特表2023-531506トンネルナノチューブ細胞および生体分子の送達のためのその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-24
(54)【発明の名称】トンネルナノチューブ細胞および生体分子の送達のためのその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20230714BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230714BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230714BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230714BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z ZNA
C12N5/10
C12N15/09 100
C12N15/09 110
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022579664
(86)(22)【出願日】2021-06-23
(85)【翻訳文提出日】2023-01-25
(86)【国際出願番号】 US2021038588
(87)【国際公開番号】W WO2021262788
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】63/042,909
(32)【優先日】2020-06-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】592017633
【氏名又は名称】ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100196966
【弁理士】
【氏名又は名称】植田 渉
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ジェイ．キース
(72)【発明者】
【氏名】カベセイラス，ピーター
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）細胞であって、ＴＮＴ促進因子（ＴＰＦ）；およびＴＮＴ細胞によって過剰発現される生体分子カーゴを含む、ＴＮＴ細胞、ならびに生体分子カーゴのＴＮＴ細胞から隣接する細胞への送達のためのその使用方法。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）細胞であって、（ｉ）細胞において過剰発現される、好ましくはＭ－Ｓｅｃ、白血球特異的転写因子１（Ｌｓｔ１）、およびＲＡＳ様がん原遺伝子Ａ（ＲａｌＡ）からなる群から選択される、ＴＮＴ促進因子（ＴＰＦ）；ならびに
（ｉｉ）前記細胞において、サイトゾルにおいて、過剰発現されるか、またはリン脂質二重層内に埋め込まれる、生体分子カーゴ
を含む、前記ＴＮＴ細胞。
【請求項2】
前記生体分子カーゴが、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タンパク質をコードする核酸である、請求項１に記載のＴＮＴ細胞。
【請求項3】
前記生体分子カーゴが遺伝子編集試薬である、請求項１に記載のＴＮＴ細胞。
【請求項4】
前記遺伝子編集試薬が、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む、請求項１に記載のＴＮＴ細胞。
【請求項5】
前記遺伝子編集試薬が、表２、３、４および５に列挙するタンパク質から選択される、請求項４に記載のＴＮＴ細胞。
【請求項6】
前記遺伝子編集試薬が、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、前記ＴＮＴ細胞が、前記ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、それを標的配列に誘導する１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項４に記載のＴＮＴ細胞。
【請求項7】
生体分子を標的細胞、好ましくはインビトロまたはインビボの細胞に送達する方法であって、標的細胞を、カーゴとして前記生体分子を含む請求項１に記載のＴＮＴ細胞と接触させることを含む、前記方法。
【請求項8】
生体分子カーゴを含むＴＮＴ細胞を産生する方法であって、好ましくはＭ－Ｓｅｃ、白血球特異的転写因子１（Ｌｓｔ１）からなる群から選択される、１つまたは複数のＴＰＦを過剰発現する細胞を用意すること、ならびに前記細胞を維持することを含む、前記方法。
【請求項9】
産生されたＴＮＴ細胞を回収し、任意に精製および／または濃縮することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記生体分子カーゴが、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タパク質をコードする核酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記生体分子カーゴが遺伝子編集試薬である、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記遺伝子編集試薬が、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項13】
前記遺伝子編集試薬が、表２、３、４、および５に列挙するタンパク質から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記遺伝子編集試薬が、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、前記ＴＮＴ細胞が、前記ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、それを標的配列に誘導する１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
好ましくはＭ－Ｓｅｃ、白血球特異的転写因子１（Ｌｓｔ１）からなる群から選択される１つまたは複数のＴＰＦ、およびカーゴ生体分子を過剰発現する細胞。
【請求項16】
前記生体分子カーゴが、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タンパク質をコードする核酸である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項17】
前記生体分子カーゴが遺伝子編集試薬である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項18】
前記遺伝子編集試薬が、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；あるいはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項19】
前記遺伝子編集試薬が、表２、３、４、および５に列挙するタンパク質から選択される、請求項１８に記載の細胞。
【請求項20】
前記遺伝子編集試薬が、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、前記ＴＮＴ細胞が、前記ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、それを標的配列に誘導する１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項21】
初代のまたは安定的なヒト細胞株である、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項22】
ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞またはＨＥＫ２９３ Ｔ細胞である、請求項２１に記載の細胞。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権主張
本出願は、２０２０年６月２３日に出願された、米国仮特許出願第６３／０４２，９０９号明細書の権利を主張するものである。上述の内容全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月２３日に出願された、米国仮特許出願第６３／０４２，９０９号明細書の権利を主張するものである。上述の内容全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【0002】
連邦政府により資金援助された研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から交付された助成金番号ＧＭ１１８１５８に基づく政府の支援により行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）から交付された助成金番号ＧＭ１１８１５８に基づく政府の支援により行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。
【0003】
技術分野
本明細書において、トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）細胞であって、ＴＮＴ細胞が刺激されて、隣接する細胞との一過性トンネルナノチューブが形成され、それを通じてカーゴをＴＮＴ細胞から隣接する細胞に送達することができるような、カーゴおよび１つまたは複数のＴＮＴ促進因子を一過性にまたは安定に過剰発現する哺乳動物細胞を含む、ＴＮＴ細胞を記載する。
本明細書において、トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）細胞であって、ＴＮＴ細胞が刺激されて、隣接する細胞との一過性トンネルナノチューブが形成され、それを通じてカーゴをＴＮＴ細胞から隣接する細胞に送達することができるような、カーゴおよび１つまたは複数のＴＮＴ促進因子を一過性にまたは安定に過剰発現する哺乳動物細胞を含む、ＴＮＴ細胞を記載する。
【背景技術】
【0004】
タンパク質および核酸等の生体分子を生細胞のサイトゾルに送達することは、生物学的療法の開発において重要な課題となっている。
【発明の概要】
【0005】
