特表 2023-531463 酵素的核酸伸長を用いたｉｎ ｓｉｔｕ単一細胞解析のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-24

(54)【発明の名称】酵素的核酸伸長を用いたｉｎ ｓｉｔｕ単一細胞解析のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6841 20180101AFI20230714BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20230714BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20230714BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6841 Z

C12Q1/68 ZNA

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022578732

(86)(22)【出願日】2021-06-17

(85)【翻訳文提出日】2023-02-17

(86)【国際出願番号】 US2021037772

(87)【国際公開番号】W WO2021257795

(87)【国際公開日】2021-12-23

(31)【優先権主張番号】63/040,651

(32)【優先日】2020-06-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513322707

【氏名又は名称】ナノストリング テクノロジーズ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100170852

【弁理士】

【氏名又は名称】白樫 依子

(72)【発明者】

【氏名】ジョナサン チェン

(72)【発明者】

【氏名】ドウェイン ダナウェイ

(72)【発明者】

【氏名】マーク グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】チェミョン チュン

(72)【発明者】

【氏名】ラステム カフィゾブ

(72)【発明者】

【氏名】デ キム

(72)【発明者】

【氏名】エバン ペリッロ

(72)【発明者】

【氏名】トゥシャー ラネ

(72)【発明者】

【氏名】リータン ウー

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ28

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR62

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本開示は、部分的には、ユーザー定義の組織領域、ユーザー定義の細胞、及び／又はユーザー定義の細胞内細胞下構造におけるタンパク質及び／又は核酸の発現の、同時且つ多重の空間的な検出及び定量化を行うための、プローブ、組成物、方法、及びキットに基づくものである。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法であって、
ａ）前記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、
各種プローブは前記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、前記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；
ｂ）前記組織試料を第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブの前記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、前記少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメインを伸長させ、空間的バーコードドメインを形成することであって、
前記第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合した前記ヌクレオチドを含む、形成すること；
ｃ）前記組織試料の少なくとも１つの部位に、前記ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の前記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、前記ポリメラーゼを遊離させ、前記組織試料の前記少なくとも１つの部位における前記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；
ｄ）前記組織試料を追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、工程（ｃ）で照射された前記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの前記空間的バーコードドメインの前記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、前記少なくとも１つの結合型プローブの前記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、
前記追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合した前記ヌクレオチドを含む、伸長させること；
ｅ）前記組織試料の前記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの前記空間的バーコードドメインが、前記空間的バーコードドメインが前記組織試料の前記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、且つ
前記組織試料の前記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの前記空間的バーコードドメインが、前記空間的バーコードドメインが前記組織試料の前記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；
ｆ）前記組織試料内の標的分析物に結合した前記プローブを収集すること；並びに、
ｇ）工程（ｆ）で収集された前記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、前記組織試料の前記第１部位及び前記少なくとも第２部位における前記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより前記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、
を含む方法。

【請求項2】

組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法であって、
ａ）前記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、
各種プローブは前記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、前記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；
ｂ）前記組織試料を第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び第１の複数のポリメラーゼと接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメインの前記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、前記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させ、空間的バーコードドメインを形成することであって、
前記第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、形成すること；
ｃ）前記組織試料の少なくとも１つの部位に、前記可逆的ターミネーターヌクレオチドの前記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、前記可逆的３’ターミネーター部分を遊離させ、前記組織試料の前記少なくとも１つの部位における前記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；
ｄ）前記組織試料を追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び追加の複数のポリメラーゼと接触させることにより、工程（ｃ）で照射された前記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの前記空間的バーコードドメインの前記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、前記少なくとも１つの結合型プローブの前記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、
前記追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して可逆的３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；
ｅ）前記組織試料の前記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの前記空間的バーコードドメインが、前記空間的バーコードドメインが前記組織試料の前記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、
前記組織試料の前記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの前記空間的バーコードドメインが、前記空間的バーコードドメインが前記組織試料の前記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；
ｆ）前記組織試料内の標的分析物に結合した前記プローブを収集すること；並びに、
ｇ）工程（ｆ）で収集された前記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、前記組織試料の前記第１部位及び前記少なくとも第２部位における前記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより前記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、
を含む、方法。

【請求項3】

前記組織試料の前記第１部位における前記少なくとも２つの標的分析物の存在量と、前記組織試料の前記少なくとも第２部位における前記少なくとも２つの標的分析物の存在量とを比較することをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ポリメラーゼが末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はその生物活性部分である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

（ａ）前記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドが３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＧＴＰ若しくは３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＴＴＰを含む；又は、
（ｂ）前記３’ターミネーター部分が２－ニトロベンジルを含む、
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記プローブが固有分子識別子をさらに含み、前記固有分子識別子が少なくとも約１４ヌクレオチド長であることが好ましい、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記プローブが増幅プライマー結合部位をさらに含み、前記増幅プライマー結合部位が少なくとも約２４ヌクレオチド長であることが好ましい、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記プローブが定常領域をさらに含み、前記定常領域が少なくとも約１２ヌクレオチド長～少なくとも約２０ヌクレオチド長であることが好ましい、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記プローブが、５’から３’に向かって、前記標的結合ドメインを、続いて前記増幅プライマー結合部位を、続いて前記固有分子識別子を、続いて前記標的同定ドメインを、続いて前記定常領域を、含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記組織試料の前記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの前記空間的バーコードドメインが前記組織試料の前記第１部位に特異的な固有空間的識別子配列を含み、前記組織試料の前記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの前記空間的バーコードドメインが前記組織試料の前記少なくとも第２部位に特異的な固有空間的識別子配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記空間的識別子配列が少なくとも約２０個のヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記空間的識別子配列が少なくとも４つの空間的同定ドメインを含み、好ましくは、
（ａ）前記少なくとも４つの空間的同定ドメインのそれぞれが同数個のヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれの空間的同定ドメインが約１個～約４個のヌクレオチドを含み、好ましくはそれぞれの空間的同定ドメインが約４個のヌクレオチドを含み；又は、
（ｂ）前記少なくとも４つの空間的同定ドメインの少なくとも１つが、同一空間的バーコード内の別の空間的同定ドメインと比較した場合で異なる数のヌクレオチドを含む、
請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも４つの空間的同定ドメインのそれぞれが３’末端に同一ヌクレオチドを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復して、前記組織試料の各部位における前記空間的バーコードドメインを、前記空間的バーコードドメインが前記３’末端に区切りドメインを含むように伸長させることをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、前記組織試料の各部位における前記空間的バーコードドメインを、前記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長させることをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、
（ｉ）工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復して、前記組織試料の各部位における前記空間的バーコードドメインを、前記空間的バーコードドメインが区切りドメインを含むように伸長させること；並びに、
（ｉｉ）前記組織試料の各部位における前記空間的バーコードドメインを、前記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長させること、
をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

（ａ）前記区切りドメインが少なくとも約４ヌクレオチド長～少なくとも約６ヌクレオチド長である；又は
（ｂ）前記区切りドメインの配列が、前記試料における全ての空間的バーコードに対して同じである、
請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記ポリＴドメインが少なくとも約１４個のヌクレオチドを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

工程（ｃ）の前記照射が、アークランプ、レーザー、集束ＵＶ光源、及び発光ダイオードからなる群から選択される光源によって供給され、前記レーザーは赤外レーザーであることが好ましい、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

工程（ｃ）の前記照射が２光子励起顕微鏡によって供給される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記組織試料の前記第１部位及び前記組織試料の前記第２部位が、ｘ方向及び／又はｙ方向に約５００ｎｍ以下、且つ、ｚ方向に約１５００ｎｍ以下である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記組織試料の前記第１部位及び前記組織試料の前記少なくとも第２部位が、
（ａ）細胞内である；
（ｂ）それぞれ、１個以下の細胞を含む；又は
（ｃ）それぞれ、１０個以下の細胞を含む、
請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

工程（ａ）の前に、前記組織試料をｄｄＴＴＰ（ジデオキシチミジン三リン酸）終結に供することをさらに含み、前記組織試料をｄｄＴＴＰ終結に供することは前記組織試料をｄｄＴＴＰ及びＴｄＴと接触させることを含むことが好ましい、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

工程（ｆ）後且つ工程（ｇ）前に、前記収集されたプローブを増幅することをさらに含み、前記収集されたプローブを増幅することは第１増幅プライマー及び第２増幅プライマーの使用を含むことが好ましく、
前記第１増幅プライマーが第１フローセルアダプター配列、第１ＮＧＳインデックス配列及び第１シーケンシングプライマー結合部位を含み、及び
前記第２増幅プライマーが第２フローセルアダプター配列、第２ＮＧＳインデックス配列及び第２シーケンシングプライマー結合部位を含む、
請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記第１増幅プライマー及び前記第２増幅プライマーの少なくとも一方が、前記区切り配列及び／又は前記ポリＴドメインに相補的な核酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年６月１８日に出願された米国仮出願第６３／０４０，６５１号に基づく優先権及び利益を主張し、当該米国仮特許出願の全内容を参照により援用するものである。

【0002】

配列表
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介しＡＳＣＩＩ形式で提出された、その全体が参照によって本明細書に援用される、配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピーは２０２１年６月１６日に作成されたものであり、「ＮＡＴＥ－０４６＿００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称で、サイズは約１．９６ＭＢである。

【背景技術】

【0003】

標準的な免疫組織化学法とin situハイブリダイゼーション法では、多くて６～１０種タンパク質標的又は核酸標的、典型的には３～４種の標的を同時に検出することが可能である。ユーザー定義の組織領域、ユーザー定義の細胞、及び／又はユーザー定義の細胞内細胞下構造におけるタンパク質及び／又は核酸の発現を、充分に高い解像度で、且つ、最低限のバックグラウンドノイズで、同時且つ多重に検出し定量化するための、プローブ、組成物、方法、及びキットが必要とされている。さらに、そのような系が、多数のエンドユーザーが既に利用可能な既存のシーケンシング技術と共に使用できることが求められている。

【発明の概要】

【0004】

本開示は、組織試料内の核酸配列をｉｎ ｓｉｔｕ合成するための方法であって、ａ）上記組織試料を少なくとも１つのプローブと接触させることであって、上記プローブは標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含み、上記プローブはフリーな３’－ＯＨ部分を含み、上記標的結合ドメインは組織試料の第１部位における少なくとも１つの標的分子に結合する、接触させること；ｂ）上記フリーな３’－ＯＨ部分を少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結し、少なくとも１つの結合型プローブを伸長させることであって、上記少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合したヌクレオチドを含む、伸長させること、ｃ）上記組織試料の第１部位に、上記少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記ポリメラーゼを遊離させ、上記伸長された少なくとも１つの結合型プローブ上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；並びに、ｄ）核酸配列の合成が完了するまで工程（ｂ）及び工程（ｃ）を反復すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0005】

本開示は、組織試料内の核酸配列をin situ合成するための方法であって、ａ）上記組織試料を少なくとも１つのプローブと接触させることであって、上記プローブは標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含み、上記プローブはフリーな３’－ＯＨ部分を含み、上記標的結合ドメインは組織試料の第１部位に位置する少なくとも１つの標的分子に結合する、接触させること；ｂ）上記組織試料を少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチド及び少なくとも１つのポリメラーゼと接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させることであって、上記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；ｃ）上記組織試料の第１部位に、上記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドの上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記３’ターミネーター部分を遊離させ、上記伸長された少なくとも１つの結合型プローブ上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；並びに、ｄ）核酸配列の合成が完了するまで工程（ｂ）及び工程（ｃ）を反復すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0006】

前述の方法のいくつかの態様では、標的結合ドメインが上記組織試料の少なくとも第２部位における少なくとも１つの標的分子に結合し、当該方法は上記少なくとも第２部位において工程（ｂ）～（ｄ）を反復することをさらに含む。

【0007】

前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記第１部位で合成された核酸配列は、上記組織試料の上記少なくとも第２部位で合成された核酸配列と異なる。

【0008】

本開示は、組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイル（ｓｐａｔｉａｌｌｙ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を生成する方法であって、ａ）上記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；ｂ）上記組織試料を第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメイン（ｂａｒｃｏｄｅ ｄｏｍａｉｎ）を伸長させ、空間的バーコードドメイン（ｓｐａｔｉａｌ ｂａｒｃｏｄｅ ｄｏｍａｉｎ）を形成することであって、上記第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、形成すること；ｃ）上記組織試料の少なくとも１つの部位に、上記ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記ポリメラーゼを遊離させ、上記組織試料の上記少なくとも１つの部位における上記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；ｄ）上記組織試料を追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、工程（ｃ）で照射された上記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインの上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、上記追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；ｅ）上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、且つ、上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；ｆ）上記組織試料内の標的分析物に結合した上記プローブを収集すること；並びに、ｇ）工程（ｆ）で収集された上記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、上記組織試料の上記第１部位及び上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより上記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0009】

本開示は、組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイル（ｓｐａｔｉａｌｌｙ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を生成する方法であって、ａ）上記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；ｂ）上記組織試料を第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び第１の複数のポリメラーゼと接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメインのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させ、空間的バーコードドメインを形成することであって、上記第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、形成すること；ｃ）上記組織試料の少なくとも１つの部位に、上記可逆的ターミネーターヌクレオチドの上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記可逆的３’ターミネーター部分を遊離させ、上記組織試料の上記少なくとも１つの部位における上記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；ｄ）上記組織試料を追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び追加の複数のポリメラーゼと接触させることにより、工程（ｃ）で照射された上記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインの上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、上記追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して可逆的３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；ｅ）上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、且つ、上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；ｆ）上記組織試料内の標的分析物に結合した上記プローブを収集すること；並びに、ｇ）工程（ｆ）で収集された上記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、上記組織試料の上記第１部位及び上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより上記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0010】

いくつかの態様において、前述の方法は、上記組織試料の上記第１部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量と、上記組織試料の上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量とを比較することをさらに含むことができる。

【0011】

ポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はその生物活性部分とすることができる。

【0012】

少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＧＴＰ又は３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＴＴＰを含むことができる。

【0013】

３’ターミネーター部分は、２－ニトロベンジルを含むことができる。

【0014】

プローブは、固有分子識別子をさらに含むことができる。固有分子識別子は、少なくとも約１４ヌクレオチド長とすることができる。

【0015】

プローブは、増幅プライマー結合部位をさらに含むことができる。増幅プライマー結合部位は、少なくとも約２４ヌクレオチド長とすることができる。

【0016】

プローブは、定常領域をさらに含むことができる。定常領域は、少なくとも約１２ヌクレオチド長～少なくとも約２０ヌクレオチド長とすることができる。

【0017】

プローブは、５’から３’に向かって、標的結合ドメイン、続いて増幅プライマー結合部位、続いて固有分子識別子、続いて標的同定ドメイン、続いて定常領域を含むことができる。

【0018】

前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの空間的バーコードドメインは、上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有空間的識別子配列を含む。前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの空間的バーコードドメインは、上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有空間的識別子配列を含む。

【0019】

空間的識別子配列は、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むことができる。

【0020】

空間的識別子配列は、少なくとも４つの空間的同定ドメインを含むことができる。上記少なくとも４つの空間的同定ドメインのそれぞれは、同じ数のヌクレオチドを含むことができる。上記少なくとも４つの空間的同定ドメインの少なくとも１つは、同一空間的バーコード内の別の空間的同定ドメインと比較した場合で異なる数のヌクレオチドを含むことができる。それぞれの空間的同定ドメインは、約１～約４個のヌクレオチドを含むことができる。それぞれの空間的同定ドメインは、約４個のヌクレオチドを含むことができる。上記少なくとも４つの空間的同定ドメインのそれぞれは、３’末端に同じヌクレオチドを含むことができる。

【0021】

前述の方法のいくつかの態様では、上記方法は、工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復して、上記組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインが３’末端に区切りドメイン（ｄｅｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）を含むように伸長させることをさらに含むことができる。

【0022】

前述の方法のいくつかの態様では、上記方法は、工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、上記組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長させることをさらに含むことができる。

【0023】

前述の方法のいくつかの態様では、上記方法は、工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復して、上記組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインが区切りドメインを含むように伸長させること；並びに（ｉｉ）上記組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長させること、をさらに含むことができる。

【0024】

区切りドメインは、少なくとも約４ヌクレオチド長～少なくとも約６ヌクレオチド長とすることができる。上記区切りドメインの配列は、試料における全ての空間的バーコードに対して同じである。

【0025】

ポリＴドメインは、少なくとも約１４個のヌクレオチドを含むことができる。

【0026】

前述の方法のいくつかの態様では、工程（ｃ）の照射は、アークランプ、レーザー、集束ＵＶ光源、及び発光ダイオードからなる群から選択される光源に供給させることができる。レーザーは赤外レーザーとすることができる。

【0027】

前述の方法のいくつかの態様では、工程（ｃ）の照射は、２光子励起顕微鏡に供給させることができる。

【0028】

前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記第２部位は、ｘ方向及び／又はｙ方向に約５００ｎｍ以下、且つ、ｚ方向に約１５００ｎｍ以下とすることができる。

【0029】

前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位は、細胞内とすることができる。

【0030】

前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位は、それぞれ、１個以下の細胞を含むことができる。

【0031】

前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位は、それぞれ、１０個以下の細胞を含むことができる。

【0032】

前述の方法のいくつかの態様では、上記組織試料の上記第１部位内及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位内のそれぞれの細胞は、個々に自動的に同定しコード化することができる。

【0033】

前述の方法のいくつかの態様では、上記方法は、工程（ａ）の前に、上記組織試料をｄｄＴＴＰ（ジデオキシチミジン三リン酸（ｄｉｄｅｏｘｔｈｙｍｉｄｉｎｅ－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ））終結に供することをさらに含むことができる。上記組織試料をｄｄＴＴＰ終結に供することは、上記組織試料をｄｄＴＴＰ及びＴｄＴと接触させることを含むことができる。

【0034】

前述の方法のいくつかの態様では、上記方法は、工程（ｆ）後且つ工程（ｇ）前に、上記収集されたプローブを増幅することをさらに含むことができる。上記収集されたプローブを増幅することは、第１増幅プライマー及び第２増幅プライマーの使用を含むものとすることができ、上記第１増幅プライマーは、第１フローセルアダプター配列、第１ＮＧＳインデックス配列及び第１シーケンシングプライマー結合部位を含み、上記第２増幅プライマーは、第２フローセルアダプター配列、第２ＮＧＳインデックス配列及び第２シーケンシングプライマー結合部位を含む。上記第１増幅プライマー及び上記第２増幅プライマーの少なくとも一方は、上記区切り配列及び／又は上記ポリＴドメインと相補的な核酸配列を含むことができる。

【0035】

上記の態様のいずれも、他のいずれの態様と組み合わせることができる。

【0036】

別途定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書では、文脈によって特に明示されない限り、単数形は複数形も包含し；例としては、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という語は、単数又は複数と理解され、「又は」という語は包括的であると理解される。例として、「要素」は１又は複数の要素を意味する。本明細書の全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素、整数、若しくは工程、又は要素群、整数群、若しくは工程群の包含を意味するが、他の要素、整数、若しくは工程、又は要素群、整数群、若しくは工程群の排除は意味していないと理解されたい。約は、記載された値の、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内、０．１％以内、０．０５％以内、又は０．０１％以内と理解することができる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書に提供された全ての数値は「約」という語で修飾されている。

【0037】

本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価の方法及び材料を、本開示の実施又は試験で使用できるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照によって援用される。本明細書に引用された参考文献は、請求項に係る発明に対する先行技術であることを認めるものではない。矛盾が生じる場合、本明細書が、定義も含めて、優先されるものとする。加えて、材料、方法、及び例は、説明のみを目的とし、限定は意図していない。本開示の他の特徴及び利点が、以下の詳細な説明及び請求項から明らかとなろう。

【0038】

上記及びさらなる特徴は、添付の図面を参照しつつ行う以下の詳細な説明からより明確に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】図１は、本開示のｉｎ ｓｉｔｕ核酸合成法の例示的な模式図である。

【0040】

【図2】図２は、本開示のｉｎ ｓｉｔｕ核酸合成法の例示的な模式図である。

【0041】

【図3A】図３Ａは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3B】図３Ｂは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3C】図３Ｃは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3D】図３Ｄは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3E】図３Ｅは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3F】図３Ｆは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3G】図３Ｇは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3H】図３Ｈは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3I】図３Ｉは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3J】図３Ｊは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3K】図３Ｋは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3L】図３Ｌは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3M】図３Ｍは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図3N】図３Ｎは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【0042】

【図4A】図４Ａは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4B】図４Ｂは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4C】図４Ｃは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4D】図４Ｄは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4E】図４Ｅは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4F】図４Ｆは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4G】図４Ｇは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4H】図４Ｈは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4I】図４Ｉは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4J】図４Ｊは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4K】図４Ｋは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4L】図４Ｌは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4M】図４Ｍは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【図4N】図４Ｎは、組織試料の少なくとも２つの部位における、少なくとも１つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法の各工程の例示的な模式図である。

