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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-25
(54)【発明の名称】新規なアテロコラーゲンおよびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 14/78 20060101AFI20230718BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230718BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20230718BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20230718BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230718BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230718BHJP
C12N 15/115 20100101ALN20230718BHJP
C07K 1/14 20060101ALN20230718BHJP
C07K 1/12 20060101ALN20230718BHJP
【ＦＩ】
C07K14/78 ZNA
A61P35/00
A61P35/04
A61K47/69
A61K47/42
A61K45/00
C12N15/115 Z
C07K1/14
C07K1/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022581508
(86)(22)【出願日】2021-06-29
(85)【翻訳文提出日】2022-12-28
(86)【国際出願番号】 KR2021008154
(87)【国際公開番号】W WO2022005155
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】10-2020-0079224
(32)【優先日】2020-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0084609
(32)【優先日】2021-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519232334
【氏名又は名称】インターオリゴ・コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＲＯＬＩＧＯ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】＃９０２， Ｆ， Ａ－ＤＯＮＧ， ６６， ＢＥＯＬＭＡＬ－ＲＯ， ＤＯＮＧＡＮ－ＧＵ， ＡＮＡＹＡＮＧ－ＳＩ， ＧＹＥＯＮＧＧＩ‐ＤＯ， １４０５８， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジュン・ファン
(72)【発明者】
【氏名】イ，セ・ナ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ド・ヨン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ダ・ギョン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジョン・ウク
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ジ・ア
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA16
4C076AA94
4C076AA95
4C076BB11
4C076BB32
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA17
4C084MA66
4C084MA67
4C084NA13
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA72
4H045CA40
4H045EA20
4H045GA01
(57)【要約】
本発明は、新規なアテロコラーゲンおよびその用途に関するものである。より詳細には、前記アテロコラーゲンは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析において、前記β鎖に対するピーク面積（Ｓβ）が前記α鎖に対する２番目のピーク面積（Ｓα２）よりも大きな特徴を有することにより、生理活性物質を担持すると、体内での生理活性物質の急激な初期放出を低下させるか、または遅すぎる初期放出による生理活性物質の効果減少を調節することができる。また、本発明のアテロコラーゲンは、優れた癌転移抑制効果を示すことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の構造式１または構造式２の繰り返し単位を有するα鎖と、前記α鎖の二量体であるβ鎖と、前記α鎖の三量体であるγ鎖とを含み、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析において、前記β鎖に対するピーク面積（Ｓβ）が前記α鎖に対する２番目のピーク面積（Ｓα２）よりも大きい、アテロコラーゲン。
［構造式１］
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｘ
（構造式１中、Ｇｌｙはグリシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｘはグリシンおよびプロリンではないアミノ酸残基である。）
［構造式２］
Ｇｌｙ－Ｙ－Ｈｙｐ
（構造式２中、Ｇｌｙはグリシン、Ｙはグリシンおよびヒドロキシプロリンではないアミノ酸残基、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンである。）
【請求項2】
前記α鎖は、α１鎖またはα２鎖の少なくとも１つであり、前記β鎖は、前記α１鎖およびα１鎖の二量体、α１鎖およびα２鎖の二量体、またはα２鎖およびα２鎖の二量体である、請求項１に記載のアテロコラーゲン。
【請求項3】
前記α鎖は、α１鎖またはα２鎖の少なくとも１つであり、前記γ鎖は、前記α１鎖、α１鎖およびα２鎖の三量体である、請求項１に記載のアテロコラーゲン。
【請求項4】
前記ＳβおよびＳα２は、下記数式１を満たす、請求項１に記載のアテロコラーゲン。［数式１］
１．１≦Ｓβ／Ｓα２≦５
【請求項5】
前記Ｓβは、下記数式２を満たす、請求項１に記載のアテロコラーゲン。［数式２］
０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．５
（式中、Ｓα１は前記α鎖に対する１番目のピーク面積であり、Ｓγはγ鎖に対するピーク面積である。）
【請求項6】
前記α鎖は１００ｋＤａ～１５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載のアテロコラーゲン。
【請求項7】
前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、下記表１の条件下で行われる、請求項１に記載のアテロコラーゲン。【表1】
【請求項8】
前記Ｓβは、前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）グラフにおける溶出時間１３．０分～１３．７分ピークの積分値である、請求項７に記載のアテロコラーゲン。
【請求項9】
前記Ｓα２は、前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）クロマトグラムにおける溶出時間１３．７分～１４．２分ピークの積分値である、請求項７に記載のアテロコラーゲン。
【請求項10】
前記アテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮に１℃～１０℃で０．５～１２時間タンパク分解酵素を処理して得られたものである、請求項１に記載のアテロコラーゲン。
【請求項11】
前記タンパク分解酵素は、真皮１００ｇ当たりに０．１×１０７ｕｎｉｔ～３．０×１０７ｕｎｉｔで処理される、請求項１０に記載のアテロコラーゲン。
【請求項12】
前記アテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮にタンパク分解酵素を処理するステップと、前記タンパク分解酵素が処理された真皮に塩基性溶液を添加し、ｐＨを８～９に調整して前記タンパク分解酵素を不活性化するステップと、
前記タンパク分解酵素が不活性化された試料に酸性溶液を処理し、試料のｐＨを３～４に調整するｐＨ調整ステップとを含む方法で製造される、請求項１に記載のアテロコラーゲン。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のアテロコラーゲンと、前記アテロコラーゲンに担持された薬物とを含む薬物送達体。
【請求項14】
前記アテロコラーゲンは、複数の空隙を有する構造体であり、前記空隙は、平均直径が１０μｍ～１００μｍである、請求項１３に記載の薬物送達体。
【請求項15】
前記薬物送達体は、手術後の残存癌部位に移植または注入される、請求項１３に記載の薬物送達体。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のアテロコラーゲンと、前記アテロコラーゲンに担持された抗癌剤とを含む、癌転移抑制剤。
【請求項17】
前記癌は、膵臓癌、乳癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌、頭頸部癌または膠芽細胞腫である、請求項１６に記載の癌転移抑制剤。
【請求項18】
前記癌転移抑制剤は、手術後の残存癌部位に移植または注入される、請求項１６に記載の癌転移抑制剤。
【請求項19】
前記抗癌剤は、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質またはアプタマーである、請求項１６に記載の癌転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規なアテロコラーゲンおよびその用途に関する。
【背景技術】
【0002】
コラーゲンは、真皮、靭帯、骨などに見られる細胞外マトリックス（extracellular matrix）であり、人体の総タンパク質の約３０％を占めている。コラーゲンは、その周辺において細胞が一定の秩序を備えて集合し、組織や器官の基本構造を形成することができる。そのため、生体の損傷部位を再生するために、損傷部位の人工組織代替物の基礎マトリックス（matrix）としてコラーゲンを利用する事例が多数ある。また、コラーゲンは位置する組織によってその種類が異なるが、最も豊富なタイプのコラーゲンは約３００ｋＤａの分子量を持ち、３つのポリペプチドで構成されるＩ型コラーゲン（Type I collagen）である。Ｉ型コラーゲンは皮膚、靭帯、骨などのほとんどすべての組織に大量に含まれているため、組織工学で最も広く利用されている。コラーゲンの分子構造には、Ｎ末端およびＣ末端領域に位置する非らせん状のテロペプチド領域および三重らせん領域が含まれる。三重らせん領域は種間で保存されて低い免疫原性を示すのに対して、テロペプチド領域は高い免疫原性を示す。そこで、コラーゲンを医薬品や化粧品などの原料として使用するために、タンパク分解酵素（protease）を処理してテロペプチド領域を除去し、コラーゲンと類似した特性を保持するアテロコラーゲン（atelocollagen）を利用する。
【0003】
従来の方法で製造されたアテロコラーゲンを薬物送達体として使用する場合には、ｉ）担持された薬物が均一でなく表面に高濃度で担持され、ｉｉ）薬物を担持して体内に移植すると、初期に薬物が過剰放出され、経時に伴って薬物の放出が急激に減少して薬物の体内持続時間が短くなる問題が発生してしまう。薬物送達体の場合、副作用を最小限に抑え、治療効果を最大化することが重要である。そのためには、最適な薬物放出速度で薬物を長時間均一に放出することが重要であるが、従来のアテロコラーゲン薬物送達体は、薬物の過剰な初期放出により、最適の治療効果が期待できない欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、新規なアテロコラーゲンおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【0005】
本発明は、新規なアテロコラーゲンを含む薬物送達体を提供することを目的とする。
【0006】
本発明は、新規なアテロコラーゲンを含む癌転移抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
１．下記の構造式１または構造式２の繰り返し単位を有するα鎖と、前記α鎖の二量体であるβ鎖と、前記α鎖の三量体であるγ鎖とを含み、
高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography、HPLC）分析において、前記β鎖に対するピーク面積（Ｓβ）が前記α鎖に対する２番目のピーク面積（Ｓα２）よりも大きい、アテロコラーゲン。
［構造式１］
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｘ
（構造式１中、Ｇｌｙはグリシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｘはグリシンおよびプロリンではないアミノ酸残基である。）
［構造式２］
Ｇｌｙ－Ｙ－Ｈｙｐ
（構造式２中、Ｇｌｙはグリシン、Ｙはグリシンおよびヒドロキシプロリンではないアミノ酸残基、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンである。）
高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography、HPLC）分析において、前記β鎖に対するピーク面積（Ｓβ）が前記α鎖に対する２番目のピーク面積（Ｓα２）よりも大きい、アテロコラーゲン。
［構造式１］
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｘ
（構造式１中、Ｇｌｙはグリシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｘはグリシンおよびプロリンではないアミノ酸残基である。）
［構造式２］
Ｇｌｙ－Ｙ－Ｈｙｐ
（構造式２中、Ｇｌｙはグリシン、Ｙはグリシンおよびヒドロキシプロリンではないアミノ酸残基、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンである。）
【0008】
２．前記項目１において、前記α鎖は、α１鎖またはα２鎖であり、前記β鎖は、前記α１鎖およびα１鎖の二量体、α１鎖およびα２鎖の二量体、またはα２鎖およびα２鎖の二量体である、アテロコラーゲン。
【0009】
３．前記項目１において、前記α鎖は、α１鎖またはα２鎖であり、前記γ鎖は、前記α１鎖、α１鎖およびα２鎖の三量体である、アテロコラーゲン。
【0010】
４．前記項目１において、前記Ｓβ及びＳα２は、下記数式１を満たす、アテロコラーゲン。
［数式１］
１．１≦Ｓβ／Ｓα２≦５
［数式１］
１．１≦Ｓβ／Ｓα２≦５
【0011】
５．前記項目１において、前記Ｓβは、下記数式２を満たす、アテロコラーゲン。
［数式２］
０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．５
（式中、Ｓα１は、前記α鎖に対する１番目のピーク面積であり、Ｓγは、γ鎖に対するピーク面積である。）
［数式２］
０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．５
（式中、Ｓα１は、前記α鎖に対する１番目のピーク面積であり、Ｓγは、γ鎖に対するピーク面積である。）
【0012】
６．前記項目１において、前記α鎖は、１００ｋＤａ～１５０ｋＤａの分子量を有する、アテロコラーゲン。
【0013】
７．前記項目１において、前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、下記表１の条件下で行われる、アテロコラーゲン。
【0014】
【表1】
【0015】
８．前記項目７において、前記Ｓβは、前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析クロマトグラムの溶出時間１３．０分～１３．７分ピークの積分値である、アテロコラーゲン。
【0016】
９．前記項目７において、前記Ｓα２は、前記高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析クロマトグラムの溶出時間１３．７分～１４．２分ピークの積分値である、アテロコラーゲン。
【0017】
１０．前記項目１において、前記アテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮に１℃～１０℃で０．５～１２時間タンパク分解酵素を処理して得られたものである、アテロコラーゲン。
【0018】
１１．前記項目１０において、前記タンパク分解酵素は、真皮１００ｇ当たりに０．１×１０７ｕｎｉｔ～３．０×１０７ｕｎｉｔで処理される、アテロコラーゲン。
【0019】
１２．前記項目１において、前記アテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮にタンパク分解酵素を処理するステップと、
前記タンパク分解酵素が処理された真皮に塩基性溶液を添加し、ｐＨを８～９に調整して前記タンパク分解酵素を不活性化するステップと、
前記タンパク分解酵素が不活性化された試料に酸性溶液を処理し、試料のｐＨを３～４に調整するｐＨ調整ステップとを含む方法で製造される、アテロコラーゲン。
前記タンパク分解酵素が処理された真皮に塩基性溶液を添加し、ｐＨを８～９に調整して前記タンパク分解酵素を不活性化するステップと、
