特表 2023-532199 プロテアソーム阻害剤治療のためのバイオマーカーに基づく患者選択

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-27

(54)【発明の名称】プロテアソーム阻害剤治療のためのバイオマーカーに基づく患者選択

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/08 20060101AFI20230720BHJP

   C12Q 1/6886 20180101ALI20230720BHJP

   A61K 31/69 20060101ALI20230720BHJP

   A61K 38/07 20060101ALI20230720BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230720BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230720BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20230720BHJP

【ＦＩ】

A61K45/08

C12Q1/6886 Z

A61K31/69

A61K38/07

A61P43/00 111

A61P35/00

G01N33/50 P

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022577525

(86)(22)【出願日】2021-06-17

(85)【翻訳文提出日】2023-02-16

(86)【国際出願番号】 US2021037943

(87)【国際公開番号】W WO2021257910

(87)【国際公開日】2021-12-23

(31)【優先権主張番号】63/040,442

(32)【優先日】2020-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ｉＰｈｏｎｅ

(71)【出願人】

【識別番号】508087147

【氏名又は名称】ユニヴァーシティー オブ ユタ リサーチ ファウンデーション

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】ウインター ジェイコブ エム

(72)【発明者】

【氏名】ラター ジャレド

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

2G045AA26

2G045DA13

2G045DA14

4B063QA01

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ42

4B063QQ53

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS25

4B063QS34

4B063QX02

4C084AA02

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA16

4C084BA32

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZC20

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA43

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC20

(57)【要約】

方法又は組成物のいずれかが、本明細書において開示される。がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することを含み、がんを有する対象が、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有する、方法が開示される。がんを診断及び治療する方法であって、対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することと、対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することと、を含む、方法が開示される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する前記対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することを含み、がんを有する前記対象が、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有する、前記方法。

【請求項2】

前記対象が、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子を更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＡＴＡＤ１遺伝子の一部分又は全てが、欠失されている、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＰＴＥＮ遺伝子の全ての一部分が、欠失されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記対象が、乳がん、肺がん、結腸がん、脳がん、又は前立腺がんを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

対象においてがんを診断及び治療する方法であって、
ａ）対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することと、
ｂ）前記対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することと、を含む、前記方法。

【請求項7】

前記対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することが、前記対象を、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有するとして識別することを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することが、前記対象を、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子を有するとして識別することを更に含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することが、ＢＩＭレベルの増加を検出することを更に含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

ＢＩＭレベルの増加が、標準と比較した増加である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有する対象が、欠失された前記ＡＴＡＤ１遺伝子の全ての一部分を有する対象である、請求項６～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

非機能性ＰＴＥＮ遺伝子を有する対象が、欠失された前記ＰＴＥＮ遺伝子の全ての一部分を有する対象である、請求項６～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記対象が、乳がん、肺がん、結腸がん、脳がん、又は前立腺がんを有する、請求項６～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

対象においてアポトーシスを増加させる方法であって、前記対象にプロテアソーム阻害剤を投与することを含み、前記対象が、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を含む、前記方法。

【請求項15】

前記対象が、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子を更に含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有する対象が、欠失された前記ＡＴＡＤ１遺伝子の全ての一部分を有する対象である、請求項１４又は１５に記載の方法。

【請求項17】

非機能性ＰＴＥＮ遺伝子を有する対象が、欠失された前記ＰＴＥＮ遺伝子の全ての一部分を有する対象である、請求項１５又は１６に記載の方法。

【請求項18】

前記対象が、がんを有する、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記対象が、乳がん、肺がん、結腸がん、脳がん、又は前立腺がんを有する、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブ、イキサゾミブ又はカーフィルゾミブである、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

以下の順序で、
（ａ）がん患者から試料を得るステップと；
（ｂ）前記対象が前記試料中に非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有するかどうかを判定するステップと；
（ｃ）前記対象が非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有する場合、プロテアソーム阻害剤による治療に好適な候補として、前記がん患者を識別するステップと；
（ｄ）前記好適な候補として識別された前記がん患者にプロテアソーム阻害剤を投与し、前記がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有しない場合には、プロテアソーム阻害剤を前記がん患者に投与しないステップと、を含む、方法。

【請求項22】

がんを有する対象におけるプロテアソーム阻害剤の有効性を増強する方法であって、前記対象に、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有する対象に対して有効量のプロテアソーム阻害剤を投与すること、を含む、前記方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／０４０，４４２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（米国国立衛生研究所）によって授与された、付与番号ＣＡ２４３４４０及びＧＭ１１５１７４の下で政府支援により行われた。政府は、本発明における特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