本明細書において、多くの疾患療法に適用可能な、種々のタンパク質および核酸分子と共に使用し得る細胞ベースの生体分子送達のための組成物および方法、例えばゲノム編集、エピゲノム調節、トランスクリプトーム編集およびプロテオーム調節試薬が記載されている。
【0006】
したがって、本明細書において、トンネルナノチューブ（ＴＮＴ）細胞であって、細胞において過剰発現される、好ましくはＭ－Ｓｅｃ（腫瘍壊死因子、アルファ－誘導タンパク質２（ＴＮＦａｉｐ２）、Ｌｓｔ１、およびＲＡＳ様がん原遺伝子Ａ（ＲａｌＡ）からなる群から選択される、ＴＮＴ促進因子（ＴＰＦ）（例えば、表１に示す）；ならびに細胞において、サイトゾルにおいて、過剰発現されるか、またはリン脂質二重層内に埋め込まれる、生体分子カーゴを含む、ＴＮＴ細胞が提供される。
【0007】
また、本明細書において、標的細胞を、カーゴとして生体分子を含む本明細書に記載するＴＮＴ細胞と接触させることによって、生体分子を標的細胞、例えば、インビボまたはインビトロの細胞に送達するための方法が提供される。
【0008】
加えて、本明細書において、生体分子カーゴを含むＴＮＴ細胞を産生するための方法であって、１つまたは複数のＴＰＦ（例えば、表１に示す）を過剰発現する細胞を用意すること；および例えば培養において、例えば最適な生存条件下で、細胞を維持することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、産生されたＴＮＴ細胞を回収し、場合によって精製および／または濃縮することを含む。
【0009】
また、本明細書において、１つまたは複数のＴＰＦ（例えば、表１に示す）およびカーゴ生体分子を過剰発現する細胞が提供される。
【0010】
いくつかの実施形態において、生体分子カーゴは、治療用もしくは診断用タンパク質、または治療用もしくは診断用タンパク質をコードする核酸である。
【0011】
いくつかの実施形態において、生体分子カーゴは遺伝子編集試薬であり、例えば、ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質；ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、および／またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質をコードする核酸；またはＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集もしくは調節タンパク質を含むリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）である。
【0012】
いくつかの実施形態において、遺伝子編集試薬は、表２、３、４＆５に列挙するタンパク質から選択される。
【0013】
いくつかの実施形態において、遺伝子編集試薬は、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質を含み、ＴＮＴ細胞は、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集または調節タンパク質に結合し、これらを標的配列に向かわせる１つまたは複数のガイドＲＮＡをさらに含む。
【0014】
いくつかの実施形態において、細胞は、哺乳動物、例えば初代のまたは安定的な、哺乳動物の、例えばヒトの細胞株である。
【0015】
いくつかの実施形態において、細胞は、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞またはＨＥＫ２９３ Ｔ細胞である。
【0016】
特に断らない限り、本明細書において使用する全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野において当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明において使用するための方法および材料は本明細書に記載されており、他の、当技術分野において公知の適切な方法および材料もまた使用し得る。材料、方法および例は、例示のためのみであり、限定することを意図するものではない。本明細書において言及する全ての出版物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、および他の参照文献は、参照によりその全体が取り込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含む本明細書が優先される。
【0017】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】例示的なＴ２ ＴＮＴ細胞産生およびＲＮＰタンパク質送達の図示。全てのＴ２ ＴＮＴ発現コンストラクトは、産生細胞のゲノムに安定的に組み込まれ得る。コンストラクト１は、カーゴ、例えばＣａｓ９に対応する。コンストラクト２は、任意のガイドＲＮＡに対応する。１は、サイトゾルにおいて翻訳され、ここで、ガイドＲＮＡと複合体化する。３は、ＴＰＦ、例えばＭＳＥＣに対応する。ＭＳＥＣタンパク質は、細胞膜に動員され、アクチンの重合を駆動するのに役立つ。これらのアクチンの重合は、標的細胞と一過性に融合することができる膜状の突起（トンネルナノチューブ）をもたらし、カーゴを、標的細胞に送達することができる。
【図2】例示的なＴ３ ＴＮＴ細胞産生およびＡＡＶ送達の図示。全てのＴ３ ＴＮＴ発現コンストラクト、例えばＡＡＶ産生コンストラクト（コンストラクトは、複製のために必要なアデノウイルス遺伝子、ＩＴＲ隣接ＤＮＡカーゴ、ならびに特異的ＡＡＶ複製およびカプシドタンパク質の産生のためのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含む）は、産生細胞のゲノムに安定的に組み込まれている。コンストラクト１は、ＩＴＲ隣接カーゴに対応する。コンストラクト２および３は、ＡＡＶヘルパーおよびｒｅｐ／ｃａｐコンストラクトに対応する。ＡＡＶ粒子は、サイトゾル中で形成され、ＩＴＲ隣接ＤＮＡカーゴを封入する。４は、ＴＰＦ、例えばＭＳＥＣに対応する。ＭＳＥＣタンパク質は、細胞膜に動員され、アクチンの重合を駆動するのに役立つ。これらのアクチンの重合は、標的細胞と一過性に融合することができる膜状の突起（トンネルナノチューブ）をもたらし、ＡＡＶ粒子カーゴを、標的細胞に送達することができる。
【図3】インビトロにおけるＴＮＴ細胞送達ｓｐＣａｓ９ゲノム編集。一過性トランスフェクションを使用して、Ｃａｓ９およびＴＰＦ（ヒトＭＳＥＣ）を発現するＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰ ＴＮＴ細胞株（「細胞Ａ」）を作出した。ＴＮＴ細胞と混合された後にｅＧＦＰを発現するＷＴ細胞（「細胞Ｂ」）のフローサイトメトリー分析の結果を示すグラフが提供される。
【発明を実施するための形態】
【0019】
治療用のタンパク質および核酸は、大きな見込みを有するものであるが、これらの多くについて、大きい生体分子の細胞内への送達が、臨床開発への障害となっている。
【0020】
ゲノム編集試薬、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、またはＲＮＡガイドされた、酵素的に不活性化または／欠損したＤＮＡ結合タンパク質、例えばＣａｓ９は、実行し得る編集の特異性および種類という観点において急速に進歩しているが、安定なインビボ送達の障害により、未だに有効な遺伝子編集療法は妨げられている。ゲノム編集試薬のタンパク質送達は、好ましい治療用送達様式であり、これは、タンパク質およびリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）が、一過性に存在し、ＺＦＮまたはＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）のＤＮＡまたはＲＮＡ送達と比較して、最低のオフターゲット効果を誘発するためである１７。従来の治療用モノクローナル抗体の送達は、タンパク質の直接注入を利用して成功している。残念ながら、遺伝子編集タンパク質を直接注入する戦略は、免疫原性、分解性、細胞特異性の低さ、および細胞膜を越えられない、またはエンドソーム／リソソームを回避できないことが障害となっている４～１０。タンパク質療法および遺伝子編集のより広範の適用が、治療用タンパク質カーゴを細胞内に送達することによって達成され得る。
【0021】
ナノ粒子は、ＤＮＡ、タンパク質、ＲＮＡ、およびＲＮＰを細胞内に送達するために使用し得る他の送達戦略である９～１８。ナノ粒子は、細胞特異性について操作することができ、エンドサイトーシスおよびそれに続くエンドソーム溶解を引き起こすことができる。しかしながら、ナノ粒子は、人工的に得られたビヒクルシェルによって種々のレベルの免疫原性を有し得る９～２０。多くのナノ粒子は、粒子の構造的統合性を維持するために強い反対の電荷分布に依存しており、静電気によって毒性となり、多くのインビボ治療場面には適さないものになっている９。ＲＮＡを送達するナノ粒子は、最近の臨床試験で成功を収めているが、ほとんどはｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの送達にのみ使用されている。かかるナノ粒子からの毒性は未だに主要な関心事である９。ゲノム編集用ＲＮＰをコードするｍＲＮＡを送達するナノ粒子も近年成功しているが、タンパク質の送達と比較してオフターゲット効果の数が多く、ＲＮＡの安定性はタンパク質に比べて低い１７。ゲノム編集ＲＮＰを送達するナノ粒子は、相同組換え修復（ＨＤＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の両方を利用できるために画期的な突破口であるが、インビトロおよびインビボにおける遺伝子改変頻度が非常に低く、かつそのために療法としてのインビボでの適用が限られている１５。
【0022】