【0043】

【図5A】図５Ａは、本開示の方法で使用することができる２光子励起法の例示的な光学系模式図である。

【0044】

【図5B】図５Ｂは、本開示の方法で使用することができる２光子励起法の例示的な光学系模式図である。

【0045】

【図6】図６は、各種プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）ｄＮＴＰの構造を示している。

【0046】

【図7】図７は、ＢＰ－２３３５４の構造を示している。

【0047】

【図8】図８は、例示的なヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体調製法の模式図である。

【0048】

【図9】図９は、本開示の方法で使用するための各種可逆的ターミネーターヌクレオチドの構造を示している。

【0049】

【図10】図１０は、本開示のプローブの例示的な模式図である。

【0050】

【図11】図１１は、図１０のプローブが、本開示の方法においてＴｄＴ伸長を用いて伸長されて空間的バーコードドメインを形成し、上記空間的バーコードドメインが４つの空間同定（ＩＤ）ドメインを含む場合の例示的な模式図である。

【0051】

【図12】図１２は、図１０のプローブが、本開示の方法においてＴｄＴ伸長を用いて伸長されて空間的バーコードドメインを形成し、上記空間的バーコードドメインが４つの空間同定（ＩＤ）ドメイン及び区切りドメインを含む場合の例示的な模式図である。

【0052】

【図13】図１３は、図１０のプローブが、本開示の方法においてＴｄＴ伸長を用いて伸長されて空間的バーコードドメインを形成し、上記空間的バーコードドメインが４つの空間同定（ＩＤ）ドメイン、区切りドメイン及びポリＴドメインを含む場合の例示的な模式図である。

【0053】

【図14A】図１４Ａは、本開示の伸長後プローブ、及び本開示の２つの増幅プライマーの例示的な模式図である。

【0054】

【図14B】図１４Ｂは、本開示の伸長後プローブ、及び本開示の２つの増幅プライマーの例示的な模式図である。この第２増幅プライマーは３’末端に２つの縮重塩基（「ＢＮ」）を含む

【0055】

【図15】図１５は、本開示のプローブの存在を検査し増幅する増幅実験で使用するためのプライマー設計の例示的な模式図である。

【0056】

【図16】図１６は、本開示の増幅プライマーを用いた本開示のプローブの増幅の、ゲル電気泳動分析の画像である。

【0057】

【図17】図１７は、本開示のプローブの存在を検査し増幅する増幅実験で使用するためのプライマー設計の例示的な模式図である。

【0058】

【図18】図１８は、本開示の増幅プライマーを用いた本開示のプローブの増幅の、ゲル電気泳動分析の画像である。

【0059】

【図19】図１９は、本開示の方法の一部としての、組織試料からの、プローブを含むＤＮＡの回収を示す図である。

【0060】

【図20】図２０は、本開示のプローブの例示的な模式図である。

【0061】

【図21】図２１は、図２０のプローブが、本開示の方法においてＴｄＴ伸長を用いて伸長されて空間的バーコードドメインを形成し、上記空間的バーコードドメインが４つの同定（ＩＤ）ドメイン、区切りドメイン及びポリＴドメインを含む場合の例示的な模式図である。

【0062】

【図22】図２２は、本開示の方法で２光子型照射を用いて得られる光切断の結果の改善を示す一連の画像である。

【0063】

【図23】図２３は、シーケンシングを介しプローブを定量化する一環として、組織試料から収集されたプローブを精製する方法の例示的な模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0064】

本開示は、部分的には、既存のシーケンス法を用いて、ユーザー定義の組織領域、ユーザー定義の細胞、及び／又はユーザー定義の細胞内細胞下構造におけるタンパク質及び／又は核酸の発現の、同時且つ多重の空間的な検出及び定量化を行うための、プローブ、組成物、方法、及びキットに基づくものである。

【0065】

本開示は、第１関心領域（例えば、組織型、細胞（正常細胞及び異常細胞を含む）、並びに細胞内部の細胞下構造）に存在する標的タンパク質及び／又は標的核酸の正体及び存在量と、第２関心領域に存在する標的タンパク質及び／又は標的核酸の正体及び存在量との比較を提供するものである。関心領域及び実行できる比較の数に予め決められた上限はなく、この上限は、試料のサイズに対する関心領域のサイズに関連している。例として、単一の細胞が関心領域を表す場合、切片は数百～数千の関心領域を有し得るが、組織切片が２つのみの細胞型を含む場合、切片は２つのみの関心領域を有し得る（それぞれ１つのみの細胞型を含む）。

【0066】

本開示は、標準的な免疫組織化学法又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で可能であるよりも高度な多重化を提供するものである。標準的な免疫組織化学的手法は６～１０種のタンパク質標的の最大同時検出を可能にするが、３～４種のタンパク質標的であることがより一般的である。同様に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法も、１０種未満の核酸標的の同時検出に限定される。本開示は、試料の定められた領域からの、核酸標的及び／又はタンパク質標的の大きな組み合わせの検出を提供するものである。本開示は、デジタル定量化により客観的測定値を増やし、信頼性及び一貫性を増大させることにより、複数の施設間での結果の比較を可能にするものである。

【0067】

当該技術分野において公知の他の方法とは異なり、本開示の方法は、組織試料の特定領域からプローブ／バーコードを抽出するための連続的な流体ステップを必要としない。

【0068】

さらに、デジタルマイクロミラー指向型照射システムを頼りとする当該技術分野において公知の他の方法とは異なり、本開示の方法は、ポイント走査型２光子システムを含む２光子照射システムと適合する。この２光子照射システムは、空間分解能が増加しており、単一細胞、さらには単一細胞内部の細胞下構ほどの小ささの単一の関心領域（ＲＯＩ）の照射を可能にする。

【0069】

本開示の種々の組成物及び方法の全詳細を本明細書において説明する。

【0070】

本開示の方法

【0071】

いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、２光子顕微鏡法と光活性化化学を併用して、単一細胞の空間的バーコードをｉｎ ｓｉｔｕで形成させることで、空間分解法における単一細胞分解能での遺伝子発現の定量化を可能にする、「ＤＮＡライティング顕微鏡（ＤＮＡ ｗｒｉｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）」と称することができる。

【0072】

本開示は、組織試料内の核酸配列をｉｎ ｓｉｔｕ合成するための方法であって、ａ）上記組織試料を少なくとも１つのプローブと接触させることであって、上記プローブは標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含み、上記プローブはフリーな３’－ＯＨ部分を含み、上記標的結合ドメインは組織試料の第１部位における少なくとも１つの標的分子に結合する、接触させること；ｂ）上記フリーな３’－ＯＨ部分を少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結し、上記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させることであって、上記少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること、ｃ）上記組織試料の第１部位に、上記少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記ポリメラーゼを遊離させ、上記伸長された少なくとも１つの結合型プローブ上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；並びに、ｄ）核酸配列の合成が完了するまで工程（ｂ）及び工程（ｃ）を反復すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0073】

上記方法の例示的な模式図を図１に示す。図１には、フリーな３’－ＯＨを有するプローブが示されている（上部、「フリーな３’－ＯＨを有するＩＳＨプローブ」）。このプローブは、次いで、上記フリーな３’－ＯＨ部分を、光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に連結されたヌクレオチドを含むヌクレオチドポリメラーゼ複合体と接触させることで、上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することによって、伸長される。この非限定例では、上記ポリメラーゼは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。上記ヌクレオチド（括弧書きの「Ｎ」）は光切断性リンカー（図１では星形で表されている）を介してＴｄＴ分子に動作可能に連結されている。その次の脱保護のステップで、この光切断性リンカーは、上記プローブ及びヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体に、上記光切断性リンカーを切断するのに充分な波長の光（この非限定例では、上記光は約３６５ｎｍの波長を有する紫外光である）を照射することにより切断される。これにより、上記ポリメラーゼが伸長後のプローブから遊離し、伸長後プローブ上のフリーな３’－ＯＨ部分が露出する。その後、所望の核酸配列が合成し終わるまでこのプロセスが反復され得る。

【0074】

本開示は、組織試料内の核酸配列をｉｎ ｓｉｔｕ合成するための方法であって、ａ）上記組織試料を少なくとも１つのプローブと接触させることであって、上記プローブは標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含み、上記プローブはフリーな３’－ＯＨ部分を含み、上記標的結合ドメインは組織試料の第１部位に位置する少なくとも１つの標的分子に結合する、接触させること；ｂ）上記組織試料を少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチド及び少なくとも１つのポリメラーゼと接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させることであって、上記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；ｃ）上記組織試料の第１部位に、上記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドの上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記３’ターミネーター部分を遊離させ、上記伸長された少なくとも１つの結合型プローブ上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；並びに、ｄ）核酸配列の合成が完了するまで工程（ｂ）及び工程（ｃ）を反復すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0075】

上記方法の模式図を図２に示す。図２には、フリーな３’－ＯＨ部分を有するプローブが示されている（上部、「フリーな３’－ＯＨを有するＩＳＨプローブ」）。このプローブは、その後、このプローブを少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチド及び少なくとも１つのポリメラーゼと接触させることで、上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することにより、伸長される。この非限定例では、上記ポリメラーゼは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）である。上記ヌクレオチド（括弧書きの「Ｎ」）は光切断性リンカー（図２では星形で表されている）によってターミネーター部分（三角）に動作可能に連結されている。その次の脱保護のステップで、この光切断性リンカーは、上記プローブに、上記光切断性リンカーを切断するのに充分な波長の光（この非限定例では、上記光は約３６５ｎｍの波長を有する紫外光である）を照射することにより切断される。これにより、上記ターミネーター部分（三角）が遊離することで、伸長後プローブ上のフリーな３’－ＯＨ部分が露出する。その後、所望の核酸配列が合成し終わるまでこのプロセスが反復され得る。

【0076】

本開示は、組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法であって、ａ）上記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；ｂ）上記組織試料を第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメインを伸長させ、空間的バーコードドメインを形成することであって、上記第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、形成すること；ｃ）上記組織試料の少なくとも１つの部位に、上記ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記ポリメラーゼを遊離させ、上記組織試料の上記少なくとも１つの部位における上記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；ｄ）上記組織試料を追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、工程（ｃ）で照射された上記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインの上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、上記追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；ｅ）上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、且つ、上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；ｆ）上記組織試料内の標的分析物に結合した上記プローブを収集すること；並びに、ｇ）工程（ｆ）で収集された上記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、上記組織試料の上記第１部位及び上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより上記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0077】

上記方法の非限定例の模式図を図３Ａ～図３Ｎに示す。上記方法は図３Ａにおける試料から始まる。この非限定例では、上記試料は４個の細胞を含み、それぞれの細胞は測定対象である特定の標的ｍＲＮＡのコピーを少なくとも１つ含んでいる。細胞＃１、細胞＃２及び細胞＃３は上記標的ｍＲＮＡのコピーを１つ含み、細胞＃３は上記標的ｍＲＮＡのコピーを２つ含んでいる。

【0078】

上記試料は、図３Ｂに示されるように、各関心領域（ＲＯＩ）へと細区画され得る。この非限定例では、各ＲＯＩは上記細胞のうちの１つを含む。さらに、各ＲＯＩは、当該ＲＯＩに固有の、予め割り当てられた、特定の空間的バーコードでもある。この例では、各空間的バーコードは４個のヌクレオチドから構成されており、最初のヌクレオチドは任意のヌクレオチド（「Ｎ」で表されている）である。ＲＯＩ＃１の空間的バーコードはＮＧＡＴであり、ＲＯＩ＃２の空間的バーコードはＮＡＴＧであり、ＲＯＩ＃３の空間的バーコードはＮＡＴＴであり、ＲＯＩ＃４の空間的バーコードはＮＴＴＡである。本明細書でさらなる説明がなされるように、上記空間的バーコードには任意の数のヌクレオチドを含ませることができ、図３Ａ～図３Ｎに示された４ヌクレオチドの空間的バーコードは例示のみを目的としている。

【0079】

上記方法の第１工程では、図３Ｃに示されるように、上記試料は複数のプローブと接触させられ、図３Ｃの左上隅に示されているように、上記プローブは、標的ｍＲＮＡに結合する固有標的結合ドメイン、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメイン、及びフリーな３’－ＯＨ部分を含む。上記標的結合ドメインは上記標的ｍＲＮＡに特異的であり、各細胞内で各標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書でさらなる説明がなされるように、上記試料は任意の数の異なる種類のプローブを含む複数のプローブと接触させられる場合があり、各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む。図３Ａ～図３Ｎでは、例示のみを目的として、プローブの種類は１つである。

【0080】

図３Ｄに示される、上記方法の第２工程では、上記試料を複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることで、空間的バーコードドメインの最初のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに結合した各プローブのフリーな３’－ＯＨに連結される。この非限定例では、上記ヌクレオチドポリメラーゼ複合体は、光切断性リンカー（四角星形として図示）を介してヌクレオチド（「Ｎ」）に動作可能に連結されたポリメラーゼＴｄＴを含む。

【0081】

図３Ｅに示される、上記方法の第３工程では、適切な空間的バーコードを構築するために「Ａ」ヌクレオチドの付加を必要とする各ＲＯＩに、上記ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な波長の光が照射される。この非限定例では、ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３が「Ａ」ヌクレオチドの付加を必要とするため、これら２つのＲＯＩがこの工程で照射を受けている。上記照射は図３Ｅでの稲妻（ｌｉｇｈｔｉｎｇ ｂｏｌｔ）形と、照射された細胞の陰影で表されている。この照射の結果、照射後の各ＲＯＩの内部では、上記ＴｄＴ分子が、上記の予め連結されていた「Ｎ」ヌクレオチドから遊離され、後の工程で連結が生じ得るフリーな３’－ＯＨ部分が露出する。図３Ｆは、ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３を照射した後の試料を示している。ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３の結合型プローブは、光切断の結果として、フリーな３’－ＯＨ部分を有している。逆に、Ａヌクレオチドの付加を必要としないＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃４の結合型プローブは、ＴｄＴ分子が手付かずの光切断性リンカーにより、予め連結されていた「Ｎ」ヌクレオチドに結合したままであるため、フリーな３’－ＯＨ部分を有していない。

【0082】

上記方法は図３Ｇへと続き、上記試料が複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させられ、これらのヌクレオチドポリメラーゼ複合体は光切断性リンカー（四角星形として図示）を介してＴｄＴ分子に動作可能に連結したｄＡＴＰ（「Ａ」）を含む。これらのＡヌクレオチドは、ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３における結合型プローブにのみ連結されるが、これは、これらの結合型プローブが、連結反応を促進できるフリーな３’－ＯＨ部分を含む唯一のプローブだからである。ＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃４の結合型プローブの３’末端は結合されたままのＴｄＴ分子によって保護されている。このようにして、「Ａ」ヌクレオチドがＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３における空間的バーコードに付加され、それらのＲＯＩで空間的バーコードのさらなる合成がなされる。

【0083】

上記方法は図３Ｈへと続き、適切な空間的バーコードを構築するために「Ｔ」ヌクレオチドの付加を必要とする各ＲＯＩに、上記ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な波長の光が照射される。この非限定例では、ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４が次の工程で「Ｔ」ヌクレオチドの付加を必要とするため、これら３つのＲＯＩが照射される。この照射の結果、照射後の各ＲＯＩの内部では、上記ＴｄＴ分子が、上記の予め連結されていたヌクレオチドから遊離され、後の工程で連結が生じ得るフリーな３’－ＯＨ部分が露出する。図３Ｉは、ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４を照射した後の試料を示している。ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４の結合型プローブは、光切断の結果として、フリーな３’－ＯＨ部分を有している。逆に、Ｔヌクレオチドの付加を必要としないＲＯＩ＃１の結合型プローブは、ＴｄＴ分子が手付かずの光切断性リンカーにより、予め連結されていたヌクレオチドに結合したままであるため、フリーな３’－ＯＨ部分を有していない。

【0084】

上記方法は図３Ｊへと続き、上記試料が複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させられ、これらのヌクレオチドポリメラーゼ複合体は光切断性リンカー（四角星形として図示）を介してＴｄＴ分子に動作可能に連結したｄＴＴＰ（「Ｔ」）を含む。これらのＴヌクレオチドは、ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４における結合型プローブにのみ連結されるが、これは、これらの結合型プローブが、連結反応を促進できるフリーな３’－ＯＨ部分を含む唯一のプローブだからである。ＲＯＩ＃１の結合型プローブの３’末端は結合されたままのＴｄＴ分子によって保護されている。このようにして、「Ｔ」ヌクレオチドがＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４における空間的バーコードに付加され、それらのＲＯＩで空間的バーコードのさらなる合成がなされる。

【0085】

上記方法は図３Ｋへと続き、適切な空間的バーコードを構築するために「Ｇ」ヌクレオチドの付加を必要とする各ＲＯＩに、上記ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な波長の光が照射される。この非限定例では、ＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃２が次の工程で「Ｇ」ヌクレオチドの付加を必要とするため、これら２つのＲＯＩが照射される。この照射の結果、照射後の各ＲＯＩの内部では、上記ＴｄＴ分子が、上記の予め連結されていたヌクレオチドから遊離され、後の工程で連結が生じ得るフリーな３’－ＯＨ部分が露出する。図３Ｌは、ＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃２を照射した後の試料を示している。ＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃２の結合型プローブは、光切断の結果として、フリーな３’－ＯＨ部分を有している。逆に、Ｔヌクレオチドの付加を必要としないＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４の結合型プローブは、ＴｄＴ分子が手付かずの光切断性リンカーにより、予め連結されていたヌクレオチドに結合したままであるため、フリーな３’－ＯＨ部分を有していない。

【0086】

上記方法は図３Ｍへと続き、上記試料が複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させられ、これらのヌクレオチドポリメラーゼ複合体は光切断性リンカー（四角星形として図示）を介してＴｄＴ分子に動作可能に連結したｄＧＴＰ（「Ｇ」）を含む。これらのＧヌクレオチドは、ＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃２における結合型プローブにのみ連結されるが、これは、これらの結合型プローブが、連結反応を促進できるフリーな３’－ＯＨ部分を含む唯一のプローブだからである。ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４の結合型プローブの３’末端は結合されたままのＴｄＴ分子によって保護されている。このようにして、「Ｇ」ヌクレオチドがＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４における空間的バーコードに付加され、それらのＲＯＩで空間的バーコードのさらなる合成がなされる。この連結の後、ＲＯＩ＃２の結合型プローブは、完全に合成された空間的バーコード「ＮＡＴＧ」を有する。

【0087】

図３Ｎに示されるように各ＲＯＩにおける全ての結合型プローブが完全な空間的バーコードを持つまで、前述の工程が、上記４種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）のいずれかを用いて任意の回数反復され得る。各ＲＯＩにおける全ての空間的バーコードの完成後、上記結合型プローブは上記試料から洗浄され、収集された後、シーケンスされ得る。収集されたプローブ毎に空間的バーコードをシーケンスすることで、その特定のプローブの由来元であるＲＯＩを特定することができ、各ＲＯＩ内の各標的ｍＲＮＡの存在量を定量化し、当該標的ｍＲＮＡの空間分解的な存在量プロファイルを得ることが可能となる。

【0088】

図３Ａ～図３Ｎにおけるヌクレオチド付加の順番（すなわちＡ、次にＴ、次にＧ）は、例示のみを目的にしている。本開示の方法では、ＲＯＩ毎に適切な空間的バーコードを合成するために、任意の順番及び／又は組み合わせで、ヌクレオチドが空間的バーコードに付加され得る。

【0089】

本開示の方法のいくつかの態様では、ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は、光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に連結したヌクレオチドを含む。

【0090】

いくつかの態様では、光切断性リンカーは、アミン－チオールクロスリンカーを含むことができる。いくつかの態様では、アミン－チオールクロスリンカーは、ＰＥＧ_４－ＳＰＤＰ（２－ピリジルジチオール－テトラオキサテトラデケース（ｔｅｔｒａｏｘａｔｅｔｒａｄｅｃａｓｅ）－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）を含むことができる。いくつかの態様では、光切断性リンカーは、ＢＰ－２３３５４などのマレイミド－ＮＨＳカーボネート系クロスリンカーを含むことができる。図７は、ＢＰ－２３３５４の構造を示している。

【0091】

本開示の方法のいくつかの態様では、ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は、Ｐａｌｌｕｋ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１８， Ｖｏｌ． ３６， Ｎｏ． ７， ｐｇｓ． ６４５－６５０に記載されたヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体を含むことができ、その内容の全体は参照によって本明細書に援用される。

【0092】

いくつかの態様では、ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体内のヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログを含むことができる。いくつかの態様では、ヌクレオチドアナログは、プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）ｄＮＴＰとすることができる。いくつかの態様では、ヌクレオチドアナログは、７－デアザ－７－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＡＴＰ、５－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＣＴＰ、７－デアザ－７－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＧＲＰ又は５－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＵＴＰとすることができる。図６は、これらの各種プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）ｄＮＴＰの構造を示している。

