特表 2023-531718 ピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）遺伝子編集治療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-25

(54)【発明の名称】ピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）遺伝子編集治療法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20230718BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20230718BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230718BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12N15/09 110

C12N15/864 100Z

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022579942

(86)(22)【出願日】2021-06-28

(85)【翻訳文提出日】2023-02-16

(86)【国際出願番号】 EP2021067719

(87)【国際公開番号】W WO2021260227

(87)【国際公開日】2021-12-30

(31)【優先権主張番号】20382568.2

(32)【優先日】2020-06-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522289264

【氏名又は名称】セントロ デ インベスティガシオネス エネルゲティカス メディオ アムビエンタレス イ テクノロジカス オー．エー．，エム．ピー．

(71)【出願人】

【識別番号】522289275

【氏名又は名称】コンソルシオ セントロ デ インベスティガシオン ビオメディカ エン レッド

(71)【出願人】

【識別番号】518158123

【氏名又は名称】フンダシオン インスティチュート デ インベスティガシオン サニタリア フンダシオン ヒメネス ディアス

(71)【出願人】

【識別番号】503115205

【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】セゴヴィア サンス ホセ カルロス

(72)【発明者】

【氏名】キンタナ ブスタマンテ オスカル

(72)【発明者】

【氏名】ファニャーナス ヴァケーロ サラ

(72)【発明者】

【氏名】ポルテウス マシュー

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA27

4B065CA44

(57)【要約】

本発明は、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムを用いたピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）の治療に関する。本技術が提供するのは、ｔｒａｃｒＲＮＡと会合させ、これがＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９）に組み込まれることで、特定の標的位置でＤＮＡ二本鎖切断を認識して誘導できるようになる、改良されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、特に、改良されたｃｒＲＮＡの設計の可能性である。ＤＮＡ二本鎖切断は、ＰＫＬＲ遺伝子修復用ドナー配列の存在下、相同組換え（ＨＲ）により修復される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離されたｃｒＲＮＡ配列であって、配列番号１若しくは配列番号１１、又は配列番号１若しくは配列番号１１と少なくとも９５％配列同一性を有する配列番号１若しくは配列番号１１のバリアントを含む、配列。

【請求項2】

前記配列は、配列番号１のみからなる、請求項１に記載の単離されたｃｒＲＮＡ配列。

【請求項3】

前記配列は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用するｔｒａｃｒＲＮＡヌクレオチド配列に化学結合している、請求項１又は２に記載の単離されたｃｒＲＮＡ配列。

【請求項4】

請求項３に記載のｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、シングルガイドｓｇＲＮＡ。

【請求項5】

前記ｓｇＲＮＡは、配列番号１２を含む、請求項４に記載のｓｇＲＮＡ。

【請求項6】

請求項１若しくは２に記載の単離されたｃｒＲＮＡ配列又は請求項５に記載のｓｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドとを含む、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体。

【請求項7】

ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、請求項４又は５に記載のｓｇＲＮＡとを含む、ＣＲＩＳＰＲシステム。

【請求項8】

前記Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチドである、請求項６に記載のＲＮＰ複合体又は請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲシステム。

【請求項9】

前記Ｃａｓポリペプチドは、高忠実度又は特異性向上型Ｃａｓ９ポリペプチドバリアントである、請求項６に記載のＲＮＰ複合体又は請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲシステム。

【請求項10】

請求項６に記載のＲＮＰ複合体又は請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲシステムと、標的細胞、例えば、初代細胞における相同性指向型修復を介したＣＲＩＳＰＲ系遺伝子編集用の組換えドナーテンプレートを送達することができるアデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶベクターとを含む、システム。

【請求項11】

前記アデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶベクターは、ＤＮＡ配列を含み、このＤＮＡ配列は、相同性アームＬＨＡ及びＲＨＡと、ＰＫＬＲ遺伝子をコードする補正ドナーテンプレートと、真核生物細胞でのタンパク質発現の専用終結配列、例えば、ｂＧＨポリ（Ａ）配列とを含む、請求項１０に記載のシステム。

【請求項12】

前記ＬＨＡは配列番号１３であり、ＲＨＡは配列番号１４であり、前記ＰＫＬＲ遺伝子をコードする前記補正ドナーテンプレートは配列番号１６であり、前記ｂＧＨポリ（Ａ）配列は配列番号１８であるか、又はこれら配列のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有するこれらの配列のいずれかのバリアントである、請求項１０に記載のシステム。

【請求項13】

前記アデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶベクターは、更に、５’ＵＴＲ配列を含み、好ましくは、前記配列は、配列番号１５又は配列番号１５と少なくとも９５％配列同一性を有する配列番号１５のバリアントである、請求項１１又は１２に記載のシステム。

【請求項14】

初代細胞に、相同組換えを介して安定遺伝子改変を導入する方法であって、前記初代細胞は、ＰＫＬＲ遺伝子に１つ以上の変異を含むＰＫＬＲ遺伝子を含む標的核酸と、配列番号１又は２１に相補的であるヌクレオチド配列とを含むことを特徴とし、前記方法は、以下：
ａ．前記初代細胞に、請求項６に記載のＲＮＰ複合体又は請求項７に記載のＣＲＩＳＰＲシステムを導入することと、それと同時に又は順次に、
ｂ．前記初代細胞に、請求項１０～１３のいずれか１項に定義されるとおりのアデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶを導入することと、
を含み、
前記標的核酸の前記安定遺伝子改変は、前記補正ドナーテンプレートを含む前記相同性ドナーＡＡＶベクターを導入することにより、前記ＰＫＬＲ遺伝子（標的核酸）の病因性変異を補償することを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムを使用した、ピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）の治療に関する。この技術が提供するのは、ｔｒａｃｒＲＮＡ又はリンカーと会合させ、これがＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ９）に組み込まれることで、特定の標的位置でＤＮＡ二本鎖切断を認識して誘導できるようになる、改良されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、特に、改良されたｃｒＲＮＡの設計の可能性である。ＤＮＡ二本鎖切断は、ＰＫＬＲ遺伝子修復のためのドナー配列の存在下で相同組換え（ＨＲ）によって修復される。

【背景技術】

【0002】

ピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）は、最も一般的な赤血球系遺伝性欠損であり、慢性非球状赤血球性溶血性貧血を引き起こす。ＰＫＤ有病率は、コーカサス人集団では人口１０００００あたり１～９症例と推定される。ＰＫＤは、ＰＫＬＲ遺伝子の変異を原因とする常染色体劣性遺伝疾患である。この遺伝子は、２種類の異なる転写バリアントであるＲＰＫ及びＬＰＫをコードし、これらはそれぞれ、赤血球細胞及び肝臓で発現する。今日までに、２００を超える様々なＰＫＬＲ遺伝子変異が、ＰＫＤと関連付けられてきた。ＰＫＤの治療選択肢は、対症療法的であり、そのような選択肢として、定期的な赤血球細胞輸血、脾臓摘出術、及び鉄キレート療法が挙げられる。これまでのところ、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が、重症患者の唯一の根治的治療となっている。遺伝子補正された細胞の自家ＨＳＣＴは、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）遺伝子治療とも呼ぶが、これは、多くの血球細胞遺伝病の治療に用いられている。CIEMATは、ＰＫＤを補正するレンチウイルスベクターを近年開発しており、これは、希少医薬品の指定を受けている（ＥＵ／３／１４／１３３０；ＦＤＡ＃ＤＲＵ－２０１６－５１６８）。このレンチウイルス介在型遺伝子治療アプローチは、単回治療で永久的かつ根治的な臨床的利益を提供すると思われる。

【0003】

ここ数年、遺伝子変異の正確な補正が可能であることを理由に、遺伝子編集が、血球細胞疾患の有望な遺伝子治療アプローチとして出現してきた。ＤＮＡ修復細胞機構を動員する特定ゲノム位置を切断する改変エンドヌクレアーゼを使用することによる二本鎖切断（ＤＳＢ）の生成は、その特定部位への所望のＤＮＡ配列の導入と併用することで、遺伝子編集効率を、臨床応用可能と見なすことが可能なパーセンテージに引き上げた。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、これまでに記載のある改変エンドヌクレアーゼの１種である。ゲノムの唯一の特定部位を認識する特定ｓｇＲＮＡを、その特定部位でＤＳＢを生成させるＣａｓ９タンパク質と合わせて複合体としたものは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）とも呼ばれるが、これの細胞への導入は、ドナーテンプレート送達用のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と併用することで、遺伝性造血器疾患の患者を治療するための遺伝子編集分野にアプローチする最も効率的なシステムであることを実証してきた（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。CIEMATは、このアプローチをＰＫＤの補正に向けて設定し、特定ＲＮＰとＡＡＶを組み合わせることを通じて、ヒト造血前駆細胞のうち最大で４０％が、治療用ＲＰＫ（Ｒ型ピルビン酸キナーゼ）遺伝子座で遺伝子編集されたことを見出した。得られた結果から、遺伝子編集療法の臨床使用は、短期間でＰＫＤを補正する見込みが非常に高いことが、示唆される。

【0004】

遺伝性疾患の治療に遺伝子編集を使用することに対して現在ボトルネックとなっていることの１つは、選択された特定のオンターゲット部位とは異なる場所でＤＳＢが生成することであり、これは、予期せぬ臨床効果を伴う望まない遺伝子改変を生成させる可能性がある。望まないＤＳＢの生成によりもたらされるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムのこの副作用は、オフターゲット効果と呼ばれる。特定のｓｇＲＮＡにより生成するオフターゲットは、その臨床応用を妨害する可能性がある。なぜなら、造血幹細胞遺伝子治療は、何百万ものＨＳＰＣの遺伝子改変を意味しており、そのため、ゲノムに望まない変更を有している細胞の数は、膨大である可能性があるからである。移植されたＨＳＰＣのうち１つに望まない改変が１つでもあれば、この療法を台無しにするとともに患者の健康にリスクをもたらす恐れがある制御不能なクローン増殖が引き起こされる可能性がある。自然な文脈、及び造血幹細胞遺伝子治療の文脈の両方において以前に記載されたことがあるとおり、単一のＨＳＰＣゲノムに変更が生じること又は宿主ゲノムにウイルスベクターがランダムに組み込まれることもまた、白血病性プロセスの引き金となり得る（非特許文献５）。それ故に、ＣＲＩＳＰＲシステムの使用に関する重要な課題は、こうしたヌクレアーゼにより誘導される潜在的に有害なオフターゲット変異を同定及び最小化する必要性である。高忠実度Ｃａｓ９の使用は、オフターゲット活性を顕著に低下させたものの（非特許文献６）、治療用ＲＮＰのオフターゲット効果は、患者の治療に遺伝子編集を使用する前に、慎重に分析される必要がある。

【0005】

潜在的オフターゲット効果の高感度分析は、どのような臨床応用にも必須である。なぜなら、たとえ低頻度の事象であっても、有害なアウトカムを潜在的に招く可能性があるからである。潜在的オフターゲットのコンピューターシミュレーション予測が関与する方法は、オフターゲット効果を予測するのに最も頻繁に使用される。しかしながら、こうしたアプローチは、潜在的オフターゲットのゲノム位置を考慮していなければ、関心対象の細胞型も考慮していない。それ故に、こうしたアプローチが特定のｓｇＲＮＡのオフターゲット部位を特定する能力は、非常に限定的である。遺伝子編集技術の副作用を分析する理想的な方法は、ゲノムワイド（genome-wide）の不偏的様式でかつ高感度でオフターゲット部位を特定するもの、すなわち、非常に巨大な細胞集団において低頻度の変異さえも検出することができるものになるはずである。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）タグの効率的な組み込み、続いてタグ特異的増幅、及び高処理配列決定に基づくものである。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑは、感度が高く、細胞集団中の、試験したｓｇＲＮＡにより変異誘発されたオフターゲット部位を検出することができる。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑの利点の幾つかとして、その実験の簡潔さ、効率及び精度の高さ、並びに生理学的に関連する細胞の文脈におけるヌクレアーゼ誘導型ＤＳＢの修復アウトカムの検出が挙げられる。CIEMATは、遺伝子編集に基づく治療ツールを選択する最も厳密な基準に注意を払って、ＨＳＰＣ自身においてＧＵＩＤＥ－ｓｅｑを通じて関連ｓｇＲＮＡのオフターゲット効果を評価してきた。遺伝子編集プラットホームの副作用についてのこうした種類のゲノムワイドの不偏的分析は、ＨＳＰＣにおける遺伝子編集の臨床使用の安全性を保証することになる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Dever, Bak et al. 2016

【非特許文献2】Bak, Dever et al. 2018

【非特許文献3】Charlesworth, Camarena et al. 2018

【非特許文献4】Pavel-Dinu, Wiebking et al. 2019

【非特許文献5】Greaves and Maley 2012

【非特許文献6】Vakulskas, Dever et al. 2018

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】ＲＰＫ開始コドンに対する様々なシングルガイドＲＮＡの位置を示す図である。ＲＰＫ ＣＤＳの部分は、紫色でマーカーを付してある。ＲＰＫ開始コドンのＡＴＧは、緑色で示す。ＲＰＫ開始コドンから３０ｂｐ上流の隠れた（Cryptic）ＡＴＧは、赤色で示す。加えて、ゲノム中のシングルガイドＲＮＡ標的は、ＳＧ１標的を除いて青色四角で示し、ＳＧ１標的は、赤色四角で示す。

【図2】ＰＫＬＲ遺伝子座を認識する様々なシングルガイドＲＮＡの有効性を示す図である。ヒト細胞株Ｋ５６２におけるＳＧ１、ＳＧ２、ＳＧ３、及びＳＧ４ガイドのインデル（挿入／欠失）頻度をＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより分析した。ゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲを行って、ＲＰＫ遺伝子の開始コドン周囲の領域を増幅させた。次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼＳを用いて製造元の指示書に従い消化し、消化産物を、１０％ＮｏｖｅｘＴＢＥゲルで分離させて評価した。切断を測定する目的で、様々なバンドの濃度測定値を測定することによりゲルの画像を分析した。

【図3】ＰＫＬＲ遺伝子座を認識する様々なシングルガイドＲＮＡのインデル頻度の有効性を示す図である。ヒトＣＢ－ＣＤ３４^＋細胞において分析したＳＧ１、ＳＧ３、ＳＧ５、ＳＧ６、及びＳＧ８のインデル頻度をＴＩＤＥアッセイにより分析した。ゲノムＤＮＡを精製し、ＰＣＲを行って、ＰＫＬＲ遺伝子のＲＰＫ転写物バリアントの開始コドン周囲の領域を増幅させた。次いで、ＰＣＲ産物にＳａｎｇｅｒ配列決定法を行った。ＴＩＤＥを用いてインデル頻度を計算するため、未編集の細胞を、常に、陰性対照として使用した。最後に、設計されたガイドの活性を、ＴＩＤＥソフトウェア（https://tide.deskgen.com/）を用いたインデル頻度の計算を通じて評価した。

