特表 2023-531444 改変された末端基および増強された肺送達を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-24

(54)【発明の名称】改変された末端基および増強された肺送達を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマー

(51)【国際特許分類】

   C08G 63/685 20060101AFI20230714BHJP

   A61K 47/59 20170101ALI20230714BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20230714BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230714BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20230714BHJP

【ＦＩ】

C08G63/685

A61K47/59

A61K9/14

A61K48/00

A61P11/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022578631

(86)(22)【出願日】2021-05-27

(85)【翻訳文提出日】2023-02-17

(86)【国際出願番号】 US2021034462

(87)【国際公開番号】W WO2021257262

(87)【国際公開日】2021-12-23

(31)【優先権主張番号】63/041,739

(32)【優先日】2020-06-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】593152720

【氏名又は名称】イェール ユニバーシティー

【氏名又は名称原語表記】Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

【住所又は居所原語表記】２ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ ０６５１０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】サルツマン， ダブリュー． マーク

(72)【発明者】

【氏名】ジャン， ユーハン

(72)【発明者】

【氏名】グラン， モリー

(72)【発明者】

【氏名】スベリ， アレクサンドラ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4J029

【Ｆターム（参考）】

4C076AA29

4C076BB27

4C076CC15

4C076EE59

4C084AA13

4C084MA41

4C084MA55

4C084NA13

4C084ZA59

4J029AA05

4J029AB01

4J029AB02

4J029AC02

4J029AE06

4J029BH01

4J029CA02

4J029DA07

4J029EG00

4J029EG10

4J029HA01

4J029HB01

4J029KH01

(57)【要約】

ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマー、それらから活性薬剤が負荷されたポリプレックスおよび粒子を形成する方法、ならびに最適な取り込みを伴う核酸薬剤の送達のためにそれらを使用する方法を開発した。実施例は、露出したカルボン酸および／またはヒドロキシル基と組み合わせた重要な分子量、ならびに作製する方法を実証する。典型的には、組成物は、対照の他のトランスフェクション試薬と比較して、毒性が低いか、薬物送達により効率的であるか、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達に好適であり、対象に全身投与して、疾患または状態を処置することができる。ＰＥＧ化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマーとの混合中に、特定のアミンまたはヒドロキシル基含有末端基を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマーについて、吸入による肺へのｉｎ ｖｉｖｏ送達を示した。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ：

【化28】

のポリマーであって、式中、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、Ｒは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である、
ポリマー。

【請求項2】

Ｒ１および／またはＲ２が、

【化29】

ではない、請求項１に記載のポリマー。

【請求項3】

前記ポリマーから形成されるポリプレックスまたは粒子が、Ｒ１および／またはＲ２が、

【化30】

からなる対応するポリプレックスまたは粒子と比べて、ｍＲＮＡの、改善された負荷、改善された細胞トランスフェクション、改善された細胞内エンドソーム放出、またはそれらの組合せを示す、請求項１に記載のポリマー。

【請求項4】

前記ポリマーが、式ＩＩ：

【化31】

の構造を有し、式中、Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、
Ｒ_３およびＲ_４は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
請求項１に記載のポリマー。

【請求項5】

前記ポリマーが、式ＩＩＩ：

【化32】

の構造を有する、請求項１に記載のポリマー。

【請求項6】

Ｚが、Ｚ’と同じである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項7】

ｎが、４、１０、１３、または１４である、請求項１に記載のポリマー。

【請求項8】

ｍが、５、６、または７である、請求項１に記載のポリマー。

【請求項9】

Ｒ_ｘが、置換または無置換アルキルである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項10】

重量平均分子量が、狭い多分散性ポリスチレン標準を使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって測定される場合、約２，０００ダルトン～２０，０００ダルトン、好ましくは、約２，０００ダルトン～約１０，０００ダルトン、最も好ましくは、約２０００ダルトン～約７，０００ダルトンである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項11】

Ｒ_３が、Ｒ４と同じである、請求項４に記載のポリマー。

【請求項12】

Ｒ３および／またはＲ４が、独立して、

【化33-1】

【化33-2】

からなる群より選択される、請求項４に記載のポリマー。

【請求項13】

Ｊ１が、－Ｏ－または－ＮＨであり、Ｊ_２が、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－もしくは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、またはそれらの組合せである、請求項４に記載のポリマー。

【請求項14】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、第一級アミン基を含有し、必要に応じて１個または複数の第二級アミン基または第三級アミン基を含有する、請求項４に記載のポリマー。

【請求項15】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、必要に応じて１個または複数のアミン基を含有する、請求項４に記載のポリマー。

【請求項16】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない、請求項４に記載のポリマー。

【請求項17】

Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つが、ヒドロキシル基を含有しない、請求項４に記載のポリマー。

【請求項18】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、または－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑであり、式中、Ａｑは、存在しないかまたは－ＮＲ_５－であり、Ｂｑは、ヒドロキシル、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンであり、Ｒ_５は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである、請求項４に記載のポリマー。

【請求項19】

ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）が、構造

【化34】

を有し、式中、ｎは、１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒ_ｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である、
請求項１に記載のポリマー。

【請求項20】

Ｚが、Ｚ’と同じである、請求項１９に記載のポリマー。

【請求項21】

Ｚが、Ｏであり、かつＺ’が、Ｏであり、Ｚが、ＮＲ’であり、かつＺ’が、ＮＲ’である、請求項２０に記載のポリマー。

【請求項22】

Ｚが、Ｏであり、かつＺ’が、ＮＲ’であるか、またはＺが、ＮＲ’であり、かつＺ’が、Ｏである、請求項１９に記載のポリマー。

【請求項23】

Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、請求項１９に記載のポリマー。

【請求項24】

ｍが、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、請求項２３に記載のポリマー。

【請求項25】

Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍが、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐが、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４であり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、請求項１９に記載のポリマー。

【請求項26】

Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍが、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒが、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、または例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルであり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、請求項１９に記載のポリマー。

【請求項27】

ｎが、１４、必要に応じて、ペンタデカラクトン（ＰＤＬ）であり、ｍが、７、必要に応じて、セバシン酸であり、ｏおよびｐが、２、必要に応じて、Ｎ－メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）である、請求項１９に記載のポリマー。

【請求項28】

式ＩＩ：

【化35】

の構造を有する、請求項１に記載のポリマーであって、式中、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式Ｉについて上記に記載される通りであり、
Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＩＩにおけるＲ_３およびＲ_４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
ポリマー。

【請求項29】

Ｊ_１が、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｊ_２が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、
請求項２８に記載のポリマー。

【請求項30】

Ｒ_３が、Ｒ_４と同一であり、必要に応じて、Ｒ_３および／またはＲ_４が、直鎖状である、請求項２８に記載のポリマー。

【請求項31】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、必要に応じて、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基および１個または複数のアミン基、必要に応じて、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する、請求項３０に記載のポリマー。

【請求項32】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない、請求項２８に記載のポリマー。

【請求項33】

Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つが、ヒドロキシル基を含有しない、請求項２８に記載のポリマー。

【請求項34】

式ＩＩＩ：

【化36】

の構造を有する、請求項１に記載のポリマーであって、式中、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式Ｉについて上記に記載される通りであり、
Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＩＩにおけるＲ_３およびＲ_４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
ポリマー。

【請求項35】

Ｊ_１が、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｊ_２が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、
請求項３４に記載のポリマー。

【請求項36】

Ｒ_３が、Ｒ_４と同一であり、必要に応じて、Ｒ_３および／またはＲ_４が、直鎖状である、請求項３４に記載のポリマー。

【請求項37】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、必要に応じて、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基および１個または複数のアミン基、必要に応じて、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する、請求項３４に記載のポリマー。

【請求項38】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない、請求項３４に記載のポリマー。

【請求項39】

Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つが、ヒドロキシル基を含有しない、請求項３４に記載のポリマー。

【請求項40】

前記ポリマーの重量平均分子量が、２０，０００ダルトン超、１５，０００ダルトン超、１０，０００ダルトン超、５，０００ダルトン超、または２，０００ダルトン超である、請求項１９～３９のいずれかに記載のポリマー。

【請求項41】

前記ポリマーの重量平均分子量が、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンである、請求項４０に記載のポリマー。

【請求項42】

１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）またはトリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製される請求項１９～４１のいずれかに記載のポリマーであって、２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミンもしくはアミン－ジオールモノマーが使用される場合、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る、ポリマー。

【請求項43】

そのポリプレックスまたは粒子に形成される、請求項１９～４２のいずれかに記載のポリマー。

【請求項44】

封入された１つまたは複数の核酸を有する、そのポリプレックスまたは粒子に形成される、請求項４３に記載のポリマー。

【請求項45】

前記ポリプレックスまたは粒子が、Ｒ_１および／またはＲ_２が、

【化37】

からなるものではない、またはそれを含まないポリマーから形成される、請求項４４に記載のポリマー。

【請求項46】

そのポリプレックスまたは粒子に形成される請求項４４に記載のポリマーであって、前記ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされた前記ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）、すなわち、ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を含有する混合物中にある、ポリマー。

【請求項47】

前記ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）が、構造

【化38】

を含有し、式中、ｍ’およびｍ’’は、独立して、０または１であるが、ただしｍ’＋ｍ’’は１または２であることを条件とし、
式ＸＩにおけるＪ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＸＩの一部の形態では、Ｊ_１が、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、式ＸＩの一部の形態では、Ｊ_２が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、
請求項４６に記載のポリマー。

【請求項48】

１つまたは複数の治療用、診断用、もしくは予防用核酸薬剤、またはそれらの組合せをｉｎ ｖｉｖｏで投与する方法であって、請求項１～４７のいずれかに記載のポリプレックスまたは粒子の形態のポリマーを細胞またはそれを必要とする個体に投与することを含む、方法。

【請求項49】

細胞を前記粒子またはポリプレックスと接触させることによって細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ポリプレックスまたは粒子が、肺に投与される、請求項４８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０２０年６月１９日に出願された米国出願第６３／０４１，７３９号の利益および優先権を主張し、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府が支援した研究または開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＥＢ０００４８７の下で政府の支援により行われた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。

【0003】

発明の分野
本発明の分野は、一般に、特に肺への、診断剤、予防剤および／または治療剤、特に、核酸系薬剤の改善された送達のためのポリマー組成物および方法に関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
遺伝子送達のための非ウイルスベクターは、限定的な免疫原性についてのそれらの可能性、大きなサイズの遺伝子材料を収容および送達する能力、ならびにそれらの表面構造の改変についての可能性に起因して、過去数十年にわたって多くの注目を集めてきた。非ウイルスベクターの主要なカテゴリーとしては、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーが挙げられる。Ｆｅｌｇｎｅｒおよび同僚によって開拓されたカチオン性脂質由来ベクターは、非ウイルス遺伝子送達のために最も広く検討されている系のいくつかを表している（Felgner, et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. PNAS, 84, 7413-7417 (1987)）（Templeton, et al. Improved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. Nat. Biotechnol. 15, 647-652 (1997)）（Chen, et al. Targeted nanoparticles deliver siRNA to melanoma. J. Invest. Dermatol. 130, 2790-2798 (2010)）。

【0005】

カチオン性ポリマー非ウイルスベクターは、それらの合成における柔軟性および特定の生物医学的適用のための構造改変を理由として、ますます注目を集めている。カチオン性脂質系およびカチオン性ポリマー系は両方とも、静電相互作用を通して負に帯電したＤＮＡとの凝縮複合体を形成することによって、遺伝子を送達し、複合体形成は、ＤＮＡを分解から保護し、その細胞取り込みおよび核への細胞内輸送を促進する。

【0006】

カチオン性ポリマーおよびＤＮＡの間で形成されるポリプレックスは、一般に、カチオン性脂質およびＤＮＡの間で形成されるリポプレックスよりも安定であるが、両方とも、血清構成要素および塩を含有する生理液中で不安定である場合が多く、複合体をばらばらにするか、または凝集させる傾向がある（Al-Dosari, et al. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. AAPS J. 11, 671-681 (2009)）（Tros de Ilarduya, et al. Gene delivery by lipoplexes and polyplexes. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)）。加えて、いくつかの研究は、アニオン性ポリマー、またはさらにネイキッドＤＮＡが、ある特定の条件下であるレベルのトランスフェクションを提供することができることを示しているが、脂質およびポリマーの両方によるトランスフェクションは、通常、表面に正味の正電荷を有するポリプレックスまたはリポプレックスをもたらす過剰な電荷を有する材料を必要とする（Nicol, et al. Gene. Ther. 9, 1351-1358 (2002)）（Schlegel, et al.. J. Contr. Rel. 152, 393-401 (2011)）（Liu, et al, AAPS J. 9, E92-E104 (2007)）（Liu, et al. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999)）。ｉｎ ｖｉｖｏで循環系に注射されると、正の表面電荷は、負に帯電した血清分子または細胞構成要素の膜との複合凝集体の迅速な形成を開始し、次いで、これは、細網内皮系（ＲＥＳ）によって除去される。

【0007】

より重要なことに、これまでに開発された多くのカチオン性ベクターは、実質的な毒性を呈し、これが、それらの臨床適用性を制限している（Tros de Ilarduya, et al. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)）（Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)）（Felgner, et al. J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994)）（Kafil, et al. BioImpacts 1, 23-30 (2011)）（Lv, et al. J Contr. Rel. 114, 100-109 (2006)）。これはまた、電荷に依存すると思われ、複合体の表面上の過剰な正電荷は、細胞膜などの細胞構成要素と相互作用し、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、イオンチャネル、膜受容体、および酵素の活性、または細胞生存シグナル伝達などの正常な細胞プロセスを阻害し得る（Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)）（Felgner, et al. J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994)）（Kafil, et al. BioImpacts 1, 23-30 (2011)）。

【0008】

結果として、カチオン性脂質は、多くの場合、動物およびヒトにおいて急性炎症応答を引き起こす一方で、ＰＥＩなどのカチオン性ポリマーは、赤血球の形質膜を不安定化し、細胞壊死、アポトーシスおよびオートファジーを誘導する（Tros de Ilarduya, et al. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)）（Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)）（Lv, et al. J. Contr. Rel. 114, 100-109 (2006)）。これらの望ましくない効果を理由として、より低い電荷密度を有する高効率の非ウイルスベクターに対する必要性が存在する。

【0009】

ジエステルとアミノ置換ジオールとの酵素共重合を経て形成される生分解性ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）のファミリーの合成は、Liu, et al. J. Biomed. Mater. Res. A 96A, 456-465 (2011)およびJiang, Z. Biomacromolecules 11, 1089-1093 (2010)において議論されている。さまざまな鎖長を有するジエステル（例えば、スクシネートからドデカンジオエートまで）を、窒素上にアルキル（メチル、エチル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル）またはアリール（フェニル）置換基のいずれかを有するジエタノールアミンと共重合させた。リパーゼ触媒の高い耐性は、共重合反応をアミノ官能基の保護および脱保護なしで１ステップで完了させることを可能にした。弱酸性条件下でのプロトン化の際に、これらのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、ＤＮＡを容易に凝縮し、ナノサイズのポリプレックスを形成する。スクリーニング研究は、これらの材料の１つであるポリ（Ｎ－メチルジエチレンアミンセバケート）（ＰＭＳＣ）が、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００およびＰＥＩ１４などの主要な市販製品の効率に匹敵する効率で、ＨＥＫ２９３、Ｕ８７－ＭＧ、および９Ｌを含む各種の細胞をトランスフェクトしたことを明らかにした。ＰＭＳＣは、遺伝子送達のために以前に使用されていたが、酵素的に合成された材料の送達効率は、任意の以前に報告されたものよりもおよそ５桁高かった（Wang, et al. Biomacromolecules 8, 1028-1037 (2007)）（Wang, et al. Biomaterials 28, 5358-5368 (2007)）。しかしながら、これらのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸の全身送達には有効ではなかった。これは、これらのポリマーおよび遺伝子材料によって形成されるポリプレックスが、（１）ｉｎ ｖｉｖｏ適用に対して十分な効率を有していない、および／または（２）血液中で十分に安定ではなく、循環の間に崩壊または凝集するという事実に起因し得る。

【0010】

したがって、高いトランスフェクション効率および低い毒性を有する核酸の効率的な全身的なｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ送達に好適な非ウイルスベクターについての必要性が残されている。

【0011】

分子量、ポリマー組成、および／または末端基を容易に制御および改変することができるポリマーナノ担体についての必要性も存在する。

【0012】

したがって、本発明の目的は、治療剤、診断剤、および／または予防剤、特に核酸を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで効果的に送達することができる改善されたポリマー、ならびにそれらを作製および使用する方法を提供することである。

【0013】

本発明の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高効率で遺伝子材料を細胞に効果的に送達することができ、核酸のｉｎ ｖｉｖｏ送達に好適な改善されたポリマー、およびそれを作製する方法を提供することである。

【0014】

本発明の目的はまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸の肺送達のために改善されたポリマーを使用する方法を提供することである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0015】

【非特許文献1】Felgner, et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. PNAS, 84, 7413-7417 (1987)

【非特許文献2】Templeton, et al. Improved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. Nat. Biotechnol. 15, 647-652 (1997)

【非特許文献3】Chen, et al. Targeted nanoparticles deliver siRNA to melanoma. J. Invest. Dermatol. 130, 2790-2798 (2010)

【非特許文献4】Al-Dosari, et al. Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress. AAPS J. 11, 671-681 (2009)

【非特許文献5】Tros de Ilarduya, et al. Gene delivery by lipoplexes and polyplexes. Eur. J. Pharm. Sci. 40, 159-170 (2010)

【非特許文献6】Nicol, et al. Gene. Ther. 9, 1351-1358 (2002)

【非特許文献7】Schlegel, et al.. J. Contr. Rel. 152, 393-401 (2011)

【非特許文献8】Liu, et al, AAPS J. 9, E92-E104 (2007)）

【非特許文献9】Liu, et al. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999)

【非特許文献10】Gao, et al. Biomaterials 32, 8613-8625 (2011)

【非特許文献11】Felgner, et al. J. Biol. Chem. 269, 2550-2561 (1994)

【非特許文献12】Kafil, et al. BioImpacts 1, 23-30 (2011)

【非特許文献13】Lv, et al. J Contr. Rel. 114, 100-109 (2006)

【非特許文献14】Liu, et al. J. Biomed. Mater. Res. A 96A, 456-465 (2011)

【非特許文献15】Jiang, Z. Biomacromolecules 11, 1089-1093 (2010)

【非特許文献16】Wang, et al. Biomacromolecules 8, 1028-1037 (2007)

【非特許文献17】Wang, et al. Biomaterials 28, 5358-5368 (2007)

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0016】

発明の概要
改変された末端基を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ポリマーは、治療剤、診断剤、および／または予防剤、特に、核酸系薬剤を、それらから形成されたポリプレックスおよび粒子に形成して、送達するために使用される。これらは、ＲＮＡなどの核酸カーゴ、より具体的にはｍＲＮＡの、改善された負荷、改善された細胞トランスフェクション、改善された細胞内エンドソーム放出、またはそれらの組合せを示す。実施例は、露出したカルボン酸および／またはヒドロキシル基と組み合わせた重要な分子量、ならびに作製する方法を実証する。改変ポリマーはまた、注射によって投与された場合に特定の組織において優先的な取り込み、および肺系に投与された場合に高レベルの取り込みを示す。典型的には、組成物は、対照の他のトランスフェクション試薬と比較して、毒性が低いか、薬物送達により効率的であるか、またはそれらの組合せである。

【0017】

式Ｉの構造を有するポリマーを開示する。

【化1】

［式中、ｎは、１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒ_ｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である］

【0018】

一部の形態では、Ｚは、Ｚ’と同じである。

【0019】

一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、Ｏである。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、Ｏである。

【0020】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0021】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0022】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐは、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0023】

一部の実施形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒは、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルである。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0024】

一部の形態では、ｎは、１４（例えば、ペンタデカラクトン、ＰＤＬ）であり、ｍは、７（例えば、セバシン酸）であり、ｏおよびｐは、２（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＭＤＥＡ）である。

【0025】

一部の実施形態では、ポリプレックスまたは粒子は、Ｒ_１および／またはＲ_２が、 からなるものではない、またはそれを含まないポリマーから形成される。

【0026】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩの構造を有する。

【化2】

［式中、Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、
Ｒ_３およびＲ_４は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである］

【0027】

一部の形態では、Ｊ_１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。

【0028】

一部の形態では、Ｊ_２は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。

【0029】

一部の形態では、Ｒ_３は、Ｒ_４と同一である。

【0030】

好ましくは、Ｒ_３および／またはＲ_４は、直鎖状である。

【0031】

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基、および１個または複数のアミン基、好ましくは、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない。

【0032】

一部の形態では、Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つは、ヒドロキシル基を含有しない。

【0033】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩＩの構造を有する。

【化3】

【0034】

特定の実施形態では、ｘ、ｙ、および／またはｑの値は、ポリマーの重量平均分子量が、２０，０００ダルトン超、１５，０００ダルトン超、１０，０００ダルトン超、５，０００ダルトン超、２，０００ダルトン超であるようなものである。一部の形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンである。

【0035】

ポリマーは、１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）またはトリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製することができる。２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミンもしくはアミン－ジオールモノマーが使用される実施形態では、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る。

【0036】

一部の実施形態では、ポリマーは、約２ｋＤａ～２０ｋＤａ、または約２ｋＤａ～約１０ｋＤａ、または約２ｋＤａ～約５ｋＤａである。

【0037】

ポリマーは、１つまたは複数の治療剤、診断剤、および／または予防剤がその中に封入されているマイクロ粒子および／またはナノ粒子を形成するために使用することができる。封入および送達される薬剤は、小分子薬剤（例えば、２，０００、１５００、１，０００、７５０、または５００ダルトン未満の分子量を有する非ポリマー性薬剤）、または高分子（例えば、オリゴマーまたはポリマー）、例えば、タンパク質、酵素、ペプチド、核酸などであり得る。粒子は、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ送達のために使用することができる。

【0038】

一部の実施形態では、ポリマーは、本明細書でポリプレックスと称されるポリマー性ナノ粒子ポリヌクレオチド担体を形成するために使用することができ、これは、ポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達するために有効である。

【0039】

肺への送達を含む送達のための改善された性質を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を開発した。

【0040】

ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、構造

【化4】

［式中、ｎは、１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒ_ｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である］
を含有する。

【0041】

一部の形態では、Ｚは、Ｚ’と同じである。

【0042】

一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、Ｏである。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、Ｏである。

【0043】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0044】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0045】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐは、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0046】

一部の実施形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒは、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルである。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0047】

一部の形態では、ｎは、１４（例えば、ペンタデカラクトン、ＰＤＬ）であり、ｍは、７（例えば、セバシン酸）であり、ｏおよびｐは、２（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＭＤＥＡ）である。

【0048】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩ：

【化5】

［式中、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式Ｉについて上記に記載される通りであり、
Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＩＩにおけるＲ_３およびＲ_４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである］
の構造を含有する。

【0049】

一部の形態では、Ｊ_１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。

【0050】

一部の形態では、Ｊ_２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。

【0051】

一部の形態では、Ｒ_３は、Ｒ_４と同一である。

【0052】

好ましくは、Ｒ_３および／またはＲ_４は、直鎖状である。

【0053】

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基、および１個または複数のアミン基、好ましくは、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない。

【0054】

一部の形態では、Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つは、ヒドロキシル基を含有しない。

【0055】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩＩ：

【化6】

［式中、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式ＩＩについて上記に記載される通りである］
の構造を含有する。

【0056】

特定の実施形態では、ｘ、ｙ、および／またはｑの値は、ポリマーの重量平均分子量が、２０，０００ダルトン超、１５，０００ダルトン超、１０，０００ダルトン超、５，０００ダルトン超、２，０００ダルトン超であるようなものである。一部の形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンである。

【0057】

ポリマーは、１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）またはトリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製することができる。２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミンもしくはアミン－ジオールモノマーが使用される実施形態では、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る。

【0058】

一部の実施形態では、ポリマーは、約２ｋＤａ～２０ｋＤａ、または約２ｋＤａ～約１０ｋＤａ、または約２ｋＤａ～約５ｋＤａである。

【0059】

ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、１つまたは複数のメッセンジャーリボ核酸がその中に封入されている、ポリプレックス、マイクロ粒子、および／またはナノ粒子を形成するために使用することができる。一部の形態では、ポリプレックスまたは粒子は、Ｒ_１および／またはＲ_２が、

【化7】

からなるものではない、またはそれを含まないポリマーから形成される。

【0060】

一部の形態では、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）、すなわち、ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を含有する混合物中にある。

【0061】

一部の形態では、ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、構造

【化8】

［式中、ｍ’およびｍ’’は、独立して、０または１であるが、ただしｍ’＋ｍ’’は１または２であることを条件とし、
式ＸＩにおけるＪ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－である］
を含有する。

【0062】

式ＸＩの一部の形態では、Ｊ_１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。式ＸＩの一部の形態では、Ｊ_２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。

【0063】

送達は、ポリマーの選択、ポリマーをポリアルキレングリコールなどの親水性ポリマーと混合することまたはコンジュゲートすること、末端基およびその混合物、ならびに分子量を制御することにより最適化することができる。

【0064】

実施例は、送達の増強、ならびに細胞への直接投与後、注射などによる全身投与後、または肺への投与（肺送達）後の高レベルのトランスフェクションを実証する。ＰＥＧと混合またはコンジュゲートされた規定の分子量のＰＡＣＥは、肺細胞において高レベルのトランスフェクションで、ｍＲＮＡを含有するポリプレックスを産生し、肺投与後に、他の組織においてほとんど産生されなかった。

【図面の簡単な説明】

【0065】

【図1-1】図１は、式Ｉに組み込まれ得るＲ_３およびＲ_４基を示す。

【図1-2】図１は、式Ｉに組み込まれ得るＲ_３およびＲ_４基を示す。

【図2】図２は、実施例２に示される方法によって合成された５ｋＤａまたは１０ｋＤａのいずれかのＭＷを有するＰＡＣＥ－ＣＯＯＨおよびＰＡＣＥ－ＭＡＥのトランスフェクション効率を示す棒グラフである。統計学的有意性は、スチューデントのｔ検定によって決定した（次の通り示す：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。

【図3-1】図３Ａは、１０％のＰＤＬ含有量、分子量が２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、および２０ｋＤａの古典的ＰＡＣＥを使用したＭＷの効果（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図３Ｂは、１０ｋＤａの古典的ＰＡＣＥポリマーを使用したＰＤＬ含有量の効果（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図３Ｃは、１０％のＰＤＬ含有量でＭＷが５ｋＤａの酸性ＰＡＣＥおよび古典的ＰＡＣＥのトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。結果を、二連で実行された３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。

【図3-2】図３Ａは、１０％のＰＤＬ含有量、分子量が２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、および２０ｋＤａの古典的ＰＡＣＥを使用したＭＷの効果（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図３Ｂは、１０ｋＤａの古典的ＰＡＣＥポリマーを使用したＰＤＬ含有量の効果（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図３Ｃは、１０％のＰＤＬ含有量でＭＷが５ｋＤａの酸性ＰＡＣＥおよび古典的ＰＡＣＥのトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。結果を、二連で実行された３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。

【図4】図４は、発動プロセス（日数での発動時間）の間のａＰＡＣＥポリマーの重量平均ＭＷ（Ｄａ）の進化を示す線グラフである（５ｋＤａ－下側の線、１０ｋＤａ－中央の線、２０ｋＤａ－上側の線）。

【図5-1】図５Ａは、それぞれのＭＷについて好ましい発動時間を実証する発動時間（日）に応じたルシフェラーゼｍＲＮＡトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す線グラフである（線は、２０ｋＤａ－０日で下側のデータポイント；１０ｋＤａ ０日で中央のデータポイント；５ｋＤａ－０日で上側のデータポイントとして特定した）。図５Ｂは、非発動ＰＡＣＥ、およびそれらの好ましい発動時間（５ｋＤａのポリマーについて５日、１０ｋＤａのポリマーについて１０日、および２０ｋＤａのポリマーについて３０日、＊＊ｐ＜０．００５）で異なる初期ＭＷの発動ＰＡＣＥを使用したトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図５Ｃは、ｍＲＮＡ：ＴｒａｎｓＩＴ複合体（下側の線）と比較した、ｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックス（５ｋＤａ ５日、１０ｋＤａ １０日、２０ｋＤａ ３０日（上側の線のクラスター））の細胞毒性プロファイル（細胞生存率（％））を示す線グラフである。図５Ｄは、異なる発動の温度を使用したａＰＡＣＥのトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）の棒グラフである（＊＊ｐ＜０．００５）。すべての結果を、二連で実行された３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。

【図5-2】図５Ａは、それぞれのＭＷについて好ましい発動時間を実証する発動時間（日）に応じたルシフェラーゼｍＲＮＡトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す線グラフである（線は、２０ｋＤａ－０日で下側のデータポイント；１０ｋＤａ ０日で中央のデータポイント；５ｋＤａ－０日で上側のデータポイントとして特定した）。図５Ｂは、非発動ＰＡＣＥ、およびそれらの好ましい発動時間（５ｋＤａのポリマーについて５日、１０ｋＤａのポリマーについて１０日、および２０ｋＤａのポリマーについて３０日、＊＊ｐ＜０．００５）で異なる初期ＭＷの発動ＰＡＣＥを使用したトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図５Ｃは、ｍＲＮＡ：ＴｒａｎｓＩＴ複合体（下側の線）と比較した、ｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックス（５ｋＤａ ５日、１０ｋＤａ １０日、２０ｋＤａ ３０日（上側の線のクラスター））の細胞毒性プロファイル（細胞生存率（％））を示す線グラフである。図５Ｄは、異なる発動の温度を使用したａＰＡＣＥのトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）の棒グラフである（＊＊ｐ＜０．００５）。すべての結果を、二連で実行された３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。

【図5-3】図５Ａは、それぞれのＭＷについて好ましい発動時間を実証する発動時間（日）に応じたルシフェラーゼｍＲＮＡトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す線グラフである（線は、２０ｋＤａ－０日で下側のデータポイント；１０ｋＤａ ０日で中央のデータポイント；５ｋＤａ－０日で上側のデータポイントとして特定した）。図５Ｂは、非発動ＰＡＣＥ、およびそれらの好ましい発動時間（５ｋＤａのポリマーについて５日、１０ｋＤａのポリマーについて１０日、および２０ｋＤａのポリマーについて３０日、＊＊ｐ＜０．００５）で異なる初期ＭＷの発動ＰＡＣＥを使用したトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図５Ｃは、ｍＲＮＡ：ＴｒａｎｓＩＴ複合体（下側の線）と比較した、ｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックス（５ｋＤａ ５日、１０ｋＤａ １０日、２０ｋＤａ ３０日（上側の線のクラスター））の細胞毒性プロファイル（細胞生存率（％））を示す線グラフである。図５Ｄは、異なる発動の温度を使用したａＰＡＣＥのトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）の棒グラフである（＊＊ｐ＜０．００５）。すべての結果を、二連で実行された３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。

【図6-1】図６Ａは、ＴｒａｎｓＩＴ、５ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、５日間発動した５ｋＤａのａＰＡＣＥ、１０ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、または１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥを使用したｍＲＮＡ（合計で２０ｍｇ）のＩＶ投与６時間後のＥＰＯ血中濃度を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図６Ｂは、ビヒクル（下側の線）、ＴｒａｎｓＩＴ（中央の線）、１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥ（上側の線）を使用したｍＲＮＡ（合計２０ｍｇ）のＩＶ投与後のＥＰＯ産生の時間経過を示す線グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊ｐ＜０．００１および＊ｐ＜０．０５）。図６Ｃ～６Ｆは、酢酸緩衝液、遊離ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックスのＩＶ投与２４時間後および７日後の血液化学（ＡＳＴ（図６Ｃ）、ＡＬＴ（図６Ｄ）、尿素（図６Ｄ）、クレアチニン（図６Ｆ））分析を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＥＭとして提示する。

【図6-2】図６Ａは、ＴｒａｎｓＩＴ、５ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、５日間発動した５ｋＤａのａＰＡＣＥ、１０ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、または１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥを使用したｍＲＮＡ（合計で２０ｍｇ）のＩＶ投与６時間後のＥＰＯ血中濃度を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図６Ｂは、ビヒクル（下側の線）、ＴｒａｎｓＩＴ（中央の線）、１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥ（上側の線）を使用したｍＲＮＡ（合計２０ｍｇ）のＩＶ投与後のＥＰＯ産生の時間経過を示す線グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊ｐ＜０．００１および＊ｐ＜０．０５）。図６Ｃ～６Ｆは、酢酸緩衝液、遊離ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックスのＩＶ投与２４時間後および７日後の血液化学（ＡＳＴ（図６Ｃ）、ＡＬＴ（図６Ｄ）、尿素（図６Ｄ）、クレアチニン（図６Ｆ））分析を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＥＭとして提示する。

