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特表2023-532108Ｔ細胞抗原受容体、その多量体複合体、その調製方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-26
(54)【発明の名称】Ｔ細胞抗原受容体、その多量体複合体、その調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230719BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230719BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230719BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230719BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230719BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230719BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230719BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20230719BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230719BHJP
C07K 14/73 20060101ALI20230719BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230719BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230719BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20230719BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20230719BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20230719BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20230719BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230719BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C07K16/08
C07K14/725
C07K14/73
C12P21/02 C
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P37/02
G01N33/569 L
G01N33/574 D
G01N33/574 Z
C12N5/078
C12P21/08
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022581319
(86)(22)【出願日】2021-06-29
(85)【翻訳文提出日】2022-12-27
(86)【国際出願番号】 CN2021102954
(87)【国際公開番号】W WO2022002014
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】202010632672.X
(32)【優先日】2020-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522435300
【氏名又は名称】華夏英泰（北京）生物技術有限公司
(71)【出願人】
【識別番号】502192546
【氏名又は名称】清華大学
【氏名又は名称原語表記】Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【住所又は居所原語表記】Ｔｓｉｎｇｈｕａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】陳花
(72)【発明者】
【氏名】劉光娜
(72)【発明者】
【氏名】雷蕾
(72)【発明者】
【氏名】劉芳
(72)【発明者】
【氏名】賈楽梅
(72)【発明者】
【氏名】黄道盛
(72)【発明者】
【氏名】趙学強
(72)【発明者】
【氏名】林欣
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA88X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085BB31
4C085CC22
4C085DD61
4C085EE01
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
Ｔ細胞抗原受容体、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現する免疫細胞、並びにその調製方法及び使用を提供する。本発明に記載のＴＣＲはウイルス抗原ペプチド提示細胞によって特異的に活性化され、細胞外サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ２の放出レベル及び乳酸デヒドロゲナーゼの放出量を向上させ、しかも標的細胞を有意に殺傷することができる。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～３３より選択される１つ又は２つ以上の組み合わせであることを特徴とするＣＭＶ ｐｐ６５に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）。
【請求項2】
前記ＣＤＲはＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含み、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１に記載のＣＤＲ。
【請求項3】
以下より選択されるいずれか１群であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＣＤＲ。
【請求項4】
ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、及び／又はＣＤＲ３αを含み、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とするＣＭＶ ｐｐ６５に結合するα鎖ポリペプチド。
【請求項5】
ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３αのいずれか１群を含むことを特徴とする請求項４に記載のα鎖ポリペプチド。
【請求項6】
ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及び／又はＣＤＲ３βを含み、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とするＣＭＶ ｐｐ６５に結合するβ鎖ポリペプチド。
【請求項7】
ＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βの以下のいずれか１群を含むことを特徴とする請求項６に記載のβ鎖ポリペプチド。
【請求項8】
ＣＭＶ ｐｐ６５に特異的に結合し、重鎖のＣＤＲ Ｈ１～ＣＤＲ Ｈ３及び／又は軽鎖のＣＤＲ Ｌ１～ＣＤＲ Ｌ３を含み、ＣＤＲ Ｈ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｌ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
【請求項9】
ＣＤＲ Ｈ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｈ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｌ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｌ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項８に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項10】
ＣＭＶ ｐｐ６５の結合エピトープはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ、２つ又は３つの組み合わせを含むことを特徴とする請求項８又は９に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項11】
前記ＣＤＲ Ｈ１～ＣＤＲ Ｈ３及びＣＤＲ Ｌ１～ＣＤＲ Ｌ３は以下より選択されるいずれか１群であることを特徴とする請求項８～１０のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項12】
軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項８～１１のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項13】
重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項８～１２のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項14】
単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体ｓｃＦｖであることを特徴とする請求項８～１３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項15】
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項８～１４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項16】
ＣＭＶ ｐｐ６５に特異的に結合し、α鎖のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はβ鎖のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含み、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とするＴ細胞抗原受容体。
【請求項17】
ＣＤＲ１αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１６に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項18】
ＣＭＶ ｐｐ６５の結合エピトープはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ、２つ又は３つの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１６～１７のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項19】
前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βは以下のいずれか１群を含むことを特徴とする請求項１６～１８のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項20】
β鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１６～１９のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項21】
そのα鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１６～２０のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項22】
α鎖とβ鎖のアミノ酸は直接連結又は間接的に連結され、好ましくは間接的に連結され、より好ましくはｆｐ２Ａを介して連結されることを特徴とする請求項１６～２１のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項23】
アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１６～２２のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項24】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲをコードする核酸。
【請求項25】
請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体のβ鎖又は請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項26】
配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０～２６５のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０～２６５のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項２５に記載の核酸。
【請求項27】
請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体のα鎖又は請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項28】
配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６～２７１のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６～２７１のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項２７に記載の核酸。
【請求項29】
請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体又は請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項30】
配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項２９に記載の核酸。
【請求項31】
請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項32】
請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸又は請求項３１に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項33】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を発現することを特徴とする免疫細胞。
【請求項34】
１つ又は複数の請求項２４～３０のいずれか１項に記載の異種核酸配列を含むことを特徴とする請求項３３に記載の免疫細胞。
【請求項35】
Ｔ細胞又は幹細胞より選択されることを特徴とする請求項３３又は３４に記載の免疫細胞。
【請求項36】
被検者のＴ細胞から単離されることを特徴とする請求項３３～３５のいずれか１項に記載の免疫細胞。
【請求項37】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体をコードする核酸配列を免疫細胞にトランスフェクションして発現させることで、免疫細胞を得るステップを含むことを特徴とする免疫細胞の調製方法。
【請求項38】
細胞の内因性ＴＣＲをノックダウンするステップをさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の調製方法。
【請求項39】
陽性Ｔ細胞をクローニングして請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ１）と、初代Ｔ細胞を単離して培養するステップ２）と、
ステップ１）で得た核酸をステップ２）の前記初代Ｔ細胞に送達し、請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を発現した組換えＴ細胞を得るステップ３）と、を含むことを特徴とする組換えＴ細胞の調製方法。
【請求項40】
陽性Ｔ細胞をクローニングして請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ（１）と、ステップ（１）で得た核酸をベクター骨格に連結し、発現ベクターを取得するステップ（２）と、
ステップ（２）で得た発現ベクターを宿主細胞に形質転換した後、その発現を誘導するステップ（３）と、
Ｔ細胞抗原受容体を取得するステップ（４）と、を含むことを特徴とするＴ細胞抗原受容体の調製方法。
【請求項41】
請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を含むことを特徴とする多量体複合体。
【請求項42】
単量体、ビオチン分子、及びストレプトアビジン分子又はアビジン分子をさらに含み、前記単量体はＭＨＣ分子α鎖細胞外領域とβ２ｍ鎖及び抗原ペプチドを含み、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジン分子に結合されることを特徴とする請求項４１に記載の多量体複合体。
【請求項43】
前記抗原ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含むことを特徴とする請求項４２に記載の多量体複合体。
【請求項44】
前記ＭＨＣ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２及びＨＬＡ－Ａ＊１１０１より選択されることを特徴とする請求項４２又は４３に記載の多量体複合体。
【請求項45】
Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、抗原ペプチド、ステップＩ）で得たβ２ｍ鎖とＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域を復元してフォールディングして、単量体を調製するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で調製した単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を取得するステップＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得たビオチン化単量体を蛍光標識付きストレプトアビジン又はアビジンと反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体を調製するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得た抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体をＴ細胞と共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体の複合体を形成するステップＶ）と、を含むことを特徴とする請求項４１～４４のいずれか１項に記載の多量体複合体の調製方法。
【請求項46】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸、請求項３１に記載の発現ベクター、請求項３２に記載の宿主細胞、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の免疫細胞、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の多量体複合体の、腫瘍又はＣＭＶ関連疾患を診断又は治療する製品の調製における使用。
【請求項47】
請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲ、請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸、請求項３１に記載の発現ベクター、請求項３２に記載の宿主細胞、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の免疫細胞、請求項４１～４４のいずれか１項に記載の多量体複合体の、Ｔ細胞標識、検出、細胞選別又は活性化における使用。