【図4】選択されたシングルガイドＲＮＡのオフターゲット分析を示す図である。ＷＴ－Ｃａｓ９タンパク質又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９タンパク質いずれかとともにＲＮＰ形式になったＳＧ１ガイドＲＮＡを用いて電気穿孔したジャーカット細胞で、ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析を行った。５日後、ゲノムＤＮＡを単離した。ＩＤＴ施設内ガイド分析ツールを用いて、４４８のオフターゲット部位を特定した。それらのうち１４７箇所は、読み取りの１％超で出現した。ＷＴ－Ｃａｓ９ ＲＮＰで編集した試料の読み取りの８４％は、特異的オンターゲット遺伝子編集を提示しており、このパーセンテージは、ＲＮＰ形成にＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を使用した場合に上昇した（インデルの９４％がオンターゲット部位で生じた）。このことは、ＰＫＬＲ ＳＧ１ ＲＮＰが、安全かつ効率的であったことを示す。

【図5】ＳＧ１、ＳＧ９、及びＳＧ１０ ＲＮＰ（ＷＴ－Ｃａｓ９又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９いずれかと複合体形成）を用いて編集したｈＣＤ３４^＋細胞における、様々なオンターゲット部位でのＨＤＲ対ＮＨＥＪの分析を示す図である。ｒｈＡｍｐＳｅｑアッセイを、図４から設計した。手短に述べると、ＰＫＬＲ ＳＧ１を用いたＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験のトップヒット（１つのオンターゲット部位、ＯＮ、及び４８のオフターゲット部位、ＯＴ）を、ｒｈＡｍｐＳｅｑプールで増幅させた。次いで、ライブラリーを、ＭｉＳｅｑシステムで走らせ、施設内分析ツールを用いて分析した。不完全ＨＤＲ（ＨＤＲテンプレートの一部の相同組換え）のパーセンテージ及び完全ＨＤＲ（ＨＤＲテンプレート全部の相同組換え）のパーセンテージに、ＮＨＥＪパーセンテージを足すことにより、切断部位での編集レベルを計算した。ＳＧ１ ＲＮＰは、最も高いオンターゲット部位での遺伝子編集活性を示した。完全ＨＤＲレベルには、ＷＴ－Ｃａｓ９又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を用いた場合の差は見られなかった（それぞれ、３０．６％対３０．４％）が、ＮＨＥＪ及び不完全ＨＤＲのレベルは、ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を用いた場合に低下した。灰色、完全ＨＤＲパーセンテージ；橙色、不完全ＨＤＲパーセンテージ；青色、ＮＨＥＪパーセンテージ。

【図6】ＳＧ１ ＲＮＰ複合体を用いて電気穿孔したＣＢ－ｈＣＤ３４^＋細胞のオフターゲット分析の上位１０箇所を高いほうから降順に並べた図である。ｒｈＡｍｐＳｅｑアッセイを、図４から設計した。ＳＧ１を用いてＣＢ－ｈＣＤ３４^＋細胞を編集した。ＳＧ１は、ＷＴ－Ｃａｓ９又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９（ＩＤＴ）いずれかと複合体形成させることでＲＮＰ複合体を形成したシングルガイドＲＮＡであった。加えて、試料の一部に特異的ＨＤＲテンプレートを加えた。ＰＫＬＲ ＳＧ１を用いたＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験のトップヒット（１つのオンターゲット部位、ＯＮ、及び４８のオフターゲット部位、ＯＴ）を、ｒｈＡｍｐＳｅｑプールで増幅させた。次いで、ライブラリーを、ＭｉＳｅｑシステムで走らせ、施設内分析ツールを用いて分析した。上位１０箇所におけるＲＮＰによる総遺伝子編集効率［ＷＴ－Ｃａｓ９又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９ ＨｉＦｉ＋ＳＧ１（ＰＫＬＲ ＳＧ１ ＡＴＧ）］±ＨＤＲ－ＳＧ１テンプレートを表示する。橙色バー及び黄色バーは、特異的ＨＤＲテンプレートの不在下で、ＷＴ－Ｃａｓ９又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９それぞれと複合体形成したＳＧ１が引き起こした遺伝子編集を示す。青色バー及び灰色バーは、特異的ＨＤＲテンプレートの存在下で、ＷＴ－Ｃａｓ９又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９それぞれと複合体形成したＳＧ１が引き起こした遺伝子編集を示す。不連続赤色線は、検出限度（０．１％未満）を示す。ＷＴ－Ｃａｓ９編集（青色バー及び橙色バー）の読み取りに比べて、ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を使用した場合、オフターゲット読み取り数は、顕著に低下した（灰色バー及び黄色バー）。ＨＤＲテンプレート不在下では、オフターゲット部位に相当する全ての読み取りは、検出限度（０．１％）を下回り、ＳＧ１－Ｃａｓ９ ＲＮＰ及びＨＤＲテンプレートで細胞を編集した場合に達成された最も高いオフターゲットスコアは、０．１３％であった。

【図7】レポータードナー及び治療用ホモログドナーをＰＫＬＲ遺伝子座に対して標的指向させるスキームを示す図である。２種の構築物を設計して、ＲＰＫ転写物バリアントのゲノム開始部位（ＲＰＫ［ＡＴＧ］の開始コドンは赤色）に、ｉ）レポータードナー（上部の紫色）及びｉｉ）治療用ドナー（下部の青色）のノックインを行った。最良のガイドＲＮＡ（ピンク色、ＳＧ１）は、ＡＴＧ部位（ＰＡＭ配列、明るい水色）の３８ｂｐ上流の切断をもたらした。レポータードナーの場合（図の上側の紫色）、切断部位近傍の４２５ｂｐの配列が、相同性アーム（ＨＡ）として使用され、これを、ＡＡＶ構築物中、ＵＢＣプロモーター、ターボＧＦＰ配列、及びｂＧＨ遺伝子のポリアデニル化シグナルに隣接してクローン導入した。治療用ドナーの場合（図の上側の青色）、ＲＨＡとして使用した配列は、レポータードナーに使用したものと同じにすることで、構築物を可能な限り比較可能にした。ＲＰＫ ５’ＵＴＲ配列の部分（褐色）を加える目的で、ＬＨＡを、８ｂｐ上流に置き換えたが、４２５ｂｐの大きさは維持した。治療用ドナーのＬＨＡ及びＲＨＡは、５’ＵＴＲ配列、ＲＰＫ転写物バリアントのコドン最適化版（ｃｏＲＰＫ）、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ配列、及びｂＧＨ遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む構築物と隣接していた。

【図8】ＳＧ１（配列番号１）。オンターゲット配列の図である。この図は、ＲＰＫ転写物バリアントの開始部位のゲノム領域を、明るい紫色で表す。タンパク質の最初の２７アミノ酸を示す。ＳＧ１の切断部位は、明るい赤色で表してあるが、これは、ＲＰＫ開始コドンの３８ｂｐ上流にある。ＳＧ１のＰＡＭ配列及び切断部位は、暗い紫色を下に付してある。ＲＰＫ転写物バリアントの転写開始部位近くにＤＳＢを導入する様々なガイドＲＮＡの設計は、この目的で利用可能な様々なウェブサイト、例えば、Dr.Zhang研究室ツール（https://zlab.bio/guide-design-resources）又はＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）ウェブサイト（https://eu.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_SEQUENCE）のツールを用いて行った。配列番号１：ＣＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＧＡＧ

【図9】ＳＧ１オンターゲットに対するＬＨＡ位置を示す図である。

【図10】ＳＧ１オンターゲット及びＲＰＫ開始コドンに対するＬＨＡ位置及びＲＨＡ位置を示す図である。ＲＰＫ転写物バリアントの転写開始部位周囲の配列を表す図（ＣＤＳは明るい紫色）であり、ぞれぞれ、ＳＧ１認識部位（赤色）、ＳＧ１により生成する切断部位（暗い紫色）、並びに右相同性アーム及び左相同性アームの相同性領域の開始（緑色）を示す。ＳＧ１の標的配列は、遺伝子編集後の再切断を回避するため、ＬＨＡとＲＨＡの間で分割されている。

【図11】ＰＫＬＲ遺伝子座における両相同性アームに対する５’ＵＴＲ位置を示す図である。５’ＵＴＲは、暗くしてある。５’ＵＴＲ領域の表示部分は、ＳＧ１により生成するＤＳＢの上流になり、その結果、内在性５’ＵＴＲは、治療用カセットの挿入後、分断されることになる。各色の説明は、図９の通りである。黄色は、５’ＵＴＲである。

【図12】ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶベクター中のＬＨＡ及び開始コドンを持たないｃｏＲＰＫに対する５’ＵＴＲ位置を示す図である。図１１で言及した５’ＵＴＲの部分の配列は、左相同性アームとｃｏＲＰＫのｃＤＮＡの間にクローン導入されて、ＲＰＫ転写物バリアントの内在性調節を維持する。転写開始部位は、クローン導入された５’ＵＴＲによりもたらされる。青色、５’ＵＴＲ局在；緑色、ＬＨＡ及びｃｏＲＰＫ配列。

【図13】ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶベクター中のＳＴＯＰコドンを持たないｃｏＲＰＫ及びｂＧＨポリ（Ａ）シグナルに対するＦＬＡＧ－Ｔａｇ位置を示す図である。ｃｏＲＰＫとＦＬＡＧ－Ｔａｇの間の融合タンパク質は、ｃｏＲＰＫ終止コドンを除去し、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）中にＦＬＡＧ－Ｔａｇ配列をクローン導入した後に作られたものである。終止コドンは、３’ＦＬＡＧ Ｔａｇ配列によりもたらされる。青色、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ配列；明るい緑色、ｃｏＲＰＫ配列；暗い緑色、ｂＧＨポリアデニル化シグナル。

【図14】ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶベクター中のｃｏＲＰＫ－ＦＬＡＧ及びＲＨＡに対するｂＧＨポリ（Ａ）シグナルを示す図である。ｃｏＲＰＫ－ＦＬＡＧタグｃＤＮＡの上流に、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨポリ（Ａ））シグナルをクローン導入して、治療用カセットを効率的に転写する。右相同性アーム（ＲＨＡ）は、このポリアデニル化シグナルの後にクローン導入する。青色、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ及び部分ＳＧ１ガイド配列、ＲＨＡ中に位置する、配列；明るい緑色、ｃｏＲＰＫ配列及びＲＨＡ配列；暗い緑色、ｂＧＨポリアデニル化シグナル。

【図15】ＰＫＤ患者由来のＨＳＰＣにおける赤血球分化能力を用いた遺伝子編集を示す図である。Ａ）特異的インアウト（in-out）ＰＣＲにより、５’（ＬＨＡ）ジャンクション及び３’（ＲＨＡ）ジャンクション両方における治療用ドナー（ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶ＋ＲＮＰ）の正確な組み込みを検証した。Ｂ）３人のＰＫＤ患者の編集されたＨＳＰＣに由来する赤血球のＡＴＰ定量を、未編集ＰＫＤ－ＨＳＰＣ由来の赤血球を基準に相対化したもの。ＨＤ未編集：ｉｎ ｖｉｔｒｏで赤血球分化を起こさせた健康なドナー由来のＨＳＰＣ；ＰＫＤ未編集：ｉｎ ｖｉｔｒｏで赤血球分化を起こさせたＰＫＤ患者由来のＨＳＰＣ；ＰＫＤ ＧＦＰ／ｃｏＲＰＫ：ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ＧＦＰ－ＡＡＶ又はｃｏＲＰＫ－ＡＡＶを用いた遺伝子編集を受け、その後赤血球分化を起こさせたＰＫＤ患者由来のＨＳＰＣ。クラスカル・ウォリス多重比較検定を行った；Ｐ値を図中に示す。ｎｓ＝有意ではない。

【図16】配列１３～配列２７の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明の説明
定義
本明細書において使用される場合、以下の用語は、特に断りのない限りそれらに帰する意味を有する。

【0009】

本明細書において使用される場合、数量を指定しない単数形（The terms "a," "an," or "the"）は、１つのメンバーを有する態様を含むだけでなく、２以上のメンバーを有する態様も含む。例えば、数量を指定しない単数形は、文脈が明確に指示しない限り、複数の対象物を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」に対する言及は、複数のかかる細胞を含み、「その作用物質（the agent）」への言及は、当業者に知られている１つ以上の作用物質への言及を含む、等々である。

【0010】

「遺伝子」という用語は、ポリヌクレオチド要素の組合せを指し、天然又は組換え様式のいずれかで作動可能に連結されると、何らかの生成物又は機能を提供する。「遺伝子」という用語は、広く解釈されるべきであり、遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ及びゲノムＤＮＡ形態を包含することができる。

【0011】

「相同性指向修復」又は「ＨＤＲ」という用語は、修復を導く相同テンプレートを使用して二本鎖ＤＮＡ切断を正しく、かつ正確に修復する細胞内の機構を指す。ＨＤＲの根底にあるメカニズムは相同組換え（ＨＲ）である。

【0012】

「相同組換え」又は「ＨＲ」という用語は、ＤＮＡの２つの類似した分子間でヌクレオチド配列が交換される遺伝的プロセスを指す。相同組換え（ＨＲ）は、ＤＮＡの両鎖に生じる有害な切断（二本鎖切断又はオーバーハング配列を生成する他の切断として知られる）を正しく修復するために細胞によって使用される。

【0013】

「シングルガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」という用語は、標的ゲノムＤＮＡに対するＣａｓヌクレアーゼを標的とするガイド配列と、Ｃａｓヌクレアーゼと相互作用する足場配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含有するＤＮＡ標的指向性ＲＮＡを指す。好ましくは、上記ｓｇＲＮＡは、配列番号１を含むか配列番号１のみからなる。

【0014】

「Ｃａｓポリペプチド」又は「Ｃａｓヌクレアーゼ」という用語は、ｃｒＲＮＡ分子内に含まれる２０ヌクレオチドガイド配列によって特定される部位でＤＮＡを切断して二本鎖切断で平滑末端を生成するクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート関連ポリペプチド又はヌクレアーゼを指す。Ｃａｓヌクレアーゼは、部位特異的ＤＮＡ認識及び切断のためにｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。ｃｒＲＮＡは、部分相補性の領域を介して、又はリンカーを介してｔｒａｃｒＲＮＡと会合し、Ｃａｓヌクレアーゼを「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ中のｃｒＲＮＡと相同な領域に導く。

【0015】

「ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９」という用語は、本明細書中、野生型Ｃａｓ９と同様なオンターゲット活性を持つが、低下したオフターゲット活性で、効率的遺伝子編集を可能にするリボ核タンパク質複合体として送達される高忠実度Ｃａｓ９変異体と解釈される。ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９は、Vakulskasらにより記載された（非特許文献６）。

【0016】

「リボ核タンパク質複合体」又は「ＲＮＰ複合体」という用語は、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを含む複合体を指す。

【0017】

「アデノ随伴ウイルスベクター送達ドナーテンプレート」又は「ドナーテンプレート含有アデノ随伴ウイルスベクター」という用語は、標的細胞、例えば初代細胞における相同性指向性修復を介したＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集のための組換えドナーテンプレートを送達することができるアデノ随伴ウイルス粒子を指す。