腫瘍抑制遺伝子であるＰＴＥＮは、ヒトがんにおいて最も一般的な欠失遺伝子のうちの１つである（１）。ＰＴＥＮ欠失は、多くの場合、隣接する遺伝子座を含む、染色体１０ｑ２３上の隣接ＤＮＡの多くのキロベース（ｋｂ）を包含する。ＰＴＥＮに最も近い遺伝子のうちの１つは、ＡＴＡＤ１であり、これは、外側ミトコンドリア膜（ＯＭＭ）上のタンパク質品質制御に関与するＡＡＡ＋ＡＴＰａｓｅをコードする（２～６）。ＡＴＡＤ１は、ヒト及びマウスの生命に不可欠であり、１０億年の進化にわたって保存されており、酵母及びヒトを分離する（６、７）。本明細書では、ＡＴＡＤ１のＰＴＥＮとの共欠失が、ユビキチンプロテアソームシステム（ＵＰＳ）の機能障害に対して細胞を感作する方法について説明する。ＡＴＡＤ１は、ＯＭＭからアポトーシス促進タンパク質ＢＩＭを直接抽出し、タンパク質品質制御が、臨床的に関連する設定において、細胞死とどのように相互作用するかを実証する。

【発明の概要】

【0004】

方法又は組成物のいずれかが、本明細書において開示される。

【0005】

がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することを含み、がんを有する対象が、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を有する、方法が開示されている。

【0006】

がんを診断及び治療する方法であって、対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することと、対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することと、を含む、方法が開示される。

【0007】

開示された方法及び組成物の追加の利点は、以下の説明において部分的に記載され、かつ説明から部分的に理解されるか、又は開示された方法及び組成物の実施によって習得され得る。開示される方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成される。前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、単に例示的及び説明的であり、特許請求される発明を限定するものではないことを理解されたい。

【0008】

本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、開示された方法及び組成物のいくつかの実施形態を例示し、説明とともに、開示された方法及び組成物の原理を説明する役割を果たす。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1A】ＡＴＡＤ１が種々のがんにおけるパッセンジャー遺伝子としてＰＴＥＮと頻繁に共欠失されることを示す。（Ａ）ヒトＣｈｒ１０ｑ２３．３１上のＡＴＡＤ１及びＰＴＥＮ遺伝子座の概略図；（Ｂ）ＰＴＥＮ－ヌル前立腺がんを有する患者におけるＩＨＣによるＡＴＡＤ１の喪失を評価すること；（Ｃ）ＰＴＥＮ－ヌル腫瘍を有する２人の患者からの代表的な組織学及びＩＨＣ；（Ｄ）ＡＴＡＤ１及びＰＴＥＮの共欠失、及びＡＴＡＤ１単独での変異の欠如を示すＴＣＧＡ腫瘍プリント；（Ｅ）がん、ＴＣＧＡにわたるＡＴＡＤ１の変化の頻度。

【図1B】同上

【図1C】同上

【図1D】同上

【図1E】同上

【図2A】ゲノム全体のＣＲＩＳＰＲスクリーニングが、ＡＴＡＤ１との遺伝的相互作用を識別することを示す；（Ａ）ＣＲＩＳＰＲスクリーニング戦略の概略図；（Ｂ）Ｊｕｒｋａｔ細胞のＰＴＥＮ－ヌル遺伝的背景におけるクローンＡＴＡＤ１ノックアウトの生成、及びＲＰＭＩ１６４０培地中のＡＴＡＤ１Δ及びＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞の増殖速度；（Ｃ）ＣＲＩＳＰＲスクリーニング結果の火山プロット；ＣＲＩＳＰＲスコアを、所与の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの平均Ｌｏｇ₂倍変化として定義した。差分ＣＲＩＳＰＲスコア（ｄＣＳ）は、ＷＴ ＣＳをＡＴＡＤ１Δ ＣＳから差し引くことによって計算した。ｄＣＳ複合は、各クローンのｄＣＳ値の合計である。Ｐ値は、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正及びＰ値メタ分析のためのフィッシャー法を用いて、コルモゴロフ－スミルノフを使用して各遺伝子について計算した。破線は、ｄＣＳ＜－２及びＰ_adj＜０．０５で区切っている；（Ｄ）ＤｅｐＭａｐデータはＭＡＲＣＨ５依存性とＭＣＬ１依存性との相関を示す；（Ｅ）ＷＴ又はＡＴＡＤ１ΔＪｕｒｋａｔ細胞からの全細胞溶解物のウェスタンブロットであって、ＢＩＭ、ＭＣＬ１、及びＦＩＳ１、非ＢＣＬ２ファミリーコントロールの定常状態レベルを示す；（Ｆ）ＡＴＡＤ１Δ細胞中のＢＩＭ_ELレベルの定量化；ｎ＝６個の独立した実験；（Ｇ）ＭＣＬ１阻害剤、ＡＭＧ１７６で２４時間処理した後のＷＴ又はＡＴＡＤ１ΔＪｕｒｋａｔ細胞の生存性。

