知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ アプタマー サイエンシズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-26
(54)【発明の名称】血液脳関門浸透アプタマー及びその利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20230719BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20230719BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230719BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230719BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230719BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230719BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230719BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20230719BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20230719BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230719BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20230719BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20230719BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61K31/711
A61P25/00
A61P25/08
A61P25/14
A61P25/16
A61P25/28
A61P25/18
A61P31/00
A61P35/00
A61K47/54
C07K16/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580190
(86)(22)【出願日】2021-06-29
(85)【翻訳文提出日】2022-12-23
(86)【国際出願番号】 KR2021008212
(87)【国際公開番号】W WO2022005179
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】10-2020-0079495
(32)【優先日】2020-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0082374
(32)【優先日】2021-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
(71)【出願人】
【識別番号】522179655
【氏名又は名称】アプタマー サイエンシズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＴＡＭＥＲ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヨンドン
(72)【発明者】
【氏名】リ，ダ ソム
(72)【発明者】
【氏名】キム，ソヨン
(72)【発明者】
【氏名】リム，ソ リョン
(72)【発明者】
【氏名】シン，ユイス
(72)【発明者】
【氏名】カン，ナイエ
(72)【発明者】
【氏名】ハン，ドンギル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC27
4C076CC31
4C076EE23
4C076EE59
4C076FF70
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA02
4C086ZA06
4C086ZA15
4C086ZA16
4C086ZB26
4C086ZB32
4H045AA10
4H045AA30
4H045EA20
(57)【要約】
本発明は、血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）に浸透して受容体を介した内在化（receptor-mediated transcytosis）が可能なアプタマー及びその利用に関する。
本発明のアプタマーは、トランスフェリン受容体（Transferrin receptor）タンパク質のみ選択的にターゲティングし、受容体を介した細胞内在化によりＢＢＢを迅速に通過し、単純な化学的結合によりタンパク質、抗体、核酸、低分子化合物などの様々な治療剤を効率的に輸送及び送達することができ、種間のトランスフェリン受容体に交差反応を示し、化学的修飾が容易であるので、神経系疾患、特に脳及び中枢神経系疾患における薬物担体として適用することができる。
本発明のアプタマーは、トランスフェリン受容体（Transferrin receptor）タンパク質のみ選択的にターゲティングし、受容体を介した細胞内在化によりＢＢＢを迅速に通過し、単純な化学的結合によりタンパク質、抗体、核酸、低分子化合物などの様々な治療剤を効率的に輸送及び送達することができ、種間のトランスフェリン受容体に交差反応を示し、化学的修飾が容易であるので、神経系疾患、特に脳及び中枢神経系疾患における薬物担体として適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式１の塩基配列を含む、トランスフェリン受容体（Transferrin receptor）タンパク質特異的アプタマー。［一般式１］
ＡＧＴＧＴＣＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴ（配列番号５２）
【請求項2】
前記アプタマーは、その５’末端及び３’末端から選択される少なくとも１つに１～３０個のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項3】
前記アプタマーは、３０～１５０個のポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項4】
前記アプタマーは、配列番号１～４のポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、又はそれと相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項5】
前記アプタマーは、そのポリヌクレオチド配列を形成する少なくとも１つのヌクレオチドに下記のものから選択される少なくとも１つの改変を含む、請求項１に記載のアプタマー。ｉ）少なくとも１つのヌクレオチド中のＴ塩基の５位の炭素がベンジル基、ナフチル基、２－ナフチル基、ピロールベンジル基及びトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つに置換される。
ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチド中の２位の炭素位置において、－ＯＨ基がデオキシ（deoxy）、メトキシ（methoxy）、アミノ（amino）及びフッ素（Ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つに置換される。
ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドがメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）及びＨＮＡ（Hexitol Nucleic acid）からなる群から選択される少なくとも１つに置換される。
【請求項6】
前記アプタマーは、配列番号５～４９のポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、又はそれと相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載のアプタマー。
【請求項7】
前記アプタマーは、そのポリヌクレオチド配列、その５’末端及び３’末端から選択される少なくとも１つに、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）、ｉｄＴ（inverted deoxythymidin, 反転デオキシチミジン）、ビオチン、蛍光物質、アミンリンカー、チオールリンカー、コレステロール及び脂肪酸からなる群から選択される少なくとも１つが接合したものである、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分として含む、神経系疾患の予防又は治療用薬学組成物。
【請求項9】
前記アプタマーは、タンパク質、抗体、核酸及び低分子化合物からなる群から選択される少なくとも１つがさらに結合したものである、請求項８に記載の薬学組成物。
【請求項10】
前記神経系疾患は、中枢神経系疾患である、請求項８に記載の薬学組成物。
【請求項11】
前記中枢神経系疾患は、脳癌、脳感染、認知症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、多発性硬化症、てんかん、中風、脳卒中、虚血性脳疾患、記憶力減退、外傷性中枢神経系疾患、脊髄損傷疾患、行動障害、発達障害、精神遅滞、ハンター病、ＡＬＳ、ダウン症候群及び統合失調症からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の薬学組成物。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか一項に記載のアプタマーを含む薬物担体。
【請求項13】
前記薬物担体は、タンパク質、抗体、核酸及び低分子化合物からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１２に記載の薬物担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、受容体介在性トランスサイトーシス（receptor-mediated transcytosis）によりヒトとマウスの血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）の両方に浸透するアプタマー及びその利用に関する。
【背景技術】
【0002】