【0093】

いくつかの態様では、ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は、プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）ｄＮＴＰを、限定はされないがＢＰ－２３３５４などのアミン－チオールクロスリンカーと反応させて、光切断性リンカー－ヌクレオチド「リンカー－ｄＮＴＰ」を形成させることにより、調製することができる。上記リンカー－ｄＮＴＰのマレイミド部分を、次に、単一の露出したシステイン残基を含む、限定はされないがＴｄＴなどのポリメラーゼと反応させることで、ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体を形成させることができる。図８は、例示的なヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体調製法の模式図である。図８では、５－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＣＴＰを、まず、ＢＰ－２３３５４と反応させることで、「リンカー－ｄＣＴＰ」を形成させている。このリンカー－ｄＣＴＰを次に、単一の露出されたシステインを含むＴｄＴポリメラーゼと反応させることで、「ＴｄＴ－ｄＣＴＰ」を形成させている。この例では、ｄＣＴＰは、任意の他のプロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）ｄＮＴＰと置き換えることができ、それらのプロパギルアミノｄＮＴＰとしては、７－デアザ－７－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＡＴＰ、７－デアザ－７－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＧＲＰ又は５－プロパギルアミノ（ｐｒｏｐａｒｇｌｙａｍｉｎｏ）－ｄＵＴＰが挙げられるが、これらに限定はされない。

【0094】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）又はその生物活性部分とすることができる。いくつかの態様では、上記ＴｄＴは、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴとすることができる。いくつかの態様では、上記ＴｄＴは、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの短いアイソフォームとすることができ、これは以下のアミノ酸配列を有する：

【化1】

【0095】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの短いアイソフォームの１３２～５１０番残基を含むことができる。ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴ 短いアイソフォームの１３２～５１０番残基のアミノ酸配列は以下である：

【化2】

【0096】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、１８８位システインがアラニンに置換され、２１６位システインがセリンに置換され、３０２位システインがアラニンに置換され、３７８位システインがアラニンに置換され、４３８位システインがセリンに置換されるように、全ての露出した天然システイン残基が除去された、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの短いアイソフォームの１３２～５１０番残基を含むことができる。この配列は、本明細書では「露出したＣｙｓがない１３２～５１０位ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴ」と称するが、以下のアミノ酸配列を有する：

【化3】

【0097】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、１８０位のグルタミン酸がシステイン残基と置換された、露出したＣｙｓがない１３２～５１０位ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの配列を含むことができる。この配列、本明細書ではＭｍＴｄＴ１８０と称するが、以下のアミノ酸配列を有する：

【化4】

【0098】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、１８８位のアラニンがシステイン残基と置換された、露出したＣｙｓがない１３２～５１０位ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの配列を含むことができる。この配列、本明細書ではＭｍＴｄＴ１８８と称するが、以下のアミノ酸配列を有する：

【化5】

【0099】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、２５３位のトレオニンがシステイン残基と置換された、露出したＣｙｓがない１３２～５１０位ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの配列を含むことができる。この配列、本明細書ではＭｍＴｄＴ２５３と称するが、以下のアミノ酸配列を有する：

【化6】

【0100】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、３０２位のアラニンがシステイン残基と置換された、露出したＣｙｓがない１３２～５１０位ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＴｄＴの配列を含むことができる。この配列、本明細書ではＭｍＴｄＴ２５３と称するが、以下のアミノ酸配列を有する：

【化7】

【0101】

いくつかの態様では、ヌクレオチドポリメラーゼ複合体内のポリメラーゼは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）－融合タンパク質とすることができる。いくつかの態様では、ＭＢＰが、ＭＢＰとポリメラーゼの始めとの間の任意の長さのアミノ酸リンカーにより、ポリメラーゼのＮ末端に融合されていてもよい。

【0102】

本開示は、組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法であって、ａ）上記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；ｂ）上記組織試料を第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び第１の複数のポリメラーゼと接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメインのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させ、空間的バーコードドメインを形成することであって、上記第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、形成すること；ｃ）上記組織試料の少なくとも１つの部位に、上記可逆的ターミネーターヌクレオチドの上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記可逆的３’ターミネーター部分を遊離させ、上記組織試料の上記少なくとも１つの部位における上記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；ｄ）上記組織試料を追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び追加の複数のポリメラーゼと接触させることにより、工程（ｃ）で照射された上記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインの上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、上記追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して可逆的３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；ｅ）上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、且つ、上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；ｆ）上記組織試料内の標的分析物に結合した上記プローブを収集すること；並びに、ｇ）工程（ｆ）で収集された上記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、上記組織試料の上記第１部位及び上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより上記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、を含む、上記方法を提供するものである。

【0103】

上記方法の非限定例の模式図を図４Ａ～図４Ｎに示す。上記方法は図４Ａにおける試料から始まる。この非限定例では、上記試料は４個の細胞を含み、それぞれの細胞は測定対象である特定の標的ｍＲＮＡのコピーを少なくとも１つ含んでいる。細胞＃１、細胞＃２及び細胞＃３は上記標的ｍＲＮＡのコピーを１つ含み、細胞＃３は上記標的ｍＲＮＡのコピーを２つ含んでいる。

【0104】

上記試料は、図４Ｂに示されるように、各関心領域（ＲＯＩ）へと細区画され得る。この非限定例では、各ＲＯＩは上記細胞のうちの１つを含む。さらに、各ＲＯＩは、当該ＲＯＩに固有の、予め割り当てられた、特定の空間的バーコードでもある。この例では、各空間的バーコードは４個のヌクレオチドから構成されており、最初のヌクレオチドは任意のヌクレオチド（「Ｎ」で表されている）である。ＲＯＩ＃１の空間的バーコードはＮＧＡＴであり、ＲＯＩ＃２の空間的バーコードはＮＡＴＧであり、ＲＯＩ＃３の空間的バーコードはＮＡＴＴであり、ＲＯＩ＃４の空間的バーコードはＮＴＴＡである。本明細書でさらなる説明がなされるように、上記空間的バーコードには任意の数のヌクレオチドを含ませることができ、図４Ａ～図４Ｎに示された４ヌクレオチドの空間的バーコードは例示のみを目的としている。

【0105】

上記方法の第１工程では、図４Ｃに示されるように、上記試料は複数のプローブと接触させられ、図４Ｃの左上隅に示されているように、上記プローブは、標的ｍＲＮＡに結合する固有標的結合ドメイン、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメイン、及びフリーな３’－ＯＨ部分を含む。上記標的結合ドメインは上記標的ｍＲＮＡに特異的であり、各細胞内で各標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書でさらなる説明がなされるように、上記試料は任意の数の異なる種類のプローブを含む複数のプローブと接触させられる場合があり、各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む。図４Ａ～図４Ｎでは、例示のみを目的として、プローブの種類は１つである。

【0106】

図４Ｄに示される、上記方法の第２工程では、上記試料を複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び複数の ポリメラーゼと接触させることで、空間的バーコードドメインの最初のヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに結合した各プローブのフリーな３’－ＯＨに連結される。この非限定例では、上記可逆的ターミネーターヌクレオチドは、光切断性リンカー（四角星形として図示）を介してターミネーター部分（三角として図示）に動作可能に連結されたヌクレオチド（ｄＮＴＰ、「Ｎ」）を含む。この非限定例では、上記ポリメラーゼはＴｄＴである。上記可逆的ターミネーターヌクレオチド及びポリメラーゼとのインキュベーション後、それぞれの結合型プローブは、図４Ｅに示されるように、１つのヌクレオチド「Ｎ」分だけ伸長されたものとなる。

【0107】

図４Ｆに示される、上記方法の次の工程では、適切な空間的バーコードを構築するために「Ａ」ヌクレオチドの付加を必要とする各ＲＯＩに、上記可逆的ターミネーターヌクレオチド複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な波長の光が照射される。この非限定例では、ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３が「Ａ」ヌクレオチドの付加を必要とするため、これら２つのＲＯＩがこの工程で照射を受けている。上記照射は図４Ｆでの稲妻形と、照射された細胞の陰影で表されている。この照射の結果、照射後の各ＲＯＩの内部では、上記ターミネーター部分が、上記の予め連結されていた「Ｎ」ヌクレオチドから遊離され、後の工程で連結が生じ得るフリーな３’－ＯＨ部分が露出する。図４Ｇは、ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３を照射した後の試料を示している。ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３の結合型プローブは、光切断の結果として、フリーな３’－ＯＨ部分を有している。逆に、Ａヌクレオチドの付加を必要としないＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃４の結合型プローブは、ターミネーター部分が手付かずの光切断性リンカーにより、予め連結されていた「Ｎ」ヌクレオチドに結合したままであるため、フリーな３’－ＯＨ部分を有していない。

【0108】

上記方法は図４Ｈへと続き、上記試料が複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び複数のポリメラーゼと接触させられる。上記可逆的ターミネーターヌクレオチドは、光切断性リンカー（四角星形として図示）を介してターミネーター部分（三角として図示）に動作可能に連結されたｄＡＴＰ（「Ａ」）を含む。これらのＡヌクレオチドは、ＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３における結合型プローブにのみ連結されるが、これは、これらの結合型プローブが、連結反応を促進できるフリーな３’－ＯＨ部分を含む唯一のプローブだからである。ＲＯＩ＃１及びＲＯＩ＃４の結合型プローブの３’末端は結合されたままのターミネーター部分によって保護されている。図４Ｉに示されるように、「Ａ」ヌクレオチドがＲＯＩ＃２及びＲＯＩ＃３における空間的バーコードに付加され、それらのＲＯＩで空間的バーコードのさらなる合成がなされる。

【0109】

上記方法は図４Ｊへと続き、適切な空間的バーコードを構築するために「Ｔ」ヌクレオチドの付加を必要とする各ＲＯＩに、上記可逆的ターミネーターヌクレオチドの上記光切断性リンカーを切断するのに充分な波長の光が照射される。この非限定例では、ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４が次の工程で「Ｔ」ヌクレオチドの付加を必要とするため、これら３つのＲＯＩが照射される。この照射の結果、照射後の各ＲＯＩの内部では、上記ターミネーター部分が、上記の予め連結されていたヌクレオチドから遊離され、後の工程で連結が生じ得るフリーな３’－ＯＨ部分が露出する。図４Ｋは、ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４を照射した後の試料を示している。ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４の結合型プローブは、光切断の結果として、フリーな３’－ＯＨ部分を有している。逆に、Ｔヌクレオチドの付加を必要としないＲＯＩ＃１の結合型プローブは、ターミネーター部分が手付かずの光切断性リンカーにより、予め連結されていたヌクレオチドに結合したままであるため、フリーな３’－ＯＨ部分を有していない。

【0110】

上記方法は図４Ｌへと続き、上記試料が複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び複数のポリメラーゼと接触させられる。上記可逆的ターミネーターヌクレオチドは、光切断性リンカー（四角星形として図示）を介してターミネーター部分（三角として図示）に動作可能に連結されたｄＴＴＰ（「Ｔ」）を含む。これらのＴヌクレオチドは、ＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４における結合型プローブにのみ連結されるが、これは、これらの結合型プローブが、連結反応を促進できるフリーな３’－ＯＨ部分を含む唯一のプローブだからである。ＲＯＩ＃１の結合型プローブの３’末端は結合されたままのターミネーター部分によって保護されている。図４Ｍに示されるように、「Ｔ」ヌクレオチドがＲＯＩ＃２、ＲＯＩ＃３及びＲＯＩ＃４における空間的バーコードに付加され、それらのＲＯＩで空間的バーコードのさらなる合成がなされる。

【0111】

図４Ｎに示されるように各ＲＯＩにおける全ての結合型プローブが完全な空間的バーコードを持つまで、前述の工程が、上記４種のヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ）のいずれかを用いて任意の回数反復され得る。各ＲＯＩにおける全ての空間的バーコードの完成後、上記結合型プローブは上記試料から洗浄され、収集された後、シーケンスされ得る。収集されたプローブ毎に空間的バーコードをシーケンスすることで、その特定のプローブの由来元であるＲＯＩを特定することができ、各ＲＯＩ内の各標的ｍＲＮＡの存在量を定量化し、当該標的ｍＲＮＡの空間分解的な存在量プロファイルを得ることが可能となる。

【0112】

図４Ａ～図４Ｎにおけるヌクレオチド付加の順番（すなわちＡ、次にＴ、次にＧ）は、例示のみを目的にしている。本開示の方法では、ＲＯＩ毎に適切な空間的バーコードを合成するために、任意の順番及び／又は組み合わせで、ヌクレオチドが空間的バーコードに付加され得る。

【0113】

本開示の方法のいくつかの態様では、３’ターミネーター部分は、２－ニトロベンジルを含むことができる。

【0114】

本開示の方法のいくつかの態様では、可逆的ターミネーターヌクレオチドは、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＧＴＰ又は３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＴＴＰを含むことができる。これらの可逆的ターミネーターヌクレオチドの構造が図９に示されている。

【0115】

本開示の方法のいくつかの態様では、可逆的ターミネーターヌクレオチドは、その内容の全体が参照によって本明細書に援用される、Ｗｕ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ， ２００７， Ｖｏｌ． １０４， Ｎｏ． ４２， ｐｇｓ． １６４６２－１６４６７に記載されている修飾ヌクレオチドのいずれかを含むことができる。

【0116】

いくつかの態様では、本開示の方法は、組織試料の、少なくとも約１０箇所、又は少なくとも約１００箇所、又は少なくとも約１，０００箇所、又は少なくとも約１０，０００箇所、又は少なくとも約１００，０００箇所、又は少なくとも約１，０００，０００箇所、又は少なくとも約１０^７箇所、又は少なくとも約１０^８箇所、又は少なくとも約１０^９箇所、又は少なくとも約１０^１０箇所、又は少なくとも約１０^１１箇所、又は少なくとも約１０^１２箇所、又は少なくとも約１０^１３箇所、又は少なくとも約１０^１４箇所、又は少なくとも約１０^１５箇所、又はより多くの箇所における、任意の数の標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成するために使用することができる。

【0117】

いくつかの態様では、本開示の方法は、組織試料の任意の数の部位における、少なくとも約３個、又は少なくとも約４個、又は少なくとも約５個、又は少なくとも約６個、又は少なくとも約７個、又は少なくとも約８個、又は少なくとも約９個、又は少なくとも約１０個、又は少なくとも約２０個、又は少なくとも約３０個、又は少なくとも約４０個、又は少なくとも約５０個、又は少なくとも約６０個、又は少なくとも約７０個、又は少なくとも約８０個、又は少なくとも約９０個、又は少なくとも約１００個、又は少なくとも約２５０個、又は少なくとも約５００個、又は少なくとも約７５０個、又は少なくとも約１０００個、又は少なくとも約５０００個、又は少なくとも約１０，０００個、又は少なくとも約１００，０００個の標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成するために使用することができる。

【0118】

本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料を少なくとも２種のプローブを含む溶液と接触させることは、組織試料を、少なくとも約３種、又は少なくとも約４種、又は少なくとも約５種、又は少なくとも約６種、又は少なくとも約７種、又は少なくとも約８種、又は少なくとも約９種、又は少なくとも約１０種、又は少なくとも約２０種、又は少なくとも約３０種、又は少なくとも約４０種、又は少なくとも約５０種、又は少なくとも約６０種、又は少なくとも約７０種、又は少なくとも約８０種、又は少なくとも約９０種、又は少なくとも約１００種、又は少なくとも約２５０種、又は少なくとも約５００種、又は少なくとも約７５０種、又は少なくとも約１０００種、又は少なくとも約５０００種、又は少なくとも約１０，０００種、又は少なくとも約１００，０００種のプローブと接触させることを含むことができ、上記プローブは標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含み、各種プローブは少なくとも２つの標的分析物の１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む。

【0119】

本明細書で使用される場合、「空間的に検出する」という語は、その最も広い意味で、試料の特定の関心領域内で特定の標的分析物の存在を確認することを言うのに用いる。空間的に検出することは、試料の特定の関心領域内に存在する特定の標的分析物の量を定量化することを含むことができる。空間的に検出することは、試料の特定の関心領域内の少なくとも第２標的分析物の量と比較して、試料の特定の関心領域内の第１標的分析物の相対量を定量化することをさらに含むことができる。また、空間的に検出することは、同じ試料又は異なる試料の少なくとも第２関心領域内の同じ標的分析物の量と比較して、試料の第１関心領域内の特定の標的分析物の相対量を定量化することを含むことができる。

【0120】

標的分析物

【0121】

本開示の方法及び組成物のいくつかの態様では、標的分析物は、空間的に検出されることになっている試料内の任意の分子とすることができる。標的分析物としては、核酸分子及びタンパク質分子が挙げられるが、これらに限定はされない。標的分析物がタンパク質である場合、このタンパク質を標的タンパク質と呼ぶことがある。標的分析物が核酸である場合、この核酸を標的核酸と呼ぶことがある。標的核酸としては、ｍＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｇＤＮＡ又は試料内に存在する任意の他の核酸を挙げることができるが、これらに限定はされない。

【0122】

本開示の方法のいくつかの態様では、標的分析物は標的核酸である。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡとすることができる。標的核酸はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とすることができる。標的核酸はマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とすることができる。

【0123】

プローブ

【0124】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、ポリヌクレオチドとすることができる。いくつかの態様では、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、プローブは、ＤＮＡを含むことができる。いくつかの態様では、プローブは、一本鎖ポリヌクレオチドとすることができる。いくつかの態様では、プローブは、二本鎖ポリヌクレオチドとすることができる。いくつかの態様では、プローブは、部分的に一本鎖のポリヌクレオチドとすることができる。いくつかの態様では、プローブは、部分的に二本鎖のポリヌクレオチドとすることができる。

【0125】

いくつかの態様では、プローブは、核酸とアミノ酸との組み合わせを含むことができる。非限定例における、プローブはポリヌクレオチドに動作可能に連結した抗体を含むことができ、上記ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせを含む。

【0126】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、標的結合ドメインを含むことができる。

【0127】

上記標的結合ドメインは、一連のヌクレオチドを含むことができる（例えば、ポリヌクレオチドである）。上記標的結合ドメインは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、上記標的結合ドメインは、ＤＮＡを含む。いくつかの態様では、上記標的結合ドメインは、一本鎖ポリヌクレオチドである。

【0128】

標的結合ドメインがポリヌクレオチドである態様では、標的結合ドメインは、標的核酸に直接的又は間接的に結合することができる。標的結合ドメインは、シーケンスプローブの標的結合ドメインに相補的な標的核酸の一部分にハイブリダイズすることにより、標的核酸に直接的に結合することができる。

【0129】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブの上記標的結合ドメインは、試料に存在する標的核酸に（中間オリゴヌクレオチドを介して）間接的にハイブリダイズすることができる。

【0130】

シーケンスプローブの標的結合ドメインは、シーケンスプローブのハイブリダイゼーション及び／又は脱ハイブリダイゼーションの可能性、並びにこれらが起こる速度を調節するように設計されたものとすることができる。一般に、プローブのＴｍが低くなるほど、当該プローブが標的核酸に／から脱ハイブリダイズする速度は増し、可能性は高くなる。したがって、使用するプローブのＴｍが低いほど、標的核酸に結合するプローブの数は減少することなる。

【0131】

標的結合ドメインの長さは、部分的に、プローブが標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズしたままとなる可能性に影響する。一般に、標的結合ドメインが長くなるほど（ヌクレオチド数が大きくなるほど）、相補的配列が標的ヌクレオチドに存在しにくくなる。逆に、標的結合ドメインが短いほど、相補的配列が標的ヌクレオチドに存在しやすくなる。

【0132】

標的結合ドメインは、任意の数のヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、標的結合ドメインは、少なくとも約２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３ヌクレオチド長、又は少なくとも約４ヌクレオチド長、又は少なくとも約５ヌクレオチド長、又は少なくとも約６ヌクレオチド長、又は少なくとも約７ヌクレオチド長、又は少なくとも約８ヌクレオチド長、又は少なくとも約９ヌクレオチド長、又は少なくとも約１０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１１ヌクレオチド長、又は少なくとも約１２ヌクレオチド長、又は少なくとも約１３ヌクレオチド長、又は少なくとも約１４ヌクレオチド長、又は少なくとも約１５ヌクレオチド長、又は少なくとも約１６ヌクレオチド長、又は少なくとも約１７ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８ヌクレオチド長、又は少なくとも約１９ヌクレオチド長、又は少なくとも約２０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２１ヌクレオチド長、又は少なくとも約２２ヌクレオチド長、又は少なくとも約２３ヌクレオチド長、又は少なくとも約２４ヌクレオチド長、又は少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約２６ヌクレオチド長、又は少なくとも約２７ヌクレオチド長、又は少なくとも約２８ヌクレオチド長、又は少なくとも約２９ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、又は少なくとも約３１ヌクレオチド長、又は少なくとも約３２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３３ヌクレオチド長、又は少なくとも約３４ヌクレオチド長、又は少なくとも約３５ヌクレオチド長、又は少なくとも約３６ヌクレオチド長、又は少なくとも約３７ヌクレオチド長、又は少なくとも約３８ヌクレオチド長、又は少なくとも約３９ヌクレオチド長、又は少なくとも約４０ヌクレオチド長、又は少なくとも約４１ヌクレオチド長、又は少なくとも約４２ヌクレオチド長、又は少なくとも約４３ヌクレオチド長、又は少なくとも約４４ヌクレオチド長、又は少なくとも約４５ヌクレオチド長、又は少なくとも約４６ヌクレオチド長、又は少なくとも約４７ヌクレオチド長、又は少なくとも約４８ヌクレオチド長、又は少なくとも約４９ヌクレオチド長、又は少なくとも約５０ヌクレオチド長又はより長いヌクレオチド長とすることができる。

