特表 2023-531963 多能性細胞懸濁物を培養するための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-26

(54)【発明の名称】多能性細胞懸濁物を培養するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20230719BHJP

   C12N 5/00 20060101ALI20230719BHJP

   C12N 5/073 20100101ALN20230719BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

C12N5/00

C12N5/073

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022579706

(86)(22)【出願日】2021-06-22

(85)【翻訳文提出日】2023-02-20

(86)【国際出願番号】 US2021038395

(87)【国際公開番号】W WO2021262663

(87)【国際公開日】2021-12-30

(31)【優先権主張番号】63/042,419

(32)【優先日】2020-06-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】502221282

【氏名又は名称】ライフ テクノロジーズ コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100136249

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 貴光

(72)【発明者】

【氏名】ニューマン ロンダ

(72)【発明者】

【氏名】エイケンヘッド マイケル

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065BB02

4B065BB10

4B065BB11

4B065BB12

4B065BB19

4B065BB20

4B065BB23

4B065BC09

4B065BC41

4B065BD39

4B065BD50

(57)【要約】

少なくとも１つのＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及び１つ以上の有糸分裂成長因子を含む細胞培養培地及び／又は細胞培養培地サプリメント、並びに多能性幹細胞を３Ｄ培養フォーマットで本明細書に記載の組成物中で培養及び／又は拡大する方法が本明細書に記載される。
【選択図】図１４

【特許請求の範囲】

【請求項1】

多能性幹細胞（ＰＳＣ）組成物であって、
細胞培養基本培地と、
１つ以上の有糸分裂成長因子と、
グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤と、
ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤と、を含み、
前記組成物は、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供する、組成物。

【請求項2】

前記ＧＳＫ３阻害剤及び／又は前記ＲＯＣＫ阻害剤が、細胞培養サプリメント中で提供される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ＧＳＫ３阻害剤及び／又は前記ＲＯＣＫ阻害剤が、前記基本培地中で提供される、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

前記組成物が、血清フリーである、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル、脂肪酸、微量元素、抗酸化剤、塩、ヌクレオシド、緩衝剤、界面活性剤、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］－Ｎ’－（５－ニトロ－２－チアゾリル）ウレア）０、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ［３，２－ｄ］［１］ベンザゼピン－６（５Ｈ）－オン）、ＳＢ２１６７６３（ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、又はＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、それらの塩、それらのエステル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記ＧＳＫ３が、ＣＨＩＲ９９０２１を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）、Ｃｈｒｏｍａｎ１、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ポリアミン、Ｔｒａｎｓ－ＩＳＲＩＢ、チアゾバビン（ｔｈｉａｚｏｖａｖｉｎ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＲＯＣＫ１活性を阻害する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＲＯＣＫ２活性を阻害する、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２活性を阻害する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記１つ以上の有糸分裂成長因子が、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ヘレグリン（ＨＲＧ）、若しくはＫＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記組成物が、少なくとも２つの有糸分裂成長因子を含み、前記少なくとも２つの有糸分裂成長因子が、ＥＧＦ及びＴＧＦ－α、ＥＧＦ及びＴＧＦ－β、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢＤＮＦ、ＥＧＦ及びＨＧＦ、ＥＧＦ及びＨＲＧ、ＥＧＦ及びＫＧＦ、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、ＴＧＦ－α及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－α及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－α及びＨＧＦ、ＴＧＦ－α及びＨＲＧ、ＴＧＦ－α及びＫＧＦ、ＴＧＦ－β及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－β及びＨＧＦ、ＴＧＦ－β及びＨＲＧ、ＴＧＦ－β及びＫＧＦ、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＨＲＧ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＧＦ、ＢＤＮＦ及ＨＲＧ、ＢＤＮＦ及びＫＧＦ、ＨＧＦ及びＨＲＧ、ＨＧＦ及びＫＧＦ、又はＨＲＧ及びＫＧＦを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記組成物が、アルブミン又はそのペプチドを含み、前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ラット血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ウマ血清アルブミンサル血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、組換え血清アルブミン、前述のうちのいずれかの機能的フラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記組成物が、１つ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を更に含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記１つ以上のＥＣＭ成分が、フィブロネクチン、ラミニン、ニドゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、若しくはヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記組成物が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）を更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記アミノ酸が、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、それらの塩、それらのエステル、又はそれらのジ若しくはトリペプチドのうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項20】

前記ビタミンが、ビオチン（Ｂ７）、コリン、葉酸（Ｂ９）、ナイアシンアミド（Ｂ３）、ピリドキシン（Ｂ６）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、コバラミン（Ｂ１２）、イノシトール、レチノール（Ａ）、パントテン酸（Ｂ５）、アスコルビン酸（Ｃ）、コレカルシフェロール（Ｄ）、トコフェロール（Ｅ）、フィロキノン（Ｋ）、リポ酸、リノール酸、パラアミノ安息香酸、それらの塩、それらのエステル、又はそれらのの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項21】

前記塩が、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、硫酸亜鉛、ピリドキシンＨＣｌ、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、硝酸塩、前述のうちのいずれかのイオン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の塩を含む、請求項５に記載の組成物。。

【請求項22】

前記脂肪酸が、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、合成コレステロール、酢酸Ｄ／Ｌ－トコフェロール、ベヘン酸、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ ａｉｄ）、セロチン酸、ミリストレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、α－リノレン酸、エルカ酸、エイコサペンタエン酸、又はドコサヘキサエン酸のうちの１つ以上を含む、請求項５に記載の組成物。

【請求項23】

インスリン及び／又はトランスフェリンを更に含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記組成物が、動物由来フリー（ａｎｉｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｆｒｅｅ）である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

懸濁物中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）を成長させるための方法であって、
懸濁物中で培養されるＰＳＣを提供することと、
前記ＰＳＣを第１の組成物と培養容器中で接触させて、懸濁培養物を形成することであって、前記第１の組成物が、
（ａ）細胞培養基本培地と、
（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ－３（ＧＳＫ３）阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む、第１の小分子阻害剤と、
（ｃ）ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む、第２の小分子阻害剤と、
（ｄ）１つ以上の有糸分裂成長因子と、
任意選択で、（ｅ）１つ以上のアルブミン又はそのペプチドと、を含む、接触させることと、
ＰＳＣ拡大に好ましい条件下で前記懸濁培養物を培養することと、を含む、方法。

【請求項26】

前記多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＰＳＣが、ｉＰＳＣ又はＥＳＣである、請求項２５又は２６に記載の方法。

【請求項28】

前記提供することが、ＰＳＣを単一細胞に解離することを含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記ＰＳＣが、前記接触させるステップの前に単一細胞として提供される、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記接触させることが、前記懸濁培養物のための播種するステップでのものである、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記播種するステップが、前記懸濁培養物の継代することでのものである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記ＰＳＣを、前記播種する又は継代するステップの少なくとも１日後に、（ａ）、（ｂ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む第２の組成物と接触させて、懸濁培養培地を改変することと、前記懸濁培養物を前記第２の組成物の存在下で培養することと、を更に含む、請求項３０又は３１に記載の方法。

【請求項33】

前記第２の組成物と接触させるステップが、
（ａ）前記第１の組成物を前記第２の組成物に置換すること、
（ｂ）前記第２の組成物を前記懸濁培養物上に重層すること、又は
（ｃ）前記第１の組成物の一部を前記第２の組成物と交換すること、を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

（ｃ）が、前記第１の組成物の少なくとも２５％を等価量の前記第２の組成物と交換することを含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

（ｃ）が、前記第１の組成物の少なくとも５０％を等価量の前記第２の組成物と交換することを含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記細胞を前記第２の組成物と接触させた少なくとも１日後に、前記懸濁培養培地の少なくとも２５％を等価量の新鮮な第２の組成物と交換することを更に含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記懸濁培養培地を前記交換することが、前記懸濁培養培地の少なくとも５０％を交換することを含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記懸濁培養培地の前記交換することが、その後毎日行われる、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項39】

前記懸濁培養培地の前記交換することが、その後１日おきに行われる、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項40】

前記ＰＳＣを、前記播種する又は継代するステップの少なくとも１日後に、（ａ）、（ｄ）及び（ｅ）を含む第２の組成物と接触させて、懸濁培養培地を改変することと、前記懸濁培養物を前記第２の組成物の存在下で培養することと、を更に含む、請求項３０又は３１に記載の方法。

【請求項41】

前記第２の組成物と接触させるステップが、
（ａ）前記第１の組成物を前記第２の組成物に置換すること、
（ｂ）前記第２の組成物を前記懸濁培養物上に重層すること、又は
（ｃ）前記第１の組成物の一部を前記第２の組成物と交換すること、を含む、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

（ｃ）が、前記第１の組成物の少なくとも２５％を等価量の前記第２の組成物と交換することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

（ｃ）が、前記第１の組成物の少なくとも５０％を等価量の前記第２の組成物と交換することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項44】

前記細胞を前記第２の組成物と接触させた少なくとも１日後に、前記懸濁培養培地の少なくとも２５％を等価量の新鮮な第２の組成物と交換することを更に含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項45】

前記懸濁培養培地を前記交換することが、前記懸濁培養培地の少なくとも５０％を交換することを含む、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記懸濁培養培地の前記交換することが、その後毎日行われる、請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項47】

前記懸濁培養培地の前記交換することが、その後１日おきに行われる、請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項48】

前記第１の組成物及び前記第２の組成物のうちの少なくとも１つが、血清フリーである、請求項２５～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記第１の組成物及び前記第２の組成物のうちの少なくとも１つが、動物由来フリーである、請求項２５～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記第１の組成物、前記第２の組成物、又はそれらの組み合わせが、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供する、請求項２５～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ＧＳＫ３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］－Ｎ’－（５－ニトロ－２－チアゾリル）ウレア）０、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ［３，２－ｄ］［１］ベンザゼピン－６（５Ｈ）－オン）、ＳＢ２１６７６３（ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、又はＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、それらの塩、それらのエステル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ＧＳＫ３が、ＣＨＩＲ９９０２１を含む、請求項２５～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）、Ｃｈｒｏｍａｎ１、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ポリアミン、Ｔｒａｎｓ－ＩＳＲＩＢ、チアゾバビン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）を含む、請求項２５～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＲＯＣＫ１活性を阻害する、請求項２５～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＲＯＣＫ２活性を阻害する、請求項２５～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２活性を阻害する、請求項２５～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記１つ以上の有糸分裂成長因子が、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ヘレグリン（ＨＲＧ）、若しくはＫＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２５～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記第１の組成物及び／又は前記第２の組成物が、少なくとも２つの有糸分裂成長因子を含み、前記少なくとも２つの有糸分裂成長因子が、ＥＧＦ及びＴＧＦ－α、ＥＧＦ及びＴＧＦ－β、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢＤＮＦ、ＥＧＦ及びＨＧＦ、ＥＧＦ及びＨＲＧ、ＥＧＦ及びＫＧＦ、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、ＴＧＦ－α及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－α及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－α及びＨＧＦ、ＴＧＦ－α及びＨＲＧ、ＴＧＦ－α及びＫＧＦ、ＴＧＦ－β及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－β及びＨＧＦ、ＴＧＦ－β及びＨＲＧ、ＴＧＦ－β及びＫＧＦ、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＨＲＧ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＲＧ、ＢＤＮＦ及びＫＧＦ、ＨＧＦ及びＨＲＧ、ＨＧＦ及びＫＧＦ、又はＨＲＧ及びＫＧＦを含む、請求項２５～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記第１の組成物及び前記第２の組成物のうちの少なくとも１つが、アルブミン又はそのペプチドを含み、前記アルブミンが、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ラット血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ウマ血清アルブミンサル血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、組換え血清アルブミン、前述のうちのいずれかの機能的フラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２５～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記第１の組成物及び前記第２の組成物のうちの少なくとも１つが、１つ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を更に含む、請求項２５～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記第１の組成物及び前記第２の組成物のうちの少なくとも１つが、インスリン及び／又はトランスフェリンを更に含む、請求項２５～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記培養容器が、マルチウェルプレート、フラスコ、又はバイオリアクターから選択される、請求項２５～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記懸濁培養物が、少なくとも２０ｍＬの体積を有する、請求項２５～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記懸濁培養物が、少なくとも１００ｍＬの体積を有する、請求項２５～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記第１及び第２の組成物中で前記懸濁培養物を培養しながら、前記細胞を撹拌することを更に含む、請求項２５～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記撹拌することが、約３０ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭでのものである、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

懸濁培養物中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物の使用であって、前記組成物が、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供する、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／０４２，４１９号（その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。

【0002】

少なくとも１つの小分子阻害剤、有糸分裂成長因子、及びアルブミン、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせを含む細胞培養培地又はサプリメントが本明細書に記載される。サプリメントは、様々な時点で培地又は細胞培養物に添加されて、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、多能性幹細胞（ＰＳＣ）成長を増加させ、ＰＳＣ増殖を増強し、ＰＳＣ多能性を維持し、スフェロイド形態を維持し、ＰＳＣ形態を維持し、ＰＳＣ継代数を増加させ、ＰＳＣ培養スケールを増加させ得る。

【背景技術】

【0003】

ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）拡大は、下流分化、疾患モデリング、創薬、及び治療用途における使用のための細胞のほぼ無制限のプールの生成を可能にする。更に、ＰＳＣの適切な増殖及び分化は、細胞の損傷又は機能不全から生じる疾患を治療するための移植に適した細胞の無制限の供給源を生成するために潜在的に使用され得る。

【0004】

しかしながら、ＰＳＣを成長させるための報告されている方法の多くは最適以下である。例えば、マウス胚性幹細胞はしばしば、白血病抑制因子（ＬＩＦ）を補充したフィーダーフリー培養を使用して未分化状態で維持される。ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、ＬＩＦの存在下でさえ、細胞がフィーダー細胞層又は好適なフィーダー細胞株からの馴化培地無しで培養されるときに分化する。フィーダー細胞（又はフィーダー細胞培養物からの馴化培地）を用いるシステムは、典型的には、培養されている幹細胞のものとは異なる種からの細胞を使用し、例えば、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）は、ｈＥＳＣの大部分の報告されている未分化成長においてフィーダー層を形成する。更に、フィーダーフリーシステムの報告は、典型的には、ＭＥＦ培養物からの馴化培地の使用を必要とし、これは非異種間産物／薬剤の必要性を取り除かない。ヒトフィーダー細胞を用いるシステムでさえ、未分化細胞を規定されていない培養条件に曝露することの欠点を有しており、したがって、多くの幹細胞培養条件はしばしば再現性がない。加えて、細胞療法を含む、多くの用途のために、大量のＰＳＣが必要とされる。過去１０年間にわたって、多能性幹細胞培養は、接着単層条件下でその拡大をサポートするための特殊化されたマトリックス及びフィーダーフリー培養培地システムの使用に移行した。これらの培養システムはワークフローを大いに単純化したが、拡大潜在力は表面積によって制限され、培養フラスコにおけるスケールアウトは著しい時間どおりの人手及び培養物汚染の危険性の増加を必要とする。例えば、エドモントンプロトコルを使用した膵島移植のために必要とされるＰＳＣの数は、１０⁹～１０¹⁰細胞／患者のオーダーであると見積もられる。

【0005】

細胞培養培地は、制御されたインビトロ環境で細胞を維持又は成長させるための栄養素を提供する。細胞培養培地の特徴及び組成は、そのために細胞が培養される特定の細胞の要求及び任意の機能に応じて変動する。培地は、典型的には、乾燥粉末、液体、液体濃縮物、凝集培地、又は凝集培地ペレットとして製造される。例えば、米国特許第６，３８３，８１０号及び同第６，６２７，４２６号、並びに米国特許出願公開第２０１８／０１４２２０３Ａ１号及び同第２０１９／００４８３１Ａ１号（これらの各々は、細胞培養培地に関連する教示のために参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0006】

規定された細胞培養培地又はサプリメントが、ＰＳＣの成長、増殖、継代数、培養スケールを増加させ、培養されるＰＳＣにおける多能性及び形態を維持する、ＰＳＣの培養、安定化、及び大スケール産生のための方法及び組成物の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0007】

本明細書に記載の一実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）組成物であって、細胞培養基本培地と、１つ以上の有糸分裂成長因子と、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む第１の阻害剤と、ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む第２の阻害剤と、を含み、組成物は、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供する、組成物である。一態様では、組成物は、ｒｈｏキナーゼ阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む、第２の小分子阻害剤を更に含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤は、細胞培養サプリメント中で提供される。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤及び／又はＲＯＣＫ阻害剤は、基本培地中で提供される。

【0008】

一態様では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル））－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］－Ｎ’－（５－ニトロ－２－チアゾリル）ウレア）０、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ［３，２－ｄ］［１］ベンザゼピン－６（５Ｈ）－オン）、ＳＢ２１６７６３（ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、又はＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、それらの塩、それらのエステル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の態様では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）、Ｃｈｒｏｍａｎ１、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ポリアミン、Ｔｒａｎｓ－ＩＳＲＩＢ、チアゾバビン（ｔｈｉａｚｏｖａｖｉｎ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）である。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ１活性を阻害する。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ２活性を阻害する。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ１活性及びＲＯＣＫ２活性を阻害する。

【0009】

一態様では、１つ以上の有糸分裂成長因子は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ヘレグリン（ＨＲＧ）、若しくはＫＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む。別の態様では、ＰＳＣ組成物は、少なくとも２つの有糸分裂成長因子を含み、少なくとも２つの有糸分裂成長因子は、ＥＧＦ及びＴＧＦ－α、ＥＧＦ及びＴＧＦ－β、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢＤＮＦ、ＥＧＦ及びＨＧＦ、ＥＧＦ及びＨＲＧ、ＥＧＦ及びＫＧＦ、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、ＴＧＦ－α及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－α及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－α及びＨＧＦ、ＴＧＦ－α及びＨＲＧ、ＴＧＦ－α及びＫＧＦ、ＴＧＦ－β及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－β及びＨＧＦ、ＴＧＦ－β及びＨＲＧ、ＴＧＦ－β及びＫＧＦ、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＨＲＧ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＲＧ、ＢＤＮＦ及びＫＧＦ、ＨＧＦ及びＨＲＧ、ＨＧＦ及びＫＧＦ、又はＨＲＧ及びＫＧＦを含む。

【0010】

一態様では、ＰＳＣ組成物は、アルブミン又はそのペプチドを更に含む。別の態様では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ラット血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ウマ血清アルブミンサル血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、組換え血清アルブミン、前述のうちのいずれかの機能的フラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一態様では、ＰＳＣ組成物は、１つ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を更に含む。別の態様では、１つ以上のＥＣＭ成分は、フィブロネクチン、ラミニン、ニドゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、若しくはヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される。別の態様では、ＰＳＣ組成物は、トランスフェリン及び／又はインスリンを更に含む。

【0011】

一実施形態では、ＰＳＣ組成物は、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル、脂肪酸、微量元素、抗酸化剤、塩、ヌクレオシド、緩衝剤、界面活性剤、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。一態様では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、それらの塩、それらのエステル、又はそれらのジ若しくはトリペプチドのうちの１つ以上を含む。別の態様では、ビタミンは、ビオチン（Ｂ７）、コリン、葉酸（Ｂ９）、ナイアシンアミド（Ｂ３）、ピリドキシン（Ｂ６）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、コバラミン（Ｂ１２）、イノシトール、レチノール（Ａ）、パントテン酸（Ｂ５）、アスコルビン酸（Ｃ）、コレカルシフェロール（Ｄ）、トコフェロール（Ｅ）、フィロキノン（Ｋ）、リポ酸、リノール酸、パラアミノ安息香酸、それらの塩、それらのエステル、又はそれらのの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。別の態様では、塩は、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、硫酸亜鉛、ピリドキシンＨＣｌ、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、硝酸塩、前述のうちのいずれかのイオン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の塩を含む。別の態様では、脂肪酸は、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、合成コレステロール、酢酸ｄ／ｌ－トコフェロール、ベヘン酸、リグノセリン酸（ｌｉｇｎｏｃｅｒｉｃ ａｉｄ）、セロチン酸、ミリストレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、α－リノレン酸、エルカ酸、エイコサペンタエン酸、又はドコサヘキサエン酸のうちの１つ以上を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＰＳＣ組成物は、血清フリーである。他の実施形態では、ＰＳＣ組成物は、動物由来フリー（ａｎｉｍａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｆｒｅｅ）である。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ組成物は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）を更に含む。

【0013】

本明細書に記載の別の実施形態は、懸濁培養物中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養するためのＰＳＣ組成物の使用であって、組成物は、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供する、使用である。

【0014】

本明細書にされる別の実施形態は、懸濁物中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）を成長させるため方法であって、懸濁物中で培養されるＰＳＣを提供することと、ＰＳＣを第１の組成物と培養容器中で接触させて、懸濁培養物を形成することと、ＰＳＣ拡大に好ましい条件下で懸濁培養物を培養することと、を含み、第１の組成物が、（ａ）細胞培養基本培地と、（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む、第１の小分子阻害剤と、（ｃ）ｒｈｏキナーゼ阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む、第２の小分子阻害剤と、（ｄ）１つ以上の有糸分裂成長因子と、任意選択で、（ｅ）１つ以上のアルブミン又はそのペプチドと、を含む、方法である。一態様では、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。別の態様では、ＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。

【0015】

一態様では、提供するステップは、ＰＳＣを単一細胞に解離することを含む。別の態様では、ＰＳＣは、接触させるステップの前に単一細胞として提供される。一態様では、接触させることは、懸濁培養物のための播種するステップでのものである。別の態様では、播種するステップは、懸濁培養物の継代することでのものである。

【0016】

一実施形態では、第１の組成物と接触させること及びそれとともに培養することとの後に、方法は、ＰＳＣを、播種する又は継代するステップの少なくとも１日後に、（ａ）細胞培養基本培地と、（ｂ）グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、その塩、又はそのエステルを含む、第１の小分子阻害剤と、（ｄ）１つ以上の有糸分裂成長因子と、（ｅ）１つ以上のアルブミン又はそのペプチドと、を含む、第２の組成物と接触させて、懸濁培養培地を改変することと、懸濁培養物を第２の組成物の存在下で培養することと、を更に含む。別の実施形態では、第１の組成物と接触させること及びそれとともに培養することの後に、方法は、ＰＳＣを、播種する又は継代するステップの少なくとも１日後に、（ａ）細胞培養基本培地と、（ｄ）１つ以上の有糸分裂成長因子と、（ｅ）１つ以上のアルブミン又はそのペプチドと、を含む、第２の組成物と接触させて、懸濁培養培地を改変することと、懸濁培養物を第２の組成物の存在下で培養することと、を更に含む。