近年、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ｍＲＮＡおよびタンパク質のカーゴを細胞のサイトゾルに送達するために利用されている２、３、２５～３０。しかし、現在までに公知であるゲノム編集試薬を送達する近年考案されたＶＬＰを含むほとんどのＶＬＰは、ＨＩＶまたは他のウイルス由来のｇａｇ－ｐｏｌタンパク質融合体およびウイルスプロテアーゼを利用してレトロウイルス様粒子を生成する２５～２７、２９、３０。第２に、ＲＧＮを含むいくつかのＶＬＰはまた、レンチウイルスＤＮＡ転写物からのガイドＲＮＡをパッケージングおよび発現しなければならない２７。第３に、いくつかのＶＬＰは、機能的な粒子を形成し、ゲノム編集カーゴを放出するために、ウイルスプロテアーゼを必要とする２５～２７、２９。このウイルスプロテアーゼは、複数のアミノ酸モチーフを認識して切断するため、タンパク質カーゴに損傷を与える可能性があり、これは治療適用にとって危険なものであり得る。第４に、現在までに公開されたゲノム編集タンパク質を送達するＶＬＰ様式のほとんどは、パッケージングおよび形質導入の効率が低いため、インビトロおよびインビボにおける遺伝子改変効率が低いことが示されている２５～２７。第５に、これらのＶＬＰ構成要素に利用される複雑なウイルスゲノムは、複数のリーディングフレームを有し、擬似的な融合タンパク質産物の送達をもたらし得るＲＮＡスプライシングを使用している２５～２７、２９、３０。最後に、これらのＶＬＰに、逆転写酵素、インテグラーゼ、カプシド、およびウイルス由来のエンベロープタンパク質が存在することは、免疫原性およびオフターゲット編集が懸念されるために、ほとんどの治療用途には適していない。
【0023】
現在、ゲノム編集療法を送達するための臨床的な標準ビヒクルは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ＡＡＶは、治療用カーゴの頑強な発現を達成することができるが、それらは、いくつかの固有の欠点、例えばＡＡＶのための４．７ｋｂのサイズ制限、種々のレベルの免疫原性、抗体による中和、タンパク質の送達と比較してＤＮＡ送達についてのオフターゲット効果の増加、ＤＮＡがゲノムに組み込まれる低いリスク、および非分裂細胞における持続を持っている２１～２３。
【0024】
トンネルナノチューブは、ある細胞のサイトゾルを他の細胞のサイトゾルに結合することができる動的なアクチンが駆動する膜状の突起である。トンネルナノチューブは、神経細胞および免疫細胞において頻繁に観察される。例えば、単一の骨髄細胞は、最大で７５個のナノチューブを支持することができる１、２、３。多くの異なる種類の細胞は、これらの細胞がＴＮＴ促進因子（ＴＰＦ）を過剰発現し、これがＴＮＴ細胞の基盤である場合に、トンネルナノチューブを形成することができる。ＴＮＴ細胞は、ＴＰＦおよびカーゴを過剰発現し、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を隣接する真核細胞にトンネルナノチューブを通じて送達することができる。本明細書に記載するＴＮＴ細胞は、人工的に得られる脂質／金ナノ粒子およびウイルス粒子ベースの送達システム等の従来の生体分子送達システムで達成不可能な生体分子送達のための方法を提供する。ナノ粒子およびウイルス粒子のように、ＴＮＴ細胞は、どの種類のカーゴ（ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質）が送達されるかをユーザーが特定することを可能にし、カーゴが封入される。しかしながら、ナノ粒子およびウイルス粒子とは異なって、ＴＮＴ細胞は、カーゴを送達しながら、より多くのカーゴを産生する。同種移植片としてＴＮＴ細胞が移植されると、例えば、ＴＮＴ細胞は、同種移植片が身体中に留まる限り、局所送達を持続することができる。局所送達は、低分子誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、および他の種類の誘導性プロモーター（すなわち、炎症誘導性プロモーター）によって誘導され得る。さらに、ＴＮＴ細胞は、ＴＮＴ細胞がカーゴを送達するのを停止させる「オフスイッチ」を備えることができる。
【0025】
ＴＮＴ細胞は、有害な免疫反応の機会を最小化する外部に露出した任意のヒト外来性構成要素を有していない。ＴＮＴ細胞はまた、腫瘍形成をもたらし得る永久的な細胞－細胞融合（シンシチウム）を引き起こさない。ＴＮＴ細胞は、トンネルナノチューブを介して、隣接する細胞と一過性に融合する。ＴＮＴ細胞は、ヒト細胞構成要素によって全体的に構成されており、それらは、機能するために任意のウイルス由来構成要素を必要とせず、カーゴは、産生の開始からカーゴが標的細胞に送達される時点まで、ＴＮＴ細胞内に完全に封入されている。ＴＮＴ細胞は、ＴＰＦをレシピエント細胞に送達することもできる。これは、レシピエント細胞がＴＮＴを形成し、より多くのカーゴを隣接する細胞に送達する原因となり、組織へのより深い送達を増強し得る。種々の異なる細胞型を、自家／同種異系細胞移植療法として患者に導入することができるＴＮＴ細胞に変換することができる。ＴＮＴ細胞は、最初のカスタマイズ可能な細胞ベースの生体分子送達様式であり、この様式は、ゲノム編集試薬のための最初の細胞ベースの送達様式でもある。
【0026】
ゲノム編集試薬、特にＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ、ジンクフィンガー、およびＴＡＬヌクレアーゼベースの試薬は、遺伝性疾患の処置のためのインビボ療法となる潜在的可能性を有するが、ゲノム編集試薬を細胞内に送達する技術は、患者にとって厳しい制限があるか、または安全ではない。例えば、Ｃａｓ９は、リン脂質二重層を効率的に通過して細胞内に進入することができず、自然免疫原性および適応免疫原性を有することが示されている４～８。したがって、直接注入、または細胞毒性および免疫原性を有し、しばしば低レベルの所望の遺伝子改変をもたらす脂質、タンパク質、または金属ベースのナノ粒子への外側／内側コンジュゲートとしてＣａｓ９を送達することは実用的でも、好ましくもない９～２０。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、真核細胞へのＤＮＡの送達が成功している有望な送達様式であるが、ＡＡＶは、４．５ｋｂを超えるＤＮＡコンストラクトを効率的にパッケージングおよび送達することができないため、より大きなＤＮＡ発現コンストラクトを必要とする多くのＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集試薬を送達することができていない。ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集試薬は、複数の異なるＡＡＶ粒子に分割することができるが、この戦略は送達および編集効率を大幅に低下させる。ＡＡＶおよびアデノウイルスベクターは、必要な投与量に応じて、種々のレベルの免疫原性を有し得る。さらに、ＡＡＶのＤＮＡコンストラクト中の逆位末端反復（ＩＴＲ）は、自発的なエピソームの形成を促進し、これがゲノム編集試薬の発現を長引かせ、オフターゲット効果を高める可能性がある。ＩＴＲはまた、ＡＡＶ ＤＮＡのゲノムＤＮＡへの望ましくない組み込みを促進し得る２１～２４。
【0027】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、レトロウイルス粒子についての代替的な送達様式として現れたものである。ＶＬＰは、レトロウイルスＤＮＡを組み込む能力を欠損しており、タンパク質／ＲＮＰ／ＤＮＡをパッケージングおよび送達するように設計し得る。レンチウイルス粒子等のレトロウイルス粒子のほとんどはＶＳＶＧでシュードタイプ化されており、ゲノム編集試薬を送達する、記載されているＶＬＰのほとんど全てはこれまで、ＶＳＶＧを有し、それを利用している２、３、２５～３０。我々は、産生細胞を一過性にトランスフェクションすることによって形成されているＶＳＶＧベースの粒子が、トランスフェクションされたＤＮＡをパッケージングおよび送達することを発見した。現在のＶＳＶＧベースのＶＬＰのバージョンでは、この不用意なＤＮＡの送達を防ぐことができず、これによって、免疫原性およびオフターゲット効果を最小限に抑える必要がある場面でのＶＬＰの使用が妨げられている。さらに、多くのＶＬＰは、臨床ツールとしてＶＬＰをさらに制限する種々の過剰なウイルス構成要素を利用する。
【0028】
細胞外小胞は、エキソソームおよびエクトソーム内でカーゴをパッケージングおよび送達し得る、他の送達様式である３１、３２。ＶＬＰと同様に、細胞外小胞は、哺乳動物細胞由来のリン脂質二重層によって構成されている。ＶＬＰとは異なり、細胞外小胞はウイルス構成要素を欠いているため、免疫原性は限定的である。ＶＬＰが外側の融合性糖タンパク質（ＶＳＶＧ）により細胞内に入る能力が高いのに対し、細胞外小胞は主にマイクロピノサイトーシスによる細胞取り込みに依存しており、このことによって細胞外小胞の送達効率が制限されている。
【0029】
細胞外小胞、ナノ粒子、ＡＡＶおよびＶＬＰと同様に、ＴＮＴ細胞は、種々の生体分子の一過性の局所送達を達成することができる。しかしながら、ＴＮＴ細胞は、持続性のまたは時間空間的誘導性の種々の生体分子の局所送達を提供することもできる。本明細書において、ゲノム編集、エピゲノム調節、トランスクリプトーム編集、およびプロテオーム調節をインビトロおよびインビボで適用するためにＴＮＴ細胞の産生および投与するための方法および組成物について記載する。望ましい編集結果は、治療の状況によって異なり、異なる遺伝子編集試薬が必要となる。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）およびアシダミノコッカス属種（acidaminococcus sp.）のＣａｓ１２ａ（機能化）は、停止コドンまたは欠失の導入にはＮＨＥＪ、または挿入を引き起こすにはＨＤＲを活用する編集用のＲＮＡガイド酵素として最も一般的なものの２つである３４～３６。塩基編集因子としても公知であるＣａｓ９デアミナーゼ融合体は、二本鎖ＤＮＡの切断を伴わずに単一ヌクレオチドを正確に編集するための現在の標準である３７、３８。重要なことに、本発明は、ゲノム編集、エピゲノム調節、トランスクリプトーム編集、およびプロテオーム調節の適用のために、試薬を産生および送達する新しい方法を提供し、これによって可能な治療用インビボゲノム改変の種類が増加する。
【0030】
サイズの制約を抑止し、オフターゲット効果を最小化し、発現の延長を排除するための努力において、我々は、本明細書に記載するデザイナーＴＮＴ細胞を使用して、タンパク質、ＲＮＰ、および非分裂細胞において異なるレベルの持続性を有する種々の特殊なＤＮＡ分子のようなゲノム編集試薬を含む生体分子のトンネルナノチューブ送達を本明細書に記載する。
【0031】
