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特表2023-531455重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-24
(54)【発明の名称】重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20230714BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20230714BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20230714BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230714BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230714BHJP
C07K 14/165 20060101ALI20230714BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20230714BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H
A61K39/39
A61K39/215
A61P31/14
A61K9/08
C07K14/165 ZNA
C12N15/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022578689
(86)(22)【出願日】2021-06-18
(85)【翻訳文提出日】2023-02-16
(86)【国際出願番号】 CN2021100826
(87)【国際公開番号】W WO2021254473
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】63/040,696
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】PCT/US2021/020277
(32)【優先日】2021-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522490583
【氏名又は名称】高端疫苗生物製劑股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｄｉｇｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．６８， Ｓｈｅｎｇｙｉ ３ｒｄ Ｒｄ．， Ｚｈｕｂｅｉ Ｃｉｔｙ， Ｈｓｉｎｃｈｕ Ｃｏｕｎｔｙ ３０２， Ｔａｉｗａｎ
(71)【出願人】
【識別番号】522490594
【氏名又は名称】ダイナヴァックス テクノロジーズ コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】Ｄｙｎａｖａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
【住所又は居所原語表記】１００ Ｐｏｗｅｌｌ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓｕｉｔｅ ９００ Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４６０８ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
(74)【代理人】
【識別番号】100082418
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 朔生
(74)【代理人】
【識別番号】100167601
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 信之
(74)【代理人】
【識別番号】100201329
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 真二郎
(74)【代理人】
【識別番号】100220917
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 忠大
(72)【発明者】
【氏名】クオ、チュンーヤン
(72)【発明者】
【氏名】チェン、チャールズ
(72)【発明者】
【氏名】ウー、チュンーチン
(72)【発明者】
【氏名】リン、イーージウン
(72)【発明者】
【氏名】リン、メーイーユン
(72)【発明者】
【氏名】ウー、ユーチ
(72)【発明者】
【氏名】キャンベル、ジョン、ディ
(72)【発明者】
【氏名】ジャンセン、ロバート、エス
(72)【発明者】
【氏名】ノヴァック、ディビッド
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076BB15
4C076CC35
4C076DD22
4C076DD30
4C076FF11
4C076FF68
4C085AA03
4C085BA71
4C085CC08
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF01
4C085FF02
4C085GG03
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物、特に、組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質およびアジュバントを有する免疫原性組成物を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗原組換えタンパク質と、アルミニウム含有アジュバント、非メチル化シトシンリン酸グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアジュバントとを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物であって、前記抗原組換えタンパク質は、実質的に、残基９８６および９８７にプロリン置換、残基６８２～６８５に「ＧＳＡＳ」置換、ならびにＣ末端Ｔ４フィブリチン三量体化ドメインを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の残基１４～１２０８からなることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項2】
残基９８６および９８７にプロリン置換、ならびに残基６８２～６８５に「ＧＳＡＳ」置換を有する前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の残基１４～１２０８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項3】
前記Ｃ末端Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の前記アミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項4】
前記抗原組換えタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５もしくは６のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５もしくは６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の前記アミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１～３のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項5】
前記アルミニウム含有アジュバントは、水酸化アルミニウム、オキシ水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、アルミニウムヒドロキシホスフェイト、アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩、硫酸アルミニウムカリウム、モノステアリン酸アルミニウム、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１～４のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項6】
０．５ｍＬ用量の前記免疫原性組成物は、約２５０～約５００μｇのＡｌ３＋、または約３７５μｇのＡｌ３＋を含むことを特徴とする、請求項１～５のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項7】
前記非メチル化ＣｐＧモチーフは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、またはこれらの組み合わせの合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含むことを特徴とする、請求項１～６のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項8】
０．５ｍＬ用量の前記免疫原性組成物は、約７５０～約３０００μｇの前記オリゴヌクレオチドを含むこと、または前記免疫原性組成物は、約７５０μｇ、約１５００μｇ、もしくは約３０００μｇの前記オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１～７のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項9】
請求項１～８のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫応答を前記被験者において誘発する方法。
【請求項10】
前記免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の産生およびＴｈ１偏向免疫応答を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫応答を、その必要がある被験者において誘発するための、請求項１～８のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用であって、前記使用は、前記免疫原性組成物の有効量をその必要がある前記被験者に投与することを含む使用。
【請求項12】
前記免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の産生およびＴｈ１偏向免疫応答を含むことを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染から、その必要がある被験者を保護するための、請求項１～８のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用であって、前記使用は、前記免疫原性組成物の有効量をその必要がある前記被験者に投与することを含む使用。
【請求項14】
その必要がある被験者がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを防ぐための、請求項１～８のうちいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用であって、前記使用は、前記免疫原性組成物の有効量をその必要がある前記被験者に投与することを含む使用。
【請求項15】
前記免疫原性組成物は筋肉内注射によって投与されることを特徴とする、請求項１１～１４のうちいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０４０，６９６号、および２０２１年３月１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２１／２０２７７号の優先権および利益を主張し、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。
本願は、２０２０年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／０４０，６９６号、および２０２１年３月１日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２１／２０２７７号の優先権および利益を主張し、これらの開示は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【0002】
本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物、特に組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質およびアジュバントを有する免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
２０１９年末に新型コロナウイルスが発生し、呼吸器感染症を引き起こすことが確認された。このウイルス性病原菌は、他の既知のウイルスとは一致せず、後に正式に「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）」と命名された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する疾患の正式名称は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）である。ＣＯＶＩＤ－１９に共通する症状に、発熱、乾性咳、疲労、倦怠、筋肉痛、体の痛み、咽頭痛、下痢、結膜炎、頭痛、味覚または嗅覚の喪失、皮疹、および息切れなどがある。大多数は軽症に終わるものの、一部の症例は、サイトカインストームによって引き起こされる急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、多臓器不全、敗血症性ショック、血栓に進行する。コロナウイルス感染症による死亡が初めて確認されたのが２０２０年１月９日で、２０２１年６月１３日時点で３，７９２，７７７人の死亡を含む１７５，３０６，５９８例のＣＯＶＩＤ－１９感染がＷＨＯに報告されており、この数はなおも急速に拡大している。
【0004】
日々の活動を縮小することなくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクを抑えるには、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが必要となる。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を速やかに誘導できるＣＯＶＩＤ－１９ワクチンが緊急に必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８（８）：ｅ０１０６８－ｅ１１２０，２０２０
【非特許文献2】Ｐａｌｌｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１４（３５）：Ｅ７３４８－Ｅ７３５７，２０１７
【非特許文献3】Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３０（２）：２５４－２６１，２０１０
【非特許文献4】Ｗｒａｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３６７（６４８３）：１２６０－１２６３，２０２０
【非特許文献5】Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．，５（２）：７９－８４，２００９
【非特許文献6】Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，２７（３）：４９３－４９７，１９３８
【非特許文献7】Ｃｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ．２５（３）：２００００４５，２０２０
【非特許文献8】Ｇａｒｃｉａ－Ｂｅｌｔｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１８４（９）：２３７２－２３８３．ｅ９，２０２１
【発明の概要】
【0006】
