(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-25
(54)【発明の名称】フレグランス放出メカニズム、方法、およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 8/64 20060101AFI20230718BHJP
A61Q 13/00 20060101ALI20230718BHJP
A61K 8/33 20060101ALI20230718BHJP
A61K 8/34 20060101ALI20230718BHJP
A61K 8/20 20060101ALI20230718BHJP
A61K 8/24 20060101ALI20230718BHJP
A61K 8/23 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 15/00 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 1/06 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 1/02 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 1/10 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 5/06 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 5/02 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 5/00 20060101ALI20230718BHJP
A61Q 5/12 20060101ALI20230718BHJP
C11B 9/00 20060101ALI20230718BHJP
C07K 14/46 20060101ALN20230718BHJP
【ＦＩ】
A61K8/64
A61Q13/00 102
A61K8/33
A61K8/34
A61K8/20
A61K8/24
A61K8/23
A61Q15/00
A61Q1/06
A61Q1/02
A61Q1/10
A61Q5/06
A61Q5/02
A61Q5/00
A61Q5/12
C11B9/00 Z
C07K14/46 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022581472
(86)(22)【出願日】2021-07-05
(85)【翻訳文提出日】2023-02-17
(86)【国際出願番号】 IB2021056011
(87)【国際公開番号】W WO2022003655
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】116561
(32)【優先日】2020-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】PT
(31)【優先権主張番号】20206292.3
(32)【優先日】2020-11-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516116507
【氏名又は名称】ユニベルズィダード ドゥ ミンホ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤＥ ＤＯ ＭＩＮＨＯ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100181847
【弁理士】
【氏名又は名称】大島 かおり
(72)【発明者】
【氏名】アルトゥール マヌエル カヴァコ パウロ
(72)【発明者】
【氏名】フィリパ ダニエラ ゴメス ゴンサウヴェス
(72)【発明者】
【氏名】アルトゥール ジョルジ アラウジョ マガリャエス リベイロ
(72)【発明者】
【氏名】カルラ マヌエラ ペレイラ マリーニョ ダ シウヴァ
【テーマコード（参考）】
4C083
4H045
4H059
【Ｆターム（参考）】
4C083AB281
4C083AB331
4C083AB351
4C083AC051
4C083AC052
4C083AC111
4C083AC121
4C083AC131
4C083AC271
4C083AC301
4C083AD041
4C083AD201
4C083AD221
4C083AD241
4C083AD391
4C083AD411
4C083CC03
4C083CC04
4C083CC05
4C083CC12
4C083CC13
4C083CC14
4C083CC17
4C083CC32
4C083CC33
4C083CC36
4C083CC38
4C083DD08
4C083DD17
4C083KK03
4H045AA10
4H045BA51
4H045CA40
4H045EA15
4H045EA60
4H059BC10
4H059BC23
4H059DA09
4H059EA32
4H059EA35
(57)【要約】
本開示は、電解質溶液の存在下で活性剤が放出される、タンパク質および活性剤を含む放出組成物に関する。本主題の放出組成物を含むキットおよび物品もまた包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、またはそれらの混合物、のリストから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する０．０１～５０００μＭの単離または人工のタンパク質と、脱臭剤、天然エッセンス、フレグランス、保湿剤、またはそれらの混合物を含むリストから選択される、０．１μＭ～２Ｍの活性剤と、