２個の細胞間で形成されるトンネルナノチューブは、繊維状（ｆ）アクチンを含む１、２、３。一過性の細胞－細胞膜融合が起こって、開口トンネルが作出される。ＴＰＦは、Ｍ－Ｓｅｃ（ＴＮＦａｉｐ２）、Ｌｓｔ１、およびＲａｌＡ等のエクソシスト複合体と相互作用するタンパク質を含む３９～５２。トンネルナノチューブは、表面に沿ってまたはナノチューブの内側のいずれかで、ある細胞から他の細胞に内容物を送達することができる。ナノチューブは、基層に付着する必要はない。ＴＰＦを発現する細胞は、潜在的に、その細胞を他の隣接する細胞に結合するトンネルナノチューブを形成することができる。これらのトンネルナノチューブは、長さが複数の細胞の直径と同じぐらい、例えば、最大で数百μｍであり得、それらは、３００～８００ｎｍの直径を有すると記載されている。５分以内の細胞－細胞接触は、トンネルナノチューブの結合を２個の細胞間で形成するのに十分であり得る３９～５２。
【0032】
ＴＮＴ細胞は、目的のタンパク質、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを産生およびパッケージングし、このカーゴを細胞のサイトゾルに送達する操作された細胞である。ＴＮＴ細胞は、ナノチューブの形成に不可欠であることが示されているＴＰＦを活用する１～３。ＴＮＴ細胞の外側は、細胞膜および細胞膜関連タンパク質によって構成されている。ＴＮＴ細胞は、ウイルス由来の構成要素を欠き、それらに半特異的細胞形質導入を可能にさせる表面分子により改良することもできる。さらに、ＴＮＴ細胞は、患者またはＦＤＡ承認細胞株に由来する細胞から産生することができ、次いで、患者に再導入され、これらの「自家ＴＮＴ細胞」または「同種異系ＴＮＴ細胞」は、自家／同種異系Ｔ細胞療法によって達成される類似の方法における免疫原性のリスクをさらに低下させることができる。ＴＮＴ細胞は、特にゲノム編集試薬の送達のための、ＶＬＰ、ＡＡＶおよびナノ粒子の通常の再投与よりも持続的な生体分子送達のための安全でより有効な選択肢であり、これは、ＴＮＴ細胞が、全てヒト構成要素によって構成されているが、前述のウイルス粒子が、抗原性であり、インビボで再投与される場合に抗体によって認識および中和されるためである。ＴＮＴ細胞は、カーゴを産生する送達ビヒクルであり、これは、産生および送達に対する時空間的な制御を与える誘導性プロモーターの使用を可能にする。
【0033】
本明細書において、効率的で部位特異的なゲノム改変、エピゲノム改変、トランスクリプトーム改変およびプロテオーム改変、ならびにインビトロ、および最終的に治療目的のためのインビボでの撹乱を行う目的の、ゲノム編集試薬を含む生体分子をＴＮＴ細胞から標的細胞に送達するための組成物および方法が記載される。
【0034】
セクション１：ＴＮＴ細胞産生および組成物
ＴＮＴ細胞は、少なくとも１つのプラスミドで一過性にトランスフェクションされたか、または産生細胞株のゲノムＤＮＡに組み込まれたコンストラクトを安定的に発現している細胞から産生される。ＴＮＴ細胞は、実質的に任意の哺乳動物細胞（すなわち、マクロファージ、破骨細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞等）から作製することができる。一度ＴＮＴ細胞株が作出されると、ＴＰＦおよびカーゴは、構成的または誘導的な方法で産生することができる。
ＴＮＴ細胞は、少なくとも１つのプラスミドで一過性にトランスフェクションされたか、または産生細胞株のゲノムＤＮＡに組み込まれたコンストラクトを安定的に発現している細胞から産生される。ＴＮＴ細胞は、実質的に任意の哺乳動物細胞（すなわち、マクロファージ、破骨細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞等）から作製することができる。一度ＴＮＴ細胞株が作出されると、ＴＰＦおよびカーゴは、構成的または誘導的な方法で産生することができる。
【0035】
いくつかの実施形態において、単一のプラスミドをトランスフェクションに使用する場合、それは、１つまたは複数のＴＰＦ（例えば、表１に示す）、１つまたは複数のカーゴ（例えば、治療用タンパク質または遺伝子編集試薬、例えばジンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム編集／調節タンパク質および／またはＲＮＰ、例えば表２、３、４および５に見られる他のもの、あるいは前述の治療用タンパク質および／またはゲノム編集剤をコードするＤＮＡをパッケージングしたＡＡＶ）、ならびに必要に応じてガイドＲＮＡをコードする配列を含んでいるべきである。好ましくは、トランスフェクションには２～３個のプラスミドを用いる。これらの２～３個のプラスミドは、以下のものを含むことができる（任意の２つ以上を１つのプラスミドにおいて組み合わせ得る）：
１． ＡＡＶ（ヘルパー配列、ｒｅｐ／ｃａｐ、およびＩＴＲ隣接カーゴ移入プラスミド）治療用タンパク質またはゲノム編集試薬をコードする配列を含む、プラスミド。
２． １つまたは複数のＴＰＦ（例えば、表１に列挙するもの）を含む、プラスミド。
３． プラスミド１からのゲノム編集試薬が、１つまたは複数のガイドＲＮＡを必要とする場合、プラスミド１におけるゲノム編集試薬に適切な１つまたは複数のガイドＲＮＡを含むプラスミド。
１． ＡＡＶ（ヘルパー配列、ｒｅｐ／ｃａｐ、およびＩＴＲ隣接カーゴ移入プラスミド）治療用タンパク質またはゲノム編集試薬をコードする配列を含む、プラスミド。
２． １つまたは複数のＴＰＦ（例えば、表１に列挙するもの）を含む、プラスミド。
３． プラスミド１からのゲノム編集試薬が、１つまたは複数のガイドＲＮＡを必要とする場合、プラスミド１におけるゲノム編集試薬に適切な１つまたは複数のガイドＲＮＡを含むプラスミド。
【0036】
一過性トランスフェクション手法を、ＴＮＴ細胞を作出するために使用する場合、ＴＮＴ細胞によって送達されるべきカーゴの組成物は、ＤＮＡ分子（トランスフェクションから）、タンパク質、ＲＮＡ、および／または関連ＡＡＶ ＤＮＡカーゴを有するＡＡＶの組合せであり得る。ＴＮＴ細胞が細胞株の一過性トランスフェクションによって産生される場合、ＴＮＴ細胞は、ＤＮＡおよびＲＮＡの組合せを送達する。細胞にトランスフェクションされたＤＮＡは、サイズ依存性の移動性を有しており、トランスフェクションされたＤＮＡのある画分はサイトゾルに留まるが、トランスフェクションされたＤＮＡの他の画分は核に局在するようになっている５３～５５。核内のトランスフェクションされたＤＮＡのある画分は、ＴＮＴ細胞を作出するために必要な構成要素を発現し、サイトゾル中／細胞膜付近の他の画分は、トンネルナノチューブを通して隣接する細胞に輸送される。
【0037】
プラスミド以外の種類のＤＮＡ分子を送達することが望ましい場合、二本鎖の閉環直鎖ＤＮＡ、エピソーム、ミニサークル、二本鎖オリゴヌクレオチドおよび／または他の特殊ＤＮＡ分子を用いて、上記のトランスフェクションを行うことができる。
【0038】
あるいは、前述の３つの構成要素をコードするＤＮＡは、一過性トランスフェクション手法によって作出されるＴＮＴ細胞よりも長い期間ＴＰＦおよびカーゴを発現するＴＮＴ細胞を作出するために、細胞のゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれ得る。前述の３つの構成要素の安定的な組み込みによって産生されたＴＮＴ細胞は、プラスミドＤＮＡ（トランスフェクション手法から）を送達しないが、代わりに、タンパク質、ＲＮＡ、および／または関連ＡＡＶ ＤＮＡカーゴを有するＡＡＶを送達する（図１および２）。
【0039】
また、プラスミド、または当技術分野において公知のもしくは上記の他の種類の特殊ＤＮＡ分子は、好ましくは、コードされた配列の発現または翻訳を駆動するための他の要素、例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、例えば、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）または３’ＵＴＲ、ポリアデニル化部位、インシュレーター配列、または発現を上昇させる、もしくは制御する他の配列（例えば、誘導性プロモーター要素）も含み得る。
【0040】
好ましくは、ＴＮＴ細胞産生のための適切な細胞および細胞株は、当業者に公知のトランスフェクション技術の効果に抵抗性のある初代のまたは安定的な、哺乳動物の、例えばヒトの細胞株である。適切な細胞株の例としては、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨＥＫ２９３ Ｔ／１７ ＳＦ細胞腎臓由来のＰｈｏｅｎｉｘ－ＡＭＰＨＯ細胞、胎盤由来のＢｅＷｏ細胞、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、およびＨｅｐＧ２細胞が挙げられる。例えば、かかる細胞は、接着細胞、または懸濁細胞として成長する能力について選択され得る。いくつかの実施形態において、産生細胞は、血清条件、無血清条件、またはエキソソーム無血清条件において古典的なＤＭＥＭ中で培養し得る。ＴＮＴ細胞、例えばＴ１およびＴ３ ＴＮＴ細胞は、患者に由来する細胞（自家ＴＮＴ細胞）および他のＦＤＡ承認細胞株（同種異系ＴＮＴ細胞）から、これらの細胞に、当技術分野で公知の種々の技術によって前述のＴＮＴ細胞産生構成要素をコードするＤＮＡコンストラクトをトランスフェクトし得る限り、産生し得る。
【0041】
さらに、望ましい場合には、２つ以上のゲノム編集試薬をトランスフェクションに含めることができる。ＤＮＡコンストラクトは、産生細胞株でタンパク質を過剰発現させるように設計し得る。トランスフェクションに使用されるプラスミド骨格は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物のためのＣＭＶプロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物のためのＵ６プロモーターを用いるｐＣＤＮＡ３骨格のような、当技術分野の当業者に周知のものであり得る。核酸分子を産生細胞に導入するために、当技術分野で公知の種々の技術を採用することができる。かかる技術としては、リン酸カルシウム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー等の化合物を用いた化学促進トランスフェクション、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００または３０００、およびＴｒａｎｓＩＴ－Ｘ２）のようなカチオン性リポソーム、ポリエチレンイミン等のリポソーム介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子ボンバードメント、マイクロインジェクション等の非化学的方法が挙げられる。