【図6-3】図６Ａは、ＴｒａｎｓＩＴ、５ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、５日間発動した５ｋＤａのａＰＡＣＥ、１０ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、または１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥを使用したｍＲＮＡ（合計で２０ｍｇ）のＩＶ投与６時間後のＥＰＯ血中濃度を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図６Ｂは、ビヒクル（下側の線）、ＴｒａｎｓＩＴ（中央の線）、１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥ（上側の線）を使用したｍＲＮＡ（合計２０ｍｇ）のＩＶ投与後のＥＰＯ産生の時間経過を示す線グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊ｐ＜０．００１および＊ｐ＜０．０５）。図６Ｃ～６Ｆは、酢酸緩衝液、遊離ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックスのＩＶ投与２４時間後および７日後の血液化学（ＡＳＴ（図６Ｃ）、ＡＬＴ（図６Ｄ）、尿素（図６Ｄ）、クレアチニン（図６Ｆ））分析を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＥＭとして提示する。

【図6-4】図６Ａは、ＴｒａｎｓＩＴ、５ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、５日間発動した５ｋＤａのａＰＡＣＥ、１０ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、または１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥを使用したｍＲＮＡ（合計で２０ｍｇ）のＩＶ投与６時間後のＥＰＯ血中濃度を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図６Ｂは、ビヒクル（下側の線）、ＴｒａｎｓＩＴ（中央の線）、１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥ（上側の線）を使用したｍＲＮＡ（合計２０ｍｇ）のＩＶ投与後のＥＰＯ産生の時間経過を示す線グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊ｐ＜０．００１および＊ｐ＜０．０５）。図６Ｃ～６Ｆは、酢酸緩衝液、遊離ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックスのＩＶ投与２４時間後および７日後の血液化学（ＡＳＴ（図６Ｃ）、ＡＬＴ（図６Ｄ）、尿素（図６Ｄ）、クレアチニン（図６Ｆ））分析を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＥＭとして提示する。

【図7】図７は、ポリプレックス上のｍＲＮＡ負荷に対するＰＡＣＥ末端基（番号は実施例５において特定された末端基に対応する）の効果を示す棒グラフである。

【図8-1】図８Ａは、図８Ｂ～８Ｄに示される結果を生じる機構の概略図である。図８Ｂは、ポリプレックスの細胞取り込みに対するＰＡＣＥ末端基（番号は表１において特定された末端基に対応する）の効果を示す棒グラフである。図８Ｃは、エンドソームエスケープに対するＰＡＣＥ末端基（番号は表１において特定された末端基に対応する）の効果を示す棒グラフである。図８Ｄは、トランスフェクション効率に対するＰＡＣＥ末端基（番号は表１において特定された末端基に対応する）の効果を示す棒グラフである。

【図8-2】図８Ａは、図８Ｂ～８Ｄに示される結果を生じる機構の概略図である。図８Ｂは、ポリプレックスの細胞取り込みに対するＰＡＣＥ末端基（番号は表１において特定された末端基に対応する）の効果を示す棒グラフである。図８Ｃは、エンドソームエスケープに対するＰＡＣＥ末端基（番号は表１において特定された末端基に対応する）の効果を示す棒グラフである。図８Ｄは、トランスフェクション効率に対するＰＡＣＥ末端基（番号は表１において特定された末端基に対応する）の効果を示す棒グラフである。

【図9-1】図９Ａ～９Ｃは、トランスフェクション効率（ｆｌｕｃ活性として表される）、ならびにｍＲＮＡ負荷（図９Ａ）、取り込み（図９Ｂ）、およびエンドソームエスケープ（図９Ｃ）を含むトランスフェクションの異なるステップの線形相関を示すプロットである。

【図9-2】図９Ａ～９Ｃは、トランスフェクション効率（ｆｌｕｃ活性として表される）、ならびにｍＲＮＡ負荷（図９Ａ）、取り込み（図９Ｂ）、およびエンドソームエスケープ（図９Ｃ）を含むトランスフェクションの異なるステップの線形相関を示すプロットである。

【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、ｍＲＮＡポリプレックスのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳速度が、トランスフェクション効率と相関しないことを実証するグラフである。ｍＲＮＡ、ｄｄＲＬｕｃ－Ｆｃ、およびＰＡＣＥを含有するポリプレックスは、細胞によってエンドサイトーシスされ、次いで、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするｍＲＮＡが放出され、翻訳される。図１０Ａは、ルシフェラーゼの発現（expire）の量（ｌｏｇ）対翻訳速度（ＡＵ）のグラフである。図１０Ｂは、翻訳速度（ＡＵ）対封入効率のグラフである。

【図11】図１１は、表１のポリマー２、４、１４、１５、１６、１７、２０、２５、２７および３１について、ｐＨ４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、および６．０でのトランスフェクション効率（パーセント）のグラフである。結果は、異なる末端基を有するＰＡＣＥポリプレックスについての最適な酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨを実証する。

【図12-1】図１２Ａは、ＰＥＧなしと比較するポリプレックスのサイズに対するＰＥＧの効果のグラフである（０．２５％のＰＡＣＥ－ＰＥＧまたは１％のＰＡＣＥ－ＰＥＧのいずれかで時間をわたってサイズの変化なしと比較した経時的な凝集（分）を示す）。図１２Ｂは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧの含有量（％）が０、０．０５、０１．０、０．２５、０．５０、および１の関数として、表１のポリマー１４、１５、１６、１７、２５、２７および３１についてのトランスフェクション効率（％）のグラフである。図１２Ｃは、同じＰＡＣＥ－ＰＥＧ混合物のＥＧＦＰ発現のグラフであり、ＰＥＧがＥＧＦＰ発現を増加させたことを示す。

【図12-2】図１２Ａは、ＰＥＧなしと比較するポリプレックスのサイズに対するＰＥＧの効果のグラフである（０．２５％のＰＡＣＥ－ＰＥＧまたは１％のＰＡＣＥ－ＰＥＧのいずれかで時間をわたってサイズの変化なしと比較した経時的な凝集（分）を示す）。図１２Ｂは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧの含有量（％）が０、０．０５、０１．０、０．２５、０．５０、および１の関数として、表１のポリマー１４、１５、１６、１７、２５、２７および３１についてのトランスフェクション効率（％）のグラフである。図１２Ｃは、同じＰＡＣＥ－ＰＥＧ混合物のＥＧＦＰ発現のグラフであり、ＰＥＧがＥＧＦＰ発現を増加させたことを示す。

【図13-1】図１３Ａは、サイズ（ｎｍ）および多分散性に対する０％、０．０１％、０．１％、１％または１０％のＤＳＰＥ－ＰＥＧの有効性のグラフである。図１３Ｂは、表１のポリマー１４、１５、１６、１７、２５、２７および３１についてのトランスフェクション効率（％）に対するＤＳＰＥ－ＰＥＧ含有量の有効性（effective）のグラフである。図１３Ｃは、ＥＧＦＰ発現に対するＤＳＰＥ－ＰＥＧ濃度（０、０．０５、０．１０、０．２５、０．５０、１．０、２．５、および５％）の効果のグラフである。

【図13-2】図１３Ａは、サイズ（ｎｍ）および多分散性に対する０％、０．０１％、０．１％、１％または１０％のＤＳＰＥ－ＰＥＧの有効性のグラフである。図１３Ｂは、表１のポリマー１４、１５、１６、１７、２５、２７および３１についてのトランスフェクション効率（％）に対するＤＳＰＥ－ＰＥＧ含有量の有効性（effective）のグラフである。図１３Ｃは、ＥＧＦＰ発現に対するＤＳＰＥ－ＰＥＧ濃度（０、０．０５、０．１０、０．２５、０．５０、１．０、２．５、および５％）の効果のグラフである。

【図14】図１４Ａおよび１４Ｂは、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、腸について、Ｉ．Ｐ．注射６時間後（図１２Ａ）およびＩ．Ｖ．注射６時間後（図１２Ｂ）の生物発光分布によって測定されたポリプレックスの体内分布を示すＩＶＩＳ画像からのデータのプロットである。

【図15】図１５は、肺投与後の生物発光分布によって測定されたポリプレックスの体内分布のグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0066】

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「ポリプレックス」という用語は、本明細書において使用される場合、典型的には、１つまたは複数のポリヌクレオチドが、その中に封入されている、その内部に分散されている、および／またはその表面と会合している、ポリマー性のマイクロ粒子および／もしくはナノ粒子またはミセルを指す。

【0067】

粒子という用語は、マイクロスフェア、マイクロカプセル、マイクロ粒子、ナノスフェア、ナノカプセル、およびナノ粒子を含む。「マイクロ粒子」という用語は、すべてが約１０００ミクロン未満の平均の寸法を有するマイクロスフェアおよびマイクロカプセルを含む。マイクロ粒子は、球状または非球状であってもよく、任意の規則的なまたは不規則な形状を有していてもよい。構造が、直径が約１ミクロン（１０００ｎｍ）未満である場合、「ナノスフェア」、「ナノカプセル」、および「ナノ粒子」という対応する当技術分野で認識されている用語が利用され得る。ある特定の実施形態では、ナノスフェア、ナノカプセルおよびナノ粒子の集団は、約５００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、１０ｎｍ、または１ｎｍの平均直径を有する。一部の実施形態では、粒子の平均直径は、約２００ｎｍ～約６００ｎｍ、好ましくは、約２００～約５００ｎｍである。「直径」という用語は、本明細書では、物理的直径または流体力学的直径のいずれかを指すために使用される。本質的に球状の粒子の直径は、物理的直径または流体力学的直径を指し得る。非球状粒子の直径は、流体力学的直径を優先的に指し得る。本明細書で使用される場合、非球状粒子の直径は、粒子の表面上の２点間の最大直線距離を指し得る。複数の粒子を指す場合、粒子の直径は、典型的には、粒子の平均直径を指す。粒子直径は、限定されるものではないが動的光散乱を含む、当技術分野における各種の技法を使用して測定することができる。

【0068】

本明細書で一般的に使用される場合、「薬学的に許容される」とは、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または合理的な利益／リスク比に見合った他の問題もしくは合併症なく、ヒトおよび動物の組織、臓器、および／または体液と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。

【0069】

「生体適合性」という用語は、本明細書で使用される場合、それら自体が宿主（例えば、動物またはヒト）に対して毒性でもなく、宿主において毒性濃度でモノマー性もしくはオリゴマー性サブユニットまたは他の副産物を生成する速度で分解もしない（材料が分解する場合）、１つまたは複数の材料を指す。

【0070】

「生分解性」という用語は、本明細書で使用される場合、材料が、その構成要素サブユニットに、または例えば、より小さな（例えば、非ポリマー性）サブユニットへの材料の生化学的プロセスによる消化で、分解または破壊されることを意味する。

【0071】

「持続放出」は、本明細書で使用される場合、物質の全量が一度に生物学的に利用可能にされるボーラス型投与とは対照的に、長期間にわたる物質の放出を指す。

【0072】

「非経口投与」および「非経口的に投与される」という語句は、当技術分野で認識されている用語であり、注射などの経腸および局所投与以外の投与の様式を含み、限定されないが、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内および胸骨内（intrastemal）の注射および注入が挙げられる。

【0073】

「界面活性剤」という用語は、本明細書で使用される場合、液体の表面張力を低下させる薬剤を指す。

【0074】

本明細書で使用される場合、「一過性」は、数時間、数日または数週間の期間にわたる非組み込み導入遺伝子の発現を指し、発現の期間は、ゲノムに組み込まれるか、または宿主細胞における安定なプラスミドレプリコン内に含有される場合の遺伝子の発現のための期間よりも短い。

【0075】

本明細書で使用される場合、「プロモーター部位」はDavanloo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:2035-39 (1984)によって記載されるバクテリオファージから、または別の供給源から元々は単離されたＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼが、Chamberlin, et al., Nature, 228:227-231 (1970)によって記載されるように、高い特異性で結合するヌクレオチドの配列である。

【0076】

本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付着した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態では、ポリＡは、５０～５０００、好ましくは、６４超、より好ましくは、１００超、最も好ましくは、３００または４００超である。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または翻訳の効率などのｍＲＮＡ機能性をモジュレートするために、化学的にまたは酵素的に改変することができる。

【0077】

本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、ポリペプチドまたはタンパク質を潜在的にコードし得る塩基の配列を含有する一連のヌクレオチドである。オープンリーディングフレームは、開始コード配列（開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎまたはｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ））および終止コドン配列（終結コドン）の間に位置する。

【0078】

「構築物」という用語は、１つまたは複数の単離されたポリヌクレオチド配列を有する組換え遺伝子分子を指す。

【0079】

「発現制御配列」という用語は、別の核酸配列の転写および／または翻訳を制御および調節する核酸配列を指す。原核生物に好適な制御配列としては、例えば、プロモーター、必要に応じて、オペレーター配列、リボソーム結合部位などが挙げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが公知である。

【0080】

「遺伝子」という用語は、その鋳型またはメッセンジャーＲＮＡを通して、特定のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に特徴的なアミノ酸の配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ産物をコードするＤＮＡ配列も指す。遺伝子という用語は、ゲノムＤＮＡに関して本明細書で使用される場合、介在する非コード領域および調節領域を含み、５’末端および３’末端を含むことができる。

【0081】

ポリペプチドという用語は、タンパク質およびその断片を含む。ポリペプチドは、それらが、「異種」である、すなわち、細菌細胞によって産生されるヒトポリペプチドなどの利用される宿主細胞に対して外来性であることを意味する「外因性」であり得る。ポリペプチドは、アミノ酸として含有する。アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への方向で左から右に書かれ、次の通り示される３文字または１文字のコードのいずれかによって表される：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、 Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。

【0082】

「バリアント」は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとは異なるが、必須の性質を保持するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的なバリアントは、アミノ酸配列において、別の参照ポリペプチドとは異なる。一般に、参照ポリペプチドおよびバリアントの配列が全体的に密接に類似し、多くの領域において同一であるように、相違は限定的である。バリアントおよび参照ポリペプチドは、１つまたは複数の改変（例えば、置換、付加、および／または欠失）によってアミノ酸配列において異なっていてもよい。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものであってもよく、またはそうでなくてもよい。ポリペプチドのバリアントは、対立遺伝子バリアントなどの天然に存在するものであってもよく、またはこれは、天然に生じることが知られていないバリアントであってもよい。

【0083】

改変および変化は、ポリペプチドの特徴を有意に変更しないポリペプチドの構造において行うことができる（例えば、保存的アミノ酸置換）。例えば、ある特定のアミノ酸は、活性の明らかな喪失なく、配列中の他のアミノ酸と置換することができる。そのポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのはポリペプチドの相互作用能力および特質であるので、ある特定のアミノ酸配列の置換は、ポリペプチド配列中で行い、それにもかかわらず同様の性質を有するポリペプチドを得ることができる。そのような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することができる。ポリペプチドにおける相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般に理解されている。ある特定のアミノ酸は、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、依然として、類似の生物活性を有するポリペプチドをもたらすことが公知である。同様のアミノ酸の置換は、特に、それによって作出される生物学的に機能的等価なポリペプチドまたはペプチドが、免疫学的実施形態における使用について意図される場合に、親水性に基づいて行うこともできる。アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、およびサイズに基づく。

【0084】

「ラクトン」および「ラクトン単位」という用語は、環状エステルを含む化合物、または環状エステルにおけるエステル結合の切断から生じる鎖式化学構造を記載するために使用される。例えば、ラクトンは、下記に示される環状エステル、および対応するラクトン由来鎖式構造：

【化9】

［ｎは、整数である］
を記載するために使用される。鎖式構造は、限定されるものではないが、加溶媒分解、例えば、加水分解、および酵素的切断を含む、当技術分野において公知の方法を経て形成される。

【0085】

「アルキル」という用語は、飽和脂肪族基のラジカルを指し、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。

【0086】

好ましい実施形態では、直鎖または分枝鎖アルキルは、その骨格中に３０個またはそれよりも少ない炭素原子（例えば、直鎖についてＣ_１～Ｃ_３０、分枝鎖についてＣ_３～Ｃ_３０）、好ましくは、２０個またはそれよりも少ない、より好ましくは、１５個またはそれよりも少ない、最も好ましくは、１０個またはそれよりも少ない炭素原子を有する。１～３０の間の骨格炭素原子の数のすべての整数値が、直鎖または分枝鎖アルキルについて企図され、開示される。同様に、好ましいシクロアルキルは、それらの環構造中に３～１０個の炭素原子を有し、より好ましくは、環構造中に５、６、または７個の炭素を有する。３～１０の間の環炭素原子の数のすべての整数値が、シクロアルキルについて企図され、開示される。

【0087】

「アルキル」（または「低級アルキル」）という用語は、本明細書、実施例、および特許請求の範囲の全体にわたって使用される場合、「無置換アルキル」および「置換アルキル」の両方を含むことが意図され、その後者は、炭化水素骨格の１個または複数の炭素上の水素を置き換える１個または複数の置換基を有するアルキル部分を指す。そのような置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。

【0088】

炭素の数が他に明示されない限り、「低級アルキル」は、本明細書で使用される場合、上記で定義されるアルキル基を意味するが、その骨格構造中に１～１０個の炭素、より好ましくは、１～６個の炭素原子を有する。同様に、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、類似の鎖長を有する。本出願全体にわたって、好ましいアルキル基は、低級アルキルである。好ましい実施形態では、本明細書でアルキルとして指定される置換基は、低級アルキルである。

【0089】

炭化水素鎖上で置換される部分は、適切である場合、それら自体が置換され得ることが当業者に理解されるであろう。例えば、置換アルキルの置換基としては、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、チオール、アミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（サルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含む）、およびシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルを含む）、－ＣＦ_３、－ＣＮ等が挙げられ得る。シクロアルキルも同じ様式で置換され得る。

【0090】

「アリール」は、本明細書で使用される場合、Ｃ_５～Ｃ_１０員の芳香族、複素環式、縮合芳香族、縮合複素環式、二芳香族、または二複素環式（bihetereocyclic）の環系を指す。一部の形態では、環系は、３～５０個の炭素原子を有する。広義の「アリール」は、本明細書で使用される場合、０～４個のヘテロ原子を含み得る５、６、７、８、９、１０および２４員の単環芳香族基、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、クリセン、ピレン、コランニュレン、コロネン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなどが挙げられる。環構造中にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は、「アリール複素環」または「複素芳香族」とも称され得る。芳香環は、１つまたは複数の環位置で、限定されるものではないが、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ（または４級化アミノ）、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族または複素芳香族部分、－ＣＦ_３、－ＣＮ；およびそれらの組合せを含む１個または複数の置換基で置換され得る。

【0091】

「アリール」という用語は、２個またはそれよりも多くの炭素が２つの隣接する環と共通である２つまたはそれよりも多くの環式環を有する多環式環系（すなわち、「縮合環」）も含み、ここで、環の少なくとも１つは芳香族であり、例えば、他の環式環または環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリールおよび／または複素環であり得る。複素環式環の例としては、限定されるものではないが、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサゾリニル、ベンズチアゾリル、ベンズトリアゾリル、ベンズテトラゾリル、ベンズイソキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンズイミダゾリニル、カルバゾリル、４ａＨカルバゾリル、カルボリニル、クロマニル、クロメニル、シンノリニル、デカヒドロキノリニル、２Ｈ，６Ｈ－１，５，２－ジチアジニル、ジヒドロフロ［２，３－ｂ］テトラヒドロフラン、フラニル、フラザニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリル、１Ｈ－インダゾリル、インドレニル、インドリニル、インドリジニル、インドリル、３Ｈ－インドリル、イサチノイル、イソベンゾフラニル、イソクロマニル、イソインダゾリル、イソインドリニル、イソインドリル、イソキノリニル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、メチレンジオキシフェニル、モルホリニル、ナフチリジニル、オクタヒドロイソキノリニル、オキサジアゾリル、１，２，３－オキサジアゾリル、１，２，４－オキサジアゾリル、１，２，５－オキサジアゾリル、１，３，４－オキサジアゾリル、オキサゾリジニル、オキサゾリル、オキシンドリル、ピリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチニル、フェノキサジニル、フタラジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピペリドニル、４－ピペリドニル、ピペロニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドオキサゾール、ピリドイミダゾール、ピリドチアゾール、ピリジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリジニル、ピロリニル、２Ｈ－ピロリル、ピロリル、キナゾリニル、キノリニル、４Ｈ－キノリジニル、キノキサリニル、キヌクリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラゾリル、６Ｈ－１，２，５－チアジアジニル、１，２，３－チアジアゾリル、１，２，４－チアジアゾリル、１，２，５－チアジアゾリル、１，３，４－チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、チエノチアゾリル、チエノオキサゾリル、チエノイミダゾリル、チオフェニルおよびキサンテニルが挙げられる。環の１つまたは複数は、「アリール」について上記で定義されたように、置換され得る。

【0092】

「アルコキシ」は、酸素架橋を通して付着した示された炭素原子の数を有する上記で定義されたアルキル基を指す。アルコキシの例としては、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、ｓ－ペントキシ、およびそれらの誘導体が挙げられる。

【0093】

第一級アミンは、アンモニア中の３個の水素原子のうちの１個が置換もしくは無置換アルキル基または置換もしくは無置換アリール基によって置き換えられる場合に生じる。第二級アミンは、１個の水素と一緒に、窒素に結合した２個の有機置換基（置換もしくは無置換アルキル、置換もしくは無置換アリール、またはそれらの組合せ）を有する。第三級アミンでは、窒素は３個の有機置換基を有する。

【0094】

「置換された」は、本明細書で使用される場合、モノマー上の１個もしくは複数の原子または原子の群が、置き換えられる原子または原子の群とは異なる１個もしくは複数の原子または原子の群で置き換えられていることを意味する。一部の実施形態では、モノマー上の１個または複数の水素は、１個または複数の原子または原子の群で置き換えられる。水素を置き換えることができる官能基の例は、定義において上記に列挙されている。一部の実施形態では、得られるモノマー／ポリマーの化学的および／または物理的性質、例えば、電荷または親水性／疎水性などを変える１個または複数の官能基を付加することができる。例示的な置換基としては、限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ニトロ、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。

【0095】

ＩＩ．ポリマー
ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）、ポリ（アミン－ｃｏ－アミド）、またはそれらの組合せを含むポリマー、ならびにそれらから形成されるポリプレックスおよび固体コア粒子。ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、ＷＯ２０１３／０８２５２９号、ＷＯ２０１７／１５１６２３号、ＷＯ２０１７／１９７１２８号、米国公開出願第２０１６／０２５１４７７号、米国公開出願第２０１５／００７３０４１号、および米国特許第９，２７２，０４３号で議論されている。

【0096】

遺伝子材料を送達するために使用される場合、ポリマーのトランスフェクション効率は、ポリマー上の末端基に強く依存する。ポリマー中のジエステルモノマーをセバシン酸などの二酸で置換すると、ヒドロキシルおよびカルボキシル末端基の混合物を有するポリマーを得ることができる。これらの２個の末端基は両方とも、１，１’－カルボジイミダゾールで活性化することができる。活性化された生成物は、アミン含有分子と反応して、新しい末端基を有するポリマーを生じることができる。

【0097】

ポリマーをさらに加水分解して、－ＯＨおよび－ＣＯＯＨなどのより活性な末端基を放出することができ、これらは両方とも、典型的には、ポリマーを、例えば制御温度（例えば、３７℃または１００℃）で、数日間または数週間インキュベートすることによる、ポリマー中のエステル結合の加水分解（本明細書では「発動」とも称される）に由来し得る。一部の実施形態では、ポリマーは、加水分解されず、したがって「非発動」と称され得る。

【0098】

一部の実施形態では、ポリマー中の疎水性モノマーの含有量は、ポリプレックスを形成するために使用される場合の同じ疎水性モノマーの含有量と比べて、増加される。ポリマー中の疎水性モノマーの含有量を増加させると、ＲＮＡを含む核酸の存在下で固体コアナノ粒子を形成することができるポリマーが形成される。

【0099】

ポリプレックスとは異なって、これらの粒子は、緩衝水または血清中でのインキュベーションの間、または動物への投与（例えば、注射）の際に、長期間安定である。それらはまた、長期の活性（例えば、ｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン）をもたらす核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）の持続放出を提供する。

【0100】

Ａ．ポリマー構造
ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、式Ｉ：

【化10】

［式中、ｎは、１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒ_ｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である］
として示される構造を有する。

【0101】

Ｒ_ｘおよびＲ’基の例としては、限定されるものではないが、水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルの同族体および異性体、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、キシリルなどが挙げられる。

【0102】

特定の実施形態では、ｘ、ｙ、および／またはｑの値は、ポリマーの重量平均分子量が、２０，０００ダルトン超、１５，０００ダルトン超、１０，０００ダルトン超、５，０００ダルトン超、２，０００ダルトン超であるようなものである。一部の形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンである。

【0103】

ポリマーは、１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）、トリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、またはヒドロキシ－ジアミン（Ｚ＝ＯかつＺ’＝ＮＲ’、またはＺ＝ＮＲ’かつＺ’＝Ｏ）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製することができる。２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミン、アミン－ジオール、もしくはヒドロキシ－ジアミンモノマーが使用される実施形態では、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る。

【0104】

一部の形態では、ラクトン単位の組成パーセントは、約１０％～約１００％であり、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される。モル比に関して表すと、ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）含有量は、約０．１～約１、すなわち、ｘ／（ｘ＋ｑ）は約０．１～約１である。好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は約１０～約２４であり、より好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は約１２～約１６である。最も好ましくは、ラクトン単位中の炭素原子の数は、１２（ドデカラクトン）、１５（ペンタデカラクトン）、または１６（ヘキサデカラクトン）である。一部の形態では、Ｚは、Ｚ’と同じである。

【0105】

一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、Ｏである。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、Ｏである。

【0106】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0107】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0108】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐは、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0109】

一部の実施形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒは、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルである。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0110】

一部の形態では、ｎは、１４（例えば、ペンタデカラクトン、ＰＤＬ）であり、ｍは、７（例えば、セバシン酸）であり、ｏおよびｐは、２（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＭＤＥＡ）である。

【0111】

一部の実施形態では、ポリプレックスまたは粒子は、Ｒ１および／またはＲ２が、対応するポリプレックスに関連しないポリマーから形成され、ここで、Ｒ１および／またはＲ２は、

【化11】

からなる、またはそれを含む。

【0112】

一部の実施形態では、ポリマーから形成されるポリプレックスまたは粒子は、Ｒ１および／またはＲ２が、

【化12】

からなる、またはそれを含む対応するポリプレックスと比べて、核酸カーゴ、例えば、ＲＮＡ、より詳細には、ｍＲＮＡの、改善された負荷、改善された細胞トランスフェクション、改善された細胞内エンドソーム放出、またはそれらの組合せを示す。

【0113】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩの構造を有する。

【化13】

［式中、Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、
Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである］一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方の分子量は、５００ダルトンもしくはそれ未満、２００ダルトンもしくはそれ未満、または１００ダルトンもしくはそれ未満である。

【0114】

一部の形態では、Ｊ_１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。

【0115】

一部の形態では、Ｊ_２は、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。

【0116】

一部の形態では、Ｒ_３は、Ｒ_４と同一である。

【0117】

好ましくは、Ｒ_３および／またはＲ_４は、直鎖状である。

【0118】

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、第一級アミン基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、第一級アミン基、および１個または複数の第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。

【0119】

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基、および１個または複数のアミン基、好ましくは、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない。

【0120】

一部の形態では、Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つは、ヒドロキシル基を含有しない。

【0121】

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、または－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ（式中、Ａｑは、存在しないかまたは－ＮＲ_５－であり、Ｂｑは、ヒドロキシル、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンであり、Ｒ_５は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）である。

【0122】

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、図１に示される基から選択される。

【0123】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩＩの構造を有する。

【化14】

【0124】

モノマー単位は、１つまたは複数の位置で、１個または複数の置換基により置換することができる。例示的な置換基としては、限定されるものではないが、アルキル基、環状アルキル基、アルケン基、環状アルケン基、アルキン、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボニル（例えば、カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシル）、チオカルボニル（例えば、チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ニトロ、ヘテロシクリル、アラルキル、または芳香族もしくは複素芳香族部分が挙げられる。

【0125】

ポリマーは、生体適合性である。さまざまな環のサイズの容易に利用可能なラクトンは、低い毒性を持つことが公知であり、例えば、ポリ（カプロラクトン）およびポリ（ｐ－ジオキサノン）などの小さなラクトンから調製されたポリエステルは、臨床適用において使用されている市販の生体材料である。大きな（例えば、Ｃ_１６～Ｃ_２４）ラクトンおよびそれらのポリエステル誘導体は、ハチなどの生物において特定されている天然産物である。１６～２４個の環炭素原子を含有するラクトンが、具体的に企図され、開示される。

【0126】

一部の形態では、ポリマーは、温度制御された加水分解を経てさらに活性化され、それによって、１個または複数の活性化された末端基を露出させることができる。１個または複数の活性化された末端基は、例えば、ヒドロキシルまたはカルボン酸末端基であり得、これらは両方とも、ポリマー内のエステル結合の加水分解を経て生じ得る。活性化されたポリマーは、約５～２５ｋＤａ、好ましくは、約５～１０ｋＤａの重量平均分子量を有することができる。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、許容されるパラメーター内のわずかな変動を意味する。明確性のために、「約」は、所与の値の±１０％を指す。一部の形態では、活性化されたポリマーは、一方の末端にＲ_１またはＲ_２、他方の末端にヒドロキシルまたはカルボン酸末端基を含有し、加水分解を介して生じる。

【0127】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＶの構造を有する。

【化15】

【0128】

一部の形態では、ポリマーは、式Ｖの構造を有する。

【化16】

【0129】

一部の形態では、ポリマーは、式ＶＩの構造を有する。

【化17】

［式中、Ｘ’は、－ＯＨまたは－ＮＨＲ’である］

【0130】

式ＶＩ、Ｖ、およびＶＩは、中間生成物の構造である。それらは、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの構造を有する多種多様なポリマーを合成するために使用することができる。

【0131】

肺への送達を含む送達のための改善された性質を有するポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を開発した。

【0132】

ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、構造

【化18】

［式中、ｎは、１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒ_ｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’（式中、Ｒ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである）であり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である］
を含有する。

【0133】

一部の形態では、Ｚは、Ｚ’と同じである。

【0134】

一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、Ｏである。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、Ｏであり、かつＺ’は、ＮＲ’である。一部の形態では、Ｚは、ＮＲ’であり、かつＺ’は、Ｏである。

【0135】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0136】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0137】

一部の形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐは、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４である。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0138】

一部の実施形態では、Ｚ’は、Ｏであり、ｎは、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍは、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒは、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、ならびに例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルである。一部の形態では、Ｚも、Ｏである。

【0139】

一部の形態では、ｎは、１４（例えば、ペンタデカラクトン、ＰＤＬ）であり、ｍは、７（例えば、セバシン酸）であり、ｏおよびｐは、２（例えば、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＭＤＥＡ）である。

【0140】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩ：

【化19】

［式中、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式Ｉについて上記に記載される通りであり、
Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＩＩにおけるＲ_３およびＲ_４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである］
の構造を含有する。

【0141】

一部の形態では、Ｊ_１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。

【0142】

一部の形態では、Ｊ_２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。

【0143】

一部の形態では、Ｒ_３は、Ｒ_４と同一である。

【0144】

好ましくは、Ｒ_３および／またはＲ_４は、直鎖状である。

【0145】

一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基、および１個または複数のアミン基、好ましくは、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない。

【0146】

一部の形態では、Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つは、ヒドロキシル基を含有しない。

【0147】

一部の形態では、ポリマーは、式ＩＩＩ：

【化20】

［式中、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式ＩＩについて上記に記載される通りである］
の構造を含有する。

【0148】

特定の実施形態では、ｘ、ｙ、および／またはｑの値は、ポリマーの重量平均分子量が、２０，０００ダルトン超、１５，０００ダルトン超、１０，０００ダルトン超、５，０００ダルトン超、２，０００ダルトン超であるようなものである。一部の形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンである。

【0149】

ポリマーは、１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）またはトリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製することができる。２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミンもしくはアミン－ジオールモノマーが使用される実施形態では、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る。

【0150】

一部の実施形態では、ポリマーは、約２ｋＤａ～２０ｋＤａ、または約２ｋＤａ～約１０ｋＤａ、または約２ｋＤａ～約５ｋＤａである。

【0151】

ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、１つまたは複数のメッセンジャーリボ核酸がその中に封入されている、ポリプレックス、マイクロ粒子および／またはナノ粒子を形成するために使用することができる。一部の形態では、ポリプレックスまたは粒子は、Ｒ_１および／またはＲ_２が、

【化21】

からなるものではない、またはそれを含まないポリマーから形成される。

【0152】

一部の形態では、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされたポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）、すなわち、ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を含有する混合物中にある。

【0153】

一部の形態では、ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、構造

【化22】

［式中、ｍ’およびｍ’’は、独立して、０または１であるが、ただしｍ’＋ｍ’’は１または２であることを条件とし、
式ＸＩにおけるＪ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－である］
を含有する。