前記タンパク分解酵素が不活性化された試料に酸性溶液を処理し、試料のｐＨを３～４に調整するｐＨ調整ステップとを含む方法で製造される、アテロコラーゲン。
【0020】
１３．前記項目１～１２のいずれかに記載のアテロコラーゲンと、前記アテロコラーゲンに担持された薬物とを含む、薬物送達体。
【0021】
１４．前記項目１３において、前記アテロコラーゲンは、複数の空隙を有する構造体であり、前記空隙は、平均直径が１０μｍ～１００μｍである、薬物送達体。
【0022】
１５．前記項目１３において、前記薬物送達体は、手術後の残存癌部位に移植または注入される、薬物送達体。
【0023】
１６．前記項目１～１２のいずれかに記載のアテロコラーゲンと、前記アテロコラーゲンに担持された抗癌剤とを含む、癌転移抑制剤。
【0024】
１７．前記項目１６において、前記癌は、膵臓癌、乳癌、肝癌、大腸癌、卵巣癌、頭頸部癌または膠芽細胞腫である、癌転移抑制剤。
【0025】
１８．前記項目１６において、前記癌転移抑制剤は、手術後の残存癌部位に移植または注入される、癌転移抑制剤。
【0026】
１９．前記項目１６において、前記抗癌剤は、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質またはアプタマーである、癌転移抑制剤。
【発明の効果】
【0027】
本発明のアテロコラーゲンは、α２鎖に対して高いβ鎖の含有量を有することにより、従来のアテロコラーゲンとは異なる物性（例えば、優れた粘度）を示すことができる。
【0028】
本発明のアテロコラーゲンに生理活性物質を均一に担持することができる。
【0029】
本発明のアテロコラーゲンに生理活性物質を担持することにより、体内での生理活性物質の遅すぎる初期放出による生理活性物質の効果の減少を調節することができる。すなわち、本発明のアテロコラーゲンに生理活性物質を担持すると、体内での生理活性物質の放出速度を調節することができ、最終的には、生理活性物質の放出を制御して体内での生理活性物質の効能を増大させることができる。
【0030】
本発明のアテロコラーゲンは、優れた癌転移抑制効果を示すことができる。
【0031】
本発明のアテロコラーゲンは、生分解され得る。
【0032】
本発明の製造方法は、アテロコラーゲンのα鎖、β鎖またはγ鎖の含有量を調節することができる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【発明を実施するための形態】
【0034】
以下、本発明を説明する。
【0035】
本発明は、新規なアテロコラーゲンを提供する。
【0036】
本発明は、α鎖と、前記α鎖の二量体であるβ鎖と、前記α鎖の三量体であるγ鎖とを含み、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析において、前記β鎖に対するピーク面積（Ｓβ）が前記α鎖に対する２番目のピーク面積（Ｓα２）よりも大きいアテロコラーゲンを提供する。
【0037】
用語「ピークの面積」とは、ＨＰＬＣ分析グラフに存在する当該ピークを有する山の面積を意味し、前記各ピークを有する山およびその面積は、通常のクロマトグラフィー分析法によって定義される。
【0038】
「ピークの面積」とは、ＨＰＬＣ分析チャート（クロマトグラム）において、特定のピークに対応する溶出時間直前の変曲点での溶出時間（または特定のピークに対応する溶出時間直前の山とベースラインとの交点での溶出時間）から、当該ピークに対応する溶出時間直後の変曲点での溶出時間（または当該ピークに対応する溶出時間直後の山とベースラインとの交点での溶出時間）までの検出量を積分した値を意味し得る。「ベースライン」とは、ＨＰＬＣ分析チャートにおける検出値が０で、横軸に平行な線を意味する。
【0039】
特定のピークを有する山の面積を求める方法について、以下の例示を挙げて説明する。特定のピークを有する山の面積の求め方は、以下の例示に限定されず、通常のクロマトグラフィー分析法によって求めることができる。
【0040】
面積を求めようとする特定のピークの溶出時間前に他のピークを有する山（ここで、前記他のピークを有する山は、前記特定のピークを有する山と隣接し、前記他のピークを有する山と前記特定のピークを有する山との間には変曲点が存在する。）が存在し、前記特定のピークの溶出時間後に存在するまた他のピークを有する山（ここで、前記また他のピークを有する山は、前記特定のピークを有する山と隣接し、前記また他のピークを有する山と前記特定のピークを有する山との間には変曲点が存在する。）が存在する場合、前記特定のピークを有する山の面積を求める方法について、図１を参照して具体的に説明する。
【0041】
図１において、前記第１ピーク１０を有する山の面積とは、前記第１ピーク１０よりも溶出時間が早い第３ピーク３０を有する山と第１ピーク１０を有する山との間に存在する第１変曲点ａ１に相当する溶出時間ｔａ１から、前記第１ピーク１０よりも溶出時間が遅い第２ピーク２０を有する山と第１ピーク１０を有する山との間に存在する第２変曲点ａ２に相当する溶出時間ｔａ２までの検出量を積分した値を意味する（図１を参照）（ここで、前記第３ピーク３０は、第１ピーク１０の前に存在し、前記第３ピーク３０を有する山と前記第１ピーク１０を有する山は隣接している。また、前記第２ピーク２０は、前記第１ピーク１０の後に存在し、前記第２ピーク２０を有する山と前記第１ピーク１０を有する山は隣接している。）。すなわち、図１における左下に傾いている斜線部分の面積１を意味する。
【0042】
同様に、図１において、前記第２ピーク２０を有する山の面積とは、前記第２ピーク２０よりも溶出時間が早い第１ピーク１０を有する山と第２ピーク２０を有する山との間に存在する第２変曲点ａ２に相当する溶出時間ｔａ２から、前記第２ピーク２０よりも溶出時間が遅い第４ピーク４０を有する山と第２ピーク２０を有する山との間に存在する第３変曲点ａ３に相当する溶出時間ｔａ３までの検出量を積分した値を意味する（図１を参照）（ここで、前記第１ピーク１０は、前記第２ピーク２０の前に存在し、前記第１ピーク１０を有する山と前記第２ピーク２０を有する山は隣接している。また、前記第４ピーク４０は、前記第２ピーク２０の後に存在し、前記第４ピーク４０を有する山と前記第２ピーク２０を有する山は隣接している。）。すなわち、図１における右下に傾いている斜線部分の面積２を意味する。
【0043】
面積を求めようとする特定のピークの溶出時間前に、前記特定のピークを有する山とベースラインとの交点が存在し（ここで、前記交点と前記特定のピークとの間には他のピークが存在しない。）、前記特定のピークの溶出時間後に、また他のピークを有する山（ここで、前記また他のピークを有する山は、前記特定のピークを有する山と隣接し、前記また他のピークを有する山と前記特定のピークを有する山との間には変曲点が存在する。）が存在する場合、前記特定のピークを有する山（図２の第１ピーク１０に対応する。）の面積を求める方法について、図２を参照して具体的に説明する。
【0044】
図２において、前記第１ピーク１０を有する山の面積とは、前記第１ピーク１０の溶出時間ｔ１０よりも早い時間に現れるベースラインｂと前記第１ピーク１０を有する山との交点ｂ１に相当する溶出時間ｔｂ１から、前記第１ピーク１０よりも溶出時間が遅い第２ピーク２０を有する山と第１ピーク１０を有する山との間に存在する第１変曲点ａ１に相当する溶出時間ｔａ１までの検出量を積分した値を意味する（図２を参照）（ここで、前記交点ｂ１と前記第１ピーク１０との間には他のピークが存在しない。また、前記第２ピーク２０は前記第１ピーク１０の後に存在し、前記第２ピーク２０を有する山と前記第１ピーク１０を有する山は隣接している。）。すなわち、図２における左下に傾いている斜線部分の面積１を意味する。
【0045】
一方、図２において、前記第２ピーク２０を有する山の面積とは、前記第２ピーク２０よりも溶出時間が早い第１ピーク１０を有する山と第２ピーク２０を有する山との間に存在する第１変曲点ａ１に相当する溶出時間ｔａ１から、前記第２ピーク２０よりも溶出時間が遅い第３ピーク３０を有する山と第２ピーク２０を有する山との間に存在する第２変曲点ａ２に相当する溶出時間ｔａ２までの検出量を積分した値を意味する（図２を参照）（ここで、前記第１ピーク１０は前記第２ピーク２０の前に存在し、前記第１ピーク１０を有する山と前記第２ピーク２０を有する山は隣接している。また、前記第３ピーク３０は前記第２ピーク２０の後に存在し、前記第３ピーク３０を有する山と前記第２ピーク２０を有する山は隣接している。）。すなわち、図２における横軸と平行な線で表示された部分の面積２を意味する。
【0046】
面積を求めようとする特定のピークの溶出時間後に、前記特定のピークを有する山とベースラインとの交点が存在し（ここで、前記交点と前記特定のピークとの間には他のピークが存在しない。）、前記特定のピークの溶出時間前にまた他のピークを有する山（ここで、前記また他のピークを有する山は、前記特定のピークを有する山と隣接し、前記他のピークを有する山と前記特定のピークを有する山との間には変曲点が存在する。）が存在する場合、 前記特定のピークを有する山（図３の第２ピーク２０に対応する。）の面積を求める方法について、図３を参照して具体的に説明する。
【0047】
図３において、前記第２ピーク２０を有する山の面積は、前記第２ピーク２０よりも溶出時間が早い第１ピーク１０を有する山と第２ピーク２０を有する山との間に存在する第２変曲点ａ２に相当する溶出時間ｔａ２から、前記第２ピーク２０の溶出時間ｔ２０よりも遅い時間でベースラインｂと前記第２ピーク２０を有する山との交点ｂ２に相当する溶出時間ｔｂ２までの検出量を積分した値を意味する（図３を参照）（ここで、前記交点ｂ２と前記第２ピーク２０との間には他のピークが存在しない。また、前記第１ピーク１０は、前記第２ピーク２０の前に存在し、前記第１ピーク１０を有する山と前記第２ピーク２０を有する山は隣接している。）。すなわち、図３における横軸と平行な線で表示された部分の面積２を意味する。
【0048】
一方、図３において、前記第１ピーク１０を有する山の面積とは、前記第１ピーク１０よりも溶出時間が早い第３ピーク３０を有する山と第１ピーク１０を有する山との間に存在する第１変曲点ａ１に相当する溶出時間ｔａ１から、前記第１ピーク１０よりも溶出時間が遅い第２ピーク２０を有する山と第１ピーク１０を有する山との間に存在する第２変曲点ａ２に相当する溶出時間ｔａ２までの検出量を積分した値を意味する（図３を参照）（ここで、前記第３ピーク３０は第１ピーク１０の前に存在し、前記第３ピーク３０を有する山と前記第１ピーク１０を有する山は隣接している。また、前記第２ピーク２０は前記第１ピーク１０の後に存在し、前記第２ピーク２０を有する山と前記第１ピーク１０を有する山は隣接している。）。すなわち、図３における左下に傾いている斜線部分の面積１を意味する。
【0049】
前記各ピークの面積は、当該ピークを示す物質の含有量に比例する。すなわち、本発明のアテロコラーゲンは、アテロコラーゲンに含まれるβ鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも高いものである。具体的には、前記含有量の単位はｗ／ｖ％であってもよい。
【0050】
用語「アテロコラーゲン」とは、コラーゲンのＮ末端およびＣ末端に位置するテロペプチドが除去されたものであり、コラーゲンの特性を維持しつつ免疫原性が除去されたものである。アテロコラーゲンは、天然に存在するコラーゲンからＮ末端およびＣ末端のテロペプチドを除去することによって製造されたものであってもよい。例えば、本発明のアテロコラーゲンは、１型または２型のコラーゲンからＮ末端およびＣ末端のテロペプチドを除去することによって製造されたものであってもよい。
【0051】
用語「コラーゲン」とは、細胞外マトリックスの大部分を占めるタンパク質であり、組織の構造を形成したり、細胞間または細胞とマトリックスとの相互作用に関与したりするものである。コラーゲン分子（Collagen molecule）は、基本構成単位であるα鎖の３本がねじれてヘリックス構造を形成した分子であり、α鎖はＧｌｙ－Ａ－Ｂ（Ｇｌｙはグリシン、Ａ及びＢはアミノ酸であり、Ａ及びＢの少なくとも一つは、プロリンまたはヒドロキシプロリンである。）の繰り返し単位を有し、約１０００個のアミノ酸からなるペプチドであってもよい。コラーゲンは、組織内での機能、配列などによって非常に多様な種類が存在する。代表的なコラーゲンの種類としては、Ｉ型コラーゲンとＩＩ型コラーゲンがある。Ｉ型コラーゲンは、２本のα１鎖と１本のα２鎖で構成され、ＩＩ型コラーゲンは、３本のα１鎖で構成される。
【0052】
本発明のアテロコラーゲンに含まれるα鎖は、Ｇｌｙ－Ａ－Ｂ（Ｇｌｙはグリシン、Ａ及びＢはアミノ酸であり、Ａ及びＢの少なくとも一つは、プロリンまたはヒドロキシプロリンである。）の繰り返し単位を有することができる。
【0053】
例えば、本発明のアテロコラーゲンに含まれるα鎖は、下記の構造式１または構造式２の繰り返し単位を有することができる。
【0054】
［構造式１］
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｘ
（構造式１中、Ｇｌｙはグリシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｘはグリシンおよびプロリンではないアミノ酸残基である。）
Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｘ
（構造式１中、Ｇｌｙはグリシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｘはグリシンおよびプロリンではないアミノ酸残基である。）
【0055】
［構造式２］
Ｇｌｙ－Ｙ－Ｈｙｐ
（構造式２中、Ｇｌｙはグリシン、Ｙはグリシンおよびヒドロキシプロリンではないアミノ酸残基、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンである。）
Ｇｌｙ－Ｙ－Ｈｙｐ
（構造式２中、Ｇｌｙはグリシン、Ｙはグリシンおよびヒドロキシプロリンではないアミノ酸残基、Ｈｙｐはヒドロキシプロリンである。）
【0056】
α鎖は、α１鎖またはα２鎖のうちの少なくとも１つであってもよい。
【0057】
β鎖は、前記α１鎖およびα１鎖の二量体、α１鎖およびα２鎖の二量体、またはα２鎖およびα２鎖の二量体であってもよい。
【0058】
γ鎖は、α１鎖、α１鎖およびα２鎖の三量体であってもよい。
【0059】
前記α鎖は、１００ｋＤａ～１５０ｋＤａの分子量、例えば、１００ｋＤａ、１０５ｋＤａ、１１０ｋＤａ、１１５ｋＤａ、１２０ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１３０ｋＤａ、１３１ｋＤａ、１３２ｋＤａ、１３３ｋＤａ、１３４ｋＤａ、１３５ｋＤａ、１３６ｋＤａ、１３７ｋＤａ、１３８ｋＤａ、１３９ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１４５ｋＤａまたは１５０ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。
【0060】
前記β鎖は、１８０ｋＤａ～２７０ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。
【0061】
前記γ鎖は、２８０ｋＤａ～３５０ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。
【0062】
本発明のアテロコラーゲンは、前記α鎖、β鎖およびγ鎖に加えて、付随的な成分（例えば、水、塩、バッファーなど）をさらに含むことができる。
【0063】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、ＳβおよびＳα２は、下記数式１を満たすものであってもよい。
【0064】
［数式１］
１．１≦Ｓβ／Ｓα２≦５
１．１≦Ｓβ／Ｓα２≦５
【0065】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／Ｓα２の値は、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１．１～５、１．１～４．５または１．２～４．５であってもよい。本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／Ｓα２の値は、１．１～５．０、１．５～４．５、２．０～４．０または２．５～３．５であってもよい。本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／Ｓα２の値は、１．１～１．９、２．０～２．９または３．０～４．５であってもよい。
【0066】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／Ｓα２は下記式を満たすことができる：１≦Ｓβ／Ｓα２≦５、１．１≦Ｓβ／Ｓα２≦４．５、１．２≦Ｓβ／Ｓα２≦４．５、１．５≦Ｓβ／Ｓα２≦４．５、２．０≦Ｓβ／Ｓα２≦４．０、２．５≦Ｓβ／Ｓα２≦３．５または２．０≦Ｓβ／Ｓα２≦３．０。
【0067】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβは下記数式２を満たすものであってもよい。
【0068】
［数式２］
０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．５
（式中、Ｓα１は前記α鎖に対する１番目のピーク面積であり、Ｓγはγ鎖に対するピーク面積である。）
前記（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は、アテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、アテロコラーゲンに由来する各ピークの面積の合計を意味する。
０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．５
（式中、Ｓα１は前記α鎖に対する１番目のピーク面積であり、Ｓγはγ鎖に対するピーク面積である。）
前記（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は、アテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、アテロコラーゲンに由来する各ピークの面積の合計を意味する。