【請求項48】
ｉ）請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲ、ｉｉ）請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、
ｉｉｉ）請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、
ｉｖ）請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、
ｖ）請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、
ｖｉ）請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸、
ｖｉｉ）請求項３１に記載の発現ベクター、
ｖｉｉｉ）請求項３２に記載の宿主細胞、
ｉｘ）請求項３３～３６のいずれか１項に記載の免疫細胞、又は
ｘ）請求項４１～４４のいずれか１項に記載の多量体複合体のうちのいずれか１群を含む医薬組成物。
【請求項49】
ｉ）請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＤＲ、ｉｉ）請求項４～５のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、
ｉｉｉ）請求項６～７のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、
ｉｖ）請求項８～１５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、
ｖ）請求項１６～２３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、
ｖｉ）請求項２４～３０のいずれか１項に記載の核酸、
ｖｉｉ）請求項３１に記載の発現ベクター、
ｖｉｉｉ）請求項３２に記載の宿主細胞、
ｉｘ）請求項３３～３６のいずれか１項に記載の免疫細胞、又は
ｘ）請求項４１～４４のいずれか１項に記載の多量体複合体のうちのいずれか１群を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＣＭＶ ｐｐ６５を認識可能なＴ細胞抗原受容体の技術分野に関し、具体的には、複数種類のＴＣＲ及びＣＭＶ関連疾患の治療及び／又は予防におけるこれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ：Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）は免疫系の細胞免疫機能に不可欠であり、ＴＣＲは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）上で提示された特異的抗原ペプチドの唯一の受容体であり、抗原特異的ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の結合によりＴ細胞と抗原提示細胞との直接的な物理的接触、相互作用を誘発し、後続の一連の細胞シグナル伝達とその他の生理的反応を引き起こし、それによって、異なる抗原特異的Ｔ細胞がその標的細胞に対して免疫効果を発揮するようにする。
【0003】
ＣＮ１０７８２７９５９Ａは、抗原特異的Ｔ細胞を単離する方法、及び抗原特異的Ｔ細胞において抗原特異的ＴＣＲをコードする遺伝子をクローニングする方法を開示する。このＴＣＲは、ＨＢＶＳ１８３－９１抗原短ペプチド複合体ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ－ＨＬＡ＊Ａ０２０１に結合することができ、また、本発明のＴＣＲが形質導入された細胞は、特異的に活性化され、標的細胞に対して強い殺傷効果を有する。ＣＮ１０６２７９４０４Ａは、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を含む、可溶でかつ安定的なヘテロ二量化ＴＣＲを開示し、このＴＣＲは可溶でかつ安定的であり、良好に復元され、フォールディングされ、精製されると同時に、原配位子と特異的に結合することができる。しかし、上記特許はいずれもサイトメガロウイルスに対する特異的ＴＣＲを開示していない。
【0004】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｃｉｒｕｓ）はヘルペスウイルス群ＤＮＡウイルスの一種であり、細胞封入体ウイルスとも呼ばれる。サイトメガロウイルスは分布が広く、集団で感染が非常に一般的であり、中国では成人の感染率は９５％以上に達し、通常は陰性感染を呈し、多数の感染者は臨床症状がないが、一定の条件下で複数の器官と系統を侵襲すると炎症疾患を引き起こす可能性がある。ＣＮ１０２６５６１８８Ａは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を介して提示されたときにアミノ酸配列ＮＬＶＰＭＶＡＴＶを有するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５由来のペプチドに特異的に結合する、サイトメガロウイルス由来の抗原を認識することができるＴ細胞受容体を開示する。しかし、この出願では、Ｔ細胞受容体の標的細胞に対する殺傷作用は明らかではない。
【0005】
このため、本発明は、ウイルス抗原ペプチド提示細胞によって特異的に活性化され、細胞外サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ２の放出レベル及び乳酸デヒドロゲナーゼの放出量を増加させ、しかも標的細胞を有意に殺傷することができるＴ細胞抗原受容体を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されるアミノ酸配列を含む、ＭＨＣ分子によって提示されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５抗原ペプチドに特異的に結合する複数のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を提供する。本発明に記載のＴＣＲは、対応するＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド－ＭＨＣ分子複合体を特異的に認識し、ＴＣＲ Ｔ細胞を活性化し、高レベルのサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ２、ＴＮＦαを生成することができ、インビボ試験及びインビトロ試験のいずれにおいても腫瘍細胞を有意に殺傷する。具体的には、以下の通りである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～３３より選択される１つ又は２つ以上の組み合わせである、ＣＭＶ ｐｐ６５に結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を提供する。
【0008】
好ましくは、前記ＣＤＲはＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含む。ＣＤＲ１αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0009】
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＣＤＲは以下より選択されるいずれか１群である。
【0010】
本発明の第２態様は、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、及び／又はＣＤＲ３αを含むＣＭＶ ｐｐ６５に結合するα鎖ポリペプチドを提供する。ＣＤＲ１αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0011】
本発明の１つの特定実施形態では、前記α鎖ポリペプチドは以下のいずれか１群のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３αを含む。
【0012】
本発明の第３態様は、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及び／又はＣＤＲ３βを含むＣＭＶ ｐｐ６５に結合するβ鎖ポリペプチドを提供する。ＣＤＲ１βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0013】
好ましくは、前記β鎖ポリペプチドは以下のいずれか１群のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含む。
【0014】
本発明の第４態様は、ＣＭＶ ｐｐ６５に特異的に結合するＴ細胞抗原受容体を提供する。
【0015】
好ましくは、ＣＭＶ ｐｐ６５の結合エピトープはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ、２つ又は３つの組み合わせを含む。
【0016】
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体は主要組織適合性複合体分子（ＭＨＣ）を介して提示され、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５由来の抗原ペプチドに特異的に結合する。
【0017】
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体は少なくとも１つのα鎖可変領域及び／又はβ鎖可変領域を含む。
【0018】
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体はαβヘテロ二量体である。
【0019】
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体はα鎖のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３αとβ鎖のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含む。
【0020】
さらに好ましくは、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0021】
さらに好ましくは、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0022】
さらに好ましくは、ＣＤＲ１αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0023】
さらに好ましくは、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0024】
さらに好ましくは、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0025】
さらに好ましくは、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0026】
よりさらに好ましくは、前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βは以下のいずれか１群を含む。
【0027】
本発明の１つの特定実施形態では、そのβ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のうちのいずれか１つ又ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0028】
本発明の１つの特定実施形態では、そのα鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0029】
好ましくは、そのα鎖とβ鎖のアミノ酸は直接連結又は間接的に連結され、好ましくは間接的に連結され、より好ましくはｆｐ２Ａ（ｆｕｒｉｎ－ＳＧＳＧ－ｐ２Ａ）を介して連結される。
【0030】
さらに好ましくは、前記ｆｐ２Ａのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５９を含む。
【0031】
本発明の１つの特定実施形態では、前記α鎖とβ鎖の連結順はα鎖、ｆｐ２Ａ及びβ鎖、又は、β鎖、ｆｐ２Ａ及びα鎖であってもよい。
【0032】
本発明の１つの特定実施形態では、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0033】
本発明の第５態様は、ＣＭＶ ｐｐ６５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【0034】
好ましくは、前記ＣＭＶ ｐｐ６５の結合エピトープはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ、２つ又は３つの組み合わせを含む。
【0035】
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は重鎖のＣＤＲ Ｈ１～ＣＤＲ Ｈ３及び／又は軽鎖のＣＤＲ Ｌ１～ＣＤＲ Ｌ３を含む。
【0036】
また、さらに好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片の軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0037】
また、さらに好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0038】
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体ｓｃＦｖである。
【0039】
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片の重鎖と軽鎖のアミノ酸は直接連結又は間接的に連結され、好ましくは間接的に連結され、より好ましくはｐ２Ａを介して連結される。
【0040】
さらに好ましくは、前記ｐ２Ａは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５９を含むｆｐ２Ａである。
【0041】
本発明の１つの特定実施形態では、前記重鎖と軽鎖の連結順は、重鎖、ｆｐ２Ａ及び軽鎖、又は、軽鎖、ｆｐ２Ａ及び重鎖であってもよい。
【0042】
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体、二重抗体（ｄＡｂ）又は線状抗体の断片を含んでもよい。
【0043】
本発明の１つの特定実施形態では、前記抗体又はその抗原結合断片のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0044】
本発明の第６態様は、上記ＣＤＲをコードする核酸を提供する。
【0045】
本発明の第７態様は、本発明に記載のＴ細胞抗原受容体のβ鎖又は上記のβ鎖ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【0046】
好ましくは、Ｔ細胞抗原受容体のβ鎖をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０～２６５のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０～２６５のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0047】
本発明の第８態様は、本発明に記載のＴ細胞抗原受容体のα鎖又は上記のα鎖ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【0048】
好ましくは、Ｔ細胞抗原受容体のα鎖をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６～２７１のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６～２７１のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0049】
本発明の第９態様は、本発明に記載のＴ細胞抗原受容体又は抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
【0050】
好ましくは、前記Ｔ細胞抗原受容体をコードするα鎖とβ鎖はｆｐ２Ａをコードする核酸配列を介して連結される。さらに好ましくは、前記ｆｐ２Ａをコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７２を含む。
【0051】
好ましくは、Ｔ細胞抗原受容体をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0052】
好ましくは、抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
【0053】
本発明に記載の核酸配列は一本鎖又は二本鎖であってもよく、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
【0054】
好ましくは、前記核酸配列はコドンによって最適化されていてもよい。さらに好ましくは、前記コドン最適化はウイルスなどに使用される大量の希少コドンを対応する哺乳動物のコドンに変更すること、及び／又はｍＲＮＡ不安定モチーフ及び／又は隠れスプライシング部位を移除することを含む。
【0055】
本発明の第１０態様は、本発明のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクターを提供する。
【0056】
好ましくは、前記発現ベクターはインビボ、インビトロ又はエクスビボの条件下で発現し得る。さらに好ましくは、前記発現ベクターはインビボ細胞において高レベルで持続的に発現している。
【0057】
好ましくは、前記発現ベクターは原核発現ベクター又は逆転写ウイルスベクターであってもよい。
【0058】
さらに好ましくは、前記原核発現ベクターは大腸菌系列である。本発明の１つの特定実施形態では、前記発現ベクターはｐＥＴ－２６ｂ又はｐＥＴ２８ａ＋である。
【0059】
さらに好ましくは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネズミ科白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ｆｕｊｉｎａｍｉ肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、ＦＢＲネズミ骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ－ＭＬＶ）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎネズミ白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、ニワトリ骨髄細胞増殖ウイルス２９（ＭＣ２９）又はニワトリ骨髄赤血球増多症ウイルス（ＡＥＶ）などであってもよい。よりさらに好ましくは、前記発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである。
【0060】
本発明の１つの特定実施形態では、前記発現ベクターはｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰである。
【0061】
さらに好ましくは、前記発現ベクターのβ鎖、α鎖が骨格ベクターに連結する順はプロモータ、β鎖、ｆｐ２Ａ、α鎖、ＩＲＥＳ及びＲＦＰ配列である。
【0062】
本発明の第１１態様は、本発明のいずれか１項に記載の核酸又は発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0063】
好ましくは、前記宿主細胞は真核細胞又は原核細胞であってもよい。より好ましくは、前記宿主細胞は酵母細胞、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、大腸菌などである。
【0064】
本発明の１つの特定実施形態では、前記宿主細胞はＳｔｂｌ３、ＢＬ２１又はｔｒａｎｓｅｔｔａである。
【0065】
本発明の第１２態様は、本発明に記載のＣＤＲ、α鎖ポリペプチド、β鎖ポリペプチド、Ｔ細胞抗原受容体又は抗体又はその抗原結合断片を発現する免疫細胞を提供する。
【0066】
好ましくは、前記免疫細胞は１つ又は複数の本発明のいずれか１項に記載の異種核酸配列を含む。
【0067】
好ましくは、前記免疫細胞は幹細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞を含む）を含むが、これらに限定されない。さらに、前記免疫細胞はＢ細胞であり、前記Ｂ細胞は上記の抗体又はその抗原結合断片を発現する。前記免疫細胞はＴ細胞であり、前記Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体の構造は上記のとおりである。