一態様では、本発明は、抗原組換えタンパク質と、アルミニウム含有アジュバント、非メチル化シトシンリン酸グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアジュバントとを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物であって、抗原組換えタンパク質が、実質的に、残基９８６および９８７にプロリン置換、残基６８２～６８５に「ＧＳＡＳ」置換、ならびにＣ末端Ｔ４フィブリチン三量体化ドメインを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の残基１４～１２０８からなる免疫原性組成物を提供する。
【0007】
別の態様では、本発明は、本発明の免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫応答を被験者において誘発する方法を提供する。
【0008】
別の態様では、本発明は、本発明の免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染から被験者を保護する方法を提供する。
【0009】
別の態様では、本発明は、本発明の免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む、被験者がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを防ぐ方法を提供する。
【0010】
別の態様では、本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫応答を、その必要がある被験者において誘発するための、本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。
【0011】
別の態様では、本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染から、その必要がある被験者を保護するための、本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。
【0012】
別の態様では、本発明は、その必要がある被験者がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを防ぐための、本発明の免疫原性組成物の使用を提供する。
【0013】
これらおよび他の態様は、以下の図面と併せて実施される好ましい実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。
【0014】
添付の図面は、本発明の１つまたは複数の実施形態を示し、説明の記述と合わせて、本発明の原理を説明するのに資するものである。可能な限り、図面全体を通して同じ参照番号で、実施形態の同じまたは同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】リン酸アルミニウムアジュバントを含む、または含まないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質で免疫したマウスの血清を用いた中和アッセイの結果を示すグラフである。
【図2】さまざまな処方のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質で免疫したマウスの血清を用いた中和アッセイの結果を示すグラフである。
【図3】２回目注射の２週間後における、ＣｐＧ１０１８および水酸化アルミニウムでアジュバント化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐによる中和抗体の誘導を示すグラフである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させ、ＣｐＧ１０１８、水酸化アルミニウム、またはその両方の組み合わせでアジュバント化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐを用いて、３週間の間隔を空けて２種類の用量レベルでＢＡＬＢ／ｃマウス（各群Ｎ＝６）を免疫し、２回目注射の２週間後に、抗血清を採取した。抗血清は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスを用いて中和アッセイを行い、中和抗体のＩＤ５０（左）およびＩＤ９０（右）力価を決定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図4】アジュバントを添加したＳ－２Ｐで免疫したマウスの総抗Ｓ ＩｇＧ力価を示すグラフである。ＣｐＧ１０１８、水酸化アルミニウム、またはその両方の組み合わせを添加した０、１、または５μｇのＳ－２Ｐで免疫した図３のＢＡＬＢ／ｃマウス（各群Ｎ＝６）の血清を、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で抗Ｓ ＩｇＧの総量について定量した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図5】ＣｐＧ１０１８および水酸化アルミニウムでアジュバント化したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐで誘導した抗体による、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和を示すグラフである。図４（各群Ｎ＝６）に記載するように抗血清を採取し、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を用いて中和アッセイを行い、中和抗体力価を測定した。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図6】ＣｐＧ１０１８および水酸化アルミニウムを添加したＳ－２Ｐで免疫したマウスによる、スパイクタンパク質のＤ６１４Ｄ（野生型）またはＤ６１４Ｇ（変異株）バージョンを持つ偽ウイルスの阻害を示すグラフである。図５のように、１０μｇのＣｐＧ１０１８および５０μｇの水酸化アルミニウムを添加した１または５μｇのＳ－２Ｐで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス（中和能評価のため各群Ｎ＝５で）の抗血清を採取した。Ｄ６１６ＤまたはＤ６１４Ｇスパイクタンパク質のいずれかを持つ偽ウイルスで中和アッセイを行った。
【図7】ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－５、およびＩＦＮ－γ／ＩＬ－６比を示すグラフである。比率はサイトカインアッセイ（各群Ｎ＝６）によるＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－６値を用いて算出した。比率値が１よりも高ければＴｈ１偏向応答を、１よりも低ければＴｈ２偏向応答を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図8A】２回目の免疫化から２週間後のハムスターにおける、偽ウイルスアッセイを用いた中和抗体力価を示すグラフである。ハムスター（各群Ｎ＝１０）は、ビヒクル対照（ＰＢＳ）、１５０μｇのＣｐＧ１０１８および７５μｇの水酸化アルミニウムでアジュバント化した１μｇ（ＬＤ）もしくは５μｇ（ＨＤ）のＳ－２Ｐ、またはアジュバントのみを用いて、３週間の間隔を空けて２回免疫した。２回目注射の２週間後に抗血清を採取し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスを用いた中和アッセイを行い、中和抗体のＩＤ９０力価を決定した。結果は幾何平均で示し、エラーバーは９５％信頼区間を表す。統計的有意性は、補正したＤｕｎｎの多重比較検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓで算出した。点線は検出下限および上限を表す（４０および５１２０）。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図8B】２回目の免疫化から２週間後のハムスターにおける、偽ウイルスアッセイを用いた抗Ｓ ＩｇＧ力価を示すグラフである。図８Ａのようにハムスターを免疫し、２回目注射の２週間後に抗血清を採取し、ＥＬＩＳＡで、総抗Ｓ ＩｇＧ抗体力価を決定した。点線は検出下限および上限を表す（１００および１，６３８，４００）。
【図9A】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染後３または６日目（ｄｐｉ）のハムスターのウイルス量を示すグラフである。ハムスターは３または６ｄｐｉに安楽死させ、肺組織試料を採取して、ウイルスゲノムＲＮＡの定量ＰＣＲでウイルス量を決定した。結果は幾何平均で示し、エラーバーは９５％信頼区間を表す。統計的有意性は、補正したＤｕｎｎの多重比較検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓで算出した。点線は検出下限を表す（１００）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図10】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染後３または６日目（ｄｐｉ）のハムスターの肺病理学的スコアリングを示すグラフである。ハムスターは３または６ｄｐｉに安楽死させ、肺組織試料を採取し、切片にして染色した。病理組織切片は、方法で概説するようにスコアリングし、結果を集計した。結果は肺病理学的スコアの平均値で示し、エラーバーは標準誤差を表す。統計的有意性は、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた一元配置分散分析で算出した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図11】第Ｉ相臨床試験における非自発報告による有害事象をまとめたグラフである。参加者には、各ワクチン接種後７日間、参加者用日誌カードに局所および全身の非自発報告による有害事象を記録するよう求めた。非自発報告による有害事象（ＡＥ）を集計し、軽度、中等度、重度に分類した。
【図12A】第Ｉ相臨床試験における体液性免疫応答の概要を示すグラフである。５、１５、または２５μｇのＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンを接種した参加者の血清は、ＥＬＩＳＡで抗スパイクＩｇＧを測定した。比較のため、ＣＯＶＩＤ－１９回復患者３５名のヒト回復期血清（ＨＣＳ）を同じアッセイで分析した。バーは幾何平均力価を示し、エラーバーは９５％信頼区間を示す。
【図13】第Ｉ相臨床試験における細胞免疫応答の概要を示すグラフである。細胞はペプチドのＳ１ペプチドプールで刺激し、３７℃で２４～４８時間インキュベートした。陽性対照として、ＣＤ３－２ｍＡｂで刺激した細胞を用いた。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用してＩＦＮ－γ（左側）またはＩＬ－４（右側）を検出した。トリプリケートのペプチドプール刺激でカウントしたスポット形成単位（ＳＦＵ）の平均を計算し、陰性対照複製物（対照培地）の平均を減算して正規化した。結果は、ＰＢＭＣ １００万個当たりのＳＦＵとして表した。バーは平均値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図14】アジュバント化したＳ－２Ｐでワクチン接種したラットの抗血清による、野生型またはＢ．１．３５１（β）変異株スパイクタンパク質を持つＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの中和を示すグラフである。ラットは、アジュバント化したＳ－２Ｐの指示量で、２週間の間隔を空けて３回免疫した。雄５匹の抗血清を１つの試料としてプールし、雌５匹の抗血清は別の試料としてプールした。これにより、投与群ごとに２つの試料がプールされた（Ｎ＝２）。２回目の免疫化の２週間後（２９日目）または３回目の免疫化の２週間後（４３日目）に抗血清を採取し、上記のようにプールして、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢野生型またはＢ．１．３５１変異株スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスを用いた中和アッセイを行い、中和抗体のＩＤ５０およびＩＤ９０力価を決定した。結果は、幾何平均力価を示すバーとして示し、各試料の値を表す記号を付した。
【図15A】異なる用量のＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンを接種した臨床試験被験者の抗血清による、野生型または変異株スパイクタンパク質を持つＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスの中和を示すグラフである。ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１被験者の第Ｉ相臨床試験の血清試料は、２回目の免疫化の４週間後（１回目の免疫化から５６日後）に採取した。偽ウイルス中和アッセイを用いて、低用量（ＬＤ）のＩＤ５０中和力価および全用量群を測定した。結果は、各点で個々の血清試料の中和力価を示す。補正したＤｕｎｎの多重比較検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを実施し、野生型に対する変異株の統計的有意性は、各カラムの上方に示す。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物に関する。免疫原性組成物は、抗原組換えタンパク質と、アルミニウム含有アジュバントおよび／または非メチル化シトシンリン酸グアノシン（ＣｐＧ）モチーフを含むアジュバントとを含む。抗原組換えタンパク質は、残基９８６および９８７にプロリン置換、残基６８２～６８５に「ＧＳＡＳ」置換、ならびにＣ末端Ｔ４フィブリチン三量体化ドメインを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の残基１４～１２０８を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、残基９８６および９８７にプロリン置換ならびに残基６８２～６８５に「ＧＳＡＳ」置換を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の残基１４～１２０８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有する。
【0018】
いくつかの実施形態では、Ｃ末端Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有する。
【0019】
いくつかの実施形態では、抗原組換えタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５もしくは６のアミノ酸配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５もしくは６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を有する。
【0020】
いくつかの実施形態では、アルミニウム含有アジュバントは、水酸化アルミニウム、オキシ水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、アルミニウムヒドロキシホスフェイト、アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩、硫酸アルミニウムカリウム、モノステアリン酸アルミニウム、またはこれらの組み合わせを含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、０．５ｍＬ用量の免疫原性組成物は、約２５０～約５００μｇのＡｌ３＋、または約３７５μｇのＡｌ３＋を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、非メチル化ＣｐＧモチーフは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、またはこれらの組み合わせの合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、０．５ｍＬ用量の免疫原性組成物は、約７５０～約３０００μｇのオリゴヌクレオチドを含む、または免疫原性組成物は、約７５０μｇ、約１５００μｇ、もしくは約３０００μｇのオリゴヌクレオチドを含む。
【0024】