【0069】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は下記式を満たすことができる：０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．５、０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．４、０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．３または０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．２５。
【0070】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は下記式を満たすことができる：０．２≦Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．３、０．３＜Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）≦０．４、０．４＜Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Sγ）≦０．５。
【0071】
α鎖に対する１番目のピークは、α１鎖に対するピークであり、α鎖に対する２番目のピークは、α２鎖に対するピークである。α鎖に対するピークの順序は、溶出時間を基準に区分される。すなわち、α鎖に対する１番目のピークの溶出時間は、α鎖に対する２番目のピークの溶出時間よりも早い。
【0072】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は、０．１～０．５、０．１１～０．４５、０．１２～０．４５または０．１３～０．４５であってもよい。例えば、本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓβ／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２, ０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９または０．５であってもよい。
【0073】
本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓα２／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は、０．０５～０．３または０．０５～０．２５であってもよい。例えば、本発明のアテロコラーゲンを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した場合、Ｓα２／（Ｓα１＋Ｓα２＋Ｓβ＋Ｓγ）は、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９または０．３であってもよい。
【0074】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、オクタデシル官能基が付着したシリカ固定相で充填された逆相Ｃ１８カラムを用いることができるが、試料を分析できるものであれば、その種類は限定しない。
【0075】
一実施形態によれば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析は、下記表１の条件下で行うことができる。
【0076】
【表1】
【0077】
最適な分析のために、高速液体クロマトグラフィーの分析条件を変更できるが、これにより本発明のアテロコラーゲンの性質が変わるものではない。高速液体クロマトグラフィーの分析結果として得られるグラフは、縦軸に検出量または検出強度を、横軸に溶出時間を示すことができる。
【0078】
一実施形態によれば、Ｓβは、表１の条件下で行われた高速液体クロマトグラフィーのグラフにおける溶出時間が１３．０分～１３．７分であるピークを有する山の面積であってもよい。一実施形態によれば、Ｓα２は、表１の条件下で行われた高速液体クロマトグラフィーグラフにおける溶出時間が１３．７分～１４．２分であるピークを有する山の面積であってもよい。
【0079】
前述のように、本発明のアテロコラーゲンではβ鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも高いが、従来のアテロコラーゲンでは、全アテロコラーゲンに対してβ鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも低い（従来のアテロコラーゲンの場合、β鎖に対するピークの面積（Ｓβ）は、α２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）と等しいか、またはα２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）よりも小さい。）。これは、後述する本発明のアテロコラーゲンの製造方法、例えば、実施段階および実施条件の違いによるものであり得る。
【0080】
本発明のアテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮に１℃～１０℃で０．５～１２時間の間、タンパク分解酵素を処理して得られたものであってもよい。
【0081】
本発明のアテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮に１８℃～３０℃で３時間未満の間、タンパク分解酵素を処理して得られたものであってもよい。
【0082】
本発明のアテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮にタンパク分解酵素を処理し、１℃～１５℃で１２時間以下、および１８℃～３０℃で３時間未満反応させて得られたものであってもよい。
【0083】
タンパク分解酵素は、真皮１００ｇ当たりに０．１×１０７ｕｎｉｔ～３．０×１０７ｕｎｉｔ、０．５×１０７ｕｎｉｔ～２．５×１０７ｕｎｉｔ、０．８×１０７ｕｎｉｔ～２．３×１０７ｕｎｉｔ、１．０×１０７ｕｎｉｔ～２．０×１０７ｕｎｉｔ、１．３×１０７ｕｎｉｔ～１．８×１０７ｕｎｉｔで処理されてもよい。
【0084】
本発明のアテロコラーゲンは、哺乳類由来の真皮にタンパク分解酵素を処理するステップと、前記タンパク分解酵素が処理された真皮に水酸化ナトリウム溶液を添加し、ｐＨを８～９に調整して前記タンパク分解酵素を不活性化するステップと、前記タンパク分解酵素が不活性化された試料に酸性溶液を処理し、試料のｐＨを３～４に調整するｐＨ調整ステップとを含む方法で製造することができる。
【0085】
本発明のアテロコラーゲンは哺乳類由来であってもよく、哺乳類はヒト、ブタ、ウシ、ニワトリなどであってもよい。本発明のアテロコラーゲンは哺乳類の組織由来であってもよく、前記組織は皮膚、尾、軟骨、骨、腱、靭帯などであってもよい。
【0086】
本発明のアテロコラーゲンは様々な形態で製剤化することができ、例えば水溶液、分散液、ゲル、粉末、タブレット、パッチ、フィルム、スポンジ、フォームまたはマトリックスなどの形態で製剤化することができる。
【0087】
また、本発明は新規なアテロコラーゲンの製造方法を提供する。
【0088】
前記製造方法は、（ａ）哺乳類の真皮サンプルにタンパク分解酵素を処理するステップを含む。
【0089】
タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記哺乳類はヒト、ブタ、ウシ、ニワトリなどであってもよい。前記タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記真皮は尾、軟骨、骨、腱または靭帯から得られるものであってもよい。前記タンパク分解酵素は、ペプシン、パパイン、アルカラーゼ（alcalase）およびカタラーゼ（catalase）の少なくとも１つであってもよい。一実施形態によれば、前記タンパク分解酵素はペプシンであってもよい。前記真皮サンプルは、哺乳類の真皮に酢酸を添加して均質化したものであってもよい。
【0090】
タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記タンパク分解酵素は、真皮１００ｇ当たりに０．１×１０７ｕｎｉｔ～３．０×１０７ｕｎｉｔ、０．５×１０７ｕｎｉｔ～２．５×１０７ｕｎｉｔ、０．８×１０７ｕｎｉｔ～２．３×１０７ｕｎｉｔ、１．０×１０７ｕｎｉｔ～２．０×１０７ｕｎｉｔ、１．３×１０７ｕｎｉｔ～１．８×１０７ｕｎｉｔで処理されてもよい。一実施形態によれば、前記タンパク分解酵素は、真皮１００ｇ当たりに１．５×１０７ｕｎｉｔで処理されてもよい。
【0091】
タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記タンパク分解酵素は、１℃～３０℃、１℃～２５℃、１℃～１５℃、１℃～１０℃、１℃～８℃、２℃～６℃または３℃～５℃で処理されてもよく、一実施形態によれば、前記タンパク分解酵素は４℃で処理されてもよい。タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記タンパク分解酵素は２４時間以下で処理されてもよい。例えば、前記タンパク分解酵素は０．１時間～２４時間、０．２時間～２０時間、０．３時間～１８時間、０．４時間～１６時間、０．５時間～１２時間、１時間～５時間または１．５時間～３時間処理されてもよい。
【0092】
タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記タンパク分解酵素は１℃～１５℃で１２時間以下処理されてもよい。一実施形態によれば、前記タンパク分解酵素は４℃で１．５時間～１１．５時間（例えば、４℃で１．５時間～３時間、４．５時間、１１．５時間）処理されてもよい。一実施形態により、タンパク分解酵素が４℃で１３時間未満、例えば０．５時間～１２時間処理される場合には、タンパク分解酵素を不活性化するステップを行わなくても、β鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも高い本発明のアテロコラーゲンを得ることができる。
【0093】
タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記タンパク分解酵素は１８℃～３０℃で３時間未満で処理されてもよい。一実施形態によれば、前記タンパク分解酵素は、１８℃～２４℃で１．５時間処理されてもよい。一実施形態により、タンパク分解酵素がＲＴ（Room temperature）で３時間未満処理される場合には、タンパク分解酵素を不活性化するステップを行わなくても、β鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも高い本発明のアテロコラーゲンを得ることができる。
【0094】
タンパク分解酵素を処理するステップにおいて、前記タンパク分解酵素は１℃～１５℃で１２時間以下、１８℃～３０℃で３時間未満処理されてもよい。一実施形態によれば、前記タンパク分解酵素は、４℃で１．５時間～１１．５時間、ＲＴで３時間未満処理されてもよい。
【0095】
このように、本発明のアテロコラーゲンは、前述のタンパク分解酵素を処理するステップでタンパク分解酵素が処理される条件によって、α鎖、β鎖およびγ鎖の含量比を調節することができる。一実施形態によれば、タンパク分解酵素を処理するステップにおけるペプシンの使用量、反応温度または時間を変えることによって、α鎖、β鎖およびγ鎖の含量比を調節することができる。
【0096】
前記製造方法は、（ｂ）前記真皮サンプルにおいて、前記タンパク分解酵素を不活性化するステップをさらに含むことができる。
【0097】
タンパク分解酵素を不活性化するステップは、タンパク分解酵素が処理された真皮サンプルに塩基性溶液（例えば、水酸化ナトリウム溶液）を添加してタンパク分解酵素を不活性化するものであってもよい。一実施形態により、前記タンパク分解酵素を不活性化するステップを行うと、β鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも高い本発明のアテロコラーゲンが得られることを確認した。
【0098】
タンパク分解酵素を不活性化するステップは、１℃～１０℃、１℃～８℃、１℃～５℃、１℃～４℃で行うことができる。
【0099】
タンパク分解酵素を不活性化するステップは、タンパク分解酵素が処理された真皮サンプルに塩基性溶液を添加して、ｐＨが８～１２、８～１１、８～１０または８～１０になるように調整するものであってもよい。
【0100】
水酸化ナトリウム溶液は、１～２８Ｍ、１～２５Ｍ、１～２０Ｍ、１～１５Ｍまたは１～１０Ｍであってもよい。
【0101】
前記製造方法は、（ｃ）前記タンパク分解酵素が不活性化された試料に酸性溶液を処理し、試料のｐＨを３～４に調整するｐＨ調整ステップをさらに含むことができる。
【0102】
このように、本発明のアテロコラーゲンは、前述のタンパク分解酵素を不活性化するステップ及びｐＨ調整ステップをすべて含む方法により製造することによって、α鎖、β鎖およびγ鎖の含量比を調節することができる。
【0103】
前記製造方法は、（ｄ）前記ｐＨが調整された真皮試料の上澄液に塩化ナトリウム溶液を添加し、沈殿物を得るステップをさらに含むことができる。
【0104】
前記真皮試料の上澄液は、脂肪または不純物が除去されたものであってもよい。
【0105】
沈殿物を得るステップにおいて、前記上澄液は、ｐＨが３～４に調整された試料を遠心分離して収集したものであり、遠心分離によって脂肪および不純物が除去されたものであってもよい。
【0106】
前記製造方法は、（ｅ）前記沈殿物を洗浄及び／又は濾過するステップをさらに含むことができる。前記濾過するステップによって、より高純度の精製アテロコラーゲンを得ることができる。
【0107】
前記製造方法によって得られたアテロコラーゲン及び／又は精製アテロコラーゲンは、凍結乾燥して保存することができる。
【0108】
一実施形態によれば、本発明のアテロコラーゲンは、前述の方法で製造されたアテロコラーゲンまたは精製アテロコラーゲンを酸に溶解した後、緩衝液を添加して透析濾過して得られたアテロコラーゲン分散液であってもよい。
【0109】
一実施形態によれば、本発明のアテロコラーゲンは、前述の方法で製造された後、凍結乾燥して保存されたアテロコラーゲンを酸に溶解した後、緩衝液を添加して透析濾過して得られたアテロコラーゲン分散液であってもよい。
【0110】
一実施形態によれば、本発明のアテロコラーゲンは、豚皮を切片化するステップと、豚皮から真皮を得るステップと、得られた真皮に酢酸を添加して均質化するステップと、均質化した真皮サンプルにペプシンを処理するステップと、真皮サンプル中でペプシンを不活性化するステップと、ペプシンが不活性化されたサンプルのｐＨを調整するステップと、ｐＨが調整された真皮サンプルから脂肪や不純物が除去された上澄液を収集するステップと、収集した上澄液に塩化ナトリウム溶液を加え、塩析して沈殿物を得るステップと、得られた沈殿物をエタノールで洗浄するステップと、洗浄された沈殿物を溶媒に溶かして濾過するステップとを含む方法により製造することができる（図４を参照）。
【0111】
さらに、本発明は、アテロコラーゲンを含む薬物送達体を提供する。
【0112】
本発明の薬物送達体は、前述のアテロコラーゲンと、前記アテロコラーゲンに担持された生理活性物質とを含む。本発明の薬物送達体は、生理活性物質の送達に使用することができる。
【0113】
本発明の薬物送達体は、様々な形態、例えば分散液、ゲル、粉末、タブレット、パッチ、フィルム、スポンジ、フォーム、マトリックスなどに製造することができる。
【0114】
本発明の薬物送達体におけるアテロコラーゲンは、固形のアテロコラーゲン構造体であってもよい。
【0115】
本発明の薬物送達体におけるアテロコラーゲンは、複数の空隙を有するアテロコラーゲン構造体であってもよい。
【0116】
本発明の薬物送達体は、薬物送達体に含まれるアテロコラーゲンのα１鎖、α２鎖、β鎖及びγ鎖の含量比によって物性（例えば、空隙の大きさ、空隙と空隙との間の開放程度、生分解速度、薬物担持量、薬物担持パターン、薬物放出速度、初期薬物放出速度、および薬物放出プロファイルなど）を調節することができる。
【0117】
前記物性は、本発明による薬物送達体の臨床適用状況（例えば、担持される薬物、移植される人体部位、適応症など）を考慮して最適な薬効を示すように調節することができる。
【0118】
本発明のアテロコラーゲンを用いて製造された複数の空隙を有するアテロコラーゲン構造体は、β鎖の含有量がα２鎖の含有量とほぼ同じかまたはα２鎖の含有量よりも小さい従来のアテロコラーゲンを用いて同様の方法で製造された構造体よりも空隙の平均直径が小さい（表３及び図２６を参照）。一実施形態によれば、前記空隙は、平均直径が１０μｍ～１００μｍ、２０μｍ～９０μｍ、３０μｍ～８０μｍ、または３μｍ～７５μｍであってもよい。本発明のアテロコラーゲンを用いて製造された、複数の空隙を有するアテロコラーゲン構造体は、両方が開いた空隙を有する構造体であってもよい。
【0119】
本発明のアテロコラーゲンを用いて製造された固形のアテロコラーゲン構造体は、β鎖の含有量がα２鎖の含有量とほぼ同じかまたはα２鎖の含有量よりも小さい従来のアテロコラーゲンを用いて同様の方法で製造された構造体よりも引張強度が小さい。一実施形態によれば、本発明のアテロコラーゲンを凍結乾燥して製造した横２０ｍｍ、縦３ｍｍ、厚さ２ｍｍのアテロコラーゲン構造体を対象として、構造体の長さ軸方向に１０．０ｍｍ／ｍｉｎの速度で均一に張力をかけて材料が切断されるまでの最大張力を測定する方法によって測定した引張強度は、０．０５～０．３０Ｎ／ｍｍ２であってもよい。例えば、本発明のアテロコラーゲンを凍結乾燥して製造した横２０ｍｍ、縦３ｍｍ、厚さ２ｍｍのアテロコラーゲン構造体を対象として、構造体の長さ軸方向に１０．０ｍｍ／ｍｉｎの速度で均一に張力をかけて材料が切断されるまでの最大張力を測定する方法によって測定した引張強度は、０．０５～０．３０Ｎ／ｍｍ２、０．１～０．２５Ｎ／ｍｍ２、または０．１５～０．２０Ｎ／ｍｍ２であってもよい。