【0154】

式ＸＩの一部の形態では、Ｊ_１は、－Ｏ－または－ＮＨ－である。式ＸＩの一部の形態では、Ｊ_２は、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である。

【0155】

Ｂ．ポリマーを作製する方法
ポリマーは、一般に、合成ポリマーから改変される。例示的な合成ポリマーとしては、ラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンから形成されるポリ（アミン－ｃｏ－エステル）が挙げられる。リパーゼなどの酵素触媒を使用するラクトン、ジアルキル酸、およびジアルキルアミンからのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）の合成のための方法も提供する。例示的なラクトンは、米国特許公開第２０１７０１２１４５４号に開示されている。一部の形態では、ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）は、スキーム１に示すようにして調製される。
スキーム１：未改変ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）の調製

【化23】

【0156】

モノマーのモル比（例えば、ラクトン：アミノジオール：二酸）は、例えば、約１０：９０：９０～約９０：１０：１０で変わり得る。一部の実施形態では、比は、１０：９０：９０、２０：８０：８０、４０：６０：６０、６０：４０：４０、または８０：２０：２０である。重量平均分子量は、狭い多分散性ポリスチレン標準を使用するＧＰＣによって決定される場合、例えば、約２，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、好ましくは、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、最も好ましくは、約５０００ダルトン～約１０，０００ダルトンで変わり得る。

【0157】

ポリマーの疎水性は、ラクトンのパーセンテージを、例えば、約１０％～約１００％（ラクトン単位対（ラクトン単位＋ジエステル／二酸）で算出される）で変えることによって調整することができる。ポリマーの分子量は、第２段階の反応時間、例えば、約８時間～約７２時間を調整することによって、調整することができる。

【0158】

酵素法は、多様な鎖構造および調整可能な疎水性を有するポリマーの合成を可能にする。一部の実施形態では、疎水性は、ラクトンモノマーの環サイズおよび／またはモル量を変えることによって変わる。広範囲の環サイズを有するラクトン（例：Ｃ_４～Ｃ_２４、好ましくは、Ｃ_６～Ｃ_２４、より好ましくは、Ｃ_６～Ｃ_１６）をコモノマーとして使用することができる。反応は、アミノ基の保護および脱保護なしで単一ステップで行うことができる。そのようなアミノ保有コポリエステルは、従来の有機金属触媒が、有機アミンに感受性であるか、またはそれによって不活性化する場合が多いので、そのような触媒を使用して調製することは極めて困難である。これらの触媒は、大きなラクトン環モノマーを重合するのに非効率的であることも公知である。酵素触媒は、酵素の高い活性および選択性、ならびに得られる金属を含まない高純度の生成物により、生物医学ポリマーを生成することについての明確な利点を有する。

【0159】

式ＩＶ、Ｖ、またはＶＩの構造を有するポリマーは、式ＶＩＩの未改変ポリマーを１，１’－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）と、約１：１０～約１：６０、好ましくは、約１：４０のモル比で反応させることを介して合成することができる。

【0160】

式ＩまたはＩＩの構造を有するポリマーは、当技術分野において公知のカップリング反応を使用する式ＶＩＩの未改変ポリマーの末端基の改変を介して得ることができる。例えば、式ＩＩＩの構造を有するポリマーは、（１）式ＶＩＩの未改変ポリマーをＣＤＩと反応させて、式ＩＶのポリマーを得るステップ、および（２）式ＩＶのポリマーをＲ_３－ＮＨ_２およびＲ_４－ＮＨ_２と反応させるステップを介して合成することができる。一部の形態では、Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方は、図１に示されるものから選択される。好ましくは、Ｒ_３およびＲ_４は、同じである。

【0161】

あるいは、式ＩＩＩの構造を有するポリマーは、（１）式ＶＩＩの未改変ポリマーをＣＤＩと反応させて、式ＶまたはＶＩのポリマーを得るステップ、（２）ステップ（１）からのポリマー中の－ＣＯＯＨ基または－Ｘ’基を保護するステップ、（３）ステップ（２）からの保護されたポリマーをＲ_４－ＮＨ_２またはＲ_３－ＮＨ_２と反応させるステップ、（４）ステップ（３）からのポリマー中の－ＣＯＯＨ基または－Ｘ’基を脱保護するステップ、および（５）ステップ（４）からの脱保護されたポリマーをＲ_３－ＮＨ_２またはＲ_４－ＮＨ_２と反応させるステップを介して合成することができる。

【0162】

式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのポリマーの加水分解媒介活性化は、最大で３０日間またはそれよりも長く、温度制御された様式で行うことができる。加水分解の長さは、活性化されるポリマーの分子量に応じて変わり得る。より大きい分子量のポリマー（例えば、約２０～２５ｋＤａ）は、より長い期間、例えば、約３０～４０日間、最適に加水分解される。より小さな分子量のポリマー（例えば、約５～７ｋＤａ）は、より短い期間、例えば、約４～１０日間、最適に加水分解される。

【0163】

一部の形態では、ポリマーは、約３０℃～４２℃、または最高で約１００℃の範囲のいずれかの温度で加水分解される。ＰＡＣＥポリマーは、約３５℃～４０℃、例えば、約３７℃の温度で加水分解することができる。

【0164】

一部の形態では、ポリマーは、例えば、約１ａｔｍで加水分解される。より高い圧力は、プロセスを加速する（例えば、約１～約１００ａｔｍの圧力）。プロセスについての速度は、作製される特定の製剤について、当業者によって決定されるであろう。

【0165】

得られる加水分解生成物の重量平均分子量は、約５ｋＤａ～約２５ｋＤａ、好ましくは、約５～約１０ｋＤａで変わり得る。

【0166】

好ましくは、ポリマー中のエステル結合の１つまたは複数が加水分解される。加水分解生成物は、一方の末端にＲ_１またはＲ_２、他方の末端に加水分解を介して生じたカルボキシルまたはヒドロキシル基を有し得る。

【0167】

ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）は、（ｉ）ラクトン、（ｉｉ）二酸／ジエステル、ならびに（ｉｉｉ）アミンジオールおよび／またはトリアミンに加えて、末端カルボキシル、ヒドロキシル、またはアミン基を含有するＰＥＧを反応物に添加することができることを除いて、スキーム１に記載された条件と類似の条件下で合成することができる。

【0168】

ＩＩＩ．ポリマーから形成されるマイクロ粒子
ポリマーは、１つまたは複数の治療剤、診断剤、または予防剤がその中に封入されているマイクロ粒子および／またはナノ粒子を調製するために使用することができる。薬剤は、粒子内に封入され、粒子を形成するポリマーマトリックス内に分散され、粒子の表面に共有結合的にもしくは非共有結合的に会合するか、またはそれらの組合せであり得る。

【0169】

他の実施形態では、ポリマーは、生体適合性および生分解性である。粒子によって封入されたおよび／または粒子に会合した核酸は、ポリマーマトリックスの拡散および分解を含む異なる機構を通して放出され得る。放出の速度は、ポリマーのモノマー組成、したがって分解の速度を変えることによって制御することができる。例えば、単純な加水分解が分解の主な機構である場合、ポリマーの疎水性を増加させると、分解の速度が遅くなり、したがって、放出の期間が増加し得る。すべての場合に、ポリマー組成は、有効量の核酸が放出されて、所望の目的／結果を達成するように選択される。

【0170】

ポリマーを使用して、各種の治療剤、予防剤または診断剤のいずれかを、封入し、それと混合し、またはイオン的にもしくは共有結合的にカップリングさせることができる。多種多様な生物学的に活性な材料を、ポリマーによる部位への送達のために、または生体接着、細胞付着、細胞成長の増強、細菌成長の阻害、および血餅形成の防止など、ポリマーに性質を付与するために、封入または組み込むことができる。

【0171】

一部の形態では、封入および送達される薬剤は、小分子薬剤（すなわち、２，０００、１５００、１，０００、７５０、または５００ダルトン未満の分子量を有する非ポリマー性薬剤）、または高分子（例えば、オリゴマーまたはポリマー）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸などであり得る。好適な小分子活性薬剤としては、有機化合物、無機化合物、および／または有機金属化合物が挙げられる。粒子は、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ送達のために使用することができる。

【0172】

好適な治療剤および予防剤の例としては、合成無機化合物および合成有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖および他の糖、脂質、ならびに治療的、予防的または診断的活性を有するＤＮＡおよびＲＮＡ核酸配列が挙げられる。核酸配列としては、遺伝子、相補的ＤＮＡに結合して転写を阻害するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。例えば、１モルあたり１００～５００，０００グラムまたはそれよりも多くの、広範囲の分子量を有する化合物を封入することができる。好適な材料の例としては、抗体、受容体リガンド、および酵素などのタンパク質、接着ペプチドなどのペプチド、糖および多糖、合成有機薬物または合成無機薬物、ならびに核酸が挙げられる。封入することができる材料の例としては、酵素、血液凝固因子、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子などの阻害剤または血餅溶解剤；免疫化のための抗原；ホルモンおよび増殖因子；ヘパリンなどの多糖；アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムなどのオリゴヌクレオチド、ならびに遺伝子治療における使用のためのレトロウイルスベクターが挙げられる。ポリマーは、細胞および組織を封入するために使用することもできる。

【0173】

粒子に組み込まれ得る例示的な治療剤としては、限定されるものではないが、腫瘍抗原、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、サイトカイン、化学療法剤、放射性核種、小分子シグナル伝達阻害剤、光熱アンテナ(photothermal antenna)、モノクローナル抗体、免疫学的危険シグナル伝達分子(immunologic danger signaling molecule)、他の免疫治療薬、酵素、抗生物質、抗ウイルス薬（特に、ＨＩＶまたはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎の処置のためのプロテアーゼ阻害剤単独またはヌクレオシドとの組合せ）、抗寄生生物薬（蠕虫、原虫）、増殖因子、成長阻害剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、抗体およびその生理活性断片（ヒト化抗体、一本鎖抗体、およびキメラ抗体を含む）、抗原およびワクチン製剤（アジュバントを含む）、ペプチド薬、抗炎症薬、免疫調節薬（自然免疫系を活性化するトール様受容体に結合するリガンド、適応免疫系を動員および最適化する分子、細胞傷害性Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞およびヘルパーＴ細胞の作用を活性化または上方調節する分子、ならびにサプレッサーまたは調節性Ｔ細胞を不活性化または下方調節する分子を含む）、細胞（樹状細胞および他の抗原提示細胞を含む）への粒子の取り込みを促進する薬剤、ビタミンなどの栄養補助食品、およびオリゴヌクレオチド薬（ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンス、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、リボザイム、リボヌクレアーゼＰの外部ガイド配列、および三重鎖形成剤を含む）が挙げられる。

【0174】

代表的な抗がん剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、ロムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、クロラムブシルおよびイホスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、フルオロウラシル（５－ＦＵ）、ゲムシタビン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、フルダラビン、およびフロクスウリジン）、有糸分裂阻害薬（タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル（decetaxel）、ならびにビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、およびビンデシンを含む）、アントラサイクリン（ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、およびエピルビシン、ならびにアクチノマイシン、例えば、アクチノマイシンＤを含む）、細胞傷害性抗生物質（マイトマイシン、プリカマイシン、およびブレオマイシンを含む）、トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン、例えば、カンプトテシン、イリノテカン、およびトポテカン、ならびにエピポドフィロトキシンの誘導体、例えば、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、およびテニポシドを含む）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体、例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、他の抗ＶＥＧＦ化合物；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））およびその誘導体、例えば、レナリドミド（ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））；エンドスタチン；アンジオスタチン；受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤、例えば、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（登録商標））；チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））、パゾパニブ、アキシチニブ、およびラパチニブ；トランスフォーミング増殖因子αまたはトランスフォーミング増殖因子β阻害剤、ならびに上皮増殖因子受容体に対する抗体、例えば、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））およびセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））が挙げられる。

【0175】

例示的な免疫調節剤としては、サイトカイン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカン、増殖因子（例えば、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦおよびＧ－ＣＳＦ）、ホルモン、例えば、エストロゲン（ジエチルスチルベストロール、エストラジオール）、アンドロゲン（テストステロン、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮ（登録商標）（フルオキシメステロン））、プロゲスチン（ＭＥＧＡＣＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＰＲＯＶＥＲＡ（登録商標）（酢酸メドロキシプロゲステロン））、およびコルチコステロイド（プレドニゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン）が挙げられる。

【0176】

粒子と会合することができる免疫学的アジュバントの例としては、限定されるものではないが、ＴＬＲリガンド、Ｃ型レクチン受容体リガンド、ＮＯＤ様受容体リガンド、ＲＬＲリガンド、およびＲＡＧＥリガンドが挙げられる。ＴＬＲリガンドとしては、リポ多糖（ＬＰＳ）およびその誘導体、ならびにリピドＡおよびその誘導体、例えば、限定されるものではないが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、グリコピラノシルリピドＡ、ＰＥＴ－リピドＡ、および３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリルリピドＡが挙げられ得る。

【0177】

粒子は、抗原および／またはアジュバント（すなわち、免疫応答を増強する分子）も含み得る。ペプチド、タンパク質、およびＤＮＡに基づくワクチンを使用して、さまざまな疾患または状態に対する免疫を誘導し得る。細胞性免疫は、ウイルス感染細胞を検出および破壊するために必要である。ほとんどの従来のワクチン（例えば、タンパク質に基づくワクチン）は、体液性免疫のみを誘導することができる。ＤＮＡに基づくワクチンは、体液性免疫および細胞性免疫の両方を誘導することができるので、ＤＮＡに基づくワクチンは、ウイルスまたは寄生生物に対してワクチン接種するための固有の手段となる。加えて、ＤＮＡに基づくワクチンは、従来のワクチンよりも潜在的に安全である。ＤＮＡワクチンは、製造および貯蔵のために、相対的により安定で、より対費用効果が高い。ＤＮＡワクチンは、２つの主要な構成要素－ＤＮＡ担体（または送達ビヒクル）および抗原をコードするＤＮＡ－からなる。ＤＮＡ担体は、ＤＮＡを分解から保護し、特定の組織または細胞へのＤＮＡの侵入および効率的なレベルでの発現を促進することができる。

【0178】

代表的な診断剤は、Ｘ線、蛍光、磁気共鳴画像法、放射能、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）によって検出可能な薬剤である。超音波造影剤は、典型的には、ガス、例えば、空気、酸素、またはパーフルオロカーボンである。例示的な診断剤としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射性核種、ならびにＸ線イメージング剤が挙げられる。

【0179】

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して生成される粒子は、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６０％未満、５０重量％未満、４０重量％未満、３０重量％未満、２０重量％未満、１５重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、または０．１重量％未満の薬剤を含有する。一部の実施形態では、薬剤は、薬学的に活性な薬剤の混合物であってもよい。負荷パーセントは、封入される薬剤、粒子を調製するために使用されるポリマー、および粒子を調製するために使用される方法を含む各種の要因に依存する。

【0180】

粒子は、薬物の制御放出を提供し得る。例えば、未変更粒子は、粒子を形成する薬物の拡散の速度および／またはポリマーの分解の速度に基づいて、経時的に、有効量の薬物の放出を提供し得る。ポリマー組成物は、ポリマーの分解挙動、およびしたがって送達される薬剤の放出速度／時間を操作するために変えることができる。あるいは、粒子は、送達される１種または複数の薬剤の持続放出または遅延放出などの制御放出を提供するために、１つまたは複数の材料でコーティングすることができる。

【0181】

持続放出および遅延放出材料は、当技術分野において周知である。リパーゼによって加水分解される脂肪酸の固体エステルは、マイクロ粒子または薬物粒子に噴霧コーティングすることができる。ゼインは、天然の水不溶性タンパク質の例である。これは、噴霧コーティングによって、または湿式造粒技法によって、薬物含有マイクロ粒子または薬物粒子上にコーティングすることができる。天然の水不溶性材料に加えて、消化酵素の一部の基質は、架橋手順で処理することができ、不溶性ネットワークの形成をもたらす。化学的および物理的手段の両方によって開始されるタンパク質を架橋する多くの方法が報告されている。架橋を得るための最も一般的な方法の１つは、化学架橋剤の使用である。化学架橋剤の例としては、アルデヒド（グルテルアルデヒドおよびホルムアルデヒド）、エポキシ化合物、カルボジイミド、およびゲニピンが挙げられる。これらの架橋剤に加えて、酸化糖および天然糖が、ゼラチンを架橋するために使用されている。架橋はまた、酵素的手段を使用して達成され得、例えば、トランスグルタミナーゼは、海産物を架橋するためのＧＲＡＳ物質として承認されている。最後に、架橋は、熱処理、ＵＶ照射およびガンマ線照射などの物理的手段によって開始することができる。

【0182】

薬物含有マイクロ粒子または薬物粒子を取り囲む架橋タンパク質のコーティング層を生成するために、水溶性タンパク質を、マイクロ粒子上に噴霧コーティングし、その後、上記に記載される方法の１つによって架橋することができる。あるいは、薬物含有マイクロ粒子は、コアセルベーション－相分離によって（例えば、塩の添加によって）、タンパク質内にマイクロカプセル化され、その後、架橋され得る。この目的のためのいくつかの好適なタンパク質としては、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、およびグルテンが挙げられる。

【0183】

多糖は、架橋して、水不溶性ネットワークを形成することもできる。多くの多糖について、これは、主なポリマー鎖を架橋するカルシウム塩または多価カチオンとの反応によって達成することができる。ペクチン、アルギン酸塩、デキストラン、アミロースおよびグアーガムは、多価カチオンの存在下で架橋に付される。反対に帯電した多糖の間の複合体を形成することもでき、ペクチンおよびキトサンは、例えば、静電相互作用を介して複合体化することができる。

【0184】

当技術分野において公知の制御放出ポリマーとしては、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸メチル、メタクリル酸メチルコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミンコポリマー、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸）（無水物）、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸無水物）、およびグリシジルメタクリレートコポリマーが挙げられる。

【0185】

ある特定の好ましい実施形態では、アクリルポリマーは、１つまたは複数のアンモニオメタクリレートコポリマーから構成される。アンモニオメタクリレートコポリマーは、当技術分野において周知であり、低含有量の第四級アンモニウム基を有するアクリル酸およびメタクリル酸エステルの完全に重合したコポリマーとしてＮＦ ＸＶＩＩに記載されている。

【0186】

好ましい一実施形態では、アクリルポリマーは、商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）でＲｏｈｍ Ｐｈａｒｍａから市販されているようなアクリル樹脂ラッカーである。さらに好ましい実施形態では、アクリルポリマーは、それぞれ、商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ３０ＤおよびＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ３０ＤでＲｏｈｍ Ｐｈａｒｍａから市販されている２つのアクリル樹脂ラッカーの混合物を含む。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ３０ＤおよびＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ３０Ｄは、低含有量の第四級アンモニウム基を有するアクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルのコポリマーであり、アンモニウム基の残りの中性の（メタ）アクリル酸エステルに対するモル比は、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ３０Ｄでは１：２０、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ３０Ｄでは１：４０である。平均分子量は、約１５０，０００である。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｓ－１００およびＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ－１００も好ましい。コード指定のＲＬ（高透過性）およびＲＳ（低透過性）は、これらの薬剤の透過性の性質を指す。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ／ＲＳ混合物は、水および消化液に不溶性である。しかしながら、これを含むように形成された多粒子系は、水溶液および消化液中で膨潤性および透過性である。

【0187】

ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ／ＲＳなどのポリマーは、望ましい溶解プロファイルを有する持続放出製剤を最終的に得るために、任意の所望の比で一緒に混合され得る。望ましい持続放出多粒子系は、例えば、１００％のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ、５０％のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬおよび５０％のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ、ならびに１０％のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬおよび９０％のＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳから得られ得る。当業者は、例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌなどの他のアクリルポリマーも使用され得ることを認識するであろう。

【0188】

他の制御放出材料としては、アクリル酸メチル－メタクリル酸メチル、ポリ塩化ビニル、およびポリエチレンが挙げられる。親水性ポリマーとしては、限定されるものではないが、セルロースポリマー、例えば、メチルおよびエチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９３４、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの混合物が挙げられる。脂肪化合物としては、限定されるものではないが、カルナウバワックスおよびトリステアリン酸グリセリルなどのさまざまなワックス、ならびに硬化ヒマシ油もしくは硬化植物油を含むワックス型物質、またはそれらの混合物が挙げられる。

【0189】

遅延放出をもたらすための好適なコーティング材料としては、限定されるものではないが、セルロースポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸トリメリト酸セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム；アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、好ましくは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチルおよび／またはメタクリル酸エチルから形成されるもの、ならびに商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（Ｒｏｈｍ Ｐｈａｒｍａ；Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で市販されている他のメタクリル樹脂、例えば、ＥＵＤＲＡＧＩｔ（登録商標）Ｌ３０Ｄ－５５およびＬ１００－５５（ｐＨ５．５およびそれよりも高いｐＨで可溶性）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ－１００（ｐＨ６．０およびそれよりも高いｐＨで可溶性）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｓ（より高いエステル化度の結果としてｐＨ７．０およびそれよりも高いｐＨで可溶性）、ならびにＥＵＤＲＡＧＩＴＳ（登録商標）ＮＥ、ＲＬおよびＲＳ（透過性および拡張性の異なる程度を有する水不溶性ポリマー）；ビニルポリマーおよびコポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、酢酸ビニル、酢酸フタル酸ビニル、酢酸クロトン酸ビニルコポリマー、およびエチレン－酢酸ビニルコポリマー；酵素的に分解可能なポリマー、例えば、アゾポリマー、ペクチン、キトサン、アミロースおよびグアーガム；ゼインならびにシェラックが挙げられる。

【0190】

Ａ．ポリヌクレオチドのトランスフェクションのための組成物
ポリカチオン性ポリマーの遺伝子送達能力が、ポリマーの分子量、疎水性、および電荷密度を含む複数の要因に起因することが発見されている。多くの合成ポリカチオン性材料は、非ウイルス遺伝子送達のためのベクターとして試験されているが、ほぼすべてが、それらの低い効率または高い毒性に起因して有効ではない。以前に記載されたほとんどのポリカチオン性ベクターは、高い電荷密度を呈し、これは、有効なＤＮＡ凝縮のための主要な要件と考えられている。結果として、それらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高効率で遺伝子を送達することが可能であるが、過剰な電荷密度に関連する毒性を理由として、ｉｎ ｖｉｖｏ適用は限定されている。

【0191】

高分子量のポリマー、特に、ターポリマー、ならびにラクトンとジアルキルジエステルおよびアミノジオールとの酵素触媒共重合を使用してそれらを作製する方法を開示する。これらのポリ（アミン－ｃｏ－エステル）ターポリマーは、低い電荷密度を有する。加えて、それらの疎水性は、特定の環サイズを有するラクトンコモノマーを選択することによって、およびポリマー中のラクトン含有量を調整することによって、変えることができる。ラクトン－ジエステル－アミノジオールターポリマーの高い分子量および増加した疎水性は、低い電荷密度を代償して、最小限の毒性で効率的な遺伝子送達を提供する。

【0192】

好ましい実施形態では、ターポリマーは、低減された毒性で効率的な遺伝子送達を呈する。ターポリマーは、著しくより効率的な市販の非ウイルスベクターであり得る。例えば、ターポリマーは、ルシフェラーゼ発現アッセイに基づくＰＥＩおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００などの市販の非ウイルスベクターよりも１００倍超効率的であり得るが、これらの市販の非ウイルスベクターと比較して、最大で０．５ｍｇ／ｍｌの毒性の用量で最小限の毒性を呈する。好ましくは、ターポリマーは、核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションの両方に好適な濃度で非毒性である。例えば、一部の実施形態では、ターポリマーは、細胞トランスフェクションの他のアプローチと比較して、より少ない非特異的細胞死を引き起こす。

【0193】

下記でより詳細に記載するように、一部の実施形態では、ターポリマーは、２０％のＰＤＬを含有するω－ペンタデカラクトン－セバシン酸ジエチル－Ｎ－メチルジエタノールアミンターポリマー（ターポリマーＩＩＩ－２０％ＰＤＬとも称される）である。

【0194】

ＩＶ．ポリマーから形成されるミセル
Ａ．ミセルの性質
１．ミセルサイズ
ＰＥＧブロック含有ポリマーなどのポリマーを、ミセルを調製するために使用することができる。平均ミセルサイズは、典型的には、約１００～約５００ｎｍ、好ましくは、約１００～約４００ｎｍ、より好ましくは、約１００～約３００ｎｍ、より好ましくは、約１５０～約２００ｎｍ、最も好ましくは、約１６０～約１９０ｎｍの範囲であり、これは、血清タンパク質の存在下で７．４の生理的ｐＨで安定であった。コポリマーは、高い血液適合性を持ち、溶血および凝集を誘発する最小限の活性を呈する。

【0195】

２．表面電荷
ミセルのサイズおよびゼータ電位は、ミセルを収容する水性媒体のｐＨが変わると有意に変化することが見出された。例えば、サイズ－ｐＨおよびゼータ－ｐＨの曲線の傾向は、異なるＰＤＬ含有量（１１％、３０％、および５１％）を有する３つのＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーのミセルについて著しく類似する。ミセル試料の平均サイズは、媒体ｐＨを７．４から５．０に下げると徐々に増加し、次いで、ｐＨ値が５．０を下回るとほぼ一定のままであることが明らかである。ミセルについて観察されるこのｐＨ応答挙動は、ｐＨを７．４から５．０に下げる際に予想され、ミセルのＰＰＭＳコアは、プロトン化され、より親水性になり、このようにして、水性媒体からより多くの水分子を吸収して、ミセルの膨潤を引き起こす。ミセルコアは、ｐＨ５．０ですでに完全にプロトン化されており、結果として、ミセルのサイズは、ｐＨが５．０からさらに下がってもかなり一定のままである。７．４～５．０のｐＨ値のミセルサイズ変化の大きさに対するＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマー中のＰＤＬ含有量の効果も注目に値する。ＰＤＬ含有量の減少およびコポリマー中の３級アミノ基含有量の増加により、ミセルコアがプロトンおよび水分子を吸収する能力が増加すると予想される。そのため、ｐＨが７．４から５．０に下がると、平均ミセルサイズの変化は、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ（１８４ｎｍ～２１４ｎｍ）およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬ（１６３ｎｍ～１８２ｎｍ）と比較して、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ（２００ｎｍ～２３４ｎｍ）についてより顕著であった（図５Ａ）。

【0196】

水性媒体中のミセルのゼータ電位も、かなりのｐＨ依存性を呈する。生理学的およびアルカリ性ｐＨ（７．４～８．５）で、ブランクＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルの表面電荷は負であり、これは、媒体のｐＨが酸性範囲（４．０～６．０）に下がると正に変化した。例えば、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬのミセルは、ｐＨ７．４で、それぞれ、－５．８、－７．１、－５．１ｍＶのゼータ電位値を持ち、より低いｐＨ５．０で、対応して、＋７．６、＋５．８、＋４．０ｍＶに変わった。上記の議論に基づいて、ｐＨに対するこの表面電荷依存性は、異なる媒体ｐＨでのミセルのＰＰＭＳコアのプロトン化または脱プロトン化に起因する。アルカリ性ｐＨ（７．４～８．５）で、ミセル中のアミノ基のほとんどは、おそらくプロトン化されず、ミセル粒子は、ミセルによるＰＢＳ中のＨＰＯ４２－および／またはＨ２ＰＯ４－アニオンの吸収に起因して負に帯電したままである。特に、ｐＨ８．５で、ゼータ電位値は、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬについて、それぞれ、－８．１ｍＶ、－７．９ｍＶ、－９．０ｍＶであった。ｐＨを７．４から５．０に下げると、ミセルＰＰＭＳコア中の第三級アミノ部分は、ほとんどプロトン化され、ミセルは正に帯電した粒子に変わる。一貫して、３つのミセル試料の中で、プロトンを吸収する最大の能力を有するＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬミセルは、ｐＨ４．０～５．０で最も高いゼータ電位値を示したが、最も小さいプロトン化能力を有するＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬミセルは、最も低いゼータ電位を示した。生理学的ｐＨでのミセルの負の表面電荷が、ミセルと血液中の血清タンパク質との相互作用を軽減し、それらのｉｎ ｖｉｖｏ循環時間を延長することができるので、媒体ｐＨに対する観察されたミセル表面電荷応答は非常に望ましい。他方で、およそ６．５の腫瘍細胞外ｐＨでの正の表面電荷への反転は、標的腫瘍細胞によるこれらのミセルの取り込みを増強し得る。

【0197】

粒子／ミセルの表面電荷は、ＰＢＳ溶液（０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４）中でわずかに負であり、ミセルのｉｎ ｖｉｖｏ薬物送達適用のために有益である。ほぼ中性の表面電荷（－１０～＋１０ｍＶのゼータ電位）を有するナノ粒子は、細網内皮系（ＲＥＳ）によるそれらの取り込みを減少させ、血液中の循環時間を延長することができることが公知である。ミセルの負の表面電荷は、アニオンとＰＥＧシェルのエーテル基またはＰＰＭＳコアのアミノ基との間の水素結合相互作用を介したミセル粒子によるＰＢＳ中のＨＰＯ_４ ^２－および／またはＨ_２ＰＯ_４ ^－アニオンの吸収から生じ得る。両親媒性ブロックコポリマーミセルについて、ミセルの外側シェル中の親水性鎖セグメント（例えば、ＰＥＧ）が、ミセルコアにおいて電荷を遮蔽することができ、長鎖ブロックが短鎖ブロックよりもゼータ電位を低減するのにより有効であると期待される。したがって、有意に低いゼータ電位値が、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルと比較して、ＰＥＧ５Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルについて観察された。

【0198】

コポリマーミセルは、ｐＨ応答性である：媒体ｐＨを７．４から５．０に下げると、ミセルサイズは、ミセルサイズを有意に増加させる一方で、ミセル表面電荷は、負電荷から正電荷に反転した。相応して、ＤＴＸ封入コポリマーミセルは、ｐＨ７．４で徐々に持続的な薬物放出を示したが、酸性のｐＨ５．０ではＤＴＸ放出を著しく加速した。不十分な酸素灌流に起因する乳酸蓄積の結果として、腫瘍微小環境が典型的には弱酸性（例えば、５．７～７．０）であることが公知であるので、この現象を、腫瘍部位での薬剤の放出を改善するために利用することができる。対照的に、正常組織および血液の細胞外ｐＨは、わずかに塩基性である（ｐＨ７．２～７．４）。そのため、ｐＨ応答性であり、酸性ｐＨがトリガーになって、薬物放出を加速することができる抗がん薬が負荷されたミセルについて、増強された薬物送達効率が期待される。さらにまた、よりさらに酸性の条件（ｐＨ＝４．０～６．０）は、エンドサイトーシス経路を介して腫瘍細胞によるミセルの取り込み後、エンドソームおよびリソソームにおいて遭遇し、これは、薬物封入ミセルの細胞毒性をさらに増加させることがある。

【0199】

Ｖ．治療剤、予防剤および診断剤
ポリマーは、さまざまなポリマー組成物を形成することができ、これは、各種の生分解性医療デバイスを調製するため、および薬物送達のために有用である。ＰＨＡコポリマーから調製されるデバイスは、広範囲の異なる医療適用のために使用することができる。そのような適用の例としては、治療剤、予防剤または診断剤の制御放出；薬物送達；組織工学足場；細胞封入；標的化送達；生体適合性コーティング；生体適合性インプラント；誘導された組織再生；創傷包帯剤；整形外科用デバイス；補てつおよび骨セメント（接着剤および／または構造用フィラーを含む）；および診断が挙げられる。

【0200】

ポリマーを使用して、各種の治療剤、予防剤または診断剤のいずれかを、封入し、それと混合し、またはイオン的にもしくは共有結合的にカップリングさせることができる。多種多様な生物学的に活性な材料を、ポリマーによる部位への送達のために、または生体接着、細胞付着、細胞成長の増強、細菌成長の阻害、および血餅形成の防止などのポリマーに性質を付与するために、封入または組み込むことができる。

【0201】

好適な治療剤および予防剤の例としては、合成無機化合物および合成有機化合物、タンパク質およびペプチド、多糖および他の糖、脂質、ならびに治療的、予防的または診断的活性を有するＤＮＡおよびＲＮＡ核酸配列が挙げられる。核酸配列としては、遺伝子、相補的ＤＮＡに結合して転写を阻害するアンチセンス分子、およびリボザイムが挙げられる。広範囲の分子量を有する化合物は、例えば、１モルあたり１００～５００，０００グラムまたはそれよりも多くを封入することができる。好適な材料の例としては、抗体、受容体リガンド、および酵素などのタンパク質、接着ペプチドなどのペプチド、糖および多糖、合成有機薬物または合成無機薬物、ならびに核酸が挙げられる。封入することができる材料の例としては、酵素、血液凝固因子、ストレプトキナーゼおよび組織プラスミノーゲン活性化因子などの阻害剤または血餅溶解剤；免疫化のための抗原；ホルモンおよび増殖因子；ヘパリンなどの多糖；アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムなどのオリゴヌクレオチド、ならびに遺伝子治療における使用のためのレトロウイルスベクターが挙げられる。ポリマーは、細胞および組織を封入するために使用することもできる。代表的な診断剤は、Ｘ線、蛍光、磁気共鳴画像法、放射能、超音波、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）によって検出可能な薬剤である。超音波診断剤は、典型的には、ガス、例えば、空気、酸素、またはパーフルオロカーボンである。好ましい実施形態では、ポリマーは、核酸の送達のために使用される。