を含むフレグランス放出組成物であって、
前記活性剤は、前記タンパク質に結合および／または捕捉され、
前記タンパク質は、１０～７０℃の温度で、電解質溶液の存在下で活性剤を放出するように構成され、
前記活性剤が２０～１０００g／molの分子量を有し、
前記電解質溶液は、汗、塩水、またはミセル水である、組成物。
【請求項2】
前記タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、またはそれらの混合物、のリストから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記タンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、またはそれらの混合物、のリストから選択されるアミノ酸配列と同一である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
０．２μＭ～１Ｍの活性剤を含む、請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
水または緩衝液中の前記活性剤に対する前記タンパク質の親和性定数が１～４．５μＭの範囲である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物。
【請求項6】
前記電解質溶液中の前記活性剤に対する前記タンパク質の親和性定数が０．１～０．９９μＭの範囲である、請求項１～５のいずれかに記載の組成物。
【請求項7】
前記活性剤が７５～３００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、請求項１～６のいずれかに記載の組成物。
【請求項8】
前記活性剤がフレグランス分子である、請求項１～７のいずれかに記載の組成物。
【請求項9】
前記活性剤が芳香族、アルデヒドまたはアルコールから選択される官能基を含む、請求項１～８のいずれかに記載の組成物。
【請求項10】
前記活性剤が、２－アセチル－１－ピロリン、α－テルピネオール、β－オシメン、酢酸ベンジル、酢酸ブチル、カンファー、カルボン、シトラール、シトロネロール、クマリン、ジアセチル、オイゲノール、フルクトン、ガンマデカラクトン、ガンマノナラクトン、ゲラニオール、ヘジオン、イソアミルアセテート、リラックアルデヒド、リモネン、リナロオール、メフロゾール、メントール、メチルブチレート、ミルセン、ピネン、ポマロース、パレゴン、サンダロレ、バニリン、またはそれらの混合物、を含むリストから選択される、フレグランス分子である、請求項１～９のいずれかに記載の組成物。
【請求項11】
前記活性剤の放出が３０秒～２４時間の間生じる、請求項１～１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項12】
前記電解質溶液のｐＨが４．０～８．５である、請求項１～１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項13】
前記汗がヒトの汗またはペットの汗である、請求項１～１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項14】
前記タンパク質が、極性および無極性溶媒、好ましくはエタノール、メタノール、ブタノール、ベンゼン、およびウンデカノール中で安定である、請求項１～１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項15】
前記タンパク質が１８～７０℃の間の温度で安定である、請求項１～１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項16】
前記タンパク質が４．０～１０．０のｐＨ範囲で安定である、請求項１～１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項17】
前記タンパク質からの活性剤の放出が２０～４０℃で起こる、請求項１～１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項18】
グリセリン、エリスリトール、アラビトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マンニトール、グルコシルグリセリン、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース、イソフルオロシド、デキストラン、レバン、ポリエチレングリコール、塩化物の塩、クエン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、もしくはリン酸塩、またはそれらの混合物をさらに含む、請求項１～１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項19】
化粧料／組成物としての請求項１～１８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項20】
消臭剤／組成物としての請求項１～１８のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項21】
請求項１～１８のいずれかに記載の組成物を含む、キットまたは物品。
【請求項22】
