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特表2023-532046組換え修飾線維芽細胞増殖因子およびそれを使用した治療
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-26
(54)【発明の名称】組換え修飾線維芽細胞増殖因子およびそれを使用した治療
(51)【国際特許分類】
A61K 38/18 20060101AFI20230719BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230719BHJP
C07K 14/50 20060101ALI20230719BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230719BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230719BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20230719BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20230719BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230719BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230719BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230719BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20230719BHJP
【ＦＩ】
A61K38/18
C12P21/02 C ZNA
C12P21/02 H
C07K14/50
C12N15/12
C12N15/63 Z
A61K47/12
A61K47/22
A61K47/26
A61K9/08
A61P27/02
A61K47/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580315
(86)(22)【出願日】2021-06-25
(85)【翻訳文提出日】2023-02-22
(86)【国際出願番号】 US2021039139
(87)【国際公開番号】W WO2021263134
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】63/044,980
(32)【優先日】2020-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．パイレックス
(71)【出願人】
【識別番号】519393956
【氏名又は名称】トレフォイル セラピューティクス，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】エヴェレス，デイヴィッド
【テーマコード（参考）】
4B064
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG13
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064DA01
4C076AA11
4C076BB24
4C076CC10
4C076DD09E
4C076DD09F
4C076DD23
4C076DD24
4C076DD26
4C076DD38
4C076DD38D
4C076DD43
4C076DD60
4C076FF11
4C076FF14
4C076FF15
4C076FF16
4C076FF63
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084DB54
4C084MA05
4C084MA17
4C084MA58
4C084NA03
4C084ZA33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045EA28
4H045FA74
4H045GA21
(57)【要約】
修飾線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）の好適な製剤、ならびに眼における送達のために、ポリペプチド、医薬組成物およびかかる修飾ＦＧＦポリペプチドを含む薬剤を作製する方法、ならびにＦＧＦの投与により恩恵を受ける状態を治療または予防するために、かかる修飾ＦＧＦポリペプチドを使用する方法が本明細書に記載される。
【選択図】図６
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬製剤であって、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド、
約１ｍＭ～約２０ｍＭ濃度のクエン酸塩またはヒスチジン、
約０．０１％～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の界面活性剤、および
約１％～約１０％（ｗ／ｖ）または約５０ｍＭ～約２００ｍＭ濃度の浸透圧調整剤、を含み、
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のＶａｌのアミノ酸残基を含む、医薬製剤。
【請求項2】
約１ｍＭまたは約１０ｍＭ濃度のヒスチジンを含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項3】
前記界面活性剤の濃度が約０．１％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の医薬製剤。
【請求項4】
前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項5】
前記ポリソルベートがＰＳ－２０またはＰＳ－８０である、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項6】
前記ポリソルベートがＰＳ－８０である、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項7】
前記浸透圧調整剤がソルビトールであり、前記医薬製剤が約５％（ｗ／ｖ）の濃度のソルビトールを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項8】
前記医薬製剤のｐＨが約４．５～約６．５である、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項9】
前記製剤のｐＨが約５．８である、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項10】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度が約０．０００５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬである、請求項１～９のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項11】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度が約１００μｇ／ｍＬである、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項12】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、（ｉ）外観検査による目に見える微粒子の欠如、および（ｉｉ）ＳＥ－ＨＰＬＣアッセイでの高分子量種についての５％未満のピーク面積、のうちいずれか一つにより測定されるように、室温で保存した場合、少なくとも２８日間は安定している、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項13】
室温で保存した場合、前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが少なくとも５０日間は安定している、請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項14】
前記製剤を室温で保存した場合、前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが少なくとも５９日間は安定している、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項15】
前記製剤が局所適用、点眼薬としての適用、眼内注射または眼周囲注射のために好適である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項16】
前記製剤が眼内送達用の注射用製剤である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項17】
前記製剤が硝子体内送達用の注射用製剤である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項18】
バルク原薬製剤であって、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド；少なくとも約２００ｍＭ～約１０００ｍＭ濃度の塩化ナトリウム、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ濃度の硫酸アンモニウム；約１ｍＭ～約５０ｍＭ濃度のリン酸水素二ナトリウム、を含み、前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のＶａｌのアミノ酸残基を含む、バルク原薬製剤。
【請求項19】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度が少なくとも約０．１ｇ／ｍＬ～約１０ｇ／ｍＬである、請求項１８に記載のバルク原薬製剤。
【請求項20】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度が約３ｇ／ｍＬである、請求項１９に記載のバルク原薬製剤。
【請求項21】
約８００ｍＭ濃度の塩化ナトリウムを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のバルク原薬製剤。
【請求項22】
約３２０ｍＭ濃度の硫酸アンモニウムを含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のバルク原薬製剤。
【請求項23】
約２０ｍＭ濃度のリン酸水素二ナトリウムを含む、請求項１８～２２のいずれか一項に記載のバルク原薬製剤。
【請求項24】
前記バルク原薬製剤のｐＨが約７～約９である、請求項１８～２３のいずれか一項に記載のバルク原薬製剤。
【請求項25】
前記バルク原薬製剤のｐＨが約７．４である、請求項２４に記載のバルク原薬製剤。
【請求項26】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが－６０℃±１０℃の温度で保存した場合に安定している、請求項１８～２５のいずれか一項に記載のバルク原薬製剤。
【請求項27】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトされた細菌細胞の培養物中の封入体から単離された、リフォールディングされた修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの精製を含む製造方法であって、前記精製が、リガンドとしてのデキストラン硫酸に結合される高度に架橋されたアガロース系マトリックスに、前記リフォールディングされた修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを捕捉し、続いて、ブチルセファロース樹脂を充填したクロマトグラフィー用カラムを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーで最終精製することを含む、方法。
【請求項28】
前記最終精製ステップからの前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの回収が、ヘパリン樹脂を充填したクロマトグラフィー用カラムを使用し、他の点では同一である製造方法における疎水性相互作用クロマトグラフィーによる最終精製ステップ後の前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの回収よりも、約１０％～約４０％多い、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するためのスケーラブルな方法であって、前記方法が、ａ．大腸菌細胞に前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、前記細胞のペリプラズムに、翻訳された修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを標的化するように構成されている組換え核酸コンストラクトを導入することと、
ｂ．約２０時間にわたり、好適な抗生物質を含む合成増殖培地で前記細胞を増殖させることと、
ｃ．治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを前記細胞から回収することと、を含み、
回収された前記修飾ＦＧＦ－１の収量は、１Ｌ以上の規模では少なくとも３ｇ／Ｌである、方法。
【請求項30】
前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のＶａｌのアミノ酸残基を含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のスケーラブルな方法。
【請求項31】
前記大腸菌細胞がＢＬ２１、Ｋ１２ ＨＭＳ１７４およびＷ３１１０の株から選択される、請求項２９または３０に記載のスケーラブルな方法。
【請求項32】
前記組換え核酸コンストラクトが、Ｔ７またはＴａｃプロモータを含むｐＭＫｅｔ＿ＴＴＨＸ１１１４である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のスケーラブルな方法。
【請求項33】
前記合成増殖培地が炭素源としてのグリセロール、ペプトンおよび酵母を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のスケーラブルな方法。
【請求項34】
前記大腸菌細胞がＢＬ２１細胞であり、ｐＭＫｅｔ＿ＴＴＨＸ１１１４を発現する前記ＢＬ２１細胞が、３７℃で約２０時間、カナマイシンの存在下で増殖される、請求項３１～３３のいずれか一項に記載のスケーラブルな方法。
【請求項35】
前記組換え核酸コンストラクトが、前記細胞からの前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための１つ以上の修飾を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載のスケーラブルな方法。
【請求項36】
前記１つ以上の修飾が、前記細胞での前記修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現を増加させるための核酸配列コドンの最適化を含む、請求項３５に記載のスケーラブルな方法。
【請求項37】
修飾ＦＧＦ１－１ポリペプチドをコードする核酸配列であって、前記核酸が配列番号２０７の配列を含む、核酸配列。
【請求項38】
前記配列番号２０７を含み、Ｔａｃプロモータに動作可能に連結される、細菌発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本願は、２０２０年６月２６日に出願された米国仮出願第６３／０４４，９８０号の恩典を主張し、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を援用する。
本願は、２０２０年６月２６日に出願された米国仮出願第６３／０４４，９８０号の恩典を主張し、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を援用する。
【0002】
修飾線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＦＧＦ）ポリペプチド、医薬組成物およびかかる修飾ＦＧＦポリペプチドを含む薬剤、ならびにＦＧＦの投与により恩恵を受ける状態を治療または予防するために、かかる修飾ＦＧＦポリペプチドを調製および使用する方法が本明細書に記載される。
【背景技術】
【0003】
ＦＧＦは、発達中の組織および成体組織で広範に発現される大きなポリペプチドであり（非特許文献１）、複数の生理学的機能にて働く（非特許文献２）。ＦＧＦファミリーとしては、少なくとも２２種類のメンバーが挙げられる（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ，３：２３９－２４３，１９９１
【非特許文献2】ＭｃＫｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１３５－１７６，１９９８；Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｗ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：５７５－６０６（１９８９）
【非特許文献3】Ｒｅｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３１３：１３９－１５７（２００３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
一実施形態は、
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド、
約１ｍＭ～約２０ｍＭ濃度のクエン酸またはヒスチジン、
約０．０１％～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の界面活性剤、および
約１％～約１０％（ｗ／ｖ）または約５０ｍＭ～約２００ｍＭ濃度の浸透圧調整剤、を含む医薬製剤を提供し、
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のＶａｌのアミノ酸残基を含む。
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド、
約１ｍＭ～約２０ｍＭ濃度のクエン酸またはヒスチジン、
約０．０１％～約１０％（ｗ／ｖ）の濃度の界面活性剤、および
約１％～約１０％（ｗ／ｖ）または約５０ｍＭ～約２００ｍＭ濃度の浸透圧調整剤、を含む医薬製剤を提供し、
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のＶａｌのアミノ酸残基を含む。
【0006】
いくつかの実施形態では、医薬製剤は約１ｍＭまたは約１０ｍＭ濃度のヒスチジンを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤の濃度は約０．１％（ｗ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、界面活性剤はポリソルベートである。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはＰＳ－２０またはＰＳ－８０である。いくつかの実施形態では、ポリソルベートはＰＳ－８０である。いくつかの実施形態では、浸透圧調整剤はソルビトールであり、医薬製剤は約５％（ｗ／ｖ）の濃度でソルビトールを含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤のｐＨは約４．５～約６．５である。いくつかの実施形態では、医薬製剤のｐＨは約５．８である。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度は約０．０００５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度は約１００μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、（ｉ）外観検査による目に見える微粒子の欠如、および（ｉｉ）ＳＥ－ＨＰＬＣ（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）アッセイでの高分子量種について５％未満のピーク面積、のうちいずれか一方により測定されるように、室温で保存した場合、少なくとも２８日間は安定している。いくつかの実施形態では、室温で保存した場合、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは少なくとも５０日間は安定している。いくつかの実施形態では、製剤を室温で保存した場合、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは少なくとも５９日間は安定している。いくつかの実施形態では、製剤は局所適用、点眼薬としての適用、眼内注射または眼周囲注射に好適である。いくつかの実施形態では、製剤は眼内送達用の注射用製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は硝子体内送達用の注射用製剤である。
【0007】
一実施形態は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド；少なくとも約２００ｍＭ～約１０００ｍＭ濃度の塩化ナトリウム；約５０ｍＭ～約５００ｍＭ濃度の硫酸アンモニウム；約１ｍＭ～約５０ｍＭ濃度のリン酸水素二ナトリウム、を含むバルク原薬製剤を提供し、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のＶａｌのアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度は少なくとも約０．１ｇ／ｍＬ～約１０ｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度は約３ｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は、約８００ｍＭ濃度の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は、約３２０ｍＭ濃度の硫酸アンモニウムを含む。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は、約２０ｍＭ濃度のリン酸水素二ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤のｐＨは約７～約９である。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤のｐＨは約７．４である。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤中の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、－６０℃±１０℃の温度で保存した場合、安定している。
【0008】
一実施形態は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトされた細菌細胞の培養物中の封入体から単離された、リフォールディングされた修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを精製することを含む製造方法を提供し、精製は、リガンドとしてのデキストラン硫酸に結合される高度に架橋されたアガロース系マトリックスに、リフォールディングされた修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを捕捉し、続いて、ブチルセファロース樹脂を充填したクロマトグラフィー用カラムを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーで最終精製することを含む。いくつかの実施形態では、最終精製ステップからの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの回収は、ヘパリン樹脂を充填したクロマトグラフィー用カラムを使用すること以外は同一である製造方法での疎水性相互作用クロマトグラフィーによる最終精製ステップ後の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの回収よりも、約１０％～約４０％多い。
【0009】
一実施形態は、治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するためのスケーラブルな方法を提供し、該方法は、
ａ．大腸菌細胞に修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、細胞のペリプラズムに、翻訳された修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを標的化するように構成されている組換え核酸コンストラクトを導入することと、
ｂ．約２０時間にわたり、好適な抗生物質を含む合成増殖培地で細胞を増殖させることと、
ｃ．治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することと、を含み、
回収された修飾ＦＧＦ－１の収量は、１Ｌ以上の規模では少なくとも３ｇ／Ｌである。
ａ．大腸菌細胞に修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、細胞のペリプラズムに、翻訳された修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを標的化するように構成されている組換え核酸コンストラクトを導入することと、
ｂ．約２０時間にわたり、好適な抗生物質を含む合成増殖培地で細胞を増殖させることと、
ｃ．治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することと、を含み、
回収された修飾ＦＧＦ－１の収量は、１Ｌ以上の規模では少なくとも３ｇ／Ｌである。
【0010】
スケーラブルな方法のいくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のアミノ酸残基を含む。スケーラブルな方法のいくつかの実施形態では、大腸菌細胞はＢＬ２１、Ｋ１２ ＨＭＳ１７４およびＷ３１１０といった株から選択される。スケーラブルな方法のいくつかの実施形態では、組換え核酸コンストラクトは、Ｔ７またはｔａｃプロモータを含むｐＭＫｅｔ＿ＴＴＨＸ１１１４である。スケーラブルな方法のいくつかの実施形態では、合成増殖培地は炭素源としてグリセロール、ペプトンおよび酵母を含む。スケーラブルな方法のいくつかの実施形態では、大腸菌細胞はＢＬ２１細胞であり、ｐＭＫｅｔ＿ＴＴＨＸ１１１４を発現するＢＬ２１細胞は、３７℃で約２０時間、カナマイシンの存在下で増殖される。スケーラブルな方法のいくつかの実施形態では、組換え核酸コンストラクトは、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための１つ以上の修飾を含む。スケーラブルな方法のいくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、細胞での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現を増加させるために最適化されている核酸配列コドンを含む。
【0011】
一実施形態は、修飾ＦＧＦ１－１ポリペプチドをコードする核酸配列であり、該核酸は配列番号２０７の配列を含む。一実施形態は、配列番号２０７を含み、Ｔａｃプロモータに動作可能に連結される細菌発現ベクターを提供する。
【0012】
一実施形態では、１つ以上の変異を有し配列番号１に示される配列を含む組換え修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供され、該ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流に位置するＮ末端メチオニン残基を含む。いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、伸長ペプチドは配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、伸長ペプチドは配列番号４～８に示される配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはポリペプチドの成熟型である。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１４～１８から選択される配列を含む。
【0013】
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、または配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の単一のアミノ酸変異を含む組換えＦＧＦ－１ポリペプチド、および（ｂ）Ｌ－メチオニン、を含む製剤が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、製剤は眼内送達用の注射用製剤である。
【0014】
いくつかの実施形態では、該ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、伸長ペプチドは配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、伸長ペプチドは配列番号４～８に示される配列のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはポリペプチドの成熟型である。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１４～１８から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号２４～２８から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号９３～１１７から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、伸長ペプチドに対してＮ末端にメチオニン残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１１８～１４１から選択される配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１３６個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に少なくとも１４１個のアミノ酸を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、組換え修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の６７位に変異を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１の最初の５つの残基のうち１つ以上の切断をさらに含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１４６～１４９から選択される配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む伸長ペプチドをさらに含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１７４～２０４から選択される配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド組換え修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２または配列番号２０５に示される配列を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはポリペプチドの成熟型である。
【0024】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｌｙｓ１２Ｖａｌ、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１１７ＶａｌおよびＰｒｏ１３４Ｖａｌからなる群から選択され、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはペプチドＡＬＴＥＫの少なくとも１つの残基をさらに含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌといった配列番号１の変異を含む１つ以上の変異を含み、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流に位置するメチオニン残基、およびＮ末端メチオニンと配列番号１の１位との間に位置するペプチドＡＬＴＥＫの少なくとも１つの残基を含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、製剤はヒト血清アルブミン（ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、ＨＳＡ）および／またはポリソルベート８０を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、製剤はＬ－メチオニンを含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、製剤はＬ－メチオニンおよびポリソルベート８０を含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、製剤は、
－少なくとも約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム、
－少なくとも約１００ｍＭ 塩化ナトリウム、
－少なくとも約１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
－少なくとも約５ｍＭ Ｌ－メチオニン、および
－少なくとも約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、のうち少なくとも１つをさらに含む。
－少なくとも約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム、
－少なくとも約１００ｍＭ 塩化ナトリウム、
－少なくとも約１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
－少なくとも約５ｍＭ Ｌ－メチオニン、および
－少なくとも約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、のうち少なくとも１つをさらに含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、製剤は、
－少なくとも約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム、
－少なくとも約１００ｍＭ 塩化ナトリウム、
－少なくとも約１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
－少なくとも約０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
－少なくとも約５ｍＭ Ｌ－メチオニン、および
－少なくとも約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、のうち少なくとも１つをさらに含む。
－少なくとも約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム、
－少なくとも約１００ｍＭ 塩化ナトリウム、
－少なくとも約１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
－少なくとも約０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
－少なくとも約５ｍＭ Ｌ－メチオニン、および
－少なくとも約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、のうち少なくとも１つをさらに含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、製剤は少なくとも約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭ濃度であるＥＤＴＡを含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、製剤は硫酸アンモニウムを含み、硫酸アンモニウムの濃度は少なくとも約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭである。
【0034】
いくつかの実施形態では、製剤は少なくとも約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭ Ｌ－メチオニンを含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、組換えＦＧＦ－１は、フックスジストロフィー、水疱性角膜症、ヘルペス性角膜症、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー１、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー２、後部多形性角膜内皮ジストロフィー、ドライアイ症候群、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、顆粒状角膜ジストロフィー、黄斑角膜ジストロフィー、シュナイダー結晶性角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、斑状角膜ジストロフィー、角膜損傷、眼の損傷、化学損傷、びらん性損傷、角膜実質損傷およびマスタードガス角膜症からなる一覧から選択される１つ以上の疾患、障害または病気を治療するのに好適な濃度で存在する。
【0036】
いくつかの実施形態では、生物への修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの投与を容易にする医薬組成物または製剤が本明細書に提供される。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与する複数の技術は当該技術分野に存在しており、局所、眼、眼内、眼周囲、静脈内、経口、エアロゾル、非経口および投与を含むがこれらに限定されない。
【0037】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は液体眼科用製剤である。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、局所的に、すなわち角膜へのマイクロニードル注射により、または房内に投与される。局所投与の様式としては、例えば局所適用、点眼薬、眼内注射または眼周囲注射が挙げられ得る。眼周囲注射は、典型的には結膜下、またはテノン嚢（眼の上の線維組織下方）への化合物の注射を含む。眼内注射は、典型的には硝子体への修飾ＦＧＦまたは医薬組成物の注射を含む。ある特定の実施形態では、投与は、局所適用または点眼薬などによる非侵襲的なものである。いくつかの実施形態では、投与は局所的方法および房内方法の併用によるものである。
【0038】
いくつかの実施形態では、製剤は房内に投与される。
【0039】
いくつかの実施形態では、製剤は硝子体内に投与される。
【0040】
いくつかの実施形態では、製剤は約－２０℃の温度で、少なくとも約２週間～約４週間安定している。
【0041】
治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するためのスケーラブルな方法が本明細書に提供され、該方法は、（ａ）修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸コンストラクトを細胞内に導入することであって、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが細胞によって産生される、導入することと、（ｂ）治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することと、を含む。いくつかの実施形態では、スケーラブルな方法は、（ａ）ｐＢＲ３２２由来のｏｒｉ配列を含むベクターに挿入される、細胞質発現のために修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸コンストラクトを、好適な大腸菌細胞に導入することと、（ｂ）約２０時間、好適な抗生物質を含む合成増殖培地中で細胞を増殖することと、（ｃ）治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することと、を含み、ステップｃで回収される修飾ＦＧＦ－１の収量は、ｐＢＲ３２２由来のｏｒｉ配列、合成増殖培地またはこれらの組合せを含むベクターの使用を含まない方法よりも少なくとも２倍高い。
【0042】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはＡｌａ６６Ｃｙｓ変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはＣｙｓ１６Ｓｅｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはＣｙｓ１１７Ｓｅｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流に位置するＮ末端メチオニン残基を含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、伸長ペプチドは配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、伸長ペプチドは配列番号４～８に示される配列のうちのいずれか１つを含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはポリペプチドの成熟型である。
【0046】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１４～１８から選択される配列を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号２４～２８から選択される配列を含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号９３～１１７から選択される配列を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、伸長ペプチドに対してＮ末端にメチオニン残基をさらに含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１１８～１４１から選択される配列を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１３６個のアミノ酸を含む形態で発現される。
【0052】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に少なくとも１４１個のアミノ酸を含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１の最初の５つの残基のうち１つ以上の切断をさらに含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１４６～１４９から選択される配列を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む伸長ペプチドをさらに含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１７４～２０４から選択される配列を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号２、配列番号２０５に示される配列を含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。
【0059】
いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１０ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。
【0060】
いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１００ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。
【0061】
いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１ｋｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。
【0062】
いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１０ｋｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。
【0063】
いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１００ｋｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。
【0064】
いくつかの実施形態では、該方法は、少なくとも１００Ｌの細胞ストックのバッチ製剤を製造するために規模を拡大することが可能である。
【0065】
いくつかの実施形態では、細胞は酵母細胞または細菌である。
【0066】
いくつかの実施形態では、細胞は細菌であり、細菌は大腸菌である。
【0067】
いくつかの実施形態では、細胞は大腸菌細胞であるＢＬＡ２１Ａ１株である。
【0068】
いくつかの実施形態では、細胞は大腸菌細胞であるＫ１２ ＨＭＳ１７４株またはＷ３１１０株である。
【0069】
いくつかの実施形態では、組換え核酸コンストラクトはプラスミドの形態である。
【0070】
いくつかの実施形態では、組換え核酸コンストラクトは、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための１つ以上の修飾を含む。
【0071】
１つ以上の修飾は、細胞での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現を増加させるために最適化されている配列を含む、実施形態６９の方法。
【0072】
いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾はプラスミドの修飾を含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための好適なプロモータを選択することを含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、方法は細胞増殖を最大化するための適切な栄養培地中で細胞を増殖することをさらに含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、適切な栄養培地は炭素源を含む。
【0076】
いくつかの実施形態では、炭素源はグルコースまたはグリセロールである。
【0077】
いくつかの実施形態では、プラスミドはｐＭＫｅｔまたはそれらの誘導体もしくは修飾である。
【0078】
いくつかの実施形態では、該方法は、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を最大化させるために１つ以上の修飾プロセスをさらに含み、１つ以上の修飾プロセスは、
ｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸内での修飾；
ｉｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸に関連し、プロモータ、エンハンサ、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、ポリＡ尾部、転写物安定化配列から選択される１つ以上の調節配列要素を含む組換え核酸内での修飾；
ｉｉｉ．組換え核酸を含むプラスミドの修飾；
ｉｖ．細胞増殖を最大化させるための細胞株の修飾または細胞株の選択；
ｖ．細胞増殖培地の変性；および
ｖｉ．細胞から修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを回収するプロセスでの修飾、から選択される。
ｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸内での修飾；
ｉｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸に関連し、プロモータ、エンハンサ、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、ポリＡ尾部、転写物安定化配列から選択される１つ以上の調節配列要素を含む組換え核酸内での修飾；
ｉｉｉ．組換え核酸を含むプラスミドの修飾；
ｉｖ．細胞増殖を最大化させるための細胞株の修飾または細胞株の選択；
ｖ．細胞増殖培地の変性；および
ｖｉ．細胞から修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを回収するプロセスでの修飾、から選択される。
【0079】
いくつかの実施形態では、組換え核酸を導入することは、細胞内に組換え核酸を電気穿孔することを含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することは、タンパク質を細胞のペリプラズム封入体から回収することを含む。
【0081】
いくつかの実施形態では、回収することは、変性緩衝液中で封入体を可溶化させること、およびＦＧＦ－１ポリペプチドを回収することを含む。
【0082】
いくつかの実施形態では、変性緩衝液は尿素またはグアニジンを含む。
【0083】
変性緩衝液は、ｐＨ７．４の６Ｍ グアニジンを含む実施形態３４または７７に記載の方法。
【0084】
いくつかの実施形態では、変性緩衝液は２ｍＭ ＥＤＴＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、ＤＴＴを加えることで回収されたＦＧＦ－１ポリペプチドを還元することをさらに含む。いくつかの実施形態では、該方法は、透析ろ過によりＤＴＴを取り除くことをさらに含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、回収されたＦＧＦ－１ポリペプチドは、リフォールディングバッファ内でリフォールディングにかけられる。
【0086】
いくつかの実施形態では、リフォールディングバッファはアルギニンを含む。
【0087】
いくつかの実施形態では、リフォールディングバッファは１Ｍ アルギニンを含む。
【0088】
いくつかの実施形態では、リフォールディングバッファはｐＨ９～９．５の５～５０ｍＭ トリスを含む。
【0089】
いくつかの実施形態では、リフォールディングバッファは５ｍＭ システインまたは２ｍＭ システインまたはその両方を含む。
【0090】
いくつかの実施形態では、ＦＧＦ－１は、ヘパリンとの疎水性相互作用カラム（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ、ＨＩＣ）で捕捉される。
【0091】
いくつかの実施形態では、治療的に有効な組換え変異ｈＦＧＦ１タンパク質を回収することは、タンパク質を精製することを含む。いくつかの実施形態では、精製することは、液体クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、超遠心分離法、クロスフローろ過および透析ろ過のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、精製することは、ヘパリンカラムろ過による精製ステップを含む。いくつかの実施形態では、精製することは、純粋な単量体の組換え変異ｈＦＧＦ１タンパク質を回収することを含む。いくつかの実施形態では、精製することは、病原体を含まず、エンドトキシンを含まず、ヘパリンを実質的に含まない純粋な単量体の組換え変異ｈＦＧＦ１タンパク質を回収することを含む。
【0092】
実施形態３４～９７のうちいずれか１つの方法により製造される、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬組成物、その凍結乾燥粉末画分またはその液体製剤が本明細書に記載される。
【0093】
修飾ヒトＦＧＦ－１をコードし、１つ以上の調節配列に動作可能に連結される組換え核酸配列を含むプラスミドベクターが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、組換え核酸配列は細胞質発現のために設計される。いくつかの実施形態では、組換え核酸はモノシストロニック配列をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、組換え核酸はポリシストロニック配列をコードしてもよい。いくつかの実施形態では、組換え核酸は、ＦＧＦ－１ポリペプチドに加えてシャペロンペプチド配列をコードする。
【0094】
フックスジストロフィー、水疱性角膜症、角膜潰瘍、ヘルペス性角膜症、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー１、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー２、後部多形性角膜内皮ジストロフィー、ドライアイ症候群、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、顆粒状角膜ジストロフィー、黄斑角膜ジストロフィー、シュナイダー結晶性角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、斑状角膜ジストロフィー、角膜損傷、眼の損傷、化学損傷、びらん性損傷、角膜実質損傷およびマスタードガス角膜症からなる一覧から選択される１つ以上の疾患、障害または病気を有する対象を治療する方法が本明細書に提供され、該方法は、好適な投与量の
【0095】
（ｉ）実施形態１～３３のうちのいずれか１つの注射用製剤、または
【0096】
（ｉｉ）実施形態９８の医薬組成物を、その必要がある対象に投与することを含む。
【0097】
ＦＧＦ－１の注射用製剤を含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の製剤または医薬組成物内の修飾ＦＧＦ－１の最小用量を提供可能であるドロッパーボトルを含む。いくつかの実施形態では、ドロッパーボトルは滅菌フィルタをさらに備える。いくつかの実施形態では、容器はシリンジを備える。いくつかの実施形態では、シリンジはツベルクリンポリプロピレンおよびガラスからなる群から選択される材料を含む。いくつかの実施形態では、キットは成形同時充填ドロッパーなどの単回投与量容器を含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、シリンジは、本明細書に記載の注射用製剤または医薬組成物で予め満たされている。
【0099】
いくつかの実施形態では、キットは電子制御部品をさらに含む。いくつかの実施形態では、電子制御部品によって、少なくとも約１０μＬ～約１００μＬの容量の本明細書に記載の注射用製剤または医薬組成物の投与を制御することができる。
【0100】
援用記載
本明細書で言及されているすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個別の刊行物または特許出願が本明細書の一部として援用されると具体的かつ個別に示されていると仮定した上で、同程度でその内容全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。
本明細書で言及されているすべての刊行物および特許出願は、それぞれ個別の刊行物または特許出願が本明細書の一部として援用されると具体的かつ個別に示されていると仮定した上で、同程度でその内容全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【図面の簡単な説明】
【0101】
【図1】例示的で一般的なＦＧＦ－１製造プロセスを表す。
【0102】
【図2A】ブチルＨＩＣクロマトグラフィーによる例示的な捕捉、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによってＦＧＦ－１に対応する１７ｋＤａの単一バンド（図示せず）が得られる、点線で示されている画分の溶出を表す。
【0103】
【図2B】ヘパリンカラムでのブチル捕捉ステップ後の例示的な最終精製ステップ、および溶離液の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを表す。
【0104】
【図3A】ブチルおよびヘパリンＨＩＣで捕捉した、異なるリフォールディングバッファを使用した実験からのデータを表す。
【図3B】ブチルおよびヘパリンＨＩＣで捕捉した、異なるリフォールディングバッファを使用した実験からのデータを表す。
【図3C】ブチルＨＩＣ（左）、続いてヘパリンＨＩＣ（右）での溶出のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す。
【0105】
【図4A】リフォールディングバッファ中で尿素またはグアニジンを使用し、ポリソルベート２０の使用とポリソルベート８０の使用を比較した代表的な実験からのＦＧＦ１回収を示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで得られたタンパク質泳動を比較した量的データを示す。
【図4B】リフォールディングバッファ中で尿素またはグアニジンを使用し、ポリソルベート２０の使用とポリソルベート８０の使用を比較した代表的な実験からのＦＧＦ１回収を示し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで得られたタンパク質泳動を比較した量的データを示す。図中の各データポイントに関して、第１のカラムは４℃でのリフォールディングを表し、第２のカラムは室温でのリフォールディングを表す。
【0106】
【図5】例示的で一般的なＦＧＦ－１製造プロセスを表す。
【0107】
【図6】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド発現のプラスミドマップを表す。
【0108】
【図7A】０日目での原薬の明確なピークを示す代表的なＳＥＣ－ＨＰＬＣデータを表す。
【図7B】２８日目での原薬の明確なピークを示す代表的なＳＥＣ－ＨＰＬＣデータを表す。
【図7C】５９日目での原薬の明確なピークを示す代表的なＳＥＣ－ＨＰＬＣデータを表す。
【発明を実施するための形態】
【0109】
眼の疾患および眼の損傷は重度の衰弱性疾患および損傷であり、広範囲にわたる形態で発生する可能性がある。眼の疾患の一分類としてマスタードガス角膜症がある。マスタードガスは、第１次世界大戦中の１９１５年４月、イープスの戦いでドイツ軍によって最初に投入されたびらん性毒ガスである。マスタードガスへの曝露によって長期合併症が生じる可能性があり、これは年月を重ねる中で発症する。角膜は瘢痕化してかつ不規則なものとなり、コレステロールおよびカルシウムがその組織に堆積することで進行性視覚障害がもたらされる。細隙灯顕微鏡検査によって、強膜組織には特徴的な模様が認められることが明らかになっている。白色磁器のような見た目と異常な血管奇形が一般的である。この奇形は、拡張してねじれた血管として確認されており、時には静脈瘤様膨脹およびソーセージ様血管とともに壺型の輪郭を有する状態で確認される。時間が経過するとともに、濃い角膜混濁が生じる。上部分は瞼が張り出していることで保護されているため、これは中央部分および下部分で最も顕著である。ＭＧＫの主要な組織病理学的特徴としては、例えば上皮の不規則な厚さ、退行性変化、肥厚した上皮基底膜、ケラチノサイトの損失およびボーマン膜の破壊が挙げられる。（Ｋａｎａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｒｏｎｉｃ ａｎｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｍｕｓｔａｒｄ ｇａｓ ｋｅｒａｔｏｐａｔｈｙ：ａ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ，Ｅｕｒ．Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；２０（５）：８３９－４３）。典型的には、角膜に水疱を生じさせる曝露の１日以内に、角膜上皮（ｃｏｒｎｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ、ＣＥ）が基底膜（ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＢＭ）から脱落して剥皮化した角膜実質に角膜浮腫が発生し、全層ケラトサイトーシスが創縁内にはっきりと認められる。５日間までに、上皮キャップが再生し、角膜浮腫が引き始める。曝露後１週間では、ＣＥは、未発達のヘミデスモソームが接着した状態で部分的に層状である。このような明らかな好転にもかかわらず、角膜は曝露後３週間ですぐに、持続して増大する角膜浮腫、角膜びらんおよび新生血管形成を含む慢性損傷の臨床的な特徴を生じる。８週間までに、基底膜領域は重度の変性を受ける。さらにはＭＧＫに冒された角膜は、創傷治癒プロセスの遅延を呈すると考えられる。
【0110】
本明細書では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよびかかる修飾ペプチドを含むその液体注射剤、ならびに眼の疾患、障害および病気（例えば、フックスジストロフィー）、角膜の上皮損傷および内皮損傷を誘発するびらん剤（例えば、マスタードガス角膜症（ＭＧＫ））、創傷治癒、心血管疾患（例えば、虚血）および神経の病気（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）などの種々の病気を治療するため、かかる修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを使用する方法が提供される。本明細書には、修飾線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－１）ポリペプチドまたはかかる修飾ペプチドを含む医薬組成物または薬剤を投与することで化学物質またはびらん性毒ガス誘発性損傷を治療する方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することで、例えば化学熱傷などの化学損傷によって誘発されるマスタードガス角膜症（ＭＧＫ）を治療することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することで、例えばナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ、ＮＭ）などのびらん性毒ガスによって誘発されるマスタードガス角膜症（ＭＧＫ）を治療することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、例えばホスゲンなどの化学兵器によって生じる化学損傷または熱傷を治療することを含む。
【0111】
本明細書では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよびその液体注射剤が、眼の疾患、障害および病気（例えば、フックスジストロフィー）、角膜の上皮損傷および内皮損傷を誘発するびらん剤（例えば、マスタードガス角膜症（ＭＧＫ））、創傷治癒、心血管疾患（例えば、虚血）および神経の病気（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などの種々の病気を治療するためにかかる修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの使用が好適であるように、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよびかかる修飾ペプチドを含むその液体注射剤を製造する方法もまた提供される。本明細書には、修飾線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－１）ポリペプチドまたはかかる修飾ペプチドを含む医薬組成物または薬剤を投与することで化学物質またはびらん性毒ガス誘発性損傷を治療する方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することで、例えば化学熱傷などの化学損傷によって誘発されるマスタードガス角膜症（ＭＧＫ）を治療することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することで、例えばナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ、ＮＭ）などのびらん性毒ガスによって誘発されるマスタードガス角膜症（ＭＧＫ）を治療することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、例えばホスゲンなどの化学兵器によって生じる化学損傷または熱傷を治療することを含む。
【0112】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがＮ末端メチオニン（Ｎ－Ｍｅｔ）残基がある状態で発現される場合、ポリペプチドは、Ｎ末端ペプチドを除去するためのタンパク質分解切断を必要とするステップなしにその後精製される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｎ末端ペプチドを除去するためのタンパク質分解切断ステップを含まずに迅速な精製方法で調製される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを提供する。これは、医薬品の製造管理および品質管理の基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ）ガイドラインに従った修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの製造に特に有利である。こうした利点としては切断分解ステップの欠如が挙げられており、切断分解された産物を後で精製すること、および分離切断に使用される試薬を除去する必要性がなくなることを含む。さらなる利点は、処理を減らすことによる収量増加、ならびに切断分解のために導入される残留切断分解試薬および汚染物質、未切断分解物質からの切断後の分離を試験する必要性の減少である。
【0113】
本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、安定性（例えば、熱安定性）を増大させ、埋没した遊離チオール数を減少させ、かつ／または有効なヘパラン硫酸プロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ、ＨＳＰＧ）親和性を増加させる。
【0114】
いくつかの他の利点は、本明細書に記載の方法での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの用途に関連する。例えば、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その医薬組成物または製剤（例えば、眼科用製剤）中にヘパリンを含むことなく投与されるため、その生物学的起源に関連する潜在的な安全性の問題を回避することができる。加えて、ヘパリンの使用を避けることで、局所的なヘパリン誘発性有害事象または既存の抗ヘパリン抗体により生じる合併症を伴うことなく、高投与量での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの使用が可能になる。さらに、ヘパリンが存在しない場合、修飾ＦＧＦの組織への即時の結合は最大化し、全身分布が著しく減少する。本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドには局所的な貯留を増強し、再分布動態を低下させるため、送達部位での排出半減期および平均滞留時間（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ、ＭＲＴ）を増加させ、投与頻度を低下させることが可能という利点もある。こうした利点は、安定性（例えば、熱安定性）を増大させ、埋没した遊離チオール数を減少させ、かつ／または有効なヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）親和性を増加させる本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの結果であり得る。
【0115】
本開示のＦＧＦ－１ポリペプチドは、種々の実施形態では、付加、切断または付加と切断の組合せといった該ポリペプチドのＮ末端に修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾は単一のＮ末端メチオニン残基の付加である。いくつかの実施形態では、修飾は伸長ペプチドの付加である。いくつかの実施形態では、修飾はＦＧＦ－１ポリペプチドの最初の５つの残基のうちの１つ以上の切断である。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｎ末端の修飾に加えて１つ以上の変異を有する、配列番号１に示される配列を含む。
【0116】
本明細書に開示される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのいくつかの例は、ポリペプチドの成熟型にＮ末端メチオニン（Ｎ－Ｍｅｔ）残基を含む。アミノ酸がタンパク質のＮ末端に付加される場合の生物学的活性の維持は、予測不可能である。いくつかのタンパク質は付加に耐性があるが、耐性のないタンパク質もあり、生物学的活性の維持および安定性変化の可能性は実験によってのみ決定される。本開示は、Ｎ末端のＭｅｔ残基の付加が生物学的活性および安定性の維持に関して許容されることを特定する。
【0117】
特定用語
上述の一般的な説明および以下の詳細な説明は例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される主題のいずれかを制限するものではないということを理解されたい。本願では、単数形の使用は、特段明記しない限り複数形の使用を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特段文脈で明確に規定しない限り、複数形の指示対象を含む。本願では、「または（ｏｒ）」の使用は、特段明記しない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」といった用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。
上述の一般的な説明および以下の詳細な説明は例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求される主題のいずれかを制限するものではないということを理解されたい。本願では、単数形の使用は、特段明記しない限り複数形の使用を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特段文脈で明確に規定しない限り、複数形の指示対象を含む。本願では、「または（ｏｒ）」の使用は、特段明記しない限り「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」といった用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。
【0118】
本明細書で使用される章の見出しは、系統立てのみを目的にしたものであり、記載の主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特段規定しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および化学用語は、特許請求される主題の一般的に理解されている意味を有する。本明細書の用語に複数の定義が存在する場合には、本章の定義が優先される。本明細書に言及されるすべての特許、特許出願、刊行物ならびに公開されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベースで利用できる配列）は、本明細書の一部を構成するものとして援用される。ＵＲＬまたはこうした他の識別子もしくはアドレスを参照する場合、こうした識別子は変わる可能性があり、かつインターネット上の特定の情報は変化する可能性がある。ただし、インターネットを検索することで同等の情報を発見することが可能である。これらの参照は、こうした情報が入手可能かつ公開されて普及していることを証明している。
【0119】
本明細書で使用される場合、配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」という用語は、必要な場合には配列をアライメントしてギャップを導入し、最大パーセント配列同一性を取得した後に、配列同一性の一部としていずれかの保存的置換を考慮していない、特定の配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義されている。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアライメントは、例えば、ＥＭＢＯＳＳ ＭＡＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＷＡＴＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＳＴＲＥＴＣＨＥＲ、ＥＭＢＯＳＳ ＮＥＥＤＬＥ、ＥＭＢＯＳＳ ＬＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを使用し、当業者の技術範囲内の種々の方法で達成することができる。当業者は、アライメントを測定するために適切なパラメータを決定することができるが、これは比較されている配列の全長にわたって最大アライメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含んでいる。
【0120】
標準的な化学用語の定義は、Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ 「Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４ｔｈ Ｅｄ．」Ｖｏｌｓ．Ａ（２０００）およびＢ（２００１），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを含むがこれに限定されない参考文献に見出され得る。特段指示しない限り、質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法は、同様の参考文献に見出され得る。
【0121】
特定の定義が提供されない限り、本明細書に記載の分析化学、合成有機化学ならびに医薬品化学および創薬化学に関連して使用される命名法、ならびにそれらの検査法および技術は、当該分野で認識されているものである。化学合成、化学分析、医薬品、製剤および送達および患者の治療に標準的な技術を使用することができる。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に標準的な技術を使用することができる。例えば製造業者仕様のキットを使用して、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載されるように反応および精製技術を使用することができる。従来の方法ならびに本明細書全体を通して引用および説明される種々の一般的な、およびより具体的な参考文献に記載されているように、通常、上述の技術および手順を実行することができる。
【0122】
本明細書に記載の方法および組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、コンストラクトおよび試薬に限定されず、そのためこれらは変化してもよいことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記載することが目的であり、本明細書に記載の方法、化合物、組成物の範囲の限定を意図していないこともまた理解されたい。
【0123】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」といった用語は、疾患、障害もしくは病気の症状を軽減すること、弱めることもしくは寛解させること、さらなる症状を予防すること、症状の主たる代謝的原因を寛解させることもしくは予防すること、例えば疾患、障害もしくは病気の発症を抑えること、疾患、障害もしくは病気を和らげること、疾患、障害もしくは病気の症状を寛解させること、疾患、障害もしくは病気により引き起こされる病気を和らげること、または疾患、障害もしくは病気の症状を止めることなど疾患、障害もしくは病気を抑制することを含む。「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」といった用語は、予防的処置および／または治療的処置を含むがこれらに限定されない。
【0124】
製剤、組成物または成分に対する「許容される」または「薬学的に許容される」といった用語は、治療されている対象の全般的な健康状態に、持続性のある有害作用を何ら有しないことを指す、または本明細書に記載の修飾ＦＧＦの生物学的活性もしくは特性を無効にせず、相対的には非毒性である。
【0125】
特定の修飾ＦＧＦまたは医薬組成物の投与による、特定の疾患、障害または病気の症状の「寛解」といった用語は、永続的または一時的、長期または短期のいずれかであったとしても、修飾ＦＧＦまたは医薬組成物の投与が原因であり得る、または投与に関連し得る、重症度の一部低下、発症の遅延、進行の緩徐化または持続期間の短縮を指す。
【0126】
本明細書で使用される場合、「組合せ」または「薬学的組合せ」といった用語は、２つ以上の活性成分を混合または組み合わせることで生じる産物を意味し、活性成分の固定の組合せまたは固定されない組合せの両方を含む。「固定の組合せ」といった用語は、ある活性成分（例えば、修飾ＦＧＦ）および助剤が、単一の存在物または用量の形態で両方が患者に同時に投与されることを意味する。「固定されない組合せ」といった用語は、ある活性成分（例えば、修飾ＦＧＦ）および助剤が、同時に、並行して、または間に特定の時間制限を設けることなく経時的に、のいずれかで、個別の存在物として患者に投与されることを意味する。かかる投与によって、患者の身体に有効なレベルの２つの薬剤が提供される。後者は、例えば３つ以上の活性成分の投与といったカクテル療法にも適用される。
【0127】
本明細書で互換的に使用される場合、「医薬組成物」または「医薬製剤」といった用語は、１つ以上の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（例えば、配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド）と、界面活性剤、緩衝剤、浸透圧調整剤、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤および／もしくは他の賦形剤、またはこれらの任意の組合せといった１つ以上の他の化学成分を含む製剤を指す。医薬製剤は、生物への修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの投与を容易にする。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与する複数の技術は当該技術分野に存在しており、局所、眼、眼内、眼周囲、静脈内、経口、エアロゾル、非経口および投与を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、例えば緩衝剤、界面活性剤、浸透圧調整剤またはこれらの組合せといった不活性成分とともに、活性薬物成分として修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（例えば、配列番号２に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド）を含む。
【0128】
本明細書で使用される場合、「担体」といった用語は、目的の薬剤（例えば、修飾ＦＧＦ）の細胞または組織への導入を容易にする、相対的に非毒性の化学化合物または薬剤を指す。
【0129】
「希釈剤」といった用語は、送達前に目的の薬剤（例えば、修飾ＦＧＦ）を希釈するために使用される化学化合物を指す。希釈剤はまた、さらに安定した環境を提供することができることから、薬剤を安定化させるために使用することができる。（ｐＨ制御または維持をもたらし得る）緩衝溶液に溶解されている塩は、当該技術分野に希釈剤として利用され、リン酸緩衝生理食塩水を含むがこれに限定されない。
【0130】
「同時投与」などの用語は、選択された薬剤（例えば、修飾ＦＧＦまたはその組成物および助剤）の単一の患者への投与を包含することを意味し、薬剤が同一もしくは異なる投与経路、または同時もしくは異なる時間で投与される治療レジメンを含むことを意図している。
【0131】
「有効量」または「治療有効量」といった用語は、治療されている疾患、障害または病気の１つ以上の症状をある程度和らげる、投与される、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド、薬剤、組合せまたは医薬組成物の十分な量を指す。この結果は、疾患の徴候、症状または原因の減少および／または軽減、または生物系の他の望ましい変化であり得る。例えば、治療使用にとっての「有効量」は、望ましい薬理効果、治療的改善または過度の有害な副作用がなく、疾患症状の臨床的に著しい軽減を提供するために必要とされる修飾ＦＧＦ、薬剤、組合せまたは医薬組成物の量である。個々のいずれかの場合での適切な「有効量」は、用量漸増試験などの技術を使用して決定されてもよい。「治療有効量」といった用語は、例えば予防有効量を含む。「効力量」は、修飾ＦＧＦ、組合せまたは医薬組成物の代謝、年齢、体重、対象の全身状態、治療されている病気、治療されている病気の重症度および処方する医師の判断の変化により患者によって変化することがあるということが理解される。単純に例として、治療有効量は、用量漸増治験を含むがこれに限定されない日常的な実験により決定されてもよい。
【0132】
「予防有効量」といった用語は、治療されている疾患、病気または障害の１つ以上の症状をある程度和らげる、患者に適用される、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ、化合物、薬剤、組合せまたは医薬組成物の量を指す。こうした予防的適用では、かかる量は患者の健康状態、体重などに応じて変化させてもよい。用量漸増治験を含むがこれに限定されない日常的な実験によってかかる予防有効量を決定することは、当業者にとって十分その技術の範囲内であると考えられる。
【0133】
本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」といった用語は、治療、観察または実験の対象である動物を指す。単純に例として、対象は限定されるわけではないが、ヒトを含むがこれに限定されない哺乳動物であってもよい。
【0134】
「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」または「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」といった用語は、効能または持続期間のいずれかで望ましい効果を増加または延長することを意味する。例として、治療薬の効果を単独で、または組み合わせて「増強する（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）」とは、効能、持続期間および／または規模のいずれかで、疾患、障害または病気の治療に対する薬剤の効果を増加または延長する能力を指す。患者で使用される場合、こうした使用に有効な量は、疾患、障害または病気の重症度および経過、投与前の治療、患者の健康状態および薬物への応答および治療する医師の判断に応じて変化させてもよい。
【0135】
「調節する」といった用語は、単純に例として標的の活性を増強させること、標的の活性を阻害もしくは弱めること、標的の活性を制限することまたは標的の活性を延ばすことを含む、標的の活性を変性させることを目的として、直接的に、または間接的に標的（例えば、ＦＧＦ受容体）と相互作用することを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、１つ以上のそれぞれの標的（例えば、１つ以上のＦＧＦ受容体）の活性を調節することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、細胞（例えば、角膜内皮細胞）での１つ以上のＦＧＦ受容体の活性を調節（例えば、増加）し、例えば細胞遊走および／または細胞増殖をもたらす。
【0136】
本明細書で使用される場合、「標的」といった用語は、本明細書に記載の選択的結合剤（例えば、修飾ＦＧＦ）または医薬組成物によって結合が可能であるＦＧＦ受容体などの生物学的分子（例えば、標的タンパク質またはタンパク質複合体）または生物学的分子の一部を指す。本明細書で使用される場合、「非標的」といった用語は、本明細書に記載の選択的結合剤または医薬組成物によって選択的に結合されない生物学的分子または生物学的分子の一部を指す。
【0137】
「標的活性」または「細胞応答」といった用語は、修飾ＦＧＦによって調節可能である生物学的活性または修飾ＦＧＦのＦＧＦ受容体への結合から生じる何らかの細胞応答を指す。ある特定の例示的な標的活性および細胞応答としては、結合親和性、シグナル伝達、遺伝子発現、細胞遊走、細胞増殖、細胞分化および眼の疾患、障害または病気に関連する１つ以上の症状の寛解が挙げられるがこれらに限定されない。
【0138】
「角膜ヘルペス」、「単純ヘルペス性角膜炎」、「ＨＳＫ」、「ヘルペス性角膜症」、「ヘルペス性角膜」および「ヘルペス性角結膜炎」といった用語は、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ、ＨＳＶ）によって典型的には引き起こされる眼の疾患、障害または病気を指す。
【0139】
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現型および成熟型
ＦＧＦは、ファミリーの７つのＦＧＦ受容体アイソフォームを刺激し、各ＦＧＦは異なるパターンの受容体を刺激してその特異的効果を得る。例えば、Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２７１（２５）：１５２９２－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，２８１（２３）：１５６９４－７００）を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、７つのＦＧＦ受容体アイソフォームすべてに結合し、かつこれらを刺激することから好ましい。Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２７１（２５）：１５２９２－７を参照されたい。
ＦＧＦは、ファミリーの７つのＦＧＦ受容体アイソフォームを刺激し、各ＦＧＦは異なるパターンの受容体を刺激してその特異的効果を得る。例えば、Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２７１（２５）：１５２９２－７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，２８１（２３）：１５６９４－７００）を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、７つのＦＧＦ受容体アイソフォームすべてに結合し、かつこれらを刺激することから好ましい。Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２７１（２５）：１５２９２－７を参照されたい。
【0140】
本明細書に開示される実施形態は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬組成物（例えば、眼科用製剤）に関連する。本明細書に開示される実施形態はまた、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬組成物（例えば、眼科用製剤）を投与することで化学損傷またはびらん性損傷を治療する方法に関連する。本明細書で使用される場合、修飾ＦＧＦポリペプチドは、配列番号１の、１つ以上の異なるアミノ酸残基の置換もしくは変異、および／または１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の欠失、および／または１つ以上のアミノ酸残基の１つ以上の付加を含む組換えＦＧＦを指す。
【0141】
第１の実施形態では、１つ以上の変異を有し配列番号１に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供され、該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流にメチオニン残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端メチオニン（Ｎ－Ｍｅｔ）残基を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはポリペプチドの成熟型である。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、第１の実施形態に従い、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流にメチオニン残基がある状態で宿主細胞で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、成熟中にＮ－Ｍｅｔ残基を除去するためのＮ末端プロセシングを受けない。したがって、いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１の成熟型はＮ－Ｍｅｔ残基および配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含む。Ｎ－Ｍｅｔ残基を含む例示的な修飾ＦＧＦ－１配列は、配列番号２として開示されている。
【0142】
本開示は、その成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含む本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１が、Ｎ－Ｍｅｔ残基を含まないバージョンと同様の生物学的活性を有すると確認している。Ｎ末端メチオニンの除去または除去（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、ポリペプチドがリボソームから出現すると即座に生じる共翻訳的プロセスである。Ｎ末端メチオニンの除去は、アラニン、グリシン、プロリン、セリン、スレオニンまたはバリンなど、小さな側鎖を有するアミノ酸残基が後に続くメチオニン残基を認識する、開裂酵素であるメチオニンアミノペプチダーゼ（ｍｅｔＡＰ）の基質特異性に関係している。この基質配列特異性により、Ｎ－Ｍｅｔ残基、続いてフェニルアラニンを含む第１の実施形態の修飾ＦＧＦ－１（配列番号１の１位を参照されたい）は、ｍｅｔＡＰによりプロセシングされない。したがって、配列番号１のすぐ上流にメチオニン残基がある状態で修飾ＦＧＦ－１を発現することで、Ｎ末端残基としてメチオニンを含む成熟した修飾ＦＧＦ－１を得ることができる。いくつかの実施形態では、第１の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１はＮ末端ペプチドがある状態で発現されず、そのため、後の精製中、Ｎ末端ペプチドを除去するためのタンパク質分解切断を受けない。
【0143】