【0018】

「組換えドナーテンプレート」という用語は、場合によっては、二本鎖切断から生じる、損傷ＤＮＡ修復機構によって開始される、相同組換え鎖侵入時の核酸鎖、例えば、ドナー鎖であるＤＮＡ鎖を指す。ドナーポリヌクレオチドは、損傷したＤＮＡ領域の修復を指示するテンプレート材料として機能する。

【0019】

２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における「配列同一性」又は「パーセント同一性」という用語は、同じ（「同一」）であるか、又は第２の分子と最大限一致するように比較及び整列されたときに同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定の割合を有する２つ以上の配列又は部分配列（「パーセント同一性」）を指し、配列比較アルゴリズムを用いて（例えば、ＢＬＡＳＴアライメント、又は当業者に知られている他の任意のアルゴリズムによって）、又は代わりに目視検査によって測定される。

【0020】

「相同」という用語は、それらが天然又は人工的に、共通の祖先タンパク質又はアミノ酸配列から誘導される場合の２つ以上のアミノ酸配列を指す。同様に、ヌクレオチド配列は、それらが共通の祖先核酸から天然又は人工的に誘導される場合、相同である。

【0021】

「初代細胞」という用語は、多細胞生物から直接単離された細胞を指す。初代細胞は、典型的には、集団倍加をほとんど受けておらず、したがって、連続した（腫瘍又は人工的に不死化された）細胞株と比較して、それらが由来する組織の主要な機能的構成要素をより表している。場合によっては、初代細胞は単離され、その後すぐに使用される細胞である。他の場合では、初代細胞は無期限に分裂することができず、したがってｉｎ ｖｉｔｒｏで長期間培養することができない。

【0022】

「遺伝子改変初代細胞」又は「ゲノム編集初代細胞」という用語は、場合によっては異種核酸がその内因性ゲノムＤＮＡに導入された初代細胞を指す。

【0023】

「医薬組成物」という用語は、生理学的に許容され、かつ薬理学的に許容され得る組成物を指す。幾つかの例では、組成物は、保存中の緩衝化及び貯蔵のための作用物質を含み、そして投与経路に応じて適切な送達のためのバッファー及び担体を含むことができる。

【0024】

「薬学的に許容され得る担体」という用語は、細胞、生物、又は対象への作用物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、改変シングルガイドＲＮＡ、遺伝子改変初代細胞等）の投与を補助する物質を指す。「薬学的に許容され得る担体」は、組成物又は製剤に含めることができ、患者に著しく有害な毒物学的影響を引き起こさない担体又は賦形剤を指す。薬学的に許容され得る担体の非限定的な例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩水、乳酸化リンゲル、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング剤、甘味料、香料及び着色剤等が挙げられる。当業者は、他の医薬担体が本発明において有用であることを認識するであろう。

【0025】

「投与する」又は「投与」という用語は、本明細書に開示される作用物質、組成物、剤形及び／又は組合せが、治療又は予防目的のために対象に送達されるプロセスを指す。本明細書に開示される組成物、剤形及び／又は組合せは、対象の臨床状態、投与部位及び投与方法、投与量、対象の年齢、性別、体重、及び医師に知られている他の要因を考慮に入れた良好な医療行為に従って投与される。例えば、「投与する、投与すること」又は「投与」という用語は、臨床医又は他の臨床専門家によって本明細書に開示される作用物質、組成物、剤形及び／又は組合せを提供すること、与えること、投薬すること及び／又は処方することを含む。

【0026】

「治療する」という用語は、治療的利益及び／又は予防的利益を含むがこれらに限定されない有益な又は所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益とは、治療中の１つ以上の疾患、状態、又は症状の任意の治療的に関連する改善又はそれに対する効果を意味する。予防的利益の場合、組成物は、特定の疾患、状態、若しくは症状を発症するリスクのある対象に、又は疾患の生理学的症状のうちの１つ以上を訴える対象に、たとえ疾患、状態、又は症状がまだ顕在化していなくても投与され得る。

【0027】

「対象」、「患者」、及び「個体」という用語は、ヒト又は動物を含むために本明細書で同じ意味で使用される。例えば、動物の対象は、哺乳動物、霊長類（例えば、サル）、家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、又はヤギ）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ）、実験室の実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的に重要な動物であってもよく、又は経済的に重要な動物であってもよい。

【0028】

特段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この技術が属する技術分野における当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。例示的な方法、装置及び材料が本明細書に記載されているが、本明細書に明示的に記載されているものと類似又は等価な任意の方法及び材料を、本技術の実施又は試験において使用することができる。例えば、本明細書に記載の試薬は単なる例示であり、かかる等価物は当該技術分野において既知である。本技術の実施には、特に断らない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組換えＤＮＡの従来の技術を採用することができ、これらは当業者の技術の範囲内である。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition、Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyのシリーズ、Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)のシリーズ、MacPherson et al. (1991) PCR I: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)、MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach、Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual、Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition、Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)、及びMakrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)を参照されたい。

【0029】

説明
本発明の背景で既に示したとおり、ここ数年で、遺伝子編集は、遺伝子変異の正確な補正が可能であることを理由に、血球細胞疾患の有望な遺伝子治療アプローチとして出現してきた。ＲＮＰは、ドナーテンプレート送達用のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と併用することで、様々な疾患の治療のための遺伝子編集の分野にアプローチしている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。この意味で、本発明者らは、このアプローチをＰＫＤの補正に向けて設定し、特定ＲＮＰとＡＡＶを組み合わせることを通じて、ヒト造血前駆細胞のうち最大で４０％が、治療用ＲＰＫ（Ｒ型ピルビン酸キナーゼ）遺伝子座で遺伝子編集されたことを見出した。これらの結果から、遺伝子編集療法の臨床使用は、ＰＫＤを補正する見込みがあることが示唆されるが、しかしながらこの新規遺伝子編集技術を臨床応用するのに最も懸念される問題は、ＲＮＰが引き起こすオフターゲット効果である。高忠実度Ｃａｓ９を使用することでオフターゲット活性は低下してきたものの、それでも依然として、患者の治療に遺伝子編集を使用する前に、オフターゲット効果を大幅に低下させる必要がある。

【0030】

この目的のため、及びオフターゲット効果を回避するため、二本鎖切断（ＤＳＢ）は、外来性ＤＮＡが組み込まれる予定の場所に可能な限り近く位置してしなければならない。ｓｇＲＮＡ、より具体的にはｃｒＲＮＡは、この位置を決定する。この意味では、ｓｇＲＮＡ、より具体的にはｃｒＲＮＡは、オンターゲット切断を最大化しかつオフターゲット効果を最小限にするように慎重に選択する必要がある。相同性アームは、ＤＳＢの部位周囲になければならない。これらは、選択されたｓｇＲＮＡに従って、機能を維持しかつ追加の配列変更を回避するように設計する必要がある。

【0031】

本発明では、ＤＳＢを関心対象のゲノム部位に導入する様々なシングルガイドＲＮＡの設計を、その目的で利用可能な様々なウェブツールを用いて行った（実施例１を参照）。得られた様々なｃｒＲＮＡ（配列番号１～配列番号１０）のＤＳＢの作成有効性を試験し、それらを、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ、ＴＩＤＥ、及び／又はＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ及びｒｈＡｍｐ－Ｓｅｑにより評価した。結果から示されたのは、選択したｃｒＲＮＡのうち１種だけが、Ｋ５６２細胞のオンターゲット部位で非常に高頻度のインデルを生成し、ヒトＣＢ－ＣＤ３４^＋細胞のオンターゲット部位で非常に高頻度のインデルを生成し、この特定ｃｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３－Ｃａｓ９細胞及びジャーカット細胞に形質移入した場合、複数のオフターゲットを示したものの、それらは、ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９ ＲＮＰが使用された場合にはほとんど無視できるものであったことである。そのようなｃｒＲＮＡは、配列番号１（ＤＮＡとして）又は配列番号１１（ＲＮＡとして）のｃｒＲＮＡ ＳＧ１に相当する。注記すべきこととして、そのようなｃｒＲＮＡ（ＳＧ１）は、実施例１に示すとおり、ＲＰＫ転写物バリアントの適切なＡＴＧ開始コドンを選択する時点でのエラーによるものであった。この意味で、そのようなｃｒＲＮＡ ＳＧ１が、試験した様々なｃｒＲＮＡと比較した場合に明らかに改善された効果を示したという事実が、驚くべきものであった。事実、そのようなｃｒＲＮＡ ＳＧ１は、ＲＰＫ開始コドンから３０ｂｐ上流に位置する隠れたＡＴＧ周囲で同定された様々なｃｒＲＮＡと比較した場合も、オフターゲット効果を回避するために、二本鎖切断（ＤＳＢ）は、外来性ＤＮＡが組み込まれる予定の場所に可能な限り近く位置してしなければならないという理由で、既に言及された設計の経過又はエラーを補正する目的で隠れたＡＴＧと適切なＡＴＧ ＲＰＫ開始部位の間で設計されたもの（ＳＧ５～ＳＧ８）と比較した場合にも、明らかな効果の改善を示した。これらの結果に基づき、本発明者らは、本明細書中、ＲＮＰが引き起こすオフターゲット効果を排除又は低減する目的で、配列番号１又は配列番号１１のｃｒＲＮＡを使用して、ＰＫＤを補正する遺伝子編集療法に使用するための新規ＲＮＰ複合体を提供することを提案した。

【0032】

この意味で、他の方法とは対照的に、本明細書中で提供されるＲＮＰ複合体は、オフターゲット効果のパーセンテージを大幅に低下させる。全体として、本発明は、ＲＮＰ複合体が、本発明のｃｏＲＰＫドナー配列の送達用アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）と併用することで、多様な細胞型において遺伝子補正を達成することができるｅｘ ｖｉｖｏで有効なゲノム編集ツールとして特別に適しているという証拠を提供し、ピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）の異なる細胞療法を開発するソースを提供する。

【0033】

それ故に、本発明の第１の態様において、本発明者らは、本明細書中、配列番号１若しくは１１を含む、又は配列番号１若しくは１１のみからなる改変ｃｒＲＮＡを提供する。他の例において、本発明の改変ｃｒＲＮＡは、配列番号１又は配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１又は配列番号１１と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する、配列番号１又は配列番号１１のバリアントである（本明細書中以後、配列番号１、配列番号１１、並びにそれらの任意のバリアントは、本発明の改変ｃｒＲＮＡと称することにする）。

【0034】

好ましくは、本発明の改変ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡヌクレオチド配列に、又はＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドと相互作用するリンカーに、会合している又は結合している（なお、本明細書中、ｔｒａｃｒＲＮＡに会合している本発明の改変ｃｒＲＮＡは、本発明の改変シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と称することにする）。好ましくは、本発明の改変ｓｇＲＮＡは、配列番号１２、若しくは配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１２と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１２のバリアントを含む、又は配列番号１２若しくは配列番号１２のバリアントのみからなる。

【0035】

本発明の第２の態様は、本発明の改変ｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドとを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を示す。例えば、改変ｓｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを、容器中で一緒に混合して、本発明のＲＮＰ複合体を形成させることができ、次いで、ＲＮＰ複合体を、初代細胞に導入することができる。

【0036】

他の実施形態において、本発明は、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡと、本発明の改変ｓｇＲＮＡとを含む「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムを示す。

【0037】

本発明の第３の態様は、相同性アーム（ＬＨＡ及びＲＨＡ）を含むｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列と、ｃｏＲＰＫ配列と、真核生物細胞におけるタンパク質発現のための専用終結配列、例えば、ｂＧＨポリ（Ａ）配列とを含むベクターを示す。このベクターにおいて、好ましくは、ＬＨＡは、配列番号１３であり、ＲＨＡは、配列番号１４であり、ｃｏＲＰＫ配列は、配列番号１６であり、ｂＧＨポリ（Ａ）配列は、配列番号１８である。好ましくは、本発明のｃｏＲＰＫ配列は、配列番号１６、若しくは配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１６と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１６のバリアントを含む、又は配列番号１６若しくは配列番号１６のバリアントのみからなる。好ましくは、本発明のＬＨＡ配列は、配列番号１３、若しくは配列番号１３と少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１３と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１３のバリアントを含む、又は配列番号１３若しくは配列番号１３のバリアントのみからなる。好ましくは、本発明のＲＨＡ配列は、配列番号１４、若しくは配列番号１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１４と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１４のバリアントを含む、又は配列番号１４若しくは配列番号１４のバリアントのみからなる。好ましくは、本発明のｂＧＨポリ（Ａ）配列は、配列番号１８、若しくは配列番号１８と少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１８と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１８のバリアントを含む、又は配列番号１８若しくは配列番号１８のバリアントのみからなる。

【0038】

幾つかの例において、本発明のｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列を含むベクターは、更に、５’ＵＴＲ配列を含み、好ましくはそのような配列は、配列番号１５である。より好ましくは、ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列を含む上記ベクターは、配列番号１５、又は配列番号１５と少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１５と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１５のバリアントを含む。

【0039】

更なる例において、ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡを含むベクターは、配列番号１９～配列番号２２のいずれか、若しくは配列番号１９～配列番号２２のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１９～配列番号２２のいずれかと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１９～配列番号２２のバリアントを含む、又は配列番号１９～配列番号２２のいずれか若しくは配列番号１９～配列番号２２のバリアントのみからなる。

【0040】

本発明の第４の態様は、本発明のＲＮＰ複合体又は本発明の全ＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲシステムと、標的細胞、例えば、初代細胞において相同性指向型修復を介してＣＲＩＳＰＲ系遺伝子編集用組換えドナーテンプレートを送達することができるアデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶとを含むシステムを示す。幾つかの例において、上記アデノ随伴ウイルス又は相同性ドナーＡＡＶ骨格、例えば、（ＡＡＶ－６）若しくは（ＡＡＶ－１）又は任意の他の可能なＡＡＶ血清型若しくは血清型キメラは、ＡＡＶ骨格と少なくとも約９０％配列同一性を有する。なお、本発明において、ＡＡＶ骨格は、標的細胞における相同性指向型修復を介したＣＲＩＳＰＲ系遺伝子編集用の本発明の組換えドナーテンプレートを含まない、アデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶと解釈される。他の例において、ＡＡＶ骨格は、野生型ＡＡＶ６又は配列番号２３と少なくとも９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号２３と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するＡＡＶ６のバリアントである。幾つかの実施形態において、ＡＡＶ骨格の様々な構成要素の１つ以上、例えば（ＡＡＶ－６）若しくは（ＡＡＶ－１）又は任意の他の可能なＡＡＶ血清型若しくは血清型キメラをコードするポリヌクレオチドのベクターは、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、又は構成的プロモーターに、作動可能に連結される。また、構成要素と作動可能に連結される制御配列は、アクチベーター結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、リプレッサー結合配列、ステムループ構造、翻訳開始配列、翻訳リーダー配列、転写終結配列、翻訳終結配列、プライマー結合部位等を含むことができる。一般的に使用されるプロモーターは、構成的哺乳動物プロモーターＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１（マウス又はヒト）、Ｕｂｃ、ＣＡＧ、ＣａＭＫＩＩａ、及びベータ－Ａｃｔ、並びに当該技術分野で既知である他のもの（Khan, K. H. (2013) ''Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications,'' Advanced Pharmaceutical Bulletin 3(2), 257-263）である。さらに、Ｈ１及びＵ６をはじめとする哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターも使用することができる。