【0202】

Ａ．ポリヌクレオチド
下記でより詳細に議論されるように、ターポリマーは、細胞を核酸でトランスフェクトするために使用することができる。したがって、ターポリマーおよび１つまたは複数のポリヌクレオチドを含むポリプレックスも開示する。

【0203】

ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のタンパク質、機能性核酸、またはそれらの組合せをコードすることができる。ポリヌクレオチドは、単シストロン性または多シストロン性であり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、複遺伝子性である。

【0204】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞にトランスフェクトされ、染色体外のままである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、宿主細胞に導入され、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。下記でより詳細に議論されるように、組成物は、遺伝子治療の方法において使用することができる。遺伝子治療の方法は、細胞の遺伝子型を変更するポリヌクレオチドの細胞への導入を含み得る。ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子組換えを介して内因性遺伝子を修正、置き換え、または他の方法で変更することができる。方法は、欠陥遺伝子、異種遺伝子、またはオリゴヌクレオチドなどの小型核酸分子の置き換えコピー全体の導入を含み得る。例えば、修正遺伝子は、宿主のゲノム内の非特異的な場所に導入することができる。

【0205】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクターに、またはその一部に組み込まれる。遺伝子配列ならびに適切な転写および翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築する方法は、当技術分野において周知である。これらの方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換えが挙げられる。発現ベクターは、一般に、調節配列、ならびに例えば、目的のポリヌクレオチドであり得る挿入されるコード配列の翻訳および／または転写に必要なエレメントを含有する。コード配列は、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを助けるプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結され得る。生命工学において使用されるプロモーターは、意図される種類の遺伝子発現の制御に従って、異なる種類のものである。それらは、一般に、構成的プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生段階特異的プロモーター、誘導性プロモーター、および合成プロモーターに分けることができる。

【0206】

例えば、一部の実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、当技術分野において公知のプロモーターまたは他の調節エレメントに作動可能に連結されている。そのため、ポリヌクレオチドは、発現ベクターなどのベクターであり得る。原核生物系または真核生物系における発現のためのポリヌクレオチドの操作は、組換え発現における当業者に一般に公知の技法によって行われ得る。発現ベクターは、典型的には、１つまたは複数のプロモーターの制御下にある組成物の１つを含む。コード配列をプロモーターの「制御下」にするために、リーディングフレームの翻訳開始部位の５’末端を、一般に、選択されたプロモーターの約１～５０ヌクレオチド「下流」（すなわち３’）に配置する。「上流」プロモーターは、挿入されたＤＮＡの転写を刺激し、コードされる組換えタンパク質の発現を促進する。これが、ここで使用される文脈における「組換え発現」の意味である。

【0207】

各種の宿主発現系においてタンパク質またはペプチド発現を達成するために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含有する発現ベクターを構築するための多くの標準的な技法が利用可能である。発現に利用可能な細胞型としては、限定されるものではないが、組換えファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの細菌が挙げられる。これらのベクターのいずれかが、ポリマーを使用してパッケージングおよび送達され得ることは認識されるであろう。

【0208】

哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターは、通常、複製起点（必要により）、発現される遺伝子の前に位置するプロモーターを、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列と一緒に含む。複製起点は、ＳＶ４０もしくは他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）供給源に由来し得るなどの外因性の起源を含むようなベクターの構築によって提供され得るか、または宿主細胞染色体複製機構によって提供され得る。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれる場合、後者が、多くの場合に十分である。

【0209】

プロモーターは、哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来していてもよい。さらに、そのような制御配列は、宿主細胞系と適合性であるという条件で、所望の遺伝子配列に通常関連するプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、望ましくあり得る。

【0210】

いくつかのウイルスに基づく発現系が利用され得、例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、両方ともＳＶ４０ウイルスの複製起点も含有する断片としてウイルスから容易に得られるので、有用である。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルス複製起点に位置するＢｇｌＩ部位の方へ伸びているおよそ２５０ｂｐの配列が含まれているという条件で、より小さいまたはより大きいＳＶ４０断片も使用され得る。

【0211】

アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合では、コード配列は、アデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素（tripartite）リーダー配列にライゲーションされ得る。次いで、このキメラ遺伝子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能で、感染した宿主においてタンパク質を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう。

【0212】

特定の開始シグナルも、組成物の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを、追加的に提供する必要があってもよい。当業者は、この必要性を決定し、必要なシグナルを提供することが容易に可能であろう。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフレーム（またはインフェーズ）でなければならないことが周知である。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の各種の供給源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントまたは転写ターミネーターの包含によって増強され得る。

【0213】

真核生物の発現では、典型的には、元のクローニングされたセグメント内に含有されていなかった場合に、適切なポリアデニル化部位を転写単位に組み込むことも望ましいであろう。典型的には、ポリＡ付加部位は、転写終結の前の位置のタンパク質の終結部位の約３０～２０００ヌクレオチド「下流」に配置される。

【0214】

組換えタンパク質の長期間の高収量産生のため、安定発現が好ましい。例えば、タンパク質をコードする構築物を安定に発現する細胞系が操作され得る。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるベクター、および選択マーカーで形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入後、操作された細胞を、富化培地中で１～２日間成長させてもよく、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、成長して増殖巣（focus）を形成することを可能にし、次に、クローニングし、細胞系に拡大することができる。

【0215】

好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドカーゴは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。ｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードすることができる。

【0216】

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’末端にキャップおよび／または３’ポリ（Ａ）テールを有し、これは、細胞において、リボソーム結合、翻訳の開始、およびｍＲＮＡの安定性をモジュレートすることができる。

【0217】

Ｂ．目的のポリペプチド
ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の目的のポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドは、任意のポリペプチドであり得る。例えば、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、生物に治療効果もしくは予防効果を提供するポリペプチド、または生物における疾患または障害を診断するために使用することができるポリペプチドであり得る。例えば、がん、自己免疫障害、寄生生物、ウイルス、細菌、真菌または他の感染症の処置のために、発現されるポリヌクレオチドは、免疫系の細胞に対するリガンドまたは受容体として機能するポリペプチドをコードしてもよく、または生物の免疫系を刺激または阻害するように機能することができる。下記の実施例で議論されるように、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）をコードするポリヌクレオチドは、がんを処置する方法においてポリプレックスを使用して腫瘍細胞に送達することができる。

【0218】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、生物において欠陥があるポリヌクレオチドを補充または置き換える。

【0219】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、選択マーカー、例えば、薬物耐性選択マーカーなどの真核細胞において有効である選択マーカーを含む。この選択マーカー遺伝子は、選択的培養培地において成長した形質転換宿主細胞の生存または成長に必要な因子をコードすることができる。典型的な選択遺伝子は、抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、カナマイシン、ゲンタマイシン、Ｚｅｏｃｉｎ、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードし、栄養要求性の欠乏を補完し、または培地から差し引かれた重要な栄養素を供給する。

【0220】

一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子は、典型的には、宿主細胞に存在しないか、または発現していない遺伝子である。レポーター遺伝子は、典型的には、一部の表現型変化または酵素的性質を提供するタンパク質をコードする。そのような遺伝子の例は、Weising et al. Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988)に提供されている。好ましいレポーター遺伝子としては、グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子およびＧＦＰ遺伝子が挙げられる。

【0221】

Ｃ．機能性核酸
ポリヌクレオチドは、機能性核酸であり得るか、またはそれをコードすることができる。機能性核酸は、標的分子と結合すること、または特定の反応を触媒することなどの特定の機能を有する核酸分子である。機能性核酸分子は、以下の非限定的なカテゴリーに分けることができる：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、および外部ガイド配列。機能性核酸分子は、標的分子が有する特定の活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、および刺激剤として作用することができ、または機能性核酸分子は、任意の他の分子とは無関係にｄｅ ｎｏｖｏ活性を持ち得る。

【0222】

機能性核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または炭水化物鎖などの任意の高分子と相互作用することができる。そのため、機能性核酸は、標的ポリペプチドのｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと相互作用することができ、またはそれらは、ポリペプチドそれ自体と相互作用することができる。多くの場合に、機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計される。他の状況では、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づいていないが、むしろ特異的認識が起こるのを可能にする三次構造の形成に基づく。

【0223】

アンチセンス分子は、標準または非標準的な塩基対形成のいずれかにより標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子および標的分子の相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解により標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写または複製などの標的分子において通常行われるであろう処理機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによるアンチセンス効率の最適化のための多くの方法がある。例示的な方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択実験、ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するＤＮＡ改変研究が挙げられる。アンチセンス分子は、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満またはそれに等しい解離定数（Ｋ_ｄ）で標的分子と結合することが好ましい。

【0224】

アプタマーは、好ましくは特定の方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、ステムループまたはＧカルテットなどの定義された二次および三次構造にフォールドされる１５～５０塩基長の範囲の小さな核酸である。アプタマーは、ＡＴＰおよびテオフィリンなどの小分子、ならびに逆転写酵素およびトロンビンなどの大きな分子に結合することができる。アプタマーは、１０^－１２Ｍ未満の標的分子からのＫ_ｄで非常に強固に結合することができる。アプタマーが、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満のＫ_ｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高い特異性で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子と分子上の単一の位置のみで異なる別の分子との間の結合親和性において１０，０００倍超の相違を有するアプタマーが単離されている。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのＫ_ｄの多くとも１０分の１、１００分の１、１０００分の１、１０，０００分の１、または１００，０００分の１の標的分子とのＫ_ｄを有することが好ましい。ポリペプチドなどの分子について比較を行う場合、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。

【0225】

リボザイムは、分子内または分子間のいずれかの化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムなどの天然系において見られるリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒する、いくつかの異なる種類のリボザイムがある。天然系では見られないが、特定の反応をｄｅ ｎｏｖｏで触媒するように操作されているいくつかのリボザイムもある。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識および結合とその後の切断により核酸基質を切断する。この認識は、多くの場合、標準または非標準の塩基対の相互作用に主に基づく。標的基質の認識が標的基質配列に基づくので、この性質は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断の特に良好な候補にする。

【0226】

三重鎖形成性機能性核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、三重鎖と呼ばれる構造が形成され、そこには、ワトソン－クリックおよびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成するＤＮＡの３つの鎖がある。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域と結合することができるので、好ましい。三重鎖形成分子が、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満のＫ_ｄで標的分子と結合することが好ましい。

【0227】

外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子と結合する分子であり、これは、ＲＮａｓｅ Ｐによって認識され、次いで、標的分子を切断する。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的化するように設計することができる。ＲＮＡｓｅ Ｐは、細胞内のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを支援する。細菌ＲＮＡｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、実質的に任意のＲＮＡ配列を切断するために動員され得る。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ ＰのＲＮＡの指向性切断を利用して、真核細胞内の所望の標的を切断することができる。各種の異なる標的分子の切断を容易にするためにＥＧＳ分子を作製および使用する方法の代表例は、当技術分野において公知である。

【0228】

遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により非常に特異的な様式で効果的にサイレンシングすることもできる。このサイレンシングは、元々は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加により観察された（Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11；Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89；Hannon, (2002) Nature, 418:244-51）。ｄｓＲＮＡが細胞に侵入すると、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ様酵素であるダイサーによって、３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを含有する２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Elbashir, et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200；Bernstein, et al. (2001) Nature, 409:363-6；Hammond, et al. (2000) Nature, 404:293-6）。ＡＴＰ依存性ステップでは、ｓｉＲＮＡは、一般にＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として公知のマルチサブユニットタンパク質複合体に組み込まれ、これが、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列にガイドする（Nykanen, et al. (2001) Cell, 107:309-21）。ある時点でｓｉＲＮＡ二重鎖がほどけ、アンチセンス鎖がＲＩＳＣに結合したままであり、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの組合せによって相補的ｍＲＮＡ配列の分解を方向付けると思われる（Martinez, et al. (2002) Cell, 110:563-74）。しかしながら、ｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡの効果またはそれらの使用は、任意の種類の機構に限定されない。

【0229】

短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導し、それによって、遺伝子発現を減少またはさらに阻害することができる二本鎖ＲＮＡである。一例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡなどの相同ＲＮＡ分子の特異的分解のトリガーになる。例えば、ＷＯ０２／４４３２１号は、３’オーバーハング末端と塩基対形成した場合に、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が可能なｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡを作製する方法について参照により本明細書に組み込まれる。配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素のダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣する合成の短い二本鎖ＲＮＡを使用して哺乳動物細胞において達成することができる（Elbashir, et al. (2001) Nature, 411:494 498）（Ui-Tei, et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82）。ｓｉＲＮＡは、化学的にもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することができ、または細胞内部でｓｉＲＮＡにプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を使用して設計される。供給業者としては、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、およびＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットなどのキットを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成することもできる。

【0230】

ベクターからのｓｉＲＮＡの産生は、より一般には、短ヘアピンＲＮＡｓｅ（ｓｈＲＮＡ）の転写により行われる。例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）構築キット、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ－ＩＴ（商標）誘導性ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクターなどのｓｈＲＮＡを含むベクターの生成のためのキットが利用可能である。

【0231】

ポリヌクレオチドの組成物
ポリヌクレオチドは、典型的には、複素環式塩基（核酸塩基）、複素環式塩基に付着した糖部分、および糖部分のヒドロキシル機能をエステル化するリン酸部分を含むＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドであり得る。主要な天然に存在するヌクレオチドは、複素環式塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニン、ならびにホスホジエステル結合によって連結されたリボースまたはデオキシリボース糖を含む。

【0232】

ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ対応物と比べて、標的配列に対する安定性、半減期、または特異性もしくは親和性を改善するように化学的に改変されたヌクレオチドアナログから構成され得る。化学改変としては、核酸塩基、糖部分、ヌクレオチド連結、またはそれらの組合せの化学改変が挙げられる。本明細書で使用される場合、「改変ヌクレオチド」または「化学的に改変されたヌクレオチド」は、複素環式塩基、糖部分またはリン酸部分構成成分の１つもしくは複数の化学改変を有するヌクレオチドを定義する。一部の実施形態では、改変ヌクレオチドの電荷は、同じ核酸塩基配列のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して低減される。例えば、オリゴヌクレオチドは、低い負電荷、電荷なし、または正電荷を有することができる。改変は、オリゴヌクレオチドが細胞に侵入する能力、および上記で議論されたような遺伝子発現の阻害などの機能を行う能力を妨げるべきではなく、好ましくは、これを増強すべきである。

【0233】

典型的には、ヌクレオシドアナログは、標準的なポリヌクレオチド塩基へのワトソン－クリック塩基対形成によって水素結合が可能な塩基を支持し、ここで、アナログの骨格は、オリゴヌクレオチドアナログ分子と標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）中の塩基との間の配列特異的な方法でそのような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。好ましいアナログは、実質的に帯電していない、リン含有骨格を有するものである。

【0234】

下記でより詳細に議論されるように、好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴヌクレオチドである。

【0235】

１．複素環式塩基
主要な天然に存在するヌクレオチドは、複素環式塩基としてウラシル、チミン、シトシン、アデニンおよびグアニンを含む。オリゴヌクレオチドは、それらの核酸塩基構成成分に対する化学改変を含み得る。複素環式塩基または複素環式塩基アナログの化学改変は、標的配列を結合する際の結合親和性または安定性を増加させるために有効であり得る。化学的に改変された複素環式塩基としては、限定されるものではないが、イノシン、５－（１－プロピニル）ウラシル（ｐＵ）、５－（１－プロピニル）シトシン（ｐＣ）、５－メチルシトシン、８－オキソ－アデニン、シュードシトシン、シュードイソシトシン、５および２－アミノ－５－（２’－デオキシ－ベータ－Ｄ－リボフラノシル）ピリジン（２－アミノピリジン）、ならびにさまざまなピロロおよびピラゾロピリミジン誘導体が挙げられる。

【0236】

２．糖改変
ポリヌクレオチドは、改変された糖部分または糖部分アナログを有するヌクレオチドを含有することもできる。糖部分の改変としては、限定されるものではないが、２’－Ｏ－アミノエトキシ、２’－Ｏ－アミノエチル（amonioethyl）（２’－ＯＡＥ）、２’－Ｏ－メトキシ、２’－Ｏ－メチル、２－グアニドエチル（２’－ＯＧＥ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン（ＬＮＡ）、２’－Ｏ－（メトキシエチル）（２’－ＯＭＥ）および２’－Ｏ－（Ｎ－（メチル）アセトアミド）（２’－ＯＭＡ）が挙げられる。２’－Ｏ－アミノエチル糖部分の置換は、それらが中性ｐＨでプロトン化され、したがってＴＦＯと標的二重鎖との間の電荷反発を抑制するので、特に好ましい。この改変は、リボースまたはデキシリボースのＣ３’－エンドコンフォメーションを安定化し、二重鎖のプリン鎖におけるｉ－１リン酸との架橋も形成する。

【0237】

ポリヌクレオチドは、モルホリノオリゴヌクレオチドであり得る。モルホリノオリゴヌクレオチドは、典型的には、塩基特異的水素結合によって、ポリヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対形成部分を含有する２つより多くのモルホリノモノマーから構成され、これは、１～３原子長のリン含有連結によって一緒に連結され、１つのモノマーのモルホリノ窒素を隣接するモノマーの５’環外炭素に接続する。プリンまたはピリミジン塩基対形成部分は、典型的には、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、および結合特徴は、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，３３７号に詳述されている。

【0238】

モルホリノに基づくサブユニットの重要な性質としては、典型的には、以下が挙げられる：安定な非帯電骨格連結によりオリゴマー形態で連結する能力；形成されるポリマーが、１０～１４塩基という短いオリゴマーでも高いＴ_ｍを有する標的ＲＮＡを含む相補的塩基標的核酸とハイブリダイズすることができるような、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシルまたはイノシン）を支持する能力；オリゴマーが哺乳動物細胞に活発に輸送される能力；およびオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖がＲＮＡｓｅ分解に抵抗する能力。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、非帯電連結によって接続された塩基対形成部分を保有しているモルホリノに基づくサブユニットを用いる。

【0239】

３．ヌクレオチド間連結
ヌクレオチド間結合は、２つのヌクレオシド部分間の化学連結を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドのリン酸骨格への改変は、ポリヌクレオチドの結合親和性もしくは安定性を増加させ得るか、またはヌクレアーゼ消化に対するポリヌクレオチドの感受性を低減し得る。限定されるものではないが、ジエチル－エチレンジアミド（ＤＥＥＤ）またはジメチル－アミノプロピルアミン（ＤＭＡＰ）を含むカチオン性改変は、オリゴヌクレオチドと標的との間の静電反発を減少させることに起因して特に有用であり得る。リン酸骨格の改変は、ホスホジエステル連結における非架橋酸素の１個に対する硫黄原子での置換も含み得る。この置換は、ホスホジエステル連結の代わりにホスホロチオエートヌクレオシド間連結を作り出す。ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでより安定であることが示されている。

【0240】

低減された電荷を有する改変ヌクレオチドの例としては、アキラルおよび非帯電サブユニット間連結を有するリン酸アナログなどの改変ヌクレオチド間連結（例えば、Sterchak, et al., Organic Chem., 52:4202, (1987)）、および上記で議論されたようなアキラルサブユニット間連結を有する非帯電モルホリノに基づくポリマー（例えば、米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）が挙げられる。一部のヌクレオチド間連結アナログとしては、モルホリデート、アセタール、およびポリアミド連結複素環が挙げられる。

【0241】

別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸から構成される。ロックド核酸（ＬＮＡ）は、改変ＲＮＡヌクレオチドである（例えば、Braasch, et al., Chem. Biol., 8(1):1-7 (2001)を参照されたい）。ＬＮＡは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）／ＤＮＡハイブリッドと類似の性質のＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドよりも安定であるＤＮＡとのハイブリッドを形成する。したがって、ＬＮＡは、ＰＮＡ分子の通りに使用することができる。ＬＮＡ結合効率は、一部の実施形態では、それに正電荷を加えることによって、増加し得る。市販の核酸合成機および標準的なホスホルアミダイト化学を使用して、ＬＮＡが作製される。

【0242】

一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸から構成される。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、オリゴヌクレオチドのリン酸骨格が、Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位を繰り返すことによってその全体が置き換えられ、ホスホジエステル結合が、典型的には、ペプチド結合によって置き換えられる、合成ＤＮＡ模倣物である。さまざまな複素環式塩基が、メチレンカルボニル結合によって骨格に連結される。ＰＮＡは、従来のＤＮＡオリゴヌクレオチドと類似する複素環式塩基の間隔を維持するが、アキラルで中性に帯電した分子である。ペプチド核酸は、ペプチド核酸モノマーから構成される。

【0243】

他の骨格改変としては、ペプチドおよびアミノ酸の変形形態および改変が挙げられる。したがって、ＰＮＡなどのオリゴヌクレオチドの骨格構成成分は、ペプチド連結であってもよく、あるいはそれらは、非ペプチドのペプチド連結であってもよい。例としては、アセチルキャップ、８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸などのアミノスペーサー（本明細書でＯ－リンカーと称される）が挙げられ、リシンなどのアミノ酸は、ＰＮＡにおいて正電荷が望まれる場合などに特に有用である。ＰＮＡの化学的アセンブリーのための方法は周知である。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，５２７，６７５号、同第５，６２３，０４９号、同第５，７１４，３３１号、同第５，７３６，３３６号、同第５，７７３，５７１号、および同第５，７８６，５７１号を参照されたい。

【0244】

ポリヌクレオチドは、必要に応じて、その標的に対するオリゴヌクレオチドの安定性および／または親和性を増加させるために、いずれかまたは両方の末端に１個または複数の末端残基または改変を含む。一般に使用される正電荷部分としては、アミノ酸のリシンおよびアルギニンが挙げられるが、他の正電荷部分も有用であり得る。例えば、リシンおよびアルギニン残基は、ビス－ＰＮＡリンカーに付加することができ、またはＰＮＡ鎖のカルボキシもしくはＮ末端に付加することができる。ポリヌクレオチドは、３’－プロピルアミン基を使用して分解を防止するために末端キャップされるようにさらに改変されていてもよい。オリゴヌクレオチドの３’または５’キャッピングの手順は、当技術分野において周知である。

【0245】

ＶＩ．ポリプレックスのためのコーティング剤
ポリマーを使用するポリヌクレオチド送達の効率は、ポリプレックス表面上の正電荷によって影響を受け得る。例えば、＋８．９ｍＶのポリプレックスのゼータ電位は、循環の間に血液中の負に帯電した血漿タンパク質を引きつけ、それと結合し、細網内皮系（ＲＥＳ）による迅速なクリアランスをもたらし得る。効率はまた、ポリプレックスナノ粒子の不安定性によって影響を受け得る。例えば、下記の実施例において議論されるように、１０％の血清を含有するＮａＡｃ緩衝液中でインキュベートされたポリプレックス粒子は、１５分以内にサイズがほぼ２倍になり、７５分後に１０倍を上回って増加した。このサイズの増加の結果として、拡大したポリプレックスは、肝臓における取り込みによって循環から除去される可能性がある。したがって、一部の実施形態では、ポリプレックスは、ポリヌクレオチド送達効率を改善するために、処理またはコーティングされる。一部の実施形態では、コーティングは、対照と比較して、ポリプレックスの細胞特異的標的化を改善するか、安定性を改善するか（すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでのポリプレックスのサイズを安定化する）、ｉｎ ｖｉｖｏの（すなわち、体循環において）ポリプレックスの半減期を増加させるか、またはそれらの組合せを行う。一部の実施形態では、対照は、コーティングなしのポリプレックスである。

【0246】

腫瘍細胞を標的化するための例示的なポリプレックスコーティングは、ポリＥ－ｍＲＧＤである。本明細書で使用される場合、ポリＥ－ｍＲＧＤは、３つのセグメントを含有する合成ペプチドを指す：生理学的ｐＨで負に帯電し、したがって、正に帯電したポリプレックスの表面に静電結合することができるポリグルタミン酸（ポリＥ）ストレッチを含む第１のセグメント；中性リンカーとして機能する中性ポリグリシンストレッチを含む第２のセグメント；ならびにＲＧＤとα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５との相互作用により腫瘍内皮と結合するＲＧＤ配列を含む第３のセグメント。

【0247】

下記でより詳細に議論されるように、実施例で使用したポリＥ－ｍＲＧＤは、ＩＩＩ－２０％ＰＤＬ／ｐＬｕｃＤＮＡポリプレックスの表面電荷を反転させた。ポリＥ－ｍＲＧＤを、５：１のペプチド／ＤＮＡ重量比で添加した場合、ポリプレックスのゼータ電位は、＋８．９ｍＶから－５．８ｍＶに変化した。ペプチドがコーティングされたポリプレックスは、１０％の血清を含有するＮａＡｃ緩衝液中でのインキュベーションの際に安定であり、凝集に対して耐性であり、改変ポリプレックスがｉｎ ｖｉｖｏでの循環の間にＲＥＳによるクリアランスを回避することができることを示した。

【0248】

一実施形態では、ポリＥ－ｍＲＧＤは、配列ＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＧＧＧＧＧＧＲＧＤＫ（配列番号１）、またはＲＧＤＫＧＧＧＧＧＧＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥ（配列番号２）、または配列番号１もしくは２に対して８５％、９０％、９５％、または９５％よりも高い配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。

【0249】

ｉｎ ｖｉｖｏでそれらのサイズを維持する電荷中性のまたは負に帯電した粒子を調製するために使用することができる別の例示的なコーティングは、Harris, et al., Biomaterials, 31:998-1006 (2010)に記載されており、非特異的全身投与のためのアミノ酸配列ＧＧＧＧＧＧＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥ（配列番号３、ポリ－Ｅ）、またはアミノ酸配列ＧｄＰｄＬＧｄＶｄＲＧ－ＧＧＧＧＧＧ－ＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥＥ－ＣＯＮＨ２（配列番号４、ポリ－Ｅ－Ｃａｔ）を含むことができ、これらは、脾臓、脊椎、胸骨、および大腿骨への標的化を増加させるポリカチオン配列を含有する。一部の実施形態では、コーティングにおいて使用されるポリペプチドは、配列番号３または４に対して８５％、９０％、９５％、または９５％よりも高い配列同一性を有する配列番号３または４のバリアントである。

【0250】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および補体タンパク質Ｃ３のナノ粒子への吸着が、クッパー細胞によるそれらの取り込みを増加させ、血清中でのインキュベーションが、肝灌流後のｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓取り込みを増加させることを示している（Nagayama, et al., Int. J. Pharm., 342:215-21 (2007)）。報告は、ガラクトースがアシアロ糖タンパク質受容体を介してポリマー性遺伝子送達粒子を肝細胞にガイドするために使用することができることも示す（Zhang, et al., J. Controlled Release, 102:749-63 (2005)）。

【0251】

Ａ．表面電荷を変更するための組成物
ポリプレックスのポリヌクレオチド送達効率は、生理学的ｐＨで負に帯電する薬剤で粒子をコーティングすることによって改善することができる。好ましくは、負に帯電した薬剤は、ポリプレックスの正に帯電した表面に静電結合することができる。負に帯電した薬剤は、ポリプレックスの電荷を中和するか、またはポリプレックスの電荷を反転させることができる。したがって、一部の実施形態では、負に帯電した薬剤は、ポリプレックスに正味の負電荷を付与する。

【0252】

一部の実施形態では、負に帯電した薬剤は、負に帯電したポリペプチドである。例えば、ポリペプチドは、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはそれらの組合せを含むことができ、その結果、ポリペプチドの全体的な電荷は、中性ｐＨで負である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０個を超えるアスパラギン酸残基からなるポリアスパラギン酸ポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、または２０個を超えるグルタミン酸残基からなるポリグルタミン酸ポリペプチドである。他の負に帯電した分子としては、ヒアルロン酸などの小分子（すなわち、１５００、１００、７５０、または５００ダルトン未満のＭＷ）が挙げられる。

【0253】

粒子の表面上の負電荷を増加させることで、上記に記載される負の相互作用を低減または防止することができ、ここで、より正に帯電した粒子は、循環の間に血液中の負に帯電した血漿タンパク質を引きつけ、結合し、細網内皮系（ＲＥＳ）による迅速なクリアランスをもたらす。一部の実施形態では、粒子のゼータ電位は、約－１５ｍＶ～約１０ｍＶ、好ましくは、約－１５ｍＶ～約８ｍＶ、より好ましくは、約－１０ｍＶ～約８ｍＶ、より好ましくは、約－８ｍＶ～約８ｍＶである。ゼータ電位は、粒子が安定であり（すなわち、凝集しないなど）、血流から容易に除去されないという条件で、上記の範囲よりも負または正であることができる。ゼータ電位は、表面電荷を変える１つまたは複数の部分で粒子表面をコーティングまたは官能化することによって操作することができる。あるいは、モノマーそれ自体を官能化することができ、および／または追加のモノマーをポリマーに導入することができ、これにより、表面電荷が変わる。

【0254】

Ｂ．標的化部分
一部の実施形態では、ポリプレックスは、細胞型または細胞状態に特異的な標的化ドメインまたは標的化シグナルを含む。ポリプレックスに連結され得るか、または連結され得ない部分の例としては、例えば、特定の細胞への分子の送達を提供する標的化部分が挙げられる。標的化シグナルまたは配列は、宿主、組織、臓器、細胞、オルガネラ、非核オルガネラ、または細胞コンパートメントに特異的であり得る。例えば、本明細書の組成物は、ガラクトシル終端高分子で改変して、組成物を肝臓または肝臓細胞に標的化することができる。改変された組成物は、担体のガラクトース残基とこれらの細胞上にのみ大量に高い親和性で存在するアシアロ糖タンパク質受容体との相互作用後に、選択的に肝細胞に侵入する。また、本明細書の組成物は、他の特定の細胞間領域、コンパートメント、または細胞型を標的化することができる。

【0255】

一実施形態では、標的化シグナルは、ベクターおよび細胞膜を互いに十分に近づけて、ベクターの細胞への浸透を可能にするように、標的細胞の表面上に位置するそのリガンドまたは受容体に結合する。本開示の追加の実施形態は、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に特異的に送達することを対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードすることができるか、または異なるポリヌクレオチドの発現を妨げることができる。細胞に送達されるポリヌクレオチドは、細胞の機能を増強し得るか、またはそれに寄与し得るポリペプチドをコードすることができる。

【0256】

標的化部分は、抗体またはその抗原結合性断片、抗体ドメイン、抗原、Ｔ細胞受容体、細胞表面受容体、細胞表面接着分子、主要組織適合性遺伝子座タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、および規定の細胞に特異的に結合するファージディスプレイによって選択されたペプチドであり得る。

【0257】

当業者は、記載されるポリプレックスの指向性が、単に標的化シグナルを変化させることによって変更することができることを認識するであろう。哺乳動物生物における組織中のほぼすべての細胞型が、ある固有の細胞表面受容体または抗原を持つことは当技術分野において公知である。そのため、細胞表面受容体または抗原に対するほぼあらゆるリガンドを標的化シグナルとして組み込むことが可能である。例えば、ペプチジルホルモンは、そのようなホルモンに対する受容体を持つそれらの細胞への送達を標的化する標的化部分を使用することができる。ケモカインおよびサイトカインは、同様に、それらの標的細胞への複合体の送達を標的化する標的化シグナルとして用いることができる。ある特定の細胞または細胞状態において優先的に発現される遺伝子を特定するために各種の技術が開発されており、当業者は、そのような技術を用いて、目的の標的組織において優先的にまたは固有に発現される標的化シグナルを特定することができる。

【0258】

腫瘍標的化
一実施形態では、標的化シグナルは、腫瘍細胞を選択的に標的化するために使用される。腫瘍細胞は、腫瘍においてのみ発現され得るか、または非腫瘍細胞に存在するが、腫瘍細胞において優先的に提示される、細胞表面マーカーを発現する。そのようなマーカーは、がん細胞へのポリプレックスの送達を増加させるために標的化することができる。

【0259】

例えば、一部の実施形態では、標的化部分は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸配列を含むポリペプチドである。例えば、標的化部分は、ＲＧＤ配列を含み、ＲＧＤとα_ｖβ_３およびα_ｖβ_５との相互作用により腫瘍内皮に結合することができるポリペプチド以外のアルギニン－グリシン－アスパラギン酸－リシン（ＲＧＤＫ、ｍＲＧＤ）であり得る。一部の実施形態では、標的化部分は、ポリペプチド配列Ｒ／ＫｘｘＲ／Ｋ（ここで「ｘ」は、任意のアミノ酸である）を含み、これは、ニューロピリン－１への結合を可能にする。インテグリンまたはニューロピリン－１との結合は、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍への腫瘍標的化送達および組織透過送達を改善するための２つのアプローチである。類似のアプローチは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのリガンド特異的遺伝子送達、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの肝臓、脾臓、および骨髄への標的遺伝子送達を促進することが報告されている。