第２の実施形態では、１つ以上の変異を有し配列番号１に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供され、該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流のメチオニン残基および配列番号３に示されるペプチドの１つ以上のアミノ酸をさらに含む。配列番号３の１つ以上の残基を含むペプチドは、本明細書では「伸長ペプチド」と呼ばれる。したがって、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１は、１つ以上の変異を有する配列番号１に示される配列、配列番号１の第１の残基上流のメチオニン残基およびメチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端メチオニンおよびメチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドを含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、ポリペプチドの成熟型である。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含み、該ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流にメチオニン残基、およびメチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドがさらにある状態で宿主細胞で発現される。いくつかの実施形態では、配列番号３の５つの残基を含み、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドがある状態で発現される。いくつかの実施形態では、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する配列番号３の４つの残基がある状態で発現される。いくつかの実施形態では、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する配列番号３の３つの残基がある状態で発現される。いくつかの実施形態では、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する配列番号３の２つの残基がある状態で発現される。いくつかの実施形態では、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する配列番号３の１つの残基がある状態で発現される。伸長ペプチドの例示的配列は、配列番号４～８を含む。
【0144】
いくつかの例では、伸長ペプチドおよびＮ末端メチオニン残基を含む第２の実施形態の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、メチオニン残基を除去するためのＮ末端プロセシングを受けず、その一方で、いくつかの例ではメチオニンは開裂酵素によって切除される。典型的には、開裂酵素はメチオニンアミノペプチダーゼ（ｍｅｔＡＰ）である。したがって、いくつかの例では、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの成熟型は、本明細書に記載されるように、Ｎ－Ｍｅｔ残基、続いて伸長ペプチドを含む。Ｎ末端メチオニンおよびメチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドの１つ以上の残基を含む第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの成熟型の例示的配列は、配列番号９～１３に示されており、該配列は、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。Ｎ末端メチオニンおよび伸長ペプチドを含む成熟した修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのさらなる例示的配列（ｅｘｅｍｐｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列番号１４～１８に示される。いくつかの他の例では、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの成熟型は、Ｎ－Ｍｅｔ残基は含まないが伸長ペプチドのみを含む。配列番号１の第１の残基上流に位置する伸長ペプチドを含む、第２の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの成熟型の例示的配列は配列番号１９～２３に示されており、該配列は、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。伸長ペプチドの１つ以上の残基を含む成熟した修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのさらなる例示的配列（ｅｘｅｍｐｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列番号２４～２８に示される。いくつかの実施形態では、メチオニン残基は、アラニン（配列番号４）またはスレオニン（配列番号５）を有する伸長ペプチドが開始する場合には、ｍｅｔＡＰによって切断分解される。前述の例では、成熟したＦＧＦ－１ポリペプチドはＮ末端メチオニン残基を含まず、例えばこれらは配列番号１９、２１、２４および２６である。
【0145】
第３の実施形態では、１つ以上の変異を有し配列番号１に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供され、該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流に位置する伸長ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、伸長ペプチドを含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはポリペプチドの成熟型である。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含み、該ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流に位置する伸長ペプチドの１つ以上のアミノ酸残基がある状態で、宿主細胞で発現される。伸長ペプチドを含み、Ｎ末端メチオニン残基なしで発現される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの例示的配列は配列番号１９～２３に示され、該配列は、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。伸長ペプチドの１つ以上の残基を含み、かつＮ末端メチオニン残基なしで発現される成熟した修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのさらなる例示的な配列は、配列番号２４～２８に示される。
【0146】
第４の実施形態では、１つ以上の変異を有し配列番号１に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供され、該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の５つの残基のうち１つ以上の切断をさらに含む。いくつかの実施形態では、配列番号１の第１の５つの残基のうち１つ以上の切断を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、ポリペプチドの成熟型である。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含み、配列番号１の第１の５つの残基のうち１つ以上が欠落している。いくつかの場合では、切断を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基がある状態で発現される。例えば、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、第４の実施形態に従い、Ｎ－Ｍｅｔ残基に続いて配列番号１の第２の残基であるアスパラギンが存在する配列を有する。いくつかの場合では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｎ－Ｍｅｔ残基に続いて配列番号１の第３の残基であるロイシンを含む。いくつかの場合では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｎ－Ｍｅｔ残基に続いて配列番号１の第４の残基であるプロリンを含む。いくつかの場合では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｎ－Ｍｅｔ残基に続いて配列番号１の第５の残基であるプロリンを含む。伸長ペプチドは、Ｎ－Ｍｅｔ残基と配列番号１の第１の残基、第２の残基、第３の残基、第４の残基または第５の残基との間に位置し得る。Ｎ－Ｍｅｔ残基が配列番号１の第２の残基、第３の残基、第４の残基または第５の残基に続く、第４の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの成熟型の例は、配列番号３７～４０に示されており、該配列は、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。切断およびＮ－Ｍｅｔ残基を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのさらなる例は、配列番号４１～４４に提供される。
【0147】
本開示はまた、配列番号１の１つ以上の変異を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドに関し、Ｎ－Ｍｅｔ残基、続いて伸長ペプチドがある状態で該ポリペプチドが発現され、該伸長ペプチドは配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断に続いている。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含み、該ポリペプチドはＮ－Ｍｅｔ残基、続いて伸長ペプチドがある状態で発現され、該伸長ペプチドは配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断に続いている。Ｎ－Ｍｅｔ残基、続いて配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断に続く伸長ペプチドがある状態で発現されるかかる配列の例は配列番号４５～６８に開示されており、該配列は配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。いくつかの例では、Ｎ末端メチオニンはＮ末端プロセシングにより切断され、したがって修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの成熟型は、配列番号６９～９２に例示されるように、配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断に続くリーダー断片の１つ以上の残基のみを含み、該例示的配列は、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。Ｎ－Ｍｅｔ残基を含まないが伸長ペプチドおよびＮ末端残基の切断を含む配列のさらなる例は、配列番号９３～１１７に提供される。
【0148】
いくつかの例では、Ｎ－Ｍｅｔ残基は成熟した修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド配列に保持され、したがって該成熟型は配列番号４５～６８に例示される配列を含み、配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。Ｎ－Ｍｅｔ残基、伸長ペプチドおよびＮ末端残基の切断を含む配列のさらなる例は、配列番号１１８～１４１に提供される。
【0149】
配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの切断バージョンは、第５の実施形態では、Ｎ末端メチオニン残基なしで、かつさらには伸長ペプチドなしで発現される。いくつかの例では、第５の実施形態に従う成熟した修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２９～３２に示される配列を含み、該配列は配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。いくつかの例では、第５の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号３３～３６からなる群から選択される配列を含む。
【0150】
配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたはその切断バージョンがＮ末端メチオニン、続いて伸長ペプチドがある状態で発現される場合では、メチオニン残基は、発現後のポリペプチドの成熟中にＮ末端を保持または切断される。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがＮ－Ｍｅｔ残基に隣接してアラニン（例えば、配列番号１４）がある状態で発現される場合、メチオニンは切断され、Ｎ－Ｍｅｔ残基を含まない成熟したＦＧＦ－１ポリペプチド（例えば、配列番号１９）が得られる。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがＮ－Ｍｅｔ残基に隣接してスレオニン（例えば、配列番号１６）がある状態で発現される場合、メチオニンは切断され、Ｎ－Ｍｅｔ残基を含まない成熟したＦＧＦ－１ポリペプチド（例えば、配列番号２０）が得られる。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがＮ－Ｍｅｔ残基に隣接してグルタミン酸（例えば、配列番号１７）がある状態で発現される場合、メチオニンは切断されず、Ｎ末端メチオニンを含み、かつ発現型と同じ配列を有する成熟したＦＧＦ－１ポリペプチドが得られる。
【0151】
第６の実施形態では、６７位に変異を含む配列番号１に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号１の６７位の変異、１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上のさらなる変異を含み、Ｎ－Ｍｅｔ残基がある状態で発現される。６７位の内部のメチオニンは、例えばアラニン残基と置換され得る。６７位に内部のメチオニンが存在しない場合、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのＮ末端メチオニンは、メチオニン残基の後でアミド結合を特異的に切断する薬剤である臭化シアン（ＣＮＢｒ）を使用して発現後に切断され得る。いくつかの場合では、第６の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは伸長ペプチドがある状態で発現される。いくつかの他の場合では、第６の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１４２～１４９に例示されるように、配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を含む形態で発現され、該配列は配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸に１つ以上の変異をさらに含む。さらに他の例では、第６の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１５１～１７５に例示されるように、伸長ペプチドおよび配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を含む形態で発現される。成熟型である第６の実施形態に従う修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのさらなる例は、配列番号１７４～２０４に示される。内部のメチオニン変異を含む形態で発現される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのうち、ポリペプチドがＮ末端メチオニン、続いて伸長ペプチドに由来するアラニンまたはスレオニン残基（例えば、配列番号１７５および配列番号１７７）がある状態で発現される場合、それぞれ、Ｎ末端メチオニンはｍｅｔＡＰによって、またはＣＮＢｒの使用のいずれかで、ポリペプチドの成熟中に切断され得る。
【0152】
第７の実施形態では、配列番号２０５に示される配列を含み、本明細書に記載の方法で使用するための修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供される。第８の実施形態では、配列番号２０６に示される配列を含み、本明細書に記載の方法で使用するための修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが本明細書に提供される。
【0153】
本開示は、当該修飾ポリペプチドが配列番号１の１つ以上の変異を含むという条件では、配列番号１の欠失、挿入および置換のうちいずれかの組合せを含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドにさらに関する。アミノ酸置換は修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドに導入されてもよく、産物は、例えば治療する眼の障害での有効性の保持／改善、フックスジストロフィーの寛解における効能の増加、マスタードガス角膜症の治療の改善といった望ましい活性についてスクリーニングされてもよい。アミノ酸置換はまた、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドに導入されてもよく、産物は、例えば凝集の傾向が低く、溶解度が向上し、半減期が延長され、眼科用医薬品としての製剤化が容易であり、安定性が増強され、有効期間が向上するといった、望ましい物理化学的特性についてスクリーニングされてもよい。保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方が企図されている。
【0154】
上記実施形態のうちいずれかにあるように、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは少なくとも１３６個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１３７個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１３８個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１３９個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１４０個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１４１個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１４２個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１４３個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１４４個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１４５個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１４６個のアミノ酸を含む形態で発現される。
【0155】
上記実施形態のうちいずれかにあるように、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に少なくとも１３６個のアミノ酸を含む形態で発現される。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１３７個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１３８個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１３９個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１４０個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１４１個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１４２個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１４３個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１４４個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１４５個のアミノ酸を含む。いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、その成熟型に１４６個のアミノ酸を含む。
【0156】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがポリペプチドの成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含むという条件では、配列番号１に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含み、該ポリペプチドが配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含むという条件では、配列番号９～１３から選択される配列のうちのいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含むという条件では、配列番号１４～１８から選択される配列のいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含み、該ポリペプチドが配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含まないという条件では、配列番号１９～２３から選択される配列のうちのいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含まないという条件では、配列番号２４～２８から選択される配列のいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含み、該ポリペプチドが配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含まないという条件では、配列番号１９～２３から選択される配列のうちのいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含み、該ポリペプチドが配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含むという条件では、配列番号３７～４０から選択される配列のうちのいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含むという条件では、配列番号４１～４４から選択される配列のいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドが配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含み、かつ当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含まないという条件では、配列番号４５～６８から選択される配列のうちのいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、配列番号６９～９２から選択される配列のうちのいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含み、当該ポリペプチドは配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含み、かつ当該ポリペプチドはその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含まないという条件では、配列番号９３～１１７から選択される配列のいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドがその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含むという条件では、配列番号１１８～１４１から選択される配列のいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、当該ポリペプチドが配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含むという条件では、配列番号２９～３２から選択される配列のうちのいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、配列番号３３～３６から選択される配列のいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。
【0157】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、配列番号１４２～２０４から選択される配列のいずれかに対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。
【0158】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｌｙｓ１２Ｖａｌを有する、１２位で変異した配列番号１に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ末端メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｌｙｓ１２Ｖａｌといった配列番号１の１２位に変異、および配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－Ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｌｙｓ１２Ｖａｌといった配列番号１の１２位に変異、伸長ペプチドおよび配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｌｙｓ１２Ｖａｌといった配列番号１の１２位に変異を有する配列を含み、ポリペプチドは、配列番号１の６７位にメチオニンの変異をさらに含み、Ｎ末端のメチオニンがある状態で発現し、メチオニンはその成熟型のポリペプチドから切断される。
【0159】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒを有する、１６位で変異した配列番号１に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒといった配列番号１の１６位に変異、および配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒといった配列番号１６の１６位に変異、伸長ペプチドおよび配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒといった配列番号１の１６位に変異を有する配列を含み、ポリペプチドは、配列番号１の６７位にメチオニンの変異をさらに含み、Ｎ末端のメチオニンがある状態で発現し、メチオニンはその成熟型のポリペプチドから切断される。
【0160】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ａｌａ６６Ｃｙｓを有する、６６位で変異した配列番号１に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ末端メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ａｌａ６６Ｃｙｓといった配列番号１の６６位に変異、および配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ａｌａ６６Ｃｙｓといった配列番号１の６６位に変異、伸長ペプチドおよび配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはＮ－Ｍｅｔ残基がある状態で発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ａｌａ６６Ｃｙｓといった配列番号１の６６位に変異を有する配列を含み、ポリペプチドは、配列番号１の６７位にメチオニンの変異をさらに含み、Ｎ末端のメチオニンがある状態で発現し、メチオニンはその成熟型のポリペプチドから切断される。
【0161】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１１７Ｖａｌを有する、１１７位で変異した配列番号１に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１１７Ｖａｌといった配列番号１の１１７位に変異、および配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１１７Ｖａｌといった配列番号１の１１７位に変異、伸長ペプチドおよび配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１１７Ｖａｌといった配列番号１の１１７位に変異を有する配列を含み、ポリペプチドは、配列番号１の６７位にメチオニンの変異をさらに含み、Ｎ末端のメチオニンがある状態で発現し、メチオニンはその成熟型のポリペプチドから切断される。
【0162】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｐｒｏ１３４Ｖａｌを有する、１３４位で変異した配列番号１に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ末端メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えばＰｒｏ１３４Ｖａｌといった配列番号１の１３４位に変異、および配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｐｒｏ１３４Ｖａｌといった配列番号１の１３４位に変異、伸長ペプチドおよび配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｐｒｏ１３４Ｖａｌといった配列番号１の１３４位に変異を有する配列を含み、ポリペプチドは、配列番号１の６７位にメチオニンの変異をさらに含み、Ｎ末端のメチオニンがある状態で発現し、メチオニンはその成熟型のポリペプチドから切断される。
【0163】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌを有する、配列番号１の１６位、６６位および１１７位で変異した配列番号１に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌを有する配列番号１の１６位、６６位および１１７位に変異、および配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはその成熟型にＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌを有する配列番号１の１６位、６６位および１１７位に変異、伸長ペプチドおよび配列番号１の第１の５つの残基のうちの１つ以上の切断を有する配列を含み、当該修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはＮ－ｍｅｔ残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、例えば変異Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌを有する配列番号１の１６位、６６位および１１７位に変異を有する配列を含み、ポリペプチドは、配列番号１の６７位にメチオニンの変異をさらに含み、Ｎ末端のメチオニンがある状態で発現し、メチオニンはその成熟型のポリペプチドから切断される。
【0164】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、配列番号２および９～２０４から選択される配列に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの配列は、配列番号２０５または２０６に対して５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは熱安定性である。本明細書で使用される場合、熱安定性ＦＧＦ（例えば、熱安定性ＦＧＦ－１）は、同一の条件下では配列番号１のポリペプチドよりもさらに安定している、配列番号１に対する修飾アミノ酸配列を有するＦＧＦを指す。ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ－１）に熱安定性を付与可能である変異および熱安定性を評価するための方法の例は、例えば米国特許第７，７９０，６８２号；同７，５９５，２９６号；同７，６９６，１７１号；同７，７７６，８２５号；同７，６５９，３７９号；同８，１１９，７７６号；同８，１５３，７７０号；同８，１５３，７７１号；および同８，４６１，１１１号；米国特許出願公開第２０１１／０２２４４０４号および同２０１３／０１３０９８３号；ならびにＸｉａ ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．（２０１２）７（１１）：ｅ４８２１０に記載されている。いくつかの実施形態では、１２位および／または１３４位はＦＧＦ－１で変異し、熱安定性がある修飾ＦＧＦ－１を生成する。ＦＧＦ－１製剤は、ある特定の温度では期間中「安定している」と考えることができるが、これはＦＧＦ－１が、指定の温度で指定の期間にわたり、その元々の純度および形態でその中に存在している製剤として理解されている。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ－１は、仮にその単量体形態で５％未満、２％未満、または好ましくは１％未満の分解または変化がある場合には、その元々の純度および形態で残っているものと考えられてもよい。こうした変化は、例えばクロマトグラフィー法、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット法といった本明細書に説明される分析手順のうちのいずれかによって検出することができる。
【0166】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、反応性チオール（例えば、遊離システイン）の数を減少させる１つ以上の修飾を含む。ＦＧＦ－１のこうした修飾の例は例えば、米国特許第７，７９０，６８２号；同７，５９５，２９６号；同７，６９６，１７１号；同７，７７６，８２５号；同７，６５９，３７９号；同８，１１９，７７６号；同８，１５３，７７０号；同８，１５３，７７１号；および同８，４６１，１１１号；米国特許出願公開第２０１１／０２２４４０４号および同２０１３／０１３０９８３号；ならびにＸｉａ ｅｔ ａｌ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ．（２０１２）７（１１）：ｅ４８２１０に記載されている。いくつかの実施形態では、８３位および／または１１７位は配列番号１で変異され、反応性チオールの数を減少させる修飾ＦＧＦ－１を生成する。
【0167】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦは、内部ジスルフィド結合の形成を可能にする１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、６６位は配列番号１で変異し、内部ジスルフィド結合を含む修飾ＦＧＦ－１を生成する。
【0168】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、安定のために製剤中に外因性ヘパリンなしで投与することができ、ヘパリンなしで製剤化および適用可能であり、これによって組織のヘパランへの結合を高めることが可能である。こうした修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、手術状態、外傷性状態またはジストロフィー状態ならびに疾患状態に曝露される組織のヘパランに高い親和性を有し、そのために適用時に疾患組織に結合する。加えて、より熱安定性がある修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、室温での製剤化および貯蔵に好適である。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが安定していることによって、これらは溶液（例えば、即時放出）製剤および徐放性製剤の両方での投与に好適なものとなる。
【0169】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位にうちの１つ以上で修飾された配列番号１である。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦは１６位、６６位および１１７位で修飾された配列番号１である。アミノ酸位置は、例えばＳｅｒ、Ｃｙｓ、Ｖａｌまたは他のアミノ酸で置換され、修飾アミノ酸と野生型アミノ酸との間にジスルフィド結合を形成することができる。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦはＮ－Ｍｅｔ ＴＨＸ１１１４とも呼ばれる配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｌｙｓ１２Ｖａｌ、Ｐｒｏ１３４Ｖａｌ、Ａｌａ６６Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１１７ＶａｌおよびＰｒｏ１３４Ｖａｌからなる群から選択される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは配列番号２の配列を含む。
【0170】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは組成物はプロドラッグとして調製されてもよい。「プロドラッグ」は、インビボで親薬物へと変換される薬剤を指す。状況によっては、プロドラッグは親薬物よりも容易に投与され得ることから、これらは多くの場合有用である。例えば、プロドラッグは経口投与では生物学的に利用可能であり得るが、一方で親薬物は利用不可である。プロドラッグはまた、親薬物よりも医薬組成物の溶解度が向上していてもよい。
【0171】
本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、同位体によって（例えば、放射性同位元素）または発色団もしくは蛍光部分、生物発光標識、光活性化型標識または化学発光型標識を含むがこれらに限定されない他の手段で標識されてもよい。
【0172】
本開示はさらに、１つ以上のＮ末端の修飾を含む修飾ＦＧＦポリペプチドに関し、修飾ＦＧＦポリペプチドは、ＦＧＦ－１（配列番号１）、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦ－９、ＦＧＦ－１０、ＦＧＦ－１１、ＦＧＦ－１２、ＦＧＦ－１３、ＦＧＦ－１４、ＦＧＦ－１５、ＦＧＦ－１６、ＦＧＦ－１７、ＦＧＦ－１８、ＦＧＦ－１９、ＦＧＦ－２０、ＦＧＦ－２１、ＦＧＦ－２２およびＦＧＦ－２３およびＦＧＦ－２４を含むＦＧＦファミリーのメンバーのいずれかであり得る。
【0173】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの合成は、当該技術分野に記載の方法の使用、本明細書に記載の方法の使用またはそれらを組み合わせて達成される。
【0174】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦの配列は、例えばＣｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌを有する、１つ以上の１６位、６６位および１１７位で変異した配列番号１に対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦは、例えばＣｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌといった１６位、６６位および１１７位での変異を有する野生型のヒトＦＧＦ－１配列を含む。
【0175】
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの調製のための組換え技術
種々の宿主発現ベクター系は、本明細書に提供される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを産生するために利用されてもよい。こうした宿主発現系は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが産生され、その後精製され得る媒体を表すが、適切なヌクレオチドのコーディング配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、その場所で修飾遺伝子産物を呈し得る細胞を表すこともできる。宿主発現系の例としては、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または例えば、ＨＴ１０８０、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３といったヒト細胞系を含む哺乳動物細胞系、例えばメタロチオネインプロモータといった哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータ、もしくは例えばアデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータといった哺乳動物ウイルス由来のプロモータ、もしくは例えばｐＳＨ１９およびｐＳＨ１５といった酵母由来プラスミド由来のプロモータ、もしくはラムダファージなどのバクテリオファージおよびこれらの誘導体由来のプロモータを含有する収容組換え発現コンストラクトなどではあるが、これらに限定されない細菌、植物、ヒト宿主系を含む哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。細菌発現系の例としては、大腸菌由来プラスミド（例えば、ｐＭＫｅｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３およびｐＥＴ－３）；枯草菌由来プラスミド（例えば、ＰＵＢ１１０、ｐＴＰ５およびｐＣ１９４）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌発現系はｐＭＫｅｔベクターを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１を発現させるためにｐＭＫｅｔ細菌発現ベクターの使用を含む方法は、修飾ＦＧＦ－１をコードする配列をｐＥＴベクターにサブクローニングすることを含む方法と比較すると、修飾ＦＧＦ－１の収量を約５倍～約６０倍向上させる。いくつかの実施形態では、ｐＥＴベクターに修飾ＦＧＦ１をサブクローニングすることを含む方法は、発酵運転後には約０．５ｇ～約０．７ｇ／１００Ｌの収量をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐＭＫｅｔベクターに修飾ＦＧＦ１をサブクローニングすることを含む方法は、発酵運転後には、例えば３７ｇ／１００Ｌなどの約２０ｇ～約４０ｇ／１００Ｌの収量をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐＭＫｅｔに修飾ＦＧＦ１をサブクローニングすること、および本明細書に記載の技術を使用してベクターからのタンパク質を精製することを含む方法は、約８２ｇ／５０Ｌの収量をもたらす。
種々の宿主発現ベクター系は、本明細書に提供される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを産生するために利用されてもよい。こうした宿主発現系は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが産生され、その後精製され得る媒体を表すが、適切なヌクレオチドのコーディング配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、その場所で修飾遺伝子産物を呈し得る細胞を表すこともできる。宿主発現系の例としては、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドについてコードするヌクレオチド配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのコーディング配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または例えば、ＨＴ１０８０、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３といったヒト細胞系を含む哺乳動物細胞系、例えばメタロチオネインプロモータといった哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータ、もしくは例えばアデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータといった哺乳動物ウイルス由来のプロモータ、もしくは例えばｐＳＨ１９およびｐＳＨ１５といった酵母由来プラスミド由来のプロモータ、もしくはラムダファージなどのバクテリオファージおよびこれらの誘導体由来のプロモータを含有する収容組換え発現コンストラクトなどではあるが、これらに限定されない細菌、植物、ヒト宿主系を含む哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。細菌発現系の例としては、大腸菌由来プラスミド（例えば、ｐＭＫｅｔ、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３およびｐＥＴ－３）；枯草菌由来プラスミド（例えば、ＰＵＢ１１０、ｐＴＰ５およびｐＣ１９４）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細菌発現系はｐＭＫｅｔベクターを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１を発現させるためにｐＭＫｅｔ細菌発現ベクターの使用を含む方法は、修飾ＦＧＦ－１をコードする配列をｐＥＴベクターにサブクローニングすることを含む方法と比較すると、修飾ＦＧＦ－１の収量を約５倍～約６０倍向上させる。いくつかの実施形態では、ｐＥＴベクターに修飾ＦＧＦ１をサブクローニングすることを含む方法は、発酵運転後には約０．５ｇ～約０．７ｇ／１００Ｌの収量をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐＭＫｅｔベクターに修飾ＦＧＦ１をサブクローニングすることを含む方法は、発酵運転後には、例えば３７ｇ／１００Ｌなどの約２０ｇ～約４０ｇ／１００Ｌの収量をもたらす。いくつかの実施形態では、ｐＭＫｅｔに修飾ＦＧＦ１をサブクローニングすること、および本明細書に記載の技術を使用してベクターからのタンパク質を精製することを含む方法は、約８２ｇ／５０Ｌの収量をもたらす。