前記物品が、生地、織物、繊維、服、スカーフ、帽子、手袋、ソックスおよびターバン、靴、インソール、バッグ、ハンドバッグ、洗浄剤、クリーム、ローション、フォーム、パフューム、軟化剤、エアロゾル、デオドラント、リップスティック、リップクリーム、フェイスマスクパウダー、フェイスおよびボディクリーム、スキンクラリファイア、プライマー、ファンデーション、アイラッシュマスカラ、ヘアシャンプー、ヘア美容液、ヘアマスク、ヘアコンディショナー、またはヘアカラークリーム、を含むリストから選択される、請求項２１に記載のキットまたは物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、フレグランス（香料）分子と、ヒトの汗と温度によって同時に調節される匂い物質結合タンパク質（OBP－I）を含む吸着と解離のメカニズムに関する。このシステムは、体温での発汗の存在によりフレグランスが放出される化粧品配合物に使用することができる。
【背景技術】
【0002】
匂い物質結合タンパク質（匂い物質結合タンパク質）（OBP）は、リポカリンスーパーファミリーに属する小水溶性タンパク質である。1-2それらは、匂い物質とよばれる疎水性の匂い分子を、杯（calyx）のような形をした空洞の中で、嗅覚受容器へ向かう水性粘液関門を横切って輸送する働きをし、ここでは、伝達信号のカスケードが脳の解釈の中で伝達される。3-4また、これらのタンパク質は、刺激後に嗅覚受容体から匂い物質を除去することに関与しているとされている。5-6
【0003】
いくつかの哺乳動物の匂い物質結合タンパク質が同定されており、それらのいくつかは、ウシ、ブタ、イノシシ、パンダ、マウス、ラットおよびヒトのような鼻粘液から単離されている。7-13
【0004】
哺乳動物OBPのDNA配列は低い類似性を示す：ブタOBP（OBP-I）およびヒトOBP（hOBPOB）はDNA配列類似性のわずか１３．９％しか示さず、OBP-Iおよび牛OBPは４２．７％存在する。4種々の哺乳動物種由来のOBP間の広い遺伝的多様性にもかかわらず、リポカリンメンバーは、保存された三次構造の場合としてそれらを識別することを可能にする特性サインをほとんど示さず、７つのループにより連結され、C末端に近い短いα‐ヘリックスと続く無秩序なC‐末端尾部に続く９番目のβ‐ストランドに連結された８つのβ‐ストランドにより構成されるβ‐バレル構造を示す。14-16 OBPの構造は非常に安定で、温度、有機溶媒、pH変化、またはタンパク質劣化による劣化に対して耐性がある。17-18
19ポーチンOBPのFT－IRスペクトルは、特にリガンドが存在する場合、熱変量（最大８０°C）に対して例外的に安定な構造を明らかにした。20さらに、脊椎動物のOBPは、変性後でもタンパク質のアンフォールディングを逆転させる能力を示す。20
【0005】
人体はストレス、不安、神経質、身体運動に伴う不快な臭いを引き起こす。21その発生を予防または減少させるために、抗菌剤および香料が化粧品製剤に通常添加される。しかしながら、異なる匂いに対する制限された効果とこれらのデオドラントの残存量に関連する欠点は、布と表皮で検出される。22
【0006】
OBPは、匂い感覚に関連するいくつかの分子に対して親和性を有する。これらの分子はすべて揮発性であり、OBPにより非常に低濃度で検出され、高感度なシステムである。OBPの迅速な応答時間とこれらのタンパク質の高い安定性は、食品または水中に存在する危険な物質および病原体、農薬および薬物の検出のためのバイオセンサとして、18,23また、防臭剤および医療診断としての潜在的使用のための優れた生物学的元素を作り出す。24-25
【0007】
匂い分子は、心地よい感情や不快な感情と関連している。OBPは匂いに関連するすべての分子に対して親和性をもつ。3-4香料（フレグランス）は、快適な感覚を持つ匂い分子を含む組成物である。
【0008】
匂いモデル分子としての１‐アミノアントラセン（１‐AMA）の使用は、蛍光アッセイによる匂い物質結合タンパク質の結合能を測定する能力を提供する。ブタOBP－Iに結合した遊離１－AMAおよび１－AMAは、２９５nmの励起波長で蛍光を測定して定量することができる。OBP－Iに結合した１‐AMAの最大波長は５３７nmから４８１nmにシフトした。20非蛍光匂い物質は、競合的アッセイまたはガスクロマトグラフィー－質量分析法によって測定することができる。
【0009】
OBPと匂いモデル分子、リポソームなどの脂質構造との相互作用については、以下の研究が既に報告されている。
【0010】
Filipa Goncalves et al (2018)「Two Engineered OBPs with opposite temperature-dependent affinities towards 1-aminoanthracene」は、ブタのOBP配列に基づく２つの組換えタンパク質に言及している（i）N末端の最初の１６残渣の欠失および結合ポケットにおける２つのフェニルアラニン残渣のアラニン残渣（F44AおよびF66A）による置換から得られた切断されたOBP（tOBP-F44A／F66A）、および（ii）OBP:GQ20：：SP－DS３は、OBP－Iとグリシン－グルタミン残渣およびアンカーペプチドSP－DS３の２０反復のスペーサーとの融合をもたらした。34実験および分子モデリングデータから、１－AMAモデルリガンドは２５℃でtOBP－F44A／F66Aに優先的に結合し、一方、リガンドは３７℃でOBP：GQ20：：SP－DS3に好ましく結合することが示された。34
【0011】
Filipa Gonvcalves et al (2018)「OBP fused with cell-penetrating peptides promotes liposomal transduction」は、ブタOBPと細胞貫通ペプチド（CPP、例えば、TAT、Pep－１およびpVEC）との融合を報告している。本研究は、リポソームへの１‐AMA伝達に関して異なる効率を明らかにした。30