【0017】

一態様では、第２の組成物と接触させるステップは、（ａ）第１の組成物を第２の組成物に置換すること、（ｂ）第２の組成物を懸濁培養物上に重層すること、又は（ｃ）第１の組成物の一部を第２の組成物と交換すること、を含む。一態様では、（ｃ）第１の組成物の一部を第２の組成物と交換することは、第１の組成物の少なくとも２５％を等価量の第２の組成物と交換することを含む。別の態様では、（ｃ）第１の組成物の一部を第２の組成物と交換することは、第１の組成物の少なくとも５０％を等価量の第２の組成物と交換することを含む。一態様では、方法は、細胞を第２の組成物と接触させた少なくとも１日後に、懸濁培養培地の少なくとも２５％を等価量の新鮮な第２の組成物と交換することを更に含む。別の態様では、方法は、細胞を第２の組成物と接触させた少なくとも１日後に、懸濁培養培地の少なくとも５０％を等価量の新鮮な第２の組成物と交換することを更に含む。一態様では、懸濁培養培地の更に交換することは、その後毎日行われる。別の態様では、懸濁培養培地の更に交換することは、その後１日おきに行われる。

【0018】

一態様では、培養容器は、マルチウェルプレート、フラスコ、又はバイオリアクターから選択される。一態様では、懸濁培養物は、少なくとも２０ｍＬの体積を有する。別の態様では、懸濁培養は、少なくとも１００ｍＬの体積を有する。一態様では、方法は、第１及び第２の組成物中で懸濁培養物を培養しながら、細胞を撹拌することを更に含む。別の態様では、撹拌することは、約３０ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭでのものである。

【0019】

いくつかの実施形態では、第１の組成物及び第２の組成物のうちの少なくとも１つは、血清フリーである。他の実施形態では、第１の組成物及び第２の組成物のうちの少なくとも１つは、動物由来フリーである。いくつかの実施形態では、第１の組成物、第２の組成物、又はそれらの組み合わせは、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供する。

【0020】

一態様では、第１の組成物及び／又は第２の組成物のＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］－Ｎ’－（５－ニトロ－２－チアゾリル）ウレア）０、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ［３，２－ｄ］［１］ベンザゼピン－６（５Ｈ）－オン）、ＳＢ２１６７６３（ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、又はＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、それらの塩、それらのエステル、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の態様では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一態様では、第１の組成物のＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）、Ｃｈｒｏｍａｎ１、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ポリアミン、Ｔｒａｎｓ－ＩＳＲＩＢ、チアゾバビン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）である。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ１活性を阻害する。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ２活性を阻害する。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ１活性及びＲＯＣＫ２活性を阻害する。

【0021】

一態様では、第１の組成物及び／又は第２の組成物の１つ以上の有糸分裂成長因子は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ヘレグリン（ＨＲＧ）、若しくはＫＧＦ、又はそれらの組み合わせを含む。別の態様では、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、少なくとも２つの有糸分裂成長因子を含み、少なくとも２つの有糸分裂成長因子は、ＥＧＦ及びＴＧＦ－α、ＥＧＦ及びＴＧＦ－β、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢＤＮＦ、ＥＧＦ及びＨＧＦ、ＥＧＦ及びＨＲＧ、ＥＧＦ及びＫＧＦ、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、ＴＧＦ－α及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－α及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－α及びＨＧＦ、ＴＧＦ－α及びＨＲＧ、ＴＧＦ－α及びＫＧＦ、ＴＧＦ－β及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－β及びＨＧＦ、ＴＧＦ－β及びＨＲＧ、ＴＧＦ－β及びＫＧＦ、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＨＲＧ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＲＧ、ＢＤＮＦ及びＫＧＦ、ＨＧＦ及びＨＲＧ、ＨＧＦ及びＫＧＦ、又はＨＲＧ及びＫＧＦを含む。

【0022】

一態様では、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、アルブミン又はそのペプチドを含み、アルブミンは、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ラット血清アルブミン、マウス血清アルブミン、ウマ血清アルブミンサル血清アルブミン、ブタ血清アルブミン、組換え血清アルブミン、前述のうちのいずれかの機能的フラグメント、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。一態様では、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、１つ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を更に含む。別の態様では、１つ以上のＥＣＭ成分は、フィブロネクチン、ラミニン、ニドゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、若しくはヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される。別の態様では、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、トランスフェリン及び／又はインスリンを更に含む。一態様では、第１の組成物及び／又は第２の組成物は、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル、脂肪酸、微量元素、抗酸化剤、塩、ヌクレオシド、緩衝剤、界面活性剤、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】実施例２に記載の、懸濁培養物中で成長させたＷＡ０９ ｈＥＳＣ（上列、「Ｈ９－ＥＳＣ」）及びＧｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ（中列、「Ｇｅｐｉ」）の拡大に対する、培養培地に様々な濃度（Ｘ軸）で添加した個々の小分子（ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ０３２５９０１、ＳＰ００１２５、ＢＩＲＤ７９６、及びＧｏ６９８３）並びに凝集剤の影響グラフの評価を示す。

【図2】実施例２に記載の様々な条件下で懸濁培養物中で成長させたｉＰＳＣの位相差顕微鏡写真［４０×］を示す。「継続的」という見出しの下の顕微鏡写真の左の列において、細胞を、示される濃度の示される小分子に継続的に曝露した。「１日目」という見出しの下の顕微鏡写真の右の列において、細胞を、示される濃度の示される小分子に１日目にのみ曝露した。

【図3】ｉＰＳＣの懸濁培養物への、抗凝集試薬無し（対照）又は抗凝集試薬有り（対照＋ＤＳ）のＰＳＣ基礎培養培地（緑色の棒）と比較した、様々な小分子の毎日の添加（青色の棒、「継続的」）対小分子の１日目の添加（赤色の棒、「１日目」）の影響の倍率変化評価を示す棒グラフである。Ｙ軸は、培養１日目～５日目の生存細胞数の倍率変化を示す。特定の条件下での５日目の細胞培養物の代表的な顕微鏡写真を示す。

【図4】ＷＡ０９ ＥＳＣの懸濁培養物への、抗凝集試薬物無し（対照）又は抗凝集試薬有り（対照＋ＤＳ）の基礎培養培地（緑色の棒）と比較した、様々な小分子の毎日の添加（青色の棒、「継続的」）対小分子の１日目の添加（赤色の棒、「１日目」）の影響の倍率変化評価を示す棒グラフである。Ｙ軸は、培養１日目～５日目の生存細胞数の倍率変化を示す。特定の条件下での５日目の細胞培養物の代表的な顕微鏡写真を示す。

【図5A-5B】実施例３に記載のＣＨＩＲ９９０２１（３ｕＭ）又は１０ｕＬの抗凝集試薬の存在下で懸濁培養物中で成長させたｉＰＳＣの拡大に対するＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ、又はＲｅｖｉｔａＣｅｌｌの影響グラフの評価を示す。

【図6】実施例３に記載の、示されるようにＣＨＩＲ９９０２１の存在下又は非存在下で様々な濃度のＢＳＡを含有する基礎培養培地中の懸濁培養物中で成長させた細胞の位相差顕微鏡写真を示す。

【図7】実施例３に記載の、示される濃度のＣＨＩＲ９９０２１及びＢＳＡの存在下で懸濁培養物中で成長させたｉＰＳＣの、培養５日目の、位相差顕微鏡写真、並びにＯＣＴ４（緑色）及びＤＮＡ（青色）について染色した再プレーティングに際しての同じ拡大細胞の免疫細胞化学顕微鏡写真を示す。

【図8】実施例３に記載の、懸濁培養物中で成長させたｉＰＳＣの拡大に対する、基礎ＰＳＣ培養培地への様々な濃度のＰｉｎａｃｉｄｉｌ、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｇｏ６８９３及びＢＳＡ（示されるように）の添加の影響グラフの評価を示す。

【図9A-9E】ＰＳＣ懸濁培養物のための。ＲＯＣＫｉ、ＰＳＣ培地処方物及び市販培地を使用した懸濁培養物におけるＰＳＣ拡大及び多能性の維持を示す。図９Ａ～９Ｂのグラフは、示される培地処方物における（Ａ）Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ及び（Ｂ）ＷＡ０９（Ｈ９）ＥＳＣの拡大倍率変化を示す。図９Ｃのグラフは、ＯＣＴ４陽性細胞％（ｉＰＳＣ（青色の棒）、ＥＳＣ（赤色の棒））を介して評価される、示される培地処方物（ｘ軸）での多能性の維持を示す。図９Ｄは、拡大後に自発的に分化したＥＳＣの位相差顕微鏡写真を示し、図９Ｅは、ＴａｑＭａｎ（商標）ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ（商標）Ｐａｎｅｌを介して評価した拡大ＥＳＣの三系列分化を示す。

【図10A-10C】ＰＳＣ拡大のためのＰＳＣ培養培地処方物とのＲＯＣＫｉの組み合わせを示す。図１０Ａは、実施例３に記載のＣＨＩＲ９９０２１を除外する基礎ＰＳＣ培養培地との、様々な濃度のＰｉｎａｃｉｄｉｌ、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ又はＹ－２７６３２の組み合わせでのｉＰＳＣ拡大における倍率変化を示す。図１０Ｂは、Ｙ－２７６３２又はＰｉｎａｃｉｄｉｌとともに播種し、ＣＨＩＲ９９０２１有り又は無しのＰＳＣ培地中で培養したｉＰＳＣの位相差顕微鏡写真を示す。図１０Ｃは、以下のＰＳＣ培地処方物を用いて培養したｉＰＳＣの拡大における３継代累積倍率変化を示すグラフである：１）ＰＳＣ培地＋１Ｘ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ、２）ＰＳＣ培地＋１Ｘ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ＋１．８８μＭのＣＨＩＲ９９０２１、３）ＰＳＣ培地＋１０μＭのＹ－２７６３２、４）ＰＳＣ培地＋１０μＭのＹ－２７６３２＋１．８８μＭのＣＨＩＲ９９０２１。

【図11A-11B】市販の培地、ｍＴｅＳＲ１と比較した、様々な糖源及び様々な濃度のＣＨＩＲ９９０２１を含む基礎ＰＳＣ培地を用いて１００ｍＬバイオリアクター中で拡大したｉＰＳＣの倍率変化拡大（Ａ）及び生存率（Ｂ）を示す。培地交換を、実施例３に記載物の毎日（ＥＤ）又は１日おき（ＥＯＤ）のケイデンスで完了した。

【図12A-12D】ＰＳＣ培養培地処方物とのＲＯＣＫｉの組み合わせの評価を示す。図１２Ａは、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌとともに及びＹ－２７６３２とともに播種したときの５日目のｉＰＳＣ拡大のグラフである。図１２Ｂは、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌとともに及びＹ－２７６３２とともに播種したときのｉＰＳＣの３継代拡大のグラフである。図１２Ｃは、Ｃｈｒｏｍａｎ Ｉとともに及びＹ－２７６３２とともに播種したときのｉＰＳＣの３継代拡大のグラフである。図１２Ｄは、示されるＲＯＣＫｉをＰＳＣ培地処方物とともに使用して生成されたｉＰＳＣスフェロイドの位相差顕微鏡写真である。

【図13】培地処方物を使用して成長させた懸濁培養物中のＰＳＣの倍率拡大を示すグラフである。（Ａ）ＣＨＩＲ９９０２１の非存在下でのＰＳＣ培地、（Ｂ）ＣＨＩＲ９９０２１を含有するＰＳＣ培地、及び（Ｃ）ｍＴｅＳＲ１。

【図14A-14C】完全ＰＳＣ培地処方物の使用及びｍＴｅＳＲ１培地の使用からのｉＰＳＣ拡大及び多能性の比較を示す。図１４Ａのグラフは、３継代にわたるｉＰＳＣ拡大倍率変化を示す。図１４Ｂのグラフは、継代の過程にわたる生存率を示す。図１４Ｃのグラフは、多能性の細胞内マーカーＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧを介して評価される多能性の維持を示す。

【図15A-15B】播種のためにＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ、Ｙ－２７６３２及びＣｅｌｌａｒｔｉｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３を使用したスフェロイド成長の評価を示す。図１５Ａは、記述される播種条件からのスフェロイドの拡大倍率変化及び位相差顕微鏡写真を示す。図１５Ｂは、記述される播種条件からのスフェロイドの多能性を示す。

【図16】完全ＰＳＣ培地及び２つの他の拡大培地中で拡大したＰＳＣが、次いで、内胚葉系列に直接分化される能力を示すグラフである。

【図17A-17B】完全ＰＳＣ培地処方物中で拡大した細胞が、次いで、外胚葉系列に直接分化される能力を示すＩＣＣ画像及びグラフを示す。図１７Ａは、ＳＯＸ１（赤色）及びネスチン（緑色）の発現を示す代表的なＩＣＣ画像を示し、ＳＯＸ１発現の定量化を下のグラフに示す。図１７Ｂは、ＰＡＸ６（赤色）及びＯＴｘ２（緑色）の発現を示す代表的なＩＣＣ画像を示し、ＰＡＸ６の定量化を下のグラフに示す。

【図18A-18D】ＰＢＳバイオリアクターを使用した１００ｍＬフォーマットでのＰＳＣ拡大及び多能性を示す。図１８Ａのグラフは、３継代にわたる倍率拡大ｉＰＳＣを示す。図１８Ｂ～１８Ｃは、ＴａｑＭａｎ（商標）ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ（商標）Ｐａｎｅｌ（Ｂ）及びＰｌｕｒｉＴｅｓｔ（商標）Ａｓｓａｙ分析（Ｃ）を介して決定される多能性の維持を示す。図１８Ｄは、ＫａｒｙｏＳｔａｔ Ａｓｓａｙ分析を介して評価した正常な核型の維持を示す。

【図19A-19C】１００ｍＬスケールのＰＢＳミニバイオリアクターにおけるスフェロイド直径チューニング（ｔｕｎｉｎｇ）の評価を示す。図１９Ａ中の画像は、開始後３日目のスフェロイド形態を示し、様々な直径のスフェロイドを生成する能力を示す。図１９Ｂのグラフは、様々な撹拌速度（ｘ軸）でのバイオリアクター培養物についての継代後５日目の倍率変化を示す。各々の個々のフラスコからの細胞数を、個々のデータポイントによって示す。図１９Ｃのグラフは、多能性の細胞外（ＴＲＡ１－６０、青色）及び細胞内（ＯＣＴ４、赤色）マーカーの存在を介した様々な撹拌速度（ｘ軸）でのバイオリアクター培養物についての多能性を示す。

【図20A-20D】シェーカーフラスコ及び他の容器における異なる細胞株からのスフェロイド成長を示す。図２０Ａは、スフェロイドの代表的な位相差顕微鏡写真を示し、図２０Ｂは、シェーカーフラスコ中で成長させたＧｉｂｃｏ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ、ＷＴＣ－１１ ｉＰＳＣ、ＷＡ０９ ＥＳＣ、及びＷＡ０１ ＥＳＣからの累積倍率拡大を示す。図２０Ｃ～２０Ｄは、様々なサイズのシェーカーフラスコ（Ｃ）及び複数のタイプの培養容器（Ｄ）におけるｉＰＳＣの倍率拡大を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

分子ＧＳＫ３阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、１つ以上の有糸分裂成長因子を含む細胞培養組成物が本明細書に記載される。有利なことに、本明細書に記載の細胞培養組成物は、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、多能性幹細胞（ＰＳＣ）成長を増加させ、ＰＳＣ増殖を増強し、ＰＳＣ多能性を維持し、スフェロイド形態を維持し、ＰＳＣ形態を維持し、ＰＳＣ継代数を増加させ、ＰＳＣ培養スケールを増加させる。

【0025】

本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、単一細胞レベルで自己再生及び分化の両方をして、子孫細胞（自己再生前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞を含む）を生成するその能力によって規定される未分化細胞を指す。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系列の機能細胞にインビトロで分化する、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じる、及び胚盤胞中への注入後に実質的に大部分の（全てではないにしても）組織に寄与するその能力によって特徴付けられる。幹細胞は、その発生潜在力によって以下のように分類される：（１）全能性、全ての胚性及び胚外性細胞型を生じることができることを意味する、（２）多能性、全ての胚性細胞型を生じることができることを意味する、（３）多分化能性、細胞系列のサブセットを生じることができるが、全てが特定の組織、器官、若しくは生理学的システム内であることを意味する（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞限定少能性前駆細胞及び血液の通常成分である全ての細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を生成し得る）、（４）少能性、多分化能性幹細胞よりも限定された細胞系列のサブセットを生じることができることを意味する、又は（５）単能性、単一の細胞系列を生じることができることを意味する（例えば、精子形成幹細胞）。

【0026】

当業者は、多能性幹細胞が、ＳＳＥＡ３及び４、アルカリホスファターゼ、ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２などを含むがこれらに限定されない、１つ以上の「多能性マーカー」、又は多能性細胞を示す生体分子を発現し得ることを容易に理解する。多能性マーカーは、抗体ベースのアッセイ、ＰＣＲベースのアッセイ、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、細胞化学ベースのアッセイ、組織化学ベースのアッセイなどを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で受け入れられている技術を使用して測定され得る。いくつかの市販の試験が利用可能である。

【0027】

増殖させられた多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３つ全ての胚葉の細胞に分化する潜在力を有する。幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス中に注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドを使用して固定し、次いで、３つの胚葉からの細胞型の証拠についてそれを組織学的に調べることによって確認され得る。あるいは、多能性は、胚様体の作製、及び胚様体を３つの胚葉に関連するマーカーの存在について評価することによって決定され得る。増殖させられた多能性幹細胞株は、標準的なＧ分染技術を使用して核型決定され、対応する霊長類種の公開された核型と比較され得る。細胞は「正常な核型」を有し得る。これは、細胞が正倍数体であることを意味し、ここで、全てのヒト染色体が存在し、著しくは変化していない。

【0028】

本明細書に記載の実施形態において有用な多能性幹細胞には、妊娠の間の任意の時に、典型的には、必ずしもそうではないが、およそ妊娠１０～１２週の前に、採取された前期胚子組織（例えば、胚盤胞など）、胚組織、又は胎児組織を含む、妊娠後に形成された組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例としては、ヒト胚性幹細胞又はヒト胚性生殖細胞の樹立株、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９などが挙げられる。本開示の組成物のそのような細胞の最初の樹立又は安定化の間の使用も企図され、この場合、供給源細胞は、供給源組織から直接採取された初代多能性細胞である。フィーダー細胞の非存在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取された細胞もまた好適である。例えば、ＢＧ０１ｖなどの、変異ヒト胚性幹細胞株もまた好適である。例えば、成体体細胞などの、非多能性細胞に由来する多能性幹細胞もまた好適である。

【0029】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞（ｉＰＳＣ）」（又は胚性様（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ－ｌｉｋｅ）幹細胞）という語句は、体細胞（例えば、成体体細胞）の脱分化によって得られる増殖性の多能性幹細胞を指す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「分化」は、それによって特殊化されていない（「拘束されていない（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」）か又はより少なく特殊化された細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化した又は分化誘導された細胞は、細胞の系列内でより特殊化された（「拘束された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）」）位置にあるものである。「拘束された」という用語は、分化のプロセスに適用されるとき、通常の状況下では、それが特異的な細胞型又は細胞型のサブセットへの分化を継続する点まで分化経路において進行しており、通常の状況下では、異なる細胞型への分化又はより少なく分化した細胞型への復帰をし得ない細胞を指す。

【0031】

本明細書で使用される場合、「脱分化」は、それによって細胞が、細胞の系列内のより少なく特殊化された（又は拘束された）位置に復帰するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞の系列は、細胞の遺伝、すなわち、それがどの細胞から来て、それが何の細胞を生じ得るかを規定する。細胞の系列は、細胞を発生及び分化の遺伝スキーム内に置く。系列特異的マーカーとは、目的の系列の細胞の表現型に特異的に関連する特徴を指し、拘束されていない細胞の目的の系列への分化を評価するために使用され得る。

【0032】

本明細書で使用される場合、「維持」は、一般に、細胞のより大きな集団を生じ得るか又はそうでない、細胞の成長、拡大、及び／又は分裂を促進する条件下で、成長培地に入れられた細胞を指す。

【0033】

本明細書で使用される場合、「継代」は、細胞を１つの培養容器から取り出し、それを細胞の成長／拡大及び／又は分裂を促進する条件下で第２の培養容器に入れるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、継代は、より小さなクラスター又は個々の細胞を得るための細胞クラスターの解離、それに続く、解離したクラスター又は細胞の培養培地中での成長を含み得る。いくつかの実施形態では、解離した細胞クラスター又は細胞の全部又は一部は、新たな培養培地に入れられる。いくつかの実施形態では、解離したクラスター又は細胞は、新たな培地に入れられず、むしろ、追加の培地又はサプリメントが、解離した細胞培養物に添加される。細胞の特定の集団、又は細胞株は、時折、それが継代された回数で称されるか又はそれによって特徴付けられる。例えば、１０回継代された培養細胞集団は、Ｐ１０培養物と称され得る。初代培養物、すなわち組織からの細胞の単離後の第１の培養物は、Ｐ０と称される。第１の継代培養の後、細胞は二次培養物（Ｐ１又は継代１）として記載される。第２の継代培養の後、細胞は三次培養物（Ｐ２又は継代２）になる、など。継代の期間の間に多くの集団倍加が存在し得、したがって、培養物の集団倍加の数は継代数よりも大きいことは、当業者によって理解される。継代間の期間の間の細胞の拡大（すなわち、集団倍加の数）は、播種密度、基材、培地、成長条件、及び継代間の時間を含むがこれらに限定されない、多くの要因に依存する。

【0034】

いくつかの実施形態では、懸濁培養のためのＰＳＣ播種密度は、約２５，０００～約４００，０００生存細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、懸濁培養のためのＰＳＣ播種密度は、約１００，０００～約２００，０００生存細胞／ｍＬである。特定の実施形態では、ＰＳＣ播種密度は、約１５０，０００生存細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ播種密度は、約２５，０００、約５０，０００、約７５，０００、約１００，０００、約１２５，０００、約１７５，０００、約２００，０００、約２２５，０００、約２５０，０００、約２７５，０００、約３００，０００、約３２５，０００、約３５０，０００、約３７５，０００、約４００，０００、約２５，０００～約１００，０００、約５０，０００～約２００，０００、約１００，０００～約３００，０００、又は約２００，０００～約４００，０００生存細胞／ｍＬである。