【0260】

他の例示的な腫瘍特異的細胞表面マーカーとしては、限定されるものではないが、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、がん抗原－５０（ＣＡ－５０）、卵巣がんに関連するがん抗原－１２５（ＣＡ－１２５）、乳がんに関連するがん抗原１５－３（ＣＡ１５－３）、胃腸がんに関連するがん抗原－１９（ＣＡ－１９）およびがん抗原－２４２、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、癌関連抗原（ＣＡＡ）、クロモグラニンＡ、上皮ムチン抗原（ＭＣ５）、ヒト上皮特異的抗原（ＨＥＡ）、ルイス（ａ）抗原、黒色腫抗原、黒色腫関連抗原１００、２５、および１５０、ムチン様癌関連抗原、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰｍ６）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ４１）、Ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質（Ｃ－ｅｒｂＢ－２）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、Ｐ－糖タンパク質（ｍｄｒ１遺伝子産物）、多剤耐性関連抗原、ｐ１７０、多剤耐性関連抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＣＤ５６、ＮＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＣＤ４４、ならびに葉酸受容体が挙げられる。一実施形態では、標的化シグナルは、腫瘍細胞表面マーカーに特異的である抗体からなる。

【0261】

抗体
別の実施形態は、標的化シグナルとして作用するポリプレックスに結合した抗体またはその抗原結合性断片を提供する。抗体またはその抗原結合性断片は、ポリプレックスを細胞型または細胞状態に方向付けるために有用である。一実施形態では、ポリプレックスは、抗体結合ドメインであるポリペプチド、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のプロテインＡおよびプロテインＧなどの抗体に結合することが公知のタンパク質に由来するポリペプチドでコーティングされる。抗体に結合することが公知の他のドメインは、当技術分野において公知であり、置換することができる。抗体結合ドメインは、抗体またはその抗原結合性断片をポリプレックスに連結する。

【0262】

ある特定の実施形態では、標的化シグナルとして機能する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、線状抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそれらの断片である。代表的な抗体断片は、非ウイルスベクターの抗体結合部分と結合するそれらの断片であり、当技術分野において公知のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖダイアボディ（diabody）、線状抗体、一本鎖抗体、および二重特異性抗体を含む。

【0263】

一部の実施形態では、標的化シグナルは、ポリプレックスを所望の標的細胞型または細胞状態に方向付ける抗体の全部または一部を含む。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得るが、好ましくは、モノクローナルである。ヒト遺伝子治療の目的のために、抗体は、ヒト遺伝子に由来し得、細胞表面マーカーに特異的であり、当技術分野において公知であるように、ヒト宿主に対する潜在的な免疫原性を低減するように産生される。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子クラスター全体を含有するトランスジェニックマウスは、利用され得る「ヒト」抗体を産生することができる。一実施形態では、そのようなヒト抗体の断片が、標的化シグナルとして用いられる。好ましい実施形態では、ヒト抗体をモデルとした一本鎖抗体が、原核生物培養において調製される。

【0264】

一実施形態では、標的化シグナルは、脳および末梢神経系を含む神経系の細胞に方向付けられる。脳における細胞は、いくつかの型および状態を含み、その型に特異的な固有の細胞表面分子を持つ。さらにまた、細胞型および状態は、共通の細胞表面分子の提示によってさらに特徴付けおよびグループ化することができる。

【0265】

一実施形態では、標的化シグナルは、神経系の細胞の表面において発現される特定の神経伝達物質受容体に方向付けられる。神経伝達物質受容体の分布は、当技術分野において周知であり、当業者は、標的化シグナルとして神経伝達物質受容体特異的抗体を使用することによって、記載される組成物を方向付けることができる。さらにまた、それらの受容体に対する神経伝達物質の指向性を考えると、一実施形態では、標的化シグナルは、神経伝達物質受容体に特異的に結合することができる神経伝達物質またはリガンドからなる。

【0266】

一実施形態では、標的化シグナルは、アストロサイト、ミクログリア、ニューロン、オリゴデンドロサイト（oligodendrite）およびシュワン細胞を含み得る神経系の細胞に特異的である。これらの細胞は、それらの機能、場所、形状、神経伝達物質クラスおよび病理学的状態によってさらに分けることができる。神経系の細胞はまた、それらの分化の状態、例えば、幹細胞によって特定することができる。これらの細胞型および状態に特異的な例示的なマーカーは、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、ＣＤ１３３およびニューロスフェアが挙げられる。

【0267】

一実施形態では、標的化シグナルは、筋骨格系の細胞に方向付けられる。筋細胞は、いくつかの型を含み、その型および状態に特異的な固有の細胞表面分子を持つ。さらにまた、細胞型および状態は、共通の細胞表面分子の提示によってさらに特徴付けおよびグループ化することができる。

【0268】

一実施形態では、標的化シグナルは、筋細胞の表面において発現される特定の神経伝達物質受容体に方向付けられる。神経伝達物質受容体の分布は、当技術分野において周知であり、当業者は、標的化シグナルとして神経伝達物質受容体特異的抗体を使用することによって、記載される組成物を方向付けることができる。さらにまた、それらの受容体に対する神経伝達物質の指向性を考えると、一実施形態では、標的化シグナルは、神経伝達物質からなる。標的化され得る筋細胞において発現される例示的な神経伝達物質としては、限定されるものではないが、アセチルコリン（acetycholine）およびノルエピネフリンが挙げられる。

【0269】

一実施形態では、標的化シグナルは、２つの主要なグループ分けであるＩ型およびＩＩ型からなる筋細胞に特異的である。これらの細胞は、それらの機能、場所、形状、ミオグロビン含有量および病理学的状態によってさらに分けることができる。筋細胞はまた、それらの分化の状態、例えば、筋幹細胞によって特定することができる。これらの細胞型および状態に特異的な例示的なマーカーは、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、ＭｙｏＤ、Ｐａｘ７、およびＭＲ４が挙げられる。

【0270】

Ｃ．リンカー
一部の実施形態では、ポリプレックスは、負に帯電した薬剤および標的化部分の両方でコーティングすることができる。一部の実施形態では、負に帯電した薬剤および標的化部分は、リンカーによって一緒に連結される。リンカーは、ポリペプチド、または当技術分野において公知である任意の他の適切なリンカー、例えば、ポリエチレングリコール（poly ethylene glycol）（ＰＥＧ）であり得る。

【0271】

一部の実施形態では、リンカーは、生理的ｐＨでおよそ中性の電荷を有するポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーポリペプチドは、ポリグリシンである。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはグリシン残基からなる。好ましい実施形態では、リンカーは、６残基ポリグリシンである。

【0272】

一部の実施形態では、負に帯電した薬剤は、単独で、または標的化部分と組み合わせて、静電相互作用によってポリプレックスに連結される。一部の実施形態では、負に帯電した薬剤、標的化部分、またはそれらの組合せは、ポリマー骨格への共有結合的なコンジュゲーションによってポリプレックスに連結されるか、またはポリマー骨格に付着した側鎖に連結される。

【0273】

Ｄ．ポリプレックスのサイズおよび凝集を低減する方法
小さな粒子径を維持することで、肝臓によるクリアランスを制限し、ポリプレックス粒子の標的細胞へのトランスフェクション能力を維持するので、凝集に対する耐性は重要であり得る。したがって、好ましい実施形態では、ポリプレックスは、凝集に対して耐性である。好ましくは、ポリプレックスは、コーティングの有無にかかわらず、約１ｎｍ～１０００ｎｍの半径、より好ましくは、約１ｎｍ～約５００ｎｍの半径、最も好ましくは、約１５ｎｍ～約２５０ｎｍの半径である。例えば、一部の実施形態では、ポリヌクレオチドが負荷されたコーティングされたポリプレックスは、約１５０ｎｍ～２７５ｎｍの半径である。

【0274】

ポリヌクレオチド重量のポリマー重量に対する比（ポリヌクレチド：ポリマー）、ポリプレックスコーティングの含有量および量、またはそれらの組合せを使用して、ポリプレックスのサイズを調整することができる。

【0275】

例えば、下記の実施例は、一部の実施形態では、ポリマーとＤＮＡの比が２５：１の粒子のトランスフェクション効率が、５０：１、１００：１、１５０：１、および２００：１のポリマー：ＤＮＡ比を有する粒子のトランスフェクション効率よりも低いことを示す。特定の製剤に対する最も好ましいポリマー：ポリヌクレオチド比は、当技術分野において公知である方法、例えば、下記の実施例に記載される方法を使用して、経験的に決定することができる。一般に、ポリマー：ポリヌクレオチドの重量：重量比は、好ましくは、約１０：１超、より好ましくは、約５０：１超、最も好ましくは、約１００：１超である。ポリマー：ポリヌクレオチドの重量：重量比は、好ましくは、約１０：１～５００：１、より好ましくは、約２５：１～２５０：１、最も好ましくは、約５０：１～１５０：１である。一部の実施形態では、ポリマー：ポリヌクレオチドの重量比は、約１００：１である。好ましくは、ポリプレックスは、球状の形状を有する。

【0276】

実施例は、一部の実施形態では、コーティング剤分子のポリヌクレオチド分子に対する比（コーティング剤：ポリヌクレオチド）による粒子のトランスフェクション効率も示す。比は重量により表される。特定の製剤に対する最も好ましいコーティング剤：ポリヌクレオチド比は、当技術分野において公知である方法、例えば、下記の実施例に記載される方法を使用して、経験的に決定することができる。一般に、コーティング剤：ポリヌクレオチドの比は、０より大きく、好ましくは、約５０：１より低く、より好ましくは、約２５：１より低く、最も好ましくは、約１０：１より低い。コーティング剤：ポリヌクレオチドの比は、好ましくは、約１：１～１０：１、より好ましくは、約２．５：１～７．５：１である。一部の実施形態では、コーティング剤：ポリヌクレオチドの比は、約５：１である。１０：１、５：１、および２．５：１のコーティング剤：ポリヌクレオチドの比は、本明細書では、それぞれ、１０×、５×、および２．５×とも称される。好ましくは、ポリプレックスは、球状の形状である。

【0277】

Ｅ．ＰＥＧブロッキング含有ポリマー
ポリマーは、薬物送達、例えば、マイクロ粒子もしくはナノ粒子などの粒子、またはミセルの形成において使用することができ、これは、望ましい期間にわたって制御放出様式で１つまたは複数の治療剤、予防剤、および／または診断剤を放出することができる。

【0278】

ｐＨ応答性ミセルナノ担体は、多くの場合、両親媒性ブロックコポリマーの自己アセンブリーを介して形成され、親水性（例えばＰＥＧ）の外側シェル、および媒体ｐＨに応答することができる疎水性内部コアからなる。典型的には、媒体ｐＨを中性またはわずかに塩基性から弱酸性に変化させる際に、ミセルコアは、加速された分解を受け、水に完全に溶解性になるか、または水性媒体中で実質的に膨潤する。結果として、生理的ｐＨでの遅い薬物放出速度を有する薬物封入ミセルは、酸性ｐＨがトリガーになって、薬物分子を迅速に下ろす（unload）ことができる。以前の報告におけるミセルコアを構成するポリマーセグメントとしては、ポリ（オルトエステル）、ポリ（β－アミノエステル）、ポリ（Ｌ－ヒスチジン）などが挙げられる。以前のミセル系のほとんどでの主な欠点は、コポリマーを調製するために必要な複数のステップ、ならびにポリマー分子量を制御すること、およびコポリマー合成の間にポリマー組成を調整することの難しさである。

【0279】

コポリマーは、ｐＨの関数として放出の速度の変動を呈した。ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマー試料（ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬ）のＤＴＸ封入ミセルのｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出挙動を、生理学的ｐＨの７．４および酸性ｐＨの５．０の両方で、ＰＢＳ溶液において研究した。一般に、すべてのミセル試料からのＤＴＸ放出は、二相性放出動態に従い、顕著なｐＨ依存性を呈した。ＤＴＸが負荷されたＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルは、最初の１２時間の間に２５～４５％の薬物を迅速に放出し、それに続いて、その後の１３２時間、追加の２５～４０％の薬物をよりゆっくりと放出する。薬物放出速度に対する媒体ｐＨの影響は、かなりのものである。例えば、インキュベーション期間の最後（１４４時間）に、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－１１％ＰＤＬ、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－３０％ＰＤＬ、およびＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳ－５１％ＰＤＬコポリマーのミセルから放出された蓄積ＤＴＸの値は、生理学的ｐＨの７．４で、それぞれ、６６％、６０％、および５５％であり、これは、酸性ｐＨの５．０で、８５％、８１％、および７５％に対応して増加する。観察されたＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルからのＤＴＸ放出のｐＨトリガー加速は、媒体ｐＨを７．４から５．０に変化させると、ミセルＰＰＭＳコアのプロトン化とサイズ増加に起因してミセルの著しい膨潤を引き起こすという以前の観察と一致する。このｐＨトリガーのミセルサイズの拡大は、ミセルコアから水性媒体への捕捉されたＤＴＸの拡散および放出を確実に促進するであろう。所与のｐＨで、ＤＴＸ放出速度は、おそらく、ミセルコア中の薬物とＰＰＭＳマトリックスとの間の相互作用によって制御される。ＰＤＬに富むＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーは、それらのミセル内部コアにおいて強い疎水性ドメインを形成して、疎水性ＤＴＸ分子をより良好に捕捉および保持することが予想されるので、そのようなコポリマーミセルからの薬物放出は、よりゆっくりと持続的であるはずである。この仮説は、７．４および５．０の両方のｐＨで、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルからのＤＴＸ放出速度が、コポリマーのＰＰＭＳ鎖セグメントにおけるＰＤＬ含有量の増加とともに減少することを示す実験結果によって支持される。

【0280】

腫瘍細胞によるミセルの取り込みの際に、ミセル粒子は、５．５～６．０の範囲のｐＨでエンドソームにおける捕捉、および４．５～５．０の範囲のｐＨでリソソームにおける捕捉に付されることが公知である。上記の結果が明らかに示すように、これらの酸性環境は、必然的に、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルからの速いＤＴＸ放出のトリガーとなり、このようにして、薬物が負荷されたミセルの細胞毒性を増強する。コポリマー中のアミノ基は、エンドソームエスケープを促進するプロトンスポンジとして作用するであろう。したがって、ＰＥＧ２Ｋ－ＰＰＭＳコポリマーミセルによって呈されるｐＨ応答性の性質は、非常に望ましく、それらを、抗がん薬の送達のための優れた担体にする。

【0281】

ＶＩＩ．製剤
製剤は、安全で有効であると考えられる材料から構成される薬学的に許容される「担体」を使用して調製され、望ましくない生物学的副作用または望まない相互作用を引き起こすことなく、個体に投与され得る。「担体」は、活性成分または成分以外の医薬製剤中に存在するすべての構成要素である。「担体」という用語は、限定されるものではないが、希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、フィラー、およびコーティング組成物を含む。

【0282】

錠剤および遅延放出剤形を調製するための材料、装置およびプロセスに関する詳細な情報について、Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, eds. Lieberman et al. (New York: Marcel Dekker, Inc., 1989)およびAnsel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6.sup.th Ed. (Media, PA: Williams & Wilkins, 1995)を参照されたい。

【0283】

ＶＩＩＩ．ポリプレックスを調製する方法
Ａ．粒子を作製するための方法
粒子は、当技術分野において公知の各種の技法を使用して調製することができる。使用される技法は、ナノ粒子を形成するために使用されるポリマー、得られる粒子の所望のサイズ範囲、および封入される材料に対する適合性を含む各種の要因に依存し得る。

【0284】

ナノ粒子を調製するために使用することができる当技術分野において公知の方法としては、限定されるものではないが、高分子電解質縮合（Suk et al., Biomaterials, 27, 5143-5150 (2006)を参照されたい）；一重および二重エマルジョン；ナノ粒子成形、ならびに静電的自己アセンブリー（例えば、ポリエチレンイミン－ＤＮＡまたはリポソーム）が挙げられる。

【0285】

一実施形態では、負荷された粒子は、典型的には、有機溶媒中のポリマーの溶液を、目的のポリヌクレオチドと混ぜ合わせることによって調製される。ポリマー溶液は、ポリマーを溶媒に溶解または懸濁させることによって調製される。溶媒は、封入される核酸に悪影響を及ぼさない（例えば、不安定化または分解しない）ように選択されなければならない。好適な溶媒としては、限定されるものではないが、ＤＭＳＯおよび塩化メチレンが挙げられる。溶媒中のポリマーの濃度は、必要により変えることができる。一部の実施形態では、濃度は、例えば、２５ｍｇ／ｍｌである。ポリマー溶液は、緩衝液、例えば酢酸ナトリウム緩衝液に希釈することもできる。

【0286】

次に、ポリマー溶液を、ポリヌクレオチドなどの封入される薬剤と混合する。薬剤は、それをポリマー溶液と混ぜ合わせる前に、溶媒に溶解して溶液を形成することができる。一部の実施形態では、薬剤は、それをポリマー溶液と混ぜ合わせる前に、生理学的緩衝液に溶解する。ポリマー溶液体積の薬剤溶液体積に対する比は、１：１であり得る。ポリマーおよび薬剤の組合せは、典型的には、トランスフェクションなどのその所望の目的のために溶液を使用する前に、数分間インキュベートして、粒子を形成する。例えば、ポリマー／ポリヌクレオチド溶液を、トランスフェクションのために溶液を使用する前に、２、５、１０、または１０分より長くインキュベートすることができる。インキュベーションは、室温であり得る。

【0287】

一部の実施形態では、粒子はまた、使用前にコーティング剤を含有する溶液とともにインキュベートされる。粒子溶液は、トランスフェクションのためにポリプレックスを使用する前に、コーティング剤とともに２、５、１０、または１０分よりも長くインキュベートすることができる。インキュベーションは、室温であり得る。

【0288】

一部の実施形態では、薬剤がポリヌクレオチドである場合、ポリヌクレオチドは、ポリマーと混合する前に、最初にポリカチオンと複合体化される。複合体化は、ポリヌクレオチドおよびポリカチオンを適切なモル比で混合することによって達成することができる。ポリアミンをポリカチオン種として使用する場合、ポリアミン窒素のポリヌクレオチドリン酸に対するモル比（Ｎ／Ｐ比）を決定することが有用である。好ましい実施形態では、阻害性ＲＮＡおよびポリアミンは、およそ１：１～１：２５、好ましくは、約８：１～１５：１のＮ／Ｐ比で、一緒に混合されて、複合体が形成される。特定のモル比を達成するために必要なポリアミン溶液の体積は、以下の式：

【数1】

［式中、Ｍ_{ｗ，ｉｎｈＲＮＡ}＝阻害性ＲＮＡの分子量、Ｍ_ｗ，Ｐ＝阻害性ＲＮＡのリン酸基の分子量、Φ_Ｎ：Ｐ＝Ｎ：Ｐ比（ポリアミン由来の窒素の阻害性ＲＮＡ由来のリン酸の比に対するモル比）、Ｃ_ＮＨ２、ｓｔｏｃｋ＝ポリアミンストック溶液の濃度、およびＭ_{ｗ，ＮＨ２}＝ポリアミンの窒素あたりの分子量］
に従って決定することができる。ポリヌクレオチドをポリカチオンと混合して、ポリヌクレオチドを縮合させる方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国公開出願第２０１１／０００８４５１号を参照されたい。

【0289】

「ポリカチオン」という用語は、選択されたｐＨ、好ましくは、生理学的ｐＨで、正電荷、好ましくは、少なくとも２つの正電荷を有する化合物を指す。ポリカチオン性部分は、選択されたｐＨ値で、約２～約１５の正電荷、好ましくは、約２～約１２の正電荷、より好ましくは、約２～約８の正電荷を有する。多くのポリカチオンが当技術分野において公知である。ポリカチオンの好適な構成成分としては、塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体、例えば、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシンおよびヒスチジン；カチオン性デンドリマー；ならびにアミノ多糖が挙げられる。好適なポリカチオンは、直鎖状、例えば、直鎖状テトラリシン、分枝状またはデンドリマーの構造であり得る。

【0290】

例示的なポリカチオンとしては、限定されるものではないが、アクリルアミドおよび２－アクリルアミド－２－メチルプロパントリメチルアミンに基づく合成ポリカチオン、ポリ（Ｎ－エチル－４－ビニルピリジン）または類似の４級化ポリピリジン、ジエチルアミノエチルポリマーおよびデキストランコンジュゲート、硫酸ポリミキシンＢ、リポポリアミン、ポリ（アリルアミン）、例えば、強ポリカチオンのポリ（ジメチルジアリルアンモニウムクロリド）、ポリエチレンイミン、ポリブレン、ならびにポリペプチド、例えば、プロタミン、ヒストンポリペプチド、ポリリシン、ポリアルギニンおよびポリオルニチンが挙げられる。

【0291】

一部の実施形態では、ポリカチオンは、ポリアミンである。ポリアミンは、２個またはそれよりも多くの第一級アミン基を有する化合物である。好適な天然に存在するポリアミンとしては、限定されるものではないが、スペルミン、スペルミジン、カダベリンおよびプトレシンが挙げられる。好ましい実施形態では、ポリアミンは、スペルミジンである。

【0292】

別の実施形態では、ポリカチオンは、環状ポリアミンである。環状ポリアミンは、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，６９８，５４６号、ＷＯ１９９３／０１２０９６号およびＷＯ２００２／０１０１４２号に記載されている。例示的な環状ポリアミンとしては、限定されるものではないが、サイクレンが挙げられる。

【0293】

スペルミンおよびスペルミジンは、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）の作用によってＬ－オルニチンから産生されるプトレシン（１，４－ジアミノブタン）の誘導体である。Ｌ－オルニチンは、アルギナーゼによるＬ－アルギニン分解の産物である。スペルミジンは、プトレシン（１，４－ジアミノブタン）の脱炭酸Ｓ－アデノシルメチオニン（ｄｃＡｄｏＭｅｔ）３－アミノプロピル供与体によるモノアルキル化を触媒するスペルミジンシンターゼ（ＳｐｄＳ）によって産生するトリアミン構造である。プトレシンの両方のアミノ基の３－アミノプロピル供与体での正式なアルキル化（formal alkylation）は、対称的なテトラアミンスペルミンが生じる。スペルミンの生合成は、ｄｃＡｄｏＭｅｔの存在下でのスペルミンシンターゼ（ＳｐｍＳ）の効果によってスペルミジンに進行する。３－アミノプロピル供与体（ｄｃＡｄｏＭｅｔ）は、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼによるＬ－メチオニンの逐次変換によってＳ－アデノシルメチオニンから誘導され、それに続いてＡｄｏＭｅｔＤＣ（Ｓ－アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ）により脱炭酸する。そのため、プトレシン、スペルミジンおよびスペルミンは、アミノ酸のＬ－アルギニン（Ｌ－オルニチン、プトレシン）およびＬ－メチオニン（ｄｃＡｄｏＭｅｔ、アミノプロピル供与体）から誘導される代謝産物である。

【0294】

ＩＸ．粒子／ミセルを使用する方法
Ａ．薬物送達
粒子は、有効量の１つまたは複数の治療剤、診断剤、および／または予防剤をそのような処置を必要とする患者に送達するために使用することができる。投与される薬剤の量は、処方する医師によって容易に決定することができ、患者の年齢および体重、ならびに処置される疾患または障害に依存する。

【0295】

粒子は、静脈内、皮下、もしくは筋肉内に注射されるか、鼻もしくは肺系に投与されるか、腫瘍環境内に注射されるか、粘膜表面（膣、直腸、頬側、舌下）に投与されるか、または経口送達のために封入されるかにかかわらず、薬物送達において有用である（本明細書で使用される場合、「薬物」は、治療剤、栄養剤、診断剤および予防剤を含む）。粒子は、乾燥粉末として、水性懸濁物（水、食塩水、緩衝食塩水などの中）、ヒドロゲル、オルガノゲル、もしくはリポソーム、カプセル剤、錠剤、トローチ、または他の標準的な医薬賦形剤中で投与され得る。

【0296】

Ｂ．トランスフェクション
組成物は、ポリヌクレオチドの細胞トランスフェクションのためのものであり得る。下記でより詳細に議論されるように、トランスフェクションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで起こり得、遺伝子治療および疾患処置を含む適用において適用することができる。組成物は、対照と比較した場合に、より効率的で、毒性が低く、またはそれらの組合せであり得る。一部の実施形態では、対照は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの代替トランスフェクション試薬で処理された細胞である。

【0297】

トランスフェクションは、細胞をポリプレックスを含有する溶液と接触させることによって行われる。ｉｎ ｖｉｖｏの方法について、接触は、典型的には、溶液が対象に投与された後にｉｎ ｖｉｖｏで起こる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法について、溶液は、典型的には、細胞の培養物に添加され、数分間、数時間、または数日間、細胞に接触させる。その後、細胞を洗浄して、過剰なポリプレックスを移動させることができる。

【0298】

ポリプレックスによって送達される特定のポリヌクレオチドは、処置される状態または疾患に応じて当業者によって選択することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、目的の遺伝子もしくはｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、阻害性ＲＮＡなどの機能性核酸、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、あるいは目的の遺伝子もしくはｃＤＮＡ、機能性核酸、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡをコードする発現ベクターであり得る。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドが、組み合わせて投与される。

【0299】

組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチドを細胞に送達する方法において使用することができる。例えば、ポリプレックスは、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションのために使用することができる。方法は、典型的には、ポリヌクレオチドを細胞の細胞質に導入するための有効量でポリヌクレオチドを含むポリプレックスと細胞を接触させることを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞の遺伝子型または表現型を変化させるための有効量で細胞に送達される。細胞は、対象から単離された初代細胞、または樹立された細胞系の細胞であり得る。細胞は、同種の細胞型のものであり得るか、または異なる細胞型の異種性混合物であり得る。例えば、ポリプレックスは、例えば、フィーダー細胞培養、またはさまざまな分化の状態の混合培養において、異なる型の細胞を持つ不均一細胞系由来の細胞の細胞質に導入することができる。細胞は、細胞培養において無期限に維持することができる形質転換細胞系であり得る。例示的な細胞系は、腫瘍細胞系を含むアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から入手可能なものである。

【0300】

任意の真核細胞をトランスフェクトして、特定の核酸、例えば、代謝遺伝子を発現する細胞、例えば、初代細胞および樹立された細胞系を生成することができる。好適な型の細胞としては、限定されるものではないが、幹細胞、全能性細胞、多能性細胞、胚性幹細胞、内部細胞塊細胞（inner mass cell）、成体幹細胞、骨髄細胞、臍帯血由来の細胞、および外胚葉、中胚葉、または内胚葉に由来する細胞を含む、未分化細胞または部分的に分化した細胞が挙げられる。好適な分化細胞としては、体細胞、神経細胞、骨格筋、平滑筋、膵臓細胞、肝細胞、および心臓細胞が挙げられる。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスポリヌクレオチドを含む）または阻害性ＲＮＡを、組成物を使用して、細胞にトランスフェクトすることができる。

【0301】

方法は、個別化治療の分野において、例えば、欠陥遺伝子を修復する、細胞を脱分化する、または細胞を再プログラミングするために、特に有用である。例えば、標的細胞は、最初に、当技術分野において公知の方法を使用してドナーから単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ｅｘ ｖｉｖｏ）への変化を引き起こすポリヌクレオチドを含むポリプレックスと接触させ、それを必要とする患者に投与される。起源または細胞は、患者またはアログラフィック（allographic）ドナーから直接採取された細胞を含む。好ましい実施形態では、対象に投与される標的細胞は、自家である、例えば、対象に由来するか、または同系である。同種異系細胞は、抗原的に一致した、遺伝的に無関係なドナー（国の登録を通じて特定される）から、あるいは遺伝的に関連する同胞もしくは親から得られるか、またはそれらに由来する標的細胞を使用することによって、単離することもできる。

【0302】

細胞は、陽性および／または陰性選択技法によって選択することができる。例えば、特定の細胞表面タンパク質に結合する抗体は、所望の細胞型を回収するために利用される磁気ビーズおよび免疫原性手順にコンジュゲートされ得る。一過性トランスフェクションの前に標的細胞を富化することが望ましくあり得る。特定の標的細胞について富化された組成物の文脈において本明細書で使用される場合、「富化された」は、天然の細胞の起源において見出されるものよりも高い所望のエレメント（例えば、標的細胞）の割合を示す。細胞の組成物は、細胞の天然起源よりも、少なくとも１桁、好ましくは、２桁または３桁、より好ましくは、１０、１００、２００、または１０００桁富化され得る。標的細胞が単離されたら、それらを、当技術分野において公知の確立された方法に従って好適な培地中で成長させることによって繁殖させてもよい。樹立された細胞系もまた、方法のために有用であり得る。細胞は、必要により、トランスフェクション前に凍結保存することができる。

【0303】

次に、細胞を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組成物と接触させて、細胞を、修復、脱分化、再分化、および／または再プログラミングする。細胞をモニタリングすることができ、所望の細胞型を、治療的投与のために選択することができる。

【0304】

修復、脱分化、および／または再分化および／または再プログラミングの後、細胞は、それを必要とする患者に投与される。最も好ましい実施形態では、細胞は、同じ患者から単離され、同じ患者に戻して投与される。代替の実施形態では、細胞は、１人の患者から単離され、第２の患者に投与される。方法はまた、後の使用のために長期間保存することができる変更細胞の凍結ストックを生成するために使用することができる。一実施形態では、線維芽細胞、ケラチノサイトまたは造血幹細胞は、患者から単離され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで修復、脱分化、または再プログラミングされて、患者のための治療用細胞を提供する。

【0305】

Ｃ．ｉｎ ｖｉｖｏの方法
組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチドを細胞に送達する方法において使用することができる。ポリマーが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ２０００、ＰＥＩ、およびさらに他のＰＭＳＣを含む代替トランスフェクション試薬よりも、ポリヌクレオチドの全身ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションについて、より効率的および／または毒性が低いことを発見した。したがって、一部の実施形態では、治療用ポリヌクレオチドを含む細胞特異的ポリプレックスは、疾患、例えば、がんを処置するために、ｉｎ ｖｉｖｏで全身投与される。

【0306】

一部のｉｎ ｖｉｖｏアプローチでは、組成物は、治療有効量で対象に投与される。本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置される障害の１つまたは複数の症状を処置、阻害、または軽減するのに十分な投薬量、またはそうでなければ、所望の薬理学的および／または生理学的効果を提供するのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患、およびもたらされる処置などの各種の要因に従って変わる。

【0307】

医薬組成物は、非経口的（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経皮的（受動的に、またはイオントフォレーシスもしくは電気穿孔を使用するかのいずれか）、もしくは経粘膜的（鼻、膣、直腸、または舌下）な投与の経路によるか、または生体内分解性挿入物を使用する投与のためのものであり得、それぞれの投与の経路に適した剤形に製剤化することができる。

【0308】

一部の実施形態では、組成物は、全身的に、例えば、静脈内または腹腔内投与によって、標的化された細胞への組成物の送達に有効な量で投与される。他の可能な経路としては、経皮または経口が挙げられる。

【0309】

ある特定の実施形態では、組成物は、局所的に、例えば、処置される部位への直接注射によって投与される。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の腫瘍に、注射されるか、またはそうでなければ直接投与される。典型的には、局所注射は、全身投与によって達成され得るものよりも高い組成物の増加した局所濃度を引き起こす。一部の実施形態では、組成物は、カテーテルまたはシリンジを使用することによって、適切な細胞に局所的に送達される。そのような組成物を細胞に局所的に送達する他の手段としては、注入ポンプ（例えば、Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．製）を使用すること、または組成物をポリマー性インプラントに組み込むこと（例えば、P. Johnson and J. G. Lloyd-Jones, eds., Drug Delivery Systems (Chichester, England: Ellis Horwood Ltd., 1987を参照されたい）が挙げられ、これは、インプラントのすぐ近くの領域へのポリプレックスの持続放出をもたらし得る。

【0310】

ポリプレックスは、それを細胞と接触させることによるなどで直接的に、または任意の生物学的プロセスの作用を通じてなどで間接的に、細胞に提供することができる。例えば、ポリプレックスは、生理学的に許容される担体またはビヒクルにおいて製剤化され、細胞を取り囲む組織または流体に注射することができる。ポリプレックスは、単純な拡散、エンドサイトーシス、または任意の能動的なまたは受動的な輸送機構によって、細胞膜を通過することができる。

【0311】

組成物は、遺伝子関連疾患または障害の処置のための遺伝子治療プロトコールにおいて使用することができる。細胞機能障害は、組成物および方法を使用して処置または低減することもできる。一部の実施形態では、遺伝子治療に適した疾患が、特異的に標的化される。疾患は、小児、例えば、１８歳未満、典型的には、１２歳未満の個体、または成人、例えば、１８歳またはそれより年長の個体であり得る。そのため、本開示の実施形態は、ポリヌクレオチドを含むポリプレックスの疾患に冒された細胞へのトランスフェクションによって、疾患と診断された宿主を処置することを対象とし、ここで、ポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードする。別の実施形態では、阻害性ＲＮＡは、タンパク質の発現を低減または排除するために特定の細胞型または状態に方向付けられ、それによって、治療効果を達成する。本開示は、遺伝子の欠陥または異常によって引き起こされる疾患を処置するための遺伝子を、操作すること、増大させること、または置き換えることを包含する。