【図2B】同上

【図2C】同上

【図2D】同上

【図2E】同上

【図2F】同上

【図2G】同上

【図3A】ＡＴＡＤ１は、膜からＢＩＭを直接抽出することによって、ＢＩＭ媒介性アポトーシスプライミングから細胞を保護することを示す；（Ａ）ミトコンドリア外膜透過性（ＭＯＭＰ）のＢＣＬ２ファミリー制御の簡略化された概略図；ＢＣＬ２ファミリータンパク質の結合選好については、図Ｓ３Ａを参照されたい；（Ｂ）Ｄｅｌ１０ｑ２３細胞（Ｈ４；ＰＴＥＮ－ヌル、ＡＴＡＤ１－ヌル）を用いたＢＨ３－プロファイリングであって、ＥＶ、触媒的に死んだＡＴＡＤ１^E193Q、又は野生型ＡＴＡＤ１は、安定的に再発現されている；ヒートマップは、３個の生物学的複製の平均として、シトクロムＣの部分的放出（ＭＯＭＰ）を表示し；（Ｃ）テトラサイクリン誘導性ＧＦＰ又はＧＦＰ－ＢＩＭ_EL融合を安定的に発現し、ドキシサイクリンで４８時間処理されたＡＴＡＤ１－ヌル又はＷＴ Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存率；（Ｄ）ＡＴＡＤ１野生型又はノックアウト細胞におけるＧＦＰ－ＢＩＭ_EL誘導に応答して、ＰＡＲＰ切断により検出されるアポトーシス；（Ｅ）ＢＡＫ１欠失背景のＡＴＡＤ１Δ細胞におけるＧＦＰ－ＢＩＭ_ELタンパク質のウェスタンブロット。細胞をドキシサイクリン（２５０ｎｇ／ｍＬ）で２４時間処理し、（Ｆ）ＡＴＡＤ１－ＦＬＡＧ又はＥＶを安定して発現する細胞におけるＡＴＡＤ１－ＦＬＡＧ／ＨＡ及びＧＦＰ－ＢＩＭ_ELの共免疫沈降であって、ｚＶＡＤ－ｆｍｋの存在下でＧＦＰ－ＢＩＭ_ELで一晩一過性にトランスフェクトしたもの；（Ｇ）ＲＰＭＩ７９５１細胞をＭＧ１３２（１０μＭ）で４時間処理し、全細胞溶解物を準備し、ウェスタンブロットによって分析した。（Ｈ）再構築されたプロテオリポソーム抽出アッセイの概略図；（Ｉ）Ｈｉｓ－ＡＴＡＤ１及び３ｘＦＬＡＧ－ＢＩＭ_L（レーン１～４、９～２０）、又は陰性対照ＴＡタンパク質、３ｘＦＬＡＧ－Ｆｉｓ１（レーン５～８）を使用した抽出アッセイ；ＧＳＴタグ付きＳＧＴＡ及びカルモジュリン（ＣａＭ）は、抽出されたＴＡタンパク質を捕捉するためのシャペロンとして含まれる。「Ｉ」＝入力、「ＦＴ」＝フロースルー、「Ｗ」＝最終洗浄、「Ｅ」＝溶出。溶出画分は、ＡＴＡＤ１によって抽出され、ＧＳＴタグ付きシャペロンによって結合されたＴＡタンパク質を表し、溶出「Ｅ」を入力「Ｉ」と比較する。†は、Ｐ＜０．０００１を示す。

【図3B】同上

【図3C】同上

【図3D】同上

【図3E】同上

【図3F】同上

【図3G】同上

【図3H】同上

【図3I】同上

【図4A】ＡＴＡＤ１が、プロテアソーム機能不全によって誘導されるアポトーシスから細胞を保護することを示す。（Ａ）ＥＶ又はＡＴＡＤ１－ＦＬＡＧで形質導入し、指示薬物で２４時間処理したＳＷ１０８８細胞の生存率；（Ｂ）ＳＷ１０８８細胞におけるボルテゾミブ処理に応答した生存率の時間経過；（Ｃ）１０ｎＭのボルテゾミブで８時間処理したＲＰＭＩ７９５１全細胞溶解物のウェスタンブロット；（Ｄ）Ｃの定量化；（Ｅ）ＢＴＺ及び汎カスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ－ＦＭＫ（２０μＭ）又はＤＭＳＯ（ｚＶＡＤビヒクル）での１６時間処理に応答した再発現ＲＰＭＩ７９５１細胞に対するＡＴＡＤ１－ヌルの生存率；（Ｆ）Ｅと同じであるが、生存率はクリスタルバイオレット染色によって測定し、（Ｇ）で定量化した。（Ｈ）プロテアソーム阻害剤毒性におけるＡＴＡＤ１の役割を説明する概略図；（Ｉ）ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるＳＷ１０８８細胞の経時的な皮下異種移植片の腫瘍サイズ；（Ｊ）経時的な触知可能な腫瘍の発生率、又は腫瘍なしの生存率；（Ｋ）クリスタルバイオレット染色で測定した培養ＳＷ１０８８細胞の増殖、ｎ＝２の別々の実験。†は、Ｐ＜０．０００１を表す。