【0035】

本明細書で使用される場合、ＰＳＣ培養物の拡大の文脈において使用される「拡大する」という用語は、培養期間にわたって達成された生存細胞／培養物において播種された生存細胞を指す。したがって、拡大は、培養期間にわたる生存ＰＳＣ数の倍率増加及び／又は増加パーセントを指し得る。単一の多能性幹細胞から得られ得る、多能性幹細胞の数は、多能性幹細胞の増殖能に依存することが理解される。多能性幹細胞の増殖能は、細胞の倍加時間（すなわち、細胞が培養物中で有糸分裂を受けるために必要とされる時間）及び多能性幹細胞培養物が未分化状態で維持され得る期間によって計算され得る（これは、継代数掛ける各継代間の日数と等価である）。

【0036】

本明細書で使用される場合、ＰＳＣの解離の文脈における「解離」という語句は、ＰＳＣの凝集塊又はクラスターをより小さな凝集塊又はクラスター及び／又は単一細胞に分離することを指す。機械的及び非機械的解離手段が、本明細書に記載の実施形態において有用である。

【0037】

本明細書で使用される場合、「単一細胞」という語句は、多能性幹細胞が細胞クラスターを形成しない状態を指す。いくつかの実施形態では、「単一細胞」は、一緒にクラスター化された１０個以下のＰＳＣ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ「クラスター」は、懸濁培養物中の、約２００個以上の多能性幹細胞の凝集を指す。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞凝集塊の各々は、少なくとも約２００個の細胞、少なくとも約５００個の細胞、少なくとも約６００個の細胞、少なくとも約７００個の細胞、少なくとも約８００個の細胞、少なくとも約９００個の細胞、少なくとも約１０００個の細胞、少なくとも約１１００個の細胞、少なくとも約１２００個の細胞、少なくとも約１３００個の細胞、少なくとも約１４００個の細胞、少なくとも約１５００個の細胞、少なくとも約５×１０³個の細胞、少なくとも約１×１０⁴個の細胞、少なくとも約５×１０⁴個の細胞、少なくとも約１×１０⁵個の細胞、少なくとも約１×１０⁶個の細胞又はそれ以上を含む。

【0038】

本明細書で使用される場合、「懸濁培養物」は、その中で多能性幹細胞が表面に接着するのではなく、培地中に懸濁されている培養物を指す。

【0039】

本明細書で使用される場合、「マーカー」は、目的の細胞において差次的に発現される生体分子（例えば、核酸、タンパク質、糖タンパク質など）を指す。この文脈において、差次的発現は、陽性マーカーについてはレベルの増加を、陰性マーカーについてはレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、目的の細胞が当該技術分野で知られている様々な方法のうちのいずれかを使用して同定され得、他の細胞と区別され得るように、他の細胞と比較して目的の細胞において十分により高いか又はより低い。多能性のマーカーには、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＣＤ２４、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0040】

本明細書で使用される場合、「慣習的なＰＳＣ培地（ｃｕｓｔｏｍａｒｙ ＰＳＣ ｍｅｄｉａ）」又は「慣習的なＰＳＣ培地（ｃｕｓｔｏｍａｒｙ ＰＳＣ ｍｅｄｉｕｍ）」は、当該技術分野で知られている任意のＰＳＣ培地、例えば、ＭＥＦ（マウス胎仔維芽細胞）馴化培地又はフィーダーフリーシステム、例えば、ＳｔｅｍＦｌｅｘ（商標）培地、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（登録商標）ｈＥＳＣ ＸＦ培養培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地、ｍＴｅＳＲ（商標）培地、ｍＴｅＳＲ（商標）－２培地などを指す。

【0041】

本明細書で使用される場合、「プリン誘導体」という用語は、プリン複素環式化合物及びその変形を指す。別の態様では、プリン誘導体は、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチド、又はプリンヌクレオチド一、二、若しくは三リン酸を指す。一態様では、「プリン誘導体」は、プリン、アデニン、アロプリノール、カフェイン、ジフィリン、グアニン、ヒポキサンチン、イソグアニン、テオブロミン、テオフィリン、尿酸、キサンチン、とりわけ、それらの塩、それらのエステル、又はそれらの組み合わせを指す。

【0042】

本明細書で使用される場合、「培地又はサプリメント濃縮物」、「濃縮培地、サプリメント、又は培地」、「濃縮物」又は「＃×濃縮物」という語句は、互換的に使用され、１つ以上の種を使用のために意図された濃度、すなわち「作業濃度」よりも高い濃度で含有する溶液を指す。「＃×濃縮物」の場合、「＃×」は希釈係数を指す。例えば、「１０×濃縮物」は、１×作業濃度を達成するために１０倍希釈される。１０×濃縮物（例えば、２Ｍ）は、１×作業濃度（例えば、２００ｍＭ）を達成するために、１部の１０×濃縮物を９部の溶媒（水など）と組み合わせることによって希釈される。希釈式Ｃ１・Ｖ１＝Ｃ２・Ｖ２（式中、Ｃ１は初期濃度であり、Ｖ１は初期体積であり、Ｃ２は最終濃度であり、Ｖ２は最終体積である）を使用して、適切な希釈を計算し得る。

【0043】

本明細書で使用される場合、「粉末」又は「乾燥粉末」という用語は、その肉眼的な外観が易流動性であり得る、乾燥顆粒形態で存在する細胞培養のためのフィード、サプリメント、又は培地粉末若しくは粉末化培地組成物を指す。「粉末」という用語は、凝集粉末を含む。凝集培地、フィード、栄養粉末、サプリメントなどの調製、それらの特性、及び凝集培地、フィード、栄養粉末、サプリメントなどの自動ｐＨ及び自動浸透圧モル濃度を調製する方法は、米国特許第６，３８３，８１０号及び同第６，６２７，４２６号、並びに米国特許出願公開第２０１９／００４８３１２Ａ１号に記載され、とりわけ、これらのそれぞれは、凝集培地に関連する教示のために参照により組み込まれている。

【0044】

本明細書で使用される場合、「成分」という用語は、化学又は生物起源に関係なく、細胞の増殖の成長を維持又は促進するために、細胞培養培地において使用され得る任意の化合物を指す。「成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」、「栄養素」、及び成分（ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」という用語は互換的に使用され、全てはそのような化合物を指す。細胞培養培地において使用される典型的な成分としては、アミノ酸、塩、金属、糖、炭水化物、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などが挙げられる。エクスビボでの細胞の培養を促進又は維持する他の成分は、特定の必要性によって、当業者によって選択され得る。

【0045】

本明細書で使用される場合、「細胞培養」又は「培養」という用語は、人工的な、例えば、インビトロ環境における細胞の維持を指す。しかしながら、「細胞培養」という用語は一般名称であり、ヒト若しくは動物細胞、個々の原核生物（例えば、細菌）又は真核生物（例えば、動物、植物及び真菌）細胞などの細胞の培養だけでなく、そのために「組織培養」、「器官培養」、「器官系培養」又は「器官型培養」という用語が「細胞培養」という用語と互換的に使用され得る、組織、ヒト若しくは動物組織、器官、器官系又は生物全体の培養もまた包含するように使用され得ることを理解されたい。

【0046】

本明細書で使用される場合、「細胞培養培地」、「培養培地」、「培地処方物」、「多能性幹細胞組成物」、「ＰＳＣ組成物」、「ＰＳＣ培地」、又は「培地」（各々の場合に複数形「培地（ｍｅｄｉａ）」）という語句は、細胞の培養及び／又は成長をサポートする栄養溶液又は「栄養培地」を指し、これらの語句は互換的に使用され得る。細胞培養培地は、基本培地（細胞成長をサポートするために追加の成分を必要とする一般的な培地）又は細胞成長をサポートするための全ての又はほとんど全ての成分を有する完全培地であり得る。細胞培養培地は、血清フリー、タンパク質フリー（一方又は両方）、動物由来フリーであり得、効率的で堅牢な細胞性能のために、小分子、成長因子、添加物、フィード、サプリメントなどの追加の成分を必要とし得るか又はそうでない。

【0047】

本明細書で使用される場合、「基礎培地」、又は「基本培地」は、典型的には、細胞成長をサポートするために補充を必要とする培地を指す。基本培地は、ビタミン及びアミノ酸を含み得るが、タンパク質、脂質、小分子、又は成長因子を含まない。

【0048】

本明細書に記載の栄養培地及びサプリメントは、本明細書に記載されるように調製及び使用され得る様々な「サブグループ」に分けられ得る。そのようなサブグループは、別々に調製され、次いで、組み合わされて、栄養培地を生成し得る。適合性サブグループ及び関連する考慮事項の例については、米国特許第５，４７４，９３１号及び同第５，６８１，７４８号を参照されたい。これらは、このような教示について参照により本明細書に組み込まれる。

【0049】

本明細書で使用される場合、「組み合わせる」という用語は、細胞培養培地処方物における成分の混合又は混ぜ合わせを指す。組み合わせは、液体若しくは粉末の形で、又は１つ以上の粉末及び１つ以上の液体で行うことができる。一例では、２つ以上の成分を混合して、培地若しくはサプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液などの複合的混合物を生成し得る。組み合わせには、乾燥成分と液体成分の混合も含まれる。

【0050】

本明細書で使用される場合、「接触させる」という用語は、培養される細胞を、その中で細胞が培養される培地及び／又はサプリメントとともに培養容器中に入れることを指す。「接触させる」という用語は、とりわけ、細胞を培地及び／又はサプリメントと混合すること、細胞を培地及び／又はサプリメントで灌流すること、培地及び／又はサプリメントを培養容器中で細胞上にピペッティングすること、並びに細胞を培養培地及び／又はサプリメント中に浸すことを包含する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「培養」という用語は、細胞の活動又は静止状態での、成長、分化、又は継続的な生存率に好都合な条件下での人工環境における細胞の維持を指す。したがって、「培養」は、「培養する」、「細胞培養」、「細胞成長」、「細胞維持」、又は上記の同義語のうちのいずれかと互換的に使用され得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、「培養容器」という用語は、細胞を保持するための入れ物を指す。容器は、細胞を培養、保持、又は貯蔵するための無菌環境を提供することができるガラス、プラスチック、金属、又は他の材料であり得る。培養容器は、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、又は９６ウェルプレートなどの、ウェルを有するプレートであり得る。プレートは、様々な細胞培養用途のために使用され得る非組織培養処理プレートであり得る。プレートは、無菌である透明な、未処理の、疎水性ポリスチレン表面を有し得る。プレートは、リバーシブルでない蓋を有し得、ウェル間の相互凝縮を防止する。培養容器は、シェーカーフラスコ、スピナーフラスコ、バイオリアクター、懸濁バッグ、又は細胞を培養するための他の手段であり得る。いくつかの実施形態では、培養容器は、１２５ｍＬシェーカーフラスコ、２５０ｍＬシェーカーフラスコ、１００ｍＬバイオリアクター、又は５００ｍＬバイオリアクターであり得る。「コンテナ」という用語は同義である。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、約１ｍＬ～約１０００ｍＬの懸濁培養体積中で成長させられる。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは、約０．５ｍＬ～約２ｍＬ、０．５ｍＬ～約２０ｍＬ、約２０ｍＬ～約１００ｍＬ、約２０ｍＬ～約５００ｍＬ、約１００ｍＬ～約５００ｍＬ、又は約５００ｍＬ～約１０００ｍＬの懸濁培養体積中で成長させられる。

【0054】

いくつかの実施形態では、ＰＳＣを培養する又は成長させることは、細胞培養の間に細胞を撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、懸濁培養物中のＰＳＣは、培養期間の大部分の間、撹拌又は撹拌運動に供される。いくつかの実施形態では、懸濁培養物中のＰＳＣは、培養期間の大部分の間、一定の又は継続的な撹拌又は撹拌運動に供される。培養細胞を撹拌するための例示的な手段としては、オービタルロッカープラットフォームなどのロッカープラットフォーム、磁気撹拌プレートなどの撹拌プレート、ＣＯ２耐性シェーカーなどのオービタルシェーカー、及びバイオリアクター、例えば、回転ホイールインペラーを有するバイオリアクター又は撹拌インペラーを有するバイオリアクターが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載されるように、ＰＳＣ懸濁培養物が撹拌される速度は、限定されないが、懸濁培養物の体積、培養容器のサイズ及びタイプ、培養物を撹拌するための手段、細胞密度、及び培養の間に所望されるスフェロイドサイズに従って変動し得る。いくつかの実施形態では、懸濁物中でＰＳＣを培養することは、細胞を少なくとも２０ＲＰＭ～約２００ＲＰＭで撹拌することを含む。いくつかの実施形態では、懸濁物中でＰＳＣを培養することは、約３０ＲＰＭ～約１８０ＲＰＭ、約４０ＲＰＭ～約１６０ＲＰＭ又は約４０ＲＰＭ～約８０ＲＰＭで細胞を撹拌することを含む。特定の実施形態では、懸濁培養物中のＰＳＣは、培養期間を通して単一の速度で撹拌される。特定の実施形態では、懸濁培養物中のＰＳＣは、培養期間の間、少なくとも２つの異なる速度で撹拌される。

【0055】

本明細書で使用される場合、「有効量」又は「有効濃度」という用語は、使用のために利用可能である、成分の量を指す。一例は、培養培地中のビタミンの量である。これは、通常そのビタミンに関連する生物学的プロセスで使用するために細胞が利用できる。したがって、有効量には、細胞が代謝するために利用可能な細胞培養成分（例えば、ビタミン又は糖）の量が含まれる。成分の有効量は、例えば、当業者に利用可能な知識から、又は実験的決定によって、決定され得る。

【0056】

本明細書で使用される場合、「サプリメント」、「サプリメント組成物」、「幹細胞培養サプリメント組成物」、「フィード」、又は「フィード又はサプリメント」という用語は、標準的な培養物中の細胞に添加されたときに、細胞の維持、拡大、成長、及び生存率に有益であり得るか、又は細胞性能に影響を与え得る、培養物寿命を増加させ得る、細胞増殖を増加させ得る、多能性を維持し得る、スフェロイド形態を維持し得る、ＰＳＣ形態を維持し得る、継代数を増加させ得る、培養スケールを増加させ得るなどの組成物を指す。「フィード」又は「サプリメント」という用語は、本開示において互換的に使用され得、培養物、又は細胞培養システム中の細胞の成長又は性能を再均衡化（ｒｅｂａｌａｎｃｅ）若しくは補充又は調節するために必要とされる、１つ以上の小分子阻害剤（例えば、ＲＯＣＫ阻害剤及び／若しくはＧＳＫ３阻害剤など）、アミノ酸、糖、ビタミン、無機塩若しくは有機塩、微量元素、緩衝液、ペプチド、加水分解物、画分、成長因子（有糸分裂成長因子を含む）、アルブミン、ホルモンなどを含む培地、フィード、又はサプリメントの乾燥粉末又は液体フォーマットを指す。フィード又はサプリメントは、それが、典型的には、細胞を培養するために使用され得るか又は使用されている細胞培養培地に添加される（例えば、特定の培地中の既存の細胞培養物に添加されるか又は培地に細胞を添加する前に特定の培地に添加される）という点で、細胞培養培地と区別され得る。細胞が培地中で成長するにつれて、成分は消費され、フィード又はサプリメントはそれらの枯渇又は分解された成分を置換する。培地、サプリメント、又はサプリメントを含む培地の一部は、細胞が培地中で成長するにつれて細胞培養物から除去され、等価量の新鮮な培地、サプリメント、又はサプリメントを含む培地に置換され得る（すなわち、交換され得る）。例えば、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が交換される。いくつかの実施形態では、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５０％が交換される。他の実施形態では、フィード、サプリメント、又はサプリメントを含有する培地は、培養溶液の上部に重層として添加され得る。更に、フィード又はサプリメントは、例えば、細胞生存率を増加させること、細胞増殖を増加させること、細胞成長を増強すること、多能性を維持すること、形態を維持すること、又は継代数を増加させることによって、培養物内の細胞を調節するために使用され得る。当業者によって理解されるように、フィード又はサプリメントは、培養物、又は細胞培養システム中の細胞の成長又は性能を再均衡化若しくは補充又は調節するために必要とされる、アミノ酸、糖、ビタミン、緩衝液などを含み得る。

【0057】

本明細書に記載の一実施形態では、フィード又はサプリメントは、細胞培養適合性ビヒクル中に、少なくとも１つの小分子阻害剤、有糸分裂成長因子、又はアルブミン、その塩、若しくはエステル、又はそれらの組み合わせを含む。そのようなサプリメントは、細胞成長を増加させる、細胞生存率を増加させる、培養物寿命を増加させる、細胞増殖を増加させる、多能性を維持する、スフェロイド形態を維持する、ＰＳＣ形態を維持する、継代数を増加させる、又は培養スケールを増加させるために、新たな又は既存の細胞培養物に時々添加され得る。そのようなフィード又はサプリメントは、濃縮物若しくは作業濃度のものであり得、又は単に希釈の割合を占め、元の培地中に存在する成分の濃度を維持するように特定の成分について部分的に濃縮され得る。

【0058】

本明細書で使用される場合、細胞培養培地組成物は、いくつもの成分で構成され、これらの成分は培養培地ごとに変動する。「１×処方物」は、作業濃度で細胞培養培地中に見出される一部又は全ての成分を含む、任意の水溶液を指すことを意味する。「１×処方物」は、例えば、細胞培養培地、又はその培地のための成分の任意のサブグループを指し得る。１×溶液における成分の濃度は、インビトロで細胞を維持又は培養するために使用される細胞培養処方物において見出されるその成分の濃度とほぼ同じである。細胞のインビトロ培養のために使用される細胞培養培地は、定義により１×処方物である。いくつもの成分が存在する場合、１×処方物中のそれぞれの成分は、細胞培養培地中のそれらの成分の濃度にほぼ等しい濃度を有する。例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培養培地は、成分の中でも、０．２ｇ／Ｌのｌ－アルギニン、０．０５ｇ／Ｌのｌ－アスパラギン、及び０．０２ｇ／Ｌのｌ－アスパラギン酸を含有する。これらのアミノ酸の「１×処方物」は、溶液中にほぼ同じ濃度のこれらの成分を含む。したがって、「１×処方物」に言及する場合、溶液中のそれぞれの成分は、説明される細胞培養培地において見出される濃度と同じ又はほぼ同じ濃度を有することが意図される。細胞培養培地の１×処方物の濃度及び成分は当業者に知られている。例えば、Ｂａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉａ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｆｏｒ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）を参照されたい。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、浸透圧モル濃度及び／又はｐＨは、特により少ない成分が１×処方物中に含有されるときに、培養培地と比較して１×処方物において異なり得る。任意の成分の１×濃度は、様々な培地処方物にわたって必ずしも一定ではない。したがって、１×は、異なる培地に言及するときに、単一成分の異なる濃度を示し得る。しかしながら、一般に使用されるときに、１×は、言及される培地のタイプにおいて一般的に見出される典型的な作業濃度を示す。１×の量は、関連する体積の培地に対して１×の濃度になる成分の量である。

【0059】

本明細書で使用される場合、「１０×処方物」は、その溶液中の各成分が、細胞培養培地中の同じ成分よりも約１０倍濃縮されている溶液を指す。例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培養培地の１０×処方物は、成分の中でも、２．０ｇ／Ｌのｌ－アルギニン、０．５ｇ／Ｌのｌ－アスパラギン、及び０．２ｇ／Ｌのｌ－アスパラギン酸を含有し得る（上述の１×処方物と比較されたい）。「１０×処方物」は、１×培養培地に見られる濃度の約１０倍の濃度でいくつもの追加の成分を含み得る。容易に明らかとなるように、「２０×処方物」、「２５×処方物」、「５０×処方物」及び「１００×処方物」は、それぞれ、１×細胞培養培地と比較して、約２０、２５、５０又は１００倍の濃度の成分を含有する溶液を示す。同様に、培地処方物及び濃縮溶液の浸透圧モル濃度及びｐＨは異なる場合がある。培養培地濃縮物技術に関する米国特許第５，４７４，９３１号を参照されたい。

【0060】

本明細書で使用される場合、「生理学的ｐＨ」は、約４より大きく、約９未満である。他の又は特定のｐＨ値又は範囲、例えば、４．２、４．５、４．８、５．０、５．２、５．５、５．７、５．８、６．０、６．２、６．５、６．７、６．８、７．０、７．２、７．４、７．５、７．８、８．０、８．２、８．４、８．５、８．７、８．８などを超える最小若しくは最大ｐＨ、又は約４．０～約９．０、約４．０～約５．０、約５．０～約６．０、約６．０～約７．０、約８．０～約９．０、約４．０～約６．０、約５．０～約７．０、約６．０～約８．０、約７．０～約９．０、約６．０～約９．０、若しくは約４．０～約７．０の最小若しくは最大ｐＨもまた、サプリメントを溶解するのに使用できる。一部のサプリメントは、好ましくはないが、これらの範囲外でのみ完全に溶解できる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「生物学的及び生化学的活性の著しい損失無しに」という語句は、新鮮に作製された同じ処方の栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、緩衝液又はサンプルと比較したときの、目的の栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、緩衝液又はサンプルの生物学的又は生化学的活性の約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、又は約１０％未満の減少を指す。

【0062】

本明細書で使用される場合、「溶媒」は、培地の別の成分を溶解するか又は溶解した液体である。溶媒は、培地、フィード、サプリメント、サブグループ、又は他の処方物の調製において、及び細胞を培養するための調製における培地の再構成又は濃縮物の希釈において使用され得る。溶媒は、極性、例えば、水性溶媒、又は非極性、例えば、有機溶媒であり得る。溶媒は複合的（すなわち、成分を可溶化するために１つより多い成分を必要とする）であり得る。複合的溶媒は、アルコール及び水などの２つの液体の単純混合物であり得、又は液体中の塩若しくは他の固体の混合物であり得る。場合によっては、可溶性混合物を形成するために、２、３、４、５、６、又はそれ以上の成分が必要になることがある。エタノール又はメタノールと水との混合物などの単純溶媒は、その調製及び取り扱いの容易さのために使用され得る。

