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特表2023-531960生体分子の超高感度検出のための単一分子アッセイ

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-26

(54)【発明の名称】生体分子の超高感度検出のための単一分子アッセイ

(51)【国際特許分類】

C12Q 1/682 20180101AFI20230719BHJP

G01N 33/483 20060101ALI20230719BHJP

G01N 33/543 20060101ALI20230719BHJP

C12Q 1/6844 20180101ALI20230719BHJP

C12Q 1/6813 20180101ALI20230719BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/682

G01N33/483 C

G01N33/543 541Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6813 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022579698

(86)(22)【出願日】2021-06-22

(85)【翻訳文提出日】2023-02-20

(86)【国際出願番号】 US2021038463

(87)【国際公開番号】W WO2021262706

(87)【国際公開日】2021-12-30

(31)【優先権主張番号】63/042,596

(32)【優先日】2020-06-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/076,833

(32)【優先日】2020-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＭＡＴＬＡＢ

(71)【出願人】

【識別番号】503146324

【氏名又は名称】ザブリガムアンドウィメンズホスピタルインコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＴｈｅＢｒｉｇｈａｍａｎｄＷｏｍｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田耕一

(72)【発明者】

【氏名】ウォルト，デイビッドアール．

(72)【発明者】

【氏名】ウー，コニー

(72)【発明者】

【氏名】マレイ，アダムエム．

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G045DA36

2G045FB02

2G045FB12

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA14

4B063QA18

4B063QA19

4B063QQ79

4B063QQ96

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR48

4B063QR56

4B063QR62

4B063QR83

4B063QS10

4B063QS22

4B063QS24

4B063QS33

4B063QS34

4B063QS36

4B063QS39

4B063QX02

(57)【要約】

本明細書で提供されるのは、タンパク質および他の生体分子を、例えば低から中程度のアトモル濃度で検出するためのデジタル測定法を提供するアッセイである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の生体分子を検出する方法であって、
前記試料を含む溶液を用意すること；
前記溶液を、前記試料中の生体分子が捕捉部分に結合する条件下およびそれに十分な時間で、前記生体分子に結合する前記捕捉部分を含む複数のビーズと接触させること；
前記溶液を、前記生体分子に結合し、標的分子を保有する各ビーズの検出を可能にするのに十分な、オンビーズの非拡散性の検出可能なシグナルの生成を可能にする結合部分と接触させ、次いで増幅されたシグナルを生成させること；
前記ビーズを、任意選択で単層に固定化すること；ならびに
前記シグナルを検出すること
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記ビーズを固定化することが、前記ビーズを含む前記溶液をスライド上にドロップキャストすること、または前記溶液のゲル化を触媒することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記溶液を、前記結合部分に結合するシグナル増幅部分と接触させることをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記シグナル増幅部分が、酵素または分枝状ＤＮＡを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記シグナルを検出することが、前記ビーズを画像化して蛍光または他のシグナルを検出することを含む、請求項１から３に記載の方法。

【請求項6】

ビーズ－生体分子複合体を含むビーズの数および／または百分率を決定することをさらに含む、請求項１から４に記載の方法。

【請求項7】

前記ビーズが、ポリマー、金属、金属酸化物、半導体および／または半導体酸化物を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記検出可能なシグナルが、ローリングサークル増幅とそれに続く相補性の蛍光標識されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）；ハイブリダイゼーション連鎖反応；酵素触媒近傍標識（ＰＬ）重合；重合ベースシグナル増幅；または磁気ビーズ量子ドットイムノアッセイによって生成される、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記検出可能なシグナルが、プレ増幅されたシグナルによって生成される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記プレ増幅されたシグナルが、標識ポリマーまたはナノ粒子である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記シグナルが検出される前に、前記ビーズが、表面上にドロップキャストされ、乾燥される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記シグナルが検出される前に、前記溶液が表面に適用されまたはそれと接触され、ゲル化が触媒される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記表面が、スライド、チップまたはフローセルである、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記溶液のゲル化を触媒することが、フィブリノーゲンおよび／もしくはトロンビン；フィブリン；セルロース；コラーゲン；ゼラチン；アガロース；ヒアルロン酸；ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ（ＨＥＭＡ））；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；またはアクリルアミドを前記溶液に混合することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記溶液が、フィブリノーゲンおよび／もしくはトロンビン；フィブリン；セルロース；コラーゲン；ゼラチン；アガロース；ヒアルロン酸；ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ（ＨＥＭＡ））；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；またはアクリルアミドから選択されるポリマーを含み；ポリマーへのゲル化を触媒することを含む、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０２０年６月２３日に出願された、米国仮特許出願第６３／０４２，５９６号明細書、および２０２０年９月１０に日出願された、同第６３／０７６，８３３号の優先権を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本明細書で提供されるのは、タンパク質および他の生体分子を低から中程度のアトモル濃度で検出するためのデジタル測定法を提供する改善された単一分子アッセイである。

【背景技術】

【0003】

極めて低いレベルの生体分子、例えば、タンパク質、核酸および代謝物を正確に測定する能力は、疾患の診断、薬物送達、食品中の病原体検出、環境中の毒素検出およびバイオプロセス制御を含む広範な臨床および環境適用のために不可欠である。多数の有望なバイオマーカーが利用可能な生体液中に、現在の検査室の方法の検出限界を大きく下回るレベルで存在することから、超高感度測定技術は、臨床診断において特に重要である^１。デジタル測定法、例えば、デジタル酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、伝統的に使用される分析技術、例えば従来のＥＬＩＳＡより最大１０００倍大きく改善された測定感度を有する^２～５。しかし、デジタル測定技術の感度は、多くの診断適用のため、特に、疾患関連タンパク質を測定するためには不十分なままである。例えば、神経学的障害についていくつかのタンパク質バイオマーカーが脳脊髄液において上方制御されていることが示されているが、高度に侵襲性の腰椎穿刺がこれらの測定のために求められることから、早期疾患検出のために個体をスクリーニングすることを非実用的にしている^６～９。脳由来タンパク質のごく一部が血液脳関門を循環に通過することから、簡易な血液検査を通じて希少なタンパク質バイオマーカーを検出および同定できる高感度技術は、この未だ対処されていない診断の必要性に対処するために決定的である^{１０～１２}。分析感度を改善することは、迅速なポイントオブケア（ＰＯＣ）診断が効果的な医療行為のために決定的である他の疾患における主な課題でもあるが、容易に利用可能である生体液、例えば、唾液または尿が求められる。これらの生体液は、わずかな血清の（serumnal）構成成分を含有するだけであり、タンパク質バイオマーカー検出のための超高感度技術を必要としている。

【0004】

デジタルＥＬＩＳＡにおいて感度を増大させるための主な１つの障害は、低い試料採取効率である。デジタルＥＬＩＳＡ法は、測定感度を改善するために単一分子計数を利用するが、低い試料採取効率が計数される標的分子の数を限定している。非常に低い標的濃度で、単一の事象を計数することからのポアソンノイズ

【0005】

【数1】

（式中、Ｎは計数される分子の数である）は、顕著に測定誤差の一因となる。例として、５％の試料採取効率では、完全な捕捉効率を仮定して、１０ａＭ試料１００μＬ中の６００個の標的分子のうち３０個だけが計数される。理論的な変動のポアソンノイズ関連係数（ＣＶ）、

【0006】

【数2】

は、この低い試料採取効率で１８％であり、実際には、１００％を大きく下回る捕捉効率および実験誤差を考慮すると、さらに高い。したがってこの高い測定不確実性は、希少な分子を検出するための主な限界を提示する。このため、さらに多くの標的分子を計数するために試料採取効率を増大させることは、測定精度および感度を大きく改善できるが、デジタルＥＬＩＳＡにおける課題のままである。

【0007】

既存のデジタルＥＬＩＳＡ手法は、単一の標的タンパク質分子を保有する個々のビーズを単離するためにマイクロウェルまたは油中水液滴を利用する^{２、５、１３～１５}。現在の最新鋭のデジタルＥＬＩＳＡは、ＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＡｒｒａｙｓ（Ｓｉｍｏａ）であり、単一の標的分子を抗体コート常磁性ビーズ上に捕捉し、単一分子計数のためにフェムトリットルサイズのマイクロウェルに個々のビーズを単離する^２。各ビーズがゼロまたは１つの捕捉された標的分子を有し、ポアソン分布に従うデジタル測定を確実にするために、試料中の標的分子数を超える大過剰量のビーズが使用される。捕捉された各分子は、次に酵素コンジュゲートストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）を用いて標識される免疫複合体サンドイッチを形成するように、ビオチン化検出抗体を用いて標識される。続いて、ビーズは、最大でビーズ１個にそれぞれフィットできるマイクロウェルに蛍光発生酵素基質と共にロードされる。オイルを用いてマイクロウェルを密封し、高い局所濃度の蛍光産生物が、ＳβＧ分子を保有するビーズを含有する各ウェル中で触媒的に生成される。それにより、標的分子の数は、「オン」および「オフ」のウェルを計数することによって測定される。

【0008】

Ｓｉｍｏａがフェムトモル以下の検出限界を達成でき、超高感度タンパク質検出のため現在の絶対的基準である一方で、その感度は、低い試料採取効率によって制限される。ビーズの総数の約５％だけがマイクロウェルに重力によってロードされて分析され得る^１６。ごく最近開発されたＳｉｍｏａ装置、ＨＤ－ＸＡｎａｌｙｚｅｒでは外部の磁力がビーズローディングに利用されているが、分析されるビーズの百分率は、およそ５％のままである。ビーズローディングを改善するための他の方法は、電場指向性ビーズローディング、疎水性中親水性（hydrophilic-in-hydrophobic）マイクロウェルアレイおよびデジタルマイクロ流体を含んで探求されている^{１４、１５、１７～１９}。これらの方法がビーズローディング効率を増大させた一方で、デジタルイムノアッセイ感度におけるそれらの改善の実証は、限定的なままである。さらに、複雑な製作法およびワークフローは、ＰＯＣ適用におけるこれらの手法の使用を限定する。デジタルバイオアッセイにおける試料採取効率を改善するための別の戦略は、油中水液滴中へのビーズ封入である。デジタル液滴ベースのイムノアッセイは、６０％に至るビーズローディング効率を実証し、現在のＳｉｍｏａ技術のものと同様またはそれより１桁まで高い感度の改善を示した^５、１３。液滴マイクロ流体システムが多様な適用のために十分に確立されている一方で、高度に制御されたハイスループットな液滴生成の必要性は、ＰＯＣシステムに統合する場合にさらなる複雑さをもたらす追加的な製作および処理ステップを導入する。さらに、かなりの割合の液滴は、ビーズを含有しないが画像化はされるはずであることから、画像処理量を改善することはＰＯＣ実行に向けた別の課題のままである。

【発明の概要】

【0009】

タンパク質および核酸を含む非常に低いレベルの生体分子の測定は、不十分な感度のために多くの臨床診断適用において重要な課題のままである。ＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＡｒｒａｙｓ（Ｓｉｍｏａ）またはデジタルＥＬＩＳＡなどのデジタル測定法が、感度において顕著に進歩した一方で、これらの技術の検出限界を下回るレベルで入手可能な生体液中に存在する多数の有望な疾患バイオマーカーがまだある。本明細書に記載されているのは、上に述べた課題に対処する高感度デジタルＥＬＩＳＡプラットフォームである。非常に簡易な読み取りプロセスおよび本方法の対費用効果の改善は、一部の実施形態では、ビーズローディングのためのスライドガラスおよびシグナル読み取りのための簡易な光学装置だけを必要とし、ＰＯＣシステムへの統合可能性を促進できる。本プラットフォームは、現在の（例えば、ＳｉｍｏａおよびデジタルＥＬＩＳＡ）技術より感度において最大２５倍増大するアトモルの検出限界を達成できる。概念の証明として本発明者らは、骨がんの稀な形態、脊索腫についての組織バイオマーカー、ブラキュリ（Brachyury）の血漿中の以前は検出不可能なレベルを測定する本方法の能力を実証した。これにより本方法の感度および簡易さの増強は、バイオマーカー発見およびＰＯＣ診断開発のためのプラットフォームを提供する。

【0010】

別の例示的方法は、ビーズが移動することなく画像化が行えるように単層にビーズを封入するためにゲルを使用し；すべての反応は、溶液中で行われ、ビーズ周囲のゲル重合および画像化が続く。

【0011】

したがって、本明細書で提供されるのは、試料中の生体分子を検出するための方法である。方法は、試料を含む溶液を用意すること；溶液を、試料中の生体分子が捕捉部分に結合する条件下およびそれに十分な時間で、生体分子に結合する捕捉部分を含む複数のビーズと接触させること；溶液を、生体分子に結合し、標的分子を保有する各ビーズの検出を可能にするのに十分な、オンビーズの非拡散性の検出可能なシグナルの生成を可能にする結合部分と（例えば、捕捉部分と連続的にまたは同時に）接触させ、次いで増幅されたシグナルを生成させること；ビーズを、任意選択で単層に固定化すること；ならびにシグナルを検出することを含む。

