▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
特表2023-532084シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト並びに関連組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-26
(54)【発明の名称】シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト並びに関連組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/705 20060101AFI20230719BHJP
C07K 17/02 20060101ALI20230719BHJP
C12N 5/0787 20100101ALI20230719BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20230719BHJP
A61K 31/7012 20060101ALI20230719BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230719BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230719BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20230719BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230719BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230719BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230719BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230719BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230719BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230719BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230719BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230719BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20230719BHJP
【ＦＩ】
C07K14/705
C07K17/02
C12N5/0787
C12N5/078
A61K31/7012
A61K47/64
A61P1/04
A61P1/16
A61P11/00
A61P11/06
A61P13/12
A61P27/02
A61P29/00
A61P37/02
A61P37/08
A61P37/06
A61K38/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580803
(86)(22)【出願日】2021-06-29
(85)【翻訳文提出日】2023-02-03
(86)【国際出願番号】 US2021039623
(87)【国際公開番号】W WO2022006113
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】63/046,140
(32)【優先日】2020-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100083806
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 秀和
(74)【代理人】
【識別番号】100111235
【弁理士】
【氏名又は名称】原 裕子
(74)【代理人】
【識別番号】100195257
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 一志
(72)【発明者】
【氏名】ベルトッツィ、 キャロライン
(72)【発明者】
【氏名】デラヴェリス、 コルレオーネ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AC12
4B065AC20
4B065BB19
4B065BC12
4C076AA12
4C076BB13
4C076CC04
4C076CC07
4C076CC10
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC18
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA01
4C084AA02
4C084BA23
4C084BA34
4C084BA36
4C084BA38
4C084CA59
4C084MA55
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZA331
4C084ZA591
4C084ZA661
4C084ZA751
4C084ZA811
4C084ZA891
4C084ZB081
4C084ZB111
4C084ZB131
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA01
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA33
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZA89
4C086ZB08
4C086ZB11
4C086ZB13
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA53
4H045BA55
4H045BA60
4H045DA50
4H045EA22
4H045FA20
4H045FA70
(57)【要約】
シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが提供される。ある特定の実施形態では、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場と、膜繋留ドメインとを含む。本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれかを含む組成物、例えば、医薬組成物も提供される。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ活性のアゴナイズを必要とする個体における、Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法も提供される。シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを含むキット及びシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを作製する方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場と、膜繋留ドメインと、
を含む、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項2】
前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場がポリマー足場を含む、請求項１に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項3】
前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場が糖ポリペプチド足場を含む、請求項２に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項4】
前記足場が２～５０個のＳｉｇｌｅｃリガンドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項5】
前記足場が２～１０個のＳｉｇｌｅｃリガンドを含む、請求項４に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項6】
前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項7】
前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが１つ以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む、請求項６に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項8】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、請求項７に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項9】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドのみを含む、請求項８に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項10】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドを含む、請求項７に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項11】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドのみを含む、請求項１０に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項12】
前記膜繋留ドメインが脂質膜繋留ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
【請求項13】
液状媒体中に存在する請求項１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストを含む、組成物。
【請求項14】
凍結乾燥形態で存在する請求項１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストを含む、組成物。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストと、薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物。
【請求項16】
前記組成物が非経口投与用に製剤化されている、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記組成物が静脈内投与用に製剤化されている、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、Ｓｉｇｌｅｃを発現する細胞を、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストと、前記膜繋留ドメインが細胞膜に挿入されかつ前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが前記細胞によって発現される１つ以上のＳｉｇｌｅｃにシスで結合する条件下で接触させることを含む、方法。
【請求項19】
前記方法がインビトロで行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記方法がインビボで行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記方法はＳｉｇｌｅｃ－９活性をアゴナイズする方法であり、前記ＳｉｇｌｅｃアゴニストがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
Ｓｉｇｌｅｃ活性のアゴナイズを必要とする個体においてＳｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、前記個体に、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストの有効量を投与することを含む、方法。
【請求項23】
前記個体は免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体であり、前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記個体が炎症性疾患を有する個体であり、前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記炎症性疾患を治療するのに有効な量で前記個体に投与される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項25】
前記個体が、加齢性黄斑変性症、好中球急性呼吸窮迫症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、好酸球性胃腸炎、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、前灌流傷害、移植片拒絶反応、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される炎症性疾患を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記個体はウイルス感染を有する個体である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項27】
前記ウイルス感染がコロナウイルス感染である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記コロナウイルス感染がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記個体における好中球活性化を阻害する、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記個体におけるＮＥＴｏｓｉｓを阻害する、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが１つ以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドのみを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項35】
前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドのみを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
請求項１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物と、前記医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与するための説明書と、
を含む、キット。
【請求項37】
前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項38】
前記説明書が、前記医薬組成物の有効量を、免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体に投与するためのものである、請求項３７に記載のキット。
【請求項39】
シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを作製する方法であって、末端に膜繋留ドメインを含むポリマー足場を合成することと、
Ｓｉｇｌｅｃリガンドを前記ポリマー足場のサブユニットに結合させることと、
を含む、方法。
【請求項40】
前記結合させることは、前記ポリマー足場のサブユニットをシアリル化することを含む、請求項３９に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０４６，１４０号の利益を主張し、この出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／０４６，１４０号の利益を主張し、この出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
政府支援の声明
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＣＡ２２７９４２に基づく政府支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＣＡ２２７９４２に基づく政府支援によって行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【0003】
序文
シアル酸結合ＩｇＧ様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）は、免疫細胞の全てのクラスに発現する免疫チェックポイント受容体のファミリーである。それらは標的細胞上の様々なシアログリカンに結合し、標的が健常であるか損傷しているか、「自己」か「非自己」かを報告するシグナルを免疫細胞に伝達する。１４個のヒトＳｉｇｌｅｃのうち、９個が細胞質抑制性シグナル伝達ドメインを含んでいる。したがって、シアログリカンによるこれらの抑制性Ｓｉｇｌｅｃの結合により、免疫細胞の活性が抑制され、抗炎症効果がもたらされる。この点で、抑制性Ｓｉｇｌｅｃは、Ｔ細胞チェックポイント受容体であるＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１と機能的に類似している。がん免疫療法の臨床的に確立されたこれらの標的と同様に、Ｓｉｇｌｅｃをアンタゴナイズしてがんに対する免疫細胞反応性を増強することに最近関心が高まっている。逆に、抗炎症療法の文脈で、Ｓｉｇｌｅｃのアゴニスト抗体への結合により免疫細胞反応性を抑制し得る。このアプローチを活用して、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ－２）のアゴニズムによって狼瘡患者のＢ細胞抑制を達成し、Ｓｉｇｌｅｃ－８のアゴニズムによって好酸球性胃腸炎の治療のために好酸球が枯渇させられた。
シアル酸結合ＩｇＧ様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）は、免疫細胞の全てのクラスに発現する免疫チェックポイント受容体のファミリーである。それらは標的細胞上の様々なシアログリカンに結合し、標的が健常であるか損傷しているか、「自己」か「非自己」かを報告するシグナルを免疫細胞に伝達する。１４個のヒトＳｉｇｌｅｃのうち、９個が細胞質抑制性シグナル伝達ドメインを含んでいる。したがって、シアログリカンによるこれらの抑制性Ｓｉｇｌｅｃの結合により、免疫細胞の活性が抑制され、抗炎症効果がもたらされる。この点で、抑制性Ｓｉｇｌｅｃは、Ｔ細胞チェックポイント受容体であるＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１と機能的に類似している。がん免疫療法の臨床的に確立されたこれらの標的と同様に、Ｓｉｇｌｅｃをアンタゴナイズしてがんに対する免疫細胞反応性を増強することに最近関心が高まっている。逆に、抗炎症療法の文脈で、Ｓｉｇｌｅｃのアゴニスト抗体への結合により免疫細胞反応性を抑制し得る。このアプローチを活用して、ＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ－２）のアゴニズムによって狼瘡患者のＢ細胞抑制を達成し、Ｓｉｇｌｅｃ－８のアゴニズムによって好酸球性胃腸炎の治療のために好酸球が枯渇させられた。
【発明の概要】
【0004】
シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが提供される。ある特定の実施形態では、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場（scaffold）と、膜繋留（tethering）ドメインとを含む。本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれかを含む組成物、例えば、医薬組成物も提供される。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ活性のアゴナイズを必要とする個体における、Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法も提供される。シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを含むキット及びシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを作製する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【0005】
【図1】糖ポリペプチドがエフェクター細胞上でＳｉｇｌｅｃをシスで（in cis）クラスター化させアゴナイズする。（Ａ）食細胞が標的細胞の「ｅａｔ－ｍｅ」シグナルに関与する活性化受容体を発現し、食作用及び炎症を刺激する。（Ｂ）シスリガンドによるＳｉｇｌｅｃ－９のクラスター化が食細胞活性化を停止させる抑制性シグナル伝達を刺激する。
【図2】ｐＳ９Ｌ－脂質の代表的な合成。（ａ）ＴＨＦ、３、２２℃で６時間、グローブボックス。（ｂ）ヒドラジン一水和物、ＭｅＯＨ／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ、２２℃で２４時間、二段階にわたって８５％。（ｃ）４、ピルビン酸ナトリウム、Ｐｄ２６ＳＴ、ＮｍＣＳＳ、ＮａｎＡ、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、４８時間、５０％。（ｄ）ベンズヒドリルアジド、ＣｕＳＯ４、ＢＴＴＡＡ、ｔＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ、２２℃で１２時間、７５～１００％。