【0063】

本明細書で使用される場合、「延長された期間」又は「長期貯蔵寿命」という用語は、互換的に、そのためにサンプル（例えば、医薬組成物、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液）が貯蔵される期間よりも長い期間を指す。したがって、本明細書で使用される場合、「延長された期間」又は「長期貯蔵寿命」は、約－７０℃、約－２０℃、約０℃、約４℃、約１０℃、約２０℃、約２５℃、約－７０℃～約２５℃、約－２０℃～約２５℃、約０℃～約２５℃、約４℃～約２５℃、約１０℃～約２５℃、又は約２０℃～約２５℃の温度での貯蔵を含み得る、所与の貯蔵条件下での、約１～３６ヶ月、約２～３０ヶ月、約３～２４ヶ月、約６～２４ヶ月、約９～１８ヶ月、又は約４～１２ヶ月を意味する。医薬組成物又は臨床組成物、細胞培養試薬、栄養素、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液の生物学的又は生化学的活性を決定するためのアッセイは、当該技術分野でよく知られており、当業者が精通している。

【0064】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は「およそ」を意味し、数値を修飾するとき、値が記述された値の±１０％変動し得ることを示す。

【0065】

本明細書に記載の一実施形態は、多能性幹細胞組成物であって、細胞培養基本培地、少なくとも１つのＧＳＫ３阻害剤、１つ以上の有糸分裂成長因子、及び、任意選択で、少なくとも１つのＲＯＣＫ阻害剤を含み、細胞培養物に添加されたときに、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供する、組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のアルブミン又はそのペプチドを更に含む。本明細書に記載の組成物はまた、任意選択で、とりわけ培養物又は細胞培養システム中の細胞の培地成分を再均衡化又は補充するために必要とされる、１つ以上のアミノ酸、糖、ビタミン、ペプチドを含有し得る。一態様では、組成物は、細胞培養における使用の前に又はその際に希釈される液体濃縮物である。別の態様では、フィードは、培養物に直接添加されるか又は細胞培養物への添加の前に濃縮物若しくは作業体積を達成するように細胞培養適合性ビヒクル（例えば、水）中に溶解される、乾燥粉末、凝集粉末、錠剤、又は他の乾燥形態である。一態様では、組成物は、表１の例示的なリストから様々に選択される成分を含む。

【表1-1】

【表1-2】

【0066】

一実施形態では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、少なくとも１つの小分子阻害剤、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせを含む。一態様では、小分子阻害剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤、その塩、若しくはそのエステル、又はｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤、その塩、若しくはそのエステルである。本明細書で使用される場合、「ＧＳＫ３阻害剤」という用語は、阻害剤分子、その塩及びそのエステルを含む。本明細書で使用される場合、「ＲＯＣＫ阻害剤」又は「ＲＯＣＫｉ」という用語は、阻害剤分子、その塩及びそのエステルを含む。一態様では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、小分子ＧＳＫ３阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む。別の態様では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］－Ｎ’－（５－ニトロ－２－チアゾリル）ウレア）０、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ［３，２－ｄ］［１］ベンザゼピン－６（５Ｈ）－オン）、ＳＢ２１６７６３（ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、又はＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、とりわけ、それらの塩、それらのエステル、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ１活性又はＲＯＣＫ２活性を阻害する。別の態様では、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ１活性及びＲＯＣＫ２活性を阻害する。別の態様では、ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）、Ｃｈｒｏｍａｎ１、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ポリアミン、Ｔｒａｎｓ－ＩＳＲＩＢ、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ又はチアゾバビン、とりわけ、それらの塩、それらのエステル、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む。Ｃｈｒｏｍａｎ１、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ポリアミン、及びＴｒａｎｓ－ＩＳＲＩＢの小分子阻害剤の組み合わせ（ＣＥＰＴ）は、そのような教示について参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ（Ｏｃｔ．２０１９）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／８１５７６１に記載されている。

【0067】

別の実施形態では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、少なくとも１つの有糸分裂成長因子、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせを含む。一態様では、有糸分裂成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヘレグリン（ＨＲＧ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、増殖刺激因子（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＭＳＦ）、肉腫成長因子（ｓａｒｃｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）（ＳＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＢＭＰ）、成長分化因子（ＧＤＦ）、ニューロトロフィン、骨格成長因子（ＳＧＦ）、とりわけ、それらの塩、それらのエステル、ジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせである。

【0068】

一態様では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、アクチビンＡ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＨＲＧ、若しくはＫＧＦ、とりわけ、それらの塩、それらのエステル、ジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上の有糸分裂成長因子を含む。別の態様では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＨＲＧ、若しくはＫＧＦ、とりわけ、それらの塩、それらのエステル、ジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせから選択される２つ以上の有糸分裂成長因子を含む。別の態様では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、ＥＧＦ及びＴＧＦ－α、ＥＧＦ及びＴＧＦ－β、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢＤＮＦ、ＥＧＦ及びＨＧＦ、ＥＧＦ及びＨＲＧ、ＥＧＦ及びＫＧＦ、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、ＴＧＦ－α及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－α及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－α及びＨＧＦ、ＴＧＦ－α及びＨＲＧ、ＴＧＦ－α及びＫＧＦ、ＴＧＦ－β及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－β及びＨＧＦ、ＴＧＦ－β及びＨＲＧ、ＴＧＦ－β及びＫＧＦ、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＨＲＧ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＲＧ、ＢＤＮＦ及びＫＧＦ、ＨＧＦ及びＨＲＧ、ＨＧＦ及びＫＧＦ、ＨＲＧ及びＫＧＦ、とりわけ、それらの塩、それらのエステル、又はそれらのジ若しくはトリペプチドから選択される少なくとも２つの有糸分裂成長因子を含む。

【0069】

一実施形態では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、少なくとも１つのアルブミン、そのペプチド、又はそれらの組み合わせを含む。一態様では、アルブミンは、ヒト（ＨＳＡ）、ウシ（ＢＳＡ）、ウシ胎児（ＦＢＳ）、ラット、マウス、ウマ、サル、又はブタ血清に由来し得る。一態様では、アルブミンは、組換えＨＳＡ又はそのペプチドを含むがこれらに限定されない、組換えアルブミンであり得る。一態様では、アルブミンは、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ＦＢＳ、それらのペプチド、又はそれらの組み合わせである。

【0070】

多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物における小分子阻害剤、有糸分裂成長因子、及びアルブミンの濃度は、同様であり得るか又は異なり得、用途及び細胞型又は培養タイプ（例えば、プレート、フラスコ、シェーカーフラスコ、バイオリアクターなど）に応じて変動し得る。更に、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、作業濃度のものであり得るか又は使用の前若しくは使用の間に希釈される濃縮物であり得る。多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、培養物に直接添加される粉末又は液体であり得る。

【0071】

一実施形態では、小分子阻害剤、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせは、約０．５μＭ～約１００μＭ（特定される範囲内の各整数を含む）の作業濃度を有する。別の実施形態では、有糸分裂成長因子、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ（特定される範囲内の各整数を含む）の作業濃度を有する。別の実施形態では、アルブミン、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約０．１％～約３％（特定される範囲内の各整数を含む）の作業濃度を有する。

【0072】

別の実施形態では、小分子阻害剤、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせは、約５μＭ～約１ｍＭ（特定される範囲内の各整数を含む）の１０×濃縮物濃度を有する。別の実施形態では、有糸分裂成長因子、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約１．０ｎｇ／ｍｌ～約１０，０００ｎｇ／ｍｌ（特定される範囲内の各整数を含む）の１０×濃縮物濃度を有する。別の実施形態では、アルブミン、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約１％～約３０％（特定される範囲内の各整数を含む）の１０×濃縮物濃度を有する。

【0073】

一実施形態では、小分子阻害剤、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせは、約０．１μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭ、０．２５μＭ、０．３μＭ、０．３５μＭ、０．４μＭ、０．４５μＭ、０．５μＭ、０．５５μＭ、０．６μＭ、０．６５μＭ、０．７μＭ、０．７５μＭ、０．８μＭ、０．８５μＭ、０．９μＭ、０．９５μＭ、１μＭ、１．１μＭ、１．１５μＭ、１．２μＭ、１．２５μＭ、１．３μＭ、１．３５μＭ、１．４μＭ、１．４５μＭ、１．５μＭ、１．５５μＭ、１．６μＭ、１．６５μＭ、１．７μＭ、１．７５μＭ、１．８μＭ、１．８５μＭ、１．９μＭ、１．９５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、２００μＭ、２１０μＭ、２２０μＭ、２３０μＭ、２４０μＭ、２５０μＭ、２６０μＭ、２７０μＭ、２８０μＭ、２９０μＭ、３００μＭ、３１０μＭ、３２０μＭ、３３０μＭ、３４０μＭ、３５０μＭ、３６０μＭ、３７０μＭ、３８０μＭ、３９０μＭ、４００μＭ、４１０μＭ、４２０μＭ、４３０μＭ、４４０μＭ、４５０μＭ、４６０μＭ、４７０μＭ、４８０μＭ、４９０μＭ、５００μＭ、５１０μＭ、５２０μＭ、５３０μＭ、５４０μＭ、５５０μＭ、５６０μＭ、５７０μＭ、５８０μＭ、５９０μＭ、６００μＭ、６１０μＭ、６２０μＭ、６３０μＭ、６４０μＭ、６５０μＭ、６６０μＭ、６７０μＭ、６８０μＭ、６９０μＭ、７００μＭ、７１０μＭ、７２０μＭ、７３０μＭ、７４０μＭ、７５０μＭ、７６０μＭ、７７０μＭ、７８０μＭ、７９０μＭ、８００μＭ、８１０μＭ、８２０μＭ、８３０μＭ、８４０μＭ、８５０μＭ、８６０μＭ、８７０μＭ、８８０μＭ、８９０μＭ、９００μＭ、９１０μＭ、９２０μＭ、９３０μＭ、９４０μＭ、９５０μＭ、９６０μＭ、９７０μＭ、９８０μＭ、９９０μＭ、１０００μＭ、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０ｍＭ、３２０ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、４００ｍＭ、４１０ｍＭ、４２０ｍＭ、４３０ｍＭ、４４０ｍＭ、４５０ｍＭ、４６０ｍＭ、４７０ｍＭ、４８０ｍＭ、４９０ｍＭ、又は約５００ｍＭの濃度を有する。

【0074】

一実施形態では、小分子阻害剤、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせは、約０．１μＭ～約１μＭ、約０．２μＭ～約１μＭ、約０．３μＭ～約１μＭ、約０．４μＭ～約１μＭ、約０．５μＭ～約１μＭ、約０．６μＭ～約１μＭ、約１μＭ～約５μＭ、約１μＭ～約４μＭ、約１μＭ～約３μＭ、約１μＭ～約２μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約５０μＭ、約１μＭ～約１００μＭ、約１μＭ～約２００μＭ、約１μＭ～約５００μＭ、約１μＭ～約１０００μＭ、約１０μＭ～約２０μＭ、約１０μＭ～約３０μＭ、約１０μＭ～約４０μＭ、約１０μＭ～約４０μＭ、約１０μＭ～約６０μＭ、約１０μＭ～約７０μＭ、約１０μＭ～約８０μＭ、約１０μＭ～約９０μＭ、約１０μＭ～約１００μＭ、約１００μＭ～約２００μＭ、約１００μＭ～約３００μＭ、約１００μＭ～約４００μＭ、約１００μＭ～約５００μＭ、約１００μＭ～約６００μＭ、約１００μＭ～約７００μＭ、約１００μＭ～約８００μＭ、約１００μＭ～約９００μＭ、約１００μＭ～約１０００μＭ、約１ｍＭ～約５ｍＭ、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約２０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、約１ｍＭ～約２００ｍＭ、約１ｍＭ～約５００ｍＭ、約１ｍＭ～約１０００ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約６０ｍＭ、約１０ｍＭ～約７０ｍＭ、約１０ｍＭ～約８０ｍＭ、約１０ｍＭ～約９０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ、約１００ｍＭ～約３００ｍＭ、約１００ｍＭ～約４００ｍＭ、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、約１００ｍＭ～約６００ｍＭ、約１００ｍＭ～約７００ｍＭ、約１００ｍＭ～約８００ｍＭ、約１００ｍＭ～約９００ｍＭ、又は約１００ｍＭ～約１０００ｍＭの濃度を有する。

【0075】

一実施形態では、有糸分裂成長因子、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約０．１ｎｇ／ｍｌ、０．２ｎｇ／ｍｌ、０．３ｎｇ／ｍｌ、０．４ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．６ｎｇ／ｍｌ、０．７ｎｇ／ｍｌ、０．８ｎｇ／ｍｌ、０．９ｎｇ／ｍｌ、１．０ｎｇ／ｍｌ、２．０ｎｇ／ｍｌ、３．０ｎｇ／ｍｌ、４．０ｎｇ／ｍｌ、５．０ｎｇ／ｍｌ、６．０ｎｇ／ｍｌ、７．０ｎｇ／ｍｌ、８．０ｎｇ／ｍｌ、９．０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、６５ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、８５ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、９５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２２５ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、２７５ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３２５ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、３７５ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４２５ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、４７５ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、５２５ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、５７５ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、６２５ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、６７５ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、７２５ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、７７５ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、８２５ｎｇ／ｍｌ、８５０ｎｇ／ｍｌ、８７５ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、９２５ｎｇ／ｍｌ、９５０ｎｇ／ｍｌ、９７５ｎｇ／ｍｌ、又は約１０００ｎｇ／ｍｌの作業濃度を有する。

【0076】

一実施形態では、有糸分裂成長因子、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、５５０ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、６５０ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、７５０ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、８５０ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、９５０ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌ、１１００ｎｇ／ｍｌ、１２００ｎｇ／ｍｌ、１４００ｎｇ／ｍｌ、１６００ｎｇ／ｍｌ、１８００ｎｇ／ｍｌ、２０００ｎｇ／ｍｌ、２２５０ｎｇ／ｍｌ、２５００ｎｇ／ｍｌ、２７５０ｎｇ／ｍｌ、３０００ｎｇ／ｍｌ、３２５０ｎｇ／ｍｌ、３５００ｎｇ／ｍｌ、３７５０ｎｇ／ｍｌ、４０００ｎｇ／ｍｌ、４２５０ｎｇ／ｍｌ、４５００ｎｇ／ｍｌ、４７５０ｎｇ／ｍｌ、５０００ｎｇ／ｍｌ、５２５０ｎｇ／ｍｌ、５５００ｎｇ／ｍｌ、５７５０ｎｇ／ｍｌ、６０００ｎｇ／ｍｌ、６２５０ｎｇ／ｍｌ、６５００ｎｇ／ｍｌ、６７５０ｎｇ／ｍｌ、７０００ｎｇ／ｍｌ、７２５０ｎｇ／ｍｌ、７５００ｎｇ／ｍｌ、７７５０ｎｇ／ｍｌ、８０００ｎｇ／ｍｌ、８２５０ｎｇ／ｍｌ、８５００ｎｇ／ｍｌ、８７５０ｎｇ／ｍｌ、９０００ｎｇ／ｍｌ、９２５０ｎｇ／ｍｌ、９５００ｎｇ／ｍｌ、９７５０ｎｇ／ｍｌ、又は約１０，０００ｎｇ／ｍｌの１０×濃縮濃度を有する。

【0077】

一実施形態では、有糸分裂成長因子、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約０．１ｎｇ／ｍｌ～約１ｎｇ／ｍｌ、約０．２ｎｇ／ｍｌ～約１ｎｇ／ｍｌ、約０．３ｎｇ／ｍｌ～約１ｎｇ／ｍｌ、約０．４ｎｇ／ｍｌ～約１ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約１ｎｇ／ｍｌ、約０．６ｎｇ／ｍｌ～約１ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約４ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約３ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約３０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約４０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約６０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約７０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約８０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約９０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約３００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約４００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約６００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約７００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約８００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約９００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約２０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約３０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約４０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約５０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約６０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約７０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約８０００ｎｇ／ｍｌ、約１０００ｎｇ／ｍｌ～約１００００ｎｇ／ｍｌ、約２０００ｎｇ／ｍｌ～約１００００ｎｇ／ｍｌ、約５０００ｎｇ／ｍｌ～約１００００ｎｇ／ｍｌ、約３００ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌ、又は約５０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0078】

一実施形態では、アルブミン、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約０．０５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．５５％、０．６％、０．６５％、０．７％、０．７５％、０．８％、０．８５％、０．９％、０．９５％、１％、１．０５％、１．１％、１．１５％、１．２％、１．２５％、１．３％、１．３５％、１．４％、１．４５％、１．５％、１．５５％、１．６％、１．６５％、１．７％、１．７５％、１．８％、１．８５％、１．９％、１．９５％、２％、２．０５％、２．１％、２．１５％、２．２％、２．２５％、２．３％、２．３５％、２．４％、２．４５％、２．５％、２．５５％、２．６％、２．６５％、２．７％、２．７５％、２．８％、２．８５％、２．９％、２．９５％、３％、３．０５％、３．１％、３．１５％、３．２％、３．２５％、３．３％、３．３５％、３．４％、３．４５％、３．５％、３．５５％、３．６％、３．６５％、３．７％、３．７５％、３．８％、３．８５％、３．９％、３．９５％、４％、４．０５％、４．１％、４．１５％、４．２％、４．２５％、４．３％、４．３５％、４．４％、４．４５％、４．５％、４．５５％、４．６％、４．６５％、４．７％、４．７５％、４．８％、４．８５％、４．９％、４．９５％、５％、６％、７％、８％、９％、又は約１０％の濃度を有する。

【0079】

一実施形態では、アルブミン、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせは、約０．１％～約５％、約０．１５％～約５％、約０．２％～約５％、約０．２５％～約５％、約０．３％～約５％、約０．３５％～約５％、約０．４％～約５％、約０．４５％～約５％、約０．５％～約５％、約０．５５％～約５％、約０．６％～約５％、約０．６５％～約５％、約０．７％～約５％、約０．７５％～約５％、約０．８％～約５％、約０．８５％～約５％、約０．９％～約５％、約０．９５％～約５％、約１％～約５％、約１．０５％～約５％、約１．１％～約５％、約１．１５％～約５％、約１．２％～約５％、約１．２５％～約５％、約１．３％～約５％、約１．３５％～約５％、約１．４％～約５％、約１．４５％～約５％、約１．５％～約５％、約１．５５％～約５％、約１．６％～約５％、約１．６５％～約５％、約１．７％～約５％、約１．７５％～約５％、約１．８％～約５％、約１．８５％～約５％、約１．９％～約５％、約１．９５％～約５％、約２％～約５％、約０．１％～約１％、約０．０５％～約２．０％、約０．１％～約２％、約０．１５％～約２％、約０．２％～約２％、約０．２５％～約２％、約０．３％～約２％、約０．３５％～約２％、約０．４％～約２％、約０．４５％～約２％、約０．５％～約２％、約０．５５％～約２％、約０．６％～約２％、約０．６５％～約２％、約０．７％～約２％、約０．７５％～約２％、約０．８％～約２％、約０．８５％～約２％、約０．９％～約２％、約０．９５％～約２％、約１％～約２％、約１．０５％～約２％、約１．１％～約２％、約１．１５％～約２％、約１．２％～約２％、約１．２５％～約２％、約１．３％～約２％、約１．３５％～約２％、約１．４％～約２％、約１．４５％～約２％、約１．５％～約２％、約１．５５％～約２％、約１．６％～約２％、約１．６５％～約２％、約１．７％～約２％、約１．７５％～約２％、又は約１．８％～約２％の濃度を有する。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞組成物におけるアルブミンの量及び小分子阻害剤（例えば、ＧＳＫ３阻害剤）の量は、拡大の際の多能性の維持のために均衡化される。小分子阻害剤とアルブミンとの組み合わせのそのような実施形態では、小分子阻害剤は、培養期間を通して含まれ得る。

【0080】

一実施形態では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、１つ以上の小分子阻害剤、有糸分裂成長因子、アルブミン、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせなどの、成分の組み合わせを含み、ここで、各成分（又はそれらの組み合わせ）は、組み合わされるか、又は細胞培養物、培養容器、若しくは他のコンテナに別々に添加される。例えば、各小分子阻害剤、有糸分裂成長因子、又はアルブミンのストック溶液のアリコートは、多能性幹細胞組成物、若しくはサプリメント組成物を構成するように組み合わされ得、又は各々は、細胞培養物若しくは他のコンテナに個別に添加され得る。一態様では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、他の細胞培養適合性成分に加えて、１つ以上の小分子阻害剤及び１つ若しくは有糸分裂成長因子、その塩、そのエステル、又はそれらの組み合わせを含み得る。別の態様では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、他の細胞培養適合性成分に加えて、１つ以上の小分子阻害剤、１つ若しくは有糸分裂成長因子、及び１つ以上のアルブミン、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0081】

表１に示される例示的な培地及びサプリメント成分は、溶液、濃縮物、粉末、凝集粉末、錠剤、カプセル、又は他の送達手段に処方され得る。一態様では、フィード又はサプリメント処方物は、固体粉末又は凝集粉末である。いくつかの実施形態では、例示的な処方物は、再構成されるか、培養物に直接添加されるか、又は使用前に細胞培養適合性ビヒクル（例えば、水、緩衝液、培地、フィード溶液など）中に溶解される、液体又は乾燥粉末として処方され得る。一態様では、例示的な処方物は、液体である。別の態様では、例示的な処方物は、使用の前又は間に希釈される液体濃縮物である。別の態様は、本明細書に記載の多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物成分を個別に又はまとめてのいずれかで補充した細胞培養物又は細胞培養システムである。別の態様は、本明細書に記載の多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物を利用する細胞培養システムである。別の態様は、本明細書に記載の多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物を細胞培養物又は細胞培養システムに添加することによって、ＰＳＣ成長を増加させる、ＰＳＣ増殖を増強する、ＰＳＣ多能性を維持する、スフェロイド形態を維持する、ＰＳＣ形態を維持する、ＰＳＣ継代数を増加させる、又はＰＳＣ培養スケールを増加させる、又はそれらの組み合わせの方法である。本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の多能性幹細胞組成物若しくはサプリメント組成物又はその個々の成分を投与された、ＰＳＣ成長の増加、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、若しくはＰＳＣ培養スケールの増加、又はそれらの組み合わせを有する細胞培養物である。