【0133】

本開示のプローブは、標的核酸を空間的に検出するために使用することができる。この態様では、上記標的結合ドメインは、標的核酸結合領域とすることができる。上記標的核酸結合領域は、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長であり、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である。特定の態様では、上記標的核酸結合領域は、およそ１０～５００ヌクレオチド長、およそ２０～４００ヌクレオチド長、およそ２５ヌクレオチド長、およそ３０～３００ヌクレオチド長、およそ３５ヌクレオチド長、およそ４０～２００ヌクレオチド長、又はおよそ５０～１００ヌクレオチド長である。標的核酸と結合しそれを同定するプローブ及び方法は、例えば、それぞれの全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００３／００１３０９１号明細書、同第２００７／０１６６７０８号明細書、同第２０１０／００１５６０７号明細書、同第２０１０／０２６１０２６号明細書、同第２０１０／０２６２３７４号明細書、同第２０１０／０１１２７１０号明細書、同第２０１０／００４７９２４号明細書、及び同第２０１４／０３７１０８８号明細書に記載されたものである。

【0134】

上記標的結合ドメインは、少なくとも１つの天然塩基を含むものであり得る。上記標的結合ドメインは、天然塩基を含まないものであり得る。上記標的結合ドメインは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含むものであり得る。上記標的結合ドメインは、修飾ヌクレオチドもヌクレオチドアナログも含まないものであり得る。上記標的結合ドメインは、少なくとも１つのユニバーサル塩基を含むものであり得る。上記標的結合ドメインは、ユニバーサル塩基を含まないものであり得る。上記標的結合ドメインは、少なくとも１つの縮重塩基を含むものであり得る。上記標的結合ドメインは、縮重塩基を含まないものであり得る。

【0135】

上記標的結合ドメインは、任意の組み合わせの、天然塩基（例えば、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の天然塩基）、修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ（例えば、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ）、ユニバーサル塩基（例えば、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上のユニバーサル塩基）、又は縮重塩基（例えば、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、又はそれ以上の縮重性塩基）を含むことができる。組み合わせて存在している場合、特定の標的結合ドメインの天然塩基、修飾ヌクレオチド若しくはヌクレオチドアナログ、ユニバーサル塩基、及び縮重塩基は、任意の順番で配列させることができる。

【0136】

「修飾ヌクレオチド」又は「ヌクレオチドアナログ」という語は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）、プロピン修飾核酸（ｐｒｏｐｙｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ジップ核酸（ｚｉｐ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＺＮＡ（登録商標））、イソグアニン、イソシトシン６－アミノ－１－（４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシメチル－テトラヒドロ－フラン－２－イル）－１，５－ジヒドロ－ピラゾロ［３，４－ｄ］ピリミジン－４－オン（ＰＰＧ）及び２’－Ｏ－メチル核酸などの２’－修飾核酸を包含するが、これらに限定はされない。上記標的結合ドメインは、０～６個（例えば、０個、１個、２個、３個、４個、５個又は６個）の修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを含むことができる。上記修飾ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログはロックド核酸（ＬＮＡ）であることが好ましい。

【0137】

「ロックド核酸（ＬＮＡ）」という語は、本明細書で使用される場合、修飾ＲＮＡヌクレオチドであって、リボース部分が２’位の酸素と４’位の炭素とを連結するメチレン架橋を含むものを包含するが、これに限定はされない。このメチレン架橋が、Ａ型ＲＮＡ二本鎖に存在する、ノースコンファメーション（ｎｏｒｔｈ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）としても知られている、３’－エンドコンファメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）のリボースをロックしている。インアクセシブルＲＮＡ（ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ＲＮＡ）という語を、ＬＮＡと同義的に使用することがある。「架橋型核酸（ＢＮＡ）」という語は、本明細書で使用される場合、ノースコンファメーション（ｎｏｒｔｈ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）としても知られている、固定された３’－エンドコンファメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）を有する、５員又は６員の架橋型構造を含む修飾ＲＮＡ分子を包含するが、これに限定はされない。上記架橋型構造はリボースの２’位の酸素をリボースの４’位の炭素に連結している。炭原子、窒原子、及び水素原子を含有する種々の架橋構造が可能である。「プロピン修飾核酸」という語は、本明細書で使用される場合、当該核酸塩基のＣ５位にプロピン修飾を含むピリミジン、すなわちシトシン及びチミン／ウラシルを包含するが、これらに限定はされない。「ジップ核酸（ＺＮＡ（登録商標））」という語は、本明細書で使用される場合、カチオン性のスペルミン部分と複合したオリゴヌクレオチドを包含するが、これらに限定はされない。

【0138】

「ユニバーサル塩基」という語は、本明細書で使用される場合、ワトソン・クリック塩基対の法則には従わないが、標的核酸上に位置する４種の正規塩基（Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ）のいずれにも結合できる、ヌクレオチド塩基を包含するが、これに限定はされない。「縮重塩基」という語は、本明細書で使用される場合、ワトソン・クリック塩基対の法則には従わないが、４種の正規塩基（Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、Ｇ）のうちの、４種全てではないが、少なくとも２種に結合できる、ヌクレオチド塩基を包含するが、これに限定はされない。縮重塩基はゆらぎ塩基と称されることもあり、これらの語は本明細書では同義的に使用される。

【0139】

いくつかの態様では、「縮重塩基」という語は、核酸分子（例えば、増幅プライマー、プローブなど）上の特定の位置を指して使用されることもあり、複数の核酸分子の文脈においては、独立して、上記複数の核酸分子中の異なる核酸分子上の１又は複数の異なるヌクレオチドとすることができる。非限定例では、複数の４ヌクレオチド長核酸分子は、縮重塩基を４番目のヌクレオチド位置に有する場合があり、この縮重塩基はＡ、Ｃ又はＧのいずれかとすることができ、１位、２位及び３位におけるこれらのヌクレオチドは異なる核酸分子間で同じである。すなわち、上記複数の核酸分子中には、４位にＡを有する核酸分子、４位にＣを有する核酸分子、及び４位にＧを有する核酸分子が存在する可能性があり、同時に、上記全ての核酸分子は１位、２位及び３位が同じである。

【0140】

標的分析物が標的タンパク質であるいくつかの態様では、標的結合ドメインはタンパク質標的結合ドメインとすることができる。いくつかの態様では、タンパク質標的結合ドメインは、標的タンパク質に結合する抗体又は抗体フラグメントを含むことができる。いくつかの態様では、抗体又はその抗原結合性フラグメントは、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ナノボディ、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子、ｓｃＦＶ又は多特異的抗体を含む。いくつかの態様では、タンパク質標的結合ドメインは、標的タンパク質に結合するアプタマーを含むことができる。いくつかの態様では、タンパク質標的結合ドメインは、生物試料内の標的タンパク質に特異的に結合できる任意の分子を含むことができる。

【0141】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、標的同定ドメインを含むことができる。

【0142】

標的同定ドメインは、プローブの標的結合ドメインに結合した標的分析物を同定する核酸分子である。上記標的同定ドメインは、上記プローブの標的結合ドメインに結合した上記標的分析物を同定する固有核酸配列を含む。非限定例では、Ｐ５３タンパク質に結合する標的結合ドメインを有するプローブは、Ｐ５３に対応する固有核酸配列を有する標的同定ドメインを含み、一方で、Ｐ９７タンパク質に結合する標的結合ドメインを有するプローブは、Ｐ９７に対応する固有核酸配列を有する標的同定ドメインを含む。

【0143】

標的同定ドメインは、任意の数のヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、標的同定ドメインは少なくとも約１２ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、標的同定ドメインは、少なくとも約７ヌクレオチド長～少なくとも約１７ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、標的同定ドメインは、少なくとも約２ヌクレオチド長～少なくとも約２２ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、標的同定ドメインは、少なくとも約２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３ヌクレオチド長、又は少なくとも約４ヌクレオチド長、又は少なくとも約５ヌクレオチド長、又は少なくとも約６ヌクレオチド長、又は少なくとも約７ヌクレオチド長、又は少なくとも約８ヌクレオチド長、又は少なくとも約９ヌクレオチド長、又は少なくとも約１０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１１ヌクレオチド長、又は少なくとも約１２ヌクレオチド長、又は少なくとも約１３ヌクレオチド長、又は少なくとも約１４ヌクレオチド長、又は少なくとも約１５ヌクレオチド長、又は少なくとも約１６ヌクレオチド長、又は少なくとも約１７ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８ヌクレオチド長、又は少なくとも約１９ヌクレオチド長、又は少なくとも約２０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２１ヌクレオチド長、又は少なくとも約２２ヌクレオチド長、又は少なくとも約２３ヌクレオチド長、又は少なくとも約２４ヌクレオチド長、又は少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約２６ヌクレオチド長、又は少なくとも約２７ヌクレオチド長、又は少なくとも約２８ヌクレオチド長、又は少なくとも約２９ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、又は少なくとも約３１ヌクレオチド長、又は少なくとも約３２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３３ヌクレオチド長、又は少なくとも約３４ヌクレオチド長、又は少なくとも約３５ヌクレオチド長、又は少なくとも約３６ヌクレオチド長、又は少なくとも約３７ヌクレオチド長、又は少なくとも約３８ヌクレオチド長、又は少なくとも約３９ヌクレオチド長又は少なくとも約４０ヌクレオチド長とすることができる。

【0144】

プローブの文脈においては、標的同定ドメインは、当該プローブの標的結合ドメインに結合した標的分析物を同定する核酸配列を含むポリヌクレオチドである。すなわち、標的同定ドメインは、当該標的同定ドメインが取り付けられた標的結合に結合した特定の標的分析物に事前に割り当てられた特定の核酸配列を含む。非限定例では、「標的分析物Ｘ」を空間的に検出するように設計された「プローブＸ」と称されるプローブは、標的同定ドメイン「標的同定ドメインＸ」に連結された、「標的結合ドメインＸ」と称される標的結合ドメインを含む。標的結合ドメインＸは標的分析物Ｘに結合し、標的同定ドメインＸは、「核酸配列Ｘ」と称される、標的分析物Ｘに対応する核酸配列を含む。したがって、本開示の方法を実施する当業者が、試料内の関心領域のプローブを収集し、シーケンシング後に核酸配列Ｘを得た場合、当該標的分析物Ｘが当該関心領域に存在したことを示すものであることが、当業者には理解される。核酸配列Ｘの量、又はシーケンスリードの数は、関心領域内の標的分析物Ｘの量を絶対的又は相対的に求める、定量化するために用いることができる。

【0145】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、固有分子識別子（ＵＭＩ）を含むことができる。

【0146】

いくつかの態様では、固有分子識別子は、少なくとも約９ヌクレオチド長～少なくとも約１９ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、固有分子識別子は、少なくとも約４ヌクレオチド長～少なくとも約２４ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、固有分子識別子は、約１４ヌクレオチド長とすることができる。固有分子識別子及びランダム分子タグという語は、本明細書では同義的に使用される。当該技術分野で公知の方法を用いて、固有分子識別子は、シーケンシング前に増幅におけるバイアスを補正するために使用することができる。

【0147】

本開示の方法及び組成物のいくつかの態様では、分子識別子は、少なくとも約５個のヌクレオチド、又は少なくとも約１０個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５個のヌクレオチド、又は少なくとも約２０個のヌクレオチド、又は少なくとも約２５個のヌクレオチド、又は少なくとも約３０個のヌクレオチド、又は少なくとも約３５個のヌクレオチド、又は少なくとも約４０個のヌクレオチド、又は少なくとも約４５個のヌクレオチド、又は少なくとも約５０個のヌクレオチドを含むことができる。

【0148】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、増幅プライマー結合部位を含むことができる。本明細書で使用される場合、「増幅プライマー結合部位」という語は、その最も広い意味で、少なくとも１つの増幅プライマーに相補的である、又は少なくとも部分的に相補的である、核酸配列を言うのに使用され、上記増幅プライマーは、ＰＣＲなどによりＤＮＡ合成及び／又はＲＮＡ合成をプライミングするのに充分な、短い一本鎖の、又は部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドである。

【0149】

本開示の方法のいくつかの態様では、増幅プライマー結合部位は、少なくとも約５個のヌクレオチド、少なくとも約１０個のヌクレオチド、少なくとも約１５個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２５個のヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約３５個のヌクレオチド、少なくとも約４０個のヌクレオチド、少なくとも約４５個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約５５個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約６５個のヌクレオチド又は少なくとも約７０個のヌクレオチドを含むことができる。

【0150】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、定常領域を含むことができる。いくつかの態様では、定常領域は、組織試料の各部位に対して同じである特定の核酸配列を含むことができる。

【0151】

本開示の方法のいくつかの態様では、定常領域は、少なくとも約１ヌクレオチド長、又は少なくとも約２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３ヌクレオチド長、又は少なくとも約４ヌクレオチド長、又は少なくとも約５ヌクレオチド長、又は少なくとも約６ヌクレオチド長、又は少なくとも約７ヌクレオチド長、又は少なくとも約８ヌクレオチド長、又は少なくとも約９ヌクレオチド長、又は少なくとも約１０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１１ヌクレオチド長、又は少なくとも約１２ヌクレオチド長、又は少なくとも約１３ヌクレオチド長、又は少なくとも約１４ヌクレオチド長、又は少なくとも約１５ヌクレオチド長、又は少なくとも約１６ヌクレオチド長、又は少なくとも約１７ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８ヌクレオチド長、又は少なくとも約１９ヌクレオチド長、又は少なくとも約２０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２１ヌクレオチド長、又は少なくとも約２２ヌクレオチド長、又は少なくとも約２３ヌクレオチド長、又は少なくとも約２４ヌクレオチド長、又は少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約２６ヌクレオチド長、又は少なくとも約２７ヌクレオチド長、又は少なくとも約２８ヌクレオチド長、又は少なくとも約２９ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長とすることができる。

【0152】

本開示の方法のいくつかの態様では、定常領域は、空間的バーコードがｉｎ ｓｉｔｕでプローブに付加された後、上記定常領域が標的同定ドメインと上記伸長した空間的バーコードとの間に位置するように、上記標的同定ドメインとフリーな３’－ＯＨ部分との間に位置させることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、上記定常領域は、配列解析の際に空間的バーコードドメインの開始部分を定めるために用いることができる。

【0153】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、５’から３’に向かって、標的結合ドメイン、次いで増幅プライマー結合部位、次いで固有分子識別子、次いで標的同定ドメインを含む、一本鎖ポリヌクレオチドとすることができる。前記プローブの模式図を図１０に示す。

【0154】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、５’から３’に向かって、標的結合ドメイン、次いで増幅プライマー結合部位、次いで固有分子識別子、次いで標的同定ドメイン、次いで定常領域を含む、一本鎖ポリヌクレオチドとすることができる。前記プローブの模式図を図２０に示す。

【0155】

本開示の方法のいくつかの態様では、プローブは、５’から３’に向かって、標的結合ドメイン、次いで増幅プライマー結合部位、次いで標的同定ドメイン、次いで固有分子識別子を含む、一本鎖ポリヌクレオチドとすることができる。

【0156】

各態様では、プローブが、典型的には免疫組織化学（ＩＨＣ）やｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に使用される濃度未満の濃度で試料に与えられる。あるいは（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、上記濃度は、ＩＨＣやＩＳＨに使用される濃度より著しく低くてもよい。例えば、上記プローブ濃度は、１／２倍、１／５倍、１／１０倍、１／２０倍、１／２５倍、１／３０倍、１／５０倍、１／６０倍、１／７０倍、１／８０倍、１／９０倍、１／１００倍、１／２００倍、１／３００倍、１／４００倍、１／５００倍、１／６００倍、１／７００倍、１／８００倍、１／９００倍、１／１０００倍、１／２０００倍、又はそれ以下、及び間の任意の数字であってもよい。各態様では、プローブは、１００ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．０１ｎＭ、及びそれ以下の濃度、並びに間の任意の濃度で、与えられる。

【0157】

タンパク質検出の際のバックグラウンドノイズは、インタクトなプローブ分子のネガティブ精製（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行うことにより低減することができる。これは、関心領域から溶離液を回収した後、プローブのアフィニティ精製を行うことでなすことができる。

【0158】

本開示の方法のいくつかの態様では、少なくとも１個、又は少なくとも２個、又は少なくとも３個、又は少なくとも４個、又は少なくとも５個、又は少なくとも６個、又は少なくとも７個、又は少なくとも８個、又は少なくとも９個、又は少なくとも１０個、又は少なくとも１１個、又は少なくとも１２個、又は少なくとも１３個、又は少なくとも１４個、又は少なくとも１５個、又は少なくとも１６個、又は少なくとも１７個、又は少なくとも１８個、又は少なくとも１９個、又は少なくとも２０個、又は少なくとも３０個、又は少なくとも４０個、又は少なくとも５０個、又は少なくとも６０個、又は少なくとも７０個、又は少なくとも８０個、又は少なくとも９０個、又は少なくとも１００個のプローブが、単一の標的分析物に結合し得る。本明細書で使用される場合、「タイリング（ｔｉｌｉｎｇ）」という語は、本開示のプローブが２個以上、標的分析物に結合している場合を説明するために使用される。

【0159】

プローブセット、複数のプローブ、複数のプローブを含む溶液は、少なくとも１種のプローブ、すなわち１つの標的を対象とするプローブ、を含むことができる。プローブセットは、少なくとも２種、例えば、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、３０種、４０種、５０種、６０種、７０種、８０種、９０種、１００種、２００種、３００種、４００種、５００種、６００種、７００種、８００種、９００種、１０００種、又はそれ以上の種類のプローブを含むことが好ましい。プローブセットは、各種プローブの１又は複数のコピーを含んでもよい。

【0160】

第１のプローブセット、第１の複数のプローブ、又は第１のプローブを含む溶液だけを試料に適用してもよい。あるいは（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、第２（又はより数字が大きい）のプローブセットを後に試料に適用してもよい。上記第１及び第２（又はより数字が大きい）は、核酸のみ、タンパク質のみ、又はその組み合わせを標的としてもよい。

【0161】

本開示では、２以上の標的（すなわち、タンパク質、核酸、又はその組み合わせ）が検出され；３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９ ２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上の標的、及びこれらの間の任意の数字、が検出される。

【0162】

プローブセットは、標的とされる細胞型又は組織型に基づいて予め定められてもよい。例えば、組織が乳がんであれば、プローブセットは、乳がん細胞（例えば、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、及びＰＲ）に関連するタンパク質を対象とするプローブ及び／又は正常乳房組織に関連するタンパク質を対象とするプローブを含むこととなる。さらに、上記プローブセットは、標的とされる細胞又は組織の発生状態に基づいて予め定められてもよい。あるいは（ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ）、上記プローブセットは、目的の細胞内局在、例えば、核、細胞質、及び膜に基づいて予め定められてもよい。例えば、Ｆｏｘｐ３、ヒストンＨ３、又はＰ－Ｓ６を対象とする抗体は核を標識し、ＣＤ３、ＣＤ４、ＰＤ－１、又はＣＤ４５ＲＯを対象とする抗体は細胞質を標識し、ＰＤ－Ｌ１を対象とする抗体は膜を標識する。

【0163】

空間的バーコードドメイン

【0164】

本開示の方法のいくつかの態様では、空間的バーコードドメインは、組織試料内の特定の関心部位／関心領域に固有である核酸配列を含む空間的識別子配列を含むことができる。このようにして、空間的バーコードが伸長し終わったプローブを収集しシーケンスするとき、ユーザーは、上記空間的バーコードドメインの上記空間的識別子配列を利用することで、プローブがその対応する標的分析物に結合していた場合に、プローブが組織試料のどの関心部位／関心領域にあったかを求めることができる。