【図3】操作された糖ポリペプチドが高親和性でＳｉｇｌｅｃ－９に結合する。（Ａ）糖ポリペプチドは同じラクトシルセリン足場に基づいている。ｐＬａｃはラクトース部分のみを有する。ｐＳｉａは末端Ｎｅｕ５Ａｃを有する。ｐＳ９ＬはＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを有する。ｐＳ７ＬはＳｉｇｌｅｃ－７リガンドを有する。ポリペプチドのＮ末端をフルオロフォア又はビオチン部分のいずれかで官能化させた。（Ｂ）Ｎ末端ビオチンを有する可溶性糖ポリペプチドを、ストレプトアビジンをコーティングした先端（チップ）に結合させた。先端を組換えＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃ融合タンパク質溶液、続いて、緩衝液のみに浸漬させることによって、会合／解離曲線を測定した。データは、２つの独立した実験の代表である。（Ｃ）ＴＨＰ－１単球を脂質繋留糖ポリポリペプチドでコーティングし、Ｓｉｇｌｅｃ－９－Ｆｃ、続いて、抗ヒトＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲート二次抗体で染色した。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図4】ｐＳ９Ｌ－脂質はＳｉｇｌｅｃ－９とシス会合するが、Ｓｉｇｌｅｃ－７とはシス会合しない。（Ａ）ｐＳ９Ｌ－脂質又はｐＳ７Ｌ－脂質のＳｉｇｌｅｃ－９又はＳｉｇｌｅｃ－７とのシス会合を評価するためのＦＲＥＴ実験。脂質コンジュゲート糖ポリペプチド（ｐＳ９Ｌ－脂質又はｐＳ７Ｌ－脂質）のＮ末端をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５で官能化し、Ｓｉｇｌｅｃ－９又はＳｉｇｌｅｃ－７のいずれかを安定して過剰発現するＪＵＲＫＡＴにロードした。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を有する抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体をＳｉｇｌｅｃに結合させ、ＦＲＥＴシグナルを蛍光顕微鏡法によって定量した。（Ｂ、Ｄ）ｐＳ９Ｌ－脂質又はｐＳ７Ｌ－脂質をＳｉｇｌｅｃ－９発現細胞にロードした場合の相対的ＦＲＥＴ効率を計算した。一元配置ｔ検定による統計分析、ｐ＜０．００１、GlassのΔ＝６．７０。（Ｃ、Ｅ）ｐＳ９Ｌ－脂質をＳｉｇｌｅｃ－９又はＳｉｇｌｅｃ－７発現細胞にロードした場合の相対的ＦＲＥＴ効率を計算した。一元配置ｔ検定による統計分析、ｐ＜０．００１、GlassのΔ＝２．４２。全てのデータは、少なくとも２つの独立した実験の代表である。（Ｃ）及び（Ｅ）のデータポイントは、単一の実験からの個々の細胞を表す。エラーバーを標準偏差として表す。
【図5】ＮＦ－κＢ転写レポーターアッセイにおいて、ｐＳ９Ｌ－脂質がＳｉｇｌｅｃ－９をアゴナイズしてＴＬＲ４シグナル伝達を阻害する。（Ａ）ＨＥＫＢｌｕｅ細胞はＮＦ－κＢ依存性分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）とＴＬＲ４シグナル伝達複合体を共発現する。ＬＰＳでの刺激時に、ＮＦ－κＢ活性の代理として比色アッセイを使用して上清中のＳＥＡＰを定量することができる。これらのアッセイでは、ＨＥＫＢｌｕｅ細胞にｐＣＭＶ－Ｓｉｇｌｅｃ発現ベクターもトランスフェクトした。（Ｂ）Ｓｉｇｌｅｃ－９発現ＨＥＫＢｌｕｅ細胞を、抗体（抗Ｓｉｇｌｅｃ－９、アイソタイプ、又はビヒクル）をコーティングしたプレート上で増殖させ、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）に応答した相対的ＮＦ－κＢ転写を測定した。（Ｃ）Ｓｉｇｌｅｃ－９発現ＨＥＫＢｌｕｅ細胞をＬＰＳ刺激（１０ｎｇ／ｍＬ）前にｐＳ９Ｌ－ｓｏｌ（１μＭ）、ｐＳ９Ｌ－脂質（１μＭ）、又はビヒクルで前処理した。（Ｄ）ＨＥＫＢｌｕｅ細胞にＳｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－７、又は偽発現ベクターをトランスフェクトし、ｐＳ９Ｌ－脂質（１μＭ）又はビヒクルでコーティングした後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。（Ｅ）ＨＥＫＢｌｕｅ細胞に野生型、Ｒ１２０Ａ、又はＹ４３３／４５６Ｆ Ｓｉｇｌｅｃ－９発現ベクターをトランスフェクトし、ｐＳ９Ｌ－脂質（１μＭ）又はビヒクルでコーティングした後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激した。統計を一元配置分散分析（Ｂ、Ｃ）又は二元配置分散分析（Ｄ、Ｅ）によって決定した。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。エラーバーを標準偏差として表す。全てのデータは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。
【図6】マクロファージの活性化はシス結合ｐＳ９Ｌ－脂質によって阻害されるが、可溶性トランス結合ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌでは阻害されない。（Ａ）過炎症性マクロファージを糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で前処理し、その後、ＬＰＳ刺激（１００ｐｇ／ｍＬ）に供した。活性化を、上清からのサイトカイン定量（Ｂ）、定量的ホスホプロテオミクス（Ｃ～Ｅ）、又はウエスタンブロット（Ｆ）によってアッセイした。（Ｂ）マクロファージを糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で前処理し、その後、ＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）で１８時間刺激した。上清のアリコートを多重炎症性サイトカインアッセイによって分析した。データを、ビヒクルで前処理した細胞と比較した３つの独立した実験からの技術的複製物の平均の倍数変化（fold-change）として表す。統計を多重ｔ検定によって決定した。＊＝ｐ＜０．０５。エラーバーを標準偏差として表す。（Ｃ～Ｅ）マクロファージを糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で前処理し、その後、ＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）で５分間刺激し、溶解させた。溶解物を３つの独立したマクロファージ分化物から収集した。溶解物を正規化し、リンタンパク質について濃縮し、標識し、定量的ホスホプロテオミクスによって分析した。（Ｃ）ＬＰＳで刺激した又は刺激していない糖ポリペプチド前処理マクロファージからの倍数変化のヒートマップ。（Ｄ）ｐＳ９Ｌ－脂質で前処理しＬＰＳで刺激したマクロファージの、ビヒクルからの倍数変化に対する有意性のボルケーノプロット。同定された有意に変化したリンペプチドを赤色で示している。選択した固有のヒットを濃い青色で強調表示している。（Ｅ）Ｄと同様であるが、ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌの場合である。（Ｆ）マクロファージを糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で処理し、ＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）で１時間刺激した後、溶解させ、ウエスタンブロットによって総ＩｋＢ及びｐＩｋＢ（Ｓ３２／３６）レベルについて分析した。レーン１は、糖ポリペプチドでもＬＰＳでも処理していない対照マクロファージを示す。ＦＣは倍数変化である。
【図7】ｐＳ９Ｌ－脂質はＳｉｇｌｅｃ－９依存的様式でマクロファージ食作用を阻害する。（Ａ）マクロファージ食作用を、酸性（すなわち、後期エンドソーム／リソソーム）コンパートメントで蛍光がオンになるビーズを使用した蛍光顕微鏡法により決定することができる。（Ｂ）０時間（上）及び１５時間（下）時点でのマージした位相及び赤色蛍光の代表的な画像。（Ｃ）ＴＨＰ－１マクロファージをポリマー（２００ｎＭ）で前処理し、１μｍのｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ標識ビーズ懸濁液を所定のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で添加した。食作用の初期速度を、最初の１時間にわたる赤色蛍光面積の増加を測定することによって決定した。データは、３つの独立した実験の代表である。（Ｄ～Ｆ）ＣＭＡＳ ＫＯ（Ｄ）、Ｓｉｇｌｅｃ－９ ＫＯ（Ｅ）、又は野生型（Ｆ）ＴＨＰ－１マクロファージを糖ポリペプチド（２００ｎＭ）で前処理し、１μｍのｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ標識ビーズを使用して１：２０のＥ：Ｔ比で１０時間にわたって毎時間食作用についてアッセイした。（Ｇ、Ｈ）ＣＲＩＳＰＲセーフ標的ガイド（Ｇ）又はＳｉｇｌｅｃ－Ｅ ＫＯ（Ｈ）のいずれかを有するＢＶ２マウスミクログリアをノイラミニダーゼ（２μＭ）で前処理し、その後、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｅ交差反応性ｐＳ７Ｌ－脂質（５００ｎＭ）をロードした後、Ｄ～Ｆと同様に食作用についてアッセイした。（Ｄ～Ｈ）の場合、二元配置分散分析による統計分析：＃＝ｐ＜０．１５、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。エラーバーは標準誤差である。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図8】単球由来の初代マクロファージによるｐＳ９Ｌ－脂質に対する応答を、Ｓｉｇｌｅｃ－９発現によって階層化する。（Ａ～Ｄ）単球をＰＢＭＣから単離し、ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）で６日間処理してＭ１マクロファージに分化させた。（Ａ～Ｃ）３体の異なるドナーから単離したＰＢＭＣから分化したＭ１マクロファージを糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で処理した後、およそ１：２０のＥ：Ｔ比でｐＨｒｏｄｏ標識ビーズの食作用をアッセイした。二元配置分散分析による統計分析、＊＝ｐ＜０．０５。エラーバーを標準誤差として表す。（Ｄ）Ｍ１マクロファージを顕微鏡法によって蛍光標識抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体で染色し、蛍光を顕微鏡法によって定量した。ドナーＡ～ＣはパネルＡ～Ｃに対応する。正規化発現を、１画像当たりの集密度に対する１画像当たりの積分蛍光強度の比率を計算することによって決定した。エラーバーを標準偏差として表す。二元配置分散分析による統計分析、＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１。データは３体の異なるドナーからのものである。
【図9】高親和性Ｓｉｇｌｅｃ－９リガンドを有する合成糖ポリペプチドがＳｉｇｌｅｃ－９に係合し、クラスター化及びシグナル伝達を誘導する。（ａ）膜繋留型シス結合糖ポリペプチド１（ｐＳ９Ｌ）がＳｉｇｌｅｃ－９シグナル伝達を誘導する一方で、可溶性対照ポリペプチド２（ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌ）、又は非結合性だが膜に繋留された対照ポリペプチド３（ｐＬａｃ）は、誘導をしない。（ｂ）ポリペプチドｐＳ９Ｌ、ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌ、及びｐＬａｃの構造。ポリペプチドは全てＯ－ラクトシルポリセリン－コ－アラニン足場に基づいており、いくつかの事例では、末端Ｓｉｇｌｅｃ－９結合シアル酸類似体及び／又はＣ末端膜繋留脂質を有する。
【図10】シス結合Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニスト（ｐＳ９Ｌ）がＳｉｇｌｅｃ－９及びＳＨＰ－１を介してＲ８４８誘導性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害する。（ａ～ｃ）初代好中球を、膜不透過性ＤＮＡインターカレーターであるＣｙｔｏｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ又はＲｅｄ（２５０ｎＭ）を含み０．５％ｈｉＦＢＳを補充したＩＭＤＭ中のＲ８４８（１０μＭ）と糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で共処理した。画像を、蛍光顕微鏡法によって１２時間にわたって１５分毎に取得した。３００μｍ２を超える全ての緑色蛍光物体の面積を定量し、１ウェル当たり３つの画像の合計面積を平均した。相対的ＮＥＴｏｓｉｓを、Ｒ８４８処理のみからの最大ＮＥＴ面積に対して正規化することによって決定した（ｔ＝８時間）。（ａ）ｔ＝８時間の代表的な位相コントラスト及び蛍光画像。スケールバーは４０μｍを示す。（ｂ）（ｃ）の曲線下面積としての経時的なＮＥＴｏｓｉｓの定量。エラーバーは標準偏差を表す。（ｃ）時間の関数としてのＮＥＴ形成及び分解。エラーバンドは標準誤差を表す。（ｄ）様々な糖ポリペプチドでのＲ８４８刺激好中球の処理。エラーバーは標準偏差を表す。（ｅ）ｐＳ９Ｌは、Ｓｉｇｌｅｃ－９に対する高親和性及び特異的リガンドを有し、かつ膜繋留脂質尾部で官能化された、ムチン様糖ポリペプチドである。（ｆ）ＨＬ－６０細胞に、ＳＩＧＬＥＣ９（Ｓｉｇｌｅｃ－９をコードする）、ＰＴＰＮ６（ＳＨＰ－１をコードする）、又はスクランブル対照に対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、その後、２日間増殖させた。その後、細胞をＲ８４８（１０μＭ）とビヒクル又はｐＳ９Ｌ（５００ｎＭ）で共処理した。相対的ＮＥＴｏｓｉｓを、２００μｍ２を超える全ての物体を定量したことを除いて（ｂ）と同様に決定し、ｄＨＬ－６０におけるＲ８４８最大が誘導後２．５時間時点で観察された。エラーバーは標準偏差を表す。統計を二元配置分散分析（ｂ）又は一元配置分散分析（ｃ、ｄ、ｆ）によって決定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図11】Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニストｐＳ９Ｌは、ＣＯＶＩＤ－１９血漿によって誘導された好中球のＮＥＴｏｓｉｓを阻害する。（ａ、ｂ）健常ドナー又はＣＯＶＩＤ－１９患者由来の末梢血中の好中球におけるＳＩＧＬＥＣ９発現（ａ）及びＰＡＤＩ４発現（ｂ）に関する、公的に入手可能な単一細胞トランスクリプトミクスデータ８の分析。エラーバーは標準偏差を表す。統計を、混合効果モデルを使用して決定した。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ｃ、ｄ）初代好中球を、健常ドナー又はＣＯＶＩＤ－１９患者由来の未希釈クエン酸抗凝固血漿中で４時間培養した。細胞を固定し、細胞外ミエロペルオキシダーゼについて染色し、蛍光顕微鏡法によってＤＡＰＩイメージング培体中で画像化した。細胞を技術的三連（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で処理し、複数の視野にわたって画像化した。（ｃ）全ての視野にわたるＮＥＴ陽性細胞の割合（％）。各ドットは、個々の血漿試料を表す。（ｄ）ｐＳ９Ｌで処理した又は処理していないＣＯＶＩＤ－１９患者由来の血漿試料の代表的な画像。エラーバーは標準偏差を表す。反復好中球ドナーを使用した試料を説明するために混合効果モデルを使用して統計を決定した。＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図12】例えば、ＣＯＶＩＤ－１９において、局所及び末梢炎症性刺激がＮＥＴｏｓｉｓ及びその後の過炎症性カスケードを誘導する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染部位での局所炎症性刺激（例えば、ビリオン）及びＣＯＶＩＤ－１９に関連する末梢炎症性刺激（例えば、炎症誘発性サイトカインＩＬ－８及びＧ－ＣＳＦ）の両方がインビトロでＮＥＴｏｓｉｓを誘導することが示された。これらの因子は、インビボでもＮＥＴｏｓｉｓの原因物質であると疑われており、中等度及び重度のＣＯＶＩＤ－１９の症状につながる有害な過炎症性カスケードを開始する。本開示に基づいて、好中球関連チェックポイント受容体Ｓｉｇｌｅｃ－９のアゴニストが一般にＮＥＴｏｓｉｓを阻害し、特にＣＯＶＩＤ－１９において阻害すると予測される。
【発明を実施するための形態】
【0006】
シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが提供される。ある特定の実施形態では、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場と、膜繋留ドメインとを含む。本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれかを含む組成物、例えば、医薬組成物も提供される。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ活性のアゴナイズを必要とする個体における、Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法も提供される。シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを含むキット及びシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを作製する方法も提供される。
【0007】
本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法が、更に詳細に説明される前に、Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法が、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく変化し得ることを理解されたい。Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法の範囲は添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、限定的であるようには意図されていないことも理解されたい。
【0008】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１まで、その範囲の上限値と下限値との間の各々の介在値、及びその提示される範囲内の任意の他の提示される値又は介在値が、Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法内に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は独立してより小さい範囲内に含まれることができ、提示される範囲内の特に除外される限界条件に従って、Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法内にも包含される。提示される範囲に限界値の一方又は両方が含まれている場合、それらの含まれる限界値のいずれか又は両方を除く範囲も、Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法に含まれる。
【0009】
ある範囲は、数値の前に「約」という用語が付いた状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが付いた正確な数字、及びその用語が付いた数字に近い又は近似する数字に文言的サポートを提供するために本明細書で使用される。ある数が、具体的に記載された数に近い又は近似するか否かを決定する際に、近い又は近似するが明記されていない数とは、それが提示されている文脈において具体的に記載された数の実質的等価物を提供する数であり得る。
【0010】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等のいずれのＳｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法も、Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法の実践又は試験で使用されることができるが、代表的な例示的Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法がこれから説明される。
【0011】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が各々参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれ、その刊行物が引用されるところのものに関する材料及び／又は方法を開示及び説明するために参照により本明細書に組み込まれる。いずれの刊行物の引用も、出願日前のその開示についてのものであり、提供される刊行日は個別に確認を必要とし得る実際の刊行日とは異なる場合があるため、本Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法が、かかる刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【0012】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲はいずれかの任意選択的な要素を排除するように起草され得ることに更に留意されたい。したがってこの記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単に」、「のみ」などの排他的な用語の使用、又は「負の」限定の使用のための文言的根拠としての役割を果たすことが意図されている。
【0013】
明確化のために別個の実施形態との関連で記載されているＳｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法のある特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせても提供され得ることが認識される。逆に、簡潔化のために単一の実施形態の文脈で記載されているＳｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法の様々な特徴は、別個に又は任意の好適な部分的組み合わせでも提供され得る。実施形態の全ての組み合わせが本開示によって具体的にに包含され、かかる組み合わせは、実施可能なプロセス及び／又は組成物を包含するかぎりにおいて、ありとあらゆる組み合わせが個別かつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。加えて、かかる変形物を記載する実施形態に列記される全ての部分的組み合わせも、本Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト、組成物、キット、及び方法によって具体的にに包含され、ありとあらゆるかかる部分的組み合わせが個別かつ明示的に開示されているかのように本明細書に開示される。
【0014】
本開示を読んだ当業者には明らかになるように、本明細書に記載及び例証される個々の実施形態は各々、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴と容易に分離又は組み合わせられ得る個別の構成要素及び特徴を有する。列挙される方法は、列挙される事象の順序で行うことも、論理的に可能な任意の他の順序で行うこともできる。