【0012】
Filipa Goncalves et al (2018) 「1-Aminoanthracene Transduction into Liposomes Driven by Odorant-Binding Protein Proximity」は、スペーサー（GQ20）の存在下および非存在下でアンカーペプチドSP－DS３32と融合させたブタOBPに基づく２つの融合タンパク質の設計を開示している。本研究は、リポソームへの１－AMAの伝達が、リポソーム膜に固定されたタンパク質の近接によって駆動されることを実証した（スペーサーがないことの利点）。33
【0013】
Filipa Goncalves et al (2019) 「Release of Fragrances from Cotton Functionalized with Carbohydrate-Binding Module Proteins」は、スペーサー（GQ20）および糖質結合モジュール（CBM）と融合させたブタOBPに基づく融合タンパク質の設計を開示している。この研究は、タンパク質の１つの香り（β‐シトロネロール）に対する親和性と、汗の存在下での綿からのこの香りの放出を実証した。25いずれにせよ、発汗時の放出能はネイティブOBPに比べて劣る。
【0014】
Alessandro Capo et al (2018) 「The porcine odorant-binding protein as molecular probe for benzene detection」は、大気中のベンゼン検出のためのプローブとして、蛍光アッセイにより使用されるブタ匂い物質結合タンパク質を開示している。28
【0015】
Nunzio Cennamo et al (2015) 「Easy to Use Plastic Optical Fiber-Based Biosensor for Detection of Butanal」は、競合アッセイによるブタの匂い物質結合タンパク質によるブタナール（２０～１０００μM）検出を報告している。このアルデヒドは非常に毒性が強く、細胞毒性や癌のようなヒトの健康に対して高いリスクを示す。著者らは液体試料中のブタノールを検出する光学バイオセンサについて述べている。27
【0016】
Carla Silva et al (2014)「Odorant binding proteins: a biotechnological tool for odour control」は、煙の匂いをマスクするための綿織物からのフレグランス放出のためのブタ匂い剤結合タンパク質の適用を開示している。著者らは不織布上でのOBPの官能化を確認した。彼らは織物からの１つの香料の放出だけを試験した。Silvaらの研究に反して、本開示は、ヒトの発汗の応答としての、異なるフレグランスまたは他の分子の、より高い効率での放出機構を含む。さらに、本開示の主題は、織物および化粧品分野での使用に適している。
【0017】
Paolo Pelosi et al (2014) 「Structure and biotechnological applications of odorant-binding proteins」は、匂い分子の揮発性および徐放性を検出するためのセンサとしてOBPが使用される可能性を開示している。
【0018】
Lei Han et al (2014) 「Operating Mechanism and Molecular Dynamics of Pheromone-Binding Protein ASP1 as Influenced by pH」は、低pHでの匂い物質としてのフェロモン結合タンパク質ASP１およびpH変化に応答する解離を示す。著者らは、バイオテクノロジーと農業におけるこの研究の利点について述べている。結果は分子ドッキングと動力学シミュレーションにより決定した。
【0019】
Alberto Mazzini et al (2007) 「Dissociation and unfolding of bovine odorant binding protein at acidic pH」は、中性および酸性pHでのウシOBPの構造を分子シミュレーションにより開示している。
【0020】
Mariella Parisi et al (2003) “Unfolding and refolding of porcine odorant binding protein in guanidinium hydrochloride: equilibrium studies at neutral pH」は、タンパク質のフォールディング／アンフォールディングにおける既知のカオトロピック剤である塩酸グアニジニウムの変性作用を開示している。この基本的研究の目的は、OBPタンパク質の構造、特にそのアンフォールディングとリフォールディング過程を理解することであった。
【0021】
文献WO0123890A1は、気体状態での臨床サンプルまたは細胞抽出物のために使用される固体支持体内の感知素子に基づく検出器アレイを開示している。ウイルスペプチドを利用した免疫測定法である。
【0022】
文献EP0335654A3には、ラットからの匂い物質結合タンパク質の遺伝子単離方法およびタンパク質製造方法が開示されている。
【0023】
文献WO2001012806A3は、OBPIIを、個人の衛生、農産食品システム、栄養および治療用途に使用され得る匂い物質のような疎水性リガンドの固定剤として記載した。
【0024】
これらの事実は、本開示によって対処される技術的問題を説明するために開示される。