【0012】

一部の実施形態では、ビーズを固定化することは、ビーズを含む溶液をスライドにドロップキャストすること、または溶液のゲル化を触媒することを含む。

【0013】

一部の実施形態では、方法は、溶液を、結合部分に結合するシグナル増幅部分と接触させることを含む。

【0014】

一部の実施形態では、シグナル増幅部分は、酵素または分枝状ＤＮＡを含む。

【0015】

一部の実施形態では、シグナルを検出することは、ビーズを画像化して蛍光または他のシグナルを検出することを含む。一部の実施形態では、ビーズは単層に固定化され、単一ｚセクション画像化（single z-section imaging）が使用され得；ビーズが単層にない実施形態では、方法は異なるｚセクションを画像化することを含み得る。

【0016】

一部の実施形態では、方法は、ビーズ－生体分子複合体を含むビーズの数および／または百分率を決定することを含む。

【0017】

一部の実施形態では、ビーズは、ポリマー、金属、金属酸化物、半導体および／または半導体酸化物を含む。

【0018】

一部の実施形態では、検出可能なシグナルは、ローリングサークル増幅とそれに続く相補性の蛍光標識されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）；ハイブリダイゼーション連鎖反応；酵素触媒近傍標識（Enzyme-catalyzed proximity labeling）（ＰＬ）重合；重合ベースシグナル増幅；または磁気ビーズ量子ドットイムノアッセイによって生成される。

【0019】

一部の実施形態では、検出可能なシグナルは、プレ増幅されたシグナル、例えば、標識されたポリマーまたはナノ粒子によって生成される。

【0020】

一部の実施形態では、シグナルが検出される前に、ビーズは、表面上にドロップキャストされ、例えば、フィルムを形成するように乾燥され、または溶液は表面に適用されもしくはそれと接触され、ゲル化が触媒される。

【0021】

一部の実施形態では、表面は、スライド、チップまたはフローセルである。

【0022】

一部の実施形態では、溶液のゲル化を触媒することは、フィブリノーゲンおよび／もしくはトロンビン；フィブリン；セルロース；コラーゲン；ゼラチン；アガロース；ヒアルロン酸；ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ（ＨＥＭＡ））；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；またはアクリルアミドを溶液に混合することを含む。

【0023】

一部の実施形態では、溶液は、フィブリノーゲンおよび／もしくはトロンビン；フィブリン；セルロース；コラーゲン；ゼラチン；アガロース；ヒアルロン酸；ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ（ＨＥＭＡ））；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；またはアクリルアミドから選択されるポリマーを含み；方法は、ポリマーへのゲル化を触媒することを含む。

【0024】

他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載され；当技術分野において公知の他の好適な方法および材料も使用され得る。材料、方法および例は、単に例示であり、限定することを意図しない。本明細書において述べられるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。

【0025】

本発明の他の特性および有利点は、続く詳細な記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】例示的ドロップキャスト単一分子アッセイの模式図である。抗体コート常磁性ビーズ上での単一免疫複合体サンドイッチの形成およびストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートを用いた標識化において、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、各免疫複合体に付着された長いコンカテマーを生成するためにビーズ上で実施される。蛍光標識されたＤＮＡプローブは、完全な免疫複合体サンドイッチを保有するビーズ上で局所的蛍光シグナルを産生するようにＲＣＡの際にコンカテマーにハイブリダイズされる。ＲＣＡ後にビーズは、濃縮され、スライドガラス上にドロップキャストされ、単層フィルムを形成するように乾燥される。単一標的分子は、ドロップキャストフィルムの蛍光画像化ならびに「オン」および「オフ」ビーズの計数によって計数される。

【図2A-G】フィルムの画像である。スライドガラス上のドロップキャストビーズフィルムの（Ａ）代表的な写真および（Ｂ）明視野画像。およそ２０００～２５００個のビーズが各フレームにおいて分析される。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ～Ｅ）ドロップキャストフィルム中の「オン」および「オフ」色素エンコードビーズ（dye-encoded bead）の代表的な画像：ビーズ蛍光（４８８ｎｍ；Ｃ）、ＡＴＴＯ６４７Ｎプローブ（６４７ｎｍ；Ｄ）およびマージ（Ｅ）。灰色矢印は「オン」ビーズを示す。スケールバー＝１０μｍ。（Ｆ～Ｇ）０ｆＭＩＬ－１β（Ｆ）および１０ｆＭＩＬ－１β（Ｇ）試料についての各ビーズ上での最大蛍光強度値（画像中のバックグラウンド蛍光強度値からの減算）の代表的なヒストグラム。正規分布は、蛍光強度値にフィットされ、「オン」対「オフ」ビーズについてのカットオフは、平均から標準偏差の５倍より上として定義された。

【図3A-F】本方法と従来のＳｉｍｏａのアッセイ感度の比較を示すグラフである。ヒトＩＬ－１０についての（Ａ）本方法および（Ｂ）従来のＳｉｍｏａの較正曲線。破線は、算出された検出限界（ＬＯＤ）を示す。（Ｃ）ＩＬ－１０較正曲線範囲にわたる本方法と従来のＳｉｍｏａとの間のシグナル対バックグラウンド比の比較。ヒトＩＬ－１βについての（Ｄ）本方法と（Ｅ）従来のＳｉｍｏａの較正曲線。（Ｆ）ＩＬ－１β較正曲線範囲にわたる本方法と従来のＳｉｍｏａとの間のシグナル対バックグラウンド比の比較。

【図4A-B】測定精度および感度への試料採取効率の影響を示すグラフである。ＩＬ－１０についての本方法較正曲線を使用して画像化されたビーズの無作為に選択されたサブセットについての（Ａ）バックグラウンドシグナルの測定されたＣＶおよび（Ｂ）算出されたＬＯＤ。分析されたビーズの百分率は、全アッセイビーズの百分率を表す。各点は、ビーズの４回の異なる無作為に選択されたサブセットの平均を表す。

【図5A-F】血漿中のブラキュリの測定のグラフである。ヒトブラキュリについての（Ａ）本方法および（Ｂ）従来のＳｉｍｏａの較正曲線。破線は、算出された検出限界（ＬＯＤ）を示す。（Ｃ）較正曲線範囲にわたる本方法と従来のＳｉｍｏａとの間のシグナル対バックグラウンド比の比較。（Ｄ～Ｅ）それぞれ、脊索腫患者血漿試料（Ｄ）ならびに市販の血漿および血清試料（Ｅ）において、従来のＳｉｍｏａおよび本方法によって測定されたビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ）およびビーズあたりの平均分子（ＡＭＢ）値。茶色の線は、アッセイのＬＯＤを示す。（Ｆ）本方法および従来のＳｉｍｏａを使用して脊索腫、軟骨肉腫ならびに市販の血漿および血清試料において測定された濃度。ＬＯＤを下回る測定値は値をゼロとした。

【図6A-B】プールされたヒト唾液におけるヒトＩＬ－１０ｄＳｉｍｏａアッセイの検証を示す図である。（Ａ）４倍希釈されたプールされたヒト唾液中に添加された組換えヒトＩＬ－１０タンパク質の回収率。（Ｂ）プールされたヒト唾液の系列希釈試料中で測定されたＩＬ－１０濃度。

【図7A-B】ヒト血漿および血清でのヒトブラキュリｄＳｉｍｏａアッセイの検証を示す図である。（Ａ）８倍希釈された個々の市販のヒト血清試料およびプールされたヒト血漿中に添加された組換えヒトブラキュリタンパク質の回収率。（Ｂ）プールされたヒト血漿の系列希釈試料中で測定されたブラキュリ濃度。

【図8A-C】（Ａ）ヒトＩＬ－１０（１５０ｐＭＳβＧ、５分間）、（Ｂ）ヒトＩＬ－１β（１５０ｐＭＳβＧ、５分間）および（Ｃ）ヒトブラキュリ（３００ｐＭＳβＧ、１５分間）について、異なるＳβＧ濃度およびインキュベーション時間で実施された従来のＳｉｍｏａアッセイを示すグラフである。灰色破線は、各アッセイについて算出されたＬＯＤを示す。各アッセイについてのＬＯＤ値は、ＩＬ－１０、ＩＬ－１βおよびブラキュリについてそれぞれ５７５ａＭ、２．７７ｆＭおよび１．４８ｆＭであった。

【図9A-C】ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡの概略図である。Ａ．標的タンパク質分子は、抗体コードビーズに捕捉され、次いでタンパク質分子は、ビオチン化検出抗体およびストレプトアビジン－ポリ－ＨＲＰを用いて標識される。オンビーズ酵素的シグナル増幅ステップでは、ビーズは、チラミド－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８とインキュベートされる。過酸化水素の存在下で、ＨＲＰはチラミド分子のラジカル形成を触媒し、これは次いで近くのタンパク質上のフェノール残基と共有結合を形成する。完全な免疫複合体を含有するビーズだけがチラミドＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８試薬で標識される。Ｂ．画像化のためにフィブリンハイドロゲル中にビーズを封入するために、ビーズはシリコン単離ウェル内のガラススライドに配置され、次に、フィブリノーゲンおよびトロンビンの溶液がビーズアレイに加えられる。ビーズは、ｉｎｓｉｔｕで形成されるフィブリンハイドロゲル中に固定化される。Ｃ．固定化されたビーズアレイは、単一分子計数を実施するために蛍光顕微鏡を使用して画像化される。ビーズは、明視野画像で同定され、蛍光画像からのビーズ強度は「オン」および「オフ」ビーズを決定するために使用される。

【図10A-B】フィブリンハイドロゲルにおけるビーズ固定化を示す図である。Ａ．各単離ウェル（７ｍｍｘ７ｍｍｘ２ｍｍ）は、フィブリンハイドロゲル中に固定化されたビーズを含む１つの試料を含む。Ｂ．フィブリンハイドロゲル中の数百個のビーズ（小さな黒点）の明視野画像（倍率１０×）。この画像は、単一の単離ウェル中のフィブリンハイドロゲル全体のうちの小領域を表す。単離ウェル全体は、倍率１０×で約２０～２５個の画像で捕捉され得る。スケールバー＝１００μｍ。

【図11A-E】画像解析および単一分子計数を示す図である。Ａ～Ｃ．「オン」および「オフ」ビーズを含む目的の小領域を示す代表的な顕微鏡画像。（Ａ．）ビーズ（明視野画像）および（Ｂ．）チラミドＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８試薬の蛍光強度（４８８ｎｍ蛍光画像）を示す画像は、（Ｃ．）「オン」ビーズを示す灰色矢印と共にオーバーレイされた。スケールバー＝１０μｍ（Ｄ．）０ｆＭおよび（Ｅ．）５０ｆＭＩＬ－６についてのビーズ蛍光強度の代表的なヒストグラム。「オフ」と「オン」の間のカットオフは、各ヒストグラムにおいて灰色四角によって示される。

【図12】ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを使用するＩＬ－６較正曲線を示すグラフである。曲線上の各データ点は、２連の測定の平均を表す。エラーバーは、２連の測定の標準偏差を表す。挿入図：ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡおよび従来のＳｉｍｏａによって測定された唾液試料の比較。データ点は、２連の測定の平均を表し、エラーバーは、２連の測定の標準偏差を表す。点線は、２つの方法の間の正確な相関関係を表す。スピアマンの相関係数は、１．００である。

【図13】従来のＳｉｍｏａによって作成されたＩＬ－６較正曲線を示すグラフである。データ点は、２連の測定の平均を表す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

最小限の侵襲性の生体液、例えば血液または唾液中のタンパク質バイオマーカーの定量的で超高感度な検出は、早期疾患診断、処置モニタリングおよび疾患再発モニタリングを含む医学的診断を改革する可能性を有する。デジタル酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）などの技術は、タンパク質（Rissin et al., Nat. Biotechnol. 2010, 28 (6), 595-599；Leirs et al., Anal. Chem. 2016, 88 (17), 8450-8458； Cohen et al., Chem. Rev. 2019, 119 (1), 293-321）、核酸（Song et al., Anal. Chem. 2013, 85 (3), 1932-1939; Cohen et al., Nucleic Acids Res. 2017, 45 (14), e137-e137）および他の生物学的に関連する小分子（Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 2018, 140 (51), 18132-18139；Wang and Walt, Chem. Sci. 2020. doi.org/10.1039/D0SC02552F）が挙げられる低含量の生体分子の超高感度検出を、マイクロウェルアレイ（Rondelez et al., Nat. Biotechnol. 2005, 23 (3), 361-365；Rissin et al., Nano Lett. 2006, 6 (3), 520-523；Cohen and Walt, Annu. Rev. Anal. Chem. 2017, 10 (1), 345-363）またはマイクロ流体液滴（Kim et al., Lab. Chip 2012, 12 (23), 4986；Witters et al., Lab. Chip 2013, 13 (11), 2047；Yelleswarapu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2019, 116 (10), 4489-4495；Cohen et al., ACS Nano 2020, 14, 8, 9491-9501）中で個々の分子を単離し、計数することによって可能にする。