【0068】
好ましくは、前記Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔなどであってもよい。
さらに好ましくは、前記免疫細胞は被検者のＴ細胞から単離される。
さらに好ましくは、前記免疫細胞は被検者のＴ細胞から単離される。
【0069】
好ましくは、前記免疫細胞はＣＭＶ血清陰性ドナー由来のＴ細胞である。
【0070】
本発明の第１３態様は、上記ＣＤＲ、α鎖ポリペプチド、β鎖ポリペプチド、抗体又はその抗原結合断片、又は前記Ｔ細胞抗原受容体をコードする核酸配列を免疫細胞にトランスフェクションして発現させることで、免疫細胞を取得することを含む免疫細胞の調製方法を提供する。
【0071】
好ましくは、前記免疫細胞は幹細胞、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞を含む）を含むが、これらに限定されない。さらに、前記免疫細胞はＢ細胞であり、前記Ｂ細胞は上記の抗体又はその抗原結合断片を発現する。前記免疫細胞はＴ細胞であり、前記Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体の構造は上記のとおりである。
【0072】
好ましくは、細胞内因性ＴＣＲをノックダウンするステップをさらに含む。具体的には、内因性ＴＣＲを標的とするｇｕｉｄｅをレンチウイルスベクターに構築し、パッケージングプラスミド、トランスフェクション試薬とＴ細胞に共トランスフェクションしてもよい。
【0073】
本発明の第１４態様は、
陽性Ｔ細胞をクローニングして本発明のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ１）と、
初代Ｔ細胞を単離して培養するステップ２）と、
ステップ１）で得た核酸をステップ２）の前記初代Ｔ細胞に送達し、本発明のいずれか１つに記載の前記ＣＤＲ、α鎖ポリペプチド、β鎖ポリペプチド、抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体を発現する組換えＴ細胞を取得するステップ３）と、を含む組換えＴ細胞の調製方法を提供する。
陽性Ｔ細胞をクローニングして本発明のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ１）と、
初代Ｔ細胞を単離して培養するステップ２）と、
ステップ１）で得た核酸をステップ２）の前記初代Ｔ細胞に送達し、本発明のいずれか１つに記載の前記ＣＤＲ、α鎖ポリペプチド、β鎖ポリペプチド、抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体を発現する組換えＴ細胞を取得するステップ３）と、を含む組換えＴ細胞の調製方法を提供する。
【0074】
好ましくは、前記Ｔ細胞は造血幹細胞又は末梢血リンパ球（ＰＢＬ）由来Ｔ細胞より選択される。
【0075】
本発明の第１５態様は、
陽性Ｔ細胞をクローニングして本発明のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得た核酸をベクター骨格に連結し、発現ベクターを取得するステップ（２）と、
ステップ（２）で得た発現ベクターを宿主細胞に形質転換した後、その発現を誘導するステップ（３）と、
抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体を取得するステップ（４）と、を含む抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体の調製方法を提供する。
陽性Ｔ細胞をクローニングして本発明のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ（１）と、
ステップ（１）で得た核酸をベクター骨格に連結し、発現ベクターを取得するステップ（２）と、
ステップ（２）で得た発現ベクターを宿主細胞に形質転換した後、その発現を誘導するステップ（３）と、
抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体を取得するステップ（４）と、を含む抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体の調製方法を提供する。
【0076】
好ましくは、前記陽性Ｔ細胞はＭＨＣによって提示されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５抗原ペプチドに特異的に結合する。さらに好ましくは、前記ＭＨＣによって提示されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５抗原ペプチド複合体は単量体又は多量体複合体である。
【0077】
本発明の第１６態様は、本発明のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を含む多量体複合体を提供する。
【0078】
好ましくは、前記多量体複合体は単量体、ビオチン分子、及びストレプトアビジン分子又はアビジン分子をさらに含み、前記単量体はＭＨＣ分子α鎖細胞外領域、β２ｍ鎖及び抗原ペプチドを含み、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジン分子に結合される。
【0079】
好ましくは、前記ＭＨＣ分子α鎖細胞外領域のＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されている。
【0080】
好ましくは、前記ＭＨＣ分子α鎖細胞外領域はシグナルペプチド配列を含まない。成熟ペプチド配列の前にＭアミノ酸が追加されている。
【0081】
好ましくは、前記β２ｍ鎖はシグナルペプチド配列を含まない。成熟ペプチド配列の前にＭとＡの２つのアミノ酸が追加されている。
【0082】
本発明の１つの特定実施形態では、前記β２ｍ鎖はシグナルペプチドを含まず、成熟ペプチド配列の前に２つのアミノ酸、好ましくはＭ、Ａが追加されている。
【0083】
好ましくは、前記抗原ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含む。
【0084】
本発明の１つの特定実施形態では、前記多量体複合体は以下のものを含む。
（１）Ｔ細胞抗原受容体であって、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
（2）単量体であって、抗原ペプチド、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びシグナルペプチドを含まないβ２ｍ鎖を含み、前記抗原ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３より選択されるいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである。
（3）ビオチン分子、及び
（4）ストレプトアビジン分子又はアビジン分子であって、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジンに結合される。
（１）Ｔ細胞抗原受容体であって、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含む。
（2）単量体であって、抗原ペプチド、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びシグナルペプチドを含まないβ２ｍ鎖を含み、前記抗原ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３より選択されるいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせである。
（3）ビオチン分子、及び
（4）ストレプトアビジン分子又はアビジン分子であって、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジンに結合される。
【0085】
好ましくは、前記ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉクラス分子又はＭＨＣ ＩＩクラス分子である。より好ましくは、前記ＭＨＣ分子はＭＨＣ Ｉクラス分子である。
【0086】
好ましくは、前記ＭＨＣ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２及びＨＬＡ－Ａ＊１１０１より選択される。
【0087】
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＭＨＣ分子α鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、５０又は５２のうちのいずれか１つで示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、５０又は５２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
【0088】
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＭＨＣ分子α鎖のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５１又は５３のうちのいずれか１つで示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５１又は５３のうちのいずれか１つで示されるヌクレオチド配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
【0089】
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＭＨＣ分子のβ２ｍ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のうちのいずれか１つで示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
【0090】
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＭＨＣ分子のβ２ｍ鎖のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のうちのいずれか１つで示されるか、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する。
【0091】
抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体とＴ細胞抗原受容体との結合の特異性を高めるために、前記単量体は少なくとも１つのアミノ酸の化学修飾、突然変異、挿入及び／又は欠失をさらに含む。
【0092】
好ましくは、前記ＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖は非共有結合である。
【0093】
好ましくは、前記多量体複合体は少なくとも１つの単量体を含む。
【0094】
好ましくは、単量体ごとに少なくとも１つのビオチン分子がカップリングされている。
【0095】
本発明の第１７態様は、
Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、
抗原ペプチド、ステップＩ）で得たβ２ｍ鎖とＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域を復元してフォールディングして、単量体を調製するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で調製した単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を取得するステップＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得たビオチンの単量体を蛍光標識付きストレプトアビジン又はアビジンと反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体を調製するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得た抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体をＴ細胞と共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体との複合体を形成するステップＶ）と、を含む本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体の調製方法を提供する。
Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、
抗原ペプチド、ステップＩ）で得たβ２ｍ鎖とＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域を復元してフォールディングして、単量体を調製するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で調製した単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を取得するステップＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得たビオチンの単量体を蛍光標識付きストレプトアビジン又はアビジンと反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体を調製するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得た抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体をＴ細胞と共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体との複合体を形成するステップＶ）と、を含む本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体の調製方法を提供する。
【0096】
好ましくは、前記ステップＩ）は、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域をコードするヌクレオチド配列及びＭＨＣ分子β２ｍ鎖のヌクレオチド配列をそれぞれクローニングし、ベクターに連結した後、発現菌に形質転換して培養し、誘導剤を加えて、封入体を提取することを含む。
【0097】
さらに好ましくは、前記発現菌はＯＤ６００値が０．２～０．４の間となるまで培養される。
【0098】
さらに好ましくは、前記誘導剤は添加後の最終モル濃度が０．５～１ｍＭである。
【0099】
好ましくは、４～６ｈ誘導発現する。
【0100】
好ましくは、前記ステップＩＩ）は、β２ｍ鎖の復元フォールディングを含み、すなわち、抗原ペプチド、ＭＨＣ分子β２ｍ鎖、Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域を希釈緩衝液に順次加えて遮光下水浴処理し、前記β２ｍ鎖の復元フォールディングは封入体を変性して、プロテアーゼ阻害剤を加えた後に透析することを含む。
【0101】
好ましくは、前記抗原ペプチドでは、シグナルペプチドを含まないβ２ｍ鎖とＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたα鎖とのモル比が（３０～５０）：（２～２．５）：１である。さらに好ましくは４０：２：１である。
【0102】
好ましくは、前記ステップＩＩ）では、単量体を精製するステップをさらに含む。
【0103】
好ましくは、前記ステップＩＩＩ）におけるビオチン化は、ＢｉｒＡ酵素の触媒の下で、単量体をＢｉｏｍｉｘＡ、ＢｉｏｍｉｘＢに結合することである。
【0104】
好ましくは、前記ステップＩＩＩ）では、ビオチン化単量体を精製するステップをさらに含む。
【0105】
好ましくは、前記ステップＩＶ）では、単量体とストレプトアビジンとの反応モル比は（４～７）：１である。
【0106】
本発明の第１８態様は、上記多量体複合体の、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体の調製、スクリーニング又は検出における使用を提供する。
【0107】
本発明の第１９態様は、
Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、
抗原ペプチド、ステップＩ）で得たＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を復元してフォールディングし、単量体を調製するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で調製した単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を取得するステップＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得たビオチン化単量体を蛍光標識付きストレプトアビジン又はアビジンと反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体を調製するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得た抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体をＴ細胞と共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体の複合体を形成し、単離してＴ細胞抗原受容体を取得するステップＶ）と、を含むＴ細胞抗原受容体の調製方法を提供する。
Ｃ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を発現して精製するステップＩ）と、
抗原ペプチド、ステップＩ）で得たＣ末端にａｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたＭＨＣ分子α鎖細胞外領域及びβ２ｍ鎖を復元してフォールディングし、単量体を調製するステップＩＩ）と、
ステップＩＩ）で調製した単量体をビオチン化し、ビオチン化単量体を取得するステップＩＩＩ）と、
ステップＩＩＩ）で得たビオチン化単量体を蛍光標識付きストレプトアビジン又はアビジンと反応させ、抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体を調製するステップＩＶ）と、
ステップＩＶ）で得た抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体をＴ細胞と共インキュベートし、Ｔ細胞抗原受容体と抗原ペプチド－ＭＨＣ分子４量体の複合体を形成し、単離してＴ細胞抗原受容体を取得するステップＶ）と、を含むＴ細胞抗原受容体の調製方法を提供する。
【0108】
本発明の第２０態様は、本発明のいずれか１項に記載のＣＤＲ、本発明のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、本発明のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、本発明のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、本発明のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明のいずれか１項に記載の核酸、本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、本発明に記載の免疫細胞、本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体の、腫瘍又はＣＭＶ関連疾患を診断又は治療する製品の調製における使用を提供する。
【0109】
好ましくは、前記ＣＭＶ関連疾患は新生児ＣＭＶ封入体疾患、急性獲得性ＣＭＶ感染、又は免疫妥協者ＣＭＶ感染による疾患より選択される。
【0110】
本発明の１つの特定実施形態では、前記ＣＭＶ関連疾患は肝臓、脾臓又は中枢神経系疾患、障害、伝染性単球増加症、骨格筋痛、ＣＭＶ網膜炎、胃腸ＣＭＶ又は脳炎などより選択される。
【0111】