【0041】

幾つかの実施形態において、上記アデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーは、ＡＡＶ骨格と、初代細胞に送達される本発明のｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列とを含む。より好ましくは、アデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶは、配列番号１９～配列番号２２のいずれか、又は配列番号１９～配列番号２２のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号１９～配列番号２２のいずれかと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号１９～配列番号２２のバリアントを含む。

【0042】

より好ましくは、本発明のｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列を含むベクターを含むアデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶは、配列番号２４～配列番号２７のいずれか、又は配列番号２４～配列番号２７のいずれかと少なくとも９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号２４～配列番号２７のいずれかと９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有する配列番号２４～配列番号２７のいずれかのバリアントから選択される。

【0043】

そのうえさらに、本発明の第５の態様において、本発明者らは、本明細書中、ＰＫＬＲ遺伝子に１つ以上の変異を含むＰＫＬＲ遺伝子を含む標的核酸と、配列番号１又は１１に対して相補的であるヌクレオチド配列とを含み、初代細胞において、好ましくは造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）若しくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）において、又はＨＳＰＣ若しくは赤血球に分化する可能性のある任意の他の細胞型において、相同組換えを介して、上記初代細胞に安定遺伝子改変を誘導する方法を提供し、本方法は、以下：
（ａ）初代細胞に、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドに会合した本発明の改変ｃｒＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡ、すなわち本発明の「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムを含む組成物を導入することと、それと同時に又は順次に、
（ｂ）初代細胞に、相同組換えを受けさせる標的核酸に対応する本発明のｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列を含むアデノ随伴ウイルス粒子又は相同性ドナーＡＡＶを導入することと、
を含み、
本方法において、標的核酸の安定遺伝子改変は、補正ドナーテンプレートを含む相同性ドナーＡＡＶ、例えば、（ＡＡＶ－６）若しくは（ＡＡＶ－１）又は任意の他の可能なＡＡＶ血清型若しくは血清型キメラ、ベクターを導入することによる、ＰＫＬＲ遺伝子（標的核酸）の病因性変異の補償を含む。

【0044】

初代細胞、好ましくは、造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）若しくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又はＨＳＰＣ若しくは赤血球に分化する可能性のある任意の他の細胞型における上述の遺伝子改変戦略は、ピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）を有している又は罹患している対象を治療する目的で行われる。なお、ピルビン酸キナーゼ欠乏症（ＰＫＤ）は、ＰＫＬＲ遺伝子の変異を原因とする遺伝性常染色体劣性遺伝疾患であり、慢性非球状赤血球性溶血性貧血の主因となっている。世界規模で、２００００人に１人がＰＫＤに罹患していると推定され、そのおよそ１７％には、まだ根治的治療法がない。ＰＫＬＲ遺伝子は、赤血球において嫌気性解糖の最終工程に関係する赤血球ピルビン酸キナーゼタンパク質（ＲＰＫ）をコードする。こうしたＰＫＤ発症性変異は、ＲＰＫ活性の総合的又は部分的低下、及びそれに続くＡＴＰレベルの低下を招き、このような低下は、ＲＢＣ溶血及び結果としての貧血に有利に働く。この疾患は、タンパク質活性が赤血球の正常活性の２５％未満に低下すると、臨床的に関連するものとなる。

【0045】

したがって、本発明の第５の態様の更なる実施形態において、相同性ドナーＡＡＶは、ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列、例えば、配列番号１６を含み、より好ましくは、上記ドナーテンプレートは、ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列と、標的核酸の２つの相同性部分、例えば、配列番号１３及び１４とを含む。

【0046】

幾つかの実施形態において、初代細胞は、初代ＨＳＰＣ、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）若しくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又はＨＳＰＣ若しくは赤血球に分化する可能性のある任意の他の細胞型、及びそれらの任意の組合せからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、初代細胞は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドに会合した本発明の改変ｃｒＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡ、すなわち本発明の「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムと、相同性ドナーＡＡＶベクターとを、初代細胞に導入する前に、哺乳動物から単離されている。例えば、初代細胞は、ヒト対象から収集することができる。幾つかの例において、初代細胞又はその子孫は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドに会合した本発明の改変ｃｒＲＮＡ若しくはｓｇＲＮＡ、すなわち本発明の「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムと、相同性ドナーＡＡＶベクターとを、初代細胞に導入した後に、哺乳動物に戻される。言い換えると、遺伝子改変された初代細胞は、自家移植を受ける。他の例において、遺伝子改変された細胞は、同種移植を受ける。例えば、安定ではない遺伝子改変を受けた細胞を、ドナー対象から単離し、次いで、遺伝子改変されたドナー細胞を、ドナー対象とは異なるレシピエント対象に移植する。

【0047】

初代細胞は、初代細胞の集団を構成することができる。場合によっては、初代細胞の集団は、初代細胞の異種性集団を含む。他の場合において、初代細胞の集団は、初代細胞の同種性集団を含む。

【0048】

更に他の例において、相同性ドナーＡＡＶ骨格、例えば、（ＡＡＶ－６）又は（ＡＡＶ－１）は、ＡＡＶ骨格と少なくとも約９０％配列同一性を有する。他の例において、相同性ドナーＡＡＶ骨格は、野生型ＡＡＶ６、又は配列番号２３と少なくとも９５％配列同一性を有する、例えば、配列番号２３と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％配列同一性を有するＡＡＶ６骨格のバリアントである。幾つかの実施形態において、ＡＡＶ骨格の様々な構成要素のうち１つ以上、例えば（ＡＡＶ－６）又は（ＡＡＶ－１）をコードするポリヌクレオチドのベクターは、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、又は構成的プロモーターに作動可能に連結される。また、構成要素と作動可能に連結される制御配列は、アクチベーター結合配列、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化認識配列、プロモーター、リプレッサー結合配列、ステムループ構造、翻訳開始配列、翻訳リーダー配列、転写終結配列、翻訳終結配列、プライマー結合部位等を含むことができる。一般的に使用されるプロモーターは、構成的哺乳動物プロモーターＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１（マウス又はヒト）、Ｕｂｃ、ＣＡＧ、ＣａＭＫＩＩａ、及びベータ－Ａｃｔ、並びに当該技術分野で既知である他のもの（Khan, K. H. (2013) ''Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications,'' Advanced Pharmaceutical Bulletin 3(2), 257-263）である。さらに、Ｈ１及びＵ６をはじめとする哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターも使用することができる。

【0049】

幾つかの実施形態において、相同性ドナーＡＡＶ骨格は、特定の細胞型における核酸の発現を優先的に指示することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用してポリヌクレオチドを発現させる）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野において知られており、限定するものではないが、アルブミンプロモーター、リンパ系特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター）、膵臓特異的プロモーター、乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター）、並びに特にＴ細胞受容体及び免疫グロブリンのプロモーターが挙げられる。発生的に調節されたプロモーター、例えば、マウスホックスプロモーター及びアルファ－フェトプロテインプロモーターも包含される。

【0050】

ＡＡＶ、例えば（ＡＡＶ－６）又は（ＡＡＶ－１）、発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において知られており、典型的には宿主細胞の種類に基づいて選択される。

【0051】

幾つかの実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子改変は、初代細胞集団の約３０％超、例えば、初代細胞集団の約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％において誘導される。他の実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子改変は、初代細胞集団の約８０％超、例えば、初代細胞集団の約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％において誘導される。更に他の実施形態において、標的核酸の安定な遺伝子改変は、初代細胞集団の約９０％超、例えば、初代細胞集団の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％において誘導される。

【0052】

幾つかの実施形態において、本発明の第５の態様の配列は、リボース基、リン酸基、核酸塩基、又はそれらの組合せにおける修飾等の改変ヌクレオチドを含み得る。幾つかの例では、リボース基における修飾は、リボース基の２’位における修飾を含む。場合によっては、リボース基の２’位における修飾は、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、２’－デオキシ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）、及びそれらの組合せからなる群より選択される。他の例において、リン酸基における修飾は、ホスホロチオエート修飾を含む。他の実施形態において、改変ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、及びそれらの組合せからなる群より選択される。

【0053】

好ましくは、本発明の全ての態様及び実施形態に関して、Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチド又は高忠実度若しくは特異性向上型Ｃａｓ９ポリペプチドバリアントである。或る特定の実施形態において、本発明の改変ｓｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドは、同時に、初代細胞に導入される。他の実施形態において、改変ｓｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドは、順次、初代細胞に導入される。場合によっては、改変ｓｇＲＮＡが最初に導入され、その後Ｃａｓポリペプチドが導入される。他の場合では、Ｃａｓポリペプチドが最初に導入され、その後本発明の改変ｓｇＲＮＡが導入される。

【0054】

幾つかの実施形態において、本明細書中に記載されるＣａｓポリペプチドは、ＣａｓポリペプチドをコードするｍＲＮＡであることが可能であり、このＣａｓ ｍＲＮＡが、本発明の改変ｇＲＮＡと一緒に「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムとして、初代細胞に導入される。或る特定の例において、本発明の改変ｇＲＮＡ及びＣａｓ ｍＲＮＡは、同時に、初代細胞に導入される。他の例において、改変ｇＲＮＡ及びＣａｓ ｍＲＮＡは、順次、初代細胞に導入される。場合によっては、本発明の改変ｇＲＮＡが最初に導入され、その後Ｃａｓ ｍＲＮＡが導入される。他の場合では、Ｃａｓ ｍＲＮＡが最初に導入され、その後本発明の改変ｇＲＮＡが導入される。

【0055】

幾つかの実施形態において、ＲＮＰ複合体と相同ドナーＡＡＶ、例えば（ＡＡＶ－６）又は（ＡＡＶ－１）、ベクターとが、初代細胞に同時に導入される。他の実施形態において、ＲＮＰ複合体及び相同ドナーＡＡＶベクターは、順次、初代細胞に導入される。幾つかの例では、ＲＮＰ複合体は、相同ドナーＡＡＶベクターの前に初代細胞に導入される。他の例では、相同ドナーＡＡＶベクターは、ＲＮＰ複合体の前に初代細胞に導入される。例えば、ＲＮＰ複合体を、相同ドナーＡＡＶベクターの約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分若しくは２４０分、又はそれ以上前に初代細胞に導入することができ、逆もまた同じである。特定の実施形態において、ＲＮＰ複合体は、相同ドナーＡＡＶベクターの約１５分（例えば、約１０分～約２０分）前に初代細胞に導入される。

【0056】

幾つかの実施形態において、「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステム及び相同ドナーＡＡＶベクターが、初代細胞に同時に導入される。他の実施形態において、「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステム及び相同ドナーＡＡＶベクターは、順次、初代細胞に導入される。幾つかの例では、「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムは、相同ドナーＡＡＶベクターの前に初代細胞に導入される。他の例では、相同ドナーＡＡＶベクターは、「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムの前に初代細胞に導入される。例えば、「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムを、相同ドナーＡＡＶベクターの約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２１０分若しくは２４０分、又はそれ以上前に初代細胞に導入することができ、逆もまた同じである。特定の実施形態において、「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステムは、相同ドナーＡＡＶベクターの約１５分（例えば、約１０分～約２０分）前に初代細胞に導入される。

【0057】

幾つかの実施形態において、本明細書に記載の方法のいずれかが、マーカーを用いて標的核酸の安定な遺伝子改変を有する初代細胞を精製することも含み得る。場合によっては、精製工程によって単離された組成物は、標的核酸の安定な遺伝子改変を有する初代細胞を少なくとも約８０％、例えば、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の標的核酸の安定な遺伝子改変を有する初代細胞を含む。

【0058】

幾つかの実施形態において、本発明の改変ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを初代細胞に導入する工程は、改変ｇＲＮＡ及びＣａｓポリペプチドを初代細胞に電気穿孔することを含む。幾つかの実施形態において、相同ドナーＡＡＶ、例えば（ＡＡＶ－６）又は（ＡＡＶ－１）、ベクターを初代細胞に導入する工程は、初代細胞を形質導入することを含む。

【0059】

他の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書中に記載される方法のいずれかにより生成した遺伝子改変初代細胞である。幾つかの実施形態において、遺伝子改変初代細胞は、ＨＳＰＣ、又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）若しくは人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、又はＨＳＰＣ若しくは赤血球に分化する可能性のある任意の他の細胞型、又はそれらの任意の組合せからなる群より選択される。

【0060】

更に他の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の遺伝子改変初代細胞のいずれかと、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物である。他の実施形態において、医薬組成物は、１種類の遺伝子改変初代細胞を含む。他の実施形態において、医薬組成物は、２つ以上の異なるタイプの遺伝子改変初代細胞、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なるタイプの遺伝子改変初代細胞を含む。

【0061】

更なる態様において、本明細書で提供されるのは、（ａ）ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ポリペプチドに会合した本発明の改変ｃｒＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ、すなわち本発明の「全ＲＮＡ」ＣＲＩＳＰＲシステム、及び／又は（ｂ）相同組換えを受けさせる標的核酸に対応する本発明のｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列を含む、アデノ随伴ウイルス粒子若しくは相同性ドナーＡＡＶを含むキットのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用である。

【0062】

幾つかの例では、キットは、対象から初代細胞を採取又は単離するための試薬も含む。対象は、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象であり得る。

【0063】

なお更なる態様において、本明細書で提供されるのは、ＰＫＤの予防又は治療を必要とする対象において、ＰＫＤを予防又は治療する方法であり、該方法は、該疾患を予防し、又は該疾患の１つ以上の症状を改善するために、本明細書に記載の遺伝子改変初代細胞のいずれか、又は本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを対象に投与することを含む。

【0064】

幾つかの実施形態において、投与する工程は、静脈内、腹腔内、骨内、又はそれらの組合せからなる群より選択される送達経路を含む。

【0065】

特定の実施形態において、本発明の遺伝子改変初代細胞又は医薬組成物は、疾患に関連する標的核酸の変異を補正するのに十分な量で対象に投与される。幾つかの例では、変異は、標的核酸中の変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子で置き換えることによって補正される。

【0066】

本発明の他の目的及び利点は、次の詳細な説明の総括から当業者に明らかになり、これは以下の例示的な図面、及び添付の特許請求の範囲を参照して進行する。

【0067】

その結果、本出願人らは、ＰＫＤ変異を確実に修復するためのＣＲＩＳＰＲシステムの使用を本明細書に示した。本出願人らは、変異部位の周囲の部位を標的とする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたＰＫＤ疾患変異のＤＮＡ修復は、新しく独創的な治療アプローチとなる。本発明は、病因性変異を不活性化又は修復するために操作されたヌクレアーゼを用いてＤＮＡレベルで作用する可能性を提供する。