【0176】
いくつかの実施形態では、宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節する、または望ましい特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングするために選択される。タンパク質産物のこのような修飾およびプロセシングは、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特異的機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実に行うために選択されることが可能である。この目的のため、遺伝子産物の一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。ヒト宿主細胞を含むこのような哺乳動物宿主細胞としては、ＨＴ１０８０、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３およびＷＩ３８が挙げられるがこれらに限定されない。
【0177】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は組換え型ＦＧＦタンパク質を発現させるために使用される。いくつかの実施形態では、細菌細胞は大腸菌細胞にある。いくつかの実施形態では、大腸菌株は、ＢＬ２１、ＢＬＡ２１Ａ１、Ｋ１２ ＨＭＳ１７４およびＷ３１１０から選択される。長期にわたる組換え型ペプチドの高収量での製造、安定した発現が望ましい。例えば、組換え型修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを安定して発現する細胞株が設計されてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するよりは、宿主細胞は、例えばプロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位および同等物、ならびに選択可能なマーカといった適切な発現制御要素で制御されるＤＮＡで形質転換されることができる。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸は、中で発現される株または細胞によるコドン使用を最大化させるように最適化される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸は、プロモータ、例えばポリＡ配列、または転写物を安定化させ、翻訳を容易にする配列といった３’ＵＴＲ制御配列に動作可能に連結される。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターは、カナマイシンなどの抗生物質への耐性遺伝子といった選択マーカを含む。
【0178】
いくつかの実施形態では、細菌発現のためのプロモータはＴ７プロモータである。
【0179】
いくつかの実施形態では、細菌発現のためのプロモータはＴａｃプロモータである。
【0180】
いくつかの実施形態では、プラスミドはｐＢＲ３２２ｏｒｉ配列を含む。
【0181】
いくつかの実施形態では、細菌発現ベクターは、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３およびｐＥＴ－Ｔ３またはｐＥＴ－Ｔ７ベクターなどの市販のベクター骨格から改変される。
【0182】
いくつかの実施形態では、タンパク質のペリプラズム発現が意図されている。組換え型タンパク質は、封入体に蓄積することがある。いくつかの実施形態では、タンパク質の細胞質発現が意図されている。いくつかの実施形態では、タンパク質の細胞質発現が意図されており、タンパク質は不溶性タンパク質である。いくつかの実施形態では、組換え型ポリペプチドは細胞外放出に望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドをコードする組換え核酸は、ｏｍｐＡリーダー配列などの好適なリーダー配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸は、ｏｍｐＡリーダー配列などの好適なリーダー配列を含まない。いくつかの実施形態では、製造中、ある特定の段階の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはペリプラズムに向けられる。ペリプラズムは封入体を含み、ここでポリペプチドが蓄積する可能性が高い。封入体は、ポリペプチドを回収するために細胞分画後に収集されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え核酸はリーダー配列を含有しない。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１は細胞での細胞質発現を対象とする。
【0183】
いくつかの実施形態では、組換え核酸コンストラクトは、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、細胞での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現を増加させるために最適化されている配列を含む。一実施形態では、１つ以上の修飾はプラスミドの修飾を含む。一実施形態では、１つ以上の修飾は、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための好適なプロモータを選択することを含む。
【0184】
さらなる実施形態では、１つ以上の修飾は、ポリペプチドを発現するための宿主細胞を開発することに関すると考えられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、細胞増殖を最大化させるための適切な栄養培地の調整につながると考えられ得る。一実施形態では、適切な栄養培地は炭素源を含む。一実施形態では、炭素源はグルコースまたはグリセロールである。
【0185】
一実施形態では、１つ以上の修飾は、宿主細胞のプラスミドのコピー数を増加し、発現効率を増加させるためにプラスミドで行われる。一実施形態では、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を最大化させるために１つ以上の修飾が考えられ、１つ以上の修飾は、
ｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸内での修飾；
ｉｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸に関連し、プロモータ、エンハンサ、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、ポリＡ尾部、転写物安定化配列から選択される１つ以上の調節配列要素を含む組換え核酸内での修飾；
ｉｉｉ．組換え核酸を含むプラスミドの修飾；
ｉｖ．細胞増殖を最大化させるための細胞株の修飾または細胞株の選択；
ｖ．細胞増殖培地の変性；および
ｖｉ．細胞から修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを回収するプロセスでの修飾、から選択されてもよい。
ｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸内での修飾；
ｉｉ．変異ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸に関連し、プロモータ、エンハンサ、５’－非翻訳領域、３’－非翻訳領域、ポリＡ尾部、転写物安定化配列から選択される１つ以上の調節配列要素を含む組換え核酸内での修飾；
ｉｉｉ．組換え核酸を含むプラスミドの修飾；
ｉｖ．細胞増殖を最大化させるための細胞株の修飾または細胞株の選択；
ｖ．細胞増殖培地の変性；および
ｖｉ．細胞から修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを回収するプロセスでの修飾、から選択されてもよい。
【0186】
いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸を含むプラスミドで、電気穿孔、または化学的に形質転換される。外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作された細胞を栄養強化培地中で１～２日間増殖させ、その後選択培地に交換される。いくつかの実施形態では、１つ以上の炭素源は、産生増加のため、発現されたＦＧＦポリペプチドの増加を目的として一定期間内に細菌細胞の増殖を最大化させるために使用される。いくつかの実施形態では、細菌細胞の炭素源はグルコースであってもよい。いくつかの実施形態では、細菌細胞の炭素源はグリセロールであってもよい。
【0187】
組換え型プラスミドの選択可能なマーカは選択に対する耐性を付与し、細胞は、プラスミドを自らの染色体中に安定的に導入し、結果として増殖して細胞株へとクローニングおよび増殖させることが可能である細胞増殖巣を形成する。いくつかの例では、この方法は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド産物を発現させる細胞株を遺伝子操作するために有利に使用され得る。このような遺伝子操作された細胞株は、遺伝子産物の生物学に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【0188】
本明細書に記載の製造方法は、修飾ＦＧＦ－１を発現する細菌培養物の製造を大規模なものにするために容易にスケールアップすることができる。いくつかの実施形態では、該方法は、１Ｌの細菌培養物中に、または１０Ｌの細菌培養物中に、または１００Ｌの細菌培養物中に、または５００Ｌの細菌培養物中にＦＧＦ－１を製造するように調整することができる。いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１０ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１００ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１ｋｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１０ｋｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。いくつかの実施形態では、該方法は、バッチあたり１００ｋｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するために規模を拡大することが可能である。
【0189】
一般に、種培養物は形質転換された細菌細胞から形成される。播種された種フラスコは、約２３５ＲＰＭ、３７℃でインキュベートされてもよい。１０～１４時間のインキュベーション後、それぞれのフラスコからの種培養物のサンプルを純度（汚染生物が観察されないウェットマウントの顕微鏡観察）、ｐＨ、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ６００）および無菌性の保持について検査してもよい。種培養物は、ＯＤ６００≧１．０および汚染生物が存在しないことを実証することで最適な増殖を示すことが望ましい。各製造運転からの６個の種フラスコは、スケールアップのために選択されてもよい。選択基準としては、１２±２時間の増殖時間、ＯＤ６００≧１．０および６個のフラスコを有することが挙げられ得る。発酵槽の種菌を形成するため、６個のフラスコの内容物は、総容量が約６リットルの種培養物については、ＢＳＣの１０Ｌのバッグ（滅菌したバイオプロセス用使い捨て容器）に貯蔵されてもよい。
【0190】
製造用培地（例えば、Ｓｏｙｔｏｎｅ１２ｇ／Ｌ、酵母抽出物 ２４ｇ／Ｌ、グリセロール １５．１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム １２．５ｇ／Ｌ、リン酸一水素カリウム ３．８ｇ／ＬおよびＰ２０００消泡剤 ０．１ｍＬ／Ｌといった栄養素を含む）を用いてｍＦＧＦ－１を発現させる培養大腸菌の発酵のため、１個以上の１５０Ｌの発酵槽が調製されてもよい。製造用培地はその場所で滅菌される。次に、滅菌培地に、硫酸マグネシウム七水和物 ０．４ｇ／Ｌ、カナマイシン ０．０５０ｇ／Ｌを含有した５±０．１Ｌ滅菌溶液が追加される。貯蔵された６リットルの種培養物を用い、適切な時点で１個または２個以上の発酵槽に播種してもよい。次に、発酵培養物を６０±３０分ごとにモニタリングし、ｐＨ、純度（ウェットマウントの顕微鏡観察）およびＯＤ６００についてサンプルを処理した。撹拌および空気流量を制御することで、溶存酸素を維持してもよい。リン酸および／または水酸化アンモニウムを適切に無菌添加することで、ｐＨを望ましい範囲内に維持してもよい。
【0191】
いくつかの実施形態では、ｍＦＧＦ－１の発現は、培養物が播種後３時間時点でＯＤ６００が約４．５に達した場合、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオ－ガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－１－ｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）０．２～０．４ｇ／ＬおよびＬ－アラビノース５．０ｇ／Ｌの追加により誘導される。いくつかの実施形態では、約１ｍＭまたは０．２５ｍＭ濃度のＩＰＴＧは、カナマイシンの有無にかかわらず、誘導のために使用される。いくつかの実施形態では、カナマイシンの存在下での誘導はプラスミド維持および細胞生存率の増加を必要としないが、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの製造に影響を及ぼす。いくつかの例では、誘導の長さは約８～１２時間、約１０～２０時間、約２０時間または約２４時間である。いくつかの例では、カナマイシンが存在する場合の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量（最終ＯＤ／細胞ペースト（ｇ／Ｌ）で測定される）は、１Ｌのスケールでは、カナマイシンが存在しない場合よりも約１．１～約５倍（例えば、１．２倍）多い。誘導のため、いくつかの実施形態では、炭素源は、例えば少なくとも約３０ｇ／Ｌの濃度のグリセロールであり、温度は約３７℃、ｐＨは約６．８である。誘導後、発酵をさらに３時間にわたって継続してもよい。遠心分離前に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび培養物純度による分析のため、各発酵槽からサンプルを採取してもよい。発酵は周期的に評価されてもよく、さらに１～２０時間にわたって増殖させてもよい。いくつかの実施形態では、最終培養物は、５０～１００、５０～２００、５０～２５０、７０～２６０または約１００、約２００または約２５０の吸光度に到達する。
【0192】
いくつかの実施形態では、チューブポンプおよび管を介して発酵ブロスを遠心分離機に移す（１分あたり０．５～０．８リットルで）ことでロットの収集を実施し、水循環ジャケットを使用して冷却しながら２０，０００ｘｇで遠心分離されてもよい。収集した細胞ペーストの質量を測定して回収し、４個の容器にこれを分け、－７０℃以下の冷凍庫に置いてもよい。
【0193】
細胞溶解：修飾ＦＧＦ－１を含む凍結細胞を適切な時点で融解し、好適な緩衝液に再懸濁させてもよい。緩衝液は例えば、トリスおよびＥＤＴＡを含んでもよい。例示的な実施形態では、細胞は、１：５（ｗ／ｖ）、すなわち５ｍＬの緩衝液中に１グラムの細胞ペーストといった割合で、１ｍＭ ＤＴＥを含有するＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で融解されてもよい。高圧ホモジナイザーにかける前に、懸濁液を１６℃未満に冷却してもよい。それぞれ通過させた後、ＯＤ６００は著しい減少がなくなるまでモニタリングされる。次に、等量のＴＥＳ＋５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を破壊された細胞懸濁液に混合してもよい。破壊された細胞懸濁液は、発現されたＦＧＦ－１タンパク質の回収のために使用されてもよい。発現されたタンパク質は、ＦＧＦ－１タンパク質に特異的に結合するアガロース系樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＤｅＶｉｒｓ（Ｃｙｔｉｖａ、ＢＰＧ ３００ｘ５００、製品番号１７－５４６６）などの高度に架橋されたアガロース系樹脂）を充填したアフィニティーカラムなど、特定の捕捉方法に細胞溶解物を通過させることで破壊された細胞から回収されてもよく、これは後で溶出される。ただし、ＦＧＦ－１の回収および収量を最大化させるため、タンパク質はＩＢでの発現を目的としてもよく、タンパク質は封入体から回収されてもよい。例示的な方法では、混合物を１５，９００ｘｇで６０分間、４℃で遠心分離にかけ、ｍＦＧＦ－１を含有する封入体を回収してもよい。溶解後、過剰発現したタンパク質は、遠心分離によって大腸菌ペーストからの封入体（ＩＢ）から回収されてもよい。
【0194】
いくつかの実施形態では、アガロース系樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＤｅＶｉｒｓ）を充填したアフィニティーカラムは、他の捕捉方法と比較すると、回収したＦＧＦ－１ポリペプチドのパーセント収量を約１％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約１５％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、約４５％～約５０％、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％または約９５％～約１００％増加させる。
【0195】
封入体からの回収：例示的な実施形態では、ＦＧＦ－１の回収のため、細胞ペーストは２～８℃で融解され、好適な緩衝液に再懸濁されてもよい。緩衝液はトリスおよびＥＤＴＡを含んでもよい。例えば、細胞ペーストはｐＨ７．４、４．５ＬのＴＥＳ緩衝液（５０ｍＭ トリス、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）で融解され、次に細胞は圧力均質化によって溶解されてもよい。５回均質化（約８，０００ｐｓｉ）を行い、最大量の細胞溶解を得てもよい。次に、等量のＴＥＳ緩衝液および５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｐＨ７．４）を細胞溶解物に加え、２．５％濃度のＴｒｉｔｏｎを得てもよい。
【0196】
便宜的に混合物を６本～２０本の遠心分離ボトルに分けてもよく、次にこれらを少なくとも３０分、約１５～２０℃にて２２５ＲＰＭで振盪させながらインキュベートさせる。これらのボトルを６０分間、４℃、１５，９００ｘｇで遠心分離にかけてもよい。上清を廃棄物として処分した。組織ホモジナイザー（Ｍｏｄｅｌ Ｏｍｎｉ ＧＬＨ８５０）を使用し、回収した封入体を２．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＥ緩衝液（約１Ｌ、５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）に個々に再懸濁させ、ボトルを少なくとも３０分、１５～２０℃にて２２５ＲＰＭで振盪させながらインキュベートさせた。インキュベーション後、ボトルを４５分間、４℃、１５，９００ｘｇで遠心分離にかけた。封入体洗浄プロセス、懸濁、インキュベーションおよび遠心分離を合計で３回実施した。回収した封入体は、２℃～８℃で一晩保存されてもよい。Ｔｒｉｔｏｎを含まないＴＥ緩衝液（約１Ｌ、５０ｍＭ トリス、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で封入体を洗浄し、ボトルを少なくとも１５分間、１５～２０℃にて２２５ＲＰＭで振盪させながらインキュベートさせた。いくつかの実施形態では、ＩＢは、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０を含む緩衝液で洗浄されてもよい。インキュベーション後、ボトルを３０分間、４℃、１５，９００ｘｇで遠心分離にかけた。Ｔｒｉｔｏｎなしでの洗浄、インキュベーションおよび遠心分離を合計で５回実施した。サンプルを取り出し、この段階での総タンパク質解析およびＳＤＳ－ＰＡＧＥクマシー染色／濃度測定解析にかけてもよい。いくつかの実施形態では、合計１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇまたは１０００ｇの封入体が回収され得る。各ロットの洗浄された封入体を含有する遠心分離ボトルは、－７０℃以下で保存され得る。
【0197】
洗浄された封入体の可溶化：各ロットの洗浄された封入体の可溶化は、可溶化緩衝液を使用して実施されてもよい。可溶化緩衝液は、尿素またはグアニジン塩などのカオトロピック成分を含んでもよい。洗浄された封入体を貯蔵から取り出し、２～８℃で融解した（１５時間～１９時間）。封入体を６０分間、４℃、１５，９００ｘｇで遠心分離にかけてもよく、液相を取り除いた後、ペレットの正味の重量を決定した。次に封入体を緩衝液中で可溶性にしてもよい。例示的な可溶化緩衝液は、４～８Ｍ グアニジンを含んでもよい。例示的な可溶化緩衝液は、６Ｍ グアニジンを含んでもよい。例示的な可溶化緩衝液は、４～６Ｍ 尿素を含んでもよい。さらに、こうした緩衝液は１００ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含んでもよい。溶液が目で見る限り均質になるまで、１０，０００ＲＰＭで組織ホモジナイザー（例えば、Ｍｏｄｅｌ Ｏｍｎｉ ＧＬＨ８５０）を使用して２～８℃で１ｇあたり１０ｍＬの割合で混合してもよい。グアニジンは、タンパク質変性をもたらすカオトロピック剤である。２～８℃の可溶化封入体に、１０ｍｇ／ｍＬの最終濃度までジチオエリトリトール（ＤＴＥ）を使用してジスルフィド結合をチオールに還元してもよい。この反応は２～６時間継続させることができる。次に、可溶化封入体を４０分間、４℃、１５，９００ｘｇで遠心分離にかけてもよい。遠心分離を含む全プロセスは、５時間未満であってもよい。上清は、２ＬのＰＥＴＧボトルに回収され、タンパク質濃度を検査しつつ、２～８℃（２５～５０分）で保存してもよい。タンパク質の結果に基づき、可溶化封入体を、希釈緩衝液（６Ｍ グアニジン、１００ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で２．０±０．５ｍｇ／ｍＬの標的濃度に希釈してもよい。１０ｍｇの標的濃度までＤＴＥを加え、混合してもよい。可溶化封入体を－７０℃以下で保存してもよい。１グラムのＩＢにつき１０ｍＬの緩衝液の割合で、１００ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ中の６Ｍ グアニジン塩酸塩（ｐＨ８．０）中にＩＢを溶解させてもよい。ＤＴＥを加え（１０ｍｇ／ｍＬ）、３～５時間混合した後（最初は組織ホモジナイザー、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ ＰＴ ３１００を用い、続いて磁気撹拌棒を用いる）、混合物を遠心分離にかけてもよい（１５，９００ｘｇで４０分以上）。上清を０．４５μｍフィルタでろ過してもよい。
【0198】
変性タンパク質のリフォールディング：グアニジン可溶化ＩＢ（２±０．５ｍｇ／ｍＬ）を冷リフォールディングバッファに加えてもよい。リフォールディングバッファは、Ｌ－アルギニン（例えば、０．５Ｍ Ｌ－アルギニン、１００ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ９．５）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リフォールディングバッファは酸化グルタチオンを含有してもよい。いくつかの実施形態では、リフォールディングバッファは還元グルタチオンを含有してもよい。可溶化ｍＦＧＦ－１をゆっくりと加え（例えば、リフォールディング溶液のボルテックス中に滴下する）、混合を２～８℃で２時間継続してもよい。等量の３Ｍ 硫酸アンモニウムをリフォールディング溶液に加え、２～８℃で１時間撹拌してもよい。
【0199】
回収されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出してもよい。当該技術分野に公知の１つ以上の方法で総タンパク質含有量を測定してもよい。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離されたタンパク質のクマシー染色で総タンパク質含有量を測定してもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）－ＨＰＬＣといったＨＰＬＣを使用し、回収されたタンパク質をさらに精製してもよい。
【0200】
インビトロでの細胞増殖アッセイでタンパク質の生物学的活性を評価してもよい。この目的のため、内皮細胞株を使用してもよい。いくつかの実施形態では、インビトロでの増殖アッセイに線維芽細胞を使用してもよい。
【0201】
いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、細胞からの修飾ＦＧＦ－１の回収量を向上させるために行われる。１つ以上の改善は、プラスミドベクターの改善、好適な細菌株の選択の改善、増殖培地の改善、ＩＰＴＧを用いた誘導時間の改善、細菌の最大増殖のためのインキュベーション時間の改善、および細菌増殖のための温度の最適化を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１２倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍の修飾ＦＧＦ－１収量の増加をもたらす。
【0202】
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのジスルフィド結合の形成
いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１にＣｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌといった変異を含み、ポリペプチドは、６６位および８３位のシステイン残基間に内部ジスルフィド結合を含む。多くの組換え型タンパク質については、正確なジスルフィド結合の形成は、これらのタンパク質の生物学的に活性である三次元立体構造を達成するためには不可欠である。誤ったジスルフィド結合の形成により、タンパク質のミスフォールディングおよび封入体への凝集が生じることがある。大腸菌では、システイン酸化は典型的にはペリプラズムで起こり、ジスルフィド結合は無数の酵素（主にＤｓｂファミリー由来の酵素）で触媒されるジスルフィド交換反応で形成される（Ｒｏｓａｎｏ，Ｇ．Ｌ．，＆Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１７２）。対照的に、細胞質のジスルフィド結合はほとんど形成されない。この状況は、Ｃｙｓ６６とＣｙｓ８３との間に内部ジスルフィド結合を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドなど、細胞質で産生されるジスルフィド結合を用いた組換え型タンパク質の産生に影響を及ぼす。したがって、いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現のため、ジスルフィド結合の形成に有利に働く酸化的細胞質環境を有する遺伝子操作された大腸菌株が宿主細胞として選択される（Ｒｏｓａｎｏ，Ｇ．Ｌ．，＆Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１７２）。こうした株の例としては、Ｋ－１２バックグラウンドにｔｒｘＢ－ｇｏｒ－遺伝子型を有するＯｒｉｇａｍｉ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＢＬ２１バックグラウンド（ＤＥ３）にｔｒｘＢ－ｇｏｒ－遺伝子型を有し、ジスルフィド結合イソメラーゼであるＤｓｂＣの染色体コピーを恒常的に発現するＳＨｕｆｆｌｅ（商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株（ＮＥＢ）を含むが、これらに限定されない。ＤｓｂＣは、誤って酸化されたタンパク質のそれらの正確な形態への補正を推進し、これはジスルフィド結合を必要としないタンパク質のフォールディングを支援することができるシャペロンでもあることが示される。特定の理論に限定されるものではないが、ＤｓｂＣの作用により、Ｃｙｓ６６とＣｙｓ８３との間に内部ジスルフィド結合を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドなどの標的タンパク質が凝集して封入体になることはほとんどないことが企図されている。したがって、ある特定の実施形態では、本開示はＣｙｓ１６とＣｙｓ８３との間に内部ジスルフィド結合を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの細胞質産生のための方法の改善を確認する。
いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１にＣｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌといった変異を含み、ポリペプチドは、６６位および８３位のシステイン残基間に内部ジスルフィド結合を含む。多くの組換え型タンパク質については、正確なジスルフィド結合の形成は、これらのタンパク質の生物学的に活性である三次元立体構造を達成するためには不可欠である。誤ったジスルフィド結合の形成により、タンパク質のミスフォールディングおよび封入体への凝集が生じることがある。大腸菌では、システイン酸化は典型的にはペリプラズムで起こり、ジスルフィド結合は無数の酵素（主にＤｓｂファミリー由来の酵素）で触媒されるジスルフィド交換反応で形成される（Ｒｏｓａｎｏ，Ｇ．Ｌ．，＆Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１７２）。対照的に、細胞質のジスルフィド結合はほとんど形成されない。この状況は、Ｃｙｓ６６とＣｙｓ８３との間に内部ジスルフィド結合を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドなど、細胞質で産生されるジスルフィド結合を用いた組換え型タンパク質の産生に影響を及ぼす。したがって、いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現のため、ジスルフィド結合の形成に有利に働く酸化的細胞質環境を有する遺伝子操作された大腸菌株が宿主細胞として選択される（Ｒｏｓａｎｏ，Ｇ．Ｌ．，＆Ｃｅｃｃａｒｅｌｌｉ，Ｅ．Ａ．（２０１４）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５，１７２）。こうした株の例としては、Ｋ－１２バックグラウンドにｔｒｘＢ－ｇｏｒ－遺伝子型を有するＯｒｉｇａｍｉ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＢＬ２１バックグラウンド（ＤＥ３）にｔｒｘＢ－ｇｏｒ－遺伝子型を有し、ジスルフィド結合イソメラーゼであるＤｓｂＣの染色体コピーを恒常的に発現するＳＨｕｆｆｌｅ（商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ株（ＮＥＢ）を含むが、これらに限定されない。ＤｓｂＣは、誤って酸化されたタンパク質のそれらの正確な形態への補正を推進し、これはジスルフィド結合を必要としないタンパク質のフォールディングを支援することができるシャペロンでもあることが示される。特定の理論に限定されるものではないが、ＤｓｂＣの作用により、Ｃｙｓ６６とＣｙｓ８３との間に内部ジスルフィド結合を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドなどの標的タンパク質が凝集して封入体になることはほとんどないことが企図されている。したがって、ある特定の実施形態では、本開示はＣｙｓ１６とＣｙｓ８３との間に内部ジスルフィド結合を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの細胞質産生のための方法の改善を確認する。
【0203】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがＮ－Ｍｅｔ残基がある状態で発現される場合、ポリペプチドは、Ｎ末端ペプチドを除去するためのタンパク質分解切断を必要とするステップなしにその後精製される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、Ｎ末端ペプチドを除去するためのタンパク質分解切断ステップを含まない、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの迅速な精製方法を提供する。これは、医薬品の製造管理および品質管理の基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＧＭＰ）ガイドラインに従った修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの製造に特に有利である。こうした利点としては切断分解ステップの欠如が挙げられており、切断分解された産物を後で精製すること、および分離切断に使用される試薬を除去する必要性がなくなることを含む。さらなる利点は、処理を減らすことによる収量増加、ならびに切断分解のために導入される残留切断分解試薬および汚染物質、未切断分解物質からの切断後の分離を試験する必要性の減少である。
【0204】
使用方法
一実施形態では、上記実施形態に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬製剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の眼の疾患、障害または病気を治療する方法が本明細書に提供される。いくつかの例では、本明細書に記載の方法で使用する修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２および配列番号９～２０４から選択される配列を含む。一実施形態では、配列番号２０５または２０６に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬製剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の眼の疾患、障害または病気を治療する方法が本明細書に提供される。
一実施形態では、上記実施形態に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬製剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の眼の疾患、障害または病気を治療する方法が本明細書に提供される。いくつかの例では、本明細書に記載の方法で使用する修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２および配列番号９～２０４から選択される配列を含む。一実施形態では、配列番号２０５または２０６に示される配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬製剤を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の眼の疾患、障害または病気を治療する方法が本明細書に提供される。
【0205】
いくつかの実施形態では、治療される眼の疾患、障害または病気は、角膜内皮層の疾患、障害または病気である。角膜内皮層の疾患、障害または病気としては、フックスジストロフィー、水疱性角膜症、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー１、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー２および後部多形性角膜内皮ジストロフィーが挙げられるが、これらに限定されない。
【0206】
理論に限定されるものではないが、眼の房水へと房内に注射される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド溶液（例えば、本明細書に記載の医薬製剤）は、内皮表面、特に健康な内皮層に覆われている角膜領域のどこかに結合すると考えられている。修飾ＦＧＦは、内皮細胞の増殖および遊走を刺激する。修飾ＦＧＦは内皮ジストロフィーに関連する角膜浮腫を軽減し、角膜または内皮移植が必要となる可能性を減少させる。修飾ＦＧＦは、最も大きいジストロフィーの部位（典型的には角膜中央）以外の部位で作用し、さらに角膜辺縁の内皮細胞および線維柱帯（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｍｅｓｈｗｏｒｋ、ＴＭ）の内皮前駆細胞プールの刺激をもたらす。
【0207】
いくつかの実施形態では、治療される眼の疾患、障害または病気は、角膜上皮の疾患、障害または病気である。角膜上皮の疾患、障害または病気としては、再発性角膜びらん、遷延性角膜上皮欠損、ドライアイ症候群、スティーヴンス・ジョンソン症候群などの炎症性疾患および角膜上皮欠損が挙げられるが、これらに限定されない。
【0208】
いくつかの実施形態では、治療される眼の疾患、障害または病気はヘルペス性角膜症である。ヘルペス性角膜症は、典型的には単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）によって引き起こされる角膜の感染症である。初感染は、感染性ＨＳＶに宿主の粘膜が直接曝露した結果であり得る。初感染および知覚神経節に潜伏が確立した後、ウイルスが刺激されて感染サイクルに入り、ここから角膜に戻る。一度感染すると、この再発性感染症によって種々の合併症、特に炎症性応答が生じるが、この炎症性応答が十分強い場合には角膜の完全性を損なう可能性があり、角膜潰瘍、混濁、濁り、瘢痕および重度の場合には失明につながる。ヘルペスへの感染に続き、慢性ヘルペス性角膜症、神経栄養性角膜症またはそれらの両方を発症する可能性がある。例えば、免疫介在性感染症であり、かつ先進国での角膜失明の主な原因である角膜実質感染症は、慢性的なウイルスの再活性化の結果として起こり、変性疾患である神経栄養性角膜症が生じる。標準状態の角膜は神経支配が密であるが血管が存在しない。ウイルスへの初感染後に発現する症状としては、神経を損傷し、それによる角膜知覚の減少（角膜知覚鈍麻）がもたらされるだけではなく、血管形成および新生血管形成ももたらし得る。さらなる実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを使用し、細菌感染または真菌感染により引き起こされる感染性角膜炎を治療することができる。
【0209】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを使用し、上皮基底膜ジストロフィー、若年性メースマン角膜上皮ジストロフィー、膠様滴状角膜ジストロフィー、虹彩角膜上皮ジストロフィー、上皮下粘液性ジストロフィー、ライス・ビュックラース角膜ジストロフィーまたはティールベンケジストロフィーおよび再発性角膜びらんを治療することができる。
【0210】
いくつかの実施形態では、眼の病気としては、角膜の損傷（例えば、角膜と房水との界面での角膜表面もしくは内皮層）またはＰＲＫ、ＬＡＳＩＫおよび全層角膜手術または角膜移植のいずれかを含む角膜手術により引き起こされる外科的破壊が挙げられる。
【0211】
本明細書には、修飾線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ－１）ポリペプチドまたはかかる修飾ペプチドを含む医薬組成物もしくは薬剤を投与することで化学物質またはびらん剤誘発性損傷を治療する方法もまた提供される。
【0212】
一実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することで化学物質またはびらん性毒ガス誘発性損傷を治療する方法もまた提供される。いくつかの実施形態では、該方法は、化学物質またはびらん剤により引き起こされる皮膚損傷または眼の損傷を治療することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、本明細書に記載のポリペプチドとして修飾ＦＧＦ－１を投与することで、例えばナイトロジェンマスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ、ＮＭ）など、びらん性毒ガスによって誘発されるマスタードガス角膜症を治療することを含む。本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドでＭＧＫを治療することにより、いくつかの実施形態では、角膜上皮層の過形成、角膜－角膜実質細胞の分離による浮腫、角膜びらんなど、ＭＧＫに関連する組織病理学的疾患の寛解がもたらされる。本開示の修飾ＦＧＦ－１の投与により、ある特定の実施形態では、浮腫の軽減および角膜びらんの除去がもたらされる。角膜びらんは、典型的には角膜の脱上皮化により特徴付けられ、いくつかの例では、修飾ＦＧＦ－１の投与により、迅速な角膜の再上皮化がもたらされる、または角膜の脱上皮化の重症度が低下する。一実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１を投与することで化学物質またはびらん性毒ガスに曝露した患者の眼表面の上皮を再生させる方法が記載される。いくつかの実施形態では、該方法は、眼の再生を促進させ、角膜変性を予防し、化学損傷による長期後遺症を予防する。いくつかの例では、該方法は、角膜内皮損傷、角膜上皮損傷または角膜実質損傷を治療することを含む。該方法によって角膜内皮損傷が治療される場合には、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１を投与することにより、角膜内皮細胞の機能が増強され、角膜の長期変性を予防する。いくつかの例では、該方法によって角膜内皮損傷が治療される場合には、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１を投与することにより、角膜浮腫および続発性前部角膜症を予防する。いくつかの例では、該方法によって角膜内皮損傷が治療される場合には、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１を投与することにより、角膜内皮細胞の減少を予防する。いくつかの実施形態では、該方法は、角膜上皮剥離の重症度の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、該方法は、角膜実質の瘢痕および角膜混濁などの角膜実質損傷を治療することを含む。
【0213】
いくつかの実施形態では、眼の病気は、角膜への事故による外傷または化学損傷もしくは熱傷を含む。いくつかの例では、化学損傷または熱傷は化学熱傷である。いくつかの例では、化学損傷または熱傷はびらん剤により引き起こされる。いくつかの例では、化学損傷または熱傷は化学兵器により引き起こされる。
【0214】
多数の家庭用化合物および業務用化合物は、眼および皮膚に化学熱傷を誘発する潜在性がある。迅速な介入を行わない場合、不可逆的な視力喪失および外見の悪化が広がる可能性がある。熱を放出することなく、酸性薬剤およびアルカリ性薬剤の両方を迅速に中和し、かつ拡散を制限する薬剤は、化学損傷を治療する上で有効であると企図されている。例示的な化学損傷としては、アルカリ性損傷、酸性損傷が挙げられるがこれらに限定されない。化学熱傷の一般的な原因としては、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）、塩酸（ＨＣｌ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、石灰（ＣａＯ）、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、塩素ガスおよび何らかの強酸化剤が挙げられる。
【0215】
本明細書に記載の化学損傷または熱傷を引き起こし得る例示的な化学兵器は、痒み促進剤（ｕｒｔｉｃａｎｔ）または湿疹剤であるホスゲンである。ホスゲンは毒性が強く、室温および標準圧力では無色の気体であり、０℃で濃縮して発煙液体となる。この分子式はＣＯＣｌ２である。ホスゲンは、急性（短期）吸入曝露によって極めて毒性が強くなる。ヒトでは、肺水腫、肺気腫を含む呼吸器への重度の作用および死亡が報告されている。重度の眼への刺激および皮膚の火傷は、眼または皮膚への曝露後に生じる可能性がある。ホスゲンへの慢性（長期）吸入曝露により、肺気腫および線維症などの不可逆的な肺の変化を引き起こす可能性もある。ホスゲンへの曝露は、その迅速な浸透と重度の皮膚損傷を即時に引き起こす能力が原因の死亡率が上昇することを含む広範かつ壊滅的な影響を生じさせる可能性がある。近年の研究結果によれば、気化したホスゲンへの局所的な皮膚曝露によって、マウスモデルでは、曝露後数分以内から曝露の８時間までに環状紅斑、壊死、浮腫、軽度の痒みおよび紅斑とともに、曝露した皮膚が白くなることが分かっている。これらの臨床的な皮膚症状は、皮膚の厚みの増加、アポトーシス細胞死、肥満細胞の脱顆粒、好中球浸潤を示すミエロペルオキシダーゼ活性、ｐ５３リン酸化および蓄積、ならびにＣＯＸ－２およびＴＮＦαレベルの増加を伴う。局所的なホスゲン曝露はまた、肝臓、膵臓、腎臓、肺および心臓組織血管内のＲＢＣを確実に増加させつつ、末梢血管の拡張ももたらす。これらの事象は、ショック、低酸素症および死につながる血圧降下を引き起こすこともあると考えられている。Ｔｅｗａｒｉ－Ｓｉｎｇｈ Ｎ，Ｇｏｓｗａｍｉ ＤＧ，Ｋａｎｔ Ｒ，Ｃｒｏｕｔｃｈ ＣＲ，Ｃａｓｉｌｌａｓ ＲＰ，Ｏｒｌｉｃｋｙ ＤＪ，Ａｇａｒｗａｌ Ｒ，Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ｖｅｓｉｃａｎｔ ｐｈｏｓｇｅｎｅ ｏｘｉｍｅ：Ａｃｕｔｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７ Ｆｅｂ １５；３１７：２５－３２を参照されたい。
【0216】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、びらん性毒ガスへの曝露により引き起こされる種々の皮膚損傷を治療、予防または寛解する方法で使用されてもよい。
【0217】