【0165】

いくつかの態様では、空間的識別子配列は、少なくとも約１個のヌクレオチド、又は少なくとも約２個のヌクレオチド、又は少なくとも約３個のヌクレオチド、又は少なくとも約４個のヌクレオチド、又は少なくとも約５個のヌクレオチド、又は少なくとも約６個のヌクレオチド、又は少なくとも約７個のヌクレオチド、又は少なくとも約８個のヌクレオチド、又は少なくとも約９個のヌクレオチド、又は少なくとも約１０個のヌクレオチド、又は少なくとも約１１個のヌクレオチド、又は少なくとも約１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１３個のヌクレオチド、又は少なくとも約１４個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５個のヌクレオチド、又は少なくとも約１６個のヌクレオチド、又は少なくとも約１７個のヌクレオチド、又は少なくとも約１８個のヌクレオチド、又は少なくとも約１９個のヌクレオチド、又は少なくとも約２０個のヌクレオチド、又は少なくとも約２１個のヌクレオチド、又は少なくとも約２２個のヌクレオチド、又は少なくとも約２３個のヌクレオチド、又は少なくとも約２４個のヌクレオチド、又は少なくとも約２５個のヌクレオチド、又は少なくとも約２６個のヌクレオチド、又は少なくとも約２７個のヌクレオチド、又は少なくとも約２８個のヌクレオチド、又は少なくとも約２９個のヌクレオチド、又は少なくとも約３０個のヌクレオチド、又は少なくとも約３１個のヌクレオチド、又は少なくとも約３２個のヌクレオチド、又は少なくとも約３３個のヌクレオチド、又は少なくとも約３４個のヌクレオチド、又は少なくとも約３５個のヌクレオチド、又は少なくとも約３６個のヌクレオチド、又は少なくとも約３７個のヌクレオチド、又は少なくとも約３８個のヌクレオチド、又は少なくとも約３９個のヌクレオチド又は少なくとも約４０個のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、空間的識別子配列は、少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むことができる。

【0166】

本開示の方法のいくつかの態様では、空間的識別子配列は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個又は少なくとも２０個の空間的同定ドメインを含むことができる。図１１は、標的結合ドメイン、増幅プライマー結合部位、固有分子識別子及び標的同定ドメインと、加えて、本開示の方法におけるＴｄＴ伸長によって合成された空間的バーコードドメインとを含む、本開示のプローブの模式図である。この非限定例では、上記空間的バーコードドメインは、４つ（＃１、＃２、＃３及び＃４）の空間的同定ドメインを含む空間的識別子配列を含む。

【0167】

空間的同定ドメインは、少なくとも約１個、又は少なくとも約２個、又は少なくとも約３個のヌクレオチド、又は少なくとも約４個のヌクレオチド、又は少なくとも約５個のヌクレオチド、又は少なくとも約６個のヌクレオチド、又は少なくとも約７個のヌクレオチド、又は少なくとも約８個のヌクレオチド、又は少なくとも約９個のヌクレオチド、又は少なくとも約１０個のヌクレオチド、又は少なくとも約１１個のヌクレオチド、又は少なくとも約１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１３個のヌクレオチド、又は少なくとも約１４個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５個のヌクレオチド、又は少なくとも約１６個のヌクレオチド又は少なくとも約１７個のヌクレオチド、又は少なくとも約１８個のヌクレオチド、又は少なくとも約１９個のヌクレオチド、又は少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、空間的同定ドメインは含むことができる

【0168】

本開示の方法のいくつかの態様では、単一の空間的バーコードドメイン内の個々の空間的同定ドメインは、その同じ単一の空間的バーコードドメイン内の別の個々の空間的同定ドメインと比較して、同じ数又は異なる数のヌクレオチドを含むことができる。非限定例では、空間的バーコードドメインは、第１空間的同定ドメイン、第２空間的同定ドメイン、第３空間的同定ドメイン及び第４空間的同定ドメインという、４つの空間的同定ドメインを含んでもよい。上記第１空間的同定ドメインは２個のヌクレオチドを含んでもよく、第２空間的同定ドメインは３個のヌクレオチドを含んでもよく、上記第３空間的同定ドメインは２個のヌクレオチドを含んでもよく、上記第４空間的同定ドメインは４個のヌクレオチドを含んでもよい。このように、この非限定例では、上記第１空間的同定ドメインは上記第３空間的同定ドメインと同じ数のヌクレオチドを含むが、上記第２空間的同定ドメインと上記第４空間的同定ドメインとを比較した場合、異なる数のヌクレオチドを含む。

【0169】

本開示の方法のいくつかの態様では、単一の空間的バーコード内の各空間的同定ドメインは、３’末端に同じヌクレオチド含んでもよい。非限定例では、空間的バーコードドメインは、第１空間的同定ドメイン、第２空間的同定ドメイン、第３空間的同定ドメイン及び第４空間的同定ドメインという、４つの空間的同定ドメインを含んでもよい。この非限定例では、各空間的同定ドメインは、３’末端に「Ｃ」ヌクレオチドを含む。このように、上記第１空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＡＴＣ－３’を含んでもよく、第２空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＴＧＣ－３’を含んでもよく、上記第３空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＴＡＣ－３’を含んでもよく、上記第４空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＡＡＣ－３’を含んでもよい。なお、この非限定例では、上記空間的バーコードの各空間的同定ドメインは同じ数のヌクレオチドを含む。

【0170】

本開示の方法のいくつかの態様では、試料内に存在する任意の空間的バーコード内の各空間的同定ドメインは、３’末端に同じヌクレオチド含んでもよい。

【0171】

別の非限定例では、空間的バーコードドメインは、第１空間的同定ドメイン、第２空間的同定ドメイン、第３空間的同定ドメイン及び第４空間的同定ドメインという、４つの空間的同定ドメインを含んでもよい。この非限定例では、各空間的同定ドメインは、３’末端に「Ｃ」ヌクレオチドを含む。このように、上記第１空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＡＣ－３’を含んでもよく、第２空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＧＴＣ－３’を含んでもよく、上記第３空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＴＡＴＣ－３’を含んでもよく、上記第４空間的同定ドメインはヌクレオチド配列５’－ＡＡＣ－３’を含んでもよい。なお、この非限定例では、上記空間的バーコードの上記空間的同定ドメインは、異なる数のヌクレオチドを含み（上記第１空間的同定ドメインは２個のヌクレオチドを有し、上記第２空間的同定ドメインは３個のヌクレオチドを有し、上記第３空間的同定ドメインは４個のヌクレオチドを有し、上記第４空間的同定ドメインは３個のヌクレオチドを有する）、各空間的同定ドメインは３’末端に「Ｃ」ヌクレオチドを有する。

【0172】

理論に拘束されることを望むものではないが、空間的バーコード内の各空間的同定ドメインが同じ数のヌクレオチドを有しているのか、それとも異なる数のヌクレオチドを有しているのかによって、必要な伸長サイクルの数と、構築可能な異なる空間的バーコードの数、そして結果的には、単一の組織試料上で解析可能な関心領域の数を、決定することができる。例えば、空間的バーコードドメインは、それぞれ１個のヌクレオチドを含む、１０個又は１１個の空間的同定ドメインを含んでいてもよい。これにより、４^１０～４^１１種類の固有空間的バーコード配列の形成が可能であり、これは、４^１０～４^１１個の異なる関心領域を単一の組織試料上で解析できることを意味している。この構成では、組織試料上で上記バーコードの全てを構築するためには、４０～４４回の伸長サイクルが必要となる。別の例では、空間的同定ドメインが１個のヌクレオチド～４個のヌクレオチドの範囲の異なる数のヌクレオチドを有することができる場合、およそ２１０万種の固有空間的バーコードを構築できる。この構成では、空間的バーコードは全長７～２８ヌクレオチドとなり、上記バーコードの全てを構築するのに、たった２８回の伸長サイクルしか必要とならない。

【0173】

組織試料内の第１部位に対応する空間的バーコードドメインは、組織試料内の第２部位に対応する空間的バーコードドメインより多い数、それより少ない数、又はそれと同じ数の空間的同定ドメインを有してもよい。

【0174】

空間的バーコードドメインは、組織試料内の単一の関心部位／関心領域に特有且つ固有の核酸配列を含むことができる。例えば、空間的バーコードドメイン内の空間的同定ドメインの全てを組み合わせた核酸配列は、組織試料内の単一の関心部位／関心領域に特有且つ固有であり得る。このようにして、空間的バーコードが伸長し終わったプローブを収集しシーケンスするとき、ユーザーは、上記空間的バーコードドメインの配列を利用することで、プローブがその対応する標的分析物に結合していた場合に、プローブが組織試料のどの関心部位／関心領域にあったかを求めることができる。

【0175】

空間的同定ドメインは、少なくとも約１個、又は少なくとも約２個、又は少なくとも約３個のヌクレオチド、又は少なくとも約４個のヌクレオチド、又は少なくとも約５個のヌクレオチド、又は少なくとも約６個のヌクレオチド、又は少なくとも約７個のヌクレオチド、又は少なくとも約８個のヌクレオチド、又は少なくとも約９個のヌクレオチド、又は少なくとも約１０個のヌクレオチド、又は少なくとも約１１個のヌクレオチド、又は少なくとも約１２個のヌクレオチド、又は少なくとも約１３個のヌクレオチド、又は少なくとも約１４個のヌクレオチド、又は少なくとも約１５個のヌクレオチド、又は少なくとも約１６個のヌクレオチド又は少なくとも約１７個のヌクレオチド、又は少なくとも約１８個のヌクレオチド、又は少なくとも約１９個のヌクレオチド、又は少なくとも約２０個のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、空間的同定ドメインは を含むことができる

【0176】

本開示の方法のいくつかの態様では、上記方法は、組織試料の各部位で空間的バーコードドメインが合成された後（例えば、工程（ｅ））、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復することで、空間的バーコードドメインが３’末端に区切りドメインを含むように組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを伸長することをさらに含むことができる。

【0177】

区切りドメインは、組織試料の各部位に対して同じである特定の核酸配列を含むことができる。区切りドメインは、少なくとも１ヌクレオチド長、又は少なくとも２ヌクレオチド長、又は少なくとも３ヌクレオチド長、又は少なくとも４ヌクレオチド長、又は少なくとも５ヌクレオチド長、又は少なくとも６ヌクレオチド長、又は少なくとも７ヌクレオチド長、又は少なくとも８ヌクレオチド長、又は少なくとも９ヌクレオチド長、又は少なくとも１０ヌクレオチド長、又は少なくとも１１ヌクレオチド長、又は少なくとも１２ヌクレオチド長、又は少なくとも１３ヌクレオチド長、又は少なくとも１４ヌクレオチド長、又は少なくとも１５ヌクレオチド長、又は少なくとも１６ヌクレオチド長、又は少なくとも１７ヌクレオチド長、又は少なくとも１８ヌクレオチド長、又は少なくとも１９ヌクレオチド長、又は少なくとも２０ヌクレオチド長とすることができる。区切りドメインは、任意の核酸配列を含むことができる。非限定例では、上記区切りドメインは、核酸配列「ＴＣＴＣ」を含むことができる。図１２は図１１のプローブの模式図であり、その空間的バーコードドメインは、区切りドメインを含ませるためにＴｄＴ合成によってさらなる伸長がなされたものである。

【0178】

理論に拘束されることを望むものではないが、シーケンス解析の際に区切りドメインの配列を用いて空間的バーコードドメインの終わりを定めることによって、収集されたプローブのシーケンシングを介した定量化を助けることができる。

【0179】

本開示の方法のいくつかの態様では、上記方法は、組織試料の各部位で空間的バーコードドメインが合成された後（例えば、工程（ｅ））、空間的バーコードドメインがポリＴドメイン又は他の増幅プライマー結合部位を含むように組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを伸長することをさらに含むことができる。

【0180】

本開示の方法のいくつかの態様では、上記方法は、組織試料の各部位で空間的バーコードドメインが合成された後（例えば、工程（ｅ））、（ｉ）工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復して、上記組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインが区切りドメインを含むように伸長させること；並びに（ｉｉ）上記組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長させることをさらに含むことができる。

【0181】

図１３は図１１のプローブの模式図であり、その空間的バーコードドメインは、区切りドメインを含ませるためにＴｄＴ合成によってさらなる伸長がなされ、その後さらに、ポリＴドメインを含ませるためにＴｄＴ合成によってさらなる伸長がなされたものである。

【0182】

図２１は、図２０のプローブの模式図であり、上記プローブは空間的バーコードドメインを含ませるために本開示の方法におけるＴｄＴ合成によって伸長されたものであり、上記空間的バーコードドメインは４つの空間的同定ドメイン、区切りドメイン及びポリＴドメインを含む。

【0183】

いくつかの態様では、ポリＴドメインは、Ｔヌクレオチドのみから構成されるポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、上記ポリＴドメインは、少なくとも約１個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約３個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約４個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約６個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約７個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約８個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約９個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１１個のＴヌクレオチド又は少なくとも約１２個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１３個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１４個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１６個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１７個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１８個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１９個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約３０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約３５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約４０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約５０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約５５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約６０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約６５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約７０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約７５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約８０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約８５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約９０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約９５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１００個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１２５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１５０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約１７５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２００個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２２５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２５０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２７５個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約３００個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約３５０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約４００個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約４５０個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約５００個のＴヌクレオチド、又は少なくとも約２０００個のＴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、ポリＴドメインは、２０個より多いが５００個より少ないＴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、ポリＴドメインは、２０個より多いが２０００個より少ないＴヌクレオチドを含む。

【0184】

いくつかの態様では、第１結合型プローブの空間的バーコードドメインのポリＴドメインは、第２結合型プローブの空間的バーコードドメインのポリＴドメインと、同じ長さ又は異なる長さとすることができる。

【0185】

いくつかの態様では、組織試料の各部位における空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長することは、上記試料を、ｄＴＴＰ及びＴｄＴを含む溶液と接触させることを含むことができる。

【0186】

増幅法

【0187】

本開示の方法のいくつかの態様では、シーケンシングを介して定量化することは、組織試料から収集されたプローブを増幅することを含むことができる。

【0188】

いくつかの態様では、組織試料から収集されたプローブを増幅することは、第１増幅プライマー及び第２増幅プローブを用いて上記収集されたプローブを増幅することを含むことができる。いくつかの態様では、組織試料から収集されたプローブを増幅することは、上記収集されたプローブを、上記収集されたプローブにハイブリダイズする第１増幅プライマー及び第２増幅プライマーと接触させることを含むことができる。いくつかの態様では、組織試料から収集されたプローブを増幅することは、当該技術分野において公知の増幅反応を含むことができ、ＰＣＲが挙げられるが、これに限定はされない。

【0189】

本開示の方法のいくつかの態様では、増幅は、少なくとも１つのＮＧＳインデックス配列を含むことができる。いくつかの態様では、上記ＮＧＳインデックス配列は、ｉ５インデックス配列又はｉ７インデックス配列である。いくつかの態様では、上記ＮＧＳインデックス配列は、当該技術分野において公知の任意のインデックス配列とすることができる。

【0190】

いくつかの態様では、ＮＧＳインデックス配列は、少なくとも約１ヌクレオチド長、又は少なくとも約２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３ヌクレオチド長、又は少なくとも約４ヌクレオチド長、又は少なくとも約５ヌクレオチド長、又は少なくとも約６ヌクレオチド長、又は少なくとも約７ヌクレオチド長、又は少なくとも約８ヌクレオチド長、又は少なくとも約９ヌクレオチド長、又は少なくとも約１０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１１ヌクレオチド長、又は少なくとも約１２ヌクレオチド長、又は少なくとも約１３ヌクレオチド長、又は少なくとも約１４ヌクレオチド長、又は少なくとも約１５ヌクレオチド長、又は少なくとも約１６ヌクレオチド長、又は少なくとも約１７ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８ヌクレオチド長、又は少なくとも約１９ヌクレオチド長、又は少なくとも約２０ヌクレオチド長とすることができる。いくつかの態様では、ＮＧＳインデックス配列は少なくとも約８ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、ＮＧＳインデックス配列は少なくとも約１０ヌクレオチド長である。

【0191】

本開示の方法のいくつかの態様では、増幅プライマーは、ｉ５インデックス配列を含むことができ、上記ｉ５配列は、配列番号８～１３及び配列番号２０～１０，４０４のいずれか１つに記載の配列、又はその逆相補配列を含む。

【表1】

【0192】

本開示の方法のいくつかの態様では、増幅プライマーは、ｉ７インデックス配列を含むことができ、上記ｉ７配列は、配列番号１４～１０，４０４のいずれか１つに記載の配列、又はその逆相補配列を含む。

【表2】

【0193】

本開示の方法のいくつかの態様では、増幅プライマーは、シーケンシングプライマー結合部位を含むことができる。いくつかの態様では、シーケンシングプライマー結合部位は、少なくとも約１ヌクレオチド長、又は少なくとも約２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３ヌクレオチド長、又は少なくとも約４ヌクレオチド長、又は少なくとも約５ヌクレオチド長、又は少なくとも約６ヌクレオチド長、又は少なくとも約７ヌクレオチド長、又は少なくとも約８ヌクレオチド長、又は少なくとも約９ヌクレオチド長、又は少なくとも約１０ヌクレオチド長、又は少なくとも約１１ヌクレオチド長、又は少なくとも約１２ヌクレオチド長、又は少なくとも約１３ヌクレオチド長、又は少なくとも約１４ヌクレオチド長、又は少なくとも約１５ヌクレオチド長、又は少なくとも約１６ヌクレオチド長、又は少なくとも約１７ヌクレオチド長、又は少なくとも約１８ヌクレオチド長、又は少なくとも約１９ヌクレオチド長、又は少なくとも約２０ヌクレオチド長、又は少なくとも約２１ヌクレオチド長、又は少なくとも約２２ヌクレオチド長、又は少なくとも約２３ヌクレオチド長、又は少なくとも約２４ヌクレオチド長、又は少なくとも約２５ヌクレオチド長、又は少なくとも約２６ヌクレオチド長、又は少なくとも約２７ヌクレオチド長、又は少なくとも約２８ヌクレオチド長、又は少なくとも約２９ヌクレオチド長、又は少なくとも約３０ヌクレオチド長、又は少なくとも約３１ヌクレオチド長、又は少なくとも約３２ヌクレオチド長、又は少なくとも約３３ヌクレオチド長、又は少なくとも約３４ヌクレオチド長、又は少なくとも約３５ヌクレオチド長、又は少なくとも約３６ヌクレオチド長、又は少なくとも約３７ヌクレオチド長、又は少なくとも約３８ヌクレオチド長、又は少なくとも約３９ヌクレオチド長又は少なくとも約４０ヌクレオチド長とすることができる。

【0194】

いくつかの態様では、シーケンシングプライマー結合部位は、少なくとも約９ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、シーケンシングプライマー結合部位は、少なくとも約３４ヌクレオチド長である。

【0195】

本開示の方法のいくつかの態様では、増幅プライマーは、シーケンシングに好適なフローセルアダプター配列を含むことができる。本開示の方法で使用される少なくとも１つの増幅プライマーは、配列番号１０，４０５に記載の配列、又はその逆相補配列を含むＰ５フローセルアダプター配列を含むことができる。本開示の方法で使用される少なくとも１つの増幅プライマーは、配列番号１０，４０６に記載の配列、又はその逆相補配列を含むＰ７フローセルアダプター配列を含むことができる。

【0196】

いくつかの態様では、フローセルアダプター配列は、約１５個～約４０個のヌクレオチドを含むことができる。フローセルアダプター配列は、約２９個のヌクレオチドを含むことができる。フローセルアダプター配列は、約２４個のヌクレオチドを含むことができる。

【0197】

本開示の方法及び組成物のいくつかの態様では、シーケンシングに好適なフローセルアダプター配列は、少なくとも約５個のヌクレオチド、少なくとも約１０個のヌクレオチド、少なくとも約１５個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２５個のヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも約３５個のヌクレオチド 少なくとも約４０個のヌクレオチド、少なくとも約４５個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約５５個のヌクレオチド、少なくとも約６０個のヌクレオチド、少なくとも約６５個のヌクレオチド、少なくとも約７０個のヌクレオチド、少なくとも約７５個のヌクレオチド、少なくとも約８０個のヌクレオチド、少なくとも約８５個のヌクレオチド、少なくとも約９０個のヌクレオチド、少なくとも約９５個のヌクレオチド、又は少なくとも約１００個のヌクレオチドを含むことができる。

【0198】

いくつかの態様では、増幅プライマーはポリＡドメインを含むことができる。いくつかの態様では、ポリＡドメインは、Ａヌクレオチドのみから構成されるポリヌクレオチドである。いくつかの態様では、上記ポリＡドメインは、少なくとも約１個、又は少なくとも約２個、又は少なくとも約３個、又は少なくとも約４個、又は少なくとも約５個、又は少なくとも約６個、又は少なくとも約７個、又は少なくとも約８個、又は少なくとも約９個、又は少なくとも約１０個、又は少なくとも約１１個 又は少なくとも約１２個、又は少なくとも約１３個、又は少なくとも約１４個、又は少なくとも約１５個、又は少なくとも約１６個、又は少なくとも約１７個、又は少なくとも約１８個、又は少なくとも約１９個、又は少なくとも約２０個、又は少なくとも約２５個、又は少なくとも約３０個、又は少なくとも約３５個、又は少なくとも約４０個のＡヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、ポリＡドメインは、少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）約３２個のヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、ポリＡドメインを利用して、上記ポリＡドメインをポリＴドメインにハイブリダイズすることにより、シーケンスプローブを伸長後の空間的バーコードドメインにハイブリダイズすることができる。