【0068】

以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0069】

本実施例は、造血サイトカインの存在下、１６時間、２４時間、又は４８時間、ＨＳＰＣをｅｘ ｖｉｖｏで拡大させることに必要となる手順と、ｉ）ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせるシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを、ＰＫＬＲ遺伝子のＲＰＫ転写物バリアントの転写開始部位の上流に導入すること、及びｉｉ）相同性アーム（左［ＬＨＡ］及び右［ＲＨＡ］）と隣接したｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡを含むドナーマトリクスを導入することとを統合する様々な構成要素を例示することを意味する。ＬＨＡ及びＲＨＡは、外来配列が挿入されることになるゲノム配列に対して同一である。本明細書中で使用されるｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡには、５’ＵＴＲ ＲＰＫ配列の部分が先行しており、内在性調節下で治療カセットを発現する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＤＮＡヌクレアーゼが細胞核にアクセスするのに有利なように、電気穿孔法により導入され、ドナーマトリクスは、アデノ随伴ウイルスベクター血清型６（ＡＡＶ－ｃｏＲＰＫ）により導入される。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を組み立てるため、Ｃａｓ９タンパク質を、ｓｇＲＮＡと混合する。ＲＮＰを細胞に核形質移入（nuclefection）するため、電気穿孔装置を使用する。細胞を、予備刺激し、次いで電気穿孔法溶液に再懸濁させる。細胞懸濁液に、ＲＮＰ複合体を加え、細胞を電気穿孔する。電気パルスの後、ＨＳＰＣを、３７℃で１０分間、インキュベートする。次いで、予備加温した培地を加え、細胞を培養プレートに移す。核形質移入（Nucleofected）した細胞に、直ちに、対応するＡＡＶを様々な濃度で形質導入する。

【0070】

この細胞、すなわち造血幹細胞（ＨＳＣ）を、このようにして患者から得て、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作し、凍結させる。産物が特性分析されて正しいことが実証されたら、その細胞を、解凍して、注入される補正細胞の生着を許容するように化学療法で前処置を受けた患者に注入される。

【0071】

実施例１．本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの設計。
ｓｇＲＮＡ：
１．ｓｇＲＮＡ設計：
以前の報告に従って、ＤＳＢを導入し、遺伝子の最初でノックイン組み込みを促進するｓｇＲＮＡは、遺伝子のＲＰＫ転写物バリアントの開始コドンに可能な限り近づけて設計しなければならない。ｃｒＲＮＡの設計は、その目的で利用可能な様々なウェブツール、例えば、Dr.Zhang研究室ツール（https://zlab.bio/guide-design-resources）、又はＩＤＴツール（https://eu.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_SEQUENCE）等を用いて行った。ＲＰＫ転写物バリアントの適切なＡＴＧ開始コドンを選択する時点でのエラーのため、異なるｃｒＲＮＡが、ＲＰＫ開始コドンから３０ｂｐ上流に位置する隠れたＡＴＧ周囲で同定された。これらの最初に設計されたｃｒＲＮＡが、ＳＧ１～ＳＧ４であった。また、先に言及した設計の経過又はエラーを補正する目的で、隠れたＡＴＧと適切なＡＴＧ ＲＰＫ開始部位の間で、更なるｃｒＲＮＡを設計した（ＳＧ５～ＳＧ８）。なぜなら、オフターゲット効果を回避するためには、二本鎖切断（ＤＳＢ）は、外来性ＤＮＡが組み込まれる予定の場所に可能な限り近く位置しなければならないからである。

【0072】

【表1】

【0073】

２．ｓｇＲＮＡの有効性及び安全性：
表１の１０種の異なるｓｇＲＮＡ（配列番号１～１０）のＤＳＢ作成の有効性を、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ、ＴＩＤＥ、及び／又はＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ及びｒｈＡｍｐ－Ｓｅｑにより評価した。

【0074】

Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの場合、ゲノムＤＮＡを精製して、ＰＣＲを行い、ＲＰＫ転写物バリアントの開始コドン周囲の領域を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼＳを用いて、製造元の指示書に従い消化した。消化産物を、１０％Ｎｏｖｅｘ ＴＢＥゲルで分離させて評価した。切断を測定する目的で、異なるバンドの濃度測定値を測定することにより、ゲルの画像を分析した。

【0075】

また、ＳＧ１、ＳＧ３、ＳＧ５、ＳＧ６、及びＳＧ８のインデル頻度を、ヒトＣＢ－ＣＤ３４^＋細胞で、ＴＩＤＥアッセイにより分析した。ゲノムＤＮＡを精製して、ＰＣＲを行い、ＰＫＬＲ遺伝子のＲＰＫ転写物バリアントの開始コドン周囲の領域を増幅した。次いで、ＰＣＲ産物に、Ｓａｎｇｅｒ配列分析を行った。未編集の細胞を、常に、ＴＩＤＥでインデル頻度を計算するための陰性対照として使用した。最後に、設計されたガイドの活性を、ＴＩＤＥソフトウェア（https://tide.deskgen.com/）を用いてインデル頻度の計算を通じて評価した。

【0076】

そのうえさらに、最も有望なｓｇＲＮＡ３種（ＳＧ１、ＳＧ２、及びＳＧ３）と、新規設計したｓｇＲＮＡ（ＳＧ４、ＳＧ９、及びＳＧ１０）とを一緒に、それらのオフターゲット活性を、現時点で最も厳密な基準であるＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ及びｒｈＡｍｐＳｅｑに従って分析してから、それらのうち１種をその臨床使用について選択した。最初に、ｉｎ ｖｉｖｏでゲノム状況を考慮してオフターゲットを広範囲に特定するため、ＷＴ－Ｃａｓ９を恒常的に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株でＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析を行った。細胞を、異なるｓｇＲＮＡで形質移入した。５日後、細胞を収集し、ゲノムＤＮＡを単離した。ＩＤＴ施設内ガイド分析ツールでＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ－ｔａｇを用いて、オフターゲット部位を特定し、それらのうち読み取りの１％超で出現するものについても観察した。これらのｓｇＲＮＡについてｉｎ ｖｉｖｏオフターゲットを特定し、遺伝子編集全体におけるオンターゲットの改変の割合を計算した（表３）。しかしながら、ＲＮＰ形式のＳＧ１を用いて電気穿孔したジャーカット細胞で同じＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析を行った場合、オフターゲットの数は、劇的に減少した（図４）。そのうえ、ＲＮＰ複合体にＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を使用すると、ＳＧ１のオフターゲット効果は縮小した。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑによりカバーされない部位でのオンターゲット及びオフターゲット活性を定量する目的で、オンターゲット及びオフターゲットのインデル頻度を、ｒｈＡｍｐＳｅｑにより測定した。このアッセイは、細胞及びゲノム状況でＳＧ１の遺伝子編集をより正確に定量分析するのに寄与した。ＣＢ－ＣＤ３４^＋細胞を、ＳＧ１又はＳＧ９又はＳＧ１０を用いて編集した。これらは、減少したオフターゲット寄与を示したものであり（表３）、ＷＴ－Ｃａｓ９又はＨｉＦｉ－Ｃａｓ９いずれかと複合体形成させてＲＮＰ複合体を形成させた。さらに、試料の一部に、特異的ｓｓＯＤＮ ＨＤＲテンプレートを加えて、各ｓｇＲＮＡがＨＤＲに介在する能力を特定した。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験のトップヒット（１つのオンターゲット部位、ＯＮ、及び４８のオフターゲット部位、ＯＴ）を、ｒｈＡｍｐＳｅｑプールを用いて増幅させた。次いで、ＭｉＳｅｑシステムでライブラリーを走らせて、施設内分析ツールで分析した。ＮＨＥＪのパーセンテージを不完全ＨＤＲパーセンテージ及び完全ＨＤＲパーセンテージに加えることにより、切断部位での編集レベルを計算した。図５に示すとおり、ＳＧ１は、オンターゲット部位での遺伝子編集活性が最高であることが確認された。そのうえ、完全ＨＤＲの頻度は、ＲＮＰ複合体を形成するのにＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を用いた場合に変化しなかった。したがって、ＳＧ１ ＲＮＰ複合体にＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を使用することは、標的部位でのＨＤＲを妨害しなかった。さらに、ｈＣＤ３４^＋でのＳＧ１ ＲＮＰのオフターゲット効果を分析した（図６）。ＳＧ１ ＲＮＰにＨｉＦｉ－Ｃａｓ９を使用すると、全てのオフターゲットの改変が、技術の検出下限である０．１未満に低下した。それ故、ＳＧ１ ＨｉＦｉ－Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体を用いたｈＣＤ３４^＋細胞の遺伝子編集は、ＨＤＲを変更することなくオンターゲット部位での改変を高レベルに維持するとともに、オフターゲット効果を検出不能なレベルに低下させた。

【0077】

２．１．Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ
Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより得られた結果を、以下の表２に加えて、図２に示す。

【0078】

【表2】

【0079】

Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果：
ＳＧ１（配列番号１）が、Ｋ５６２細胞においてオンターゲット部位で最も高いインデル頻度をもたらした。

【0080】

２．２．ＴＩＤＥアッセイ
ＴＩＤＥアッセイにより得られた結果を、図３に示す。

【0081】

ＴＩＤＥアッセイの結果：
ＳＧ１（配列番号１）が、ヒトＣＢ－ＣＤ３４^＋細胞においてオンターゲット部位で最も高いインデル頻度をもたらした。

【0082】

２．３．ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ及びｒｈＡｍｐ－Ｓｅｑ：
ｉｎ ｖｉｖｏオフターゲットの同定：ＷＴ－Ｃａｓ９を恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３－Ｃａｓ９）でＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ分析を行って、ｉｎ ｖｉｖｏオフターゲットの同定を押し進めた。

【0083】

【表3】

【0084】

結果：
ＳＧ１（配列番号１）は、ＨＥＫ２９３－Ｃａｓ９に形質移入した場合、複数のオフターゲットを示した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）形式でのＰＫＬＲ ＳＧ１ ＡＴＧの安全性に関する結果を、図４及び図６に示す。ｈＣＤ３４^＋におけるＳＧ１由来のオフターゲット効果は、ＨｉＦｉ Ｃａｓ９－ＲＮＰを使用した場合、０．１％未満に低下した。

【0085】

３．ｒｈＡｍｐ－Ｓｅｑによる定量的オンターゲット改変及びＨＤＲ頻度
結果を図５に示す。図中、オンターゲット頻度は、ＣＢ－ＣＤ３４^＋において、ＳＧ１を使用した場合に最も高かった。さらに、ＳＧ１のＨＤＲ頻度の高さは、ＨｉＦｉ Ｃａｓ９－ＲＮＰを使用した場合に損なわれなかった。

【0086】

配列番号１：プロトスペーサーＳＧ１配列
CTGCGGGACCATGGAATGAG

【0087】

配列番号１１：ｃｒＲＮＡ ＳＧ１配列（ＲＮＡとして）
CUGCGGGACCAUGGAAUGAG

【0088】

配列番号１２：ｓｇＲＮＡ ＳＧ１配列（ＲＮＡとして）
CUGCGGGACCAUGGAAUGAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAUAAGGCUAGUCCG

【0089】

実施例２．ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶの設計
最も効率的かつ最も安全なｓｇＲＮＡは、特に実験の経過又はエラーの産物であったが、それが選択されたところで、ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶを設計した。以下のセクションで説明するとおり、ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶを、ＳＧ１オンターゲット部位周囲の２つの相同性アーム（左相同性アームすなわちＬＨＡ、及び右相同性アームすなわちＲＨＡ）、ＡＴＧの上流の配列（５’ＵＴＲ）、ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂｇｈ－ポリＡ）シグナルにより形成する。これは、図７及び図８に示すとおりである。ｃｏＲＰＫ－ＡＡＶは、ＳＧ１切断部位を考慮に入れて設計された。ＳＧ１切断部位は、ＲＰＫ開始コドンから３８ｂｐ上流にある。２つの相同性アームは、ＳＧ１切断部位周囲の配列から選択した。ＬＨＡは、ＲＰＫ開始コドンの上流４６３ｂｐ～３９ｂｐのゲノム領域を包含する（合計サイズ４２５ｂｐ）。ＲＨＡは、ＲＰＫ開始コドンの３０ｂｐ上流からＲＰＫ開始コドンの３９５ｂｐ下流までの領域を包含する（合計サイズ４２５ｂｐ）。ＬＨＡ及びＲＨＡと相同なゲノム領域の間に、８ｂｐのＳＧ１標的配列の領域が存在し、ここにＳＧ１切断部位が含まれる。相同性指向型修復が生じた後のＳＧ１の再切断を防ぐため、両相同性アーム間のこの８ｂｐギャップを考慮した。一方で、ＲＰＫ開始コドンの３７ｂｐ上流を包含する配列は、ＲＰＫ転写物バリアントのＫｏｚａｃ配列の一部であるが、ここを、ＡＴＧ及び終止コドンなしでｃｏＲＰＫ－ＡＡＶのｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡの５’にクローン導入した。なお、ＬＨＡと５’ＵＴＲの間には１ｂｐのギャップが存在するが、これはＳＧ１切断部位に相当し、いったんＨＤＲが生じた後、ＳＧ１により治療カセットが切断されるリスクを低下させるためである。

【0090】

１．ＬＨＡ（左相同性アーム）（配列番号１３）：
図９に示すとおり、ＬＨＡは、ＳＧ１切断部位の上流４２５ｂｐを包含する。
CAGAGTGGTGAAGGCACTCTGCATTTCTTGGTTGAGACAGAGAAAAAAAGTGGTCAGAACTGGGTAACCCTCCCCCCACCATATTATCACAGTGATCCCTTTTGTCTTTCTTCAGGCTCCAGCCCCACCCTACAGCCCCTGCTCCCTGGATTCACTAGAGCTAACTTCAGTAAAGTACAAAGAAAATGGGGCCATATGACTGGCCAAAAAAAAAATATCTATTCACGTGGATGACCAGATAGTATGAATGGATTGAAAATTTATCAGGAAAAAAGGATGAGAGGAAATGCCAGGAGATGAGGGCAGAGAGCAGGCCGTTCTGGGGGAGGGATTCTGTGGGGACAGGGTGGCCTACTGGGTGTGCCCCTTTTCTCTTCTCTGTCTCCCTTAGATAAGACCAGCAGTTTTGTCATCCTCTCCCTCTC