【0028】

超高感度タンパク質検出は、Ｓｉｍｏａにおいて以下の通り達成され得る：最初に、個々のタンパク質分子は抗体コート常磁性ビーズに捕捉される。タンパク質分子の数と比較して過剰な数のビーズが、各ビーズがタンパク質分子に結合しないかまたは１つのタンパク質分子に結合するかのいずれかであることを確実にするように使用される。次いで、結合したタンパク質分子は、ビオチン化検出抗体およびストレプトアビジン－コンジュゲート酵素を用いて標識される。最後に、ビーズは、蛍光発生酵素基質を含有する溶液に再懸濁され、マイクロウェルアレイにロードされる。アレイは、オイルを用いて密封され、蛍光産生物の局在性の濃度は、完全な免疫複合体を含むウェルだけで産生される。単一分子計数は、アクティブウェルを計数することによって実施され、ビーズの総数に対する「オン」ビーズの割合が算出され、次に、較正曲線を作成するためにビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ）に変換される。近年、Ｓｉｍｏａは、神経学的および神経変性疾患（Mattsson et al., JAMA Neurol. 2017, 74 (5), 557；Shahim et al., JAMA Neurol. 2014, 71 (6), 684；Gill et al., Neurology 2018, 91 (15), e1385-e1389；Ng et al., Clin. Transl. Neurol. 2019, 6 (3), 615-619）、腫瘍学（Wilson et al., Clin. Chem. 2011, 57 (12), 1712-1721；Shi et al., Nature 2019, 569 (7754), 131-135；Olsen et al., J. Immunol. Methods 2018, 459, 63-69）および感染性疾患（Leirs et al., 2016, supra; J. Clin. Microbiol. 2018, 56 (8)；Anderson et al., Clin. Infect. Dis. 2018, 67 (1), 137-140；Ahmad et al., Sci. Transl. Med. 2019, 11 (515), eaaw8287）が挙げられる多数の臨床適用において実行されている（Wu et al., Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 2020, 57 (4), 270-290）。Ｓｉｍｏａは、フェムトモル（ｆｇ／ｍＬ）またはフェムトモル以下の範囲の濃度のタンパク質を検出するために使用され得る。

【0029】

本発明者らは、低から中程度のアトモルタンパク質濃度を検出できる革新的で簡易な単一分子測定プラットフォームを開発した。デジタルＥＬＩＳＡ手法での希少な標的分子の試料採取における低効率の課題に対処することによって、本発明者らは、超高感度タンパク質検出についての現在の絶対的基準である現在のＳｉｍｏａ技術より最大２５倍感度を増強した。本方法によって達成されたアトモルの検出限界（ＬＯＤ）は、感度において従来のイムノアッセイの１０，０００倍を超える増大に相当する。非拡散性の増幅されたシグナルの各ビーズへの局在化は、マイクロウェルまたは液滴へのシグナル区画化の必要性を除外する。

【0030】

一部の実施形態では、方法は、迅速な乾燥および単層フィルムの形成、またはハイドロゲルの層中でのビーズの固定化のために、表面上、例えば、スライドへのすべてのビーズの直接ドロップキャスティングを含む。１つの例示的方法は、単一分子計数のためにオンビーズシグナル生成を単層フィルムへのビーズドロップキャスティングと組み合わせて使用する。これらの方法の一実施形態は、本明細書においてｄＳｉｍｏａと称される。加えて、本明細書で提供するのは、オンビーズシグナル生成のために、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）、触媒レポーター沈着（Catalyzed Reporter Deposition）（ＣＡＲＤ）のための方法を使用し（図９Ａ）、フィブリンハイドロゲルへのビーズの固定化（図９Ｂ）および単一分子計数のための画像化（図９Ｃ）が続く方法である。本方法の一部の実施形態は、本明細書においてＣＡＲＤデジタルＥＬＩＳＡ（ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡ）として言及される。標的分子を保有する各ビーズに非拡散性蛍光シグナルを局在化することによって、このプラットフォームは、シグナル区画化のためのマイクロウェルまたは液滴へのビーズローディングの必要性を除外するだけでなく、試料採取効率の改善のためにさらに著しく多いビーズが分析されるようにし、それにより感度を増強する。

【0031】

この簡易な手法は、平均で全アッセイビーズの４０～５０％が分析されるようにし、現在のＳｉｍｏａ技術の約５％の試料採取効率より８から１０倍増大する。低い試料濃度、特に１００％を大きく下回る捕捉効率（本研究において開発された本アッセイでは、すべての捕捉および標識ステップにわたって約１～３％）では、試料採取の改善は、測定に関連するポアソンノイズＣＶを最小化するために重要である。一部のビーズは、洗浄ステップの際に失われる、または重複もしくは凝集した場合に分析から除外されるが、実験結果は、全アッセイビーズの２０％を分析することは、より多くのビーズが分析されたことから、測定ＣＶおよびＬＯＤでの少しのさらなる改善を伴って、ＬＯＤを約一桁改善したことを示した。本方法の試料採取効率の顕著な改善は、従来のＳｉｍｏａと比較してより少ないアッセイビーズの使用も可能にし、「オン」ビーズの割合およびそれによるシグナル対バックグラウンドを増加させる。感度におけるさらなる改善は、低い解離定数を有する親和性試薬を使用し、親和性試薬とストレプトアビジン－ＤＮＡ標識との非特異的結合を減少させることによって得ることができる。非特異的結合を低減するさらに良好な親和性試薬および方法の開発で本方法は、ゼプトモルタンパク質濃度に至るまで検出できる可能性がある。

【0032】

アトモル感度を有して本方法は、種々の疾患の根底にある新しいバイオマーカーおよび生物学的機構の発見に向けた道を築き得る。原理の証明として、本発明者らは、本方法が、脊索腫患者由来の血漿試料において現在のＳｉｍｏａ技術によっては以前検出できなかった低濃度の、Ｔ－ｂｏｘ－ファミリー転写因子ブラキュリを測定できることを実証した。ブラキュリが、脊索腫患者の腫瘍において高度に過発現されることは示されているが、血漿中のそのレベルは評価されていない^{２６～３０}。脊索腫の診断が、頭蓋底または脊椎への侵襲性の針または切開での生検を必要とすることから、血液ベースの検査は、顕著に低リスクの診断手順を提供し、脊索腫の早期診断を促進する可能性がある^{３１、３２}。本発明者らの測定は、小さな試料コホートにおいてだけで実施されたが、本方法を使用する脊索腫患者の血漿試料中のブラキュリ検出性の顕著な改善は、有望な血液検査および新たな生物学的機構の発見のための新たな可能性を開く。本方法を用いて感度における一桁またはそれ以上の改善を達成することは、多数の他の種類のがんおよび神経学的障害のための新たな血液ベースのバイオマーカーの発見に重要な意義も有する。アルツハイマーおよびパーキンソン病などの神経変性疾患のための診断用血液検査は、高度に侵襲性の腰椎穿刺が必要であることから現在非常に困難である広範なスクリーニングおよび早期の診断のために特に重要であると判明した。バイオマーカーレベルが明らかな疾患進行後にだけ検出可能になる多くの場合では、本方法の感度の増強は、健康転帰の改善のために初期段階での疾患診断を加速できる。

【0033】

重要なことに、本方法は、デジタルバイオアッセイシグナル読み取りの簡易さも増大させ、さらなる開発においてそれは、ＰＯＣプラットフォームに統合することができ、現在のＰＯＣ診断の低い感度の課題に対処する可能性がある。デジタルイムノアッセイにおける感度の増強のための試料採取効率の増大が、ビーズ液滴アレイおよび液滴デジタルＥＬＩＳＡ方法におい実証された一方で、これらの方法が追加的な複雑さを製作および処理ステップにもたらす^{１３、１４}。対照的に、本方法のためのデジタル読み取りプロセスは、追加的な材料または複雑な装置の必要性を伴わずに、ビーズローディングのためのスライドガラスおよび簡易な光学装置だけを必要とする。さらに、ドロップキャスティングプロセスは、極めて簡易かつ迅速である。ドロップキャスト法は、単一分子検出読み取りプロセスを簡易化し、現在のマイクロウェルベースのデジタルＥＬＩＳＡ方法または液滴ベースのデジタルＥＬＩＳＡ方法と比較して対費用効果を増大させる。本方法の感度の増強は、非常に低い濃度で存在し、容易に入手できる生体液、例えば、唾液および尿において、以前測定されなかった種々のバイオマーカーの検出を可能にする。本方法の追加的な興味深い態様は、ドロップキャストフィルムでの長期間のシグナル安定性であり、それはアッセイプロセスにおける柔軟性を増加させる。例えば、好適な光学装置が容易に利用できない物資が限られた環境では、ドロップキャストフィルムは、少なくとも１か月間シグナルの喪失を伴わずに、画像化および分析のための施設に容易に輸送され得る。

【0034】

本方法は、試料処理のためのマイクロ流体デバイスへの統合およびポータブル画像化の組込みが挙げられる、ＰＯＣ適用に適合され得る。例えば、試料処理ワークフローは、マイクロ流体システムに自動化され得、本方法の単一分子分解能および高い試料採取効率と組み合わされ、既存のＰＯＣプラットフォームによっては現在検出できない低含量のバイオマーカーを検出するための高感度を依然として達成しながら、アッセイ時間を低減できる可能性がある。さらに、ＲＣＡの迅速な動態および小さなマイクロ流体反応体積中の拡散距離の低減により、ＲＣＡを含む各試料処理ステップの時間は短縮され得る。ＲＣＡは、下に記載される実施例では１時間で実行されたが、検出可能なシグナルは１５分後に観察可能であった。ＲＣＡシグナル増幅時間は、各コンカテマー上の蛍光標識の空間密度を増加させることによってさらに低減され得る。いくつかの自動化され、合理化されたマイクロ流体に基づく方法は、ビーズベースのイムノアッセイのために開発され、本試料処置ステップは、自動化マイクロ流体プラットフォームに組み込まれ得る^{５、３３～３６}。加えて、多数のポータブル蛍光画像化プラットフォームは、単一蛍光ナノ粒子およびＲＣＡ産生物を画像化するためのスマートフォン付属品を含んで開発され、本方法に容易に適合され得る^{５、３７～４１}。一部の実施形態では、複数のフレームが各ドロップキャストフィルムを完全に捕捉するために使用され得、例えば自動化ハンドヘルドリーダーまたは広角カメラを使用して、さらに短い画像化時間も使用され得る。さらに、本方法を使用する結果のサンプリング分析によって支持される通り、全アッセイビーズの約２０％だけが最大感度近くを達成するために画像化される必要がある可能性がある。本方法の超高感度、ポータブルおよび自動化プラットフォームへの統合は、近年のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックおよび結核などの感染性疾患、外傷性脳損傷ならびに心筋梗塞が挙げられる多数の疾患の広範なスクリーニング、早期発見およびモニタリングを促進するために使用される。

【0035】

現在のバージョンのデジタルＥＬＩＳＡは、簡易なワークフローを有し、生物学的液体中のタンパク質の超高感度定量を可能にする。一部の実施形態では、例えば、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、オンビーズ酵素的シグナル生成のためにチラミドシグナル増幅を使用する。

【0036】

本方法は、フィブリンハイドロゲルへのビーズ封入および単一分子計数のための画像化を含み得る。ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、良好な感度およびダイナミックレンジを示し、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡが従来のＳｉｍｏａへのより簡易だがロバストな選択肢であることを示している。さらに、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、従来のＳｉｍｏａにおいて必要であったいくつかの高価な装置および消耗品の必要性をなくし、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡが、ポイントオブケアデジタルＥＬＩＳＡプラットフォームへの組込みのために好適であることを実証している。今後の研究は、統合された試料処理（すなわち、標的捕捉、標識化およびオンビーズシグナル増幅）^{１３、３２、３３}、ビーズ画像化ならびにデータ分析を含む、組み合わされたポイントオブケアＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡプラットフォームを開発することを含むであろう。ビーズ画像化のために、本発明者らは、マイクロの、およびナノスケールの対象物を測定するための感度を有するプラットフォームに小型の顕微鏡モジュールを組み込む。顕微鏡モジュールは、ＬＥＤ光原、適切なフィルターおよびレンズを含み、画像化は、スマートフォンカメラ^{３４～３６}またはコンパクトＣＭＯＳ^３７を使用して実施される。さらに本発明者らは、アッセイ感度を増大させ、総アッセイ時間を減少させるためにＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを最適化および改善し続けている。現在ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、従来のＳｉｍｏより感度が約１０分の１であるが、完全に統合されたポイントオブケアデバイスへのＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡの自動化は、バックグラウンドシグナルのＣＶ（変動係数）をおそらく低下させ、それによりアッセイ感度を改善する。ポイントオブケアデバイスに統合されれば、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、ＴＢ、敗血症または軽度の外傷性脳傷害などの疾患についてのトリアージ検査または早期診断のための有望なプラットフォームである。

【0037】

アッセイ方法
本方法では、溶液中の試料は、ビーズ－生体分子複合体を形成するように試料のビーズへの結合を可能にする条件下で、目的の生体分子に結合する捕捉部分にコンジュゲートされた複数のビーズと接触される。複合体が形成されると、方法は、標的分子を保有する各ビーズの検出を可能にし、次いで増幅されたシグナルを生成するオンビーズで非拡散性の検出可能なシグナル、例えば蛍光シグナルの生成を可能にする、第２の捕捉部分と生体分子を接触させることを含む。方法は、未結合ビーズの除去を含み得る。