【0120】
本発明のアテロコラーゲンは、β鎖に対するピークの面積（Ｓβ）がα２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）に等しいかまたはα２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）よりも小さい従来のアテロコラーゲンよりも粘性が高い。一実施形態によれば、本発明のアテロコラーゲンを用いて、コラーゲン濃度１．０％、ｐＨ６．８～７．４（中性）となるように製造したアテロコラーゲン溶液を対象として、回転型レオメーターを用いた分析方法により測定した粘度は１．０～３．０Ｐａ・ｓであってもよい。例えば、本発明のアテロコラーゲンを用いて、コラーゲン濃度１．０％、ｐＨ６．８～７．４（中性）となるように製造したアテロコラーゲン溶液を対象として、回転型レオメーターを用いた分析方法により測定した粘度は１．０～３．０Ｐａ・ｓ、１．５～２．５Ｐａ・ｓまたは１．８～２．０Ｐａ・ｓであってもよい。
【0121】
本発明のアテロコラーゲンから製造された固形のアテロコラーゲン構造体及び／又は固形のアテロコラーゲン構造体を含む薬物送達体は、高い粘性を示すので、体内に移植して容易に付着することができる。また、本発明のアテロコラーゲンから製造された固形のアテロコラーゲン構造体及び／又は固形のアテロコラーゲン構造体を含む薬物送達体は、高い粘性を示すので、体内に移植して容易に曲げることができ、屈曲のある領域（例えば、体内の移植部位）に容易に付着することができる。
【0122】
本発明のアテロコラーゲンを含む薬物送達体は、担持された生理活性物質の急激な初期放出を減少させるか、または遅すぎる初期放出による生理活性物質の効果の減少を調節することができる。本発明のアテロコラーゲンを含む薬物送達体は、担持された生理活性物質の放出が持続する時間を最適な範囲に調節することができる。
【0123】
本発明のアテロコラーゲンを用いて製造された薬物送達体は、β鎖に対するピークの面積（Ｓβ）がα２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）に等しいかまたはα２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）よりも小さい従来のアテロコラーゲンを用いて製造した薬物送達体に比べて、担持された生理活性物質の放出が遅すぎることを阻害することにより、生理活性物質の効能を増強することができる。これは、アテロコラーゲンのα２鎖に対するβ鎖の含有量が増加することで生分解速度が調節できるためであるとも考えられる。
【0124】
生理活性物質は公知の物質であってもよく、低分子化合物、高分子化合物、アプタマー、核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドなどであってもよい。
【0125】
生理活性物質は、抗癌剤、抗生剤などを含むことができるが、これらに限定されるものではなく、薬学的に許容可能な生理活性物質であれば種類に制限なく使用することができる。生理活性物質は１種を担持しても、１種以上を担持してもよい。
【0126】
抗癌剤は、アルキル化剤（Alkylating agents）として、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、イホスファミド（Ifosfamide）、プロカルバジン（Procarbazine）、ブスルファン（Busulfan）、カルムスチン（Carmustine）、ロムスチン（Lomustine）、ダカルバジン（Dacarbazine）、シスプラチン（Cisplatin）などを含むことができる。抗癌剤は、抗代謝物質（Antimetabolites）として、メトトレキサート（Methotrexate）、フルオロウラシル（5－Fluorouracil）、カペシタビン（Capecitabine）、シトシンアラビノシド（Cytosine Arabinoside）、ゲムシタビン（Gemcitabine）などを含むことができる。抗癌剤は、ビンカアルカロイド（Vinca Alkaloid）系の天然物質として、ビンブラスチン（Vinblastine）、ビンクリスチン（Vincristine）などを含むことができる。抗癌剤は、タキサン（Taxane）薬物として、パクリタキセル（Paclitaxel）、ドセタキセル（Docetaxel）などを含むことができる。エピポドフィロトキシン（Epipodophyllotoxin）薬物としては、エトポシド（Etoposide）などを含むことができる。抗癌剤は、カンプトテシン（Camptothecin）薬物として、トポテカン（Topotecan）、イリノテカン（Irinotecan）などを含むことができる。抗癌剤は、抗腫瘍性抗生物質（Antitumor Antibiotics）として、マイトマイシンＣ（Miitomycin－C）、ダウノルビシン（Daunorubicin）、ドキソルビシン（Doxorubicin）、ブレオマイシン（Bleomycin）などを含むことができる。抗癌剤は、酵素系薬物として、アスパラギナーゼ（L－asparaginase）などを含むことができる。抗癌剤は、ウレア（Urea）系薬物として、ヒドロキシウレア（Hydroxyurea）などを含むことができる。チロシンキナーゼ（Tyrosine Kinase）阻害剤としては、リツキシマブ（Rituximab）、トラスツズマブ（Trastuzumab）、イマチニブ（Imatinib）、ゲフィチニブ（Gefitinib）、エルロチニブ（Erlotinib）などを含むことができる。抗癌剤は、免疫抗癌剤として、オプジボ、キイトルーダ、ヤーボイ、テセントリク、キムリア、イエスカルタなどを含むことができる。抗癌剤は、薬学的に許容可能な塩または水和物の形態であってもよい。
【0127】
本発明の薬物送達体は、体内に移植または注入されるものであってもよい。
【0128】
本発明の薬物送達体は、手術後の開腹状態で手術部位に付着、塗布または挿入されるものであってもよい。一実施形態によれば、本発明の薬物送達体は、癌手術後の開腹状態で癌切除部位に付着、塗布または挿入されるものであってもよい。一実施形態によれば、本発明の薬物送達体は、癌手術後の開腹状態で残存癌部位に付着、塗布または挿入されるものであってもよい。
【0129】
本発明の薬物送達体は、皮下移植されるものであってもよい。本発明の薬物送達体は、皮膚、粘膜などに付着または塗布されるものであってもよい。本発明の薬物送達体は、口腔内、胃腸管内などに挿入されるものであってもよい。
【0130】
本発明の薬物送達体は、公知の薬物送達体の製造方法で製造されたものであってもよい。
【0131】
一実施形態によれば、本発明の薬物送達体は、以下のステップを含む方法で製造されたものであってもよい。
【0132】
本発明のアテロコラーゲンを酢酸ナトリウム溶液に０．５～３重量％添加し、ｐＨ２～４を維持しながら撹拌するステップと、
前記アテロコラーゲンが添加された酢酸ナトリウム溶液（以下、「アテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液」）に緩衝液を添加し、前記酢酸ナトリウム溶液を前記緩衝液で置換してアテロコラーゲン－緩衝液（以下、「アテロコラーゲン分散液」）を得るステップとを含むことができる。
前記アテロコラーゲンが添加された酢酸ナトリウム溶液（以下、「アテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液」）に緩衝液を添加し、前記酢酸ナトリウム溶液を前記緩衝液で置換してアテロコラーゲン－緩衝液（以下、「アテロコラーゲン分散液」）を得るステップとを含むことができる。
【0133】
前記薬物送達体を製造する方法は、前述のステップで得られた前記アテロコラーゲン分散液に生理活性物質を分散させるステップをさらに含むことができる。
【0134】
前記緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline、PBS）であってもよい。
【0135】
前記アテロコラーゲン分散液を得るステップにおいて、前記緩衝液は、ミニメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置（Minimate（登録商標）TFF system、PALL）を用いてアテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液に添加し、ダイアフィルトレーション （diafiltration）過程によって前記酢酸ナトリウム溶液が前記緩衝液で置換されるものであってもよい。
【0136】
図５は、ミニメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置（Minimate TFF system）でアテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液をアテロコラーゲン－緩衝液で置換する方法の模式図である。
【0137】
本発明は、前述のアテロコラーゲンを含む癌転移抑制剤を提供する。
【0138】
本発明の癌転移抑制剤は、前述のアテロコラーゲンと、前記アテロコラーゲンに担持された抗癌剤とを含むものであってもよい。
【0139】
前記抗癌剤は、低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質またはアプタマーであってもよい。抗癌剤については前述の通りであるので、具体的な内容を省略する。
【0140】
前記癌は、膵臓癌、乳癌、肝癌、頭頸部癌、大腸癌、卵巣癌または膠芽細胞腫であってもよい。
【0141】
癌の転移は、癌細胞が組織に浸潤して発生するものであり、タンパク質の分解に必須となる酵素であるマトリックス・メタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase、MMP）の中でも特にＭＭＰ－２とＭＭＰ－９により細胞外マトリックスと基底膜が分解されることにより、細胞の浸潤が起こることが知られている（図６の上図を参照）。
【0142】
前述のように、β鎖の含有量がα２鎖よりも高い本発明のアテロコラーゲンを癌組織に移植すると、転移抑制効果が示されるが、これはＭＭＰ－２とＭＭＰ－９が本発明のアテロコラーゲンを認識及び分解することにより、相対的に癌疾患を有した個体の体内に存在する細胞外マトリックスと基底膜が分解されないためであると言える（図６を参照）。また、本発明のアテロコラーゲンがＭＭＰ－２とＭＭＰ－９により認識および分解されることにより、これに担持されている生理活性物質（例えば、抗癌剤）が放出され、癌細胞が死滅する効果が示され得る。
【0143】
一方、β鎖の含有量がα２鎖と同じかまたは小さいアテロコラーゲン（比較例）は、癌組織に移植しても転移抑制効果が示されないが、これはＭＭＰ－２とＭＭＰ－９が、β鎖の含有量がα２鎖と同じかまたは小さいアテロコラーゲンを認識および分解できず、癌疾患を有した個体の体内に存在する細胞外マトリックスと基底膜を分解するためであると言える（図７を参照）。
【実施例】
【0144】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明することとする。
【0145】
【0146】
（１）ステップ：豚皮の準備および切片化のステップ
豚皮を水道水で３回洗浄し、一次精製水で３回洗浄した後、２ｋｇ（２０ｃｍ×２０ｃｍ）に分けて－２０℃の冷凍庫に保存した。冷凍した豚皮を４℃で２時間静置して解凍した後、１．５ｃｍ×８ｃｍの大きさに切断し、０．５Ｍ酢酸を５Ｌ加えて一晩静置し、豚皮が膨潤することを確認した。
豚皮を水道水で３回洗浄し、一次精製水で３回洗浄した後、２ｋｇ（２０ｃｍ×２０ｃｍ）に分けて－２０℃の冷凍庫に保存した。冷凍した豚皮を４℃で２時間静置して解凍した後、１．５ｃｍ×８ｃｍの大きさに切断し、０．５Ｍ酢酸を５Ｌ加えて一晩静置し、豚皮が膨潤することを確認した。
【0147】
（２）ステップ：真皮を得るステップ
膨潤した豚皮を取り出し、豚皮の表皮層及び脂肪層をナイフを用いて除去する真皮作業を行い、表皮層及び脂肪層が除去された組織（真皮）を１．５ｃｍ×１．５ｃｍの大きさに切断した。真皮に新しい０．５Ｍ酢酸をさらに５Ｌ添加し、数時間静置した後、ふるいを用いて真皮のみを濾過回収した。精製水１０Ｌを用いて真皮を洗浄した。洗浄過程を合計５回繰り返した。洗浄を終えた真皮にエタノール２０Ｌを加えた後、４℃で一晩攪拌した。一晩攪拌を終えた後、真皮のみを回収し、新しいエタノール２０Ｌを加え、さらに４℃で１時間攪拌した。ふるいを用いて真皮のみを回収し、１時間程度静置してエタノールを除去した。このようにして脂肪が除去された真皮を適当な重量（２５０ｇ）に小分けして－８０℃の冷凍庫に保存した。
膨潤した豚皮を取り出し、豚皮の表皮層及び脂肪層をナイフを用いて除去する真皮作業を行い、表皮層及び脂肪層が除去された組織（真皮）を１．５ｃｍ×１．５ｃｍの大きさに切断した。真皮に新しい０．５Ｍ酢酸をさらに５Ｌ添加し、数時間静置した後、ふるいを用いて真皮のみを濾過回収した。精製水１０Ｌを用いて真皮を洗浄した。洗浄過程を合計５回繰り返した。洗浄を終えた真皮にエタノール２０Ｌを加えた後、４℃で一晩攪拌した。一晩攪拌を終えた後、真皮のみを回収し、新しいエタノール２０Ｌを加え、さらに４℃で１時間攪拌した。ふるいを用いて真皮のみを回収し、１時間程度静置してエタノールを除去した。このようにして脂肪が除去された真皮を適当な重量（２５０ｇ）に小分けして－８０℃の冷凍庫に保存した。
【0148】
（３）ステップ：真皮を均質化するステップ
冷凍保存した真皮（２５０ｇ）に０．５Ｍ酢酸を０．６２５Ｌ加えた後、３０分間静置して解凍した。このとき、０．５Ｍ酢酸の体積は真皮１００ｇ当たり０．２５Ｌであることが好ましい。ふるいを用いて、解凍された真皮のみを回収し、１時間程度静置して０．５Ｍ酢酸を除去した。下記の均質化ステップは、４℃で行った。２５０ｇの真皮と三次蒸留水２Ｌをミキサーに入れて２分間粉砕した後、さらに精製水２Ｌを加えて２分間粉砕した。粉砕した組織に０．５Ｍ酢酸を４Ｌ加えた。このとき、０．５Ｍ酢酸の体積は真皮２５０ｇ当たり４Ｌであることが好ましい。さらにホモジナイザー（Homogenizer）を用いて組織を３分間均質化した。均質化した組織に、さらに０．５Ｍ酢酸を４．５Ｌ添加した。攪拌機を用いて攪拌しながらｐＨ２．５以下であるかを確認し、ｐＨ２．５以上の場合は少量の４Ｍ塩酸溶液でｐＨを調整した。攪拌機を用いて３時間低速攪拌した。
冷凍保存した真皮（２５０ｇ）に０．５Ｍ酢酸を０．６２５Ｌ加えた後、３０分間静置して解凍した。このとき、０．５Ｍ酢酸の体積は真皮１００ｇ当たり０．２５Ｌであることが好ましい。ふるいを用いて、解凍された真皮のみを回収し、１時間程度静置して０．５Ｍ酢酸を除去した。下記の均質化ステップは、４℃で行った。２５０ｇの真皮と三次蒸留水２Ｌをミキサーに入れて２分間粉砕した後、さらに精製水２Ｌを加えて２分間粉砕した。粉砕した組織に０．５Ｍ酢酸を４Ｌ加えた。このとき、０．５Ｍ酢酸の体積は真皮２５０ｇ当たり４Ｌであることが好ましい。さらにホモジナイザー（Homogenizer）を用いて組織を３分間均質化した。均質化した組織に、さらに０．５Ｍ酢酸を４．５Ｌ添加した。攪拌機を用いて攪拌しながらｐＨ２．５以下であるかを確認し、ｐＨ２．５以上の場合は少量の４Ｍ塩酸溶液でｐＨを調整した。攪拌機を用いて３時間低速攪拌した。
【0149】
（４）ステップ：均質化した真皮サンプルにペプシンを処理するステップ
以下のペプシンを処理するステップでは、４℃で真皮１００ｇ当たり１．５×１０７ｕｎｉｔのペプシンを添加し、真皮サンプルと処理したペプシンとがよく混合されるように４℃で一晩低速撹拌した。
以下のペプシンを処理するステップでは、４℃で真皮１００ｇ当たり１．５×１０７ｕｎｉｔのペプシンを添加し、真皮サンプルと処理したペプシンとがよく混合されるように４℃で一晩低速撹拌した。
【0150】
（５）ステップ：ペプシンを不活性化するステップ
以下のペプシンを不活性化するステップは、４℃で行った。ペプシンを処理したサンプルに１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて撹拌し、ｐＨが８～９になるように調整し、さらに１０分間撹拌してペプシンを不活性化した。
以下のペプシンを不活性化するステップは、４℃で行った。ペプシンを処理したサンプルに１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて撹拌し、ｐＨが８～９になるように調整し、さらに１０分間撹拌してペプシンを不活性化した。
【0151】
（６）ステップ：ｐＨを調整するステップ
塩基処理によるペプシンの不活性化後、４Ｍ塩酸溶液を加えて撹拌し、ｐＨ３．４になるように調整し、さらに１０分間撹拌した。
塩基処理によるペプシンの不活性化後、４Ｍ塩酸溶液を加えて撹拌し、ｐＨ３．４になるように調整し、さらに１０分間撹拌した。
【0152】
（７）ステップ（下記の（７－１）ステップ及び（７－２）ステップを含む）：ｐＨが調整された真皮サンプルの上澄液を収集して塩析するステップ
（７－１）ステップ：ｐＨが調整されたサンプルを遠心分離機を用いて４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液の表面の脂肪層を除去して残りの上澄液を収集した。脂肪層が除去された上澄液をふるいに更に一回濾過して上澄液のみを収集した。
（７－２）ステップ：最終的に得られた上澄液に５Ｍ塩化ナトリウム溶液をゆっくり添加し、４℃で１５分間攪拌した後、４℃で２４時間または一晩静置して塩析した。このとき、５Ｍ塩化ナトリウム溶液の体積は、上澄液の重量１００ｇ当たり１６．３ｍｌであることが好ましい。塩析後、遠心分離機を用いて４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上澄液を除去して沈殿物を得た。
（７－１）ステップ：ｐＨが調整されたサンプルを遠心分離機を用いて４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄液の表面の脂肪層を除去して残りの上澄液を収集した。脂肪層が除去された上澄液をふるいに更に一回濾過して上澄液のみを収集した。