【0091】

２．ＲＨＡ（右相同性アーム）（配列番号１４）：
図１０に示すとおり、ＲＨＡは、ＳＧ１ ＰＡＭ配列から１１ｂｐ離れて始まる４２５ｂｐを包含する。
GTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGTCGATCCAGGAGAACATATCATCCCTGCAGCTTCGGTCATGGGTCTCTAAGTCCCAAAGAGACTTAGCAAAGTCCATCCTGATTGGGGCTCCAGGAGGTAAGAAGGGGAGACAGAAGCCATGGAACATAGGAGGAAAATGAGGGTGAAAACTAGGAGCCAGGGTGGAGGGCATAAATGATCCACATCAGCCACTGGCTAGGTGGGTTTTGGAGAGGAACGTACGTTCTTCAGAGCCTCCCGTGTGTTAAATTATGGACCCTGGCCTGGGTCTTTTCCAGGCCCTATAGGCAGGCCAGAGCCACAGCATGTAAGCCACGGGGCACTCCCGTGGTTCCTGGACTCTGGCCCCTGGCATACAGGGCTTCCAATGGAACAGGAGACAGTGGTGACA

【0092】

３．５’ＵＴＲ配列（配列番号１５）：
ＳＧ１プロトスペーサーの第４ｎｔからＲＰＫ開始コドンまでを含む４０ｂｐ配列を、開始コドン及び終止コドンを含まずに、ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡの下流にクローン導入した。この配列は、開始コドンとは別に、ｃｏＲＰＫの同様な赤血球発現に最も適切な５’ＵＴＲをＷＴ ＲＰＫに提供する。なぜなら、ＲＰＫ転写物バリアントのＫｏｚａｃ配列が、この配列の一部だからである。

【0093】

注：ＬＨＡと５’ＵＴＲの間には１ｂｐのギャップが存在して、遺伝子編集補正後のＳＧ１による再切断を防ぐ。なぜなら、ＳＧ１プロトスペーサーは、遺伝子編集後、完全には再建されないからである。
TTCCATGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATG

【0094】

４．ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ（配列番号１６）：
ｃｏＲＰＫ ｃＤＮＡ配列は、ＬＶ ｃｏＲＰＫの改変版（Garcia-Gomez et al. Mol Ther. 2016）であって、これは、ＧｅｎｅＡｒｔによるコドン最適化後に得られた。本明細書では、本発明者らは以下の変更を加えた。ｉ）ｃｏＲＰＫの発現を内在性ＰＫＬＲプロモーター及び内在性制御配列により駆動されるものとする目的で、ＰＫＬＲ内在性配列を使用するために、この配列を、開始コドンなしでクローン導入した；ｉｉ）この配列をＦＬＡＧ－Ｔａｇと融合させる目的で、終止コドンなしでクローン導入した。
AGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGC

【0095】

５．ＦＬＡＧ－Ｔａｇ（配列番号１７）：
健康なドナー由来のｈＣＤ３４^＋細胞を用いた遺伝子編集条件の設定中、遺伝子編集後の治療ＲＰＫタンパク質を追跡する目的で、この配列は、終止コドンなしでｃｏＲＰＫとともにインフレームで付加して、融合タンパク質を生成させた。しかし、ＦＬＡＧ－Ｔａｑは、臨床使用のために提案されるｃｏＲＰＫ－ＡＡＶには存在しない。なぜなら、ＦＬＡＧ－Ｔａｑは、ＰＫＤの補正に対してどのような機能的寄与もないからである。
GACTACAAAGACGATGACGATAAATGA

【0096】

６．ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル（配列番号１８）：
ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨ－ポリＡ）シグナルは、真核生物細胞におけるタンパク質発現のための専用終結配列である。
CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG

【0097】

７．ＬＨＡ－５’ＵＴＲ－ｃｏＲＰＫ－ＦＬＡＧ－ｂＧＨポリ（Ａ）－ＲＨＡ（配列番号１９）
これは、設定実験中、ＳＧ１標的部位でＨＤＲを通じてＰＫＤを補正するように設計されたドナー配列である。これは、ＬＨＡ（配列番号１３、太字）、５’ＵＴＲ（配列番号１５、斜体）、開始コドン及び終止コドンのないｃｏＲＰＫ（配列番号１６、下線付）、ＦＬＡＧ－Ｔａｑ（配列番号１７、太字かつ斜体）、及びｂＧＨポリ（Ａ）（配列番号１８、太字かつ下線付）ＲＨＡ（配列番号１４、太字かつ斜体）を、言及した順序で含む。これら要素配列の機能を、以下に記載する：
相同性アームは、ＳＧ１標的部位でｃｏＲＰＫカセットの挿入に介在する
５’ＵＴＲは、ｃｏＲＰＫ発現の適切な調節を確実にする
ｃｏＲＰＫは、ＲＰＫ転写物のコドン最適化版であり、これは、赤血球におけるＰＫＤ表現型を補正するＲＰＫタンパク質をコードする
ＦＬＡＧ－Ｔａｑは、健康なドナー由来のｈＣＤ３４^＋細胞を用いた遺伝子編集条件の設定中、ＷＴ ＲＰＫタンパク質とｃｏＲＰＫがコードするＲＰＫを区別するために付加されていたが、ＦＬＡＧ－Ｔａｑは、臨床使用のために提案されるｃｏＲＰＫ－ＡＡＶには存在しない。なぜなら、ＦＬＡＧ－Ｔａｑは、ＰＫＤの補正に対してどのような機能的寄与もないからである。
最後に、ｂＧＨポリ（Ａ）シグナルは、ｃｏＲＰＫ－ＦＬＡＧからタンパク質への翻訳を促進する。
CAGAGTGGTGAAGGCACTCTGCATTTCTTGGTTGAGACAGAGAAAAAAAGTGGTCAGAACTGGGTAACCCTCCCCCCACCATATTATCACAGTGATCCCTTTTGTCTTTCTTCAGGCTCCAGCCCCACCCTACAGCCCCTGCTCCCTGGATTCACTAGAGCTAACTTCAGTAAAGTACAAAGAAAATGGGGCCATATGACTGGCCAAAAAAAAAATATCTATTCACGTGGATGACCAGATAGTATGAATGGATTGAAAATTTATCAGGAAAAAAGGATGAGAGGAAATGCCAGGAGATGAGGGCAGAGAGCAGGCCGTTCTGGGGGAGGGATTCTGTGGGGACAGGGTGGCCTACTGGGTGTGCCCCTTTTCTCTTCTCTGTCTCCCTTAGATAAGACCAGCAGTTTTGTCATCCTCTCCCTCTCTTCCATGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCGACTACAAAGACGATGACGATAAATGAACGCGTGAGTTACAAATAAAGCACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGTCGATCCAGGAGAACATATCATCCCTGCAGCTTCGGTCATGGGTCTCTAAGTCCCAAAGAGACTTAGCAAAGTCCATCCTGATTGGGGCTCCAGGAGGTAAGAAGGGGAGACAGAAGCCATGGAACATAGGAGGAAAATGAGGGTGAAAACTAGGAGCCAGGGTGGAGGGCATAAATGATCCACATCAGCCACTGGCTAGGTGGGTTTTGGAGAGGAACGTACGTTCTTCAGAGCCTCCCGTGTGTTAAATTATGGACCCTGGCCTGGGTCTTTTCCAGGCCCTATAGGCAGGCCAGAGCCACAGCATGTAAGCCACGGGGCACTCCCGTGGTTCCTGGACTCTGGCCCCTGGCATACAGGGCTTCCAATGGAACAGGAGACAGTGGTGACA

【0098】

８．ＬＨＡ－５’ＵＴＲ－ｃｏＲＰＫ－ｂＧＨポリ（Ａ）－ＲＨＡ（配列番号２０）
配列番号２０は、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ配列が除去されたドナーマトリクス（配列番号１９）である。
CAGAGTGGTGAAGGCACTCTGCATTTCTTGGTTGAGACAGAGAAAAAAAGTGGTCAGAACTGGGTAACCCTCCCCCCACCATATTATCACAGTGATCCCTTTTGTCTTTCTTCAGGCTCCAGCCCCACCCTACAGCCCCTGCTCCCTGGATTCACTAGAGCTAACTTCAGTAAAGTACAAAGAAAATGGGGCCATATGACTGGCCAAAAAAAAAATATCTATTCACGTGGATGACCAGATAGTATGAATGGATTGAAAATTTATCAGGAAAAAAGGATGAGAGGAAATGCCAGGAGATGAGGGCAGAGAGCAGGCCGTTCTGGGGGAGGGATTCTGTGGGGACAGGGTGGCCTACTGGGTGTGCCCCTTTTCTCTTCTCTGTCTCCCTTAGATAAGACCAGCAGTTTTGTCATCCTCTCCCTCTCTTCCATGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGAACGCGTGAGTTACAAATAAAGCACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGTCGATCCAGGAGAACATATCATCCCTGCAGCTTCGGTCATGGGTCTCTAAGTCCCAAAGAGACTTAGCAAAGTCCATCCTGATTGGGGCTCCAGGAGGTAAGAAGGGGAGACAGAAGCCATGGAACATAGGAGGAAAATGAGGGTGAAAACTAGGAGCCAGGGTGGAGGGCATAAATGATCCACATCAGCCACTGGCTAGGTGGGTTTTGGAGAGGAACGTACGTTCTTCAGAGCCTCCCGTGTGTTAAATTATGGACCCTGGCCTGGGTCTTTTCCAGGCCCTATAGGCAGGCCAGAGCCACAGCATGTAAGCCACGGGGCACTCCCGTGGTTCCTGGACTCTGGCCCCTGGCATACAGGGCTTCCAATGGAACAGGAGACAGTGGTGACA

【0099】

９．ＬＨＡ－５’ＵＴＲ－ｃｏＲＰＫ－ｂＧＨポリ（Ａ）－ＲＨＡ（配列番号２１）
配列番号２１は、上記配列番号１９の逆配列である。

【0100】

ｃｏＲＰＫ治療ドナーからＡＡＶへの順序は、５’から３’に向かって：右相同性アーム（太字）、ｂＧＨポリ（Ａ）、ＦＬＡＧ－Ｔａｇ（太字かつ斜体）、開始コドンのないｃｏＲＰＫ（下線付）、５’ＵＴＲ（斜体）、及び左相同性アーム（太字）。
TGTCACCACTGTCTCCTGTTCCATTGGAAGCCCTGTATGCCAGGGGCCAGAGTCCAGGAACCACGGGAGTGCCCCGTGGCTTACATGCTGTGGCTCTGGCCTGCCTATAGGGCCTGGAAAAGACCCAGGCCAGGGTCCATAATTTAACACACGGGAGGCTCTGAAGAACGTACGTTCCTCTCCAAAACCCACCTAGCCAGTGGCTGATGTGGATCATTTATGCCCTCCACCCTGGCTCCTAGTTTTCACCCTCATTTTCCTCCTATGTTCCATGGCTTCTGTCTCCCCTTCTTACCTCCTGGAGCCCCAATCAGGATGGACTTTGCTAAGTCTCTTTGGGACTTAGAGACCCATGACCGAAGCTGCAGGGATGATATGTTCTCCTGGATCGACATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTGCTTTATTTGTAACTCACGCGTTCATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCGCTGATGGACAGCACCCTCATGATGTTGGTGTAGCCGCTGCCAGGCCGCCAGCCTGTCACCACGATCACCAGGTCGCCCACTCTCAGGAAGCCCCGCAGCTTGCCGCTCTCGATGCCGAACTGCACCCGTCTGTCCACGTCGTCGGCCCAGATGGCCTCGGGAGGCTCCCGGTACAGCAGGGGGAACACGCCTCTGCACAGGTGGACCTGTCTAGCGGCCTGGGCGGATCTTGTCACGGCGATCACGGCGGCTCTGGGTCTGTATCTGGACAGCAGCTGGGCGCTTCTGCCTGTGGTGGTCAGCACGATGATTGCAGCGGCGCAGCACTTGAAGGCGGCTTCCACGGCTCCGATGGCGGTCACTTCGGTGGGATCTCTGCTCAGAGGGGCGGCTCTCCGCAGTTCCTCGAACAGCTGCCGGTGGTACACGGCGGCCTCGGCTTCTCTGGCAATGGCGTGCTGCATCTTCACGGCCTCCACGGGGAAGTTGCCCTTGGCTGTCTCGCCGGACAGCATGATGCAGTCAGCGCCATCCAGCACGGCGTTGGCCACGTCGCTTGTCTCGGCTCTGGTGGGTCTGGGCTTGGTGATCATGCTTTCCAGCATCTGGGTGGCGCACACCACAGGTTTGCCGGCCAGGTTGCACCGTCCGATCATCATTTTCTGGGCCAGGAACACCTTCTCGGCGGGGATCTCGATGCCCAGGTCGCCTCTGGCCACCATGATGCCGTCGGACACTTCCAGGATCTCGTCGAACCGCTTCACGCCCTCGTGGTTCTCGATCTTGCTGATGATCTTGATGCCGTGGCCTTCAGGGCCCAGAGCGGCTCTCACGGCGGCCACATCAGAGGCCTTCCGCACGAAGCTGGCGAACACGATGTCCACGCCGTGCTCCACGCCAAATCTCAGGTCTCTCACGTCCTGCTCAGACAGGCCAGGCAGGTCCACCTGGGCGCCTGGCAGATTCACGCCCTTTCTGCTGCCCAGCACGCCGCCATTCTCGACCTGGGTCACCAGGCCCTCAGGTCCGATCTTCTGCACCACCAGGCTGATCAGGCCGTCGTCGATGTAGATTCTGCCGCCCACAGGCACCACCCGCACGATGTTGGGGTAGTCCACCCACACTGTGTTGGCGTTGCCTCTGGTTCTGAAGGCGGGGTCCACGGTCACCAGCACTTGGCTGCCCTTCACCAGCTCCACCTCGCTCTCAGGCCCTCCCTGCAGAATTCCTGTTCTGATCTCGGGGCCCTTGGTGTCCAGGGCAATGGCCACGGGTCTGTAGCTCAGGGGGCTGCCGGCAAAGCTCTCCACGGCCTCCCGGACGTTGGCAATGCTCTCTGCGTGGTACTCGTGGCTGCCGTGGGAGAAGTTCAGCCGGGCGATATTCATGCCGGCCTTGATCATCTCTTTCAGCCGCTCCACGCTTCTGCTGGCAGGGCCGATGGTGGCAATGATGCTGGTGCTTCTGGCGGCCACGGGCTCAGAGTCGATGTCCAGCAGGCACAGGTGTTCCAGAAAGGTGTCGGCCATGGCGGCTGGCAGCTGCTGCTGCTGGAAAAAGGCGGTGCCCAGTTCCTGGGTCAGCTGGGCCACGCTAGCCCTTCTCAGGTATCCGGCTGGTCCGCCAGGGGCTCCGATCAGGATGCTCTTGGCCAGGTCTCTCTGGCTCTTGGACACCCAGGACCGCAGCTGCAGAGAGCTGATATTTTCCTGGATGCTCATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCATGGAAGAGAGGGAGAGGATGACAAAACTGCTGGTCTTATCTAAGGGAGACAGAGAAGAGAAAAGGGGCACACCCAGTAGGCCACCCTGTCCCCACAGAATCCCTCCCCCAGAACGGCCTGCTCTCTGCCCTCATCTCCTGGCATTTCCTCTCATCCTTTTTTCCTGATAAATTTTCAATCCATTCATACTATCTGGTCATCCACGTGAATAGATATTTTTTTTTTGGCCAGTCATATGGCCCCATTTTCTTTGTACTTTACTGAAGTTAGCTCTAGTGAATCCAGGGAGCAGGGGCTGTAGGGTGGGGCTGGAGCCTGAAGAAAGACAAAAGGGATCACTGTGATAATATGGTGGGGGGAGGGTTACCCAGTTCTGACCACTTTTTTTCTCTGTCTCAACCAAGAAATGCAGAGTGCCTTCACCACTCTG