【0015】
シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト
上で要約されるように、本開示は、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト（本明細書では「Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト」とも称される）を提供する。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場と、膜繋留ドメインとを含む。本明細書に示されるように、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは細胞膜に自発的に挿入され、免疫細胞表面で特定のＳｉｇｌｅｃにシスで（in cis）結合する。Ｓｉｇｌｅｃアゴニストには、様々なインビトロ用途及びインビボ用途での使用が見出される。予想外に、同程度の濃度での可溶化剤としてではなく細胞膜に繋留されたときに、本ＳｉｇｌｅｃリガンドはＳｉｇｌｅｃに結合し、レポーター系、マクロファージ細胞株、及び初代マクロファージにおける炎症活性を阻害する。したがって、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、とりわけ、シス相互作用を操作してグリコカリックスにすることによる免疫抑制の新規モダリティの構成要素となる。本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストの実施形態に関する詳細がこれから記載される。
上で要約されるように、本開示は、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト（本明細書では「Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト」とも称される）を提供する。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場と、膜繋留ドメインとを含む。本明細書に示されるように、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは細胞膜に自発的に挿入され、免疫細胞表面で特定のＳｉｇｌｅｃにシスで（in cis）結合する。Ｓｉｇｌｅｃアゴニストには、様々なインビトロ用途及びインビボ用途での使用が見出される。予想外に、同程度の濃度での可溶化剤としてではなく細胞膜に繋留されたときに、本ＳｉｇｌｅｃリガンドはＳｉｇｌｅｃに結合し、レポーター系、マクロファージ細胞株、及び初代マクロファージにおける炎症活性を阻害する。したがって、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、とりわけ、シス相互作用を操作してグリコカリックスにすることによる免疫抑制の新規モダリティの構成要素となる。本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストの実施形態に関する詳細がこれから記載される。
【0016】
シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）は、グリカンリガンドによって機能調節される免疫調節受容体のファミリーである。Ｓｉｇｌｅｃファミリーは、ヒトにおいて１５のファミリーメンバーで構成されており、造血系統における限られた細胞セットで発現し、例外として希突起膠細胞及びシュワン細胞上のＳｉｇｌｅｃ－４（ＭＡＧ）及び胎盤栄養膜上のＳｉｇｌｅｃ－６を含む。Ｓｉｇｌｅｃは、それらの最も外側のＮ末端Ｖセットドメインを介して、糖タンパク質及び糖脂質上のシアル酸含有グリカンリガンドを、特有であるが重複する特異性で認識する。それらのリガンドの認識により、それらの細胞質尾部の免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を介して細胞シグナル伝達に影響が及ぼされ得る。Ｓｉｇｌｅｃの大部分では、これらのＩＴＩＭはホスファターゼをリクルートする能力を有し、それ故に、これらのメンバーは抑制型Ｓｉｇｌｅｃと称される。例外としては、かかるモチーフを欠くＳｉｇｌｅｃ－１及びＭＡＧ、並びに、膜貫通領域内の正荷電アミノ酸を介して免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアダプタータンパク質に付随する活性化型Ｓｉｇｌｅｃ（Ｓｉｇｌｅｃ－１４～Ｓｉｇｌｅｃ－１６）が挙げられる。
【0017】
Ｓｉｇｌｅｃは、哺乳類種間のそれらの遺伝子相同性に基づいて２つの群に分けることができる。第１の群は全ての哺乳類に存在し、Ｓｉｇｌｅｃ－１（シアロアドヘシン）、Ｓｉｇｌｅｃ－２（ＣＤ２２）、Ｓｉｇｌｅｃ－４、及びＳｉｇｌｅｃ－１５で構成されている。第２の群は、Ｓｉｇｌｅｃ－３（ＣＤ３３）、Ｓｉｇｌｅｃ－５、Ｓｉｇｌｅｃ－６、Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－８、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、Ｓｉｇｌｅｃ－１４、及びＳｉｇｌｅｃ－１６を含むＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃで構成されている。単球、単球由来のマクロファージ、及び単球由来の樹状細胞は、ほぼ同じＳｉｇｌｅｃプロファイル、すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ－３、Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－９の高発現、Ｓｉｇｌｅｃ－１０の低発現、及びＩＦＮ－αでの刺激時のＳｉｇｌｅｃ－１の発現を有する。対照的に、マクロファージは、それらの分化状態に応じて、主にＳｉｇｌｅｃ－１、Ｓｉｇｌｅｃ－３、Ｓｉｇｌｅｃ－８、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、Ｓｉｇｌｅｃ－１５、及びＳｉｇｌｅｃ－１６の発現を有する。通常の樹状細胞は、単球由来の樹状細胞と同様に、Ｓｉｇｌｅｃ－３、Ｓｉｇｌｅｃ－７、及びＳｉｇｌｅｃ－９を発現するが、加えて、低レベルのＳｉｇｌｅｃ－２及びＳｉｇｌｅｃ－１５も発現する。形質細胞様樹状細胞は、Ｓｉｇｌｅｃ－１及びＳｉｇｌｅｃ－５を発現する。単球由来の樹状細胞でのＳｉｇｌｅｃ－７及びＳｉｇｌｅｃ－９発現のダウンレギュレーションがＬＰＳで４８時間刺激した後に観察されるが、単球由来のマクロファージでは、ＬＰＳでの刺激時にＳｉｇｌｅｃ発現は変化しない。Ｓｉｇｌｅｃは、Ｂ細胞、好塩基球、好中球、及びＮＫ細胞などの他の免疫細胞にも存在する。Ｓｉｇｌｅｃに関する更なる詳細は、Ａｎｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．３６（１０）：６４５－６６０、Ｌｕｂｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２８０７、Ｂｏｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（３）：５９８－６０８、及びＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（１）：３６５－３９５で見つけることができ、これらの開示は全ての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0018】
上で要約されるように、ある特定の実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場（scaffold）を含む。「足場」とは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドが１つ以上の対応するＳｉｇｌｅｃにシス結合することができるようにＳｉｇｌｅｃリガンドを提示することに適した構造を意味する。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場は、ポリマー足場を含む。本明細書で使用される場合、「ポリマー」とは、共有結合によって互いに連結された直鎖状の一連のモノマーである。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリペプチドである。「ポリペプチド」、「ペプチド」、又は「タンパク質」という用語は、隣接する残基のアルファ－アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに連結された直鎖状の一連のアミノ酸残基を規定するために本明細書で互換的に使用される。アミノ酸には、２０個の「標準の」遺伝子コード可能なアミノ酸、側鎖の生物学的修飾を伴う天然アミノ酸、非天然アミノ酸、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場は、糖ポリペプチド足場を含む。好適な糖ポリペプチド足場の非限定的な例には、下記の実験のセクションに記載のものが挙げられる。
【0019】
本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、任意の好適な数のＳｉｇｌｅｃリガンドを含み得る。ある特定の実施形態では、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、２～２００個のＳｉｇｌｅｃリガンド、例えば、２～１５０、２～１００、２～７５、２～５０、２～２５、又は２～１０個のＳｉｇｌｅｃリガンド、例えば、４～８個（例えば６個）のＳｉｇｌｅｃリガンドを含む。本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、単一のタイプのＳｉｇｌｅｃリガンドを含み得る。他の実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、２つ以上の異なるタイプのＳｉｇｌｅｃリガンド、例えば、同じＳｉｇｌｅｃ又は２つ以上の異なるＳｉｇｌｅｃに結合するための複数の異なるタイプのＳｉｇｌｅｃリガンドを含む。
【0020】
いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、特定のＳｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、特定のＳｉｇｌｅｃに対するリガンドのみを含む。この文脈における「のみ」とは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドが特定のＳｉｇｌｅｃに対するリガンドのみを含むことを意味し、これらのリガンドには、特定のＳｉｇｌｅｃに対する選択的又は特異的なリガンドが含まれるが、これらに限定されない。「選択的」とは、リガンドが、例えば試料中及び／又はインビボで、１つ以上の他のＳｉｇｌｅｃ（例えば他の全てのＳｉｇｌｅｃ）への結合と比較して、特定のＳｉｇｌｅｃに優先的に結合することを意味する。ある特定の実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、例えば、約１０４Ｍ－１又はそれを超える親和性あるいはＫａ（すなわち、特定の結合相互作用の１／Ｍの単位での会合速度定数）でＳｉｇｌｅｃに結合又は会合する場合に、特定のＳｉｇｌｅｃに対して「特異的」である。あるいは、親和性は、特定の結合相互作用のＭの単位で平衡解離定数（ＫＤ）（例えば、１０－５Ｍ～１０－１３Ｍ、又はそれ未満）として定義され得る。ある特定の態様では、特異的結合とは、Ｓｉｇｌｅｃリガンドが、約１０－５Ｍ以下、約１０－６Ｍ以下、約１０－７Ｍ以下、約１０－８Ｍ以下、又は約１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、若しくは１０－１２Ｍ以下のＫＤで特定のＳｉｇｌｅｃに結合することを意味する。Ｓｉｇｌｅｃに対するＳｉｇｌｅｃリガンドの結合親和性は、従来の技法を使用して、例えば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ製のＯｃｔｅｔ ＲＥＤ９６デバイスを使用する）によって、競合的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によって、平衡透析によって、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、製造業者によって概説された一般手順を使用するＢＩＡｃｏｒｅ ２０００又はＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００機器）を使用して、ラジオイムノアッセイによって、又は同様のものによって容易に決定することができる。
【0021】
本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含み得る。本明細書で使用される場合、「免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンド」とは、細胞質抑制性シグナル伝達ドメインを含むＳｉｇｌｅｃに対するリガンドであって、Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドによるそのＳｉｇｌｅｃの係合が該Ｓｉｇｌｅｃを発現する免疫細胞の活性を抑制する（例えば、抗炎症効果をもたらす）ものである。ある特定の実施形態では、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む、免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含み得る。ＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃの例としては、Ｓｉｇｌｅｃ－３（ＣＤ３３）、Ｓｉｇｌｅｃ－５、Ｓｉｇｌｅｃ－６、Ｓｉｇｌｅｃ－７、Ｓｉｇｌｅｃ－８、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、Ｓｉｇｌｅｃ－１４、及びＳｉｇｌｅｃ－１６が挙げられる。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－３リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－３リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－５リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－５リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－６リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－６リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－７リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－７リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－８リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－８リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－９リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１０リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１０リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１１リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１１リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１４リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１４リガンドのみを含む。いくつかの実施形態によれば、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１６リガンドを含む。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－１６リガンドのみを含む。ある特定の実施形態では、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、Ｓｉｇｌｅｃ－２（ＣＤ２２）に対するリガンドを含む、免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含み得る。ある特定のかかる実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、Ｓｉｇｌｅｃ－２リガンドのみを含む。
【0022】
本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストにおいて使用され得る、目的とする１つ以上のＳｉｇｌｅｃへの結合のためのＳｉｇｌｅｃリガンド（例えば、シアロシド及び／又はそれらの類似体）が知られており、それらには、例えば、Ｃｏｕｒｔｎｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０６（８）：２５００－２５０５、Ｓｐｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．７（３０３）：１－１３、Ｐｅｒｄｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１３（１２）：３３２９－３３３４、Ｓｈａｈｒａｚ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１－１７、Ｎｙｃｈｏｌａｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１４１（３６）：１４０３２－１４０３７、及びＲｉｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．５１（４４）：１１０１４－１１０１８に記載のものが含まれ、これらの開示は全ての目的のために参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0023】
上で要約されるように、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、膜繋留ドメインを含む。「膜繋留ドメイン」とは、該ＳｉｇｌｅｃアゴニストによってシスでアゴナイズされるところのＳｉｇｌｅｃをその表面に発現する細胞（例えば、免疫細胞）の細胞膜と安定して会合することができるドメイン（例えば化学的部分（moiety））を意味する。ある特定の実施形態では、「安定して会合する」とは、会合の平均半減期が４℃のＰＢＳ中で１日以上である２つの実体間の物理的会合を意味する。いくつかの実施形態では、２つの実体間の物理的会合は、４℃のＰＢＳ中で１日以上、１週間以上、１ヶ月以上（６ヶ月以上、例えば、１年以上を含む）の平均半減期を有する。いくつかの実施形態によれば、安定した会合は、２つの実体間の共有結合、２つの実体間の非共有結合（例えば、イオン結合若しくは金属結合）、又は他の形態の化学的誘引力、例えば、水素結合、ファンデルワールス力などから生じる。
【0024】
好適な膜繋留ドメインには、細胞の原形質膜に挿入するように適合された化学的部分が含まれるが、これらに限定されない。原形質膜の基礎構造は、２つの水性コンパートメント間に安定した障壁を形成するリン脂質二重層である。動物細胞の原形質膜には、４つの主要なリン脂質（ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及びスフィンゴミエリン）が含まれており、これらが合わさって、大半の膜中で脂質の半分以上を占めている。これらのリン脂質は、膜二重層の２つの半部分の間で非対称に分布している。原形質膜の外葉が主にホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンで構成されている一方で、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルセリンは内葉の主なリン脂質である。第５のリン脂質であるホスファチジルイノシトールも原形質膜の内側半分に局在している。ホスファチジルイノシトールは量的に微量の膜成分であるが、細胞シグナル伝達において重要な役割を果たしている。ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールの両方の頭部基は負に帯電しており、それ故に、内葉でのそれらの優位性により、原形質膜の細胞質面に正味の負電荷が生じる。ある特定の実施形態では、膜繋留ドメインは、ホモ二量体コイルドコイルタンパク質ドメイン又はマルチサブユニット繋留複合体（ＭＴＣ）であり、Ｚｈｉ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｆ１０００Ｐｒｉｍｅ Ｒｅｐ．６：７４に記載のものを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、膜繋留ドメインは、脂質膜繋留ドメインを含む。脂質膜繋留ドメインの非限定的な例には、下記の実験のセクションで用いられるものが挙げられる。
【0025】
好適な膜繋留ドメインには、細胞膜に安定して結合するように適合された化学的部分（それらの構成要素（例えば、膜貫通タンパク質などの膜付随タンパク質）を含む）も含まれる。ある特定の実施形態では、かかる化学的部分は、小分子を含む。「小分子」とは、１０００原子質量単位（ａｍｕ）以下の分子量を有する化合物を意味する。いくつかの実施形態によれば、小分子は、７５０ａｍｕ以下、５００ａｍｕ以下、４００ａｍｕ以下、３００ａｍｕ以下、又は２００ａｍｕ以下である。ある特定の実施形態では、小分子は、ポリマー中に存在するような反復分子単位では作製されていない。
【0026】
いくつかの実施形態によれば、細胞膜に安定して結合するように適合された化学的部分（それらの任意の構成要素を含む）は、抗体である。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭなど）、全抗体（例えば、四量体で構成される抗体であって、その四量体がさらに重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの２つの二量体から構成されるもの）；単鎖抗体；単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、（ｓｃＦｖ’）２、及びダイアボディを含むがこれらに限定されない、標的細胞の細胞表面分子への特異的結合を保持する抗体の断片（例えば、全抗体又は単鎖抗体の断片）；キメラ抗体；モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体（例えば、ヒト化全抗体、ヒト化半抗体、又はヒト化抗体断片）、及び抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質を含む。