【0199】

いくつかの態様では、増幅プライマーは、縮重塩基を含むことができる。いくつかの態様では、増幅プライマーは、少なくとも約２個の縮重塩基を含むことができる。いくつかの態様では、増幅プライマーは、少なくとも約３個、又は少なくとも約４個、又は少なくとも約５個、又は少なくとも約６個、又は少なくとも約７個、又は少なくとも約８個、又は少なくとも約９個、又は少なくとも約１０個の縮重塩基を含むことができる。いくつかの態様では、上記縮重塩基は、増幅プライマーの３’末端に位置させることができる。いくつかの態様では、複数の増幅プライマーの文脈では、上記複数の増幅プライマー内の縮重塩基の位置には、Ａヌクレオチド、Ｔヌクレオチド、Ｃヌクレオチド又はＧヌクレオチドがあってもよい。いくつかの態様では、複数の増幅プライマーの文脈では、縮重塩基の位置には、Ａヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、又はＧヌクレオチドがあってもよい。

【0200】

図１４Ａは、シーケンシングを介しプローブを定量化する一環として、組織試料から収集されたプローブを増幅する方法の例示的な模式図である。この非限定例では、上記プローブは、標的結合ドメイン、続いて増幅プライマー結合部位、続いて固有分子識別子、続いて標的同定ドメインを有する。この非限定例では、空間的バーコードが上記プローブの３’末端に合成及び伸長されている。上記空間的バーコードドメインはＴｄＴ伸長によって合成されたものであり、４つ（＃１、＃２、＃３及び＃４）の空間的同定ドメイン、区切りドメイン及びポリＴドメインを含む空間的識別子配列を含む。この非限定例では、第１増幅プライマーは、フローセルアダプター配列（Ｐ５）、続いてＮＧＳインデックス配列（ｉ５）、続いてシーケンシングプライマー結合部位、続いて上記プローブ上の上記増幅プライマー結合部位と一致する配列を有する。この非限定例では、第２増幅プライマーは、ポリＡドメイン、続いてシーケンシングプライマー結合部位、続いてＮＧＳインデックス配列（ｉ７）、続いてフローセルアダプター配列（Ｐ７）を有する。これらの増幅プライマーは、図示されているように上記プローブにハイブリダイズさせることができ、これらの増幅プライマーを使用することで、ＰＣＲを含むがこれに限定はされない標準的な技術を用いて上記プローブを増幅することができることは、当業者には理解される。

【0201】

図１４Ｂは、シーケンシングを介しプローブを定量化する一環として、組織試料から収集されたプローブを増幅する方法の例示的な模式図である。この非限定例では、上記プローブは、標的結合ドメイン、続いて増幅プライマー結合部位、続いて固有分子識別子、続いて標的同定ドメインを有する。この非限定例では、空間的バーコードが上記プローブの３’末端に合成及び伸長されている。上記空間的バーコードドメインはＴｄＴ伸長によって合成されたものであり、４つ（＃１、＃２、＃３及び＃４）の空間的同定ドメイン、区切りドメイン及びポリＴドメインを含む空間的識別子配列を含む。この非限定例では、第１増幅プライマーは、フローセルアダプター配列（Ｐ５）、続いてＮＧＳインデックス配列（ｉ５）、続いてシーケンシングプライマー結合部位、続いて上記プローブ上の上記増幅プライマー結合部位と一致する配列を有する。この非限定例では、第２増幅プライマーは、２つの縮重塩基（３’－ＮＢ－５’、ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｃ又はＧであり、ＢはＡ、Ｃ又はＧである）、続いてポリＡドメイン、続いてシーケンシングプライマー結合部位、続いてＮＧＳインデックス配列（ｉ７）、続いてフローセルアダプター配列（Ｐ７）を有する。上記縮重塩基は上記第２増幅プライマーの３’末端に位置する。これらの増幅プライマーは、図示されているように上記プローブにハイブリダイズさせることができ、これらの増幅プライマーを使用することで、ＰＣＲを含むがこれに限定はされない標準的な技術を用いて上記プローブを増幅することができることは、当業者には理解される。

【0202】

本開示の方法のいくつかの態様では、増幅プライマーは、アフィニティ部分を含むことができる。アフィニティ部分としては、ビオチンを挙げることができるが、これに限定はされない。増幅プライマーがアフィニティ部分を含む態様では、上記アフィニティ部分に特異的に結合する試薬を用いて増幅後プローブをさらに精製するために、上記アフィニティ部分を用いることができる。アフィニティ部分がビオチンであるいくつかの態様では、増幅後プローブを精製するために、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを用いることができる。

【0203】

照射法

【0204】

本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料の部位を照射することは、２光子励起法を用いて上記部位を照射することを含むことができる。いくつかの態様では、上記２光子励起法は、近赤外（ＮＩＲ）の波長を有する光を用いた２光子励起法である。いくつかの態様では、ＮＩＲ波長は、約７００ｎｍ～約１０００ｎｍとすることができる。理論に拘束されることを望むものではないが、２光子励起は、ＵＶ（３００～４０５ｎｍ）波長での１光子励起法を含む１光子励起法と比較した場合、空間的制限を改善し、励起のクロストークを最小限にすることが可能である。これにより、空間的バーコードを組織試料のより小さく、より輪郭がはっきりとした領域で合成し、本開示の方法の空間分解能及び正確度を増すことができる。

【0205】

いくつかの態様では、２光子励起法は、パターン化２光子照射法とすることができる。パターン化２光子照射法は、試料全体で、励起光の点をラスタースキャンすることを含むことができる。このラスタースキャンは、ガルバノミラー、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）ミラー、音響光学偏向器又はこれらの任意の組み合わせの使用を通じて達成することができる。パターン化２光子照射法は、レーザーをピクセル毎に高速にオンオフ変調することを含むことができる。そのような変調は、音響光学変調器、ポッケルスセル又はこれらの任意の組み合わせの使用を通じて達成することができる。いくつかの態様では、パターン化２光子照射法は、試料全体で、励起光の点をラスタースキャンし、レーザーをピクセル毎に高速にオンオフ変調することを含むことができる。

【0206】

２光子励起法の例示的な光学系模式図を図５Ａ及び図５Ｂに示す。

【0207】

本開示の方法のいくつかの態様では、２光子励起法は、エルビウムファイバーレーザーの使用を含むことができる。いくつかの態様では、エルビウムファイバーレーザーは、約１５５０ｎｍの波長の光を放出することができる。いくつかの態様では、エルビウムファイバーレーザーからの光を、パルス幅が１００フェムト秒未満の約７７５ｎｍに周波数倍増することができる。

【0208】

本開示の方法のいくつかの態様では、２光子励起法は、７８０ｎｍのファイバーベースのフェムト秒レーザーの使用を含むことができる。いくつかの態様では、レーザーの反復率は、９０フェムト秒未満のクリーンなパルス幅を有する１０～８０ＭＨｚに特定することができる。いくつかの態様では、ビーム品質のＭ^２因子は１．２未満とすることができる。いくつかの態様では、ビーム直径は約１．５７ｍｍとすることができる。いくつかの態様では、ビーム新円度は少なくとも９４％とすることができる。

【0209】

本発明に２光子照射を適用することで、ユーザー定義の組織領域、ユーザー定義の細胞、及び／又はユーザー定義の細胞内の細胞下構造における、タンパク質及び／又は核酸の発現を検出し定量化する能力に、３つの驚くべき改善がもたらされた。１つ目は、本発明で使用されたような２光子照射が、Ｚ解像度を劇的に改善し、Ｘ－Ｙ解像度を多少改善することである。２つ目は、２光子照射では、特徴から離れた視野全体のバックグラウンドも小さくなることである（図２２参照）。３つ目は、おそらく最も重大であるが、１光子ＵＶ照射では、細胞構造によって引き起こされる、予想外の回析、散乱及び／又は光パイプ現象が存在することである。これらのアーティファクトは、回析期待値以下に、紫外光を集光する能力を著しく低下させる可能性がある。これらの組織的アーティファクトは、本発明で使用されるような２光子照射では存在しない。

【0210】

関心部位又は関心領域

【0211】

本明細書で使用される場合、「組織試料の部位」及び「関心領域」という語は、同義的に用いられて、内部の１又は複数の標的分析物の存在量が定量化される組織試料の特定の定義された領域を指す。

【0212】

本開示の方法のいくつかの態様では、関心領域は、ｘ方向及び／若しくはｙ方向に約１０ｎｍ以上、ｘ方向及び／若しくはｙ方向に約１００ｎｍ以上、又は、ｘ方向及び／若しくはｙ方向に約４００ｎｍ以上とすることができる。本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料の照射部位は、ｘ方向及び／若しくはｙ方向に約１０ｎｍ以上、ｘ方向及び／若しくはｙ方向に約１００ｎｍ以上、又は、ｘ方向及び／若しくはｙ方向に約４００ｎｍ以上とすることができる。

【0213】

本開示の方法のいくつかの態様では、関心領域は、ｚ方向に約１０ｎｍ以上、ｚ方向に約５００ｎｍ以上、又は、ｚ方向に約１５００ｎｍ以上とすることができる。本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料の照射部位は、ｚ方向に約１５００ｎｍ以下とすることができる。

【0214】

関心領域は、試料に存在する組織型、細胞型、細胞、又は細胞内の細胞下構造としてよい。

【0215】

まとめると、第１関心領域（例えば、組織型、細胞型（正常細胞及び異常細胞を含む）、並びに細胞内部の細胞下構造）に存在する標的タンパク質及び／又は標的核酸の正体及び存在量と、第２関心領域又はそれ以上の関心領域に存在する標的タンパク質及び／又は標的核酸の正体及び存在量との比較を、本開示の方法を用いて行うことができる。

【0216】

いくつかの態様では、関心領域は単一細胞を含んでもよい。いくつかの態様では、関心領域は、限定はされないが、２個以下の細胞、３個以下の細胞、４個以下の細胞、５個以下の細胞、６個以下の細胞、７個以下の細胞、８個以下の細胞、９個以下の細胞、又は１０個以下の細胞などの、複数の細胞を含んでもよい。

【0217】

いくつかの態様では、関心領域は、単一細胞内部の細胞下構造を含んでもよい。

【0218】

いくつかの態様では、組織試料の領域はユーザーによって手動で選ばれてもよく、その領域内の各細胞は自動的に関心領域として確認されエンコードされる。細胞は特定の染色によって確認することができ、ソフトウェアを用いて細胞の境界が定められる。これにより、本明細書に記載の方法及びシステムは、ユーザインタラクションを最小限にして、各細胞を別々にエンコードすることができる。

【0219】

プローブ収集

【0220】

本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料内の標的分析物に結合したプローブを収集する工程は、組織試料をスクレイピングすること、組織試料をプロテアーゼＫで消化すること、又はこれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの態様では、プロテアーゼＫ消化を約５６℃で少なくとも約１時間行った後、さらなる消化を約９０℃で少なくとも約１５分間行うことができる。

【0221】

当業者には理解されるように、本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料内の標的分析物に結合したプローブを収集する工程は、ＡＭＰｕｒｅ ＳＰＲＩ精製を含むことができる。

【0222】

当業者には理解されるように、本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料内の標的分析物に結合したプローブを収集する工程は、ｘＧｅｎハイブリダイゼーションキャプチャーをベースとした精製を含むことができる。

【0223】

いくつかの態様では、ｘＧｅｎハイブリダイゼーションキャプチャーをベースとした精製は、組織試料内の標的分析物に結合したプローブに少なくとも１つのキャプチャープローブをハイブリダイズすることを含む。

【0224】

いくつかの態様では、キャプチャープローブは、アフィニティ部分を含むことができる。アフィニティ部分はビオチンとすることができる。

【0225】

いくつかの態様では、キャプチャープローブは、本開示のプローブに相補的な核酸配列の少なくとも１コピーを含むことができる。いくつかの態様では、キャプチャープローブは、本開示のプローブに相補的な核酸配列の少なくとも約２コピーを含むことができる。いくつかの態様では、キャプチャープローブは、本開示のプローブに相補的な核酸配列の少なくとも約３コピー、又は少なくとも約４コピー、又は少なくとも約５コピー、又は少なくとも約６コピー、又は少なくとも約７コピー、又は少なくとも約８コピー、又は少なくとも約９コピー、又は少なくとも約１０コピーを含むことができる。本開示のプローブに相補的な核酸配列は、上記プローブ上に位置する増幅プライマー結合部位に相補的であるとすることができる。

【0226】

図２３は、シーケンシングを介しプローブを定量化する一環として、組織試料から収集されたプローブを精製する方法の例示的な模式図である。この非限定例では、上記プローブは、標的結合ドメイン、続いて増幅プライマー結合部位、続いて固有分子識別子、続いて標的同定ドメインを有する。この非限定例では、空間的バーコードが上記プローブの３’末端に合成及び伸長されている。上記空間的バーコードドメインはＴｄＴ伸長によって合成されたものであり、４つ（＃１、＃２、＃３及び＃４）の空間的同定ドメイン、区切りドメイン及びポリＴドメインを含む空間的識別子配列を含む。この非限定例では、上記プローブ上の上記増幅プライマー結合部位に相補的な配列を２コピー含む、キャプチャープローブが用いられている。上記キャプチャープローブは、ビオチン部分をさらに含む。上記キャプチャープローブを上記プローブにハイブリダイズさせた後、上記ビオチン部分を５×ＳＳＰＥバッファー中のストレプトアビジンビーズに結合させる。その後、上記ビーズを、熱５×ＳＳＰＥと室温（ＲＴ）の０．１×ＳＳＰＥで洗浄してもよい。その後、上記プローブを、熱Ｈ_２Ｏ中で上記ストレプトアビジンビーズから抽出してもよい。

【0227】

実施例４は、本開示の方法で使用することができるｘＧｅｎハイブリダイゼーションキャプチャーをベースとした精製の非限定例を記載している。当業者には理解されることであるが、実施例４に記載された、試薬の体積、試薬の量、試薬の濃度、特定の工程の長さ、及び特定の工程が行われる温度は変更することができ、特定の試料タイプ及び／又は試料サイズに合うように最適化できる。

【0228】

組織試料の前処理

【0229】

本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料を少なくとも１つのプローブ又は複数のプローブと接触させる工程は、上記組織試料を、上記少なくとも１つのプローブ又は上記複数のプローブと共に、少なくとも約１時間、又は少なくとも約２時間、又は少なくとも約３時間、又は少なくとも約４時間、又は少なくとも約５時間、又は少なくとも約６時間、又は少なくとも約７時間、又は少なくとも約８時間、又は少なくとも約９時間、又は少なくとも約１０時間、又は少なくとも約１１時間、又は少なくとも約１２時間、又は少なくとも約２４時間、又は少なくとも約３６時間、又は少なくとも約４８時間インキュベートすることを含むことができる。

【0230】

本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料を少なくとも１つのプローブ又は複数のプローブと接触させる工程は、上記組織試料を、ｄｄＴＴＰで終結されたブロッキングＤＮＡと組み合わせて、上記少なくとも１つのプローブ又は複数のプローブと接触させることを含むことができる。

【0231】

本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料を少なくとも１つのプローブ又は複数のプローブと接触させる前に、上記組織試料を、ｄｄＴＴＰ（ジデオキシチミジン三リン酸）終結に供してもよい。ｄｄＴＴＰ終結は、上記組織試料をｄｄＴＴＰ及びＴｄＴと接触させることを含むことができる。理論に拘束されることを望むものではないが、ｄｄＴＴＰ終結を行うことで、上記組織試料内の内在性核酸のフリーな３’－ＯＨ部分を除去封鎖し、上記内在性核酸が空間的バーコードの伸長時に伸長されることを防止する。

【0232】

本開示の方法のいくつかの態様では、組織試料内の標的分析物に結合したプローブを収集する工程は、ＥｘｏＩＩＩ消化を含むことができる。理論に拘束されることを望むものではないが、ＥｘｏＩＩＩ消化により、ｄｓＤＮＡを取り除き、ｓｓＤＮＡ又は突出３’オーバーハングを有するｄｓＤＮＡを集積させることができる。

【0233】

ランドマークプローブ及び方法

【0234】

いくつかの態様では、本開示の方法は、試料を、本開示の少なくとも１つの一般的ランドマークプローブと共にインキュベートすることをさらに含むことができる。

【0235】

いくつかの態様では、本開示の方法は、試料内で結合している少なくとも１つの一般的ランドマークプローブを検出することをさらに含むことができる。

【0236】

いくつかの態様では、試料内で結合している少なくとも１つの一般的ランドマークプローブの検出は、試料内の個々の細胞の境界を定めるために利用することができる。試料内の個々の細胞の境界を検出することで、下流の試料内の空間的バーコードの合成のための、空間的パターンを決定することができる。いくつかの態様では、試料内の１又は複数の一般的ランドマークプローブの検出を利用して、蛍光細胞画像を生成し、その後それに、後に収集される遺伝子発現データをマッピングすることで、空間分解的な遺伝子発現プロファイルを生成することができる。

【0237】

いくつかの態様では、一般的ランドマークプローブは、検出可能な標識を含むことができる。いくつかの態様では、上記検出可能な標識は、蛍光ラベルとすることができる。

【0238】

いくつかの態様では、一般的ランドマークプローブは、少なくとも１つの抗体を含むことができる。上記抗体は、少なくとも１つの細胞性マーカーに特異的に結合することができる。いくつかの態様では、上記少なくとも１つの抗体は、少なくとも１つの検出可能な標識に、直接的又は間接的に、連結することができる。

【0239】

細胞性マーカーは、細胞質マーカーとすることができる。細胞性マーカーは、当該技術分野において公知の任意の細胞質マーカーとすることができる。細胞質マーカーの例としては、細胞の細胞質内に独占的に又は主要に位置している特定のタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。細胞の細胞質内に独占的に又は主要に位置している特定のタンパク質としては、微小管タンパク質、ビメンチン、デスミン及びサイトケラチンを挙げることができるが、これらに限定はされない。

【0240】

細胞性マーカーは、膜マーカーとすることができる。細胞性マーカーは、当該技術分野において公知の任意の膜マーカーとすることができる。膜マーカーの例としては、独占的に又は主要に、細胞内の特定の膜上にある、それと結合している、又はそれに埋め込まれた、特定のタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。このようなタンパク質の例として、ナトリウム・カリウムＡＴＰアーゼ、細胞膜カルシウムＡＴＰアーゼ（ＰＭＣＡ）、カドヘリンファミリーのタンパク質、ＣＤ９８、カベオラと結合しているタンパク質（例えばカベオリン）、当該技術分野において公知の任意の内在性膜タンパク質、及び当該技術分野において公知の任意の膜結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0241】

細胞性マーカーは、細胞小器官マーカーとすることができる。細胞小器官マーカーは、当該技術分野において公知の任意の細胞小器官マーカーとすることができる。細胞小器官マーカーの例としては、独占的に又は主要に、特定の細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、リボソーム、リソソーム、エンドソーム、ペルオキシソーム、オートファゴソーム、又は当該技術分野において公知の任意の他の細胞小器官）と結合している特定のタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。このようなタンパク質の例としては、カルレティキュリン（小胞体）、ＧＭ１３０（ゴルジ体）、ＡＴＰ５Ａ（ミトコンドリア）、ＴＯＭＭ２０（ミトコンドリア）、ＲＰＳ３（リボソーム）、Ｍ６ＰＲ（リソソーム）、ＥＥＡ１（エンドソーム）、ＲＡＢ７（エンドソーム）、カタラーゼ（ペルオキシソーム）、ＳＱＳＴＭ１／ｐ６２（オートファゴソーム）、及びＬＣ３Ｂ（オートファゴソーム）が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0242】

細胞性マーカーは、核マーカーとすることができる。核マーカーは、当該技術分野において公知の任意の核マーカーとすることができる。核マーカーの例としては、独占的に又は主要に、細胞の核、又は細胞の核内の特定の下部構造と結合している特定のタンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。このようなタンパク質の例としては、ＫＤＭ１、ＮＵＰ９８、ラミンＡ、ラミンＣ、ラミン、ＳＣ３５、フィブリラリン、ＨＰ１α、ＣＥＮＰＡ又は当該技術分野において公知の任意の他の核タンパク質が挙げられるが、これらに限定はされない。また、核マーカーとして、細胞の核酸を染色するためのＤＡＰＩ又はＳＹＴＯ９などの核酸染色も挙げることができるが、これらに限定はされない。

【0243】

いくつかの態様では、本開示の一般的ランドマークプローブは、原形質膜、核膜、小胞体膜、リソソーム膜、又は当該技術分野において公知の任意の他の膜など、細胞における１又は複数の特定の膜を標的とする色素を含むことができる。

【0244】

いくつかの態様では、試料内の個々の細胞の境界を定める目的で、本開示の一般的ランドマークプローブを検出することができる。試料内の個々の細胞の境界を検出することで、下流の試料内の空間的バーコードの合成のための、空間的パターンを決定することができる。いくつかの態様では、試料内の１又は複数の一般的ランドマークプローブの検出を利用して、蛍光細胞画像を生成し、その後それに、後に収集される遺伝子発現をマッピングすることで、空間分解的な遺伝子発現プロファイルを生成することができる。

