示し、これは、細胞表面に存在しエンドサイトーシスおよびエンドソーム輸送経路を介して逆方向ソーティングを受け、その後ＡＤＡＭ１７依存性タンパク分解性プロセシングにより細胞表面から脱落した、成熟ｓｏｒＬＡである。レトロマー促進輸送は、ｓｏｒＬＡがＡＤの発生で保護的役割を果たすために必須である。これは、ＡＤの中核的な病理学的特徴に繋がるレトロマー機能不全と一致する。ｓｓｏｒＬＡ産生を増大させる因子は従って、ＡＤの治療のための潜在的薬物候補であると予測できる。
【0050】
本開示のいくつかの実施形態では、方法は、細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を増大させる化合物を特定するために使用される。細胞培地中のｓｏｒＬＡ融合タンパク質の増大はｓｓｏｒＬＡの増大を表すので、このような化合物は、エンドソーム活性に対し活性化効果を有すると予測される。細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を増大させる化合物は従って、ＡＤの治療のための潜在的薬物候補であると予測される。
ＳＯＲＬ１の特定の病原性バリアントは、家族性／早期発症型ＡＤに関与する。
さらに、エンドソーム機能不全は、ＡＤ発生の最初期の神経病理学的特徴であり、今日では、ＡＤの遺伝的リスク因子に密接に関連付けられている。従って、極めて初期段階でＡＤの進行を防ぐためにエンドソーム機能不全を制御し得る化合物を特定することは、重要な関心事であろう。
ＳＯＲＬ１の特定の病原性バリアントは、家族性／早期発症型ＡＤに関与する。
さらに、エンドソーム機能不全は、ＡＤ発生の最初期の神経病理学的特徴であり、今日では、ＡＤの遺伝的リスク因子に密接に関連付けられている。従って、極めて初期段階でＡＤの進行を防ぐためにエンドソーム機能不全を制御し得る化合物を特定することは、重要な関心事であろう。
【0051】
化合物
当業者は、本明細書で記載のポリヌクレオチド構築物、ベクター、融合タンパク質、細胞または方法が、化合物、すなわち、エンドソームエンハンサーまたはリプレッサーであるそれらの特性を試験される化合物を評価するために使用できることを理解するであろう。これらの化合物は、「試験化合物」と呼ばれることもある。試験化合物は、エンドソームエンハンサーまたはエンドソームリプレッサーであるその特性に関して分析される任意の分子であり得る。例えば、試験化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、高分子または脂質であり得る。試験化合物はまた、遺伝子および／または遺伝子調節および／またはトランスクリプトームレベルで、エンドソーム成熟および輸送機械の構成要素に影響を与える分子でもあり得る。当業者は、好適な化合物、例えば、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アレイライブラリー、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡまたはｃＤＮＡに属する化合物をわかるであろう。
当業者は、本明細書で記載のポリヌクレオチド構築物、ベクター、融合タンパク質、細胞または方法が、化合物、すなわち、エンドソームエンハンサーまたはリプレッサーであるそれらの特性を試験される化合物を評価するために使用できることを理解するであろう。これらの化合物は、「試験化合物」と呼ばれることもある。試験化合物は、エンドソームエンハンサーまたはエンドソームリプレッサーであるその特性に関して分析される任意の分子であり得る。例えば、試験化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、高分子または脂質であり得る。試験化合物はまた、遺伝子および／または遺伝子調節および／またはトランスクリプトームレベルで、エンドソーム成熟および輸送機械の構成要素に影響を与える分子でもあり得る。当業者は、好適な化合物、例えば、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アレイライブラリー、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡまたはｃＤＮＡに属する化合物をわかるであろう。
【0052】
試験化合物は、活性化するもしくは強化するもしくは刺激的な方式（エンドソームエンハンサー）で、または阻害するもしくは不活化するもしくは抑制する方式（エンドソームリプレッサー）で、エンドソーム成熟およびｓｏｒＬＡの成熟および／またはシェディングをもたらす輸送機構の１つまたは複数の構成要素とのその相互作用またはそれらに対する効果に関し、分析される。
【0053】
本開示のいくつかの実施形態では、化合物は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、高分子、脂質、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｃＤＮＡからなる群より選択される。
本開示のいくつかの実施形態では、化合物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アレイライブラリー由来である。
本開示のいくつかの実施形態では、化合物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９アレイライブラリー由来である。
【0054】
キット
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類するためのスクリーニングアッセイを行うためのキットに関し、キットは、
－上記ポリヌクレオチド構築物、および／または
－上記ベクター、および／または
－上記細胞、および
使用説明書、
を含む。
別の態様では、本発明は、エンドソームを強化するまたはエンドソームを抑制するとして化合物を分類するためのスクリーニングアッセイを行うためのキットに関し、キットは、
－上記ポリヌクレオチド構築物、および／または
－上記ベクター、および／または
－上記細胞、および
使用説明書、
を含む。
【0055】
実施例
実施例１：ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡをコードするポリヌクレオチドの構築
目的：
ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物の構築物
実施例１：ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡをコードするポリヌクレオチドの構築
目的：
ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物の構築物
【0056】
材料および方法：
図１は、ＷＴ－ｓｏｒＬＡ（図１Ａ）およびＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）の概略図を示し、ＳＥＡＰはＮ末端に付加され、プロペプチドを置換する。次の手順は、構築物の生成を記載し、ＳＥＡＰは２アミノ酸リンカー（ロイシン、グルタミン酸）を介してｓｏｒＬＡに連結され、配列番号１および図１Ｃのアミノ酸配列を有する構築物を生じた。
図１は、ＷＴ－ｓｏｒＬＡ（図１Ａ）およびＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ（図１Ｂ、Ｃ、Ｄ）の概略図を示し、ＳＥＡＰはＮ末端に付加され、プロペプチドを置換する。次の手順は、構築物の生成を記載し、ＳＥＡＰは２アミノ酸リンカー（ロイシン、グルタミン酸）を介してｓｏｒＬＡに連結され、配列番号１および図１Ｃのアミノ酸配列を有する構築物を生じた。
【0057】
類似の手順が使用されてよく、ＳＥＡＰがｓｏｒＬＡ（配列番号５および図１Ｂ）に直接結合される、または異なる長さのリンカーが付加される（実施例４参照）。
【0058】
ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡをコードするポリヌクレオチド構築物を、次の手順により短いｓｏｒＬＡ挿入断片の増幅のための２段階ＰＣＲを最初に用いることにより調製した（図２の概略図を参照）：ｓｏｒＬＡ ｃＤＮＡの残基５４～内部ＮｈｅＩ部位および内部ＮｓｉＩ部位～残基２２１４＋停止コドンにわたる２つのフラグメントを、単純ＰＣＲにより増幅し、その後ネステッドＰＣＲ反応でテンプレートとして使用して、それらの「合計」を増幅し、隣接ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ認識部位を設けた（図２Ａ、２Ｂ）。
【0059】
このフラグメントをＸｂａＩおよびＸｈｏＩ制限酵素で消化し、その後、同じ２つの酵素で消化されたｐＢＳ－ＫＳクローニングベクターに連結した（図２Ｃ）。
【0060】
ｓｏｒＬＡ ｃＤＮＡの長い内部ＮｈｅＩ－ＮｓｉＩフラグメントを、単離し、隣接ｓｏｒＬＡ配列を含むｐＢＫ－ＫＳプラスミドに連結した。産物は、この時点で、５４～２２１４、停止コドンにわたる、ＸｂａＩとＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ部位に挟まれたｓｏｒＬＡコード領域を含んだ（図２Ｄ）。
【0061】
ＡＰＰに融合されたＳＥＡＰを含むプラスミド（バックボーンベクターｐ１２）は、Ｓｔｅｆａｎ Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒからの贈与であり、ここでＡＰＰ挿入断片の読み枠は、ＸｂａＩ（インフレーム）およびＮｏｔＩフラグメントにより置換できる。この構築物は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でＳＥＡＰ－ＡＰＰを発現する（図２Ｅ）。
【0062】
残基５４～２２１４、停止コドンにわたるｓｏｒＬＡフラグメントを、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ消化後に単離し、最終的に、ｐ１２ベクターに連結し、ＡＰＰ挿入断片は、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ消化後に除去された。
【0063】
最終ポリヌクレオチド構築物は、この時点で、ｐ１２プラスミド中でＳＥＡＰとインフレームでｓｏｒＬＡ ５４～２２１４、停止コドンを含み、ＥＦ１αプロモーターの制御下で発現される（図２Ｆ）。
【0064】
結果：
ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡ構築物を確立した。
ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡ構築物を確立した。
【0065】
結論：
確立されたＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物を使用して、それらの機能を評価し、レポーター（例えば、ＳＥＡＰ）とＳＯＲＬＡの間のリンカーの種々のバリアントを試験することにより例えば実施例４で記載のように、または代替レポーター（ＳＥＡＰの代わりにガウシアルシフェラーゼレポーター）を用いることにより実施例５で記載のように、それらをさらに最適化できる、
確立されたＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物を使用して、それらの機能を評価し、レポーター（例えば、ＳＥＡＰ）とＳＯＲＬＡの間のリンカーの種々のバリアントを試験することにより例えば実施例４で記載のように、または代替レポーター（ＳＥＡＰの代わりにガウシアルシフェラーゼレポーター）を用いることにより実施例５で記載のように、それらをさらに最適化できる、
【0066】
実施例２：対照実験
目的：
ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物の機能を評価する。
目的：
ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物の機能を評価する。
【0067】
材料および方法：
陽性および陰性対照
化学的シャペロンＲ５５は、レトロマーの活性を高める（それにより、「エンドソーム活性化剤」として機能する）ため、従ってｓｏｒＬＡエンドソームソーティングを強化するために使用され得、増大された脱落したｓｏｒＬＡ（ｓｓｏｒＬＡ）産生、および従って条件培地中の増大されたレポーター活性をもたらす。Ｒ５５は従って、例えばＳＯＲＬＡ－レポーター構築物の試験および最適化の間に、エンドソーム活性の尺度としてアッセイを検証するための陽性対照としてアッセイに含まれ得る。従って、化合物Ｒ５５は、概念実証として使用されて、本明細書で記載のアッセイを検証できる。
陽性および陰性対照
化学的シャペロンＲ５５は、レトロマーの活性を高める（それにより、「エンドソーム活性化剤」として機能する）ため、従ってｓｏｒＬＡエンドソームソーティングを強化するために使用され得、増大された脱落したｓｏｒＬＡ（ｓｓｏｒＬＡ）産生、および従って条件培地中の増大されたレポーター活性をもたらす。Ｒ５５は従って、例えばＳＯＲＬＡ－レポーター構築物の試験および最適化の間に、エンドソーム活性の尺度としてアッセイを検証するための陽性対照としてアッセイに含まれ得る。従って、化合物Ｒ５５は、概念実証として使用されて、本明細書で記載のアッセイを検証できる。
【0068】
アッセイに陰性対照、例えばｓｏｒＬＡエンドソームソーティングを低減する薬剤、を含めることも可能であり、低減された脱落したｓｏｒＬＡ（ｓｓｏｒＬＡ）産生および従って条件培地中で低減されたレポーター活性をもたらす（それにより「エンドソームリプレッサー」または「エンドソーム不活性化剤」として機能する）。
【0069】
同様に、好適な陰性対照はまた、ｓｏｒＬＡ構築物であり得、これは、ｓｏｒＬＡエンドソームソーティングが妨害されるように改変され、それにより低減された脱落したｓｏｒＬＡ（ｓｓｏｒＬＡ）産生および従って条件培地中で低減されたレポーター活性をもたらす。
【0070】
さらに、および例えば上記選択肢に関連して、ｓｏｒＬＡ尾部ＦＡＮＳＨＹモチーフ（Ｆｊｏｒｂａｃｋ ２０１２）の変異を有するように設計される上記ｓｏｒＬＡ融合タンパク質は、大きく低減された活性、従って脱落したｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント構築物の低減された産生を示す。これは、ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント構築物が野生型機能を示すことを確証する。例えば、ｓｏｒＬＡ尾部ＦＡＮＳＨＹモチーフの変異を導入することは、それがｗｔ－ｓｏｒＬＡに影響を与えるのと同じように、レポーター－ｓｏｒＬＡ構築物に影響を与えることが、示される。
【0071】
いずれの特定された化合物も、ｓｏｒＬＡ－ＦＡＮＳＨＹがアッセイの陰性対照であるので、これに与える影響について試験され得る。
【0072】