アプタマー（Aptamer）は、それ自体が安定した３次元構造を有し、標的分子に高い親和性及び特異性で結合するという特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ又は修飾核酸）であり、１９９０年にＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment）というアプタマー開発技術が初めて導入されて以来、低分子有機物、ペプチド、膜タンパク質に至る様々な標的分子に結合する多くのアプタマーが続けて開発されてきた。アプタマーは、固有の高い親和性（通常ｐＭレベル）及び特異性で標的分子に結合するという特性を有するので、しばしば単一抗体と比較され、特に「ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ」と言われるほどに代替抗体としての可能性が非常に高い。
【0003】
各種標的分子に結合するアプタマーが報告されると共に、様々な疾患を媒介する標的分子に結合するアプタマーを治療剤として用いようとする努力が続けられており、特に疾患を誘発する分子に拮抗的に作用するアプタマーを開発すれば、標的治療（targeted therapy）に用いることができるであろうと期待されている。その結果、２００４年末に、Ｐｆｉｚｅｒ社とＥｙｅｔｅｃｈ社が共同開発したアプタマー治療剤であるＭａｃｕｇｅｎが初めてＦＤＡから新薬承認され、販売開始された。Ｍａｃｕｇｅｎは、加齢黄斑変性（age-related macular degeneration, AMD）を誘発するＶＥＧＦ１６５タンパク質に特異的に結合し、その結果ＶＥＧＦ１６５タンパク質がＶＥＧＦレセプターに結合することを妨げるので、ＡＭＤに対して優れた治療効効果がある。Ａｒｃｈｅｍｉｘ社は、過剰な血栓形成を誘発するｖＷＦに選択的に結合することにより血栓形成を抑制するＡＲＣ１７７９（血栓性微小血管症治療）などをはじめとする様々な新薬候補を開発している。ウイルスが媒介する疾患に対するアプタマー治療剤の研究も活発に行われており、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼに結合するアプタマーが最初に報告されて以来、特にＨＩＶ－１とＨＣＶが生成するタンパク質に対するアプタマーが多く開発されている。
【0004】
一方、現在、脳癌、脳感染、ＣＮＳ疾患などの神経系疾患の数が増加するにつれて、先端薬物送達技術の需要が拡大してきている。しかし、血液中への薬物投入によっては脳に薬物が送達されないが、それは血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）が存在するからである。血液脳関門は、脳と血液を隔離する血管バリアであり、選択的透過性が高く、脳をはじめとする中枢神経系の調節機能を細菌などの血液で輸送される病源体や血液中の潜在的な危険物質から隔離する役割を果たす。脳毛細血管の内皮細胞は、星状膠細胞の足突起から分泌される物質により密着結合を形成して細胞間の溶質の移動を妨げ、高分子や親水性物質の通過を妨げる。よって、水溶性分子が血液脳関門を通過するために、特別なチャネルや輸送体タンパク質を必要とするのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献3】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【非特許文献7】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献11】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献12】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献13】J.A. Kim et al, Biomicrofluidics, 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明者らは、受容体介在性トランスサイトーシス（receptor-mediated transcytosis）によりヒトとマウスの血液脳関門の両方に浸透するアプタマーを開発し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は、トランスフェリン受容体（Transferrin receptor）タンパク質特異的アプタマーを提供することを目的とする。
【0008】
また、本発明は、前記アプタマーを有効成分として含む、神経系疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。
【0009】
さらに、本発明は、前記アプタマーを含む薬物担体を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0010】
本発明のアプタマーは、トランスフェリン受容体（Transferrin receptor）タンパク質のみ選択的にターゲティングし、受容体を介した細胞内在化により血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）を迅速に通過し、単純な化学的結合によりタンパク質、抗体、核酸、低分子化合物などの様々な治療剤を効率的に輸送及び送達することができ、種間のトランスフェリン受容体に交差反応を示し、化学的修飾が容易であるので、神経系疾患、特に脳及び中枢神経系疾患における薬物担体として適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1a】ＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認した図である。
【図1b】ＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認した図である。
【図2】ＴｆＲアプタマーの細胞結合力を確認した図である。
【図3a】ＴｆＲアプタマーのヒト細胞株結合力を確認した図である。
【図3b】ＴｆＲアプタマーのマウス細胞株結合力を確認した図である。
【図4a】ＴｆＲアプタマーのマウス細胞株内在化を確認した図である。
【図4b】ＴｆＲアプタマーのマウス細胞株内在化を確認した図である。
【図5】ＧＦＰに結合したＴｆＲアプタマーのヒト及びマウス細胞株内在化を確認した図である。
【図6】セツキシマブ又はリツキシマブに結合したＴｆＲアプタマーのヒト、サル、マウス細胞株内在化を確認した図である。
【図7】ｉｎ ｖｉｔｒｏ脳微小血管構造を示す模式図である。
【図8】ＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ脳微小血管構造浸透効果を確認した図である。
【図9】ＴｆＲアプタマーにより脳に送達された抗体の分布を確認した図である。
【図10】セツキシマブ結合アプタマーにより脳に送達された抗体の分布を確認した図である。
【図11】リツキシマブ結合アプタマーにより脳に送達された抗体の分布を確認した図である。
【図12】抗体に結合したＴｆＲアプタマーの循環網状赤血球に対する影響を確認した図である。
【図13a】化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認した図である。
【図13b】化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認した図である。
【図14a】化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのヒト細胞株内在化を確認した図である。
【図14b】化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのマウス細胞株内在化を確認した図である。
【図14c】化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのサル細胞株内在化を確認した図である。
【図15】化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーの血清安定性を確認した図である。
【図16】抗体に結合して化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのヒト細胞株内在化を確認した図である。
【図17】各ｐＨ条件におけるＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認した図である。
【図18】本発明のＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）の構造を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本明細書で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本明細書で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【0013】
前記課題を解決するために、本発明の一態様は、トランスフェリン受容体（Transferrin receptor）タンパク質特異的アプタマーを提供する。
【0014】
本発明のアプタマーは、次の一般式１の塩基配列を含むものであってもよい。
［一般式１］
ＡＧＴＧＴＣＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴ（配列番号５２）
［一般式１］
ＡＧＴＧＴＣＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣＣＴＣＧＴＣＧＣＴ（配列番号５２）
【0015】
本発明における「トランスフェリン受容体（Transferrin receptor）」とは、細胞内の鉄濃度に応じて細胞内に鉄を輸送するタンパク質を意味する。前記トランスフェリン受容体は、受容体を介した内在化（receptor-mediated endocytosis）によりトランスフェリン－鉄複合体を内在化して鉄を細胞内に輸送することが知られており、前記受容体を介した内在化により血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）を通過することができる。
【0016】
本発明における「アプタマー」とは、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ」であり、特定化合物からタンパク質に至る各種標的リガンドに高い特異性及び親和性で結合するという特性を有する短い（２０～８０塩基）一本鎖核酸分子を意味する。アプタマーは、ＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）により、生体外（in vitro）で開発することができる。
【0017】
アプタマーは、標的タンパク質に対してナノモル（ｎＭ）～フェムトモル（ｆＭ）レベルの高い結合力と選択性を有するという点で抗体に類似した特性を有するオリゴ核酸分子であると考えられる。一方、抗体と比較すると、アプタマーは次のような様々な利点を有する。（１）化学合成法で作製されるアプタマーは、抗体などのタンパク質ベースの物質より、目的とする化学的修飾が容易であり、（２）ＳＥＬＥＸ過程により選択性及び親和性を最大化することができ、（３）化学的合成で作製されるので、純度が高く、（４）機器分析により作製された物質を同定することができ、（５）熱に安定しているので、室温で長期間保存することができる。