【0042】
必要なＴＮＴ細胞構成要素を構成的および／または誘導的に安定して発現するヒト産生細胞株を、ＴＮＴ細胞、例えばＴ２およびＴ４ＴＮＴ細胞の産生に用いることができる。ＴＮＴ細胞、例えばＴ２およびＴ４ＴＮＴ細胞は、患者に由来する細胞（自家ＴＮＴ細胞）および他のＦＤＡ承認細胞株（同種異系ＴＮＴ細胞）から、これらの細胞が前述のＴＮＴ細胞構成要素を発現する安定的な細胞株に変換されている場合、産生することができる。
【0043】
本明細書において、ＴＮＴ細胞自体も提供される。
【0044】
カーゴ産生ＴＮＴ細胞および組成物の産生
好ましくは、ＴＮＴ細胞コード構成成分を真核細胞に一過性にまたは安定的に導入するためのトランスフェクション／ヌクレオフェクション／形質導入／他の方法の３６～４８時間後、ＴＮＴ細胞を回収する。遠心分離の後、ＴＮＴ細胞を遠心分離物（ペレット）の形態で濃縮し、これを所望の濃度に再懸濁し、他の試薬と混合し、緩衝剤交換に供しても、またはそのまま使用してもよい。いくつかの実施形態において、ＴＮＴ細胞含有上清をろ過し、沈殿させ、遠心分離し、濃縮溶液に再懸濁し得る。精製された細胞は、液体窒素中で凍結することができ、－２７０℃で数年間保存しても、ＴＮＴ細胞構成要素が細胞のゲノムＤＮＡから安定的に発現される場合に適切な活性を失わない。一過性トランスフェクションによって作出されたＴＮＴ細胞は、最初のトランスフェクションの１週間以内に使用されなければならない。
好ましくは、ＴＮＴ細胞コード構成成分を真核細胞に一過性にまたは安定的に導入するためのトランスフェクション／ヌクレオフェクション／形質導入／他の方法の３６～４８時間後、ＴＮＴ細胞を回収する。遠心分離の後、ＴＮＴ細胞を遠心分離物（ペレット）の形態で濃縮し、これを所望の濃度に再懸濁し、他の試薬と混合し、緩衝剤交換に供しても、またはそのまま使用してもよい。いくつかの実施形態において、ＴＮＴ細胞含有上清をろ過し、沈殿させ、遠心分離し、濃縮溶液に再懸濁し得る。精製された細胞は、液体窒素中で凍結することができ、－２７０℃で数年間保存しても、ＴＮＴ細胞構成要素が細胞のゲノムＤＮＡから安定的に発現される場合に適切な活性を失わない。一過性トランスフェクションによって作出されたＴＮＴ細胞は、最初のトランスフェクションの１週間以内に使用されなければならない。
【0045】
好ましくは、ＴＮＴ細胞は再懸濁されるか、または細胞が適切なキャリアに懸濁されるように緩衝剤交換を受ける。いくつかの実施形態において、緩衝剤交換は、限外ろ過または透析によって行うことができる。インビトロ用途に使用するＴＮＴ細胞の例示的な適切なキャリアは、好ましくは、ＴＮＴ細胞と混合され、共培養される細胞に適した細胞培養培地であろう。細胞は、適切な細胞培養インキュベーター（例えば、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター）において、同じ容器中で共培養される。
【0046】
哺乳動物、特にヒトに投与するＴＮＴ細胞の適切なキャリアは、好ましくは薬学的に許容される組成物であろう。「薬学的に許容される組成物」は、任意の種類の非毒性の半固体、液体、またはエアロゾル化された充填剤、希釈剤、カプセル化材料、コロイド懸濁液、または製剤補助剤を指す。好ましくは、この組成物は注射に適している。特に等張性の無菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウム、塩化マグネシウムおよびかかる塩の類似の溶液または混合物）、または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であって、場合によって滅菌水または生理食塩水を添加することにより、注射用液剤を構成することができるものであり得る。他の適切な医薬形態は、鼻腔内吸入または気管内挿管によって投与するためにエアロゾル化された粒子であり得る。ＴＮＴ細胞は、同種移植片として投与することもできる。
【0047】
注射使用に適した医薬形態としては、無菌水性液剤または懸濁剤が挙げられる。液剤または懸濁剤は、ＴＮＴ細胞と適合性である添加物を含んでいてもよい。いずれの場合も、形態は無菌でなければならず、前記形態を注射器で投与できる程度の流動性がなければならない。製造および保存の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されていなければならない。適切な液剤の例は、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝剤である。
【0048】
適切な医薬組成物を製剤する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005およびDrugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker、NY)シリーズの書籍を参照されたい。例えば、非経口、皮内、または皮下の適用に使用される液剤または懸濁剤は、以下の構成要素、注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の無菌希釈剤、ベンジルアルコール、またはメチルパラベン等の抗菌剤、アスコルビン酸、または重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩等の緩衝剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張性調整剤等を含んでいてもよい。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整し得る。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量バイアルに封入することができる。
【0049】
注射使用に適した医薬組成物は、無菌水性液剤（水溶性の場合）または分散剤、および無菌注射用液剤または分散剤を即座に調製するための無菌粉末を含み得る。静脈内投与に適切なキャリアとしては生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針を追加できる程度の流動性がなければならない。製造および保存の条件下で安定していなければならず、細菌および真菌等の微生物による汚染作用から保護されていなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング剤の使用、分散剤の場合は必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持し得る。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール等の種々の抗菌および抗真菌剤によって達成し得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらし得る。
【0050】
無菌注射用液剤は、必要な量の活性化合物を、上に挙げた成分の１つまたは複数と組み合わせて適切な溶媒に取り込み、その後、必要に応じてろ過滅菌することによって調製し得る。一般的に、分散剤は、無菌ビヒクルに活性化合物を取り込むことによって調製され、これは、基本的な分散媒と上に列挙するものからの必要な他の成分とを含む。無菌注射用液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらの方法では、活性成分の粉末に加えて、事前に滅菌ろ過された溶液からの任意の追加の所望の成分を得ることができる。
【0051】
カーゴ産生ＴＮＴ細胞を含む組成物は、投与のための指示書と共に、コンテナ、パック、またはディスペンサーに含め得る。
【0052】
セクション２：ＴＮＴ細胞カーゴおよび適用
ＴＮＴ細胞「カーゴ」は、例えば、治療または診断的使用のため、またはゲノム編集、エピゲノム調節、および／もしくはトランスクリプトーム調節の用途のための、例えば、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＰの組合せ、ＲＮＰ、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せ、またはタンパク質を含むことができる。これらの区別を簡単にするために、ＤＮＡおよびＲＮＰの組合せを１型カーゴ（Ｔ１）と称し、ＲＮＰを２型カーゴ（Ｔ２）と称し、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せを３型カーゴ（Ｔ３）と称し、タンパク質を４型カーゴ（Ｔ４）と称する。当業者は、これらが例であり、かつ非限定的であることを認識するであろう。この文脈におけるＲＮＡは、例えば、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および／またはカーゴをコードするｍＲＮＡであり得る。ゲノム編集の用途のために開発されたカーゴには、例えば、ヌクレアーゼおよび塩基編集因子も含まれる。ヌクレアーゼとしては、例えば、ＦｏｋＩおよびＡｃｕＩ ＺＦＮ、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはその機能的誘導体（例えば、表２に示す）が挙げられる（ＺＦＮは、例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書、第２００５０２０８４８９号明細書、第２００５００２６１５７号明細書、第２００５００６４４７４号明細書、第２００６０１８８９８７号明細書、第２００６００６３２３１号明細書、および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットに記載されている）（ＴＡＬＥＮは、例えば、米国特許第９３９３２５７号明細書、および国際公開第２０１４１３４４１２号パンフレットに記載されている）（ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８６９７３５９号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２０８９７６号明細書、および国際公開第２０１４０９３６６１号パンフレット、国際公開第２０１７１８４７８６号パンフレットに記載されている）３４～３６。