さらに、融合タンパク質がエンドソーム輸送（ＷＴ－ｓｏｒＬＡと同様の）中に獲得されるＮ－グリコシル化の成熟に依存する（ｗｔタンパク質のように）ことを確認して、レトロマー構成要素（ＶＰＳ２６およびＶＰＳ３５）またはＭＧＡＴ１をノックダウン処理した細胞は、脱落したｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント産生および酵素活性の低減を示すであろう。同様に、培地中のレポーター活性は、クロールプロマジン（ＣＰＺ）、ダイナソア（ＤＹＮ）またはｐｉｔｓｔｏｐ２のようなエンドサイトーシス阻害剤で処理した細胞では低減し、なぜならこれは、脱落したｓｏｒＬＡ－レポーター構築物の低減をもたらすからである。
【0073】
ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡレポーター構築物の検出
ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物の３つのバッチを、実施例１に詳述されるように確立した。細胞に構築物を遺伝子導入した。培地（上清）を収集し、細胞を次いで、溶解した。培地および溶解物を、調製し、ウェスタンブロッティングにより分析した（図３）。ウェスタンブロット、を抗ＳＯＲＬＡ抗体で検出した。
ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物の３つのバッチを、実施例１に詳述されるように確立した。細胞に構築物を遺伝子導入した。培地（上清）を収集し、細胞を次いで、溶解した。培地および溶解物を、調製し、ウェスタンブロッティングにより分析した（図３）。ウェスタンブロット、を抗ＳＯＲＬＡ抗体で検出した。
【0074】
結果：
ウェスタンブロットを、抗ＳＯＲＬＡ抗体で検出し、ＷＴ－ＳＯＲＬＡ（上段＝溶解物）およびＳＥＡＰ ＳＯＲＬＡ（下段＝培地）の両方の発現を確認した。図３中の矢印は、ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物を示し、これは予測通り、ｗｔ－ＳＯＲＬＡ（アスタリスク＊）を示すバンドに比べてより大きい分子量のため、ゲル中でより高く泳動する。一般に、溶解物中において、ＷＴ－ｓｏｒＬＡに比べてＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡのより低い発現を観察でき、これは、内在性の状況により類似する発現レベルを目指すＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物の活性の低いプロモーターに起因する。溶解物試料の場合、ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡにより示されるレーンは、反復実験を表す。培地試料の場合、ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡにより示されるレーンは反復実験を表すが、右側の最後のレーン（レーン４）は、より多くの培地をロードされた。このレーンでは、ＳＯＲＬＡシグナルは、遙かに強く、このレーンは、エンドソーム活性化剤が使用され培地中へのｓｏｒＬＡ－レポーター構築物の増大されたシェディングをもたらす場合、予測される結果がどのように見えるかを表す（矢頭）。培地のウェスタンブロット分析（図の下段）は、培地中の脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの存在を確認し、ＷＴ－ｓｏｒＬＡに類似のＡＤＡＭ１７依存性プロセスの場合と同様に、融合タンパク質は切断され脱落したことを示す。
ウェスタンブロットを、抗ＳＯＲＬＡ抗体で検出し、ＷＴ－ＳＯＲＬＡ（上段＝溶解物）およびＳＥＡＰ ＳＯＲＬＡ（下段＝培地）の両方の発現を確認した。図３中の矢印は、ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物を示し、これは予測通り、ｗｔ－ＳＯＲＬＡ（アスタリスク＊）を示すバンドに比べてより大きい分子量のため、ゲル中でより高く泳動する。一般に、溶解物中において、ＷＴ－ｓｏｒＬＡに比べてＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡのより低い発現を観察でき、これは、内在性の状況により類似する発現レベルを目指すＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物の活性の低いプロモーターに起因する。溶解物試料の場合、ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡにより示されるレーンは、反復実験を表す。培地試料の場合、ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡにより示されるレーンは反復実験を表すが、右側の最後のレーン（レーン４）は、より多くの培地をロードされた。このレーンでは、ＳＯＲＬＡシグナルは、遙かに強く、このレーンは、エンドソーム活性化剤が使用され培地中へのｓｏｒＬＡ－レポーター構築物の増大されたシェディングをもたらす場合、予測される結果がどのように見えるかを表す（矢頭）。培地のウェスタンブロット分析（図の下段）は、培地中の脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの存在を確認し、ＷＴ－ｓｏｒＬＡに類似のＡＤＡＭ１７依存性プロセスの場合と同様に、融合タンパク質は切断され脱落したことを示す。
【0075】
図４は、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ，２０２０で提案された、ＳＯＲＬＡ輸送経路の概略図を示す。図４Ａは、合成されたｓｏｒＬＡは、ＥＲ中でおよびシスゴルジ体への移行後にグリコシル化を受け（１）、未成熟ｓｏｒＬＡは、高マンノース（Ｈ）Ｎ－グリカンの成熟を回避でき（２）、細胞表面へ通過できる（３、４）ことを示す。未成熟Ｎ－グリカンを有するｓｏｒＬＡは、ＴＡＣＥの基質ではない（５）が、クラスリンコートピットを介して初期エンドソームに内部移行でき（６）、そこから、それは、ゴルジ体へとレトロマー依存性経路で逆方向輸送を受ける（７）。ここでＮ－グリカンは、細胞表面に戻る複合体型に成熟でき（８、９）、成熟ｓｏｒＬＡはその後、ＴＡＣＥ切断およびシェディングを受けやすい。図４Ｂは、ＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡがどのように類似の輸送経路をたどるかを示す。これは、上記および図３で詳述のように、ウェスタンブロッティングにより確認される。ＳｏｒＬＡに対する抗体は、培地中のＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡを特定し、より大きい分子量のためｗｔ ＳＯＲＬＡよりも遅くゲル中を泳動する（ゲル／ブロット上のより高いバンド）。結論として、ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡは、ＷＴ－ｓｏｒＬＡと同様に脱落し、従って、ｗｔ－ＳＯＲＬＡと同じエンドソーム輸送および改変を受ける。別のレポーターフラグメントを有するいずれかの構築物もまた、この輸送経路を同様にたどると予測される。
【0076】
結論として、ｓｏｒＬＡ輸送経路は、例えば、旅程ソーティングステップ（ｓｏｒｔｉｎｇ ｉｔｉｎｅｒａｒｙ ｓｔｅｐ）（図４ＡまたはＢの７－８－９）のエンドソームエンハンサーの存在下で増殖された細胞において増強され、脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの産生の増大をもたらす。
さらに、ｓｏｒＬＡ輸送経路は、例えば、旅程ソーティングステップ（図４ＡまたはＢの７－８－９）のエンドソームリプレッサーまたは不活化剤の存在下で増殖された細胞において抑制され、脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの産生の低減をもたらす。
我々の結果は、確立されたＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡ構築物は、細胞に遺伝子導入され、かつ細胞溶解物中でおよび培地中で検出できることを示す。これはまた、ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡが機能的であり、ｗｔ－ＳＯＲＬＡと同様に脱落されることを示す。
さらに、ｓｏｒＬＡ輸送経路は、例えば、旅程ソーティングステップ（図４ＡまたはＢの７－８－９）のエンドソームリプレッサーまたは不活化剤の存在下で増殖された細胞において抑制され、脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡの産生の低減をもたらす。
我々の結果は、確立されたＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡ構築物は、細胞に遺伝子導入され、かつ細胞溶解物中でおよび培地中で検出できることを示す。これはまた、ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡが機能的であり、ｗｔ－ＳＯＲＬＡと同様に脱落されることを示す。
【0077】
結論：
ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡ構築物を用いて、増大された脱落したＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡまたは低減された脱落したＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡをそれぞれもたらすエンドソーム活性化剤またはエンドソームリプレッサーの効果を試験できる。これに基づき、アッセイは、種々の陽性および陰性対照、すなわちＳＯＲＬＡシェディングを増大または低減させると知られる因子またはＳＯＲＬＡ変異を用いて、さらに検証できる。
ＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡ構築物を用いて、増大された脱落したＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡまたは低減された脱落したＳＥＡＰ－ＳＯＲＬＡをそれぞれもたらすエンドソーム活性化剤またはエンドソームリプレッサーの効果を試験できる。これに基づき、アッセイは、種々の陽性および陰性対照、すなわちＳＯＲＬＡシェディングを増大または低減させると知られる因子またはＳＯＲＬＡ変異を用いて、さらに検証できる。
【0078】
実施例３：アッセイプロトコル
目的：
アッセイの説明。
目的：
アッセイの説明。
【0079】
材料および方法：
実施例１に記載のようにＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物を安定に発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株を、生成する。他のヒト細胞株、例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＳＹ５Ｙ細胞株などの、他の細胞株も使用し得る。
実施例１に記載のようにＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡ構築物を安定に発現するＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞株を、生成する。他のヒト細胞株、例えば、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＳＹ５Ｙ細胞株などの、他の細胞株も使用し得る。
【0080】
細胞を、９６／３８４ウェルプレートに播種し、８０～１００％集密度の密度に達するまで培養した（図５Ａ）。いくらかの細胞に、試験化合物を次に新鮮培地と一緒に加え、他の細胞には、ビークルおよび新鮮培地を加える。例えば、試験化合物を加える場合、化合物は、緩衝液などのビークル中に溶解され得る（「試験試料」）。試験化合物を加えない場合、ビークルのみが細胞に加えられる（「ビークル」または「試験化合物－対照なし」）。試験化合物はまた、細胞に添加される培地中に直接溶解され得る。この場合、培地のみが、「試験－化合物－対象なし」に関して細胞に添加される。細胞を次に、２４または４８時間インキュベートする。ＳＥＡＰの活性がその後、この分野で使用される標準的な方法を用いて測定される。例えば、脱落したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡを含む培地は、新規試験容器に移され、ＳＥＡＰの基質が添加される。これは、例えば放射光または色変化の形態で、測定可能なシグナルを生じ、それは測定される（図５Ｂ）。
【0081】
結果：
ベースラインレポーターシグナルが、試験化合物に曝露されなかった培地中で細胞から収集した培地中のレポーターシグナルを測定することにより確立される（「ビークル」または「試験化合物－対象なし」）。その後の分析で、この値、例えばいくつかの試料の平均値が、１００％のレポーターシグナルと見なされ得る（図５Ｃ）。各試験化合物に対し、レポーターシグナルが測定される。
ベースラインレポーターシグナルが、試験化合物に曝露されなかった培地中で細胞から収集した培地中のレポーターシグナルを測定することにより確立される（「ビークル」または「試験化合物－対象なし」）。その後の分析で、この値、例えばいくつかの試料の平均値が、１００％のレポーターシグナルと見なされ得る（図５Ｃ）。各試験化合物に対し、レポーターシグナルが測定される。
【0082】
増大されたレポーターシグナルをもたらす試験化合物は、高められたｓｏｒＬＡ－レポーターエンドソームプロセシングおよびシェディングをもたらすエンドソームエンハンサーである（例えば、図５Ｃで灰色矢印により示される試料）。
【0083】
低減されたレポーターシグナルをもたらす試験化合物は、低減されたｓｏｒＬＡ－レポーターエンドソームプロセシングおよびシェディングをもたらすエンドソームリプレッサーである（例えば、図５Ｃで白色矢印により示される試料）。原理を図５Ｄにまとめる。
【0084】
結論：
増大されたレポーターシグナルを誘発する試験化合物は、ｓｏｒＬＡ－レポーター－構築物の増大されたエンドソームプロセシングおよびシェディングをもたらすエンドソーム活性化剤として分類できる。
低減されたレポーターシグナルを誘発する試験化合物は、ｓｏｒＬＡ－レポーター－構築物の低減されたエンドソームプロセシングおよびシェディングをもたらすエンドソームリプレッサーとして分類できる。
増大されたレポーターシグナルを誘発する試験化合物は、ｓｏｒＬＡ－レポーター－構築物の増大されたエンドソームプロセシングおよびシェディングをもたらすエンドソーム活性化剤として分類できる。