【0312】

本明細書の組成物で処置することができる好適な遺伝ベースの疾患としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる。

【0313】

ミトコンドリア病：アルパース病；バース症候群；β酸化欠損；カルニチン－アシル－カルニチン欠損症；カルニチン欠損症；コエンザイムＱ１０欠損症；複合体Ｉ欠損症；複合体ＩＩ欠損症；複合体ＩＩＩ欠損症；複合体ＩＶ欠損症；複合体Ｖ欠損症；シトクロムｃオキシダーゼ（ＣＯＸ）欠損症、ＬＨＯＮ－レーベル遺伝性視神経症；ＭＭ－ミトコンドリアミオパチー；ＬＩＭＭ－致死性乳児ミトコンドリアミオパチー；ＭＭＣ－母体ミオパチーおよび心筋症；ＮＡＲＰ－神経原性筋力低下、運動失調、および網膜色素変性症；リー病；ＦＩＣＰ－致死性乳児心筋症プラス（Fatal Infantile Cardiomyopathy Plus）、ＭＥＬＡＳ関連心筋症；ＭＥＬＡＳ－乳酸アシドーシスおよび脳卒中様エピソードを伴うミトコンドリア脳筋症；ＬＤＹＴ－レーベル遺伝性視神経症およびジストニア；ＭＥＲＲＦ－ミオクローヌスてんかんおよびラッグド－レッド筋線維；ＭＨＣＭ－母性遺伝性肥大型心筋症；ＣＰＥＯ－慢性進行性外眼筋麻痺；ＫＳＳ－カーンズセイヤー症候群；ＤＭ－真性糖尿病；ＤＭＤＦ 真性糖尿病＋聴覚消失；ＣＩＰＯ－ミオパチーおよび眼筋麻痺を伴う慢性偽性腸閉塞；ＤＥＡＦ－母性遺伝性聴覚消失またはアミノグリコシド誘発性聴覚消失；ＰＥＭ－進行性脳症；ＳＮＨＬ－感音性難聴；脳筋症；ミトコンドリア細胞症；拡張型心筋症；ＧＥＲ－消化管逆流；ＤＥＭＣＨＯ－認知症および舞踏病；ＡＭＤＦ－運動失調、ミオクローヌス；運動不耐容；ＥＳＯＣ てんかん、脳卒中、視神経萎縮症および認知低下；ＦＢＳＮ 家族性両側線条体壊死；ＦＳＧＳ 巣状分節性糸球体硬化症；ＬＩＭＭ 致死性乳児ミトコンドリアミオパチー；ＭＤＭ ミオパチーおよび真性糖尿病；ＭＥＰＲ ミオクローヌスてんかんおよび精神運動退行；ＭＥＲＭＥ ＭＥＲＲＦ／ＭＥＬＡＳ重複病；ＭＨＣＭ 母性遺伝性肥大型心筋症；ＭＩＣＭ 母性遺伝性心筋症；ＭＩＬＳ 母性遺伝性リー症候群；ミトコンドリア脳心筋症；多系統ミトコンドリア障害（ミオパチー、脳症、失明、難聴、末梢神経障害）；ＮＡＩＯＮ 非動脈炎性前部虚血性視神経症；ＮＩＤＤＭ 非インスリン依存性真性糖尿病；ＰＥＭ 進行性脳症；ＰＭＥ 進行性ミオクローヌスてんかん；ＲＴＴ レット症候群；ＳＩＤＳ 乳幼児突然死症候群；ＭＩＤＤ 母性遺伝性糖尿病および聴覚消失；ならびにＭＯＤＹ 若者の成人発症型糖尿病。

【0314】

核疾患（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ）：筋ジストロフィー、エリス－ファンクレフェルト症候群、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症、軟骨無形成症、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー－マリー－トゥース症候群、コケイン症候群、捻曲性骨異形成症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、エリス－ファンクレフェルト症候群、進行性骨化性線維異形成症、アルツハイマー病、アンジェルマン症候群、てんかん、本態性振戦、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ運動失調症、ハンチントン病、ニーマン－ピック病、パーキンソン病、プラダー－ウィリー症候群、レット症候群、脊髄小脳萎縮症、ウィリアムズ症候群、毛細血管拡張性運動失調症、貧血、鎌状赤血球、バーキットリンパ腫、ゴーシェ病、血友病、白血病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ポルフィリン症、サラセミア、クローン病、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏症、嚢胞性線維症、聴覚消失、ペンドレッド症候群、緑内障、脳回転状網膜脈絡膜萎縮、副腎皮質過形成症、副腎白質ジストロフィー、コケイン症候群、ＱＴ延長症候群、高ＩｇＭを伴う免疫不全症、アルポート症候群、エリス－ファンクレフェルト症候群、進行性骨化性線維異形成症、ワールデンブルグ症候群、ウェルナー症候群。

【0315】

感染性疾患：ウイルス－ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連症候群、水痘（水疱瘡）、風邪、サイトメガロウイルス感染症、コロラドダニ熱、デング熱、エボラ出血熱、流行性耳下腺炎、インフルエンザ、 手足口病、肝炎－単純ヘルペス、帯状疱疹、ＨＰＶ、インフルエンザ、ラッサ熱、麻疹、マールブルグ出血熱、伝染性単核球症、おたふく風邪、灰白髄炎、進行性多巣性白質脳症（Progressive multifocal leukencephalopathy）、狂犬病、風疹、ＳＡＲＳ、天然痘（痘瘡）、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎、ウイルス性肺炎、ウエストナイル病－黄熱病；細菌－炭疽病、細菌性髄膜炎、ブルセラ症、腺ペスト、カンピロバクター症、ネコひっかき病、コレラ、ジフテリア、発疹チフス、淋病、ハンセン病、レジオネラ症、ライ病、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病、類鼻疽、ＭＲＳＡ感染症、ノカルジア症、百日咳、肺炎球菌性肺炎、オウム病、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱またはＲＭＳＦ、サルモネラ症、猩紅熱、細菌性赤痢、梅毒、テタヌス、トラコーマ、結核、野兎病、腸チフス、チフス、百日咳；寄生生物－アフリカトリパノソーマ症、アメーバ症、回虫症、バベシア症、シャーガス病、肝吸虫症、クリプトスポリジウム症、嚢虫症、裂頭条虫症、メジナ虫症、エキノコックス症、腸蟯虫症、肝蛭症、肥大吸虫症、フィラリア症、自由生活性アメーバ感染症、ジアルジア症、顎口虫症、膜様条虫症、イソスポーラ症、カラアザール、リーシュマニア症、マラリア、横川吸虫症、ハエ幼虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症、蟯虫感染症、疥癬、住血吸虫症、テニア症、トキソカラ症、トキソプラズマ症、旋毛虫症（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌｏｓｉｓ）、旋毛虫症（Ｔｒｉｃｈｉｎｏｓｉｓ）、鞭虫症、トリパノソーマ症。

【0316】

がん：乳がんおよび卵巣がん、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、結腸がん、肺がん、悪性黒色腫、多発性内分泌腫瘍、神経線維腫症、ｐ５３ ＬｉｅＦｒａｕＭｅｎｉ、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、フォンヒッペル－リンダウ症候群、多発性嚢胞腎、結節硬化症。

【0317】

代謝障害：副腎白質ジストロフィー、アテローム性動脈硬化症、ベスト病、ゴーシェ病、グルコースガラクトース吸収不良症、脳回転状萎縮症、若年発症糖尿病、肥満、発作性夜間ヘモグロビン尿症、フェニルケトン尿症、レフサム病、タンジール病、テイ－サックス病、副腎白質ジストロフィー、２型糖尿病、ゴーシェ病、遺伝性ヘモクロマトーシス、レッシュ－ナイハン症候群、メープルシロップ尿症、メンケス症候群、ニーマン－ピック病、膵臓がん、プラダー－ウィリー症候群、ポルフィリン症、レフサム病、タンジール病、ウィルソン病、ツェルウェーガー症候群、早老症、ＳＣＩＤ。

【0318】

自己免疫障害：多腺性自己免疫症候群、ループス、Ｉ型糖尿病、強皮症、多発性硬化症、クローン病、慢性活動性肝炎、関節リウマチ、グレーブス病、重症筋無力症、筋炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、ぶどう膜炎、多発性筋炎、レイノー現象、および脱髄性神経障害、ならびにリウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病（Bechet's disease）、チャーグ－ストラウス症候群、および高安動脈炎などのまれな障害。

【0319】

炎症性障害：脱毛症、捻曲性骨異形成症、エリス－ファンクレフェルト症候群、喘息、関節炎、例えば、変形性関節症、関節リウマチ、および脊椎関節症。

【0320】

加齢関連障害：アルツハイマー病、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症、加齢黄斑変性症、加齢性骨粗鬆症。

【0321】

方法および組成物はまた、組織再生／再生医療、幹細胞移植、可逆的遺伝子改変の誘導、阻害性ＲＮＡの発現、認知増強、パフォーマンス増強、およびヒトまたは非ヒト動物に対する美容的変更において、加齢に関連する症状を処置、管理、または低減するために使用することができる。

【0322】

Ｄ．トランスジェニック非ヒト動物
組成物および方法はまた、トランスジェニック非ヒト動物を生成するために使用することができる。特に、接合体マイクロインジェクション、核移植、割球電気融合、および胚性幹（ＥＳ）細胞サイブリッドの胚盤胞注入は、トランスジェニック動物を作出するための実現可能な戦略をそれぞれ提供している。一実施形態では、胚性幹（ＥＳ）細胞を、トランスフェクトし、キメラマウスを生成する手段として哺乳類胚の胚盤胞に注入する。別の実施形態では、胚性幹（ＥＳ）細胞を、最初に調製し、それに続いて胚への胚盤胞注入を行う。特定の遺伝子および目的の改変を有する細胞の使用は、トランスフェクトされたＤＮＡの作出およびその結果の研究を可能にする。理論的に、この技法は、任意のポリヌクレオチドを生物全体に移入する見込みを提供する。例えば、方法および組成物は、特定の細胞型または細胞状態で送達されたポリヌクレオチドを持つマウスを作出するために使用することができる。

【0323】

単一細胞性または多細胞性の非ヒト生物、好ましくは、非ヒト哺乳動物、より好ましくは、マウスを、本開示の組成物を非ヒト生物に投与することによって、組成物でトランスフェクトすることができる。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、エピソームのままであり、宿主生物のゲノムに安定に組み込まれない。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、目的の遺伝子の発現を防止する。そのため、宿主の特定の細胞におけるポリヌクレオチドの発現は、宿主に投与されるポリヌクレオチドの量によって制御することができる。

【0324】

トランスフェクトされた非ヒト生物は、従来のトランスジェニック生物に対していくつかの利点を有する。例えば、本明細書のトランスフェクトされた生物は、有性生殖なしで、従来のトランスジェニック生物よりも短い時間で生成することができる。また、宿主における目的のポリヌクレオチドの発現は、宿主に投与される目的のポリヌクレオチドの量によって直接調節することができる。目的のポリヌクレオチドの投薬量で制御された発現は、トランスフェクトされた動物において観察される表現型および変化と相関し得る。加えて、誘導性発現および／または複製制御エレメントを、目的のポリヌクレオチドに含ませて、誘導性および投薬量依存性の発現および／または複製を提供することができる。好適な誘導性発現および／または複製制御エレメントは、当技術分野において公知である。さらにまた、特定の細胞型および状態における遺伝子および遺伝子改変の効果は、動物の細胞全体に影響を及ぼすことなく、研究することができる。

【0325】

Ｘ．キット
真核生物または原核生物のトランスフェクション、特に、特定の細胞型または細胞状態のトランスフェクションを実施するために必要なエレメントを供給するキットまたはパックも開示する。一実施形態によれば、ポリマー、および必要に応じてポリプレックスコーティング、例えば、標的特異的コーティングを含むキットを提供する。ポリマーは、ユーザーが選択したポリヌクレオチドと組み合わせて、宿主または宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる複合体を形成することができる。ポリプレックスを、コーティングとさらに混合して、細胞型または細胞状態特異的な指向性を提供することができる。

【0326】

キットの個々の構成要素は、各種の容器、例えば、バイアル、管、マイクロタイターウェルプレート、ボトルなどに包装することができる。例えば、陽性対照試料、陰性対照試料、緩衝液、細胞培養培地など、他の試薬は、別々の容器に含め、キットとともに提供することができる。好ましくは、キットは、使用のための指示も含むであろう。

【実施例】

【0327】

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによって、さらに理解されるであろう。

【0328】

解決される課題：タンパク質治療薬は、幅広い疾患に対する高度に有効な医療的処置として使用することができる（Harris et al., Pharmacol. Biochem. Behav. 150e151 48e56 (2016)、Jiang et al., J. Control Release 213 36e44 (2015)、Natarajan et al., Transl. Res. 188 10e26 (2017)、Efremenko et al., J. Control Release 247 175e181 (2017)、Jiang et al., Funct. Mater. 28 (6) 1703982 (2018)、Jiang et al., J. Control Release 231 38e49 (2016)）。しかしながら、この治療クラスの臨床使用は、それらの費用および全身投与後の不安定性によって制限されており、持続性の、効率的で、安全な送達を確実にするための新しいアプローチについての必要性を明らかにしている（Carter, Exp. Cell Res. 317 (9) 1261e1269 (2011)）。遺伝子治療は、低い投与頻度で持続的なタンパク質分泌の見込みに起因して魅力的である（Weissman, Expert Rev. Vaccines 14 (2) 265e281 (2015)）。

【0329】

ウイルスを利用するＤＮＡに基づく療法は、長期のタンパク質発現の可能性を提供するが、それらは、特に、挿入変異誘発のリスク、重度の免疫応答の誘導、およびタンパク質発現レベルの制御の困難さに関して、多くの安全性の懸念も生じる。ＤＮＡとは対照的に、ｍＲＮＡは、核に侵入することなくコードされたタンパク質の発現を誘発し、そのため、挿入変異誘発のリスクを低減しながら、非分裂細胞をトランスフェクトするのにより高い効率を実証している。ｍＲＮＡ療法は、その投薬がスケーラブルであり、処置がサイトゾルにおけるｍＲＮＡ安定性に一過性に関連するという追加の利点を有する。

【0330】

課題に対する解決手段：ポリマー材料のライブラリーを合成するための「トップダウン」アプローチを本明細書で提供する。ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）（ＰＡＣＥ）を、遺伝子送達のために使用した。ＰＡＣＥ：ｐＤＮＡポリプレックスは、最も効率的かつ最も毒性が低い非ウイルスベクターの１つである（Zhou et al., Nat. Mater. 11 (1) 82e90 (2012)）。ＰＡＣＥポリマーは、いくつかの重要な特徴を持つように設計された：（１）ポリマーの主鎖におけるエステル連結によって提供される生分解性；（２）高カチオン性ポリマーに関連する毒性を回避しながら、核酸との静電複合体化を可能にする低いカチオン電荷密度；および（３）ポリプレックスを安定化するラクトン基によって提供される疎水性。リパーゼ化学の耐性は、高い化学的多用途性を提供し、モノマー選択を介したポリマー構造のモジュレーションを可能にして、異なる材料のファミリーを容易に生じる。そのような多用途性は、ｍＲＮＡ送達のためのＰＡＣＥ技術を移行する見込みがある。

【0331】

さらなる改変を、肺系への薬剤の送達に有効であることが示されている化学および送達系に対して行った。

【0332】

（実施例１）
ＰＡＣＥポリマーはｍＲＮＡを送達することができる
材料および方法
材料
ｕ－ペンタデカラクトン（ＰＤＬ）、セバシン酸ジエチル（ＤＥＳ）、セバシン酸、Ｎ－メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）、クロロホルム、ジクロロメタン、ヘキサン、クロロホルム－ｄ、クロム（ＩＩＩ）アセチルアセトネート、エチレンジアミン、エタノールアミン、グリシン、および１，１０－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、受領したままで使用した。２－［（２－アミノエチル）（メチル）アミノ］エタノール（ＡＥＭＡＥ）は、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。アクリル樹脂に担持された固定化Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）（Ｎｏｖｏｚｙｍ ４３５）も、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、使用前に２．０ｍｍＨｇで、５０℃で２０時間、乾燥させた。ＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡトランスフェクションキットは、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。ルシフェラーゼをコードする改変Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡおよびエリスロポエチン（ＥＰＯ）をコードするマウスＥＰＯ ｍＲＮＡを、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ＨＥＫ２９３細胞、Ｄａｏｙ細胞、およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。

【0333】

ポリマー合成
ＰＡＣＥ合成を、異なる構造を有するポリマーを生成するためのいくつかの改変を含んで、Zhou et al., Nat. Mater. 11 (1) 82-90 (2012)によって記載されたようにして行った。簡潔には、（１）古典的または酸性のＰＡＣＥのいずれかを得るために、セバシン酸ジエチルまたはセバシン酸を重合のために使用し、（２）古典的ＰＡＣＥの疎水性を変えるために、異なるパーセンテージのＰＤＬ（１０％または２０％）を反応物に添加し、（３）１０％のＰＤＬを含有する古典的ＰＡＣＥの分子量（ＭＷ）を変えるために、第２段階の反応時間を、２ｋＤａ～２０ｋＤａのＭＷを有するポリマーを得るために、８～７２時間で変えた。

【0334】

結果
ＰＡＣＥは、ジエステル／二酸とアミノ置換ジオールおよびラクトンとの酵素共重合により形成されるターポリマーのファミリーである。ＰＡＣＥは、ｐＤＮＡ（Zhou et al., Nat. Mater. 11 (1) 82e90 (2012)）、マイクロＲＮＡ（Adams et al., Cancer Res. 76 (4) 927e939(2016)）、およびｓｉＲＮＡ（Cui et al., Nat. Commun. 8 (1) 191 (2017)）を効率的に送達することができる。しかしながら、ｍＲＮＡとこれらの他の核酸との間の構造的な相違を考えると（Kauffman et al., Nano Lett. 15 (11) 7300e7306 (2015)）、既存のＰＡＣＥ構造の改変および／または新しいＰＡＣＥバリアントの開発が、送達を改善する手段として考慮された。リパーゼ触媒の高い耐性は、特に疎水性およびＭＷの観点で、構造の多用途性を提供する。ＤＮＡの送達およびトランスフェクションのために最も効率的なＰＡＣＥ組成物の１つから開始して（古典的ＰＡＣＥ）、ｍＲＮＡの送達およびトランスフェクションを特異的に改善するために、さまざまなＭＷおよびラクトン含有量を有する異なるポリマーを合成した。

【化24】

【0335】

ＰＡＣＥ合成は、最終ポリマーにおける異なるパラメーターを変えるように改変した。セバシン酸ジエチル（Ｒ＝ＣＨ２ＣＨ３）またはセバシン酸（Ｒ＝Ｈ）を使用して、それぞれ、古典的（エステル／ＯＨ）末端または酸性（ＣＯＯＨ／ＯＨ）末端ＰＡＣＥを作製した。古典的ＰＡＣＥにより、合成の第２ステップの持続時間を８時間～７２時間で変えて、ＭＷを変えた。ＰＤＬ含有量（１０％または２０％）を変えて、ポリマーの疎水性を改変した。

【0336】

ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して、ポリマーのＭＷを決定した。すべてのＰＡＣＥポリマーは、ｍＲＮＡを複合体化し、中性または負の表面電荷を有するナノサイズのポリプレックスを形成することが可能であった。

【0337】

ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）アッセイを使用して評価した場合、すべてのポリマーは、５５～７６％の範囲の効率でｍＲＮＡを封入することが可能であった。ＨＥＫ－２９３細胞においてルシフェラーゼ（ＬＵＣ）を発現するｍＲＮＡをトランスフェクトする異なるＰＡＣＥポリマーの能力を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションの性能をスクリーニングした。異なる構造改変を表すこれらのＰＡＣＥポリマーはいずれも、陽性対照として使用された市販の薬剤であるＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）と同等のトランスフェクションレベルを提供しなかった（図１Ａ～１Ｃ）。しかしながら、ポリマーのＭＷによるトランスフェクションレベルの明確な傾向が観察された。ポリマーのＭＷが２０ｋＤａから５ｋＤａに減少するにつれて、２桁のトランスフェクション効率（それぞれ、１．１×１０^５ＲＬＵ／ｍｇおよび４．４×１０^７ＲＬＵ／ｍｇ）の増加が観察された。しかしながら、トランスフェクションのレベルが、遊離ｍＲＮＡで得られるレベルと同等の２ｋＤａのＭＷのＰＡＣＥを使用すると劇的に減少したので、この傾向は５ｋＤａでプラトーになるように見える。以前の研究は、ポリカチオンとポリアニオンとの間の静電的複合体化の強度および安定性が、ポリカチオンの長さとともに指数関数的に増加することを報告している（Akinc et al., Bioconj. Chem. 14 (5) 979e988 (2003)、Tsuchida & Osada, Makromol. Chem. 175 (2) 593e601 (1974)、Choosakoonkriang et al., J. Pharmaceut. Sci. 92 (8) 1710e1722 (2003)、Schaffer et al., Biotechnol. Bioeng. 67 (5) 598e606 (2000)）。

【0338】

これらの結果は、非常に短いポリマー（２ｋＤａ）が、おそらくｍＲＮＡの不十分な複合体化に起因して、トランスフェクションに非効率的であることを示す。２ｋＤａの閾値を上回ると、より短いポリマー（５ｋＤａ）は、おそらく細胞内部の高ＭＷのＰＡＣＥポリプレックスからのｍＲＮＡの非効率的な放出に起因して、より高いＭＷのポリマー（１０ｋＤａまたは２０ｋＤａ）よりもｍＲＮＡの送達においてより効率的である。高ＭＷのＰＡＣＥ鎖は、多数の正電荷および疎水性ドメインを含有し、これは、ｍＲＮＡとの熱力学的に安定な結合をもたらし、ポリプレックスからのその放出を防止する。結果は、効率的なｍＲＮＡ送達が、ポリマーのＭＷの精細なバランスに由来することを示し、ポリマー鎖の長さは、ｍＲＮＡの複合体化およびポリプレックスの安定化を確実にするために十分に長いが、細胞の内側でのｍＲＮＡの放出のために十分に短いことが必要である。他方で、１０ｋＤａのＰＡＣＥポリマーのＰＤＬ含有量を１０％から２０％に増加させることは、トランスフェクション効率に有意な影響を及ぼさず（図１Ｂ）、これは、ｐＤＮＡで観察されたものとは逆であり、ポリマー構造がそれぞれの遺伝子材料のモジュレーションから利益を得ることが確認された。

【0339】

これは、２ｋＤａ超～１０ｋＤａ未満、より好ましくは、３ｋＤａ～８ｋＤａの範囲、最も好ましくは、５ｋＤａの分子量を有するポリマーが最も効果的であろうことを示す。

【0340】

（実施例２）
ＰＡＣＥトランスフェクション効率はその末端基組成に高度に依存する
材料および方法
ポリマー末端基の改変
異なる末端基を有するＰＡＣＥを調製するために、親ポリマーを、セバシン酸ジエチルの代わりにセバシン酸を用いて合成し、これは、ヒドロキシルおよびカルボキシル末端基の混合物を有するＰＡＣＥを与えた。次いで、両方の末端基を、１：４０のモル比で、ＣＤＩにより、室温で終夜、乾燥ジクロロメタン中で撹拌することによって活性化した。混合物を、脱イオン水で３回洗浄し、それに続いて真空下でＤＣＭを蒸発させて、反応物であるＰＡＣＥ－ＣＤＩを得た（下記のスキームを参照されたい）。

【0341】

ＰＡＣＥ－ＣＤＩを、アミン含有分子と反応させて、新しい末端基を有するＰＡＣＥを得た。具体的には、グリシンおよびＡＥＭＡＥを使用して、それぞれ、ＰＡＣＥ－ＣＯＯＨおよびＰＡＣＥ－ＭＡＥを生成した。コンジュゲーションのために、５ｍＭのグリシンまたはＡＥＭＡＥを、ＤＭＳＯ中の０．５ｍＭのＰＡＣＥ－ＣＤＩと、一定の撹拌下、室温で４０時間反応させた。反応後、混合物を、１０倍体積の脱イオン水で洗浄し、ＤＣＭで抽出し、それに続いて真空下でＤＣＭを蒸発させて、ＰＡＣＥ－ＣＯＯＨおよびＰＡＣＥ－ＭＡＥを得た。このプロトコールを採用して、１０ｋＤａの酸性ＰＡＣＥを合成する場合、５ｋＤａのＰＡＣＥ－ＣＤＩおよびエチレンジアミンを、２：１の正確なモル比で添加した。

【化25】

【0342】

上記に示されるように、－ＣＯＯＨまたは－ＭＡＥ末端基を有するＰＡＣＥを得るために、ＣＤＩ活性化（１、２）による酸性ＰＡＣＥ、それに続いてアミン含有分子による求核置換（３、４；Ｒ＝グリシン、またはＡＥＭＡＥ）を行った。

【0343】

ポリマーの特徴付け
１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ５００分光計において記録した。逆ゲート化１３Ｃ ＮＭＲのために、試料を、クロロホルム－ｄ中の５０ｍｇ／ｍＬのポリマーで調製し、クロム（ＩＩＩ）アセチルアセトネート（Ｃｒ（ａｃａｃ）３）を、緩和剤として５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加した。シグナルを、１０秒のＴ１緩和時間を使用して記録した。ポリマーの分子量（ＭＷ）を、ｍｉｃｒｏＳＴＹＲＡＧＥＬカラム（混合ベッド；細孔サイズ１００Å～１０^６Å）を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。０．２ｗｔ％のトリエチルアミンを含有するクロロホルムを、１ｍＬ／分の流速で、溶離液として使用した。２ｍｇ／ｍＬの試料濃度および１００μＬの注入体積を使用した。ポリマーのＭＷを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）製の狭い多分散性ポリスチレン標準によって作成された従来の較正曲線に基づいて決定した。Ｅｍｐｏｗｅｒ ＩＩ ＧＰＣソフトウェアを使用して、ＧＰＣ機器を実行し、ＭＷ算出を行った。

【0344】

ポリプレックスの調製および特徴付け
明示されない限り、ポリマー：ｍＲＮＡポリプレックスを、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）中で１００：１のポリマー：ｍＲＮＡ重量比で調製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のために、１０μｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの溶液を調製した：１μＬのポリマー溶液（ＤＭＳＯ中に１００ｍｇ／ｍＬ）を、最初に５０μＬの酢酸ナトリウム緩衝液で希釈した。短時間のボルテックス後、ポリマー溶液を、５０ｍＬの酢酸ナトリウム緩衝液で希釈された１μｇのｍＲＮＡと混合し、再度ボルテックスした。ポリマー：ｍＲＮＡ混合物を、使用前に室温で１０分間インキュベートした。ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、酢酸ナトリウム緩衝液中の１００μｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの溶液を、同じ方法によって調製した。

【0345】

ポリプレックスの流体力学的直径を、２μｇ／ｍＬのｍＲＮＡの濃度でのＤＩ水へのポリプレックスの希釈後、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ－ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ゼータ電位を測定するために、同じ溶液を、使い捨てキャピラリーセルにロードし、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ－ＺＳにおいて分析した。

【0346】

ポリプレックスにおけるｍＲＮＡの封入効率（ＥＥ）を、製造業者の説明書に従って、Ｑｕａｎｔ－ＩＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号Ｒ１１４９１）を使用して測定した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎアッセイは、溶液中の遊離ｍＲＮＡの量を測定するので、この量を、ポリプレックスを形成するために添加された初期量に対して減算して、ポリプレックス内で複合体化したｍＲＮＡの量を得た。

【0347】

細胞培養
ＨＥＫ２９３細胞およびＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで追加補充された４．５ｇ／ＬのグルコースＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ 番号１１９６５）中、３７℃および５％のＣＯ_２で培養した。Ｄａｏｙ細胞を、１０％のＦＢＳおよび１％のｐｅｎ／ｓｔｒｅｐで追加補充された２ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１５００ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ 番号３０－２００３）中、３７℃および５％のＣＯ_２で培養した。

【0348】

ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション
Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションのために、細胞を、５００μＬの培地中、７５，０００個細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレートに播種し、接着を確実にするために終夜インキュベートした。培地を、４００μＬのトランスフェクション培地（１０％のＦＢＳを含有するが、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐなしの培養培地）に置き換え、１００μＬのポリプレックス（合計で１μｇのｍＲＮＡ）をそれぞれのウェルに添加した。遊離ｍＲＮＡ対照のために、１μｇのｍＲＮＡを、１００μＬの酢酸緩衝液に希釈し、ウェルに添加した。市販のｍＲＮＡトランスフェクションキットであるＴｒａｎｓＩＴを、対照として使用した。簡潔には、１μｇのｍＲＮＡを、１００μＬのＯＰＴＩＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ 番号１１０５８０２１）中の０．７μＬのブースト試薬および１．１μＬのＴｒａｎｓＩＴ試薬と混合した。トランスフェクションの２４時間後、ルシフェラーゼ発現を測定した。細胞を、２００μＬの１×溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｅ３９７Ａ）を使用して洗浄および溶解し、－８０℃で１回の凍結融解サイクルを行った。次いで、２０μＬの溶解物を、１００μＬのルシフェラーゼレポーター試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号Ｅ１４８３）と混合し、発光を、Ｇｌｏｍａｘルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）において読み取った。溶解物のタンパク質含有量を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、番号２３２２５）を使用して測定した。すべての実験は、二連の３つの独立した試験で実行した。

【0349】

結果
図２は、実施例２に示される方法によって合成された５ｋＤａまたは１０ｋＤａのいずれかのＭＷを有するＰＡＣＥ－ＣＯＯＨおよびＰＡＣＥ－ＭＡＥのトランスフェクション効率を示す棒グラフである。統計学的有意性は、スチューデントのｔ検定によって決定した（次の通り示す：＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。

【0350】

セバシン酸ジエチル、ＰＤＬ、およびＭＤＥＡの三元重合によって合成されたＰＡＣＥは、メチル（セバシン酸ジエチルから）およびヒドロキシル（ＭＤＥＡから）末端基の混合物を含有する。モノマーのセバシン酸ジエチルを、ＰＡＣＥ合成のためにセバシン酸によって置き換えて、酸性ＰＡＣＥを形成した場合、そのｍＲＮＡトランスフェクション効率は、２倍になった（図２）。同じポリマー上の異なる末端基は、ｐＤＮＡのトランスフェクション効率に劇的な影響を及ぼし得る（Sunshine et al., Biomacromolecules 12 (10) 3592e3600 (2011)、Sunshine et al., Mol. Pharm. 9 (11) 3375e3383 (2012)）。実験を、末端基組成がｍＲＮＡトランスフェクションにも影響を及ぼし得るか、より詳細には、ＰＡＣＥ上の改変末端基がｍＲＮＡ送達を改善し得るかを決定するために設計した。

【0351】

分子量が５ｋＤａ周辺のカルボキシルおよびヒドロキシル末端基の混合物を含有する酸性ＰＡＣＥを出発材料として使用した。これらの２つの末端基は両方とも、１，１０－カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）によって活性化され得、これは、グリシンまたはＡＥＭＡＥを含むアミン含有分子によってさらに置換されて、それぞれ、カルボキシル（ｅＣＯＯＨ）末端基（ＰＡＣＥ－ＣＯＯＨ）または（メチルアミノ）エタノール（－ＭＡＥ）末端基（ＰＡＣＥ－ＭＡＥ）を形成した。

【0352】

－ＣＯＯＨまたは－ＭＡＥ末端基を有するＰＡＣＥである酸性ＰＡＣＥを、ＣＤＩ活性化、それに続くアミン含有分子による求核置換（３、４；Ｒ＝グリシン、またはＡＥＭＡＥ）によって得た。

【0353】

これらの２つのモノマーは、より高いトランスフェクション効率を有する末端基を特定するために、酸性ＰＡＣＥにおいて見られる末端基の天然に存在するミックスを模倣するように選択した。反応機構は、ＮＭＲ分光法によって確認される通り、両方の末端基について、９０％超の変換率を保証した。

【0354】

次に、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡをトランスフェクトするこれらのポリマーの能力を評価した。図３Ａは、１０％のＰＤＬ含有量、分子量が２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、および２０ｋＤａの古典的ＰＡＣＥを使用したＭＷの効果（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図３Ｂは、１０ｋＤａの古典的ＰＡＣＥポリマーの１０または２０％のＰＤＬを使用したＰＤＬ含有量の効果（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図３Ｃは、１０％のＰＤＬ含有量で、ＭＷが５ｋＤａの酸性ＰＡＣＥおよび古典的ＰＡＣＥのトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。結果を、二連で実行された３つの独立した実験の平均±ＳＤとして表す。