【0018】
本発明における「ＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）」とは、標的物質に結合するアプタマーを選択する方法である。一般に、公知の方法においては、ランダムな塩基配列を有するオリゴヌクレオチドライブラリー（ＤＮＡ又はＲＮＡ）と共に標的タンパク質を一定温度で反応させ、その後標的に結合していないＤＮＡ／ＲＮＡライブラリーを除去する。標的に結合したヌクレオチドを分離して遺伝子増幅法により増幅し、前記過程を複数回繰り返すことにより、標的に対して高い結合力を有するアプタマーを選択する。
【0019】
本発明のアプタマーは、前述したような一般的なＳＥＬＥＸ法により製造したものであってもよい。
【0020】
アプタマー選択過程には、一般に１０14～１０15個程度の異なる配列、すなわち多様性を有するライブラリーから一本鎖核酸プール（pool）を確保する過程が必要である。そのための方法として様々な方法が用いられているが、一般に非対称ＰＣＲを用いて一方の鎖のみ増幅する方法、二本鎖核酸の一方の鎖の端部にビオチン（biotin）を付け、その後ストレプトアビジン（streptavidin）で被覆したビーズ（bead）を用いて一方の鎖のみ選択的に分離する方法が最も多く用いられている。
【0021】
その後、確保したライブラリーを標的分子に結合させ、結合力の高いアプタマーを選択する選択過程を行う。標的分子がタンパク質の場合は、通常はストレプトアビジンビーズを用いてタンパク質に標識されたビオチンをプルダウン（Pull down）する。標的タンパク質と修飾核酸ライブラリーの結合を誘導し、その後バッファーで洗浄して標的タンパク質に結合していない修飾核酸ライブラリーを除去する。
【0022】
プレート（Plate）の場合も、同様に核酸ライブラリーと標的タンパク質の結合を誘導し、その後バッファーで洗浄して標的タンパク質に結合していない核酸を除去する。前記方法により、リガンドに対して親和性を有するアプタマーが得られる。通常、５～１５回の選択－増幅過程を繰り返せば、高い親和性を有するアプタマーが得られる。選択過程の終了後に、増幅した核酸をクローニングし、次いで個々のクローンにおいて配列分析によりその配列を確認し、アプタマーを合成して標的分子との親和性及び結合力を測定する。
【0023】
本発明における「標的分子」とは、本発明のアプタマーにより検出することのできる物質を意味する。具体的には、前記標的分子は、分離された試料中に存在するものであり、捕獲アプタマーが結合するタンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、補因子（cofactor）、薬物、染料、成長因子及び規制物質（controlled substance）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。本発明の目的上、前記標的分子は、トランスフェリン受容体タンパク質であってもよい。
【0024】
本発明のアプタマーは、その５’末端及び３’末端から選択される少なくとも１つに１～３０個のポリヌクレオチドをさらに含むものであってもよい。
【0025】
前記アプタマーは、その５’末端及び３’末端から選択される少なくとも１つに前述したポリヌクレオチドをさらに含み、３０～１５０個のポリヌクレオチドを含むものであってもよい。
【0026】
本発明のアプタマーは、配列番号１～４のポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、又はそれと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むものであってもよい。また、そのような相同性もしくは同一性を有して前記アプタマーに相当する効能を示す塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドも本発明のアプタマーに含まれることは言うまでもない。
【0027】
本発明における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
【0028】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。
【0029】
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0030】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
【0031】
また、任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１１、１２）で決定されてもよい。
【0032】
前記アプタマーは、そのポリヌクレオチド配列を形成する少なくとも１つのヌクレオチドに下記のものから選択される少なくとも１つの改変（modification）を含んでもよい。
【0033】
ｉ）少なくとも１つのヌクレオチド中のＴ塩基の５位の炭素がベンジル基、ナフチル基、２－ナフチル基、ピロールベンジル基及びトリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つに置換される。
【0034】
ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチド中の２位の炭素位置において、－ＯＨ基がデオキシ（deoxy）、メトキシ（methoxy）、アミノ（amino）及びフッ素（Ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つに置換される。
【0035】
ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドがメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid）、ＰＮＡ（Peptide Nucleic Acid）及びＨＮＡ（Hexitol Nucleic acid）からなる群から選択される少なくとも１つに置換される。
【0036】
例えば、前述したベンジル基への置換は、Ｂｎ－ｄＵ（5'-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine）への置換であるが、これに限定されるものではなく、前記Ｂｎ－ｄＵは化学式１で表されるものである。
【0037】
【化1】
【0038】
例えば、前述したナフチル基への置換は、ＮａｐｄＵ（5-(N-1-naphthylmethylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine）への置換であるが、これに限定されるものではない。
【0039】
例えば、前述した２－ナフチル基への置換は、２ＮａｐｄＵ（5-(N-(2-naphthylmethyl)carboxyamide)-2'-deoxyuridine）への置換であるが、これに限定されるものではない。
【0040】
前記ＮａｐｄＵは化学式２で表されるものであり、前記２ＮａｐｄＵは化学式３で表されるものである。
【0041】
【化2】
【0042】
【化3】
【0043】
本発明において、前述した改変を含むアプタマーは、例えば配列番号５～４９のポリヌクレオチド配列からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列、又はそれと相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド配列を含むものであるが、これらに限定されるものではなく、以下では、「化学的に最適化されたアプタマー」、「ＴｆＲコンビ（combi）アプタマー」などともいう。
【0044】
本発明のアプタマーは、配列中のＴ塩基の５位の炭素が特定の官能基に置換され、かつ／又はＡ、Ｕ、Ｇ及びＣから選択されるいずれかの塩基の２位の炭素がメトキシ基に置換されて改変されることにより、改変されていない場合と比較して、トランスフェリン受容体タンパク質に対する結合力が著しく高くなる。
【0045】
また、本発明のアプタマーは、種間の交差反応を示す。
【0046】
本発明の一実施例において、本発明のＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を調べたところ、ヒト及びマウストランスフェリン受容体タンパク質の両方に対して結合力が優れることが確認された（図１）。
【0047】
本発明の他の実施例において、化学的に最適化されていないＴｆＲアプタマー（配列番号１）に比べて、化学的に最適化されたＴｆＲアプタマー（配列番号４６～４９）は、トランスフェリン受容体タンパク質結合力が向上することが確認された（図１３）。
【0048】
【0049】
本発明のアプタマーは、細胞内在化（receptor-mediated endocytosis）に優れるものであってもよい。
【0050】
本発明の一実施例において、ＴｆＲアプタマーの細胞内在化を調べたところ、ヒト及びマウス細胞の両方で内在化を示すことが確認された（図２～４）。
【0051】
本発明の他の実施例において、タンパク質又は抗体に結合したＴｆＲアプタマーの細胞内在化を調べたところ、ＧＦＰに結合したＴｆＲアプタマーは、ヒト及びマウス細胞株の両方で内在化を示し（図５）、セツキシマブ（Cetuximab）又はリツキシマブ（Rituximab）に結合したＴｆＲアプタマーは、ヒト、サル及びマウス細胞株の全てで内在化を示すことが確認された（図６）。
【0052】
また、本発明のさらに他の実施例において、化学的に最適化されていないＴｆＲアプタマーと化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーは、ヒト、マウス及びサル細胞株での内在化に差がないことが確認された（図１４）。
【0053】
本発明のアプタマーは、血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）に浸透するものであってもよい。
【0054】
また、本発明のアプタマーは、ＢＢＢに浸透して抗体、タンパク質、薬物などの治療剤を送達するものであってもよい。
【0055】
本発明の一実施例において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ脳微小血管構造を作製し、ＴｆＲアプタマーが前記構造を通過するか否かを調べたところ、ＴｆＲアプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ脳微小血管構造を通過することが確認された（図８）。
【0056】