【0038】

次いで方法は、例えばビーズを含む溶液をフィルムを形成するように表面上にドロップキャストすることによって（例えば、溶液の平らな表面への滴下に続く溶液の蒸発による薄いフィルムの形成）、または溶液のゲル化を触媒することによってビーズを固定化することを含む。表面として、例えば画像化による検出に適用される、例えば、スライド、チップまたはフローセルが挙げられる。最後に方法は、ビーズ由来のシグナルを検出することならびに任意選択でビーズ－生体分子複合体を含むビーズの数および／または百分率を決定することを含む。

【0039】

一般に試料は、画像化の前は未処理のまま維持される、例えば、画像化の前に細分されず、個々のウェルに区画化されない。本方法は、マイクロウェルまたは液滴へのシグナルの区画化の必要性を除外する。

【0040】

試料
本明細書において使用される場合、用語「試料」は、本発明の方法を使用して目的のマーカーの生体分子の存在について検査される材料に言及する場合、とりわけ、組織、全血、血漿、血清、尿、汗、唾液、呼気、エキソソームまたはエキソソーム様マイクロベシクル（米国特許第８．９０１．２８４号明細書）、リンパ液、大便、脳脊髄液、腹水、気管支肺胞洗浄液、胸水、精液、痰、乳頭吸引液、術後漿液腫または創部ドレナージ液を含む。使用される試料の種類は、検査される生物学的マーカーおよび本方法が使用される臨床的状況の特性に応じて変化する場合がある。試料由来の生物学的マーカーの同定および／または単離および／または精製のための種々の方法が当技術分野内で周知である。「単離された」または「精製された」生物学的マーカーは、生物学的マーカーが由来する細胞または組織源由来の細胞物質または他の混入物を実質的に含まない、すなわち、ヒトの介入を通じて天然の状態から部分的にまたは完全に変更または除去されている。例えば、試料中に含有される核酸は、標準的方法に従って、例えば、溶解性酵素、化学溶液を使用して最初に単離されるか、または製造者の説明書に従って核酸結合レジンによって単離される。

【0041】

ビーズ
本方法は、所望の生体分子に結合する捕捉部分にコンジュゲートされたマイクロまたはナノ粒子ビーズの使用を含む。マイクロおよび／またはナノ粒子（例えば、マイクロビーズ）は、種々の材料から作られてよい。一般に、任意のポリマー性またはプラスチック材料が、マイクロ粒子、マイクロビーズまたはナノ粒子を創出するために使用されてよく、例えば、ポリスチレンおよびポリエチレンなどの材料が挙げられる。一部の実施形態では、マイクロ粒子は、生物学的に適合性のポリマー材料、例えばポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、および／またはポリアミドから形成され得る。

【0042】

ある特定の実施形態では、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｄ、Ｓｅ、Ｇｅ、Ｐｄ、Ｓｎ、酸化鉄、ＴｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３およびＳｉＯ_２の１つまたは複数から形成された金属性、金属酸化物、半導体および／または半導体酸化物ミクロおよび／またはナノ粒子は、多数のサイズで作製され、使用され得る。例えば、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）および架橋された酸化鉄（ＣＬＩＯ）粒子が使用され得る。一部の実施形態では、ビーズは、常磁性である。好適なビーズとして、これだけに限らないが、磁性ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、シリカビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイト（carbon graphited）ビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセルおよびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズが挙げられる。一部の実施形態では、球状のビーズが使用されるが、非球状または不規則な形状のビーズも使用され得る。

【0043】

一部の実施形態では、ビーズは、「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｎｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅａｒｒａｙｓ，」Ｄ．Ｄｕｆｆｙ、Ｅ．Ｆｅｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ、Ｄ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｗａｌｔ．米国特許第８，２２２，０４７号明細書、２０１２年７月１７日；「Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｒｒａｙｓｆｏｒｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ，」Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ．米国特許第８，４６０，８７９号明細書、２０１３年６月１１日；「Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｒｒａｙｓｆｏｒｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｔｈａｔａｆｆｅｃｔａｒｅａｃｔｉｏｎ」ＤａｖｉｄＷａｌｔ、ＤａｖｉｄＲｉｓｓｉｎ、Ｈａｎｓ－ＨｅｉｎｅｒＧｏｒｒｉｓ．米国特許第８，４９２，０９８号明細書、２０１３年７月２３日；「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｎｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅａｒｒａｙｓ，」ＤａｖｉｄＣ．Ｄｕｆｆｙ、ＥｖａｎＦｅｒｒｅｌｌ、ＪｅｆｆｒｅｙＤ．Ｒａｎｄａｌｌ、ＤａｖｉｄＭ．Ｒｉｓｓｉｎ、ＤａｖｉｄＲ．Ｗａｌｔ．米国特許第８，８４６，４１５号明細書、２０１４年９月３０日；「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｒｐａｒｔｉｃｌｅｓｕｓｉｎｇｂｅａｄｓｏｒｏｔｈｅｒｃａｐｔｕｒｅｏｂｊｅｃｔｓ，」Ｄ．Ｃ．Ｄｕｆｆｙ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ、Ｄ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、Ｃ．Ｋａｎ．ＱｕａｎｔｅｒｉｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．米国特許第９，３１０，３６０号明細書、２０１６年４月１２日；「Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｒｒａｙｓｆｏｒｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ，」Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ．米国特許第９，３９５，３５９号明細書、２０１６年７月１９日；または「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｒｐａｒｔｉｃｌｅｓｕｓｉｎｇｂｅａｄｓｏｒｏｔｈｅｒｃａｐｔｕｒｅｏｂｊｅｃｔｓ」、Ｄ．Ｃ．Ｄｕｆｆｙ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ、Ｄ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、Ｃ．Ｋａｎ．ＱｕａｎｔｅｒｉｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．米国特許第９，４８２，６６２号明細書、２０１６年１１月１日；または国際公開第２０２００３７１３０号パンフレットに記載される通りである。

【0044】

捕捉および結合部分
ビーズは、目的の生体分子に結合する捕捉部分を用いてコート、例えば、コンジュゲートされる。追加的に、結合部分は、生体分子に結合したビーズを検出し、それ由来のシグナルを増幅するために使用される。

【0045】

一部の実施形態では、捕捉または結合部分は、抗体またはその抗原結合性部分または生体分子に結合するアプタマーであり、例えば、生体分子はタンパク質またはペプチドである。一部の実施形態では、捕捉または結合部分は、目的の核酸の一部に相補性であるオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、捕捉または結合部分は、タンパク質の、例えば受容体のリガンド結合部分であり、生体分子はホルモンなどの分子である。

【0046】

捕捉または結合部分は、捕捉部分または標的分析物に特異的に結合できるまたは、そうでなければ特異的に会合できる。捕捉または結合部分は、捕捉部分にコンジュゲート、捕捉、付着、結合または付き得る。例えば一部の実施形態では、捕捉または結合部分は、抗体（例えば、全長抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体）または抗原結合性抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、ＦｖまたはＦｅｂ））、アプタマー、抗体模倣物（例えば、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（fynomer）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、またはナノＣＬＡＭＰ）、抗体ＩｇＧ結合タンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬまたは組換えプロテインＡ／Ｇ）、ポリペプチド、核酸または小分子である。例えば一部の実施形態では、捕捉または結合成分は、抗体のＦｃ領域に結合する。

【0047】

一部の実施形態では、方法は、生体分子に結合する捕捉部分；および捕捉部分に結合する結合部分の使用を含む。一部の実施形態では、方法は、生体分子に結合する捕捉部分；捕捉部分に結合する第１の結合部分；および第１の結合部分に結合する第２の結合部分またはシグナル増幅部分の使用を含む。捕捉部分、結合部分または第２の結合部分／シグナル増幅部分の１つまたは複数は、検出可能な標識を含むか、または生成できる。例えば、一部の実施形態では、結合部分はビオチンを含み、第２の結合部分／シグナル増幅部分はシグナル生成の前に結合するストレプトアビジン標識西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素である。試料は、捕捉および結合部分と同時に（例えば、同じ溶液中で）接触される場合があるか、または連続的に、例えば捕捉部分と接触され、次に結合部分と接触される場合がある。方法は、検出の前にすべての未結合の試薬、例えば、ビーズ、捕捉および／または結合部分を除去することを含み得る。

【0048】

一部の実施形態では、捕捉または結合部分は、「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｎｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅａｒｒａｙｓ，」Ｄ．Ｄｕｆｆｙ、Ｅ．Ｆｅｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ｒａｎｄａｌｌ、Ｄ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｗａｌｔ．米国特許第８，２２２，０４７号明細書、２０１２年７月１７日；「Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｒｒａｙｓｆｏｒｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ，」Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ．米国特許第８，４６０，８７９号明細書、２０１３年６月１１日；「Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｒｒａｙｓｆｏｒｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｔｈａｔａｆｆｅｃｔａｒｅａｃｔｉｏｎ」ＤａｖｉｄＷａｌｔ、ＤａｖｉｄＲｉｓｓｉｎ、Ｈａｎｓ－ＨｅｉｎｅｒＧｏｒｒｉｓ．米国特許第８，４９２，０９８号明細書、２０１３年７月２３日；「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｎｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅａｒｒａｙｓ，」ＤａｖｉｄＣ．Ｄｕｆｆｙ、ＥｖａｎＦｅｒｒｅｌｌ、ＪｅｆｆｒｅｙＤ．Ｒａｎｄａｌｌ、ＤａｖｉｄＭ．Ｒｉｓｓｉｎ、ＤａｖｉｄＲ．Ｗａｌｔ．米国特許第８，８４６，４１５号明細書、２０１４年９月３０日；「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｒｐａｒｔｉｃｌｅｓｕｓｉｎｇｂｅａｄｓｏｒｏｔｈｅｒｃａｐｔｕｒｅｏｂｊｅｃｔｓ，」Ｄ．Ｃ．Ｄｕｆｆｙ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ、Ｄ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、Ｃ．Ｋａｎ．ＱｕａｎｔｅｒｉｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．米国特許第９，３１０，３６０号明細書、２０１６年４月１２日；「Ｍｅｔｈｏｄｓａｎｄａｒｒａｙｓｆｏｒｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔａｎａｌｙｔｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎ，」Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ．米国特許第９，３９５，３５９号明細書、２０１６年７月１９日；または「Ｕｌｔｒａ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌｅｓｏｒｐａｒｔｉｃｌｅｓｕｓｉｎｇｂｅａｄｓｏｒｏｔｈｅｒｃａｐｔｕｒｅｏｂｊｅｃｔｓ」，Ｄ．Ｃ．Ｄｕｆｆｙ、Ｄ．Ｍ．Ｒｉｓｓｉｎ、Ｄ．Ｒ．Ｗａｌｔ、Ｄ．Ｆｏｕｒｎｉｅｒ、Ｃ．Ｋａｎ．ＱｕａｎｔｅｒｉｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ．米国特許第９，４８２，６６２号明細書、２０１６年１１月１日；または国際公開第２０２００３７１３０号パンフレットに記載される通りである。

【0049】

生体分子
一部の実施形態では、目的の生体分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、ウイルス、細胞表面分子、代謝物または小分子である。

【0050】

「生体分子」によって、検出される、測定される、定量されるまたは評価されるかのいずれかの任意の原子、分子、イオン、分子イオン、化合物、粒子、細胞、ウイルス、複合体またはこれらの断片が意味される。標的分析物は、試料（例えば、液体試料（例えば、生物学的試料または環境試料））中に含有され得る。例示的な標的分析物として、非限定的に、小分子（例えば、有機化合物、ステロイド、ホルモン、ハプテン、生体アミン、抗生物質、マイコトキシン、有機汚染物質、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類もしくは二次代謝物）、タンパク質（糖タンパク質またはプリオンを含む）、核酸（例えば、修飾核酸またはｍｉＲＮＡ）、多糖類、脂質、細胞外ベシクル、グリカン、毒素、脂肪酸、細胞、ガス、治療剤、生物（例えば、病原体）またはウイルスが挙げられる。標的分析物は、天然に存在するか、または合成であってよい。一部の実施形態では、標的分析物は、インターフェロン、例えば、インターフェロンｇ（ＩＦＮｇ）である。一部の実施形態では、標的分析物は、インターロイキン、例えば、インターロイキン２（ＩＬ－２）である。

【0051】

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的にされ、少なくとも２個の共有結合で連結されたヌクレオチドモノマーを指す。用語は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）これらのハイブリッドおよびこれらの混合物を包含する。ヌクレオチドは、典型的には核酸中でリン酸ジエステル結合によって連結されているが、用語「核酸」は、他の種類の連結または骨格（例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミド、ジチオリン酸、Ｏ－メチルホスホロアミデート、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびペプチド核酸（ＰＮＡ）連結または骨格など）を有する核酸類似体も包含する。核酸は１本鎖、２本鎖であってよく、または１本鎖および２本鎖配列の両方の部分を含有してよい。核酸は、デオキシリボ核酸およびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびに、例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシルおよび修飾もしくは非標準的塩基を含む塩基の任意の組合せを含有し得る。