【0355】

５ｋＤａのＰＡＣＥ－ＭＡＥポリマーが、同じＭＷのＰＡＣＥ－ＣＯＯＨよりも２桁高いトランスフェクション効率を実証したように、異なる末端基を有するＰＡＣＥ間でトランスフェクション効率に有意差が観察された（図３Ｃ）。ＰＡＣＥ－ＭＡＥは全ｍＲＮＡの９８％を封入し、ＰＡＣＥ－ＣＯＯＨは１８％しか封入できなかったので、この効果は、これら２つのポリマーのＥＥの相違によって説明することができる。５ｋＤａより高い分子量の酸性ＰＡＣＥは、技術的な課題（ポリマー鎖が長く成長するにつれて、水の副生成物を除去することの困難さ）に起因して、直接合成されなかったが、１０ｋＤａの酸性ＰＡＣＥは、５ｋＤａのポリマーのＣＤＩ活性化とそれに続くエチレンジアミン分子による２つのポリマー鎖の架橋によって得ることができる。１０ｋＤａの酸性ＰＡＣＥをカルボキシルまたはヒドロキシル末端基のいずれかで改変した場合、そのトランスフェクション効率は、その５ｋＤａの対応物と比較して有意に改善され（図３Ａ）、これは、ＰＡＣＥ－ＣＯＯＨおよびＰＡＣＥ－ＭＡＥポリマーについて、ＭＷが増加すると、トランスフェクション効率が増加することを意味する。

【0356】

この挙動は、ＭＷが増加するにつれて、トランスフェクション効率が減少する古典的ＰＡＣＥとは劇的に異なり、トランスフェクション効率における末端基の重要性をさらに実証する。ＰＡＣＥ－ＣＯＯＨのＥＥは、ＭＷが５ｋＤａから１０ｋＤａに増加した場合に１８％から４５％に増加したが、ＰＡＣＥ－ＭＡＥのＥＥは、実際にはあまり変化せず（５ｋＤａで９８％対１０ｋＤａで９５％）、ＥＥの増加がトランスフェクション効率の改善についての唯一の説明ではないことを示す。

【0357】

これらのデータは、ＰＡＣＥ末端基およびＭＷの寄与が、相加的よりも大きいことを示す。ＰＡＣＥ末端基の特質は、そのｍＲＮＡとの複合体化の能力に寄与すると思われ、ＭＷは、複合体化においても役割を果たし、エンドソームエスケープおよび／またはサイトゾルにおけるｍＲＮＡ放出などの下流の生物学的ステップに関与し得る。

【0358】

（実施例３）
ｍＲＮＡ送達のためのＰＡＣＥの「トップダウン」発動はＰＡＣＥポリマーを発動した
材料および方法
ポリマーの発動
異なる出発ＭＷを有するポリマー（２０～３０ｍｇ）を、ガラスバイアルの内面に均一に広げ、効率的な空気浸透を確実にする薄膜を形成した。次いで、バイアルを、異なる時間の長さにわたって湿った空気流への暴露を伴って、制御された温度（典型的には、３７℃）でインキュベートした。

【0359】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性
ＰＡＣＥポリマーおよびＴｒａｎｓＩＴの細胞毒性を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞を、１００μＬの培地中、１０，０００個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、終夜インキュベートして、接着を確実にした。ポリマー：ｍＲＮＡポリプレックスまたはＴｒａｎｓＩＴ／ｍＲＮＡ複合体を、トランスフェクション実験についてと同じｗ：ｗ比を使用して形成し、異なる濃度でトランスフェクション培地に希釈した。１００μＬのポリプレックス含有培地を、ウェルに添加して、０．０１～２０μｇ／ｍＬの範囲のｍＲＮＡの最終濃度を達成した。２４時間のインキュベーション後、細胞生存率を、ＭＴＴアッセイを使用して測定した。すべての実験は、二連の３つの独立した試験で実行した。

【0360】

ポリプレックスの凍結乾燥
ＰＡＣＥ：ｍＲＮＡポリプレックスを、酢酸ナトリウム緩衝液を使用して調製し、異なる濃度のトレハロース溶液（２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝５．８中に３０ｍｇ／ｍＬまたは６０ｍｇ／ｍＬ）を１：１の体積比でポリプレックス懸濁物に添加し、０、１５または３０ｍｇ／ｍＬの最終トレハロース濃度を得た。次いで、混合物を、液体窒素中で急速凍結し、２日間凍結乾燥した。凍結乾燥の最後に、ポリプレックスを、酢酸ナトリウム緩衝液に再懸濁させ、トランスフェクション効率を、ＨＥＫ２９３細胞において評価した。トランスフェクションおよび遺伝子発現の特徴付けを、上記に記載される方法を使用して行った。

【0361】

結果
ＰＡＣＥのライブラリーの「ボトムアップ」合成による最初のスクリーニングの後、ポリマーのＭＷおよび末端基の組成を、ｍＲＮＡに対するこの材料のトランスフェクション効率を決定する２つの重要なパラメーターとして特定した。ＭＷの効果は、５ｋＤａ～１０ｋＤａの狭い範囲内で、トランスフェクション効率に有意に影響を及ぼすと思われた。「トップダウン」アプローチは、高ＭＷポリマーの制御された加水分解によりＰＡＣＥのＭＷおよび末端基を同時に変えるように適合させた。これを行うことによって、より高いトランスフェクション効率を有するＰＡＣＥ末端基およびＭＷが、モジュレートされ、特定された。

【0362】

この方法は、発動ＰＡＣＥ（ａＰＡＣＥ）と呼ばれる新しい材料ファミリーを生成した。これらの生分解性ａＰＡＣＥポリマーは、ごくわずかな毒性で、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で高いトランスフェクションレベルを与えた。

【0363】

ａＰＡＣＥは、エステル骨格の制御された加水分解によって生成した。適度な温度下での空気への暴露は、ＰＡＣＥの加水分解のために温和な条件を提供し、このようにして、そのＭＷを減少させ、ヒドロキシルおよびカルボキシル末端基を露出させる。

【0364】

これを確認するために、ａＰＡＣＥを、ＮＭＲ分光法およびＧＰＣによって特徴付けた。ａＰＡＣＥのＮＭＲ分析は、古典的非発動ＰＡＣＥと比較して、ヒドロキシル基ピーク下面積の増加（ａＰＡＣＥおよび古典的ＰＡＣＥについて、それぞれ、５８．２および５８．９）、およびａＰＡＣＥにおいて１７８ｐｐｍに明確なカルボキシルのピーク出現が観察されたように、発動プロセスがヒドロキシルおよびカルボキシル末端基の露出をもたらしたことを実証した。ＧＰＣは、発動プロセスが、すべてのＰＡＣＥポリマーのＭＷを減少させたことを示した（図４）。

【0365】

ポリエステルの加水分解は周知である。これらの反応は、通常、高温、高圧、および／または触媒の存在下で進行し得る。発動が、３７℃と比較して１００℃で行われると加速され得ることが観察された。しかしながら、より再現性の高いプロセスのために提供されるより温和な温度を使用すると、ａＰＡＣＥの所望の分子量が得られた。

【0366】

ｍＲＮＡについてのＰＡＣＥトランスフェクション効率に対する発動プロトコールの効果を調べるために、異なる発動期間で異なる開始ＭＷから生成したａＰＡＣＥを試験した。ａＰＡＣＥおよびｍＲＮＡから生成した自己アセンブル化ポリプレックスは、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションに高度に有効であり、陽性対照のＴｒａｎｓＩＴと同等のルシフェラーゼ発現のレベルをもたらした（図５Ａ～５Ｂ）。トランスフェクション効率は、発動時間および発動ポリマーの初期ＭＷに依存し、それぞれの初期ＭＷに最適な発動時間があるように思われた（図５Ａ：５ｋＤａのポリマーについて５日、１０ｋＤａのポリマーについて１０日、および２０ｋＤａのポリマーについて３０日）。これらの改善された発動時間について、すべてのａＰＡＣＥポリマーは、ＴｒａｎｓＩＴと同等のレベルのトランスフェクションを提供し、それらの非発動対応物と比較して、有意に高いトランスフェクションレベルを提供した（図２、ｐ＜０．００５）。

【0367】

異なる濃度で細胞毒性について試験した場合、ＴｒａｎｓＩＴは、かなりの細胞死を誘導したが、類似する量の送達されるｍＲＮＡについて、すべてのａＰＡＣＥ製剤は細胞毒性ではなかった（図５Ｃ）。

【0368】

２０ｋＤａのポリマーを１００℃で６時間発動した加速発動プロセスは、２０ｋＤａのポリマーを３７℃で３０日間発動した場合と類似のトランスフェクションレベルをもたらした（図５Ｄ）。加速発動プロセスにもかかわらず、３７℃と比較して、１００℃で発動を行う場合、類似の動態プロファイルが観察された。両プロセスは、トランスフェクション効率が最適まで増加し、それに続いて活性の低下を呈した。この観察は、類似の時間依存性プロセスが、両方の温度で起こっていることを示す。

【0369】

これらのａＰＡＣＥのＭＷは、６ｋＤａ～８ｋＤａの範囲で互いに近かった。それらのトランスフェクション効率の相違を考慮すると、データは、ａＰＡＣＥのＭＷの狭い範囲内でトランスフェクション効率の迅速な変化を示し、スクリーニングのための「トップダウン」発動アプローチを使用する価値を強調する。送達ビヒクルは、異なる遺伝子材料の輸送のためにモジュレートされるべきであるので、制御された「トップダウン」発動プロセスは、それぞれの遺伝子材料についてのＭＷおよび末端基の組合せを最適化するための簡単で強力な方法を構成する。このプロセスの利点は、ＭＷのような重要な要因を微調整する精度、および同じ出発材料から発動段階でポリマーの別々のライブラリーを合成する単純さを含む。全体として、結果は、アプローチが、ｍＲＮＡ送達およびトランスフェクションに合わせたＭＷおよび末端基の最適な組合せを提供したことを確認した。

【0370】

ａＰＡＣＥの幅広い有効性を確実にするために、これらのポリマーは、ヒト髄芽腫細胞系であるＤａｏｙ細胞、およびヒト神経芽細胞腫細胞系であるＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞におけるトランスフェクションについても試験した。ＨＥＫ２９３細胞において観察されたように、発動プロセスは、両方の細胞系においてＰＡＣＥトランスフェクション効率を有意に増加させた。

【0371】

ａＰＡＣＥ：ｍＲＮＡポリプレックスに対する凍結乾燥の効果も試験した。トレハロースを凍結保護剤として使用し、トランスフェクション効率を、ポリプレックスの再構成後に、ＨＥＫ２９３細胞において評価した。ａＰＡＣＥを用いて調製された凍結乾燥ポリプレックスは、凍結保護剤がない場合でさえ、新鮮なポリプレックスと同じくらい効率的であったが、高濃度のトレハロース（６％）の添加は、トランスフェクション効率をわずか増加させた。

【0372】

（実施例４）
ａＰＡＣＥはｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ送達に有効である
材料および方法
ｉｎ ｖｉｖｏ研究
すべての動物の作業は、Ｙａｌｅ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＹＡＲＣ）およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従ってＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて完了した。雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｌｉｍａｎｔｉｃ、ＣＴ、ＵＳＡ）を実験のために使用した。

【0373】

ＰＡＣＥ：ｍＲＮＡポリプレックス（ｍＲＮＡにおいて０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｎ＝３）、ａＰＡＣＥ：ｍＲＮＡポリプレックス（ｍＲＮＡにおいて０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｎ＝３）、ＴｒａｎｓＩＴ：ｍＲＮＡ複合体（ｍＲＮＡにおいて０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｎ＝３）、酢酸ナトリウム緩衝液に希釈された遊離ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡにおいて０．１ｍｇ／ｍＬ、Ｎ＝３）または酢酸ナトリウム緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ５．８、Ｎ＝３）を、２００μＬの体積で、尾静脈を通して静脈内投与した。

【0374】

後眼窩採血（５０μＬ）を、粒子投与前、および注射の６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および７日後に行った。採血直後に、血漿を、遠心分離（３０００ｇ、１０分）によって分離し、さらなる分析まで－８０℃で凍結した。血漿中のＥＰＯ濃度を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。注射の２４時間後および７日後に、肝臓、腎臓、および脾臓を採取し、Ｈ＆Ｅ染色のために処理し、任意の異常な細胞形態について外部の病理学者によってスコア化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／）を、グラフ作成および統計分析のために使用した。統計学的有意性は、９５％の信頼水準で両側の独立スチューデントのｔ検定を使用して試験した。

【0375】

結果
治療的に関連するｍＲＮＡの送達についてａＰＡＣＥポリマーを評価するために、ＥＰＯ発現ｍＲＮＡを送達するそれらの能力を、マウスにおいて評価した。２つのａＰＡＣＥポリマー（５日間発動した５ｋＤａのＰＡＣＥおよび１０日間発動した１０ｋＤａのＰＡＣＥ）を、試験し、陽性対照のＴｒａｎｓＩＴ（これはｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡ送達のためのその証明された有効性のために選択した（Kariko et al., Mol. Ther. 20 (5) 948e953 (2012)）と比較した。３０日間発動した２０ｋＤａのＰＡＣＥは、形成されたポリプレックスが、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に必要な高濃度でのサイズの観点で十分に安定ではなかったので、試験しなかった。

【0376】

ＥＰＯ ｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックスを、野生型マウスに静脈内注射して、２０ｍｇのｍＲＮＡの総用量を送達し、血液を、注射後の異なる時点で採取して、ＥＬＩＳＡによってＥＰＯレベルを測定した。最適化されたａＰＡＣＥポリマーを使用したｍＲＮＡポリプレックスは、その後のＥＰＯ産生において反映されるように、ＥＰＯ ｍＲＮＡの送達における高い有効性を実証した。

【0377】

注射の６時間後、最良の非発動ポリマーであった５ｋＤａの非発動ＰＡＣＥは、陽性対照のＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）（１７０ｎｇ／ｍＬ）よりも高い高レベルのＥＰＯ（５３０ｎｇ／ｍＬ）を産生した。１０ｋＤａの非発動ＰＡＣＥは、６時間でより低いＥＰＯレベル（１４ｎｇ／ｍＬ）を産生し、ＭＷが５ｋＤａよりも大きいポリマーから形成されるポリプレックスがより低いトランスフェクション効率を提供するという非作動ポリマーについてｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された傾向を確認した。

【0378】

図５Ａは、それぞれのＭＷについて好ましい発動時間を実証する発動時間（日）に応じたルシフェラーゼｍＲＮＡトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す線グラフである（２０ｋＤａとして特定される線－０日で下側のデータポイント；１０ｋＤａとして特定される線 ０日で中央のデータポイント；５ｋＤａとして特定される線－０日で上側のデータポイント）。発動した５ｋＤａのＰＡＣＥは、非発動形態と比較して、ＥＰＯ産生を有意に増加させなかったが、３７℃、１０日間にわたる１０ｋＤａの発動は、ＥＰＯレベルを、１１００ｎｇ／ｍＬまで有意に増加させた（図５Ａ、ｐ＜０．０００１）。

【0379】

図５Ｂは、非発動ＰＡＣＥ、およびそれらの好ましい発動時間（５ｋＤａのポリマーについて５日、１０ｋＤａのポリマーについて１０日、および２０ｋＤａのポリマーについて３０日、＊＊ｐ＜０．００５）で異なる初期ＭＷの発動ＰＡＣＥを使用したトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）を示す棒グラフである。図５Ｃは、ｍＲＮＡ：ＴｒａｎｓＩＴ複合体（下側の線）と比較した、ｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックス（５ｋＤａ ５日、１０ｋＤａ １０日、２０ｋＤａ ３０日（上側の線のクラスター））の細胞毒性プロファイル（細胞生存率（％））を示す線グラフである。血液化学および組織学分析は、ａＰＡＣＥが投与の２４時間後または７日後、全身毒性を誘発しなかったことを実証した。図５Ｄは、異なる発動の温度を使用したａＰＡＣＥのトランスフェクション効率（タンパク質１ｍｇあたりの平均ＬＵＣ）の棒グラフである（＊＊ｐ＜０．００５）。

【0380】

図６Ａは、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）、５ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、５日間発動した５ｋＤａのａＰＡＣＥ、１０ｋＤａの非発動ＰＡＣＥ、または１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥを使用したｍＲＮＡ（合計で２０ｍｇ）のＩＶ投与６時間後のＥＰＯ血中濃度を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図６Ｂは、ビヒクル（下側の線）、ＴｒａｎｓＩＴ（中央の線）、１０日間発動した１０ｋＤａのａＰＡＣＥ（上側の線）を使用したｍＲＮＡ（合計２０ｍｇ）のＩＶ投与後のＥＰＯ産生の時間経過を示す線グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＤとして提示する（＊＊＊ｐ＜０．００１および＊ｐ＜０．０５）。図６Ｃ～６Ｆは、酢酸緩衝液、遊離ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ：ａＰＡＣＥポリプレックスのＩＶ投与２４時間後および７日後の血液化学（ＡＳＴ（図６Ｃ）、ＡＬＴ（図６Ｄ）、尿素（図６Ｅ）、クレアチニン（図６Ｆ））分析を示す棒グラフである。結果を、Ｎ＝３頭の動物の平均±ＳＥＭとして提示する。

【0381】

ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）およびａＰＡＣＥポリプレックスの両方について、ＥＰＯ産生は、注射の６時間後にピークに達した。酢酸緩衝液（ビヒクル）の注射とそれに続く出血の反復は、経時的にＥＰＯ血中レベルのわずかな増加を誘発したが、１０ｋＤａの発動ＰＡＣＥポリプレックスの投与後のＥＰＯのレベルは、最大で４８時間にわたって、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）の投与後に得られたレベルと比較して有意に高かった（６時間でｐ＜０．００１、ならびに２４時間および４８時間でｐ＜０．０５）。

【0382】

最良のａＰＡＣＥポリマー（１０日間発動した１０ｋＤａ）を使用すると、有意なＥＰＯ産生が、遊離ＥＰＯの血中半減期（約２時間）よりも有意に長い最大で４８時間にわたって得られた。

【0383】

これらの結果は、ＰＡＣＥの末端基およびＭＷが、そのｍＲＮＡトランスフェクションに影響を及ぼすことを実証する。発動ポリマーにおけるＭＷおよび末端基の組合せは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの効率的なｍＲＮＡ複合体化およびトランスフェクションを可能にする一方で、ＰＡＣＥの低いカチオン密度は、低い毒性プロファイルを保証した。

【0384】

（実施例５）
ＰＡＣＥ末端基はポリプレックスに対するメッセンジャーＲＮＡ負荷に影響を及ぼす
材料および方法
末端基改変ＰＡＣＥポリマーおよびポリプレックスの合成
カチオン性ジオール、セバシン酸ジエチル、およびラクトンから作製されたＰＡＣＥ骨格は、ヒドロキシルおよびメチル末端基の混合物を有する（Zhou, et al., Nature Materials, 11:82-90 (2012). [PMCID: PMC4180913]）。

【0385】

異なる末端基を有するＰＡＣＥを改変するために、親ポリマーを、セバシン酸ジエチルの代わりにセバシン酸を用いて合成し、これは、ヒドロキシルおよびカルボキシル末端基の混合物を有するＰＡＣＥを与えた。２つの末端基を両方とも、１：４０のモル比で、カルボジイミダゾール（ＣＤＩ）により、室温で終夜、乾燥ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で撹拌することによって活性化した。混合物を、脱イオン水で３回洗浄し、それに続いて真空下でＤＣＭを蒸発させて、反応物であるＰＡＣＥ－ＣＤＩを得た：下記および実施例１～４に示されるように、ＣＤＩ活性化（１、２）、それに続くアミン含有分子による求核置換（３、４）。

【化26】

【0386】

コンジュゲーションのために、５ｍＭのアミン含有分子を、ＤＭＳＯ中の０．５ｍＭのＰＡＣＥ－ＣＤＩと、一定の撹拌下、室温で４０時間反応させた。反応後、混合物を、１０倍体積の脱イオン水で洗浄し、ＤＣＭで抽出し、それに続いて真空下でＤＣＭを蒸発させて、新たな末端基を有するＰＡＣＥを得た。

【0387】

末端基の化学構造を下記に示す。

【化27-1】

【化27-2】

【0388】

Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ｍＲＮＡ負荷アッセイ
Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎは、メッセンジャーＲＮＡとの結合後に蛍光を発する小さな色素である。ＰＡＣＥとの複合体化の後、メッセンジャーＲＮＡは、色素にアクセス不能になり、より低い蛍光シグナルが観察されるであろう。ｍＲＮＡ、ポリプレックス、およびｒｉｂｏｇｒｅｅｎを混合し、蛍光をモニタリングした。

【0389】

Ｃｙ５ ｍＲＮＡ／ポリプレックス取り込みアッセイ
ｄｄＲＬｕｃ－Ｆｃタンパク質およびＦＬｕｃをコードするｍＲＮＡを、最初に、ＰＡＣＥポリマーによって共封入（coencapsulate）し、次いで、プロテアソーム阻害剤であるエポキソミシン（epoxomycin）の存在下、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に７時間供給した。次いで、細胞を、デュアルルシフェラーゼアッセイによってチェックして、ＲＬｕｃ活性を明らかにした（ｎ＝４）。データを、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）（１に設定）に対して正規化した。

【0390】

Ｃｙ５標識ｍＲＮＡは、異なる末端基を有するＰＡＣＥとポリプレックスを形成し、これを、ＨＥＫ２９３細胞に供給した。細胞を、蛍光についてモニタリングした。

【0391】

エンドソームエスケープアッセイ
異なる末端基を有するＰＡＣＥを使用して、ｆＬｕｃ ｍＲＮＡを用いて調製したポリプレックスのエンドソームエスケープを、ｄｄＲＬｕｃシステムで定量化した。

【0392】

結果
ＰＡＣＥ末端基は、ポリプレックスに対するメッセンジャーＲＮＡ負荷に影響を及ぼす。ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイの結果を、図７に示し、これは、対応するゲル遅延度アッセイと非常に一致する。

【0393】

ＰＡＣＥ末端基は、ポリプレックスの細胞取り込みに影響を及ぼす。細胞取り込みアッセイの結果を、図８Ａ～８Ｄに示す。図８Ａは、図８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄにおける結果を生成するために起こっていることの概略図を示し、ｍＲＮＡ封入、取り込みおよびエンドソームエスケープの効率、ならびにトランスフェクション効率を示す。ｍＲＮＡ封入の効率は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイ（ｎ＝４）によって定量化した。Ｃｙ５標識ｍＲＮＡを封入したポリマーを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に供給し、それに続いてＦＡＣＳを行って、取り込みレベルを定量化した（ｎ＝３）（図８Ｂ）。統計的差を、ｍＲＮＡ基を有するそれぞれのポリマー間の独立スチューデントのｔ検定で分析した。＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示し、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示し、ｎ．ｓ．は有意差なしを示す。

【0394】

異なる末端基を有するＰＡＣＥは、細胞によって取り込まれる異なる能力を実証した。ＰＡＣＥ末端基は、ｍＲＮＡのエンドソームエスケープに影響を及ぼす。ｆＬｕｃ ｍＲＮＡおよび異なる末端基を有するＰＡＣＥを使用したエンドソームエスケープアッセイの結果を図８Ｃに示す。

【0395】

ＰＡＣＥ末端基化学は、ポリマー性送達システムのトランスフェクション効率に影響を及ぼす。ＰＡＣＥのトランスフェクション効率を、ＨＥＫ２９３細胞によって生成されたｆｌｕｃ活性によって測定した。結果を図８Ｄに示す。

【0396】

図９Ａ～９Ｃは、トランスフェクション効率（ｆｌｕｃ活性として表される）、ならびにｍＲＮＡ負荷（図９Ａ）、取り込み（図９Ｂ）、およびエンドソームエスケープ（図９Ｃ）を含むトランスフェクションの異なるステップの線形相関を示す。生物学的ステップがタンパク質産生に近づくにつれて、線形相関のＲ２値が高くなり、より良好な予測力（predicting power）を示す。

【0397】

（実施例６）
ｍＲＮＡ送達のためのポリマーのライブラリーのエンドソームエスケープの定量化
材料および方法
ポリマー合成
ＰＡＣＥ合成を、異なる末端基を有するＰＡＣＥポリマーを生成するためのいくつかの改変を含んで、上記に記載されるようにして行った。親ポリマーを、セバシン酸を用いて合成し、これは、ヒドロキシルおよびカルボキシル末端基の混合物を有するＰＡＣＥを与えた。２つの末端基を両方とも、１：４０のモル比で、ＣＤＩにより、室温で終夜、乾燥ジクロロメタン中で撹拌することによって活性化した。混合物を、脱イオン水で３回洗浄し、それに続いて真空下でＤＣＭを蒸発させて、反応物であるＰＡＣＥ－ＣＤＩを得た。

【0398】

次いで、ＰＡＣＥ－ＣＤＩを、アミン含有化合物（表１）と反応させて、新しい末端基を有するＰＡＣＥを得た。コンジュゲーションのために、５ｍＭのそれぞれの化合物を、ＤＭＳＯ中の０．５ｍＭのＰＡＣＥ－ＣＤＩと、一定の撹拌下、室温で４０時間反応させた。反応後、混合物を、１０倍体積の脱イオン水で洗浄し、ＤＣＭで抽出し、それに続いて真空下でＤＣＭを蒸発させて、Ｐ１～Ｐ３１として記述される新たなポリマー（表１）を得た。

【0399】

ポリマーの特徴付け
^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＤ２ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ分光計において記録した。シグナルを、１０秒のＴ_１緩和時間を使用して記録した。ポリマーの分子量（ＭＷ）を、ｍｉｃｒｏＳＴＹＲＡＧＥＬカラム（混合ベッド；細孔サイズ１００Å～１０６Å）を備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステムを使用して、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。０．２ｗｔ％のトリエチルアミンを含有するクロロホルムを、１ｍＬ／分の流速で、溶離液として使用した。２ｍｇ／ｍＬの試料濃度および１００μＬの注入体積を使用した。ポリマーのＭＷを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）製の狭い多分散性ポリスチレン標準によって作成された従来の較正曲線に基づいて決定した。Ｅｍｐｏｗｅｒ ＩＩ ＧＰＣソフトウェアを使用して、ＧＰＣ機器を実行し、ＭＷ算出を行った。

【0400】

ＰＡＣＥ末端基改変の反応を、ＮＭＲスペクトルを使用してモニタリングした。ＰＡＣＥの特徴的なピークは、１～４．５ｐｐｍの領域に分布していた。ＭＤＥＡモノマーが末端基であった場合、その末端側の水素は、それぞれ、４．２（ｇ）から３．６（ｇ’）ｐｐｍ、および２．７（ｅ）から２．６（ｅ’）ｐｐｍにシフトした。ＣＤＩ活性化は、２つの異なるＰＡＣＥ－ＣＤＩコンジュゲーションの形成に起因して、７～８．５ｐｐｍ領域に分割ピークの形成をもたらした（図Ｓ２）。ＭＤＥＡモノマーの末端側の水素は、それぞれ、３．６（ｇ’）から４．４（ｇ’’）ｐｐｍ、および２．６（ｅ’）から２．８（ｅ’’）ｐｐｍにシフトし、セバシン酸モノマーの末端側の水素は、それぞれ、２．３（ｃ）から２．４（ｃ’’）ｐｐｍ、および１．５（ｂ）から１．７（ｂ’’）ｐｐｍにシフトした。次いで、３１個の小分子のコンジュゲーション反応は、７～８．５ｐｐｍ領域の分割ピークの消失、ならびにｇ’’、ｅ’’、ｃ’’、およびｂ’’ピークの移動によって、確認された。

【表1-1】

【表1-2】

【0401】

ポリプレックスの調製および特徴付け
明示されない限り、ポリマー：ｍＲＮＡポリプレックスを、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．８）中で１００：１のポリマー：ｍＲＮＡ重量比で調製した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のために、１０μｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの溶液を調製した：１μＬのポリマー溶液（ＤＭＳＯ中に１００ｍｇ／ｍＬ）を、最初に５０μＬの酢酸ナトリウム緩衝液に希釈した。短時間のボルテックス後、ポリマー溶液を、５０μＬの酢酸ナトリウム緩衝液に希釈された１μｇのｍＲＮＡと混合し、再度ボルテックスした。ポリマー：ｍＲＮＡ混合物を、使用前に室温で１０分間インキュベートした。ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、酢酸ナトリウム緩衝液中の１００μｇ ｍＲＮＡ／ｍＬの溶液を、同じ方法によって調製した。

【0402】

ポリプレックスの流体力学的直径を、２μｇ／ｍＬのｍＲＮＡの濃度での脱イオン水へのポリプレックスの希釈後、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ－ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。ゼータ電位を測定するために、同じ溶液を、使い捨てキャピラリーセルにロードし、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏ－ＺＳにおいて分析した。

【0403】

透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
２μＬのナノ粒子を、ＴＥＭグリッド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＣＦ４００－Ｃｕ－ＴＨ）に適用した。１分後、液体を、注意深く除去した。次いで、１滴の染色溶液（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、ＮＡＮＯ－Ｗ）をグリッドの頂部に添加した。１分後、液体を除去した。グリッドを風乾した。画像を、ＴＥＭ（ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｏｓｉｒｉｓ ２００ｋＶ ＴＥＭ）を使用して撮影した。

【0404】

細胞培養
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１４５２７）を、マイクロプレートシェーカー（ＶＷＲ、カタログ番号８９０３２－０９２）で一定に振とうしながら、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ１４３５１０２）中、３７℃および８％のＣＯ_２で維持した。

【0405】

ｄｄＲＬｕｃ－Ｆｃ精製
ｄｄＲＬｕｃ－Ｆｃをコードするプラスミドを、直鎖状ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ、カタログ番号２３９６６）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの６０時間後、細胞を回収し、ｄｄＲＬｕｃ－Ｆｃを、細胞溶解物から精製した。細胞を、０．５～１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００（ＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏ、カタログ番号ＡＢ０２０２５）およびＥＤＴＡ不含プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１８７３５８０００１）で追加補充されたＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に、４℃で１時間溶解した。次いで、細胞溶解物を、Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００Ｋ超遠心機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）において、１１０，０００×ｇ、４℃で１時間遠心分離し、それに続く０．２２μｍフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＧＰＴ０１ＲＥ）を通した濾過によって清澄化した。プロテインＡ－ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－０７８０－０１）を、濾過した細胞溶解物に添加し、タンパク質結合のために、回転しながら４℃で３時間インキュベートした。ビーズを、ＴＢＳ中で洗浄し、タンパク質を、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３．３）で溶出した。次いで、溶出液を、中和し、濃縮し、ＰＢＳに緩衝液交換した。

【0406】

ＰＡＣＥポリマーによるＦＬｕｃ ｍＲＮＡおよびｄｄＲＬｕｃ－Ｆｃの共封入
アガロースゲル遅延度アッセイを行って、ＦＬｕｃをコードするｍＲＮＡおよびｄｄＲＬｕｃ－Ｆｃプローブの共封入効率をチェックした。遊離ｍＲＮＡおよびタンパク質は、封入されたものをローディングウェルに保持しながら、ゲルに移動することが可能であった。

【0407】

水平アガロースゲル電気泳動
５μｇのｄｄＲＬｕｃ－ＦｃおよびＦＬｕｃをコードする１μｇのｍＲＮＡを、１８μＬの総体積中で１００μｇのポリマーと一緒に混合し、室温で１０分間インキュベートした。２μＬの１０×ＤＮＡローディング緩衝液をポリプレックスに添加し、それに続いて１％のアガロースゲルにローディングした。ｍＲＮＡの移動を、ＵＶ光を使用して検出し、タンパク質の移動を、クーマシーブルー染色（Ｂｉｏ－ｒａｄ、カタログ番号１６１－０７８６）によって検出した。

【0408】

ルシフェラーゼアッセイ
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、最初に、２００ｎＭのエポキソミシン（ＡｐｅｘＢｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ａ２６０６）中、３７℃で３０分間処理し、次いで、遊離ｍＲＮＡ（陰性対照）、ＴＲＡＮＳＩＴ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ、カタログ番号ＭＩＲ２２５０、陽性対照）、またはｄｄＲＬｕｃ－ＦｃおよびＦＬｕｃ ｍＲＮＡを共封入したポリマーを含有する９６－Ｖ底プレートに、ウェルあたり２００，０００個細胞で添加した。トランスフェクションの７時間後、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、２０μＭのｚ－ＶＡＤ（ＯＭｅ）－ＦＭＫ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２０４８７）で追加補充された５０μＬの受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１９１０）に、室温で２０分間溶解した。溶解物を、Ｃｅｎｔｒｏ ＸＳ^３ ＬＢ ９６０高感度マイクロプレートルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、カタログ番号４６９７０）によってアッセイした。ＲＬｕｃ発光を、ｎａｔｉｖｅ－Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｉｎｚｅ（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号３０３）を使用して１秒間測定し、ＦＬｕｃ発光を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１５０１）を使用して３秒間測定した。すべての独立した実験は、三連で実行した。