本研究によって記載されている塩基編集因子としては、可変長のポリペプチドリンカーを用いた１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）とのＣ末端での融合を伴う、または伴わない、例えば、表２に示すように、Ｎ末端でデアミナーゼと融合した、任意のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼオルソログ（ｗｔ、ニッカーゼ、または触媒的に不活性（ＣＩ））、またはその機能的誘導体（例えば表３に示す）を含む（塩基編集因子は、例えば、米国特許出願公開第２０１５０１６６９８２号明細書、米国特許出願公開第２０１８０３１２８２５号明細書、米国特許第１０１１３１６３号明細書、および国際公開第２０１５０８９４０６号パンフレット、国際公開第２０１８２１８１８８号パンフレット、国際公開第２０１７０７０６３２号パンフレット、国際公開第２０１８０２７０７８号パンフレット、国際公開第２０１８１６５６２９号パンフレットに記載されている）３７、３８。ｓｇＲＮＡは、ＴＮＴ細胞内での産生の間にゲノム編集試薬と複合体化し、トンネルナノチューブによってＴＮＴ細胞に結合した隣接する細胞に共送達される。現在までに、この概念はインビトロにおいて、ヒト外因性部位を部位特異的に編集する目的でＲＧＮ、ならびにデアミナーゼおよびＵＧＩ（塩基編集因子）に融合されたＣＩ ＲＧＮをＴ１およびＴ２で送達することを示す実験によって実証されている（図３および４）。例えば、外因性のＧＦＰを編集する目的で、Ｔ１ ＴＮＴ細胞を用いて、Ｕ２ＯＳおよびＨＥＫ ２９３細胞にＣａｓ９ ＲＮＰが送達されている（図３および４）。
ＴＮＴ細胞「カーゴ」は、例えば、治療または診断的使用のため、またはゲノム編集、エピゲノム調節、および／もしくはトランスクリプトーム調節の用途のための、例えば、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＰの組合せ、ＲＮＰ、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せ、またはタンパク質を含むことができる。これらの区別を簡単にするために、ＤＮＡおよびＲＮＰの組合せを１型カーゴ（Ｔ１）と称し、ＲＮＰを２型カーゴ（Ｔ２）と称し、ＤＮＡおよびタンパク質の組合せを３型カーゴ（Ｔ３）と称し、タンパク質を４型カーゴ（Ｔ４）と称する。当業者は、これらが例であり、かつ非限定的であることを認識するであろう。この文脈におけるＲＮＡは、例えば、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および／またはカーゴをコードするｍＲＮＡであり得る。ゲノム編集の用途のために開発されたカーゴには、例えば、ヌクレアーゼおよび塩基編集因子も含まれる。ヌクレアーゼとしては、例えば、ＦｏｋＩおよびＡｃｕＩ ＺＦＮ、および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼまたはその機能的誘導体（例えば、表２に示す）が挙げられる（ＺＦＮは、例えば、米国特許出願公開第２００３０２３２４１０号明細書、第２００５０２０８４８９号明細書、第２００５００２６１５７号明細書、第２００５００６４４７４号明細書、第２００６０１８８９８７号明細書、第２００６００６３２３１号明細書、および国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットに記載されている）（ＴＡＬＥＮは、例えば、米国特許第９３９３２５７号明細書、および国際公開第２０１４１３４４１２号パンフレットに記載されている）（ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８６９７３５９号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２０８９７６号明細書、および国際公開第２０１４０９３６６１号パンフレット、国際公開第２０１７１８４７８６号パンフレットに記載されている）３４～３６。本研究によって記載されている塩基編集因子としては、可変長のポリペプチドリンカーを用いた１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）とのＣ末端での融合を伴う、または伴わない、例えば、表２に示すように、Ｎ末端でデアミナーゼと融合した、任意のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼオルソログ（ｗｔ、ニッカーゼ、または触媒的に不活性（ＣＩ））、またはその機能的誘導体（例えば表３に示す）を含む（塩基編集因子は、例えば、米国特許出願公開第２０１５０１６６９８２号明細書、米国特許出願公開第２０１８０３１２８２５号明細書、米国特許第１０１１３１６３号明細書、および国際公開第２０１５０８９４０６号パンフレット、国際公開第２０１８２１８１８８号パンフレット、国際公開第２０１７０７０６３２号パンフレット、国際公開第２０１８０２７０７８号パンフレット、国際公開第２０１８１６５６２９号パンフレットに記載されている）３７、３８。ｓｇＲＮＡは、ＴＮＴ細胞内での産生の間にゲノム編集試薬と複合体化し、トンネルナノチューブによってＴＮＴ細胞に結合した隣接する細胞に共送達される。現在までに、この概念はインビトロにおいて、ヒト外因性部位を部位特異的に編集する目的でＲＧＮ、ならびにデアミナーゼおよびＵＧＩ（塩基編集因子）に融合されたＣＩ ＲＧＮをＴ１およびＴ２で送達することを示す実験によって実証されている（図３および４）。例えば、外因性のＧＦＰを編集する目的で、Ｔ１ ＴＮＴ細胞を用いて、Ｕ２ＯＳおよびＨＥＫ ２９３細胞にＣａｓ９ ＲＮＰが送達されている（図３および４）。
【0053】
Ｔ３カーゴはＡＡＶ（タンパク質カプシドおよびＩＴＲ隣接ＤＮＡカーゴ）を指し得る。
【0054】
エピゲノム調節を目的として設計されたＴ１～Ｔ４カーゴは、エピゲノム調節因子またはエピゲノム調節因子の組合せ、または１つもしくは複数の可変長ポリペプチドリンカーで結合したその機能的誘導体と融合したＣＩ ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼ、ジンクフィンガー（ＺＦ）およびＴＡＬＥを含む（表２および４に示す例）。トランスクリプトーム編集を目的として設計されたＴ１～Ｔ４カーゴは、表５のＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼもしくはその任意の機能的誘導体、または１つもしくは複数の可変長ポリペプチドリンカーによってデアミナーゼ（表３に示す例）と融合した、ＣＩ ＣＲＩＳＰＲベースのヌクレアーゼもしくはその任意の機能的誘導体（表５に示す例）を含む。
【0055】
Ｔ１～Ｔ４カーゴはまた、治療的または診断的に有用な任意のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＰ、またはＤＮＡ、タンパク質および／またはＲＮＰの組合せを含み得る。例えば、国際公開第２０１４００５２１９号パンフレット、米国特許第１０１３７２０６号明細書、米国特許出願公開第２０１８０３３９１６６号明細書、米国特許第５８９２０２０号明細書、欧州特許第２１３４８４１号明細書、国際公開第２００７０２０９６５号パンフレットを参照されたい。例えば、ヌクレアーゼまたは塩基編集タンパク質もしくはＲＮＰまたはその誘導体をコードまたはこれらによって構成されるカーゴを、リーバー先天性甘皮症１０型の原因となるスプライシング部位の欠陥を修正する目的で網膜細胞に送達することができる。哺乳動物の内耳では、β－カテニンをより安定化させるために、β－カテニンを編集する（β－カテニンＳｅｒ３３は、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、またはＣｙｓに編集される）目的で、塩基編集試薬またはＨＤＲ促進カーゴを蝸牛支持細胞および有毛細胞等の感覚細胞にＴＮＴ細胞送達することによって、難聴の回復に役立つ可能性がある。
【0056】
他の適用において、同種移植片の形態のＴＮＴ細胞は、ｓｈＲＮＡ、ジンクフィンガー／ｄＣａｓ９リプレッサー、Ｃａｓ９、塩基編集因子、およびカルシニューリンを阻害し、免疫抑制薬の必要性を取り除き、かつ同種移植片拒絶を抑制する他の調節因子を局所的に送達するために操作することができる。免疫抑制薬は、同種移植片拒絶のリスクを低下させるが、それらは、適当な感染症およびがんのリスクを増加させる。この文脈では、カーゴは、構成的に発現され得るか、または誘導性プロモーターから発現され得る。誘導性プロモーターは、低分子、組織特異的プロモーター、または炎症誘導性プロモーターの添加によって誘導され得る。
【0057】
他の適用において、ＴＮＴ細胞は、誘導性のプログラム可能な多重エピジェネティック修飾因子を局所的に送達する。
【0058】
他の適用において、ＴＮＴ細胞は、ＡＡＶ粒子の隣接する細胞への完全に封入された（細胞外空間に露出していない）送達のために利用することができる。これは、抗体中和からＡＡＶを遮断することによってＡＡＶ送達を増強するのに役立ち得る。
【0059】
他の適用において、ＲＮＡ編集試薬またはプロテオーム撹乱試薬のＴＮＴ細胞送達は、１つまたは複数の特定の目的のタンパク質の細胞レベルの一過性の低下を引き起こし（潜在的には、全身レベルで、特定の器官または腫瘍などの細胞の特定のサブセットにおいて）、これにより、副次的な薬剤を投与できる治療的に作用可能なウィンドウが作成され得る（この副次的な薬剤は、目的のタンパク質が存在しないか、または目的のタンパク質の存在のレベルが低くなっている際に、より効果的である）。例えば、ＲＮＡ編集試薬またはプロテオーム撹乱試薬のＴＮＴ細胞による送達によって、ベムラフェニブ／ダブラフェニブ耐性のＢＲＡＦ駆動腫瘍細胞において、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴタンパク質ならびに関連するｍＲＮＡの標的化分解が引き起こされ、ＢＦＡＦ阻害剤耐性が一時的に無効化される（ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路に基づく耐性機構がＴＮＴ細胞カーゴによって一時的に下方制御される）ために、ベムラフェニブ／ダブラフェニブ投与のためのウィンドウが開かれ得る。この例は、抗原誘導性があり、したがって腫瘍細胞に特異的なＴＮＴ細胞と組み合わせた場合に特に適切である。