本発明は、本発明の免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫応答を被験者において誘発する方法にも関する。
【0025】
本発明は、本発明の免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染から被験者を保護する方法にも関する。
【0026】
本発明は、本発明の免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む、被験者がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを防ぐ方法にも関する。
【0027】
本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫応答を、その必要がある被験者において誘発するための、本発明の免疫原性組成物の使用にも関し、方法は、免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の産生およびＴｈ１偏向免疫応答を含む。
【0029】
本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染から、その必要がある被験者を保護するための、本発明の免疫原性組成物の使用にも関し、方法は、免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む。
【0030】
本発明は、その必要がある被験者がＣＯＶＩＤ－１９疾患に罹患するのを防ぐための、本発明の免疫原性組成物の使用にも関し、方法は、免疫原性組成物の有効量をその必要がある被験者に投与することを含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は筋肉内注射によって投与される。
【0032】
本明細書に記載する科学技術用語の意味は、当業者には明確に理解できるものである。
【0033】
本明細書で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数の言及を含む。例えば、「ａｎ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ（賦形剤）」は、１つまたは複数の賦形剤を含む。
【0034】
本明細書で使用する語句「を含む」はオープンエンド形式であり、かかる実施形態が追加の要素を含み得ることを示す。これに対し「からなる」はクローズドエンド形式であり、かかる実施形態が追加の要素を含まない（微量不純物を除く）ことを示す。「から本質的になる」という語句は部分的にクローズドであり、かかる実施形態が、かかる実施形態の基本的特性を実質的に変化させない要素をさらに含み得ることを示す。
【0035】
本明細書において同義で使用する用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド、またはこれらの組み合わせを含む。オリゴヌクレオチドは、直鎖状または環状に構成できる、または直鎖状および環状の両方のセグメントを含むことができる。オリゴヌクレオチドは、一般にホスホジエステル結合を介して結合したヌクレオシドのポリマーであるが、ホスホロチオエートエステルなどの代替結合もオリゴヌクレオチドに用いられ得る。ヌクレオシドは、プリン（アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ）、もしくはそれらの誘導体）またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、もしくはウラシル（Ｕ）、もしくはそれらの誘導体）塩基が糖に結合したものである。ＤＮＡの４つのヌクレオシド単位（または塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、およびデオキシシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルである。
【0036】
本明細書で使用する用語「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）」は、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）を引き起こすコロナウイルスの株を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ゲノムサイズが２９，９０３塩基のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンはそれぞれ直径が５０～２００ｎｍで、Ｓ（スパイク）、Ｅ（エンベロープ）、Ｍ（膜）、およびＮ（ヌクレオカプシド）タンパク質として知られる４種類の構造タンパク質を有する。Ｎタンパク質はＲＮＡゲノムを有し、Ｓ、Ｅ、およびＭタンパク質が共にウイルスのエンベロープを構築している。スパイクタンパク質は、ウイルスが宿主細胞の膜に付着および融合できるようにするタンパク質であり、具体的には、そのＳ１サブユニットが付着を、Ｓ２サブユニットが融合を触媒する。
【0037】
本明細書で使用する用語「重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に対する免疫原性組成物」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫応答を刺激または誘発する組成物を指す。免疫応答には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体の産生およびＴｈ１偏向免疫応答があるがこれらに限定されない。
【0038】
本明細書で使用する用語「アルミニウム含有アジュバント」は、アルミニウムを含むアジュバントを指す。いくつかの実施形態では、アルミニウム含有アジュバントは、水酸化アルミニウム、オキシ水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムゲル、アルミニウムヒドロキシホスフェイト、アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩、非晶質アルミニウムヒドロキシホスフェイト硫酸塩、硫酸アルミニウムカリウム、モノステアリン酸アルミニウム、またはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルミニウム含有アジュバントは、ヒトへの投与についてＦＤＡの承認を受けたアルミニウム含有アジュバントである。いくつかの実施形態では、アルミニウム含有アジュバントは、ヒトへの投与についてＦＤＡの承認を受けた水酸化アルミニウムアジュバントである。いくつかの実施形態では、アルミニウム含有アジュバントは、ヒトへの投与についてＦＤＡの承認を受けたリン酸アルミニウムアジュバントである。
【0039】
本明細書で使用する用語「非メチル化シトシンリン酸グアノシン（ＣｐＧ）モチーフ」はＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを指し、Ｃはメチル化されておらず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ ｖｉｖｏで測定される、測定可能な免疫応答に寄与する。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、一般式が５’－プリン－プリン－ＣＧ－ピリミジン－ピリミジン－３’である回文構造の六量体を含む。いくつかの好ましい実施形態では、非メチル化シトシンリン酸グアノシン（ＣｐＧ）モチーフはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のオリゴヌクレオチド（５’－ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ－３’）を有し、ＣＧのＣはメチル化されていない。いくつかの実施形態では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＴＣＧを含み、Ｃはメチル化されておらず、鎖長が８～１００ヌクレオチド、好ましくは８～５０ヌクレオチド、または好ましくは８～２５ヌクレオチドである。いくつかの好ましい実施形態では、非メチル化シトシンリン酸グアノシン（ＣｐＧ）モチーフはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のオリゴヌクレオチド（５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ－３’）を有し、ＴＣＧのＣはメチル化されていない。非メチル化シトシンリン酸グアノシン（ＣｐＧ）モチーフの例としてさらに、５’－ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）、５’－ＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）、５’－ＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＡＣＧＴＴＧＡＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）、および５’－ＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）があるがこれらに限定されない。本明細書に記載するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、別段の指示がない限り、薬学的に許容される塩の形態である。好ましい一実施形態では、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはナトリウム塩の形態である。
【0040】
物質の「有効量」または「十分な量」とは、臨床結果などの有益な、または所望の結果をもたらすのに十分な量であり、したがって「有効量」は、それが適用される状況に応じて異なる。免疫原性組成物を投与するという状況においては、有効量は、免疫応答を誘発するのに十分なアジュバントおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質を含む。有効量は、１回または複数回の用量で投与できる。
【0041】
用語「個人」および「被験者」は哺乳類を指す。「哺乳類」は、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、家畜、競技用動物、げっ歯動物（例えば、マウスやラット）、および愛玩動物（例えば、イヌやネコ）を含むがこれらに限定されない。
【0042】
免疫原性組成物に関連して本明細書で使用する用語「用量」は、任意の１回に被験者が取り入れる（投与される、または受け取る）免疫原性組成物の測定された量を指す。
【0043】
本明細書で使用する用語「単離された」および「精製された」は、自然状態でそれが結びついている少なくとも１つの成分から除去された（例えば、元の環境から除去された）物質を指す。用語「単離された」は、組換えタンパク質に関して使用される場合、そのタンパク質を産生した宿主細胞の培地から除去されたタンパク質を指す。
【0044】
反応またはパラメータの「刺激」は、目的のパラメータ以外がすべて同じ条件と比較した場合、あるいは、他の条件と比較した場合に、その反応またはパラメータを誘発および／または増強することを含む（例えば、ＴＬＲアゴニスト非存在下と比較した場合のＴＬＲアゴニスト存在下でのＴＬＲシグナルの増加）。例えば、免疫応答の「刺激」は、応答の増加を意味する。測定するパラメータに応じて、増加は５倍から５００倍以上、または５、１０、５０、もしくは１００倍から５００、１，０００、５，０００、もしくは１０，０００倍であってよい。
【0045】
本明細書で使用する用語「免疫化」は、抗原に対する哺乳類被験者の反応を増加させ、それにより感染に抵抗または感染を克服する能力を向上させるプロセスを指す。
【0046】
本明細書で使用する用語「ワクチン接種」は、哺乳類被験者体内へのワクチンの導入を指す。
【0047】
「アジュバント」は、抗原を含む組成物に添加すると、曝露時にレシピエントにおいて抗原に対する免疫応答を非特異的に増強または強化する物質を指す。
【0048】
以下の実施例によって本発明をさらに説明していくが、これらは限定ではなく実証を目的として提供するものである。本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更が可能であり、それでも本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果が得られることを当業者は理解すべきである。
【実施例1】
【0049】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物の調製
残基９８６および９８７にプロリン置換、フューリン切断部位（残基６８２～６８５）に「ＧＳＡＳ」置換（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、およびＣ末端Ｔ４フィブリチン三量体化ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、８ｘ Ｈｉｓ Ｔａｇ、およびＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（武漢Ｈｕ－１株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７）の残基１～１２０８をコードするポリヌクレオチドを有するプラスミドを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）にトランスフェクトした。
残基９８６および９８７にプロリン置換、フューリン切断部位（残基６８２～６８５）に「ＧＳＡＳ」置換（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）、およびＣ末端Ｔ４フィブリチン三量体化ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ切断部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、８ｘ Ｈｉｓ Ｔａｇ、およびＴｗｉｎ－Ｓｔｒｅｐ Ｔａｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質（武漢Ｈｕ－１株、ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７）の残基１～１２０８をコードするポリヌクレオチドを有するプラスミドを、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）にトランスフェクトした。
【0050】
６日後に細胞培養物を回収し、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ樹脂（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ、ゲッティンゲン）を用いて上清からタンパク質を精製した。ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（１％ｗｔ／ｗｔ）をタンパク質に添加し、４℃で一晩、反応をインキュベートした。消化されたタンパク質はＳｕｐｅｒｏｓｅ６ １６／７０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国イリノイ州シカゴ）を用いてさらに精製した。次いで、精製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５または６）を、非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ１０１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）および／またはアルミニウム含有アジュバント、例えば水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）もしくはリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）を用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物として調製した。
【実施例2】
【0051】
マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物の免疫原性