本発明の第２１態様は、本発明のいずれか１項に記載のＣＤＲ、本発明のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、本発明のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、本発明のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、本発明のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、本発明のいずれか１項に記載の核酸、本発明に記載の発現ベクター、本発明に記載の宿主細胞、本発明に記載の免疫細胞、本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体の、Ｔ細胞標識、検出、細胞選別又は活性化における使用を提供する。
【0112】
本発明の第２２態様は、
ｉ）本発明のいずれか１項に記載のＣＤＲ、
ｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、
ｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、
ｉｖ）本発明のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、
ｖ）本発明のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、
ｖｉ）本発明のいずれか１項に記載の核酸、
ｖｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の発現ベクター、
ｖｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の宿主細胞、
ｉｘ）本発明のいずれか１項に記載の免疫細胞、又は
ｘ）本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体のうちのいずれか１群を含む医薬組成物を提供する。
ｉ）本発明のいずれか１項に記載のＣＤＲ、
ｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、
ｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、
ｉｖ）本発明のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、
ｖ）本発明のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、
ｖｉ）本発明のいずれか１項に記載の核酸、
ｖｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の発現ベクター、
ｖｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の宿主細胞、
ｉｘ）本発明のいずれか１項に記載の免疫細胞、又は
ｘ）本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体のうちのいずれか１群を含む医薬組成物を提供する。
【0113】
好ましくは、前記医薬組成物は薬学的に許容可能な補助材料をさらに含んでもよい。
【0114】
好ましくは、前記医薬組成物は他の治療剤と併用されてもよい。さらに好ましくは、前記治療剤は免疫調整剤であってもよい。
【0115】
本発明の第２３態様は、
ｉ）本発明のいずれか１項に記載のＣＤＲ、
ｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、
ｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、
ｉｖ）本発明のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、
ｖ）本発明のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、
ｖｉ）本発明のいずれか１項に記載の核酸、
ｖｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の発現ベクター、
ｖｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の宿主細胞、
ｉｘ）本発明のいずれか１項に記載の免疫細胞、又は
ｘ）本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体のうちのいずれか１群を含むキットを提供する。
ｉ）本発明のいずれか１項に記載のＣＤＲ、
ｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のα鎖ポリペプチド、
ｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載のβ鎖ポリペプチド、
ｉｖ）本発明のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、
ｖ）本発明のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、
ｖｉ）本発明のいずれか１項に記載の核酸、
ｖｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の発現ベクター、
ｖｉｉｉ）本発明のいずれか１項に記載の宿主細胞、
ｉｘ）本発明のいずれか１項に記載の免疫細胞、又は
ｘ）本発明のいずれか１項に記載の多量体複合体のうちのいずれか１群を含むキットを提供する。
【0116】
本発明の第２４態様は、検出対象サンプルを本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体と接触させた後、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５と抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体とで形成される複合体を検出することを含む、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５の検出方法を提供する。
【0117】
好ましくは、前記検出サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５の存在又は含有量を検出する。前記存在は有無を表し、前記含有量は発現量又はタンパク質濃度などであってもよい。
【0118】
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体は検出可能なマーカーを含む。
【0119】
本発明の１つの特定実施形態では、前記マーカーはＨｉｓ及び／又はＨＡであってもよい。
【0120】
本発明に記載のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５の検出方法は、疾患の診断方法ではない。まず、検出対象サンプルは生物体又はその摘出組織や細胞ではなく、次に、生物体中にサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５が存在するか、又は所定の濃度又は発現レベルのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５が含まれていても、疾患であると判定できず、可能性に過ぎない。
【0121】
本発明の第２５態様は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、前記Ｔ細胞抗原受容体、前記核酸、前記発現ベクター、前記宿主細胞、前記免疫細胞又は前記医薬組成物の有効量を個体に投与することを含むＣＭＶ関連疾患の治療及び／又は予防方法を提供する。
【0122】
好ましくは、前記方法は、本発明に記載のＴ細胞抗原受容体を発現するＴ細胞を被検者に養子転移するステップを含む。
【0123】
好ましくは、前記方法は、本発明に記載のＴ細胞抗原受容体をＣＭＶ関連疾患（好ましくは腫瘍又は転移性腫瘍）の付近に局在化し、毒素又は免疫刺激剤の効果を高めることを含む。
【0124】
好ましくは、同種異体造血幹細胞移植後のＣＭＶ再活性化を治療及び／又は予防する。
【0125】
好ましくは、器官移植（例えば腎臓、肝臓、脾臓、腸、角膜）、組織移植、細胞移植（膵島細胞、角膜縁幹細胞）又は幹細胞治療後のＣＭＶ再活性化を治療及び／又は予防する。
【0126】
好ましくは、前記本発明に記載のＴ細胞抗原受容体を発現するＴ細胞は被検者に由来する。
【0127】
好ましくは、前記本発明に記載のＴ細胞抗原受容体を発現するＴ細胞は前記造血幹細胞、器官、組織、細胞又は幹細胞と同様のドナーに由来する。
【0128】
本発明の第２６態様は、サンプルを採取し、サンプルを本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体と接触させた後、ＣＭＶ ｐｐ６５と抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体とで形成される複合体を検出することを含むＣＭＶ関連疾患の診断方法を提供する。
【0129】
好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片又はＴ細胞抗原受容体は検出可能なマーカーを含む。
【0130】
本発明に記載のＴＣＲは、対応するＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド－ＭＨＣ分子複合体を特異的に認識し、ＴＣＲ Ｔ細胞を活性化させ、高レベルのサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ２、ＴＮＦαを生成することができ、インビボ試験及びインビトロ試験のいずれにおいても腫瘍細胞を有意に殺傷する。
【0131】
本発明に記載の「Ｔ細胞抗原受容体」は、ＭＨＣ分子又はその４量体によって提示されたときのペプチドを認識することができる分子である。
【0132】
本発明に記載の「腫瘍」とは、膵臓癌、肝臓癌、結腸癌、直腸癌、胃癌、リンパ腫、基底細胞癌、非小細胞肺癌、白血病、卵巣癌、鼻咽頭癌、乳癌、子宮内膜癌、膀胱癌、肺癌、気管支癌、骨癌、前立腺癌、胆管癌、食道癌、腎臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌、精巣癌、膠芽腫、星細胞腫、黒色腫、骨髄異形成症候群、及び肉腫を含むが、これらに限定されない。ここで、前記白血病は、急性リンパ球性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄性白血病、髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、形質細胞白血病、及び慢性骨髄性白血病より選択され、前記リンパ腫は、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫より選択され、Ｂ細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、及びバルデンストロームマクログロブリン血症を含み、前記肉腫は、骨肉腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、滑膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、軟骨肉腫より選択される。前記腫瘍は、膵臓癌、肝臓癌、口腔扁平上皮癌、結腸癌、卵巣癌、胃癌より選択されることが好ましい。本発明の１つの特定実施形態では、前記腫瘍はリンパ腫である。
【0133】
本発明に記載の「ＣＭＶ関連疾患」は、肝臓、脾臓及び中枢神経系に重大な影響を及ぼす可能性のある新生児ＣＭＶ封入体疾患を含む、ＣＭＶ ｐｐ６５感染に起因する疾患を含む。また、伝染性単球増加症に類似し、発熱、骨格筋疼痛などがある急性獲得性ＣＭＶ感染も含まれる。また、ＣＭＶ網膜炎、胃腸ＣＭＶ及び脳炎などを引き起こすことがある、臓器を移植された人やＨＩＶに罹患している人などの免疫妥協者も含まれる。
【0134】
本発明に記載の「抗原結合断片」は、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦａｂ断片、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ又は複数のシステイン残基を有するＦａｂ断片であるＦａｂ’断片、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、ＣＨ１ドメインのＣ末端に１つ又は複数のシステイン残基とを有するＦｄ’断片、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖ断片、ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなるｄＡｂ断片、単離されたＣＤＲ領域、ヒンジ領域においてジスルフィドブリッジによって連結された２つのＦａｂ’断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体分子（例えば、一本鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）、２つの抗原結合部位を有する「二重抗体」であって、軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合した重鎖可変領域（ＶＨ）を同一ポリペプチド鎖中に含むもの、相補的軽鎖ポリペプチドと共に抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む「線状抗体」、抗原結合活性を保持する前記物質のいずれかの改変された形態を含むが、これらに限定されない。
【0135】
本発明に記載の「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）又はＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の短い断片であり、抗原エピトープに単独で又は他のＣＤＲと組み合わせて結合する。前記免疫グロブリンは抗体であってもよく、この場合、ＣＤＲは抗体の可変配列内の相補性決定領域に対応する。可変領域ごとに、重鎖及び軽鎖の各可変領域に、それぞれ重鎖又は軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲがある。前記Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）において、ＣＤＲはα鎖又はβ鎖に存在し、α鎖又はβ鎖にはそれぞれ３つのＣＤＲが存在し、これらはそれぞれα鎖又はβ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と呼ばれる。これらのＣＤＲの正確な境界は、システムによって異なって定義されている。Ｋａｂａｔら(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)と(1991))によるシステムは、抗体の可変領域に適した明確な残基番号体系を提供するだけでなく、３つのＣＤＲを限定する残基境界も提供する。これらのＣＤＲはＫａｂａｔ ＣＤＲと呼ばれてもよい。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義されるような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基を含んでもよい。Ｃｈｏｔｈｉａら(Chothia&Lesk, J. Mol. Biol, 196:901-917 (1987)とChothia et al., Nature 342:877-883 (-1989))は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内の一部のサブセクションが、アミノ酸配列のレベルでは大きな多様性があるものの、ほぼ同じペプチド骨格配座をとることを見出した。これらのサブセクションは、それぞれＬ１、Ｌ２、Ｌ３、又はＨ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれ、ここで、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ軽鎖領域及び重鎖領域を表す。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重なり合う境界を有するＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲとばれてもよい。他のＣＤＲ境界定義は、上記のシステムの１つに厳密に従わなくてもよいが、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとオーバーラップし、本明細書で使用される方法は、好ましい実施形態ではＫａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａによって定義されたＣＤＲを使用するが、これらのシステムのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用することができる。前記ＴＣＲにおけるＣＤＲの残基境界は、上記と同じである。前記「抗体可変領域」とは、抗体分子の軽鎖及び重鎖のうち、相補性決定領域（ＣＤＲ、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）及びフレームワーク領域（ＦＲ）を含むアミノ酸配列の部分をいう。ＶＨは重鎖の可変領域を指す。ＶＬは軽鎖の可変領域を指す。
【0136】
本発明に記載の「含む」が本願においてタンパク質又は核酸の配列を説明するために使用される場合、前記タンパク質又は核酸は、その配列から構成されていてもよく、又は前記タンパク質又は核酸の一端又は両端に付加的なアミノ酸又はヌクレオチドを有していても、本発明に記載の活性を有していてもよい。
【0137】
本発明に記載の「予防」とは、本発明に記載の製品を投与することによって、症状を抑制するか、又は特定の症状の緊張を遅らせるすべての行為を意味する。
【0138】
本発明に記載の「診断」とは、患者が過去、診断時又は将来に疾患又は障害に罹患しているか否かを明らかにすること、又は疾患の進行又は将来の可能性のある進行を明らかにすること、又は治療に対する患者の反応を評価することを意味する。
【0139】
本発明に記載の「治療」とは、徴候、症状、失調、障害、又は疾患の進行又は重篤度を遅延、中断、阻止、制御、停止、軽減、又は逆転することを意味するが、必ずしも疾患に関連するすべての徴候、症状、障害又は失調の完全な除去に関わるわけではなく、しかも疾患がすでに発展し始めた後に疾患又は病理状態の徴候、病状などを改善する治療干渉を意味する。
【0140】
本発明に記載の「有効量」とは、単一又は複数の用量で患者又は臓器に投与された後に所望の治療又は予防を提供する本発明に記載の製品の量又は用量を意味する。
【0141】
本発明に記載の「製品」は、本発明に記載の抗体又はその抗原結合断片、前記Ｔ細胞抗原受容体、前記核酸、前記発現ベクター、前記宿主細胞、前記免疫細胞、又は前記多量体複合体、及び上記の製品と相乗的又は補助的な他の試薬を含むが、これらに限定されない。
【0142】
本発明に記載の「製品」は、キット、チップ、抗体コンジュゲート又は多機能抗体などの医薬組成物であってもよい。
【0143】
本発明に記載の「被検者」には、ヒト又は非ヒト哺乳動物が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、前記非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、サル、ブタやウサギ等を含むが、これらに限定されない。
【0144】