【図4B】同上

【図4C】同上

【図4D】同上

【図4E】同上

【図4F】同上

【図4G】同上

【図4H】同上

【図4I】同上

【図4J】同上

【図4K】同上

【図5】ＡＴＡＤ１及びＰＴＥＮ ＩＨＣを、ＰＴＥＮ陽性腫瘍を有する１５人の患者からの生検で実施し、ＡＴＡＤ１は、全ての（ＰＴＥＮ陽性）試料で検出可能であったことを示す。

【図6A】ＡＴＡＤ１との遺伝的相互作用に関するゲノム全体のＣＲＩＳＰＲスクリーニングを示す。（Ａ）互いにプロットした各クローン細胞株対ＷＴの差分ＣＲＩＳＰＲスコア。ピアソン係数＝０．５１、Ｐ＝２．１６×１０～１６。（Ｂ）ＭＡＲＣＨ５を標的とする各ｓｇＲＮＡの微分（示差）倍率変化についてのｓｇＲＮＡレベルのデータ；（Ｃ）ＡＣＯＴ１１についてのＢと同じである。

【図6B】同上

【図6C】同上

【図7A】（Ａ）図３ＢのＢＨ３プロファイリング実験に関連するＢＨ３ペプチド及びＢＨ３模倣小分子の結合パターンを示し、Ｌｅｔａｉ，Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１７、及びＫａｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ及びＤｉｆｆ，２０１８に由来する；（Ｂ）Ｔｅｔ－ＯＮ ＧＦＰ－ＢＩＭＥＬを安定的に発現するＢＡＫ１Δ及びＢＡＫ１Δ ＡＴＡＤ１Δ細胞株の全細胞溶解物中のＢＩＭアイソフォームのウェスタンブロットの定量化。「ＧＦＰ－ＢＩＭＥＬ」は異所性融合タンパク質を示し、一方で「ＢＩＭＥＬ」及び「ＢＩＭＬ」は内因性である。細胞を、採取前に２４時間、２５０ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリンで処理した。ｎ＝３の独立した実験；（Ｃ）可溶性Ｈｉｓ－Ｍｓｐ１及び全長Ｍｓｐ１；（Ｄ）プロテオリポソームからの抽出物ＢＩＭＬ￢。（Ｅ）抽出アッセイは、Ｍｓｐ１の生理学的基質選択性を再現する。残基の疎水性パッチがＴＭＤのＮ末端に挿入されると、Ｆｉｓ１が抽出される（「Ｆｉｓ１－パッチ」）。Ｓｅｃ２２及びＳｅｃ６１ｂは、Ｍｓｐ１がＥＲネイティブＴＡタンパク質を認識することができることを示す陽性対照である。

【図7B】同上

【図7C】同上

【図7D】同上

【図7E】同上

【図8A】Ｄｅｌ（１０ｑ２３）細胞におけるＡＴＡＤ１発現の回復により、プロテアソーム阻害剤に対する耐性が増加することを示す。（Ａ）ＲＰＭＩ７９５１細胞をボルテゾミブ又はカーフィルゾミブで１６時間処理し、生存率をＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏによって測定した。（Ｂ）ボルテゾミブ（３．１２５ｎＭ）ｎ＝３個の生物学的複製物で処理したＲＰＭＩ７９５１細胞の時間経過；（Ｃ）ＳＷ１０８８細胞を５ ｎＭのボルテゾミブ中で４８時間培養し、ＲＰＭＩ７９５１細胞を２４時間培養し、生存率をクリスタルバイオレット染色によって評価した；（Ｄ）Ｈ４細胞をボルテゾミブで２４時間処理し、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏで評価した；（Ｅ）ＡＴＡＤ１アドバックにより、ＳＷ１０８８細胞中のボルテゾミブに応答して、ミトコンドリア形態表現型を回復する。細胞をＢＴＺ（１０ｎＭ）で１２時間処理し、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ（ミトトラッカーレッド）で染色し、次いで広視野蛍光顕微鏡で撮像し、（Ｆ）ＤｅｐＭａｐ細胞株でのＡＴＡＤ１の発現、ＰＣ３細胞（ＡＴＡＤ１半接合型）及び２つのＤｅｌ１０ｑ２３細胞株を強調した；（Ｇ）非標的Ｃａｓ９のみを対照（ＬＣｖ２Ｇ）としてｓｇＡＴＡＤ１（ＬＣｖ２Ｇ中）の安定した発現を用いた、ＡＴＡＤ１欠損ポリクローナルＰＣ３細胞の生成；（Ｈ）ＡＴＡＤ１の欠失は、ＰＣ３細胞でのボルテゾミブに対する感受性を増加させる。（Ｉ）ＡＴＡＤ１ＷＴの過剰発現は、ＡＴＡＤ１Ｅ１９３Ｑではなく、ボルテゾミブに対する耐性を増加させる。