【0060】
他の適用において、ＴＮＴ細胞は、山中因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃ－Ｍｙｃをヒトまたはマウスの線維芽細胞に送達し、人工多能性幹細胞を作製することができる。
【0061】
他の適用において、ＴＮＴ細胞は、治療効果を引き出すために、ドミナントネガティブ形態のタンパク質を送達し得る。
【0062】
抗原特異的なＴＮＴ細胞を、がん細胞に対して標的化して、アポトーシス促進タンパク質であるＢＩＭ、ＢＩＤ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤ、ＢＩＫ、ＢＡＸ、ＢＡＫ、および／またはＨＲＫを送達し、がん細胞のアポトーシスを引き起こし得る。
【0063】
膵臓がん患者の９０％は切除不能な疾患を呈している。切除不能な膵臓腫瘍患者の約３０％は局所的な疾患の進行により死亡するため、局所進行膵臓腫瘍を放射線で切除して処置することが望ましいが、腸管は腫瘍切除を引き起こすのに必要な高線量の放射線に耐えることができない。腸管を選択的に放射線保護することによって、周囲の消化管に対する損傷を最小限に抑えながら、膵臓腫瘍の切除放射線療法を行うことが可能になる。この目的のために、転写抑制因子ＫＲＡＢおよびＥＧＬＮを標的とするガイドＲＮＡと融合したｄＣａｓ９をＴＮＴ細胞に導入し得る。ＥＧＬＮの阻害は、膵臓腫瘍ではなく消化管の選択的な放射線保護を引き起こすため、切除的放射線処置による消化管傷害性を有意に軽減することが示されている５６。
【0064】
結合していないステロイド受容体は、サイトゾルに存在する。リガンドへの結合後、これらの受容体は核へと局在移行し、応答遺伝子の転写を開始する。ＴＮＴ細胞は、サイトゾルのステロイド受容体に結合し、それを破壊する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体を細胞のサイトゾルに送達することができる。例えば、ｓｃＦｖは、グルココルチコイド受容体に結合し、デキサメタゾンとの結合を阻害することで、腫瘍形成と関連しているメタロチオネイン１Ｅ等の応答遺伝子の転写を阻止し得る５７。
【0065】
ＴＮＴ細胞は、タンパク質の標的化破壊を伴う処置に適応し得る。例えば、抗体／ｓｃＦｖを細胞のサイトゾルに送達することによって、細胞のサイトゾル内のタンパク質を標的化し、破壊するために、ＴＮＴ細胞を利用し得る。従来、細胞膜を介して細胞のサイトゾルに抗体を送達することが、困難かつ非効率的であることが周知されていた。このようなタンパク質の阻害方法は、標的化された低分子がサイトゾル内のタンパク質に結合して破壊する方法と類似しており、多様な疾患の処置に有用であり得る５８～６０。
【0066】
さらに、標的化低分子の標的化は、触媒機能またはタンパク質－タンパク質の相互作用に関連する結合ポケットを含む一定の大きさのタンパク質に限定される。ｓｃＦｖは、触媒機能および他のタンパク質との相互作用を阻害するために、タンパク質の多くの異なる部位に結合するように生成し得るため、これらの制限に妨げられない。例えば、ＲＡＳがんタンパク質は、多くのがんのサブタイプに関与しており、ＲＡＳはがんにおいて最も頻繁に観察されるがん遺伝子の１つである。例えば、国際がんゲノムコンソーシアムでは、膵臓腺がんサンプルの９５％でＫＲＡＳが変異していることが見出されている。ＲＡＳアイソフォームは、ＰＩ３Ｋ経路およびＭＡＰＫ経路のような、ヒトのがんで制御不能となっている種々の経路を活性化することが知られている。ＲＡＳはがんにおいて異常な役割を果たしているにもかかわらず、効果的な薬理学的な直接または間接のＲＡＳの低分子阻害剤は開発されておらず、臨床使用が承認されていない。ＲＡＳを標的とする１つの戦略は、複数のＲＡＳアイソフォームに結合し、その機能を阻害するｓｃＦｖをがん細胞に特異的に送達できるＴＮＴ細胞であり得る５８～６０。
【0067】
詳細な方法
Ｔ１ ＴＮＴ細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのプラスミドのトランスフェクションを使用して、ＷＴ ＨＥＫ２９３等の細胞株から産生された。ＰＥＩはポリエチレニミン２５ｋＤ 直鎖（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃２３９６６－２）である。「ＰＥＩ ＭＡＸ」のストック溶液を作製するために、１ｇのＰＥＩを１Ｌの事前に約８０℃まで加熱したエンドトキシンフリーのｄＨ２Ｏに添加し、室温まで冷却した。この混合物を１０ＮのＮａＯＨの添加によってｐＨ７．１に中和し、０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）でろ過滅菌した。ＰＥＩ ＭＡＸは－２０℃で保存する。
Ｔ１ ＴＮＴ細胞は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのプラスミドのトランスフェクションを使用して、ＷＴ ＨＥＫ２９３等の細胞株から産生された。ＰＥＩはポリエチレニミン２５ｋＤ 直鎖（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃２３９６６－２）である。「ＰＥＩ ＭＡＸ」のストック溶液を作製するために、１ｇのＰＥＩを１Ｌの事前に約８０℃まで加熱したエンドトキシンフリーのｄＨ２Ｏに添加し、室温まで冷却した。この混合物を１０ＮのＮａＯＨの添加によってｐＨ７．１に中和し、０．２２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）でろ過滅菌した。ＰＥＩ ＭＡＸは－２０℃で保存する。
【0068】
ＷＴ ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクション時に７０％～９０％コンフルエントになるように分割し、１０％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地で培養する。カーゴベクター、例えば、コドン最適化Ｃａｓ９の発現を駆動するＣＭＶプロモーターをコードするベクターを、Ｕ６プロモーター－ｓｇＲＮＡ（ＧＦＰを標的にする）コードプラスミド、およびヒトＭＳＥＣ ｃＤＮＡコードプラスミドと共トランスフェクションした。トランスフェクション反応は、還元血清培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ ＃３１９８５－０７０）中で組み立てた。１０ｃｍプレートでのＴ１ ＴＮＴ細胞産生のために、７．５μｇのＣａｓ９発現プラスミド、７．５μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミドおよび５μｇのヒトＭＳＥＣ発現プラスミドを１ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合し、次いで２７．５μｌのＰＥＩ ＭＡＸを添加した。室温で２０～３０分インキュベーションした後、トランスフェクション反応物をＷＴ ＨＥＫ２９３細胞上に滴下分散させた。
【0069】
Ｔ１ ＴＮＴ ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの４８時間後に回収した。ＴＮＴ細胞を、室温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離の後、上清をデカンテーションし、ＴＮＴ細胞ペレットを、ＰＢＳで洗浄し、もう一度、室温で１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離の後、上清をデカンテーションし、ＴＮＴ細胞ペレットをＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ培地に再懸濁した。次いで、ＴＮＴ細胞を、ＧＦＰの単一コピーを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞と混合した。これらの２種類の細胞を、２４ウェルプレートに播種し、４８～７２時間共培養した。
【実施例】
【0070】
本発明は、以下の実施例でさらに説明されるが、これらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【0071】
[実施例１]
図３において、一過性トランスフェクションを使用して、Ｃａｓ９およびＴＰＦ（ヒトＭＳＥＣ）を発現するＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰ ＴＮＴ細胞株を作出した。別個の細胞培養容器において、ＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰ細胞株の他の群を、ＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ＴＮＴ細胞を、ｓｇＲＮＡ発現細胞と混合し、共培養した。フローサイトメトリーを共培養の４８時間後に行った。ＧＦＰノックダウンを起こすために、単一細胞内のｓｇＲＮＡとのＣａｓ９複合体およびこのＲＮＰ複合体が、インデルが作出され得るＧＦＰ遺伝子に標的とされるように、細胞はｓｇＲＮＡまたはＣａｓ９のいずれかを互いに送達しなければならない。ＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰは、ＧＦＰの単一コピーをそれぞれ安定的に発現する。図３に示す結果は、ＧＦＰ発現細胞のレベルの著しい低下によって証拠付けられるように、ＷＴ細胞への遺伝子編集カーゴの効率的な移入を示した。
図３において、一過性トランスフェクションを使用して、Ｃａｓ９およびＴＰＦ（ヒトＭＳＥＣ）を発現するＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰ ＴＮＴ細胞株を作出した。別個の細胞培養容器において、ＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰ細胞株の他の群を、ＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡでトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ＴＮＴ細胞を、ｓｇＲＮＡ発現細胞と混合し、共培養した。フローサイトメトリーを共培養の４８時間後に行った。ＧＦＰノックダウンを起こすために、単一細胞内のｓｇＲＮＡとのＣａｓ９複合体およびこのＲＮＰ複合体が、インデルが作出され得るＧＦＰ遺伝子に標的とされるように、細胞はｓｇＲＮＡまたはＣａｓ９のいずれかを互いに送達しなければならない。ＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰは、ＧＦＰの単一コピーをそれぞれ安定的に発現する。図３に示す結果は、ＧＦＰ発現細胞のレベルの著しい低下によって証拠付けられるように、ＷＴ細胞への遺伝子編集カーゴの効率的な移入を示した。