本発明に記載の「相同性」とは、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の使用において、当業者が、元の配列の主要な構造又は機能を変更することなく、実用上の必要に応じて配列を調整することができ、使用する配列が、本発明に記載の特定の配列と比較して、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有するようにすることを意味する。例えば、本発明に記載の「ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有する」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リンタンパク質ｐｐ６５ペプチドエピトープ：ＭＨＣ複合体との結合機能を維持しながら、実用上の必要に応じてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、１３、１４、１５、１６又は１７を調整することができ、例えば、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入などの１つ又は複数の改変、切断、又は一端又は両端の延長を含むことができ、８０％以上の相同性を維持し、ｐｐ６５エピトープ：ＭＨＣ複合体又はｐｐ６５エピトープ：ＭＨＣ分子４量体との結合能力を保持すればよい。前記改変は、置換、追加、又は欠失とすることであってもよい。同極性アミノ酸間の置換、同電荷アミノ酸間の置換、非電荷アミノ酸間の置換、脂肪族アミノ酸間の置換、芳香族アミノ酸間の置換、無極性アミノ酸間の置換、又は関連する性質を有する側鎖部分のアミノ酸間の置換であってもよい。ここで、塩基性側鎖は、リジン、アルギニン又はヒスチジンを含むが、これらに限定されない。酸性側鎖は、アスパラギン酸又はグルタミン酸を含むが、これらに限定されない。非電荷アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン、セリン、トレオニン又はチロシンが含まれるが、これらに限定されない。非極性側鎖は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインを含むが、これらに限定されない。ここで、前記少なくとも８０％は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【0145】
以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。
【図1】抗原ペプチド－ＭＨＣ単量体のＳＤＳ ＰＡＧＥ検出結果であり、Ｍはタンパク質Ｍａｒｋｅｒであり、バンド１、２は単量体である。
【図2】４量体抽出特異的Ｔ細胞の検出結果であり、第１列は独自に開発したＡ０２０１－ＮＬＶ４量体と市販４量体抽出特異的Ｔ細胞との比較結果であり、第２列は独自に開発したＡ２４０２－ＱＹＤ４量体と市販４量体抽出特異的Ｔ細胞との比較結果である。
【図3】Ａ１１０１－ＡＴＶ４量体について検出したＣ４４ ＴＣＲ－Ｔ細胞陽性率である。
【図4】ＴＣＲ β鎖及びα鎖のｐＨＡＧＥベクターにおける連結の概略図であり、連結順は順次プロモータ、β鎖、ｆｕｒｉｎ－ｐ２Ａ、α鎖、ＩＲＥＳ及びＲＦＰ配列である。
【図5】フローサイトメトリー検出によるＴＣＲの膜表面発現の状況であり、図５ＡはＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的ＴＣＲ（Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２９）の膜表面発現の状況であり、図５ＢはＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ特異的ＴＣＲ（Ｃ２７、Ｃ３０）の膜表面発現の状況であり、図５ＣはＨＬＡ－Ａ＊Ａ１１０１ ＡＴＶＱＧＱＮＬＫ特異的ＴＣＲ（Ｃ４４、Ｃ４５）の膜表面発現の状況であり、ここで、ＢＶ４２１は一連のフルオレセインのうちの１種であり、ＢＶのフルネームはＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔである。
【図6】フローサイトメトリー検出によるＴＣＲのＣＭＶ ｐｐ６５４量体プローブへの結合の親和性である。図６ＡはＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ特異的ＴＣＲ（Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２９）のＣＭＶ ｐｐ６５４量体プローブへの結合の親和性の検出結果であり、図６ＢはＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ特異的ＴＣＲ（Ｃ２７、Ｃ３０）のＣＭＶ ｐｐ６５４量体プローブへの結合の親和性の検出結果であり、図６ＣはＨＬＡ－Ａ＊Ａ１１０１ ＡＴＶＱＧＱＮＬＫ特異的ＴＣＲ（Ｃ４４、Ｃ４５）のＣＭＶ ｐｐ６５４量体プローブへの結合の親和性の検出結果である。
【図7】Ｃ２－ＴＣＲ Ｔ、Ｃ２２－ＴＣＲ Ｔ、Ｃ２９－ＴＣＲ ＴサイトカインＩＬ２（図７Ｂ）、ＴＮＦα（図７Ｃ）及びＩＦＮγ（図７Ｄ）の放出レベル及び標的細胞のルシフェラーゼレベル（図７Ａ）の検出結果図であり、Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２９は実施例２で調製されたＴＣＲであり、ＮＥは空白対照群を表し、ＮＴはＴ細胞群のみを表し、Ｒａｊｉはｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞を表し、１Ｇ４はＮＹ－ＥＳＯ－１に対して特異的なＴＣＲを表す。
【図8】Ｃ２７－ＴＣＲ Ｔ、Ｃ３０－ＴＣＲ ＴサイトカインＩＬ２（図８Ｂ）、ＴＮＦα（図８Ｃ）及びＩＦＮγ（図８Ｄ）の放出レベル及び標的細胞のルシフェラーゼレベル（図８Ａ）の検出結果図であり、Ｃ２７、Ｃ３０は実施例２で調製されたＴＣＲであり、ＮＥは空白対照群を表し、ＮＴはＴ細胞群のみを表し、Ｒａｊｉはｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞を表し、１Ｇ４はＮＹ－ＥＳＯ－１に対して特異的なＴＣＲを表す。
【図9】Ｃ４４－ＴＣＲ Ｔ、Ｃ４５－ＴＣＲ ＴサイトカインＩＦＮγの放出レベル（図９Ｂ）及び標的細胞のルシフェラーゼレベル（図９Ａ）の検出結果図であり、Ｃ４４、Ｃ４５は実施例２で調製されたＴＣＲであり、ＮＥは空白対照群を表し、ＮＴはＴ細胞群のみを表し、Ｒａｊｉはｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞を表し、１Ｇ４はＮＹ－ＥＳＯ－１に対して特異的なＴＣＲを表す。
【図10】リンパ腫動物モデルにおいてＣ２２－ＴＣＲのマウスの体内での腫瘍成長抑制を評価したものである。
【図11】リンパ腫動物モデル、非Ｔ細胞注射群（ＰＢＳ）、対照Ｔ細胞注射群（ＮＣ）、及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｃ２２－ＴＣＲ）のマウスの生存率を統計した結果である。
【図12】リンパ腫動物モデル、非Ｔ細胞注射群（ＰＢＳ）、対照Ｔ細胞注射群（ＮＣ）、及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｃ２２－ＴＣＲ）のマウスの体重を統計した結果である。
【図13】リンパ腫動物モデル、非Ｔ細胞注射群（ＰＢＳ）、対照Ｔ細胞注射群（ＮＣ）、及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｃ２２－ＴＣＲ）のマウス体内のＴＣＲ Ｔ細胞特異増殖を統計した結果であり、その結果、ＰＢＳ群及びＮＣ群の結果は全て０であり、図１３においては、６本の折れ線はＣ２２－ＴＣＲ群の６個の異なるマウス体内のＴＣＲ Ｔ細胞特異増殖を統計した結果である。
【図14】リンパ腫動物モデルにおいてＣ２７－ＴＣＲのマウス体内での腫瘍成長抑制を評価したものである。
【図15】リンパ腫動物モデル、非Ｔ細胞注射群（ＰＢＳ）、対照Ｔ細胞注射群（ＮＣ）、及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｃ２７－ＴＣＲ）のマウスの腫瘍成長を統計した結果である。
【図16】リンパ腫動物モデル、非Ｔ細胞注射群（ＰＢＳ）、対照Ｔ細胞注射群（ＮＣ）、及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｃ２７－ＴＣＲ）のマウス体内のＴＣＲ Ｔ細胞特異増殖を統計した結果である。
【図17】リンパ腫動物モデルにおいてＣ４５－ＴＣＲのマウス体内での腫瘍成長抑制を評価したものである。
【図18】リンパ腫動物モデル、非Ｔ細胞注射群（ＰＢＳ）、対照Ｔ細胞注射群（ＮＣ）、及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｃ４５－ＴＣＲ）のマウスの腫瘍成長を統計した結果である。
【図19】リンパ腫動物モデル、非Ｔ細胞注射群（ＰＢＳ）、対照Ｔ細胞注射群（ＮＣ）、及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔ注射群（Ｃ４５－ＴＣＲ）のマウス体内でのＴＣＲ Ｔ細胞特異増殖を統計した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0146】
以下、図面を参照して本発明の実施例における技術的解決手段を明確かつ完全に説明するが、明らかに、説明される実施例は本発明の一部の実施例にすぎず、全ての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的な努力を必要とせずに得る他のすべての実施例は本発明の特許範囲に属する。
【0147】
実施例１：ＣＭＶ抗原エピトープ４量体の構築及び効果検出
【0148】
一、ＣＭＶ抗原エピトープ４量体の構築
１）配列が最適化されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示す）、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示す）、及びＨＬＡ－Ａ＊１１０１（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示す）のα鎖とβ２ｍ鎖（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示す）を発現した。α鎖の構造は対応するＨＬＡ型α鎖の細胞外領域配列にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結されており、ＢａｍＨＩ酵素切断部位で隔てられて、ビオチン化部位を提供する。β２ｍ鎖にはシグナルペプチド配列が取り除かれ、成熟ペプチド配列の前に２つのアミノ酸（ＭとＡ）が追加されている。発現ベクターはＰＥＴ２８ａ＋であり、発現菌はｔｒａｎｓｅｔｔａ又はＢＬ２１である。ＩＰＴＧ濃度は０．５ｍＭで、４ｈ誘導発現する。α鎖とβ２ｍ鎖タンパク質封入体を抽出した。
２）ＣＭＶ抗原エピトープ（抗原ペプチド）の選択：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１型対応抗原エピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２型対応抗原エピトープＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１型対応抗原エピトープＡＴＶＱＧＱＮＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
３）ｐＭＨＣ Ｉ単量体のフォールディング及び精製：ステップ２）の前記抗原ペプチド、対応するステップ１）の前記β２ｍ鎖復元グタンパク質及びα鎖タンパク質を４０：２：１のモル比で還元系に順に加え、７２ｈフォールディング反応させた。得られた産物をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラムに通して精製した。精製産物を収集して、ａｖｉｄｉｔｙキットでビオチン化し、再度精製してビオチン化単量体を得、ゲル電気泳動により単量体純度を検出した。
４）ステップ３）の前記ビオチン化単量体をＡＰＣ標識ストレプトアビジンと結合反応させて、対応する４量体を得、それぞれＡ０２０１－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－４量体（Ａ０２０１－ＮＬＶ４量体と略称する）、Ａ２４０２－ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ－４量体（Ａ２４０２－ＱＹＤ４量体と略称する）、Ａ１１０１－ＡＴＶＱＧＱＮＬＫ－４量体（Ａ１１０１－ＡＴＶ４量体と略称する）と命名した。
１）配列が最適化されたＨＬＡ－Ａ＊０２０１（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示す）、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示す）、及びＨＬＡ－Ａ＊１１０１（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示す）のα鎖とβ２ｍ鎖（そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示す）を発現した。α鎖の構造は対応するＨＬＡ型α鎖の細胞外領域配列にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結されており、ＢａｍＨＩ酵素切断部位で隔てられて、ビオチン化部位を提供する。β２ｍ鎖にはシグナルペプチド配列が取り除かれ、成熟ペプチド配列の前に２つのアミノ酸（ＭとＡ）が追加されている。発現ベクターはＰＥＴ２８ａ＋であり、発現菌はｔｒａｎｓｅｔｔａ又はＢＬ２１である。ＩＰＴＧ濃度は０．５ｍＭで、４ｈ誘導発現する。α鎖とβ２ｍ鎖タンパク質封入体を抽出した。
２）ＣＭＶ抗原エピトープ（抗原ペプチド）の選択：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１型対応抗原エピトープＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２型対応抗原エピトープＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１型対応抗原エピトープＡＴＶＱＧＱＮＬＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）。
３）ｐＭＨＣ Ｉ単量体のフォールディング及び精製：ステップ２）の前記抗原ペプチド、対応するステップ１）の前記β２ｍ鎖復元グタンパク質及びα鎖タンパク質を４０：２：１のモル比で還元系に順に加え、７２ｈフォールディング反応させた。得られた産物をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラムに通して精製した。精製産物を収集して、ａｖｉｄｉｔｙキットでビオチン化し、再度精製してビオチン化単量体を得、ゲル電気泳動により単量体純度を検出した。
４）ステップ３）の前記ビオチン化単量体をＡＰＣ標識ストレプトアビジンと結合反応させて、対応する４量体を得、それぞれＡ０２０１－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－４量体（Ａ０２０１－ＮＬＶ４量体と略称する）、Ａ２４０２－ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ－４量体（Ａ２４０２－ＱＹＤ４量体と略称する）、Ａ１１０１－ＡＴＶＱＧＱＮＬＫ－４量体（Ａ１１０１－ＡＴＶ４量体と略称する）と命名した。
【0149】
二、ＣＭＶ抗原エピトープの４量体効果の検出
１．ヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を単離するか、ＴＣＲ－Ｔ細胞を準備し、細胞密度１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
２．細胞を３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上清を除去し、１％血清を含むＰＢＳ ５０μＬで重懸濁させた。
３．４量体２μＬを加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
４．ＣＤ８抗体２μＬを加えて、氷上で２０ｍｉｎインキュベートした。
５．ＰＢＳ １ｍＬを加えて、３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
６．上清を除去し、ＰＢＳ １ｍＬを加えて、３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
７．上清を除去し、４％パラホルムアルデヒド５００μＬで細胞を再懸濁させ、ろ過膜で細胞懸濁液をろ過した。
８．フローサイトメータで陽性細胞を検出した。
１．ヒト末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）を単離するか、ＴＣＲ－Ｔ細胞を準備し、細胞密度１×１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
２．細胞を３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上清を除去し、１％血清を含むＰＢＳ ５０μＬで重懸濁させた。
３．４量体２μＬを加えて室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
４．ＣＤ８抗体２μＬを加えて、氷上で２０ｍｉｎインキュベートした。
５．ＰＢＳ １ｍＬを加えて、３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
６．上清を除去し、ＰＢＳ １ｍＬを加えて、３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
７．上清を除去し、４％パラホルムアルデヒド５００μＬで細胞を再懸濁させ、ろ過膜で細胞懸濁液をろ過した。
８．フローサイトメータで陽性細胞を検出した。
【0150】
三、実験結果
単量体のＳＤＳ ＰＡＧＥ検出結果を図１に示す。図１に示すように、復元フォールディングとＨＰＬＣ精製により得られた単量体は重鎖（Ｃ末端にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたα鎖細胞外領域）と軽鎖（シグナルペプチド領域が除去されたβ２ｍ鎖）に対応するサイズのタンパク質を明確に示し、純度が高い。
構築した４量体をそれぞれ対応するＨＬＡ型ＰＢＭＣ細胞と共インキュベートして特異的Ｔ細胞を抽出した。図２に示すように、独自に開発した４量体は市販４量体（ＭＢＬ社）より特異的Ｔ細胞を抽出する面で明らかな優位性がある。具体的には、独自に開発したＡ０２０１－ＮＬＶ４量体により選別された特異的Ｔ細胞は、市販４量体（ＭＢＬ、ＴＳ－００１０－２Ｃ）の２倍となっている。また、異なるロットの選別効率は類似し、極めて高い選別効率と安定性を示した。このＡ０２０１－ＮＬＶ４量体でＣ２２ ＴＣＲとＣ２９ ＴＣＲを抽出した。市販Ａ２４０２－ＱＹＤ（ＭＢＬ、ＴＳ－００２０－２Ｃ）４量体は対応する特異的Ｔ細胞を検出しなかったが、独自に開発した４量体は０．０２～０．０５％の陽性群を検出し、このことから、独自に開発した４量体は特異的Ｔ細胞を選別する面で高度な感度を持ち、しかも異なるロットのデータは高度な安定性を示した。このＡ２４０２－ＱＹＤ４量体でＣ２７ ＴＣＲとＣ３０ ＴＣＲを抽出した。
また、Ａ１１０１型対応ＴＣＲ（Ｃ４４ ＴＣＲ）は同じエピトープの独自に開発した４量体と市販４量体（ＭＢＬ、ＴＳ－Ｍ０１２－１）の両方により認識され（図３参照）、市販４量体陽性群は感染細胞の９０．５％を占め、独自に開発した４量体陽性群は感染細胞の９１％を占めた。Ｃ４５ ＴＣＲの結果は図５を参照する。
単量体のＳＤＳ ＰＡＧＥ検出結果を図１に示す。図１に示すように、復元フォールディングとＨＰＬＣ精製により得られた単量体は重鎖（Ｃ末端にＡｖｉ－ｔａｇ配列が連結されたα鎖細胞外領域）と軽鎖（シグナルペプチド領域が除去されたβ２ｍ鎖）に対応するサイズのタンパク質を明確に示し、純度が高い。
構築した４量体をそれぞれ対応するＨＬＡ型ＰＢＭＣ細胞と共インキュベートして特異的Ｔ細胞を抽出した。図２に示すように、独自に開発した４量体は市販４量体（ＭＢＬ社）より特異的Ｔ細胞を抽出する面で明らかな優位性がある。具体的には、独自に開発したＡ０２０１－ＮＬＶ４量体により選別された特異的Ｔ細胞は、市販４量体（ＭＢＬ、ＴＳ－００１０－２Ｃ）の２倍となっている。また、異なるロットの選別効率は類似し、極めて高い選別効率と安定性を示した。このＡ０２０１－ＮＬＶ４量体でＣ２２ ＴＣＲとＣ２９ ＴＣＲを抽出した。市販Ａ２４０２－ＱＹＤ（ＭＢＬ、ＴＳ－００２０－２Ｃ）４量体は対応する特異的Ｔ細胞を検出しなかったが、独自に開発した４量体は０．０２～０．０５％の陽性群を検出し、このことから、独自に開発した４量体は特異的Ｔ細胞を選別する面で高度な感度を持ち、しかも異なるロットのデータは高度な安定性を示した。このＡ２４０２－ＱＹＤ４量体でＣ２７ ＴＣＲとＣ３０ ＴＣＲを抽出した。
また、Ａ１１０１型対応ＴＣＲ（Ｃ４４ ＴＣＲ）は同じエピトープの独自に開発した４量体と市販４量体（ＭＢＬ、ＴＳ－Ｍ０１２－１）の両方により認識され（図３参照）、市販４量体陽性群は感染細胞の９０．５％を占め、独自に開発した４量体陽性群は感染細胞の９１％を占めた。Ｃ４５ ＴＣＲの結果は図５を参照する。
【0151】
実施例２：ｐＨＡＧＥ－ＴＣＲ－ＲＦＰベクターの構築
【0152】
一、ＣＭＶ ｐｐ６５エピトープ特異的ＴＣＲのβとα遺伝子断片の取得