本発明の他の実施例において、ＴｆＲアプタマー及び抗体に結合したＴｆＲアプタマーにより脳に送達された抗体の分布を調べるために、ｉｎ ｖｉｖｏで脳分布定量実験を行ったところ、脳領域で注入量（injected dose, ID）に対して０．４２％のＴｆＲアプタマー（図９）、０．６１～０．６７％（注入２時間後）及び０．８３～１．０１％（注入２４時間後）のセツキシマブ結合アプタマー（図１０）が確認され、抗体に結合したＴｆＲアプタマーのほとんどが脳実質に存在し、ＴｆＲアプタマーが抗体と結合するとＢＢＢ浸透が大きく改善されることが確認された。また、リツキシマブに結合したＴｆＲアプタマーにおいても、アプタマーが抗体を脳全体、特に脳実質に送達することが確認され（図１１）、抗体に結合したＴｆＲアプタマーによる循環網状赤血球の減少はないことが確認された（図１２）。
【0057】
さらに、本発明のさらに他の実施例において、リツキシマブに結合したＴｆＲ ｃｏｍｂｉ １アプタマーは、ヒト細胞の細胞膜を介して抗体を効率的に輸送することが確認された（図１６）。
【0058】
よって、本発明のＴｆＲアプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、ＢＢＢに浸透して脳実質に抗体、タンパク質、薬物などの治療剤を送達できることが分かる。
【0059】
本発明のアプタマーは、血清安定性が向上するものであってもよい。
【0060】
本発明の一実施例において、化学的に最適化されていないＴｆＲアプタマーに比べて、化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーは、血清中の半減期が延長されて血清安定性が向上することが確認された（図１５）。
【0061】
前記アプタマーは、そのポリヌクレオチド配列、その５’末端及び３’末端から選択される少なくとも１つに、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール）、ｉｄＴ（inverted deoxythymidin, 反転デオキシチミジン）、ビオチン、蛍光物質、アミンリンカー、チオールリンカー、コレステロール及び脂肪酸からなる群から選択される少なくとも１つが接合したものであるが、これらに限定されるものではない。
【0062】
本発明の他の態様は、本発明のアプタマーを有効成分として含む、神経系疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【0063】
本発明における「神経系疾患（nervous system diseases）」とは、神経系、すなわち脳、脊髄、神経などに問題が生じて発生する疾患を意味し、一部の精神病もこれに含まれる。本発明の目的上、前記神経系疾患は、中枢神経系疾患であってもよい。
【0064】
本発明における「中枢神経系疾患（central nervous system diseases, CNS diseases）」とは、脳及び脊髄に生じる疾患を意味する。
【0065】
前記中枢神経系疾患は、例えば脳癌、脳感染、認知症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、多発性硬化症、てんかん、中風、脳卒中、虚血性脳疾患、記憶力減退、外傷性中枢神経系疾患、脊髄損傷疾患、行動障害、発達障害、精神遅滞、ハンター病、 筋萎縮性側索硬化症 (ＡＬＳ)、ダウン症候群、統合失調症などであるが、これらに限定されるものではない。
【0066】
本発明のアプタマーは、タンパク質、抗体、核酸及び低分子化合物からなる群から選択される少なくとも１つがさらに結合したものであってもよい。
【0067】
前記タンパク質、抗体、核酸及び低分子化合物は、例えば抗癌剤、抗ウイルス剤、抗生剤などであるが、これらに限定されるものではない。
【0068】
本発明における「抗癌剤」には、肺癌（例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、悪性中皮腫）、中皮腫、膵臓癌（例えば、膵管癌、膵内分泌腫瘍）、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、胃癌（例えば、乳頭腺癌、粘液性腺癌、腺扁平上皮癌）、十二指腸癌、小腸癌、大腸癌（例えば、結腸癌、直腸癌、肛門癌、家族性大腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、消化管間質腫瘍）、乳癌（例えば、浸潤性乳管癌，非浸潤性乳管癌，炎症性乳癌）、卵巣癌（例えば、上皮性卵巣癌、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、精巣腫瘍、前立腺癌（例えば、ホルモン依存性前立腺癌、ホルモン非依存性前立腺癌）、甲状腺癌（例えば、甲状腺髄様癌）、腎臓癌（例えば、腎細胞癌、腎盂尿管移行上皮癌）、子宮癌（例えば、子宮頸癌、子宮体癌、子宮肉腫）、脳癌又は脳腫瘍（例えば、髄芽腫、神経膠腫、松果体星細胞腫瘍、毛様細胞性星細胞腫、びまん性星細胞腫、退形成性星細胞腫、下垂体腺腫）、網膜芽細胞腫、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、悪性黒色腫）、肉腫（例えば、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、軟部肉腫）、悪性骨腫瘍、膀胱癌、血液癌（例えば、多発性骨髄腫、白血病、悪性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患）、原発不明癌など、末梢神経障害を副作用として引き起こす癌の予防剤及び治療剤が含まれる。前記抗癌剤の例としては、セツキシマブ（Cetuximab）（アービタックス）、リツキシマブ（Rituximab）（リツキサン）、アテゾリズマブ（Atezolizumab）（テセントリク）、レナリドミド（lenalidomide）（レブラミド）、トレオスルファン（Treosulfan）（トレオスルファン注）、メシル酸イマチニブ（Imatinib mesylate）（グリベック）、デキサメタゾン（Dexamethasone）（デキサメタゾン注）、ゲムシタビン（Gemcitabine）（ゲムシタビン注）、カルボプラチン（Carboplatin）（パラプラチン）、シスプラチン（Cisplatin）（プラチノール，プラチノール－ＡＱ）、クリゾチニブ（Crizotinib）（ザーコリ）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）（シトキサン，ネオサール）、ドセタキセル（Docetaxel）（タキソテール）、ドキソルビシン（Doxorubicin）（アドリアマイシン）、エルロチニブ（Erlotinib）（タルセバ）、エトポシド（Etoposide）（ベプシド）、フルオロウラシル（5-fluorouracil, 5-FU）、イリノテカン（irinotecan）（カンプトサール）、リポソーマルドキソルビシン（ドキシル）、メトトレキサート（Methotrexate）（フォレックス，メキセート，アメトプテリン）、パクリタキセル（Paclitaxel）（タキソール，アブラキサン）、ソラフェニブ（Sorafenib）（ネクサバール）、スニチニブ（Sunitinib）（スーテント）、トポテカン（Topotecan）（ハイカムチン）、トラベクテジン（Trabectedin）（ヨンデリス）、ビンクリスチン（Vincristine）（オンコビン，ビンカサールＰＦＳ）、ビンブラスチン（Vinbrastine）（ベルバン）などが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、公知の抗癌剤であればいかなるものを用いてもよい。具体的には、前記抗癌剤は、レナリドミド、トレオスルファン、メシル酸イマチニブ及びデキサメタゾンからなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。
【0069】
本発明の薬学組成物は、神経系疾患の「予防」（prevention）及び／又は「治療」（treatment）の用途を有する。予防的用途において、本発明の薬学組成物は、本発明に記載された疾患、障害又は状態を有するか、発症するリスクのある個体に投与するもの、すなわち神経系疾患を発症するリスクのある個体に投与するものである。治療的用途において、本発明の薬学組成物は、本発明に記載された障害を既に発症している患者などの個体に、本発明に記載された疾病、障害又は状態の症状を治療するか、少なくとも部分的に停止させるために、十分な量で投与するものである。このような使用に効果的な量は、疾患、障害又は状態の深刻度及び経過、以前の治療、個体の健康状態や薬物に対する感受性、並びに医師又は獣医師の判断により決定される。
【0070】
本発明の薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常用いられる適切な担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。ここで、前記組成物に含まれる有効成分の含有量は、特にこれらに限定されるものではないが、組成物の総重量に対して０．０００１重量％～１０重量％、具体的には０．００１重量％～１重量％であってもよい。
【0071】
前記薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有し、経口又は非経口の様々な剤形である。製剤化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口用固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、これらの固形製剤は、少なくとも１つの化合物に少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース（sucrose）又はラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤も用いられる。経口用液体製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが挙げられ、通常用いられる通常の希釈剤である水、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられる。非経口用製剤としては、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が挙げられる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。
【0072】
本発明の組成物は、個体に薬学的に有効な量で投与してもよい。
【0073】