【0082】

本明細書に記載されるように生成される栄養培地、培地サプリメント及び培地サブグループは、細胞の成長をサポートするために使用され得る任意の培地、培地サプリメント又は培地サブグループ（血清フリー又は血清含有）であり、細胞は、動物細胞（特に、哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞）であり得、そのうちの任意のものは、体細胞、生殖細胞、正常細胞、罹患細胞、形質転換細胞、変異細胞、幹細胞、前駆細胞又は胚細胞であり得る。細胞は、幹細胞などの自己複製細胞であり得る。幹細胞は、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）、胚に由来する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞核移植によって作製された胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、及び未受精卵からの胚性幹細胞（単為生殖胚性幹細胞、若しくはｐＥＳ細胞）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）であり得る。そのような栄養培地には、細胞培養培地、好ましくはＰＳＣ培養培地又は動物細胞培養培地が含まれ得るが、これらに限定されない。ＰＳＣ培地及び／又は培地サプリメントは、生物学的流体（特に、ウシ血清、特に、ウシ胎児、新生仔ウシ又は正常仔ウシ血清、ウマ血清、ブタ血清、ラット血清、マウス血清、ウサギ血清、サル血清、類人猿血清又はヒト血清（それらのうちの任意のものは胎児血清であり得る））及びその抽出物（より好ましくはウシ血清アルブミン又はヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない、血清アルブミン）を含み得るが、これらに限定されない。ＰＳＣ培地及び／又は培地サプリメントは、組換え発現アルブミン、その抽出物又はペプチドフラグメント、例えば、組換えヒトアルブミンを含み得る。培地サプリメントには、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＬｉｐｏＭＡＸ（商標）サプリメント、ＯｐｔｉＭＡｂ（商標）サプリメント、Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの規定された代替物もまた含まれ得る。そのようなサプリメントはまた、とりわけ、ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、脂質、付着因子、タンパク質を含むが、これらに限定されない、規定された成分を含み得る。

【0083】

一実施形態では、フィード又はサプリメントは、培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液の凝集粉末を含む。本明細書に記載の一態様では、凝集培地サプリメントは、培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液の溶液を凝集させるために流動床技術を使用して生成される。流動床技術は、出発物質から特徴（特に、例えば、溶解度）が変化した凝集粉末を製造するプロセスである。一般に、技術の適用、粉末を上向きに移動している空気柱中で懸濁し、同時に制御され規定された量の流体を粉末流中に注入して、粉末の湿潤状態を生成し、次いで、温和な熱を使用して材料を乾燥させ、凝集粉末を生成する。いくつかの態様では、凝集培地サプリメント又はサブグループは、専有のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）（ＡＧＴ（商標）乾燥培地フォーマット）（Ｇｉｂｃｏ（商標））を使用して生成される。Ｊａｙｍｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｏｖｅｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｗｄｅｒｅｄ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ，”Ｉｎ：Ｓｈｉｒａｈａｔａ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ）Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ＆Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ．Ｖｏｌ．１２（２００２），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔを参照されたい。

【0084】

本明細書に記載の処方物及び方法を使用して、ＰＳＣ成長を増加させる、ＰＳＣ増殖を増強する、ＰＳＣ多能性を維持する、スフェロイド形態を維持する、ＰＳＣ形態を維持する、ＰＳＣ継代数を増加させる、若しくはＰＳＣ培養スケールを増加させる、又はそれらの組み合わせのための栄養培地サプリメント又は培地サプリメントサブグループを調製し得る。

【0085】

任意の栄養培地、培地サプリメント、又は培地サプリメントサブグループは、本明細書に記載の方法によって調製され得る。特に、本明細書に記載されるように調製され得る栄養培地サプリメント又はサプリメントサブグループには、ヒト及び他の動物細胞、特に、幹細胞、例えば、限定されないが、ｉＰＳＣ、ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、及びｐＥＳ細胞などのＰＳＣの成長をサポートする細胞培養培地、フィード、又はサプリメント、及び培地サプリメントサブグループが含まれる。

【0086】

本明細書に記載されるように利用され得る動物細胞培養培地の例としては、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＤＥＭ、ＩＭＤＭ、ＭＥＭ、Ｍ１９９、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｍｅｄｉａ Ｅ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｆ１０ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ、Ｆ１２ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ、ＭＥＦ（マウス胎仔線維芽細胞）馴化培地、ＳｔｅｍＦｌｅｘ、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ ｈＥＳＣ ＸＦ培養培地、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）培地、ｍＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ－２培地、及び幹細胞、ＰＳＣ、ケラチノサイト、内皮細胞、肝細胞、メラノサイト、様々なＣＨＯ細胞、２９３細胞、ＰｅｒＣ６、ハイブリドーマ、造血細胞、胚細胞、神経細胞などの培養をサポートするように設計されたものなどの細胞特異的血清フリー培地（ＳＦＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の化学的に規定された培地製品には、ＣＤ ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、Ｄｙｎａｍｉｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＥｘｐｉＣＨＯ Ｓｔａｂｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＢａｌａｎＣＤ（登録商標）ＣＨＯ Ｇｒｏｗｔｈ Ａ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）Ａｄｖａｎｃｅ（Ｌｏｎｚａ）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＣＨＯ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）ＡｃｔｉＰｒｏ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。特定のフィードサプリメントには、ＣＨＯ ＣＤ ＥｆｆｉｃｅｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ａ（又はＢ）ＡＧＴ（商標）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＣＤ ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｃ ＡＧＴ（商標）Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ａ＋ＡＧＴ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＦｅｅｄ（商標）Ｂ＋ＡＧＴ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、Ｒｅｓｕｒｇｅ（商標）ＣＤ１ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ（様々なバージョン）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＥＸ－ＣＥＬＬ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＣＨＯ Ｆｅｅｄ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）などが含まれる。調製に好適な他の培地、培地サプリメント、及び培地サブグループは市販されている。これらの培地、培地サプリメント及び培地サブグループ、並びに多くの他の一般的に使用される動物細胞培養培地、培地サプリメント及び培地サブグループのための処方は、当該技術分野でよく知られており、文献に記載されており、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの商業的供給業者から入手可能である。

【0087】

本明細書に記載されるように使用され得る上述の培地、培地サプリメント、培地サプリメントサブグループ、又は緩衝液のうちの任意のものはまた、指示剤又は選択剤（例えば、色素、抗生物質、アミノ酸、酵素、基質など）、フィルター（例えば、木炭）、塩、多糖、イオン、界面活性剤、安定剤などの、１つ以上の追加の成分を含み得る。

【0088】

本明細書に記載の別の実施形態では、多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物は、培養培地に最適な緩衝能を提供するのに十分な濃度の１つ以上の緩衝塩を含み得る。一態様では、１つ以上の緩衝液は、酢酸、アセチルサリチル酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、重硫酸、ホウ酸、ブタン酸、酪酸、樟脳酸、樟脳スルホン酸を、炭酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グリセリン酸、グリセロリン酸、グリシン、グリグリシン、グルコヘプタン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グルタル酸、グリコール酸、ヘミ硫酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒプリン酸、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフチル酸、ニコチン酸、亜硝酸、シュウ酸、ペラルゴン、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サッカリン、サリチル酸、ソルビン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、チオシアン酸、チオグリコール酸、チオ硫酸、トシル酸、ウンデシレン酸、ＭＥＳ、ビス－トリスメタン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ビス－トリスプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、塩化コラミン、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳ、アセトアミドグリシン、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＳ、ＨＥＰＰＳ、トリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トロメタミン）、グリシンアミド、グリシルグリシン、ＨＥＰＢＳ、ビシン、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＢ、ＣＨＥＳ、ＡＭＰ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ＣＡＢＳ、それらの組み合わせ、又はそれらの塩を含む。一態様では、緩衝液は、リン酸塩、硫酸塩、炭酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ブタン酸塩、乳酸塩、グリシン、マレイン酸塩、ピルビン酸塩、クエン酸塩、アコニット酸塩、イソクエン酸塩、α－ケトグルタル酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、リンゴ酸塩、オキサロ酢酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トロメタミン）、それらの組み合わせ、又はそれらの塩の１つ以上を含む。

【0089】

本明細書に記載の一態様では、炭酸水素ナトリウムなどの緩衝塩が、培地の凝集の前、間、又は後に細胞培養培地、フィード、又はサプリメントに添加され得る。本明細書に記載のこの態様の一例では、凝集培地の再構成に際して、培養培地が、様々な細胞型の培養に最適な又は実質的に最適なｐＨにあるように、緩衝塩が、適切な溶媒（例えば、水、血清、又はｐＨ調整剤、例えば、酸（例えば、１Ｍ～５Ｍ、０．１Ｍ～５Ｍ、若しくは好ましくは１Ｍの濃度のＨＣｌ）又は塩基（例えば、１Ｍ～５Ｍ、０．１Ｍ～５Ｍ、若しくは好ましくは１Ｍの濃度のＮａＯＨ）とともに凝集の前、間、又は後に培養培地に添加され得る。例えば、本方法によって調製された動物細胞培養培地は、再構成に際して、好ましくは、約６～８又は約７～８、より好ましくは約７～７．５、又は約７．２～７．４のｐＨを有する。

【0090】

別の例では、１つ以上の緩衝塩が、栄養培地に直接添加され得る。関連する態様では、酸（例えば、ＨＣｌ）又は塩基（例えば、ＮａＯＨ）などのｐＨ調整剤が、１つ以上の緩衝塩を含有し得る栄養培地に、流動床装置における栄養培地中へのｐＨ調整剤の凝集によって、ｐＨ調整剤の粉末化若しくは凝集栄養培地上への噴霧乾燥によって、又はそれらの組み合わせによって添加され得、このアプローチにより、粉末化培地の再構成後のｐＨ調整剤のその後の添加が不要になる。本明細書に記載の栄養培養培地は、溶媒（例えば、水又は血清）を用いた再構成に際して、液体培地のｐＨの調整の必要性無しに、細胞の培養又は成長のサポートに最適であるｐＨを有する、インビトロでの細胞の培養又は成長に有用である。例えば、これらの方法に従って調製された哺乳動物細胞培養培地は、約７．１～約７．５、より好ましくは約７．１～約７．４、最も好ましくは約７．２～約７．４又は約７．２～約７．３のｐＨを有し得る。

【0091】

別の実施形態では、特定の培地成分（特に、リン酸塩又は他の緩衝塩）のｐＨ反対（ｐＨ－ｏｐｐｏｓｉｎｇ）形態が、所望のｐＨを提供するために培養培地において使用され得る。成分のｐＨ反対形態は、共役酸－塩基ペアであり、ここで、ペアのメンバーは、ｐＨを上昇させるか又は低下させるかのいずれかをして、溶液の所望のｐＨを達成し得る。ナトリウムＨＥＰＥＳ（ｐＨ上昇）及びＨＥＰＥＳ－ＨＣｌ（ｐＨ低下）は、ｐＨ反対成分の例である。例えば、４．５～７．２のｐＨを有する培地を調製する場合、最初のステップは、所望のｐＨをもたらすために一塩基性（ｐＨを低下させるための）リン酸塩の二塩基性（ｐＨを上昇させるための）リン酸塩に対する正しいバランスを決定することである。典型的には、一塩基性及び二塩基性リン酸塩は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、約０．２ｍＭ～約９ｍＭ、約０．３ｍＭ～約８．５ｍＭ、約０．４ｍＭ～約８ｍＭ、約０．５ｍＭ～約７．５ｍＭ、約０．６ｍＭ～約７ｍＭ、又は好ましくは約０．７ｍＭ～約７ｍＭの濃度で使用される。他の緩衝系が処方物において使用される場合、塩基性（典型的には、ナトリウム又は一塩基性）緩衝塩及び対応する酸性（又はｐＨ反対、典型的にはＨＣｌ又は二塩基性）緩衝塩の適正な比率又はバランスは、処方物が所望の最終ｐＨになることを確実にするために同様に決定される。溶液中に存在する実際のリン酸分子種は、塩基性（例えば、ナトリウム又は一塩基性）又は酸性（例えば、ＨＣｌ又は二塩基性）の形態が添加されても、所与のｐＨで同じであるため、この調整は緩衝能に影響を及ぼすとは予想されない。一旦適切な緩衝液のｐＨ反対形態の適切な比率が決定されると、これらの成分は、使用前に適切なｐＨレベルのものである培養培地を提供するために、培地（例えば、乾燥粉末培地）に添加され得る。

【0092】

別の実施形態は、使用前の培地へのいかなる補充栄養成分の添加の必要も無しに、インビトロでの細胞の培養を直接サポートする、本明細書に記載の多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物である。したがって、本明細書に記載のこの態様による培地は、好ましくは、インビトロでの細胞の培養に必要な栄養成分を含み、その結果、追加の栄養成分が、溶媒中に含まれるか、又は使用前に培地に添加される必要はない。そのような完全培地は、自動的ｐＨ調整培地であり得、１つ以上の培養培地サプリメント（血清、血清代替物サプリメント又は組換えアルブミンを含むがこれに限定されない）、１つ以上のアミノ酸（ｌ－グルタミンを含むがこれに限定されない）、インスリン、トランスフェリン、１つ以上のホルモン、１つ以上の脂質、１つ以上の成長因子、１つ以上の有糸分裂成長因子、１つ以上の小分子阻害剤、１つ以上のサイトカイン、１つ以上の神経伝達物質、１つ以上の動物組織、器官若しくは腺の抽出物、１つ以上の酵素、１つ以上のタンパク質、１つ以上の微量元素、１つ以上の細胞外マトリックス成分、１つ以上の抗生物質、１つ以上のウイルス阻害剤、及び又は１つ以上の緩衝液などの１つ以上の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、完全培地には、細胞が成長し、培地からそのような成分を消費するか又は枯渇させるにつれて、少なくとも１つの小分子阻害剤、有糸分裂成長因子、又はそれらの組み合わせを含むフィード又はサプリメントを更に補充し得る。特定の実施形態では、完全培地には、細胞が成長し、培地からそのような成分を消費するか又は枯渇させるにつれて、少なくとも１つの小分子阻害剤、有糸分裂成長因子、及びアルブミン、その塩、そのエステル、そのジ若しくはトリペプチド、又はそれらの組み合わせを含むフィード又はサプリメントを更に補充し得る。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞組成物、サプリメント及び／又は完全培地は、血清フリーである。他の実施形態では、多能性幹細胞組成物、サプリメント及び／又は完全培地は、動物由来フリーである。

【0093】

本明細書に記載の培地、フィード若しくはサプリメントに添加され得る、又は本明細書に記載の方法によって調製され得る追加の成分の例としては、ウシ血清、ウシ胎児、新生仔ウシ及び仔ウシ血清、ヒト血清、ウマ血清、ブタ血清、サル血清、類人猿血清、ラット血清、マウス血清、ウサギ血清、ヒツジ血清などのような動物血清、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）ＬｉｐｏＭＡＸ（商標）サプリメント、ＯｐｔｉＭＡｂ（商標）サプリメント、Ｋｎｏｃｋ－Ｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの規定された代替物、ホルモン（コルチコステロイド、エストロゲン、アンドロゲン（例えば、テストステロン）などのステロイドホルモン、及びインスリンなどのペプチドホルモンを含む、サイトカイン（成長因子（例えば、ＥＧＦ、αＦＧＦ、βＦＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、ＮＧＦなど）、インターロイキン、コロニー刺激因子、インターフェロンなどを含む）、有糸分裂成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＨＲＧ、ＫＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＭＳＦ、ＳＧＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＴＰＯ、ＢＭＰ、ＧＤＦ、ニューロトロフィン、ＳＧＦ）、小分子阻害剤（例えば、ＧＳＫ３阻害剤、ｒｈｏキナーゼ阻害剤）、神経伝達物質、脂質（リン脂質、スフィンゴ脂質、脂肪酸、Ｅｘｃｙｔｅ（商標）、コレステロールなどを含む）、付着因子（フィブロネクチ、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどのような細胞外マトリックス成分を含む）、並びに動物組織、細胞、器官又は腺の抽出物又は加水分解物（ウシ下垂体抽出物、ウシ脳抽出物、ニワトリ胚抽出物、ウシ胚抽出物、ニワトリ肉抽出物、ニワトリ組織抽出物、アキレス腱及びそれらの抽出物など）など）が挙げられるが、これらに限定されない。本方法によって生成され得る、又は本明細書に記載の培養培地中に含まれ得る他の培地サプリメントには、天然又は組換えであり得る様々なタンパク質（血清アルブミン、特にウシ又はヒト血清アルブミン、免疫グロブリン及びそのフラグメント又は複合体、アプロチニン、ヘモグロビン、ヘミン又はヘマチン、酵素（トリプシン、コラゲナーゼ、パンクレアチニン（ｐａｎｃｒｅａｔｉｎｉｎ）、又はディスパーゼなど）、リポタンパク質、フェチュイン、フェリチンなどのような）、ビタミン、アミノ酸及びそのバリアント（ｌ－グルタミン及びｌ－シスチンを含むがこれらに限定されない）、酵素補因子、多糖、塩又はイオン（モリブデン、バナジウム、コバルト、マンガン、セレンなどの塩又はイオンなどの微量元素を含む）、並びに、当業者が精通する、インビトロで細胞を培養するのに有用である他のサプリメント及び組成物が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成される培地及び／又は培地サプリメントは、動物又は哺乳動物（例えば、ヒト、魚、ウシ、ブタ、ウマ、サル、類人猿、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、昆虫など）由来のサプリメント、成分、又は産物を含む。これらの血清及び他の培地サプリメントは市販されている。あるいは、本明細書に記載の血清及び他の培地サプリメントは、当業者にとって日常的である当該技術分野で知られている方法によって、それらの天然供給源から単離され得るか、又は組換え的に産生され得る。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７４－７８（１９８３）を参照されたい。Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．，ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）もまた参照されたい。他の実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成される培地及び／又は培地サプリメントは、動物由来成分を含まず、動物由来フリー培地及び／又はサプリメントである。

【0094】

本明細書に記載の多能性幹細胞組成物又はサプリメント組成物と組み合わせて使用され得る緩衝液の例としては、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）処方物、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）処方物、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）処方物、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ダルベッコＰＢＳ（ＤＰＢＳ）、アール平衡塩類溶液、Ｐｕｃｋの生理食塩水、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ植物基本塩類溶液、Ｋｅｌｌｅｒの海洋植物基本塩類溶液、Ｐｒｏｖａｓｏｌｉの海洋植物基本塩類溶液、並びにＫａｏ及びＭｉｃｈａｙｌｕｋの基本塩類溶液などが挙げられるが、これらに限定されない。市販されている、これらの緩衝液のための、並びに多くの他の一般的に使用される緩衝液のための処方は、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃａｔａｌｏｇｕｅにおいて、ＤＩＦＣＯ（商標）＆ＢＢＬ（商標）Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，２００９）において、及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅにおいて見出され得る。

【0095】

試験培養培地中の化合物（例えば、ビタミン）の有効濃度を決定するための１つの方法は、以下のとおりである。例証の目的のためにビタミンを使用すると、既知の濃度のビタミンを、ビタミンを欠く培養培地中に段階希釈する。試験培養培地を、これもまたビタミンを欠く培養培地中に段階希釈する、段階希釈液の第２のセットを設定する。次いで、成長のためにビタミンを必要とする細胞を、段階希釈したサンプルの両方のセットに添加し、適切な条件下で培養する。一定期間の後、細胞複製を測定する（例えば、細胞計数によって又は光学密度を測定することによって）。既知の濃度の測定値をグラフ化して標準曲線を作成し、これに試験培養培地希釈液からの測定値を比較して、試験培養培地中のビタミンの有効濃度を決定する。任意のいくつかの同様のアッセイを使用して、サンプル中の代謝物の量を決定し得る。

【0096】

本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載の栄養培地、培地サプリメント、培地サプリメントサブグループ又は緩衝液を滅菌するための、並びにボールミル又は凍結乾燥などの標準的な方法によって調製された粉末化栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ及び緩衝液を滅菌するための方法である。本明細書に記載の栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、及び緩衝液を含むサンプルを滅菌又は実質的に滅菌するための方法も記載されている。そのような追加の方法には、濾過、熱滅菌、照射、又は他の化学的又は物理的方法が含まれ得る。栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液（本明細書に記載されるように調製されるは、滅菌に好都合な条件下で照射され得る。栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、及び緩衝液は通常、大きな体積の溶液で調製され、熱に不安定な成分を含むことが多いため、照射又は加熱による滅菌には適していない。したがって、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、及び緩衝液は、一般に、濾過などの汚染物質除去方法によって滅菌され、そのような培地、培地サプリメント、培地サブグループ、及び緩衝液を製造するために必要な費用及び時間を大幅に増加させる。

【0097】

本明細書に記載の方法に従って調製された栄養培地、培地サプリメント、培地サプリメントサブグループ、又は緩衝液は、濾過、照射、又はオートクレーブを含む当該技術分野における一般的な方法によって滅菌され得る。例えば、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液は、滅菌に好都合な条件下で照射され得る。好ましくは、この照射は、バルクで（すなわち、サンプル、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液の包装の後に）達成され、最も好ましくは、この照射は、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液中に存在し得る細菌、真菌、胞子又はウイルスが不活性化される（すなわち、複製するのを妨げられる）ような条件下での、本明細書に記載のバルク包装されたサンプル、培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液のガンマ線源への曝露によって達成される。あるいは、照射は、サンプル、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液の、包装の前の、ガンマ線源又は紫外線源への曝露によって達成され得る。本明細書に記載のサンプル、培地、培地サプリメント、培地サブグループ及び緩衝液は、あるいは、例えば、瞬間殺菌又はオートクレーブによる熱処理によって滅菌することができる（サブグループ、又はサンプル、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液の成分が熱安定性である場合）。当業者によって理解されるように、滅菌のために必要とされる、照射の線量又は熱、及び曝露の時間は、滅菌される材料の容積に依存し、過度の実験無しに当業者によって容易に決定され得る。