１）ＭＢＬ社から購入又は自社で自作したＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－４量体、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ－４量体、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＡＴＶＱＧＱＮＬＫ－４量体を用いて、製品の取扱書と末梢血染色に従って、４量体染色陽性のＴ細胞について単細胞をフローサイトメトリーソーティングし、逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(R)ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）原理により、２回のＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）によりＴＣＲβ遺伝子の可変領域断片を増幅した。
逆転写プライマー：ＴＲＢＣ１－ＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）
ＰＣＲ増幅プライマー：
上流プライマー１：Ｔ細胞受容体β可変領域－ＴＲＢＶ＿Ｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６～９５参照）
上流プライマー２：Ｔ細胞受容体β可変領域－ＴＲＢＶ＿Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６～１３５参照）
下流プライマー１：Ｔ細胞受容体β定常領域－ＴＲＢＣ２－ＧＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）
下流プライマー２：Ｔ細胞受容体β定常領域－ＴＲＢＣ３－ＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応するサイズのバンドについてゲルをカットして回収し（天根生社製のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー２である。ＴＣＲβ遺伝子配列を得た。Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４、Ｃ４５のβ鎖ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７、２６０～２６５に示す。
２）以上のように、４量体染色陽性Ｔ細胞を逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(R)ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。取扱書に従って２回のＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）によりＴＣＲα遺伝子断片を増幅した。
逆転写プライマーは、Ｔ細胞受容体α定常領域－ＴＲＡＣ１－ＣＧＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）
ＰＣＲ増幅プライマー：
上流プライマー３：Ｔ細胞受容体α可変領域－ＴＲＡＶ＿Ｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２～１８６参照）
上流プライマー４：Ｔ細胞受容体α可変領域－ＴＲＡＶ＿Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７～２２８参照）
下流プライマー３：Ｔ細胞受容体α定常領域－ＴＲＡＣ２－ＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＡＣＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）
下流プライマー４：Ｔ細胞受容体α定常領域－ＴＲＡＣ３－ＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応するサイズのバンドについてゲルをカットして回収し（天根生社製のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー４である。ＴＣＲα遺伝子配列を得た。具体的には、Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４、Ｃ４５のα鎖ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８、２６６～２７１に示す。
１）ＭＢＬ社から購入又は自社で自作したＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－４量体、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ－４量体、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＡＴＶＱＧＱＮＬＫ－４量体を用いて、製品の取扱書と末梢血染色に従って、４量体染色陽性のＴ細胞について単細胞をフローサイトメトリーソーティングし、逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(R)ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ）原理により、２回のＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）によりＴＣＲβ遺伝子の可変領域断片を増幅した。
逆転写プライマー：ＴＲＢＣ１－ＴＣＡＧＧＣＡＧＴＡＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６）
ＰＣＲ増幅プライマー：
上流プライマー１：Ｔ細胞受容体β可変領域－ＴＲＢＶ＿Ｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６～９５参照）
上流プライマー２：Ｔ細胞受容体β可変領域－ＴＲＢＶ＿Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６～１３５参照）
下流プライマー１：Ｔ細胞受容体β定常領域－ＴＲＢＣ２－ＧＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＣＡＴＴＣＡＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７）
下流プライマー２：Ｔ細胞受容体β定常領域－ＴＲＢＣ３－ＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応するサイズのバンドについてゲルをカットして回収し（天根生社製のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー２である。ＴＣＲβ遺伝子配列を得た。Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４、Ｃ４５のβ鎖ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７７、２６０～２６５に示す。
２）以上のように、４量体染色陽性Ｔ細胞を逆転写してｃＤＮＡ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ(R)ＩＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を得た。取扱書に従って２回のＰＣＲ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）によりＴＣＲα遺伝子断片を増幅した。
逆転写プライマーは、Ｔ細胞受容体α定常領域－ＴＲＡＣ１－ＣＧＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）
ＰＣＲ増幅プライマー：
上流プライマー３：Ｔ細胞受容体α可変領域－ＴＲＡＶ＿Ｆ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２～１８６参照）
上流プライマー４：Ｔ細胞受容体α可変領域－ＴＲＡＶ＿Ｆ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８７～２２８参照）
下流プライマー３：Ｔ細胞受容体α定常領域－ＴＲＡＣ２－ＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＡＣＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）
下流プライマー４：Ｔ細胞受容体α定常領域－ＴＲＡＣ３－ＣＡＧＧＧＴＣＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）
具体的には、ＰＣＲポリメラーゼＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏの製品取扱書によると、１回目のＰＣＲ系は２０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。１回目のＰＣＲ反応の産物１μＬを２回目のＰＣＲのテンプレートとし、２回目のＰＣＲ系は３０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。次に、２回目のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、対応するサイズのバンドについてゲルをカットして回収し（天根生社製のゲル回収キット）、シーケンシングに送り、シーケンシングプライマーは下流プライマー４である。ＴＣＲα遺伝子配列を得た。具体的には、Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４、Ｃ４５のα鎖ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７８、２６６～２７１に示す。
【0153】
二、ｐＨＡＧＥ－ＴＣＲベクターの構築
ＴＣＲβ、ｆｐ２Ａ、ＴＣＲαを長いプライマー（ｆｐ２Ａ配列を含む）でｏｖｅｒｌａｐ－ＰＣＲ増幅し（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）、ＴＣＲβ－ｆｐ２Ａ－ＴＣＲα断片を得、それぞれＣ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４又はＣ４５と命名した。
増幅プライマーは、上流プライマー５（表１）、下流プライマー５、上流プライマー６（表２）、下流プライマー６を含む。
下流プライマー５：TCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGCTccgtttccgccgGAAATCCTTTCTCTTGACCATG（SEQ ID NO：235）
下流プライマー６：agggatcctctagactcgagctagcTCAGCTGGACCACAGCCGCA（SEQ ID NO：242）。
具体的には、プライマー５とプライマー６でＴＣＲβとＴＣＲαをそれぞれ増幅し、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動にかけ、ゲルを回収し（天根生社製のゲル回収キット）、回収産物１μＬをそれぞれテンプレートとし、上流プライマー５と下流プライマー６でｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行い、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。アガロースゲル電気泳動にかけ、約１８００ｂｐのバンドを得、ゲルをカットして回収した。
レンチウイルスベクターｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰをＮｏｔＩとＮｈｅＩで二重酵素切断した。酵素切断系はＮｏｔＩとＮｈｅＩをそれぞれ１．５μＬ、プラスミドを２～３μｇを含む４０μＬである。３７℃で６ｈ酵素切断し、その後、系にアルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）１μＬを加え、１ｈ処理してプラスミドの自己結合を減少させ、酵素切断後のプラスミドをゲル電気泳動にかけて回収し、ｎａｎｏｄｒｏｐで濃度を測定し、骨格としてプラスミド構築に用いた。
Ｃｌｏｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ製品の取扱書に従って、ＴＣＲをｏｖｅｒｌａｐで酵素切断後線形化したｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターと連結し（図４参照）、Ｓｔｂｌ３菌株に形質転化し、アンピジルを含むＬＢプレートで１２～１６ｈ培養し、単一クローン菌を選んでシーケンシングを行い、シーケンシングプライマーはｐＨＡＧＥベクター上のプライマーｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｆとｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｒ、及び下流プライマー４を選択した。対応するＴＣＲを取得し、それぞれＣ２２（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示す）、Ｃ２７（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示す）、Ｃ２９（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４１、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示す）、Ｃ３０（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示す）、Ｃ４４（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示す）、Ｃ４５（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示す）、Ｃ２（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３、そのβ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５、そのα鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６に示す）と略称する。
その中で、調製したＣ２を対照とし、このＣ２はＣ２２のＣＤＲ領域といくつかのアミノ酸のみが異なっており、具体的には、表３を参照する。
ＴＣＲβ、ｆｐ２Ａ、ＴＣＲαを長いプライマー（ｆｐ２Ａ配列を含む）でｏｖｅｒｌａｐ－ＰＣＲ増幅し（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ）、ＴＣＲβ－ｆｐ２Ａ－ＴＣＲα断片を得、それぞれＣ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４又はＣ４５と命名した。
増幅プライマーは、上流プライマー５（表１）、下流プライマー５、上流プライマー６（表２）、下流プライマー６を含む。
具体的には、プライマー５とプライマー６でＴＣＲβとＴＣＲαをそれぞれ増幅し、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。ＰＣＲ産物をゲル電気泳動にかけ、ゲルを回収し（天根生社製のゲル回収キット）、回収産物１μＬをそれぞれテンプレートとし、上流プライマー５と下流プライマー６でｏｖｅｒｌａｐ ＰＣＲを行い、ＰＣＲ系は５０μＬ、アニーリング温度は６０℃、反応は３０サイクルである。アガロースゲル電気泳動にかけ、約１８００ｂｐのバンドを得、ゲルをカットして回収した。
レンチウイルスベクターｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰをＮｏｔＩとＮｈｅＩで二重酵素切断した。酵素切断系はＮｏｔＩとＮｈｅＩをそれぞれ１．５μＬ、プラスミドを２～３μｇを含む４０μＬである。３７℃で６ｈ酵素切断し、その後、系にアルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）１μＬを加え、１ｈ処理してプラスミドの自己結合を減少させ、酵素切断後のプラスミドをゲル電気泳動にかけて回収し、ｎａｎｏｄｒｏｐで濃度を測定し、骨格としてプラスミド構築に用いた。
Ｃｌｏｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ製品の取扱書に従って、ＴＣＲをｏｖｅｒｌａｐで酵素切断後線形化したｐＨＡＧＥ－ＩＲＥＳ－ＲＦＰベクターと連結し（図４参照）、Ｓｔｂｌ３菌株に形質転化し、アンピジルを含むＬＢプレートで１２～１６ｈ培養し、単一クローン菌を選んでシーケンシングを行い、シーケンシングプライマーはｐＨＡＧＥベクター上のプライマーｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｆとｓｅｑ－ｐＨＡＧＥ－Ｒ、及び下流プライマー４を選択した。対応するＴＣＲを取得し、それぞれＣ２２（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示す）、Ｃ２７（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示す）、Ｃ２９（そのヌクレオチド配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４１、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示す）、Ｃ３０（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示す）、Ｃ４４（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示す）、Ｃ４５（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示す）、Ｃ２（そのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７３、そのβ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７５、そのα鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７６に示す）と略称する。
その中で、調製したＣ２を対照とし、このＣ２はＣ２２のＣＤＲ領域といくつかのアミノ酸のみが異なっており、具体的には、表３を参照する。
【0154】
実施例３：ｐＭＨＣ４量体染色法によるＴＣＲの膜発現と親和性の検出
【0155】
１、内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔＴ細胞株の構築
Ｊｕｒｋａｔ細胞ＴＣＲの配列の特徴に基づき、α鎖とβ鎖の定常領域でｇｕｉｄｅ配列(TRA_oligo1-CACCGTCTCTCAGCTGGTACACGGC（SEQ ID NO：243）、TRA_oligo2-AAACGCCGTGTACCAGCTGAGAGAC（SEQ ID NO：244）、TRB_oligo1-CACCGGGCTCAAACACAGCGACCTC（SEQ ID NO：245）、TRB_oligo2-AAACGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCC（SEQ ID NO：246)を設計した。
合成したα鎖とβ鎖のｇｕｉｄｅ配列をそれぞれｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏとｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤレンチウイルスベクターに構築し、パッケーシングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びＰＥＩトランスフェクション試薬と一定の割合で２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションし、４８ｈと７２ｈの細胞培養上清を採取し、濃縮した２つのウイルスを同時にヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞株に感染した。４８ｈ感染後、２つの薬物のそれぞれの対照群の細胞がすべて死亡するまで、適切な濃度のピューロマイシンとブラストサイジンで殺滅した。生存している細胞について、９６ウェルプレートに単細胞をフローサイトメトリーソーティングして培養した。得られた単一クローン細胞株に対して、ＴＣＲα鎖とβ鎖の抗体を用いてそれぞれ発現を同定し、両鎖が共に欠損した細胞株を得られた内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とし、ＪＣ５と命名した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞ＴＣＲの配列の特徴に基づき、α鎖とβ鎖の定常領域でｇｕｉｄｅ配列(TRA_oligo1-CACCGTCTCTCAGCTGGTACACGGC（SEQ ID NO：243）、TRA_oligo2-AAACGCCGTGTACCAGCTGAGAGAC（SEQ ID NO：244）、TRB_oligo1-CACCGGGCTCAAACACAGCGACCTC（SEQ ID NO：245）、TRB_oligo2-AAACGAGGTCGCTGTGTTTGAGCCC（SEQ ID NO：246)を設計した。