【0027】
ある特定の実施形態では、細胞膜に安定して結合するように適合された化学的部分は、細胞表面に発現する細胞表面分子（例えば、細胞表面受容体）に対するリガンドである。リガンドは、細胞の表面上で細胞表面分子と複合体を形成する循環因子、分泌因子、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ペプチド、ポリペプチド、小分子、核酸などであり得る。いくつかの実施形態では、その化学的部分がリガンドである場合、リガンドは、細胞表面分子との複合体形成は起こるがかかる複合体形成の通常の生物学的結果は起こらないような態様で修飾されている。ある特定の実施形態では、リガンドは、標的細胞上に存在する細胞表面受容体のリガンドである。目的とする細胞表面受容体には、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、非受容体チロシンキナーゼ（非ＲＴＫ）、成長因子受容体、サイトカイン受容体などが含まれるが、これらに限定されない。
【0028】
いくつかの実施形態では、細胞膜に安定して結合するように適合された化学的部分（それらの構成要素を含む）は、アプタマーである。「アプタマー」とは、細胞表面分子に対して特異的結合親和性を有する核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）を意味する。アプタマーは、選択及び合成の容易さ、高い結合親和性及び特異性、低い免疫原性、並びに万能な合成アクセス性などの、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストの標的指向化送達のために望ましい特性を呈する。本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストでの使用が見出されるアプタマーには、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ １０（１）：３９－４５、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３：ｅ１８２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８（２７）：４１８５－４１９４に記載のものが含まれる。
【0029】
ある特定の実施形態によれば、細胞膜に安定して結合するように適合された化学的部分（それらの任意の構成要素を含む）は、ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」とは、１ｎｍ～１０００ｎｍ、２０ｎｍ～７５０ｎｍ、５０ｎｍ～５００ｎｍ（１００ｎｍ～３００ｎｍ、例えば、１２０～２００ｎｍを含む）の範囲内の少なくとも１つの寸法を有する粒子である。ナノ粒子は、球状、回転楕円体、棒形状、円盤形状、錐体形状、立方体形状、円筒形状、ナノ螺旋形状、ナノスプリング形状、ナノリング形状、矢印形状、涙滴形状、テトラポッド形状、プリズム形状、又は任意の他の好適な幾何学的形状若しくは非幾何学的形状を含むが、これらに限定されない任意の好適な形状を有し得る。ある特定の態様では、ナノ粒子は、その表面に、本明細書に記載の他の化学的部分、例えば、抗体、リガンド、アプタマー、小分子などのうちの１つ以上を含む。本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストでの使用が見出されるナノ粒子には、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．６２（２）：９０－９９、Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９（６）：５７２５－５７４０、及びＢｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．６０（１５）：１６１５－１６２６に記載のものが含まれる。
【0030】
いくつかの実施形態によれば、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、下記の実験のセクションに記載のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれかのものから独立して選択される、ポリマー足場、Ｓｉｇｌｅｃリガンド、膜繋留ドメイン、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0031】
本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、例えば、インビボ造影剤、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識され得る。Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、特異的結合対のメンバー、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などの他の化学的部分に更にコンジュゲートされ得る。
【0032】
シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト（例えば、本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれか）を作製する方法も提供される。ある特定の実施形態では、かかる方法は、末端に膜繋留ドメインを含むポリマー足場を合成することと、Ｓｉｇｌｅｃリガンドをポリマー足場のサブユニットに結合させることとを含む。いくつかの実施形態によれば、結合させることは、ポリマー足場のサブユニットをシアリル化することを含む。ポリマー足場を合成し、かつＳｉｇｌｅｃリガンドをかかるポリマー足場のサブユニットに結合させるのに好適な様々なアプローチが利用可能である。かかるアプローチの非限定的な例には、下記の実験のセクションで用いられるものが含まれる。
【0033】
組成物
本開示は、本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストのうちの１つ又はそれらの任意の組み合わせを含む組成物も提供する。
本開示は、本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストのうちの１つ又はそれらの任意の組み合わせを含む組成物も提供する。
【0034】
ある特定の態様では、本開示の組成物は、液状媒体中に存在する本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを含む。液状媒体は、水、緩衝溶液などの水性液状媒体であり得る。１つ以上の添加物、例えば、塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４）、緩衝剤（トリス緩衝液、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）スルホン酸ナトリウム塩（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ－トリス［ヒドロキシメチル］メチル－３－アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）など）、可溶化剤、洗剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ－２０などの非イオン性洗剤）、ヌクレアーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、グリセロール、キレート剤などがかかる組成物中に存在し得る。
【0035】
本開示の態様は、医薬組成物を更に含む。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む。
【0036】
本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、治療的投与用の様々な製剤に組み込むことができる。より具体的には、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、適切な薬学的に許容される賦形剤又は希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液、注射液、吸入剤、及びエアロゾルなどの固体、半固体、液体、又は気体形態で調製物に製剤化されてもよい。
【0037】
個体への投与用の（例えば、ヒト投与に好適な）Ｓｉｇｌｅｃアゴニストの製剤は概して無菌であり、更に、検出可能な発熱物質、又は選択された投与経路による患者への投与に禁忌である他の混入物を含んでいない状態であり得る。
【0038】
医薬剤形では、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、それらの薬学的に許容される塩の形態で投与され得、単独で、又は他の薬学的に活性な化合物に適切に付随して、あるいは組み合わされても使用され得る。以下の方法及び担体／賦形剤は単なる例であり、決して限定するものではない。
【0039】
経口調製物の場合、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、単独で、又は錠剤、粉末剤、顆粒剤、若しくはカプセル剤を作製するのに適切な添加物、例えば、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、若しくはジャガイモデンプンなどの従来の添加物、結晶セルロース、セルロール誘導体、アカシア、トウモロコシデンプン、若しくはゼラチンなどの結合剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの粉砕剤、滑石若しくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、並びに所望の場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤、及び香味剤と組み合わせて使用することができる。
【0040】
Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、非経口（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、髄腔内、皮下など）投与用に製剤化することができる。ある特定の態様では、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、水性若しくは非水性溶媒、例えば、植物油若しくは他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸エステル若しくはプロピレングリコールエステル中に、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを溶解する、懸濁する、又は乳化することによって、かつ所望の場合、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、及び防腐剤などの従来の添加物を用いて、注射用に製剤化される。
【0041】
Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを含む医薬組成物は、所望の純度を有するＳｉｇｌｅｃアゴニストを任意選択的な生理学的に許容される担体、賦形剤、安定剤、界面活性剤、緩衝剤、及び／又は等張化剤と混合することによって調製することができる。許容される担体、賦形剤、及び／又は安定剤は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これらには、緩衝剤（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、抗酸化剤（アスコルビン酸、グルタチオン、システイン、メチオニン、及びクエン酸を含む）、防腐剤（エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチル若しくはプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、又はそれらの組み合わせなど）、アミノ酸（アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、プロリン、及びそれらの組み合わせなど）、単糖、二糖、及び他の炭水化物、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（ゼラチン又は血清アルブミンなど）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖（トレハロース、スクロース、ラクトース、グルコース、マンノース、マルトース、ガラクトース、フラクトース、ソルボース、ラフィノース、グルコサミン、Ｎ－メチルグルコサミン、ガラクトサミン、及びノイラミン酸など）、及び／又は非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｂｒｉｊ Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）が含まれる。
【0042】
本医薬組成物は、液体形態、凍結乾燥形態、又は凍結乾燥形態から再構成される液体形態であってもよく、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌溶液で再構成されるものである。凍結乾燥組成物を再構成するための標準手順は、ある体積の純水（典型的には、凍結乾燥中に除去された体積と同等である）を戻し添加することであるが、抗菌剤を含む溶液が非経口投与用の医薬組成物の産生のために使用されてもよい。
【0043】
Ｓｉｇｌｅｃアゴニストの水性製剤は、例えば、約４．０～約７．０の範囲、又は約５．０～約６．０の範囲、又はあるいは約５．５のｐＨで、ｐＨ緩衝溶液中で調製することができる。この範囲内のｐＨに好適な緩衝剤の例には、リン酸緩衝剤、ヒスチジ緩衝剤、クエン酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、及び他の有機酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤の濃度は、例えば、緩衝剤及び製剤の所望の張度に応じて、約１ｍＭ～約１００ｍＭ、又は約５ｍＭ～約５０ｍＭとすることができる。
【0044】
製剤の張度を調節するために、等張化剤を製剤に含めてもよい。例示的な等張化剤には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、並びにアミノ酸の群からの任意の成分、糖、及びそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態では、水性製剤は等張性であるが、高張溶液又は低張溶液も好適となり得る。「等張性」という用語は、生理食塩水又は血清などの比較される他の溶液と同じ張度を有する溶液を意味する。等張化剤は、約５ｍＭ～約３５０ｍＭの量、例えば、１００ｍＭ～３５０ｍＭの量で使用され得る。
【0045】
界面活性剤を製剤に添加して、凝集を減少させる、及び／又は製剤中の微粒子の形成を最小限に抑える、及び／又は吸着を減少させることもできる。界面活性剤の例には、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ）、アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。好適なポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの例は、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０（商標）の商標名で販売されている）及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）の商標名で販売されている）である。好適なポリエチレン－ポリプロピレンコポリマーの例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８又はＰｏｌｏｘａｍｅｒ １８８（商標）の名称で販売されているものである。好適なポリオキシエチレンアルキルエーテルの例は、Ｂｒｉｊ（商標）の商標名で販売されているものである。界面活性剤の濃度の例は、約０．００１％～約１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。
【0046】
凍結乾燥保護剤を添加して、凍結乾燥プロセス中の不安定条件からＳｉｇｌｅｃアゴニストを保護することもできる。例えば、既知の凍結乾燥保護剤には、糖（グルコース及びスクロースを含む）、ポリオール（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む）、及びアミノ酸（アラニン、グリシン、及びグルタミン酸を含む）が挙げられる。凍結乾燥保護剤は、約１０ｍＭ～５００ｎＭの量で含まれ得る。
【0047】
いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストと、上で特定された成分（例えば、界面活性剤、緩衝剤、安定剤、等張化剤）のうちの１つ以上とを含み、エタノール、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ－クレゾール、ｐ－クロロ－ｍ－クレゾール、メチル又はプロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、及びそれらの組み合わせなどの１つ以上の防腐剤を本質的に含まない。他の実施形態では、防腐剤は、例えば、約０．００１～約２％（ｗ／ｖ）の濃度で、製剤中に含まれる。
【0048】
方法
本開示は、本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを使用する方法も提供する。ある特定の実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、Ｓｉｇｌｅｃを発現する細胞を、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれかと、膜繋留ドメインが細胞膜に挿入されかつＳｉｇｌｅｃリガンドが該細胞によって発現される１つ以上のＳｉｇｌｅｃにシスで結合する条件下で接触させることを含む、方法が提供される。一例として、本方法は、ＳｉｇｌｅｃアゴニストがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、Ｓｉｇｌｅｃ－９活性をアゴナイズする方法であり得る。いくつかの実施形態によれば、本開示の方法は、インビトロで行われる。
本開示は、本開示のシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを使用する方法も提供する。ある特定の実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、Ｓｉｇｌｅｃを発現する細胞を、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれかと、膜繋留ドメインが細胞膜に挿入されかつＳｉｇｌｅｃリガンドが該細胞によって発現される１つ以上のＳｉｇｌｅｃにシスで結合する条件下で接触させることを含む、方法が提供される。一例として、本方法は、ＳｉｇｌｅｃアゴニストがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、Ｓｉｇｌｅｃ－９活性をアゴナイズする方法であり得る。いくつかの実施形態によれば、本開示の方法は、インビトロで行われる。
【0049】
ある特定の実施形態では、本方法は、インビボで行われる。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ活性のアゴナイズを必要とする個体におけるＳｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、個体に、有効量の本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストのうちのいずれかを投与することを含む、方法が提供される。「有効量」又は「治療有効量」とは、所望の結果をもたらすのに十分な投薬量、例えば、対照と比較して免疫細胞（例えば、マクロファージ）活性に起因する症状の軽減などの有益な又は所望の治療結果（予防結果を含む）をもたらすのに十分な量を意味する。有効量は、１回以上の投与で投与することができる。
【0050】
いくつかの実施形態によれば、個体は、免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体であり、Ｓｉｇｌｅｃリガンドは、免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンド、例えば、本明細書の他の箇所に記載の免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドのうちのいずれかのうちの１つ以上、例えば、１つ以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃ（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－９）に対するリガンド、Ｓｉｇｌｅｃ－２に対するリガンド、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0051】
ある特定の実施形態では、個体は、炎症性疾患を有する個体であり、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、炎症性疾患を治療するのに有効な量で個体に投与される。「治療する」又は「治療」とは、個体の炎症性疾患に関連する１つ以上の症状の少なくとも改善を意味し、ここで、改善は、治療される炎症性疾患に関連するパラメータ（例えば症状）の規模の少なくとも減少を指すために広義で使用される。したがって、治療は、個体が炎症性疾患又は少なくともそれを特徴付ける症状に苦しまないように、炎症性疾患又はそれに関連する少なくとも１つ以上の症状が完全に抑制される、例えば、発症が防がれる、又は食い止められる、例えば、終結する状況も含む。
【0052】
本方法に従って治療され得る炎症性疾患の非限定的な例には、加齢性黄斑変性症、好中球急性呼吸窮迫症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、好酸球性胃腸炎、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、前灌流傷害（preperfusion injury）、移植片拒絶反応、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0053】