【0052】

本明細書において「タンパク質」によって、共有結合で連結された少なくとも２個のアミノ酸が意味され、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合または合成ペプチド模倣構造から構成され得る。これにより、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、本明細書において使用される場合、天然に存在するおよび合成のアミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的のためのアミノ酸とみなされる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）立体配置のいずれであってもよい。一部の実施形態では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ－立体配置にある。天然に存在しない側鎖が使用される場合、例えばｉｎｖｉｖｏでの分解を妨げるまたは遅らせるために非アミノ酸置換基が使用される場合がある。用語「一部」は、全長または参照ポリペプチドよりも少ないアミノ酸（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％少ないアミノ酸）を含有する断片（例えば、切断産生物または組換え的に産生された断片）または要素もしくはドメイン（例えば、活性を有するポリペプチドの領域）などのタンパク質の任意の領域を含む。

【0053】

用語「小分子」は、本明細書において使用される場合、５０００Ｄａ未満の分子量を有する任意の分子を意味する。例えば、一部の実施形態では、小分子は、有機化合物、ステロイド、ホルモン、ハプテン、生体アミン、抗生物質、マイコトキシン、シアノトキシン、ニトロ化合物、残留薬物、残留農薬、有機汚染物質、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖類または二次代謝物である。国際公開第２０２００３７１３０号パンフレットも参照されたい。

【0054】

検出方法
本方法は、単一分子シグナル生成のためにオンビーズシグナル増幅を含む。シグナルは、任意の検出可能なシグナル、例えば、蛍光もしくは化学発光または比色分析などの光学的に検出可能な標識であってよく、あるいは他の標識、例えば、金ビーズまたは非光学的アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴または他の方法を使用する）によって検出可能な他の標識であってよい。一部の実施形態では、方法は、コンカテマーのローリングサークル増幅を使用し；各免疫複合体に付着した生成されたＤＮＡコンカテマーは、可視化のために多数の相補性の蛍光標識されたＤＮＡプローブにハイブリダイズされ得る。これらの方法では感度は、ＲＣＡ時間を増大（より高い感度）または減少（より低い感度）させることによって調整され得る。

【0055】

他の核酸増幅方法も使用され得る、例えば、ハイブリダイゼーション連鎖反応、酵素触媒近接標識化（ＰＬ）重合（例えば、Branon et al., Nat Biotechnol. 2018 Oct;36(9):880-887を参照されたい）；重合ベースシグナル増幅（例えば、可視光誘導重合、例えば、Badu-Tawiah et al., Lab Chip, 2015, 15, 655に記載の通り）；磁気ビーズ量子ドットイムノアッセイ（Kim et al., ACS Sens. 2017, 2, 6, 766-772）；または免疫シグナルハイブリダイゼーション連鎖反応（ｉｓＨＣＲ）（Lin et al., Nat Methods. 2018 Apr;15(4):275-278）。分枝状ＤＮＡも使用され得る。

【0056】

代替的に、方法は、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を使用することを含む。ＴＳＡは、触媒レポーター沈着（ＣＡＲＤ）とも称され、低含量で存在する生体分子の検出を可能にする高感度法である。ＴＳＡは、免疫組織化学およびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験において使用され、デジタルＥＬＩＳＡに使用されている（Akama et al., Anal. Chem. 2016, 88 (14), 7123-7129）。ＴＳＡでは、ＨＲＰ（例えば、第２の結合部分に結合する）は、次いで、近くのチロシン残基に供給結合で結合し、高密度の検出可能なシグナルを生成する反応性ラジカルへの標識チラミドの変換を触媒する。

【0057】

他の増幅化学も使用され得る、例えばDunbar and Das, J Clin Virol. 2019 Jun; 115: 18-31に記載の通り、例えば、分枝状ＤＮＡアッセイ（ｂＤＮＡ）。

【0058】

一部の実施形態では、方法は、結合部分を、標識されたポリマーまたはナノ粒子；例えばTang et al., Analyst, 2013,138, 981-990；Hansen et al., Anal Bioanal Chem. 2008 Sep; 392(1-2): 167-175；Wu et al., Chem 2, 760-790, June 8, 2017；Skaland et al., Applied immunohistochemistry & molecular morphology: AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry 18(1):90-6 (2009)；Gormley et al., Nano Lett. 2014, 14, 11, 6368-6373（酵素または金属イオンのいずれかによって生成されたラジカルは、複数の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を巻き込むポリマーを形成するように重合される）を参照されたい；色素ロードポリマーナノ粒子（例えば、Melnychuk and Klymchenko, J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 34, 10856-10865に記載の通り）などのプレ増幅されたシグナルに接触させることを含む。

【0059】

選択用の検出可能な（detactable）標識のために好適な画像化または他の方法は使用され得る。一部の実施形態では、ビーズは、単層に固定化され、単一ｚセクション画像化が使用され得る；ビーズが単層中にない実施形態では、方法は、異なるｚセクションを画像化することを含み得る。

【0060】

ハイドロゲル
一部の実施形態では、方法は、シグナル検出の前に個々のビーズを固定化するためのハイドロゲルの層のゲル化を含む。ハイドロゲルのゲル化を触媒するための方法は、当技術分野において公知である。ハイドロゲルは、例えば、フィブリン、フィブリノーゲン、セルロース、コラーゲン、ゼラチン、アガロースおよびヒアルロン酸、またはポリヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ（ＨＥＭＡ））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはアクリルアミドなどの合成ハイドロゲルを含み得る。例えば、Ahmed, J Adv Res. 2015 Mar;6(2):105-21を参照されたい。

【0061】

キット
同様に本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法における使用のための、例えば、本明細書に記載されるビーズおよび試薬を含むキットである。

【実施例】

【0062】

本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。

【0063】

[実施例１]
ドロップキャスト単一分子アッセイによるアトモルタンパク質濃度の超高感度検出
本発明者らは、現在の最新鋭のデジタルＥＬＩＳＡ技術より最大２５倍感度を増強した簡易な超高感度単一分子検出プラットフォームを開発した。希少な標的分子の試料採取を改善することによって、本手法は、アトモル範囲でのタンパク質検出を可能にし、それにより以前は測定できなかった広範な有望な疾患バイオマーカーへの機会を開いた。重要なことに、本方法はデジタルアッセイ読み取りプロセスを簡易化し、それによりＰＯＣシステムへの将来的な統合にさらに適している。プラットフォームは、以前開発されたＳｉｍｏａアッセイと比べてより簡易で、より感度が高いアッセイで、マイクロＲＮＡおよび小分子を含む他の疾患関連生体分子を測定することにも容易に適合され得る^{４２、４３}。現在の方法によっては検出できない非常に低い濃度の生体分子を測定することによって、本方法は、早期の疾患診断を促進できる超高感度検出のためのプラットフォームを提供する。

【0064】

方法
材料。この研究において使用したすべての抗体、組換えタンパク質およびＤＮＡ配列は、付帯情報に列挙する。ＤＮＡプライマー、テンプレートおよびプローブは、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから入手した。コンジュゲーションおよびアッセイ緩衝液ならびに色素エンコードカルボキシル化２．７μｍ常磁性ビーズ（ＨｏｍｅｂｒｅｗＭｕｌｔｉｐｌｅｘＢｅａｄｓ４８８）は、ＱｕａｎｔｅｒｉｘＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから購入した。

【0065】

抗体コート捕捉ビーズの調製。各標的について、捕捉抗体をビーズコンジュゲーション緩衝液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）に、５０ＫＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（０．５ｍＬ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用して緩衝液交換した。ビーズコンジュゲーション緩衝液をフィルター中の抗体溶液に５００μＬまで加え、１４，０００ｘｇ、５分間での遠心分離を続けた。溶離液を廃棄し、プロセスを２回反復した。緩衝液交換した抗体を新たなチューブ中にフィルターを反転させ、１０００ｘｇ、２分間遠心分離し、続いて５０μＬビーズコンジュゲーション緩衝液でのすすぎおよび１０００ｘｇ、２分間での２回目の遠心分離を行うことによって回収した。抗体濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて測定し、続くビーズカップリングのために抗体をビーズコンジュゲーション緩衝液中の０．５ｍｇ／ｍＬ（ＩＬ－１０）、０．３ｍｇ／ｍＬ（ブラキュリ）または０．２ｍｇ／ｍＬ（ＩＬ－１β）に希釈した。２．８×１０^８個の色素エンコード常磁性ビーズを、２００μＬビーズ洗浄緩衝液（ビーズコンジュゲーション緩衝液）を用いて３回、および２００μＬビーズコンジュゲーション緩衝液を用いて２回洗浄し、１９０μＬ冷ビーズコンジュゲーション緩衝液に再懸濁した。次に、１ｍｇバイアルの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１００μＬ冷ビーズコンジュゲーション緩衝液中に再構成し、１０μＬを直ちにビーズに加えた。ビーズを振とうしながら３０分間活性化した。活性化後、ビーズを２００μＬ冷ビーズコンジュゲーション緩衝液を用いて洗浄し、２００μＬの捕捉抗体溶液に再懸濁し、抗体カップリングのために２時間振とう器上に置いた。続いて、抗体をカップリングしたビーズを２００μＬビーズ洗浄緩衝液を用いて２回洗浄し、２００μＬビーズブロッキング緩衝液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を用いて３０分間、振とうしながらブロックした。ブロッキング後、ビーズを２００μＬビーズ希釈液への再懸濁の前に、２００μＬビーズ洗浄緩衝液、次に２００μＬビーズ希釈液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を用いて洗浄した。ＩＬ－１βについて、ＥＤＣ活性化および抗体カップリングステップを４℃で、ビーズ４．２×１０^８個、ビーズ活性化のための９μＬＥＤＣおよびコンジュゲーションのための３００μＬ０．２ｍｇ／ｍＬ抗体を用いて実施した。ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＺ１ＰａｒｔｉｃｌｅＣｏｕｎｔｅｒをビーズを計数するために使用し、アッセイでの続く使用のために４℃で保存した。

【0066】

ストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートの調製。４５μＬ１００μＭプライマー、５４μＬ１００μＭテンプレートおよび２６．６μＬ５ｘＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ＱｕｉｃｋＬｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）の溶液を９５℃、２分間加熱し、９０分かけてゆっくり室温に冷やすことによって、ＲＣＡテンプレート（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を５’アジド修飾プライマー（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に最初にアニールした。次にテンプレートに７．５μＬＴ４ＤＮＡリガーゼ（２，０００，０００単位／ｍＬ、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を加え、反応物を室温、３時間インキュベートすることによってライゲートさせた。次にライゲーション反応物を１ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳにＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（７ＫＭＷＣＯ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して緩衝液交換した。ストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ２８０３０２）を１０ＫＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルター（０．５ｍＬ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を用いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換し、捕捉抗体について上に記載した同じ緩衝液交換手順が続き、次にＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ、１ｍｇ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を２００μＬジメチルスルホキシドに溶解し、２０倍モル過剰量を緩衝液交換したストレプトアビジンに加えた。コンジュゲーション反応物を３０分間、室温でインキュベートし、次に１０ＫＡｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを用いて精製した。コンジュゲートしたストレプトアビジンを１ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて５回の１４，０００ｘｇ、５分間の遠心分離に続く１４，０００ｘｇ、１５分間の１回の遠心分離で洗浄した。次に、精製したＤＢＣＯコンジュゲートしたストレプトアビジンを、フィルターを反転させ、１０００ｘｇ、２分間遠心分離することによって回収した。アニールしたプライマーテンプレートをＤＢＣＯ－コンジュゲートストレプトアビジンに２倍モル過剰で加え、コンジュゲーション反応を一晩、４℃で進行させた。次にストレプトアビジンＤＮＡコンジュゲートを、さらなる精製をせずに０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．０２％アジ化ナトリウムを含むアリコートに、－８０℃で保存した。

【0067】

ドロップキャスト単一分子アッセイ。すべてのｄＳｉｍｏａアッセイは、９６ウェルプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－Ｏｎｅ、６５５０９６）において実施した。抗体コートビーズ、組換えタンパク質およびビオチン化検出抗体を所望の濃度に試料希釈液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）に希釈した。各アッセイのための検出抗体およびストレプトアビジン－ＤＮＡ濃度を付帯情報に記載する。各アッセイについて、１０μＬ抗体コートビーズ（総ビーズ１００，０００個）および１０μＬビオチン化検出抗体を１００μＬのタンパク質試料に加えた。次にプレート密封し、１時間、免疫複合体形成のために振とうした。ビーズをシステム洗浄緩衝液１（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を用いてＢｉｏＴｅｋ４０５ＴＳマイクロプレート洗浄機を使用して６回洗浄し、その後、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む試料希釈液中に希釈した１００μＬストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートへ再懸濁した。プレートを免疫複合体のストレプトアビジン－ＤＮＡ標識のために、１５分間振とうし、次いでシステム洗浄緩衝液１を用いてマイクロプレート洗浄機を使用して８回洗浄した。洗浄後、ビーズを新たな９６ウェルプレートに移し、６０μＬＲＣＡ溶液に再懸濁する前に２００μＬシステム洗浄緩衝液１を用いて追加に洗浄した。ＲＣＡ溶液は、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４および１０ｍＭＭｇＣｌ_２を含む反応緩衝液中の、０．５ｍＭデオキシヌクレオチドミックス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、０．３３Ｕ／ｕＬｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、１ｎＭＡＴＴＯ６４７Ｎ標識ＤＮＡプローブ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０からなる。Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム（７ＫＭＷＣＯ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して製造者から得たｐｈｉ２９ポリメラーゼ溶液からジチオスレイトール（ＤＴＴ）を除去した。ＲＣＡを３７℃、１時間、プレートを振とうしながら実施し、その後５ｍＭＥＤＴＡを含む１５０μＬＰＢＳを各試料に加え、ＲＣＡ反応を停止させた。次いでビーズを２００μＬドロップキャスト緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、０．５％ＢＳＡ）を用いて２回洗浄し、再懸濁および手作業のピペッティングでのスライドガラスへのドロップキャスティングの前に１０～１５μＬに濃縮した。ドロップキャストビーズを単層フィルムを形成するように１０から１５分間乾燥させた。