合成したα鎖とβ鎖のｇｕｉｄｅ配列をそれぞれｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ｐｕｒｏとｓｇＲＮＡ－ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ－ＢＳＤレンチウイルスベクターに構築し、パッケーシングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びＰＥＩトランスフェクション試薬と一定の割合で２９３Ｔ細胞に共トランスフェクションし、４８ｈと７２ｈの細胞培養上清を採取し、濃縮した２つのウイルスを同時にヒトＪｕｒｋａｔＴ細胞株に感染した。４８ｈ感染後、２つの薬物のそれぞれの対照群の細胞がすべて死亡するまで、適切な濃度のピューロマイシンとブラストサイジンで殺滅した。生存している細胞について、９６ウェルプレートに単細胞をフローサイトメトリーソーティングして培養した。得られた単一クローン細胞株に対して、ＴＣＲα鎖とβ鎖の抗体を用いてそれぞれ発現を同定し、両鎖が共に欠損した細胞株を得られた内因性ＴＣＲノックアウトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞とし、ＪＣ５と命名した。
【0156】
２、ＣＭＶ ＴＣＲを安定して組み込んだＪＣ５細胞株の構築
実施例２で構築した上記Ｃ２２、Ｃ２７などのｐＨＡＧＥ－ＴＣＲプラスミドをそれぞれパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びトランスフェクション試薬ＰＥＩと一定の割合で混合し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８ｈと７２ｈの細胞培養上清を採取し、濃縮後に対数成長期のＪＣ５細胞（ＭＯＩ＝０．３）に感染した。３日感染後、抗ヒトＣＤ３と抗ヒトＴＣＲαβフロー抗体を用いて細胞を染色し、同じＴＣＲ発現レベルの細胞を選別して培養したものをＪＣ５－ＴＣＲ細胞株とした。
実施例２で構築した上記Ｃ２２、Ｃ２７などのｐＨＡＧＥ－ＴＣＲプラスミドをそれぞれパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２、ｐＭＤ２．Ｇ及びトランスフェクション試薬ＰＥＩと一定の割合で混合し、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。４８ｈと７２ｈの細胞培養上清を採取し、濃縮後に対数成長期のＪＣ５細胞（ＭＯＩ＝０．３）に感染した。３日感染後、抗ヒトＣＤ３と抗ヒトＴＣＲαβフロー抗体を用いて細胞を染色し、同じＴＣＲ発現レベルの細胞を選別して培養したものをＪＣ５－ＴＣＲ細胞株とした。
【0157】
３、ＴＣＲの膜への結合及び親和性の検出
１×１０６ＪＣ５－ＴＣＲ細胞を、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１TMａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＴＣＲαβ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び対応するＣＭＶ ｐｐ６５ｐＭＨＣ４量体－ＡＰＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＡＰＣ）で染色し、その後フローサイトメトリー解析を行った。
図５、６より、調製されたＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶに対して特異的なＣ２２－ＴＣＲ、Ｃ２９－ＴＣＲは、いずれも正しく発現し細胞膜外にディスプレイされ、対応する４量体プローブとは所定の親和性があることが分かった。その中で、Ｃ２－ＴＣＲはＣ２２－ＴＣＲと比較してＣＤＲ領域のいくつかのアミノ酸が異なるだけで、膜への結合（図５Ａ）及び対応する４量体プローブとの親和性（図６Ａ）の効果の差はかなり顕著であった。ＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＱＹＤＰＶＡＡＬＦに対して特異的なＣ２７－ＴＣＲ、Ｃ３０－ＴＣＲ及びＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ１１０１ ＡＴＶＱＧＱＮＬＫに対して特異的なＣ４４－ＴＣＲ、Ｃ４５－ＴＣＲはすべて正しく発現でき、しかも細胞膜外にディスプレイされ、しかも対応する４量体プローブと所定の親和性がある。以上の結果から、本願の実施例の調製により得られたＴＣＲは良好な親和性を有することが明らかになった。
１×１０６ＪＣ５－ＴＣＲ細胞を、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１TMａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＴＣＲαβ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及び対応するＣＭＶ ｐｐ６５ｐＭＨＣ４量体－ＡＰＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｒ－ＡＰＣ）で染色し、その後フローサイトメトリー解析を行った。
図５、６より、調製されたＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ０２０１ ＮＬＶＰＭＶＡＴＶに対して特異的なＣ２２－ＴＣＲ、Ｃ２９－ＴＣＲは、いずれも正しく発現し細胞膜外にディスプレイされ、対応する４量体プローブとは所定の親和性があることが分かった。その中で、Ｃ２－ＴＣＲはＣ２２－ＴＣＲと比較してＣＤＲ領域のいくつかのアミノ酸が異なるだけで、膜への結合（図５Ａ）及び対応する４量体プローブとの親和性（図６Ａ）の効果の差はかなり顕著であった。ＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ２４０２ ＱＹＤＰＶＡＡＬＦに対して特異的なＣ２７－ＴＣＲ、Ｃ３０－ＴＣＲ及びＣＭＶ ｐｐ６５ ＨＬＡ－Ａ＊Ａ１１０１ ＡＴＶＱＧＱＮＬＫに対して特異的なＣ４４－ＴＣＲ、Ｃ４５－ＴＣＲはすべて正しく発現でき、しかも細胞膜外にディスプレイされ、しかも対応する４量体プローブと所定の親和性がある。以上の結果から、本願の実施例の調製により得られたＴＣＲは良好な親和性を有することが明らかになった。
【0158】
実施例４：ヒト初代ＴＣＲ Ｔ細胞の構築及びインビトロ機能検出
【0159】
１．ヒト初代Ｔ細胞の単離、培養及びレンチウイルス感染
スクリーニングされたＴＣＲのＣＭＶ ｐｐ６５抗原に対する認識と殺傷機能をさらに検証するために、リンパ球単離液Ｆｉｃｏｌｌを用いてボランティアの末梢血から単核球（ＰＢＭＣ）を単離した後、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製品の取扱書に従って、ＰＢＭＣから負の選択によりＴ細胞を取得し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ２を含む１６４０完全培地で細胞を１×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆されたシャーレで培養して活性化させた。活性化４８ｈ後、ＴＣＲを担持したウイルス顆粒（実施例３で調製）をレンチウイルスシステムでＴ細胞に感染させ、感染方法は３２℃、１５００ｒｐｍで２ｈ遠心分離し、取り出した後３７℃の細胞インキュベータで１０ｈ培養し、その後培地の交換により感染を停止し、３７℃細胞インキュベータで培養を続けることである。感染３日後、フローサイトメータでＴＣＲ陽性細胞を選別し、ＴＣＲＴ細胞（上記Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４及びＣ４５を含む）を得た。
スクリーニングされたＴＣＲのＣＭＶ ｐｐ６５抗原に対する認識と殺傷機能をさらに検証するために、リンパ球単離液Ｆｉｃｏｌｌを用いてボランティアの末梢血から単核球（ＰＢＭＣ）を単離した後、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製品の取扱書に従って、ＰＢＭＣから負の選択によりＴ細胞を取得し、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ２を含む１６４０完全培地で細胞を１×１０６細胞／ｍＬに再懸濁させ、抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で被覆されたシャーレで培養して活性化させた。活性化４８ｈ後、ＴＣＲを担持したウイルス顆粒（実施例３で調製）をレンチウイルスシステムでＴ細胞に感染させ、感染方法は３２℃、１５００ｒｐｍで２ｈ遠心分離し、取り出した後３７℃の細胞インキュベータで１０ｈ培養し、その後培地の交換により感染を停止し、３７℃細胞インキュベータで培養を続けることである。感染３日後、フローサイトメータでＴＣＲ陽性細胞を選別し、ＴＣＲＴ細胞（上記Ｃ２、Ｃ２２、Ｃ２７、Ｃ２９、Ｃ３０、Ｃ４４及びＣ４５を含む）を得た。
【0160】
２．標的細胞の構築
ｐｐ６５－ＰＵＲＯ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＢＳＤ、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＢＳＤ、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＢＳＤ及びルシフェラーゼ－ＧＦＰをそれぞれ担持したウイルス顆粒をレンタウイルスシステムで対数成長期のＲａｊｉ細胞に感染させた。薬物スクリーニング及びフローサイトメトリーソーティングにより、ｐｐ６５、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／２４０２／１１０１分子及びルシフェラーゼ－ＧＦＰを同時に安定して発現するＲａｊｉ細胞を得、それぞれＲａｊｉ－Ａ０２０１－ｐｐ６５－ルシフェラーゼ、Ｒａｊｉ－Ａ２４０２－ｐｐ６５－ルシフェラーゼ、Ｒａｊｉ－Ａ１１０１－ｐｐ６５－ルシフェラーゼと命名した。
ｐｐ６５－ＰＵＲＯ、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１－ＢＳＤ、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２－ＢＳＤ、ＨＬＡ－Ａ＊１１０１－ＢＳＤ及びルシフェラーゼ－ＧＦＰをそれぞれ担持したウイルス顆粒をレンタウイルスシステムで対数成長期のＲａｊｉ細胞に感染させた。薬物スクリーニング及びフローサイトメトリーソーティングにより、ｐｐ６５、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／２４０２／１１０１分子及びルシフェラーゼ－ＧＦＰを同時に安定して発現するＲａｊｉ細胞を得、それぞれＲａｊｉ－Ａ０２０１－ｐｐ６５－ルシフェラーゼ、Ｒａｊｉ－Ａ２４０２－ｐｐ６５－ルシフェラーゼ、Ｒａｊｉ－Ａ１１０１－ｐｐ６５－ルシフェラーゼと命名した。
【0161】
３．ヒト初代Ｔ細胞におけるＴＣＲのインビトロ機能検証
Ｒａｊｉ／ＨＬＡ－Ａ０２０１／ｐｐ６５及びｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉと命名）と１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ２Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ２２Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ２９Ｔ細胞を１：１の数の比で共培養し、２４時間共培養後、細胞と上清をそれぞれ収集し、ＴＣＲ－Ｃ２２ＴとＴＣＲ－Ｃ２９Ｔ細胞の活性化と標的細胞の死亡を予備的に検出した。細胞外サイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγ（図７参照）の放出レベルから見ると、ＴＣＲ－Ｃ２２ＴとＴＣＲ－Ｃ２９Ｔは標的細胞と共インキュベートした後、対照群１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ２Ｔと比較して、Ｔ細胞の活性化を有意に引き起こすことが明らかになった。標的細胞の分解後に放出されるルシフェラーゼ量は標的細胞の死亡の状況を反映し（図７参照）、本願の実施例で調製されたＴＣＲ－Ｃ２２Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ２９Ｔは、ＣＤＲ構造が類似しているＴＣＲ－Ｃ２Ｔと比較して、標的細胞に対する殺傷効果が顕著である。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＴＣＲ－Ｃ２２Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ２９Ｔ細胞は、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド提示細胞によって特異的に活性化され、標的細胞を有意に殺傷することができることが証明された。
また、ＴＣＲ α鎖とβ鎖のＣＤＲ３高可変領域はＴＣＲの機能に最も大きな影響を与える。実験により、ＣＤＲ３高可変領域は１つのアミノ酸のみが異なるほど高度に類似していても、その機能は非常に異なることが示された。例えば、ＴＣＲ Ｅ１４１のα鎖とβ鎖のＣＤＲ３領域の先頭以降のアミノ酸を順次アラニンに突然変異させ、レンチウイルスベクターに構築し、対応するＴＣＲ－Ｔ細胞を調製した。それを標的細胞と１：１で共培養し、ルシフェラーゼ量並びにサイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγの分泌量を検出した。その結果、突然変異していないＥ１４１はＨＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉに出会った後に標的細胞を効果的に除去でき、しかも大量のサイトカインＩＬ２を特異的に産生することを示した。さらに、ａ３、ａ５、ａ６及びｂ６、ｂ７、ｂ８の各部位では、単一アミノ酸の突然変異がＴＣＲ Ｔ細胞を完全に不活性化させるのに十分であった（詳細については特許ＣＮ２０２０１０３７３１００．４参照）。そのため、突然変異後のＴＣＲは、１つのアミノ酸が異なるだけではあるが、ＴＣＲ－Ｔ細胞を完全に不活性化させるのに十分である。このことから、標的は同じであっても、１つのアミノ酸が異なるだけで２つのほぼ同じＴＣＲが全く異なる技術的効果をもたらすことになり、まして複数のアミノ酸が異なることは言うまでもない。
Ｒａｊｉ／ＨＬＡ２４０２／ｐｐ６５及びｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉと命名）をそれぞれ１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ２７Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞と１：１の数の比で共培養し、２４時間共培養後、細胞と上清をそれぞれ収集し、ＴＣＲ－Ｃ２７Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞の活性化及び標的細胞の生存状況を予備的に検出した。細胞外サイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγ（図８参照）の放出レベルから見ると、ＴＣＲ－Ｃ２７ＴとＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞は標的細胞と共インキュベートした後、対照群１Ｇ４－ＴＣＲＴと比較して、Ｔ細胞の活性化を有意に引き起こすことが明らかになった。標的細胞の分解後に放出されたルシフェラーゼの量はＴＣＲ－Ｃ２７ＴとＴＣＲ－Ｃ３０Ｔが標的細胞を有意に殺傷できることを反映した（図８参照）。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＴＣＲ－Ｃ２７Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞は、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド提示細胞により特異的に活性化され、標的細胞を有意に殺傷できることが証明された。
Ｒａｊｉ／ＨＬＡ１１０１／ｐｐ６５及びｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉと命名）をそれぞれ１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ４４Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞と１：１の数の比で共培養し、２４時間共培養後、細胞と上清をそれぞれ収集し、ＴＣＲ－Ｃ４４Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞の活性化及び標的細胞の生存状況を予備的に測定した。細胞外サイトカインＩＦＮγ（図９参照）の放出レベルから見ると、ＴＣＲ－Ｃ４４ＴとＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞は標的細胞と共インキュベートした後、対照群１Ｇ４－ＴＣＲＴと比較して、有意にＴ細胞の活性化を引き起こすことが明らかになった。標的細胞の分解後に放出されたルシフェラーゼの量はＴＣＲ－Ｃ４４ＴとＴＣＲ－Ｃ４５Ｔが標的細胞を有意に殺傷できることを反映した（図９参照）。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＴＣＲ－Ｃ４４Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞は、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド提示細胞により特異的に活性化され、標的細胞を有意に殺傷できることが証明された。
Ｒａｊｉ／ＨＬＡ－Ａ０２０１／ｐｐ６５及びｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉと命名）と１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ２Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ２２Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ２９Ｔ細胞を１：１の数の比で共培養し、２４時間共培養後、細胞と上清をそれぞれ収集し、ＴＣＲ－Ｃ２２ＴとＴＣＲ－Ｃ２９Ｔ細胞の活性化と標的細胞の死亡を予備的に検出した。細胞外サイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγ（図７参照）の放出レベルから見ると、ＴＣＲ－Ｃ２２ＴとＴＣＲ－Ｃ２９Ｔは標的細胞と共インキュベートした後、対照群１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ２Ｔと比較して、Ｔ細胞の活性化を有意に引き起こすことが明らかになった。標的細胞の分解後に放出されるルシフェラーゼ量は標的細胞の死亡の状況を反映し（図７参照）、本願の実施例で調製されたＴＣＲ－Ｃ２２Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ２９Ｔは、ＣＤＲ構造が類似しているＴＣＲ－Ｃ２Ｔと比較して、標的細胞に対する殺傷効果が顕著である。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＴＣＲ－Ｃ２２Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ２９Ｔ細胞は、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド提示細胞によって特異的に活性化され、標的細胞を有意に殺傷することができることが証明された。