【0072】
図４Ａにおいて、野生型ＨＥＫ２９３およびＵ２ＯＳ細胞の一過性トランスフェクションを使用して、Ｃａｓ９、ＧＦＰ標的化ｓｇＲＮＡ、およびＴＰＦ（ヒトＭＳＥＣ）を発現するＴＮＴ細胞株を作出した。トランスフェクションの４８時間後、ＴＮＴ細胞をＧＦＰ発現細胞と混合した。細胞溶解を共培養の７２時間後に行った。ＧＦＰアニーリングプライマーをＰＣＲで使用して、ＧＦＰアンプリコンを生成し、アンプリコン配列決定を行った。ＧＦＰノックダウンを起こすために、細胞は、ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方を隣接するＧＦＰ発現細胞に送達しなければならない。ＨＥＫ２９３ ｅＧＦＰおよびＵ２ＯＳ ｅＧＦＰは、ＧＦＰの単一コピーをそれぞれ安定的に発現する。図４Ｂに示す結果は、ＧＦＰ配列中の標的部位の改変の存在によって証拠付けられるように、ＷＴ細胞への遺伝子編集カーゴの効率的な移入を示した。
【0073】
【表1】
【0074】
【表2】
【0075】
【表3】
【0076】
【表4】
【0077】
【表5】
【0078】
例示的な関連タンパク質配列：
ドブネズミ（Rattus norvegicus）＆合成：ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ Ｌ８－ｎｓｐＣａｓ９－ＵＧＩ－ＳＶ４０ ＮＬＳ
ドブネズミ（Rattus norvegicus）＆合成：ＡＰＯＢＥＣ１－ＸＴＥＮ Ｌ８－ｎｓｐＣａｓ９－ＵＧＩ－ＳＶ４０ ＮＬＳ
【0079】
【化1】
【0080】
ヒト（Homo sapiens）：ＡＩＤ
【0081】
【化2】
【0082】
ヒト（Homo sapiens）：Ｎ末端のＲＮＡ結合領域を欠くＡＩＤｖ可溶性バリアント
【0083】
【化3】
【0084】
ヒト（Homo sapiens）：Ｎ末端のＲＮＡ結合領域およびＣ末端の十分に構造化されていない領域を欠くＡＩＤｖ可溶性バリアント
【0085】
【化4】
【0086】
ドブネズミ（Rattus norvegicus）：ＡＰＯＢＥＣ１
【0087】
【化5】
【0088】
ハツカネズミ（Mus musculus）：ＡＰＯＢＥＣ３
【0089】
【化6】
【0090】
ハツカネズミ（Mus musculus）：ＡＰＯＢＥＣ３触媒ドメイン
【0091】
【化7】
【0092】
ヒト（Homo sapiens）：ＡＰＯＢＥＣ３Ａ
【0093】
【化8】
【0094】
ヒト（Homo sapiens）：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ
【0095】
【化9】
【0096】
ヒト（Homo sapiens）：ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ触媒ドメイン
【0097】
【化10】
【0098】
ヒト（Homo sapiens）：ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ
【0099】
【化11】
【0100】
ヒト（Homo sapiens）：ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ
【0101】
【化12】
【0102】
ヒト（Homo sapiens）：ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ触媒ドメイン
【0103】
【化13】
【0104】
大腸菌（Escherichia coli）：ＴａｄＡ
【0105】
【化14】
【0106】
ヒト（Homo sapiens）：Ａｄａｒ１
【0107】
【化15】
【0108】
ヒト（Homo sapiens）：Ａｄａｒ２
【0109】
【化16】
【0110】
化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）：Ｃａｓ９双節型ＮＬＳ
【0111】
【化17】
【0112】
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）：Ｃａｓ９
【0113】
【化18】
【0114】
ジェジュニ菌（Campylobacter jejuni）：Ｃａｓ９
【0115】
【化19】
【0116】
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）：Ｃａｓ９
【0117】
【化20】
【0118】
アシダミノコッカス属種（Acidaminococcus sp.）Ｃａｓ１２ａ
【0119】
【化21】
【0120】
ラクノスピラ科（Lachnospiraceae）菌Ｃａｓ１２ａ：
【0121】
【化22】
【0122】
レプトトリキア・シャーイイ（Leptotrichia shahii）Ｃａｓ１３ａ
【0123】
【化23】
レプトトリキア・ウェイディイ（Leptotrichia wadei）Ｃａｓ１３ａ
【0124】
【化24】
【0125】
ヒト（Homo sapiens）：Ｍｓｅｃ
【0126】
【化25】
【0127】
ハツカネズミ（Mus musculus）：Ｍｓｅｃ
【0128】
【化26】
【0129】
ヒト（Homo sapiens）：Ｌｓｔ１アイソフォーム１
MLSRNDDICIYGGLGLGGLLLLAVVLLSACLCWLHRRVKRLERSWHLLSWSQAQGSSEQELHYASLQRLPVPSSEGPDLRGRDKRGTKEDPRADYACIAENKPT (配列番号27)
MLSRNDDICIYGGLGLGGLLLLAVVLLSACLCWLHRRVKRLERSWHLLSWSQAQGSSEQELHYASLQRLPVPSSEGPDLRGRDKRGTKEDPRADYACIAENKPT (配列番号27)
【0130】
ヒト（Homo sapiens）：Ｌｓｔ１アイソフォーム４
MLSRNDDICIYGGLGLGGLLLLAVVLLSACLCWLHRRVKRLERSWAQGSSEQELHYASLQRLPVPSSEGPDLRGRDKRGTKEDPRADYACIAENKPT (配列番号28)
MLSRNDDICIYGGLGLGGLLLLAVVLLSACLCWLHRRVKRLERSWAQGSSEQELHYASLQRLPVPSSEGPDLRGRDKRGTKEDPRADYACIAENKPT (配列番号28)
【0131】
ヒト（Homo sapiens）：ＲａｌＡ
【0132】
【化27】
【0133】
単純ヘルペスウイルス（HSV）１型：ＶＰ１６転写活性化ドメイン
PTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDM (配列番号30)
PTDALDDFDLDMLPADALDDFDLDMLPADALDDFDLDM (配列番号30)
【0134】
単純ヘルペスウイルス（HSV）１型＆合成：ＶＰ６４
GRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDML (配列番号31)
GRADALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDMLGSDALDDFDLDML (配列番号31)
【0135】
ヒト（Homo sapiens）：Ｐ６５
【0136】
【化28】
【0137】
カポジ肉腫関連ヘルペスウイルストランス活性化因子：ＲＴＡ
【0138】
【化29】
【0139】
ヒト（Homo sapiens）：ＫＲＡＢ
MDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP (配列番号34)
MDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP (配列番号34)
【0140】
ヒト（Homo sapiens）：ＭｅＣＰ２
【0141】
【化30】
【0142】
ヒト（Homo sapiens）：Ｔｅｔ１
【0143】
【化31】
【0144】
ヒト（Homo sapiens）：Ｄｎｍｔ３ａ
【0145】
【化32】
【0146】
ヒトコドン最適化化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）ＮＬＳ
【0147】
【化33-1】
【0148】
【化33-2】
【0149】
ヒトコドン最適化化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）双節型（ＢＰ）ＮＬＳ
【0150】
【化34-1】
【0151】
【化34-2】
【0152】
ヒトコドン最適化化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）ＢＥ４
【0153】
【化35-1】
【0154】
【化35-2】
【0155】
【化35-3】
【0156】
ヒトコドン最適化化膿性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ９）ＡＢＥ
【0157】
【化36-1】
【0158】
【化36-2】
【0159】
【化36-3】
【0160】
参考文献
【0161】
【表6-1】
【0162】
【表6-2】
【0163】
【表6-3】
【0164】
【表6-4】
【0165】
【表6-5】
【0166】
【表6-6】
【0167】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを目的としており、本発明を限定するものではないことは理解されたい。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明することを目的としており、本発明を限定するものではないことは理解されたい。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【国際調査報告】