【0068】

唾液試料について、プールされたヒト唾液（ＢｉｏＩＶＴ）を１３，１５０ｘｇ、２０分間、４℃で遠心分離した。希釈直線性実験では、所望の体積の上清をプロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ（商標）ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む試料希釈液中に２から３２倍系列希釈した。添加および回収実験のために、組換えヒトＩＬ－１０タンパク質を４倍希釈唾液試料に１００、１０および１ｆＭで添加した。

【0069】

脊索腫患者由来の血漿試料は、Ｄｒ．ＳａｎｄｒｏＳａｎｔａｇａｔａおよびＤｒ．ＫｅｉｔｈＬｉｇｏｎ（ＢｒｉｇｈａｍａｎｄＷｏｍｅｎ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌ）から入手し、２０００ｘｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、凍結融解サイクルを避けるために上清をアリコートした。市販の血漿および血清試料は、ＢｉｏＩＶＴから入手した。すべての試料は、測定のために試料希釈液中に８倍希釈した。

【0070】

画像化および分析。ドロップキャストビーズフィルムの明視野および蛍光画像は、科学用ＣＭＯＳカメラ（ＯＲＣＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ＬＴ＋、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）および１０ｘ対物レンズを備えたＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８１倒立顕微鏡を使用して取得した。ＧＦＰフィルター（露光１秒）を用いて得た蛍光画像を、色素エンコードビーズを位置付けるために使用し、Ｃｙ５フィルター（露光１秒）を用いて得た蛍光画像は「オン」対「オフ」ビーズを同定するために使用した。市販のソフトウェア（ｃｅｌｌＳｅｎｓ）をステージおよびカメラを制御するために使用した。明視野および蛍光画像を各フレームについて取得し、複数のフレームは、フィルム端を除くドロップキャストフィルム全体を捕捉するために取得した。ドロップキャストフィルムあたり約２０～２５個のフレームをおよそ１５分の平均総画像化時間で取得した。

【0071】

画像解析をＭＡＴＬＡＢにおいて実施した。不均等な照明を補正するためのトップハットフィルター処理（top-hat filtering）を備えたディスク型形態構造化エレメント（morphological structuring element）を使用してビーズを最初に４８８ｎｍ蛍光画像に位置付けた。重複しているまたは凝集したビーズを流域セグメンテーション（watershed segmentation）によって分離し、残ったすべての凝集したビーズをサイズカットオフによって除去した。同定された各ビーズの最大シグナル強度は、不均一な照明を補正するためのトップハットフィルター処理を最初に受けた、対応するＣｙ５蛍光画像において決定した。ガウス分布をビーズ蛍光強度にフィットさせ、「オン」対「オフ」ビーズについてのカットオフ強度値を分布の平均から標準偏差の５倍より上として決定した。それにより、カットオフ値を超える強度のすべてのビーズを「オン」ビーズとして計数する。ビーズの割合は、ビーズの総数分の「オン」ビーズの総数として算出し、ビーズあたりの平均分子（ＡＭＢ）は、続いてポアソン分布から算出した。

【0072】

較正曲線をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍにおいて４パラメーターロジスティクス（４ＰＬ）フィットを使用してフィットさせ、未知試料の濃度を決定するために使用した。較正曲線フィットのＲ^２値は、付帯情報に見出すことができる。２連で実施した希釈直線性ならびに添加および回収アッセイを除いて、すべての測定は、３～４連で実施した。各アッセイの検出限界（ＬＯＤ）は、バックグラウンドＡＥＢから標準偏差の３倍より上に対応する濃度として算出した。

【0073】

Ｓｉｍｏａアッセイ。従来のＳｉｍｏａアッセイを、対応するｄＳｉｍｏａアッセイにおいてと同じ抗体コート捕捉ビーズ（アッセイあたりビーズ５００，０００個）およびビオチン化検出抗体を同じ濃度で、試料体積１００μＬを使用してＨＤ－ＸＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）において実施した。ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）濃縮物（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を所望の濃度にＳβＧ希釈液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）中で希釈した。１時間の同じインキュベーション時間を、ビーズ、試料および検出抗体を免疫複合体サンドイッチ形成のためにインキュベートする抗体捕捉ステップについて使用した。各標的について、２つのアッセイ条件を実施した：対応するｄＳｉｍｏａアッセイと同じＳβＧ濃度およびインキュベーション時間を用いる１つのアッセイ、ならびにＨＤ－Ｘにおいて使用される標準ＳβＧ濃度およびインキュベーション時間を用いる１つのアッセイ（１５０ｐＭＳβＧ、５分間）。ビーズ、検出抗体およびＳβＧをプラスチックボトル（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）に入れ、試料を９６ウェルプレートに加え、そのすべてをＨＤ－ＸＡｎａｌｙｚｅｒにロードした。酵素基質（レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド）、洗浄緩衝液１、洗浄緩衝液２およびＳｉｍｏａシーリングオイルを製造者の説明書に従ってＨＤ－ＸＡｎａｌｙｚｅｒにロードした。すべてのアッセイステップ、画像解析およびビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ）の算出を、以前詳細に記載の通り自動化した^１３。

【0074】

結果
ドロップキャスト単一分子アッセイの開発
「オン」および「オフ」ビーズの計数のためのビーズドロップキャスティングを可能にするために、本発明者らは、先ず、完全免疫複合体サンドイッチを保有する各ビーズ上に局在化したシグナルを生成するための戦略を開発した。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、環状ＤＮＡテンプレート周囲のポリメラーゼの進行性の作用に基づく等温ＤＮＡ増幅法は、迅速で強いシグナル増幅を提供するようにＤＮＡリピートの長いコンカテマーを生成する。ＲＣＡが、個々のタンパク質タンパク質複合体および核酸の検出のために成功裏に使用されていることから、本発明者らは、ＲＣＡがビーズ上に捕捉された単一免疫複合体サンドイッチの検出を可能にすると仮定した^{２０～２３}。ＲＣＡは、マルチプレックスなタンパク質検出を可能にするようにマイクロウェルアレイ中で単離されたビーズ上の免疫複合体上で実施される^２４。本発明者らの単一分子検出プラットフォームにＲＣＡを組み込むために、本発明者らは、環状ＤＮＡテンプレートにアニールされたＲＣＡプライマーを用いて各免疫複合体サンドイッチを標識した（図１）。ＲＣＡを実施した後に、各免疫複合体に付着された生成されたＤＮＡコンカテマーは、可視化のために多数の相補性の蛍光標識されたＤＮＡプローブとハイブリダイズされ得る。

【0075】

ｄＳｉｍｏａ法は、抗体コート常磁性ビーズが免疫複合体サンドイッチを形成するように試料およびビオチン化検出抗体とインキュベートされる、従来のＳｉｍｏａと同じ標的捕捉ステップを利用する。しかし、免疫複合体サンドイッチをストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）を用いて標識する代わりに、プレアニールされたプライマーテンプレート対にコンジュゲートされたストレプトアビジンを免疫複合体サンドイッチを標識するために使用する。次にＲＣＡを、シグナル増幅のために各標識免疫複合体サンドイッチについて３７℃で実行する。さらに、蛍光標識されたＤＮＡプローブをｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためにＲＣＡ反応物に加える。ＲＣＡ反応後、ビーズを洗浄し、濃縮し、スライドガラスにドロップキャストし、画像化のために単層フィルムを形成するように乾燥させる。免疫複合体形成のために検出抗体ＤＮＡコンジュゲートを直接使用し、ＲＣＡが続く本発明者らの予備的な試みが、高いバックグラウンドシグナル（データ未記載）を生じたことから、本発明者らは、すべてのｄＳｉｍｏａアッセイのためにストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートを使用した。

【0076】

ドロップキャストフィルムでのシグナル増幅およびビーズ分布を評価するために、本発明者らは、以前検証したＳｉｍｏａアッセイにおいて使用した同じ捕捉および検出抗体対を用いて、モデル分析物としてのインターロイキン－１ベータ（ＩＬ－１β）を検出するためにｄＳｉｍｏａを使用した。ドロップキャスト緩衝液由来の塩結晶形成が明視野でのビーズ同定を妨害する場合があることから、蛍光色素エンコードビーズ（４８８ｎｍ）を、分析のためのドロップキャストフィルムでのビーズ同定を促進するために使用した。アッセイビーズ１００，０００個およびおよそ１５μＬのドロップキャスト体積を用いて、ドロップキャストビーズフィルムは、フィルムにわたって最小限のビーズ凝集および高く、均一なビーズ密度を示す（図２Ａ～Ｂ）。さらに、ドロップキャストプロセスは、迅速で、１５μＬドロップキャスト体積は１５分間以内に直径１２～１５ｍｍのフィルムに乾燥される。ビーズ上に捕捉された標的分析物の存在は、ビーズの全体または一部を覆う蛍光シグナルによって示される（図２Ｃ～Ｅ）。画像解析での凝集したビーズの含有が「オン」ビーズの算出される割合の正確性に影響を与える場合があることから、各フィルム中のビーズの約２０～２５％を構成する２つ以上のビーズのビーズ凝集物は、画像解析アルゴリズムにおいて流域セグメンテーションによって分離し、いずれの残存ビーズ凝集物もサイズ閾値を介して分析から排除した。ドロップキャストフィルムにおいて画像化されたすべてのビーズでの最大蛍光強度の代表的なヒストグラムは、ＲＣＡによって生成されたコンカテマーの幅広いサイズ分布のために、広範囲の「オン」ビーズシグナル強度を示す（図２Ｆ～Ｇ）。各ドロップキャストフィルムでの「オン」および「オフ」ビーズの数を、各ビーズの最大蛍光強度に正規分布をフィットさせ、平均から標準偏差の５倍より上として「オン」ビーズについての閾値を割り当てることによって算出した。ビーズあたりの平均標的分子（ＡＭＢ）は、従来のＳｉｍｏａにおいて算出したビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ）と同様に、ポアソン分布方程式を使用して決定した^２５。

【0077】

ビーズの全体積をスライドガラスに単に移すことによって、本発明者らは、平均でアッセイビーズの総数の４０～５０％を画像化し、分析することができ、残りのビーズの大部分は洗浄または移すステップの際に失われたか、または凝集物の形成のために分析から除外されかのいずれかである。したがって、ｄＳｉｍｏａにおける試料採取効率は、現在のＳｉｍｏａ技術を使用して分析されるビーズの約５％を超える顕著な改善を示す。マイクロウェルの必要性の除外に加えて、ｄＳｉｍｏａは、分析され得るビーズの百分率の増加により標的捕捉のために使用され得るビーズをはるかに少なくすることができ、そのためポアソンノイズを最小化しながら希少な標的分子の試料採取を改善する。現在のＳｉｍｏａ技術は、ビーズ５００，０００個を使用する一方で、ｄＳｉｍｏａはビーズ１００，０００個を使用する。ビーズの数の減少は、ビーズの総数と比較してより多くの「オン」ビーズおよびそれにより、より高いＡＭＢがあることからバックグラウンドに対するシグナルを増大できる。さらに、乾燥状態では蛍光シグナルは、１か月後でも測定されるＡＭＢ値が減少せず、ドロップキャストフィルムにおいて高度に安定なままである（表２）。

【0078】

ｄＳｉｍｏａを用いたタンパク質のデジタル検出
ｄＳｉｍｏａの感度を評価するために、本発明者らは、対応するＳｉｍｏａアッセイにおいて以前使用した同じ抗体対を使用して、２つのヒトサイトカイン、ＩＬ－１βおよびインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）について較正曲線を作成した。これらのｄＳｉｍｏａアッセイは、ＩＬ－１０およびＩＬ－１βのそれぞれについて対応する従来のＳｉｍｏａアッセイの２５および１５倍の感度の改善を示して、低から中程度のアトモルの検出限界（ＬＯＤ）を達成した（図３Ａ～Ｆ；表１）。バックグラウンド（ブランクのＡＭＢまたはＡＥＢ）から標準偏差の１０倍より上として算出される定量限界（ＬＯＱ）も従来のＳｉｍｏａアッセイと比較してｄＳｉｍｏａアッセイにおいて一桁改善された。分析され得るビーズの百分率を実質的に増加させることによって、ｄＳｉｍｏａは、低含量分子の試料採取効率を増強し、使用されるビーズをはるかに少なくできる。加えてビーズの数の５分の１の低減は、バックグラウンドに対するシグナルを増加させ、感度における顕著な増強に寄与する（図３Ｃ、Ｆ）。