【0098】

栄養培地、培地フィード若しくはサプリメント、培地サプリメントサブグループ、又は緩衝液は、当業者に知られている標準的な細胞培養技術に従って細胞を培養又は操作するために使用され得る。そのような技術において、培養される細胞は、細胞の培養又は操作に好都合な条件（制御された温度、湿度、細胞撹拌、照明、及び大気条件など）の下で、本明細書に記載の栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ、又は緩衝液と接触させられる。そのような方法による培養に特に適している細胞には、動物細胞が含まれるが、これに限定されない。そのような動物細胞は、既知の培養物保管所、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）及び当業者が精通する他のものから市販されている。いくつかの実施形態では、これらの方法による培養のための動物細胞には、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＡＥ－１細胞、ＳＰ２／０細胞、Ｌ５．１細胞、ハイブリドーマ細胞並びにヒト細胞、例えば、２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞及びＨｅＬａ細胞など）が含まれるが、これらに限定されず、それらのうちの任意のものは、体細胞、生殖細胞、正常細胞、罹患細胞、形質転換細胞、変異細胞、幹細胞、ＰＳＣ、前駆細胞又は胚細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、ＩＰＳＣ、ｎｔＥＳ細胞、ｐＥＳ細胞、ウイルス又はベクター産生のために使用される細胞（すなわち、２９３、ＰｅｒＣ６）、細胞又は遺伝子治療のために使用される初代ヒト部位に由来する細胞、すなわち、リンパ球、造血細胞、他の白血球（ＷＢＣ）、マクロファージ、好中球、樹状細胞であり得、それらのうちの任意のものは、足場依存性又は足場非依存性（すなわち、「浮遊」）細胞であり得る。別の態様は、組織又は器官の移植又は操作のための細胞及び／又は組織、すなわち、肝細胞、膵島、骨芽細胞、破骨細胞／軟骨細胞、皮膚又は筋肉又は他の結合組織、上皮細胞、ケラチノサイトのような組織、神経、角膜、皮膚、器官起源の細胞、及びワクチンとして使用される細胞、すなわち、血液細胞、造血細胞、他の幹細胞又は前駆細胞、並びに様々な組織型の不活化又は改変された腫瘍細胞の操作又は培養である。

【0099】

別の実施形態は、１つ以上の細胞を操作又は培養する方法であって、当該細胞を本明細書に記載のフィード又はサプリメントと接触させることと、当該細胞又は複数の細胞を細胞又は複数の細胞の培養又は操作に好都合な条件下でインキュベートすることと、を含む、方法である。任意の細胞が、本方法に従って培養又は操作され得る（本明細書に記載の動物細胞及び他の細胞又は細胞株）。本明細書に記載のこの態様に従って培養又は操作される細胞は、正常細胞、罹患細胞、形質転換細胞、変異細胞、体細胞、生殖細胞、幹細胞、前駆細胞、幹細胞、ＰＳＣ又は胚性幹細胞、ｉＰＳＣであり得、それらのうちの任意のものは、樹立細胞株であり得るか、又は天然供給源から得られ得る。

【0100】

一態様では、ＰＳＣ培地又はサプリメントは、１つ以上のアミノ酸を含む。別の態様では、アミノ酸の塩が使用される。別の態様では、塩は、ナトリウム塩である。別の態様では、一塩基性及び二塩基性リン酸塩が使用される。好ましいカチオンはナトリウムである。別の態様では、得られるｐＨ、例えば、約ｐＨ７が得られるように、一塩基性及び二塩基性の塩が提供される。処方に応じて、一塩基性塩と二塩基性塩との比率は所望のｐＨによって決定され得るが、特に濃縮された又は高度に濃縮されたサプリメントを使用する場合は、溶解度を最適化するために様々な総塩濃度を試す必要がある。塩分濃度を評価する際にもｐＨを確認できる。アミノ酸が塩として提供されない場合、酸のｐＨ効果は、三塩基性リン酸塩、好ましくはリン酸三ナトリウムによって対抗され得る。ナトリウムはカチオンとして使用され得るが、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどの他の金属が使用され得る。特定の対イオンが所望される場合は、リン酸塩として利用できる場合がある。別の態様では、サプリメントは、例えば、補充される培地中のその成分の濃度の約２×以上、３×、５×、８×、１０×、１２×、１５×、２０×、２５×、５０×、７５×、８５×、９５×、又は約１００×倍以上さえの濃度の１つ以上の成分を含む、高度に濃縮された混合物として調製及び使用され得る。サプリメントのそれぞれの所望の成分の濃度は、独立して選択することができる。

【0101】

サプリメントは、補充される培地と共通の成分を持たない場合もあれば、１つ以上の共通の成分を含む場合もある。サプリメントは、１つ以上の成分の異なる濃度、例えば、２つの成分の異なる比率、異なる成分混合、追加の成分、又はサプリメントにおける省略された成分など、少なくとも１つの方法で、補充される培地と異なり得る。例えば、サプリメントは、実行可能な程度まで塩を省略し得、例えば、著しく増強された濃度の成長因子又はアミノ酸を含有し得る。好ましいサプリメント処方物は、少なくとも２つ、より好ましくは３つ、しかしおそらく少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上のアミノ酸（その塩又は二量体を含む）を含む。

【0102】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＳＣ培地又はサプリメントは、細胞を培養するために使用されたか又は使用されている培地を補充するために利用され、例えば、細胞が培養されるときに、いくつかの成分は細胞によって培地から除去される。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、フィードサプリメントは、とりわけ、これらの成分のいくつか又は全てを置換するために使用される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ培地又はサプリメントは、補充される元の培地中に存在した成分の大半を含有するが、ＰＳＣ培地又はサプリメントは、少なくとも１つの成分を欠いている。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ培地又はサプリメントは、補充される元の培養培地の濃度と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上の成分を欠いている。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ培地又はサプリメントは、濃縮形態で、例えば、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１５×、２０×、３０×、４０×、５０×、１００×、２００×、３００×、４００×、５００×又は１０００×で添加される。濃縮形態は、ＰＳＣ培地又はサプリメント中の成分のうちの少なくとも１つが、培養培地における所望の濃度であるものよりも高い濃度でのものであることを意味する。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ培地は、培養物中の細胞に１×処方物として添加される。いくつかの実施形態では、ＰＳＣ培地又はサプリメントのための成分は、例えば、適合性サブグループに基づいて、複数のＰＳＣ培地又はサプリメントに分けられ得る。

【0103】

細胞培養培地の浸透圧モル濃度（浸透圧の尺度）は、細胞に出入りする物質の流れを調節するのに役立つため、重要である。これは典型的には、培養培地中の塩の添加又は除去によって制御される。浸透圧モル濃度の急速な増加（例えば、基礎成長培地と比較して上昇した浸透圧モル濃度を有する濃縮サプリメントの添加）は、ストレスを受けた、損傷した、又は死んだ細胞をもたらし得る。細胞培養／成長中に最適な浸透圧モル濃度範囲を維持することは、細胞機能及び／又は生物生産の成功にとって望ましいことである。

【0104】

基礎成長培地の浸透圧モル濃度は、一般に２５０ｍＯｓｍｏ／ｋｇ～３５０ｍＯｓｍｏ／ｋｇの範囲である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の濃縮ＰＳＣ培地又はサプリメントの添加は、浸透圧モル濃度を、約２５ｍＯｓｍｏ／ｋｇ又は約０～約１００、約０．０１～約１００、約０．１～約１００、約１～約１００、約１０～約１００、約５０～約１００、約７５～約１００、約１～約１０、約１～約５０、約１～約７５、約１０～約５０、約１５～約３５、約２５～約５０、又は約２０～約３０ｍＯｓｍｏ／ｋｇ増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の濃縮サプリメント培地（例えば、５×濃縮サプリメント培地）の浸透圧モル濃度は、約０～約１５００、１～約１０００、１～約７５０、１～約５００、１～約４００、１～約３００、１～約２００、１～約１００、１～約５０、５０～約１０００、１００～約１０００、３００～約１０００、５００～約１０００、７５０～約１０００、１００～約２００、２００～約３００、３００～約４００、４００～約５００、４５０～約５００、５００～約６００、５５０～約６５０、６００～約７００、７５０～約８５０、７００～約８００、８００～約９００、９００～約１０００、１０００～約１２５０、又は約１２５０～約１５００ｍＯｓｍｏ／ｋｇの浸透圧モル濃度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の濃縮ＰＳＣ培地又はサプリメントの浸透圧モル濃度は、補充又は供給される培地の浸透圧モル濃度と比較して、約３．０×～約３．５×、約３．５×～約４．５×、約４．５×～約５．５×、約５．５×～約６．５×、約６．５×～約７．５×、約７．５×～約８．５×、約８．５×～約９．５×、約９．５×～約１０．５×、約１０．５×～約１１．５×、約１１．５×～約１２．５×、約１２．５×約１３．５×、約１３．５×～約１４．５×、約１４．５×～１８．５×～約１９．５×、約１９．５×～約２０．５×、約３×～約１０×、約５×～約１０×、約１０×～約１５×、約１５×～約２０×、約２０×～約２５×、又は約２５×～約１００×である。

【0105】

一実施形態では、本明細書で提供されるのは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）組成物は、細胞培養基本培地と、小分子ＧＳＫ３阻害剤その塩、又はそのエステルと、ＲＯＣＫ阻害剤、その塩、又はそのエステルと、１つ以上の有糸分裂成長因子と、を含み、組成物は、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供し得る。別の実施形態では、ＰＳＣ組成物は、１つ以上のアルブミン又はそのペプチドを更に含む。

【0106】

一態様では、ＰＳＣ組成物のＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム）、ＡＲ－Ａ０１４４１８（Ｎ－［（４－メトキシフェニル）メチル］－Ｎ’－（５－ニトロ－２－チアゾリル）ウレア）０、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（９－ブロモ－７，１２－ジヒドロ－インドロ［３，２－ｄ］［１］ベンザゼピン－６（５Ｈ）－オン）、ＳＢ２１６７６３（ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、又はＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）のうちの１つ以上を含み得る。別の態様では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。実施例２に示すように、ＣＨＩＲ９９０２１の基本培地への添加は、多能性幹細胞の倍率拡大の著しい改善をもたらす。いくつかの態様では、ＧＳＫ３阻害剤は、培養の最初の日のみ（例えば、継代時）に基本培地に添加され得、又は培養期間を通して継続的に基本培地に添加され得る。いくつかの実施形態では、継続的にＧＳＫ３阻害剤の存在下でＰＳＣを培養することは、懸濁培養物における拡大倍率変化及び多能性の維持を改善する実施例２に示すように、ＧＳＫ３阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）の継続的な存在は、懸濁培養物中の細胞の倍率変化を改善するが、小分子阻害剤の組み合わせを含有するいくつかの培地処方物では、スフェロイドの形態が失われ、これは、多能性が失われることを示す。そのような処方物において、１日目のみのＣＨＩＲ９９０２１の添加、それに続くＣＨＩＲ９９０２１を含まない完全培地の２～４日目の供給が、多能性幹細胞拡大。及び正常なスフェロイドの形態の維持をサポートする。

【0107】

一態様では、ＰＳＣ組成物のｒｈｏキナーゼ阻害剤は、ＲＯＣＫ１活性及び／又はＲＯＣＫ２活性を阻害し得る。ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）、Ｃｈｒｏｍａｎ１、Ｅｍｒｉｃａｓａｎ、ポリアミン、Ｔｒａｎｓ－ＩＳＲＩＢ、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ、又はチアゾバビンであり得る。別の態様では、ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ－２７６３２（（Ｒ）－（＋）－トランス－４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（４－ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）であり得る。ＰＳＣの播種又は継代時のＣＨＩＲ９９０２１の使用と組み合わせたＹ－２７６３２の実行は、最適な倍率変化もたらすことが実施例２において示されている。

【0108】

別の態様では、ＰＳＣ組成物の１つ以上の有糸分裂成長因子は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＨＲＧ、及びＫＧＦのうちの１つ以上を含む。別の態様では、ＰＳＣ組成物は、ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－β、ｂＦＧＦ、ＢＤＮＦ、ＨＧＦ、ＨＲＧ、及びＫＧＦから選択される少なくとも２つの有糸分裂成長因子を含む。別の態様では、ＰＳＣ組成物は、ＥＧＦ及びＴＧＦ－α、ＥＧＦ及びＴＧＦ－β、ＥＧＦ及びｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＢＤＮＦ、ＥＧＦ及びＨＧＦ、ＥＧＦ及びＨＲＧ、ＥＧＦ及びＫＧＦ、ＴＧＦ－α及びＴＧＦ－β、ＴＧＦ－α及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－α及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－α及びＨＧＦ、ＴＧＦ－α及びＨＲＧ、ＴＧＦ－α及びＫＧＦ、ＴＧＦ－β及びｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β及びＢＤＮＦ、ＴＧＦ－β及びＨＧＦ、ＴＧＦ－β及びＨＲＧ、ＴＧＦ－β及びＫＧＦ、ｂＦＧＦ及びＢＤＮＦ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦ、ｂＦＧＦ及びＨＲＧ、ｂＦＧＦ及びＫＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＧＦ、ＢＤＮＦ及びＨＲＧ、ＢＤＮＦ及びＫＧＦ、ＨＧＦ及びＨＲＧ、ＨＧＦ及びＫＧＦ、又はＨＲＧ及びＫＧＦを含む少なくとも２つの有糸分裂成長因子を含む。別の態様では、組成物は、インスリン及び／又はトランスフェリンを更に含み得る。別の態様では、組成物は、フィブロネクチン、ラミニン、ニドゲン、コラーゲン、ビトロネクチン、若しくはヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はそれらのフラグメントから選択されるものなどの１つ以上の細胞外マトリックス成分又はタンパク質を更に含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外マトリックスタンパク質又はそのフラグメントは、組換えタンパク質若しくはフラグメント、又は合成ペプチドである。別の実施形態では、ＰＳＣ懸濁培養のために本明細書で提供される細胞培養基本培地は、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル、脂肪酸、微量元素、抗酸化剤、塩、ヌクレオシド、緩衝剤、ペプチド、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0109】

別の態様では、ＰＳＣ培養培地は、ヒト（ＨＳＡ）、ウシ（ＢＳＡ）、ウシ胎児（ＦＢＳ）、ラット、マウス、ウマ、サル、若しくはブタ血清に由来するアルブミン、又は組換えアルブミン若しくはそのフラグメントなどのアルブミンを含み得る。別の態様では、アルブミンは、ＨＳＡ、ＢＳＡ、ＦＢＳ、それらのペプチド、又はそれらの組み合わせであり得る。実施例３に示すように、ＣＨＩＲ９９０２１と一緒に高濃度のアルブミンを含めることは、著しいＰＳＣ拡大及び拡大されたＰＳＣの多能性の維持をもたらした。

【0110】

実施例３に示すように、本明細書に記載の培地及びワークフローは、ｉＰＳＣ及びＥＳＣの拡大及び多能性をサポートする。別の態様では、ＰＳＣは、ｉＰＳＣ又はＥＳＣであり得る。ＰＳＣは、例えば、Ｇｉｂｃｏ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ、ＷＴＣ－１１、ＷＡ０９、又はＷＡ０１細胞であり得る。

【0111】

特定の実施形態、懸濁培養のためのＰＳＣ組成物及びサプリメントは、ｐＨ指示薬、抗生物質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、脂肪酸、微量元素、抗酸化剤、ヌクレオシド、緩衝剤、ペプチド、界面活性剤、非必須アミノ酸、脂質、無機塩、有機塩、抗真菌剤、プリン誘導体、溶媒、緩衝液、糖、ホルモン、追加の成長因子、サイトカイン、抗ウイルス剤、ホルモン、神経伝達物質、及び付着因子を含むが、これらに限定されない本明細書に記載の追加の成分を含有し得る。

【0112】

別の態様では、組成物は、グリシン、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、それらの塩、それらのエステル、又はそれらのジ若しくはトリペプチドのうちの１つ以上を含み得るアミノ酸を含み得る。

【0113】

別の態様では、組成物は、ビオチン（Ｂ７）、コリン、葉酸（Ｂ９）、ナイアシンアミド（Ｂ３）、ピリドキシン（Ｂ６）、リボフラビン（Ｂ２）、チアミン（Ｂ１）、コバラミン（Ｂ１２）、イノシトール、レチノール（Ａ）、パントテン酸（Ｂ５）、アスコルビン酸（Ｃ）、コレカルシフェロール（Ｄ）、トコフェロール（Ｅ）、フィロキノン（Ｋ）、リポ酸、リノール酸、パラアミノ安息香酸、それらの塩、又はそのエステルのうちの１つ以上を含み得るビタミンを含み得る。

【0114】

別の態様では、組成物は、グルコース、スクロース、ガラクトース、フルクトース、トレハロース、ピルビン酸塩（例えば、ピルビン酸ナトリウム）のうちの１つ以上を含み得る炭水化物を含み得る。

【0115】

別の態様では、組成物は、ビオチン、鉄、マンガン、銅、ヨウ素、亜鉛、コバルト、フッ化物、クロム、モリブデン、セレン、ニッケル、ケイ素、バナジウム、それらの塩、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含み得るミネラルを含み得る。

【0116】

別の態様では、組成物は、限定されないが、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸、パルミトレイン酸、合成コレステロール、酢酸ｄ／ｌ－トコフェロール、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ミリストレイン酸、サピエン酸、エライジン酸、バクセン酸、α－リノレン酸、エルカ酸、エイコサペンタエン酸、若しくはドコサヘキサエン酸、又はそれらのエステル、又はそれらの誘導体などのｎ－３、ｎ－６及びｎ－９ファミリーの脂肪酸のうちの１つ以上を含み得る脂肪酸を含み得る。

【0117】

別の態様では、組成物は、アルミニウム塩、バリウム塩、カドミウム塩、銅塩、マグネシウム塩、マンガン塩、ニッケル塩、カリウム塩、カルシウム塩、銀塩、スズ塩、ジルコニウム塩、ナトリウム塩、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含み得る無機又は有機塩を含み得る。塩には、ＡｇＮＯ₃、ＡｌＣｌ₃、Ｂａ（Ｃ₂Ｈ₃Ｏ₂）₂、ＣａＣｌ₂、ＣｄＳＯ₄、ＣｄＣｌ₂、ＣｏＣｌ₂、Ｃｒ₂（ＳＯ₄）₃、ＣｕＣｌ₂、ＣｕＳＯ₄、ＦｅＳＯ₄、ＦｅＣｌ₂、ＦｅＣｌ₃、Ｆｅ（ＮＯ₃）₃、ＧｅＯ₂、Ｎａ₂ＳｅＯ₃、Ｈ₂ＳｅＯ₃、ＫＢｒ、ＫＣｌ、ＫＩ、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ４、ＭｎＣ１₂、ＮａＣｌ、ＮａＦ、Ｎａ₂ＳｉＯ₃、ＮａＶＯ₃、Ｎａ₃ＶＯ₄、（ＮＨ₄）₆Ｍｏ₇Ｏ₂₄、Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ＮａＨ₂ＰＯ₄、ＮａＨＣＯ₃、ＮｉＳＯ４、ＮｉＣｌ₂、Ｎｉ（ＮＯ₃）₂、ＲｂＣｌ、ＳｎＣｌ₂、ＺｎＣｌ₂、ＺｎＳＯ４、ＺｒＯＣｌ２、ＥＤＴＡ四ナトリウム、ピリドキシンＨＣＬ、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、有機又は無機アニオンを用いて作製されたものが含まれる。一態様では、組成物は、塩化カルシウム、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第二鉄、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸一ナトリウム、硫酸亜鉛、ピリドキシンＨＣｌ、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、硝酸塩、前述のうちのいずれかのイオン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の塩を含む。

【0118】

別の態様では、組成物は、ｄ／ｌ－リポ酸チオクト（ｄ／ｌ－Ｌｉｐｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｉｏｃｔｉｃ）、アスコルビン酸２リン酸、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ３、ビタミンＤ２、カルシフェロール、ナイアシン、ナイアシンアミド、アスコルビン酸、トコフェロール、アスコルビン酸塩、Ｎ－アセチル－ｌ－システイン（ＮＡＣ）、又は還元グルタチオンのうちの１つ以上を含み得る抗酸化剤を含み得る。

【0119】

別の態様では、組成物は、アデノシン、グアノシン、チミジン、シチジン、ウリジン、キサントシン、又はイノシンのうちの１つ以上を含み得るヌクレオシドを含み得る。

【0120】

別の態様では、組成物は、炭酸水素ナトリウム、リン酸塩、硫酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、リン酸二ナトリウム、又はリン酸一ナトリウムのうちの１つ以上を含み得る緩衝剤を含み得る。

【0121】

別の態様では、組成物は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、（ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロック共重合体）Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ１２７（ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンブロック共重合体）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）（ポリエトキシル化ヒマシ油ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８，０００、ＰＥＧ２０，０００、若しくはＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ（ポリエトキシル化ヒマシ油）、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含み得る界面活性剤を含み得る。

【0122】

本明細書に記載の別の実施形態は、懸濁物中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）を成長させるための方法であり、方法は、懸濁物中で培養される多能性幹細胞を提供することと、本明細書に記載のＰＳＣ組成物のうちのいずれかの中で成長に好ましい条件下で懸濁物中でＰＳＣを培養することと、を含み得、ここで、細胞を培養した少なくとも１日後に、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が交換され得る。組成物の少なくとも２５％が毎日交換され得る。別の態様では、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５０％が毎日交換され得る。組成物は、１日おきに交換され得る。実施例３及び４に示すように、本明細書に記載の培地組成物及びサプリメント組成物は、組成物が毎日交換されるか又は１日おきに交換されるときに、拡大におけるＰＳＣの倍率変化の増加及び多能性の維持をサポートする。

【0123】

本明細書に記載の別の実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の多能性を維持するための方法であり、方法は、ＰＳＣを、本明細書に記載のＰＳＣ培地組成物又はサプリメント組成物のうちのいずれかを含み得る培地と接触させることを含み得、ここで、細胞を接触させた少なくとも１日後に、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が交換され得る。組成物の少なくとも２５％が毎日交換され得る。別の態様では、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５０％が毎日交換され得る。組成物は、１日おきに交換され得る。

【0124】

本明細書に記載の別の実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の細胞形態を維持するための方法であり、方法は、ＰＳＣを、本明細書に記載のＰＳＣ培地組成物又はサプリメント組成物のうちのいずれかを含み得る培地と接触させることを含み得、ここで、細胞を接触させた少なくとも１日後に、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が交換され得る。組成物の少なくとも２５％が毎日交換され得る。別の態様では、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５０％が毎日交換され得る。組成物は、１日おきに交換され得る。

【0125】

本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のプロセスのうちのいずれかのプロセスを使用して培養され得る多能性幹細胞である。

【0126】

本明細書に記載の別の実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を成長させるための手段であり、プロセスは、懸濁物中で培養される多能性幹細胞を提供することと、本明細書に記載のＰＳＣ組成物のうちのいずれかの中で成長に好ましい条件下で懸濁物中でＰＳＣを培養することと、を含み得、ここで、細胞を培養した少なくとも１日後に、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が交換され得る。組成物の少なくとも２５％が毎日交換され得る。別の態様では、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５０％が毎日交換され得る。組成物は、１日おきに交換され得る。