【図8B】同上

【図8C】同上

【図8D】同上

【図8E】同上

【図8F】同上

【図8G】同上

【図8H】同上

【図8I】同上

【発明を実施するための形態】

【0010】

開示される方法及び組成物は、特定の実施形態の以下の詳細な説明及びその中に含まれる実施例、並びに図及びそれらの前後の説明を参照することにより、より容易に理解され得る。

【0011】

開示される方法及び組成物は、別途指定されない限り、特定の合成方法、特定の分析技術、又は特定の試薬に限定されず、したがって、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0012】

開示された方法及び組成物に使用することができ、これらと併用することができ、これらの調製に使用することができ、又はこれらの生成物である、材料、組成物、及び成分が開示されている。これら及び他の材料を本明細書に開示し、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示される場合、これらの化合物の様々な個別及び集合の組み合わせ及び順列のそれぞれの具体的な参照が明示的に開示されない場合があるが、それぞれが本明細書に具体的に企図及び記載されることを理解されたい。したがって、分子Ａ、Ｂ、及びＣのクラス、並びに分子Ｄ、Ｅ、及びＦのクラス、並びに組み合わせ分子の例が開示される場合、Ａ～Ｄが開示され、次いで、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれが個別に及び集合的に企図される。したがって、この例では、組み合わせＡ－Ｅ、Ａ－Ｆ、Ｂ－Ｄ、Ｂ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、Ｃ－Ｄ、Ｃ－Ｅ、及びＣ－Ｆの各々が具体的に企図され、Ａ、Ｂ、及びＣ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、並びに例示的な組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されると考えるべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組み合わせも具体的に企図及び開示される。したがって、例えば、Ａ－Ｅ、Ｂ－Ｆ、及びＣ－Ｅのサブグループが具体的に企図され、Ａ、Ｂ、及びＣ、Ｄ、Ｅ、及びＦ、並びに例示的な組み合わせＡ－Ｄの開示から開示されるとみなされるべきである。この概念は、開示される組成物の作製及び使用方法におけるステップを含むが、これらに限定されない、本出願の全ての態様に適用される。したがって、実施され得る様々な追加のステップが存在する場合、これらの追加のステップのそれぞれが、開示された方法の任意の特定の実施形態又は実施形態の組み合わせで実施され得ること、及びそのような組み合わせのそれぞれが具体的に企図され、開示されたものとみなされるべきであることを理解されたい。

【0013】

Ａ．定義
開示される方法及び組成物は、これらが変化し得るように記載される特定の方法、プロトコル、及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0014】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「対象」への言及は、複数のそのような対象を含み、「プロテアソーム阻害剤」への言及は、当業者に既知の１つ以上のプロテアソーム阻害剤及びその等価物への言及等である。

【0015】

本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、同義的に使用され得、例えば、実験、診断、及び／又は治療目的のために、本発明の組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、非ヒト霊長類及びヒト等の哺乳動物；鳥類；ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ及びブタ等の家畜動物又は農耕動物；マウス、ラット及びモルモット等の実験動物；ウサギ；魚；爬虫類；動物園及び野生動物）が挙げられる。典型的には、「対象」は、ヒト及び霊長類等の哺乳動物を含む動物である。

【0016】

「治療」とは、疾患若しくは状態の効果の悪化を予防若しくは遅延させるために、又は疾患若しくは状態（例えば、がん）の効果を部分的に若しくは完全に逆転させるために、がんを発症させる感受性が増加した、ヒト若しくは他の哺乳動物（例えば、動物モデル）などの対象に、プロテアソーム阻害剤などの治療薬を投与することを意味する。

【0017】

「予防する」とは、がんの発症に対する増加された感受性を有する対象という可能性を最小限に抑えることを意味する。

【0018】

本明細書で使用される場合、「投与する」及び「投与」という用語は、プロテアソーム阻害剤などの治療薬を対象に提供する任意の方法を指す。かかる方法は、当業者に周知であり、経口投与、経皮投与、吸入による投与、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼科投与、耳内投与、脳内投与、直腸投与、舌下投与、口腔投与、及び静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、及び皮下投与などの注射剤を含む非経口投与を含むが、これらに限定されない。投与は、連続的又は間欠的であり得る。様々な態様において、調製物は、治療的に投与することができる、すなわち、既存の疾患又は状態を治療するために投与される。更なる様々な態様において、調製物は、予防的に投与され得る、すなわち、疾患又は状態の予防のために投与される。ある態様において、当業者は、対象を治療するために、有効な用量、有効なスケジュール、又は有効な投与経路を判定することができる。

【0019】

本明細書で使用される場合、「生体試料」は、哺乳動物、特にヒト患者、例えば、体液（血液、唾液、尿等）、生検、組織、及び／又は患者からの廃棄物に由来することができるか又は由来する任意の試料を指す。したがって、組織生検、便、痰、唾液、血液、血漿、血清、リンパ、涙、汗、尿、膣分泌物等は、本質的に、適切な核酸を含有する目的の任意の組織と同様に、ＳＮＰについて容易にスクリーニングすることができる。これらの試料は、通常、インフォームドコンセントの後、標準的な医療検査法によって患者から採取される。試料は、患者から直接得られた形態であり得るか、又は少なくともいくつかの非核酸材料を除去するために、少なくとも部分的に処理（精製）され得る。