【0245】

試料

【0246】

本開示のいくつかの態様では、試料は、細胞（初代細胞及び培養細胞株の両方を含む）及び組織（培養組織又は移植組織を含む）を含むが、これらに限定はされない、任意の数の物を含んでもよい。各態様では、組織試料（固定又は未固定）を包埋し、連続切片にし、顕微鏡用スライド上に固定する。周知のように、一対の連続切片は、両方の連続切片に存在する少なくとも１つの細胞を含むこととなる。１つ目の連続切片上に位置する構造及び細胞型は、隣接した連続切片上では同様の位置を有することとなる。上記試料は、スライド上に固定された培養細胞又は分離細胞（固定又は未固定）とすることができる。試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料とすることができる。

【0247】

各態様では、組織試料は、生検腫瘍又はその一部、すなわち臨床的に関連する組織試料である。例えば、上記腫瘍は乳がん由来の腫瘍としてもよい。上記試料は摘出されたリンパ節としてもよい。

【0248】

上記試料は、実質的にいかなる生物からも得ることができ、例えば、植物界、真菌界、及び動物界の多細胞生物が挙げられ；好ましくは、上記試料は動物、例えば哺乳動物から得られる。ヒト試料が特に好ましい。

【0249】

いくつかの態様では、本明細書に記載のプローブ、組成物、方法、及びキットは、状態の診断で使用される。本明細書で使用される場合、状態を診断する、又は状態の診断という語は、状態を予測又は診断すること、状態の素因を判定すること、状態の治療をモニターすること、疾患の治療反応を診断すること、並びに、状態の予後、状態の進行、及び状態の特定の治療に対する反応を診断すること、を包含する。例えば、組織試料を、本明細書に記載のプローブ、方法、又はキットのいずれかによりアッセイすることで、試料における疾患又は悪性細胞型のマーカーの存在及び／又は量を（非疾患状態と比較して）求め、それにより、疾患又はがんを診断又は病期判定できる。

【0250】

一般に、スライドに付着させた試料を、まず、蛍光（例えば、蛍光抗体又は蛍光染色液（例えば、ＤＡＰＩ））を用いてイメージングし、形態、関心領域、目的の細胞型、及び単一細胞を確認してから、同スライド上の試料からタンパク質及び／又は核酸の発現をデジタル処理でカウントすることができる。

【0251】

シーケンシング

【0252】

本開示の方法のいくつかの態様では、シーケンシングを介して定量化することは、当該技術分野において公知の任意のシーケンス法を用いて、ａ）特定の標的分析物に対応する（すなわち、特定の標的同定ドメインを含む）、及び、ｂ）特定の関心部位／関心領域に対応し結合している（すなわち、空間的バーコードドメイン内に同じ識別子ドメインを含む）、収集されたプローブの数を求めることを含むことができる。

【0253】

シーケンシングは、任意の公知のシーケンス法で行うことができ、次世代シーケンス法、合成によるシーケンシング、大規模並列シーケンス、又は当業者に公知であり実施される任意の他のシーケンス法が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0254】

好ましい態様では、核酸増幅は固相核酸増幅とすることができる。すなわち、さらなる態様において、本発明は、鋳型ポリヌクレオチド分子の固相核酸増幅の方法であって、本開示の方法を用いて５’末端及び３’末端に共通の配列を有する鋳型ポリヌクレオチド分子のライブラリーを作製すること、並びに、上記鋳型ポリヌクレオチド分子が増幅される固相核酸増幅反応を行うこと、を含む方法を提供するものである。核酸増幅及びシーケンシングのための組成物及び方法は、例えば、米国特許第９３７６６７８号明細書に記載されており、上記米国特許はその全体が参照によって本明細書に援用される。

【0255】

「固相増幅」という語は、本明細書で使用される場合、増幅産物の全て又は一部が、形成されながら、固相上に固定されるように、固相上で、又は固相と共同して実行される任意の核酸増幅反応を指す。特に、上記語は、フォワード増幅プライマー及びリバース増幅プライマーの一方又は両方が固相上に固定されることを除いて標準的液相ＰＣＲに類似した反応である、固相ポリメラーゼ連鎖反応（固相ＰＣＲ）を包含する。

【0256】

本発明は一方の増幅プライマーだけが固定される（他方のプライマーは通常、遊離溶解状態で存在する）「固相」増幅法を包含するが、上記固相は、固定されたフォワードプライマー及びリバースプライマーの両方が備わっていることが好ましい。実際には、ＰＣＲプロセスが増幅を持続するために過剰なプライマーを必要とすることから、「複数」の同一のフォワードプライマー及び／又は「複数」の同一のリバースプライマーが固相上に固定されて存在することとなる。したがって、本明細書でフォワードプライマー及びリバースプライマーと言う場合、文脈上特に指示がない限り、「複数」の係るプライマーを包含すると解釈されるべきである。

【0257】

当業者（ｓｋｉｌｌｅｄ ｒｅａｄｅｒ）には理解されることであるが、いかなるＰＣＲ反応であっても、増幅対象の鋳型に特異的な少なくとも１種のフォワードプライマー及び少なくとも１種のリバースプライマーを必要とする。しかし、ある態様では、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーは、同一配列の鋳型特異的な部分を含んでもよく、また、全く同一のヌクレオチド配列及び構造（任意の非ヌクレオチド修飾を含む）を有してもよい。言い換えれば、１種類のプライマーだけを用いて固相増幅を行うことが可能であり、そのような単一プライマー法も本発明の範囲に包含される。他の態様は、同一の鋳型特異的配列を含むが、その他の構造的特徴においては異なる、フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いる場合がある。例えば、１種類のプライマーが、その他には存在しない非ヌクレオチド修飾を含む場合がある。

【0258】

本発明の他の態様では、上記フォワードプライマー及びリバースプライマーは、配列が異なる鋳型特異的な部分を含んでもよい。

【0259】

固相ＰＣＲ用の増幅プライマーが、当該プライマーの５’末端において、又はその付近で固相に共有結合で固定され、当該プライマーの鋳型特異的な部分がその同族異型へのアニーリング用にフリーであり、且つ、３’ヒドロキシル基がプライマー伸長用にフリーであることが好ましい。この目的のために、当該技術分野において公知の任意の好適な共有結合手段が使用されてよい。選択される結合化学は、固相の性質と、それに適用されたあらゆる誘導体化又は機能化に依存する。プライマーそれ自体が、結合を容易にする、非ヌクレオチド化学修飾であってもよい、部分を含んでもよい。１つの特定の好ましい態様では、上記プライマーは、ホスホロチオエート又はチオリン酸塩などの硫黄含有求核剤を、５’末端に含んでもよい。固相支持ポリアクリルアミドハイドロゲル（以下で説明される）の場合、この求核剤が、当該ハイドロゲル中に存在する「Ｃ」基に結合する。プライマー及び鋳型を固相に結合する最も好ましい手段は、重合アクリルアミド及びＮ－（５－ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）から構成される、ハイドロゲルに対する、５’ホスホロチオエート結合を介したものである。

【0260】

「クラスター」及び「コロニー」という語は、本明細書では同義的に使用されて、複数の同一の固定された核酸鎖及び複数の同一の固定されていない相補的核酸鎖から構成される、固相上に分散した部位を指す。「クラスター化されたアレイ」という語は、そのようなクラスター又はコロニーから形成されたアレイを指す。この文脈において、「アレイ」という語は、クラスターの規則正しい配列を必要とするものと理解されるべきではない。

【0261】

本発明には、固相増幅によって生成された増幅後核酸をシーケンスする方法も包含される。すなわち、本発明は、上記の本開示の方法により核酸鋳型のライブラリーを増幅することであって、上記のような固相増幅を用いてこのライブラリーを固相上で増幅すること、及び、固相増幅反応で生成された少なくとも１つの増幅後核酸鎖の全体又は一部の配列を決定するための核酸シーケンス反応を実行すること、を含む、核酸シーケンス法を提供するものである。

【0262】

本明細書で言うシーケンスは、ヌクレオチドをフリーな３’ヒドロキシル基に連続的に付加し、５’→３’方向にポリヌクレオチド鎖を合成させる、任意の好適な「逐次合成シーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」手法を用いて実行することができる。付加されたヌクレオチドの性質は、各ヌクレオチドの付加後に決定されることが好ましい。

【0263】

シーケンシングプライマーが全ゲノム増幅反応又は固相増幅反応の産物にアニーリングすることで、シーケンス反応の開始点が与えられてもよい。これに関連して、鋳型ライブラリーの形成時に添加されたアダプターの一方又は両方が、鋳型ライブラリーの全ゲノム増幅又は固相増幅によって得られる増幅産物にシーケンシングプライマーがアニーリングすることを可能にするヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0264】

フォワード増幅プライマー及びリバース増幅プライマーの両方が固体表面上に共有結合的に結合される固相増幅反応の産物は、共に５’末端において固相に結合された、固定されたポリヌクレオチド鎖と固定された相補鎖の対がアニーリングすることによって形成される、いわゆる「ブリッジ」構造である。標準的なハイブリダイゼーション条件下では、従来のシーケンシングプライマーのこれらの固定された鎖の一方へのハイブリダイゼーションが、この鎖のその固定された相補鎖へのアニーリングと比較して、優先されるものではないことから、このようなブリッジ構造から構成されるアレイでは非効率的な核酸シーケンス用鋳型しか得られない。

【0265】

より好適な核酸シーケンス用鋳型を得るためには、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型を形成する目的で、「ブリッジ」構造における固定された鎖のうちの一方の実質的に全て又は少なくとも一部を除去することが好ましい。このようにして、一本鎖である鋳型の一部が、シーケンシングプライマーへのハイブリダイゼーションに利用可能となる。「ブリッジ」二本鎖核酸構造における一方の固定鎖の全て又は一部を除去するプロセスは、「直線化」と呼ばれる場合もある。

【0266】

ブリッジ形成された鋳型構造は、一方若しくは両方の鎖の制限酵素による切断によって、又は一方の鎖のニッキングエンドヌクレアーゼによる切断によって、直線化されてもよい。他の切断法を制限酵素やニッキング酵素の代替として用いることができ、α間（ｉｎｔｅｒ ａｌｆａ）化学切断（例えば、過ヨウ素酸塩によるジオール結合の切断）、エンドヌクレアーゼを用いた切断による、若しくは熱若しくはアルカリへの暴露による無塩基部位の切断、増幅産物に組み込まれたリボヌクレオチドを切断してそれ以外をデオキシリボヌクレオチドで構成させること、光化学的な切断、又はペプチドリンカーの切断が挙げられる。

【0267】

一方のプライマーだけが共有結合的に固定され、他方は遊離溶解した状態で固相増幅反応が実行される場合、直線化工程は必須でない場合があることは理解されよう。

【0268】

シーケンスに適した直線化した鋳型を得るためには、完全又は部分的に一本鎖状態の、シーケンス用の直線化した鋳型を残すように、増幅によって形成されたブリッジ構造において「不等」量の相補鎖を除去することが必要である。ブリッジ構造の一方の鎖が大幅に又は完全に除去されることが最も好ましい。

【0269】

切断工程に続いて、切断に使用された方法に関わらず、切断反応の産物は、固相に結合していない、切断された鎖の部分を除去するために、変性条件に曝される場合がある。好適な変性条件は、標準的な分子生物学プロトコルを参照することで、当業者（ｓｋｉｌｌｅｄ ｒｅａｄｅｒ）には明らかとなる。

【0270】

変性（及びその後の切断された鎖の再アニーリング）により、部分的又は実質的に一本鎖のシーケンス用鋳型が生成される。次いで、シーケンシングプライマーが鋳型の一本鎖部分にハイブリダイズすることによって、シーケンス反応が開始されてもよい。

【0271】

このように、核酸シーケンス反応は、シーケンシングプライマーを直線化された増幅産物の一本鎖領域にハイブリダイズすること、シーケンス対象である増幅された鋳型鎖の領域に相補的なポリヌクレオチド鎖に１又は複数のヌクレオチドを連続的に組み込むこと、１又は複数の組み込まれたヌクレオチドに存在する塩基を同定すること、及び、それによって、鋳型鎖の領域の配列を決定することを含んでもよい。

【0272】

本発明において使用できる１つの好ましいシーケンス法は、連鎖停止剤として作用し得る修飾ヌクレオチドの使用に依存している。上記修飾ヌクレオチドがシーケンス中の鋳型の領域に相補的な伸長中のポリヌクレオチド鎖に組み込まれると、さらなる配列伸長を誘導するために使用可能なフリーな３’－ＯＨ基がなくなるため、ポリメラーゼがさらなるヌクレオチドを付加できない。伸長中の鎖に組み込まれた塩基の性質が決定されたら、３’ブロックを除去して、後続のヌクレオチドの付加を可能にしてもよい。これらの修飾ヌクレオチドを用いて得られた産物を順序付けることで、鋳型ＤＮＡのＤＮＡ配列を推定することができる。修飾ヌクレオチドのそれぞれが、各組み込み工程で付加された塩基間の識別を容易にするための、特定の塩基に対応することが知られている異なる標識を結合している場合、このような反応は単一の実験で行うことができる。あるいは、修飾ヌクレオチドのそれぞれを別々に含む別々の反応を行ってもよい。

【0273】

修飾ヌクレオチドは、それらの検出を容易にするための標識を有していてもよい。これは蛍光ラベルであることが好ましい。ヌクレオチドの種類ごとに異なる蛍光ラベルを有していてもよい。しかし、上記検出可能な標識は蛍光ラベルである必要はない。組み込まれたヌクレオチドの検出を可能にするいかなる標識も使用できる。

【0274】

蛍光標識ヌクレオチドを検出するための１つの方法は、標識されたヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光の使用、又は他の好適な照射源の使用を含む。上記ヌクレオチド上の標識からの蛍光はＣＣＤカメラ又は他の好適な検出手段で検出すればよい。

【0275】

本発明は、ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖への連続的な組み込みに依存した基本的に全てのシーケンス法が使用可能であるため、上記で概説したシーケンス法の使用に限定されることは意図されない。好適な代替技術としては、例えば、ピロシーケンスをベースとした方法、ＦＩＳＳＥＱ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕシーケンス）をベースとした方法、ＭＰＳＳ（超並列署名シーケンス）をベースとした方法、及びライゲーションによるシーケンシングをベースとした方法が挙げられる。

【0276】

ハイブリダイゼーション

【0277】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」という語は、その最も広い意味で、安定な核酸二本鎖の形成を意味して用いられる。一つの態様では、「安定な二本鎖」は、例えば、二本鎖の鎖のＴｍを約５℃下回る又は約５℃上回る温度、及び低い一価塩濃度、例えば、０．２Ｍ未満、又は０．１Ｍ未満、又は当業者に公知の塩濃度などの条件下での、ストリンジェントな洗浄によって、二本鎖構造が破壊されないことを意味する。二本鎖は、各鎖の全てのヌクレオチドが他方の鎖のヌクレオチドとワトソン・クリック塩基対形成を行うように、上記二本鎖を構成しているポリヌクレオチド鎖及び／又はオリゴヌクレオチド鎖が互いと二本鎖構造を形成するような、「完全マッチ」をし得る。「二本鎖」という語は、使用することができる、デオキシイノシン、２－アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、ＰＮＡ、及び同種のものなどのヌクレオシドアナログの対合を含むが、これらに限定はされない。二本鎖は少なくとも１つのミスマッチを含むことができ、ここで、「ミスマッチ」という語は、二本鎖内のヌクレオチド対がワトソン・クリック結合を行うことができないことを意味する。

【0278】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション条件」という語は、典型的には約１Ｍ未満、より典型的には約５００ｍＭ未満、さらにより典型的には約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は５℃と低くすることができるが、典型的には２２℃超であり、より典型的には約３０℃超であり、約３７℃超である場合が多い。ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントな条件下で、例えば、プローブがその標的分析物に特異的にハイブリダイズする条件下で、実行される。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、状況毎に異なる。長い断片ほど、特異的なハイブリダイゼーションにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。相補鎖の塩基組成及び長さ、有機溶剤の存在、並びに塩基ミスマッチの程度を含む他の要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与えることがあるため、いずれか１つのみの絶対尺度よりもパラメーターの組み合わせの方が重要である。ある特定のハイブリダイゼーション条件が、標的結合ドメインの全長と標的分析物との間での二本鎖の形成を促進する。他のハイブリダイゼーション条件では、上記標的結合ドメインのある特定の部分でのみ二本鎖の形成を促進するだけである。

【0279】

本開示の組成物

【0280】

本開示は、本明細書に記載のプローブ、伸長後プローブ又はプローブ中間体のいずれかを含む組成物を提供するものである。

【0281】

好ましい実施形態

【0282】

実施形態１
組織試料内の核酸配列をｉｎ ｓｉｔｕ合成するための方法であって、
ａ）上記組織試料を少なくとも１つのプローブと接触させることであって、
上記プローブは標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含み、
上記プローブはフリーな３’－ＯＨ部分を含み、
上記標的結合ドメインは組織試料の第１部位における少なくとも１つの標的分子に結合する、接触させること；
ｂ）上記フリーな３’－ＯＨ部分を少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結し、少なくとも１つの結合型プローブを伸長させることであって、
上記少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること、
ｃ）上記組織試料の第１部位に、上記少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記ポリメラーゼを遊離させ、上記伸長された少なくとも１つの結合型プローブ上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；並びに、
ｄ）核酸配列の合成が完了するまで工程（ｂ）及び工程（ｃ）を反復すること、
を含む方法。

【0283】

実施形態２
組織試料内の核酸配列をｉｎ ｓｉｔｕ合成するための方法であって、
ａ）上記組織試料を少なくとも１つのプローブと接触させることであって、
上記プローブは標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含み、
上記プローブはフリーな３’－ＯＨ部分を含み、
上記標的結合ドメインは組織試料の第１部位に位置する少なくとも１つの標的分子に結合する、接触させること；
ｂ）上記組織試料を少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチド及び少なくとも１つのポリメラーゼと接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させることであって、
上記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；
ｃ）上記組織試料の第１部位に、上記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドの上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記３’ターミネーター部分を遊離させ、上記伸長された少なくとも１つの結合型プローブ上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；並びに、
ｄ）核酸配列の合成が完了するまで工程（ｂ）及び工程（ｃ）を反復すること、
を含む方法。

【0284】

実施形態３
上記標的結合ドメインが上記組織試料の少なくとも第２部位における少なくとも１つの標的分子に結合し、上記少なくとも第２部位において工程（ｂ）～（ｄ）を反復することをさらに含む、実施形態１又は２に記載の方法。

【0285】

実施形態４
上記組織試料の上記第１部位で合成された上記核酸配列が、上記組織試料の上記少なくとも第２部位で合成された上記核酸配列と異なる、実施形態３に記載の方法。

【0286】

実施形態５
組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法であって、
ａ）上記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、
各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；
ｂ）上記組織試料を第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメインを伸長させ、空間的バーコードドメインを形成することであって、
上記第１の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、形成すること；
ｃ）上記組織試料の少なくとも１つの部位に、上記ヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体の上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記ポリメラーゼを遊離させ、上記組織試料の上記少なくとも１つの部位における上記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；
ｄ）上記組織試料を追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体と接触させることにより、工程（ｃ）で照射された上記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインの上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、
上記追加の複数のヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体中の少なくとも１つのヌクレオチド－ポリメラーゼ複合体は光切断性リンカーを介してポリメラーゼに動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；
ｅ）上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、且つ、
上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、
工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；
ｆ）上記組織試料内の標的分析物に結合した上記プローブを収集すること；並びに、
ｇ）工程（ｆ）で収集された上記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、上記組織試料の上記第１部位及び上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより上記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、
を含む方法。

【0287】

実施形態６
組織試料の第１部位と少なくとも第２部位とにおける少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成する方法であって、
ａ）上記組織試料を、標的結合ドメインと標的同定ドメインとを含むプローブを少なくとも２種類含む溶液と接触させることであって、
各種プローブは上記少なくとも２つの標的分析物のうちの１つに結合する固有標的結合ドメインと、上記標的分析物に特異的な固有標的同定ドメインと、フリーな３’－ＯＨ部分とを含む、接触させること；
ｂ）上記組織試料を第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び第１の複数のポリメラーゼと接触させることにより、少なくとも１つの結合型プローブのバーコードドメインのフリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブを伸長させ、空間的バーコードドメインを形成することであって、
上記第１の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、形成すること；
ｃ）上記組織試料の少なくとも１つの部位に、上記可逆的ターミネーターヌクレオチドの上記光切断性リンカーを切断するのに充分な光を照射することで、上記可逆的３’ターミネーター部分を遊離させ、上記組織試料の上記少なくとも１つの部位における上記空間的バーコードドメイン上にフリーな３’－ＯＨ部分を露出させること；
ｄ）上記組織試料を追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド及び追加の複数のポリメラーゼと接触させることにより、工程（ｃ）で照射された上記少なくとも１つの部位における少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインの上記フリーな３’－ＯＨ部分にヌクレオチドを連結することで、上記少なくとも１つの結合型プローブの上記空間的バーコードドメインを伸長させることであって、
上記追加の複数の可逆的ターミネーターヌクレオチド中の少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドは光切断性リンカーを介して可逆的３’ターミネーター部分に動作可能に結合したヌクレオチドを含む、伸長させること；
ｅ）上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長され、且つ、
上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記空間的バーコードドメインが上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有核酸配列を含むように伸長されるまで、
工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復すること；
ｆ）上記組織試料内の標的分析物に結合した上記プローブを収集すること；並びに、
ｇ）工程（ｆ）で収集された上記プローブをシーケンシングを介して定量化することで、上記組織試料の上記第１部位及び上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量を求め、それにより上記少なくとも２つの標的分析物の空間分解的な存在量プロファイルを生成すること、
を含む方法。