低減されたレポーターシグナルを誘発する試験化合物は、ｓｏｒＬＡ－レポーター－構築物の低減されたエンドソームプロセシングおよびシェディングをもたらすエンドソームリプレッサーとして分類できる。
【0085】
実施例１で記載されるようなｓｏｒＬＡ－レポーター構築物および実施例２におけるような任意選択の陽性および陰性対照を用いる上記のアッセイは、エンドソームエンハンサーまたはエンドソームリプレッサーを特定するまたはスクリーニングするための容易で直接的な、定量化可能手法を提供する。アッセイは、高スループット用途に好適である。
【0086】
実施例４：リンカー延長
目的：
ＳＥＡＰおよびＳＯＲＬＡパートナーを連結する種々のリンカー配列を用いるレポーター活性の最適化。
目的：
ＳＥＡＰおよびＳＯＲＬＡパートナーを連結する種々のリンカー配列を用いるレポーター活性の最適化。
【0087】
材料および方法：
ＳＥＡＰとＳＯＲＬＡ ＶＰＳ１０ｐドメインの間のリンカーは、９ヌクレオチド挿入を有する一連のプライマーおよびテンプレートとして図１Ｃに示すレポーター構築物（２アミノ酸リンカーを有する構築物）を用いる部位特異的変異誘発により、２アミノ酸（６ヌクレオチド）～５アミノ酸延長される。これは、配列番号２および図１Ｃのアミノ酸配列を有する構築物をもたらす。
ＳＥＡＰとＳＯＲＬＡ ＶＰＳ１０ｐドメインの間のリンカーは、９ヌクレオチド挿入を有する一連のプライマーおよびテンプレートとして図１Ｃに示すレポーター構築物（２アミノ酸リンカーを有する構築物）を用いる部位特異的変異誘発により、２アミノ酸（６ヌクレオチド）～５アミノ酸延長される。これは、配列番号２および図１Ｃのアミノ酸配列を有する構築物をもたらす。
【0088】
次の実験では、８アミノ酸へのリンカーのさらなる延長が、方法を反復することおよび、再度、追加の９ヌクレオチド挿入を有する新規セットのプライマーを用いることにより、実施される（図１Ｃ）。これは、配列番号３および図１Ｃのアミノ酸配列を有する構築物をもたらす。
【0089】
さらに別の実験では、ＳＯＲＬＡの完全な５３アミノ酸プロペプチド（図１Ｄ）（ＳＯＲＬＡ配列、ユニプロットＱ９２６７３の残基２９～８１に対応する）が、リンカーとして含まれるが、フーリンの切断部位である配列ＲＲＫＲ８１が、ＧＳＧＳ配列で置換されている。これは、配列番号４および図１Ｄのアミノ酸配列を有する構築物をもたらす。
【0090】
リンカーの任意の他の長さ、例えば１～５３アミノ酸の任意の長さもまた試験され得る。リンカーとしてアミノ酸を選択する基準は、アミノ酸が不活性、水溶性で、芳香族アミノ酸のように立体的に障害しないことである。例えば、我々は、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の配列のリンカーを使用し試験する。しかし、他の長さのリンカー、および異なるアミノ酸組成または配列のリンカーも試験されてよい。
【0091】
ＳＥＡＰセットのレポーター構築物の活性は、Ｎ２ａ細胞の一時的遺伝子導入および２４時間前処置培地の収集により測定され、その後、供給業者のガイドラインに従って市販のＱｕａｎｔｉ－Ｂｌｕｅ検出アッセイにより定量される。
【0092】
結果：
異なるＳＥＡＰレポーター構築物の測定された活性を比較することにより、機能的および／または最適構築物が特定される。
異なるＳＥＡＰレポーター構築物の測定された活性を比較することにより、機能的および／または最適構築物が特定される。
【0093】
結論：
我々は、試験したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡレポーター構築物中で最適なリンカーを特定できる。
我々は、試験したＳＥＡＰ－ｓｏｒＬＡレポーター構築物中で最適なリンカーを特定できる。
【0094】
実施例５：ガウシアルシフェラーゼレポーター
目的：
融合レポーターとしてＳＥＡＰ（約６０ｋＤａ；５５０アミノ酸）を使用することに代えて、我々は、ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物中の融合パートナーとして、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）と呼ばれる、カイアシ類（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）由来のより小さい（約１８ｋＤａ；１８０アミノ酸）ルシフェラーゼを試験する（図１Ｅ、Ｆ）。最小のルシフェラーゼであることに加えて、Ｇｌｕｃはまた、標準ルシフェラーゼレポーターより約２，０００倍超高感度であり、かつＳＥＡＰより約２０，０００倍超高感度である。Ｇｌｕｃからの発光シグナルの急速消滅の潜在問題を回避するために、我々は、Ｚａｄｏｏ ｅｔ ａｌ（Ｚａｄｏｏ ２０１６）により記載されるように、酸化しやすいメチオニンＭ４３１およびＭ１１０の置換を有する変異バージョンのＧｌｕｃ（ｅＧｌｕｃ－Ｍ４３１Ｉ；Ｍ１１０Ｉ）を使用する。
目的：
融合レポーターとしてＳＥＡＰ（約６０ｋＤａ；５５０アミノ酸）を使用することに代えて、我々は、ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物中の融合パートナーとして、ガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）と呼ばれる、カイアシ類（Ｇａｕｓｓｉａ ｐｒｉｎｃｅｐｓ）由来のより小さい（約１８ｋＤａ；１８０アミノ酸）ルシフェラーゼを試験する（図１Ｅ、Ｆ）。最小のルシフェラーゼであることに加えて、Ｇｌｕｃはまた、標準ルシフェラーゼレポーターより約２，０００倍超高感度であり、かつＳＥＡＰより約２０，０００倍超高感度である。Ｇｌｕｃからの発光シグナルの急速消滅の潜在問題を回避するために、我々は、Ｚａｄｏｏ ｅｔ ａｌ（Ｚａｄｏｏ ２０１６）により記載されるように、酸化しやすいメチオニンＭ４３１およびＭ１１０の置換を有する変異バージョンのＧｌｕｃ（ｅＧｌｕｃ－Ｍ４３１Ｉ；Ｍ１１０Ｉ）を使用する。
【0095】
Ｍａｇｕｉｒｅらも、使用し得るガウシアルシフェラーゼバリアント（ＧｌｕｃＭ４３Ｉ）（Ｍａｇｕｉｒｅ ２００９）を記載した。最適化された特性を有するこの変異体は、強化型Ｇｌｕｃ（ｅＧｌｕｃ）と呼ばれることもある。
【0096】
材料および方法：
リンカー（例えば、２、５または８アミノ酸のリンカー）でＭＹＯＣ遺伝子（Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｈｕｌｌｅｍａｎにより提供された）に付着された強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）レポーターを含むベクターは、テンプレートとして機能し、我々は、ＭＹＯＣ挿入断片をＳＯＲＬ１コーディングフレームで置換する。これは、配列番号６および図１Ｅ；および配列番号７ならびに図１Ｅおよび配列番号８ならびに図１Ｅのアミノ酸配列を有する構築物をもたらす。最初のＰＣＲで、我々は、増幅されたフラグメントの両部位に付着末端を作製する一連のプライマーを用いて、ｅＧｌｕｃおよびベクターを増幅する－しかしＭＹＯＣ部分を含まない。第２のＰＣＲで、我々は、ｅＧｌｕｃ－ベクター構築物の付着末端と一致する適合性のある付着末端を作成する別のプライマーセットを有する上記のＳＯＲＬ１発現プラスミド発現プラスミド由来のＳＯＲＬＡ領域を増幅する。これらの２つのフラグメントはその後、ギブソンアセンブリー法（１回の等温反応で複数のＤＮＡフラグメントのライゲーションを可能にする分子クローニング法）を用いて結合される。２、５、または８アミノ酸リンカーを有するＳＯＲＬＡ－ｅＧｌｕｃレポーター構築物は、標準ＤＮＡ塩基配列決定法により検証される。
リンカー（例えば、２、５または８アミノ酸のリンカー）でＭＹＯＣ遺伝子（Ｊｏｈｎ Ｄ．Ｈｕｌｌｅｍａｎにより提供された）に付着された強化型ガウシアルシフェラーゼ（ｅＧｌｕｃ）レポーターを含むベクターは、テンプレートとして機能し、我々は、ＭＹＯＣ挿入断片をＳＯＲＬ１コーディングフレームで置換する。これは、配列番号６および図１Ｅ；および配列番号７ならびに図１Ｅおよび配列番号８ならびに図１Ｅのアミノ酸配列を有する構築物をもたらす。最初のＰＣＲで、我々は、増幅されたフラグメントの両部位に付着末端を作製する一連のプライマーを用いて、ｅＧｌｕｃおよびベクターを増幅する－しかしＭＹＯＣ部分を含まない。第２のＰＣＲで、我々は、ｅＧｌｕｃ－ベクター構築物の付着末端と一致する適合性のある付着末端を作成する別のプライマーセットを有する上記のＳＯＲＬ１発現プラスミド発現プラスミド由来のＳＯＲＬＡ領域を増幅する。これらの２つのフラグメントはその後、ギブソンアセンブリー法（１回の等温反応で複数のＤＮＡフラグメントのライゲーションを可能にする分子クローニング法）を用いて結合される。２、５、または８アミノ酸リンカーを有するＳＯＲＬＡ－ｅＧｌｕｃレポーター構築物は、標準ＤＮＡ塩基配列決定法により検証される。
【0097】
別の実験では、我々は、ｅＧｌｕｃ－ｓｏｒＬＡレポーター構築物を生成し、ここでリンカーは、フーリンの切断部位である配列ＲＲＫＲ８１がＧＳＧＳ配列で置換されている５３アミノ酸ＳＯＲＬＡプロペプチドにより作製される。これは、配列番号９および図１Ｆのアミノ酸配列を有する構築物をもたらす。
【0098】
ｅＧｌｕｃ－ｓｏｒＬＡレポーター構築物の活性は、Ｎ２ａ細胞の一時的遺伝子導入により試験され、記載のように（Ｚａｄｏｏ ２０１６）、例えば、実施例３および図５で例示されるように、Ｇｌｕｃアッセイにより定量された。
【0099】
結果：
異なるＧｌｕｃレポーター構築物の測定された活性を比較することにより、機能的なおよび／または最適な構築物が特定される。
異なるＧｌｕｃレポーター構築物の測定された活性を比較することにより、機能的なおよび／または最適な構築物が特定される。
【0100】
結論：
我々は、遺伝子導入細胞から培地中に脱落したｓｓｏｒＬＡの定量化のために使用できるＧｌｕｃ－ＳＯＲＬＡレポーター構築物を特定する。
我々は、遺伝子導入細胞から培地中に脱落したｓｓｏｒＬＡの定量化のために使用できるＧｌｕｃ－ＳＯＲＬＡレポーター構築物を特定する。
【0101】
実施例６：病原性ＳＯＲＬ１バリアント
目的：
第１に、ＳＯＲＬ１中の既知の病原性ミスセンスバリアントに対応する変異の導入が、遺伝子導入細胞由来の培地中のレポーター活性の量を低減することを実証すること。第２に、所与のＳＯＲＬ１バリアントが、エンドソーム活性を高める薬物に応答するかどうかを試験すること。
目的：
第１に、ＳＯＲＬ１中の既知の病原性ミスセンスバリアントに対応する変異の導入が、遺伝子導入細胞由来の培地中のレポーター活性の量を低減することを実証すること。第２に、所与のＳＯＲＬ１バリアントが、エンドソーム活性を高める薬物に応答するかどうかを試験すること。
【0102】
材料および方法：
我々は、変異構築物のシェディングが損なわれた遺伝子導入Ｎ２ａ細胞のウェスタンブロッティングにより示される低減されたｓｓｏｒＬＡレベルをもたらすことを我々が以前に示した、一連のＳＯＲＬ１ミスセンスバリアントを選択する。各変異は、部位特異的変異誘発により、選択されたレポーター構築物（すなわち、最適化レポーター構築物、実施例１～５参照）に導入される。
所与のＳＯＲＬ１バリアントレポーター構築物を発現する細胞は、所定の薬物で処理され、標準比色分析法により活性について試験される。
我々は、変異構築物のシェディングが損なわれた遺伝子導入Ｎ２ａ細胞のウェスタンブロッティングにより示される低減されたｓｓｏｒＬＡレベルをもたらすことを我々が以前に示した、一連のＳＯＲＬ１ミスセンスバリアントを選択する。各変異は、部位特異的変異誘発により、選択されたレポーター構築物（すなわち、最適化レポーター構築物、実施例１～５参照）に導入される。
所与のＳＯＲＬ１バリアントレポーター構築物を発現する細胞は、所定の薬物で処理され、標準比色分析法により活性について試験される。
【0103】
結果：
変異または野性型レポーター構築物でのＮ２ａ細胞の遺伝子導入は、Ｆｕｇｅｎｅ標準プロトコルを用いて実施され、培地は、２４時間後に回収され、その後上述のレポーター活性の測定に使用される。
変異または野性型レポーター構築物でのＮ２ａ細胞の遺伝子導入は、Ｆｕｇｅｎｅ標準プロトコルを用いて実施され、培地は、２４時間後に回収され、その後上述のレポーター活性の測定に使用される。
【0104】
結論：
我々は、病原性ＳＯＲＬ１バリアントを有するレポーター構築物が、野性型ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物に比べて、遺伝子導入細胞由来の培地中で低減されたレポーター活性を有することを明らかにする。我々は、変異体ＳＯＲＬＡタンパク質がエンドソーム活性を増大させる薬物に応答できるかどうかを決定できる。
我々は、病原性ＳＯＲＬ１バリアントを有するレポーター構築物が、野性型ｓｏｒＬＡ－レポーター構築物に比べて、遺伝子導入細胞由来の培地中で低減されたレポーター活性を有することを明らかにする。我々は、変異体ＳＯＲＬＡタンパク質がエンドソーム活性を増大させる薬物に応答できるかどうかを決定できる。
【0105】
これに基づき、我々は、レポーター構築物が、特定されたＳＯＲＬ１バリアントの病原性をスクリーニングするのに好適であると結論できる。例えば、病原性ＳＯＲＬ１バリアントを有するレポーター構築物は、陰性対照として機能し得る。これは最終的に、ＡＤに対するエンドソームエンハンサーを試験する臨床試験に登録できるＳＯＲＬ１担体を特定する目的に役立つであろう。
【0106】
配列
配列番号１
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（２アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｃに示す通り
リンカーは下線で示される
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
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ＤＤＹＳＱＧＧＴＲＬ ＤＧＫＮＬＶＱＥＷＬ ＡＫＲＱＧＡＲＹＶＷ
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ＨＲＤＳＴＬＤＰＳＬ ＭＥＭＴＥＡＡＬＲＬ ＬＳＲＮＰＲＧＦＦＬ
ＦＶＥＧＧＲＩＤＨＧ ＨＨＥＳＲＡＹＲＡＬ ＴＥＴＩＭＦＤＤＡＩ
ＥＲＡＧＱＬＴＳＥＥ ＤＴＬＳＬＶＴＡＤＨ ＳＨＶＦＳＦＧＧＹＰ
ＬＲＧＳＳＩＦＧＬＡ ＰＧＫＡＲＤＲＫＡＹ ＴＶＬＬＹＧＮＧＰＧ
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ＥＥＴＨＡＧＥＤＶＡ ＶＦＡＲＧＰＱＡＨＬ ＶＨＧＶＱＥＱＴＦＩ
ＡＨＶＭＡＦＡＡＣＬ ＥＰＹＴＡＣＤＬＡＰ ＰＡＧＴＴＤＡＡＨＰ
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ＫＳＳＤＶＹＶＳＹＤ ＹＧＫＳＦＫＫＩＳＤ ＫＬＮＦＧＬＧＮＲＳ
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ＧＳＭＮＥＥＮＭＲＳ ＶＩＴＦＤＫＧＧＴＷ ＥＦＬＱＡＰＡＦＴＧ
ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
ＲＭＰＩＬＳＫＥＳＡ ＰＧＬＩＩＡＴＧＳＶ ＧＫＮＬＡＳＫＴＮＶ
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ＡＩＡＱＧＭＥＴＮＥ ＬＫＹＳＴＮＥＧＥＴ ＷＫＴＦＩＦＳＥＫＰ
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ＬＩＬＱＶＮＡＴＤＡ ＬＧＶＰＣＴＥＮＤＹ ＫＬＷＳＰＳＤＥＲＧ
ＮＥＣＬＬＧＨＫＴＶ ＦＫＲＲＴＰＨＡＴＣ ＦＮＧＥＤＦＤＲＰＶ
ＶＶＳＮＣＳＣＴＲＥ ＤＹＥＣＤＦＧＦＫＭ ＳＥＤＬＳＬＥＶＣＶ
ＰＤＰＥＦＳＧＫＳＹ ＳＰＰＶＰＣＰＶＧＳ ＴＹＲＲＴＲＧＹＲＫ
ＩＳＧＤＴＣＳＧＧＤ ＶＥＡＲＬＥＧＥＬＶ ＰＣＰＬＡＥＥＮＥＦ
ＩＬＹＡＶＲＫＳＩＹ ＲＹＤＬＡＳＧＡＴＥ ＱＬＰＬＴＧＬＲＡＡ
ＶＡＬＤＦＤＹＥＨＮ ＣＬＹＷＳＤＬＡＬＤ ＶＩＱＲＬＣＬＮＧＳ
ＴＧＱＥＶＩＩＮＳＧ ＬＥＴＶＥＡＬＡＦＥ ＰＬＳＱＬＬＹＷＶＤ
ＡＧＦＫＫＩＥＶＡＮ ＰＤＧＤＦＲＬＴＩＶ ＮＳＳＶＬＤＲＰＲＡ
ＬＶＬＶＰＱＥＧＶＭ ＦＷＴＤＷＧＤＬＫＰ ＧＩＹＲＳＮＭＤＧＳ
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ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
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ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
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ＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶ ＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨ ＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹ
ＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳ ＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩ ＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴ
ＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧ ＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩ ＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰ
ＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥ ＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥ ＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶ
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ＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤ ＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴ ＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳ
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ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
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ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号２
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｃに示す通り
リンカーは下線で示される
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
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ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
ＲＭＰＩＬＳＫＥＳＡ ＰＧＬＩＩＡＴＧＳＶ ＧＫＮＬＡＳＫＴＮＶ
ＹＩＳＳＳＡＧＡＲＷ ＲＥＡＬＰＧＰＨＹＹ ＴＷＧＤＨＧＧＩＩＴ
ＡＩＡＱＧＭＥＴＮＥ ＬＫＹＳＴＮＥＧＥＴ ＷＫＴＦＩＦＳＥＫＰ
ＶＦＶＹＧＬＬＴＥＰ ＧＥＫＳＴＶＦＴＩＦ ＧＳＮＫＥＮＶＨＳＷ
ＬＩＬＱＶＮＡＴＤＡ ＬＧＶＰＣＴＥＮＤＹ ＫＬＷＳＰＳＤＥＲＧ
ＮＥＣＬＬＧＨＫＴＶ ＦＫＲＲＴＰＨＡＴＣ ＦＮＧＥＤＦＤＲＰＶ
ＶＶＳＮＣＳＣＴＲＥ ＤＹＥＣＤＦＧＦＫＭ ＳＥＤＬＳＬＥＶＣＶ
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ＩＳＧＤＴＣＳＧＧＤ ＶＥＡＲＬＥＧＥＬＶ ＰＣＰＬＡＥＥＮＥＦ
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ＶＡＬＤＦＤＹＥＨＮ ＣＬＹＷＳＤＬＡＬＤ ＶＩＱＲＬＣＬＮＧＳ
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ＡＧＦＫＫＩＥＶＡＮ ＰＤＧＤＦＲＬＴＩＶ ＮＳＳＶＬＤＲＰＲＡ
ＬＶＬＶＰＱＥＧＶＭ ＦＷＴＤＷＧＤＬＫＰ ＧＩＹＲＳＮＭＤＧＳ
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ＥＣＩＥＲＩＴＦＳＧ ＱＱＲＳＶＩＬＤＮＬ ＰＨＰＹＡＩＡＶＦＫ
ＮＥＩＹＷＤＤＷＳＱ ＬＳＩＦＲＡＳＫＹＳ ＧＳＱＭＥＩＬＡＮＱ
ＬＴＧＬＭＤＭＫＩＦ ＹＫＧＫＮＴＧＳＮＡ ＣＶＰＲＰＣＳＬＬＣ
ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
ＰＱＧＹＱＬＫＮＮＴ ＣＶＫＱＥＮＴＣＬＲ ＮＱＹＲＣＳＮＧＮＣ
ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
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ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号３
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（８アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｃに示す通り
リンカーは下線で示される
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ
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ＡＡＹＨＬＶＳＥＤＶ ＫＷＰＮＧＩＳＶＤＤ ＱＷＩＹＷＴＤＡＹＬ
ＥＣＩＥＲＩＴＦＳＧ ＱＱＲＳＶＩＬＤＮＬ ＰＨＰＹＡＩＡＶＦＫ
ＮＥＩＹＷＤＤＷＳＱ ＬＳＩＦＲＡＳＫＹＳ ＧＳＱＭＥＩＬＡＮＱ
ＬＴＧＬＭＤＭＫＩＦ ＹＫＧＫＮＴＧＳＮＡ ＣＶＰＲＰＣＳＬＬＣ
ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
ＰＱＧＹＱＬＫＮＮＴ ＣＶＫＱＥＮＴＣＬＲ ＮＱＹＲＣＳＮＧＮＣ
ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
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ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
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ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号４
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５３アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｄに示す通り
リンカーは下線で示される
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ
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ＮＥＩＹＷＤＤＷＳＱ ＬＳＩＦＲＡＳＫＹＳ ＧＳＱＭＥＩＬＡＮＱ
ＬＴＧＬＭＤＭＫＩＦ ＹＫＧＫＮＴＧＳＮＡ ＣＶＰＲＰＣＳＬＬＣ
ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
ＰＱＧＹＱＬＫＮＮＴ ＣＶＫＱＥＮＴＣＬＲ ＮＱＹＲＣＳＮＧＮＣ
ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
ＴＱＦＲＣＱＥＳＧＴ ＣＩＰＬＳＹＫＣＤＬ ＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥ
ＳＨＣＥＭＨＱＣＲＳ ＤＥＹＮＣＳＳＧＭＣ ＩＲＳＳＷＶＣＤＧＤ
ＮＤＣＲＤＷＳＤＥＡ ＮＣＴＡＩＹＨＴＣＥ ＡＳＮＦＱＣＲＮＧＨ
ＣＩＰＱＲＷＡＣＤＧ ＤＴＤＣＱＤＧＳＤＥ ＤＰＶＮＣＥＫＫＣＮ
ＧＦＲＣＰＮＧＴＣＩ ＰＳＳＫＨＣＤＧＬＲ ＤＣＳＤＧＳＤＥＱＨ
ＣＥＰＬＣＴＨＦＭＤ ＦＶＣＫＮＲＱＱＣＬ ＦＨＳＭＶＣＤＧＩＩ
ＱＣＲＤＧＳＤＥＤＡ ＡＦＡＧＣＳＱＤＰＥ ＦＨＫＶＣＤＥＦＧＦ
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ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
ＴＬＴＣＭＳＲＥＦＱ ＣＥＤＧＥＡＣＩＶＬ ＳＥＲＣＤＧＦＬＤＣ
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ＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫ ＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶ ＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷ
ＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴ ＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤ ＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱ
ＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤ ＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬ ＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳ
ＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶ ＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨ ＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹ
ＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳ ＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩ ＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴ
ＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧ ＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩ ＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰ
ＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥ ＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥ ＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶ
ＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫ ＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧ ＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬ
ＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡ ＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰ ＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧ
ＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡ ＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣ ＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹ
ＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤ ＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴ ＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳ
ＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲ ＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳ ＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤ
ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号５
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）（リンカーなし）
図１Ｂに示す通り
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ
ＦＬＧＤＧＭＧＶＳＴ ＶＴＡＡＲＩＬＫＧＱ ＫＫＤＫＬＧＰＥＩＰ
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配列番号６
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（２アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
図１Ｅに示す通り
リンカーは下線で示される
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配列番号７
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
図１Ｅに示す通り
リンカーは下線で示される
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ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号８
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（８アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
図１Ｅに示す通り
リンカーは下線で示される
ＫＰＴＥＮＮＥＤＦＮＩＶＡＶＡＳＮＦＡＴＴＤＬＤＡＤＲＧＫＬＰＧＫＫＬＰＬＥＶＬＫＥＩＥＡＮＡＲＫＡＧＣＴＲＧＣＬＩＣＬＳＨＩＫＣＴＰＫＭＫＫＦＩＰＧＲＣＨＴＹＥＧＤＫＥＳＡＱＧＧＩＧＥＡＩＶＤＩＰＥＩＰＧＦＫＤＬＥＰＩＥＱＦＩＡＱＶＤＬＣＶＤＣＴＴＧＣＬＫＧＬＡＮＶＱＣＳＤＬＬＫＫＷＬＰＱＲＣＡＴＦＡＳＫＩＱＧＱＶＤＫＩＫＧＡＧＧＤＬＳＲＳＳＧＧＥＳＡＡＬＱＰＥＰＩ ＫＶＹＧＱＶＳＬＮＤ
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ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号９
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５３アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
図１Ｆに示す通り
ＫＰＴＥＮＮＥＤＦＮＩＶＡＶＡＳＮＦＡＴＴＤＬＤＡＤＲＧＫＬＰＧＫＫＬＰＬＥＶＬＫＥＩＥＡＮＡＲＫＡＧＣＴＲＧＣＬＩＣＬＳＨＩＫＣＴＰＫＭＫＫＦＩＰＧＲＣＨＴＹＥＧＤＫＥＳＡＱＧＧＩＧＥＡＩＶＤＩＰＥＩＰＧＦＫＤＬＥＰＩＥＱＦＩＡＱＶＤＬＣＶＤＣＴＴＧＣＬＫＧＬＡＮＶＱＣＳＤＬＬＫＫＷＬＰＱＲＣＡＴＦＡＳＫＩＱＧＱＶＤＫＩＫＧＡＧＧＤ
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ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
ＰＱＧＹＱＬＫＮＮＴ ＣＶＫＱＥＮＴＣＬＲ ＮＱＹＲＣＳＮＧＮＣ
ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
ＴＱＦＲＣＱＥＳＧＴ ＣＩＰＬＳＹＫＣＤＬ ＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥ
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ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
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ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号１０
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質
ＳＡＡＬＱＰＥＰＩ ＫＶＹＧＱＶＳＬＮＤ
ＳＨＮＱＭＶＶＨＷＡ ＧＥＫＳＮＶＩＶＡＬ ＡＲＤＳＬＡＬＡＲＰ
ＫＳＳＤＶＹＶＳＹＤ ＹＧＫＳＦＫＫＩＳＤ ＫＬＮＦＧＬＧＮＲＳ
ＥＡＶＩＡＱＦＹＨＳ ＰＡＤＮＫＲＹＩＦＡ ＤＡＹＡＱＹＬＷＩＴ
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ＩＬＹＡＶＲＫＳＩＹ ＲＹＤＬＡＳＧＡＴＥ ＱＬＰＬＴＧＬＲＡＡ
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ＮＥＩＹＷＤＤＷＳＱ ＬＳＩＦＲＡＳＫＹＳ ＧＳＱＭＥＩＬＡＮＱ
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ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
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ＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫ ＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶ ＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷ
ＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴ ＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤ ＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱ
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ＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥ ＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥ ＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶ
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ＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤ ＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴ ＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳ
ＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲ ＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳ ＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤ
ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
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ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号１１
ＳＥＡＰレポーター
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ
ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ ＦＬＧＤＧＭＧＶＳＴ
ＶＴＡＡＲＩＬＫＧＱ ＫＫＤＫＬＧＰＥＩＰ ＬＡＭＤＲＦＰＹＶＡ
ＬＳＫＴＹＮＶＤＫＨ ＶＰＤＳＧＡＴＡＴＡ ＹＬＣＧＶＫＧＮＦＱ
ＴＩＧＬＳＡＡＡＲＦ ＮＱＣＮＴＴＲＧＮＥ ＶＩＳＶＭＮＲＡＫＫ
ＡＧＫＳＶＧＶＶＴＴ ＴＲＶＱＨＡＳＰＡＧ ＴＹＡＨＴＶＮＲＮＷ
ＹＳＤＡＤＶＰＡＳＡ ＲＱＥＧＣＱＤＩＡＴ ＱＬＩＳＮＭＤＩＤＶ
ＩＬＧＧＧＲＫＹＭＦ ＲＭＧＴＰＤＰＥＹＰ ＤＤＹＳＱＧＧＴＲＬ
ＤＧＫＮＬＶＱＥＷＬ ＡＫＲＱＧＡＲＹＶＷ ＮＲＴＥＬＭＱＡＳＬ
ＤＰＳＶＴＨＬＭＧＬ ＦＥＰＧＤＭＫＹＥＩ ＨＲＤＳＴＬＤＰＳＬ
ＭＥＭＴＥＡＡＬＲＬ ＬＳＲＮＰＲＧＦＦＬ ＦＶＥＧＧＲＩＤＨＧ
ＨＨＥＳＲＡＹＲＡＬ ＴＥＴＩＭＦＤＤＡＩ ＥＲＡＧＱＬＴＳＥＥ
ＤＴＬＳＬＶＴＡＤＨ ＳＨＶＦＳＦＧＧＹＰ ＬＲＧＳＳＩＦＧＬＡ
ＰＧＫＡＲＤＲＫＡＹ ＴＶＬＬＹＧＮＧＰＧ ＹＶＬＫＤＧＡＲＰＤ
ＶＴＥＳＥＳＧＳＰＥ ＹＲＱＱＳＡＶＰＬＤ ＥＥＴＨＡＧＥＤＶＡ
ＶＦＡＲＧＰＱＡＨＬ ＶＨＧＶＱＥＱＴＦＩ ＡＨＶＭＡＦＡＡＣＬ
ＥＰＹＴＡＣＤＬＡＰ ＰＡＧＴＴＤＡＡＨＰ Ｇ
配列番号１２
リンカー５アミノ酸
ＬＳＲＳＥ
配列番号１３
リンカー８アミノ酸
ＬＳＲＳＳＧＧＥ
配列番号１４
リンカー５３アミノ酸
ｓｏｒＬＡプロペプチドに対応する（ＲＲＫＲはＧＳＧＳで置換されている）
ＥＶＷＴＱＲＬＨＧＧＳＡＰＬＰＱＤＲＧＦＬＶＶＱＧＤＰＲＥＬＲＬＷＡＲＧＤＡＲＧＡＳＲＡＤＥＫＰＬＧＳＧＳ
配列番号１５
ｅＧｌｕｃレポーター
ＫＰＴＥＮＮＥＤＦＮＩＶＡＶＡＳＮＦＡＴＴＤＬＤＡＤＲＧＫＬＰＧＫＫＬＰＬＥＶＬＫＥＩＥＡＮＡＲＫＡＧＣＴＲＧＣＬＩＣＬＳＨＩＫＣＴＰＫＭＫＫＦＩＰＧＲＣＨＴＹＥＧＤＫＥＳＡＱＧＧＩＧＥＡＩＶＤＩＰＥＩＰＧＦＫＤＬＥＰＩＥＱＦＩＡＱＶＤＬＣＶＤＣＴＴＧＣＬＫＧＬＡＮＶＱＣＳＤＬＬＫＫＷＬＰＱＲＣＡＴＦＡＳＫＩＱＧＱＶＤＫＩＫＧＡＧＧＤ
配列番号１６
ｓｏｒＬＡプロペプチドの一部、フーリンのための切断部位
ＲＲＫＲ
配列番号１７
置換されたフーリンのための切断部位
ＧＳＧＳ
配列番号１
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（２アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｃに示す通り
リンカーは下線で示される
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ
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ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
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ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
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ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
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ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号２
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｃに示す通り
リンカーは下線で示される
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ
ＦＬＧＤＧＭＧＶＳＴ ＶＴＡＡＲＩＬＫＧＱ ＫＫＤＫＬＧＰＥＩＰ
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ＫＶＶＨＬＬＧＳＥＱ ＱＳＳＶＱＬＷＶＳＦ ＧＲＫＰＭＲＡＡＱＦ
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ＴＬＶＲＹＦＡＮＥＰ ＦＡＤＦＨＲＶＥＧＬ ＱＧＶＹＩＡＴＬＩＮ
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ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
ＲＭＰＩＬＳＫＥＳＡ ＰＧＬＩＩＡＴＧＳＶ ＧＫＮＬＡＳＫＴＮＶ
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ＡＩＡＱＧＭＥＴＮＥ ＬＫＹＳＴＮＥＧＥＴ ＷＫＴＦＩＦＳＥＫＰ
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ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
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ＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫ ＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶ ＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷ
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ＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤ ＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬ ＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳ
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ＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤ ＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴ ＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳ
ＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲ ＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳ ＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤ
ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号３
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（８アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｃに示す通り
リンカーは下線で示される
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ
ＦＬＧＤＧＭＧＶＳＴ ＶＴＡＡＲＩＬＫＧＱ ＫＫＤＫＬＧＰＥＩＰ
ＬＡＭＤＲＦＰＹＶＡ ＬＳＫＴＹＮＶＤＫＨ ＶＰＤＳＧＡＴＡＴＡ
ＹＬＣＧＶＫＧＮＦＱ ＴＩＧＬＳＡＡＡＲＦ ＮＱＣＮＴＴＲＧＮＥ
ＶＩＳＶＭＮＲＡＫＫ ＡＧＫＳＶＧＶＶＴＴ ＴＲＶＱＨＡＳＰＡＧ
ＴＹＡＨＴＶＮＲＮＷ ＹＳＤＡＤＶＰＡＳＡ ＲＱＥＧＣＱＤＩＡＴ
ＱＬＩＳＮＭＤＩＤＶ ＩＬＧＧＧＲＫＹＭＦ ＲＭＧＴＰＤＰＥＹＰ
ＤＤＹＳＱＧＧＴＲＬ ＤＧＫＮＬＶＱＥＷＬ ＡＫＲＱＧＡＲＹＶＷ
ＮＲＴＥＬＭＱＡＳＬ ＤＰＳＶＴＨＬＭＧＬ ＦＥＰＧＤＭＫＹＥＩ
ＨＲＤＳＴＬＤＰＳＬ ＭＥＭＴＥＡＡＬＲＬ ＬＳＲＮＰＲＧＦＦＬ
ＦＶＥＧＧＲＩＤＨＧ ＨＨＥＳＲＡＹＲＡＬ ＴＥＴＩＭＦＤＤＡＩ
ＥＲＡＧＱＬＴＳＥＥ ＤＴＬＳＬＶＴＡＤＨ ＳＨＶＦＳＦＧＧＹＰ
ＬＲＧＳＳＩＦＧＬＡ ＰＧＫＡＲＤＲＫＡＹ ＴＶＬＬＹＧＮＧＰＧ
ＹＶＬＫＤＧＡＲＰＤ ＶＴＥＳＥＳＧＳＰＥ ＹＲＱＱＳＡＶＰＬＤ
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ＧＬＳＲＳＳＧＧＥＳＡＡＬＱＰＥＰＩ ＫＶＹＧＱＶＳＬＮＤ
ＳＨＮＱＭＶＶＨＷＡ ＧＥＫＳＮＶＩＶＡＬ ＡＲＤＳＬＡＬＡＲＰ
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ＥＡＶＩＡＱＦＹＨＳ ＰＡＤＮＫＲＹＩＦＡ ＤＡＹＡＱＹＬＷＩＴ
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ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
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ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号４
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５３アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）
図１Ｄに示す通り
リンカーは下線で示される
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ＹＶＬＫＤＧＡＲＰＤ ＶＴＥＳＥＳＧＳＰＥ ＹＲＱＱＳＡＶＰＬＤ
ＥＥＴＨＡＧＥＤＶＡ ＶＦＡＲＧＰＱＡＨＬ ＶＨＧＶＱＥＱＴＦＩ
ＡＨＶＭＡＦＡＡＣＬ ＥＰＹＴＡＣＤＬＡＰ ＰＡＧＴＴＤＡＡＨＰ
Ｇ
ＥＶＷＴＱＲＬＨＧＧＳＡＰＬＰＱＤＲＧＦＬＶＶＱＧＤＰＲＥＬＲＬＷＡＲＧＤＡＲＧＡＳＲＡＤＥＫＰＬＧＳＧＳＳＡＡＬＱＰＥＰＩ ＫＶＹＧＱＶＳＬＮＤ
ＳＨＮＱＭＶＶＨＷＡ ＧＥＫＳＮＶＩＶＡＬ ＡＲＤＳＬＡＬＡＲＰ
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ＥＡＶＩＡＱＦＹＨＳ ＰＡＤＮＫＲＹＩＦＡ ＤＡＹＡＱＹＬＷＩＴ
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ＫＶＶＨＬＬＧＳＥＱ ＱＳＳＶＱＬＷＶＳＦ ＧＲＫＰＭＲＡＡＱＦ
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ＴＬＶＲＹＦＡＮＥＰ ＦＡＤＦＨＲＶＥＧＬ ＱＧＶＹＩＡＴＬＩＮ
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ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
ＲＭＰＩＬＳＫＥＳＡ ＰＧＬＩＩＡＴＧＳＶ ＧＫＮＬＡＳＫＴＮＶ
ＹＩＳＳＳＡＧＡＲＷ ＲＥＡＬＰＧＰＨＹＹ ＴＷＧＤＨＧＧＩＩＴ
ＡＩＡＱＧＭＥＴＮＥ ＬＫＹＳＴＮＥＧＥＴ ＷＫＴＦＩＦＳＥＫＰ
ＶＦＶＹＧＬＬＴＥＰ ＧＥＫＳＴＶＦＴＩＦ ＧＳＮＫＥＮＶＨＳＷ
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ＩＳＧＤＴＣＳＧＧＤ ＶＥＡＲＬＥＧＥＬＶ ＰＣＰＬＡＥＥＮＥＦ
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ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
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ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
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ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
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ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号５
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質およびレポーターフラグメント（ＳＥＡＰ）（リンカーなし）
図１Ｂに示す通り
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ
ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ
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ＮＲＴＥＬＭＱＡＳＬ ＤＰＳＶＴＨＬＭＧＬ ＦＥＰＧＤＭＫＹＥＩ
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ＹＶＬＫＤＧＡＲＰＤ ＶＴＥＳＥＳＧＳＰＥ ＹＲＱＱＳＡＶＰＬＤ
ＥＥＴＨＡＧＥＤＶＡ ＶＦＡＲＧＰＱＡＨＬ ＶＨＧＶＱＥＱＴＦＩ
ＡＨＶＭＡＦＡＡＣＬ ＥＰＹＴＡＣＤＬＡＰ ＰＡＧＴＴＤＡＡＨＰ
ＧＳＡＡＬＱＰＥＰＩ ＫＶＹＧＱＶＳＬＮＤ
ＳＨＮＱＭＶＶＨＷＡ ＧＥＫＳＮＶＩＶＡＬ ＡＲＤＳＬＡＬＡＲＰ
ＫＳＳＤＶＹＶＳＹＤ ＹＧＫＳＦＫＫＩＳＤ ＫＬＮＦＧＬＧＮＲＳ
ＥＡＶＩＡＱＦＹＨＳ ＰＡＤＮＫＲＹＩＦＡ ＤＡＹＡＱＹＬＷＩＴ
ＦＤＦＣＮＴＬＱＧＦ ＳＩＰＦＲＡＡＤＬＬ ＬＨＳＫＡＳＮＬＬＬ
ＧＦＤＲＳＨＰＮＫＱ ＬＷＫＳＤＤＦＧＱＴ ＷＩＭＩＱＥＨＶＫＳ
ＦＳＷＧＩＤＰＹＤＫ ＰＮＴＩＹＩＥＲＨＥ ＰＳＧＹＳＴＶＦＲＳ
ＴＤＦＦＱＳＲＥＮＱ ＥＶＩＬＥＥＶＲＤＦ ＱＬＲＤＫＹＭＦＡＴ
ＫＶＶＨＬＬＧＳＥＱ ＱＳＳＶＱＬＷＶＳＦ ＧＲＫＰＭＲＡＡＱＦ
ＶＴＲＨＰＩＮＥＹＹ ＩＡＤＡＳＥＤＱＶＦ ＶＣＶＳＨＳＮＮＲＴ
ＮＬＹＩＳＥＡＥＧＬ ＫＦＳＬＳＬＥＮＶＬ ＹＹＳＰＧＧＡＧＳＤ
ＴＬＶＲＹＦＡＮＥＰ ＦＡＤＦＨＲＶＥＧＬ ＱＧＶＹＩＡＴＬＩＮ
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ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
ＲＭＰＩＬＳＫＥＳＡ ＰＧＬＩＩＡＴＧＳＶ ＧＫＮＬＡＳＫＴＮＶ
ＹＩＳＳＳＡＧＡＲＷ ＲＥＡＬＰＧＰＨＹＹ ＴＷＧＤＨＧＧＩＩＴ
ＡＩＡＱＧＭＥＴＮＥ ＬＫＹＳＴＮＥＧＥＴ ＷＫＴＦＩＦＳＥＫＰ
ＶＦＶＹＧＬＬＴＥＰ ＧＥＫＳＴＶＦＴＩＦ ＧＳＮＫＥＮＶＨＳＷ
ＬＩＬＱＶＮＡＴＤＡ ＬＧＶＰＣＴＥＮＤＹ ＫＬＷＳＰＳＤＥＲＧ
ＮＥＣＬＬＧＨＫＴＶ ＦＫＲＲＴＰＨＡＴＣ ＦＮＧＥＤＦＤＲＰＶ
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ＰＤＰＥＦＳＧＫＳＹ ＳＰＰＶＰＣＰＶＧＳ ＴＹＲＲＴＲＧＹＲＫ
ＩＳＧＤＴＣＳＧＧＤ ＶＥＡＲＬＥＧＥＬＶ ＰＣＰＬＡＥＥＮＥＦ
ＩＬＹＡＶＲＫＳＩＹ ＲＹＤＬＡＳＧＡＴＥ ＱＬＰＬＴＧＬＲＡＡ
ＶＡＬＤＦＤＹＥＨＮ ＣＬＹＷＳＤＬＡＬＤ ＶＩＱＲＬＣＬＮＧＳ
ＴＧＱＥＶＩＩＮＳＧ ＬＥＴＶＥＡＬＡＦＥ ＰＬＳＱＬＬＹＷＶＤ
ＡＧＦＫＫＩＥＶＡＮ ＰＤＧＤＦＲＬＴＩＶ ＮＳＳＶＬＤＲＰＲＡ
ＬＶＬＶＰＱＥＧＶＭ ＦＷＴＤＷＧＤＬＫＰ ＧＩＹＲＳＮＭＤＧＳ
ＡＡＹＨＬＶＳＥＤＶ ＫＷＰＮＧＩＳＶＤＤ ＱＷＩＹＷＴＤＡＹＬ
ＥＣＩＥＲＩＴＦＳＧ ＱＱＲＳＶＩＬＤＮＬ ＰＨＰＹＡＩＡＶＦＫ
ＮＥＩＹＷＤＤＷＳＱ ＬＳＩＦＲＡＳＫＹＳ ＧＳＱＭＥＩＬＡＮＱ
ＬＴＧＬＭＤＭＫＩＦ ＹＫＧＫＮＴＧＳＮＡ ＣＶＰＲＰＣＳＬＬＣ
ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
ＰＱＧＹＱＬＫＮＮＴ ＣＶＫＱＥＮＴＣＬＲ ＮＱＹＲＣＳＮＧＮＣ
ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
ＴＱＦＲＣＱＥＳＧＴ ＣＩＰＬＳＹＫＣＤＬ ＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥ
ＳＨＣＥＭＨＱＣＲＳ ＤＥＹＮＣＳＳＧＭＣ ＩＲＳＳＷＶＣＤＧＤ
ＮＤＣＲＤＷＳＤＥＡ ＮＣＴＡＩＹＨＴＣＥ ＡＳＮＦＱＣＲＮＧＨ
ＣＩＰＱＲＷＡＣＤＧ ＤＴＤＣＱＤＧＳＤＥ ＤＰＶＮＣＥＫＫＣＮ
ＧＦＲＣＰＮＧＴＣＩ ＰＳＳＫＨＣＤＧＬＲ ＤＣＳＤＧＳＤＥＱＨ
ＣＥＰＬＣＴＨＦＭＤ ＦＶＣＫＮＲＱＱＣＬ ＦＨＳＭＶＣＤＧＩＩ
ＱＣＲＤＧＳＤＥＤＡ ＡＦＡＧＣＳＱＤＰＥ ＦＨＫＶＣＤＥＦＧＦ
ＱＣＱＮＧＶＣＩＳＬ ＩＷＫＣＤＧＭＤＤＣ ＧＤＹＳＤＥＡＮＣＥ
ＮＰＴＥＡＰＮＣＳＲ ＹＦＱＦＲＣＥＮＧＨ ＣＩＰＮＲＷＫＣＤＲ
ＥＮＤＣＧＤＷＳＤＥ ＫＤＣＧＤＳＨＩＬＰ ＦＳＴＰＧＰＳＴＣＬ
ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
ＴＬＴＣＭＳＲＥＦＱ ＣＥＤＧＥＡＣＩＶＬ ＳＥＲＣＤＧＦＬＤＣ
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配列番号６
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（２アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
図１Ｅに示す通り
リンカーは下線で示される
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配列番号７
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
図１Ｅに示す通り
リンカーは下線で示される
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配列番号８
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（８アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
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ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
ＴＬＴＣＭＳＲＥＦＱ ＣＥＤＧＥＡＣＩＶＬ ＳＥＲＣＤＧＦＬＤＣ
ＳＤＥＳＤＥＫＡＣＳ ＤＥＬＴＶＹＫＶＱＮ ＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤ
ＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫ ＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶ ＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷ
ＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴ ＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤ ＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱ
ＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤ ＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬ ＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳ
ＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶ ＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨ ＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹ
ＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳ ＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩ ＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴ
ＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧ ＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩ ＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰ
ＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥ ＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥ ＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶ
ＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫ ＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧ ＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬ
ＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡ ＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰ ＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧ
ＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡ ＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣ ＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹ
ＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤ ＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴ ＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳ
ＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲ ＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳ ＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤ
ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号９
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質、リンカー（５３アミノ酸）およびレポーターフラグメント（ｅＧｌｕｃ）
図１Ｆに示す通り
ＫＰＴＥＮＮＥＤＦＮＩＶＡＶＡＳＮＦＡＴＴＤＬＤＡＤＲＧＫＬＰＧＫＫＬＰＬＥＶＬＫＥＩＥＡＮＡＲＫＡＧＣＴＲＧＣＬＩＣＬＳＨＩＫＣＴＰＫＭＫＫＦＩＰＧＲＣＨＴＹＥＧＤＫＥＳＡＱＧＧＩＧＥＡＩＶＤＩＰＥＩＰＧＦＫＤＬＥＰＩＥＱＦＩＡＱＶＤＬＣＶＤＣＴＴＧＣＬＫＧＬＡＮＶＱＣＳＤＬＬＫＫＷＬＰＱＲＣＡＴＦＡＳＫＩＱＧＱＶＤＫＩＫＧＡＧＧＤ
ＥＶＷＴＱＲＬＨＧＧＳＡＰＬＰＱＤＲＧＦＬＶＶＱＧＤＰＲＥＬＲＬＷＡＲＧＤＡＲＧＡＳＲＡＤＥＫＰＬＧＳＧＳ
ＳＡＡＬＱＰＥＰＩ ＫＶＹＧＱＶＳＬＮＤ
ＳＨＮＱＭＶＶＨＷＡ ＧＥＫＳＮＶＩＶＡＬ ＡＲＤＳＬＡＬＡＲＰ
ＫＳＳＤＶＹＶＳＹＤ ＹＧＫＳＦＫＫＩＳＤ ＫＬＮＦＧＬＧＮＲＳ
ＥＡＶＩＡＱＦＹＨＳ ＰＡＤＮＫＲＹＩＦＡ ＤＡＹＡＱＹＬＷＩＴ
ＦＤＦＣＮＴＬＱＧＦ ＳＩＰＦＲＡＡＤＬＬ ＬＨＳＫＡＳＮＬＬＬ
ＧＦＤＲＳＨＰＮＫＱ ＬＷＫＳＤＤＦＧＱＴ ＷＩＭＩＱＥＨＶＫＳ
ＦＳＷＧＩＤＰＹＤＫ ＰＮＴＩＹＩＥＲＨＥ ＰＳＧＹＳＴＶＦＲＳ
ＴＤＦＦＱＳＲＥＮＱ ＥＶＩＬＥＥＶＲＤＦ ＱＬＲＤＫＹＭＦＡＴ
ＫＶＶＨＬＬＧＳＥＱ ＱＳＳＶＱＬＷＶＳＦ ＧＲＫＰＭＲＡＡＱＦ
ＶＴＲＨＰＩＮＥＹＹ ＩＡＤＡＳＥＤＱＶＦ ＶＣＶＳＨＳＮＮＲＴ
ＮＬＹＩＳＥＡＥＧＬ ＫＦＳＬＳＬＥＮＶＬ ＹＹＳＰＧＧＡＧＳＤ
ＴＬＶＲＹＦＡＮＥＰ ＦＡＤＦＨＲＶＥＧＬ ＱＧＶＹＩＡＴＬＩＮ
ＧＳＭＮＥＥＮＭＲＳ ＶＩＴＦＤＫＧＧＴＷ ＥＦＬＱＡＰＡＦＴＧ
ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
ＲＭＰＩＬＳＫＥＳＡ ＰＧＬＩＩＡＴＧＳＶ ＧＫＮＬＡＳＫＴＮＶ
ＹＩＳＳＳＡＧＡＲＷ ＲＥＡＬＰＧＰＨＹＹ ＴＷＧＤＨＧＧＩＩＴ
ＡＩＡＱＧＭＥＴＮＥ ＬＫＹＳＴＮＥＧＥＴ ＷＫＴＦＩＦＳＥＫＰ
ＶＦＶＹＧＬＬＴＥＰ ＧＥＫＳＴＶＦＴＩＦ ＧＳＮＫＥＮＶＨＳＷ
ＬＩＬＱＶＮＡＴＤＡ ＬＧＶＰＣＴＥＮＤＹ ＫＬＷＳＰＳＤＥＲＧ
ＮＥＣＬＬＧＨＫＴＶ ＦＫＲＲＴＰＨＡＴＣ ＦＮＧＥＤＦＤＲＰＶ
ＶＶＳＮＣＳＣＴＲＥ ＤＹＥＣＤＦＧＦＫＭ ＳＥＤＬＳＬＥＶＣＶ
ＰＤＰＥＦＳＧＫＳＹ ＳＰＰＶＰＣＰＶＧＳ ＴＹＲＲＴＲＧＹＲＫ
ＩＳＧＤＴＣＳＧＧＤ ＶＥＡＲＬＥＧＥＬＶ ＰＣＰＬＡＥＥＮＥＦ
ＩＬＹＡＶＲＫＳＩＹ ＲＹＤＬＡＳＧＡＴＥ ＱＬＰＬＴＧＬＲＡＡ
ＶＡＬＤＦＤＹＥＨＮ ＣＬＹＷＳＤＬＡＬＤ ＶＩＱＲＬＣＬＮＧＳ
ＴＧＱＥＶＩＩＮＳＧ ＬＥＴＶＥＡＬＡＦＥ ＰＬＳＱＬＬＹＷＶＤ
ＡＧＦＫＫＩＥＶＡＮ ＰＤＧＤＦＲＬＴＩＶ ＮＳＳＶＬＤＲＰＲＡ
ＬＶＬＶＰＱＥＧＶＭ ＦＷＴＤＷＧＤＬＫＰ ＧＩＹＲＳＮＭＤＧＳ
ＡＡＹＨＬＶＳＥＤＶ ＫＷＰＮＧＩＳＶＤＤ ＱＷＩＹＷＴＤＡＹＬ
ＥＣＩＥＲＩＴＦＳＧ ＱＱＲＳＶＩＬＤＮＬ ＰＨＰＹＡＩＡＶＦＫ
ＮＥＩＹＷＤＤＷＳＱ ＬＳＩＦＲＡＳＫＹＳ ＧＳＱＭＥＩＬＡＮＱ
ＬＴＧＬＭＤＭＫＩＦ ＹＫＧＫＮＴＧＳＮＡ ＣＶＰＲＰＣＳＬＬＣ
ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
ＰＱＧＹＱＬＫＮＮＴ ＣＶＫＱＥＮＴＣＬＲ ＮＱＹＲＣＳＮＧＮＣ
ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
ＴＱＦＲＣＱＥＳＧＴ ＣＩＰＬＳＹＫＣＤＬ ＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥ
ＳＨＣＥＭＨＱＣＲＳ ＤＥＹＮＣＳＳＧＭＣ ＩＲＳＳＷＶＣＤＧＤ
ＮＤＣＲＤＷＳＤＥＡ ＮＣＴＡＩＹＨＴＣＥ ＡＳＮＦＱＣＲＮＧＨ
ＣＩＰＱＲＷＡＣＤＧ ＤＴＤＣＱＤＧＳＤＥ ＤＰＶＮＣＥＫＫＣＮ
ＧＦＲＣＰＮＧＴＣＩ ＰＳＳＫＨＣＤＧＬＲ ＤＣＳＤＧＳＤＥＱＨ
ＣＥＰＬＣＴＨＦＭＤ ＦＶＣＫＮＲＱＱＣＬ ＦＨＳＭＶＣＤＧＩＩ
ＱＣＲＤＧＳＤＥＤＡ ＡＦＡＧＣＳＱＤＰＥ ＦＨＫＶＣＤＥＦＧＦ
ＱＣＱＮＧＶＣＩＳＬ ＩＷＫＣＤＧＭＤＤＣ ＧＤＹＳＤＥＡＮＣＥ
ＮＰＴＥＡＰＮＣＳＲ ＹＦＱＦＲＣＥＮＧＨ ＣＩＰＮＲＷＫＣＤＲ
ＥＮＤＣＧＤＷＳＤＥ ＫＤＣＧＤＳＨＩＬＰ ＦＳＴＰＧＰＳＴＣＬ
ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
ＴＬＴＣＭＳＲＥＦＱ ＣＥＤＧＥＡＣＩＶＬ ＳＥＲＣＤＧＦＬＤＣ
ＳＤＥＳＤＥＫＡＣＳ ＤＥＬＴＶＹＫＶＱＮ ＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤ
ＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫ ＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶ ＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷ
ＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴ ＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤ ＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱ
ＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤ ＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬ ＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳ
ＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶ ＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨ ＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹ
ＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳ ＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩ ＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴ
ＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧ ＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩ ＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰ
ＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥ ＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥ ＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶ
ＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫ ＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧ ＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬ
ＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡ ＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰ ＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧ
ＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡ ＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣ ＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹ
ＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤ ＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴ ＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳ
ＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲ ＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳ ＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤ
ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号１０
ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質
ＳＡＡＬＱＰＥＰＩ ＫＶＹＧＱＶＳＬＮＤ
ＳＨＮＱＭＶＶＨＷＡ ＧＥＫＳＮＶＩＶＡＬ ＡＲＤＳＬＡＬＡＲＰ
ＫＳＳＤＶＹＶＳＹＤ ＹＧＫＳＦＫＫＩＳＤ ＫＬＮＦＧＬＧＮＲＳ
ＥＡＶＩＡＱＦＹＨＳ ＰＡＤＮＫＲＹＩＦＡ ＤＡＹＡＱＹＬＷＩＴ
ＦＤＦＣＮＴＬＱＧＦ ＳＩＰＦＲＡＡＤＬＬ ＬＨＳＫＡＳＮＬＬＬ
ＧＦＤＲＳＨＰＮＫＱ ＬＷＫＳＤＤＦＧＱＴ ＷＩＭＩＱＥＨＶＫＳ
ＦＳＷＧＩＤＰＹＤＫ ＰＮＴＩＹＩＥＲＨＥ ＰＳＧＹＳＴＶＦＲＳ
ＴＤＦＦＱＳＲＥＮＱ ＥＶＩＬＥＥＶＲＤＦ ＱＬＲＤＫＹＭＦＡＴ
ＫＶＶＨＬＬＧＳＥＱ ＱＳＳＶＱＬＷＶＳＦ ＧＲＫＰＭＲＡＡＱＦ
ＶＴＲＨＰＩＮＥＹＹ ＩＡＤＡＳＥＤＱＶＦ ＶＣＶＳＨＳＮＮＲＴ
ＮＬＹＩＳＥＡＥＧＬ ＫＦＳＬＳＬＥＮＶＬ ＹＹＳＰＧＧＡＧＳＤ
ＴＬＶＲＹＦＡＮＥＰ ＦＡＤＦＨＲＶＥＧＬ ＱＧＶＹＩＡＴＬＩＮ
ＧＳＭＮＥＥＮＭＲＳ ＶＩＴＦＤＫＧＧＴＷ ＥＦＬＱＡＰＡＦＴＧ
ＹＧＥＫＩＮＣＥＬＳ ＱＧＣＳＬＨＬＡＱＲ ＬＳＱＬＬＮＬＱＬＲ
ＲＭＰＩＬＳＫＥＳＡ ＰＧＬＩＩＡＴＧＳＶ ＧＫＮＬＡＳＫＴＮＶ
ＹＩＳＳＳＡＧＡＲＷ ＲＥＡＬＰＧＰＨＹＹ ＴＷＧＤＨＧＧＩＩＴ
ＡＩＡＱＧＭＥＴＮＥ ＬＫＹＳＴＮＥＧＥＴ ＷＫＴＦＩＦＳＥＫＰ
ＶＦＶＹＧＬＬＴＥＰ ＧＥＫＳＴＶＦＴＩＦ ＧＳＮＫＥＮＶＨＳＷ
ＬＩＬＱＶＮＡＴＤＡ ＬＧＶＰＣＴＥＮＤＹ ＫＬＷＳＰＳＤＥＲＧ
ＮＥＣＬＬＧＨＫＴＶ ＦＫＲＲＴＰＨＡＴＣ ＦＮＧＥＤＦＤＲＰＶ
ＶＶＳＮＣＳＣＴＲＥ ＤＹＥＣＤＦＧＦＫＭ ＳＥＤＬＳＬＥＶＣＶ
ＰＤＰＥＦＳＧＫＳＹ ＳＰＰＶＰＣＰＶＧＳ ＴＹＲＲＴＲＧＹＲＫ
ＩＳＧＤＴＣＳＧＧＤ ＶＥＡＲＬＥＧＥＬＶ ＰＣＰＬＡＥＥＮＥＦ
ＩＬＹＡＶＲＫＳＩＹ ＲＹＤＬＡＳＧＡＴＥ ＱＬＰＬＴＧＬＲＡＡ
ＶＡＬＤＦＤＹＥＨＮ ＣＬＹＷＳＤＬＡＬＤ ＶＩＱＲＬＣＬＮＧＳ
ＴＧＱＥＶＩＩＮＳＧ ＬＥＴＶＥＡＬＡＦＥ ＰＬＳＱＬＬＹＷＶＤ
ＡＧＦＫＫＩＥＶＡＮ ＰＤＧＤＦＲＬＴＩＶ ＮＳＳＶＬＤＲＰＲＡ
ＬＶＬＶＰＱＥＧＶＭ ＦＷＴＤＷＧＤＬＫＰ ＧＩＹＲＳＮＭＤＧＳ
ＡＡＹＨＬＶＳＥＤＶ ＫＷＰＮＧＩＳＶＤＤ ＱＷＩＹＷＴＤＡＹＬ
ＥＣＩＥＲＩＴＦＳＧ ＱＱＲＳＶＩＬＤＮＬ ＰＨＰＹＡＩＡＶＦＫ
ＮＥＩＹＷＤＤＷＳＱ ＬＳＩＦＲＡＳＫＹＳ ＧＳＱＭＥＩＬＡＮＱ
ＬＴＧＬＭＤＭＫＩＦ ＹＫＧＫＮＴＧＳＮＡ ＣＶＰＲＰＣＳＬＬＣ
ＬＰＫＡＮＮＳＲＳＣ ＲＣＰＥＤＶＳＳＳＶ ＬＰＳＧＤＬＭＣＤＣ
ＰＱＧＹＱＬＫＮＮＴ ＣＶＫＱＥＮＴＣＬＲ ＮＱＹＲＣＳＮＧＮＣ
ＩＮＳＩＷＷＣＤＦＤ ＮＤＣＧＤＭＳＤＥＲ ＮＣＰＴＴＩＣＤＬＤ
ＴＱＦＲＣＱＥＳＧＴ ＣＩＰＬＳＹＫＣＤＬ ＥＤＤＣＧＤＮＳＤＥ
ＳＨＣＥＭＨＱＣＲＳ ＤＥＹＮＣＳＳＧＭＣ ＩＲＳＳＷＶＣＤＧＤ
ＮＤＣＲＤＷＳＤＥＡ ＮＣＴＡＩＹＨＴＣＥ ＡＳＮＦＱＣＲＮＧＨ
ＣＩＰＱＲＷＡＣＤＧ ＤＴＤＣＱＤＧＳＤＥ ＤＰＶＮＣＥＫＫＣＮ
ＧＦＲＣＰＮＧＴＣＩ ＰＳＳＫＨＣＤＧＬＲ ＤＣＳＤＧＳＤＥＱＨ
ＣＥＰＬＣＴＨＦＭＤ ＦＶＣＫＮＲＱＱＣＬ ＦＨＳＭＶＣＤＧＩＩ
ＱＣＲＤＧＳＤＥＤＡ ＡＦＡＧＣＳＱＤＰＥ ＦＨＫＶＣＤＥＦＧＦ
ＱＣＱＮＧＶＣＩＳＬ ＩＷＫＣＤＧＭＤＤＣ ＧＤＹＳＤＥＡＮＣＥ
ＮＰＴＥＡＰＮＣＳＲ ＹＦＱＦＲＣＥＮＧＨ ＣＩＰＮＲＷＫＣＤＲ
ＥＮＤＣＧＤＷＳＤＥ ＫＤＣＧＤＳＨＩＬＰ ＦＳＴＰＧＰＳＴＣＬ
ＰＮＹＹＲＣＳＳＧＴ ＣＶＭＤＴＷＶＣＤＧ ＹＲＤＣＡＤＧＳＤＥ
ＥＡＣＰＬＬＡＮＶＴ ＡＡＳＴＰＴＱＬＧＲ ＣＤＲＦＥＦＥＣＨＱ
ＰＫＴＣＩＰＮＷＫＲ ＣＤＧＨＱＤＣＱＤＧ ＲＤＥＡＮＣＰＴＨＳ
ＴＬＴＣＭＳＲＥＦＱ ＣＥＤＧＥＡＣＩＶＬ ＳＥＲＣＤＧＦＬＤＣ
ＳＤＥＳＤＥＫＡＣＳ ＤＥＬＴＶＹＫＶＱＮ ＬＱＷＴＡＤＦＳＧＤ
ＶＴＬＴＷＭＲＰＫＫ ＭＰＳＡＳＣＶＹＮＶ ＹＹＲＶＶＧＥＳＩＷ