【0101】

１０．ＬＨＡ－５’ＵＴＲ－ｃｏＲＰＫ－ｂＧＨポリ（Ａ）－ＲＨＡ（配列番号２２）
配列番号２２は、上記配列番号２０の逆配列である。

【0102】

ｃｏＲＰＫ治療ドナーからＡＡＶへの順序は、５’から３’に向かって：右相同性アーム（太字）、ｂＧＨポリ（Ａ）、開始コドンのないｃｏＲＰＫ（下線付）、５’ＵＴＲ（斜体）、及び左相同性アーム（太字）。
TGTCACCACTGTCTCCTGTTCCATTGGAAGCCCTGTATGCCAGGGGCCAGAGTCCAGGAACCACGGGAGTGCCCCGTGGCTTACATGCTGTGGCTCTGGCCTGCCTATAGGGCCTGGAAAAGACCCAGGCCAGGGTCCATAATTTAACACACGGGAGGCTCTGAAGAACGTACGTTCCTCTCCAAAACCCACCTAGCCAGTGGCTGATGTGGATCATTTATGCCCTCCACCCTGGCTCCTAGTTTTCACCCTCATTTTCCTCCTATGTTCCATGGCTTCTGTCTCCCCTTCTTACCTCCTGGAGCCCCAATCAGGATGGACTTTGCTAAGTCTCTTTGGGACTTAGAGACCCATGACCGAAGCTGCAGGGATGATATGTTCTCCTGGATCGACATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTGCTTTATTTGTAACTCACGCGTTCAGCTGATGGACAGCACCCTCATGATGTTGGTGTAGCCGCTGCCAGGCCGCCAGCCTGTCACCACGATCACCAGGTCGCCCACTCTCAGGAAGCCCCGCAGCTTGCCGCTCTCGATGCCGAACTGCACCCGTCTGTCCACGTCGTCGGCCCAGATGGCCTCGGGAGGCTCCCGGTACAGCAGGGGGAACACGCCTCTGCACAGGTGGACCTGTCTAGCGGCCTGGGCGGATCTTGTCACGGCGATCACGGCGGCTCTGGGTCTGTATCTGGACAGCAGCTGGGCGCTTCTGCCTGTGGTGGTCAGCACGATGATTGCAGCGGCGCAGCACTTGAAGGCGGCTTCCACGGCTCCGATGGCGGTCACTTCGGTGGGATCTCTGCTCAGAGGGGCGGCTCTCCGCAGTTCCTCGAACAGCTGCCGGTGGTACACGGCGGCCTCGGCTTCTCTGGCAATGGCGTGCTGCATCTTCACGGCCTCCACGGGGAAGTTGCCCTTGGCTGTCTCGCCGGACAGCATGATGCAGTCAGCGCCATCCAGCACGGCGTTGGCCACGTCGCTTGTCTCGGCTCTGGTGGGTCTGGGCTTGGTGATCATGCTTTCCAGCATCTGGGTGGCGCACACCACAGGTTTGCCGGCCAGGTTGCACCGTCCGATCATCATTTTCTGGGCCAGGAACACCTTCTCGGCGGGGATCTCGATGCCCAGGTCGCCTCTGGCCACCATGATGCCGTCGGACACTTCCAGGATCTCGTCGAACCGCTTCACGCCCTCGTGGTTCTCGATCTTGCTGATGATCTTGATGCCGTGGCCTTCAGGGCCCAGAGCGGCTCTCACGGCGGCCACATCAGAGGCCTTCCGCACGAAGCTGGCGAACACGATGTCCACGCCGTGCTCCACGCCAAATCTCAGGTCTCTCACGTCCTGCTCAGACAGGCCAGGCAGGTCCACCTGGGCGCCTGGCAGATTCACGCCCTTTCTGCTGCCCAGCACGCCGCCATTCTCGACCTGGGTCACCAGGCCCTCAGGTCCGATCTTCTGCACCACCAGGCTGATCAGGCCGTCGTCGATGTAGATTCTGCCGCCCACAGGCACCACCCGCACGATGTTGGGGTAGTCCACCCACACTGTGTTGGCGTTGCCTCTGGTTCTGAAGGCGGGGTCCACGGTCACCAGCACTTGGCTGCCCTTCACCAGCTCCACCTCGCTCTCAGGCCCTCCCTGCAGAATTCCTGTTCTGATCTCGGGGCCCTTGGTGTCCAGGGCAATGGCCACGGGTCTGTAGCTCAGGGGGCTGCCGGCAAAGCTCTCCACGGCCTCCCGGACGTTGGCAATGCTCTCTGCGTGGTACTCGTGGCTGCCGTGGGAGAAGTTCAGCCGGGCGATATTCATGCCGGCCTTGATCATCTCTTTCAGCCGCTCCACGCTTCTGCTGGCAGGGCCGATGGTGGCAATGATGCTGGTGCTTCTGGCGGCCACGGGCTCAGAGTCGATGTCCAGCAGGCACAGGTGTTCCAGAAAGGTGTCGGCCATGGCGGCTGGCAGCTGCTGCTGCTGGAAAAAGGCGGTGCCCAGTTCCTGGGTCAGCTGGGCCACGCTAGCCCTTCTCAGGTATCCGGCTGGTCCGCCAGGGGCTCCGATCAGGATGCTCTTGGCCAGGTCTCTCTGGCTCTTGGACACCCAGGACCGCAGCTGCAGAGAGCTGATATTTTCCTGGATGCTCATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCATGGAAGAGAGGGAGAGGATGACAAAACTGCTGGTCTTATCTAAGGGAGACAGAGAAGAGAAAAGGGGCACACCCAGTAGGCCACCCTGTCCCCACAGAATCCCTCCCCCAGAACGGCCTGCTCTCTGCCCTCATCTCCTGGCATTTCCTCTCATCCTTTTTTCCTGATAAATTTTCAATCCATTCATACTATCTGGTCATCCACGTGAATAGATATTTTTTTTTTGGCCAGTCATATGGCCCCATTTTCTTTGTACTTTACTGAAGTTAGCTCTAGTGAATCCAGGGAGCAGGGGCTGTAGGGTGGGGCTGGAGCCTGAAGAAAGACAAAAGGGATCACTGTGATAATATGGTGGGGGGAGGGTTACCCAGTTCTGACCACTTTTTTTCTCTGTCTCAACCAAGAAATGCAGAGTGCCTTCACCACTCTG

【0103】

１１．ＡＡＶ骨格（配列番号２３）：
ＡＡＶ２ ＩＴＲ（内部末端リピート（Internal Terminal Repeats））含有ｐＡＡＶ－ＭＣＳプラスミド（Agilent Technologies）由来のＩＴＲを有するトランスファープラスミドを使用した。逆方向のＬＨＡ－５’ＵＴＲ－ｃｏＲＰＫ－ＦＬＡＧ－ｂＧＨポリ（Ａ）－ＲＨＡ（配列番号２０）を、ＮｏｔＩ制限部位クローニングを通じて、ＡＡＶ骨格にクローン導入した。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

【0104】

１２．前臨床試験に使用するｃｏＲＰＫ ＡＡＶ（配列番号２４）：
ＡＡＶ骨格（配列番号２３）に挿入されたｃｏＲＰＫ治療ドナー（配列番号１９）を含む配列。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCCAGAGTGGTGAAGGCACTCTGCATTTCTTGGTTGAGACAGAGAAAAAAAGTGGTCAGAACTGGGTAACCCTCCCCCCACCATATTATCACAGTGATCCCTTTTGTCTTTCTTCAGGCTCCAGCCCCACCCTACAGCCCCTGCTCCCTGGATTCACTAGAGCTAACTTCAGTAAAGTACAAAGAAAATGGGGCCATATGACTGGCCAAAAAAAAAATATCTATTCACGTGGATGACCAGATAGTATGAATGGATTGAAAATTTATCAGGAAAAAAGGATGAGAGGAAATGCCAGGAGATGAGGGCAGAGAGCAGGCCGTTCTGGGGGAGGGATTCTGTGGGGACAGGGTGGCCTACTGGGTGTGCCCCTTTTCTCTTCTCTGTCTCCCTTAGATAAGACCAGCAGTTTTGTCATCCTCTCCCTCTCTTCCATGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCGACTACAAAGACGATGACGATAAATGAACGCGTGAGTTACAAATAAAGCACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGTCGATCCAGGAGAACATATCATCCCTGCAGCTTCGGTCATGGGTCTCTAAGTCCCAAAGAGACTTAGCAAAGTCCATCCTGATTGGGGCTCCAGGAGGTAAGAAGGGGAGACAGAAGCCATGGAACATAGGAGGAAAATGAGGGTGAAAACTAGGAGCCAGGGTGGAGGGCATAAATGATCCACATCAGCCACTGGCTAGGTGGGTTTTGGAGAGGAACGTACGTTCTTCAGAGCCTCCCGTGTGTTAAATTATGGACCCTGGCCTGGGTCTTTTCCAGGCCCTATAGGCAGGCCAGAGCCACAGCATGTAAGCCACGGGGCACTCCCGTGGTTCCTGGACTCTGGCCCCTGGCATACAGGGCTTCCAATGGAACAGGAGACAGTGGTGACAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAACGATCGGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

【0105】

１３．前臨床試験に使用するｃｏＲＰＫ ＡＡＶ（配列番号２５）：
ＡＡＶ骨格（配列番号２３）に挿入されたｃｏＲＰＫ治療ドナー（配列番号２０）を含む配列。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCCAGAGTGGTGAAGGCACTCTGCATTTCTTGGTTGAGACAGAGAAAAAAAGTGGTCAGAACTGGGTAACCCTCCCCCCACCATATTATCACAGTGATCCCTTTTGTCTTTCTTCAGGCTCCAGCCCCACCCTACAGCCCCTGCTCCCTGGATTCACTAGAGCTAACTTCAGTAAAGTACAAAGAAAATGGGGCCATATGACTGGCCAAAAAAAAAATATCTATTCACGTGGATGACCAGATAGTATGAATGGATTGAAAATTTATCAGGAAAAAAGGATGAGAGGAAATGCCAGGAGATGAGGGCAGAGAGCAGGCCGTTCTGGGGGAGGGATTCTGTGGGGACAGGGTGGCCTACTGGGTGTGCCCCTTTTCTCTTCTCTGTCTCCCTTAGATAAGACCAGCAGTTTTGTCATCCTCTCCCTCTCTTCCATGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGAGCATCCAGGAAAATATCAGCTCTCTGCAGCTGCGGTCCTGGGTGTCCAAGAGCCAGAGAGACCTGGCCAAGAGCATCCTGATCGGAGCCCCTGGCGGACCAGCCGGATACCTGAGAAGGGCTAGCGTGGCCCAGCTGACCCAGGAACTGGGCACCGCCTTTTTCCAGCAGCAGCAGCTGCCAGCCGCCATGGCCGACACCTTTCTGGAACACCTGTGCCTGCTGGACATCGACTCTGAGCCCGTGGCCGCCAGAAGCACCAGCATCATTGCCACCATCGGCCCTGCCAGCAGAAGCGTGGAGCGGCTGAAAGAGATGATCAAGGCCGGCATGAATATCGCCCGGCTGAACTTCTCCCACGGCAGCCACGAGTACCACGCAGAGAGCATTGCCAACGTCCGGGAGGCCGTGGAGAGCTTTGCCGGCAGCCCCCTGAGCTACAGACCCGTGGCCATTGCCCTGGACACCAAGGGCCCCGAGATCAGAACAGGAATTCTGCAGGGAGGGCCTGAGAGCGAGGTGGAGCTGGTGAAGGGCAGCCAAGTGCTGGTGACCGTGGACCCCGCCTTCAGAACCAGAGGCAACGCCAACACAGTGTGGGTGGACTACCCCAACATCGTGCGGGTGGTGCCTGTGGGCGGCAGAATCTACATCGACGACGGCCTGATCAGCCTGGTGGTGCAGAAGATCGGACCTGAGGGCCTGGTGACCCAGGTCGAGAATGGCGGCGTGCTGGGCAGCAGAAAGGGCGTGAATCTGCCAGGCGCCCAGGTGGACCTGCCTGGCCTGTCTGAGCAGGACGTGAGAGACCTGAGATTTGGCGTGGAGCACGGCGTGGACATCGTGTTCGCCAGCTTCGTGCGGAAGGCCTCTGATGTGGCCGCCGTGAGAGCCGCTCTGGGCCCTGAAGGCCACGGCATCAAGATCATCAGCAAGATCGAGAACCACGAGGGCGTGAAGCGGTTCGACGAGATCCTGGAAGTGTCCGACGGCATCATGGTGGCCAGAGGCGACCTGGGCATCGAGATCCCCGCCGAGAAGGTGTTCCTGGCCCAGAAAATGATGATCGGACGGTGCAACCTGGCCGGCAAACCTGTGGTGTGCGCCACCCAGATGCTGGAAAGCATGATCACCAAGCCCAGACCCACCAGAGCCGAGACAAGCGACGTGGCCAACGCCGTGCTGGATGGCGCTGACTGCATCATGCTGTCCGGCGAGACAGCCAAGGGCAACTTCCCCGTGGAGGCCGTGAAGATGCAGCACGCCATTGCCAGAGAAGCCGAGGCCGCCGTGTACCACCGGCAGCTGTTCGAGGAACTGCGGAGAGCCGCCCCTCTGAGCAGAGATCCCACCGAAGTGACCGCCATCGGAGCCGTGGAAGCCGCCTTCAAGTGCTGCGCCGCTGCAATCATCGTGCTGACCACCACAGGCAGAAGCGCCCAGCTGCTGTCCAGATACAGACCCAGAGCCGCCGTGATCGCCGTGACAAGATCCGCCCAGGCCGCTAGACAGGTCCACCTGTGCAGAGGCGTGTTCCCCCTGCTGTACCGGGAGCCTCCCGAGGCCATCTGGGCCGACGACGTGGACAGACGGGTGCAGTTCGGCATCGAGAGCGGCAAGCTGCGGGGCTTCCTGAGAGTGGGCGACCTGGTGATCGTGGTGACAGGCTGGCGGCCTGGCAGCGGCTACACCAACATCATGAGGGTGCTGTCCATCAGCTGAACGCGTGAGTTACAAATAAAGCACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCCCGCAGCCCCAGGCCCACACTGAAAGCATGTCGATCCAGGAGAACATATCATCCCTGCAGCTTCGGTCATGGGTCTCTAAGTCCCAAAGAGACTTAGCAAAGTCCATCCTGATTGGGGCTCCAGGAGGTAAGAAGGGGAGACAGAAGCCATGGAACATAGGAGGAAAATGAGGGTGAAAACTAGGAGCCAGGGTGGAGGGCATAAATGATCCACATCAGCCACTGGCTAGGTGGGTTTTGGAGAGGAACGTACGTTCTTCAGAGCCTCCCGTGTGTTAAATTATGGACCCTGGCCTGGGTCTTTTCCAGGCCCTATAGGCAGGCCAGAGCCACAGCATGTAAGCCACGGGGCACTCCCGTGGTTCCTGGACTCTGGCCCCTGGCATACAGGGCTTCCAATGGAACAGGAGACAGTGGTGACAGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAACGATCGGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