また、ＴＣＲ α鎖とβ鎖のＣＤＲ３高可変領域はＴＣＲの機能に最も大きな影響を与える。実験により、ＣＤＲ３高可変領域は１つのアミノ酸のみが異なるほど高度に類似していても、その機能は非常に異なることが示された。例えば、ＴＣＲ Ｅ１４１のα鎖とβ鎖のＣＤＲ３領域の先頭以降のアミノ酸を順次アラニンに突然変異させ、レンチウイルスベクターに構築し、対応するＴＣＲ－Ｔ細胞を調製した。それを標的細胞と１：１で共培養し、ルシフェラーゼ量並びにサイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγの分泌量を検出した。その結果、突然変異していないＥ１４１はＨＬＡ ｍａｔｃｈｅｄ－Ｒａｊｉに出会った後に標的細胞を効果的に除去でき、しかも大量のサイトカインＩＬ２を特異的に産生することを示した。さらに、ａ３、ａ５、ａ６及びｂ６、ｂ７、ｂ８の各部位では、単一アミノ酸の突然変異がＴＣＲ Ｔ細胞を完全に不活性化させるのに十分であった（詳細については特許ＣＮ２０２０１０３７３１００．４参照）。そのため、突然変異後のＴＣＲは、１つのアミノ酸が異なるだけではあるが、ＴＣＲ－Ｔ細胞を完全に不活性化させるのに十分である。このことから、標的は同じであっても、１つのアミノ酸が異なるだけで２つのほぼ同じＴＣＲが全く異なる技術的効果をもたらすことになり、まして複数のアミノ酸が異なることは言うまでもない。
Ｒａｊｉ／ＨＬＡ２４０２／ｐｐ６５及びｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉと命名）をそれぞれ１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ２７Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞と１：１の数の比で共培養し、２４時間共培養後、細胞と上清をそれぞれ収集し、ＴＣＲ－Ｃ２７Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞の活性化及び標的細胞の生存状況を予備的に検出した。細胞外サイトカインＴＮＦα、ＩＬ２及びＩＦＮγ（図８参照）の放出レベルから見ると、ＴＣＲ－Ｃ２７ＴとＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞は標的細胞と共インキュベートした後、対照群１Ｇ４－ＴＣＲＴと比較して、Ｔ細胞の活性化を有意に引き起こすことが明らかになった。標的細胞の分解後に放出されたルシフェラーゼの量はＴＣＲ－Ｃ２７ＴとＴＣＲ－Ｃ３０Ｔが標的細胞を有意に殺傷できることを反映した（図８参照）。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＴＣＲ－Ｃ２７Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ３０Ｔ細胞は、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド提示細胞により特異的に活性化され、標的細胞を有意に殺傷できることが証明された。
Ｒａｊｉ／ＨＬＡ１１０１／ｐｐ６５及びｐｐ６５をトランスフェクションしていないＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉと命名）をそれぞれ１Ｇ４－ＴＣＲＴ、ＴＣＲ－Ｃ４４Ｔ、ＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞と１：１の数の比で共培養し、２４時間共培養後、細胞と上清をそれぞれ収集し、ＴＣＲ－Ｃ４４Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞の活性化及び標的細胞の生存状況を予備的に測定した。細胞外サイトカインＩＦＮγ（図９参照）の放出レベルから見ると、ＴＣＲ－Ｃ４４ＴとＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞は標的細胞と共インキュベートした後、対照群１Ｇ４－ＴＣＲＴと比較して、有意にＴ細胞の活性化を引き起こすことが明らかになった。標的細胞の分解後に放出されたルシフェラーゼの量はＴＣＲ－Ｃ４４ＴとＴＣＲ－Ｃ４５Ｔが標的細胞を有意に殺傷できることを反映した（図９参照）。実験の結果、本発明の実施例により構築されたＴＣＲ－Ｃ４４Ｔ及びＴＣＲ－Ｃ４５Ｔ細胞は、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原ペプチド提示細胞により特異的に活性化され、標的細胞を有意に殺傷できることが証明された。
【0162】
実施例５：動物モデルの構築及びＣＭＶ ＴＣＲ－Ｔインビボ機能の検出
３×１０５ Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１／０２０１／２４０２－ｐｐ６５－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を５～６週齢のＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒγ ｎｕｌｌ（ＮＣＧ）雌マウスに尾静脈を通して接種し、リンパ腫モデルを構築し（図１０、１４、１７参照）、これを１日目とし、６日目に、マウスを３つの群に分け、それぞれＡ：ＰＢＳ注射群（等体積ＰＢＳ注射）、Ｂ：対照ＮＣ細胞注射群（ＮＣ Ｔ細胞）、Ｃ：ＣＭＶ ＴＣＲ Ｔ注射群（Ｃ２２／Ｃ２７／Ｃ４５－ＴＣＲ Ｔ細胞）とし、Ｂ群のマウスには１×１０７ ＮＣ Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ｃ群のマウスには１×１０７ ＴＣＲ Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ａ群には等体積２００μＬのＰＢＳを注射した。他のＴＣＲ Ｔ細胞の具体的な再注入量と再注入時間を図１４、１７に示す。その後数週間、マウス体内の腫瘍細胞の増殖、Ｔ細胞の体内増殖及びマウスの生存を監視し、図１０～１３に示すように、本発明の実施例で構築されたＣＭＶ特異的Ｃ２２－ＴＣＲ Ｔ細胞は、対照群と比較して、マウス体内の腫瘍細胞を有意に殺傷し（図１０）、マウスの生存率を向上させ（図１１、図１２）、再注入されたＴＣＲ Ｔ細胞は生体内で特異的に増殖した（図１３）。さらに、図１４～１９に示すように、本発明の実施例で構築されたＣＭＶ特異的Ｃ２７－ＴＣＲ Ｔ、Ｃ４５－ＴＣＲ Ｔ細胞は、対照群と比較して、マウス体内の腫瘍細胞を有意に殺傷することができた。
３×１０５ Ｒａｊｉ－ＨＬＡ－Ａ＊１１０１／０２０１／２４０２－ｐｐ６５－ルシフェラーゼ腫瘍細胞を５～６週齢のＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒγ ｎｕｌｌ（ＮＣＧ）雌マウスに尾静脈を通して接種し、リンパ腫モデルを構築し（図１０、１４、１７参照）、これを１日目とし、６日目に、マウスを３つの群に分け、それぞれＡ：ＰＢＳ注射群（等体積ＰＢＳ注射）、Ｂ：対照ＮＣ細胞注射群（ＮＣ Ｔ細胞）、Ｃ：ＣＭＶ ＴＣＲ Ｔ注射群（Ｃ２２／Ｃ２７／Ｃ４５－ＴＣＲ Ｔ細胞）とし、Ｂ群のマウスには１×１０７ ＮＣ Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ｃ群のマウスには１×１０７ ＴＣＲ Ｔ細胞を尾静脈注射し、Ａ群には等体積２００μＬのＰＢＳを注射した。他のＴＣＲ Ｔ細胞の具体的な再注入量と再注入時間を図１４、１７に示す。その後数週間、マウス体内の腫瘍細胞の増殖、Ｔ細胞の体内増殖及びマウスの生存を監視し、図１０～１３に示すように、本発明の実施例で構築されたＣＭＶ特異的Ｃ２２－ＴＣＲ Ｔ細胞は、対照群と比較して、マウス体内の腫瘍細胞を有意に殺傷し（図１０）、マウスの生存率を向上させ（図１１、図１２）、再注入されたＴＣＲ Ｔ細胞は生体内で特異的に増殖した（図１３）。さらに、図１４～１９に示すように、本発明の実施例で構築されたＣＭＶ特異的Ｃ２７－ＴＣＲ Ｔ、Ｃ４５－ＴＣＲ Ｔ細胞は、対照群と比較して、マウス体内の腫瘍細胞を有意に殺傷することができた。
【0163】
以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態における詳細に限定されるものではなく、本発明の技術的発想の範囲内において、本発明の技術的解決手段に対して、本発明の特許範囲に属する様々な簡単な変形を施すことができる。
【0164】
なお、上記の特定実施形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾しない限り、任意の適切な方法で組み合わせてもよく、不必要な重複を避けるために、本発明は種々の可能な組み合わせの方式については別途説明しない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-12
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＭＶ ｐｐ６５に特異的に結合し、重鎖のＣＤＲ Ｈ１～ＣＤＲ Ｈ３及び／又は軽鎖のＣＤＲ Ｌ１～ＣＤＲ Ｌ３を含み、ＣＤＲ Ｈ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｌ３のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
ＣＤＲ Ｈ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｈ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｌ１のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ Ｌ２のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
ＣＭＶ ｐｐ６５の結合エピトープはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ、２つ又は３つの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記ＣＤＲ Ｈ１～ＣＤＲ Ｈ３及びＣＤＲ Ｌ１～ＣＤＲ Ｌ３は以下より選択されるいずれか１群であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。【請求項5】
軽鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項6】
重鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項7】
単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体ｓｃＦｖであることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項8】
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項9】
ＣＭＶ ｐｐ６５に特異的に結合し、α鎖のＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及び／又はβ鎖のＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βを含み、ＣＤＲ３αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２～１７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ３βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８～３３のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とするＴ細胞抗原受容体。
【請求項10】
ＣＤＲ１αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４～７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２αのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１１のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ１βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含み、ＣＤＲ２βのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２７のうちのいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項９に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項11】
ＣＭＶ ｐｐ６５の結合エピトープはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ、２つ又は３つの組み合わせを含むことを特徴とする請求項９～１０のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項12】
前記ＣＤＲ１α～ＣＤＲ３α及びＣＤＲ１β～ＣＤＲ３βは以下のいずれか１群を含むことを特徴とする請求項９～１１のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。【請求項13】
β鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７～２５２のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項９～１２のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項14】
そのα鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３～２５８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項９～１３のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項15】
α鎖とβ鎖のアミノ酸は直接連結又は間接的に連結され、好ましくは間接的に連結され、より好ましくはｆｐ２Ａを介して連結されることを特徴とする請求項９～１４のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項16】
アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のうちのいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３８、４０、４２、４４又は４６のいずれか１つで示されるアミノ酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項９～１５のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体。
【請求項17】
請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体又は請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項18】
配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３９、４１、４３、４５又は４７のいずれか１つで示される核酸配列とは少なくとも８０％の相同性を有するものを含むことを特徴とする請求項１７に記載の核酸。
【請求項19】
請求項１７～１８のいずれか１項に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項20】
請求項１７～１８のいずれか１項に記載の核酸又は請求項１９に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項21】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を発現することを特徴とする免疫細胞。
【請求項22】
１つ又は複数の請求項１７～１８のいずれか１項に記載の異種核酸配列を含むことを特徴とする請求項２１に記載の免疫細胞。
【請求項23】
Ｔ細胞又は幹細胞より選択され、好ましくは、被検者のＴ細胞から単離されることを特徴とする請求項２１又は２２に記載の免疫細胞。
【請求項24】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体をコードする核酸配列を免疫細胞にトランスフェクションして発現させることで、免疫細胞を得るステップを含むことを特徴とする免疫細胞の調製方法。
【請求項25】
細胞の内因性ＴＣＲをノックダウンするステップをさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の調製方法。
【請求項26】
陽性Ｔ細胞をクローニングして請求項１７～１８のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ１）と、初代Ｔ細胞を単離して培養するステップ２）と、
ステップ１）で得た核酸をステップ２）の前記初代Ｔ細胞に送達し、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を発現した組換えＴ細胞を得るステップ３）と、を含むことを特徴とする組換えＴ細胞の調製方法。
【請求項27】
陽性Ｔ細胞をクローニングして請求項１７～１８のいずれか１項に記載の核酸を得るステップ（１）と、ステップ（１）で得た核酸をベクター骨格に連結し、発現ベクターを取得するステップ（２）と、
ステップ（２）で得た発現ベクターを宿主細胞に形質転換した後、その発現を誘導するステップ（３）と、
Ｔ細胞抗原受容体を取得するステップ（４）と、を含むことを特徴とするＴ細胞抗原受容体の調製方法。
【請求項28】
請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体を含むことを特徴とする多量体複合体。
【請求項29】
単量体、ビオチン分子、及びストレプトアビジン分子又はアビジン分子をさらに含み、前記単量体はＭＨＣ分子α鎖細胞外領域とβ２ｍ鎖及び抗原ペプチドを含み、前記単量体は前記ビオチン分子にカップリングされ、前記ビオチン分子は前記ストレプトアビジン又はアビジン分子に結合され、好ましくは、前記抗原ペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３のうちのいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせを含み、
好ましくは、前記ＭＨＣ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊２４０２及びＨＬＡ－Ａ＊１１０１より選択されることを特徴とする請求項２８に記載の多量体複合体。
【請求項30】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、請求項１７～１８のいずれか１項に記載の核酸、請求項１９に記載の発現ベクター、請求項２０に記載の宿主細胞、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の免疫細胞、請求項２８～２９のいずれか１項に記載の多量体複合体の、腫瘍又はＣＭＶ関連疾患を診断又は治療する製品の調製における使用。
【請求項31】
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、請求項１７～１８のいずれか１項に記載の核酸、請求項１９に記載の発現ベクター、請求項２０に記載の宿主細胞、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の免疫細胞、請求項２８～２９のいずれか１項に記載の多量体複合体の、Ｔ細胞標識、検出、細胞選別又は活性化における使用。
【請求項32】
ｉ）請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片、ｉｉ）請求項９～１６のいずれか１項に記載のＴ細胞抗原受容体、
ｉｉｉ）請求項１７～１８のいずれか１項に記載の核酸、
ｉｖ）請求項１９に記載の発現ベクター、
ｖ）請求項２０に記載の宿主細胞、
ｖｉ）請求項２１～２３のいずれか１項に記載の免疫細胞、又は
ｖｉｉ）請求項２８～２９のいずれか１項に記載の多量体複合体のうちのいずれか１群を含む医薬組成物又はキット。
【国際調査報告】