本実施例は、実施例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物の免疫原性をマウスで評価する前臨床試験を提供する。
本実施例は、実施例１で得たＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物の免疫原性をマウスで評価する前臨床試験を提供する。
【0052】
Ａ．予備試験１：リン酸アルミニウムを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質
材料および方法
マウスの免疫化。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、台湾）（Ｎ＝５／群）に、０および３週目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質をワクチン接種した。ＰＢＳで希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（終濃度が１または１０μｇ／ｍＬ）をリン酸アルミニウムと混合した（終濃度が０．５ｍｇアルミニウム／ｍＬ）。１００μＬ（各後肢に５０μＬ）をマウスの筋肉内に接種した。最終免疫化の２週間後に血清を採取し、抗体応答を測定した。
材料および方法
マウスの免疫化。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、台湾）（Ｎ＝５／群）に、０および３週目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質をワクチン接種した。ＰＢＳで希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（終濃度が１または１０μｇ／ｍＬ）をリン酸アルミニウムと混合した（終濃度が０．５ｍｇアルミニウム／ｍＬ）。１００μＬ（各後肢に５０μＬ）をマウスの筋肉内に接種した。最終免疫化の２週間後に血清を採取し、抗体応答を測定した。
【0053】
偽ウイルスの作製。武漢Ｈｕ－１株（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）のスパイクタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて合成した後、ＣＭＶ／Ｒプラスミドに挿入した。ＣＭＶ／Ｒ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクプラスミドはシークエンシングを用いて確認した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを作製するために、Ｆｕｇｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソンン）を用いて、ＣＭＶ／Ｒ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクプラスミドを、パッケージングプラスミドｐＣＭＶＤＲ８．２および形質導入プラスミドｐＨＲ ＣＭＶ－Ｌｕｃと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収し、ろ過して－８０℃で凍結した。
【0054】
偽ウイルスの感染力および中和アッセイ。Ｈｕｈ７．５細胞（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿７９２７）は、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。偽ウイルスの感染力は、９６ウェルホワイト／ブラックＩｓｏＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）に一晩播種したＨｕｈ７．５細胞で評価した。偽ウイルスの２倍段階希釈液を、静止状態のＨｕｈ７．５細胞にトリプリケートで添加した。２時間のインキュベーション後、新鮮な培地を加えた。７２時間後に細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。ルシフェラーゼ活性は、ＳｐｅｃｔｒａｍａｘＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼ）上で、５７０ｎｍで相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として測定した。中和試験のために、マウス血清の段階希釈液（１：４０、４倍、８回希釈）を、あらかじめ５０，０００ＲＬＵを目標にタイタリングしたさまざまな偽ウイルス株と混合した。ＲＬＵの測定値から、希釈ごとにトリプリケートの平均をとってシグモイド曲線を作成し、未感染細胞を１００％中和、ウイルスのみを形質導入した細胞を０％中和とし、５０％中和力価（ＩＣ５０）を算出した。
【0055】
結果
中和アッセイの結果は図１に示す。リン酸アルミニウムを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（０．１および１μｇ／マウス）は、組換えタンパク質（０．１および１μｇ／マウス）のみよりも優れた中和を誘発した。これらのデータは、リン酸アルミニウムが、コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチンの抗原であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質の免疫原性を有意に高めることを示している。
中和アッセイの結果は図１に示す。リン酸アルミニウムを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（０．１および１μｇ／マウス）は、組換えタンパク質（０．１および１μｇ／マウス）のみよりも優れた中和を誘発した。これらのデータは、リン酸アルミニウムが、コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチンの抗原であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質の免疫原性を有意に高めることを示している。
【0056】
Ｂ．予備試験２：ＣｐＧと水酸化アルミニウムの組み合わせを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質
材料および方法
マウスの免疫化。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、台湾）（Ｎ＝６／群）に、０および３週目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質をワクチン接種した。ＰＢＳで希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（終濃度が１０または５０μｇ／ｍＬ）を、ＣｐＧ１０１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ）、水酸化アルミニウム（終濃度が０．５ｍｇアルミニウム／ｍＬ）、またはＣｐＧ１０１８（終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ）と水酸化アルミニウム（終濃度が０．５ｍｇアルミニウム／ｍＬ）の組み合わせのそれぞれと混合した。１００μＬ（各後肢に５０μＬ）をマウスの筋肉内に接種した。最終免疫化の２週間後に血清を採取し、抗体応答を測定した。
材料および方法
マウスの免疫化。６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、台湾）（Ｎ＝６／群）に、０および３週目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質をワクチン接種した。ＰＢＳで希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（終濃度が１０または５０μｇ／ｍＬ）を、ＣｐＧ１０１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）（終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ）、水酸化アルミニウム（終濃度が０．５ｍｇアルミニウム／ｍＬ）、またはＣｐＧ１０１８（終濃度が０．１ｍｇ／ｍＬ）と水酸化アルミニウム（終濃度が０．５ｍｇアルミニウム／ｍＬ）の組み合わせのそれぞれと混合した。１００μＬ（各後肢に５０μＬ）をマウスの筋肉内に接種した。最終免疫化の２週間後に血清を採取し、抗体応答を測定した。
【0057】
偽ウイルスの作製、偽ウイルスの感染力、および中和アッセイ。方法はセクションＡに記載する。
【0058】
結果
中和試験の結果は図２に示す。ＣｐＧと水酸化アルミニウムの組み合わせを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質は、低用量（１μｇ／マウス）と高用量（５μｇ／マウス）の両方で、最高の中和活性を誘発した。加えて、水酸化アルミニウムのみを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（１μｇ／マウス）は、ＣｐＧのみを用いて調製した組換えタンパク質（１および５μｇ／マウス）よりも優れた中和を誘発した。ＣｐＧのみを用いて調製した組換えタンパク質は、用量依存的に中和活性を誘発した。これらのデータは、ＣｐＧおよび／または水酸化アルミニウムが、コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチンの抗原であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質の免疫原性を有意に高めることを示している。
中和試験の結果は図２に示す。ＣｐＧと水酸化アルミニウムの組み合わせを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質は、低用量（１μｇ／マウス）と高用量（５μｇ／マウス）の両方で、最高の中和活性を誘発した。加えて、水酸化アルミニウムのみを用いて調製したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質（１μｇ／マウス）は、ＣｐＧのみを用いて調製した組換えタンパク質（１および５μｇ／マウス）よりも優れた中和を誘発した。ＣｐＧのみを用いて調製した組換えタンパク質は、用量依存的に中和活性を誘発した。これらのデータは、ＣｐＧおよび／または水酸化アルミニウムが、コロナウイルス疾患（ＣＯＶＩＤ－１９）に対するワクチンの抗原であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐ組換えタンパク質の免疫原性を有意に高めることを示している。
【0059】
Ｃ．アジュバント化した安定化前融合ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質抗原の作製
材料および方法
偽ウイルスの作製および滴定。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを作製するために、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて、全長野生型武漢Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を発現するプラスミドを、パッケージングプラスミドおよびレポータープラスミドｐＣＭＶΔ８．９１およびｐＬＡＳ２ｗ．ＦＬｕｃ．Ｐｐｕｒｏ（ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。部位特異的突然変異誘発を用いて、２３４０３の位置（武漢Ｈｕ－１参考株）のヌクレオチドをＡからＧに置き換えてＤ６１４Ｇ変異株を作製した。偽ウイルスは、ｐ２０１９－ｎＣｏＶ スパイクを除去して作製した（ＷＴ）。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収し、ろ過して－８０℃で凍結した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型レンチウイルスの形質導入単位（ＴＵ）を、レンチウイルスの限界希釈法により、細胞生存率アッセイを用いて推定した。簡単に述べると、ヒトＡＣＥ２遺伝子を安定発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、レンチウイルス形質導入の１日前に９６ウェルプレートに播種した。偽ウイルスのタイタリングのために、さまざまな量の偽ウイルスをポリブレン含有培地に添加した。９６ウェルプレートで、１１００×ｇ、３７℃で３０分間、スピン感染を行った。細胞を３７℃で１６時間インキュベートした後、ウイルスとポリブレンを含む培地を除去し、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含む新鮮な完全ＤＭＥＭに交換した。ピューロマイシンで４８時間処理した後、培地を除去し、製造指示書に従って１０％ＡｌａｒｍａＢｌｕｅ試薬を用いて細胞生存率を検出した。未感染細胞（ピューロマイシン処理なし）の生存率を１００％として設定した。希釈したウイルス用量に対する生存細胞をプロットして、ウイルス力価（形質導入単位）を決定した。
材料および方法
偽ウイルスの作製および滴定。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルスを作製するために、ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて、全長野生型武漢Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を発現するプラスミドを、パッケージングプラスミドおよびレポータープラスミドｐＣＭＶΔ８．９１およびｐＬＡＳ２ｗ．ＦＬｕｃ．Ｐｐｕｒｏ（ＲＮＡｉ Ｃｏｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。部位特異的突然変異誘発を用いて、２３４０３の位置（武漢Ｈｕ－１参考株）のヌクレオチドをＡからＧに置き換えてＤ６１４Ｇ変異株を作製した。偽ウイルスは、ｐ２０１９－ｎＣｏＶ スパイクを除去して作製した（ＷＴ）。トランスフェクションの７２時間後に上清を回収し、ろ過して－８０℃で凍結した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽型レンチウイルスの形質導入単位（ＴＵ）を、レンチウイルスの限界希釈法により、細胞生存率アッセイを用いて推定した。簡単に述べると、ヒトＡＣＥ２遺伝子を安定発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、レンチウイルス形質導入の１日前に９６ウェルプレートに播種した。偽ウイルスのタイタリングのために、さまざまな量の偽ウイルスをポリブレン含有培地に添加した。９６ウェルプレートで、１１００×ｇ、３７℃で３０分間、スピン感染を行った。細胞を３７℃で１６時間インキュベートした後、ウイルスとポリブレンを含む培地を除去し、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを含む新鮮な完全ＤＭＥＭに交換した。ピューロマイシンで４８時間処理した後、培地を除去し、製造指示書に従って１０％ＡｌａｒｍａＢｌｕｅ試薬を用いて細胞生存率を検出した。未感染細胞（ピューロマイシン処理なし）の生存率を１００％として設定した。希釈したウイルス用量に対する生存細胞をプロットして、ウイルス力価（形質導入単位）を決定した。
【0060】
偽ウイルスベースの中和アッセイ。ＨＥＫ２９３－ｈＡｃｅ２細胞（２×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルホワイトＩｓｏＰｌａｔｅに播種し、一晩インキュベートした。血清は５６℃で３０分間加熱して補体を不活性化し、２％ＦＢＳを補充したＭＥＭで２０倍の初期希釈で希釈した後に、２倍段階希釈を行った（計８回の希釈ステップで最終希釈率１：５１２０）。希釈した血清は等量の偽ウイルス（１０００ＴＵ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を入れたプレートに添加した。１時間インキュベートした後、培地を５０μＬの新鮮な培地に交換した。翌日、培地を１００μＬの新鮮な培地に交換した。感染の７２時間後に細胞を溶解し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。ルシフェラーゼ活性は、Ｔｅｃａｎ ｉ－ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ５００）で検出した。未感染細胞を１００％中和、ウイルスのみを形質導入した細胞を０％中和とし、５０％および９０％阻害希釈倍率（ＩＤ５０およびＩＤ９０）を算出した。ＩＤ５０力価が検出上限で常に飽和している場合、ＩＤ９０力価が有用であることから、逆数ＩＤ５０とＩＤ９０の幾何平均力価（ＧＭＴ）を求めた。