【発明の概要】
【0025】
本開示は、天然の匂い物質結合タンパク質（OBP－I）、特にブタOBP-I（配列番号１）、およびリンカーGQ ２０xおよびKPペプチド（OBP：：GQ20：：KP、配列番号２１）と融合したOBPの吸着および解離機構に関する。これらのタンパク質は、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基の高い含有量のために、約－２０（pH ７．４）の負の（マイナス）電荷を有する。これらのタンパク質の等電点は４．０８～４．６５である。26
【0026】
一実施形態では、ここに開示された解決策は、発汗問題に関連する人間の社会生活に大きな影響を与えることができる。このシステムには、生態系にダメージを与えることなく、バイオインスパイアされた化粧料生体成分（グリーンソリューション）の使用を含むいくつかの利点がある。
【0027】
本明細書のメカニズムは、匂い物質結合タンパク質、特にブタ匂い物質結合タンパク質（OBP－I）が、３７℃、５０mM Tris-HCl pH ７．５緩衝液中でフレグランスに対して高い親和性（吸着）を示すことを明らかにした。OBP－Iの親和性定数（Ka）は４．００±０．０３μMであった。他方、OBP－Iは、異なるpH（４．０～８．５の範囲、表２）でも、発汗（汗）の曝露時に、還元Ka（０．２０±０．０２μM）を有するその結合ポケットからのフレグランスの解離、すなわち逆機構を提示する。同様に、OBP：：GQ20：：KPは、３７℃（Ka = ４．００±０．０４μM）で、汗などの電解質溶液の存在下で還元される（Ka = ０．５９±０．０１μM）、緩衝液中のフレグランスに対して高い親和性を示す。このため、OBPは、発汗に接触すると親和性が低下し、この状態でフレグランスを放出する。
【0028】
驚くべきことに、OBP：：GQ20：：KP（配列番号２１）は、発汗の存在下で、緩衝液の存在下と比較して、６．８倍多くのフレグランス放出を示した。これらの値は、最新技術で報告された値、特にOBP：：GQ20：：CBM（配列番号２２）で報告された値よりも優れている。ここでは、放出機構は、汗がある場合に１.３x のフレグランスの放出を示している。２５
【0029】
ブタの匂い物質結合タンパク質の吸着と解離機構は反復的に行うことができる。
【0030】
ヒトの汗は、OBP－Iからフレグランスを放出／解離させる引き金として使用できる。したがって、本開示の主題は、スキンケア製品、および繊維製品、特に衣類に使用することができる。
【0031】
一実施形態では、本開示は、化粧料または織物用途のための製剤に組み込まれる哺乳動物匂い物質結合タンパク質に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質に関する。
【0032】
一実施形態では、匂い物質結合タンパク質の天然型は、ブタ、ヒト、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウシ、イノシシ、パンダ、チャイニーズハムスター、メイシャンブタ、モルモット、チベットブタ、ウマ、イルカおよびチンパンジーからのものであってよい。
【0033】
本開示の一態様において、本主題の適用は、体温での電解質溶液により誘発される、匂い物質結合タンパク質からの匂い分子の放出に基づくことができる。
【0034】
一実施形態では、電解質溶液とは、９.５グラム／Lより高いNaCl濃度を有する溶液、特に、９.５～４５グラム／Lの範囲のNaCl濃度を有する溶液をいう。好ましくは、電解質溶液は、ヒトの汗、ペットの汗、塩水またはミセル水である。
【0035】
一実施形態では、ヒトの汗は、水、乳酸、尿素、およびナトリウム、カリウム、カルシウム、およびマグネシウムなどのミネラルを含むことができる。
【0036】
一実施形態では、化粧品用途は、皮膚および毛髪ケア用であってもよい。スキンケア用途は、スキンクリーム、リップスティック、リップクリーム、フェイスマスク粉末、フェイスおよびボディクリーム、スキンクラリファイア、プライマー、ファンデーション用の特殊な配合に処方されたOBPに関連している可能性がある。
【0037】
さらなる実施形態では、ヘアケア用途は、アイラッシュマッカラス、ヘアシャンプー、ヘアセラム、ヘアマスク、ヘアコンディショナー、またはヘアカラークリーム中に処方されたOBPと関連させることができる。
【0038】
本開示は、以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、またはそれらの混合物、から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、または、同一性を有する単離または人工タンパク質と、消臭剤、天然エッセンス、香料、保湿剤、またはそれらの混合物を含むリストから選択される活性薬剤であって、活性薬剤が上記タンパク質に結合しており、タンパク質が電解質溶液の存在下で、１０～６０℃の温度で活性薬剤を放出する、活性薬剤と、を含む放出組成物に関する。
【0039】
一実施形態では、放出組成物は、以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１またはその混合物から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは９１％の同一性、９２％の同一性、９３％の同一性、９４％の同一性、９５％の同一性、９６％の同一性、９７％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性、または、同一性、を有する単離されたまたは人工の非修飾タンパク質を含む。