本医薬組成物は、様々な個体のうちのいずれかに投与され得る。ある特定の態様では、個体は、「哺乳動物」又は「哺乳類」であり、ここで、これらの用語は、肉食動物（例えば、イヌ及びネコ）、齧歯類（例えば、マウス、モルモット、及びラット）、及び霊長類（例えば、ヒト、チンパンジー、及びサル）を含む哺乳綱内の生物を説明するために広範に使用される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。ある特定の態様では、個体は、免疫細胞反応性を特徴とする状態（例えば炎症性疾患）の動物モデル（例えば、マウスモデル、霊長類モデルなど）である。
【0054】
いくつかの実施形態では、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストの有効量（例えば、それを含む医薬組成物中に存在する）は、単独で（例えば、単剤療法において）又は１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて（例えば、併用療法において）、１回以上の用量で投与されたときに、個体における免疫細胞反応性を特徴とする状態（例えば、炎症性疾患）の症状を、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストでの治療の不在下での個体の症状と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以上軽減するのに有効な量である。
【0055】
投薬は、治療される免疫細胞反応性を特徴とする状態（例えば、炎症性疾患）の重症度及び応答性に依存する。最適な投薬スケジュールは、個体の体内におけるＳｉｇｌｅｃアゴニスト蓄積の測定値から計算することができる。投与担当医師は、最適な投薬量、投与方法、及び反復速度を決定することができる。最適な投薬量は、個々のＳｉｇｌｅｃアゴニストの相対効力に応じて変化し得、一般に、インビトロ及びインビボ動物モデルなどにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、投薬量は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇであり、１日１回以上、週１回以上、月１回以上、又は年１回以上投与され得る。治療担当医師は、測定された滞留時間及び体液又は組織中のＳｉｇｌｅｃアゴニストの濃度に基づいて投薬反復速度を推定することができる。治療が成功した後、疾患状態の再発を防ぐために個体に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、この場合、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ～１００ｇの範囲の維持用量で、１日１回以上～数ヶ月に１回、６ヶ月に１回、年１回、又は任意の他の好適な頻度で投与される。
【0056】
本開示の治療方法は、個体に１種類のＳｉｇｌｅｃアゴニストを投与することを含み得、又は別個の投与若しくは異なるＳｉｇｌｅｃアゴニストのカクテルの投与により２つ以上の種類のＳｉｇｌｅｃアゴニストを投与することを含み得る。
【0057】
本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストは、インビボ及びエクスビボ法を含む薬物送達に好適な任意の利用可能な方法及び経路、並びに全身及び局所投与経路を使用して個体に投与され得る。従来の薬学的に許容される投与経路には、鼻腔内、筋肉内、気管内、皮下、皮内、局所適用、眼内、静脈内、動脈内、経口、並びに他の腸内及び非経口投与経路が含まれる。投与経路は、所望に応じて組み合わされてもよく、又は特定のＳｉｇｌｅｃアゴニスト及び／若しくは所望の効果に応じて調整されてもよい。Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、単回投与又は複数回投与で投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、非経口投与、例えば、静脈内投与、動脈内投与、又は同様の様式で投与される。いくつかの実施形態では、Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは、例えば、全身送達（例えば、静脈内注入）のために注射により投与されるか、又は局所部位、例えば、局所炎症部位に投与される。
【0058】
キット
上で要約されるように、本開示は、キットも提供する。本キットは、例えば、本開示の方法の実施での使用が見出される。いくつかの実施形態によれば、本キットは、本開示の医薬組成物のうちのいずれかと、それを必要とする個体に有効量の医薬組成物を投与するための説明書とを含む。いくつかの実施形態によれば、本開示のキットは、免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含むシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを含む医薬組成物を含む。かかるキットは、免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体に有効量の医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。かかるキットは、炎症性疾患を有する個体に有効量の医薬組成物を投与するための説明書を含み得、炎症性疾患の非限定的な例には、加齢性黄斑変性症、好中球急性呼吸窮迫症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、好酸球性胃腸炎、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、前灌流傷害、移植片拒絶反応、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
上で要約されるように、本開示は、キットも提供する。本キットは、例えば、本開示の方法の実施での使用が見出される。いくつかの実施形態によれば、本キットは、本開示の医薬組成物のうちのいずれかと、それを必要とする個体に有効量の医薬組成物を投与するための説明書とを含む。いくつかの実施形態によれば、本開示のキットは、免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含むシス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを含む医薬組成物を含む。かかるキットは、免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体に有効量の医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。かかるキットは、炎症性疾患を有する個体に有効量の医薬組成物を投与するための説明書を含み得、炎症性疾患の非限定的な例には、加齢性黄斑変性症、好中球急性呼吸窮迫症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、好酸球性胃腸炎、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、前灌流傷害、移植片拒絶反応、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0059】
本キットは、単位投薬量、例えば、アンプル、又は複数回投薬形式で存在するある量の本組成物を含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、本キットは、本開示のＳｉｇｌｅｃアゴニストを含む組成物の１つ以上（例えば、２つ以上）の単位投薬量（例えば、アンプル）を含み得る。「単位投薬量」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒト及び動物対象に好適な単位投薬量として物理的に別個の単位を指し、これらの単位は各々、所望の効果をもたらすのに十分な量で計算された所定量の本組成物を含む。単位投薬量の量は、対象において用いられる特定のＳｉｇｌｅｃアゴニスト、達成されるべき効果、及びＳｉｇｌｅｃアゴニストに関連する薬力学などの様々な要因に依存する。なお他の実施形態では、本キットは、単一の複数回投薬量の本組成物を含み得る。
【0060】
本キットの構成要素は別個の容器内に存在してもよく、又は複数の構成要素が単一の容器内に存在してもよい。好適な容器には、単一チューブ（例えば、バイアル）、アンプル、１つ以上のウェルのプレート（例えば、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレートなど）などが挙げられる。
【0061】
本キットに含まれる説明書（例えば、使用説明書（ＩＦＵ））は、好適な記録媒体に記録され得る。例えば、本説明書は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷されてもよい。したがって、本説明書は、添付文書として本キット、本キットの容器又はその構成要素（すなわち、包装又は部分包装に関連するもの）のラベルなどに存在し得る。他の実施形態では、本説明書は、好適なコンピューター可読記憶媒体、例えば、携帯用フラッシュドライブ、ＤＶＤ、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。なお他の実施形態では、実際の説明書は本キットに存在しないが、遠隔ソースから、例えば、インターネットを経由して本説明書を入手するための手段が提供される。この実施形態の一例は、本説明書を閲覧することができるウェブアドレス及び／又は本説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。本説明書と同様に、本説明書を入手するための手段は、好適な基材上に記録される。
【0062】
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の実施形態によっても定義される。
１． Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場と、
膜繋留ドメインと、
を含む、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト。
２． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場がポリマー足場を含む、実施形態１に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
３． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場が糖ポリペプチド足場を含む、実施形態２に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
４． 前記足場が２～５０個のＳｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
５． 前記足場が２～１０個のＳｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態４に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
６． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
７． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが１つ以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む、実施形態６に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
８． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、実施形態７に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
９． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドのみを含む、実施形態８に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１０． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドを含む、実施形態７に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１１． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドのみを含む、実施形態１０に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１２． 前記膜繋留ドメインが脂質膜繋留ドメインを含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１３． 液状媒体中に存在する実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストを含む、組成物。
１４． 凍結乾燥形態で存在する実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストを含む、組成物。
１５． 実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストと、
薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物。
１６． 前記組成物が非経口投与用に製剤化されている、実施形態１５に記載の医薬組成物。
１７． 前記組成物が静脈内投与用に製剤化されている、実施形態１６に記載の医薬組成物。
１８． Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、Ｓｉｇｌｅｃを発現する細胞を、実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストと、前記膜繋留ドメインが細胞膜に挿入されかつ前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが前記細胞によって発現される１つ以上のＳｉｇｌｅｃにシスで結合する条件下で接触させることを含む、方法。
１９． 前記方法がインビトロで行われる、実施形態１８に記載の方法。
２０． 前記方法がインビボで行われる、実施形態１８に記載の方法。
２１． 前記方法はＳｉｇｌｅｃ－９活性をアゴナイズする方法であり、前記ＳｉｇｌｅｃアゴニストがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、実施形態１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２． Ｓｉｇｌｅｃ活性のアゴナイズを必要とする個体においてＳｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、前記個体に、実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストの有効量を投与することを含む、方法。
２３． 前記個体は免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体であり、前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態２２に記載の方法。
２４． 前記個体が炎症性疾患を有する個体であり、前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記炎症性疾患を治療するのに有効な量で前記個体に投与される、実施形態２２又は２３に記載の方法。
２５． 前記個体が、加齢性黄斑変性症、好中球急性呼吸窮迫症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、好酸球性胃腸炎、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、前灌流傷害、移植片拒絶反応、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される炎症性疾患を有する、実施形態２４に記載の方法。
２６． 前記個体はウイルス感染を有する個体である、実施形態２２又は２３に記載の方法。
２７． 前記ウイルス感染がコロナウイルス感染である、実施形態２６に記載の方法。
２８． 前記コロナウイルス感染がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染である、実施形態２７に記載の方法。
２９． 前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記個体における好中球活性化を阻害する、実施形態２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０． 前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記個体におけるＮＥＴｏｓｉｓを阻害する、実施形態２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
３１． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが１つ以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む、実施形態２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
３２． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、実施形態３１に記載の方法。
３３． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドのみを含む、実施形態３２に記載の方法。
３４． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドを含む、実施形態３１に記載の方法。
３５． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドのみを含む、実施形態３４に記載の方法。
３６． 実施形態１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物と、
前記医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与するための説明書と、
を含む、キット。
３７． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態３６に記載のキット。
３８． 前記説明書が、前記医薬組成物の有効量を、免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体に投与するためのものである、実施形態３７に記載のキット。
３９． シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを作製する方法であって、
末端に膜繋留ドメインを含むポリマー足場を合成することと、
Ｓｉｇｌｅｃリガンドを前記ポリマー足場のサブユニットに結合させることと、
を含む、方法。
４０． 前記結合させることは、前記ポリマー足場のサブユニットをシアリル化することを含む、実施形態３９に記載の方法。
以下の実施例は、限定するものではなく、例証として提供される。
１． Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場と、
膜繋留ドメインと、
を含む、シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニスト。
２． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場がポリマー足場を含む、実施形態１に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
３． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有する足場が糖ポリペプチド足場を含む、実施形態２に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
４． 前記足場が２～５０個のＳｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態１～３のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
５． 前記足場が２～１０個のＳｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態４に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
６． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
７． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが１つ以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む、実施形態６に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
８． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、実施形態７に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
９． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドのみを含む、実施形態８に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１０． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドを含む、実施形態７に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１１． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドのみを含む、実施形態１０に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１２． 前記膜繋留ドメインが脂質膜繋留ドメインを含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニスト。