【0127】

本明細書に記載の別の実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の多能性を維持するための手段であり、プロセスは、ＰＳＣを、本明細書に記載のＰＳＣ培地組成物又はサプリメント組成物のうちのいずれかを含み得る培地と接触させることを含み得、ここで、細胞を接触させた少なくとも１日後に、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が交換され得る。組成物の少なくとも２５％が毎日交換され得る。別の態様では、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５０％が毎日交換され得る。組成物は、１日おきに交換され得る。

【0128】

本明細書に記載の別の実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の細胞形態を維持するための手段であり、プロセスは、ＰＳＣを、本明細書に記載のＰＳＣ培地組成物又はサプリメント組成物のうちのいずれかを含み得る培地と接触させることを含み得、ここで、細胞を接触させた少なくとも１日後に、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が交換され得る。組成物の少なくとも２５％が毎日交換され得る。別の態様では、培地及びサプリメント組成物の少なくとも５０％が毎日交換され得る。組成物は、１日おきに交換され得る。

【0129】

本明細書に記載の別の実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養するための本明細書で提供されるＰＳＣ組成物の使用であって、本明細書に記載のＰＳＣ組成物又は幹細胞培養サプリメント組成物のうちのいずれかを含み得る組成物中で成長に好ましい条件下でＰＳＣを培養することを含み得る、使用である。一態様では、ＰＳＣ組成物が、慣習的なＰＳＣ培地と比較して、ＰＳＣ成長の増強、ＰＳＣ増殖の増強、ＰＳＣ多能性の維持、スフェロイド形態の維持、ＰＳＣ形態の維持、ＰＳＣ継代数の増加、又はＰＳＣ培養スケールの増加のうちの１つ以上を提供するように、懸濁培養物中でＰＳＣを培養するための、本明細書で提供されるＰＳＣ組成物の使用が本明細書で提供される。

【0130】

本明細書に記載の別の実施形態は、本明細書に記載のプロセスのうちのいずれかのプロセスによって調製され得る細胞培養フィード又はサプリメントである。

【0131】

本明細書に記載の別の実施形態は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養するためのキットであり、キットは、本明細書に記載の培地、培地サプリメント、及び細胞含有組成物の乾燥又は液体溶液を含有する１つ以上のコンテナを含み得る。そのようなキットは、バイアル、試験管、ボトル、パッケージ、ポーチ、ドラムなどのような１つ以上のコンテナを含み得る。コンテナの各々は、本明細書に記載の細胞培養試薬、栄養培地、培地サプリメント、若しくは細胞、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含有し得る。細胞培養試薬、栄養培地、又は培地サプリメントは、水和又は脱水され得る。そのような調製物は、無菌又は実質的に無菌であり得る。キットは、乾燥粉末医薬若しくは臨床組成物、細胞培養試薬、栄養培地、培地サプリメント、培地サブグループ及び／又は緩衝液の再構成において使用される溶媒を含有する１つ以上の追加のコンテナを更に含み得、そのような溶媒は、水性又は有機であり得、緩衝液、生理食塩水、栄養培地溶液、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0132】

いくつかの実施形態では、キットは、ＰＳＣ培地及び／又はサプリメントを含有するコンテナ、使用のための説明書、及び培地又はサプリメントにアクセスするための手段、例えば開封帯を含み得る。キットはまた、１つ以上の追加のコンテナ中に、ＰＳＣ又はＰＳＣ株などの１つ以上の細胞を含有し得る。

【0133】

いずれかの実施形態又はその態様の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物、処方物、方法、プロセス、及び用途に対して好適な改変及び適合をなし得ることが、関連技術分野の当業者には明らかであろう。提供される組成物及び方法は例示的であり、特定される実施形態のうちのいずれかの範囲を限定することを意図しない。本明細書に開示される様々な実施形態、態様、及びオプションの全ては、任意の変形又は反復で組み合わせることができる。本明細書に記載の組成物、処方物、方法、及びプロセスの範囲には、本明細書に記載の実施形態、態様、オプション、例、及び優先の全ての実際の又は潜在的な組み合わせが含まれる。本明細書に記載の例示的な組成物及び処方物は、任意の成分を省略し得、本明細書に開示される任意の成分を置換し得、又は本明細書の他所に開示される任意の成分を含み得る。本明細書に開示される組成物又は処方物のうちのいずれかの任意の成分の質量の、処方物中の任意の他の成分の質量に対する、又は処方物中の他の成分の総質量に対する比率は、それらが明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。参照により組み込まれる特許又は刊行物のいずれかの用語の意味が、本開示で使用される用語の意味と矛盾する場合、本開示の用語又は語句の意味が優先する。更に、前述の考察は単に例示的な実施形態を開示及び記載する。本明細書で引用される全ての特許及び刊行物は、その特定の教示について参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0134】

実施例１ ＰＳＣ培地組成物及び培養物
以下は、拡大細胞のスフェロイド形態及び多能性を維持しながら、懸濁培養物中でＰＳＣを拡大するための、本明細書で提供されるＰＳＣ培地処方物の使用のための例示的なプロトコルである。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、本実施例において記載するが、しかしながら、ＰＳＣ培地及び一般的なプロトコルは、他のｉＰＳＣ及びＥＳＣ株の拡大において有効である。本実施例において、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地を、凍結保存後の最初の２Ｄ播種のために使用する。当該技術分野で知られている他のもの及び本明細書で提供されるものを含めて、他の細胞培養培地は、２Ｄ及び／又は３Ｄ播種における使用に好適である。

【0135】

Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）完全培地を、サプリメントを一晩２～８℃で融解することによって調製した。融解したサプリメントを、穏やかな反転によって混合した。１０ｍＬのサプリメント混合物を、５００ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ８基本培地に移した。５ｍＬの抗生物質及び抗真菌剤を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８完全培地に添加し、穏やかな反転によって混合した。この完全培地を、最大２週間２～８℃で遮光して貯蔵し得る。

【0136】

本明細書において記載及び提供されるＰＳＣ完全培地を、サプリメントを本明細書に記載されるように一晩２～８℃で、又は約１時間室温で融解することによって調製した。融解したサプリメントを、穏やかな反転によって混合した。１００ｍＬのＰＳＣサプリメント混合物を、９００ｍＬのＰＳＣ基本培地に移した。１０ｍＬの抗生物質及び抗真菌剤を、ＰＳＣ完全培地に添加し、穏やかな反転によって混合した。この完全培地を、最大２週間２～８℃で遮光して貯蔵し得る。

【0137】

０日目に、凍結保存したＧｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、Ｇｅｌｔｒｅｘコート６ウェルプレート上に播種した。２０ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ８（商標）完全培地及び２００μＬのＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメントを、２つの５０ｍＬコニカルチューブに添加し、３７℃に水浴中で５分以下の間加温した。１．５ｍＬのＥｓｓｅｎｔｉａｌ８完全培地を、プレートの各ウェルに添加した。ｉＰＳＣを、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ８完全培地２ｍＬ中に再懸濁した。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ自動セルカウンターを使用して、再懸濁した細胞を計数した。細胞を、３つの細胞播種密度、ウェル中４０，０００生存細胞／ｃｍ²、６０，０００生存細胞／ｃｍ²、及び８０，０００生存細胞／ｃｍ²で播種した。播種した細胞を、一晩３７±１℃、５％（±１％）ＣＯ２の加湿インキュベーター中でインキュベートした。播種後１日目及び２日目に、ウェル中の培地を吸引し、細胞に１ｍＬの予熱した（３７℃）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８ 完全培地を供給した。

【0138】

播種後３日目に、ｉＰＳＣを継代した。ｉＰＳＣの２Ｄヴェルセン継代を行った。２Ｄ培養物のコンフルエンシーを見積もった。ＰＳＣは、理想的には、継代時に５０～８０％コンフルエントであるべきである。１つのウェルを選択して、新たな２Ｄプレート中に継代した。ヴェルセン溶液とのインキュベーションの後、細胞を８ｍＬのそれぞれの成長培地中に再懸濁した。細胞懸濁物を１：８、１：１２、及び１：１６の分割比率で２連のウェルに移し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で約２４時間インキュベートした。翌日、２ＤプレートにＥｓｓｅｎｔｉａｌ８完全培地を供給した。供給を毎日行った。ｉＰＳＣが５０～８０％コンフルエンシーに達したときはいつも、２Ｄプレートをヴェルセンを用いて継代した。２Ｄ培養物を、３Ｄ実験のための細胞を供給するために使用した。非組織培養処理６ウェルプレートを、３Ｄ培養のために使用した。１３μＬの１０ｍＭ Ｙ－２７６３２を、ＰＳＣ完全培地の１３ｍＬアリコートに添加した。２ｍＬのＰＳＣ完全培地＋Ｙ－２７６３２溶液を、６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを、３７℃＋５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で貯蔵した。

【0139】

２Ｄ Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣのＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬又はＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ酵素継代を行って、３Ｄ培養物を播種した。例えば、２Ｄ培養の残りのウェルを、Ａｃｃｕｔａｓｅ継代のために使用した。各培地条件の５ｍＬを１５ｍＬコニカルチューブ中にとり、５μＬの１０ｍＭ Ｙ－２７６３２を培地アリコートの各々に添加した。ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液とのインキュベーションの後、細胞を、ＰＳＣ完全培地＋Ｙ－２７６３２を使用することによって継代したウェル当たり１ｍＬの適切な培地中に再懸濁した。Ｃｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ自動セルカウンターを使用して、再懸濁した細胞を計数した。細胞を、３００，０００生存細胞／ウェルの播種密度でウェル中に播種した。プレートを、３７℃＋５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中のオービタルシェーカープラットフォーム（７０ＲＰＭで継続的に回転）上で一晩インキュベートした。

【0140】

４、８、及び１２日目に、ｉＰＳＣはスフェロイドであるべきである。健全なスフェロイドは、典型的には、最小の「くぼみのある」外観を有して丸く見え、一方、不健全な又は分化中のスフェロイドは、いびつで著しく「くぼみのある」ように見え得る。スフェロイドは、３Ｄ培養物をプレーティングした最初の２４時間で形成され始める。培地の５０％をそれぞれの新鮮な予熱した培地に置換することによって、３Ｄスフェロイドに供給した。５、９、及び１３日目には、スフェロイドに供給しない。６、１０、及び１４日目に、培地の５０％をそれぞれの新鮮な予熱した培地に置換することによって、スフェロイドに供給する。７、１１、及び１５日目に、ｉＰＳＣスフェロイドを、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して継代した。非組織培養処理６ウェルプレートを使用し、Ｙ－２７６３２を含む完全ＰＳＣ培地２ｍＬを各ウェルに添加した。非組織培養処理６ウェルプレートの各ウェルからのスフェロイドをチューブに移し、スピンダウンし、１ｍＬの予熱したＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ中でインキュベートした。細胞を、完全ＰＳＣ培地＋Ｙ－２７６３２を使用することによって、１ｍＬの適切な培地中に再懸濁した。ＣｏｕｎｔｅｓｓＩＩ自動セルカウンターを使用して、再懸濁した細胞を計数した。細胞を、３００，０００生存細胞／ウェルの播種密度でウェル中に播種した。プレートを、３７℃＋５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中のオービタルシェーカープラットフォーム（７０ＲＰＭで継続的に回転）上で一晩インキュベートした。継代３の終わり、すなわち１５日目に、細胞数及び生存率を使用して、倍率変化及び生存細胞のパーセンテージを決定した。

【0141】

他の培養プロトコルでは、スフェロイドを３～５日ごとに継代する。いくつかの場合では、細胞を（記載される）日に播種し、続いて、２日目の培地重層ステップ、３日目の供給無し、４日目の供給、５日目の継代を行う。

【0142】

６ウェルフォーマットからスケールアップするために、適切な培養条件を、追加の培養容器のために決定した。６ウェルフォーマットを異なる培養容器フォーマットに適応させるために、表２の例示的なパラメーターを使用した。

【表2】

【0143】

実施例２ グリコーゲン合成酵素キナーゼ－３（ＧＳＫ３）阻害剤は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の拡大を改善し、形態を維持する
以前のナイーブ培地処方物は、限定されないが、ＫＳＲ、ＡｌｂｕｍａｘＩＩ、Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＧｌｕｔａＭＡＸ、非必須アミノ酸、インスリン、及びアスコルビン酸を含有するリッチで複合的な培地ベースを必要とすることが示されている。この基礎培地への４つ又は５つの小分子並びに成長因子ＬＩＦ、ＴＧＦベータ１、及びＦＧＦの添加は、接着培養及び懸濁培養物におけるよりナイーブな状態のＰＳＣの拡大をサポートすることが示されている（Ｇａｆｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５０４（７４７９））：２８２－２８６（２０１３）、Ｌｉｐｓｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１１５（２５）：６３６９－６３７４（２０１８））。実験計画法（ＤＯＥ）を、Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びＷＡ０９胚性幹細胞（ＥＳＣ）を使用して実施して、小分子の影響を決定した。これらのＰＳＣを、基礎ＰＳＣ培地＋１Ｘ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ中に播種し、２４ウェル非組織培養処理プレート中、オービタルシェーカープラットフォーム上で１２０ＲＰＭで成長させ、細胞拡大を５日目の生存細胞数を介して評価した。加えて、抗凝集試薬の影響を含めた。なぜなら、刊行物が、Ｌｉｐｓｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ１１５（２５）：６３６９－６３７４（２０１８）において評価されたナイーブ培地処方物について、デキストラン硫酸を含めることが、スフェロイドをより一貫したより小さなサイズに維持することによって細胞拡大を助けたことを示したからである（Ｌｉｐｓｉｔｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．１１５（８）：２０６１－２０６６（２０１８））。図１は、ｉＰＳＣ及びＷＡ０９ ｈＥＳＣの拡大に対する、様々な濃度の抗凝集剤並びに個々の小分子ＣＨＩＲ９９０２１、ＰＤ０３２５９０１、ＳＰ００１２５、ＢＩＲＤ７９６、及びＧｏ６９８３の評価からの結果を示す。これらのデータは、本発明者らの基本ＰＳＣ培地処方物の存在下で、ＣＨＩＲ９９０２１のみがＰＳＣの倍率拡大の著しい改善を提供することが示されることを示す。ＰＤ０３２５９０１及びＳＰ００１２５は、全体的なＰＳＣ拡大に有害であることが示される。抗凝集試薬を含めることについて本発明者らの処方物の文脈において著しい利益は示されなかった。基礎ＰＳＣ培地処方物の存在下でのＣＨＩＲ９９０２１単独は、驚くべきことに、細胞核形成を補助した。

【0144】

ＣＨＩＲ９９０２１の添加は、懸濁培養物中の細胞の倍率変化を改善することが示されたが、スフェロイドの形態は失われた。継続的培養培地中に３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を含有する処方物への曝露後の細胞形態を、１日目のみの曝露に対して評価した。ｉＰＳＣを、２４ウェル非組織培養処理プレート中、オービタルシェーカープラットフォーム上で１２０ＲＰＭで成長させ、細胞形態を５日目に評価した。この実験において、小分子を１日目にのみ又は培養期間を通して添加した。様々な条件で成長させたｉＰＳＣの例示的な位相差顕微鏡写真を図２に示す。典型的な滑らかな縁及びスフェロイド形態が、ＣＨＩＲ９９０２１を継代時（１日目）にのみ含めた条件について観察された一方で、異常な分化が、高濃度の３μＭのＣＨＩＲ９９０２１を継続的に含めたいくつかの条件について認められた。

【0145】

細胞拡大及び形態を、ＣＨＩＲ９９０２１を単独で又は他の小分子及び／若しくは抗凝集剤のうちの１つ以上と組み合わせて含有する基礎ＰＳＣ培地処方物とのインキュベーション後のＰＳＣ懸濁培養物について評価した。ＰＳＣを、２４ウェル非組織培養処理プレート中、オービタルシェーカープラットフォーム上で１２０ＲＰＭで成長させ、細胞形態を調べ、細胞拡大を５日目の生存細胞数を介して評価した。この実験において、小分子を１日目にのみ又は培養期間を通してのいずれかで添加した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを使用した例示的な結果を図３に示し、ＷＡ０９ ＥＳＣを使用した例示的な結果を図４に示す。これらの図において、ｘ軸は試験した様々な処方物を示し、ｙ軸は培養１日目～５日目の生存細胞数の倍率変化を示す。特定の条件下での５日目の細胞培養物の顕微鏡写真もまた示す。

【0146】

１日目のみのＣＨＩＲ９９０２１の添加へのシフト、それに続く完全基礎ＰＳＣ培地の２～４日目のみの供給は、ＰＳＣ拡大をサポートし、正常なスフェロイドの形態を維持することが示された（図２～図４）。倍率変化の増加が、継代時のみ（例えば、１日目のみ）にＣＨＩＲ９９０２１を含めることを通じて達成され得たことは、驚くべきことであった。これらのデータは、継代時にのみ様々な濃度のＣＨＩＲ９９０２１を含めることが、スフェロイドの形態の視覚的評価を介して評価される望まれない異常な分化を最小にしながら、倍率拡大を増加させることにおいて有効であることを示す。

【0147】

実施例３ ＣＨＩＲ９９０２１との使用のためのｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ）の決定
実施例２に記載の実験を、抗酸化及びフリーラジカルスカベンジャー特性を含む分子と相まってｒｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫｉ）を含有するサプリメントである、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの存在下で実施した。ＣＨＩＲ９９０２１又は抗凝集試薬を添加したときの懸濁培養物におけるＰＳＣ細胞の生存及び拡大に対する、ＲＯＣＫｉ／カクテルＹ－２７６３２、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ、及びＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔの影響を評価するために、Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを使用してＤＯＥを実施した。図５に示す結果での評価のために、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ（４０μＭ）、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ（５０μＭ）又はＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメント（１Ｘ）を、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）又は１０μＬの抗凝集試薬の存在下でＰＳＣ培養培地に含めた。ＰＳＣを、２４ウェル非組織培養処理プレート中、オービタルシェーカープラットフォーム上で１２０ＲＰＭで成長させ、細胞拡大を５日目の生存細胞数を介して評価した。この実験において、小分子を１日目にのみ添加した。

【0148】

継代時にＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせてＲＯＣＫｉを含めることは、最適な倍率変化をもたらすことが示され、Ｙ－２７６３２は最大の有効性を示した。（図５）。他のＲＯＣＫｉ／カクテルを用いて等価な細胞拡大が観察され、より低い倍率変化をもたらしたが、抗凝集試薬の存在を必要としなかった（図５）。

【0149】

多能性の維持のサポートもまた提供しながら、最適な倍率拡大を達成することにおける、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｇｏ６９８３（広域スペクトルＰＫＣ阻害剤）、及びＢＳＡのバランスを評価するために、ＤＯＥを実施した。ＰＳＣを、１０μＭのＹ－２７６３２の存在下で播種し、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１の存在下又は非存在下で様々な濃度のＢＳＡを含有するＰＳＣ基礎培地中の懸濁培養物中で成長させた。様々な培養条件から生じるスフェロイドサイズの変動を、位相差イメージングによって評価した。細胞を１０μＭのＹ－２７６３２の存在下で播種すると、ＣＨＩＲ９９０２１はスフェロイド形成を助ける（図６）。ｉＰＳＣをＰｉｎａｃｉｄｉｌの存在下で播種し、様々な濃度のＣＨＩＲ９９０２１、ＢＳＡ、及び抗凝集剤の存在下で懸濁培養物中で成長させた。培養５日目に、スフェロイドを、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して解離し、２Ｄフォーマットに２４時間再プレーティングした。２４時間の成長の後、細胞を固定し、透過処理し、ＤＡＰＩでそしてＯｃｔ４発現について染色して、解離した細胞の多能性を決定した。Ｏｃｔ４を発現する細胞の数を、ＤＡＰＩを発現する細胞の総数と比較した。これは、スフェロイドから得られた多能性幹細胞のパーセンテージの見積もりを可能にする。多能性の低下がより低い濃度のＢＳＡで観察され、これは、ＣＨＩＲ９９０２１とアルブミンとの間のバランスが多能性の維持のために必要とされることを示す（図７）。

【0150】

懸濁培養物におけるＰＳＣ拡大を、また、ＰＳＣ培地処方物においてＢＳＡに代えてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又は組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）を使用して分析した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、非組織培養処理６ウェルプレート中、７０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカー上で拡大した。細胞を、２Ｄ培養物からＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して継代し、ＣＨＩＲ９９０２１を含むＰＳＣ培地中で成長させた。細胞を０日目に２ｍＬ体積中１５０，０００細胞／ｍＬの濃度で播種し、ＲＯＣＫ阻害剤を培養物に添加した。スフェロイドを５日間にわたって成長させ、５０％の培地置換を毎日行った。５日後に、ｉＰＳＣの８～１２倍の拡大が、ＣＨＩＲ９９０２１を含有するＰＳＣ培地処方物中でＨＳＡ又はｒＨＳＡを使用して得られた。

【0151】

様々な濃度のＰｉｎａｃｉｄｉｌ、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｇｏ６８９３、及びＢＳＡを、抗凝集剤有り又は無しで、懸濁培養物中のｉＰＳＣの倍率拡大の達成について評価した。最適濃度の決定のためのＤＯＥ予測プロファイラー分析（それは倍率拡大に関連することから、特にＢＳＡ及びＣＨＩＲ９９０２１に焦点を当てた）は、中濃度のＣＨＩＲ９９０２１及び高濃度のＢＳＡが最大の倍率変化を提供することを示す（図８）。全体として、ＣＨＩＲ９９０２１はスフェロイド形成を促進し、アルブミンとＣＨＩＲ９９０２１とのバランスは、適切なスフェロイドサイズを維持する。驚くべきことに、同様の倍率変化を有する処方にもかかわらず、高濃度のアルブミンが、ＣＨＩＲ９９０２１の存在下での多能性の維持のために最適である。２つの細胞株（ＷＡ０９ ＥＳＣ及びＧｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ）にわたって、中濃度のＣＨＩＲ９９０２１とバランスをとる高レベルのＢＳＡとともに、Ｇｏ６９８３及び抗凝集剤の除外が好ましいことが決定された。