【0079】

バックグラウンドに対するシグナルの改善に加えて、本発明者らは、捕捉された標的分子の試料採取効率の増大は、ポアソンノイズによる測定の不正確性を低減することによって、ｄＳｉｍｏａを用いたより低いＬＯＤを達成することも助けると仮定した。本発明者らの実験結果がこの仮説を支持するかどうかを判定するために、本発明者らは、ＩＬ－１０較正曲線において分析されたビーズのサブセットを無作為に選択し、分析される全アッセイビーズの百分率を変動させて、バックグラウンド測定値のＬＯＤおよび変動係数（ＣＶ）を決定した（図４Ａ～Ｂ）。わずかなビーズ（全ビーズの１０％未満）を分析した場合、ポアソン試料採取ノイズから予測される通り、バックグラウンド測定値の不正確性は、低いＬＯＤに対応して２０％を超えるＣＶで非常に高かった。さらに、低い百分率のビーズが分析された場合、異なる無作為試料採取中で得られたＬＯＤにおいて高い変動があった。したがって、これらの観察は、デジタル測定の精度および感度における試料採取効率の重要な役割を実証している。２０％以上のビーズが分析された場合に算出されたＬＯＤ値は、さらには増加せず、最大近くの感度がアッセイビーズの少なくとも２０％の画像化で達成され得ることを示唆している。

【0080】

生物学的液体におけるｄＳｉｍｏａの性能を検証するために、本発明者らは、ヒト唾液においてＩＬ－１０について添加および回収実験を実施した。プールされたヒト唾液に添加された種々の濃度の組換えヒトＩＬ－１０タンパク質の回収率は、７６％から１２２％の範囲であり、ｄＳｉｍｏａが唾液中のタンパク質を確実に検出できることを実証している（図６Ａ）。さらに、ヒト唾液の系列希釈物中のＩＬ－１０のｄＳｉｍｏａ測定は、直線性希釈を示し、ｄＳｉｍｏａアッセイでの唾液マトリクスからの最小限の干渉を示している（図６Ｂ）。ｄＳｉｍｏａアッセイは、すべての唾液試料にわたって１０％をはるかに下回るＣＶで高い測定精度も示した。

【0081】

ｄＳｉｍｏａの感度の改善の潜在的な診断有用性を調査するために、本発明者らは、脊索腫、脊椎または頭蓋底における原発性骨がんに強く関連するＴ－ｂｏｘ転写因子、ブラキュリのためのｄＳｉｍｏａアッセイを開発した^２６。ブラキュリ発現のレベルの上昇が脊索腫瘍において見出されたが、血漿中のブラキュリの測定についての報告は、本発明者らが知る限りない^{２７～３０}。ブラキュリについてｄＳｉｍｏａおよび従来のＳｉｍｏａアッセイによって生成された較正曲線は、それぞれ２４４．６ａＭおよび８４１．４ａＭのＬＯＤをもたらした（図５Ａ～Ｂ）。このｄＳｉｍｏａアッセイは、従来のＳｉｍｏａアッセイより感度における３倍の改善をもたらしただけである。ＬＯＤにおける比較的小さな改善は、従来のＳｉｍｏａアッセイと比較してバックグラウンドに対してシグナルのより小さな増大に起因する可能性がある（図５Ｃ）。アッセイビーズの総数の低減は捕捉抗体濃度も低減させることから、アッセイビーズの数の減少からのバックグラウンドに対するシグナルにおける改善の程度は、より低い結合親和性を有する抗体についてより小さい可能性があり、ビーズに対する標的分子のより高い比にもかかわらず、捕捉効率の減少をもたらし得る。血漿および血清マトリクスにおけるｄＳｉｍｏａアッセイの性能を検証するために、本発明者らは、添加および回収実験を実施し、添加された血漿および血清試料の大部分において、大部分の測定値ＣＶが１０％を下回って、少なくとも６５～７０％の回収率を得た（図７Ａ）。本発明者らは、許容可能な希釈直線性を確認することによって血漿中のｄＳｉｍｏａアッセイの精度をさらに検証した（図７Ｂ）。

【0082】

最終的に本発明者らは、いくつかの脊索腫患者血漿試料ならびに健常ドナー由来の市販の血漿および血清試料において内在性ブラキュリを検出するｄＳｉｍｏａおよび従来のＳｉｍｏａの能力を比較した。従来のＳｉｍｏａ測定値は、６個すべての脊索腫患者試料についてそのＬＯＤを下回った一方で、ｄＳｉｍｏａは、６個すべての試料においてブラキュリの検出可能なレベルを測定することができ（図５Ｄ）、感度における比較的小さな改善でさえ、臨床的に重要なバイオマーカーを測定するのに十分である場合があることを実証している。本発明者らは、従来のＳｉｍｏａによっては検出不能だったが、ｄＳｉｍｏａによっては検出可能である１個の軟骨肉腫患者試料も検査した。６個の市販の血漿および血清試料のうち、ブラキュリは、従来のＳｉｍｏａを使用して１個の試料において、およびｄＳｉｍｏａを使用して３個の試料において検出可能であった（図５Ｅ）。注目すべきことに、多数の試料においてｄＳｉｍｏａによって測定された濃度は低フェムトモル範囲であり、従来のＳｉｍｏａアッセイの算出されたＬＯＤを超えていたが、従来のＳｉｍｏａによるこれらの試料の測定値はそのＬＯＤを下回ったままであった（図５Ｆ）。しかし、従来のＳｉｍｏａＬＯＤを下回ったＡＥＢのうち、より高いＡＥＢ値は、より高いＡＭＢ値およびｄＳｉｍｏａアッセイにおいて測定された濃度と一般に相関した。さらに、より高い試料濃度では、ｄＳｉｍｏａおよび従来のＳｉｍｏａは、同様の測定濃度をもたらした。低濃度での血漿および血清におけるｄＳｉｍｏａの優れた性能は、ｄＳｉｍｏａのＬＯＤの改善およびさらに良好な試料採取効率を含むいくつかの要因に起因する可能性があり、特に低濃度での測定の精密度を増加できる。別の可能性は、ｄＳｉｍｏａが、５分の１の少ないビーズを使用して、血漿および血清においてバックグラウンドに対してより高いシグナルおよび回収を有して、血漿および血清マトリクスにおいて従来のＳｉｍｏａよりもさらに正確に実施することである。加えて従来のＳｉｍｏａは、ｄＳｉｍｏａにおいて使用されるより小さいオリゴヌクレオチド標識よりもさらに高い非特異的結合を示す可能性がある大きな酵素標識を使用する。最終的に、従来のＳｉｍｏａアッセイと比較してｄＳｉｍｏａアッセイの際の多量の洗浄液は、血漿および血清構成成分からの干渉をさらに低減する可能性がある。

【0083】

【表1】

ＬＯＤおよびＬＯＱ値はバックグラウンドから標準偏差のそれぞれ３倍より上および１０倍より上として算出した。対応するＱｕａｎｔｅｒｉｘＳｉｍｏａアッセイによって報告されたＬＯＤ値は、バックグラウンドから標準偏差の２．５倍より上として算出した。

【0084】

【表2】

【0085】

【表3】

【0086】

【表4】

【0087】

【表5】

【0088】

【表6】

【0089】

実施例１についての参考文献

【0090】

【表7-1】

【0091】

【表7-2】

【0092】

【表7-3】

【0093】

【表7-4】

【0094】

【表7-5】

【0095】

[実施例２]
チラミドシグナル増幅およびフィブリンハイドロゲルを使用するデジタル酵素結合免疫吸着アッセイの簡易化
方法
材料。すべての材料は、以下に他に特に指定のない限り、製造者の説明書により得て、使用した。ＩＬ－６タンパク質標準物（＃２０６－ＩＬ－０１０）および抗体（捕捉＃ＭＡＢ２０６および検出＃ＢＡＦ２０６）は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓから購入した。

【0096】

抗体コート捕捉ビーズの調製。ＩＬ－６抗体は、保存緩衝液を除去するために最初に緩衝液交換した。０．１３ｍｇの抗体を５０ＫＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５ｍＬＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌＦｉｌｔｅｒ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）に添加した。ビーズコンジュゲーション緩衝液（ＱｕａｎｔｅｒｉｘＣｏｒｐ．）をフィルターに体積５００μＬまで加えた。フィルターデバイスを１４，０００×ｇ、５分間遠心分離した。遠心分離後、流出液を廃棄し、追加的なビーズコンジュゲーション緩衝液をフィルターに加えた（総体積５００μＬ）。遠心分離プロセスをさらに２回繰り返した。次にフィルターを新たなチューブ中に反転させ、１０００ｘｇ、２分間遠心分離した。回収した抗体の濃度をＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して測定した。緩衝液交換した抗体をビーズコンジュゲーション緩衝液を使用して０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。コンジュゲーション用のビーズを調製するために、２．８×１０^８Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ６４７ｎｍ色素エンコードカルボキシル化常磁性ビーズ（２．７μｍ）をビーズ洗浄緩衝液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を用いて３回、ビーズコンジュゲーション緩衝液を用いて３回洗浄し、次に１９０μＬのビーズコンジュゲーション緩衝液に再懸濁した。使用前に、１ｍｇの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）を１００μＬのビーズコンジュゲーション緩衝液に溶解した。ビーズを洗浄後、１０μＬのＥＤＣをビーズに加え、ビーズを３０分間ローテーター上で撹拌した。ＥＤＣを用いたビーズ活性化後、ビーズを、ビーズコンジュゲーション緩衝液を用いて１回洗浄し、次に２００μＬの０．５ｍｇ／ｍＬ捕捉抗体溶液に再懸濁した。ビーズを２時間ローテーター上で撹拌した。コンジュゲーション後、ビーズを、ビーズ洗浄緩衝液を用いて２回洗浄し、次に２００μＬのビーズブロッキング緩衝液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）中で３０分間ＢＳＡを用いてブロックした。最後に、抗体コンジュゲートビーズをビーズ洗浄緩衝液、ビーズ希釈液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を用いて洗浄し、２００μＬのビーズ希釈液に再懸濁した。ビーズをＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒＺ１ＰａｒｔｉｃｌｅＣｏｕｎｔｅｒを使用して計数し、４℃で保存した。

【0097】

ＣＡＲＤデジタルＥＬＩＳＡ。ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを使用する較正曲線を作成するために、３ステップアッセイを、ビーズ上の標的タンパク質を捕捉および標識するために実施し、オンビーズシグナル増幅ステップを実施する。第１のステップでは、ＩＬ－６タンパク質標準物をＨｏｍｅｂｒｅｗ試料希釈液（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）に系列希釈し、１００μＬの各較正標準物を低結合９６ウェルプレート（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏ－Ｏｎｅ）に加えた。ＩＬ－６捕捉ビーズ（１０μＬ、ビーズ２０，０００個／μＬで）および１０μＬのビオチン化ＩＬ－６検出抗体（最終濃度０．３μｇ／ｍＬ）も９６ウェルプレートに加えた。プレートを振とうしながら１時間インキュベートし、次にシステム洗浄緩衝液１（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を用いて３回洗浄した。最終洗浄サイクル後、残った洗浄緩衝液を除去し、ビーズを１００μＬの試料希釈液に再懸濁した。第２のステップでは、１０μＬの５μｇ／ｍＬストレプトアビジン－ポリ－ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｉｅｒｃｅ）を各試料に加えた。プレートを振とうしながら１０分間インキュベートし、次にシステム洗浄緩衝液１を用いて３回洗浄した。最終洗浄サイクル後、残った洗浄緩衝液を除去した。第３のステップでは、オンビーズチラミドシグナル増幅をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ＴｙｒａｍｉｄｅＳｕｐｅｒＢｏｏｓｔＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して変更したプロトコールを用いて実施した。具体的には、使用溶液を１．６ｍＬの１Ｘ反応緩衝液を１６μＬの１Ｘ過酸化水素溶液および１６μＬのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８－チラミド試薬と混合することによって調製した。次にビーズを２００μＬのチラミド使用溶液に再懸濁した。プレートを振とうしないで１時間インキュベートした。標識後、５０μＬの１：１１希釈した反応停止溶液（ＳｕｐｅｒＢｏｏｓｔＫｉｔ）を各ビーズ懸濁物に加え、振とうしながら２分間インキュベートした。次にプレートを、１：１１希釈した反応停止溶液を含むシステム洗浄緩衝液１を用いて６回洗浄した。最終洗浄サイクル後、ビーズを３０μＬの１×ＰＢＳに再懸濁した。次にビーズをスライドガラス上のシリコン単離ウェル（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙＳｃｉｅｎｃｅｓ）に加えた。フィブリンハイドロゲルを調製するために、１×ＰＢＳ中のフィブリノーゲン（ウシ血漿由来、Ｉ－Ｓ型、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液および１×ＰＢＳ中のトロンビン（ウシ血漿由来、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）の１．２５Ｕ／ｍＬ溶液の等量を混合した。フィブリノーゲンをＰＢＳに溶解するために、使用前に溶液を３７℃で加熱した。ハイドロゲル試薬を混合後、５０μＬの混合物を各単離ウェルに加え、画像化前にハイドロゲルを１５分間形成させた。