【0020】

本明細書で使用される場合、「調節する」は、増加又は減少によって変更することを意味することを意味する。調節は、活性又は機能又は数値の変化を意味し得る。変化は、活性、機能、若しくは数の増加又は減少、増強又は阻害であり得る。

【0021】

「任意選択的な」又は「任意選択的に」とは、後述の事象、状況、又は材料が発生し得る、又は発生しない場合がある、又は存在し得ることを意味し、この記述は、事象、状況、又は材料が発生する、又は存在する場合、及びそれが発生しない、又は存在しない場合を含む。

【0022】

範囲は、本明細書において、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表され得る。そのような範囲が表現されるとき、文脈が別途具体的に指示しない限り、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までの範囲も具体的に企図され、開示されるとみなされる。同様に、値が近似値として表現されるとき、先行する「約」の使用によって、特定の値は、文脈が別途具体的に指示しない限り、開示されるとみなされるべき別の、具体的に企図される実施形態を形成することが理解されるであろう。範囲の各々のエンドポイントは、文脈が別途具体的に指示しない限り、他のエンドポイントとの関係においても、他のエンドポイントから独立していても、有意であることが理解されるであろう。最後に、明示的に開示された範囲内に含まれる個々の値及び値のサブ範囲の全ても具体的に企図されており、文脈が別途具体的に指示しない限り、開示されているとみなされるべきであることが理解されるべきである。上記は、特定の場合において、これらの実施形態のうちのいくつか又は全てが明示的に開示されるかどうかにかかわらず、適用される。

【0023】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示される方法及び組成物が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものに類似又は同等の任意の方法及び材料は、本方法及び組成物の実施又は試験に使用され得るが、特に有用な方法、デバイス、及び材料は、記載されているものと同様である。本明細書に引用される刊行物及びそれらが引用される材料は、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。任意の参照が先行技術を構成することは認められない。参考文献の考察は、その著者が主張することを述べており、出願人は、引用された文書の正確性と関連性に異議を唱える権利を留保する。本明細書では、いくつかの刊行物が参照されるが、そのような参照は、これらの文書のいずれかが当該技術分野の一般的な知識の一部を形成することを認めるものではないことが明確に理解されるであろう。

【0024】

本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通して、「含む」という語及び当該語の変形例、例えば、「含んでいる」及び「含む」は、「含むが、これらに限定されない」ことを意味し、例えば、他の添加剤、構成要素、整数又はステップを除外することを意図されない。特に、１つ以上のステップ又は動作を含むと記載される方法では、各ステップが列挙されるものを含むことが具体的に企図され（そのステップが「～からなる」等の限定用語を含む場合を除く）、各ステップが、例えば、該ステップに列挙されていない他の添加剤、構成要素、整数、又はステップを除外することを意図されていないことを意味する。

【0025】

Ｂ．治療する方法
がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することを含み、がんを有する対象が、非機能性ＡＴＡＤ１を有する、方法が開示される。がんを有する対象を治療する方法であって、がんを有する対象に、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬を投与することを含む方法であって、がんを有する対象が、非機能性ＡＴＡＤ１を有する、方法が開示される。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子又は非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質を含む。

【0026】

いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は機能性タンパク質に翻訳され、次いで翻訳後修飾して非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質にされ得る。

【0027】

いくつかの態様において、対象は、非機能性ＰＴＥＮを更に含む。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮは、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子又は非機能性ＰＴＥＮタンパク質であり得る。非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は機能性タンパク質に翻訳され、次いで翻訳後修飾して非機能性ＰＴＥＮタンパク質にされ得る。

【0028】

いくつかの態様において、がんを有する対象は、乳がん、肺がん、結腸がん、脳がん、又は前立腺がんを有する。

【0029】

いくつかの態様において、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カーフィルゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン－３－ガラート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ、デランゾミブ、エポキソミシン、ＭＧ１３２、β－ヒドロキシβ－メチル酪酸塩であり得るが、これらに限定されない。

【0030】

いくつかの態様において、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬は、ＩＲＥ１調節物質、ＰＥＲＫ調節物質、ＡＴＦ６調節物質、熱ショックタンパク質阻害剤、選択的アンドロゲン受容体分解薬、又は選択的エストロゲン受容体分解薬であり得るが、これらに限定されない。

【0031】

Ｃ．診断及び治療する方法
対象においてがんを診断及び治療する方法であって、対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することと、対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することと、を含む、方法が開示される。

【0032】

対象においてがんを診断及び治療する方法であって、対象を、プロテアソーム阻害剤による治療に応答性であると診断することと、対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することと、を含む、方法が開示される。