１３． 液状媒体中に存在する実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストを含む、組成物。
１４． 凍結乾燥形態で存在する実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストを含む、組成物。
１５． 実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストと、
薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物。
１６． 前記組成物が非経口投与用に製剤化されている、実施形態１５に記載の医薬組成物。
１７． 前記組成物が静脈内投与用に製剤化されている、実施形態１６に記載の医薬組成物。
１８． Ｓｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、Ｓｉｇｌｅｃを発現する細胞を、実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストと、前記膜繋留ドメインが細胞膜に挿入されかつ前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが前記細胞によって発現される１つ以上のＳｉｇｌｅｃにシスで結合する条件下で接触させることを含む、方法。
１９． 前記方法がインビトロで行われる、実施形態１８に記載の方法。
２０． 前記方法がインビボで行われる、実施形態１８に記載の方法。
２１． 前記方法はＳｉｇｌｅｃ－９活性をアゴナイズする方法であり、前記ＳｉｇｌｅｃアゴニストがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、実施形態１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２． Ｓｉｇｌｅｃ活性のアゴナイズを必要とする個体においてＳｉｇｌｅｃ活性をアゴナイズする方法であって、前記個体に、実施形態１～１２のいずれか一項に記載のＳｉｇｌｅｃアゴニストの有効量を投与することを含む、方法。
２３． 前記個体は免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体であり、前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態２２に記載の方法。
２４． 前記個体が炎症性疾患を有する個体であり、前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記炎症性疾患を治療するのに有効な量で前記個体に投与される、実施形態２２又は２３に記載の方法。
２５． 前記個体が、加齢性黄斑変性症、好中球急性呼吸窮迫症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、好酸球性胃腸炎、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎、炎症性腸疾患、前灌流傷害、移植片拒絶反応、及びそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される炎症性疾患を有する、実施形態２４に記載の方法。
２６． 前記個体はウイルス感染を有する個体である、実施形態２２又は２３に記載の方法。
２７． 前記ウイルス感染がコロナウイルス感染である、実施形態２６に記載の方法。
２８． 前記コロナウイルス感染がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染である、実施形態２７に記載の方法。
２９． 前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記個体における好中球活性化を阻害する、実施形態２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０． 前記Ｓｉｇｌｅｃアゴニストが前記個体におけるＮＥＴｏｓｉｓを阻害する、実施形態２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
３１． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが１つ以上のＣＤ３３関連Ｓｉｇｌｅｃに対するリガンドを含む、実施形態２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
３２． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドを含む、実施形態３１に記載の方法。
３３． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－９リガンドのみを含む、実施形態３２に記載の方法。
３４． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドを含む、実施形態３１に記載の方法。
３５． 前記ＳｉｇｌｅｃリガンドがＳｉｇｌｅｃ－７リガンドのみを含む、実施形態３４に記載の方法。
３６． 実施形態１５～１７のいずれか一項に記載の医薬組成物と、
前記医薬組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与するための説明書と、
を含む、キット。
３７． 前記Ｓｉｇｌｅｃリガンドが免疫抑制性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを含む、実施形態３６に記載のキット。
３８． 前記説明書が、前記医薬組成物の有効量を、免疫細胞反応性の抑制を必要とする個体に投与するためのものである、実施形態３７に記載のキット。
３９． シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストを作製する方法であって、
末端に膜繋留ドメインを含むポリマー足場を合成することと、
Ｓｉｇｌｅｃリガンドを前記ポリマー足場のサブユニットに結合させることと、
を含む、方法。
４０． 前記結合させることは、前記ポリマー足場のサブユニットをシアリル化することを含む、実施形態３９に記載の方法。
以下の実施例は、限定するものではなく、例証として提供される。
【実施例】
【0063】
実験
実施例１ ― Ｎ－カルボキシ無水物重合による糖ポリペプチド合成
Ｓｉｇｌｅｃに対するバイオミメティックシスリガンドの設計は、天然Ｓｉｇｌｅｃリガンドである、高度にグリコシル化されたポリペプチドであるムチンからインスピレーションを得たものであった。糖ポリペプチド骨格を構築するために、Ｎ－カルボキシ無水物（ＮＣＡ）重合プラットフォームを用いた。脂質繋留開始剤を使用してＮＣＡ単量体を重合して、細胞膜に自発的に挿入される脂質繋留ポリペプチドを得た。糖ポリペプチドの足場を精巧に作り上げる（elaborate）ために、我々は、以前に使用された、Ｃｈｅｎと共同研究者らによる酵素法（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５（２４），３９３８－３９４４）（Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｌｏｗ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓ．ＣｈｅｍＲｘｉｖ ２０１９）を、高い親和性と選択性で個別のＳｉｇｌｅｃに結合することがＰａｕｌｓｏｎと共同研究者らによって以前に報告されたシアル酸類似体（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１（４４），１１０１４－１１０１８）と組み合わせた。かかる脂質連結型シアロ糖ポリペプチドが細胞膜に挿入されてシス結合を介して隣接するＳｉｇｌｅｃ受容体をクラスター化させるかどうかをここで評価した。
実施例１ ― Ｎ－カルボキシ無水物重合による糖ポリペプチド合成
Ｓｉｇｌｅｃに対するバイオミメティックシスリガンドの設計は、天然Ｓｉｇｌｅｃリガンドである、高度にグリコシル化されたポリペプチドであるムチンからインスピレーションを得たものであった。糖ポリペプチド骨格を構築するために、Ｎ－カルボキシ無水物（ＮＣＡ）重合プラットフォームを用いた。脂質繋留開始剤を使用してＮＣＡ単量体を重合して、細胞膜に自発的に挿入される脂質繋留ポリペプチドを得た。糖ポリペプチドの足場を精巧に作り上げる（elaborate）ために、我々は、以前に使用された、Ｃｈｅｎと共同研究者らによる酵素法（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５（２４），３９３８－３９４４）（Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｌｏｗ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓ．ＣｈｅｍＲｘｉｖ ２０１９）を、高い親和性と選択性で個別のＳｉｇｌｅｃに結合することがＰａｕｌｓｏｎと共同研究者らによって以前に報告されたシアル酸類似体（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１（４４），１１０１４－１１０１８）と組み合わせた。かかる脂質連結型シアロ糖ポリペプチドが細胞膜に挿入されてシス結合を介して隣接するＳｉｇｌｅｃ受容体をクラスター化させるかどうかをここで評価した。
【0064】
糖ポリペプチド足場を、アラニンＮＣＡ １とＯ－β－ペルアセチルラクトースセリンＮＣＡ ２との等モル混合物の重合によって合成した（図２）。重合は、Ｎｉ（０）複合体を用いて開始して可溶性糖ポリペプチドを得たか、またはＮｉ（０）を脂質コンジュゲートＮ－アリルカルボキシロイシンアミドと事前に複合体化 して活性化Ｎｉ（ＩＩ）開始剤複合体３を形成することによって開始したかのいずれかであった。脂質コンジュゲート開始剤により、ポリペプチド上にＣ末端コンジュゲート脂質がもたらされる。重合後、炭水化物をヒドラジンで脱保護して、それぞれ、Ｏ－ラクトシル糖ポリペプチドｐＬａｃ－ｓｏｌ又はｐＬａｃ－脂質を得た。
【0065】
ワンポットマルチ酵素系を使用して、共通のｐＬａｃ前駆体を、Ｎ－アセチルノイラミン酸で（ｐＳｉａの場合）、９－Ｎ－プロパルギルカルボキシＮ－アセチルノイラミン酸で（ｐＳ７Ｌの場合）、又はピルビン酸ナトリウム及びノイラミン酸アルドラーゼとともにＮ－プロパルギルカルボキシマンノサミン ４で（ｐＳ９Ｌの場合、図２）α－２，６－シアリル化した。酵素で精巧に作り上げた後、アダマンチルアジド（ｐＳ７Ｌの場合）又はベンズヒドリルアジド（ｐＳ９Ｌの場合）のいずれかを使用したＨｕｉｓｇｅｎ環化付加によって高親和性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを合成した。これにより、Ｃ末端脂質又は可溶性基のいずれかと、遊離Ｎ末端と、末端高親和性Ｓｉｇｌｅｃリガンドを有するグリカンとを有する糖ポリペプチドを得た。最後に、市販のビオチン又はＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ＮＨＳエステルでポリペプチドをＮ末端標識した（方法）。
【0066】
実施例２ ― ｐＳ９Ｌ－脂質は細胞膜に挿入され、Ｓｉｇｌｅｃ－９にシス結合する
一連のＮ末端標識シアリル化糖ポリペプチドを、共通の前駆体ｐＬａｃ－脂質又はｐＬａｃ－ｓｏｌから構築した（図３、パネルＡ）。組換え可溶性Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆｃ融合タンパク質への該構築物の結合を、インビトロ及び細胞表面上で試験した。インビトロ結合の場合、Ｎ末端ビオチン化脂質フリー糖ポリペプチドを、ストレプトアビジンをコーティングしたチップに固定化し、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆｃ融合タンパク質溶液に浸漬した。各糖ポリペプチドはその同族Ｓｉｇｌｅｃ受容体に特異的に結合した（図３、パネルＢ）。例えば、ｐＳ９Ｌは高親和性でＳｉｇｌｅｃ－９－Ｆｃに結合したが、試験したいずれの他の糖ポリペプチドも結合しなかった（図３、パネルＢ）。脂質連結型バージョンを細胞膜に挿入し、細胞を組換えＳｉｇｌｅｃ－９－Ｆｃで染色した場合にも、同様の特異性が観察された（図３、パネルＣ）。様々な糖ポリペプチドの挿入間で実質的な差はなかった。シアル酸結合喪失の変異体である、Ｓｉｇｌｅｃ－９の変異Ｒ１２０Ａは、インビトロ実験及びフロー実験の両方で観察された効果を無効にし、ＳＮＡでの染色では、いずれの構造でも結合の増加が見られなかった。
一連のＮ末端標識シアリル化糖ポリペプチドを、共通の前駆体ｐＬａｃ－脂質又はｐＬａｃ－ｓｏｌから構築した（図３、パネルＡ）。組換え可溶性Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆｃ融合タンパク質への該構築物の結合を、インビトロ及び細胞表面上で試験した。インビトロ結合の場合、Ｎ末端ビオチン化脂質フリー糖ポリペプチドを、ストレプトアビジンをコーティングしたチップに固定化し、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｆｃ融合タンパク質溶液に浸漬した。各糖ポリペプチドはその同族Ｓｉｇｌｅｃ受容体に特異的に結合した（図３、パネルＢ）。例えば、ｐＳ９Ｌは高親和性でＳｉｇｌｅｃ－９－Ｆｃに結合したが、試験したいずれの他の糖ポリペプチドも結合しなかった（図３、パネルＢ）。脂質連結型バージョンを細胞膜に挿入し、細胞を組換えＳｉｇｌｅｃ－９－Ｆｃで染色した場合にも、同様の特異性が観察された（図３、パネルＣ）。様々な糖ポリペプチドの挿入間で実質的な差はなかった。シアル酸結合喪失の変異体である、Ｓｉｇｌｅｃ－９の変異Ｒ１２０Ａは、インビトロ実験及びフロー実験の両方で観察された効果を無効にし、ＳＮＡでの染色では、いずれの構造でも結合の増加が見られなかった。
【0067】
脂質繋留糖ポリペプチドがＳｉｇｌｅｃとシス会合するかを決定するために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５５５ドナーフルオロフォアでＮ末端標識された脂質連結型糖ポリペプチドのフルオロフォアと、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７アクセプターにコンジュゲートされた抗Ｓｉｇｌｅｃ抗体のフルオロフォアとの間のフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定した（図４、パネルＡ）。ドナーフルオロフォアを５３５ｎｍレーザーで励起させ、蛍光を５５５ｎｍ及び６４７ｎｍの両方の発光波長で検出した。ＦＲＥＴシグナルを、アクセプター蛍光強度とドナー蛍光強度の合計に対するアクセプター蛍光強度の比である、相対的効率（Ｅｒｅｌ）として知られるＦＲＥＴ効率の簡易化バージョンを使用して定量した。
【0068】
糖ポリペプチドの特異性を、Ｓｉｇｌｅｃ－９発現細胞でｐＳ９Ｌ－脂質及びｐＳ７Ｌ－脂質を使用して分析し（図４、パネルＢ及びＤ）、Ｓｉｇｌｅｃ特異性を、Ｓｉｇｌｅｃ－９又はＳｉｇｌｅｃ－７発現細胞でｐＳ９Ｌ－脂質を使用して分析した（図４、パネルＣ及びＥ）。印象深いことに、相対的ＦＲＥＴ効率の劇的な増加が、ｐＳ９Ｌ－脂質をＳｉｇｌｅｃ－９と組み合わせた場合にのみ観察されたが、ミスマッチの場合は観察されなかった。更に、Ｓｉｇｌｅｃ－９／ｐＳ９Ｌ－脂質の場合には、強烈な点（puncta）が観察された。抗体結合親和性又は抗体／フルオロフォア比における違いを勘案するために、単色対照と比較した、ＦＲＥＴの場合のアクセプターフルオロフォア発光の強度も決定した。Ｓｉｇｌｅｃ－９／ｐＳ９Ｌ－脂質のＦＲＥＴとアクセプターのみ対照との間ではアクセプター発光強度の実質的な増加が観察されたが、Ｓｉｇｌｅｃ－７／ｐＳ９Ｌ－脂質では観察されなかった。
【0069】
実施例３ ― シス結合糖ポリペプチドは、Ｓｉｇｌｅｃ－９発現細胞においてＴＬＲ４誘導性ＮＦ－κＢ活性を阻害する
膜繋留糖ポリペプチドが炎症性シグナル伝達に及ぼす影響を調べるために、ＨＥＫＢｌｕｅ ｈＴＬＲ４レポーターアッセイに基づいてＳｉｇｌｅｃ活性のレポーター系を開発した。ＣＤ３３関連ＳｉｇｌｅｃがトランスジェニックＨＥＫ細胞においてｈＴＬＲ４を調節することが以前に示されている。このレポーター株では、ＬＰＳ誘導によるＴＬＲ４シグナル伝達が、上清に分泌されるアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のＮＦ－κＢ転写を開始する。ＮＦ－κＢ活性は、比色アッセイにおけるＳＥＡＰ活性と相関している。これらの細胞にＳｉｇｌｅｃ発現ベクターをトランスフェクトすることによってこのアッセイを改変した（図５、パネルＡ）。このアッセイを、Ｓｉｇｌｅｃ－９発現ＨＥＫＢｌｕｅ細胞を、抗Ｓｉｇｌｅｃ－９をコーティングしたプレートにプレーティングして、Ｓｉｇｌｅｃ－９シグナル伝達に関与させることによって検証した。ビヒクルで処理したプレート又はアイソタイプをコーティングしたプレートと比較して活性の実質的な減少が観察された（図５、パネルＢ）。
膜繋留糖ポリペプチドが炎症性シグナル伝達に及ぼす影響を調べるために、ＨＥＫＢｌｕｅ ｈＴＬＲ４レポーターアッセイに基づいてＳｉｇｌｅｃ活性のレポーター系を開発した。ＣＤ３３関連ＳｉｇｌｅｃがトランスジェニックＨＥＫ細胞においてｈＴＬＲ４を調節することが以前に示されている。このレポーター株では、ＬＰＳ誘導によるＴＬＲ４シグナル伝達が、上清に分泌されるアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のＮＦ－κＢ転写を開始する。ＮＦ－κＢ活性は、比色アッセイにおけるＳＥＡＰ活性と相関している。これらの細胞にＳｉｇｌｅｃ発現ベクターをトランスフェクトすることによってこのアッセイを改変した（図５、パネルＡ）。このアッセイを、Ｓｉｇｌｅｃ－９発現ＨＥＫＢｌｕｅ細胞を、抗Ｓｉｇｌｅｃ－９をコーティングしたプレートにプレーティングして、Ｓｉｇｌｅｃ－９シグナル伝達に関与させることによって検証した。ビヒクルで処理したプレート又はアイソタイプをコーティングしたプレートと比較して活性の実質的な減少が観察された（図５、パネルＢ）。
【0070】
ＨＥＫＢｌｕｅ細胞にＳｉｇｌｅｃ－９をトランスフェクトし、糖ポリペプチド（１μＭ）でコーティングした後、ＬＰＳで刺激した。相対的ＮＦ－κＢ活性の減少が、シス結合ｐＳ９Ｌ－脂質によって観察されたが、可溶性トランス結合ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌ（図５、パネルＣ）又は他の脂質繋留糖ポリペプチドでは観察されなかった。
【0071】
ｐＳ９Ｌ－脂質のＳｉｇｌｅｃ特異性を試験するために、ＨＥＫＢｌｕｅ細胞にＳｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－７、又は偽（mock）ベクターをトランスフェクトし、ｐＳ９Ｌ－脂質（１μＭ）でコーティングした後、ＬＰＳで刺激した。細胞がＳｉｇｌｅｃ－９を発現する場合にのみ、ビヒクルで処理した細胞と比較してｐＳ９Ｌ－脂質はＮＦ－κＢ活性を阻害することが観察された（図５、パネルＤ）。ＩＴＩＭ／ＩＳＩＭドメインのチロシンリン酸化を防ぐＲ１２０Ａの変異又はＹ４３３／４５６Ｆの二重変異体を有するＳｉｇｌｅｃ－９構築物のトランスフェクションにより、ｐＳ９Ｌ－脂質に応答したＮＦ－κＢ活性はレスキューされた（図５、パネルＥ）。
【0072】
実施例４ ― トランス結合ではなくシス結合ｐＳ９ＬがマクロファージにおいてＭＡＰＫシグナル伝達を阻害する
炎症性疾患においてＳｉｇｌｅｃ－９を発現する病理学的に関連する細胞型は、主にマクロファージ系統のものである。ＴＨＰ－１細胞は不死化単球株であり、可塑性であり、マクロファージ生物学の研究に使用されてきた。ＴＨＰ－１単球を、ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテートを使用してＳｉｇｌｅｃ－９＋マクロファージに分化し、これらのマクロファージを使用して、ｐＳ９Ｌ－脂質の効果及び作用機序を調査した。低シアリルＴＨＰ－１マクロファージを、過炎症性食細胞の低シアリル化を再現する活性を有効にするために以前に使用された低シアリル化に匹敵する、過炎症性マクロファージのモデルとして使用した。このモデルが、天然シスリガンドの交絡的効果をデコンボリューションし、ｐＳ９Ｌ－脂質シグナル伝達経路の単離を可能にするかを評価した。細胞を糖ポリペプチドでコーティングし、ＬＰＳで刺激して又は刺激せずにそれらを分析することにより、可溶性トランス結合ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌの効果及び膜繋留シス結合ｐＳ９Ｌ－脂質の効果をビヒクル処理細胞と比較した。初期シグナル伝達カスケードを、定量的ホスホプロテオミクスを使用して分析し、より後の時点ではこの技法をサイトカイン定量化で補足した（図６、パネルＡ）。
炎症性疾患においてＳｉｇｌｅｃ－９を発現する病理学的に関連する細胞型は、主にマクロファージ系統のものである。ＴＨＰ－１細胞は不死化単球株であり、可塑性であり、マクロファージ生物学の研究に使用されてきた。ＴＨＰ－１単球を、ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテートを使用してＳｉｇｌｅｃ－９＋マクロファージに分化し、これらのマクロファージを使用して、ｐＳ９Ｌ－脂質の効果及び作用機序を調査した。低シアリルＴＨＰ－１マクロファージを、過炎症性食細胞の低シアリル化を再現する活性を有効にするために以前に使用された低シアリル化に匹敵する、過炎症性マクロファージのモデルとして使用した。このモデルが、天然シスリガンドの交絡的効果をデコンボリューションし、ｐＳ９Ｌ－脂質シグナル伝達経路の単離を可能にするかを評価した。細胞を糖ポリペプチドでコーティングし、ＬＰＳで刺激して又は刺激せずにそれらを分析することにより、可溶性トランス結合ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌの効果及び膜繋留シス結合ｐＳ９Ｌ－脂質の効果をビヒクル処理細胞と比較した。初期シグナル伝達カスケードを、定量的ホスホプロテオミクスを使用して分析し、より後の時点ではこの技法をサイトカイン定量化で補足した（図６、パネルＡ）。
【0073】
細胞のサイトカイン産生を、６つの炎症性ヒトサイトカインの多重サイトメトリービーズアッセイを使用して分析した。マクロファージを糖ポリペプチド（２００ｎＭ）で前処理し、その後、ビヒクル又はＬＰＳのいずれかで１８時間刺激した。上清の試料を採取し、サイトカイン含有量についてアッセイした。シス結合ｐＳ９Ｌ－脂質で処理した場合、ＩＬ－１β、ＩＬ－８、及びＴＮＦαの顕著な減少が観察されたが、トランス結合可溶性類似体ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌでは観察されなかった（図６、パネルＢ）。ＩＬ－１０及びＩＬ－１２ｐ７０は、このアッセイの検出限界未満（２０ｐｇ／ｍＬ未満）であった。
【0074】