【0098】

画像化および分析。ハイドロゲル固定化ビーズアレイの明視野および蛍光画像をＯｌｙｍｐｕｓＩＸ８１倒立顕微鏡を用い、倍率１０×でＯＣＲＡ－Ｆｌａｓｈ４．０ＬＴ＋ＣＭＯＳカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて取得した。ＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを顕微鏡ステージを管理し、画像を取得するために使用した。ビーズの位置を同定するために使用した明視野画像を露光時間２０ｍｓで取得した。「オン」および「オフ」ビーズを同定するために使用したＧＦＰフィルターキューブを使用する蛍光画像は、露光時間１秒で取得した。

【0099】

画像解析をカスタムＭＡＴＬＡＢアルゴリズムを使用して実施した。明視野画像を、画像の補完をコンピューターで計算すること（ビーズは明るく、バックグラウンドは暗くなるように）、不均等な照明を補正するためにトップハットフィルターを用いてフィルタリングすること、バイナリー画像を変換することによって処理した。蛍光画像も不均等な照明を補正するためにトップハットフィルターを用いてフィルタリングした。ビーズをディスク型形態構造化エレメントを使用してビーズを明視野画像中で位置付けた。各ビーズのシグナル強度をビーズ領域中の上位４分の１の強度を算出することによって対応するＧＦＰ蛍光画像から測定した。「オフ」ビーズと「オン」ビーズとの間のカットオフ値を、ブランク（０ｆＭ）標準物でのビーズ強度の分布を正規分布にフィッテイングし、カットオフ強度を、低濃度試料について平均から標準偏差の３倍より上（＜５０ｆＭ、カットオフ値約９０）および高濃度試料について平均から標準偏差の４倍より上（≧５０ｆＭ、カットオフ値約１００）に設定することにより、決定した。「オン」ビーズの割合を、「オン」ビーズの数をビーズの総数で割ることによって算出した。

【0100】

ＡＥＢ対濃度の較正曲線をＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン８．３．０において４パラメーターロジスティクス（４ＰＬ）回帰にフィットさせた。４ＰＬフィット曲線は、唾液試料中の未知のＩＬ－６濃度を決定するために使用した。すべての測定は、２連で実施した。

【0101】

唾液試料分析。プールされた唾液試料は、ＢｉｏＩＶＴから購入し、使用まで－８０℃で保存した。唾液を１３，１５０×ｇ、２０分間、４℃で遠心分離した。遠心分離後に上清を除去し、唾液試料をＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡ分析のために２５Ｘ、Ｓｉｍｏａ分析のために８Ｘに希釈した。

【0102】

Ｓｉｍｏａアッセイ。従来のＳｉｍｏａアッセイをＨＤ－１Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で実施した。捕捉ビーズ、検出抗体およびストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）の溶液を試薬ビンに入れ、装置に載せた。較正曲線のために系列希釈したＩＬ－６タンパク質標準物および希釈した唾液試料を９６ウェルプレート（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）にピペッティングし、装置に載せた。ＳβＧ基質レゾルフィンβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、システム洗浄緩衝液１、システム洗浄緩衝液２およびＳｉｍｏａシーリングオイルをＱｕａｎｔｅｒｉｘから得て、製造者の説明書に従って装置に載せた。標準物および試料を標準的な３ステップアッセイを使用して処理した。画像解析およびＡＥＢ算出は、オンボードＳｉｍｏａソフトウェアによって自動的に実施した。

【0103】

結果
本発明者らは、高価な機器および精巧なマイクロ流体またはロボット工学の必要性を低減する簡易化したデジタルＥＬＩＳＡフォーマットの開発を試みた。フルオロフォアがビーズに直接コンジュゲートされているシグナル増幅ステップを実行することによって、本発明者らは、マイクロウェルアレイまたはマイクロ流液滴中でのビーズの区画化の必要性を除外する。代わりに、シグナル増幅ステップは、標的タンパク質捕捉および標識ステップと同じ反応チャンバーにおいてなど、バルク溶液において生じる。さらに、本手法は、マイクロウェルアレイへのビーズローディングのために必要である高価なエンジニアリングおよびロボット工学を必要としない。ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、安価なフィブリンハイドロゲル中にビーズを固定化することによって、単一分子計数のために使用されるビーズ画像化のための簡易化された手法を有する。このフォーマットでは、ビーズを、ガラススライド上に配置し、ｉｎｓｉｔｕで形成するフィブリンハイドロゲル層に固定化した。画像取得後にビーズを位置付け、単一分子計数のためにその蛍光強度を測定するためにＭＡＴＬＡＢのアルゴリズムを使用する。概念の証明として、本発明者らは、インターロイキン６（ＩＬ－６）について較正曲線を作成し、唾液試料中のＩＬ－６レベルを測定した。

【0104】

ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを開発するための最初のステップは、単一分子シグナル生成のためのオンビーズ酵素増幅のための方法を確立し、最適化することであった。本発明者らは、免疫組織化学およびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験において一般に使用されるＴＳＡを使用する。他の研究者らもデジタルＥＬＩＳＡのためのＴＳＡの使用について報告している^２７。本発明者らは、デジタルＥＬＩＳＡをポイントオブケアデバイスに実装する場合に考慮される重要な事柄である、イムノアッセイにおけるステップ数を低減することによって以前の文献報告を改善した（５ステップアッセイから３ステップアッセイに低減した）。ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡのアッセイフォーマットを図９Ａに要約する。抗体コート捕捉ビーズ（２００，０００個）を標的タンパク質分子の捕捉を可能にするように試料に加える。従来のＳｉｍｏａと同様に本発明者らは、標的タンパク質分子の数と比較して多数のビーズを使用する。このことはアッセイが、大部分のビーズが標的分子に結合せず、わずかな百分率のビーズだけが１つの標的分子に結合するポアソン分布に従うことを確実にする。タンパク質捕捉後、標的分子は、ビオチン化検出抗体およびストレプトアビジン－ポリ－ＨＲＰ（数個の西洋ワサビペルオキシダーゼ分子を含むストレプトアビジン－コンジュゲートポリマー）を用いて標識し、完全な酵素標識免疫複合体を形成する。次にビーズを、シグナル生成ステップのために過酸化水素およびチラミドフルオロフォアコンジュゲート（チラミドＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８）を含有する溶液に再懸濁する。過酸化水素の存在下でＨＲＰは、チラミドをラジカル中間体に触媒的に変換する。このチラミドラジカルは、ＨＲＰ分子近くの他の芳香族環、ビーズ上の付近のタンパク質および抗体上のチロシン残基などと共有結合を形成する。このステップの完了で、完全な免疫複合体を有するビーズは、供給結合で付着した多数の蛍光色素を用いて標識される。このことは、オンビーズシグナル生成ステップを完了させ、続く単一分子計数を可能にする。本発明者らは、チラミド標識ステップ後にビーズ間の検出可能な交差標識を観察しなかった。これは、ポアソン分布に従う本アッセイフォーマットにおいて予測される、低タンパク質濃度においてごく一部のビーズだけが検出可能な蛍光シグナルを有するとの観察によって支持される。さらに、チラミド標識ステップでは、本発明者らは、ラジカル中間体の寿命の間にチラミドラジカルが別のビーズに拡散しないように薄いビーズ溶液を使用する^２７。

【0105】

ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを開発する第２のステップは、画像化および単一分子計数のためにビーズ固定化の方法を確立することであった。増幅された酵素シグナルがアッセイの先行するステップにおいてビーズに既にコンジュゲートされていることから、本発明者らは、酵素増幅のためのマイクロウェルまたは液滴でのビーズの区画化の必要性によって制限されない。本発明者らは、ビーズ固定化のためにフィブリンハイドロゲルを使用した（図９Ｂ）。フィブリンハイドロゲルは、トロンビンがフィブリノーゲンをフィブリンハイドロゲルネットワークに酵素的に重合する場合に形成される^２８。合成フィブリンハイドロゲルは、細胞封入および組織工学を含む適用のためにしばしば使用され、ｉｎｓｉｔｕで容易に形成され得る^{２９～３１}。フィブリンハイドロゲル中のビーズの封入は、画像化のためにビーズを固定化する早くて簡易な方法である。図１０Ａは、フィブリンハイドロゲルに封入された、いくつかのビーズ試料を示す。フィブリンハイドロゲル中にビーズを固定化するために、ビーズ溶液をシリコン単離ウェル（７ｍｍｘ７ｍｍｘ２ｍｍ）内部のガラススライドに最初にドロップキャストする。フィブリノーゲンおよびトロンビンの溶液を混合し、単離ウェルに直ちに加える。ハイドロゲルは約１５分間で形成され、ビーズはフィブリンポリマーネットワーク中に捕捉される。フィブリンハイドロゲル中の数百個のビーズの明視野画像を図１０Ｂに示す。この画像は約１００μｍｘ約１００μｍであり、ビーズアレイの小領域を表している。ビーズアレイ全体は、倍率１０×で約２０～２５枚の画像で捕捉され得る。ビーズが比較的大きく（直径２．７μｍ）、溶液から急速に沈降することから、本発明者らは、ビーズが主に同じｚ平面（すなわち、ガラススライドとフィブリンハイドロゲルとの界面）にあることを観察した。早く簡易であることに加えて、フィブリンハイドロゲルへのビーズ封入は、マイクロウェルアレイと比べて安い選択肢でもある。この費用の削減は、安価なポイントオブケアデジタルＥＬＩＳＡプラットフォームを開発するために重要である。

【0106】

ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡの最後のステップは、単一分子計数のための方法を開発することである。ビーズアレイの明視野および蛍光画像を倒立蛍光顕微鏡を用いて捕捉し、次に画像を単一分子計数を実施するためにＭＡＴＬＡＢのアルゴリズムを使用して分析した。目的の小領域の明視野画像（図１１Ａ）および４８８ｎｍ蛍光画像（図１１Ｂ）の例を示す。明視野画像を各ビーズを位置付けるために使用し、蛍光画像をシグナル増幅ステップ由来の沈着したチラミドＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８色素を有するビーズを同定するために使用した。２つの画像を重ね合わせて（図１１Ｃ）、本発明者らは、画像中の８個のビーズのうち２個が「オン」（灰色矢印）であることを観察した。各ビーズの位置は、ＭＡＴＬＡＢアルゴリズムによって自動的に決定され、各ビーズの対応する蛍光強度を算出する。すべての試料について、すべてのビーズの蛍光強度をヒストグラムとしてプロットする；０ｆＭＩＬ－６標準物は図１１Ｄにプロットし、５０ｆＭＩＬ－６標準物は図１１Ｅにプロットする。図１１Ｄのブランク試料についてのヒストグラムは正規分布にフィットされ、「オン」対「オフ」ビーズのカットオフは、ブランクの平均蛍光強度から標準偏差の４倍より上に設定する（図１１Ｄおよび１１Ｅの灰色四角）。ＡＥＢを「オン」ビーズの数をビーズの総数で割ることによって算出する。本発明者らは、試料あたりビーズ約５０，０００～６０，０００個を分析する（すなわち、ビーズの約３０％を分析する）、これは、ビーズの約５％だけを分析する従来のＳｉｍｏａと比較して分析されるビーズの割合における改善である。

【0107】

概念の証明として、本発明者らは、図１２にプロットする、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを使用する較正曲線を生成するためのモデルタンパク質としてＩＬ－６を使用し；較正曲線のためのＡＥＢ値を表７に示す。予測される通り低タンパク質濃度では、大部分のビーズはＩＬ－６に結合しない（ＡＥＢ値は小さい）。ＩＬ－６濃度が増加するとともに、ＩＬ－６に結合するビーズの数は増加する。本発明者らは、ＨＤ－１Ａｎａｌｙｚｅｒ上において標準的Ｓｉｍｏａアッセイを使用してＩＬ－６較正曲線（図１３）も作成した。両曲線を、各アッセイのＬＯＤおよびＬＯＱを推定するために使用した４パラメーターロジスティクス（４ＰＬ）回帰にフィットさせた（表８）。ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、広いダイナミックレンジおよびＩＬ－６について１．３６ｆＭのＬＯＤをもたらした。最終的に本発明者らは、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを使用して市販の唾液試料中のＩＬ－６を測定し、生体液中のタンパク質を確実に検出するためにＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡを使用できることを確認するために、従来のＳｉｍｏａの結果と比較した。両アッセイからの結果を表９に報告し、図１２の挿入図にプロットした。本発明者らは、２つの方法の間に十分な一致を観察し（スピアマンの相関係数は１．００である）、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡが唾液中のＩＬ－６を確実に検出できることを実証している。さらにＳｉｍｏａと同様にＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、高度に希釈された試料の使用を可能にする。ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡによって分析した唾液試料を２５Ｘに希釈した。高い試料希釈倍率の使用は、非特異的吸着を低減し、したがってアッセイの精度を改善する。加えて、ＣＡＲＤ－ｄＥＬＩＳＡは、１０μＬの唾液を必要とするだけであり、タンパク質バイオマーカーが少量の試料から測定できることを意味している。

【0108】

【表8】