【0061】
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の中和。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いた中和アッセイは、以前に報告されているように（非特許文献１）行った。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。血清は５６℃で３０分間加熱して補体を不活性化し、無血清ＭＥＭで２０倍の初期希釈で希釈し、次いでさらに２倍段階希釈を行って、計１１回の希釈ステップで最終希釈率１：４０，９６０とした。希釈した血清は等量のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと１００ＴＣＩＤ５０／５０μＬ（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＣＧＭＨ－ＣＧＵ－０１／２０２０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＴ１９２７５９）で混合し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、血清－ウイルス混合物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞と共に９６ウェルプレートに添加し、２％ＦＢＳを添加したＭＥＭで、３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルに４％ホルマリンを添加して１０分間細胞を固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色して可視化した。結果は、ＩＤ５０力価のｌｏｇ５０％エンドポイントとＩＤ９０力価のｌｏｇ９０％エンドポイントについてＲｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法で算出した。
【0062】
マウスの免疫化。雌のＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７ＢＬ／６マウスをＡｃａｄｅｍｉａ ＳｉｎｉｃａのＮａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台湾）およびＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．から入手した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－２Ｐタンパク質を等量のＣｐＧ１０１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、水酸化アルミニウム、ＰＢＳ、またはＣｐＧ１０１８＋水酸化アルミニウムのいずれかと混合して、抗原を調製した。６～９週齢のマウスは、以前に説明されているように（非特許文献２）３週間の間隔を空けて２回（マウスの左右大腿四頭筋の筋肉内にそれぞれ５０μＬ）免疫した。血清総抗Ｓ ＩｇＧおよび抗ＲＢＤ ＩｇＧ力価は、それぞれＳ－２Ｐ抗原、およびＲＢＤ領域を含むＳタンパク質の大腸菌発現断片を塗布したカスタム９６ウェルプレートを用いた直接ＥＬＩＳＡ法により検出した。
【0063】
サイトカインアッセイ。以前に説明されているように（非特許文献３）、マウスは２回目注射の２週間後に安楽死させ、脾細胞を単離し、Ｓ－２Ｐタンパク質（２μｇ／ウェル）で刺激した。ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－５の検出のために、９６ウェルマイクロプレートから培養上清を回収し、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ－γ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、Ｍｏｕｓｅ ＩＬ－４ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ、およびＭｏｕｓｅ ＩＬ－５ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いてＥＬＩＳＡでサイトカインのレベルを分析した。ＯＤ４５０値はＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。
【0064】
Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットにおける単回および反復筋肉内注射（ＩＭ）の用量設定試験。Ｃｒｌ：ＣＤ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．から入手した。動物実験は、台湾のＴＦＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．のＴｅｓｔｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙで実施した。６～８週齢のＳＤラットは、１５００μｇのＣｐＧ１０１８のみ、または７５０μｇのＣｐＧ１０１８と３７５μｇの水酸化アルミニウムの組み合わせでアジュバント化した５、２５、または５０μｇのＳ－２Ｐで免疫した。各ラットには、１日目（単回投与試験）および１５日目（反復投与試験）に試験物質またはビヒクル対照を筋肉内投与（０．２５ｍＬ／部位、大腿四頭筋の２部位）した。観察期間は１４日間（単回投与試験）および２８日間（反復投与試験）であった。評価項目は、臨床症状、局所刺激性試験、瀕死／死亡率、体温、体重、および生存期間中の摂餌量とした。血液試料を採取し、凝固検査などの血液学的検査および血液生化学検査を行った。ラットはすべて安楽死させ、剖検して肉眼的病変の検査、臓器重量、ならびに注射部位および肺の病理組織学的評価を行った。
【0065】
統計解析。中和アッセイでは、幾何平均力価はバーの高さで表し、９５％信頼区間はエラーバーで表した。サイトカインおよびラットのデータでは、バーまたは記号の高さは平均値を示し、ＳＤはエラーバーで表している。点線は検出下限と検出上限を表す。統計解析にはＰｒｉｓｍ６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ）の解析パッケージを使用した。データは、アジュバントが異なるＳ－２Ｐを同じ用量レベルで、または同じアジュバント系を異なる抗原用量で比較した。３つ以上の実験群間のノンパラメトリック検定には、補正したＤｕｎｎの多重比較検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを使用した。２群間の比較にはＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を用いた。抗体力価と中和力価の相関には、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数を用いた。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0066】
結果
ＣｐＧ１０１８と水酸化アルミニウムでアジュバント化したＳ－２Ｐによる強力な中和抗体の誘導。臨床試験や商業生産のために安定したクローンが確立できるよう、ＥｘｐｉＣＨＯシステムをＳ－２Ｐ抗原の発現系として使用した。ＣＨＯ細胞で産生したＳ－２Ｐタンパク質とその構造は、クライオ電子顕微鏡下で典型的なスパイク三量体を示し、２９３で発現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のそれと似ており（非特許文献４）、ＣＨＯ細胞がＳ－２Ｐの産生に適していることが示唆された。次に、Ｔｈ１偏向ＣｐＧ１０１８の臨床応用の可能性を検討した。水酸化アルミニウム（以下、ミョウバンと略記する）は、ＣｐＧ１０１８と組み合わせると、Ｔｈ１応答を誘導する特性を保持しながらも、ＣｐＧアジュバントの効力を増強する特徴があることから、ＣｐＧ１０１８と共に試験した（非特許文献５）。偽ウイルス中和アッセイは、初回注射の３週間後または２回目注射の２週間後に採取した血清で実施した。初回注射の３週間後に、ＣｐＧ１０１８とミョウバンを添加した１および５μｇのＳ－２Ｐの両方でマウスを免疫したとき、中和活性がすでに観察された。２回目注射の２週間後に、ＣｐＧ１０１８、ミョウバン、およびＣｐＧ１０１８とミョウバンの両方でアジュバント化した１μｇのＳ－２Ｐを用いた免疫で、それぞれ２４５、３１０９、および５１２０の５０％逆数阻害希釈倍率（ＩＤ５０）ＧＭＴが得られた（図３）。同様の傾向は、ＢＡＬＢ／ｃ（図３）およびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方において、５μｇのＳ－２Ｐで観察された。
ＣｐＧ１０１８と水酸化アルミニウムでアジュバント化したＳ－２Ｐによる強力な中和抗体の誘導。臨床試験や商業生産のために安定したクローンが確立できるよう、ＥｘｐｉＣＨＯシステムをＳ－２Ｐ抗原の発現系として使用した。ＣＨＯ細胞で産生したＳ－２Ｐタンパク質とその構造は、クライオ電子顕微鏡下で典型的なスパイク三量体を示し、２９３で発現したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質のそれと似ており（非特許文献４）、ＣＨＯ細胞がＳ－２Ｐの産生に適していることが示唆された。次に、Ｔｈ１偏向ＣｐＧ１０１８の臨床応用の可能性を検討した。水酸化アルミニウム（以下、ミョウバンと略記する）は、ＣｐＧ１０１８と組み合わせると、Ｔｈ１応答を誘導する特性を保持しながらも、ＣｐＧアジュバントの効力を増強する特徴があることから、ＣｐＧ１０１８と共に試験した（非特許文献５）。偽ウイルス中和アッセイは、初回注射の３週間後または２回目注射の２週間後に採取した血清で実施した。初回注射の３週間後に、ＣｐＧ１０１８とミョウバンを添加した１および５μｇのＳ－２Ｐの両方でマウスを免疫したとき、中和活性がすでに観察された。２回目注射の２週間後に、ＣｐＧ１０１８、ミョウバン、およびＣｐＧ１０１８とミョウバンの両方でアジュバント化した１μｇのＳ－２Ｐを用いた免疫で、それぞれ２４５、３１０９、および５１２０の５０％逆数阻害希釈倍率（ＩＤ５０）ＧＭＴが得られた（図３）。同様の傾向は、ＢＡＬＢ／ｃ（図３）およびＣ５７ＢＬ／６マウスの両方において、５μｇのＳ－２Ｐで観察された。
【0067】
次いで、これらのマウスの血清を抗Ｓ ＩｇＧの量について調べた。ＣｐＧ１０１８とミョウバンを組み合わせると、ＣｐＧ１０１８のみの場合と比較して、抗Ｓ ＩｇＧの力価が有意に高まった（図４）。Ｓタンパク質の重要な受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に対する抗体の活性を確認するために、免疫血清で抗ＲＢＤ ＩｇＧを調べたところ、結果は、ＣｐＧ１０１８とミョウバンの両方と組み合わせたＳ－２Ｐにおける抗Ｓ ＩｇＧと同様であり、最も高いＩｇＧ力価を誘導した。抗Ｓ ＩｇＧと抗ＲＢＤ ＩｇＧ力価の間には、Ｓｐｅａｒｍａｎの順位相関係数０．６４８６で示されるように、中程度の相関があった。野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和能について、中和アッセイで免疫血清をさらに試験した。Ｓ－２Ｐは、偽ウイルスよりも低い効力ではあるが、１μｇの濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害できた（図３、５）。ＣｐＧ１０１８、ミョウバン、およびＣｐＧ１０１８とミョウバン両方の存在下での１μｇのＳ－２Ｐの逆数ＩＤ５０ ＧＭＴは、それぞれ約６０、２５０、および１５００であった（図５）。現在支配的なＤ６１４Ｇ変異株スパイクを有する偽ウイルスも作製したところ、ＣｐＧ１０１８とミョウバンを添加したＳ－２Ｐで免疫したマウスの中和抗体は、スパイクタンパク質の野生型Ｄ６１４および変異株Ｄ６１４Ｇバージョンを有する偽ウイルスの両方に対して有効であった（図６）。野生型ウイルスと偽ウイルスの中和力価および総抗Ｓ ＩｇＧ力価は、いずれもＳｐｅａｒｍａｎの順位相関係数が０．８超と、高い相関があることが分かった。
【0068】
ＣｐＧ１０１８はＴｈ１免疫を誘導した。ＣｐＧ１０１８がワクチン－アジュバント系でＴｈ１応答を誘導できるかを確認するために、ミョウバン、ＣｐＧ１０１８、またはこの２つの組み合わせを添加したＳ－２Ｐで免疫したマウスの脾細胞でＴｈ１応答とＴｈ２応答に関与するサイトカインを測定した。予想通り、ミョウバンでアジュバント化したＳ－２Ｐは、Ｔｈ１応答の代表的なサイトカインであるＩＦＮ－γとＩＬ－２を限定的に誘導した。これに対し、高抗原用量とＣｐＧ１０１８およびミョウバンの組み合わせでは、ＩＦＮ－γとＩＬ－２の有意な増加が最も強く検出された。Ｔｈ２応答については、ミョウバンとＳ－２Ｐの存在下でＩＬ－４、ＩＬ－５、およびＩＬ－６のレベルが増加したのに対し、ミョウバンにＣｐＧ１０１８を追加すると、ＩＬ－５およびＩＬ－６のレベルが抑制された。ＩＦＮ－γ／ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ／ＩＬ－５、およびＩＦＮ－γ／ＩＬ－６比はＴｈ１偏向応答を強く示しており、Ｇ１０１８とミョウバンを組み合わせたＳ－２Ｐの存在下では、それぞれ約３６、１３０、２倍増加した（図７）。これらの結果は、高い抗体レベルを保持しながら、細胞媒介応答をＴｈ１応答に向ける場合に、ＣｐＧ１０１８の効果はミョウバンよりも優れていることを示唆した。
【0069】
Ｓ－２Ｐはラットに全身性の有害作用をもたらさなかった。ワクチン候補の安全性および潜在的な毒性を評価するために、１５００μｇのＣｐＧ１０１８、または７５０μｇのＣｐＧ１０１８と３７５μｇの水酸化アルミニウムの組み合わせでアジュバント化した５、２５、または５０μｇのＳ－２Ｐを、単回投与試験および反復投与試験でＳＤラットに投与した。単回投与では、雌雄とも、Ｓ－２Ｐ（アジュバント添加および非添加）に起因する可能性のある死亡、臨床症状異常、体重変化、体温、および摂餌量の差は認められなかった。投与４時間後または２４時間後の体温上昇が、単回投与試験および反復投与試験で雌雄共に認められたが、これらの体温変化は軽度であり、対照群（ＰＢＳ）を含むすべての投与群で雌雄共に４８時間後には回復した。雄ラット１匹を除く、単回投与および反復投与の大部分の雌雄ラットで臓器に肉眼的病変は観察されず、この１匹についても、ワクチンと無関係と判断された。結論として、ＣｐＧ１０１８、またはＣｐＧ１０１８とミョウバンの組み合わせをアジュバントとして添加したＳ－２Ｐタンパク質をＳＤラットに１回または２回筋肉内投与しても、全身性の有害作用は発生しなかった。
【0070】
結果から、マウスでは、ＣｐＧ１０１８およびミョウバンでアジュバント化した前融合スパイクタンパク質（Ｓ－２Ｐ）からなるサブユニットワクチンを２回注射すると、野生型およびＤ６１４Ｇ変異株スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスと、野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の両方に対する強力な中和活性を誘導する上で有効であったことが示される。Ｓ－２ＰとＣｐＧ１０１８およびミョウバンとの組み合わせは、マウスでは中和抗体レベルが高いＴｈ１優位の免疫応答を誘発し、ラットでは重大な有害作用は示されなかった。したがって、本発明者らは、本実施例において、ミョウバンと組み合わせてアジュバントのＣｐＧ１０１８を添加したＳ－２Ｐが、変異株ウイルスの交差中和を示す高い抗体量を保持しながらも、野生型ウイルス感染を防ぐ強力なＴｈ１偏向免疫応答を誘導することを実証した。これにより、本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物は、世界的なＣＯＶＩＤ－１９パンデミックの負担を軽減する上で、理想的なワクチンの役割を果たす。
【実施例3】
【0071】
ハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する免疫原性組成物によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露からの保護