【0040】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知であり、そのような方法は、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTAを含む。GAPはNeedleman and Wunsch（(1970) J Mol Biol 48: 443-453）のアルゴリズムを使用して、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する２つの配列のグローバル（配列全体にわたる）アラインメントを見つける。BLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）は、配列同一性のパーセントを計算し、２つの配列間の類似性の統計解析を行う。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）を通じて公に入手可能である。また、MatGATソフトウェアパッケージ（Campanella et al., BMC Bioinformatics. 2003 Jul 10; 4:29. MatGAT: an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences（タンパク質またはDNA配列を用いて類似性／同一性行列を生成するアプリケーション））で利用可能な方法の１つを用いて、類似性および同一性のグローバルパーセンテージ（全体的な割合）を決定することもできる。当業者には明らかなように、保存されたモチーフ間のアラインメントを最適化するために、軽微な手動編集を行うことができる。パーセンテージとして現在の主題に示されている配列同一性値は、デフォルトパラメータを有するBLASTを用いて、アミノ酸配列全体にわたって決定された。
【0041】
一実施形態では、本主題の組成物は、０．０１～５０００μMの未修飾タンパク質を含む。
【0042】
一実施形態では、本主題の組成物は、０．０１～５０００μMのタンパク質を含む。
【0043】
別の実施形態では、放出組成物は、０.１μM～２Mの活性剤、好ましくは０.２μM～１Mを含む。
【0044】
一実施形態では、タンパク質は、水または緩衝液、好ましくはトリス－HCl、リン酸塩溶液、および／またはリン酸緩衝生理食塩水中で、活性剤に対して１～４.５μMの親和性一定を有する。さらなる実施形態において、活性剤に対するタンパク質の親和性定数は、電解質溶液中で、好ましくは汗中で０．１～０．９９μMの範囲である。
【0045】
本開示は、以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１またはその混合物、から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する、０.０１～５０００μMの単離または人工タンパク質と；脱臭剤、天然エッセンス、香料、保湿剤、またはそれらの混合物を含むリストから選択される０.１μMから２Mの活性剤と；を含む、フレグランス放出組成物に関し、ここで、活性剤は、タンパク質に結合および／または取り込まれており；タンパク質は、電解質溶液の存在下、１０～７０℃、好ましくは１０～６０℃の温度で活性剤を放出し；水中の活性剤に対するタンパク質の親和性定数は、１～４.５μMの範囲であり；活性剤は、分子量が２０～１０００g／molであり；電解質溶液は、汗、塩水、またはミセル水である。
【0046】
一実施形態では、活性剤は、２０～１０００g／mol、好ましくは７５～３００g／molの分子量を有する。さらなる実施形態において、活性剤はフレグランス分子である。さらに別の実施形態において、生物活性剤は、芳香族、アルデヒドまたはアルコールから選択される官能基を含む。さらに別の実施形態では、活性剤は、表１にリストされた分子を含むリストから選択されるフレグランス分子である。
【0047】
【表1】
【0048】
一実施形態では、活性剤の放出は３０秒～２４時間の間に生じる。
【0049】
一実施形態では、電解質溶液のpHは４．０～８．５である。さらなる実施形態において、電解質溶液は、汗、塩水またはミセル水、好ましくはヒトの汗またはペットの汗である。
【0050】
一実施形態では、未修飾タンパク質は、メタノール、ブタノール、ベンゼン、エタノールおよびウンデカノールを含む極性および無極性溶媒、ならびに、緩衝液、好ましくはTris‐HCl、リン酸塩、またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で安定である。さらなる実施形態において、未修飾タンパク質はまた、１８～７０℃、好ましくは１８～６０℃の間の温度、および４．０～１０．０のpH領域で安定である。
【0051】
一実施形態では、タンパク質は、メタノール、ブタノール、ベンゼンおよびウンデカノールならびに緩衝溶液（Tris‐HCl、リン酸塩、PBS）を含む極性および無極性溶媒中で安定である。さらなる実施形態において、タンパク質はまた、１８～７０℃、好ましくは１８～６０℃の間の温度、および４．０～１０．０のpH領域で安定である。
【0052】
一実施形態では、タンパク質からの活性剤の放出は、２０～４０℃で生じる。
【0053】
一実施形態では、組成物は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マンノシドマンニトール（mannisdomannitol）、グルコシルグリセリン、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース、イソフルオロシド、デキストラン、レバン、ポリエチレングリコール、塩化物の塩、クエン酸塩、硫酸塩、酢酸塩またはリン酸塩、またはそれらの混合物をさらに含む。