びらん性毒ガスまたはびらん剤または水疱剤は、火傷により引き起こされる皮膚損傷に似た損傷を生じさせる毒性化合物である。吸入時、これらの薬剤は上気道および肺に影響を及ぼし、肺水腫を引き起こす。例えば、Ｇａｎｅｓａｎ，Ｋ．，Ｓ．Ｋ．Ｒａｚａ，ａｎｄ Ｒ．Ｖｉｊａｙａｒａｇｈａｖａｎ（２０１０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ａｇｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２．３：１６６－１７８を参照されたい。これらの薬剤は重度の眼損傷も引き起こす可能性がある。これらの薬剤としては、マスタードとヒ素剤といった２つの形態のびらん剤が存在する。こうした分類の化学兵器における最も重要な物質はスルフィルマスタードである。他のメンバーとしては、ナイトロジェンマスタード（ＨＮ１、ＨＮ２およびＨＮ３）およびルイサイト（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）、エチルジクロロアルシン、メチルジクロロアルシン、フェニルジクロリアルシン（ｐｈｅｎｙｌｄｉｃｈｌｏｒｉａｒｓｉｎｅ）などのヒ素性びらん剤が挙げられる。びらん剤の特定の例としては、スルフィルマスタード（ＳＭ）、ビス－（２－クロロエチル）スルフィド、クロロエチルエチルスルフィド（ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｉｄｅ、ＣＥＥＳ）、ルイサイトおよびナイトロジェンマスタード（ＮＭ）ファミリーの一員である２－クロロ－Ｎ－（２－クロロエチル）－Ｎ－メチルエタンアミンヒドロクロリドが挙げられるが、これらに限定されない。本開示全体を通して使用される場合、びらん性毒ガス、水疱形成誘発剤または化学物質、水疱形成剤などといった用語は、本明細書に具体的に列挙されているようなびらん性毒ガスならびに毒物および／または化学兵器などの他の化合物を意味すると解釈される。スルフィルマスタードは、第一次世界大戦での使用を理由として最も軍事的意義が大きいびらん性毒ガスである。ナイトロジェンマスタードは１９３０年代に合成されたが、戦争を目的としては大量生産されなかった。塩酸メクロレタミン（ＨＮ２、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）は、がん用化学療法剤としての最も平和的な用途が発見されており、長年にわたってがん用化学療法剤用の標準的化合物として存在し続けている。ルイサイト（Ｌ）は、その非可燃性およびマスタードに類似する毒性により軍事目的で１９１８年に合成されたが、戦場での使用はされていないものと考えられている。マスタードは放射線類似性であり、分裂細胞に対して極めて毒性が高い。マスタードは脂溶性であり、皮膚、ほとんどの織物およびゴムに容易に浸透する。細胞膜を通過した後、スルフィルマスタードは高い反応性を有するスルホニウムイオンに変換される。スルホニウムイオンはＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質を不可逆的にアルキル化して細胞死を引き起こす。最も重要な標的はＤＮＡである。マスタードは、ＤＮＡのプリン塩基をアルキル化し、それらを損傷させる。ルイサイトは極めて迅速に皮膚に吸収され、冒された器官に直ちに疼痛および刺激を引き起こし、さらに全身症状を生じさせる。これはスルフヒドリル基に直接結合し、これらを不活性化させる。
【0218】
戦争におけるスルフィルマスタード（ＳＭ）および他の水疱形成剤の使用は長い間知られてきた。直近では、２０１５年８月、ＩＳＩＳはイラクのクルド人組織との戦闘、およびシリアでの戦闘でＳＭを使用した。マスタード剤は、眼、皮膚および肺を損傷させるが、眼が最も感受性が高い。症状は曝露後２～４時間までは顕在化しないため、曝露したヒトは自分がマスタードに曝露したことを直ちに認識することがない。この認識の遅れは、曝露症状が最終的に発症した時の混乱およびパニックの要因となる。眼については、これらの症状は眼瞼痙攣、流涙、刺激、疼痛および羞明からなる。気化したスルフィルマスタード（ＳＭ）への眼の曝露による角膜損傷は、最も一般的な戦争による化学損傷である。眼の曝露は、損傷の完全な消散、慢性損傷への即時移行または明白な回復とそれに続く、眼の持続症状のその後の発症といった３つの異なる用量依存的な臨床経過を呈する。これらの臨床経過のうち後者２つの経過としては、マスタードガス角膜症（ＭＧＫ）としてまとめて知られている一連の角膜症状が挙げられる。急性損傷中の組織特異性損傷によって角膜内皮および角膜縁幹細胞の再生能が低下し、それによって角膜は慢性型または遅延型のＭＧＫの素因となってしまう。
【0219】
一部の患者については、ＭＧＫは曝露後数週間で生じるが、他の患者については顕在化までに数年を要した。この角膜症は、角膜の結膜弛緩症および角膜縁幹細胞欠乏により特徴付けられる。ヒトの角膜内皮では、ＣＥＣ損失によるギャップは、典型的には近位ＣＥＣが伸展することで満たされることが示されている。これらの組織の変換は、角膜と房水との間のバリアのそれ以上の維持が不可能となるまで内皮損失を補い、持続性角膜浮腫および続発性前部角膜症をもたらす。成人のヒトＣＥＣはインビボで増殖しないため、それゆえにＣＥＣが損失することは、内皮能の永続的な減少を潜在的に表す。したがって、内皮機能はＣＥＣ伸展による軽度損傷後に回復する可能性があるが、より重度の損傷は、ヒト内皮の修復能力を上回る可能性がある。ウサギは、限定的なＣＥＣ増殖を起こすことができるという点でヒトと異なるため、ＣＥＣ損失から回復する能力が改善される。ただし、ヒトと同様に、ウサギ内皮に対して十分重度の損傷もまた、不可逆的な角膜代償不全および続発性角膜症をもたらす。
【0220】
上記研究に基づき、びらん性毒ガスによって誘発される内皮不全は、ＭＧＫ病因の背景にある原因機構である可能性があると仮定されている。この仮説は、ヒトおよびウサギで認められるＳＭとＭＧＫ発症との間の用量依存性、ならびにヒト死傷者で報告されている異なる臨床経過（消散した慢性ＭＧＫおよび遅延発症型ＭＧＫ）と一致している。この仮説に従い、低用量のびらん性毒ガスへの角膜曝露により、最小限の内皮毒性による急性上皮病変がもたらされるが、角膜は長期合併症なしで回復する可能性がある。代替的には、角膜内皮に対する回復不可能な損傷を引き起こす用量のびらん性毒ガスへの曝露により、内皮のバリア不全が生じ、それによって続発性前部角膜症を伴う持続性浮腫が生じる。重度の損傷の後、急性損傷とＭＧＫ発症との間には明白な遅延が存在しない場合がある。
したがって、スルフィルマスタードおよび同様に作用する化学毒物、特に化学兵器による損傷を最小化または予防するための組成物および方法は、米国国防総省のために働く科学者にとって重要な探求である。近年の研究は、水疱形成剤としてのマスタード化合物は、上皮－実質付着の減少につながることを示している。角膜ではミクロの水疱が形成され、一度十分な量が発生すると角膜上皮は基底膜をしっかりと維持することができず、上皮組織を脱落させる。したがって、角膜実質に付着し続けるように角膜上皮の能力を増強するため、ＳＭへの有効な曝露後治療が望ましい。理論に限定されるものではないが、角膜実質に付着し続ける角膜上皮の能力によって、一部の基底上皮がその場所で回復する機会を与え、それらの基底膜と角膜実質との接合を維持することが企図されている。上皮－実質完全性において重要な役割を担うもののうちの１つは、ヘミデスモソームの膜貫通成分であるコラーゲンＸＶＩＩ（すなわち、ＢＰ１８０）であるとも仮定されている。損傷後、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７を含むタンパク質のＡＤＡＭ（「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ」）ファミリーによるコラーゲンＸＶＩＩの切断は、上皮細胞をそれらの基底膜から放出させ、こうした切断は上皮細胞を遊走させる。
したがって、スルフィルマスタードおよび同様に作用する化学毒物、特に化学兵器による損傷を最小化または予防するための組成物および方法は、米国国防総省のために働く科学者にとって重要な探求である。近年の研究は、水疱形成剤としてのマスタード化合物は、上皮－実質付着の減少につながることを示している。角膜ではミクロの水疱が形成され、一度十分な量が発生すると角膜上皮は基底膜をしっかりと維持することができず、上皮組織を脱落させる。したがって、角膜実質に付着し続けるように角膜上皮の能力を増強するため、ＳＭへの有効な曝露後治療が望ましい。理論に限定されるものではないが、角膜実質に付着し続ける角膜上皮の能力によって、一部の基底上皮がその場所で回復する機会を与え、それらの基底膜と角膜実質との接合を維持することが企図されている。上皮－実質完全性において重要な役割を担うもののうちの１つは、ヘミデスモソームの膜貫通成分であるコラーゲンＸＶＩＩ（すなわち、ＢＰ１８０）であるとも仮定されている。損傷後、ＡＤＡＭ９、ＡＤＡＭ１０および／またはＡＤＡＭ１７を含むタンパク質のＡＤＡＭ（「ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ」）ファミリーによるコラーゲンＸＶＩＩの切断は、上皮細胞をそれらの基底膜から放出させ、こうした切断は上皮細胞を遊走させる。
【0221】
ＴＮＦ－α変換酵素またはＴＡＣＥとしても公知であるＡＤＡＭ１７は、損傷に対する一般的な応答であり、コラーゲンＸＶＩＩ放出の「シェダーゼ」である。びらん剤への曝露によって誘発される角膜でのミクロ水疱形成は、コラーゲンＸＶＩＩを切断可能であるＡＤＡＭ１７が部分的に活性化していることに起因すると仮定されていた。実験データにより、びらん剤であるＮＭに曝露した角膜の基底膜領域で、ＡＤＡＭ１７発現の誘導が確認された。したがって、ＡＤＡＭ１７発現の曝露後増加を阻害することができる薬剤は、びらん剤により引き起こされる角膜損傷の減弱に有用であると企図されている。
【0222】
本開示は、治療して有害作用を減少させ、それ以外の場合にはＳＭおよびＮＭなどのびらん剤への曝露の治癒の一助となる修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを提供する。本明細書に開示される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、ＳＭおよび／またはＮＭなどのびらん剤への曝露後のＡＤＡＭ１７の過剰発現を予防することが可能である。
【0223】
本開示はまた、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することで、化学物質またはびらん性毒ガス誘発性損傷への曝露の有害作用を治療、予防、軽減し、それ以外の場合にはこれを治癒する一助となる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって、ＳＭおよび／またはＮＭなどのびらん剤への曝露後にＡＤＡＭ１７の過剰発現がさらに予防される。
【0224】
例えば配列番号１の野生型ＦＧＦ－１タンパク質は、酸化およびアルキル化を受けやすい不対システイン残基を有する。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが不対システイン残基を含まない本開示のいくつかの実施形態では、こうした修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはびらん剤による酸化および／またはアルキル化をほとんど受けない。実験データはまた、ＦＧＦ－１およびそのｍＲＮＡレベルの減少がマスタード剤への曝露から生じることが公知であると示しており、この損失が、マスタードにより誘発される角膜病変の治癒を遅延させる一因であり得ると仮定される。本開示のいくつかの実施形態では、遊離システイン残基を含まず、したがってシステイン修飾をほとんど受けない、またはこれを受けない修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、マスタードによる角膜病変の治癒を加速させるという点で有効である。
【0225】
本開示のいくつかの実施形態では、該方法は不対システイン残基を含まず、びらん剤による酸化および／またはアルキル化をほとんど受けない修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することを含む。本開示のいくつかの実施形態では、該方法は遊離システイン残基を含まず、したがってシステイン修飾をほとんど受けない、またはこれを受けない修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＭＧＫに関連する角膜病変の治癒を加速させるという点で有効である。
【0226】
スルフィルマスタード（ＳＭ）およびナイトロジェンマスタード（ＮＭ）などのびらん剤への曝露は、ゆっくりとした水疱形成を伴う重度の皮膚損傷を引き起こし得る。これらの曝露の用量および時間に応じ、浮腫および紅斑は水疱、潰瘍、壊死、剥離、色素沈着の変化へと潜在的に発展する可能性があり、曝露後数週間、場合によっては数年間これが持続する。例えば、Ｔｅｗａｒｉ－Ｓｉｎｇｈ Ｎ，Ａｇａｒｗａｌ Ｒ，Ｍｕｓｔａｒｄ ｖｅｓｉｃａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｓｉｌｉｂｉｎｉｎ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔｅｒｍｅａｓｕｒｅ，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２０１６ Ｊｕｎ；１３７４（１）：１８４－９２を参照されたい。別の例示的なびらん剤であるホスゲンオキシム（ＣＸ）は痒み促進剤または湿疹剤であるが、潜在的な化学兵器およびテロ兵器でもある。
【0227】
いくつかの実施形態では、治療される眼の疾患、障害または病気は、角膜実質の疾患、障害または病気である。角膜実質の疾患、障害または病気としては、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、顆粒状角膜ジストロフィー、黄斑角膜ジストロフィー、シュナイダー結晶性角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、斑状角膜ジストロフィー、外傷または化学損傷もしくは熱傷、トラコーマなどの感染症に続発する損傷が挙げられるが、これらに限定されない。
【0228】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、角膜もしくは眼表面細胞の治癒の加速ならびに／または侵襲に対する細胞応答の改善（例えば、移植細胞の生存率および／もしくは寿命の増加による）が治療効果をもたらすであろう場合、角膜（例えば、角膜内皮構造）の破壊を含む角膜移植手技（例えば、角膜移植またはデスメ膜を含む手技）の前、その間またはその後に適用され得る。
【0229】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを使用し、移植のために調製されている角膜細胞または角膜前駆細胞の生存率および健康を増加させることができる。提供された角膜および他の提供された角膜組織向けの器官培養培地に加えられる修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、角膜細胞を刺激し、角膜の移植前貯蔵可能時間を増加させ、移植に有用であるように十分に健康な細胞を角膜が有する可能性を増加させる。加えて、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、これらの細胞の増殖を刺激するように角膜前駆細胞を培養する場合に培地中で使用することができる。
【0230】
さらなる実施形態は、角膜内皮細胞と修飾ＦＧＦ（例えば、配列番号２の配列を含むものといった修飾ＦＧＦ－１）とを接触させることを含む、当該角膜内皮細胞で１つ以上の線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の活性を調節する方法に関する。かかる方法を使用して１つ以上のＦＧＦＲの活性を増加または刺激し、それによって細胞遊走および／または細胞増殖の増加をもたらすことができる。
【0231】
さらなる実施形態では、本開示に従って修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを投与することで、代謝性疾患を治療する方法が記載されている。本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドで治療することができる例示的な代謝性疾患としては、（１）糖尿病（Ｉ型およびＩＩ型）、妊娠糖尿病、高血糖症、インスリン抵抗性、グルコース代謝異常、「境界型糖尿病」（空腹時血糖異常（Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｆａｓｔｉｎｇ Ｇｌｕｃｏｓｅ、ＩＦＧ）または耐糖能異常（Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ、ＩＧＴ））を含む、グルコース利用障害およびそれらに関連する後遺症、ならびに例えば膵β細胞破壊などの組織病理学的変化を含む高血糖状態に関連またはここから生じる他の生理学的障害；（２）例えば、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、脳血管障害などの脂質異常症およびそれらの後遺症；（３）肥満および体重増加（非アルコール性脂肪性疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＮＡＤＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ、ＮＡＳＨ）および多嚢胞性卵巣症候群（ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｏｖａｒｉａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＰＣＯＳ）など、肥満および体重増加の併存症を含むがこれらに限定されない）などのメタボリックシンドロームに関連する可能性があり、血栓症、凝固性亢進および血栓形成促進性症状（動脈および静脈）、高血圧、心血管疾患、脳卒中および心不全もまた含み得る他の病気；（４）アテローム性動脈硬化、慢性炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、喘息、エリテマトーデス、関節炎または他の炎症性リウマチを含む、炎症性反応が含まれる障害または病気；（５）脂肪細胞腫瘍、例えば脂肪肉腫を含む脂肪腫性肉腫、充実性腫瘍および腫瘍など、細胞周期または細胞分化プロセスの障害；（６）アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、進行性多巣性白質脳症およびギランバレー症候群を含む、神経変性疾患ならびに／または中枢神経系および末梢神経系の脱髄障害ならびに／または脳内炎症プロセスおよび／もしくは他の末梢神経障害に関係する神経性疾患；（７）紅斑性扁平上皮皮膚疾患を含む、皮膚および皮膚科学障害ならびに／または創傷治癒プロセスの障害、ならびに（８）シンドロームＸ、変形性関節症および急性呼吸窮迫症候群などの他の障害、が挙げられるが、これらに限定されない。治療有効量の本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（またはこれをコードする核酸分子）を投与することによる、摂食時および空腹時の血中ブドウ糖を減少させる方法、インスリン感受性および耐糖能を改善する方法、慢性全身性炎症を軽減させる方法、哺乳動物での脂肪肝を寛解させる方法、食物摂取を減少させる方法、またはこれらの方法の組合せもまた、記載される。
【0232】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは創傷治癒のために投与される。創傷の例としては、表皮剥脱、剥離、気胸（例えば、開放性気胸）、火傷、挫傷、銃創、切創、開放創、穿通創、貫通創、穿刺創、串線創、刺創、手術創、皮下創傷、糖尿病性病変または接線創傷が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載の化合物および組成物で治療することができるさらなる創傷の例としては、熱傷、化学熱傷、放射線熱傷、紫外線への過度の曝露により引き起こされる火傷（例えば、日焼け）などの急性疾患または創傷；分娩および出産の結果としての会陰などの生体組織の損傷；会陰切開など医療手技中に経験する損傷；切除、切開、擦過傷を含む外傷誘発性損傷；事故によって経験する損傷；手術後の損傷および褥瘡、床ずれ、糖尿病および循環不良に関連する病気などの慢性疾患、ならびに全種類の挫瘡が挙げられる。加えて、創傷としては、膿痂疹、間擦疹、毛包炎および湿疹などの皮膚炎、歯科手術後の創傷；歯肉炎、外傷後の創傷；ならびに腫瘍関連創傷が挙げられ得る。創傷のさらに他の例としては、動物による咬傷、動脈疾患、昆虫による刺傷および咬傷、骨感染症、皮膚／筋肉移植片の損傷、壊疽、皮膚裂傷または裂創、皮膚老化、手術創の治癒がゆっくりとした、もしくは治癒しない手術創を含む術創、脳内出血、動脈瘤、皮膚無力症ならびに術後感染症が挙げられる。
【0233】
擦過、切除外傷、裂傷、咬傷、弾傷、刺創、火傷、日焼け、化学熱傷、手術創、床ずれ、放射線損傷、あらゆる種類の急性創傷および慢性創傷、美容的皮膚手技により形成された創傷または病変により引き起こされるが、これらに限定されない外傷を治療するために本発明の治療用ペプチドを使用することができる。このペプチドを使用し、皮膚老化の効果を緩和することもできる。このペプチドは外傷の創傷治癒を加速させ、かつ／または創傷領域もしくは老化した、および疾患に罹患した皮膚の審美性を改善することができる。このペプチドを使用し、心臓、骨、脳、脊髄、網膜、末梢神経を含むがこれらに限定されない器官および組織、ならびに急性損傷および慢性損傷、疾患、先天性および発生学的奇形、ならびに老化プロセスを一般的に経験する他の組織および器官、疾患、手術、砲撃、刺傷、事故、梗塞、虚血傷害により引き起こされるがこれらに限定されない、内部損傷を治療することができる。
【0234】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは火傷の治療のために投与される。例示的な火傷としては、例えば第Ｉ度熱傷（すなわち、皮膚表面の赤くなった領域）；第ＩＩ度熱傷（水疱液を取り除いた後、自発的に治癒可能である水疱が生じた損傷部位）；第ＩＩＩ度熱傷（皮膚全体にわたる熱傷であり、通常、創傷治癒のために外科的介入を必要とする）；熱傷（ｓｃａｌｄｉｎｇ）（沸点近くの熱湯、油またはラジエータ液により生じ得る）；熱傷（ｔｈｅｒｍａｌ ｂｕｒｎ）（炎により生じ得る、通常は深部火傷である）；化学熱傷（酸およびアルカリに由来し得る、通常は深部火傷である）電撃傷（家庭用の低電圧または仕事中の高電圧のいずれか）；爆発によるフラッシュ（通常は表面火傷）；ならびに接触熱傷（通常は深部火傷であり、マフラーテイルパイプ、熱したアイロンおよびストーブにより生じ得る）を含む火傷の結果として生じる潰瘍を含む「熱傷潰瘍」を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、治癒がゆっくりとした、または治癒困難な創傷としては、例えば１）長期炎症段階、２）細胞外マトリックス（ＥＣＭ）形成の遅延、および３）上皮形成速度の減少により、少なくとも部分的に特徴付けられる創傷が挙げられ得る。
【0235】
例えば、ＦＧＦ－１といった増殖因子は、神経再生および神経治癒において重要な役割を果たす。ＦＧＦ－１は神経増殖および成長を刺激し、かつ神経保護性であり得ると考えられることから、腕神経叢損傷などの脊髄損傷もしくは外傷、急性もしくは特発性横断性骨髄炎（ＴＭ）などの後の神経免疫障害、またはニューロンもしくは神経組織の再生および／もしくは保護が望ましい他のいずれかの疾患もしくは病気後に神経系組織を再生する際の使用が提案されている。例えば、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，「Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｒｅｐａｉｒ ｗｉｔｈ Ａｃｉｄｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ａｓ ａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ａ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｐａｒａｐｌｅｇｉａ，」 ＳＰＩＮＥ ２９（１４）：Ｅ２８４－Ｅ２８８（２００４）；ａｎｄ Ｌｉｎ，Ｐ－Ｈ．，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ ｍｙｅｌｉｔｉｓ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ，」 Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ ４４：２５４－２５７（２００６）を参照されたい。ＦＧＦ－１は、神経栄養活性を有し、軸索成長を促進し、脊髄損傷および軸索再生モデルに有益な影響をもたらすことで知られている。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは神経再生を促進し、神経再生によって好転する病気を治療する方法で使用することができる。いくつかの例示的な方法では、神経の病気は筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉ、ＡＬＳ）である。いくつかの例示的な方法では、神経の病気は急性または特発性横断性骨髄炎（ＴＭ）である。ある特定の例では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、神経再生によって利益がある病気を治療するため、他の増殖因子および他の薬学的に活性のある成分と組み合わせて投与され得る。
【0236】
医薬組成物、投与方法および投与
本明細書に記載の修飾ＦＧＦポリペプチドを含む医薬組成物は、薬学的に使用され得る製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む、１つ以上の生理学的に許容される担体を使用する従来方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存している。本明細書に記載の医薬組成物にとって好適な賦形剤についてのさらなる詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）に見出すことができ、こうした開示についてはその内容全体が本明細書の一部として援用される。
本明細書に記載の修飾ＦＧＦポリペプチドを含む医薬組成物は、薬学的に使用され得る製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む、１つ以上の生理学的に許容される担体を使用する従来方法で製剤化され得る。適切な製剤は、選択される投与経路に依存している。本明細書に記載の医薬組成物にとって好適な賦形剤についてのさらなる詳細は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）に見出すことができ、こうした開示についてはその内容全体が本明細書の一部として援用される。
【0237】
本明細書で使用される場合、医薬組成物は、担体、安定化剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤および／または賦形剤などの他の化学成分、ならびに任意選択的には他の治療的および／または予防的成分との修飾ＦＧＦの混合物を指す。医薬組成物は、生物への修飾ＦＧＦの投与を容易にする。本明細書で提供される治療方法または使用方法を実施する際には、本明細書に記載の治療有効量の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、治療される眼の疾患、障害または病気に罹患している哺乳動物へと医薬組成物にて投与される。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康状態、使用される化合物の効能および他の要因に応じて幅広く変更することができる。薬学的に許容される、または好適な組成物としては、眼科的に好適、または許容される組成物が挙げられる。
【0238】
医薬組成物（例えば、注射による送達用または点眼薬としての適用目的）は、液状または固形状であり得る。液体医薬組成物は、例えば注射用水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンガー液、生理食塩液などの滅菌希釈剤、溶媒または懸濁用媒体として機能可能である固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒、抗菌薬、酸化防止剤、キレート剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧を調整するための緩衝液および薬剤、のうちの１つ以上を含む。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチックで製造されたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数回投与用バイアルに封入されることができる。生理食塩水は賦形剤として一般的に使用されており、注射可能な医薬組成物または眼に送達される組成物（例えば、点眼薬として）は、滅菌されていることが好ましい。
【0239】
本明細書に記載の修飾ＦＧＦポリペプチドまたは医薬組成物は、例えば、局所的、眼内、房内、経口、非経口、静脈内、腹腔内、鼻腔内を含む任意の好適な手段（もしくは、例えば鼻、喉および気管支の粘膜への他の送達方法）によって、または眼への局所投与によって、または眼内デバイスもしくは眼周囲デバイスによって、対象に送達され得る。局所投与の様式としては、例えば局所適用、点眼薬、眼内注射または眼周囲注射が挙げられ得る。眼周囲注射は、典型的には結膜下、またはテノン嚢（眼の上の線維組織下方）への化合物の注射を含む。眼内注射は、典型的には硝子体への修飾ＦＧＦまたは医薬組成物の注射を含む。ある特定の実施形態では、投与は、局所適用または点眼薬などによる非侵襲的なものである。いくつかの実施形態では、投与は局所的方法および房内方法の併用によるものである。
【0240】
本明細書に記載の修飾ＦＧＦまたはその医薬組成物は、薬学的に許容される（好適な）担体または媒体、および当該技術分野で日常的に利用される技術を使用し、投与のために製剤化され得る。薬学的に許容される、または好適な担体は、眼科的に好適な、または許容される担体を含む。担体は、特定の修飾ＦＧＦの溶解度に従って選択される。好適な眼科的組成物および製剤は、点眼薬、注射など、目に局所的に投与される組成物および製剤を含む。点眼薬の場合には、製剤は例えば、塩化ナトリウム、濃グリセリンなどの等張化剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどの緩衝剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（ポリソルベート８０とも呼ばれる）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（ポリソルベート２０とも呼ばれる）、ポリオキシルステアラート４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などの界面活性剤；クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウムなどの安定化剤；塩化ベンザルコニウム、パラベンなどの保存剤；および他の成分などの眼科的に適合する薬剤を任意選択的に含むこともできる。保存剤は例えば、約０．００１～約１．０％重量／体積の量で使用され得る。製剤のｐＨは通常、眼科用製剤に許容される範囲内であり、例えばｐＨは約４～８の範囲内である。
【0241】
注射のために、修飾ＦＧＦまたは医薬組成物は注射グレードの食塩水の形態、注射可能なリポソーム溶液の形態、徐放性ポリマー系などの形態で提供されてもよい。眼内注射および眼周囲注射は当業者に公知であり、例えばＳｐａｅｔｈ，Ｅｄ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，８５－８７，１９９０を含む多数の刊行物に記載されている。
【0242】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦまたは医薬組成物（例えば、眼科用製剤）は、マイクロニードルによって角膜内に投与される（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ４８（９）：４０３８－４０４３）。マイクロニードルアレイは、修飾ＦＧＦまたは医薬組成物でコーティングされており、マイクロニードルが角膜実質に達するものの、角膜すべてを貫通しないように角膜に押し付けられる。これを取り外すと、修飾ＦＧＦまたは医薬組成物が角膜実質内に残る。残った修飾ＦＧＦまたは医薬組成物は角膜細胞を刺激して増殖または遊走し、実質細胞が通常有している瘢痕反応を抑制する。
【0243】
いくつかの実施形態では、組成物は眼内送達用に製剤化されてもよい。眼内送達は、硝子体内送達、角膜注射、房内送達を含む。いくつかの実施形態では、組成物は房内送達用に製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は硝子体内送達用に製剤化される。製剤は注射可能な液体であり、非常に少量を含むことができ、注射可能な液体製剤の密度は、標的とする空間での液体製剤の放出が組織への損傷を引き起こさないよう、調整されてもよい。いくつかの実施形態では、房内送達用の容量は、約１００マイクロリットル、約１００マイクロリットル未満、約２０マイクロリットル未満、約１０マイクロリットル未満、約５マイクロリットル未満、約２．５マイクロリットル未満または約１マイクロリットルである。配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、または配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の単一のアミノ酸変異を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド、およびＬ－メチオニン、を含む眼内送達用注射用製剤が本明細書に提供される。該製剤内の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、約９５％を超える純粋な状態で存在し、ポリペプチドは製剤内では単量体形態である。ポリペプチドがＮ末端メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の製剤。いくつかの実施形態では、注射用製剤は、配列番号２、２０５、２０６、３～８、１４～１８、２４～２８、９３～１１７、１１８～１４１、１４６～１４９および１７４～２０４のうちのいずれか１つに示されるアミノ酸配列、またはこれらの配列に少なくとも９０％同一である配列、またはこれらの断片を含む修飾ＦＧＦ－１を含んでもよい。
【0244】
いくつかの実施形態では、ここに注射用製剤が提供され、該製剤は、必要とされる投与量および濃度の修飾ＦＧＦ－１、ならびに塩化ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸一水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸およびＬ－メチオニンのうちの１つ以上を含む賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、注射用製剤は、修飾ＦＧＦ；少なくとも約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム；少なくとも約１００ｍＭ 塩化ナトリウム；少なくとも約１０ｍＭ 硫酸アンモニウム；少なくとも約０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；少なくとも約５ｍＭ Ｌ－メチオニン、および少なくとも約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、のうち少なくとも１つをさらに含む。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む注射用製剤は、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌ、Ｌｙｓ１２Ｖａｌ、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１１７ＶａｌおよびＰｒｏ１３４Ｖａｌからなる群から選択される１つ以上の変異を含み、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはペプチドＡＬＴＥＫの少なくとも１つの残基をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌといった配列番号１の変異を含む１つ以上の変異を含み、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流に位置するメチオニン残基、およびＮ末端メチオニンと配列番号１の１位との間に位置するペプチドＡＬＴＥＫの少なくとも１つの残基を含む。
【0245】
いくつかの実施形態では、製剤またはその中の薬学的に好適な賦形剤は、ヒト血清アルブミンおよび／またはポリソルベート８０を含む。いくつかの実施形態では、製剤はＬ－メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、Ｌ－メチオニンは、製剤内に１ｍＭ～２０ｍＭ濃度で存在する。いくつかの実施形態では、Ｌ－メチオニンは、製剤内に２ｍＭ～１０ｍＭ濃度で存在する。いくつかの実施形態では、Ｌ－メチオニンは、製剤内に１ｍＭ～１０ｍＭ濃度で存在する。いくつかの実施形態では、Ｌ－メチオニンは、製剤内に２．５ｍＭ～１５ｍＭ濃度で存在する。いくつかの実施形態では、Ｌ－メチオニンは、製剤内に約５ｍＭ濃度で存在する。本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む組成物を、鼻腔、喉および気道に送達することを含む粘膜経路を介しての送達については、組成物はエアロゾルの形態で送達されてもよい。化合物は、粘膜内送達のために液状または粉末状であってもよい。例えば、組成物は、炭化水素噴霧剤（例えば、プロパン、ブタン、イソブテン）などの好適な噴霧剤を備えた加圧エアロゾルを介して送達されてもよい。組成物は、ネブライザーまたはアトマイザーなどの非加圧送達系を介して送達されてもよい。
【0246】
好適な経口剤形としては例えば、硬ゼラチンまたは軟ゼラチン、メチルセルロースまたは消化管で容易に溶解される別の好適な材料の、錠剤、ピル、分包、またはカプセルが挙げられる。例えば薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む好適な非毒性固体担体が使用され得る。（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ，２１ｓｔ Ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（２００５）を参照されたい）。
【0247】
本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは医薬組成物は、持続放出または徐放のために製剤化されてもよい。かかる組成物は周知の技術を使用して一般には調製され、例えば眼周囲、眼内、直腸、経口または皮下注入によって、または所望の標的部位での注入によって、または局所適用によって投与されてもよい。徐放性製剤は、担体マトリックス内に分散される、および／または速度制御膜で囲まれたリザーバ内に含有される薬剤を含有してもよい。こうした製剤内で使用するための賦形剤は生物適合性があり、生分解可能であってもよく、好ましくは該製剤によって相対的に一定レベルの活性成分が放出される。徐放性製剤内に含有された活性化合物の量は注入部位、放出速度および予想される持続期間、ならびに治療される、または予防される病気の性質に依存する。
【0248】
眼経路によって投与される薬物または組成物の全身薬物吸収は、当業者に公知である（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２３３：１－１８（２００２）を参照されたい）。一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、眼への局所送達方法によって送達される（例えば、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．４：２１３－２２（２００３））。組成物は、水性点眼薬、水性懸濁点眼剤、非水性点眼薬および非水性懸濁点眼剤、ゲル、眼用軟膏など、点眼薬、膏薬または軟膏などの形態であってもよい。ゲルの調製については、例えばカルボキシビニルポリマー、メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン無水マレイン酸ポリマーなどが使用され得る。
【0249】
別の実施形態では、修飾ＦＧＦ溶液または医薬組成物（例えば、眼科用製剤）は、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロースまたは安定した眼用溶液を製造するための眼の忍容性の増加、粘度の増加および浸透圧の増加を提供する他の多糖類を含有する。
【0250】
本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む修飾ＦＧＦまたは医薬組成物の投与量は、患者（例えば、ヒト）の状態、すなわち眼の疾患、障害または病気の段階、一般的な健康状態、年齢および医療分野の当業者が投与量を決定するために使用する他の因子に応じて異なっていてもよい。組成物が点眼薬として使用される場合、例えば単位投与量あたり１滴～数滴、好ましくは１滴または２滴（１滴あたり約５０μＬ）が１日あたり約１回～６回適用され得る。
【0251】
医薬組成物は、医療分野の当業者によって決定されるように、治療される（または予防される）疾患、障害または病気に対して適切な方法で投与される。適切な投与量、ならびに投与の好適な持続期間および頻度は、患者の状態、患者の疾患、障害または病気の種類および重症度、特定の形態の活性成分、ならびに投与方法などの因子により決定される。一般には、適切な投与量および治療レジメンは、治療的および／または予防的利益（例えば、さらに高頻度の完全もしくは部分的寛解、またはより長期の無病状態、または症状重症度の軽減などの臨床アウトカムの改善）を提供するのに十分な量の１つ以上の組成物を提供する。予防的使用については、投与量は眼の疾患、障害または病気の発症の予防、遅延またはこれらの重症度の軽減を行う上で十分なものでなければならない。最適な投与量は、一般には実験モデルおよび／または治験を使用して決定され得る。最適な投与量は、患者の体格、体重または血液量に依存し得る。
【0252】
種々の実施形態では、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、一定期間にわたって１日量として対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは慢性的に、または長期で投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、対象の生涯にわたり数日間、数週間、数ヶ月間、数年間の期間、または持続的治療期間に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、約７日間、約１５日間、約２１日間、約３０日間、約３ヶ月間、約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２年間、約５年間、約７年間、約１０年間、約１５年間、約２０年間、約２５年間、約３０年間、約３５年間または約４０年間の期間にわたり投与されてもよい。いくつかの実施形態では、治療レジメンは、種々の因子に応じて個々の対象で決定されてもよい。いくつかの例では、治療レジメンは、びらん性化合物など、化学損傷または熱傷を引き起こす化合物への曝露量に応じて変化する。いくつかの実施形態では、治療レジメンは、急性曝露については約２週間、長期曝露については数ヶ月～１年である。いくつかの実施形態では、治療レジメンは慢性的である。いくつかの例では、因子としては、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの投与に応答した角膜組織変性度の変化の決定が挙げられ得るが、これに限定されない。いくつかの例では、因子としては、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの投与に応答したＭＧＫ後遺症の寛解が挙げられ得るが、これに限定されない。いくつかの例では、因子としては、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの投与に応答した角膜内皮病変の治癒が挙げられ得るが、これに限定されない。いくつかの例では、因子としては、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの投与に応答した角膜上皮細胞増殖が挙げられ得るが、これに限定されない。いくつかの例では、因子としては、本開示の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの投与に応答したフックスジストロフィーに関連する症状の軽減が挙げられ得るが、これに限定されない。複数の実施形態では、組成物に対して例えばフックスジストロフィーに関連する症状の即時軽減といった即時応答を呈する対象は、後に、または複数回の投薬の後に組成物に対して応答を示す対象よりも、必要となる投与回数は少なくなり得る。
【0253】
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドまたは医薬組成物の投与量は、対象の臨床状態、症状および年齢、剤形などに応じて好適に選択され得る。点眼薬の場合には、本明細書に記載の修飾ＦＧＦは、１週間につき１～７回、例えば約１０μｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの修飾ＦＧＦを投与することができる。
【0254】
本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物を製造する方法もまた提供される。薬学的に許容される賦形剤または担体および本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのうちの少なくとも１つを含む組成物は、本明細書に記載の、または当該技術分野で行われている方法のうちのいずれか１つに従って修飾ＦＧＦを合成し、続いて薬学的に許容される担体と化合物とを製剤化することで調製されてもよい。組成物の製剤化は適切なものであり、送達経路、投与量および化合物の安定性を含むがこれらに限定されない複数の因子に依存している。
【0255】
本明細書に記載の少なくとも１つの修飾ＦＧＦは、ヒトまたは非ヒトの他の脊椎動物に投与され得る。ある特定の実施形態では、修飾ＦＧＦは、例えば合成方法のステップのうち１つ以上で形成される、混入中間生成物または副生成物などの他の有機分子を約５％未満または約１％未満、または約０．１％未満含有するという点で実質的に純粋である。他の実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの組合せが投与され得る。