【0033】

いくつかの態様において、対象をプロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することは、対象を、非機能性ＡＴＡＤ１を有するものとして識別することを含む。いくつかの態様において、対象をプロテアソーム阻害剤による治療に応答性であると診断することは、対象を、非機能性ＡＴＡＤ１を有するものとして識別することを含む。

【0034】

いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子又は非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質であり得る。非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、機能性タンパク質に翻訳され、次いで翻訳後修飾して非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質にされ得る。

【0035】

いくつかの態様において、対象をプロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することは、対象が機能性ＰＴＥＮを有するかどうかを識別することを更に含む。いくつかの態様において、対象をプロテアソーム阻害剤による治療に応答すると診断することは、対象が機能性ＰＴＥＮを有するかどうかを識別することを更に含む。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮは、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子又は非機能性ＰＴＥＮタンパク質であり得る。非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、機能性タンパク質に翻訳され、次いで翻訳後修飾して非機能性ＰＴＥＮタンパク質にされ得る。

【0036】

いくつかの態様において、対象をプロテアソーム阻害剤による治療に感受性であると診断することは、ＢＩＭレベルの増加を検出することを更に含む。いくつかの態様において、対象をプロテアソーム阻害剤による治療に応答すると診断することは、ＢＩＭレベルの増加を検出することを更に含む。いくつかの態様において、ＢＩＭは、ＡＴＡＤ１の基質であることが理解され、したがって、非機能性ＡＴＡＤ１は、ＢＩＭの増加をもたらす。いくつかの態様において、ＢＩＭレベルの増加は、標準と比較した増加である。いくつかの態様において、標準は、機能性ＡＴＡＤ１を有する対象において生じることが知られているＢＩＭの正常レベル又は既知レベルであり得る。いくつかの態様において、標準は、機能性ＡＴＡＤ１を有する対象群の平均として判定される量であり得る。

【0037】

いくつかの態様において、対象が、乳がん、肺がん、結腸がん、脳がん、又は前立腺がんを有する。

【0038】

いくつかの態様において、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カーフィルゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン－３－ガラート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ、デランゾミブ、エポキソミシン、ＭＧ１３２、β－ヒドロキシβ－メチル酪酸塩であり得るが、これらに限定されない。

【0039】

Ｄ．アポトーシスを増加させる方法
対象においてアポトーシスを増加させる方法であって、対象に、プロテアソーム阻害剤を投与することを含み、対象が非機能性ＡＴＡＤ１を含む、方法が開示されている。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子又は非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質であり得る。非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、機能性タンパク質に翻訳され、次いで翻訳後修飾して非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質にされ得る。

【0040】

いくつかの態様において、対象は、非機能性ＰＴＥＮを更に含む。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮは、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子又は非機能性ＰＴＥＮタンパク質であり得る。非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、機能性タンパク質に翻訳され、次いで、翻訳後修飾して、非機能性ＰＴＥＮタンパク質にされ得る。

【0041】

いくつかの態様において、対象はがんを有する。いくつかの態様において、対象が、乳がん、肺がん、結腸がん、脳がん、又は前立腺がんを有する。

【0042】

いくつかの態様において、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カーフィルゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン－３－ガラート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ、デランゾミブ、エポキソミシン、ＭＧ１３２、β－ヒドロキシβ－メチル酪酸塩であり得るが、これらに限定されない。

【0043】

Ｅ．対象を識別する方法
以下の順序で、がん患者から試料を得るステップと；がん患者が試料中に非機能性ＡＴＡＤ１を有するかどうかを判定するステップと；がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有する場合、プロテアソーム阻害剤による治療に好適な候補として、がん患者を識別するステップと；好適な候補として識別されたがん患者に、プロテアソーム阻害剤を投与し、がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有しない場合には、がん患者に、プロテアソーム阻害剤を投与しないステップとを含む、方法が開示される。

【0044】

以下の順序で、がん患者から得られた試料中に、がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有するかどうかを判定するステップと；がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有する場合に、プロテアソーム阻害剤による治療に好適な候補として、がん患者を識別するステップと；好適な候補として識別されたがん患者に、プロテアソーム阻害剤を投与し、がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有しない場合には、がん患者に、プロテアソーム阻害剤を投与しないステップとを含む、方法が開示される。

【0045】

以下の順序で、がん患者から試料を得るステップと；がん患者が試料中に非機能性ＡＴＡＤ１を有するかどうかを判定するステップと；がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有する場合に、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬による治療に好適な候補として、がん患者を識別するステップと；好適な候補として識別されたがん患者に、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬を投与し、がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有しない場合には、がん患者に、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬を投与しないステップと、を含む、方法が開示される。

【0046】

以下の順序で、がん患者から得られた試料中に、がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有するかどうかを判定するステップと；対象が非機能性ＡＴＡＤ１を有する場合に、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬による治療に好適な候補として、がん患者を識別するステップと；好適な候補として識別されたがん患者に、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬を投与し、がん患者が非機能性ＡＴＡＤ１を有しない場合には、がん患者に、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬を投与しないステップと、を含む、方法が開示される。