【0054】
本開示の一態様は、本主題に記載の組成物を含むキットまたは物品を含む。一実施形態では、前記組成物を含む物品は、織物、繊維、ファイバー、衣類、スカーフ、帽子、手袋、ソックスおよびターバン、靴、インソール、バッグ、ハンドバッグ、洗剤、クリーム、ローション、フォーム、パフューム、柔軟剤、エアロゾル、消臭剤、リップスティック、リップクリーム、フェイスマスクパウダー、フェイスおよびボディクリーム、スキンクラリファイア、プライマー、ファンデーション、ヘアシャンプー、ヘアセラム、ヘアマスク、ヘアコンディショナー、またはヘア着色クリームを含むリストから選択することができる。
【0055】
本開示はまた、化粧料における、好ましくは化粧料剤／組成物としての、より好ましくはスキンケアまたはヘアケアとしての、本主題に記載されるフレグランス放出組成物の使用；ならびに織物産業における前記組成物の使用に関する。
【0056】
本開示はまた、消臭剤／組成物としてのフレグランス放出組成物の使用に関する。
【0057】
以下の図は、開示を説明するための好ましい実施形態を提供するものであり、発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミド（SDS－PAGE）ゲル電気泳動（A）、および天然のブタ匂い物質結合タンパク質の円偏光二色性（CD）スペクトル（B）の模式図。Mw：Precision Plus ProteinTMスタンダード（BioRad）。
【発明を実施するための形態】
【0059】
本明細書は、フレグランス／タンパク質複合体の製造方法、および天然の匂い物質結合タンパク質（OBP－I）、特にブタのOBP－I、ならびにGQ20およびKPペプチドと融合した天然のタンパク質の吸着および解離機構に関する。この機構は、ヒトの発汗に反応して、好ましくは匂い分子（またはフレグランス）の活性剤の放出を含む。
【0060】
本開示は、繊維および化粧品分野において、特にローションおよびクリーム基剤製品並びにグリーンソリューション（green solution）を与える繊維織物からのフレグランスの放出において、大きな影響を与える。
【0061】
一実施形態では、製造された匂い物質結合タンパク質およびフレグランス／タンパク質複合体は、非常に可溶性であり、様々な溶媒（メタノール、ブタノール、ベンゼンおよびウンデカノールなど）および様々な温度の範囲（１８～６０℃）および様々なpHの範囲（４．０～１０．０）で安定である。１２２７－２９
【0062】
更なる実施形態では、匂い分子とOBP－IまたはOBP：：GQ20 ：：KPタンパク質の混合物は、緩衝液中および汗中の親和性定数に関して改善された結果を示した（表２）。特に、汗中の低Kaは、汗誘発応答が想定されるときにOBPタンパク質の使用を強制する。特に、タンパク質による吸着および解離機構は可逆的である。種々のpH（pH ４．０～８．５）でのヒトの発汗に応答して、開示されたタンパク質は、ブタの匂い物質結合タンパク質に基づく他の融合タンパク質と比較して、２０倍～６．８倍以上（それぞれ、OBP－IおよびOBP：：GQ20：：KP）の匂い分子を放出した（表２）。このように、フレグランスの放出は発汗に反応して起こり、各人の汗のpHとは無関係である。さらに、フレグランスの放出は少なくとも０．５～２４時間生じる。
【0063】
一実施形態では、消臭剤、天然エッセンス、香料（フレグランス剤）、保湿剤、またはそれらの混合物を含む種々の活性剤を複合体形成に使用することができ、広範囲の化粧品用途を可能にする。特に、快適な匂い分子（サイズと形状が異なる）は、匂い物質結合タンパク質、特にブタ匂い物質結合タンパク質に対して大きな親和性を示した。
【0064】
一実施形態では、本開示で使用される臭素分子は、異なる官能基（芳香族、アルデヒド、アルコール）に属する。さらなる実施形態では、匂い分子は、２０，００～１０００，００g／molの範囲の分子量を有し、濃度は０．２～２０００μMの範囲である。
【0065】
一実施形態では、匂い分子の分子量は、７５～３００g／molである。
【0066】
一実施形態では、システムはヒトの発汗に効率的に応答し、経時的に香料を放出する。重要なことに、このシステムは、人体に存在する水に対して応答せず、この開示で提示された主題に特異性とロバスト性（頑強性）を与えた。この選択性がなしに、すなわち、システムが水に反応した場合、OBPタンパク質は、表皮に接触すると、直ちに匂い分子を放出する。
【0067】
実施例:
一実施形態では、スペーサーグリシン－グルタミン、反復２０x（GQ20）および糖鎖結合モジュール（OBP：：GQ20：：CBM）と融合させた天然のブタ匂い物質結合タンパク質（OBP－I）およびOBP－Iを、プラスミドpET２８a中にクローン化し、大腸菌BL２１（DE３）に形質転換した。タンパク質を発現させ、タンパク質のN末端に存在するHis‐タグに特異的なニッケル磁気ビーズで精製した。１０μMのタンパク質を還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミド（SDS－PAGE）ゲル電気泳動上にロードした。同じ濃度を用いて、円偏光二色性（CD）分光法によりタンパク質の構造を決定した。