本発明における「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定される。本発明の組成物は、単独で又は他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次又は同時に投与してもよい。また、単一又は多重投与してもよい。前記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大限の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定される。本発明の組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾患の程度、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なる。投与は、１日１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記組成物は、神経系疾患の予防又は治療を目的とする個体であれば、特に限定されるものではなく、いかなる個体にも適用することができる。投与方法は、当該技術分野の通常の方法であればいかなるものでもよい。例えば、経口、直腸、又は静脈、筋肉、皮下、子宮内、硬膜又は脳血管内注射により投与してもよい。
【0074】
本発明の薬学組成物は、神経系疾患が発症して進行した個体や、発症する可能性の高い個体に投与すると、神経系疾患の発生を防止したり、発生の程度を緩和することができる。
【0075】
本発明の薬学組成物において、有効成分であるアプタマー、又はタンパク質、抗体、核酸及び低分子化合物からなる群から選択される少なくとも１つが結合したアプタマーは、薬学組成物中に０．０００１～１０重量％、具体的には０．００１～１重量％含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0076】
本発明のさらに他の態様は、本発明のアプタマーを含む薬物担体を提供する。
【0077】
ここで用いられる用語については、前述した通りである。
【0078】
前記薬物担体は、タンパク質、抗体、核酸及び低分子化合物からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0079】
前記タンパク質、抗体、核酸及び低分子化合物としては、例えば抗癌剤、抗ウイルス剤、抗生剤などが挙げられ、それらについては前述した通りである。
【0080】
本発明のさらに他の態様は、薬学組成物又は薬物担体を個体に投与するステップを含む、神経系疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0081】
ここで用いられる用語については、前述した通りである。
【0082】
本発明における「個体」とは、神経系疾患が発症したか、発症するリスクのあるあらゆる動物を意味し、本発明の薬学組成物又は薬物担体を神経系疾患の疑いのある個体に投与することにより、個体を効率的に治療することができる。
【0083】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で神経系疾患の疑いのある個体に本発明の薬学組成物又は薬物担体を導入することを意味し、投与経路は標的組織に送達できるものであれば経口又は非経口の様々な経路で投与することができる。
【0084】
本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与してもよい。前記薬学的に有効な量については、前述した通りである。
【0085】
本発明の薬学組成物又は薬物担体は、神経系疾患の予防又は治療を目的とする個体であれば、特に限定されるものではなく、いかなる個体にも適用することができる。例えば、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどの非ヒト動物、鳥類、魚類などいかなる個体にも適用することができる。前記薬学組成物又は薬物担体は、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内投与してもよく、局部的治療のために、必要に応じて病変内投与をはじめとする好ましい方法により投与してもよい。本発明の前記薬学組成物又は薬物担体の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、疾患の程度、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者により適宜選択される。例えば、経口、直腸、又は静脈、筋肉、皮下、子宮内、硬膜もしくは脳血管内注射により投与するが、これらに限定されるものではない。
【0086】
本発明の薬学組成物又は薬物担体の好適な総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、一般に０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には０．０５～２００ｍｇ／ｋｇ、より具体的には０．１～１００ｍｇ／ｋｇの量を１日１回又は数回に分けて投与する。
【実施例】
【0087】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらに限定されるものではない。
【0088】
実施例１
トランスフェリン受容体（Transferrin receptor, TfR）アプタマーの作製及びそのトランスフェリン受容体タンパク質結合力及び細胞結合力（cell binding）の確認
１－１．ＴｆＲアプタマーの作製
ＴｆＲアプタマーは、アプタマーを開発する一般的プロセスであるＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）によりヒトトランスフェリン受容体タンパク質に結合するアプタマーを開発し、選択された配列に対する化学的な合成により配列番号１～４のように作製した（表１）。作製したアプタマーの長さはそれぞれ４１ｍｅｒ、３４ｍｅｒ、３２ｍｅｒ、２６ｍｅｒであり、各アプタマーの大きさは＜１５ｋＤａである。
トランスフェリン受容体（Transferrin receptor, TfR）アプタマーの作製及びそのトランスフェリン受容体タンパク質結合力及び細胞結合力（cell binding）の確認
１－１．ＴｆＲアプタマーの作製
ＴｆＲアプタマーは、アプタマーを開発する一般的プロセスであるＳＥＬＥＸ（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment）によりヒトトランスフェリン受容体タンパク質に結合するアプタマーを開発し、選択された配列に対する化学的な合成により配列番号１～４のように作製した（表１）。作製したアプタマーの長さはそれぞれ４１ｍｅｒ、３４ｍｅｒ、３２ｍｅｒ、２６ｍｅｒであり、各アプタマーの大きさは＜１５ｋＤａである。
【0089】
【表1】
【0090】
前記Ｂは、Ｂｎ－ｄＵ（5'-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine）に置換された塩基を意味する。
【0091】
実施例２
ＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力及び細胞結合力（cell binding）の確認
２－１．ＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力
作製したＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認するために、各アプタマーを１×ＳＢ１８バッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid），１０５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ＫＣｌ，０．０５％［ｖ／ｖ］ｔｗｅｅｎ－２０）に入れ、９５℃、７０℃、４８℃、３７℃でそれぞれ５分間反応させた。１×ＳＢ１８バッファーを用いて、ヒト又はマウストランスフェリン受容体タンパク質を１００ｎＭから４．６４倍ずつ７ポイントで順次希釈し、その後アプタマー（配列番号１～４）を３０ｕｌずつ添加し、３７℃で３０分間反応させた。Ｄｙｎａｂｅａｄ ＴＡＬＯＮ ５．５ｕｌをアプタマーとタンパク質の結合体に添加し、常温で５分間反応させた。予め１×ＳＢ１８バッファー３０ｕｌで濡らしておいたＤｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートにアプタマーとタンパク質の結合体を入れて真空をかけ、その後１×ＳＢ１８バッファー１００ｕｌを入れて再び真空をかけ、洗浄した。その後、２ｍＭ ＮａＯＨ溶液を入れて常温で５分間反応させ、次いで溶離（elution）して８ｍＭ ＨＣｌ溶液で中和し、アプタマーとタンパク質の結合体をｑＰＣＲにより増幅した。ｑＰＣＲは、０．２ｕＭ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５０）及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５１）、０．２ｕＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０２５Ｕ／ｕｌ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡタンパク質の結合体を全体積が２０ｕｌになるように混合し、次いで９６℃で１５秒間、５５℃で１０秒間、７０℃で３０分間の条件で１回、そして９６℃で１５秒間、５５℃で１０秒間、７０℃で１分間の条件で４０回繰り返して増幅するものとした。Ｃｔ値を標準として正規化し、その後ＳｉｇｍａＰｌｏｔでＫｄを計算した。
ＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力及び細胞結合力（cell binding）の確認
２－１．ＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力
作製したＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認するために、各アプタマーを１×ＳＢ１８バッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid），１０５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，５ｍＭ ＫＣｌ，０．０５％［ｖ／ｖ］ｔｗｅｅｎ－２０）に入れ、９５℃、７０℃、４８℃、３７℃でそれぞれ５分間反応させた。１×ＳＢ１８バッファーを用いて、ヒト又はマウストランスフェリン受容体タンパク質を１００ｎＭから４．６４倍ずつ７ポイントで順次希釈し、その後アプタマー（配列番号１～４）を３０ｕｌずつ添加し、３７℃で３０分間反応させた。Ｄｙｎａｂｅａｄ ＴＡＬＯＮ ５．５ｕｌをアプタマーとタンパク質の結合体に添加し、常温で５分間反応させた。予め１×ＳＢ１８バッファー３０ｕｌで濡らしておいたＤｕｒａｐｏｒｅフィルタープレートにアプタマーとタンパク質の結合体を入れて真空をかけ、その後１×ＳＢ１８バッファー１００ｕｌを入れて再び真空をかけ、洗浄した。その後、２ｍＭ ＮａＯＨ溶液を入れて常温で５分間反応させ、次いで溶離（elution）して８ｍＭ ＨＣｌ溶液で中和し、アプタマーとタンパク質の結合体をｑＰＣＲにより増幅した。ｑＰＣＲは、０．２ｕＭ ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５０）及びｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号５１）、０．２ｕＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０２５Ｕ／ｕｌ ＫＯＤ ＸＬ ＤＮＡポリメラーゼとＤＮＡタンパク質の結合体を全体積が２０ｕｌになるように混合し、次いで９６℃で１５秒間、５５℃で１０秒間、７０℃で３０分間の条件で１回、そして９６℃で１５秒間、５５℃で１０秒間、７０℃で１分間の条件で４０回繰り返して増幅するものとした。Ｃｔ値を標準として正規化し、その後ＳｉｇｍａＰｌｏｔでＫｄを計算した。