（７－２）ステップ：最終的に得られた上澄液に５Ｍ塩化ナトリウム溶液をゆっくり添加し、４℃で１５分間攪拌した後、４℃で２４時間または一晩静置して塩析した。このとき、５Ｍ塩化ナトリウム溶液の体積は、上澄液の重量１００ｇ当たり１６．３ｍｌであることが好ましい。塩析後、遠心分離機を用いて４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離後、上澄液を除去して沈殿物を得た。
【0153】
（８）ステップ（下記の（８－１）ステップ及び（８－２）ステップを含む）：沈殿物を洗浄するステップ
（８－１）ステップ：塩析ステップで得られた沈殿物に１００ｇ当たり１Ｌのエタノールを加えた後、４℃の条件で一晩撹拌して一次洗浄を行った。遠心分離機を用いて、４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離を行った。
（８－２）ステップ：遠心分離後に得られた沈殿物に、さらに１００ｇ当たり１Ｌのエタノールを加えた後、４℃の条件で６時間撹拌して二次洗浄を行った。遠心分離機を用いて、４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離を行い、生成物を得た。
（８－１）ステップ：塩析ステップで得られた沈殿物に１００ｇ当たり１Ｌのエタノールを加えた後、４℃の条件で一晩撹拌して一次洗浄を行った。遠心分離機を用いて、４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離を行った。
（８－２）ステップ：遠心分離後に得られた沈殿物に、さらに１００ｇ当たり１Ｌのエタノールを加えた後、４℃の条件で６時間撹拌して二次洗浄を行った。遠心分離機を用いて、４℃の条件で１０分間７８００ｒｐｍで遠心分離を行い、生成物を得た。
【0154】
２）実施例２
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに生成物を得た。
【0155】
３）実施例３
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに生成物を得た。
【0156】
４）実施例４
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップ（すなわち、（８－１）及び（８－２）ステップ）を行わずに生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップ（すなわち、（８－１）及び（８－２）ステップ）を行わずに生成物を得た。
【0157】
５）実施例５
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに生成物を得た。
【0158】
６）実施例６
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
【0159】
７）実施例７
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
【0160】
８）実施例８
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
【0161】
９）実施例９
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
【0162】
１０）実施例１０
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
【0163】
１１）実施例１１
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行って生成物を得た。
【0164】
１２）実施例１２
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を３時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を３時間行って生成物を得た。
【0165】
１３）実施例１３
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４．５時間行って生成物を得た。
【0166】
１４）実施例１４
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１１．５時間行って生成物を得た。
【0167】
１５）実施例１５
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で１．５時間行って生成物を得た。
【0168】
１６）実施例１６
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行って生成物を得た。
【0169】
１７）実施例１７
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行って生成物を得た。
【0170】
１８）実施例１８
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0171】
１９）実施例１９
実施例１６と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１６と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0172】
２０）実施例２０
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0173】
２１）実施例２１
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を０．２５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を０．２５時間行って生成物を得た。
【0174】
２２）実施例２２
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１．５時間行って生成物を得た。
【0175】
２３）実施例２３
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１１．４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１１．４時間行って生成物を得た。
【0176】
２４）実施例２４
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１４．２時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１４．２時間行って生成物を得た。
【0177】
２５）実施例２５
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0178】
２６）実施例２６
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行って生成物を得た。
【0179】
２７）実施例２７
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行って生成物を得た。
【0180】
２８）実施例２８
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行って生成物を得た。
【0181】
２９）実施例２９
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0182】
３０）実施例３０
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0183】
３１）実施例３１
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0184】
３２）実施例３２
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を０．２５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を０．２５時間行って生成物を得た。
【0185】
３３）実施例３３
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１．５時間行って生成物を得た。
【0186】
３４）実施例３４
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１１．４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１１．４時間行って生成物を得た。
【0187】
３５）実施例３５
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１４．２時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１４．２時間行って生成物を得た。
【0188】
３６）実施例３６
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）でペプシンを０．７５×１０７ｕｎｉｔ添加し、前記（４）ステップを１．５時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0189】
３７）実施例３７
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
【0190】
３８）実施例３８
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
【0191】
３９）実施例３９
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
【0192】
４０）実施例４０
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0193】
４１）実施例４１
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0194】
４２）実施例４２
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0195】
４３）実施例４３
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で８時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で８時間行って生成物を得た。
【0196】
４４）実施例４４
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で８時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で８時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
【0197】
４５）実施例４５
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７－２）ステップ及び前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７－２）ステップ及び前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行って生成物を得た。
【0198】
４６）実施例４６
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を５時間行って生成物を得た。
【0199】
４７）実施例４７
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１０時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１０時間行って生成物を得た。
【0200】
４８）実施例４８
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１２．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１２．５時間行って生成物を得た。
【0201】
４９）実施例４９
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１４時間行って生成物を得た。
【0202】
５０）実施例５０
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１５時間行って生成物を得た。
【0203】
５１）実施例５１
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を４℃で１．５時間およびＲＴ（Room temperature）で２．６８時間行い、前記（７）ステップで前記塩析を１７時間行って生成物を得た。
【0204】
５２）比較例１
市販のアテロコラーゲンを比較例１として用意した（Ｍａｔｒｉｘｅｎ－ＰＳＰ、ＳＫ バイオランド社製）。
市販のアテロコラーゲンを比較例１として用意した（Ｍａｔｒｉｘｅｎ－ＰＳＰ、ＳＫ バイオランド社製）。
【0205】
５３）比較例２
市販のアテロコラーゲンを比較例２として用意した（ＣＯＬＴＩＸ（登録商標）Ｔｅｎｄｏｒｅｇｅｎ、ユビオシス社製）。
市販のアテロコラーゲンを比較例２として用意した（ＣＯＬＴＩＸ（登録商標）Ｔｅｎｄｏｒｅｇｅｎ、ユビオシス社製）。
【0206】
５４）比較例３
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに生成物を得た。
【0207】
５５）比較例４
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を２４時間行って生成物を得た。
【0208】
５６）比較例５
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１３時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）を１３時間行って生成物を得た。
【0209】
５７）比較例６
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
【0210】
５８）比較例７
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（６）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
【0211】
５９）比較例８
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（７）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
【0212】
６０）比較例９
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
【0213】
６１）比較例１０
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（８－２）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
【0214】
６２）比較例１１
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で２０時間行って生成物を得た。
【0215】
６３）比較例１２
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で３時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で３時間行って生成物を得た。
【0216】
６４）比較例１３
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で４．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で４．５時間行って生成物を得た。
【0217】
６５）比較例１４
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で１１．５時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で１１．５時間行って生成物を得た。
【0218】
６６）比較例１５
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で１３時間行って生成物を得た。
実施例１と同様にして製造する一方、前記（５）～（８）ステップを行わずに、前記（４）ステップ（ペプシンを処理するステップ）をＲＴ（Room temperature）で１３時間行って生成物を得た。
【0219】
２．ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造
（１）高純度のアテロコラーゲンの製造
前記「１．アテロコラーゲン（Atelocollagen, AC）の製造」で製造された実施例及び比較例で得られたものに０．０２Ｍウレア溶液を加えた後、４℃の条件で一晩攪拌した。このとき、０．０２Ｍウレア溶液の体積は、アテロコラーゲン１００ｇ当たり１．４Ｌであることが好ましい。セントラメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置（Centramate Tangential Flow Filtration（TFF）system）またはミニメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置（Minimate TFF system）を用いた前記アテロコラーゲン溶液の限外濾過（Ultrafiltration）およびダイアフィルトレーション（Diafiltration）過程を行うことにより、高純度のアテロコラーゲンを得た。得られたアテロコラーゲン溶液に０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて攪拌し、ｐＨ７とした。このようにして製造した中性のアテロコラーゲンをジップロック（登録商標）に、薄く平らに小分けし、－８０℃の超低温冷凍庫に保存した。凍結乾燥機の予備凍結（－４０℃）を最低１時間以上行った後、－８０℃の超低温冷凍庫に保存中のアテロコラーゲンを凍結乾燥機に入れて凍結乾燥を行った。凍結乾燥が完了したアテロコラーゲンは、適当な大きさに切って真空包装した後、冷蔵保存した。