材料および方法
偽ウイルスベースの中和アッセイおよびＩｇＧ ＥＬＩＳＡ。武漢Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するレンチウイルスを構築し、実施例２に記載するように中和アッセイを実施した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３－ｈＡＣＥ２細胞を９６ウェルホワイトＩｓｏＰｌａｔｅに播種し、一晩インキュベートした。ワクチン接種したハムスターと未接種のハムスターの血清を加熱不活性化し、２％ＦＢＳを補充したＭＥＭで２０倍の初期希釈で希釈した後に、２倍段階希釈を行って、計８回の希釈ステップで最終希釈率を１：５１２０とした。希釈した血清は等量の偽ウイルス（１０００ＴＵ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を入れたプレートに添加した。感染の７２時間後に細胞を溶解し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。未感染細胞を１００％中和、ウイルスのみを形質導入した細胞を０％中和とし、５０％および９０％阻害希釈倍率（ＩＤ５０およびＩＤ９０）を算出した。血清総抗Ｓ ＩｇＧ力価は、Ｓ－２Ｐ抗原を塗布したカスタム９６ウェルプレートを用いた直接ＥＬＩＳＡ法により検出した。
材料および方法
偽ウイルスベースの中和アッセイおよびＩｇＧ ＥＬＩＳＡ。武漢Ｈｕ－１株ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するレンチウイルスを構築し、実施例２に記載するように中和アッセイを実施した。簡潔に説明すると、ＨＥＫ２９３－ｈＡＣＥ２細胞を９６ウェルホワイトＩｓｏＰｌａｔｅに播種し、一晩インキュベートした。ワクチン接種したハムスターと未接種のハムスターの血清を加熱不活性化し、２％ＦＢＳを補充したＭＥＭで２０倍の初期希釈で希釈した後に、２倍段階希釈を行って、計８回の希釈ステップで最終希釈率を１：５１２０とした。希釈した血清は等量の偽ウイルス（１０００ＴＵ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートした後、細胞を入れたプレートに添加した。感染の７２時間後に細胞を溶解し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。未感染細胞を１００％中和、ウイルスのみを形質導入した細胞を０％中和とし、５０％および９０％阻害希釈倍率（ＩＤ５０およびＩＤ９０）を算出した。血清総抗Ｓ ＩｇＧ力価は、Ｓ－２Ｐ抗原を塗布したカスタム９６ウェルプレートを用いた直接ＥＬＩＳＡ法により検出した。
【0072】
ハムスターの免疫化と曝露。試験開始時に６～９週齢の雌のゴールデンシリアンハムスターを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（台湾台北市）から入手した。異腹子のハムスターを無作為に４群に分け（各群ｎ＝１０）、ビヒクル対照（ＰＢＳ）、１５０μｇのＣｐＧ１０１８および７５μｇの水酸化アルミニウム（ミョウバン）、またはアジュバントのみでアジュバント化した１または５μｇのＳ－２Ｐタンパク質を、３週間の間隔を空けて２回、筋肉内注射でワクチン接種した。２回目の免疫化の２週間後にハムスターの顎下静脈から採血し、中和抗体の存在を確認した。２回目の免疫化の４週間後に、１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＴＣＤＣ＃４（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／４／２０２０、ＧＩＳＡＩＤアクセッション番号：ＥＰＩ＿ＩＳＬ＿４１１９２７）を、各ハムスターにつき１００μＬの量で鼻腔内曝露した。ハムスターは２つのコホートに分け、曝露後３および６日目に安楽死させ、剖検と組織試料の採取を行った。各ハムスターの体重と生存率は感染後毎日記録した。ハムスターは曝露後３および６日目に二酸化炭素で安楽死させた。右肺はウイルス量測定のために採取した（ＲＮＡ力価およびＴＣＩＤ５０アッセイ）。左肺は、病理組織学的検査のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。
【0073】
細胞培養感染アッセイによる肺組織中のウイルス力価の定量（ＴＣＩＤ５０）。ハムスターの肺の中葉、下葉、下大静脈葉を、ホモジナイザーを用いて２％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む６００μＬのＤＭＥＭ中でホモジナイズした。組織ホモジネートを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を生ウイルス滴定のために回収した。簡単に述べると、各試料の１０倍段階希釈液をＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層上に４回添加し、４日間インキュベートした。次いで、１０％ホルムアルデヒドで細胞を固定し、０．５％クリスタルバイオレットで２０分間染色した。プレートを水道水で洗浄し、感染をスコア化した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬはＲｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法により算出した（非特許文献６）。
【0074】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡ定量化のためのリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムのエンベロープ（Ｅ）遺伝子の２６，１４１～２６，２５３領域を標的とする特定のプライマーを使用し、ＴａｑＭａｎリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡレベルを測定した（非特許文献７）。順方向プライマーＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｆ１ ５’－ＡＣＡＧＧＴＡＣＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＧＴ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）と逆方向プライマーＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｒ２ ５’－ＡＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）に加えて、プローブＥ－Ｓａｒｂｅｃｏ－Ｐ１ ５’－ＦＡＭ－ＡＣＡＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＴＣＧ－ＢＢＱ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を使用した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツ）を用いて、製造指示書に従って、各肺試料から計３０μＬのＲＮＡ溶液を採取した。５μＬのＲＮＡ試料を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの計２５μＬ混合液に添加した。最終反応混合物は、順方向および逆方向プライマー４００ｎＭ、プローブ２００ｎＭ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）１．６ｍＭ、硫酸マグネシウム４ｍＭ、ＲＯＸ参照染料５０ｎＭ、および酵素混合液１μＬを含有していた。ワンステップＰＣＲプロトコルを使用し、以下のサイクル条件で実施した：第一鎖ｃＤＮＡ合成に５５℃１０分、続いて９４℃３分、次いで９４℃１５秒および５８℃３０秒の増幅サイクルを４５回。データはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）で収集し、算出した。１１３ｂｐの合成オリゴヌクレオチド断片をｑＰＣＲ標準として使用し、ウイルスゲノムのコピー数を推定した。オリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ＢｉｏＳｃｉ ａｎｄ Ｔｅｃｈ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（台湾台北市）で合成した。
【0075】
結果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス曝露モデルとしてのハムスター。Ｓ２－Ｐワクチンについて、ハムスターでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス曝露モデルを作製するために、初回試験を実施し、曝露試験に最適なウイルス用量を決定した。ワクチン未接種のハムスターに１０３、１０４、または１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種し、感染後３または６日目に安楽死させ、組織を採取した。１０３～１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後、ハムスターは用量依存的な体重減少を示した。１０３ＰＦＵを感染させたハムスターは体重が増加したのに対し、１０４および１０５ＰＦＵを感染させたハムスターは、感染後６日目（ｄｐｉ）に体重が次第に激しく減少した。しかし、１０３～１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターで３および６ｄｐｉに測定したウイルスゲノムＲＮＡのレベルとウイルス力価との間に有意な差は認められなかった。体重減少が生じなかった１０３ＰＦＵも含め、すべてのウイルス投与量で肺病理学的な上昇が見られた。また、肺病理学的スコアおよび肺ウイルス量にウイルス接種用量依存的な影響は認められなかった。そこで、臨床症状と接種のウイルス力価のバランスが適当であった１０４ＰＦＵをウイルス曝露試験に使用した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス曝露モデルとしてのハムスター。Ｓ２－Ｐワクチンについて、ハムスターでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス曝露モデルを作製するために、初回試験を実施し、曝露試験に最適なウイルス用量を決定した。ワクチン未接種のハムスターに１０３、１０４、または１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種し、感染後３または６日目に安楽死させ、組織を採取した。１０３～１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後、ハムスターは用量依存的な体重減少を示した。１０３ＰＦＵを感染させたハムスターは体重が増加したのに対し、１０４および１０５ＰＦＵを感染させたハムスターは、感染後６日目（ｄｐｉ）に体重が次第に激しく減少した。しかし、１０３～１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染ハムスターで３および６ｄｐｉに測定したウイルスゲノムＲＮＡのレベルとウイルス力価との間に有意な差は認められなかった。体重減少が生じなかった１０３ＰＦＵも含め、すべてのウイルス投与量で肺病理学的な上昇が見られた。また、肺病理学的スコアおよび肺ウイルス量にウイルス接種用量依存的な影響は認められなかった。そこで、臨床症状と接種のウイルス力価のバランスが適当であった１０４ＰＦＵをウイルス曝露試験に使用した。
【0076】
高レベルの中和抗体を誘導したハムスターへの、ＣｐＧ１０１８と水酸化アルミニウムでアジュバント化したＳ－２Ｐの投与。ハムスターは４群に分け、ビヒクル対照（ＰＢＳのみ）、アジュバントのみ、ＣｐＧ１０１８と水酸化アルミニウムを組み合わせた低用量（ＬＤ）または高用量（ＨＤ）のＳ－２Ｐ（Ｓ－２Ｐ＋ＣｐＧ１０１８＋ミョウバン）のいずれかを２１日間隔で２回免疫した。ワクチン接種後、４群間で体重変化に差は認められなかった。２回目の免疫化の１４日後、ＬＤ群とＨＤ群の両方で、９０％阻害希釈倍率（ＩＤ９０）幾何平均力価（ＧＭＴ）がそれぞれ２，２２６および１，７８３と、高レベルの中和抗体力価が認められた（図８Ａ）。抗Ｓ ＩｇＧ抗体レベルは、いくつかの個別検体が検出の上限に達するほど高く、ＬＤ群およびＨＤ群のＧＭＴはそれぞれ１，４９２，９５９および１，１９８，３１５であった（図８Ｂ）。全体的には、低用量でも、Ｓ－２Ｐ＋ＣｐＧ１０１８＋ミョウバンはハムスターで強力な免疫原性を誘導した。
【0077】
アジュバントＳ－２ＰはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２曝露後に臨床症状およびウイルス負荷からハムスターを保護した。２回目の免疫化の４週間後、ハムスターを１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに曝露し、感染後３または６日目（ｄｐｉ）まで体重を測定した。ハムスター群は３または６ｄｐｉに屠殺し、ウイルス量の測定と病理組織学的解析を行った。ＬＤおよびＨＤ接種群は、ウイルス曝露後３または６日目まで体重減少を示さず、逆に６ｄｐｉ時点で平均体重がそれぞれ５および３．８ｇ増加した。両方のワクチン接種群で６ｄｐｉに保護効果が最も顕著であったのに対し、ビヒクル対照およびアジュバント単独群は著しい体重減少を示した。ウイルスＲＮＡおよびＴＣＩＤ５０アッセイで測定した肺ウイルス量から、ワクチンを接種したハムスターで３ｄｐｉにウイルスＲＮＡとウイルス力価の両方が有意に減少し、６ｄｐｉには検出下限以下に低下したことが示された（図９Ａ、９Ｂ）。ウイルス量、特にＴＣＩＤ５０で測定したウイルス力価は、ハムスターの自然免疫応答により、６ｄｐｉに対照群およびアジュバント単独群で著しく減少したことに注意されたい（図９Ａ、９Ｂ）。肺切片を分析し、病理学的スコアリングをまとめた（図１０）。３ｄｐｉでは対照群と実験群との間に差は認められないが、６ｄｐｉには、ビヒクル対照群とアジュバント単独群で、ＨＤ抗原／アジュバント免疫群と比較して、広範な免疫細胞浸潤やびまん性肺胞損傷などの肺病理が有意に増加した（図１０）。これらの結果から、Ｓ－２Ｐ＋ＣｐＧ１０１８＋ミョウバンは、感染したハムスターにおいて、肺のウイルス量を抑制し、体重減少および肺病理を防ぐことができる強固な免疫応答を誘導することが示された。
【0078】
Ｓ－２Ｐ＋ＣｐＧ１０１８＋ミョウバン免疫群のハムスターはいずれも、肺病理が有意に減少し、保護されていた（概ね最小から軽度、ＬＤ群およびＨＤ群の平均スコアは１．７２）のに対し、対照群では６ｄｐｉにハムスターの肺にウイルスによるびまん性肺胞損傷が認められた（中程度から重度で、ビヒクル群およびアジュバント対照群の平均スコアは４．０９）。本試験の意義は、ｉｎ ｖｉｖｏの有効性だけでなく、安全性を実証することにもある。ウイルス曝露試験により、ワクチン候補による疾患増強リスクの評価が可能となった。免疫群の病理組織学的スコアは非曝露動物と差がなく、ワクチンによる病理の増強がないことを示している。本実施例の試験の結果は、ワクチン候補の臨床開発の進行を支持する多くのデータを提供するものである。
【実施例4】
【0079】
ＣｐＧでアジュバント化したＳ－２Ｐサブユニットワクチン「ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１」のヒトにおける安全性および免疫原性
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニットワクチン（すなわち、本発明の免疫原性組成物）の安全性および免疫原性を評価するための、健康なヒト被験者を対象とした第Ｉ相試験である。本明細書で「Ｓ－２Ｐ＋ＣｐＧ１０１８＋ミョウバン」または「ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１」と称されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニットワクチンについては、実施例１に詳しく説明している。