【0106】

１４．前臨床試験に使用するｃｏＲＰＫ ＡＡＶ（配列番号２６）：
ＡＡＶ骨格（配列番号２３）に挿入されたｃｏＲＰＫ治療ドナー（配列番号２１）を含む配列。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTGTCACCACTGTCTCCTGTTCCATTGGAAGCCCTGTATGCCAGGGGCCAGAGTCCAGGAACCACGGGAGTGCCCCGTGGCTTACATGCTGTGGCTCTGGCCTGCCTATAGGGCCTGGAAAAGACCCAGGCCAGGGTCCATAATTTAACACACGGGAGGCTCTGAAGAACGTACGTTCCTCTCCAAAACCCACCTAGCCAGTGGCTGATGTGGATCATTTATGCCCTCCACCCTGGCTCCTAGTTTTCACCCTCATTTTCCTCCTATGTTCCATGGCTTCTGTCTCCCCTTCTTACCTCCTGGAGCCCCAATCAGGATGGACTTTGCTAAGTCTCTTTGGGACTTAGAGACCCATGACCGAAGCTGCAGGGATGATATGTTCTCCTGGATCGACATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTGCTTTATTTGTAACTCACGCGTTCATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCGCTGATGGACAGCACCCTCATGATGTTGGTGTAGCCGCTGCCAGGCCGCCAGCCTGTCACCACGATCACCAGGTCGCCCACTCTCAGGAAGCCCCGCAGCTTGCCGCTCTCGATGCCGAACTGCACCCGTCTGTCCACGTCGTCGGCCCAGATGGCCTCGGGAGGCTCCCGGTACAGCAGGGGGAACACGCCTCTGCACAGGTGGACCTGTCTAGCGGCCTGGGCGGATCTTGTCACGGCGATCACGGCGGCTCTGGGTCTGTATCTGGACAGCAGCTGGGCGCTTCTGCCTGTGGTGGTCAGCACGATGATTGCAGCGGCGCAGCACTTGAAGGCGGCTTCCACGGCTCCGATGGCGGTCACTTCGGTGGGATCTCTGCTCAGAGGGGCGGCTCTCCGCAGTTCCTCGAACAGCTGCCGGTGGTACACGGCGGCCTCGGCTTCTCTGGCAATGGCGTGCTGCATCTTCACGGCCTCCACGGGGAAGTTGCCCTTGGCTGTCTCGCCGGACAGCATGATGCAGTCAGCGCCATCCAGCACGGCGTTGGCCACGTCGCTTGTCTCGGCTCTGGTGGGTCTGGGCTTGGTGATCATGCTTTCCAGCATCTGGGTGGCGCACACCACAGGTTTGCCGGCCAGGTTGCACCGTCCGATCATCATTTTCTGGGCCAGGAACACCTTCTCGGCGGGGATCTCGATGCCCAGGTCGCCTCTGGCCACCATGATGCCGTCGGACACTTCCAGGATCTCGTCGAACCGCTTCACGCCCTCGTGGTTCTCGATCTTGCTGATGATCTTGATGCCGTGGCCTTCAGGGCCCAGAGCGGCTCTCACGGCGGCCACATCAGAGGCCTTCCGCACGAAGCTGGCGAACACGATGTCCACGCCGTGCTCCACGCCAAATCTCAGGTCTCTCACGTCCTGCTCAGACAGGCCAGGCAGGTCCACCTGGGCGCCTGGCAGATTCACGCCCTTTCTGCTGCCCAGCACGCCGCCATTCTCGACCTGGGTCACCAGGCCCTCAGGTCCGATCTTCTGCACCACCAGGCTGATCAGGCCGTCGTCGATGTAGATTCTGCCGCCCACAGGCACCACCCGCACGATGTTGGGGTAGTCCACCCACACTGTGTTGGCGTTGCCTCTGGTTCTGAAGGCGGGGTCCACGGTCACCAGCACTTGGCTGCCCTTCACCAGCTCCACCTCGCTCTCAGGCCCTCCCTGCAGAATTCCTGTTCTGATCTCGGGGCCCTTGGTGTCCAGGGCAATGGCCACGGGTCTGTAGCTCAGGGGGCTGCCGGCAAAGCTCTCCACGGCCTCCCGGACGTTGGCAATGCTCTCTGCGTGGTACTCGTGGCTGCCGTGGGAGAAGTTCAGCCGGGCGATATTCATGCCGGCCTTGATCATCTCTTTCAGCCGCTCCACGCTTCTGCTGGCAGGGCCGATGGTGGCAATGATGCTGGTGCTTCTGGCGGCCACGGGCTCAGAGTCGATGTCCAGCAGGCACAGGTGTTCCAGAAAGGTGTCGGCCATGGCGGCTGGCAGCTGCTGCTGCTGGAAAAAGGCGGTGCCCAGTTCCTGGGTCAGCTGGGCCACGCTAGCCCTTCTCAGGTATCCGGCTGGTCCGCCAGGGGCTCCGATCAGGATGCTCTTGGCCAGGTCTCTCTGGCTCTTGGACACCCAGGACCGCAGCTGCAGAGAGCTGATATTTTCCTGGATGCTCATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCATGGAAGAGAGGGAGAGGATGACAAAACTGCTGGTCTTATCTAAGGGAGACAGAGAAGAGAAAAGGGGCACACCCAGTAGGCCACCCTGTCCCCACAGAATCCCTCCCCCAGAACGGCCTGCTCTCTGCCCTCATCTCCTGGCATTTCCTCTCATCCTTTTTTCCTGATAAATTTTCAATCCATTCATACTATCTGGTCATCCACGTGAATAGATATTTTTTTTTTGGCCAGTCATATGGCCCCATTTTCTTTGTACTTTACTGAAGTTAGCTCTAGTGAATCCAGGGAGCAGGGGCTGTAGGGTGGGGCTGGAGCCTGAAGAAAGACAAAAGGGATCACTGTGATAATATGGTGGGGGGAGGGTTACCCAGTTCTGACCACTTTTTTTCTCTGTCTCAACCAAGAAATGCAGAGTGCCTTCACCACTCTGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAACGATCGGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

【0107】

１５．臨床使用のためのｃｏＲＰＫ ＡＡＶ（配列番号２７）：
ＡＡＶ骨格（配列番号２３）に挿入されたｃｏＲＰＫ治療ドナー（配列番号２２）を含む配列。
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTGCGGCCGCTGTCACCACTGTCTCCTGTTCCATTGGAAGCCCTGTATGCCAGGGGCCAGAGTCCAGGAACCACGGGAGTGCCCCGTGGCTTACATGCTGTGGCTCTGGCCTGCCTATAGGGCCTGGAAAAGACCCAGGCCAGGGTCCATAATTTAACACACGGGAGGCTCTGAAGAACGTACGTTCCTCTCCAAAACCCACCTAGCCAGTGGCTGATGTGGATCATTTATGCCCTCCACCCTGGCTCCTAGTTTTCACCCTCATTTTCCTCCTATGTTCCATGGCTTCTGTCTCCCCTTCTTACCTCCTGGAGCCCCAATCAGGATGGACTTTGCTAAGTCTCTTTGGGACTTAGAGACCCATGACCGAAGCTGCAGGGATGATATGTTCTCCTGGATCGACATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCCTGCTATTGTCTTCCCAATCCTCCCCCTTGCTGTCCTGCCCCACCCCACCCCCCAGAATAGAATGACACCTACTCAGACAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGGCACCTTCCAGGGTCAAGGAAGGCACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTGCTTTATTTGTAACTCACGCGTTCAGCTGATGGACAGCACCCTCATGATGTTGGTGTAGCCGCTGCCAGGCCGCCAGCCTGTCACCACGATCACCAGGTCGCCCACTCTCAGGAAGCCCCGCAGCTTGCCGCTCTCGATGCCGAACTGCACCCGTCTGTCCACGTCGTCGGCCCAGATGGCCTCGGGAGGCTCCCGGTACAGCAGGGGGAACACGCCTCTGCACAGGTGGACCTGTCTAGCGGCCTGGGCGGATCTTGTCACGGCGATCACGGCGGCTCTGGGTCTGTATCTGGACAGCAGCTGGGCGCTTCTGCCTGTGGTGGTCAGCACGATGATTGCAGCGGCGCAGCACTTGAAGGCGGCTTCCACGGCTCCGATGGCGGTCACTTCGGTGGGATCTCTGCTCAGAGGGGCGGCTCTCCGCAGTTCCTCGAACAGCTGCCGGTGGTACACGGCGGCCTCGGCTTCTCTGGCAATGGCGTGCTGCATCTTCACGGCCTCCACGGGGAAGTTGCCCTTGGCTGTCTCGCCGGACAGCATGATGCAGTCAGCGCCATCCAGCACGGCGTTGGCCACGTCGCTTGTCTCGGCTCTGGTGGGTCTGGGCTTGGTGATCATGCTTTCCAGCATCTGGGTGGCGCACACCACAGGTTTGCCGGCCAGGTTGCACCGTCCGATCATCATTTTCTGGGCCAGGAACACCTTCTCGGCGGGGATCTCGATGCCCAGGTCGCCTCTGGCCACCATGATGCCGTCGGACACTTCCAGGATCTCGTCGAACCGCTTCACGCCCTCGTGGTTCTCGATCTTGCTGATGATCTTGATGCCGTGGCCTTCAGGGCCCAGAGCGGCTCTCACGGCGGCCACATCAGAGGCCTTCCGCACGAAGCTGGCGAACACGATGTCCACGCCGTGCTCCACGCCAAATCTCAGGTCTCTCACGTCCTGCTCAGACAGGCCAGGCAGGTCCACCTGGGCGCCTGGCAGATTCACGCCCTTTCTGCTGCCCAGCACGCCGCCATTCTCGACCTGGGTCACCAGGCCCTCAGGTCCGATCTTCTGCACCACCAGGCTGATCAGGCCGTCGTCGATGTAGATTCTGCCGCCCACAGGCACCACCCGCACGATGTTGGGGTAGTCCACCCACACTGTGTTGGCGTTGCCTCTGGTTCTGAAGGCGGGGTCCACGGTCACCAGCACTTGGCTGCCCTTCACCAGCTCCACCTCGCTCTCAGGCCCTCCCTGCAGAATTCCTGTTCTGATCTCGGGGCCCTTGGTGTCCAGGGCAATGGCCACGGGTCTGTAGCTCAGGGGGCTGCCGGCAAAGCTCTCCACGGCCTCCCGGACGTTGGCAATGCTCTCTGCGTGGTACTCGTGGCTGCCGTGGGAGAAGTTCAGCCGGGCGATATTCATGCCGGCCTTGATCATCTCTTTCAGCCGCTCCACGCTTCTGCTGGCAGGGCCGATGGTGGCAATGATGCTGGTGCTTCTGGCGGCCACGGGCTCAGAGTCGATGTCCAGCAGGCACAGGTGTTCCAGAAAGGTGTCGGCCATGGCGGCTGGCAGCTGCTGCTGCTGGAAAAAGGCGGTGCCCAGTTCCTGGGTCAGCTGGGCCACGCTAGCCCTTCTCAGGTATCCGGCTGGTCCGCCAGGGGCTCCGATCAGGATGCTCTTGGCCAGGTCTCTCTGGCTCTTGGACACCCAGGACCGCAGCTGCAGAGAGCTGATATTTTCCTGGATGCTCATGCTTTCAGTGTGGGCCTGGGGCTGCGGGACCATGGAAGAGAGGGAGAGGATGACAAAACTGCTGGTCTTATCTAAGGGAGACAGAGAAGAGAAAAGGGGCACACCCAGTAGGCCACCCTGTCCCCACAGAATCCCTCCCCCAGAACGGCCTGCTCTCTGCCCTCATCTCCTGGCATTTCCTCTCATCCTTTTTTCCTGATAAATTTTCAATCCATTCATACTATCTGGTCATCCACGTGAATAGATATTTTTTTTTTGGCCAGTCATATGGCCCCATTTTCTTTGTACTTTACTGAAGTTAGCTCTAGTGAATCCAGGGAGCAGGGGCTGTAGGGTGGGGCTGGAGCCTGAAGAAAGACAAAAGGGATCACTGTGATAATATGGTGGGGGGAGGGTTACCCAGTTCTGACCACTTTTTTTCTCTGTCTCAACCAAGAAATGCAGAGTGCCTTCACCACTCTGGCGGCCGCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGGGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTTGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGGCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAACGATCGGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA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【0108】

実施例３．ＰＫＤ－ＨＳＰＣにおけるＰＫＬＲ補正
発明者らの遺伝子編集システムの治療可能性を評価する目的で、ＰＫＬＲ遺伝子に変異を有するＰＫＤ患者４人に由来するヒトＨＳＰＣ及びＨＤ－ＣＤ３４^＋細胞を、４８時間、予備刺激した。次いで、細胞に、ｒＡＡＶで核形質移入及び形質導入した。遺伝子編集手順から２４時間後、細胞を収集し、赤血球分化培地に移した。全ての実験の間、赤血球分化プロセスを、ＦＡＣＳにより評価したところ、健康試料と遺伝子編集したドナー試料の間で成熟プロファイルに差は観察されなかった。１４日目、細胞を収集し、ゲノム分析及び機能分析を行った。最初に、１人の患者由来の試料において（ＰＫＤ２）、ベクター挿入を、３’ジャンクション及び５’ジャンクションの特異的ＰＣＲにより評価した。図１５Ｃで観察されるとおり、患者の試料に特異的バンドを検出することができた。そのうえさらに、赤血球のＡＴＰの定量に基づく機能分析を行った。未編集ＰＫＤ細胞又はＧＦＰ－ＡＡＶを用いて編集したＰＫＤ細胞は、低レベルでＡＴＰを産生した。しかしながら、ＲＮＰ及びｃｏＲＰＫ－ＡＡＶで遺伝子編集を受けたＰＫＤ－ＨＳＰＣから生じた赤血球は、ＡＴＰレベルをＨＤ細胞近くまで回復させることができた（図１５Ｄ）。まとめると、本発明者らのデータは、ＰＫＬＲ遺伝子での遺伝子編集が、患者の赤血球のｉｎ ｖｉｔｒｏ機能を回復させることが可能であることを示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

2023531718000001.app

【国際調査報告】