【0092】
その結果、図１のように、配列の長さが短いアプタマーがヒト及びマウストランスフェリン受容体タンパク質に対する結合力に優れることが確認された。
【0093】
２－２．ＴｆＲアプタマーの細胞結合力
作製したアプタマーの細胞結合力を確認するために、カバーガラスを火で消毒し、その後６ウェルの底面に置き、ヒトＨｅｐＧ２細胞又はマウスｂＥＮＤ．３細胞を１×１０6／ｗｅｌｌでシーディング（seeding）して培養した。細胞が底面に７０％程度充填されたら培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。細胞をＫＲＰＨバッファー２ｍｌで処理した。９５℃で５分間加熱し、次いで室温で１５分間冷却したアプタマー（配列番号１～４）２５ｎＭで細胞を処理し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。４時間後に、１×ＰＢＳを入れて常温で５分経過後に１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）２ｍｌで４℃にて１５分間処理して固定した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、その後１×ＰＢＳを入れて常温で５分間放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返し、マウンティング溶液（mounting solution）で染色してシール（sealing）した。これを光を遮断した箱に入れて冷蔵保管し、翌日共焦点（confocal）装置（LSM800）で測定した。
作製したアプタマーの細胞結合力を確認するために、カバーガラスを火で消毒し、その後６ウェルの底面に置き、ヒトＨｅｐＧ２細胞又はマウスｂＥＮＤ．３細胞を１×１０6／ｗｅｌｌでシーディング（seeding）して培養した。細胞が底面に７０％程度充填されたら培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。細胞をＫＲＰＨバッファー２ｍｌで処理した。９５℃で５分間加熱し、次いで室温で１５分間冷却したアプタマー（配列番号１～４）２５ｎＭで細胞を処理し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。４時間後に、１×ＰＢＳを入れて常温で５分経過後に１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。４％パラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）２ｍｌで４℃にて１５分間処理して固定した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、その後１×ＰＢＳを入れて常温で５分間放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返し、マウンティング溶液（mounting solution）で染色してシール（sealing）した。これを光を遮断した箱に入れて冷蔵保管し、翌日共焦点（confocal）装置（LSM800）で測定した。
【0094】
その結果、図２のように、配列の長さが短いアプタマーがヒト及びマウス細胞内在化を示すことが確認された。
【0095】
実施例３
ＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞結合力及び内在化（receptor-mediated endocytosis）の確認
３－１．ＴｆＲアプタマーの細胞結合力及び内在化
ＴｆＲアプタマーの細胞結合力を確認するために、ヒトＨｅｐＧ２細胞又はマウス３Ｔ３－Ｌ１細胞２×１０6／ｍｌを１００ｍｍ2ディッシュに入れ、３７℃、５％ＣＯ2の条件で２４時間培養した。培養した細胞を１×ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）で洗浄した。１×ＰＢＳを除去し、その後成長培地を入れ、細胞をスクレーパー（Scraper）で掻き取ってＦＡＣｓチューブに入れ、次いで２０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して上清を除去した。ＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）の５’末端にＣｙ５を標識したアプタマー（Ｃｙ５－ＴｆＲアプタマー）を９５℃で５分間加熱し、次いで室温で１５分間冷却し、その後ＫＲＰＨバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＣａＣｌ2，１３６ｍＭ ＮａＣｌ，４．７ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４）を用いて所望の濃度に希釈し、４℃の光遮断条件で細胞を処理した。３０分後に、１×ＰＢＳを２ｍｌずつ入れてピペッティング（pipetting）し、次いで遠心分離して上清を除去する過程を３回繰り返した。上清を除去し、その後１×ＰＢＳを入れて新たなｓｔｒａｉｎｅｒ ｃａｐ ＦＡＣｓチューブに移し、次いでフローサイトメトリー（Flow cytometry）装置（BD FACS Calibur）で測定した。
ＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞結合力及び内在化（receptor-mediated endocytosis）の確認
３－１．ＴｆＲアプタマーの細胞結合力及び内在化
ＴｆＲアプタマーの細胞結合力を確認するために、ヒトＨｅｐＧ２細胞又はマウス３Ｔ３－Ｌ１細胞２×１０6／ｍｌを１００ｍｍ2ディッシュに入れ、３７℃、５％ＣＯ2の条件で２４時間培養した。培養した細胞を１×ＰＢＳ（Phosphate-buffered saline）で洗浄した。１×ＰＢＳを除去し、その後成長培地を入れ、細胞をスクレーパー（Scraper）で掻き取ってＦＡＣｓチューブに入れ、次いで２０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心分離して上清を除去した。ＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）の５’末端にＣｙ５を標識したアプタマー（Ｃｙ５－ＴｆＲアプタマー）を９５℃で５分間加熱し、次いで室温で１５分間冷却し、その後ＫＲＰＨバッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4，１ｍＭ ＭｇＳＯ4，１ｍＭ ＣａＣｌ2，１３６ｍＭ ＮａＣｌ，４．７ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ７．４）を用いて所望の濃度に希釈し、４℃の光遮断条件で細胞を処理した。３０分後に、１×ＰＢＳを２ｍｌずつ入れてピペッティング（pipetting）し、次いで遠心分離して上清を除去する過程を３回繰り返した。上清を除去し、その後１×ＰＢＳを入れて新たなｓｔｒａｉｎｅｒ ｃａｐ ＦＡＣｓチューブに移し、次いでフローサイトメトリー（Flow cytometry）装置（BD FACS Calibur）で測定した。
【0096】
次に、実施例２－２と同様に、ヒトＨｅｐＧ２細胞、マウスｂＥＮＤ．３細胞を用いて、細胞内在化を確認した。
【0097】
【0098】
３－２．タンパク質又は抗体に結合したＴｆＲアプタマーの内在化
ヒトＨｅｐＧ２細胞、マウスｂＥＮＤ．３細胞又はサルＣｏｓ７細胞を実施例３－１と同様に培養し、１×ＰＢＳで洗浄した。細胞を培養している間に、ＧＦＰ（green fluorescence protein）に結合したＴｆＲアプタマー、表皮成長因子受容体に対する単クローン抗体である抑制剤セツキシマブ（Cetuximab）に結合したＴｆＲアプタマー、及びＢ細胞表面抗原ＣＤ２０に対する単クローン抗体であるリツキシマブ（Rituximab）に結合したＴｆＲアプタマーを１×ＳＢ１８バッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１０５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．０５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ－２０，０．１ｍｇ ｍＬ－１ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ｐＨ８．０）で所望のストック濃度に希釈し、その後常温で１時間放置した。前述したタンパク質又は抗体に結合したＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）をＫＲＰＨバッファーに５０ｎＭになるように混合し、その後２ｍｌずつ細胞を処理し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で４時間培養した。４時間後に、ＫＲＰＨバッファーを除去し、その後１×ＰＢＳ ２ｍｌを入れて常温で５分間放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。その後、４％パラホルムアルデヒド２ｍｌで４℃にて１５分間処理して固定した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、その後１×ＰＢＳ ２ｍｌを入れて常温で５分放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。透過化バッファー（Permeabilization buffer）（１×ＰＢ中に０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を入れて常温で１５分間放置し、透過化バッファーを除去し、その後１×ＰＢＳ ２ｍｌを入れて常温で５分間放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。