【0256】
本明細書に記載の組成物は、予防的処置、および／または治療的処置のために投与され得る。治療的適用では、組成物は、疾患または病気の症状を治癒または少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、疾患または病気に既に罹患している患者に投与される。こうした使用に有効な量は、疾患または病気の重症度および経過、投与前の治療、患者の健康状態、体重および薬物への応答ならびに治療する医師の判断に応じて変化させてもよい。
【0257】
予防的適用では、本明細書に記載の組成物は、特定の疾患、障害または病気に罹患しやすい、またはそれ以外の場合にはそうした疾患、障害または病気のリスクがある患者に投与される。こうした量は、「予防有効量または投与量」であると定義される。この使用では、正確な量はまた、患者の健康状態、体重などに依存する。
【0258】
患者の状態が改善しない場合には、医師の裁量に応じて、組成物の投与は慢性的に投与されてもよい。これはすなわち、患者の疾患または病気の症状を寛解、またはそれ以外の場合には制御もしくは制限するために、患者の生存期間全体を含む長期期間にわたり投与されるということである。
【0259】
患者の状態が改善しない場合には、医師の裁量に応じて、組成物の投与は連続的に行われてもよく、代替的には投与される薬物の投与量を段階的に減少してもよく、またはある特定の長さの時間にわたって一時的に停止してもよい（すなわち、「休薬期間」）。
【0260】
患者の状態が改善した時には、必要な場合には維持投与量が投与される。その後に、用量もしくは投与頻度、またはそれら両方を、症状の関数として、疾患、障害または症状の改善が保持されている量まで減少させることができる。ただし、患者は何らかの症状が長期的に再発した場合に、周期的治療を必要とすることがある。
【0261】
望ましい投与量は、単回投与量で、または同時に（もしくは短時間にわたって）、もしくは例えば１日あたり２回、３回、４回以上の投与量未満の量として適切な間隔で投与される分割投与量として適切に提示され得る。
【0262】
本明細書に記載の医薬組成物は、正確な用量の単回投与に好適な単位剤形であってもよい。単位剤形では、製剤は１つ以上の適切な量の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含有する単位投与量に分割される。単位用量は、別個の量の製剤を含有する包装形態であってもよい。非限定的な例は、包装された錠剤またはカプセル、およびバイアルまたはアンプル内の粉末である。水性懸濁液組成物は、再密閉不可能な単回投与量の容器または再度封入可能な容器に包装され得る。代替的には、複数投与量の再密閉可能な容器を使用することができ、この場合、組成物内に保存剤を含むことが典型的である。単純に例として、非経口注射用の製剤は、保存剤を加えた状態のアンプル、または複数投与量の容器を含むがこれらに限定されない単位剤形で提供されてもよい。
【0263】
こうした治療レジメンの毒性効果および治療効果は、細胞培養物または実験用動物でのＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％の薬効量）の決定が挙げられるが、これらに限定されない、標準的な薬学的手順で決定され得る。毒性と治療効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比として表され得る。高い治療指数を表す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から取得されるデータは、ヒトでの使用のために用量の範囲を処方する場合に使用され得る。こうした化合物の用量は、最小限の毒性を伴い、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化してもよい。
【0264】
バルク原薬製剤および医薬製剤
本開示の一実施形態は、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二ナトリウム二水和物のうちの少なくとも１つを含む製剤のバルク原薬製剤（ＢＤＳ）としての修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（例えば、配列番号２の配列を含むＦＧＦ－１ポリペプチド）を提供する。いくつかの実施形態では、ＢＤＳは、例えばブチルセファロースファストフローカラムを使用して修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを発現する宿主細胞からの精製後に溶離緩衝液内の溶液（バルク原薬製剤を保存するための製剤である）として保存される。精製中、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは典型的には勾配をつけて溶出するため、いくつかの例では、溶離緩衝液は正確な組成物を有さない。例えば、いくつかの場合では、溶離緩衝液は塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二ナトリウム二水和物を含み、そのｐＨは約７．４である。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ 塩化ナトリウムなど、約１００ｍＭ～約１０００ｍＭ 塩化ナトリウム；約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約３１０ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３９０ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ 硫酸アンモニウムなど、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ 硫酸アンモニウム；および約２ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭもしくは約３０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物など、約１ｍＭ～約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ＢＤＳは、約６～約８のｐＨを有する製剤内に保存される。
本開示の一実施形態は、塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二ナトリウム二水和物のうちの少なくとも１つを含む製剤のバルク原薬製剤（ＢＤＳ）としての修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（例えば、配列番号２の配列を含むＦＧＦ－１ポリペプチド）を提供する。いくつかの実施形態では、ＢＤＳは、例えばブチルセファロースファストフローカラムを使用して修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを発現する宿主細胞からの精製後に溶離緩衝液内の溶液（バルク原薬製剤を保存するための製剤である）として保存される。精製中、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは典型的には勾配をつけて溶出するため、いくつかの例では、溶離緩衝液は正確な組成物を有さない。例えば、いくつかの場合では、溶離緩衝液は塩化ナトリウム、硫酸アンモニウムおよびリン酸水素二ナトリウム二水和物を含み、そのｐＨは約７．４である。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は、約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ、約１０００ｍＭ 塩化ナトリウムなど、約１００ｍＭ～約１０００ｍＭ 塩化ナトリウム；約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、約３１０ｍＭ、約３２０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約３４０ｍＭ、約３６０ｍＭ、約３７０ｍＭ、約３８０ｍＭ、約３９０ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ 硫酸アンモニウムなど、約１００ｍＭ～約５００ｍＭ 硫酸アンモニウム；および約２ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２３ｍＭ、約２４ｍＭ、約２５ｍＭ、約２６ｍＭ、約２７ｍＭ、約２８ｍＭ、約２９ｍＭもしくは約３０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物など、約１ｍＭ～約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、ＢＤＳは、約６～約８のｐＨを有する製剤内に保存される。
【0265】
本開示の一実施形態は、ｐＨ５．８のヒスチジン／ポリソルベート／ソルビトール製剤から構成される医薬製剤を提供する。種々の利点は医薬製剤に関連しており、こうした利点としては目に見える微粒子、ＳＥ－ＨＰＬＣによるほぼ一定の主ピーク面積、ＳＥ－ＨＰＬＣによる可溶性のある凝集体の経時的に低い割合、経時的なｐＨの制御が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヒスチジンは、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭなどの約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ濃度で存在する。いくつかの実施形態では、医薬製剤は界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤およびこれらのいずれかの組合せが挙げられ得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤はポリソルベートである。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、例えばＰＳ２０、ＰＳ８０といったポリソルベートを含む。いくつかの実施形態では、製剤は約０．０１％～約１０％の濃度で存在するＰＳ８０を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、少なくとも約０．００５％、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０１５％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％または少なくとも約０．１％の濃度のポリソルベート８０、ＮＦ（ＰＳ８０）（％ｗ／ｖ）を含む。他の実施形態では、製剤は約０．００５％～約０．１％のＰＳ８０、約０．００５％～約０．０２％のＰＳ８０、約０．００５％～約０．０５％のＰＳ８０、約０．０１％～約０．０２％のＰＳ８０、約０．０２％～約０．１％のＰＳ８０、または約０．０１％～約０．０３％のＰＳ８０を含む。さらに他の実施形態では、組成物は約０．０１％の濃度のＰＳ８０を含む。さらに他の実施形態では、組成物は約０．０２％の濃度のＰＳ８０を含む。いくつかの実施形態では、組成物は約０．０３％の濃度のＰＳ８０を含む。特定の実施形態では、組成物は約０．０４％の濃度のＰＳ８０を含む。いくつかの実施形態では、組成物は約０．０５％の濃度のＰＳ８０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０６％の濃度のＰＳ８０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０７％の濃度のＰＳ８０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０８％の濃度のＰＳ８０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０９％の濃度のＰＳ８０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．１％の濃度のＰＳ８０を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、少なくとも約０．００５％、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０１５％、少なくとも約０．０２％、少なくとも約０．０３％、少なくとも約０．０４％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．０６％、少なくとも約０．０７％、少なくとも約０．０８％、少なくとも約０．０９％または少なくとも約０．１％の濃度のポリソルベート２０、ＮＦ（ＰＳ２０）（％ｗ／ｖ）を含む。他の実施形態では、製剤は約０．００５％～約０．１％のＰＳ２０、約０．００５％～約０．０２％のＰＳ２０、約０．００５％～約０．０５％のＰＳ２０、約０．０１％～約０．０２％のＰＳ２０、約０．０２％～約０．１％のＰＳ２０、または約０．０１％～約０．０３％のＰＳ２０を含む。さらに他の実施形態では、組成物は約０．０１％の濃度のＰＳ２０を含む。さらに他の実施形態では、組成物は約０．０２％の濃度のＰＳ２０を含む。いくつかの実施形態では、組成物は約０．０３％の濃度のＰＳ２０を含む。特定の実施形態では、組成物は約０．０４％の濃度のＰＳ２０を含む。いくつかの実施形態では、組成物は約０．０５％の濃度のＰＳ２０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０６％の濃度のＰＳ２０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０７％の濃度のＰＳ２０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０８％の濃度のＰＳ２０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．０９％の濃度のＰＳ２０を含む。他の実施形態では、組成物は約０．１％の濃度のＰＳ２０を含む。他の実施形態では、医薬製剤は例えば、眼内注射、房内注射、眼周囲注射、静脈内注射、腹腔内注射または鼻腔内注射を含む好適な手段で対象に送達される。
【0266】
いくつかの実施形態では、医薬製剤はアルコール化合物を含む。いくつかの実施形態では、アルコール化合物は、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、グリセロール、マンニトールまたはこれらのいずれかの組合せである。いくつかの実施形態では、アルコール化合物は例えば、ソルビトールといった浸透圧調整剤である。いくつかの実施形態では、アルコール化合物は約１％～約１０％で存在するソルビトールである。いくつかの実施形態では、製剤は塩化ナトリウムである浸透圧調整剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬製剤はグリセリンを含む。
【0267】
ある特定の実施形態では、製剤は、少なくとも約０．２５％、少なくとも約０．５％、少なくとも約０．７５％、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、少なくとも約２％、少なくとも約２．５％、少なくとも約３％、少なくとも約３．５％、少なくとも約４％、少なくとも４．５％、少なくとも約５％、少なくとも約７．５％または少なくとも約１０％の濃度のソルビトール（％ｗ／ｖ）ＵＳＰを含む。他の実施形態では、組成物は約０．５％～約５％のソルビトール、約０．５％～約４％のソルビトール、約０．５％～約１．５％のソルビトール、約１％～約２％のソルビトールまたは約２．５％～約３．５％のソルビトールを含む。
【0268】
いくつかの実施形態では、医薬製剤のｐＨは約５．８、約４．５～約６．５、約４．０～約６．０、約４．０～約６．５未満、約５．０～約６．０、約５．１～約５．９、約５．２～約５．８、約５．３～約５．４、約５．４～約５．５、約４．１～約６．１、約４．２～約６．２、約４．３～約６．３、約４．４～約６．４、約４．５～約６．５、約４．６～約６．６、約４．７～約６．７、約４．８～約６．８、約４．９～約６．９、約５．０～約７．０、約４．１～約５．１、約４．２～約５．２、約４．３～約５．３、約４．４～約５．４、約４．５～約５．５、約４．６～約５．６、約４．７～約５．７、約４．８～約５．８、約４．９～約５．９、約５．０～約６．０、約６．１未満、約６．２未満、約６．３未満、約６．４未満、約６．５未満、約６．６未満、約６．７未満、約６．８未満、約６．９未満、約７．０未満である。
【0269】
いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（例えば、配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド）は、本明細書に記載の医薬製剤内に活性成分を含み、約１００ｐｇ／ｍＬ～約１０００μｇ／ｍＬ、約５００ｐｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬ、約０．０００１μｇ／ｍＬ～約０．０００５μｇ／ｍＬ、約０．０００５μｇ／ｍＬ～約１．０μｇ／ｍＬ、約１．０μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約２０μｇ／ｍＬ～約３０μｇ／ｍＬ、約３０μｇ／ｍＬ～約４０μｇ／ｍＬ、約４０μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約５０μｇ／ｍＬ～約６０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ～約７０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ～約９０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ～約１１０μｇ／ｍＬ、約１１０μｇ／ｍＬ～約１２０μｇ／ｍＬ、約１２０μｇ／ｍＬ～約１３０μｇ／ｍＬ、約１３０μｇ／ｍＬ～約１４０μｇ／ｍＬ、約１４０μｇ／ｍＬ～約１５０μｇ／ｍＬ、約１５０μｇ／ｍＬ～約１６０μｇ／ｍＬ、約１６０μｇ／ｍＬ～約１７０μｇ／ｍＬ、約１７０μｇ／ｍＬ～約１８０μｇ／ｍＬ、約１８０μｇ／ｍＬ～約１９０μｇ／ｍＬ、約１９０μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【0270】
本開示の一実施形態は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド；少なくとも約２００ｍＭ～約１０００ｍＭ濃度の塩化ナトリウム、約５０ｍＭ～約５００ｍＭ濃度の硫酸アンモニウム；約１ｍＭ～約５０ｍＭ濃度のリン酸水素二ナトリウムを含むバルク原薬製剤を提供する。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、１６位のＳｅｒ、６６位のＣｙｓおよび１１７位のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度は、少なくとも約０．１ｇ／ｍＬ～約１０ｇ／ｍＬ、約０．２ｇ／ｍＬ～約１５ｇ／ｍＬ、約０．３ｇ／ｍＬ～約２０ｇ／ｍＬ、約１ｇ／ｍＬ～約５ｇ／ｍＬ、約１ｇ／ｍＬ～約４ｇ／ｍＬ、約２ｇ／ｍＬ～約３ｇ／ｍＬなどである。いくつかの実施形態では、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの濃度は約３ｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は、約８００ｍＭ濃度の塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は、約３２０ｍＭ濃度の硫酸アンモニウムを含み、いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤は約２０ｍＭ濃度のリン酸水素二ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤のｐＨは約７～約９である。いくつかの実施形態では、バルク原薬製剤のｐＨは約７．４である。いくつかの実施形態では、－６０±１０℃の温度で保存した場合、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは安定している。
【0271】
本開示の一実施形態は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトされた細菌細胞の培養物中の封入体から単離された、リフォールディングされた修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを精製することを含む製造方法を提供し、精製は、アガロース系樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ（商標）ＤｅＶｉｒＳ）を充填したクロマトグラフィー用カラムを使用してリフォールディングされた修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを捕捉し、続いて、ブチルセファロース樹脂を充填したクロマトグラフィー用カラムを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーで最終精製することを含む。いくつかの実施形態では、最終精製ステップによる修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの回収は、ヘパリン樹脂を充填したクロマトグラフィー用カラムを使用すること以外は同一である製造方法での疎水性相互作用クロマトグラフィーによる最終ステップ後の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの回収よりも、約１０％～約４０％多い、または約１１％多い、約１２％多い、約１３％多い、約１４％多い、約１５％多い、約１６％多い、約１７％多い、約１８％多い、約１９％多い、約２０％多い、約２５％多い、約３０％多い、約３５％多い、約４０％多いなど、約１０％～約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％大きい。
【0272】
併用治療
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、治療される病気についての治療価値のために選択される他の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、びらん性毒ガス損傷を治療することに関する治療価値のために選択される他の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。こうした薬剤は、同じ医薬組成物で投与される必要はなく、その異なる物理学的特徴および化学的特徴を理由に、異なる経路で投与されなければならない場合がある。同じ医薬組成物に関する投与様式の決定および投与への助言は、可能であれば、これらは医師の知識の範囲内に十分存在する。初期投与は、当該分野で認識されている確立したプロトコールに従って行われてよく、その後観察された効果に基づいて、医師は用量、投与様式および投与時間を変更することができる。
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、治療される病気についての治療価値のために選択される他の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、びらん性毒ガス損傷を治療することに関する治療価値のために選択される他の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。こうした薬剤は、同じ医薬組成物で投与される必要はなく、その異なる物理学的特徴および化学的特徴を理由に、異なる経路で投与されなければならない場合がある。同じ医薬組成物に関する投与様式の決定および投与への助言は、可能であれば、これらは医師の知識の範囲内に十分存在する。初期投与は、当該分野で認識されている確立したプロトコールに従って行われてよく、その後観察された効果に基づいて、医師は用量、投与様式および投与時間を変更することができる。
【0273】
使用される任意のさらなるこれらの薬剤の個別選択は、診療を行う医師の診断および患者の症状の判断および適切な治療プロトコールに応じて変化する。薬剤は、疾患、障害または病気の性質、患者の病状および使用される実際の薬剤の選択に応じて、並行して（例えば、同時に、本質的に同時に、もしくは同じ治療プロトコール内で）、または経時的に投与されてもよい。投与順の決定および治療プロトコール中の各治療薬の投与の反復回数は、治療されている疾患および患者の症状の評価後の医師の知識の十分な範囲内にある。
【0274】
本明細書に開示される併用治療を構成する治療薬は、併用剤形または実質的に同時投与を意図した別個の剤形であり得る。併用治療を構成する治療薬はまた、任意の治療化合物が２段階投与を必要とするレジメンで投与される状態で、経時的に投与されてもよい。２段階投与レジメンは、活性薬の経時的投与、または間隔をあけての別個の活性薬の投与を必要としてもよい。複数の投与ステップ間の期間は、治療薬の効能、溶解度、バイオアベイラビリティ、血漿半減期および動態プロファイルなどの各治療薬の特性に応じ、数分～数時間の範囲であってもよい。標的分子濃度の概日変動によっても、最適な投与量の間隔を決定することができる。
【0275】
治療有効量は、薬物が治療を組み合わせる際に使用される場合には変化する可能性がある。治療レジメンを組み合わせて使用するための治療有効量の薬物および他の薬剤を実験的に決定するための方法は、文献中に記載されている。例えば、メトロノーム投与（すなわち、毒性副作用を最小化するために回数を増やし、投与量を減らすこと）は、文献内では広く記載されている。併用治療は、患者の臨床管理を支援するため、様々な時点で開始および停止する定期的な治療をさらに含む。
【0276】
例えば、修飾されたものは、ステロイド、抗生物質、抗炎症薬、ＩＬ－１もしくはＩＬ－１の類似体、またはＩＬ－１７の阻害薬などのサイトカインの拮抗薬といった他の活性成分を含有する製剤へと導入されてもよい。
【0277】
他の例示的なサイトカインとしては、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１α、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１ ＲＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＧＭ－ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ、エリスロポエチン、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＬＩＦ）、インターフェロン、Ｂ７．１（ＣＤ８０としても知られている）、Ｂ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６としても知られている）、ＴＮＦファミリーメンバー（ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、ＬＴ－β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４－１ＢＢＬ、Ｔｒａｉｌ）および遊走阻止因子（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ、ＭＩＦ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【0278】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組合せまたは医薬組成物は、免疫系の活性を減少、阻害または予防するために免疫抑制療法で投与される。免疫抑制療法は、移植された臓器および組織の拒絶の防止、自己免疫疾患または自己免疫由来である可能性が最も高い疾患の治療、および一部の他の非自己免疫疾患炎症性疾患の治療のために臨床的に使用される。
【0279】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、非ステロイド性抗炎症薬（ｎｏｎ－ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ、ＮＳＡＩＤｓ）および副腎皮質ホルモン（グルココルチコイド）を含むがこれらに限定されない、１つ以上の抗炎症薬とともに投与される。
【0280】
ＮＳＡＩＤｓとしては、アスピリン、サリチル酸、ゲンチジン酸、サリチル酸マグネシウムコリン、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウムコリン、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸ナトリウム、ジフルニサル、カプロフェン、フェノプロフェン、フェノプロフェンカルシウム、フルオロビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブトン、ケトロラク、ケトロラクトロメタミン、ナプロキセン、オキサプロジン、ジクロフェナク、エトドラク、インドメタシン、スリンダク、トルメティン、メクロフェナメート、メクロフェナメートナトリウム、メフェナム酸、ピロキシカム、メロキシカムおよびＣＯＸ－２特異的阻害薬（セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、ＣＳ－５０２、ＪＴＥ－５２２、Ｌ－７４５，３３７およびＮＳ３９８などであるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0281】
副腎皮質ホルモンとしては、ベタメタゾン、プレドニゾン、アルクロメタゾン、アルドステロン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、シクレソニド、クロベタゾール、クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコート、デオキシコルチコステロン、デソニド、デスオキシメタゾン、デスオキシコルトン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドナート、フルクロロロン、フルドロコルチゾン、フルドロキシコルチド、フルメタゾン、フルニソリド、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルオコルチン、フルオコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロン、フルプレドニデン、フルチカゾン、ホルモコータル、ハルシノニド、ハロメタゾン、ヒドロコルチゾン／コルチゾール、ヒドロコルチゾンアセポナート、ヒドロコルチゾンブテプラート、ヒドロコルチゾンブチラート、ロテプレドノール、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、メチルプレドニゾロンアセポナート、フロ酸モメタゾン、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾン／プレドニゾロン、リメキソロン、チキソコルトール、トリアムシノロンおよびウロベタゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0282】
抗炎症薬として使用される他の薬剤としては、米国特許公開第２００５／０２２７９２９号に記載のものが挙げられ、その内容全体が本明細書の一部として援用される。
【0283】
一部の市販の抗炎症薬としては、Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ（登録商標）（ジクロフェナクおよびミソプロストール）、Ａｓａｃｏｌ（登録商標）（５－アミノサリチル酸）、Ｓａｌｏｆａｌｋ（登録商標）（５－アミノサリチル酸）、Ａｕｒａｌｇａｎ（登録商標）（アンチピリンおよびベンゾカイン）、Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ（登録商標）（スルファサラジン）、Ｄａｙｐｒｏ（登録商標）（オキサプロジン）、Ｌｏｄｉｎｅ（登録商標）（エトドラク）、Ｐｏｎｓｔａｎ（登録商標）（メフェナム酸）、Ｓｏｌｕｍｅｄｒｏｌ（登録商標）（メチルプレドニゾロン）、Ｂａｙｅｒ（登録商標）（アスピリン）、Ｂｕｆｆｅｒｉｎ（登録商標）（アスピリン）、Ｉｎｄｏｃｉｎ（登録商標）（インドメタシン）、Ｖｉｏｘｘ（登録商標）（ロフェコキシブ）、Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）（セレコキシブ）、Ｂｅｘｔｒａ（登録商標）（バルデコキシブ）、Ａｒｃｏｘｉａ（登録商標）（エトリコキシブ）、Ｐｒｅｘｉｇｅ（登録商標）（ルミラコキシブ）、Ａｄｖｉｌ（登録商標）、Ｍｏｔｒｉｎ（登録商標）（イブプロフェン）、Ｖｏｌｔａｒｅｎ（登録商標）（ジクロフェナク）、Ｏｒｕｄｉｓ（登録商標）（ケトプロフェン）、Ｍｏｂｉｃ（登録商標）（メロキシカム）、Ｒｅｌａｆｅｎ（登録商標）（ナブメトン）、Ａｌｅｖｅ（登録商標）、Ｎａｐｒｏｓｙｎ（登録商標）（ナプロキセン）、Ｆｅｌｄｅｎｅ（登録商標）（ピロキシカム）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0284】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＢＡＹ ｕ９７７３（欧州特許第００７９１５７６号；１９９７年８月２７日公開を参照されたい）、ＤＵＯ－ＬＴ（Ｔｓｕｊｉ ｅｔ ａｌ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１，３１３９－３１４１，２００３）、ザフィルルカスト（Ａｃｃｏｌａｔｅ（登録商標））、モンテルカスト（Ｓｉｎｇｕｌａｉｒ（登録商標））、プランクラスト（Ｏｎｏｎ（登録商標））およびこれらの誘導体または類似体を含むがこれらに限定されない、ロイコトリエン受容体拮抗薬とともに投与される。
【0285】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、１つ以上のＲｈｏキナーゼ阻害物質とともに投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物は、上皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）および神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＮＧＦ）を含むがこれらに限定されない１つ以上の追加の増殖因子とともに投与される。例えば、Ｊｏｙｃｅ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ Ｓｃｉ．５０：２１１６－２１２２、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、腫瘍細胞増殖因子αおよびβ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｄ ｂｅｔａ、ＴＧＦ－ａｌｐｈａおよびＴＦＧ－ｂｅｔａ）、血小板由来内皮成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤ－ＥＣＧＦ）、血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ａｌｐｈａ、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ）、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）、エリスロポエチン、コロニー刺激因子（ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＣＳＦ）、マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）および一酸化窒素合成酵素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＮＯＳ）を参照されたい。
【0286】
キット／製造品
本明細書に記載の治療適用で使用するため、キットおよび製造品もまた本明細書に提供される。かかるキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を受容するように区画を分けられている容器（ｃａｒｒｉｅｒ）、包装または入れ物を含み、１つ以上の容器のそれぞれは、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素のうちの１つを含み得る。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管を含む。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の物質から形成され得る。
本明細書に記載の治療適用で使用するため、キットおよび製造品もまた本明細書に提供される。かかるキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を受容するように区画を分けられている容器（ｃａｒｒｉｅｒ）、包装または入れ物を含み、１つ以上の容器のそれぞれは、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素のうちの１つを含み得る。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジおよび試験管を含む。容器はガラスまたはプラスチックなどの種々の物質から形成され得る。
【0287】
本明細書にて提供される製造品はパッケージ材料を含む。医薬品の包装に使用するためのパッケージ材料は、例えば米国特許第５，３２３，９０７号、同５，０５２，５５８号および同５，０３３，２５２号に含まれる。医薬用パッケージ材料の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトルならびに選択される製剤および投与および治療の意図する様式に好適なパッケージ材料のいずれかを含むが、これらに限定されない。本明細書に提供される修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドおよび医薬組成物の多様な眼科用製剤は、本明細書に記載の修飾ＦＧＦまたは医薬組成物の投与によって好転する何らかの眼の疾患、障害または病気のための種々の治療として企図されている。
【0288】
例えば、１つ以上の容器は、配列番号２の配列を有する修飾ＦＧＦ－１などの修飾ＦＧＦを含み得る。１つ以上の容器は、任意選択的に滅菌アクセスポートを有する。こうしたキットは、任意選択的には、本明細書に記載の方法を用いた使用に関する識別用の説明またはラベルまたは取扱説明書とともに化合物を含む。
【0289】
いくつかの実施形態では、キットは、眼内送達用の注射可能な液体製剤に好適であってもよい、または好適であるように設計されていてもよい。キットは、低容量バイアルとして設計されてもよく、円錐形のインサートを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットはドロッパーボトルである。いくつかの実施形態では、ドロッパーボトルは、注射用製剤中の修飾ＦＧＦ－１の最小用量を提供可能であってもよい。いくつかの実施形態では、ドロッパーボトルは滅菌フィルタをさらに備える。いくつかの実施形態では、容器はシリンジを備える。いくつかの実施形態では、シリンジはツベルクリンポリプロピレンおよびガラスからなる群から選択される材料を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、注射用製剤で予め満たされている。いくつかの実施形態では、キットは電子制御部品をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、電子制御部品によって、前述した章に記載の内容に従い、少なくとも約１０マイクロリットル～約１００マイクロリットルの容量の注射用製剤の投与を制御することができる。いくつかの実施形態では、ドロッパーボトルが、上記実施形態のうちいずれか１つに記載の注射用製剤中の修飾ＦＧＦ－１、または本開示のいずれかの箇所に記載の医薬組成物の最小用量を提供することができる、請求項１０７に記載のキット。いくつかの実施形態では、ドロッパーボトルは滅菌フィルタをさらに備えてもよい。いくつかの実施形態では、容器はシリンジを備える。いくつかの実施形態では、シリンジはツベルクリンポリプロピレンおよびガラスからなる群から選択される材料を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の注射用製剤、または本開示のいずれかの箇所に記載の医薬組成物で満たされる。キットは、電子制御部品をさらに備えてもよい。いくつかの実施形態では、電子制御部品は、少なくとも約１０μＬ～約１００μＬの容量の、請求項１～４５のいずれか一項に記載の注射用製剤または請求項９０～９５のいずれか一項に記載の医薬組成物の投与を制御することができる。
【0290】
いくつかの実施形態では、キットは典型的には、本明細書に記載の修飾ＦＧＦの使用にとって商業的観点およびユーザ観点から望ましい、種々の物質（試薬、任意選択的には濃縮形態および／またはデバイス）のうち１つ以上をそれぞれ含む、１つ以上のさらなる容器を含んでもよい。こうした物質の非限定的な例としては、緩衝液、希釈剤、フィルタ、ニードル、シリンジ、内容物および／または使用説明書を列挙する容器（ｃａｒｒｉｅｒ）、包装、容器、バイアルおよび／またはチューブのラベル、ならびに使用説明書と添付文書が挙げられるが、これらに限定されない。一連の説明もまた典型的には含まれる。
【0291】
ラベルは、容器上にある、あるいは容器に付随し得る。ラベルを形成する文字、数字または他の文字が容器自体に添付、成形または書き入れられる場合にはラベルは容器上にあり得、ラベルが、例えば添付文書として容器もまた保持する入れ物または容器内に提示される場合には、これは容器に付随し得る。ラベルは、内容物が特定の治療用途に使用されなければならないと示すために使用され得る。ラベルはまた、本明細書に記載の方法でなど、内容物の使用に関する指示を示し得る。
【0292】
ある特定の実施形態では、修飾ＦＧＦ医薬組成物は、本明細書に提供される化合物を含有する１つ以上の単位剤形を含有することができるパックまたはディスペンサデバイス内に提供され得る。パックは例えば、ブリスターバックなどの金属またはプラスチック箔を含有する。パックまたはディスペンサデバイスは、投与についての説明書を含み得る。パックまたはディスペンサには、医薬の製造、使用または販売を規制する行政機関により規定される形態にて容器に付随する形で通知が同封され得る。この通知は、ヒトまたは獣医学的な投与のための薬物形態の承認を反映している。こうした通知は例えば、処方薬に関する米国食品医薬品局によって承認されるラベルまたは認可された製品への挿入物であり得る。適合性のある薬学的担体内に製剤化された本明細書に提供される修飾ＦＧＦを含有する組成物が調製され、適切な容器に入れられ、かつ指示される病状の治療を目的に標識されている。
【実施例】
【0293】
これらの例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書に提供される特許請求の範囲を限定するものではない。本明細書に記載の例で使用される出発物質および試薬は合成されることができ、または商業的供給源から得ることができる。
【0294】
実施例１：修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの治療効果を評価するための例示的な方法 組換え技術の章にて記載される方法を使用して産生した配列番号２（Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４）または配列番号２０５（ＴＴＨＸ１００１）の配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを、ＮＩＨ－３Ｔ３線維芽細胞細胞増殖アッセイを使用し、生物学的活性について評価した。配列番号２および配列番号２０５の両方の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、線維芽細胞の増殖を誘導する有効性に関しては同等の能力を示した。配列番号２（Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４）または配列番号２０５（ＴＴＨＸ１００１）の配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを、以下に記載のように眼の疾患の実験モデルでさらに評価した。
【0295】
健康なドナーからのヒト角膜内皮細胞の初期培養物（継代１）を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、８％）の存在下で２４ウェルプレート上に播種し、２４時間後、低（０．８％）ＦＢＳを含む培地中で様々な濃度のＮ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４（配列番号２）、ＴＴＨＸ１００１（配列番号２０５）またはｗｔ－ＦＧＦ－１（配列番号１）で処理した。８％のＦＢＳ群を陽性対照として機能させる。結果は、Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４が、ヒト角膜上皮細胞増殖の刺激に関してはＴＴＨＸ１００１またはｗｔ－ＦＧＦ－１よりも強力であり、これはその中で用量応答的であることを示している。Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４のＥＣ５０は、ｗｔ－ＦＧＦ－１または他に検査した修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（ＴＴＨＸ１００１、配列番号２０５）よりも約１００倍低い。
【0296】