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニットワクチン（すなわち、本発明の免疫原性組成物）の安全性および免疫原性を評価するための、健康なヒト被験者を対象とした第Ｉ相試験である。本明細書で「Ｓ－２Ｐ＋ＣｐＧ１０１８＋ミョウバン」または「ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１」と称されているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２サブユニットワクチンについては、実施例１に詳しく説明している。
【0080】
ワクチン。ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１は、アジュバントとしてＣｐＧ１０１８と水酸化アルミニウムを添加したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質を３つの用量で調製した。ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンはそれぞれ、７５０μｇのＣｐＧ１０１８および３７５μｇ（Ａｌ換算重量）の水酸化アルミニウムでアジュバント化した５、１５、または２５μｇのＳ－２Ｐを含み、１回０．５ｍＬを筋肉内（ＩＭ）注射で投与した。
【0081】
参加者。本試験では被験者４５名の組み入れを目指した。２０～４９歳の健康な成人を適格参加者とした。適格性は、病歴、身体検査、臨床検査、および治験責任医師の臨床的判断に基づいて決定した。除外基準には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１または２ウイルスへの既知の潜在的な曝露歴、他のＣＯＶＩＤ－１９ワクチンの接種、免疫機能障害、自己免疫疾患、コントロール不良のＨＩＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶ感染の履歴、自己抗体検査異常、初回投与前２日以内の発熱性または急性疾患、および初回投与前１４日以内の急性呼吸器疾患が含まれていた。
【0082】
試験デザイン。本試験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチンＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１の安全性および免疫原性を評価する第Ｉ相前向き非盲検単施設試験である。本試験では、２０～４９歳の参加者を３群に分けた、用量漸増試験であった。各サブフェーズは参加者１５名からなる。投与量はＳ－２Ｐタンパク質５、１５、および２５μｇの３種類とし、それぞれコホート１ａ、１ｂ、および１ｃとした。ワクチン接種スケジュールは、２８日の間隔を空けて２回（１日目と２９日目）、利き腕ではない腕の三角筋にＩＭ注射で投与するものとした。
【0083】
コホート１ａ：センチネル参加者４名を採用して５μｇのＳ－２Ｐを含むワクチンを投与し、ワクチンの予備安全性データを評価した。センチネル参加者４名への初回投与後７日以内にグレード３以上の有害事象（ＡＥ）または重篤な有害事象（ＳＡＥ）が起こらなかった場合、フェーズ１ａおよびフェーズ１ｂで残りの参加者への投与に進むものとした。
【0084】
コホート１ｂ：別のセンチネル参加者４名を登録して１５μｇのＳ－２Ｐを含むワクチンを投与した。センチネル参加者４名への初回投与後７日以内にグレード３以上のＡＥまたはＳＡＥが起こらなかった場合、フェーズ１ｂおよびフェーズ１ｃで残りの参加者への投与に進むものとした。
【0085】
コホート１ｃ：別のセンチネル参加者４名を登録して２５μｇのＳ－２Ｐを含むワクチンを投与するものとした。センチネル参加者４名への初回投与後７日以内にグレード３以上のＡＥまたはＳＡＥが起こらなかった場合、フェーズ１ｃで残りの参加者への投与に進むものとした。
【0086】
ワクチン接種の前後にバイタルサインおよび心電図（ＥＣＧ）を実施した。参加者は各投与後に少なくとも３０分間観察を行って、急激なＡＥがないか確認した。また、各投与後７日間、参加者用日誌カードに、非自発報告による局所（疼痛、紅斑、腫脹／硬結）および全身（発熱、筋肉痛、倦怠／疲労、悪心／嘔吐、下痢）ＡＥを記録するよう求めた。自発報告によるＡＥは、各投与後２８日間報告を行い、他のすべてのＡＥ、ＳＡＥ、および特に注目すべき有害事象（ＡＥＳＩ）は、試験期間（約７ヵ月間）を通じて報告が行われた。血清試料を採取し、血液学的、生化学的、免疫学的評価を行った。
【0087】
免疫原性エンドポイントは、初回投与の１４日後（１５日目）と２８日後（２９日目）、２回目投与の１４日後（４３日目）と２８日後（５７日目）、さらに２回目投与の９０日後と１８０日後に中和抗体力価と結合抗体力価を評価するものとした。ＣＯＶＩＤ－１９回復患者３５名の回復期血清検体（Ｍｉｔｅｋ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｐａｎｅｌ １．１およびＣＯＶＩＤ－１９ Ｐａｎｅｌ １．４、Ａｃｃｅｓｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＬＬＣ、米国カリフォルニア州ビスタから入手）も検査した。細胞免疫応答は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔおよびＩＬ－４ ＥＬＩＳｐｏｔにより、２回目投与の２８日後に評価した。
【0088】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク特異的免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）：血清総抗スパイクＩｇＧ力価は、Ｓ－２Ｐ抗原を塗布したカスタム９６ウェルプレートを用いた直接酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）法により検出した。
【0089】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２偽ウイルス中和アッセイ：検査試料は段階希釈を行った（初期希釈率が１：２０、続いて２倍希釈、最終希釈率が１：２５６０）。希釈した血清は等量の偽ウイルス（１０００ＴＵ）と混合し、インキュベートした後、ＨＥＫ２９３－ｈＡｃｅ２細胞（１×１０４細胞／ウェル）を入れたプレートに添加した。細胞に侵入した偽ウイルスの量は、細胞の溶解および相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）の測定により算出した。未感染細胞を１００％中和、ウイルスを形質導入した細胞を０％中和として、５０％阻害希釈（濃度）力価（ＩＤ５０）を算出し、逆数ＩＤ５０幾何平均力価（ＧＭＴ）は両方とも求めた。
【0090】
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和アッセイ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ｈＣｏＶ－１９／Ｔａｉｗａｎ／ＣＧＭＨ－ＣＧＵ－０１／２０２０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＴ１９２７５９）は滴定してＴＣＩＤ５０を求め、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（２．５×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種してインキュベートした。血清は２倍希釈を行って最終希釈率を１：８１９２とし、希釈した血清は、１００ ＴＣＩＤ５０を含む等量のウイルス溶液と混合した。血清－ウイルス混合液はインキュベートした後に、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を入れたプレートに添加し、さらにインキュベートした。中和力価は、５０％の細胞変性効果を阻害できる最高希釈の逆数（ＣＰＥ ＮＴ５０）と定義し、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法を用いて算出した。比較対照として、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＮＩＢＳＣ、英国ポッターズ・バー）の参照血清試料２０／１３０を、同一の有効なアッセイを用いて分析した。
【0091】
細胞免疫応答。抗原特異的なＩＦＮ－γまたはＩＬ－４分泌スポット形成単位（ＳＦＵ）の数は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより決定した。凍結保存された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を急速解凍し、一晩静置した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｋｉｔ，Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン、ストックホルム）については１×１０５細胞／ウェル、またはＩＬ－４ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ Ｋｉｔ，Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン、ストックホルム）については２×１０５細胞／ウェルで細胞を分配した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質のＮ末端Ｓ１ドメインをカバーする、主に１１アミノ酸が重複した１５マー配列からなるペプチドのプールで細胞を刺激し（ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｐｒｏｔ＿Ｓ１，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、３７℃で２４～４８時間インキュベートした。ＣＤ３－２ｍＡｂで刺激した細胞を陽性対照とした。ＩＦＮ－γまたはＩＬ－４の放出はマニュアルに従って検出し、スポットはＣＴＬ自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダーを使用してカウントした。トリプリケートのペプチドプール刺激でカウントした平均ＳＦＵを算出し、陰性対照複製物（対照培地）の平均を差し引いて正規化した。結果は、ＰＢＭＣ １００万個当たりのＳＦＵとして表した。
【0092】
統計解析。安全性解析は、少なくとも１回分のワクチン投与を受けた全ワクチン接種群（ＴＶＧ）の集団で実施した。免疫原性エンドポイントには、抗原特異的免疫グロブリンの幾何平均力価（ＧＭＴ）および血清変換率（ＳＣＲ）、ならびに野生型ウイルスおよび偽ウイルス中和抗体力価が含まれていた。ＳＣＲは、ベースラインから、またはベースラインで検出されなかった場合は検出下限（ＬｏＤ）の半分から力価が４倍以上増加した参加者の割合と定義される。ＧＭＴとＳＣＲは、両側９５％ＣＩで表される。抗原特異的細胞免疫応答は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔおよびＩＬ－４ ＥＬＩＳｐｏｔにより決定した平均値で示される。
【0093】
結果
安全性。このデータカットオフ時点でＳＡＥもＡＥＳＩも発生していなかった。試験介入の変更や中断もなかった。非自発報告によるＡＥの発生は図１１にまとめる。最も多く報告された局所ＡＥは疼痛／圧痛（８０．０％）であり、全治療群で最も多く報告された全身ＡＥは倦怠／疲労（２８．９％）であった。２５μｇ投与群の倦怠／疲労１例を除き、局所および全身ＡＥのいずれも軽度であった。発熱した参加者はいなかった。初回および２回目投与後の非自発報告によるＡＥは同様であった。安全性臨床検査値の評価、心電図の解釈、およびその他の自発報告による有害事象から、特別な懸念は明らかにならなかった。
安全性。このデータカットオフ時点でＳＡＥもＡＥＳＩも発生していなかった。試験介入の変更や中断もなかった。非自発報告によるＡＥの発生は図１１にまとめる。最も多く報告された局所ＡＥは疼痛／圧痛（８０．０％）であり、全治療群で最も多く報告された全身ＡＥは倦怠／疲労（２８．９％）であった。２５μｇ投与群の倦怠／疲労１例を除き、局所および全身ＡＥのいずれも軽度であった。発熱した参加者はいなかった。初回および２回目投与後の非自発報告によるＡＥは同様であった。安全性臨床検査値の評価、心電図の解釈、およびその他の自発報告による有害事象から、特別な懸念は明らかにならなかった。
【0094】
体液性免疫応答。体液性免疫原性の結果は図１２Ａ～１２Ｃにまとめる。図１２Ａに示すように、Ｓタンパク質に対する結合ＩｇＧ力価は２回目投与後に急激に増加し、４３および５７日目までに全参加者で血清変換が生じた。ＧＭＴは、４３日目に５、１５、および２５μｇ投与群でそれぞれ７１７８．２（９５％ＣＩ：４２４０．３～１２１５１．７）、７７４６．１（９５％ＣＩ：５５３０．２～１０８４９．８）、１１２２０．６（９５％ＣＩ：８５９２．２９３～１４６５２．８４）の値でピークに達した。４３日目の５、１５、および２５μｇ投与群におけるＧＭＴレベルは、回復期血清検体のＧＭＴの３．３～５．１倍の範囲であった（２１７９．６、［９５％ＣＩ：１２４０．９～３８２８．４］）。
【0095】
図１２Ｂに示すように、ベースライン時のアッセイで、試験した血清濃度の下限（１：２０希釈）で検出可能な偽ウイルス中和力価（ＩＤ５０）を示した被験者はいなかった。４３日目の偽ウイルス中和力価（ＩＤ５０）は、５、１５、および２５μｇ投与群でそれぞれ５３８．５（９５％ＣＩ：２６１．９～１１０７．０）、９９３．１（９５％ＣＩ：６５５．０～１５０５．７）、および１９０５．８（９５％ＣＩ：１６０１．７～２２６７．８）のピークＧＭＴを示した。全参加者（１００％）で２回目投与後に血清変換が生じた。４３日目の５、１５、および２５μｇ投与群におけるＧＭＴレベルは、回復期血清検体のＧＭＴの１．２５～４．４倍の範囲であった（４３０．５、［９５％ＣＩ：２７４．９～６７４．０］）。
【0096】
野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体力価の結果は図１２Ｃにまとめる。ワクチン接種前のアッセイでは、検査した血清濃度の下限（１：８希釈）で検出可能な野生型ウイルス中和力価（ＮＴ５０）を示した被験者はいなかった。２回目投与投与後、１５および２５μｇ投与群の全参加者の血清試料で中和応答が確認された。４３日目のＧＭＴは、５、１５、および２５μｇ投与群でそれぞれ３３．３（９５％ＣＩ：１８．５～５９．９）、７６．３（９５％ＣＩ：５３．７～１０８．３）、および１６７．４（９５％ＣＩ：１２２．１～２２９．６）であった。５７日目のＧＭＴは、１５および２５μｇ投与群でそれぞれ５２．２（９５％ＣＩ：３７．９～７１．８）および８１．９（９５％ＣＩ：５５．８～１２０．２）と同程度であった。４３日目の５、１５、および２５μｇ投与群におけるＧＭＴレベルは、回復期血清検体のＧＭＴの０．８、１．８、および３．９倍の範囲であった（４２．７、［９５％ＣＩ：２６．４～６９．０］；力価は未検出から６３１．０の範囲）。１５および２５μｇ投与群の全参加者で４３日目と５７日目に血清変換が生じており、一部はＮＩＢＳＣ参照血清２０／１３０（２８１．８）と同程度であった。
【0097】
細胞免疫応答。細胞免疫応答の結果は図１３にまとめる。すべての参加者が、ベースライン時に最小限のＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞を有していた。５７日目までに、５、１５、および２５μｇのワクチン接種を受けた参加者で、細胞１００万個当たりそれぞれ平均１６１．３、８５．５、および９４．９個のＩＦＮ－γ分泌Ｔ細胞が観察された。すべての参加者が、ワクチン接種前に最小限のＩＬ－４分泌Ｔ細胞を有していた。５７日目までに、５、１５、および２５μｇのワクチン接種を受けた参加者で、細胞１００万個当たりそれぞれ平均２４．１、１６．０、および３１．３個のＩＬ－４分泌Ｔ細胞が観察された。ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１によって誘導された細胞免疫応答では、ＩＦＮ－γ産生細胞数がかなり増加しており、Ｔｈ１偏向免疫応答を示唆した。
【0098】
結論として、非自発報告による有害事象は大部分が軽度で類似していた。発熱を呈した被験者はなかった。２回目投与後、評価した３つの投与群のうち１５および２５μｇ投与群の両方が高い中和抗体応答を誘導し、すべての参加者で血清変換およびＴｈ１偏向Ｔ細胞免疫応答が認められた。したがって、ＣｐＧ１０１８および水酸化アルミニウムと組み合わせた１５μｇのＳ－２Ｐは、高い体液性免疫応答を誘発するのに十分であると判断された。結果は、ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンは忍容性が良好であり、強固な免疫応答を誘発し、開発をさらに進めるのに適していることも示している。