一実施形態では、スペーサーグリシン－グルタミン、反復２０x（GQ20）および糖鎖結合モジュール（OBP：：GQ20：：CBM）と融合させた天然のブタ匂い物質結合タンパク質（OBP－I）およびOBP－Iを、プラスミドpET２８a中にクローン化し、大腸菌BL２１（DE３）に形質転換した。タンパク質を発現させ、タンパク質のN末端に存在するHis‐タグに特異的なニッケル磁気ビーズで精製した。１０μMのタンパク質を還元条件下でドデシル硫酸ナトリウムおよびポリアクリルアミド（SDS－PAGE）ゲル電気泳動上にロードした。同じ濃度を用いて、円偏光二色性（CD）分光法によりタンパク質の構造を決定した。
【0068】
実験室で精製したタンパク質は、バレル中の二次構造と高レベルの純度（SDS－PAGEゲルで観察される、図１‐A）を示し、円偏光二色性分光法（図１‐B）で分析したように、多くのβシートが存在する結果である。
【0069】
一実施形態では、純粋な匂い物質結合タンパク質を凍結乾燥し、さらなる手順で使用した。匂い分子に対する匂い物質結合タンパク質の親和性を決定するために、１‐アミノアントラセン（１‐AMA）を匂いモデル分子として用いた。蛍光リガンドモデル１‐アミノアントラセン（１‐AMA）の濃度上昇を１μMのタンパク質に添加し、３７°Cで１時間後に４８１nmでの蛍光発光（２９５nmでの励起）によりリガンド／タンパク質複合体の形成を定量した。30解離定数（Kd）は、Malpeli et al.（1998）に記載されているスタンダード非線形回帰法で得られた蛍光強度対リガンド濃度のプロットから決定された。31汗溶液存在下でのタンパク質の親和性挙動を競合的蛍光アッセイにより行った。ここで、１μMのタンパク質を２μMの１‐AMAと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。この期間の後、汗溶液の増加した量を複合体に添加し、同じ条件でインキュベートした。
【0070】
一実施形態では、汗溶液は、AATCCメソッド15‐2009「Colorfastness to Perspiration」に示されるように調製された。調製した溶液のpHは４．０～８．５であった。その組成に従い、汗溶液も電解質溶液と見なされる。
【0071】
さらなる実施形態では、４８１nmでの蛍光発光（２９５nmでの励起）を記録し、解離定数（Kd）を計算した。会合定数（Ka）は式 Kd＝１／Kaにより計算した。
【0072】
一実施形態では、フレグランスの放出は、ガスクロマトグラフィー－質量分析（GC‐MS）によって定量化した。増加した濃度のフレグランスが、異なるバイアル中で使用され、ヘッドスペース中のフレグランスは、検量線（ピーク面積対フレグランス濃度）を実施して定量化された。フレグランスは、匂い物質結合タンパク質と３７℃でインキュベートした。汗溶液を添加し、数時間（０．５～２４時間）の汗曝露後にフレグランス放出を測定した。
【0073】
一実施形態では、比較データとして、ブタの匂い物質結合タンパク質を、以前に報告されたように、スペーサーGQ20および炭水化物結合モジュール（CBM）と融合した。25Cellulomonas fimi（セルロモナスフィミ）からのエンドグルカナーゼCのCBMN1（PDB ID １ULP）の融合を通して、OBPはコットンに特異的親和性を有する。修飾タンパク質は高い会合定数（Ka＝４．１７±０．０５μM）を示し、汗溶液を添加するとKa＝３．１６±０．０２μMで減少した。天然OBP‐I（配列番号１）およびOBP：：GQ20：：KP（配列番号２１）は、OBP：GQ20：：CBM（配列番号２２、Ka＝４．１７±０．０５）に対して得られた値と非常に類似した関連定数（Ka＝４．００±０．０３μM）を示した。しかしながら、汗溶液の添加は、天然タンパク質（Ka＝０．２０±０．０２μM）とOBP：GQ20：：KP（Ka＝０．５９±０．０１μM）の一定の親和性に顕著な影響を及ぼした。天然のOBP（配列番号１）を用いると２０ｘ、および、OBP：：GQ20：：KP（配列番号２１）を用いると６．８x、の親和性の高い低下が観察され、CBM（配列番号２２）と融合したタンパク質について定量化された値と比較すると、わずか１．３xの低下が確認された（Ka＝３．１６±０．０２ 表２）。このように、OBP‐IとKPと融合したOBPによるフレグランスの放出は、発汗に反応していることは明らかである。
【0074】
【表2】
【0075】
一実施形態では、汗の存在下でフレグランスを放出するために、以下のタンパク質配列を異なる基材に組み込むことができる。この点に関し、基材は、とりわけ、繊維、布、スキンケア製品、ヘアケア製品を含むリストから選択することができる。
【0076】
タンパク質配列のリスト
タンパク質の配列はアミノ酸の１文字コードで表される。コードは次のとおりである。
タンパク質の配列はアミノ酸の１文字コードで表される。コードは次のとおりである。
【0077】
【表3】
【0078】
【化1-1】
【化1-2】
【化1-3】
【化1-4】
【化1-5】
【化1-6】
【化1-7】
【化1-8】
【化1-9】
【0079】
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【0080】
この文書において使用されるときはいつでも「含む」という用語は、記述された特徴、整数、工程、構成要素の存在を示すことを意図しているが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素またはそれらのグループの存在または付加を排除するものではない。
【0081】
本開示は、記載された実施形態に限定されるものではなく、当業者は、その修正に対する多くの可能性を予見するであろう。
【0082】
上述の実施形態は、組み合わせ可能である。
【0083】
以下の特許請求の範囲は、本開示の特定の実施形態をさらに記載する。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】