本明細書に記載の医薬組成物の治療効果を評価するために、ナイトロジェンマスタード（ＮＭ）を使用した例示的な角膜損傷モデルを使用することができる。ウサギの角膜器官培養モデル系を使用し、ＮＭへの曝露後の治癒を評価した。ウサギの眼（８～１２週齢）を入手し、２ｍｍの強膜辺縁を残したままで眼から角膜を切開し、上皮側を下にしてスポットプレートの中に入れ、その凹面を、５５８Ｃ 溶解寒天（０．７５％）を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）で満たした。溶液をゲル化させると、上皮層にアクセスすることが可能であるように、角膜を反転させた。６０ｍｍ径のパイレックス製組織培養皿に培養物を置いた。１３ＭＥＭ－ＮＥＡＡ（最小必須培地－非必須アミノ酸）、１３ＲＭＰＩ １６４０ビタミン溶液、１３抗生物質／抗真菌薬、アスコルビン酸（０．４５ｍＭ）およびシプロフロキサシン（１０ｌｇ／ｍｌ）を含有する高グルコースＤＭＥＭを調製する。高グルコースＤＭＥＭを強膜辺縁まで加え、角膜を空気に曝露させる。５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿したインキュベータ内にこの皿を入れる。７～９時間ごとに角膜中央の上へと滴下することで、各培養物の上皮を５００μＬの培地で湿らせた。水疱形成剤であるＮＭを角膜中央上へと滴下した。角膜サンプル（寒天支持体から剥離したもの）を、最適切断温度（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ＯＣＴ、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ；Ｓａｋｕｒａ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）化合物を含有するクリオモルド内に上皮側を下にして置いて染色法および免疫蛍光法のために凍結し、またはウェスタンブロットおよびＡＤＡＭ１７活性アッセイ（ＩｎｎｏＺｙｍｅ ＴＡＣＥ活性アッセイキット；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含むさらなるタンパク質解析のために直接急速凍結させた。
【0297】
角膜中央上へとＮＭを適用した後、びらん性毒ガスを除去せずに培養物を３７℃のインキュベータに２時間戻す。このインキュベーション後に、汚染培地を除去し、皿内での培地高さが強膜辺縁上部に達するまで角膜中央に新しい培地を加えた。対照の曝露されていない角膜および曝露された角膜を２２時間インキュベーションするために３７℃に戻し、３回のみの短期間でこれを取り出し、Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４療法を受けない曝露サンプルに２０μＬの培地を加え、または角膜中央への療法として２０μＬのＮ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４を加える。第１のｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４適用を８時間維持し、第２の適用を９時間維持し、第３の適用を５時間維持する。この結果、２時間の曝露とその後の治療の長さは合計で２４時間である。
【0298】
ＮＭによって生じた損傷は、（ａ）角膜実質に押し下げている上皮細胞の数および深さの増加から明らかである上皮層の過形成であり、これは下方過形成と呼ばれ、曝露されていない（まだ曝露をうけていない）角膜は、一部下方過形成を示しているがＮＭに曝露された角膜と同程度広範なものではない、上皮層の下形成、（ｂ）基底上皮細胞頂部に向かって隆起している基底細胞核、および（ｃ）上皮－角膜実質分離を含む。組織病理学的反応は、曝露後４日という早さで認められる。組織病理学的なグレードは、Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４を用いた治療で改善する。Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４処理済の角膜部分は、非処置角膜に由来する部分と比較すると、低スコア（損傷がより少ないことを示す）を呈する。角膜上皮細胞（ｃｏｒｎｅａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ、ＣＥＣ）のＥｄＵ導入で周辺角膜上皮層の刺激を評価する。例えば、Ｋａｙ ｅｔ ａｌにより記載の手順といった標準的な手順を使用してウサギＣＥＣの初期培養物を確立する（Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３；３４（３）：６６３－７２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９；５０（５）：２０６７－７６）。細胞を２時間、ＮＭに曝露させる。例えば、Ｃｌｉｃｋ－ＩＴアッセイキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、１２ウェルプレートにて増殖アッセイを実施する。角膜上皮細胞へのＥｄＵの導入は、上皮増殖の指標である。ＥｄＵを導入している角膜上皮細胞の割合は、ＮＭ曝露後にＮ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４で処理した場合には、非処理の対照と比較すると低い。
【0299】
同様のモデルでは、スルフィルマスタードを使用して実験用角膜内皮損傷を誘発させ、消散を試験するためにＮ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４（または偽群）を投与することができる。ウサギの角膜に曝露させた８週間後に、試験群（消散した眼とも呼ばれる）と偽対照群（後にＭＧＫを発症する）との間の内皮細胞の形態および構造を比較する。消散した眼は、角膜びらん、新生血管形成または角膜の濁りなどの臨床的評価中の特徴的なＭＧＫ後遺症が存在しないことで区別される。これらは６週間時点までは偽－曝露対照とは統計的に区別できない角膜厚を有していた。消散した眼のＥｎｆａｃｅ走査顕微鏡写真は、組織化された多角形細胞の単層を有する偽－曝露対照と著しく類似していることが認められる。平均的なＣＥＣサイズは、対照角膜と比較した場合、消散した眼では増加しているが、一方で消散した眼は後方面にわたる著しい変化を呈しない。対照的に、ＭＧＫ内皮を有する偽対照で処理されたウサギは、動物における細胞形状および細胞サイズの広範な変化を示しているが、これは動的な損傷プロセスを示している。内皮形態の限局した変化は、個々の角膜に日常的に観察され、領域の一部は拡張しているがモザイク状のＣＥＣを呈し、他の領域は著しい組織崩壊を示し、様々な程度の頂端部の水疱を伴い、領域が剥皮化したＤＭを示し、かつ細胞境界の欠損を明確に表している。これらの現象は、Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４処理済の消散した内皮では観察されない。Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４処理済の消散した角膜の透過型電子顕微鏡画像は、未曝露の内皮と非常に類似している。対照的に、ＭＧＫ病態を有する偽対照処理済内皮は、後方ＤＭの拡散した肥厚を呈し、これは浮腫および／または角膜後線維膜の沈着と一致している。ＭＧＫ角膜はまた、細胞質の希薄化、過剰な空胞形成および腫大した小胞体を含む、ＣＥＣストレスまたは損傷の広範なマーカを呈する。高頻度の重複する細胞プロセスが存在しているが、これは２４時間の画像と類似しており、直近で剥皮化したＤＭを継続して生着させようとしていることを示唆している。
【0300】
ヘルペス性角膜症の治療のため、例えば配列番号２（Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４）または配列番号２０５（ＴＴＨＸ１００１）の配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドといったＦＧＦ－１ポリペプチドの治療効果を評価するため、以下の方法を採用することができる。
【0301】
この研究のためにヘルペス性角膜症に罹患している患者群を選択する。患者を３つのサブグループに分ける。第１のサブグループの患者に、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、０．３％のプロピレングリコール、０．４％のポリエチレングリコール４００および０．０５％のヒドロキシプロピルグアーガム中に製剤化される約５００ｐｇ／ｍｌ（すなわち、０．０００５μｇ／ｍｌ）のＮ－ｍｅｔ ＴＴＨＸ１１１４（配列番号２）を含有している、点眼薬などの眼科用製剤を眼に投与する。第２のサブグループの患者に、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）、０．３％のプロピレングリコール、０．４％のポリエチレングリコール４００および０．０５％のヒドロキシプロピルグアーガム中に製剤化される約５００ｐｇ／ｍｌ（すなわち、０．０００５μｇ／ｍｌ）のＴＴＨＸ１００１（配列番号２０５）を含有している、点眼薬などの眼科用製剤を眼に投与する。第３のサブグループの患者に、Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４（配列番号２）またはＴＴＨＸ１００１（配列番号２０５）を含まないが、その他は第１のサブグループおよび第２のサブグループに投与されるものと同一の偽眼科用製剤を眼に投与する。３つのサブグループすべてについて、点眼薬は患者によって自己投与される、または看護師もしくは介護者によって投与される。Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４（配列番号２）含有眼科用製剤、ＴＴＨＸ１００１（配列番号２０５）含有眼科用製剤および偽眼科用製剤を、第１のサブグループ、第２のサブグループおよび第３のサブグループの患者それぞれに、最大３０日間にわたって１日に２回、投与する。
【0302】
Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４（配列番号２）を含有する眼科用製剤およびＴＴＨＸ１００１（配列番号２０５）を含有する眼科用製剤により、約１４日以内に、疼痛および炎症持続期間の減少とともに、第１のサブグループおよび第２のサブグループに属する患者の大半にヘルペス性角膜潰瘍の治癒が生じる。さらには、Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４（配列番号２）含有眼科用製剤およびＴＴＨＸ１００１（配列番号２０５）含有眼科用製剤でそれぞれ治療された第１のサブグループおよび第２のサブグループの患者の眼は、偽眼科用製剤で治療された第３のサブグループの患者よりも角膜の濁りと瘢痕が少なくなる。
【0303】
例えば、ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）増殖での配列番号２０６（ＴＴＨＸ１１１４）または配列番号２０５（ＴＴＨＸ１００１）の配列を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの効果を試験するため、健康なドナーからのヒト角膜内皮細胞の初期培養物（継代１）を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、８％）の存在下で２４ウェルプレート上に播種し、２４時間後、低（０．８％）ＦＢＳを含む培地中で様々な濃度のＴＴＨＸ１１１４（配列番号２０６）、ＴＴＨＸ１００１（配列番号２０５）またはｗｔ－ＦＧＦ－１（配列番号１）で処理した。８％のＦＢＳ群を陽性対照として機能させる。結果は、ＴＴＨＸ１１１４が、ヒト角膜上皮細胞増殖の刺激に関してはＴＴＨＸ１００１またはｗｔ－ＦＧＦ－１よりも強力であり、これは中で用量応答的であることを示していた。ＴＴＨＸ１１１４のＥＣ５０は、ｗｔ－ＦＧＦ－１または他に検査した修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（ＴＴＨＸ１００１、配列番号２０５）よりも約１００倍低かった。
【0304】
実施例２：組換えヒトＦＧＦ－１を大規模に作製する方法：眼内治療薬としてＦＧＦ－１を製造するための例示的で一般的な方法は、図１に概略的に示されている。一般的な方法をさらに開発し、種々の修飾を行う。簡潔には、修飾ヒトＦＧＦ－１（Ｎ－Ｍｅｔ－ＴＴＨＸ１１１４）をコードする組換え核酸配列を含むプラスミドで大腸菌を形質転換する。
【0305】
例示的な一セットでは、Ｎｄｅ１／ＢａｍＨ１クローニング制限部位を使用し、大腸菌コドン最適化ヒトＦＧＦ－１（ＴＴＨＸ１１１４）配列をｐＥＴ２６ｂ（＋）ベクター中にサブクローニングし、ｐＥＴ２６＿ＴＴＨＸ１１１４プラスミドを得た。ｈＦＧＦ－１をコードする例示的な大腸菌コドン最適化配列を以下に提供する：
【0306】
ＣＡＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＧＴＣＣＴＣＧＴＡＣＧＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧ。
【0307】
例示的な一セットでは、Ｎｄｅ１／ＢａｍＨ１部位を使用し、大腸菌コドン最適化ヒトＦＧＦ－１配列をｐＭＫｅｔベクター骨格中にサブクローニングし、ｏｍｐＡリーダー配列などのリーダー配列を含まないｐＭＫｅｔ＿ＴＴＨＸ１１１４プラスミドを得た。ｐＭＫｅｔベクターはｐＢＲ３２２ｏｒｉ配列を含む。
【0308】
例示的な一セットでは、ＴＴＨＸ１１１４コーディング配列上流にｏｍｐＡリーダー配列を挿入してＦＧＦ－１ポリペプチドのペリプラズム発現を指示するＯＡ＿ＴＴＨ１１１４ｐＭＫｅｔプラスミドを得る。ｏｍｐＡリーダー配列をコードする例示的な核酸配列を以下に提供する：
【0309】
５’－ＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＣ ＡＡＧＣＴ－３’。
【0310】
例示的なｏｍｐＡアミノ酸配列は、ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡである。
【0311】
Ｎ末端ｆＭｅｔの有無にかかわらず、ＦＧＦ－１配列を試験する。
【0312】
試験する宿主細胞は、大腸菌のＢＬ２１株および大腸菌のＷ３１１０株である。
【0313】
炭素源としてグルコースまたはグリセロールを含む、２ＹＴの試験培地または特注の合成培地中で宿主細胞を増殖させる。全体を通し、カナマイシンの存在下で培養物を静置した。
【0314】
形質転換させた大腸菌細胞を発酵培養物中で増殖させ、例示的なＦＧＦ－１製造のために１０Ｌのアリコートを使用した。発酵運転Ｔ１ Ｆ０１Ｅ（１０Ｌ）からの１００ｇの大腸菌細胞ペーストを再懸濁し、続いて細胞溶解させて封入体（ＩＢ）を単離し、可溶化緩衝液中に希釈させ、リフォールディングバッファ中でリフォールディングした（１：２０体積／体積）。ＦＧＦ－１を含む２５０ｍｌのリフォールディングバッファをブチルおよびヘパリンＨＩＣカラム中へと通した。
【0315】
上記の一般化プロトコールを使用する例示的な一運転では、収量は１Ｌのリフォールディングバッファにつき、約０．６ｍｇのＦＧＦ－１であった。０．２５Ｌリフォールディングから約０．２～０．２５ｍｇのＦＧＦを得た（約１ｍｇ／Ｌ）。精製したタンパク質の同定をウェスタンブロットで確認した。
【0316】
例示的な一運転では、ＢＬ２１細胞でのｐＭＫｅｔ ＴＴＸ１１１４（ｏｍｐＡリーダー配列を含まない）の使用、および合成培地中での増殖によって、ｏｍｐＡリーダー配列を含むプラスミドよりも収量が向上し、約１０倍収量が向上した。図２Ａは、ブチル捕捉クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｃａｐｔｏ ＤｅＶｉｒｓ（Ｃｙｔｉｖａ，ＢＰＧ ３００ｘ５００，製品番号１７－５４６６）からの溶離液を示し、図２Ｂは、示されるようにＡ２１５およびＡ２８０で検出されるヘパリンＨＩＣからの溶離液を示す。点線で示される溶離液画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび単量体の存在を示すウェスタンブロット解析にかけた。本アッセイに使用されるカラムは５ｍｌのブチル４ＦＦであり、１．５Ｍ 硫酸アンモニウムを加えサンプル負荷量２５０ｍｌを調整し、ｐＨ７．４で１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４で溶出させた。ヘパリンカラム溶出サンプルの例示的なウェスタンブロット結果を図２Ｂに示す。例示的な別の方法では、プロトコールではいくつかの調整を行った。１Ｌの培養物について、以下の表１に示される条件を使用し、クローンスクリーニングにかけた。
【0317】
【表1】
【0318】
上記の最適化試験から、高密度の細胞を得た。合成培地およびコドン最適化ＦＧＦ－１をコードする配列を有するｐＭＫｅｔプラスミドで形質転換させた大腸菌ＢＬ２１株によって、３ｇ／ＬのＦＧＦ－１の予想し得なかった高収量がもたらされた。これは表に示されるように、他の実験変動よりも約５～３０倍の増加である。
【0319】
修飾ＦＧＦ－１を作製するための例示的な方法では、実施される方法は以下の通りである：
・ｐＨ７．４である５０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ グアニジン、０．１Ｍ ＮａＣｌ中に可溶化された１０ｇの調製ＩＢ
・５０ｍＭ ＤＴＴの添加（２時間以上）によるｈＦＧＦの減少
・透析ろ過／限外ろ過によるＤＴＴの除去
・急速希釈による約１．０のＡ２８０へのリフォールディング（一晩のＲＦ）
・リフォールディングバッファ：
・Ｉ（ＲＦＢ）：ｐＨ９．５である１Ｍ アルギニン、５０ｍＭ トリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ
・ＩＩ（ＲＦＤ）ｐＨ９．０である５ｍＭ トリス、２ｍＭ システイン、５ｍＭ システイン
・沈殿剤を除去するための遠心分離
・ヘパリンによる捕捉について：ｐＨ調整および２５ｍＳ／ｃｍ未満の濃さに減少させるために希釈（必要があれば）し、続いてＨＩＣ（Ｃ４）によるヘパリン溶離液の塩調整
・カラム：ヘパリン ＨｉＴｒａｐ ＨＰ（５ｍＬ）
緩衝液：
Ｉ（等量／洗浄Ｉ）：ＰＢＳ ｐＨ７．０
ＩＩ（洗浄ＩＩ）：ＰＢＳ＋０．６Ｍ ＮａＣＬ（ｐＨ７．０）
ＩＩＩ（溶出）：ＰＢＳ＋１．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）
グラジエント：０～１００％緩衝液ＩＩＩ（１０ＣＶ）
流速：５ｍＬ／分
・ＨＩＣ（Ｃ４）による捕捉について：１．５Ｍ 硫酸アンモニウムへの塩調整、ｐＨ７．４へのｐＨ調整。
・ｐＨ７．４である５０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ グアニジン、０．１Ｍ ＮａＣｌ中に可溶化された１０ｇの調製ＩＢ
・５０ｍＭ ＤＴＴの添加（２時間以上）によるｈＦＧＦの減少
・透析ろ過／限外ろ過によるＤＴＴの除去
・急速希釈による約１．０のＡ２８０へのリフォールディング（一晩のＲＦ）
・リフォールディングバッファ：
・Ｉ（ＲＦＢ）：ｐＨ９．５である１Ｍ アルギニン、５０ｍＭ トリス、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ
・ＩＩ（ＲＦＤ）ｐＨ９．０である５ｍＭ トリス、２ｍＭ システイン、５ｍＭ システイン
・沈殿剤を除去するための遠心分離
・ヘパリンによる捕捉について：ｐＨ調整および２５ｍＳ／ｃｍ未満の濃さに減少させるために希釈（必要があれば）し、続いてＨＩＣ（Ｃ４）によるヘパリン溶離液の塩調整
・カラム：ヘパリン ＨｉＴｒａｐ ＨＰ（５ｍＬ）
緩衝液：
Ｉ（等量／洗浄Ｉ）：ＰＢＳ ｐＨ７．０
ＩＩ（洗浄ＩＩ）：ＰＢＳ＋０．６Ｍ ＮａＣＬ（ｐＨ７．０）
ＩＩＩ（溶出）：ＰＢＳ＋１．２Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）
グラジエント：０～１００％緩衝液ＩＩＩ（１０ＣＶ）
流速：５ｍＬ／分
・ＨＩＣ（Ｃ４）による捕捉について：１．５Ｍ 硫酸アンモニウムへの塩調整、ｐＨ７．４へのｐＨ調整。
【0320】
リフォールディングバッファＩおよびＩＩの使用によるそれぞれの溶離液プロファイルを図３Ａおよび図３Ｂに示す。ヘパリンＨｉＴｒａｐ後の対応するＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像を評価した（図示せず）。これらの試験は、リフォールディングバッファ１（ＲＦＢ）の使用は、リフォールディングバッファ２（ＲＦＤ）の使用よりも著しく良好な結果をもたらしたことを示した。ＲＦＤによって大量の沈殿物が生じた。
【0321】
別の例示的な試験では、周囲温度ではＨＩＣを使用した捕捉スクリーニングを実施した。以下の手順を使用した：
・ｐＨ７．０の１２ｍＭ ＰＯ４中に再懸濁された１０ｇの細胞ペレット
・ＨＰＨによる細胞溶解（２×４００バール、Ｔ＜２５℃）
・１７５００ｘｇでの遠心分離、３０分、８℃
・ヘパリンによる捕捉について：５０ｍＬの細胞溶解物→ｐＨ調整→負荷
・ＨＩＣ（Ｃ４）による捕捉について：５０ｍＬの細胞溶解物→１．５Ｍ 硫酸アンモニウムまでの塩添加、ｐＨ７．４までのｐＨ調整→負荷。
・ｐＨ７．０の１２ｍＭ ＰＯ４中に再懸濁された１０ｇの細胞ペレット
・ＨＰＨによる細胞溶解（２×４００バール、Ｔ＜２５℃）
・１７５００ｘｇでの遠心分離、３０分、８℃
・ヘパリンによる捕捉について：５０ｍＬの細胞溶解物→ｐＨ調整→負荷
・ＨＩＣ（Ｃ４）による捕捉について：５０ｍＬの細胞溶解物→１．５Ｍ 硫酸アンモニウムまでの塩添加、ｐＨ７．４までのｐＨ調整→負荷。
【0322】
【0323】
別の例示的な試験では、尿素およびグアニジン緩衝液での可溶化についての比較を行った。ＩＢの洗浄の有無にかかわらず、尿素およびグアニジンでの封入体（ＩＢ）の可溶化を試験した。ＩＢの洗浄におけるポリソルベート２０またはポリソルベート８０の使用もまた試験した。結果は、ＰＳ２０およびＰＳ８０は同等の効果を有することを示していた。可溶化ＦＧＦの純度は、両方の洗浄手法では同等であった。可溶化ＦＧＦの収量は、両方の洗剤について同等であった。
【0324】
例示的な方法では、微生物の発現のため、クローンをさらに最適化した。新しいコンストラクトを異なる株へと形質転換かつこれを増殖させ、ＦＧＦ産物を異なる培地で試験した。特注の合成培地または２ＴＹ培地にて各コンストラクト／株の組合せを増殖させた。炭素源はグリセロールまたはグルコースのいずれかであった。ＯＤ６００を２に増加させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｃ：３７℃で２０時間の発現、ｐ：２６℃で２０時間の発現）で培養物を誘導した。浸透圧衝撃を用いてペリプラズムのコンストラクトを送り、その後超音波を用いて処理して細胞を開裂させた。ペリプラズム発現および細胞質発現用のコンストラクトを以下に一般化した（図２および図３）：
【0325】
【表2】
【0326】
【表3】
【0327】
ＢＬ２１株およびＷ３１１０株で発現される細胞質コンストラクトと、ＢＬ２１株およびＷ３１１０株で発現されるペリプラズムのコンストラクトの比較を行った。加えて、すべてのコンストラクトを炭素源としてグリセロールおよびグルコースを含む自家製培地および２ＹＴ培地中で培養した。ＯＤ６００を２に増加させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（細胞質：３７℃で２０時間の発現、ペリプラズム：２６℃で２０時間の発現）で培養物を誘導させた。浸透圧衝撃を用いてペリプラズムのコンストラクトを送り、その後超音波を用いて処理して細胞を開裂させた。
【0328】
修飾ＦＧＦ－１タンパク質の微生物での発現については、ｐＭＫｅｔコンストラクトは、プロモータまたは本明細書に記載の他の修飾を含まない現存するプラスミドよりも著しく良好であった。
【0329】
別の例示的な試験では、リフォールディングバッファで尿素を使用し、洗剤としてＰＳ２０を使用した。変性のためにグアニジンを使用した。リフォールディングは、ＲＴおよび２～８℃で実施した（予め開示したリフォールディングバッファ）。リフォールディング後、スピンカラムを使用してサンプルを透析ろ過し、ＤＴＴを除去した。伝導率を高くするために各ＲＦ手法を希釈した。緩衝液Ａ（平衡化）：ｐＨ７．０のＰＢＳ、緩衝液Ｂ（洗浄）：ｐＨ７．０のＰＢＳ、０．６Ｍ ＮａＣｌ、緩衝液Ｃ（溶出）：ｐＨ７．０のＰＢＳ、１．２Ｍ ＮａＣｌ、を使用した５ｍＬ ＨｉＴｒａｐヘパリンを用いて、ヘパリンカラムを構成した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用する解析のための各ステップ後にサンプルを採取した。以下の表４に構成をまとめた：
【0330】
【表4】
【0331】
表５はそれぞれの収量を示す：
【0332】
【表5】
【0333】
タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、図４Ａ～図４Ｂに示されるデータに定量化したＦＧＦ－１回収物を示す。Ａｇｉｌｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅ Ｂｉｏ ＳＥＣ ３００Ａ（孔径２．７μｍ）を使用し、サイズ排除クロマトグラフィーを構成した。泳動用緩衝液は、ｐＨ７．４の０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳを含んでいた。流速を０．７５ｍＬ／分に調整し、２０分間これを泳動させた。Ａ２１５ｎｍで吸光度を観察した。各泳動について、それぞれのＳＥＣのピークを評価した。リフォールディングバッファＡおよびＢは、変性溶液としてグアニジンを含むプロセスでは良好な結果を示した。加えて、ＩＢ可溶化に使用されるカオトロピック薬剤は、リフォールディング性能に影響を及ぼさないと考えられる。リフォールディングバッファＣおよびＤは、尿素を使用する場合、リフォールディングバッファＡおよびＢ（低コスト）よりもわずかに良好である。リフォールディングは４℃ではわずかに良好であったこともまた確認された。
【0334】
実施例３：バルク原薬の製造条件
封入体の発酵および初期回収
例示的な研究は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）バルク原薬（ＢＤＳ）の封入体の発酵、収集／回収、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）バルク原薬（ＢＤＳ）の精製、単離および試験に関与している。配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを発現するための核酸配列を含む大腸菌であるＢＬ２１ ｐＭＫｅｔのマスター細胞バッチ（ＭＣＢ）を使用し、ＴＴＨＸ１１１４のＢＤＳのｃＧＭＰ製造を実施した。
封入体の発酵および初期回収
例示的な研究は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）バルク原薬（ＢＤＳ）の封入体の発酵、収集／回収、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）バルク原薬（ＢＤＳ）の精製、単離および試験に関与している。配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを発現するための核酸配列を含む大腸菌であるＢＬ２１ ｐＭＫｅｔのマスター細胞バッチ（ＭＣＢ）を使用し、ＴＴＨＸ１１１４のＢＤＳのｃＧＭＰ製造を実施した。
【0335】
ＭＣＢを含有する融解したバイアルの内容物を混合し、これを使用し、前培養：５．２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．４ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、４．０ｇ／ＬのＫＣｌ、５．３ｇ／Ｌのクエン酸ｘＨ２Ｏ、１．３ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＦｅＣｌ３ｘ６Ｈ２Ｏ、１ｘＴＥＳ（２１ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、２４ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４ｘＨ２Ｏ、８ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４ｘ５Ｈ２Ｏ、４ｍｇ／ＬのＣｏＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ）、グリセロール１０ｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシン、１０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ酵母抽出物および１６ｇ／ＬのＰｈｙｔｏｎｅペプトン、のために合成培地を含有する種フラスコに播種した。播種した種フラスコを、培養物が約２～５のＯＤに達するまで、３７℃でインキュベートした。
【0336】
１５０Ｌのバイオリアクタ内で、５０Ｌの出発容量の培地（３０ｇ／Ｌのグリセロール、５．２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、４．４ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、４．０ｇ／ＬのＫＣｌ、５．３ｇ／Ｌのクエン酸ｘＨ２Ｏ、１．３ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＦｅＣｌ３ｘ６Ｈ２Ｏ、１倍のＴＥＳ（２１ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、２４ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ４ｘＨ２Ｏ、８ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ４ｘ５Ｈ２Ｏ、４ｍｇ／ＬのＣｏＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ、０．３ｍｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、０．２ｍｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ）、１ｍＬの消泡剤、１０ｇ／ＬのＢａｃｔｏ酵母抽出物および１６ｇ／ＬのＰｈｙｔｏｎｅペプトンで、本培養を実施した。本培養物に５００ｍＬの前培養物を播種し、続いて酸素の制限なしに３７℃、ｐＨ６．８でこれをインキュベートした。２５％の水酸化アンモニウムおよび１Ｍ リン酸を加え、ｐＨを制御した。培地中の初期グリセロール量（３０ｇ／Ｌ）を消費（これは、ｐＯ２－ピークで示される）した後、２．３３３ｋｇ／ｈの供給速度で４５％グリセロール水溶液の一定供給を開始した。供給を開始して約１０時間後、１ｍＭ最終濃度までイソプロピル－β－Ｄ－１－チオ－ガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－１－ｔｈｉｏ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、ＩＰＴＧ）を加えて産物形成を誘導し、追加のグリセロール供給量を減少させた（０．９７３ｋｇ／ｈの供給速度にて４５％グリセロール水溶液）。誘導から収集までの時間を、誘導期または産物形成期と呼んだ。
【0337】
発酵培地を約１８±２℃まで冷却させて誘導期を停止し、顕微鏡分析のためにサンプルを採取した。遠心分離（４０～１００Ｌ／ｈの流速で８Ｌのボウルを使用する連続ＣＥＰＡ遠心分離機）によってバイオマスを回収し、１８℃±２℃まで冷却させながら１８，０００ｘｇで遠心分離した。１５℃以下で、細胞破壊緩衝液（４８ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、９６ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に細胞ペーストを再懸濁し、９５０±５０バールでの２サイクルの高圧均質化（ＳＰＸホモジナイザー）で再懸濁細胞を破壊した。均質化ステップ中、産物含有溶液を絶えず冷却した。
【0338】
細胞破壊後、以前同様遠心分離によって封入体（ＩＢ）を回収し、異なる緩衝液（洗浄１および２、５０ｍＭ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．２％のポリソルベート８０、ｐＨ７．４；洗浄３および４、５０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２％のポリソルベート８０、２０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．４；洗浄５、５０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．４）を使用し、５回の連続洗浄サイクルで溶解性不純物を洗浄した（２００Ｌの撹拌タンク）。洗浄終了後、封入体を－６０℃以下で保存した。
封入体の可溶化およびリフォールディング
封入体の可溶化およびリフォールディング
【0339】
可溶化およびさらなる処理のため、洗浄された封入体の半分（約１ｋｇ）を貯蔵から取り出し、２～８℃で融解した（１～３日間）。合計２５Ｌの可溶化緩衝液（５０ｍＭ トリス、２ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ グアニジン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中にＩＢを再懸濁した。５０００～８０００ｒｐｍで８～１０分間、Ｓ５０Ｎ－Ｇ４５Ｇプローブを用い、続いて７０００～１００００ｒｐｍでさらに８～１０分間、Ｓ５０Ｎ－Ｇ４５Ｆプローブを用いてＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸ（ＩＫＡ）を使用して分散させ、最終的に６０分間撹拌した。ＩＢの再懸濁後、５０ｍＭ最終濃度までＤＴＴを加え、１５時間にわたってジスルフィド結合をチオールに還元した。続いて、Ｐａｌｌカセットシステム（ＰＥＳ膜を備えた１０ｋＤａ Ｓａｒｔｏｃｏｎ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、製品番号３０２１４６３９０７Ｅ）を使用する限外ろ過によって再びＤＴＴを除去した。続いて、５５０Ｌのリフォールディングバッファ（１Ｍ アルギニン塩酸塩、０．１Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＧＳＳＧ、５ｍＭ ＧＳＨ、ｐＨ７．４）に産物をゆっくりと加え、これを９時間インキュベートした。最後に、深層ろ過で産物の不純物を清澄化し、その後０．２μｍのバイオバーデン減少膜（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ＸＬＧカプセル、０．８／０．２μｍの保持速度、ＰＥＳ製のメンブレンフィルタ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、製品番号５４４５３０７Ｇ）でろ過し、５００Ｌのバッグに入れた。
【0340】
以下に記載されるように、さらなる下流処理のため、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）を含有するろ過したリフォールディングタンパク質溶液を後で使用した。
バルク原薬のクロマトグラフィー精製および充填
バルク原薬のクロマトグラフィー精製および充填
【0341】
結合を確実なものとするため、水で１：１に希釈した後、Ｃａｐｔｏ ＤｅＶｉｒｓ（Ｃｙｔｉｖａ、ＢＰＧ ３００ｘ５００、製品番号１７－５４６６）を充填したカラム（１５．６Ｌ容量）を使用し、リフォールディングＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）を捕捉した。０％～１００％の緩衝液１Ｂ（緩衝液１Ａの１００％～０％に対応する）の直線勾配で、室温にて２１．２～１７９．９Ｌ／ｈの流速で流すことで、カラムを溶出した。溶出後、５ＣＶにわたり、１００％の緩衝液１Ｂでカラムを保持した。緩衝液１Ｂ＝７８．１３ｇ／Ｌの塩化ナトリウム；０．２０ｇ／Ｌの塩化カリウム；１．７８ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム二水和物；０．２７ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム；ｐＨ７．４（緩衝液１Ａ：８．００ｇ／Ｌの塩化ナトリウム；０．２０ｇ／Ｌの塩化カリウム；１．７８ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム二水和物；０．２７ｇのリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４の１００％～０％に対応する）。緩衝液１Ａ＝８．００ｇ／Ｌの塩化ナトリウム；０．２０ｇ／Ｌの塩化カリウム；１．７８ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム二水和物；０．２７ｇのリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４。緩衝液１Ｂ＝７８．１３ｇ／Ｌの塩化ナトリウム；０．２０ｇ／Ｌの塩化カリウム；１．７８ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム二水和物；０．２７ｇのリン酸二水素カリウム、ｐＨ７．４。
【0342】
単一画分に溶離液を収集した。収集した溶離液を０．２μｍのフィルタ（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ＸＬＧ Ａｒｔ．番号：５４４５３０７Ｇ８）でろ過し、１５～２５℃で２４時間未満保存した。Ｃａｐｔｏ ＤｅＶｉｒｓカラムを使用した捕捉ステップ後の収量は、溶離液の約１．７４ｇ／Ｌの濃度の約１２０ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）であった。
【0343】
このカラムステップ後、硫酸アンモニウム（１．０Ｍ最終濃度）および塩化ナトリウム（２．５Ｍ最終濃度）を加えて最終精製するため、産物をコンディショニングした。ブチルセファロース４ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ、ＢＰＧ ３００ｘ５００、製品番号１７－０９８０）を充填し、２０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物（ｐＨ７．４）で平衡化したカラム（１０．６Ｌ容量）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）で最終精製を実施した。同一緩衝液の３ベッドボリュームでカラムを洗浄した。０％～１００％の緩衝液２Ｂ（緩衝液２Ａの１００％～０％に対応する）の直線勾配で、１０ＣＶにわたって室温で５１．３Ｌ／ｈの流速で流すことで、産物を溶出した。緩衝液２Ａ＝２０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物、ｐＨ７．４および緩衝液２Ｂ＝２．５ｍＭ 塩化ナトリウム、１Ｍ 硫酸アンモニウム、２０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物、ｐＨ７．４。溶離液をＳｔｅｄｉｍバッグ（１×５０Ｌ）に移した。最終精製ステップ後の収量は、３ｇ／Ｌの濃度で約９２ｇの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）であった。ブチルセファロースＦＦカラムを使用した最終精製ステップでの収量は約５０％であり、最終精製ステップにヘパリン樹脂を使用することで約２０％の収量と比較して著しく向上した。
【0344】
上記方法に従って精製されたバルク原薬（ＢＤＳ）を、ブチルセファロースＦＦカラムの溶出緩衝液中に溶液として保存した。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）は勾配をつけて溶出することが観察されており、そのために緩衝液は正確な組成物は含まず、ｐＨ７．４で約８００ｍＭ 塩化ナトリウム、３２０ｍＭ 硫酸アンモニウムおよび２０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物を含有していた。
【0345】
精製ＢＤＳをろ過（Ｍｉｌｌｉｐａｋ １００ Ｇａｍｍａ Ｇｏｌｄ、０．２２μｍ、Ｍｅｒｋ、製品番号ＭＰＧＬ１ＧＣＦ３）し、チューブポンプを使用して第２のＳｔｅｄｉｍ滅菌バッグに入れた。上記プロセスによるバルク原薬の総収量は、５０Ｌの培養物からは約８２ｇであった。
【0346】
高密度ポリエチレン製スクリューキャップを備えたガンマ線滅菌したパイロジェンフリーのポリエチレン製ボトルに、ろ過済のタンパク質溶液を無菌状態で分注することで、上記にて調製されるように原薬の充填を実施した。約－６０℃±１０℃の温度でバルク原薬のアリコートを保存した。
【0347】
実施例４：医薬製剤
配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬製剤の異なるバリエーションを評価するための例示的に一般化した試験は、最適化された安定性および分解傾向が減少した医薬製剤を識別するために、２つの異なる界面活性剤条件中での異なる３つのｐＨ値での１０ｍＭ ヒスチジン緩衝液対１ｍＭ ヒスチジンの比較を含んでいた。目盛り付きの外観検査、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＦｌｏｗＣａｍ解析など、２つの方法で安定性を決定した。白黒の背景に対し、白色光源（１３Ｗの蛍光管）下で外観検査を行った。各時点ですべての製剤のデジタル写真を取得した。ＦｌｏｗＣａｍ粒子イメージングシステムは、粒子の自動解析のために光学、エレクトロニクスおよび流体工学を組み合わせている。流体中の粒子がフローセルを通過するときの流体のリアルタイム画像を捕捉するため、光学系を使用する。イメージングソフトウェアは、粒径および形態を評価する能力を提供する。すべてのサンプルを７５トールで３０分間脱気し、適切に解析した。
配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬製剤の異なるバリエーションを評価するための例示的に一般化した試験は、最適化された安定性および分解傾向が減少した医薬製剤を識別するために、２つの異なる界面活性剤条件中での異なる３つのｐＨ値での１０ｍＭ ヒスチジン緩衝液対１ｍＭ ヒスチジンの比較を含んでいた。目盛り付きの外観検査、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＦｌｏｗＣａｍ解析など、２つの方法で安定性を決定した。白黒の背景に対し、白色光源（１３Ｗの蛍光管）下で外観検査を行った。各時点ですべての製剤のデジタル写真を取得した。ＦｌｏｗＣａｍ粒子イメージングシステムは、粒子の自動解析のために光学、エレクトロニクスおよび流体工学を組み合わせている。流体中の粒子がフローセルを通過するときの流体のリアルタイム画像を捕捉するため、光学系を使用する。イメージングソフトウェアは、粒径および形態を評価する能力を提供する。すべてのサンプルを７５トールで３０分間脱気し、適切に解析した。
【0348】
例えば、目盛り付きの外観検査法を使用して薬物沈殿を解析し、ＳＥ－ＨＰＬＣ解析を使用して薬物分解および高分子量（ＨＭＷ）種の形成を解析した。医薬製剤の調製後、最終製剤を、カバー付きチューブラック内のベンチトップに室温（約２０℃）で保存した。調製後、外観検査およびＳＥ－ＨＰＬＣ解析を０日目、５日目、１４日目、２８日目および５９日目に実施した。
【0349】
例示的な試験では、ｐＨが６．５超のサンプルでは調製後すぐに目に見える沈殿が生じた。ヒスチジン濃度に関係なく、ｐＨが５．８のサンプルは溶液中での薬物の保持は良好であり、調製後５９日目までは１０ｍＭ ヒスチジン緩衝液中には粒子は見られなかったが、１ｍＭ ヒスチジン緩衝液では２８日目に１つのサンプルのみで懸濁粒子が観察されている。すべてのＰＳ２０製剤は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって５日目にそれらのＰＳ８０対照物よりも回収量がすべて低かったため、５日目以降は検査されない。
【0350】
界面活性剤のスクリーニングを２回行った。１回目のスクリーニングでは、１０ｍＭ クエン酸塩、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６にて約０．１ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ／ｍＬ）の濃度の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）を製剤化した。様々な界面活性剤を試験した。ＦＧＦ－１製剤を界面活性剤原液に混合し、最終濃度を以下の通りとした：０．１％（ｗ／ｖ）チロキサポール、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリソルベート８０（ＰＳ８０）および０．１％（ｗ／ｖ）ポロキサマー１８８（Ｆ－６８）。界面活性剤を含まないＦＧＦ－１製剤を対照として使用した。別の界面活性剤のスクリーニングでは、ｐＨ７．４の１．０４６Ｍ ＮａＣｌ、０．４１９Ｍ 硫酸アンモニウム、２０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム二水和物（ブチル溶離液）中で約０．２５ｍｇ／ｍＬ（２５０μｇ／ｍＬ）の濃度でＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）を製剤化した。第２の界面活性剤のスクリーニングでは、１０ｍＭ クエン酸塩および３００ｍＭ ＮａＣｌを含有する製剤、またはブチル溶離液製剤のいずれかの中の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）を様々な製剤（表６を参照されたい）に透析し、透析後、それぞれの製剤緩衝液中で原薬濃度を０．２５ｍｇ／ｍＬ～約０．１ｍｇ／ｍＬに減少し、約１．２５ｍＬの容量のＣｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈバイアルに充填した。以下の表は、２回の界面活性剤スクリーニングの詳細を提供する。
【0351】
【表6】
【0352】
１０００ｒｐｍ、周囲温度で約４時間にわたり振盪機上で撹拌ストレスにかけることで各製剤のサンプルバイアルを試験し、同一製剤のバイアルをストレスのかかっていない静的対照（室温で４時間保存した）として使用した。４時間撹拌ストレスをかけた後、ストレスをかけたサンプルを５サイクルの凍結と融解に供した（凍結するまで－２０℃で保存し、融解するまで周囲温度に置いた）。凍結融解サイクルの間、ストレスのかかっていないサンプルを５℃で保存した。撹拌および凍結融解ストレスの終了後、外観検査およびＦｌｏｗＣａｍでサンプルを解析した。
【0353】
第１回の界面活性剤スクリーニングについては、すべての静的サンプルは界面活性剤の有無にかかわらず透明で無色であり、微粒子を多少示した。撹拌および凍結融解サイクルにかけた界面活性剤を含まないサンプルは、わずかに不透明に見え、多くの微粒子を含有していた。０．１％のチロキサポールまたは０．１％のＦ－６８を含有するサンプルは透明で無色であり、撹拌および凍結融解サイクル時にフレーク状の白色沈殿を呈した。０．０１％のＰＳ８０を含有し、ストレスをかけたサンプルは透明かつ無色であったが、多くの微粒子を有する。ＦｌｏｗＣａｍ解析では、すべての静的サンプルは中程度の、目視で確認できる減少した粒子数を示した。０．１％のＦ－６８を含有する撹拌済サンプルは、他の界面活性剤条件の撹拌済サンプルと比較すると最も低い粒子数を示した。ただし、ストレスをかけたＦ－６８サンプルは、目視で確認できる粒子の著しい増加を依然として示していた。界面活性剤を含まない撹拌および凍結融解サンプルは、目視で確認できる粒子濃度が最も高くなった。