ヒトＨｅｐＧ２細胞、マウスｂＥＮＤ．３細胞又はサルＣｏｓ７細胞を実施例３－１と同様に培養し、１×ＰＢＳで洗浄した。細胞を培養している間に、ＧＦＰ（green fluorescence protein）に結合したＴｆＲアプタマー、表皮成長因子受容体に対する単クローン抗体である抑制剤セツキシマブ（Cetuximab）に結合したＴｆＲアプタマー、及びＢ細胞表面抗原ＣＤ２０に対する単クローン抗体であるリツキシマブ（Rituximab）に結合したＴｆＲアプタマーを１×ＳＢ１８バッファー（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１０５ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．０５％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ－２０，０．１ｍｇ ｍＬ－１ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，ｐＨ８．０）で所望のストック濃度に希釈し、その後常温で１時間放置した。前述したタンパク質又は抗体に結合したＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）をＫＲＰＨバッファーに５０ｎＭになるように混合し、その後２ｍｌずつ細胞を処理し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で４時間培養した。４時間後に、ＫＲＰＨバッファーを除去し、その後１×ＰＢＳ ２ｍｌを入れて常温で５分間放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。その後、４％パラホルムアルデヒド２ｍｌで４℃にて１５分間処理して固定した。４％パラホルムアルデヒドを除去し、その後１×ＰＢＳ ２ｍｌを入れて常温で５分放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。透過化バッファー（Permeabilization buffer）（１×ＰＢ中に０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）を入れて常温で１５分間放置し、透過化バッファーを除去し、その後１×ＰＢＳ ２ｍｌを入れて常温で５分間放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返した。
【0099】
その後、ブロッキング（Blocking）溶液（３％ＢＳＡ（bovine serum albumin）＋１×ＰＢＳ）を入れて３７℃、５％ＣＯ2の条件で２０分間インキュベートし、次いで１×ＰＢＳ ２ｍｌを入れて常温で５分間放置し、１×ＰＢＳを除去した。ヒト２次抗体－ＦＩＴＣ（Fluorescein isothiocyanate）（52230-0425）５μｇ／ｍｌを含むブロッキング溶液を６ウェルプレートに２ｍｌずつ入れ、３７℃、５％ＣＯ2の条件で１時間３０分間インキュベートした。２次抗体を除去し、その後１×ＰＢＳを２ｍｌずつ入れて常温で５分間放置し、次いで１×ＰＢＳを除去する過程を３回繰り返して洗浄した。これをマウンティング溶液で染色し、その後シールし、光を遮断した箱に入れて冷蔵保管し、翌日共焦点（confocal）装置（LSM800）で測定した。
【0100】
その結果、図５のように、ＧＦＰに結合したＴｆＲアプタマーがヒト及びマウス細胞株の両方で内在化を示し、図６のように、セツキシマブ又はリツキシマブに結合したＴｆＲアプタマーがヒト、サル及びマウス細胞株の全てで内在化を示すことが確認された。
【0101】
実施例４
ＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）浸透効果の確認
ＴｆＲアプタマーのＢＢＢ浸透効果を脳微小血管構造（Brain microvasculature model, 非特許文献１３）（図７）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。
ＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ血液脳関門（Blood-brain barrier, BBB）浸透効果の確認
ＴｆＲアプタマーのＢＢＢ浸透効果を脳微小血管構造（Brain microvasculature model, 非特許文献１３）（図７）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。
【0102】
具体的には、脳微小血管構造を作製するために、３Ｄプリントしたフレームの正方形開口部の内部表面と正方形カバーガラスを１％［ｖ／ｖ］ポリエチレンイミン（polyethyleneimine, PEI）で３０分間、０．１％［ｖ／ｖ］グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）で３０分間順次処理した。その後、グルタルアルデヒドでコーティングした表面を蒸留水で２回十分に洗浄した。微細針を３Ｄプリントフレームの円筒形マイクロホールに挿入して３Ｄプリントフレームを組み立て、その後予め混合しておいたコラーゲン溶液をマイクロニードルとグルタルアルデヒドコーティングしたカバーガラスを配置した箇所である四角形開口部が充填されるまで徐々に注入した。次に、上部を徐々に覆ってゲルを押し込んだ。ゲルの漏れを防止するために、３つの層を滅菌したステンレススチールネジで固定した。組み立てた装置内のコラーゲンは、ゲル化のために、ＣＯ2インキュベータに３７℃で３０分間放置した。ゲル化した後に微細針を除去し、ゲル化したコラーゲン内で中空管状の微小血管を生成した。ｂＥｎｄ．３細胞の接着を促進するために、コラーゲンマイクロチャネルの内部表面を２０ｕｇ／ｍｌのフィブロネクチン（fibronectin）で３０分間コーティングした。ｂＥｎｄ．３細胞をフィブロネクチンでコーティングしたコラーゲンマイクロチャネルにローディングし、装置をインキュベータに１０分間放置した。初期細胞接着領域を増加させるために、装置を迅速に反転してさらに１０分間培養し、細胞を培養している間に、３Ｄプリントしたフレームの２つのアダプターに別途に作製した一対の拡張された貯蔵所を連結した。約１．５ｍｌの培地を各貯蔵所に充填し、最大２１日の培養期間を通して毎日交換した。
【0103】
脳微小血管構造内の微小血管による内皮透過性を測定するために、Ｃｙ５－ＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）を用いた。コラーゲンマイクロチャネルにＣｙ５－ＴｆＲアプタマー溶液を充填した直後に、一時的な界面拡散のために、Ｆｌｏｗを中止した。初期の５分間は、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７００レーザスキャン共焦点顕微鏡を用いて、分子輸送の蛍光イメージを捕捉した。その後、イメージを色マッピングし、マイクロチャネル全体の平均蛍光強度値をカスタマイズ型ＭＡＴＬＡＢ（MathWorks）コードで分析した。
【0104】
その結果、図８のように、ＴｆＲアプタマーは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ脳微小血管構造を通過することが確認された。
【0105】
実施例５
ＴｆＲアプタマー及び抗体に結合したＴｆＲアプタマーの脳への抗体送達の確認
ＴｆＲアプタマー及び抗体に結合したＴｆＲアプタマーにより脳に送達された抗体の分布を確認するために、ｉｎ ｖｉｖｏで脳分布定量実験を行った。
ＴｆＲアプタマー及び抗体に結合したＴｆＲアプタマーの脳への抗体送達の確認
ＴｆＲアプタマー及び抗体に結合したＴｆＲアプタマーにより脳に送達された抗体の分布を確認するために、ｉｎ ｖｉｖｏで脳分布定量実験を行った。
【0106】
具体的には、Ｂａｌｂ／ｃマウスにＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）、セツキシマブ又はリツキシマブに結合したＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）をそれぞれ尾静脈に注入し、２時間又は２４時間後に屠殺し、血漿及び脳を得た。生理食塩水（physiological Buffer）を脳組織に対して３：１ｖ／ｗの割合で入れ、氷上で均質化（homogenize）した。均質化した組織の一部を分取（aliquot）して残し、それ以外の組織に同量の２６％［ｖ／ｖ］デキストラン（dextran）溶液を添加し（最終デキストラン濃度１３％）、再度氷上で均質化した。２つのマイクロチューブ（１．５ｍＬ）に均質化した組織を分注し、同量の２６％［ｖ／ｖ］デキストラン溶液を添加した。これを５，４００ｇ、４℃の条件で１５分間遠心分離し、上清（脳実質）とペレット（脳毛細血管）を分離した。均質化した組織、脳毛細血管、脳実質を１×ＰＢＳで洗浄し、１４，０００ｒｐｍ、４℃の条件で１０分間の遠心分離を３回繰り返した。各サンプルのペレット重量を測定し、次いで１×ＲＩＰＡバッファーを各重量に対して２．５：１ｖ／ｗの割合で入れて溶解した。４℃で約１時間インキュベートし、その後１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上清のみ採取して新たなチューブに移した。その後、組織溶解物のタンパク質濃度を測定した。
【0107】
その結果、脳領域で注入量（injected dose, ID）に対して０．４２％のＴｆＲアプタマー（図９）、０．６１～０．６７％（注入２時間後）及び０．８３～１．０１％（注入２４時間後）のセツキシマブ結合アプタマー（図１０）が確認され、抗体に結合したＴｆＲアプタマーのほとんどが実質に存在し、ＴｆＲアプタマーが抗体と結合するとＢＢＢ浸透が大きく改善されることが確認された。また、リツキシマブに結合したＴｆＲアプタマーにおいても、アプタマーが抗体を脳全体、特に脳実質に送達することが確認された（図１１）。
【0108】
実施例６
抗体に結合したＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ浸透の効果及び循環網状赤血球（circulating reticulocytes）に対する影響の確認
抗体に結合したＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ浸透の効果及び循環網状赤血球に対する影響を確認した。
抗体に結合したＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ浸透の効果及び循環網状赤血球（circulating reticulocytes）に対する影響の確認
抗体に結合したＴｆＲアプタマーのｉｎ ｖｉｖｏ ＢＢＢ浸透の効果及び循環網状赤血球に対する影響を確認した。
【0109】