【実施例5】
【0099】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の懸念される変異株（ＶｏＣ）に対するＣｐＧ－アジュバントＳ－２Ｐサブユニットワクチン「ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１」の中和能力の評価
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックが始まって以降、定期的に変異株が検出されてきた。それらの中には、懸念される変異株（ＶｏＣ）と呼ばれる、抗体の認識および中和のための主要な標的である重要な受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に変異を有するものも多数発見されている。これらのＶｏＣのうち最も代表的なものは、いずれもスパイクＲＢＤにＮ５０１Ｙの変異を持つ、Ｂ．１．１．１．７（α変異株）、Ｂ．１．３５１（β変異株）、およびＰ１（γ変異株）である。これらの変異を有するＶｏＣは、モノクローナル抗体およびワクチン誘導抗体の中和能を低下させることが判明しており、このため現在の治療薬やワクチンが無効となる可能性がある（非特許文献８）。本実施例は、２つの供給源からの血清、すなわち動物毒性試験のラット血清、および第Ｉ相臨床試験のヒト血清を用いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶｏＣに対するＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンの中和能力の調査を含む試験である。
ＣＯＶＩＤ－１９パンデミックが始まって以降、定期的に変異株が検出されてきた。それらの中には、懸念される変異株（ＶｏＣ）と呼ばれる、抗体の認識および中和のための主要な標的である重要な受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に変異を有するものも多数発見されている。これらのＶｏＣのうち最も代表的なものは、いずれもスパイクＲＢＤにＮ５０１Ｙの変異を持つ、Ｂ．１．１．１．７（α変異株）、Ｂ．１．３５１（β変異株）、およびＰ１（γ変異株）である。これらの変異を有するＶｏＣは、モノクローナル抗体およびワクチン誘導抗体の中和能を低下させることが判明しており、このため現在の治療薬やワクチンが無効となる可能性がある（非特許文献８）。本実施例は、２つの供給源からの血清、すなわち動物毒性試験のラット血清、および第Ｉ相臨床試験のヒト血清を用いた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶｏＣに対するＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンの中和能力の調査を含む試験である。
【0100】
Ａ．ラットにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶｏＣに対するＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンの中和能力
材料および方法
動物実験。Ｃｒｌ：ＣＤ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（台湾台北市）から入手し、試験はＴＦＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．のＴｅｓｔｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ（台湾新北市）で実施した。ＳＤラットの免疫化は、実施例２のセクションＣに記載の通りに実施した。簡単に述べると、ラットは、１，５００μｇのＣｐＧ１０１８および７５０μｇの水酸化アルミニウムでアジュバント化した５、２５、または５０μｇのＳ－２Ｐで、２週間の間隔を空けて３回免疫した。２回目の免疫化の２週間後（２９日目）または３回目の免疫化の２週間後（４３日目）に血清を採取し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢野生型（ＷＴ）またはＢ．１．３５１変異株（β変異株）スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスを用いた中和アッセイを行った。
材料および方法
動物実験。Ｃｒｌ：ＣＤ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットは、ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ．Ｌｔｄ．（台湾台北市）から入手し、試験はＴＦＢＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．のＴｅｓｔｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ（台湾新北市）で実施した。ＳＤラットの免疫化は、実施例２のセクションＣに記載の通りに実施した。簡単に述べると、ラットは、１，５００μｇのＣｐＧ１０１８および７５０μｇの水酸化アルミニウムでアジュバント化した５、２５、または５０μｇのＳ－２Ｐで、２週間の間隔を空けて３回免疫した。２回目の免疫化の２週間後（２９日目）または３回目の免疫化の２週間後（４３日目）に血清を採取し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢野生型（ＷＴ）またはＢ．１．３５１変異株（β変異株）スパイクタンパク質を発現する偽ウイルスを用いた中和アッセイを行った。
【0101】
偽ウイルス中和アッセイ。武漢Ｈｕ－１野生型株（ＷＴ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するレンチウイルスを構築し、実施例２のセクションＣに記載の通りに中和アッセイを実施した。Ｂ．１．３５１変異株（β変異株）スパイクタンパク質を発現するレンチウイルスを同じように構築したが、野生型スパイクタンパク質配列は変異株配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＺ３１４９９８．１）に置き換えた。
【0102】
統計解析。統計解析にはＰｒｉｓｍ６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた二元配置分散分析、および補正したＤｕｎｎの多重比較検定を用いたＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓを用いて、各図面の説明に記載したように有意性を算出した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0103】
結果
ラットにおけるＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１誘導抗体は、野生型と比較して変異株を効果的に中和した。図１４に示すように、２９および４３日目には抗体はＢ．１．３５１（β変異株）に対して有効性を保持していたが、力価は減少していた。特に、３回目の免疫化の２週間後（４３日目）に採取した血清は、２回目の免疫化の２週間後（２９日目）に採取した血清よりもＩＤ５０およびＩＤ９０幾何平均力価（ＧＭＴ）が高く、３回目の免疫化で、このＶｏＣに対する中和活性が向上傾向にあることを示唆している。この効果は、特に低用量（５μｇ）で顕著である。４３日目までに、Ｂ．１．３５１に対するＧＭＴは、すべての投与群でＩＤ５０（図１４、左側）およびＩＤ９０（図１４、右側）で同レベルに達した。
ラットにおけるＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１誘導抗体は、野生型と比較して変異株を効果的に中和した。図１４に示すように、２９および４３日目には抗体はＢ．１．３５１（β変異株）に対して有効性を保持していたが、力価は減少していた。特に、３回目の免疫化の２週間後（４３日目）に採取した血清は、２回目の免疫化の２週間後（２９日目）に採取した血清よりもＩＤ５０およびＩＤ９０幾何平均力価（ＧＭＴ）が高く、３回目の免疫化で、このＶｏＣに対する中和活性が向上傾向にあることを示唆している。この効果は、特に低用量（５μｇ）で顕著である。４３日目までに、Ｂ．１．３５１に対するＧＭＴは、すべての投与群でＩＤ５０（図１４、左側）およびＩＤ９０（図１４、右側）で同レベルに達した。
【0104】
要約すると、ラット試験は、３回投与レジメンを用いることにより、３回投与群間で同レベルの中和力価を誘導できたことを示している。３回投与レジメンが、変異株に対する高い免疫原性をもたらしたことを考えると、これらの結果は、ヒトでも追加免疫化がＶｏＣに対する免疫を高める戦略であり得ると推定できよう。
【0105】
Ｂ．ヒトにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＶｏＣに対するＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１ワクチンの中和能力
材料および方法
臨床試験。２０～４９歳のヒト被験者４５名を、前向き非盲検単施設用量漸増第Ｉ相試験に組み入れ、２０～５０歳未満の参加者を３つのサブフェーズに分けた。各サブフェーズは参加者１５人からなる。本臨床試験では、７５０μｇのＣｐＧ１０１８および３７５μｇの水酸化アルミニウムでアジュバント化したＳ－２Ｐタンパク質を、低用量（ＬＤ；５μｇ）、中用量（ＭＤ；１５μｇ）、および高用量（ＨＤ；２５μｇ）の３種類の投与量で使用し、それぞれフェーズ１ａ、１ｂ、および１ｃとした。ワクチン接種スケジュールは、好ましくは２８日の間隔を空けて、１日目と２９日目に、利き腕ではない腕の三角筋に０．５ｍＬを筋肉内（ＩＭ）注射で投与するものであった。５７日目（２回目投与の４週間後）に血清試料を採取し、偽ウイルス中和アッセイを行った。臨床試験の詳細については実施例４に記載する。
材料および方法
臨床試験。２０～４９歳のヒト被験者４５名を、前向き非盲検単施設用量漸増第Ｉ相試験に組み入れ、２０～５０歳未満の参加者を３つのサブフェーズに分けた。各サブフェーズは参加者１５人からなる。本臨床試験では、７５０μｇのＣｐＧ１０１８および３７５μｇの水酸化アルミニウムでアジュバント化したＳ－２Ｐタンパク質を、低用量（ＬＤ；５μｇ）、中用量（ＭＤ；１５μｇ）、および高用量（ＨＤ；２５μｇ）の３種類の投与量で使用し、それぞれフェーズ１ａ、１ｂ、および１ｃとした。ワクチン接種スケジュールは、好ましくは２８日の間隔を空けて、１日目と２９日目に、利き腕ではない腕の三角筋に０．５ｍＬを筋肉内（ＩＭ）注射で投与するものであった。５７日目（２回目投与の４週間後）に血清試料を採取し、偽ウイルス中和アッセイを行った。臨床試験の詳細については実施例４に記載する。
【0106】
偽ウイルス中和アッセイ。武漢Ｈｕ－１野生型株（ＷＴ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するレンチウイルスを構築し、実施例２のセクションＣに記載の通りに中和アッセイを実施した。Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７（α変異株；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＺ３１４９９７．１）、Ｂ．１．３５１（β変異株；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＺ３１４９９８．１）、Ｐ１（γ変異株；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＬＲ９６３０７５）、およびＢ．１．４２９（ε変異株；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＭＷ５９１５７９）スパイクタンパク質を発現するレンチウイルスを同じように構築したが、野生型スパイクタンパク質配列は、対応する変異株配列に置き換えた。
【0107】
統計解析。統計解析の方法は、上記のセクションに記載の通りに実施した。
【0108】
結果
ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１のワクチン接種を受けたヒト抗血清は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７（α）、Ｐ１（γ）変異株を中和したが、Ｂ．１．３５１（β）およびＢ．１．４２９（ε）変異株では中和が減少した。図１５Ａ～Ｃは、ヒト血清の偽ウイルス中和アッセイのデータを、ＷＴ、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７（α）、Ｂ．１．３５１（β）、Ｐ１（γ）、およびＢ．１．４２９（ε）変異株それぞれについて示したものである。Ｄ６１４ＧおよびＢ．１．１．７（α変異株）に対する全群（ＬＤ、ＭＤ、およびＨＤ群）の中和抗体の力価は、ＷＴ（図１５Ａ～Ｃ）に対するものと比較して減少したが、この減少は統計的に有意ではなかった。しかし、Ｂ．１．３５１（β変異株）をＷＴと比較すると、中和抗体の力価は全群（ＬＤ、ＭＤ、およびＨＤ群）で有意に減少していた。一方、Ｐ１（γ変異株）に対する全群（ＬＤ、ＭＤ、およびＨＤ群）の中和抗体の力価は、ＷＴに対するものよりも高い。Ｂ．１．４２９（ε変異株）をＷＴと比較すると、中和抗体の力価は、ＬＤおよびＭＤ群（図１５Ａ、Ｂ）で有意に減少したが、ＨＤ群（図１５Ｃ）ではＢ．１．４２９（ε変異株）に対する中和抗体の力価に有意差は認められなかった。変異株に対する各投与群の中和力価をプロットすると（図１５Ａ～Ｃ）、用量依存効果が確認できた。Ｂ．１．３５１（β）、Ｐ１（γ）、およびＢ．１．４２９（ε）変異株に対する中和力価は、より高い用量の抗原を用いることにより、増加させることができた。
ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１のワクチン接種を受けたヒト抗血清は、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７（α）、Ｐ１（γ）変異株を中和したが、Ｂ．１．３５１（β）およびＢ．１．４２９（ε）変異株では中和が減少した。図１５Ａ～Ｃは、ヒト血清の偽ウイルス中和アッセイのデータを、ＷＴ、Ｄ６１４Ｇ、Ｂ．１．１．７（α）、Ｂ．１．３５１（β）、Ｐ１（γ）、およびＢ．１．４２９（ε）変異株それぞれについて示したものである。Ｄ６１４ＧおよびＢ．１．１．７（α変異株）に対する全群（ＬＤ、ＭＤ、およびＨＤ群）の中和抗体の力価は、ＷＴ（図１５Ａ～Ｃ）に対するものと比較して減少したが、この減少は統計的に有意ではなかった。しかし、Ｂ．１．３５１（β変異株）をＷＴと比較すると、中和抗体の力価は全群（ＬＤ、ＭＤ、およびＨＤ群）で有意に減少していた。一方、Ｐ１（γ変異株）に対する全群（ＬＤ、ＭＤ、およびＨＤ群）の中和抗体の力価は、ＷＴに対するものよりも高い。Ｂ．１．４２９（ε変異株）をＷＴと比較すると、中和抗体の力価は、ＬＤおよびＭＤ群（図１５Ａ、Ｂ）で有意に減少したが、ＨＤ群（図１５Ｃ）ではＢ．１．４２９（ε変異株）に対する中和抗体の力価に有意差は認められなかった。変異株に対する各投与群の中和力価をプロットすると（図１５Ａ～Ｃ）、用量依存効果が確認できた。Ｂ．１．３５１（β）、Ｐ１（γ）、およびＢ．１．４２９（ε）変異株に対する中和力価は、より高い用量の抗原を用いることにより、増加させることができた。
【0109】
結論として、ワクチン接種した第Ｉ相ヒト被験者は、ＩＤ９０において、特に高用量でＢ．１．３５１（β）、Ｐ１（γ）、およびＢ．１．４２９（ε）変異株に対してより減少が見られたものの、それでもかなりの中和能力を示した。この結果は、ＭＶＣ－ＣＯＶ１９０１の２つの用量が、用量依存的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２変異株に対する中和抗体を誘発できたことを示す。
【0110】
本発明の上述した実施形態は、当然のことながら、これらの範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正が可能である。従って、科学および有用な技術の進歩を促進するために本発明を開示し、また本発明は、添付の請求項の範囲によってのみ限定されることを意図する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【配列表】
【国際調査報告】