（１）高純度のアテロコラーゲンの製造
前記「１．アテロコラーゲン（Atelocollagen, AC）の製造」で製造された実施例及び比較例で得られたものに０．０２Ｍウレア溶液を加えた後、４℃の条件で一晩攪拌した。このとき、０．０２Ｍウレア溶液の体積は、アテロコラーゲン１００ｇ当たり１．４Ｌであることが好ましい。セントラメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置（Centramate Tangential Flow Filtration（TFF）system）またはミニメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置（Minimate TFF system）を用いた前記アテロコラーゲン溶液の限外濾過（Ultrafiltration）およびダイアフィルトレーション（Diafiltration）過程を行うことにより、高純度のアテロコラーゲンを得た。得られたアテロコラーゲン溶液に０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えて攪拌し、ｐＨ７とした。このようにして製造した中性のアテロコラーゲンをジップロック（登録商標）に、薄く平らに小分けし、－８０℃の超低温冷凍庫に保存した。凍結乾燥機の予備凍結（－４０℃）を最低１時間以上行った後、－８０℃の超低温冷凍庫に保存中のアテロコラーゲンを凍結乾燥機に入れて凍結乾燥を行った。凍結乾燥が完了したアテロコラーゲンは、適当な大きさに切って真空包装した後、冷蔵保存した。
【0220】
（２）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造
三次滅菌水５５ｍｌと９９％以上の純度の酢酸（Acetic acid）溶液４５ｍｌに酢酸ナトリウム（Sodium acetate, CH3CO2Na）２．４ｇを溶かして、酢酸ナトリウム溶液（0.3M Sodium acetate, 45% Acetic acid）を製造した。その後、ｐＨ測定器（pH meter）を用いて、酢酸ナトリウム溶液（0.3M Sodium acetate、45% Acetic acid）のｐＨが３．０となるように滴定した。攪拌機を用いて酢酸ナトリウム溶液を攪拌しながら、前記「２．（１）高純度のアテロコラーゲンの製造」で製造された高純度の実施例及び比較例のものそれぞれを０．５～３重量％添加し、一晩攪拌してアテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液を得た。
三次滅菌水５５ｍｌと９９％以上の純度の酢酸（Acetic acid）溶液４５ｍｌに酢酸ナトリウム（Sodium acetate, CH3CO2Na）２．４ｇを溶かして、酢酸ナトリウム溶液（0.3M Sodium acetate, 45% Acetic acid）を製造した。その後、ｐＨ測定器（pH meter）を用いて、酢酸ナトリウム溶液（0.3M Sodium acetate、45% Acetic acid）のｐＨが３．０となるように滴定した。攪拌機を用いて酢酸ナトリウム溶液を攪拌しながら、前記「２．（１）高純度のアテロコラーゲンの製造」で製造された高純度の実施例及び比較例のものそれぞれを０．５～３重量％添加し、一晩攪拌してアテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液を得た。
【0221】
アテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液をアテロコラーゲン－リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline, PBS）溶液で置換するために、ミニメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置（Minimate（登録商標）Tangential Flow Filter system, PALL）を用いてダイアフィルトレーション（Diafiltration）を行った。具体的には、連続式定量送液ポンプ（Peristaltic pump、プングリム社製）にメンブレン（Minimate TFF capsule、PALL）を取り付けてミニメイト・タンジェンシャルフロー濾過装置 （Minimate（登録商標）Tangential Flow Filter system）を準備した。このとき、メンブレンの空隙の大きさは１００ｋＤａであることが好ましい。準備したシステムにアテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液とリン酸緩衝生理食塩水リザーバー（PBS reservoir）を接続し（図５を参照）、酢酸ナトリウム溶液を濾過物チューブ（Filtrate tube）を介して、残りの溶液を透過残留物チューブ（Retentate tube）を介して移動させた。１Ｘ ＰＢＳ溶液をＰＢＳリザーバー（PBS reservoir）に添加してアテロコラーゲン溶液の水位を一定に維持し、透析濾過を行った。最初に供給したアテロコラーゲン－酢酸ナトリウム溶液の１０倍に相当する体積の１Ｘ ＰＢＳ溶液を用いて透析濾過を継続し、これによりバッファー交換（Buffer exchange）を行った。バッファー交換が完了した後、濾過物チューブ（Filtrate tube）を通して透過されて出てくる溶液のｐＨが中性ｐＨであるかを確認した。バッファー交換が完了したｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液を回収して４℃で冷蔵保存した。
【0222】
（３）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液中のアテロコラーゲンの純度の確認
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動法を用いて、前記「２．（２）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造」で製造されたアテロコラーゲン溶液中のアテロコラーゲンの純度を確認した。具体的には、前記「２．（１）高純度のアテロコラーゲンの製造」で製造された実施例１を０．５Ｍ酢酸溶液に０．３重量％で溶解して対照群として使用した。前記「２．（２）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造」で製造されたアテロコラーゲン溶液（ｐＨ中性のアテロコラーゲン・サンプル）を０．５Ｍ酢酸溶液に１０倍希釈し、アテロコラーゲン分析サンプルを作製した。５Ｘサンプルバッファーが１Ｘになるようにサンプルと混合し、８５℃で５分間加熱した。６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに準備したサンプルをロードし、電気泳動した。電気泳動は、９０Ｖで３０分間展開した後、電圧を１２０Ｖに上げ、ゲルマーカー（gel marker）のサイズのうち、７５ｋＤａがゲルの下端に下がるまで展開した。ゲル中でサンプルがよく分離されると、ゲルを取り出してCoomassie Brilliant Blue R250 Staining Solution（BIO－RAD）によって常温で２時間または４℃で１６時間以上染色した。ロッカー（Rocker）の上で染色したゲルをデステイン溶液（De-staining solution）で洗浄し、アテロコラーゲンバンドがよく見えるようにした。前記の分析方法により、前記「２．（２）」で製造されたｐＨ中性のアテロコラーゲン・サンプルの純度を確認することができた（図８を参照）。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動法を用いて、前記「２．（２）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造」で製造されたアテロコラーゲン溶液中のアテロコラーゲンの純度を確認した。具体的には、前記「２．（１）高純度のアテロコラーゲンの製造」で製造された実施例１を０．５Ｍ酢酸溶液に０．３重量％で溶解して対照群として使用した。前記「２．（２）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造」で製造されたアテロコラーゲン溶液（ｐＨ中性のアテロコラーゲン・サンプル）を０．５Ｍ酢酸溶液に１０倍希釈し、アテロコラーゲン分析サンプルを作製した。５Ｘサンプルバッファーが１Ｘになるようにサンプルと混合し、８５℃で５分間加熱した。６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに準備したサンプルをロードし、電気泳動した。電気泳動は、９０Ｖで３０分間展開した後、電圧を１２０Ｖに上げ、ゲルマーカー（gel marker）のサイズのうち、７５ｋＤａがゲルの下端に下がるまで展開した。ゲル中でサンプルがよく分離されると、ゲルを取り出してCoomassie Brilliant Blue R250 Staining Solution（BIO－RAD）によって常温で２時間または４℃で１６時間以上染色した。ロッカー（Rocker）の上で染色したゲルをデステイン溶液（De-staining solution）で洗浄し、アテロコラーゲンバンドがよく見えるようにした。前記の分析方法により、前記「２．（２）」で製造されたｐＨ中性のアテロコラーゲン・サンプルの純度を確認することができた（図８を参照）。
【0223】
３．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によるアテロコラーゲンの鎖含有量の比較
（１）ＨＰＬＣ分析におけるアテロコラーゲンの各鎖の分布の確認
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）機器を用いてアテロコラーゲン・サンプルを分取（prep）した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析して、ＨＰＬＣ分析におけるアテロコラーゲン鎖の分布を確認した。
（１）ＨＰＬＣ分析におけるアテロコラーゲンの各鎖の分布の確認
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）機器を用いてアテロコラーゲン・サンプルを分取（prep）した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析して、ＨＰＬＣ分析におけるアテロコラーゲン鎖の分布を確認した。
【0224】
アテロコラーゲンを含む０．５Ｍ酢酸溶液を５．０μｇ／ｕｌの濃度で製造し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ装置を使用して分析した。検出器としてはＵＶ検出器（UV detector）（２２０ｎｍ）を使用した。カラムは逆相カラムＲＰ Ｃ１８カラム、移動相はバッファーＡ：０．１％ ＴＦＡ ｉｎ ＤＷ、バッファーＢ：０．１％ ＴＦＡ ｉｎ ＡＣＮを用いてｇｒａｄｉｅｎｔに設定し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎとした。まず、前記アテロコラーゲン・サンプルを３０μｌ注入（injection）し、クロマトグラムから４つのアテロコラーゲンピークを確認した。アテロコラーゲン・サンプルを１００μｌ注入し、クロマトグラムで滞留時間が１１分～１４．５分であるピークのみを分取し、分取した分画（fraction）を再分析してピーク分離度を確認した。分離度が確認された分画のうち、アテロコラーゲンのメインピークのみを収集し、ピークごとにＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。
【0225】
分析の結果、溶出時間が最も小さいピーク１はγ鎖に対するピーク、２番目に小さいピーク２はα１鎖に対するピーク、３番目に小さいピーク３はβ鎖に対するピーク、最も大きいピーク４はα２鎖に対するピークであることが確認できた（図９を参照）。
【0226】
（２）ＨＰＬＣ分析によるアテロコラーゲンの鎖含有量の比較
分析試料は、前記「２．（１）高純度のアテロコラーゲンの製造」で製造された高純度の実施例及び比較例のそれぞれを０．５Ｍ酢酸溶液に溶かして２．５μｇ／ｕｌの濃度で製造した。
分析試料は、前記「２．（１）高純度のアテロコラーゲンの製造」で製造された高純度の実施例及び比較例のそれぞれを０．５Ｍ酢酸溶液に溶かして２．５μｇ／ｕｌの濃度で製造した。
【0227】
分析条件としては、アジレント（Agilent）ＨＰＬＣ機器を使用し、検出器としては、ＵＶ検出器（２２０ｎｍ）を使用した。カラムは逆相カラムＲＰ Ｃ１８カラム、移動相はバッファーＡ：０．１％ ＴＦＡ ｉｎ Ｄ．Ｗ、バッファーＢ：０．１％ ＴＦＡ ｉｎ ＡＣＮを用いてｇｒａｄｉｅｎｔに設定し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎとした。
【0228】
実施例及び比較例を高速液体クロマトグラフィーで分析して各鎖に相当するピークを含む山の下の面積を測定したところ、実施例１～５１はβ鎖に対するピークの面積（Ｓβ）がα２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）よりも大きいことを確認した。これに対して、比較例１～１５は、β鎖に対するピークの面積（Ｓβ）がα２鎖に対するピークの面積（Ｓα２）と等しいか小さいことを確認した（図１０～図２４を参照）。すなわち、本発明のアテロコラーゲンは、従来の他のアテロコラーゲンとは異なり、β鎖の含有量がα２鎖よりも高くなっている。このような鎖含有量の差は、本発明のアテロコラーゲンの物性および効果に影響を及ぼし得る。
【0229】
より具体的には、市販のアテロコラーゲン（比較例１及び２）は、β鎖の含有量がα２鎖とほぼ等しいか、またはα２鎖に比べて小さくなっている。これに対して、本発明のアテロコラーゲンは、β鎖の含有量がα２鎖に比べて大きく、具体的にはα２鎖に対するβ鎖の含有量が１．１以上５以下であった（図１０～１１を参照）。
【0230】
また、ペプシンを不活性化するステップ（実施例１に記載の（５）ステップ）を行って製造したアテロコラーゲンは、そうでない場合に比べて、α２鎖に対するβ鎖の含有量が大きいことが確認できた（図１２～１３、１６、１９及び２４を参照）。
【0231】
ペプシンを不活性化するステップ（実施例１に記載の（５）ステップ）を行わなくても、ペプシンを処理するステップ（実施例１に記載の（４）ステップ）を４℃で１３時間未満行った場合には、α２鎖に対するβ鎖の含有量が大きいことが確認できた。これに対して、ペプシンを処理するステップを１３時間以上行った場合には、α２鎖の含有量がβ鎖よりも大きい結果を示した（図１４及び２２を参照）。
【0232】
ペプシンを不活性化するステップ（実施例１に記載の（５）ステップ）を行わなくても、ペプシンを処理するステップ（実施例１に記載の（４）ステップ）をＲＴで３時間未満行った場合には、α２鎖に対するβ鎖の含有量が高くなることが確認できた。これに対して、ペプシンを処理するステップをＲＴで３時間以上行った場合には、α２鎖の含有量がβ鎖よりも高い結果を示した（図１５、１７及び１９を参照）。
【0233】
また、前述の実施例及び比較例において、前記（１）ステップ～（８）ステップをすべて行って得られたアテロコラーゲン（実施例及び比較例）の各鎖含有量、およびβ鎖：α２鎖の割合を下記表２に示す。
【0234】
【表2】
【0235】
前記分析結果によると、ｉ）アテロコラーゲンの製造において、ペプシンを不活性化するステップ（実施例１に記載の（５）ステップ）及び／又はペプシンを不活性化した後にｐＨを調整するステップ（実施例１に記載の（６）ステップ）を含むか、または、ｉｉ）真皮にペプシンを処理するステップ（実施例１に記載の（４）ステップ）を特定の温度と反応時間（例えば、４℃で１３時間未満行うか、またはＲＴ（Room temperature）で３時間未満行う）の条件で行うことにより、α２鎖に対してβ鎖の含有量が高いアテロコラーゲンを製造することができる。上の結果により、アテロコラーゲンの製造過程において、特定ステップの実施有無またはペプシン処理条件（ペプシン処理時間、ペプシン処理温度など）によって、アテロコラーゲンのβ鎖：α２鎖の割合を調節できることを確認した。
【0236】
４．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によるアテロコラーゲンの鎖含有量の比較
前記「２．（３）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液中のアテロコラーゲンの純度の確認」方法と同様の方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）分析を行った。分析結果として得られたゲルの写真をＩｍａｇｅＪプログラムを用いて、相対的なｇｅｌ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを測定したところ、実施例１のβ鎖に対するバンドの厚さが、比較例１または２のβ鎖に対するバンドの厚さよりも顕著に厚いことを確認した。すなわち、比較例に比べて実施例のアテロコラーゲンのβ鎖の含有量がより大きいことを確認した（図２５参照）。
前記「２．（３）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液中のアテロコラーゲンの純度の確認」方法と同様の方法により、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）分析を行った。分析結果として得られたゲルの写真をＩｍａｇｅＪプログラムを用いて、相対的なｇｅｌ ｂａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙを測定したところ、実施例１のβ鎖に対するバンドの厚さが、比較例１または２のβ鎖に対するバンドの厚さよりも顕著に厚いことを確認した。すなわち、比較例に比べて実施例のアテロコラーゲンのβ鎖の含有量がより大きいことを確認した（図２５参照）。