ＫＴＬＥＴＨＳＮＫＴ ＮＴＶＬＫＶＬＫＰＤ ＴＴＹＱＶＫＶＱＶＱ
ＣＬＳＫＡＨＮＴＮＤ ＦＶＴＬＲＴＰＥＧＬ ＰＤＡＰＲＮＬＱＬＳ
ＬＰＲＥＡＥＧＶＩＶ ＧＨＷＡＰＰＩＨＴＨ ＧＬＩＲＥＹＩＶＥＹ
ＳＲＳＧＳＫＭＷＡＳ ＱＲＡＡＳＮＦＴＥＩ ＫＮＬＬＶＮＴＬＹＴ
ＶＲＶＡＡＶＴＳＲＧ ＩＧＮＷＳＤＳＫＳＩ ＴＴＩＫＧＫＶＩＰＰ
ＰＤＩＨＩＤＳＹＧＥ ＮＹＬＳＦＴＬＴＭＥ ＳＤＩＫＶＮＧＹＶＶ
ＮＬＦＷＡＦＤＴＨＫ ＱＥＲＲＴＬＮＦＲＧ ＳＩＬＳＨＫＶＧＮＬ
ＴＡＨＴＳＹＥＩＳＡ ＷＡＫＴＤＬＧＤＳＰ ＬＡＦＥＨＶＭＴＲＧ
ＶＲＰＰＡＰＳＬＫＡ ＫＡＩＮＱＴＡＶＥＣ ＴＷＴＧＰＲＮＶＶＹ
ＧＩＦＹＡＴＳＦＬＤ ＬＹＲＮＰＫＳＬＴＴ ＳＬＨＮＫＴＶＩＶＳ
ＫＤＥＱＹＬＦＬＶＲ ＶＶＶＰＹＱＧＰＳＳ ＤＹＶＶＶＫＭＩＰＤ
ＳＲＬＰＰＲＨＬＨＶ ＶＨＴＧＫＴＳＶＶＩ ＫＷＥＳＰＹＤＳＰＤ
ＱＤＬＬＹＡＶＡＶＫ ＤＬＩＲＫＴＤＲＳＹ ＫＶＫＳＲＮＳＴＶＥ
ＹＴＬＮＫＬＥＰＧＧ ＫＹＨＩＩＶＱＬＧＮ ＭＳＫＤＳＳＩＫＩＴ
ＴＶＳＬＳＡＰＤＡＬ ＫＩＩＴＥＮＤＨＶＬ ＬＦＷＫＳＬＡＬＫＥ
ＫＨＦＮＥＳＲＧＹＥ ＩＨＭＦＤＳＡＭＮＩ ＴＡＹＬＧＮＴＴＤＮ
ＦＦＫＩＳＮＬＫＭＧ ＨＮＹＴＦＴＶＱＡＲ ＣＬＦＧＮＱＩＣＧＥ
ＰＡＩＬＬＹＤＥＬＧ ＳＧＡＤＡＳＡＴＱＡ ＡＲＳＴＤＶＡＡＶＶ
ＶＰＩＬＦＬＩＬＬＳ ＬＧＶＧＦＡＩＬＹＴ ＫＨＲＲＬＱＳＳＦＴ
ＡＦＡＮＳＨＹＳＳＲ ＬＧＳＡＩＦＳＳＧＤ ＤＬＧＥＤＤＥＤＡＰ
ＭＩＴＧＦＳＤＤＶＰ ＭＶＩＡ
配列番号１１
ＳＥＡＰレポーター
ＭＬＬＬＬ ＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳ ＬＧＩＩＰＶＥＥＥＮ ＰＤＦＷＮＲＥＡＡＥ
ＡＬＧＡＡＫＫＬＱＰ ＡＱＴＡＡＫＮＬＩＩ ＦＬＧＤＧＭＧＶＳＴ
ＶＴＡＡＲＩＬＫＧＱ ＫＫＤＫＬＧＰＥＩＰ ＬＡＭＤＲＦＰＹＶＡ
ＬＳＫＴＹＮＶＤＫＨ ＶＰＤＳＧＡＴＡＴＡ ＹＬＣＧＶＫＧＮＦＱ
ＴＩＧＬＳＡＡＡＲＦ ＮＱＣＮＴＴＲＧＮＥ ＶＩＳＶＭＮＲＡＫＫ
ＡＧＫＳＶＧＶＶＴＴ ＴＲＶＱＨＡＳＰＡＧ ＴＹＡＨＴＶＮＲＮＷ
ＹＳＤＡＤＶＰＡＳＡ ＲＱＥＧＣＱＤＩＡＴ ＱＬＩＳＮＭＤＩＤＶ
ＩＬＧＧＧＲＫＹＭＦ ＲＭＧＴＰＤＰＥＹＰ ＤＤＹＳＱＧＧＴＲＬ
ＤＧＫＮＬＶＱＥＷＬ ＡＫＲＱＧＡＲＹＶＷ ＮＲＴＥＬＭＱＡＳＬ
ＤＰＳＶＴＨＬＭＧＬ ＦＥＰＧＤＭＫＹＥＩ ＨＲＤＳＴＬＤＰＳＬ
ＭＥＭＴＥＡＡＬＲＬ ＬＳＲＮＰＲＧＦＦＬ ＦＶＥＧＧＲＩＤＨＧ
ＨＨＥＳＲＡＹＲＡＬ ＴＥＴＩＭＦＤＤＡＩ ＥＲＡＧＱＬＴＳＥＥ
ＤＴＬＳＬＶＴＡＤＨ ＳＨＶＦＳＦＧＧＹＰ ＬＲＧＳＳＩＦＧＬＡ
ＰＧＫＡＲＤＲＫＡＹ ＴＶＬＬＹＧＮＧＰＧ ＹＶＬＫＤＧＡＲＰＤ
ＶＴＥＳＥＳＧＳＰＥ ＹＲＱＱＳＡＶＰＬＤ ＥＥＴＨＡＧＥＤＶＡ
ＶＦＡＲＧＰＱＡＨＬ ＶＨＧＶＱＥＱＴＦＩ ＡＨＶＭＡＦＡＡＣＬ
ＥＰＹＴＡＣＤＬＡＰ ＰＡＧＴＴＤＡＡＨＰ Ｇ
配列番号１２
リンカー５アミノ酸
ＬＳＲＳＥ
配列番号１３
リンカー８アミノ酸
ＬＳＲＳＳＧＧＥ
配列番号１４
リンカー５３アミノ酸
ｓｏｒＬＡプロペプチドに対応する（ＲＲＫＲはＧＳＧＳで置換されている）
ＥＶＷＴＱＲＬＨＧＧＳＡＰＬＰＱＤＲＧＦＬＶＶＱＧＤＰＲＥＬＲＬＷＡＲＧＤＡＲＧＡＳＲＡＤＥＫＰＬＧＳＧＳ
配列番号１５
ｅＧｌｕｃレポーター
ＫＰＴＥＮＮＥＤＦＮＩＶＡＶＡＳＮＦＡＴＴＤＬＤＡＤＲＧＫＬＰＧＫＫＬＰＬＥＶＬＫＥＩＥＡＮＡＲＫＡＧＣＴＲＧＣＬＩＣＬＳＨＩＫＣＴＰＫＭＫＫＦＩＰＧＲＣＨＴＹＥＧＤＫＥＳＡＱＧＧＩＧＥＡＩＶＤＩＰＥＩＰＧＦＫＤＬＥＰＩＥＱＦＩＡＱＶＤＬＣＶＤＣＴＴＧＣＬＫＧＬＡＮＶＱＣＳＤＬＬＫＫＷＬＰＱＲＣＡＴＦＡＳＫＩＱＧＱＶＤＫＩＫＧＡＧＧＤ
配列番号１６
ｓｏｒＬＡプロペプチドの一部、フーリンのための切断部位
ＲＲＫＲ
配列番号１７
置換されたフーリンのための切断部位
ＧＳＧＳ
【0107】
参考文献
Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｓ Ｋ， Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒＬＡ， ｂｉｏＲｘｉｖ ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｄｏｉ： ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０７．１２．１９９８８５； Ｊｕｌｙ １３， ２０２０．
Ｆｊｏｒｂａｃｋ Ａ Ｗ， Ｒｅｔｒｏｍｅｒ ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ ＦＡＮＳＨＹ ｓｏｒｔｉｎｇ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ＳｏｒＬＡ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１２ Ｊａｎ ２５；３２（４）：１４６７－８０．
Ｍａｇｕｉｒｅ Ｃ Ａ， Ｇａｕｓｓｉａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｖａｒｉａｎｔ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ａｕｇ １５；８１（１６）：７１０２－６．
Ｍｅｃｏｚｚｉ Ｖ Ｊ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｚｅ ｒｅｔｒｏｍｅｒ ｔｏ ｌｉｍｉｔ ＡＰＰ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｊｕｎ；１０（６）：４４３－９． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ．１５０８．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ａｐｒ ２０．
Ｓｍａｌｌ Ｓ Ａ， Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｔｒａｆｆｉｃ ｊａｍｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｈｕｂ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１７ Ｏｃｔｏｂｅｒ ； ４０（１０）：５９２－６０２．
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Ｚａｄｏｏ Ｓ， Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｍｙｏｃｉｌｉｎ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１６ Ａｐｒ １；５７（４）：１９３９－５０． ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．１５－１８７８９．
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Ｓｍａｌｌ Ｓ Ａ， Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ Ｒｅｃｏｎｃｉｌｅｓ ｔｈｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｐａｒａｄｏｘ， Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０２０ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ０２； １２（５７２）．
Ｚａｄｏｏ Ｓ， Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｍｙｏｃｉｌｉｎ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ．２０１６ Ａｐｒ １；５７（４）：１９３９－５０． ｄｏｉ：１０．１１６７／ｉｏｖｓ．１５－１８７８９．
【0108】
項目
１．下記ステップを含むアッセイ：
ａ．ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質およびレポーターフラグメントを含む融合タンパク質を発現している細胞を用意するステップ、
ｂ．いくらかのｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント発現細胞を化合物と、およびいくらかのｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント発現細胞を緩衝液と接触させるステップ、
ｃ．ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの量の尺度として、化合物の添加のあるおよびない場合について、細胞培地中でレポーターフラグメントの活性を測定するステップ、
ｄ．レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合エンドソームを強化するとして化合物を分類し、およびレポーターフラグメント活性の低減が観察される場合エンドソームを抑制するとして化合物を分類するステップ。
２．細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を増大させる化合物を特定するために使用される、項目１に記載の方法。
３．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼから選択される、項目１および２のいずれか１項に記載の方法。
４．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
５．ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質およびレポーターフラグメント（配列番号１）を含む融合タンパク質。
６．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼからなる群より選択される、項目５に記載の融合タンパク質。
７．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、項目５および６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
８．レポーターフラグメントが、Ｎ末端でｓｏｒＬＡと融合される、項目５～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
９．項目５～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
１０．項目９に記載の単離ポリヌクレオチドを含む構築物またはベクター。
１１．項目５～１０のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド、構築物、またはベクターを含む細胞。
１２．ヒト起源のものである、項目１１に記載の細胞。
１３．ＨｅＬａ、ＨＥＫおよびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞からなる群より選択される、項目１１および１２のいずれか１項に記載の細胞。
１４．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である、項目１３に記載の細胞。
１．下記ステップを含むアッセイ：
ａ．ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質およびレポーターフラグメントを含む融合タンパク質を発現している細胞を用意するステップ、
ｂ．いくらかのｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント発現細胞を化合物と、およびいくらかのｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメント発現細胞を緩衝液と接触させるステップ、
ｃ．ｓｏｒＬＡ－レポーターフラグメントの量の尺度として、化合物の添加のあるおよびない場合について、細胞培地中でレポーターフラグメントの活性を測定するステップ、
ｄ．レポーターフラグメント活性の増大が観察される場合エンドソームを強化するとして化合物を分類し、およびレポーターフラグメント活性の低減が観察される場合エンドソームを抑制するとして化合物を分類するステップ。
２．細胞培地中のｓｏｒＬＡ－レポーター融合タンパク質の量を増大させる化合物を特定するために使用される、項目１に記載の方法。
３．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼまたはウミシイタケルシフェラーゼから選択される、項目１および２のいずれか１項に記載の方法。
４．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
５．ヒトソーティリン関連受容体１（ｓｏｒＬＡ）タンパク質およびレポーターフラグメント（配列番号１）を含む融合タンパク質。
６．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼからなる群より選択される、項目５に記載の融合タンパク質。
７．レポーターフラグメントが、分泌型アルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、項目５および６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
８．レポーターフラグメントが、Ｎ末端でｓｏｒＬＡと融合される、項目５～７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
９．項目５～８のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
１０．項目９に記載の単離ポリヌクレオチドを含む構築物またはベクター。
１１．項目５～１０のいずれか１項に記載の単離ポリヌクレオチド、構築物、またはベクターを含む細胞。
１２．ヒト起源のものである、項目１１に記載の細胞。
１３．ＨｅＬａ、ＨＥＫおよびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞からなる群より選択される、項目１１および１２のいずれか１項に記載の細胞。
１４．ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞である、項目１３に記載の細胞。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【手続補正書】
【提出日】2023-02-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】