同様のプロトコルを使用して、ホスホプロテオームの変化を、糖ポリペプチドのローディング又はＬＰＳでの５分間の刺激のいずれかを行った後の溶解物から分析した（図６、パネルＣ～Ｅ）。刺激していないマクロファージでは、最小限の変化しか観察されなかった。ＬＰＳで刺激した細胞がシス結合ｐＳ９Ｌ－脂質で前処理された場合、リン酸化の劇的な変化が観察されたが、ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌ又はｐＬａｃ－脂質では観察されなかった。注目すべきことに、ＭＡＰＫシグナル伝達の活性の低下と相関するリン酸化が観察された。ＳＨ２ドメイン含有タンパク質（例えば、ＳＨＩＰ２及びＰＴＮ７）の差次的リン酸化も観察された。ウエスタンブロットによるＩκＢの総タンパク質のリン酸化の分析によって下流ＭＡＰＫシグナル伝達を検証した（図６、パネルＦ）。ｐＳ９Ｌ－脂質は、ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌと比較して、より多い総ＩκＢ、及び、ＩκＢ分解をシグナル伝達する部位（Ｓ３２／３６）でのより低いＩκＢリン酸化の両方を有することが見出された。Ｓｉｇｌｅｃ－９上のホスホチロシンの差次的リン酸化は、アッセイしたいずれの時点でも観察されなかった。
【0075】
実施例５ ― Ｓｉｇｌｅｃ－９及びＳｉｇｌｅｃ－Ｅのシスリガンドは、マクロファージ及びミクログリアによる食作用を阻害する
Ｓｉｇｌｅｃ受容体の係合が食作用を阻害することが示されている。この実施例では、ｐＳ９Ｌ－脂質がＳｉｇｌｅｃ－９を介して食作用を阻害することができるかを評価した。これを、顕微鏡を用いて低ｐＨで蛍光がオンになる（ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ）ビーズの食作用を監視することによって調査した（図７、パネルＡ及びＢ）。
Ｓｉｇｌｅｃ受容体の係合が食作用を阻害することが示されている。この実施例では、ｐＳ９Ｌ－脂質がＳｉｇｌｅｃ－９を介して食作用を阻害することができるかを評価した。これを、顕微鏡を用いて低ｐＨで蛍光がオンになる（ｐＨｒｏｄｏ ｒｅｄ）ビーズの食作用を監視することによって調査した（図７、パネルＡ及びＢ）。
【0076】
食作用の初期速度を、複数のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で分析した（図７、パネルＣ）。ｐＳ９Ｌ－脂質を、その可溶性類似体（ｐＳ９Ｌ－ｓｏｌ）、不活性ラクトースのみを有する糖バリアント（ｐＬａｃ－脂質）、及び未処理の細胞と比較して、ｐＳ９Ｌグリカン結合の潜在的な相互作用又は脂質挿入によって引き起こされる非特異的効果を分析した。糖ポリペプチドを野生型ＴＨＰ－１マクロファージにロードした後（２００ｎＭ）、様々な量の標的ｐＨｒｏｄｏ標識ビーズを添加した。その後、標的を添加した直後及びその１時間後に顕微鏡を用いて食作用を監視して、食作用の初期速度を決定した。１試料当たり３つのウェルで１ウェル当たり５つの画像上で観察された、バックグラウンド閾値を超える蛍光の面積として食作用を定量した。ｐＳ９Ｌ－脂質の場合、我々は、所与のＥ：Ｔ比の全てでの食作用速度及び見かけの最大食作用速度の劇的な低下を観察した一方で、両方の対照糖ポリペプチドはビヒクル処理細胞に匹敵する結果をもたらした。
【0077】
観察された効果がＳｉｇｌｅｃ－９アゴニズムによって媒介されたかどうかを決定するために、以下の２つのＣＲＩＳＰＲノックアウトを生成した：１つはＳｉｇｌｅｃ－９のノックアウト、もう１つは、シアル酸生合成に必要な遺伝子であるＣＭＡＳのノックアウトである。ＣＭＡＳのノックアウト（ＫＯ）によりシアル酸欠乏マクロファージがもたらされ、それが上記効果を有効にするかどうかを決定するためにその評価を行った。ｐＳ９Ｌ－脂質はＣＭＡＳノックアウトマクロファージを強力に阻害し（図７、パネルＤ）、Ｓｉｇｌｅｃ－９のノックアウトはｐＳ９Ｌ－脂質の効果を無効にすることが見出された（図７、パネルＥ）。
【0078】
次に、ｐＳ９Ｌ－脂質と同じ足場に基づく少数の糖バリアントを試験した（図７、パネルＦ）。ｐＳ９Ｌ－脂質のみが食作用を有意に阻害することができたことが観察された。Ｓｉｇｌｅｃ－７結合ｐＳ７Ｌ脂質による阻害の傾向が観察されたが、これは統計学的に有意ではなかった。ＴＨＰ－１マクロファージは低いレベルでＳｉｇｌｅｃ－７を発現する。同じグリカン及び同様の分子量を有する可溶性トランス結合糖ポリペプチドのパネルもアッセイしたが、食作用に対する効果は観察されなかった。ｐＳ９Ｌ－脂質による阻害は糖ポリペプチドの前処理に用量依存的であり、ザイモサン真菌粒子を含む代替の標的でも観察することができることが決定された。
【0079】
シスリガンドでのＳｉｇｌｅｃのクラスター化による阻害の一般性を評価するために、ｐＳ７Ｌ－脂質による上記軽度の阻害について追加調査した。Ｓ７ＬシアロシドはＳｉｇｌｅｃ－７に対していくらかの親和性を有する一方で、これは、Ｐａｕｌｓｏｎと共同研究者らの発見によると、Ｓｉｇｌｅｃ－７／９のマウスオルソログであるＳｉｇｌｅｃ－Ｅに対する最も強力なリガンドであった。したがって、Ｓｉｇｌｅｃ－Ｅ発現細胞に対する阻害効果の可能性を評価した。実際に、ｐＳ７Ｌ－脂質で前処理したマウスミクログリアで阻害傾向が観察され（図７、パネルＧ）、これはＳｉｇｌｅｃ－ＥのＣＲＩＳＰＲノックアウトにより無効になった（図７、パネルＨ）。対照ポリマーと比較して、より強力で統計学的に有意な効果が観察された。
【0080】
これらの発見の臨床的関連性を実証するために、ヒト初代マクロファージを用いて同様のアッセイを行った。健常ドナー由来のＰＢＭＣから単球を単離し、休止（Ｍ０）、Ｍ１、又はＭ２マクロファージに分化させた。糖ペプチドで前処理した場合、６人のドナーのうち５人由来の、Ｍ２マクロファージではなくＭ０及びＭ１マクロファージの食作用活性が、ｐＳ９Ｌ－脂質での処理によって阻害されたが、対照ポリマーｐＳ９Ｌ－ｓｏｌ又はｐＬａｃ－脂質での処理では阻害されなかったことが観察された（図８、パネルＡ～Ｃ）。一人の非応答性ドナーのフォローアップにより、このドナー由来のマクロファージは劇的に低いレベルのＳｉｇｌｅｃ－９発現を有することが決定された（図８、パネルＤ）。
【0081】
実施例１～５のための方法
統計分析
全ての統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して行った。
統計分析
全ての統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６を使用して行った。
【0082】
糖ポリペプチド合成
糖ポリペプチドを、以前に記述されたように合成した（Ｄｅｌａｖｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｌｏｗ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓ．ＣｈｅｍＲｘｉｖ）。簡潔には、アラニン及びＯ－ラクトシルセリンのＮ－カルボキシ無水物を、事前に複合体化された開始剤を使用して重合して、脂質連結型又は可溶性の保護糖ポリペプチドを得た。ヒドラジンを使用してグリカンを脱アセチル化し、透析によって精製した。その後、ワンポットマルチ酵素系を使用してポリラクトシル足場を精巧に作り上げて、糖ポリペプチド足場上に様々なシアロシドを得た。その後、アルキンハンドルを有する非天然シアロシドをアジドと反応させて、前述の高親和性Ｓｉｇｌｅｃリガンドのポリマー提示を提供した。
糖ポリペプチドを、以前に記述されたように合成した（Ｄｅｌａｖｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｍｅｍｂｒａｎｅ－Ｔｅｔｈｅｒｅｄ Ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｓｌｏｗ Ｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｖｉｒｕｓ．ＣｈｅｍＲｘｉｖ）。簡潔には、アラニン及びＯ－ラクトシルセリンのＮ－カルボキシ無水物を、事前に複合体化された開始剤を使用して重合して、脂質連結型又は可溶性の保護糖ポリペプチドを得た。ヒドラジンを使用してグリカンを脱アセチル化し、透析によって精製した。その後、ワンポットマルチ酵素系を使用してポリラクトシル足場を精巧に作り上げて、糖ポリペプチド足場上に様々なシアロシドを得た。その後、アルキンハンドルを有する非天然シアロシドをアジドと反応させて、前述の高親和性Ｓｉｇｌｅｃリガンドのポリマー提示を提供した。
【0083】
ヒト細胞培養
細胞株を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＨＥＫＢｌｕｅ ｈＴＬＲ４、ＢＶ２）又はＲＰＭＩ（ＪＵＲＫＡＴ、ＴＨＰ－１）のいずれかで培養した。ＴＨＰ－１細胞には５０μＭのベータメルカプトエタノールを更に補充した。ＴＨＰ－１単球を、ＰＭＡで２４時間活性化し、その後、一般的な培地で２４時間回復させることによってマクロファージに分化した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離を使用して全血からのバフィーコート又はＬＲＳチャンバから単離した。組織培養プラスチックへの付着によって単球を単離し、外因性サイトカインを用いずに（Ｍ０）、ＧＭ－ＣＳＦを用いて（未成熟Ｍ１）、ＧＭ－ＣＳＦを用いて５日間、その後、１０％熱不活性化ＦＢＳ中ＬＰＳ及びＩＦＮ－γを用いて２日間（活性化Ｍ１）、又はＭ－ＣＳＦを用いて５日間、その後、１０％熱不活性化ＦＢＳ中ＩＬ－４及びＩＬ－１３を用いて２日間（Ｍ２）のいずれかで、２０％熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中で７日間単球をマクロファージに分化させた。
細胞株を、１０％熱不活化ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＨＥＫＢｌｕｅ ｈＴＬＲ４、ＢＶ２）又はＲＰＭＩ（ＪＵＲＫＡＴ、ＴＨＰ－１）のいずれかで培養した。ＴＨＰ－１細胞には５０μＭのベータメルカプトエタノールを更に補充した。ＴＨＰ－１単球を、ＰＭＡで２４時間活性化し、その後、一般的な培地で２４時間回復させることによってマクロファージに分化した。ＰＢＭＣは、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離を使用して全血からのバフィーコート又はＬＲＳチャンバから単離した。組織培養プラスチックへの付着によって単球を単離し、外因性サイトカインを用いずに（Ｍ０）、ＧＭ－ＣＳＦを用いて（未成熟Ｍ１）、ＧＭ－ＣＳＦを用いて５日間、その後、１０％熱不活性化ＦＢＳ中ＬＰＳ及びＩＦＮ－γを用いて２日間（活性化Ｍ１）、又はＭ－ＣＳＦを用いて５日間、その後、１０％熱不活性化ＦＢＳ中ＩＬ－４及びＩＬ－１３を用いて２日間（Ｍ２）のいずれかで、２０％熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地中で７日間単球をマクロファージに分化させた。
【0084】
インビトロタンパク質結合
ストレプトアビジンをコーティングしたチップ上にローディングされた、ＢＳＡ（０．１％）を伴うＰＢＳ中のビオチン化リガンド（２００ｎＭ）を使用して、ＯｃｔｅｔＲｅｄ９６において６０秒間タンパク質結合を記録した（約０．４ｎｍの応答）。その際、チップをＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃの段階希釈に浸漬して３０秒間会合させ、その後、緩衝液中で３０秒間解離させた。チップはグリシン緩衝液（ｐＨ１．５）での洗浄間で再生させた。
ストレプトアビジンをコーティングしたチップ上にローディングされた、ＢＳＡ（０．１％）を伴うＰＢＳ中のビオチン化リガンド（２００ｎＭ）を使用して、ＯｃｔｅｔＲｅｄ９６において６０秒間タンパク質結合を記録した（約０．４ｎｍの応答）。その際、チップをＳｉｇｌｅｃ－Ｆｃの段階希釈に浸漬して３０秒間会合させ、その後、緩衝液中で３０秒間解離させた。チップはグリシン緩衝液（ｐＨ１．５）での洗浄間で再生させた。
【0085】
フローサイトメトリー
細胞を回収し、１５分毎に穏やかに撹拌しながら無血清培地中１０７細胞／ｍＬの密度で１時間、フルオロフォアコンジュゲート糖ポリペプチドをロードした。その後、細胞を洗浄し、フルオロフォアコンジュゲート一次抗体、又はフルオロフォアコンジュゲート抗ＩｇＧ二次抗体を伴う非コンジュゲート一次抗体のいずれかで、４℃で染色し、染色後に３回洗浄した。全てのフロー分析は固定されていない細胞で行った。
細胞を回収し、１５分毎に穏やかに撹拌しながら無血清培地中１０７細胞／ｍＬの密度で１時間、フルオロフォアコンジュゲート糖ポリペプチドをロードした。その後、細胞を洗浄し、フルオロフォアコンジュゲート一次抗体、又はフルオロフォアコンジュゲート抗ＩｇＧ二次抗体を伴う非コンジュゲート一次抗体のいずれかで、４℃で染色し、染色後に３回洗浄した。全てのフロー分析は固定されていない細胞で行った。
【0086】
蛍光顕微鏡法
ＦＲＥＴデータを共焦点顕微鏡で収集した。Ｓｉｇｌｅｃ－７又はＳｉｇｌｅｃ－９を発現するＪＵＲＫＡＴを無血清ＲＰＭＩ中に１０７細胞／ｍＬで懸濁し、１５分毎に穏やかに撹拌しながらＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５標識糖ポリペプチド（２μＭ）で１時間標識した。細胞を洗浄し、その後、完全培地中、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗Ｓｉｇｌｅｃ－７又は抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体で、室温で３０分間標識した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、フィブロネクチンで事前にコーティングされた生細胞イメージング用８ウェルホウケイ酸ガラス＃１．５カバースリップ上にプレーティングした。その後、細胞を画像化した。Ｓｉｇｌｅｃ－９免疫細胞化学の場合、細胞を１０％ホルマリンで固定し、洗浄し、氷上で、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗Ｓｉｇｌｅｃ－９で１時間染色した。その後、細胞を洗浄し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅで４８８ｎｍの蛍光によって画像化し、１条件当たり３つのウェルで１ウェル毎に５つの画像を収集した。
ＦＲＥＴデータを共焦点顕微鏡で収集した。Ｓｉｇｌｅｃ－７又はＳｉｇｌｅｃ－９を発現するＪＵＲＫＡＴを無血清ＲＰＭＩ中に１０７細胞／ｍＬで懸濁し、１５分毎に穏やかに撹拌しながらＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５標識糖ポリペプチド（２μＭ）で１時間標識した。細胞を洗浄し、その後、完全培地中、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７標識抗Ｓｉｇｌｅｃ－７又は抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体で、室温で３０分間標識した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、フィブロネクチンで事前にコーティングされた生細胞イメージング用８ウェルホウケイ酸ガラス＃１．５カバースリップ上にプレーティングした。その後、細胞を画像化した。Ｓｉｇｌｅｃ－９免疫細胞化学の場合、細胞を１０％ホルマリンで固定し、洗浄し、氷上で、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗Ｓｉｇｌｅｃ－９で１時間染色した。その後、細胞を洗浄し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅで４８８ｎｍの蛍光によって画像化し、１条件当たり３つのウェルで１ウェル毎に５つの画像を収集した。
【0087】
クローニング
ＰｍＮａｎＡの発現プラスミドは、ＩＤＴ製のｇＢｌｏｃｋをＰＣＲ直鎖化ｐＥＴ２２ｂベクターにライゲーションすることによるＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングによって構築した。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、最適化ガイドを使用して構築し、Ｇｅｃｋｏプロトコルを使用してＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２プラスミドにクローニングし、ＭｉｒａＰｒｅｐによって精製した。ｐＣＭＶ Ｓｉｇｌｅｃ－９変異体は、Ｑ５変異誘発キットを使用して生成した。
ＰｍＮａｎＡの発現プラスミドは、ＩＤＴ製のｇＢｌｏｃｋをＰＣＲ直鎖化ｐＥＴ２２ｂベクターにライゲーションすることによるＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングによって構築した。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、最適化ガイドを使用して構築し、Ｇｅｃｋｏプロトコルを使用してＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ ｖ２プラスミドにクローニングし、ＭｉｒａＰｒｅｐによって精製した。ｐＣＭＶ Ｓｉｇｌｅｃ－９変異体は、Ｑ５変異誘発キットを使用して生成した。
【0088】
タンパク質の発現及び精製
ＰｍＮａｎＡ、Ｐｄ２６ＳＴ、及びＮｍＣＳＳをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、単離した。
ＰｍＮａｎＡ、Ｐｄ２６ＳＴ、及びＮｍＣＳＳをＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、単離した。
【0089】
ＨＥＫＢｌｕｅ ｈＴＬＲ４レポーターアッセイ
ＨＥＫＢｌｕｅ ｈＴＬＲ４アッセイは、概して、製造業者の指示に従って行った。細胞を、リポフェクタミンＬＴＸを使用してアッセイの２４時間前にトランスフェクトした。抗体でコーティングしたプレートのアッセイの場合、９６ウェルプレートをＰＢＳ中抗体溶液（１０ｎｇ／ｍＬ）と３７℃で２時間インキュベートすることによってプレートを調製し、その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、トランスフェクトした細胞をプレーティングした。糖ポリペプチドアッセイの場合、細胞をトランスフェクションプレートから回収し、遠心分離（３００ｒｃｆ、５分間）によってペレット化し、無血清ＤＭＥＭ中の糖ポリペプチドの溶液（１μＭ）に再懸濁した。細胞を１時間にわたって１５分毎に混合し、その時点で細胞を完全培地（１ｍＬ）で洗浄し、計数し、プレーティングした。
ＨＥＫＢｌｕｅ ｈＴＬＲ４アッセイは、概して、製造業者の指示に従って行った。細胞を、リポフェクタミンＬＴＸを使用してアッセイの２４時間前にトランスフェクトした。抗体でコーティングしたプレートのアッセイの場合、９６ウェルプレートをＰＢＳ中抗体溶液（１０ｎｇ／ｍＬ）と３７℃で２時間インキュベートすることによってプレートを調製し、その後、ＰＢＳで３回洗浄した後、トランスフェクトした細胞をプレーティングした。糖ポリペプチドアッセイの場合、細胞をトランスフェクションプレートから回収し、遠心分離（３００ｒｃｆ、５分間）によってペレット化し、無血清ＤＭＥＭ中の糖ポリペプチドの溶液（１μＭ）に再懸濁した。細胞を１時間にわたって１５分毎に混合し、その時点で細胞を完全培地（１ｍＬ）で洗浄し、計数し、プレーティングした。
【0090】
サイトカインビーズアッセイ
ＣＭＡＳ ＫＯ ＴＨＰ－１マクロファージを培養し、糖ポリペプチド（２００ｎＭ）で３時間標識した。この時点で、培地とビヒクル又はＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）のいずれかとを添加し、細胞を１８時間培養した。その後、培地のアリコートを採取し、－８０℃で急速冷凍させた。その後、ＢＤヒト炎症性サイトカインビーズによる定量化を、製造業者の指示に従って、１つのバッチにおいて３つの生物学的複製物から解凍した試料に対して行った。
ＣＭＡＳ ＫＯ ＴＨＰ－１マクロファージを培養し、糖ポリペプチド（２００ｎＭ）で３時間標識した。この時点で、培地とビヒクル又はＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）のいずれかとを添加し、細胞を１８時間培養した。その後、培地のアリコートを採取し、－８０℃で急速冷凍させた。その後、ＢＤヒト炎症性サイトカインビーズによる定量化を、製造業者の指示に従って、１つのバッチにおいて３つの生物学的複製物から解凍した試料に対して行った。
【0091】
ホスホプロテオミクス
ＣＭＡＳ ＫＯ ＴＨＰ－１マクロファージを培養し、無血清培地中糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で３時間標識した。この時点で、培地とビヒクル又はＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）のいずれかとを添加して、細胞を５分間刺激した。その後、細胞を、ベンゾナーゼを含む冷ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、遠心分離（１８０００ｒｃｆ、１５分間、４℃）によってペレット化し、上清タンパク質濃度をＲａｐｉｄ Ｇｏｌｄ ＢＣＡによって定量した。
ＣＭＡＳ ＫＯ ＴＨＰ－１マクロファージを培養し、無血清培地中糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で３時間標識した。この時点で、培地とビヒクル又はＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）のいずれかとを添加して、細胞を５分間刺激した。その後、細胞を、ベンゾナーゼを含む冷ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、遠心分離（１８０００ｒｃｆ、１５分間、４℃）によってペレット化し、上清タンパク質濃度をＲａｐｉｄ Ｇｏｌｄ ＢＣＡによって定量した。
【0092】