【0354】
第２回の界面活性剤スクリーニングについては、界面活性剤を含まないすべての静的サンプルは透明で無色であり、目に見える微粒子を多少呈した。新規ＤＳ（ブチル溶離液）ソルビトールサンプルは、他のサンプルよりも見た目には透明になり、溶液中に微細な気泡を多く呈した。新規ＤＳ（ブチル溶離液）を除き、ＮａＣｌおよび０．１％のＰＳ２０を含む、ＰＳ２０を含有するすべての静的サンプルは、透明で無色であり、目に見える粒子を含まなかった。０．１％のＰＳ２０を含有する新規ＤＳ ＮａＣｌサンプルは透明で無色であり、目に見える粒子を多少呈した。ソルビトールを含有する撹拌済サンプルは一般には透明で無色であり、目に見える微粒子を多少呈した。ＮａＣｌを含有する撹拌済サンプルは一般には見た目がわずかに不透明であり、目に見える粒子を呈した。
【0355】
ＰＳ８０を含有するすべての静的サンプルは透明で無色であり、一般には目に見える粒子を含まない。ソルビトールを含有する撹拌済サンプルは一般には透明で無色であり、目に見える微粒子を多少呈した。ＮａＣｌを含有する撹拌済サンプルは、一般には見た目がわずかに不透明であり、目に見える粒子を呈した。Ｆ－６８を含有するすべての静的サンプルは透明で無色であり、目に見える粒子を含まない。Ｆ－６８を含有するすべての撹拌済サンプルは一般には透明で無色であり、目に見える微粒子を多少呈した。第２回の界面活性剤スクリーニング後のＦｌｏｗＣａｍ解析に関して、ソルビトールを含む製剤は、一般にはＮａＣｌを含む製剤と比較して目視で確認できる粒子濃度の減少を示した。新規原薬（ブチル溶離液）は、すべての界面活性剤条件について、製剤にかかわらず（ソルビトール対ＮａＣｌ）、従来の原薬（クエン酸塩製剤）と比較すると、ストレス後の目視で確認できる粒子濃度の著しい低下を呈した。全体的には、０．１０％のＰＳ８０を含有するソルビトール製剤中の新規ＤＳ（ブチル溶離液）は、ストレス後に目視で確認できる粒子内容物の変化量は最も少ないものであった。
【0356】
ＳＥ－ＨＰＬＣ解析では、ソルビトール製剤中の新規ＤＳ（ブチル溶離液）および０．０５％または０．１％のいずれかのＰＳ８０は、静的条件およびストレスをかけた条件下では同等のプロファイルを呈した。０．０５％または０．１０％のＰＳ８０を含むソルビトール製剤中のすべての新規ＤＳ（ブチル溶離液）サンプルは、２つのＨＭＷ種（ＨＭＷピーク１については約０．５％の％面積、ＨＭＷピーク２については７．８～８％、および主ピークについては約９１．６～９１．８％）を呈するソルビトールおよびＰＳ２０を含有する新規ＤＳ（ブチル溶離液）サンプルと比較すると、１つのＨＭＷ種（ピーク１については約７％の％領域、および主ピークについては９２～９３％の％領域）を示した。
【0357】
この後、配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの種々の医薬製剤を用い、加速安定性試験を行った。加速安定性試験は、５つの異なる貯蔵温度で保存しながら、８週間にわたって様々なアッセイで製剤を評価した。開始時点（ゼロ時点）、急激なストレス時点および最終時点でデータを収集した（４０℃ではＴ＝２週間、他のすべての温度ではＴ＝８週間）。医薬製剤評価および最適化試験の一部としてｐＨ変動試験も行った。加速安定性試験の結論は、ヒスチジン／ポリソルベート／ソルビトール製剤中の配列番号２の修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬製剤には低ｐＨが最適であり、これは外観検査、ＦｌｏＣａｍ解析およびＳＥ－ＨＰＬＣによる２つの方法で支持されるということである。ＳＥ－ＨＰＬＣでは例えば、主ピークは低ｐＨのサンプルでは高い。このことは、低ｐＨでは凝集および／または分解が少なく、検出される未変化単量体が多く残っていることを示していた。一方、高ｐＨサンプルは、これよりも低いｐＨのサンプルよりも、各時点での可溶性凝集体の割合が高かった。これらはＨＭＷ種では経時的に増加し、ｐＨが上昇するにつれてさらに状況は悪化すると考えられる。換言すれば、経時的には、ｐＨとＨＭＷ種の存在との間には正の相関が観察された。
【0358】
さらなる試験では、製剤中のヒスチジン濃度を１０ｍＭから１ｍＭに低下させ、ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して、ＨＭＷ種のピーク面積の割合の変化の影響を評価した。表８に提供されるように、ｐＨ５．８の製剤は、ヒスチジン濃度にかかわらず、６．０よりも高いｐＨの製剤と比較して低いＨＭＷピークを示した。
【0359】
例えば２つの異なる界面活性剤条件について、３つの異なるｐＨ値での１０ｍＭ ヒスチジン緩衝液対１ｍＭ ヒスチジン緩衝液といった候補となる製剤の異なるバリエーションを比較した（表７）。比較されるパラメータを選択し、ｐＨが、１０ｍＭ ヒスチジン緩衝液とは対照的に１ｍＭ ヒスチジン緩衝液で依然として制御されるのかどうかを決定した。これらの製剤を比較する主な目的は、見込みのある候補となる製剤および／またはそのバリエーションのうちのいずれかが、室温の１００（±２０％）μｇ／ｍＬのＴＴＨＸ１１１４にとって最大１ヶ月の好適な安定性を提供するかどうか推定することであった。副次的には、ヒスチジン濃度が低下した、および／またはｐＨがわずかに上昇したバリエーションでは、こうした調整によって適用時により鎮静作用のある点眼薬がもたらされる可能性があることから、同程度の安定性を達成可能かどうかを認識することが望ましいものであった。
【0360】
【表7】
【0361】
（ｉ）薬物沈殿を観察する目盛り付きの外観検査法、および（ｉｉ）薬物分解およびＨＭＷ種の形成を観察するＳＥ－ＨＰＬＣ解析で安定性を決定した。調製後、最終製剤をカバー付きチューブラック内のベンチトップに室温（約２０℃）で保存した。調製後、外観検査およびＳＥ－ＨＰＬＣ解析を０日目、５日目、１４日目、２８日目および５９日目に実施した。特定の時点で良好に機能しない製剤は、その後の時点で解析から除外した。さらに、残りの製剤で５９日目にｐＨを測定し、試験過程にわたってドリフトが発生しないことを確認した。
希釈剤および原液の調製
希釈剤および原液の調製
【0362】
Ｌ－ヒスチジンを欠く２つのベース希釈剤を調製した：脱イオン（ＤＩ）Ｈ２Ｏ中にＰＳ８０およびソルビトールを溶解し、希釈剤Ａ（０．２％のＰＳ８０／１０％のソルビトール）を調製した。これをＤＩ Ｈ２Ｏを用いて５００ｍＬに希釈し、続いて０．２μｍのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜真空フィルタユニットでろ過した。第２のベース希釈剤は希釈剤Ｂ（０．２％のＰＳ２０／１０％のソルビトール）であり、ＤＩ Ｈ２Ｏ中にＰＳ２０およびソルビトールを溶解することで調製した。これをＤＩ Ｈ２Ｏを用いて５００ｍＬに希釈し、続いて０．２μｍのＰＥＳ膜真空フィルタユニットでろ過した。
【0363】
ベース希釈剤を調製した後、透析緩衝液の２つの異なる濃縮原液を調製した。ＤＩ Ｈ２Ｏ中にソルビトール、ＰＳ８０およびＬ－ヒスチジンを加え、かつ溶解させ、原液Ａ（９．２９ｍＭ ヒスチジン／０．９２９％のＰＳ８０／４６．４３％のソルビトール）を調製した。これをＤＩ Ｈ２Ｏを用いて３．５Ｌに希釈し、このうち２Ｌを０．２μｍのボトルトップ型ＰＥＳ膜真空フィルタでろ過し、２Ｌの滅菌ボトルに入れた。ＤＩ Ｈ２Ｏ中にソルビトール、ＰＳ２０およびＬ－ヒスチジンを加え、かつ溶解させ、原液Ｂ（９．１８ｍＭ ヒスチジン／０．９０９％のＰＳ８０／４５．４５％のソルビトール）を調製した。これをＤＩ Ｈ２Ｏを用いて２７５０ｍＬに希釈し、このうち２Ｌを０．２μｍのボトルトップ型ＰＥＳ膜真空フィルタでろ過し、別個の２Ｌの滅菌ボトルに入れた。
【0364】
－７０℃の冷凍庫での貯蔵から修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）アリコートを取り出した後、原液を望ましい１倍濃度：２ｍＭ ヒスチジン／０．２％のポリソルベート８０または２０／１０％のソルビトールの透析緩衝液に希釈しつつ、室温で１時間、このアリコートを融解した。融解したサンプルをよく混合し、Ｏ．Ｄを２８０ｎｍで測定した。透析緩衝液に対してサンプルを１：１００の比率で（３０ｍＬのサンプル：３０００ｍＬの透析緩衝液）室温（ＲＴ）にて透析を実施し、その後緩衝液を２回変更した。第１の変更は開始時間の２時間後に実施し、第２の変更は開始時間の４時間後に実施した。第２の変更後、サンプルをＲＴで一晩透析させた（１３時間超）。続いてＴＴＨＸ１１４を２ｍＭ ヒスチジン／０．２％のＰＳ８０またはＰＳ２０／１０％のソルビトール中に処方した。
【0365】
透析した両方のサンプルを２部（２Ａ．１＋２Ａ．２および２Ｂ．１＋２Ｂ．２）に分割した。２Ａ／Ｂ．１溶液に対しては、１８０ｍＭ、１０倍ヒスチジンを補充した希釈剤Ａまたは希釈剤Ｂを加えることで、ヒスチジン濃度を２０ｍＭに増加させた。４０ｍＬの希釈剤Ａおよび希釈剤Ｂのそれぞれに１．１１７ｇのＬ－ヒスチジンを加え、これらの１０倍溶液を調製した。
【0366】
溶液２Ａ．１については、１．６ｍＬの希釈剤Ａ中の１０倍ヒスチジン溶液を１４．４ｍＬの透析済サンプルに加えた。溶液２Ｂ．１については、１．８ｍＬの希釈剤Ａ中の１０倍ヒスチジンを１４．６ｍＬの透析済サンプルに加え、続いて１．６ｍＬの希釈剤Ｂを加えた。２Ａ．１および２Ｂ．１溶液中でヒスチジン濃度を２０ｍＭにすることに加え、これらの部分でこれらの希釈剤もまた、ＴＴＨＸ１１１４濃度を２００μｇ／ｍＬにした。両方の透析したサンプル（２Ａ／Ｂ．２溶液）の他の部分は、２ｍＭ ヒスチジンで補充した希釈剤Ａまたは希釈剤Ｂで２００μｇ／ｍＬのＴＴＨＸ１１１４に単純に希釈した（これは、１８０ｍＭ 溶液をそれぞれの希釈剤で１：９０に希釈して調製した）。２Ａ．１＋２Ａ．２および２Ｂ．１＋２Ｂ．２はすべての成分が２倍である。０．２μｍの酢酸セルロースシリンジフィルタでサンプルをろ過した。特定の懸濁液の外観検査を行い、０～３および３超の単一ランクのスケールでランク付けした。この場合、０は目に見える懸濁された粒子物質がなかったことを意味する。
【0367】
結果：ヒスチジン濃度に関係なく、ｐＨが５．８のサンプルは溶液中での薬物の保持は良好であり、調製後５９日目までは１０ｍＭ ヒスチジン緩衝液中には粒子は見られなかったが、１ｍＭ ヒスチジン緩衝液では２８日目に１つのサンプルのみで懸濁粒子が観察された。すべてのＰＳ２０製剤は、ＳＥ－ＨＰＬＣによって５日目にそれらのＰＳ８０対照物よりも回収量がすべて低かったため、５日目以降は検査されなかった。代表的なＳＥ－ＨＰＬＣピークを図７に示す。
【0368】
【表8】
【0369】
ｐＨの維持
０日目に必要となるｐＨに調整した後（表６を参照されたい）、製剤のｐＨにドリフトが見られないことを確認するために５９日目にｐＨを再び評価した。両方のヒスチジン濃度のサンプルは試験過程にわたってｐＨを良好に維持しており、顕著なドリフトは観察されなかった。
０日目に必要となるｐＨに調整した後（表６を参照されたい）、製剤のｐＨにドリフトが見られないことを確認するために５９日目にｐＨを再び評価した。両方のヒスチジン濃度のサンプルは試験過程にわたってｐＨを良好に維持しており、顕著なドリフトは観察されなかった。
【0370】
【表9】
【0371】
全体的には、この試験は薬物産物（配列番号２のＦＧＦ－１ポリペプチド）が室温では少なくとも２８日間にわたって安定している製剤を明らかにした。長期期間にわたる目に見える粒子の欠乏、ＳＥ－ＨＰＬＣによるほぼ一定の主ピーク面積、ＳＥ－ＨＰＬＣによる経時的に低い割合の可溶な凝集体および経時的なｐＨの制御から、最適化された製剤は、１０ｍＭ ヒスチジン／０．１％のＰＳ８０／５％のソルビトール製剤（ｐＨ５．８）である。類似の傾向は、１ｍＭ ヒスチジン／０．１％のＰＳ８０／５％のソルビトールを含有する製剤について観察されており、これは薬物産物（配列番号２のＦＧＦ－１ポリペプチド）が少なくとも５９日間にわたって安定していると見出された別の製剤となる。
【0372】
実施例５プラスミド、修飾ヒトＦＧＦ－１のクローニングおよび発現
本実施例は、細菌中での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）の製造を記載する。大腸菌（ＢＬ２１形質転換受容性細胞）中で遺伝子操作された（修飾）ヒトＦＧＦ－１（ＴＴＨＸ１１１４）の発現を可能とするため、標的タンパク質のコード配列を、コドン使用、転写および翻訳効率、ならびにｍＲＮＡ安定性を含む大腸菌発現のために最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔが新規に合成し、発現プラスミドへとサブクローニングした。選択されたプラスミドＴＴＨＸ１１１４＿ｐＭＫｅｔのプラスミドマップを図６に示す。設計されたコンストラクトは、末端融合を含まない修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの遺伝情報をコードする。
本実施例は、細菌中での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド（配列番号２）の製造を記載する。大腸菌（ＢＬ２１形質転換受容性細胞）中で遺伝子操作された（修飾）ヒトＦＧＦ－１（ＴＴＨＸ１１１４）の発現を可能とするため、標的タンパク質のコード配列を、コドン使用、転写および翻訳効率、ならびにｍＲＮＡ安定性を含む大腸菌発現のために最適化し、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔが新規に合成し、発現プラスミドへとサブクローニングした。選択されたプラスミドＴＴＨＸ１１１４＿ｐＭＫｅｔのプラスミドマップを図６に示す。設計されたコンストラクトは、末端融合を含まない修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの遺伝情報をコードする。
【0373】
修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドのペリプラズム蓄積については、外膜タンパク質（ｏｍｐＡ、ｏＡ）のリーダー配列を成熟型タンパク質とＮ末端で融合させた。リーダー配列は、プレタンパク質がペリプラズムにトランスロケーションする上で必要であり、これはシグナルペプチダーゼＩ（ＳＰ－１）を介してトランスロケーション後に切断される。プラスミドはカナマイシン耐性を付与する配列を有する。プラスミド骨格ＴＴＨＸ１１１４＿ｐＭＫｅｔにインサートをサブクローニングした。ｐＭＫｅｔ骨格（プラスミド名：ｏＡ－ＴＴＨＸ１１１４＿ｐＭＫｅｔ）にペリプラズムコンストラクトをサブクローニングした。修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現は、ＩＰＴＧ依存性プロモータであるＴａｃプロモータによって制御された。
【0374】
ペリプラズムコンストラクトは、スクリーニング後に、例えばシャペロン（遺伝子操作したｈＦＧＦ－１の例示的なコドン最適化したヌクレオチド配列の２つの停止コドン（下線部）とＢａｍＨＩ制限部位（イタリック体）の間の配列）のバイシストロニックな共発現を可能とするため、修飾ＦＧＦ－１ＯＲＦ下流のさらなる配列の挿入を確実なものとするために設計されており、これを以下に提供する（長さ：４３８ｂｐ、隣接部位を含む）：
ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＧＴＣＣＴＣＧＴＡＣＧＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣ（配列番号２０７）。
ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＣＴＡＴＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＧＴＣＧＡＴＧＧＴＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＧＡＴＣＡＡＣＡＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＡＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＴＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＴＧＡＡＧＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＡＣＴＡＴＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＧＡＡＡＣＡＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＴＴＴＧＴＧＧＧＴＣＴＧＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＣＣＧＴＣＡＡＧＣＧＣＧＧＴＣＣＴＣＧＴＡＣＧＣＡＴＴＡＴＧＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＧＴＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＡＡＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣ（配列番号２０７）。
【0375】
ペリプラズム蓄積のための修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの例示的配列を以下に提供する：
【0376】
ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡＦＮＬＰＰＧＮＹＫＫＰＫＬＬＹＳＳＮＧＧＨＦＬＲＩＬＰＤＧＴＶＤＧＴＲＤＲＳＤＱＨＩＱＬＱＬＳＡＥＳＶＧＥＶＹＩＫＳＴＥＴＧＱＹＬＣＭＤＴＤＧＬＬＹＧＳＱＴＰＮＥＥＣＬＦＬＥＲＬＥＥＮＨＹＮＴＹＩＳＫＫＨＡＥＫＮＷＦＶＧＬＫＫＮＧ ＳＶＫＲＧＰＲＴＨＹＧＱＫＡＩＬＦＬＰＬＰＶＳＳＤ（配列番号２０８）。
【0377】
転位後、配列番号２の成熟型ＦＧＦ－１ポリペプチドを生成した。
【0378】
実施形態
実施形態１は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、または配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の単一のアミノ酸変異を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド、
および（ｂ）Ｌ－メチオニン、を含む製剤を提供する。
実施形態１は、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、または配列番号１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の単一のアミノ酸変異を含む修飾ＦＧＦ－１ポリペプチド、
および（ｂ）Ｌ－メチオニン、を含む製剤を提供する。
【0379】
実施形態２は、製剤が眼内送達用の注射用製剤である実施形態１に記載の製剤を提供する。
【0380】
実施形態３は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、配列番号１の第１の残基上流に位置するＮ末端メチオニン残基を含む、実施形態１に記載の製剤を提供する。
【0381】
実施形態４は、ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドをさらに含む、実施形態１に記載の製剤を提供する。
【0382】
実施形態５は、伸長ペプチドが配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む、または配列番号４～８に示される配列のうちいずれか１つを含む、実施形態４に記載の製剤を提供する。
【0383】
実施形態６は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがポリペプチドの成熟型である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0384】
実施形態７は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１４～１８から選択される配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0385】
実施形態８は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号２４～２８から選択される配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0386】
実施形態９は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号９３～１１７から選択される配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0387】
実施形態１０は、ポリペプチドが、伸長ペプチドに対してＮ末端にメチオニン残基をさらに含む、実施形態１～６のいずれか１つを提供する。
【0388】
実施形態１１は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１１８～１４１から選択される配列を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0389】
実施形態１２は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが１３６個のアミノ酸を含む形態で発現される、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0390】
実施形態１３は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがその成熟型に少なくとも１４１個のアミノ酸を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0391】
実施形態１４は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１の６７位に変異を含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0392】
実施形態１５は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１の第１の５つの残基のうち１つ以上に切断をさらに含む、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0393】
実施形態１６は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１４６～１４９から選択される配列を含む、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0394】
実施形態１７は、ポリペプチドが、配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む伸長ペプチドをさらに含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0395】
実施形態１８は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１７４～２０４から選択される配列を含む、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0396】
実施形態１９は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号２または配列番号２０５に示される配列を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0397】
実施形態２０は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがポリペプチドの成熟型である、実施形態１９に記載の製剤を提供する。
【0398】
実施形態２１は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌからなる群から選択される１つ以上の変異を含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0399】
実施形態２２は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１の１つ以上の変異を含み、当該変異は、Ｌｙｓ１２Ｖａｌ、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６Ｃｙｓ、Ｃｙｓ１１７ＶａｌおよびＰｒｏ１３４Ｖａｌからなる群から選択され、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドはペプチドＡＬＴＥＫの少なくとも１つの残基をさらに含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0400】
実施形態２３は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ、Ａｌａ６６ＣｙｓおよびＣｙｓ１１７Ｖａｌといった配列番号１の変異を含む１つ以上の変異を含み、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドは、配列番号１の第１の残基上流に位置するメチオニン残基、およびＮ末端メチオニンと配列番号１の１位との間に位置するペプチドＡＬＴＥＫの少なくとも１つの残基を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0401】
実施形態２４は、製剤がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および／またはポリソルベート８０を含む、実施形態１に記載の製剤を提供する。
【0402】
実施形態２５は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが製剤中で９５％を超える純粋な単量体形態である、実施形態１に記載の製剤を提供する。
【0403】
実施形態２６は、
－少なくとも約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム、
－少なくとも約１００ｍＭ 塩化ナトリウム、
－少なくとも約１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
－少なくとも約０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
－少なくとも約５ｍＭ Ｌ－メチオニン、および
－少なくとも約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、のうち少なくとも１つをさらに含む、実施形態２５の製剤を提供する。
－少なくとも約５０ｍＭ リン酸水素二ナトリウム、
－少なくとも約１００ｍＭ 塩化ナトリウム、
－少なくとも約１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、
－少なくとも約０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
－少なくとも約５ｍＭ Ｌ－メチオニン、および
－少なくとも約０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、のうち少なくとも１つをさらに含む、実施形態２５の製剤を提供する。
【0404】
実施形態２７は、製剤が少なくとも約０．０１ｍＭ～約１０ｍＭ濃度であるＥＤＴＡを含む、実施形態２６に記載の製剤を提供する。
【0405】
実施形態２８は、製剤が硫酸アンモニウムを含み、硫酸アンモニウムの濃度が少なくとも約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭ濃度である、実施形態２６に記載の製剤を提供する。
【0406】
実施形態２９は、製剤が少なくとも約０．０１ｍＭ～約１００ｍＭ濃度であるＬ－メチオニンを含む、実施形態２６に記載の製剤を提供する。
【0407】
実施形態３０は、修飾ＦＧＦ－１が、フックスジストロフィー、水疱性角膜症、ヘルペス性角膜症、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー１、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー２、後部多形性角膜内皮ジストロフィー、ドライアイ症候群、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、顆粒状角膜ジストロフィー、黄斑角膜ジストロフィー、シュナイダー結晶性角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、斑状角膜ジストロフィー、角膜損傷、眼の損傷、化学損傷、びらん性損傷、角膜実質損傷およびマスタードガス角膜症からなる一覧から選択される１つ以上の疾患、障害または病気を治療するのに好適な濃度で存在する、実施形態１に記載の製剤を提供する。
【0408】
実施形態３１は、製剤が房内に投与される、実施形態１または３０に記載の製剤を提供する。
【0409】
実施形態３２は、製剤が硝子体内に投与される、実施形態１または３０に記載の製剤を提供する。
【0410】
実施形態３３は、製剤が約－２０℃の温度で少なくとも約２週間～約４週間安定している、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の製剤を提供する。
【0411】
実施形態３４は、治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを製造するためのスケーラブルな方法を提供し、該方法が、
（ａ）ｐＢＲ３２２由来のｏｒｉ配列を含むベクターに挿入される、細胞質発現のために修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸コンストラクトを、好適な大腸菌細胞に導入することと、
（ｂ）約２０時間、好適な抗生物質を含む合成増殖培地中で細胞を増殖することと、
（ｃ）治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することと、を含み、
ステップｃで回収される修飾ＦＧＦ－１の収量は、ｐＢＲ３２２由来のｏｒｉ配列、合成増殖培地またはこれらの組合せを含むベクターの使用を含まない方法よりも少なくとも２倍高い。
（ａ）ｐＢＲ３２２由来のｏｒｉ配列を含むベクターに挿入される、細胞質発現のために修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸コンストラクトを、好適な大腸菌細胞に導入することと、
（ｂ）約２０時間、好適な抗生物質を含む合成増殖培地中で細胞を増殖することと、
（ｃ）治療的に有効な修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することと、を含み、
ステップｃで回収される修飾ＦＧＦ－１の収量は、ｐＢＲ３２２由来のｏｒｉ配列、合成増殖培地またはこれらの組合せを含むベクターの使用を含まない方法よりも少なくとも２倍高い。
【0412】
実施形態３５は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列、または配列番号１の１２位、１６位、６６位、１１７位および１３４位に１つ以上の変異を含む配列を含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0413】
実施形態３６は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが（ｉ）Ａｌａ６６Ｃｙｓ変異、（ｉｉ）Ｃｙｓ１６Ｓｅｒ変異、（ｉｉｉ）Ｃｙｓ１１７Ｓｅｒ変異のうち１つ以上を含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0414】
実施形態３７は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、配列番号１の第１の残基上流に位置するＮ末端メチオニン残基を含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0415】
実施形態３８は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、Ｎ末端メチオニン残基と配列番号１の第１の残基との間に位置する伸長ペプチドをさらに含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0416】
実施形態３９は、伸長ペプチドが配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む、実施形態３８に記載の方法を提供する。
【0417】
実施形態４０は、伸長ペプチドが配列番号４～８に示される配列のうちいずれか１つを含む、実施形態３９に記載の方法を提供する。
【0418】
実施形態４１は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがポリペプチドの成熟型である、実施形態３４～４０のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0419】
実施形態４２は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１４～１８から選択される配列を含む、実施形態３４～４１のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0420】
実施形態４３は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号２４～２８から選択される配列を含む、実施形態３４～４２のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0421】
実施形態４４は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号９３～１１７から選択される配列を含む、実施形態３４～４３のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0422】
実施形態４５は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、伸長ペプチドに対してＮ末端にメチオニン残基をさらに含む、実施形態３４～４４のいずれか１つの方法を提供する。
【0423】
実施形態４６は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１１８～１４１から選択される配列を含む、実施形態３４～４５のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0424】
実施形態４７は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが１３６個のアミノ酸を含む形態で発現される、実施形態３４～４６のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0425】
実施形態４８は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドがその成熟型に少なくとも１４１個のアミノ酸を含む、実施形態３４～４６のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0426】
実施形態４９は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１の第１の５つの残基のうち１つ以上に切断をさらに含む、実施形態３４～４８のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0427】
実施形態５０は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号１４６～１４９および１７４～２０４から選択される配列を含む、実施形態３４～４９のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0428】
実施形態５１は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが、配列番号３の１つ以上のアミノ酸残基を含む伸長ペプチドをさらに含む、実施形態３４～５０のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0429】
実施形態５２は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドが配列番号２、配列番号２０５に示される配列を含む、実施形態３４～５１のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0430】
実施形態５３は、好適な細胞がＢＬ２１、Ｋ１２ ＨＭＳ１７４またはＷ３１１０といった株の大腸菌細胞である、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0431】
実施形態５４は、組換え核酸コンストラクトが、Ｔ７またはｔａｃプロモータを含むｐＭＫｅｔ＿ＴＴＨＸ１１１４である、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0432】
実施形態５５は、合成培地が炭素源としてグリセロール、ペプトンおよび酵母を含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0433】
実施形態５６は、ｐＭＫｅｔ＿ＴＴＨＸ１１１４を発現するＢＬ２１細胞が、３７℃で２０時間、カナマイシンの存在下で増殖された、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0434】
実施形態５７は、組換え核酸コンストラクトが、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための１つ以上の修飾を含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0435】
実施形態５８は、１つ以上の修飾が、細胞での修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの発現を増加させるために最適化されている配列を含む、実施形態５７に記載の方法を提供する。
【0436】
実施形態５９は、１つ以上の修飾が、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を増加させるための好適なプロモータを選択することを含む、実施形態５７に記載の方法を提供する。
【0437】
実施形態６０は、細胞増殖を最大化するため、適切な栄養培地中で細胞を増殖させることをさらに含み、適切な栄養培地が炭素源を含み、炭素源がグルコースまたはグリセロールである、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0438】
実施形態６１は、プラスミドがｐＭＫｅｔまたはその誘導体またはその修飾である、実施形態５７に記載の方法を提供する。
【0439】
実施形態６２は、細胞からの修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドの収量を最大化させるために１つ以上の修飾を導入することをさらに含み、１つ以上の修飾プロセスは、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸内での修飾；修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをコードする組換え核酸に動作可能に関連する１つ以上の調節配列要素を含む組換え核酸内での修飾；組換え核酸を含むプラスミドの修飾；細胞増殖を最大化させるための細胞株の修飾または細胞株の選択；細胞増殖培地の変性をさらに含む、実施形態３４～６１のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0440】
実施形態６３は、組換え核酸を導入することが細胞内に組換え核酸を電気穿孔することを含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0441】
実施形態６４は、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを細胞から回収することが、タンパク質を細胞のペリプラズム封入体から回収することを含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0442】
実施形態６５は、回収することが、変性緩衝液中で封入体を可溶化させること、および修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを回収することを含む、実施形態６４に記載の方法を提供する。
【0443】
実施形態６６が、変性緩衝液が尿素またはグアニジンを含む、実施形態６５のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0444】
実施形態６７が、変性緩衝液が２ｍＭ ＥＤＴＡをさらに含む、実施形態６６に記載の方法を提供する。
【0445】
実施形態６８が、ＤＴＴを加えることで回収された修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを還元することをさらに含み、透析ろ過によってＤＴＴを取り除くことをさらに含む、実施形態６５～６７のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0446】
実施形態６９が、回収された修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドをリフォールディングバッファ内でリフォールディングにかけることである、実施形態６５～６８のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0447】
実施形態７０は、リフォールディングバッファがＬ－アルギニンを含む、実施形態６９に記載の方法を提供する。
【0448】
実施形態７１は、リフォールディングバッファが５ｍＭ システインまたは２ｍＭ システインまたはそれら両方を含む、実施形態６９または７０のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0449】
実施形態７２は、ＦＧＦ－１がヘパリンとの疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ）で捕捉される、実施形態６９～７１のいずれか１つに記載の方法を提供する。
【0450】
実施形態７３は、治療的に有効な組換え変異ｈＦＧＦ１タンパク質を回収することがタンパク質を精製することを含み、精製することが、液体クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、超遠心分離法、クロスフローろ過および透析ろ過のうちの１つ以上を含む、実施形態３４に記載の方法を提供する。
【0451】
実施形態７４は、実施形態３４～７３のうちいずれか１つの方法により製造される、修飾ＦＧＦ－１ポリペプチドを含む医薬組成物、その凍結乾燥粉末画分またはその液体製剤を提供する。
【0452】
実施形態７５は、フックスジストロフィー、水疱性角膜症、ヘルペス性角膜症、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー１、先天性遺伝角膜内皮ジストロフィー２、後部多形性角膜内皮ジストロフィー、ドライアイ症候群、円錐角膜、格子状角膜ジストロフィー、顆粒状角膜ジストロフィー、黄斑角膜ジストロフィー、シュナイダー結晶性角膜ジストロフィー、先天性実質性角膜ジストロフィー、斑状角膜ジストロフィー、角膜損傷、眼の損傷、化学損傷、びらん性損傷、角膜実質損傷およびマスタードガス角膜症からなる一覧から選択される１つ以上の疾患、障害または病気に罹患している対象を治療する方法を提供し、該方法が、好適な投与量の（ｉ）実施形態１～３３のいずれか１つに記載の注射用製剤または（ｉｉ）実施形態７４に記載の医薬組成物を、必要のある対象に投与することを含む。
【0453】
実施形態７６は、ＦＧＦ－１の注射用製剤を含むキットを提供する。
【0454】
実施形態７７は、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の製剤内に、または実施形態７４に記載の医薬組成物内の修飾ＦＧＦ－１の最小用量を提供可能であるドロッパーボトルを含む、実施形態７６に記載のキットを提供する。
【0455】
実施形態７８は、ドロッパーボトルが滅菌フィルタをさらに備える、実施形態７６または７７に記載のキットを提供する。
【0456】
実施形態７９は、容器がシリンジを含む、実施形態７６～７８のいずれか１つに記載のキットを提供する。
【0457】
実施形態８０は、シリンジがツベルクリンポリプロピレンおよびガラスからなる群から選択される材料を含む、実施形態７９に記載のキットを提供する。
【0458】
実施形態８１は、シリンジが実施形態１～３３のいずれか１つに記載の注射用製剤または実施形態７４に記載の医薬組成物で満たされている、実施形態７９または８０に記載のキットを提供する。
【0459】
実施形態８２は、電子制御部品をさらに含む、実施形態７９～８１のいずれか１つに記載のキットを提供する。
【0460】
実施形態８３は、電子制御部品が、少なくとも約１０μＬ～約１００μＬの容量の実施形態１～３３のいずれか１つに記載の注射用製剤または実施形態７４に記載の医薬組成物の投与を制御することができる、実施形態８２に記載のキット。
【0461】
【表10-1】
【0462】
【表10-2】
【0463】
【表10-3】
【0464】
【表10-4】
【0465】
【表10-5】
【0466】
【表10-6】
【0467】
【表10-7】
【0468】
【表10-8】
【0469】
【表10-9】
【0470】
【表10-10】
【0471】
【表10-11】
【0472】
【表10-12】
【0473】
【表10-13】
【0474】
【表10-14】
【0475】
【表10-15】
【0476】
【表10-16】
【0477】
【表10-17】
【0478】
【表10-18】
【0479】
【表10-19】
【0480】
【表10-20】
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【配列表】
【国際調査報告】