【0152】

Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ及びＷＡ０９ ＥＳＣを、以下の培地条件（図９Ａ～９Ｂ）で、６ウェル非組織培養処理プレート中、オービタルシェーカープラットフォーム上で７０ＲＰＭで、５０パーセントの培地置換を毎日行って成長させた：ｍＴｅＳＲ１＋Ｙ－２７６３２、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ、Ｄｅｆ－ＣＳ３Ｄ ＰＳＣ培地＋Ｙ－２７６３２、ＰＳＣ培地＋ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）サプリメント、ＰＳＣ培地＋５０μＭのＰｉｎａｃｉｄｉｌ＋１．８８μＭのＣＨＩＲ９９０２１。その後、細胞拡大を５日ごとに生存細胞数を介して評価し、５継代の間１５０，０００生存細胞／ｍＬで播種した細胞を維持した（図９Ａ～９Ｂ）。継代時の中濃度のＣＨＩＲ９９０２１と一緒のＰｉｎａｃｉｄｉｌの利用の文脈において、培地における倍率拡大は、ｍＴｅＳＲ１処方物と比較して、ｉＰＳＣについては匹敵し、又はＥＳＣについては改善されることが示された。ＣＨＩＲ９９０２１と組み合わせたときの性能は、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔとの組み合わせと比較して、両方の細胞株について著しく改善され、より大きな利得がＥＳＣについて観察され、ｍＴｅＳＲ１＋Ｙ－２７６３２について観察されたものに匹敵するか又はそれを上回って改善された（図９Ａ～９Ｂ）。３継代の拡大後の多能性の維持に関する性能の比較を、免疫細胞化学（ＩＣＣ）を介して評価した。ＯＣＴ４を発現する細胞のパーセンテージを、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ ＣＸ５ Ｃｅｌｌｉｎｓｉｇｈｔを使用して定量的に評価した。ＯＣＴ４陽性細胞％を、Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ（青色の棒）及びＷＡ０９ ＥＳＣ（赤色の棒）について強調する（図９Ｃ）。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ Ｄｅｆ－ＣＳ３Ｄは、本明細書で提供されるＰＳＣ培地処方物よりも高いｉＰＳＣについての倍率細胞拡大をもたらすことが示されたが、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ Ｄｅｆ－ＣＳ３Ｄ中で拡大した細胞は、多能性の有意な損失を被る（図９Ｃ）。５日間の拡大の後、ＰＳＣ培地＋５０μＭのＰｉｎａｃｉｄｉｌ＋１．８８μＭのＣＨＩＲ９９０２１中で拡大したＷＡ０９ ＥＳＣを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ Ｍｅｄｉｕｍに移し、自発的に分化させた。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ６ Ｍｅｄｉｕｍ中での懸濁培養物中での１０日間の後、細胞を三系列分化潜在力についてＴａｑＭａｎ（商標）ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ（商標）Ｐａｎｅｌを使用して評価し、３つ全ての系列に効率的に分化することが示された（図９Ｄ～９Ｅ）。ＣＨＩＲ９９０２１を含有する本発明者らのＰＳＣ培地処方物を使用して拡大し、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌを用いて継代した細胞は、多能性幹細胞の古典的な品質証明である、三系列分化潜在力を維持することが示された。

【0153】

ＲＯＣＫ阻害剤Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、及びＹ－２７６３２を、ＰＳＣ基礎培地処方物との組み合わせについて評価した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、様々な濃度のＰｉｎａｃｉｄｉｌ、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、又はＹ－２７６３２を含むＰＳＣ基礎培地処方物中に１５０，０００生存細胞／ｍＬで播種した。毎日の５０％の培地交換及びオービタルシェークプラットフォーム上での一定の撹拌を伴う５日間の成長の後、拡大に際しての倍率変化を評価した。図１０Ａは、様々な濃度のＰｉｎａｃｉｄｉｌ、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ又はＹ－２７６３２の、ＣＨＩＲ９９０２１を除外する基礎ＰＳＣ培養培地との組み合わせでのｉＰＳＣ拡大における倍率変化を示す。図１０Ｂは、Ｙ－２７６３２又はＰｉｎａｃｉｄｉｌとともに播種し、ＣＨＩＲ９９０２１有り又は無しのＰＳＣ培地中で培養したｉＰＳＣの位相差顕微鏡写真を示す。Ｐｉｎａｃｉｄｉｌと比較して、より大きなスフェロイドが、継代時にＹ－２７６３２及びＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎを使用した条件について特定された。ＰＳＣ培地処方物を用いたフォローアップ実験により、以下のＰＳＣ培地処方物を用いて培養したｉＰＳＣの拡大における３継代累積倍率変化を使用して評価される、最大倍率変化のためのＣＨＩＲ９９０２１とのＹ－２７６３２との組み合わせが確認された（図１０Ｃ）：１）ＰＳＣ培地＋１Ｘ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ、２）ＰＳＣ培地＋１Ｘ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ＋１．８８μＭのＣＨＩＲ９９０２１、３）ＰＳＣ培地＋１０μＭのＹ－２７６３２、４）ＰＳＣ培地＋１０μＭのＹ－２７６３２＋１．８８μＭのＣＨＩＲ９９０２１。Ｙ－２７６３２は、継代時にのみ含まれたときにＰＳＣ培地処方物の存在下で倍率変化の改善に対する最大の影響を有することが示された。

【0154】

毎日の供給のための処方物中に含まれた場合のＰＳＣ培地処方物における使用のためのＣＨＩＲ９９０２１の最適範囲を評価した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、１００ｍＬ ＰＢＳバイオリアクター中で２連で拡大し、細胞計数を各継代の終わりに行った。細胞を１日目に１０μＭのＹ－２７６３２を補充した培地６０ｍＬ中に播種し、２日目に４０ｍＬの追加の培地を重層し、次いで、５０％の培地交換を毎日（ＥＤ）又は１日おき（ＥＯＤ）に完了した。糖源（グルコース／ガラクトース）及びＣＨＩＲ９９０２１の濃度を変動させた。供給スケジュールもまた、毎日対１日おきの供給スケジュールを含むように改変した。拡大に際しての倍率変化及び生存率を、各条件について評価した。０．６μＭほど低いＣＨＩＲ９９０２１濃度が、毎日の培地交換供給スケジュールでの最適な細胞拡大（図１１Ａ）、並びに毎日及び１日おきの培地交換供給スケジュールでの生存率（図１１Ｂ）をサポートした。低い生存率が、グルコース／ガラクトース含有処方物についてより後の継代で観察され、クラスターを継代するのが困難であり、生存率及びその結果としての倍率変化の低下がもたらされた。これらのデータから、培地中に継続的に含まれる０．６μＭほど低いＣＨＩＲ９９０２１濃度が、市販のｍＴｅＳＲ１培地処方物と比較して最適な倍率変化を提供することが観察された。最大１．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、培養物に１日おきのケイデンスで供給したときでさえ、最適な倍率拡大をサポートすることが示された。（図１１Ａ～１１Ｂ）。

【0155】

ＲＯＣＫｉ ＣｈｒｏｍａｎＩを、ＰＳＣ懸濁培養についてＰＳＣ培地においてＹ－２７６３２、Ｐｉｎａｃｉｄｉｌ、及びＲｅｖｉｔａＣｅｌｌと比較した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、非組織培養処理６ウェルプレート中、７０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカー上で拡大した。細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して２Ｄ培養物から継代し、ＰＳＣ培地中で成長させた。細胞を０日目に２ｍＬ体積中１５０，０００細胞／ｍＬの濃度で播種し、ＲＯＣＫ阻害剤を培養物に添加した。添加したＲＯＣＫｉは、１Ｘ ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（図１２Ａ）、６０μＭのＰｉｎａｃｉｄｉｌ（図１２Ｂ）、又は５０μＭのＣｈｒｏｍａｎＩ（図１２Ｃ）のいずれかであり、全てを１０μＭのＹ－２７６３２に対して比較した。スフェロイドを５日間にわたって成長させ、５０％の培地置換を毎日行った。ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ及び６０μＭのＰｉｎａｃｉｄｉｌは同様に作用し、スフェロイドを拡大するときに１０μＭのＹ－２７６３２より劣っていた（図１２Ａ～１２Ｂ）。５０ｎＭのＣｈｒｏｍａｎＩ及び１０μＭのＹ－２７６３２は、スフェロイドを拡大するときに同様に作用する（図１２Ｃ）。ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ及び６０μＭのＰｉｎａｃｉｄｉｌのスフェロイドは形態学的により小さく、一方、５０ｎＭのＣｈｒｏｍａｎＩ及び１０μＭのＹ－２７６３２のスフェロイドは形態学的により大きい（図１２Ｄ）。全体として、ＣＨＩＲ９９０２１含有ＰＳＣ培地処方物の文脈における最適の性能は、Ｙ－２７６３２及びＣｈｒｏｍａｎ１継代培養物について示された。

【0156】

本明細書で提供されるＰＳＣ培地処方物を使用したＰＳＣ拡大を、市販の培地中での拡大と比較した。Ｈ９（ＷＡ０９）ＥＳＣを、ＣＨＩＲ９９０２１の非存在下でのＰＳＣ基本培地中、ＣＨＩＲ９９０２１の存在下でのＰＳＣ基本培地、及びｍＴｅＳＲ１培地処方物（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で拡大した。ＰＳＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬を使用して継代し、２ｍＬの培地中１５０，０００生存細胞／ｍＬで播種した６ウェル非組織培養処理プレート中で成長させ、オービタルシェーカープラットフォーム上で７０ＲＰＭで撹拌した。これらの比較のために、１０μＭのＹ－２７６３２を細胞培養物に継代時に添加して、スフェロイド核形成を促進した。細胞拡大を、５日目の生存細胞数を介して評価した。培養物に、毎日行った５０％の培地置換で供給した。図１３に示すように、ＰＳＣ基本培地へのＣＨＩＲ９９０２１の添加は、ＣＨＩＲ９９０２１無しのＰＳＣ基本培地と比較して、倍率拡大を増強し図１３Ｂ対図１３Ａ）、ｍＴｅＳＲ１と比較して倍率拡大を有意に増強した（図１３Ｃ）。

【0157】

Ｇｉｂｃｏ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、非組織培養処理６ウェルプレート中、７０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカー上で拡大した。細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して２Ｄ培養物から継代し、完全ＰＳＣ培地又はｍＴｅＳＲ－３Ｄ培地中で成長させた。完全ＰＳＣ培地培養物に、毎日の５０％の培地置換によって供給し、一方、ｍＴｅＳＲ－３Ｄ培地培養物に、毎日の２２４μＬのフィード培地の添加による製造業者が推奨する重層プロトコルを使用して供給した。培養物を、３継代にわたる倍率拡大（図１４Ａ）、継代の過程にわたる生存率の維持（図１４Ｂ）、並びにＯｃｔ４及びＮａｎｏｇ発現についてのフローサイトメトリーを使用して評価される多能性の維持（図１４Ｃ）について評価した。全体として、ＰＳＣ完全培地処方物は、ｍＴｅＳＲ－３Ｄと比較して匹敵する多能性パーセントを維持しながら、ｍＴｅＳＲ－３Ｄを上回って倍率変化を改善したことが示された。

【0158】

ＰＳＣ倍率拡大及び多能性維持を、ＲＯＣＫ阻害剤を用いて又は市販のＣｅｌｌａｒｔｉｓ Ｄｅｆ－ＣＳ３Ｄ培地システムのＣｅｌｌａｒｔｉｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３を用いて播種し、本明細書で提供される完全ＰＳＣ培地中で成長させたスフェロイド培養物について比較した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、２４ウェル非組織培養処理プレート中、オービタルシェーカープラットフォーム上で１２０ＲＰＭで、完全ＰＳＣ培地中で拡大して、使用のために選択したＲＯＣＫｉ又はサプリメントのタイプが、全体的なスフェロイド成長に影響するかどうかを決定した。全てのＰＳＣを、完全ＰＳＣ培地処方物中で成長させ、唯一の例外は１日目で、細胞をＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（１Ｘ）、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）、又はＣｅｌｌａｒｔｉｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３（５００×希釈）のいずれかの中で成長させた。全体的なスフェロイド成長及び拡大を、細胞が５日間２４ウェルプレート中で成長した後に評価した（図１５Ａ）。スフェロイドの多能性もまた、細胞が５日間２４ウェルプレート中で成長した後に評価した（図１５Ｂ）。多能性を評価するために、スフェロイドを、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して解離し、２Ｄフォーマットに２４時間再プレーティングした。２４時間の成長の後、細胞を固定し、透過処理し、ＤＡＰＩでそしてＯｃｔ４発現について染色して、解離した細胞の多能性を決定した。Ｏｃｔ４を発現する細胞の数を、ＤＡＰＩを発現する細胞の総数と比較した。これは、スフェロイドから得られた多能性幹細胞のパーセンテージの見積もりを可能にする。Ｙ－２７６３２は、最も効率的であることが示され、ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（商標）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔに対して、継代時にＹ－２７６３２を添加する培養物中で成長した５日目でより大きなスフェロイドであった。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ３は、Ｙ－２７６３２と比較して、匹敵するサイズ及び形態を有した。ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ及びＹ－２７６３２は、ＰＳＣ培地処方と組み合わせて使用したときに、スフェロイド成長の間に高レベルの多能性幹細胞を維持し得る。Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ Ｄｅｆ－ＣＳ３Ｄは、完全ＰＳＣ培地とは対照的に、拡大細胞集団におけるＯＣＴ４発現の減少によって示されるように、細胞の多能性を維持するために不十分であった（図１５Ｂ）。

【0159】

多能性幹細胞の拡大は、ＰＳＣ懸濁培養ワークフローにおける重要な最初のステップであるが、拡大後に、細胞が所望の下流系列への方向付けられた分化を受け得ることもまた重要である。下流分化能力を評価するために、ＰＳＣを６ウェル非組織培養処理プレート中の様々な培地条件に播種し、オービタルシェーカープラットフォーム上で７０ＲＰＭで拡大し、拡大の２、３、又は４日間、５０パーセントの培地置換を毎日行った。拡大期の後、胚体内胚葉分化を、Ｇｉｂｃｏ ＰＳＣ Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｄｅｒｍ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔをキットのプロトコルに従って使用して実施した。分化プロトコルに従った、胚体内胚葉マーカーである、ＣＸＣＲ４の発現に関する性能の比較を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ フローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーによって定量的に評価した。ＣＸＣＲ４について陽性のＧｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｓｉｏｍａｌ ｉＰＳＣのパーセンテージを、図１６のグラフに示す。これらは、完全ＰＳＣ培地処方物を使用して拡大した細胞が、内胚葉系列への方向付けられた分化を受ける能力を示す。ＰＳＣ培地での内胚葉分化性能は、市販のｍＴｅＳＲ１及びｍＴｅＳＲ３Ｄ培地で観察されるものに匹敵する。

【0160】

この評価を、外胚葉系列に分化する能力の評価に拡張した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、スフィア形成のために完全ＰＳＣ懸濁培養培地中で２又は３日間培養した（図１７中、ＰＳＣ．Ｄ２、ＰＳＣ．Ｄ３）。培地を６、７、及び８日間ＰＳＣ Ｎｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに変えた（図１７中、Ｉｎｄ．Ｄ６、Ｉｎｄ．Ｄ７、Ｉｎｄ．Ｄ８）。誘導後、神経幹細胞凝集体を拡大培地中で１～３日間培養した。１１日目に、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて解離し、２日間拡大培地中でＧｅｌｔｒｅｘコートプレート上で単層でプレーティングした。細胞を固定し、マーカーＳＯＸ１及びネスチン又はＰＡＸ６及びＯＴｘ２について染色した。図１７Ａは、ＳＯＸ１（赤色）及びネスチン（緑色）の発現の代表的な免疫細胞化学画像を示し、ＳＯＸ１の定量的発現をグラフに示す。図１７Ｂは、ＰＡＸ６（赤色）及びＯＴｘ２（緑色）の発現の代表的なＩＣＣ画像を示し、ＰＡＸ６の定量的発現をグラフに示す。これらのデータは、完全ＰＳＣ培地を使用して拡大した細胞が、Ｇｉｂｃｏ Ｎｅｕｒａｌ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍを使用した外胚葉系列への方向付けられた分化を受ける能力を示す。中胚葉系列への細胞拡大及び方向付けられた分化もまた示されている。

【0161】

実施例４ ＰＳＣ培地のスケーラビリティ
２４ウェル及び６ウェルフォーマットの懸濁培養物を使用することに加えて、ＰＳＣ拡大を、より高い培養体積において評価した。このために、ＰＳＣ培地中でのＰＳＣの拡大を、ＰＢＳバイオリアクターを使用して１００ｍＬスケールで評価した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）細胞解離試薬を使用して継代し、１００ｍＬ ＰＢＳミニバイオリアクター中で４０ｒｐｍで撹拌しながら成長させた。細胞を、１．５μＭのＣＨＩＲ９９０２１への継続的な曝露を伴ってＰＳＣ完全培地中で、又はｍＴｅＳＲ１培地を用いて培養した。１０μＭのＹ－２７６３２を、継代時にのみ添加した。ＰＳＣ培地培養物については、細胞に毎日（ＥＤ）又は１日おき（ＥＯＤ）のいずれかで５０％の培地置換を使用して供給した。ｍＴｅＳＲ１条件については、細胞に毎日の５０％の培地置換を使用して毎日供給した。図１８Ａは、評価した全ての条件についての３継代にわたるＧｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣの倍率拡大を示す。匹敵する拡大が、１日おき及び毎日の供給スケジュールを使用したＰＳＣ培地処方物について観察された。ｍＴｅＳＲ１と比較して増加した性能が、１００ｍｌスケールで観察された。正常な多能性幹細胞特性の維持を、含んだＥＯＤの５０％の培地交換スケジュールを使用して供給したＰＳＣ培地中のｉＰＳＣ培養物について評価した。多能性の維持を、ＴａｑＭａｎ（商標）ｈＰＳＣ Ｓｃｏｒｅｃａｒｄ（商標）Ａｓｓａｙ（図１８Ｂ）及びＰｌｕｒｉＴｅｓｔ（商標）アッセイ分析（図１８Ｃ）を使用して評価し、正常な核型の維持を、ＫａｒｙｏＳｔａｔ分析を介して評価した（図１８Ｄ）。更に、１日おきのＰＳＣ完全培地条件下で拡大したＧｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣは、多能性マーカーの発現の維持及び正常な核型の維持を含む、正常な多能性幹細胞特性を維持することが示された。提供されるＰＳＣ培地及び細胞拡大ワークフローの使用は、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔ（商標）分析によって及びフローサイトメトリー分析によって評価されるように、５連続継代にわたってスフェロイドとして成長させたｉＰＳＣ及びＥＳＣ（ＷＡ０９）の多能性を維持し、同じ拡大細胞株の＞９０％がＯｃｔ４及びＮａｎｏｇマーカーを発現することが示された。

【0162】

拡大に際して得られたスフェロイドのサイズが、細胞が継代後に懸濁物中で開始され、その後懸濁物中で分化するときに、下流分化能力に対する影響を有し得ることが示されている。これに取り組むために、細胞が、完全ＰＳＣ培地処方物を使用してスフェロイド直径において「チューニングされる（ｔｕｎｅｄ）」能力を、１００ｍＬスケールのＰＢＳミニバイオリアクターと組み合わせて、一定範囲の撹拌速度を使用することによって調べた。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣを、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して継代し、１００ｍＬ ＰＢＳミニバイオリアクター中で、継代後最初の２４時間は初期撹拌速度で撹拌し、続いて、２～５日目は第２の撹拌速度に調整して、成長させた。細胞を、継代時に１０μＭのＹ－２７６３２を補充した完全ＰＳＣ培地６０ｍＬ中に播種し、２日目に４０ｍＬの追加の完全ＰＳＣ培地単独を重層し、続いて、５０％の培地交換を介して１日おきに供給した。開始後３日目のスフェロイド形態の評価は、チューニング可能な（ｔｕｎａｂｌｅ）スフェロイドの存在を示し、より小さなスフェロイド直径はより高いＲＰＭで達成された（図１９Ａ）。図１９Ｂは、個々のデータポイントによって示される各々の個々のフラスコからの細胞数での継代後５日目に評価した倍率変化を示す。撹拌速度条件を、ｘ軸に示す。多能性の維持を、多能性の細胞外（ＴＲＡ１－６０、青色）及び細胞内（ＯＣＴ４、赤色）マーカーの存在を検出するためのフローサイトメトリーを使用して評価した（図１９Ｃ）。これらのデータは、スフェロイド直径が、可変撹拌速度を使用して改変され得ることを示す。匹敵する倍率変化及び多能性は、使用した撹拌速度（例えば、３０～４０ＲＰＭ）にかかわらず、５日目に観察された。

【0163】

シェーカーフラスコにおけるスフェロイド成長を分析した。Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣ、ＷＴＣ－１１ ｉＰＳＣ、ＷＡ０９ ＥＳＣ、及びＷＡ０１ ＥＳＣを、シェーカーフラスコ（１２５ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、１０００ｍＬ）中、７０ＲＰＭに設定したオービタルシェーカー上で拡大した。細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して２Ｄ培養物から継代し、完全ＰＳＣ培地中で成長させた。細胞を０日目に２ｍＬ体積中１５０，０００細胞／ｍＬの濃度で播種し、阻害剤Ｙ－２７６３２を培養物に添加した。スフェロイドを５日間にわたって成長させ、５０％の培地置換を毎日行った。複数の細胞株の成長を比較した。試験した４つ全ての細胞株は、ＰＳＣ培地中でスフェロイドとして拡大した（図２０Ａ～２０Ｂ）。驚くべきことに、ＰＳＣ培地処方物は、効率的なソリューションを、ｉＰＳＣの拡大だけでなく、ＥＳＣの拡大にも提供した。これは、そのうちのいくつかは容易には懸濁培養に移行しない、ここで培養及び拡大した４つの細胞株によって実証された。１０個を上回る異なるｉＰＳＣ及びＥＳＣ細胞株が、提供されるＰＳＣ培地及び拡大ワークフローを使用した懸濁培養拡大に適合性であることが示されている。平均して、継代当たり５～１０倍の拡大が得られており、倍率拡大は細胞株によって変動し得る。様々なシェーカーフラスコ体積における（図２０Ｃ）及び複数のタイプの容器における（図２０Ｄ）Ｇｉｂｃｏ Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｉＰＳＣの性能を分析した。試験した全てのシェーカーフラスコサイズは、ＰＳＣ培地での一貫した拡大性能を示した。シェーカーフラスコ性能は、６ウェルプレート及びバイオリアクターにおける性能と同様であった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A-9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15A】

【図15B】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B-18C】

【図18D】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20】

【国際調査報告】