【0237】
５．アテロコラーゲンの物性の分析
（１）固形のアテロコラーゲン構造体の製造
実施例及び比較例で製造された高純度のアテロコラーゲンをシリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、固形のアテロコラーゲン構造体を製造した。
（１）固形のアテロコラーゲン構造体の製造
実施例及び比較例で製造された高純度のアテロコラーゲンをシリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、固形のアテロコラーゲン構造体を製造した。
【0238】
具体的には、高純度のアテロコラーゲン溶液をシリコンモールドに一定量分注した。アテロコラーゲン溶液を分注したシリコンモールドを－２０℃で４時間以上一次凍結した。一次凍結が完了したサンプルをシリコンモールドから分離して滅菌ディッシュまたはプレートに移した後、－８０℃で２時間以上二次凍結した。凍結乾燥機のコールドトラップの温度が－８０℃になるように予備凍結を行った後、凍結乾燥機にアテロコラーゲンのサンプルを入れて１６時間以上凍結乾燥した。凍結乾燥した固形のアテロコラーゲン構造体は、４℃で冷蔵保存した。
【0239】
（２）走査電子顕微鏡（Scanning Electron Micro Scope, SEM）を用いたアテロコラーゲンの構造の観察
走査電子顕微鏡（Scanning Electron Micro Scope, SEM）を用いて、アテロコラーゲンのβ鎖及びα２鎖の割合によってアテロコラーゲンの構造が変化するかどうかを確認した。実施例１、実施例４２、実施例３１、比較例１及び比較例２のアテロコラーゲン溶液を凍結乾燥して、直径１０ｍｍ、高さ５ｍｍの円形サンプルを作製した。白金コート装置を用いて、製造されたサンプルの表面をコーティングした。その後、ＳＥＭチャンバーに入れて、１０．０～１５．０ｋＶの高電圧を加え、サンプルの上端（Surface）、側面（Cross）、下端（Bottom）を５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍の倍率で測定した。その後、同一倍率で製造したサンプルの空隙直径を測定し、空隙の平均直径および標準偏差を算出した。
走査電子顕微鏡（Scanning Electron Micro Scope, SEM）を用いて、アテロコラーゲンのβ鎖及びα２鎖の割合によってアテロコラーゲンの構造が変化するかどうかを確認した。実施例１、実施例４２、実施例３１、比較例１及び比較例２のアテロコラーゲン溶液を凍結乾燥して、直径１０ｍｍ、高さ５ｍｍの円形サンプルを作製した。白金コート装置を用いて、製造されたサンプルの表面をコーティングした。その後、ＳＥＭチャンバーに入れて、１０．０～１５．０ｋＶの高電圧を加え、サンプルの上端（Surface）、側面（Cross）、下端（Bottom）を５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍の倍率で測定した。その後、同一倍率で製造したサンプルの空隙直径を測定し、空隙の平均直径および標準偏差を算出した。
【0240】
測定の結果、実施例１、４２及び３１のアテロコラーゲン・サンプルは、いずれも両方が開いた空隙を含み、α２に対するβ鎖の含有量が高くなるほど空隙の平均直径が小さくなることを確認することができた（図２６及び表３を参照）。これに対して、比較例１はいずれか一方が塞いだ空隙、比較例２はいずれか一方が広く、もう一方が狭い空隙を含み、比較例１及び比較例２は空隙の平均直径が実施例に比べて顕著に大きな結果を示した。この結果は、β鎖とα２鎖の含量比によって物性が変わり得ることを示唆する。
【0241】
【表3】
【0242】
（３）アテロコラーゲンの引張強度の測定
アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によってアテロコラーゲンの強度が変化するかどうかを確認した。
実施例１及び３１のアテロコラーゲン溶液および比較例２のアテロコラーゲン溶液を凍結乾燥して、２０ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍサイズの引張強度試験用物質を製造した。引張圧縮試験機（ＭＣＴ－１１５０）を用いて、試験用物質の長さ軸方向に１０．０ｍｍ／ｍｉｎの速度で均一に張力をかけ、物質が切断されるまでの最大張力を測定し、引張強度（Maximum stress）および引張変形（Maximum tensile Strain）の値を算出した。β鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも大きい実施例と小さい比較例との間の引張強度および引張変形の値は有意な差を示した（表４、図２８～３０を参照）。
アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によってアテロコラーゲンの強度が変化するかどうかを確認した。
実施例１及び３１のアテロコラーゲン溶液および比較例２のアテロコラーゲン溶液を凍結乾燥して、２０ｍｍ×３ｍｍ×２ｍｍサイズの引張強度試験用物質を製造した。引張圧縮試験機（ＭＣＴ－１１５０）を用いて、試験用物質の長さ軸方向に１０．０ｍｍ／ｍｉｎの速度で均一に張力をかけ、物質が切断されるまでの最大張力を測定し、引張強度（Maximum stress）および引張変形（Maximum tensile Strain）の値を算出した。β鎖の含有量がα２鎖の含有量よりも大きい実施例と小さい比較例との間の引張強度および引張変形の値は有意な差を示した（表４、図２８～３０を参照）。
【0243】
【表4】
【0244】
（４）アテロコラーゲンの粘度の測定
アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によってアテロコラーゲンの粘度が変化するかどうかを確認した。
実施例１、実施例４２及び実施例３１のアテロコラーゲン溶液および比較例２のアテロコラーゲンをコラーゲン濃度１．０％、ｐＨ６．８～７．４（中性）となるように調製した。回転式レオメータ（ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．，ＡＲＥＳ－Ｇ２）を用いて、前記調製したアテロコラーゲン溶液の１０℃での粘度η（Ｐａ・ｓ）を測定した。剪断速度１（１／ｓ）の条件で実施例１は比較例２よりも高い粘度ηを有することが確認できた。同じ条件下で、実施例１、実施例４２及び実施例３１の粘度ηは、α２鎖の含有量に対するβ鎖の含有量の比が増加するほど多少減少した（表５参照）。
アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によってアテロコラーゲンの粘度が変化するかどうかを確認した。
実施例１、実施例４２及び実施例３１のアテロコラーゲン溶液および比較例２のアテロコラーゲンをコラーゲン濃度１．０％、ｐＨ６．８～７．４（中性）となるように調製した。回転式レオメータ（ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．，ＡＲＥＳ－Ｇ２）を用いて、前記調製したアテロコラーゲン溶液の１０℃での粘度η（Ｐａ・ｓ）を測定した。剪断速度１（１／ｓ）の条件で実施例１は比較例２よりも高い粘度ηを有することが確認できた。同じ条件下で、実施例１、実施例４２及び実施例３１の粘度ηは、α２鎖の含有量に対するβ鎖の含有量の比が増加するほど多少減少した（表５参照）。
【0245】
【表5】
【0246】
６．アテロコラーゲン薬物送達体の製造および物性の分析
（１）固形のアテロコラーゲン薬物送達体の製造
実施例及び比較例で製造された高純度のアテロコラーゲンと薬物を混合し、円形のシリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、薬物（ゲムシタビン又は［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）が担持された固形のアテロコラーゲン薬物送達体を製造した。［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］としては、［ＴＧＧ］４－ＴＴＧ－［ＴＧＧ］５配列（配列番号１）の５’末端に（Ｇｅｍ）２が結合した薬物を用いた（Ｇｅｍ：ゲムシタビン、（Ｇｅｍ）２： ２つのゲムシタビン）。
（１）固形のアテロコラーゲン薬物送達体の製造
実施例及び比較例で製造された高純度のアテロコラーゲンと薬物を混合し、円形のシリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、薬物（ゲムシタビン又は［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）が担持された固形のアテロコラーゲン薬物送達体を製造した。［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］としては、［ＴＧＧ］４－ＴＴＧ－［ＴＧＧ］５配列（配列番号１）の５’末端に（Ｇｅｍ）２が結合した薬物を用いた（Ｇｅｍ：ゲムシタビン、（Ｇｅｍ）２： ２つのゲムシタビン）。
【0247】
具体的には、高純度のアテロコラーゲンに薬物（例えば、ゲムシタビン又は［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）を添加した後、マルチミキサー（ＳＬＲＭ－３、ＭＹＬＡＢ）を用いて常温で３０分間均一に混合した。その後、アテロコラーゲン－薬物混合物を円形のシリコンモールドに一定量分注した（図３１の上の写真）。アテロコラーゲン－薬物混合物が分注された円形のシリコンモールドを－２０℃で４時間以上一次凍結した。一次凍結が完了したサンプルを円形のシリコンモールドから分離して滅菌ディッシュまたはプレートに移した後、－８０℃で２時間以上二次凍結した。凍結乾燥機のコールドトラップの温度が－８０℃になるように予備凍結した後、凍結乾燥機にアテロコラーゲン・サンプルを入れて１６時間以上凍結乾燥した（図３１の下左の写真）。凍結乾燥した固形のアテロコラーゲン薬物送達体を４℃で冷蔵保存した。
【0248】
（２）走査電子顕微鏡（Scanning Electron Micro Scope, SEM）を用いたアテロコラーゲン薬物送達体の構造の観察
走査電子顕微鏡（Scanning Electron Micro Scope, SEM）を用いて、アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によって、薬物が担持されたアテロコラーゲン薬物送達体の構造が変化するかどうかを確認した。実施例１、実施例４２、実施例３１、比較例１及び比較例２のアテロコラーゲン溶液と［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を混合した溶液を凍結乾燥して、直径１０ｍｍ、高さ５ｍｍの円形サンプルを製造した。白金コート装置を用いて、製造されたサンプルの表面をコーティングした。その後、ＳＥＭチャンバーに入れて１５．０ｋＶの高電圧を加え、サンプルの上端（Surface）、側面（Cross）、下端（Bottom）を５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍の倍率で測定した。その後、同一倍率で作製したサンプルの空隙直径を測定し、空隙の平均直径および標準偏差を算出した。
走査電子顕微鏡（Scanning Electron Micro Scope, SEM）を用いて、アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によって、薬物が担持されたアテロコラーゲン薬物送達体の構造が変化するかどうかを確認した。実施例１、実施例４２、実施例３１、比較例１及び比較例２のアテロコラーゲン溶液と［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を混合した溶液を凍結乾燥して、直径１０ｍｍ、高さ５ｍｍの円形サンプルを製造した。白金コート装置を用いて、製造されたサンプルの表面をコーティングした。その後、ＳＥＭチャンバーに入れて１５．０ｋＶの高電圧を加え、サンプルの上端（Surface）、側面（Cross）、下端（Bottom）を５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍の倍率で測定した。その後、同一倍率で作製したサンプルの空隙直径を測定し、空隙の平均直径および標準偏差を算出した。
【0249】
測定の結果、薬物が担持された実施例１のアテロコラーゲン・サンプルは、両方が開いた空隙を含み、α２に対するβ鎖の含有量が高くなるほど空隙の平均直径が小さくなることを確認することができた（図２７及び表６を参照）。これに対して、比較例１及び比較例２は、いずれか一方が広く、もう一方が狭い空隙を含んでいた。この結果は、β鎖とα２鎖の含量比によって物性が変わり得ることを示唆する。
【0250】
【表6】
【0251】
（３）アテロコラーゲン薬物送達体の薬物放出試験
アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によって、アテロコラーゲン薬物送達体の薬物放出パターンが変化するかどうかを確認した。
前記「６．（１）固形のアテロコラーゲン薬物送達体の製造」方法と同様にする一方、凍結乾燥が完了した後、アテロコラーゲン・サンプルをアクリルプレートを用いてパッチ型に圧着した（図３１の下右の写真）。１つのパッチ型アテロコラーゲン薬物送達体当たり、前記［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］２ｍｇが担持されるように製造した。より具体的には、実施例１、実施例４２及び実施例３１のアテロコラーゲン溶液と［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を混合した溶液を凍結乾燥して製造した直径１０ｍｍのパッチ型アテロコラーゲン薬物送達体を溶出液に入れた後、３７℃の条件で時間帯別に溶出する薬物を測定した。アテロコラーゲン薬物送達体から放出される［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］の濃度をＡｂｓ、２６０ｍｍでＵＶで測定したところ、β鎖の含有量が増加するほど薬物が徐々に放出されることを確認した（図３８参照）。
アテロコラーゲンのβ鎖とα２鎖の割合によって、アテロコラーゲン薬物送達体の薬物放出パターンが変化するかどうかを確認した。
前記「６．（１）固形のアテロコラーゲン薬物送達体の製造」方法と同様にする一方、凍結乾燥が完了した後、アテロコラーゲン・サンプルをアクリルプレートを用いてパッチ型に圧着した（図３１の下右の写真）。１つのパッチ型アテロコラーゲン薬物送達体当たり、前記［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］２ｍｇが担持されるように製造した。より具体的には、実施例１、実施例４２及び実施例３１のアテロコラーゲン溶液と［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を混合した溶液を凍結乾燥して製造した直径１０ｍｍのパッチ型アテロコラーゲン薬物送達体を溶出液に入れた後、３７℃の条件で時間帯別に溶出する薬物を測定した。アテロコラーゲン薬物送達体から放出される［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］の濃度をＡｂｓ、２６０ｍｍでＵＶで測定したところ、β鎖の含有量が増加するほど薬物が徐々に放出されることを確認した（図３８参照）。
【0252】
７．パッチ型アテロコラーゲン薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果
実施例１のアテロコラーゲンに薬物を担持したパッチ型薬物送達体と、比較例２のアテロコラーゲンに薬物を担持したパッチ型薬物送達体とで、薬物放出による癌細胞の死滅および転移抑制効果を比較した。
実施例１のアテロコラーゲンに薬物を担持したパッチ型薬物送達体と、比較例２のアテロコラーゲンに薬物を担持したパッチ型薬物送達体とで、薬物放出による癌細胞の死滅および転移抑制効果を比較した。
【0253】
実験の結果、実施例１のアテロコラーゲンで製造されたパッチ型薬物送達体は膵臓癌および転移抑制において優れた効果を示したが、比較例２のアテロコラーゲンで製造されたパッチ型薬物送達体は膵臓癌の抑制効果も低く、腹腔内の他の組織、すなわち肝臓、腎臓および腹膜などへの転移が起こったことを確認した。これは、癌転移を誘発するＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９が本発明のアテロコラーゲン（実施例）をよく認識することにより、本発明のアテロコラーゲン（実施例）で製造されたパッチ型薬物送達体が分解され、薬物がよく放出されるからであると考えられる。これに対して、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９が比較例のアテロコラーゲンをよく認識できないため、比較例のアテロコラーゲンで製造されたパッチ型薬物送達体はよく分解されず、担持された薬物がよく放出できず、癌細胞の死滅および転移抑制の効果が良好でないものと考えられる（図６、７参照）。
【0254】
パッチ型アテロコラーゲン薬物送達体からの担持薬物の放出効果とパッチ型アテロコラーゲン薬物送達体による腫瘍抑制および癌転移効果を確認した具体的な実験方法および結果について下記（１）～（３）に示す。
【0255】
（１）パッチ型アテロコラーゲン薬物送達体の製造
前記「２．（２）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造」で製造されたｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液と薬物を混合し、円形のシリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、薬物（ゲムシタビンまたは配列番号１の５’末端に（Ｇｅｍ）２が結合した薬物［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）が担持されたアテロコラーゲンパッチを製造した。