具体的には、Ｂａｌｂ／ｃマウスにセツキシマブ、リツキシマブ、又はセツキシマブもしくはリツキシマブに結合したＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１，配列番号１）を８ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）、４０ｍｐｋで尾静脈に注入した。全血を採血し、その後ＥＤＴＡチューブに入れて氷上に放置した。ＢＤ－Ｒｅｔｉｃ－ＣｏｕｎｔTM（Ｃａ．３４９２０４）試薬１ｍｌと全血５μｌを混合し、その後光を遮断した状態で常温にて３０分間インキュベートした。Ｓｔｒａｉｎｅｒ ｃａｐ ＦＡＣｓチューブに移し、その後血液中の循環網状赤血球数をフローサイトメトリー装置で分析した。
【0110】
その結果、図１２のように、マウスにおいて、抗体に結合したＴｆＲアプタマーによる循環網状赤血球の減少はないことが確認された。
【0111】
実施例７
ＴｆＲアプタマーの化学的最適化
実施例１で作製したアプタマー（配列番号１）を化学的に最適化するために、各アプタマー配列中の塩基をメトキシ（methoxy）に改変した。それを表２～５に示す。表２～５において、前記Ｂは、Ｂｎ－ｄＵ（5'-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine）に置換された塩基を意味し、前記ＮMe（ここで、Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ及びＣから選択されるいずれか）は、ヌクレオチド中の２位の炭素位置において、－ＯＨ基がメトキシ（methoxy）に置換された塩基を意味する。
ＴｆＲアプタマーの化学的最適化
実施例１で作製したアプタマー（配列番号１）を化学的に最適化するために、各アプタマー配列中の塩基をメトキシ（methoxy）に改変した。それを表２～５に示す。表２～５において、前記Ｂは、Ｂｎ－ｄＵ（5'-(N-benzylcarboxyamide)-2'-deoxyuridine）に置換された塩基を意味し、前記ＮMe（ここで、Ｎは、Ａ、Ｕ、Ｇ及びＣから選択されるいずれか）は、ヌクレオチド中の２位の炭素位置において、－ＯＨ基がメトキシ（methoxy）に置換された塩基を意味する。
【0112】
【表2】
【0113】
【表3】
【0114】
【表4】
【0115】
【表5】
【0116】
その後、改変したＴｆＲアプタマーのマウストランスフェリン受容体タンパク質に対する結合力を実施例２－１と同様にそれぞれ測定した。その結果を表６～９に示す。
【0117】
【表6】
【0118】
【表7】
【0119】
【表8】
【0120】
【表9】
【0121】
表６～９のマウストランスフェリン受容体タンパク質に対する結合力の結果から、Ｋｄが減少に影響を与える部位を表１０及び表１１に示し、当該部分を除いた残りの部分において化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマー配列４種を表１２に示す。表１２の各配列は、５’末端にＣｙ５標識されており、３’末端にｉｄＴ結合されている。
【0122】
【表10】
【0123】
【表11】
【0124】
【表12】
【0125】
実施例８
化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力及び内在化の確認
８－１．化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力
実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマー配列４種（表１２）のトランスフェリン受容体タンパク質結合力を実施例２－１と同様に確認した。
化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力及び内在化の確認
８－１．化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力
実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマー配列４種（表１２）のトランスフェリン受容体タンパク質結合力を実施例２－１と同様に確認した。
【0126】
その結果、図１３のように、対照群である化学的に最適化されていないＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１）に比べて、化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーは、トランスフェリン受容体タンパク質結合力が向上することが確認された。
【0127】
８－２．化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーの内在化
ヒトＨｅｐＧ２細胞、マウスｂＥＮＤ．３細胞又はサルＣｏｓ７細胞を対象に、実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマー配列４種（表１２）の内在化を実施例２－２と同様に確認した。
ヒトＨｅｐＧ２細胞、マウスｂＥＮＤ．３細胞又はサルＣｏｓ７細胞を対象に、実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマー配列４種（表１２）の内在化を実施例２－２と同様に確認した。
【0128】
その結果、図１４のように、化学的に最適化されていないＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１）と化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーは、ヒト、マウス及びサル細胞株での内在化に差がないことが確認された。
【0129】
実施例９
化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーの血清安定性の確認
実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマーの血清安定性を確認した。
化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーの血清安定性の確認
実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマーの血清安定性を確認した。
【0130】
具体的には、１００％血清４５ｕｌを１０ｕＭの濃度のＴｆＲ ４１ｍｅｒ＿ｃｏｍｂｉ １（配列番号４６）アプタマー１０ｕｌで処理し、３７℃で０、４、２４、４８、７２時間培養した。培養終了後に、１０ｕＭの濃度の化学的に最適化されていない対照群としてＴｆＲアプタマー（ＴｆＲ－０１－０１－４１）５ｕｌで処理し、次いで１６５ｕｌの蒸留水で希釈した。サンプルに同じ体積のフェノール（phenol）：クロロホルム（chloroform）：イソアミルアルコール（isoamyl alcohol）２５：２４：１［ｖ／ｖ］を追加し、ボルテックスミキサーで２０秒間混合した。混合物を室温にて１６，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を新たなチューブに移した。上清にサンプルバッファー５個を追加し、９５℃で５分間加熱した。Ｕｒｅａ ＰＡＧＥにサンプルを追加し、２２０Ｖで２５分間電気泳動し、その後ＳＹＢＲゴールドでゲルを染色し、Ｇｅｌ ＤｏｃTM ＥＺシステム赤外線イメージングシステムでゲルイメージを分析した。
【0131】
その結果、図１５のように、対照群である化学的に最適化されていないＴｆＲアプタマーに比べて、化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーは、血清中の半減期が延長されて血清安定性が向上することが確認された。
【0132】
実施例１０
抗体に結合した、化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーの内在化の確認
実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマー（ＴｆＲ ４１ｍｅｒ＿ｃｏｍｂｉ １，配列番号４６）にリツキシマブを結合させ、その後内在化を実施例２－２と同様に確認した。
抗体に結合した、化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーの内在化の確認
実施例７で作製した、化学的に最適化されたＴｆＲコンビアプタマー（ＴｆＲ ４１ｍｅｒ＿ｃｏｍｂｉ １，配列番号４６）にリツキシマブを結合させ、その後内在化を実施例２－２と同様に確認した。
【0133】
その結果、図１６のように、化学的に最適化されたＴｆＲアプタマーは、抗体（リツキシマブ）と結合すると、ヒト細胞の細胞膜を介して抗体を効率的に輸送することが確認された。
【0134】
実施例１１
各ｐＨ条件におけるＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力
実施例７で作製したＴｆＲコンビアプタマー（ＴｆＲ ４１ｍｅｒ＿ｃｏｍｂｉ １，配列番号４６）のトランスフェリン受容体タンパク質結合力がｐＨ条件により変化するか否かを確認するために、ｐＨ７．５、６．５、５．５の１×ＳＢ１８バッファーを用いて、実施例２－１と同様に各ｐＨにおけるＴｆＲコンビアプタマー（ＴｆＲ ４１ｍｅｒ＿ｃｏｍｂｉ １，配列番号４６）のトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認した。
各ｐＨ条件におけるＴｆＲアプタマーのトランスフェリン受容体タンパク質結合力
実施例７で作製したＴｆＲコンビアプタマー（ＴｆＲ ４１ｍｅｒ＿ｃｏｍｂｉ １，配列番号４６）のトランスフェリン受容体タンパク質結合力がｐＨ条件により変化するか否かを確認するために、ｐＨ７．５、６．５、５．５の１×ＳＢ１８バッファーを用いて、実施例２－１と同様に各ｐＨにおけるＴｆＲコンビアプタマー（ＴｆＲ ４１ｍｅｒ＿ｃｏｍｂｉ １，配列番号４６）のトランスフェリン受容体タンパク質結合力を確認した。
【0135】
その結果、図１７のように、ＴｆＲコンビアプタマーは、エンドソーム（endosome）ｐＨ、すなわちｐＨ６．５～５．５の条件でトランスフェリン受容体タンパク質に対する結合力を失うことが確認された。
【0136】
前記実施例の結果から、本発明のＴｆＲアプタマーは、トランスフェリン受容体タンパク質のみ選択的にターゲティングし、受容体を介した細胞内在化によりＢＢＢを迅速に通過し、単純な化学的結合によりタンパク質、抗体、核酸、低分子化合物などの様々な治療剤を効率的に輸送及び送達することができ、種間のトランスフェリン受容体に交差反応を示し、化学的修飾が容易であるので、神経系疾患、特に脳及び中枢神経系疾患における薬物担体として適用することができる。
【0137】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図1a】
【図1b】
【図2】
【図3a】
【図3b】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13a】
【図13b】
【図14a】
【図14b】
【図14c】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】