【0288】

実施形態７
上記組織試料の上記第１部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量と、上記組織試料の上記少なくとも第２部位における上記少なくとも２つの標的分析物の存在量とを比較することをさらに含む、実施形態５又は６に記載の方法。

【0289】

実施形態８
上記ポリメラーゼが末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ又はその一部である、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。

【0290】

実施形態９
上記少なくとも１つの可逆的ターミネーターヌクレオチドが３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＧＴＰ又は３’－Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＴＴＰを含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。

【0291】

実施形態１０
上記３’ターミネーター部分が２－ニトロベンジルを含む、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。

【0292】

実施形態１１
上記プローブが固有分子識別子をさらに含む、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【0293】

実施形態１２
上記固有分子識別子が少なくとも約１４ヌクレオチド長である、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【0294】

実施形態１３
上記プローブが増幅プライマー結合部位をさらに含む、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【0295】

実施形態１４
上記増幅プライマー結合部位が少なくとも約２４ヌクレオチド長である、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【0296】

実施形態１５
上記プローブが定常領域をさらに含む、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【0297】

実施形態１６
上記定常領域が少なくとも約１２ヌクレオチド長～少なくとも約２０ヌクレオチド長である、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【0298】

実施形態１７
上記プローブが、５’から３’に向かって、上記標的結合ドメインを、続いて上記増幅プライマー結合部位を、続いて上記固有分子識別子を、続いて上記標的同定ドメインを、続いて上記定常領域を、含む、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【0299】

実施形態１８
上記組織試料の上記第１部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの空間的バーコードドメインが、上記組織試料の上記第１部位に特異的な固有空間的識別子配列を含む、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【0300】

実施形態１９

【0301】

上記組織試料の上記少なくとも第２部位における標的分析物に結合した少なくとも１つのプローブの上記空間的バーコードドメインが、上記組織試料の上記少なくとも第２部位に特異的な固有空間的識別子配列を含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【0302】

実施形態２０
上記空間的識別子配列が少なくとも約２０個のヌクレオチドを含む、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【0303】

実施形態２１
上記空間的識別子配列が少なくとも４つの空間的同定ドメインを含む、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【0304】

実施形態２２
上記少なくとも４つの空間的同定ドメインのそれぞれが同じ数のヌクレオチドを含む、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【0305】

実施形態２３
上記少なくとも４つの空間的同定ドメインの少なくとも１つが、同一空間的バーコード内の別の空間的同定ドメインと比較した場合で異なる数のヌクレオチドを含む、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【0306】

実施形態２４
それぞれの空間的同定ドメインが約１個～約４個のヌクレオチドを含む、実施形態１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【0307】

実施形態２５
それぞれの空間的同定ドメインが約４個のヌクレオチドを含む、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【0308】

実施形態２６
上記少なくとも４つの空間的同定ドメインのそれぞれが３’末端に同一ヌクレオチドを含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【0309】

実施形態２７
工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復して、上記組織試料の各部位における上記空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインが３’末端に区切りドメインを含むように伸長させることをさらに含む、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【0310】

実施形態２８
工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、上記組織試料の各部位における上記空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長させることをさらに含む、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【0311】

実施形態２９
工程（ｅ）後且つ工程（ｆ）前に、以下をさらに含む、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の方法：

【0312】

（ｉ）工程（ｃ）及び工程（ｄ）を反復して、上記組織試料の各部位における上記空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインが区切りドメインを含むように伸長させること；並びに、

【0313】

（ｉｉ）上記組織試料の各部位における上記空間的バーコードドメインを、上記空間的バーコードドメインがポリＴドメインを含むように伸長させること。

【0314】

実施形態３０
上記区切りドメインが少なくとも約４ヌクレオチド長～少なくとも約６ヌクレオチド長である、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【0315】

実施形態３１
上記区切りドメインの配列が、上記試料における全ての空間的バーコードに対して同じである、実施形態１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【0316】

実施形態３２
上記ポリＴドメインが少なくとも約１４個のヌクレオチドを含む、実施形態１～３１のいずれか一項に記載の方法。

【0317】

実施形態３３
工程（ｃ）の照射が、アークランプ、レーザー、集束ＵＶ光源、及び発光ダイオードからなる群から選択される光源によって供給される、実施形態１～３２のいずれか一項に記載の方法。

【0318】

実施形態３４
上記レーザーが赤外レーザーである、実施形態１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【0319】

実施形態３５
工程（ｃ）の照射が２光子励起顕微鏡によって供給される、実施形態１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【0320】

実施形態３６
上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記第２部位が、ｘ方向及び／又はｙ方向に約５００ｎｍ以下、且つ、ｚ方向に約１５００ｎｍ以下である、実施形態１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【0321】

実施形態３７
上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位が細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）である、実施形態１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【0322】

実施形態３８
上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位がそれぞれ１個以下の細胞を含む、実施形態１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【0323】

実施形態３９
上記組織試料の上記第１部位及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位がそれぞれ１０個以下の細胞を含む、実施形態１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【0324】

実施形態４０
上記組織試料の上記第１部位内及び上記組織試料の上記少なくとも第２部位内のそれぞれの細胞が個々に自動的に同定及びコード化される、実施形態１～３９のいずれか一項に記載の方法。

【0325】

実施形態４１
工程（ａ）の前に、上記組織試料をｄｄＴＴＰ（ジデオキシチミジン三リン酸）終結に供することをさらに含む、実施形態１～４０のいずれか一項に記載の方法。

【0326】

実施形態４２
上記組織試料をｄｄＴＴＰ終結に供することが上記組織試料をｄｄＴＴＰ及びＴｄＴと接触させることを含む、実施形態１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【0327】

実施形態４３
工程（ｆ）後且つ工程（ｇ）前に、上記収集されたプローブを増幅することをさらに含む、実施形態１～４２のいずれか一項に記載の方法。

【0328】

実施形態４４
上記収集されたプローブを増幅することが第１増幅プライマー及び第２増幅プライマーの使用を含み、
上記第１増幅プライマーが第１フローセルアダプター配列、第１ＮＧＳインデックス配列及び第１シーケンシングプライマー結合部位を含み、
上記第２増幅プライマーが第２フローセルアダプター配列、第２ＮＧＳインデックス配列及び第２シーケンシングプライマー結合部位を含む、
実施形態１～４３のいずれか一項に記載の方法。

【0329】

実施形態４５

【0330】

上記第１増幅プライマー及び上記第２増幅プライマーの少なくとも一方が、上記区切り配列及び／又は上記ポリＴドメインに相補的な核酸配列を含む、実施形態１～４４のいずれか一項に記載の方法。

【実施例】

【0331】

実施例１：本開示のプローブの増幅

【0332】

以下は、本開示のプローブの増幅を検査するための一連の実験である。

【0333】

１つ目の実験において、増幅対象のプローブは、図１５に示されるように、標的結合ドメイン及び増幅プライマー結合部位から構成されたものであった。図１５に示されるように、第１増幅プライマーには標的結合ドメインの配列を含ませ、第２増幅プライマーには上記プローブ上の増幅プライマー結合部位に相補的な配列を含ませた。次いで、これら２つの増幅プライマーを用いて上記プローブを増幅し、予測されるアンプリコンは６１ｂｐであった。図１６は、ゲル電気泳動を用いて分析された、上記増幅実験の結果を示している。最初の５つのレーンは、プローブを含めず（ＮＴＣ、テンプレートなしのコントロール）、ＴｄＴ及びｄＴＴＰと一緒にインキュベートし、その後５ｎｇのヒトＤＮＡに添加した、コントロール増幅反応である。レーン６～１０は、２５アトモルのプローブを含ませ、ＴｄＴ及びｄＴＴＰと一緒にインキュベートし、その後５ｎｇのヒトＤＮＡに添加した、増幅反応である。コントロール反応では増幅産物は生じず、一方、プローブを用いた増幅反応では予測分子量に増幅産物が生じた。

【0334】

２つ目の実験において、増幅対象のプローブは、図１７に示されるように、標的結合ドメイン及び増幅プライマー結合部位から構成されたものであった。図１７に示されるように、第１増幅プライマーには、フローセルアダプター配列、ＮＧＳインデックス配列、シーケンシングプライマー結合部位及び上記プローブの増幅プライマー結合部位の配列を含ませた。第２増幅プライマーには、フローセルアダプター配列、ＮＧＳインデックス配列、シーケンシングプライマー結合部位、及びＴｄＴ伸長により上記プローブの末端に付加されたポリＴドメインにハイブリダイズできるポリＡドメインを含ませた。次いで、これら２つの増幅プライマーを用いて上記プローブを増幅し、予測されるアンプリコンは１９４ｂｐであった。図１８は、ゲル電気泳動を用いて分析された、上記増幅実験の結果を示している。２５アトモルのプローブをまず、ＴｄＴの存在下又は非存在下でｄＴＴＰと共にインキュベートし、ＴｄＴを介したポリＴ伸長を行った。次に、これらの反応物を、別々に５ｎｇの３００ｂｐヒトｇＤＮＡに添加し、増幅プライマーを用いて増幅した。ゲルのレーン１～５は、ＴｄＴによる処理を行わなかったためにポリＴドメインを有していないはずのプローブを用いた増幅反応物を含んでいる。予想通り、第２増幅プライマーはポリＴドメインのラック（ｌａｃｋ）に結合できないため、これらのプローブは増幅されなかった。ゲルのレーン６～８及びレーン１０はＴｄＴによる処理を行ったためにポリＴドメインを有しているはずのプローブを用いた増幅反応物を含んでいる。これらの増幅反応は予想された分子量に産物をもたらし、ＴｄＴによって伸長された本開示のプローブを特異的に増幅するためにポリＴドメインを利用できることが示された。

【0335】

まとめると、これらの結果は、本明細書に記載の増幅プライマー及び方法を用いて本開示のプローブを増幅できることを示している。

【0336】

実施例２：ｉｎ ｓｉｔｕＴｄＴ合成及びプローブ／ＤＮＡの回収

【0337】

以下は、ＴｄＴ及びｄＴＴＰと共にインキュベートされた組織試料からのＤＮＡの回収を試験するための一連の実験である。

【0338】

１つ目のコントロール実験群では、新鮮組織試料及び４日経過後の組織試料を、５６℃で１時間のプロテアーゼＫ消化に曝し、次いで、９０℃で１５分間のさらなる消化に曝した。ＤＮＡを、この組織試料から抽出し、Ｑｕｂｉｔ分析に供して、高分子量の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ＿高分子量）、低分子量の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ＿低分子量）、高分子量の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ＿高分子量）、及び低分子量の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ＿低分子量）の含量を求めた。この分析の結果を図１９の棒グラフの左側に示す（コントロール実験とラベル）。図１９に示されるように、高分子量画分（＞５００ｂｐ）がｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡの両方で確認され、ｓｓＤＮＡが回収されたＤＮＡの約８０％を占めた。

【0339】

２つ目の実験群では、組織試料を、ｄｄＴＴＰで終結されたブロッキングＤＮＡと組み合わせて本開示のプローブと共に一晩インキュベートした。次いで、この組織試料を洗浄し、脱水した。次いで、この組織試料を、ＴｄＴによるポリＴテーリングを可能にするためのＴｄＴの存在下（ＴｄＴ＿組織）又は非存在下（無ＴｄＴ＿組織）で、ｄＴＴＰと共にインキュベートした。テーリング反応の後、組織試料を、５６℃で１時間のプロテアーゼＫ消化に曝し、次いで、９０℃で１５分間のさらなる消化に曝した。ＤＮＡを、この組織試料から抽出し、Ｑｕｂｉｔ分析に供して、高分子量の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ＿高分子量）、低分子量の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ＿低分子量）、高分子量の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ＿高分子量）、及び低分子量の一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ＿低分子量）の含量を求めた。この分析の結果を図１９の棒グラフの右側に示す（テーリング実験）。図１９に示されているように、ＴｄＴとインキュベートされた組織試料では、高分子量ＤＮＡの含量が増加しており、これはポリＴテーリング反応が成功したことを示している。実際には、組織上の（ｏｎ－ｔｉｓｓｕｅ）テーリングの結果、平均ポリＴ長が５００ヌクレオチドより大きいポリＴテールを有するＤＮＡは３５％を超えた。次いで、低分子量ＤＮＡ画分及び高分子量ＤＮＡ画分をさらに分析して、それらが組織試料に接触したプローブを含有しているかどうかを確認した。プローブに特異的な増幅プライマーを用いた増幅により、プローブが低分子量ＤＮＡ画分に存在していることが示された。さらに、ＴｄＴテーリングに供された組織試料においてより多くのプローブが回収された。

【0340】

まとめると、これらの結果は、ＴｄＴを用いて、組織試料内のｉｎ ｓｉｔｕでポリヌクレオチドを伸長できること、及びこれらの伸長後ポリヌクレオチドをその後に収集できることを示している。これらの結果はまた、結合したプローブ上にポリＴテールを付加することで、上記プローブの回収を増加させることができることも示している。

【0341】

実施例３：ＴｄＴを用いたｉｎ ｓｉｔｕＤＮＡ合成

【0342】

以下の実施例は、組織試料内でｉｎ ｓｉｔｕＤＮＡ合成を行うためにＴｄＴ酵素を使用することができることを示す、一連の実験を記述している。

【0343】

ＦＦＰＥ組織試料（ＴＭＡ扁桃腺又は３細胞ペレットアレイ、シランコートカバーガラス上に５μｍ厚）を、以下の２日間プロトコルを用いて作製した：
１日目：
１）試料を６０℃でベーキングした後、キシレン及びＥｔＯＨを介した脱パラフィンにかけた；
２）試料を１００℃で加熱し、プロテアーゼで処理した；
３）基準マーカーを試料上に配置した；
４）試料を、ＮＢＦ、トリス－グリシン及びスルホ－ＮＨＳアセテート（シランをブロックするため）を用いて固定／架橋結合した；及び
５）試料を、プローブの存在下又は非存在下で、１００μｇ／ｍＬキャリアＤＮＡ（２０００ｂｐ未満）と共に、一晩インキュベートした。
２日目：
６）試料を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する又は含有しない、２×生理食塩水－クエン酸ナトリウム、５０％ホルムアミドを用いて、３７℃又は室温で洗浄した；
７）試料を、７５μｌのＴｄＴテーリングミックス（１５０ユニットのＴｄＴを含有する又は含有しない、２５ｎｍｏｌ ｄＴＴＰ）と共に３７℃で１．５時間インキュベートし、その後０．２Ｍ ＥＤＴＡを添加することで反応をクエンチした；
８）試料を、ＥｔＯＨで３回洗浄し、風乾し、４℃で保存した。

【0344】

ＴｄＴ酵素が試料内で結合したプローブ上にポリＴテールを付加したかどうかを判定するため、上記で準備した試料を、１００ｎＭのＡｌｅｘａ５４６標識ポリＡオリゴヌクレオチド（１５個の「Ａ」ヌクレオチドを含む）で染色した。これらの標識ポリＡオリゴヌクレオチドは、ＴｄＴ酵素によって付加されたあらゆるポリＴテールに結合し、蛍光顕微鏡下で検出可能なはずである。ポリＡオリゴヌクレオチドを最初に検出した後、ポリＡオリゴヌクレオチドを試料から取り除くために、試料に０．００３３×塩化ナトリウム－リン酸ナトリウム－ＥＤＴＡ（ＳＳＰＥ）洗浄による処理も行った。細胞がプローブで処理されていたかどうかにかかわらず、細胞は上記ポリＡ１５オリゴヌクレオチドで染色された。理論に拘束されることを望むものではないが、このことは、ＴｄＴ酵素が、ＩＳＨプローブの他に、ブロッキングＤＮＡ及び内在性の核ＤＮＡ上にもポリＴテールを付加したことを示している可能性が最も高い。さらに、ＳＳＰＥは、標識ポリＡオリゴヌクレオチドの大部分を細胞から取り除くことができた。

【0345】

上記と同様の実験において、細胞を２０ｎＭの標識ポリＡオリゴヌクレオチドで染色し、３種類の異なる試料の試験を行った（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ細胞、ＤＡＵＤＩ細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞）。プローブ及びＴｄＴで処理された３種類全ての細胞がポリＡオリゴヌクレオチドで染色され、ＴｄＴ処理によって、細胞内のＤＮＡ分子にポリＴテールが付加されたことを示している。同じ３種類の試料に、プローブ（「ＩＳＨプローブ」）での処理を行うが、ＴｄＴでの処理は行わない、コントロール実験も行った。これらのコントロール試料が呈した標識ポリＡオリゴヌクレオチドによる染色は低～無であり、上記の実験で観察されたシグナルがＴｄＴによるポリＴテーリングに起因していることが示された。

【0346】

まとめると、これらの結果は、ＴｄＴによって、組織試料内でのｉｎ ｓｉｔｕＤＮＡ合成が実行できることを示している。

【0347】

実施例４：ｘＧｅｎハイブリダイゼーションキャプチャーをベースとした精製

【0348】

以下は、本開示の方法で使用できるｘＧｅｎハイブリダイゼーションキャプチャーをベースとした精製の非限定例である。

【0349】

ｘＧｅｎハイブリダイゼーションキャプチャーをベースとした精製は以下を含むことができる：
ａ）組織試料ライセート（未精製又はＡｍｐｕｒｅ精製）を、本開示のプローブに相補的な配列を少なくとも１つ、及びビオチン部分を少なくとも１つを含むキャプチャープローブと共に、９５℃の５×ＳＳＰＥ中で３０秒間インキュベートし、その後、４３℃の５×ＳＳＰＥ中で１時間インキュベートすること；
ｂ）工程（ａ）より得られた溶液を、ストレプトアビジンコートビーズと共に、３８℃の５×ＳＳＰＥ中で１０分間、３回インキュベートすること；
ｃ）ビーズを４３℃の５×ＳＳＰＥで２回洗浄し、未結合の分子を除去すること；
ｄ）さらにビーズを室温の０．１×ＳＳＰＥで３回洗浄し、非特異的結合を減らすこと；並びに
ｅ）ビーズを４５℃のＨ_２Ｏ中で１０分間インキュベートすることで、結合型プローブをビーズから溶離させること。

【0350】

ｘＧｅｎハイブリダイゼーションキャプチャーをベースとした精製は以下を含むことができる：
ａ）２５μｌの組織ライセート（約７５～１２５ｎｇ／μｌの総ＤＮＡ）又はモックライセート（２００ｎｇのｈｕＤＮＡ±２５ａｍｏｌのプローブ）を、２００ｐｍｏｌのキャプチャープローブと共に、室温の計３５μｌの５ｘＳＳＰＥ緩衝液中で５分間インキュベートすること；
ｂ）工程（ａ）から得られた溶液を９５℃で３０秒間さらにインキュベートすること；
ｃ）工程（ｂ）から得られた溶液を４３℃で１時間さらにインキュベートすること；
ｄ）工程（ｃ）から得られた溶液を、１ｍＬの５０℃ ５×ＳＳＰＥで２回洗浄された、ストレプトアビジンコート磁性ビーズ１１０μｌ（１．１ｍｇ）と混合すること；
ｅ）工程（ｄ）から得られた溶液を１０回ピペッティングすること；
ｆ）工程（ｅ）から得られた溶液を３８℃で１０分間３回インキュベートすることであって、それぞれの１０分間のインキュベーション中に、溶液を穏やかにボルテックスしてビーズを再懸濁する；
ｇ）磁石でビーズを回収すること；
ｈ）ビーズを１００μｌの５×ＳＳＰＥで２回洗浄することであって、各洗浄では４３℃で５分間インキュベートを行う；
ｉ）洗浄後のビーズを１００μｌの０．１×ＳＳＰＥ中に再懸濁すること；
ｊ）ビーズを１ｍＬの０．１×ＳＳＰＥで３回さらに洗浄すること；
ｋ）洗浄後のビーズを１００μｌの０．１×ＳＳＰＥ中に再懸濁すること；
ｌ）磁石でビーズを回収すること；
ｍ）ビーズを２５μｌのＨ_２Ｏ中に再懸濁し、４５℃で１０分間インキュベートして、結合型プローブをビーズから溶離させること、
ｎ）所望により、各精製後溶離液にキャリアＤＮＡを添加して、チューブ上への非特異的な吸収によるプローブのロスを防ぐこと。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図3J】

【図3K】

【図3L】

【図3M】

【図3N】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図4L】

【図4M】

【図4N】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

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【国際調査報告】