【0409】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳（ＩＶＴ）
ｍＲＮＡが負荷されたポリプレックスのＩＶＴを、製造業者の説明書に従って、ウサギ網状赤血球ライセートシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｌ４９６０）を使用して行った。ＦＬｕｃをコードする１μｇのｍＲＮＡで負荷されたポリプレックスを、５０μＬの溶解物混合物中、３７℃で７５分間インキュベートした。２μＬの試料を、１５分ごとに反応混合物から採取し、直ちにドライアイス上で凍結した。試料収集後、すべての試料におけるＦＬｕｃ活性を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１５０１）を使用して測定した。特定のポリプレックスに対するＩＶＴの速度を、ＦＬｕｃ活性および試料採取の時間の間の線形回帰の傾きとして評価した。

【0410】

封入効率の測定
ポリプレックスにおけるｍＲＮＡの封入効率を、製造業者の説明書に従って、Ｑｕａｎｔ－ＩＴ ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、番号Ｒ１１４９１）を使用して測定した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）アッセイは、溶液中の遊離ｍＲＮＡの量を測定するので、この量を、ポリプレックスを形成するために添加された初期量に対して減算して、ポリプレックス内で複合体化したｍＲＮＡの量を得た。

【0411】

蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、５，０００個細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレートに播種した。１２時間後、Ｃｙ５ ｍＲＮＡを封入しているナノ粒子を、それぞれのウェルに添加した。１時間後、細胞を、ＦＡＣＳ解析（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）のために収集した。

【0412】

結果
結果を図１０Ａ～１０Ｂに示す。すべてのポリプレックスのＩＶＴ速度を、１時間あたりのＦＬｕｃ活性の生成によって測定した。ＦＬｕｃ ｍＲＮＡトランスフェクション結果およびＩＶＴ速度、ならびにＩＶＴ速度および封入効率の間の単純な線形回帰を、定量化および正規化されたデータを使用して行った。それぞれのデータポイントは、固有の末端基を持つＰＡＣＥポリマーを表す。直線は最良のフィットを表す。Ｒ^２値にラベル付けする。

【0413】

ポリマー末端基の効果および投与の経路
ｍＲＮＡポリプレックスのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳速度は、トランスフェクション効率と相関しない。図１０Ａおよび１０Ｂは、ｍＲＮＡポリプレックスのｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳速度が、トランスフェクション効率と相関しないことを実証するグラフである。すべてのポリプレックスのＩＶＴ速度を、１時間あたりのＦＬｕｃ活性の生成によって測定した。（図１０Ａ）ＦＬｕｃ ｍＲＮＡトランスフェクション結果およびＩＶＴ速度、ならびに（図１０Ｂ）ＩＶＴ速度および封入効率の間の単純な線形回帰を、定量化および正規化されたデータを使用して行った。それぞれのデータポイントは、固有の末端基を持つＰＡＣＥポリマーを表す。直線は最良のフィットを表す。Ｒ^２値にラベル付けする。

【0414】

（実施例７）
ＰＡＣＥ－ＰＥＧブレンドポリプレックスの調製およびＰＡＣＳ－ポリプレックス製剤の肺送達
ｍＲＮＡに基づくワクチンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などの新興ウイルス株に容易に適応できる有望な戦略であるが、より多くの研究が、最適なｍＲＮＡワクチン製剤を開発するための送達戦略に対して必要である。異なる末端基を有するカチオン性ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはＰＡＣＥのライブラリーは、それが効率的で安全なｍＲＮＡ送達ビヒクルであることを実証している。

【0415】

ＣＯＶＩＤ－１９などの疾患および生じる肺疾患による最近の事象は、肺送達のための改善された製剤が重要であることを明らかにした。以下は、ＰＡＣＥポリプレックスを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングして、肺へのｍＲＮＡの吸入送達のための有望な製剤を特定した研究である。この研究は、ｍＲＮＡトランスフェクション効率に対するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の効果、およびナノ粒子の安定化におけるその役割を調べた。追加の研究は、ポリプレックスの肺送達後の肺における高レベルのトランスフェクションを実証した。

【0416】

材料および方法
前述の実施例および表１に記載されるように、異なる末端基を有するＰＡＣＥポリマーのライブラリーを、Ａ４５９ヒト肺細胞におけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡのサイズ、安定性、およびトランスフェクション効率についてスクリーニングした。製剤を最適化するために、ポリプレックスを、４．８～６のｐＨの範囲の緩衝溶液中で調製し、小体積のＰＥＧコンジュゲート化ＰＡＣＥ（ＰＡＣＥ－ＰＥＧ）を組み込んで、ポリプレックスの安定性を改善した。

【0417】

ポリマー合成
ＰＡＣＥポリマーを、上記に記載されるようにして合成した。

【0418】

ポリプレックス製剤
すべてのＰＡＣＥポリプレックスを、１：１００ ＰＡＣＥ対ｍＲＮＡの重量比で形成した。ポリマーを、振とうしながら、３７℃で終夜、ＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。ポリプレックスを形成するために、ｍＲＮＡを、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８～６．０）に、２０～２００μｇ／ｍＬの濃度に希釈した。別の管において、溶解したＰＡＣＥを、２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．８～６．０）に、２～２０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、１５秒間ボルテックスした。次いで、希釈したｍＲＮＡおよび希釈したＰＡＣＥを合わせ、２５秒間ボルテックスした。溶液を、使用前に室温で１０分間放置して、ポリプレックスを形成させた。ポリプレックスのサイズおよびゼータ電位を、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｐｒｏ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）によって特徴付けた。

【0419】

ＰＡＣＥ－ＰＥＧブレンドポリプレックスを製剤化するために、ＰＡＣＥ－ＰＥＧおよびＰＡＣＥを、１００ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに別々に溶解した。溶解したＰＡＣＥ－ＰＥＧを、溶解したＰＡＣＥに希釈して（必要により、中間希釈物を用いて）、所望のＰＡＣＥ－ＰＥＧ濃度のブレンドポリマー溶液を作出した。次いで、ポリプレックスを、上記に記載されるようにして調製した。

【0420】

ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（ＰＥＧ２ｋ、Ｎａｎｏ ＯＣＳ）でコーティングされたポリプレックスを、ＤＳＰＥ－ＰＥＧをＤＭＳＯに溶解する（１０ｍｇ／ｍＬ）ことによって形成した。次いで、溶解したＤＳＰＥ－ＰＥＧを、ＤＭＳＯ中のＰＡＣＥ（１００ｍｇ／ｍＬ）と１：１０の体積比で合わせた。ＤＭＳＯ中の中間ＤＳＰＥ－ＰＥＧ希釈を、ＤＳＰＥ－ＰＥＧのＰＡＣＥに対する所望の最終比を達成するために、必要により行った。次いで、ポリプレックスを、上記に記載されるようにして、ＤＭＳＯ中のＤＳＰＥ－ＰＥＧ／ＰＡＣＥブレンドをＤＭＳＯ中のＰＡＣＥの代わりに用いることによって、形成した。

【0421】

ポリプレックス安定性研究
ポリプレックスの安定性を評価するために、ポリプレックスを、上記に記載されるようにして、酢酸ナトリウム緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬの最終濃度に製剤化した。２０μＬのポリプレックス溶液を、１ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とともに管に添加し、次いで、試料を、振とうインキュベーター（３００ｒｐｍ、３７℃）に入れ、ＤＬＳによるサイジングのためにさまざまな時点で取り出した。Jiang Y, Lu Q, Wang Y, et al. Quantitating Endosomal Escape of a Library of Polymers for mRNA Delivery. Nano Lett. 2020;20(2):1117-1123. doi:10.1021/acs.nanolett.9b04426

【0422】

ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング
Ａ５４９ヒト肺細胞系（ＡＴＣＣ）を、すべてのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング実験のために使用した。細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで強化されたＤＭＥＭ：Ｆ１２（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の１：１溶液中で成長させ、５％ＣＯ_２下、３７℃のインキュベーターに保管した。ポリプレックス送達の２４時間前に、細胞を、２４ウェルプレートに、ウェルあたり５０，０００個細胞で播種した。ポリプレックス送達の直前に、細胞培地をリフレッシュし、細胞を、ＰＡＣＥポリプレックスを使用して、０．５μｇのＥＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した。処理の２４時間後、細胞を、ＰＢＳですすぎ、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１５分間解離させ、次いで、９６ウェル丸底プレートに移した。細胞を、ＰＢＳ中の２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１回洗浄し、次いで、製造業者の説明書に従ってＺｏｍｂｉｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ ＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。染色後、細胞を、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡでもう一回洗浄し、次いで、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）によって解析した。結果を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．６．２において解析した。

【0423】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ
すべての動物の作業は、Ｙａｌｅ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒ（ＹＡＲＣ）およびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイドラインに従ってＹａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにおいて完了した。雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｗｉｌｌｉｍａｎｔｉｃ、ＣＴ、ＵＳＡ）を実験のために使用した。酢酸ナトリウム緩衝液に希釈されたＰＡＣＥ：ｍＲＮＡポリプレックス（０．１ｍｇ／ｍＬ ｍＲＮＡ、Ｎ＝３）を、２００μＬの体積により、静脈内または腹腔内に投与した。ｉｎ ｖｉｖｏ生物発光（光子／秒／ｃｍ^２／ｓｒ）を、注射６時間後にＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によって検出および定量化した。

【0424】

吸入送達
ｉｎ ｖｉｖｏ実験を、１０～３０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＥＧＦＰ ｍＲＮＡ送達）およびＢＡＬＢ／ｃマウス（ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ送達）において行った。ポリプレックス溶液（１０ｍｇ／ｍＬポリマー）を、投与直前に調製した。吸入送達のために、マウスを、イソフルランで麻酔し、門歯によって吊るした。舌を、ピンセットで引っ込ませ、ＰＡＣＥポリプレックス中の５μｇのｍＲＮＡを口の奥に投与した。舌を、ポリプレックスが吸入されている１０呼吸の間、引っ込ませた位置で保持した。

【0425】

フローサイトメトリーによるＥＧＦＰ発現の解析のために、マウスを、２４時間後に安楽死させた。肺を、１０ｍＬのＰＢＳ、次いで、１ｍＬのディスパーゼ（５０Ｕ／ｍＬ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で灌流した。次いで、気管を、鈍らな先端の針で挿管し、肺を、１ｍＬのディスパーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）で膨張させ、縫合糸により気管に沿ってしばった。肺を取り出し、さらなる処理まで、氷冷ＰＢＳ中に入れた。フローサイトメトリー用の単一細胞懸濁物を調製するために、肺組織を、ハサミで２～３ｍｍの小片に刻み、ＰＢＳ中の５ｍＬのＤＮａｓｅ １（１ｍｇ／ｍＬ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびコラゲナーゼ１（５ｍｇ／ｍＬ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）で１５ｍＬの管に移し、３０分間インキュベートした（３７℃、振とう）。次いで、組織片を、１８ゲージ針を有する５ｍＬのシリンジに３～５回引き出した。最終吸引において、流体を、事前に湿らせた７０μｍフィルター上に出した。シリンジプランジャーを使用して、フィルター上の残りの組織を穏やかに破壊し、フィルターを、２ｍＬのＰＢＳ中の０．５％のＢＳＡですすぎ、得られた細胞懸濁物を、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。残りの赤血球を溶解するために、細胞を、２ｍＬの塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液に再懸濁させ、室温で４分間インキュベートした。次いで、緩衝液を、４ｍＬのＰＢＳ中の１０％のＦＢＳで中和し、細胞を、７０μｍフィルターで再濾過し、１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞を、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡに再懸濁させ、９６ウェル丸底プレートに移し、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡでもう一回洗浄した。細胞を、製造業者の説明書に従ってＺｏｍｂｉｅ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ ＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。細胞を、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡでもう一回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーによって解析した。結果を、ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．６．２において解析した。

【0426】

肺におけるルシフェラーゼ発現を、Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）および抽出された肺タンパク質の直接測定によって分析した。ｍＲＮＡ送達の６分後、マウスに、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－ルシフェリンを腹腔内注射し、イソフルランによって麻酔し、発光シグナルを、３２分後にＩＶＩＳによって検出した。２４時間後、マウスに、Ｄ－ルシフェリン（１５０ｍｇ／ｋｇ）を再注射し、１５分後に画像化した。肺、脾臓、肝臓、腎臓、および心臓を取り出し、ｅｘ ｖｉｖｏ臓器発光を、最初の注射の３０分後にＩＶＩＳによって検出した。次いで、肺および脾臓の組織を刻み、１ｍＬのＧｌｏ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を有するＰｒｅｃｅｌｌｙｓ溶解管（Ｂｅｒｔｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に入れ、６５００ｒｐｍで、２回、３０秒間ホモジナイズした。溶解物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に移し、２１，０００×ｇで１０分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。２０ｕＬの溶解物を、１００ｕＬのＤ－ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と合わせ、発光を、ルミノメーターにおいて１０秒間測定した。発光値を、製造業者の説明書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定された総タンパク質濃度に対して正規化した。

【0427】

結果
ｐＨ
図１１は、表１のポリマー２、４、１４、１５、１６、１７、２０、２５、２７および３１について、ｐＨ４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、および６．０でのトランスフェクション効率（パーセント）のグラフである。結果は、異なる末端基を有するＰＡＣＥポリプレックスについての最適な酢酸ナトリウム緩衝液のｐＨを実証する。ＰＡＣＥトランスフェクション効率は、緩衝液のｐＨに強く依存し、最適なｐＨは、ポリマー末端基によって変化する。

【0428】

ＰＥＧ濃度
図１２Ａによって示されるように、ＰＡＣＥ－ＰＥＧの存在は、ポリプレックス安定性を増加させた。

【0429】

図１２Ｂは、ＰＡＣＥ－ＰＥＧの含有量（％）が０、０．０５、０１．０、０．２５、０．５０、および１の関数として、表１のポリマー１４、１５、１６、１７、２５、２７および３１についてのトランスフェクション効率（％）のグラフである。図１２Ｃは、同じＰＡＣＥ－ＰＥＧ混合物のＥＧＦＰ発現のグラフであり、ＰＥＧがＥＧＦＰ発現を増加させたことを示す。０．０５重量％という低いＰＡＣＥ－ＰＥＧ濃度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでほとんどのポリマーのｍＲＮＡトランスフェクション効率を低下させたが、１つのポリマー（Ｐ１４）は、ＰＥＧ濃度の範囲にわたって高いトランスフェクション効率を維持した。

【0430】

吸入送達のためのｍＲＮＡに基づくワクチン製剤の開発は、特に高いトランスフェクション能力を維持しながら粘液バリアを克服する上で、固有の課題がある。ＰＥＧコーティングは、多くの場合、粘液を通る浸透を増加させるために用いられるが、しかしながら、ＰＥＧ適用範囲（coverage）は、トランスフェクション効率が失われないことを確実にするために最適化されなければならない。

【0431】

ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（ＰＥＧ２ｋ、Ｎａｎｏ ＯＣＳ）でコーティングされたポリプレックスを、ＤＳＰＥ－ＰＥＧをＤＭＳＯに溶解する（１０ｍｇ／ｍＬ）ことによって形成した。次いで、溶解したＤＳＰＥ－ＰＥＧを、ＤＭＳＯ中のＰＡＣＥ（１００ｍｇ／ｍＬ）と１：１０の体積比で合わせた。ＤＭＳＯ中の中間ＤＳＰＥ－ＰＥＧ希釈を、ＤＳＰＥ－ＰＥＧのＰＡＣＥに対する所望の最終比を達成するために、必要により行った。次いで、ポリプレックスを、上記に記載されるようにして、ＤＭＳＯ中のＤＳＰＥ－ＰＥＧ／ＰＡＣＥブレンドをＤＭＳＯ中のＰＡＣＥの代わりに用いることによって、形成した。

【0432】

トランスフェクション効率および遺伝子発現に対するＰＥＧの効果を、図１３Ａ～１３Ｃに示す。図１３Ａは、サイズ（ｎｍ）および多分散性に対する０％、０．０１％、０．１％、１％または１０％のＤＳＰＥ－ＰＥＧの有効性のグラフである。図１３Ｂは、表１のポリマー１４、１５、１６、１７、２５、２７および３１についてのトランスフェクション効率（％）に対するＤＳＰＥ－ＰＥＧ含有量の有効性のグラフである。図１３Ｃは、ＥＧＦＰ発現に対するＤＳＰＥ－ＰＥＧ濃度（０、０．０５、０．１０、０．２５、０．５０、１．０、２．５、および５％）の効果のグラフである。

【0433】

投与の経路は組織分布に影響を及ぼす
図１４Ａおよび１４Ｂによって示されるように、Ｉ．Ｖ．注射およびＩ．Ｐ．注射の６時間後の解剖前の生物発光分布は、ポリプレックスが、注射された場合、最初に脾臓に主に分布し、次いで、脾臓、肝臓および腸に分布していることを示す。

【0434】

対照的に、図１５によって示されるように、肺への投与は、驚くべきことに、高い肺濃度を示し、他の組織ではほとんど発現しない。

【0435】

これは、この製剤が、肺に投与された場合に、肺へのｍＲＮＡなどの核酸の送達のための効果的で高度に選択的な手段であることを確立した。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【配列表】

2023531444000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-02-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ：

【化28】

のポリマーであって、式中、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、Ｒｘは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、
Ｒ_１およびＲ_２は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である、
ポリマー。

【請求項2】

Ｒ１および／またはＲ２が、

【化29】

ではない、請求項１に記載のポリマー。

【請求項3】

前記ポリマーから形成されるポリプレックスまたは粒子が、Ｒ１および／またはＲ２が、

【化30】

からなる対応するポリプレックスまたは粒子と比べて、ｍＲＮＡの、改善された負荷、改善された細胞トランスフェクション、改善された細胞内エンドソーム放出、またはそれらの組合せを示す、請求項１に記載のポリマー。

【請求項4】

前記ポリマーが、式ＩＩ：

【化31】

の構造を有し、式中、Ｊ_１およびＪ_２は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、Ｒ_３およびＲ_４は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
請求項１に記載のポリマー。

【請求項5】

前記ポリマーが、式ＩＩＩ：

【化32】

の構造を有する、請求項４に記載のポリマー。

【請求項6】

Ｚが、Ｚ’と同じである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項7】

ｎが、４、１０、１３、または１４である、請求項１に記載のポリマー。

【請求項8】

ｍが、５、６、または７である、請求項１に記載のポリマー。

【請求項9】

Ｒ_ｘが、置換または無置換アルキルである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項10】

重量平均分子量が、狭い多分散性ポリスチレン標準を使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって測定される場合、約２，０００ダルトン～２０，０００ダルトン、約２，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンまたは約２０００ダルトン～約７，０００ダルトンである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項11】

Ｒ_３が、Ｒ４と同じである、請求項４に記載のポリマー。

【請求項12】

Ｒ３および／またはＲ４が、独立して、

【化33-1】

【化33-2】

からなる群より選択される、請求項４に記載のポリマー。

【請求項13】

Ｊ _１ およびＪ_２が、独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－または－ＮＨ－から選択される、請求項４に記載のポリマー。

【請求項14】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、第一級アミン基を含有し、必要に応じて１個または複数の第二級アミン基または第三級アミン基を含有する、請求項４に記載のポリマー。

【請求項15】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、必要に応じて１個または複数のアミン基を含有する、請求項４に記載のポリマー。

【請求項16】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない、請求項４に記載のポリマー。

【請求項17】

Ｒ_３およびＲ_４の少なくとも１つが、ヒドロキシル基を含有しない、請求項４に記載のポリマー。

【請求項18】

Ｒ_３、Ｒ_４、またはその両方が、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑ、または－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキレン－Ｂｑであり、式中、Ａｑは、存在しないかまたは－ＮＲ_５－であり、Ｂｑは、ヒドロキシル、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンであり、Ｒ_５は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである、請求項４に記載のポリマー。

【請求項19】

Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数であり、ｍが、１～１０の整数であり、ｏおよびｐが、１～６の同じ整数であり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項20】

Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数であり、ｍが、１～１０の整数であり、Ｒが、アルキル、またはアリールであり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、請求項１に記載のポリマー。

【請求項21】

ｎが、１３、必要に応じて、ペンタデカラクトン（ＰＤＬ）であり、ｍが、７、必要に応じて、セバシン酸であり、ｏおよびｐが、２、必要に応じて、Ｎ－メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）である、請求項１に記載のポリマー。

【請求項22】

１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）またはトリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製される請求項１～２１のいずれかに記載のポリマーであって、２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミンもしくはアミン－ジオールモノマーが使用される場合、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る、ポリマー。

【請求項23】

そのポリプレックスまたは粒子に形成される、請求項１～２２のいずれかに記載のポリマー。

【請求項24】

封入された１つまたは複数の核酸を有する、そのポリプレックスまたは粒子に形成される、請求項２３に記載のポリマー。

【請求項25】

前記ポリプレックスまたは粒子が、Ｒ_１および／またはＲ_２が、

【化37】

からなるものではない、またはそれを含まないポリマーから形成される、請求項２４に記載のポリマー。

【請求項26】

そのポリプレックスまたは粒子に形成される請求項２４に記載のポリマーであって、前記ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされた前記ポリマーを含有する混合物中にある、ポリマー。

【請求項27】

前記ＰＥＧコンジュゲート化ポリマーが、構造

【化38】

を含有し、式中、ｍ’およびｍ’’は、独立して、０または１であるが、ただしｍ’＋ｍ’’は１または２であることを条件とし、
式ＸＩにおけるＪ_１およびＪ_２は、独立して、存在しないかまたは連結部分であり、必要に応じて、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－から選択される、
請求項２６に記載のポリマー。

【請求項28】

１つまたは複数の治療用、診断用、もしくは予防用核酸薬剤、またはそれらの組合せをｉｎ ｖｉｖｏで投与する方法において使用するための、請求項１～２７のいずれかに記載のポリプレックスまたは粒子の形態のポリマーを含む組成物であって、前記方法は、ポリプレックスまたは粒子の形態の前記ポリマーを細胞またはそれを必要とする個体に投与することを含む、組成物。

【請求項29】

前記方法が、細胞を前記粒子またはポリプレックスと接触させることによって細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

前記ポリプレックスまたは粒子が、肺に投与されるものである、請求項２８に記載の組成物。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０４３５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0435】

これは、この製剤が、肺に投与された場合に、肺へのｍＲＮＡなどの核酸の送達のための効果的で高度に選択的な手段であることを確立した。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
式Ｉ：

【化28】

のポリマーであって、式中、ｎは、１～３０の整数であり、ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、Ｒは、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、
Ｒ _１ およびＲ _２ は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である、
ポリマー。
（項目２）
Ｒ１および／またはＲ２が、

【化29】

ではない、項目１に記載のポリマー。
（項目３）
前記ポリマーから形成されるポリプレックスまたは粒子が、Ｒ１および／またはＲ２が、

【化30】

からなる対応するポリプレックスまたは粒子と比べて、ｍＲＮＡの、改善された負荷、改善された細胞トランスフェクション、改善された細胞内エンドソーム放出、またはそれらの組合せを示す、項目１に記載のポリマー。
（項目４）
前記ポリマーが、式ＩＩ：

【化31】

の構造を有し、式中、Ｊ _１ およびＪ _２ は、独立して、連結部分であるかまたは存在せず、Ｒ _３ およびＲ _４ は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
項目１に記載のポリマー。
（項目５）
前記ポリマーが、式ＩＩＩ：

【化32】

の構造を有する、項目１に記載のポリマー。
（項目６）
Ｚが、Ｚ’と同じである、項目１に記載のポリマー。
（項目７）
ｎが、４、１０、１３、または１４である、項目１に記載のポリマー。
（項目８）
ｍが、５、６、または７である、項目１に記載のポリマー。
（項目９）
Ｒ _ｘ が、置換または無置換アルキルである、項目１に記載のポリマー。
（項目１０）
重量平均分子量が、狭い多分散性ポリスチレン標準を使用するゲル浸透クロマトグラフィーによって測定される場合、約２，０００ダルトン～２０，０００ダルトン、好ましくは、約２，０００ダルトン～約１０，０００ダルトン、最も好ましくは、約２０００ダルトン～約７，０００ダルトンである、項目１に記載のポリマー。
（項目１１）
Ｒ _３ が、Ｒ４と同じである、項目４に記載のポリマー。
（項目１２）
Ｒ３および／またはＲ４が、独立して、

【化33-1】

【化33-2】

からなる群より選択される、項目４に記載のポリマー。
（項目１３）
Ｊ１が、－Ｏ－または－ＮＨであり、Ｊ _２ が、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－もしくは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、またはそれらの組合せである、項目４に記載のポリマー。
（項目１４）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、第一級アミン基を含有し、必要に応じて１個または複数の第二級アミン基または第三級アミン基を含有する、項目４に記載のポリマー。
（項目１５）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、必要に応じて１個または複数のアミン基を含有する、項目４に記載のポリマー。
（項目１６）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない、項目４に記載のポリマー。
（項目１７）
Ｒ _３ およびＲ _４ の少なくとも１つが、ヒドロキシル基を含有しない、項目４に記載のポリマー。
（項目１８）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、－無置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ｂｑ、－無置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ｂｑ、－置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ａｑ－無置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ｂｑ、または－置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ａｑ－置換Ｃ _１ ～Ｃ _１０ アルキレン－Ｂｑであり、式中、Ａｑは、存在しないかまたは－ＮＲ _５ －であり、Ｂｑは、ヒドロキシル、第一級アミン、第二級アミン、または第三級アミンであり、Ｒ _５ は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールである、項目４に記載のポリマー。
（項目１９）
ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）が、構造

【化34】

を有し、式中、ｎは、１～３０の整数であり、
ｍ、ｏ、およびｐは、独立して、１～２０の整数であり、
ｘ、ｙ、およびｑは、独立して、１～１０００の整数であり、
Ｒ _ｘ は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリール、または置換もしくは無置換アルコキシであり、
ＺおよびＺ’は、独立して、ＯまたはＮＲ’であり、ここでＲ’は、水素、置換もしくは無置換アルキル、または置換もしくは無置換アリールであり、
Ｒ _１ およびＲ _２ は、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する化学実体である、
項目１に記載のポリマー。
（項目２０）
Ｚが、Ｚ’と同じである、項目１９に記載のポリマー。
（項目２１）
Ｚが、Ｏであり、かつＺ’が、Ｏであり、Ｚが、ＮＲ’であり、かつＺ’が、ＮＲ’である、項目２０に記載のポリマー。
（項目２２）
Ｚが、Ｏであり、かつＺ’が、ＮＲ’であるか、またはＺが、ＮＲ’であり、かつＺ’が、Ｏである、項目１９に記載のポリマー。
（項目２３）
Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、項目１９に記載のポリマー。
（項目２４）
ｍが、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、項目２３に記載のポリマー。
（項目２５）
Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍが、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、ｏおよびｐが、１～６の同じ整数、例えば、２、３、または４であり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、項目１９に記載のポリマー。
（項目２６）
Ｚ’が、Ｏであり、ｎが、１～２４の整数、例えば、４、１０、１３、または１４であり、ｍが、１～１０の整数、例えば、４、５、６、７、または８であり、Ｒが、アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、または例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチルの同族体および異性体、またはアリール、例えば、フェニル、ナフタリル、アントラセニル、フェナントリル、クリセニル、ピレニル、トリル、もしくはキシリルであり、必要に応じて、Ｚも、Ｏである、項目１９に記載のポリマー。
（項目２７）
ｎが、１４、必要に応じて、ペンタデカラクトン（ＰＤＬ）であり、ｍが、７、必要に応じて、セバシン酸であり、ｏおよびｐが、２、必要に応じて、Ｎ－メチルジエタノールアミン（ＭＤＥＡ）である、項目１９に記載のポリマー。
（項目２８）
式ＩＩ：

【化35】

の構造を有する、項目１に記載のポリマーであって、式中、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式Ｉについて上記に記載される通りであり、
Ｊ _１ およびＪ _２ は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＩＩにおけるＲ _３ およびＲ _４ は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
ポリマー。
（項目２９）
Ｊ _１ が、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｊ _２ が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、
項目２８に記載のポリマー。
（項目３０）
Ｒ _３ が、Ｒ _４ と同一であり、必要に応じて、Ｒ _３ および／またはＲ _４ が、直鎖状である、項目２８に記載のポリマー。
（項目３１）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、必要に応じて、Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基および１個または複数のアミン基、必要に応じて、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する、項目３０に記載のポリマー。
（項目３２）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない、項目２８に記載のポリマー。
（項目３３）
Ｒ _３ およびＲ _４ の少なくとも１つが、ヒドロキシル基を含有しない、項目２８に記載のポリマー。
（項目３４）
式ＩＩＩ：

【化36】

の構造を有する、項目１に記載のポリマーであって、式中、Ｒｘ、Ｚ、Ｚ’、ｍ、ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｘ、およびｙは、式Ｉについて上記に記載される通りであり、
Ｊ _１ およびＪ _２ は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＩＩにおけるＲ _３ およびＲ _４ は、独立して、ヒドロキシル基、第一級アミン基、第二級アミン基、第三級アミン基、またはそれらの組合せを含有する置換アルキルである、
ポリマー。
（項目３５）
Ｊ _１ が、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、
Ｊ _２ が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、
項目３４に記載のポリマー。
（項目３６）
Ｒ _３ が、Ｒ _４ と同一であり、必要に応じて、Ｒ _３ および／またはＲ _４ が、直鎖状である、項目３４に記載のポリマー。
（項目３７）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、必要に応じて、Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基および１個または複数のアミン基、必要に応じて、第二級アミン基または第三級アミン基を含有する、項目３４に記載のポリマー。
（項目３８）
Ｒ _３ 、Ｒ _４ 、またはその両方が、ヒドロキシル基を含有し、アミン基を含有しない、項目３４に記載のポリマー。
（項目３９）
Ｒ _３ およびＲ _４ の少なくとも１つが、ヒドロキシル基を含有しない、項目３４に記載のポリマー。
（項目４０）
前記ポリマーの重量平均分子量が、２０，０００ダルトン超、１５，０００ダルトン超、１０，０００ダルトン超、５，０００ダルトン超、または２，０００ダルトン超である、項目１９～３９のいずれかに記載のポリマー。
（項目４１）
前記ポリマーの重量平均分子量が、約２，０００ダルトン～約２０，０００ダルトン、より好ましくは、約５，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンである、項目４０に記載のポリマー。
（項目４２）
１つまたは複数のラクトン、１つまたは複数のアミン－ジオール（ＺおよびＺ’＝Ｏ）またはトリアミン（ＺおよびＺ’＝ＮＲ’）、および１つまたは複数の二酸またはジエステルから調製される項目１９～４１のいずれかに記載のポリマーであって、２つまたはそれよりも多くの異なるラクトン、二酸もしくはジエステル、および／またはトリアミンもしくはアミン－ジオールモノマーが使用される場合、ｎ、ｏ、ｐ、および／またはｍの値は、同じまたは異なり得る、ポリマー。
（項目４３）
そのポリプレックスまたは粒子に形成される、項目１９～４２のいずれかに記載のポリマー。
（項目４４）
封入された１つまたは複数の核酸を有する、そのポリプレックスまたは粒子に形成される、項目４３に記載のポリマー。
（項目４５）
前記ポリプレックスまたは粒子が、Ｒ _１ および／またはＲ _２ が、

【化37】

からなるものではない、またはそれを含まないポリマーから形成される、項目４４に記載のポリマー。
（項目４６）
そのポリプレックスまたは粒子に形成される項目４４に記載のポリマーであって、前記ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされた前記ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）、すなわち、ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）を含有する混合物中にある、ポリマー。
（項目４７）
前記ＰＥＧコンジュゲート化ポリ（アミン－ｃｏ－エステル）またはポリ（アミン－ｃｏ－アミド）が、構造

【化38】

を含有し、式中、ｍ’およびｍ’’は、独立して、０または１であるが、ただしｍ’＋ｍ’’は１または２であることを条件とし、
式ＸＩにおけるＪ _１ およびＪ _２ は、独立して、存在しないかまたは連結部分、例えば、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－、および－ＮＨ－であり、
式ＸＩの一部の形態では、Ｊ _１ が、－Ｏ－または－ＮＨ－であり、式ＸＩの一部の形態では、Ｊ _２ が、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、または－Ｃ（Ｏ）Ｏ－である、
項目４６に記載のポリマー。
（項目４８）
１つまたは複数の治療用、診断用、もしくは予防用核酸薬剤、またはそれらの組合せをｉｎ ｖｉｖｏで投与する方法であって、項目１～４７のいずれかに記載のポリプレックスまたは粒子の形態のポリマーを細胞またはそれを必要とする個体に投与することを含む、方法。
（項目４９）
細胞を前記粒子またはポリプレックスと接触させることによって細胞をトランスフェクトすることを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリプレックスまたは粒子が、肺に投与される、項目４８に記載の方法。

【国際調査報告】