前記「２．（２）ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液の製造」で製造されたｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液と薬物を混合し、円形のシリコンモールドに注ぎ、凍結乾燥して、薬物（ゲムシタビンまたは配列番号１の５’末端に（Ｇｅｍ）２が結合した薬物［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）が担持されたアテロコラーゲンパッチを製造した。
【0256】
具体的には、ｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液に薬物（例えば、ゲムシタビン又は［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）を添加した後、マルチミキサー（ＳＬＲＭ－３、ＭＹＬＡＢ）を用いて常温で３０分間均一に混合した。その後、アテロコラーゲン－薬物混合物を円形のシリコンモールドに一定量分注した（図３１の上の写真）。アテロコラーゲン－薬物混合物が分注された円形のシリコンモールドを－２０℃で４時間以上一次凍結した。一次凍結が完了したサンプルを円形のシリコンモールドから分離して滅菌ディッシュまたはプレートに移した後、－８０℃で２時間以上二次凍結した。凍結乾燥機のコールドトラップの温度が－８０℃になるように予備凍結した後、凍結乾燥機にアテロコラーゲン・サンプルを入れて１６時間以上凍結乾燥した（図３１の下左の写真）。凍結乾燥したアテロコラーゲン・サンプルをアクリルプレートを用いてパッチ型に圧着した後（図３１の下右の写真）、アルミニウムポーチに入れて密封した。包装されたパッチ型アテロコラーゲン薬物送達体を４℃で冷蔵保存した。
【0257】
（２）パッチ型アテロコラーゲン薬物送達体の膵臓癌細胞株における薬物放出効果
膵臓癌細胞株のＢＸＰＣ－３を３日間培養し、ＭＭＰ－２とＭＭＰ－９が過剰発現した培地（ＣＭ培地）と、ＭＭＰ－２とＭＭＰ－９が発現していない培地（コントロール培地）を準備した。ザイモグラフィー（Zymography）を用いて、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の活性を確認した（図３２参照）。
膵臓癌細胞株のＢＸＰＣ－３を３日間培養し、ＭＭＰ－２とＭＭＰ－９が過剰発現した培地（ＣＭ培地）と、ＭＭＰ－２とＭＭＰ－９が発現していない培地（コントロール培地）を準備した。ザイモグラフィー（Zymography）を用いて、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の活性を確認した（図３２参照）。
【0258】
ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９活性が過剰発現したＣＭ培地において、実施例１のアテロコラーゲン薬物送達体と比較例２のアテロコラーゲン薬物送達体から、担持された薬物（［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）がよく放出されるかどうかを確認した。放出される［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］およびゲムシタビンの濃度をそれぞれＡｂｓ．２６０ｎｍでＵＶで測定した。実験の結果、実施例１のアテロコラーゲンを用いて製造されたパッチ型薬物送達体は、コントロール培地と比較してＣＭ培地でよりよく溶けた。その結果、薬物送達体に含有された［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］及びゲムシタビンの放出がより良好であることを確認した。これにより、実施例１のアテロコラーゲンは、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９により、よく認識されることが分かった。また、ＣＭ培地において、比較例２のアテロコラーゲン薬物送達体に比べ、実施例１のアテロコラーゲン薬物送達体がパッチ内に含有された［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］とゲムシタビンを効果的に放出させることを確認した（図３３参照）。
【0259】
（３）パッチ型アテロコラーゲン薬物送達体の膵臓癌マウスモデルにおける残存癌の除去後の腫瘍抑制及び転移抑制効果
１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果
実施例１のアテロコラーゲンにゲムシタビン０．１２ｍｇを担持したパッチ型薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［実施例１］パッチ型薬物送達体」）と比較例２のアテロコラーゲンにゲムシタビン０．１２ｍｇを担持したパッチ型薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［比較例２］パッチ型薬物送達体」）をｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ膵臓癌マウスに移植し、残存腫瘍の抑制及び腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。
１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果
実施例１のアテロコラーゲンにゲムシタビン０．１２ｍｇを担持したパッチ型薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［実施例１］パッチ型薬物送達体」）と比較例２のアテロコラーゲンにゲムシタビン０．１２ｍｇを担持したパッチ型薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［比較例２］パッチ型薬物送達体」）をｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ膵臓癌マウスに移植し、残存腫瘍の抑制及び腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。
【0260】
具体的には、Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕｄｅ（male、６週齢、２１匹）および特定のベクター（vector）の置換でルシフェラーゼ（luciferase）を発現する５×１０５ＢｘＰＣ３癌細胞株（ＢＸＰＣ－３－Ｌｕｃ細胞）２５ｕｌを用意した。腹腔麻酔したマウスの腹部を切開して膵臓を取り出して準備し、ＢＸＰＣ－３－Ｌｕｃ細胞を膵臓に注入して膵臓癌マウスモデルを作製した。２週間後、ルシフェラーゼ・イメージング（luciferase imaging）を行って腫瘍を確認した。腫瘍はルシフェリン（luciferin）を用いて測定した。自己蛍光を減らすために、画像撮影の１週間前に膵臓癌マウスモデルに無蛍光飼料を提供した。腹腔麻酔したマウスの腹部を切開して膵臓癌を除去した後、残りの腫瘍部位にＧｅｍ／ＡＣ［比較例２］パッチ型薬物送達体またはＧｅｍ／ＡＣ［実施例１］パッチ型薬物送達体を移植した。ルシフェラーゼ・イメージング（Luciferase imaging）を用いて、腫瘍サイズおよび転移有無を確認した。各薬物送達体を挿入して３０日が経過した後、実験動物をｅｘ－ｖｉｖｏで腫瘍および臓器別転移有無を確認した。その結果、Ｇｅｍ／ＡＣ［比較例２］パッチ型薬物送達体に比べて、Ｇｅｍ／ＡＣ［実施例１］パッチ型薬物送達体の方が優れた腫瘍抑制及び転移抑制効果を示した（図３４参照）。
【0261】
２）［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］が担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果
前記「７．（３）－１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果」の方法と同様にする一方、担持された薬物として［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を用いて、残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。
前記「７．（３）－１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果」の方法と同様にする一方、担持された薬物として［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を用いて、残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。
【0262】
より具体的には、実施例１のアテロコラーゲンに［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］２ｍｇを担持したパッチ型薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ－ａｐｔａｍｅｒ［実施例１］パッチ型薬物送達体」）と、比較例２のアテロコラーゲンに［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］２ｍｇを担持したパッチ型薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ－ａｐｔａｍｅｒ［比較例２］パッチ型薬物送達体」）をｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ膵臓癌マウスに移植して残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。その結果、Ｇｅｍ－ａｐｔａｍｅｒ［比較例２］パッチ型薬物送達体が移植されたマウスでは、脾臓、腹膜および腎臓などへの癌転移が見られたが、Ｇｅｍ－ａｐｔａｍｅｒ［実施例１］パッチ型薬物送達体が移植されたマウスでは、腹腔内転移が全く見られず、腫瘍サイズも小さいことを確認した（図３５参照）。
【0263】
８．ゾル－ゲル型アテロコラーゲン薬物送達体（薬物が担持されたアテロコラーゲンゾル－ゲル）の腫瘍抑制及び転移抑制効果
（１）ゾル－ゲル型アテロコラーゲン薬物送達体の製造
０．５％～３．０％濃度のｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液１００μＬに薬物（ゲムシタビン又は［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）を添加した後、マルチミキサー（ＳＬＲＭ－３、ＭＹＬＡＢ）を用いて常温で３０分間均一に混合した。または、０．５％～３．０％濃度のｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液１００μＬと薬物をそれぞれ２つのシリンジに添加した後、２つのシリンジを連結してピストン往復によって均等に混合した。
（１）ゾル－ゲル型アテロコラーゲン薬物送達体の製造
０．５％～３．０％濃度のｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液１００μＬに薬物（ゲムシタビン又は［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］）を添加した後、マルチミキサー（ＳＬＲＭ－３、ＭＹＬＡＢ）を用いて常温で３０分間均一に混合した。または、０．５％～３．０％濃度のｐＨ中性のアテロコラーゲン溶液１００μＬと薬物をそれぞれ２つのシリンジに添加した後、２つのシリンジを連結してピストン往復によって均等に混合した。
【0264】
（２）ゾル－ゲル型アテロコラーゲン薬物送達体の膵臓癌マウスモデルにおける残存癌の除去後の腫瘍抑制及び転移抑制効果
１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果
「７．（３）－１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果」の方法と同様にする一方、実施例１のアテロコラーゲンで製造されたゾル－ゲルにゼムシタビン０．１２ｍｇを担持した薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［実施例１］ゾル－ゲル薬物送達体」）と、比較例２のアテロコラーゲンで製造されたゾル－ゲルにゲムシタビン０．１２ｍｇを担持した薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［比較例２］ゾル－ゲル薬物送達体」）をｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ膵臓癌マウスに注入して、残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。その結果、Ｇｅｍ／ＡＣ［比較例２］ゾル－ゲル薬物送達体が注入されたマウスでは脾臓、腹膜などへの癌転移が見られたが、Ｇｅｍ／ＡＣ［実施例１］ゾル－ゲル薬物送達体が注入されたマウスでは腹腔内転移が全くなかった（図３６参照）。
１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果
「７．（３）－１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果」の方法と同様にする一方、実施例１のアテロコラーゲンで製造されたゾル－ゲルにゼムシタビン０．１２ｍｇを担持した薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［実施例１］ゾル－ゲル薬物送達体」）と、比較例２のアテロコラーゲンで製造されたゾル－ゲルにゲムシタビン０．１２ｍｇを担持した薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ＡＣ［比較例２］ゾル－ゲル薬物送達体」）をｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ膵臓癌マウスに注入して、残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。その結果、Ｇｅｍ／ＡＣ［比較例２］ゾル－ゲル薬物送達体が注入されたマウスでは脾臓、腹膜などへの癌転移が見られたが、Ｇｅｍ／ＡＣ［実施例１］ゾル－ゲル薬物送達体が注入されたマウスでは腹腔内転移が全くなかった（図３６参照）。
【0265】
２）［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］が担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果
「８．（２）－１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果」の方法と同様にする一方、担持された薬物として［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を用いて、残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。
「８．（２）－１）ゲムシタビンが担持された薬物送達体の腫瘍抑制及び転移抑制効果」の方法と同様にする一方、担持された薬物として［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］を用いて、残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。
【0266】
実施例１のアテロコラーゲンで製造されたゾル－ゲルに［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］２ｍｇを担持した薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ａｐｔａｍｅｒ［実施例１］ゾル－ゲル型薬物送達体」）と、比較例２のアテロコラーゲンで製造されたゾル－ゲルに［ＧＲＯ－アプタマー及びゲムシタビン接合体］２ｍｇを担持した薬物送達体（以下、「Ｇｅｍ／ａｐｔａｍｅｒ［比較例２］ゾル－ゲル型薬物送達体」）をｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ膵臓癌マウスに注射し、残存腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移抑制有無を観察した。
【0267】
その結果、Ｇｅｍ／ａｐｔａｍｅｒ［比較例２］ゾル－ゲル型薬物送達体が注入された場合に比べて、Ｇｅｍ／ａｐｔａｍｅｒ［実施例１］ゾル－ゲル型薬物送達体が注入されたマウスでは腫瘍サイズが小さいことを確認した（図３７参照）。
【符号の説明】
【0268】
１，２：ＨＰＬＣピークを有する山の面積
１０，２０，３０，４０：ＨＰＬＣピーク
ａ１，ａ２，ａ３：ＨＰＬＣピークを有する山と山との間の変曲点
ｂ：ＨＰＬＣクロマトグラムのベースライン
ｔ１０，ｔ２０：ＨＰＬＣピークに相当する溶出時間
ｔａ１，ｔａ２，ｔａ３：２つのＨＰＬＣピークを有する山の間の変曲点に相当する溶出時間
ｔｂ１，ｔｂ２：ベースラインとＨＰＬＣピークを有する山の交点に相当する溶出時間
１０，２０，３０，４０：ＨＰＬＣピーク
ａ１，ａ２，ａ３：ＨＰＬＣピークを有する山と山との間の変曲点
ｂ：ＨＰＬＣクロマトグラムのベースライン
ｔ１０，ｔ２０：ＨＰＬＣピークに相当する溶出時間
ｔａ１，ｔａ２，ｔａ３：２つのＨＰＬＣピークを有する山の間の変曲点に相当する溶出時間
ｔｂ１，ｔｂ２：ベースラインとＨＰＬＣピークを有する山の交点に相当する溶出時間
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【配列表】
【国際調査報告】