Ｓ－ｔｒａｐプロトコル（Ｐｒｏｔｉｆｉ）を使用してタンパク質をトリプシンペプチドに消化し、その後、１０－ｐｌｅｘ ＴＭＴ（Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｔａｇｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。リン酸化ペプチドをＴｉ（ＩＶ）－ＩＭＡＣビーズ（ＲｅＳｙｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で濃縮した。リン酸化ペプチド及びタンパク質存在量試料を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続したＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＰＬＣナノシステムを使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。トラップカラム（Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００ Ｃ１８、５ｕｍ粒子、長さ２０ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にペプチドをロードし、０．２％ギ酸を有する水（移動相Ａ）及び０．２％ギ酸を有するアセトニトリル（移動相Ｂ）を使用して、２５ｃｍのＥａｓｙＳｐｒａｙ逆相ＬＣカラム（内径７５μｍ、２μｍ、１００Å、ＰｅｐＭａｐ Ｃ１８粒子を装填、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分離した。全てのメソッドの合計取得時間は１分析当たり１８０分間であった。Ａｎｄｒｏｍｅｄａアルゴリズムを使用して生ファイルを検索し、ＭａｘＱｕａｎｔで処理した。その後、結果をＰｅｒｓｅｕｓで処理して、ホスホプロテオームにおける統計学的に有意な変化を計算した。データは、ＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してデータセット識別子ＰＸＤ０１８７７４でＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託した。
【0093】
ウエスタンブロット
ＣＭＡＳ ＫＯ ＴＨＰ－１マクロファージを培養し、無血清培地中糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で３時間標識した。この時点で、培地とビヒクル又はＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）のいずれかとを添加して細胞を６０分間刺激した。その後、細胞を、ベンゾナーゼを含む冷ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、遠心分離（１８０００ｒｃｆ、１５分間、４℃）によってペレット化し、上清タンパク質濃度をＢＣＡによって定量した。その後、溶解物を、ＸＴ－ＭＥＳ中で４～１２％ビスアクリルアミドゲルを使用して２００Ｖで１時間ＳＤＳ－ＰＡＧＥに泳動させた。標準ＴｕｒｂｏＢｌｏｔ条件を使用するＴｒａｎｓＢｌｏｔ Ｔｕｒｂｏを使用してゲルをニトロセルロースに移した。ブロットをＴＢＳ中５％ＢＳＡでブロックし、一次抗体で、４℃で一晩染色し、その後、ＩＲ色素標識二次抗体と室温で１時間インキュベートした。ブロットをＬｉＣＯＲによって画像化した。
ＣＭＡＳ ＫＯ ＴＨＰ－１マクロファージを培養し、無血清培地中糖ポリペプチド（５００ｎＭ）で３時間標識した。この時点で、培地とビヒクル又はＬＰＳ（１００ｐｇ／ｍＬ）のいずれかとを添加して細胞を６０分間刺激した。その後、細胞を、ベンゾナーゼを含む冷ＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させ、遠心分離（１８０００ｒｃｆ、１５分間、４℃）によってペレット化し、上清タンパク質濃度をＢＣＡによって定量した。その後、溶解物を、ＸＴ－ＭＥＳ中で４～１２％ビスアクリルアミドゲルを使用して２００Ｖで１時間ＳＤＳ－ＰＡＧＥに泳動させた。標準ＴｕｒｂｏＢｌｏｔ条件を使用するＴｒａｎｓＢｌｏｔ Ｔｕｒｂｏを使用してゲルをニトロセルロースに移した。ブロットをＴＢＳ中５％ＢＳＡでブロックし、一次抗体で、４℃で一晩染色し、その後、ＩＲ色素標識二次抗体と室温で１時間インキュベートした。ブロットをＬｉＣＯＲによって画像化した。
【0094】
食作用アッセイ
食細胞を、無血清培地中、糖ポリペプチドで３時間処理した。細胞を洗浄し、１００μＬの無血清培地でコーティングした。その後、１００μＬの無血清培地中の懸濁物として標的を添加した。プレートを短時間遠心分離して（３００ｒｃｆ、１分間）標的を沈降させ、その後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅでの蛍光顕微鏡法によって食作用を監視した。１条件当たり３つのウェルで１ウェル当たり５つの画像を収集した。ＢＶ２食作用の場合、ＢＶ２細胞を組換えエンドトキシンフリーV. choleraシアリダーゼで、２μＭにて１時間前処理した後に、糖ポリペプチドで処理した。
食細胞を、無血清培地中、糖ポリペプチドで３時間処理した。細胞を洗浄し、１００μＬの無血清培地でコーティングした。その後、１００μＬの無血清培地中の懸濁物として標的を添加した。プレートを短時間遠心分離して（３００ｒｃｆ、１分間）標的を沈降させ、その後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅでの蛍光顕微鏡法によって食作用を監視した。１条件当たり３つのウェルで１ウェル当たり５つの画像を収集した。ＢＶ２食作用の場合、ＢＶ２細胞を組換えエンドトキシンフリーV. choleraシアリダーゼで、２μＭにて１時間前処理した後に、糖ポリペプチドで処理した。
【0095】
実施例６ ― シス結合Ｓｉｇｌｅｃアゴニストは好中球の活性化を阻害する
ＴＬＲ－７／８アゴニストＲ８４８は、インビトロで初代好中球のＮＥＴｏｓｉｓを誘導する
好中球は、多数の自然免疫機能に関与する骨髄系統の免疫細胞である。好中球は、ＮＥＴｏｓｉｓと呼ばれる死滅過程を介してＣＯＶＩＤ－１９における過炎症性応答を誘導することが示唆されており、この過程では、好中球がクロマチンを迅速に脱凝縮し、ゲノムＤＮＡ、細胞内タンパク質（例えばヒストン）、及び組織損傷酵素（例えば、好中球エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ）のアマルガムである好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を吐き出す。細胞外ＤＮＡ及びＮＥＴ関連酵素による組織損傷は、他の免疫細胞への炎症誘発性シグナルとして作用し、ＣＯＶＩＤ－１９で過炎症性カスケードを開始させて、ＡＲＤＳおよび潜在的には死亡につながることが提唱されている。この仮説と一致して、ＮＥＴは感染部位（すなわち、肺組織）及び末梢（すなわち、血清及び血漿）の両方で広く観察されている。
ＴＬＲ－７／８アゴニストＲ８４８は、インビトロで初代好中球のＮＥＴｏｓｉｓを誘導する
好中球は、多数の自然免疫機能に関与する骨髄系統の免疫細胞である。好中球は、ＮＥＴｏｓｉｓと呼ばれる死滅過程を介してＣＯＶＩＤ－１９における過炎症性応答を誘導することが示唆されており、この過程では、好中球がクロマチンを迅速に脱凝縮し、ゲノムＤＮＡ、細胞内タンパク質（例えばヒストン）、及び組織損傷酵素（例えば、好中球エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ）のアマルガムである好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を吐き出す。細胞外ＤＮＡ及びＮＥＴ関連酵素による組織損傷は、他の免疫細胞への炎症誘発性シグナルとして作用し、ＣＯＶＩＤ－１９で過炎症性カスケードを開始させて、ＡＲＤＳおよび潜在的には死亡につながることが提唱されている。この仮説と一致して、ＮＥＴは感染部位（すなわち、肺組織）及び末梢（すなわち、血清及び血漿）の両方で広く観察されている。
【0096】
ＣＯＶＩＤ－１９では、広範なＮＥＴｏｓｉｓの証拠を感染した肺で観察することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンはインビトロで健常な好中球に感染してＮＥＴｏｓｉｓを誘導することが示されている。これらの報告は、ＴＬＲ－７及び／又はＴＬＲ－８を、感染部位での好中球のＮＥＴｏｓｉｓの誘導に関連付けている。注目すべきことに、ＴＬＲ－７及びＴＬＲ－８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムで多数の基質が同定されている一本鎖ＲＮＡ受容体である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がＴＬＲ－７／８媒介性免疫を誘導するという仮説と一致して、ＴＬＲ７におけるヒトの遺伝的バリエーションは重度のＣＯＶＩＤ－１９に関連している。したがって、ＴＬＲ－７／８のアゴニストは、生ウイルスを使用することなくインビトロでウイルス感染によって誘導される局所炎症をモデル化する便利な手段を提供し得る。
【0097】
新たに単離された好中球が蛍光発生性かつ膜不透過性のＤＮＡインターカレート色素（Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ）の存在下の低血清培地中で培養される生細胞イメージング技法を使用して、ＴＬＲアゴニストをアッセイした。ＮＥＴｏｓｉｓによるゲノムＤＮＡの外部化により、色素がインターカレートし、蛍光が増加する。以前に実証されたようにＮＥＴはアポトーシス細胞の核よりもはるかに大きいため、顕微鏡で観察された場合、ＮＥＴｏｔｉｃ細胞はアポトーシス細胞よりもはるかに大きい蛍光面積を生成する。したがって、大きい（すなわち、１００μｍ２超の）蛍光物体のみを計数することによってアポトーシス細胞は除外することができる。
【0098】
本研究では、ＴＬＲ－７／８アゴニストであるＲ８４８がインビトロで健常な好中球のＮＥＴｏｓｉｓを誘導するのに十分であることが見出された（図１０ａ～ｃ）。ＰＡＤＩ４基質Ｈ３のシトルリン化状態もウエスタンブロットによってアッセイし、Ｒ８４８が、Ｒ２、Ｒ８、及びＲ１７におけるシトルリン化を迅速に誘導することが観察された。シトルリン化はＮＥＴｏｓｉｓの重要な側面である一方で、例えばＰＭＡ誘導性ＮＥＴｏｓｉｓは控えめなシトルリン化しか生じないことから（データ示さず）、シトルリン化の程度は必ずしもＮＥＴｏｓｉｓの度合いを示すとは限らない。加えて、培地、ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）、又はＲ８４８で処理した好中球の溶解物を用いた定量的ホスホプロテオミクスも行った。Ｒ８４８又はＰＭＡのいずれかで刺激した好中球を使用して、以前に公開されたデータセットと同様の結果が観察された。更に、好中球の脱顆粒及びカルシウムの流動に関与するものを含め、いくつかのホスホサイトが両方のデータセットで差次的に調節されていることが見出され、これは、記述されたＮＥＴｏｔｉｃ細胞死のメカニズムと一致している。これらの結果は、ＴＬＲ－７／８アゴニストであるＲ８４８が初代好中球においてＮＥＴｏｓｉｓを誘導することを示している。したがって、この化合物を使用して、ＣＯＶＩＤ－１９を含むウイルス感染に関連する局所炎症をモデル化することができる。
【0099】
Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニストは、ＳＨＰ－１を介してＴＬＲ－７／８誘導性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害する
先の研究では、Ｓｉｇｌｅｃ－９の係合がアポトーシス死及び非アポトーシス死経路並びに好中球の免疫抑制につながることを示した。したがって、Ｓｉｇｌｅｃ－９媒介性の免疫抑制及び細胞死が優先して抗ウイルスＴＬＲシグナル伝達のＮＥＴｏｔｉｃ効果を無効にすること（override）ができると仮定した。この概念を検証するために、Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニストであるｐＳ９Ｌ、並びに２つの対照糖ポリペプチドｐＬａｃ及びｐＳ９Ｌ－ｓｏｌを使用した（図９）。上記の生細胞アッセイにおける初代好中球において糖ポリペプチド（５００ｎＭ）とＲ８４８（１０μＭ）の共処理によって抗ＮＥＴｏｔｉｃ活性をアッセイした（図１０）。ｐＳ９Ｌは、Ｒ８４８処理によって誘導されるＮＥＴｏｓｉｓを阻害するのに十分であることが観察された（図１０ａ～ｃ）。更に、いずれの対照ポリマーもＲ８４８誘導性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害しなかった（図１０ｄ）。ｐＳ９Ｌは、高濃度の架橋抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体（クローン１９１２４０）と同等にＮＥＴｏｓｉｓを阻害することも確認された。ミトコンドリア由来の反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成がＳｉｇｌｅｃ－９誘導性アポトーシスシグナル伝達の重要なシグナル伝達ステップとして以前に説明されている。炎症性シグナル伝達におけるＮＡＤＰＨ由来のＲＯＳを回避するためにあらゆるＴＬＲリガンドの不在下で、ｐＳ９Ｌでの処理は、架橋抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体で処理した場合と同様に、酸化的破壊を誘導したことがここで見出された。更に、この酸化的破壊はＳＨＰ－１／２阻害剤ＮＳＣ－８７８７７の添加によって阻害され、Ｓｉｇｌｅｃ－９係合と合致してＳＨＰ－１及び／又はＳＨＰ－２が好中球におけるｐＳ９Ｌ誘導性酸化的破壊を媒介することが示唆された。
先の研究では、Ｓｉｇｌｅｃ－９の係合がアポトーシス死及び非アポトーシス死経路並びに好中球の免疫抑制につながることを示した。したがって、Ｓｉｇｌｅｃ－９媒介性の免疫抑制及び細胞死が優先して抗ウイルスＴＬＲシグナル伝達のＮＥＴｏｔｉｃ効果を無効にすること（override）ができると仮定した。この概念を検証するために、Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニストであるｐＳ９Ｌ、並びに２つの対照糖ポリペプチドｐＬａｃ及びｐＳ９Ｌ－ｓｏｌを使用した（図９）。上記の生細胞アッセイにおける初代好中球において糖ポリペプチド（５００ｎＭ）とＲ８４８（１０μＭ）の共処理によって抗ＮＥＴｏｔｉｃ活性をアッセイした（図１０）。ｐＳ９Ｌは、Ｒ８４８処理によって誘導されるＮＥＴｏｓｉｓを阻害するのに十分であることが観察された（図１０ａ～ｃ）。更に、いずれの対照ポリマーもＲ８４８誘導性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害しなかった（図１０ｄ）。ｐＳ９Ｌは、高濃度の架橋抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体（クローン１９１２４０）と同等にＮＥＴｏｓｉｓを阻害することも確認された。ミトコンドリア由来の反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成がＳｉｇｌｅｃ－９誘導性アポトーシスシグナル伝達の重要なシグナル伝達ステップとして以前に説明されている。炎症性シグナル伝達におけるＮＡＤＰＨ由来のＲＯＳを回避するためにあらゆるＴＬＲリガンドの不在下で、ｐＳ９Ｌでの処理は、架橋抗Ｓｉｇｌｅｃ－９抗体で処理した場合と同様に、酸化的破壊を誘導したことがここで見出された。更に、この酸化的破壊はＳＨＰ－１／２阻害剤ＮＳＣ－８７８７７の添加によって阻害され、Ｓｉｇｌｅｃ－９係合と合致してＳＨＰ－１及び／又はＳＨＰ－２が好中球におけるｐＳ９Ｌ誘導性酸化的破壊を媒介することが示唆された。
【0100】
ビヒクル、ｐＳ９Ｌ、又はｐＬａｃで共処理したＲ８４８刺激初代好中球の溶解物を使用して、定量的ホスホプロテオミクスを行った。注目すべきことに、ＮＥＴｏｓｉｓの媒介に関与するシグナル伝達分子のクラスであるホスホイノシチドのリン酸化における重要な構成要素であるヒチン（ＨＹＣＣＩ／ＦＡＭ１２６Ａ）のリン酸化の増加が観察された。加えて、ＭＡＰＫシグナル伝達経路の負の調節因子であるＲＡＳＡＬ３（ＲＡＳＬ３）のリン酸化の増加が観察された。これらのデータは、ｐＳ９Ｌが、ＮＥＴｏｓｉｓに必要なカルシウム流動及びＮＡＤＰＨ活性、並びにマクロファージでのｐＳ９Ｌについて先に記述されたＭＡＰＫ抑制効果を阻害することを示唆する。
【0101】
ｐＳ９Ｌの抗ＮＥＴｏｔｉｃ効果がＳｉｇｌｅｃ－９シグナル伝達によって特異的に媒介されるかを決定するために、これらの結果を前骨髄球性白血病細胞株ＨＬ－６０で再現した。これらの細胞は、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ、１００ｎＭ）及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、１．２５％（ｖ／ｖ））を使用して好中球様細胞（ｄＨＬ－６０）に分化させることができる。注目すべきことに、ｄＨＬ－６０細胞はインビトロでＮＥＴｏｓｉｓを研究するために以前に使用されている。先の報告と一致して、Ｒ８４８はｄＨＬ－６０細胞でＮＥＴｏｓｉｓを誘導した。ｐＳ９ＬはＮＥＴｏｓｉｓを阻害し、Ｓｉｇｌｅｃ－９（ＳＩＧＬＥＣ９によってコードされる）又はＳＨＰ－１（ＰＴＰＮ６によってコードされる）のｓｉＲＮＡノックダウンがｐＳ９Ｌの該効果を無効にすることが更に観察された（図１０ｅ）。したがって、Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニストであるｐＳ９Ｌは、Ｓｉｇｌｅｃ－９及びＳＨＰ－１を介してＴＬＲ７／８誘導性ＮＥＴｏｓｉｓを阻害する。
【0102】
Ｓｉｇｌｅｃ－９は重度のＣＯＶＩＤ－１９においてアップレギュレートされ、ＣＯＶＩＤ－１９血漿によって誘導されるＮＥＴｏｓｉｓを抑制することができる
ＣＯＶＩＤ－１９患者由来の血清及び血漿が、健常ドナーから単離した好中球のＮＥＴｏｓｉｓをインビトロで誘導することが示されている。原因となる成分は不明であるが、潜在的な因子には、ウイルスＴＬＲリガンド、ＴＬＲに結合する損傷関連分子パターン、活性化血小板、及び炎症（誘発）性サイトカインが含まれる。最近の報告では、ＣＯＶＩＤ－１９血漿中の好中球活性化サイトカイン、主にＩＬ－８及びＧ－ＣＳＦのレベルの増加が報告されている。ＩＬ－８とＧ－ＣＳＦとの組み合わせがインビトロでＮＥＴｏｓｉｓを誘導するのに十分であったことも本研究で観察された。加えて、ＣＯＶＩＤ－１９患者における末梢骨髄細胞及び好中球のトランスクリプトーム解析により、ＳＩＧＬＥＣ９発現（図１１ａ）及びＰＡＤＩ４発現（図１１ｂ）の増加が明らかになった。これは、疲弊した腫瘍浸潤Ｔ細胞上のＳｉｇｌｅｃ－９で観察されたものと同様に、過剰ＮＥＴｏｔｉｃ好中球上でＳｉｇｌｅｃ－９発現が誘導される疲弊様表現型であるという仮説が得られた。これらの観察結果は、Ｓｉｇｌｅｃ－９が、一般的に、そして特にＣＯＶＩＤ－１９において、過炎症性ＮＥＴｏｓｉｓの治療的遮断のための魅力的な標的であることを更に支持している。
ＣＯＶＩＤ－１９患者由来の血清及び血漿が、健常ドナーから単離した好中球のＮＥＴｏｓｉｓをインビトロで誘導することが示されている。原因となる成分は不明であるが、潜在的な因子には、ウイルスＴＬＲリガンド、ＴＬＲに結合する損傷関連分子パターン、活性化血小板、及び炎症（誘発）性サイトカインが含まれる。最近の報告では、ＣＯＶＩＤ－１９血漿中の好中球活性化サイトカイン、主にＩＬ－８及びＧ－ＣＳＦのレベルの増加が報告されている。ＩＬ－８とＧ－ＣＳＦとの組み合わせがインビトロでＮＥＴｏｓｉｓを誘導するのに十分であったことも本研究で観察された。加えて、ＣＯＶＩＤ－１９患者における末梢骨髄細胞及び好中球のトランスクリプトーム解析により、ＳＩＧＬＥＣ９発現（図１１ａ）及びＰＡＤＩ４発現（図１１ｂ）の増加が明らかになった。これは、疲弊した腫瘍浸潤Ｔ細胞上のＳｉｇｌｅｃ－９で観察されたものと同様に、過剰ＮＥＴｏｔｉｃ好中球上でＳｉｇｌｅｃ－９発現が誘導される疲弊様表現型であるという仮説が得られた。これらの観察結果は、Ｓｉｇｌｅｃ－９が、一般的に、そして特にＣＯＶＩＤ－１９において、過炎症性ＮＥＴｏｓｉｓの治療的遮断のための魅力的な標的であることを更に支持している。
【0103】
ｐＳ９ＬがＣＯＶＩＤ－１９血漿によって誘導されるＮＥＴｏｓｉｓを阻害することができるという仮説を検証するために、健常ドナーの全血から単離した好中球を、健常ドナー又はＣＯＶＩＤ－１９患者由来のクエン酸抗凝固処理した異種（heterologous）血漿で処理した。未希釈の血漿中の好中球を、ｐＳ９Ｌ（５００ｎＭ）、非結合類似体ｐＬａｃ（５００ｎＭ）、又はビヒクルで共処理した。バイオセーフティー規制を満たすために、細胞をＣＯＶＩＤ－１９血漿の存在下で４時間インキュベートし、固定した後に、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）とＤＮＡ（ＤＡＰＩ）との細胞外複合体をアッセイした（図１１ｃ、１１ｄ）。細胞外で観察された場合にＮＥＴｏｓｉｓを示すこれらの染色の組み合わせは、ＣＯＶＩＤ－１９との関連でＮＥＴ＋細胞を特定するために以前に使用されている。本研究では、ウェブ様ＮＥＴ構造の形成によって示されるように、ＣＯＶＩＤ－１９血漿が健常ドナー由来の好中球のＮＥＴｏｓｉｓを誘導することが観察された（図１１ｄ）。Ｒ８４８を用いた先の実験と同様に、ＣＯＶＩＤ－１９血漿で刺激したＮＥＴｏｓｉｓはｐＳ９Ｌ処理によって阻害された（図１１ｃ、１１ｄ）。更に、ｐＬａｃはＣＯＶＩＤ－１９血漿によって誘導されるＮＥＴｏｓｉｓを阻害せず、ｐＳ９ＬもｐＬａｃもインビトロ培養好中球の基礎（basal）ＮＥＴｏｓｉｓに影響を及ぼさなかった（図１１ｃ）。ＮＥＴの別のマーカーである細胞外Ｈ１／ＤＮＡ複合体について、ＩＭＤＭ中１０％血漿又は未希釈血漿で処理した好中球を染色することによって同様の実験を行い、匹敵する結果が観察された。
【0104】
まとめると、これらのデータは、Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニズムがＣＯＶＩＤ－１９患者血漿によって誘導されるＮＥＴｏｓｉｓを阻害し、それ故に、ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の末梢炎症を抑制することができることを示す。加えて、Ｓｉｇｌｅｃ－９アゴニストは、ＣＯＶＩＤ－１９並びに免疫血栓症及び敗血症などの他の状況で観察されるものを含め、概してＮＥＴ関連病理を解決し得る。
【0105】
したがって、前述の内容は、単に本開示の原理を例証するものである。当業者であれば、本明細書に明示的に記載も図示もされていないが、本発明の原理を具現化し、かつその趣旨及び範囲内に含まれる様々な構成を工夫することができるであろうことを理解されたい。更に、本明細書に列挙される全ての例及び条件的文言は、主に本発明の原理及び当該技術分野の推進のために発明者らにより寄与された概念を理解する際に読者の助けとなるよう意図されており、かかる具体的に列挙される例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにそれらの具体的な例を列挙する本明細書における全ての記述は、それらの構造的等価物及び機能的等価物の両方を包含するよう意図されている。加えて、かかる等価物が、現在既知の等価物及び将来開発される等価物、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たす開発されるあらゆる要素の両方を含むよう意図されている。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示され記載されている例示的な実施形態に限定されるようには意図されていない。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【国際調査報告】