【0047】

いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、機能性タンパク質に翻訳され、次いで、翻訳後修飾して、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質にされ得る。

【0048】

いくつかの態様において、本方法は、がん患者が非機能性ＰＴＥＮを有するかどうかを判定することを更に含む。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮは、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子又は非機能性ＰＴＥＮタンパク質であり得る。非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、機能性タンパク質に翻訳され、次いで、翻訳後修飾されて、非機能性ＰＴＥＮタンパク質に翻訳され得る。

【0049】

がんを有する対象におけるプロテアソーム阻害剤の有効性を増強する方法であって、対象に、非機能性ＡＴＡＤ１を有する対象に対して有効量のプロテアソーム阻害剤を投与することを含む、方法も開示されている。がんを有する対象におけるタンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬の有効性を増強する方法であって、対象に、非機能性ＡＴＡＤ１を有する対象に対して、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する有効量の化合物又は治療薬を投与することを含む、方法も開示されている。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は、非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質は機能性タンパク質に翻訳され、次いで翻訳後修飾して非機能性ＡＴＡＤ１タンパク質にされ得る。いくつかの態様において、対象は、非機能性ＰＴＥＮを更に含む。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮは、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子又は非機能性ＰＴＥＮタンパク質であり得る。非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、欠失遺伝子又は変異遺伝子であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子は、部分的に又は完全に欠失され得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は、非機能性ＰＴＥＮ遺伝子から翻訳されるタンパク質であり得る。いくつかの態様において、非機能性ＰＴＥＮタンパク質は機能性タンパク質に翻訳され、次いで翻訳後修飾して非機能性ＰＴＥＮタンパク質にされ得る。

【0050】

いくつかの態様において、がん患者は、乳がん、肺がん、結腸がん、脳がん、又は前立腺がんを有する。

【0051】

本明細書に記載されるのは、臨床試験に適切な対象を識別する方法であって、対象において非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子の存在を判定することを含み、非機能性ＡＴＡＤ１の存在は、対象がプロテアソーム阻害剤による治療のための臨床試験に適切であることを示す、方法である。「臨床試験に適している」とは、臨床試験の治療から利益を得る可能性が高い対象を指す。例えば、非機能性ＡＴＡＤ１を有するとして識別された対象は、プロテアソーム阻害剤による治療を必要としている、これに応答性である、又はこれに感受性であるとみなされ得、したがって、プロテアソーム阻害剤の臨床試験に適している。例えば、本明細書に記載されるのは、プロテアソーム阻害剤を用いた臨床試験に適切な対象を識別する方法であって、対象において非機能性ＡＴＡＤ１の存在を判定することを含み、非機能性ＡＴＡＤ１の存在は、対象がプロテアソーム阻害剤の臨床試験に適切であることを示す、方法である。

【0052】

本明細書に記載されるのは、これらの臨床試験のために適切な患者集団を選択することを含む、臨床試験を増強する方法である。一態様において、本方法を使用して、対象がプロテアソーム阻害剤、又はタンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物若しくは治療薬による治療から利益を得ることができるかどうかの可能性に基づいて、患者が臨床試験に参加するように識別されることを確実にすることができる。いくつかの態様において、本方法は、対象が非機能性ＡＴＡＤ１を有するかどうかを判定することを含み、それによって、プロテアソーム阻害剤、又はタンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物若しくは治療薬による治療から利益を得ることができる対象を識別することを含む。

【0053】

本明細書に開示されるのは、臨床試験のための対象を識別するための方法であって、対象から得られた試料中の非機能性ＡＴＡＤ１遺伝子を検出することを含み、非機能性ＡＴＡＤ１の存在は、対象が臨床試験に適切であることを示し、対象における非機能性ＡＴＡＤ１は、対象から得られた試料から判定される方法である。

【0054】

いくつかの態様において、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブ、イキサゾミブ、カーフィルゾミブ、ラクタシスチン、ジスルフィラム、エピガロカテキン－３－ガラート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ、デランゾミブ、エポキソミシン、ＭＧ１３２、β－ヒドロキシβ－メチル酪酸塩であり得るが、これらに限定されない。

【0055】

いくつかの態様において、タンパク質分解のタンパク質品質制御を調節する化合物又は治療薬は、ＩＲＥ１調節物質、ＰＥＲＫ調節物質、ＡＴＦ６調節物質、熱ショックタンパク質阻害剤、選択的アンドロゲン受容体分解薬、又は選択的エストロゲン受容体分解薬であり得るが、これらに限定されない。

【0056】

Ｆ．組成物
本明細書において、組成物のいずれかが開示される。本明細書において、構築物のいずれかが開示される。本明細書において、核酸配列又はアミノ酸配列のいずれかが開示される。

【0057】

Ｇ．キット
上記の材料並びに他の材料は、開示された方法を実施する、又はこの実施を補助するのに有用なキットとして、任意の好適な組み合わせで一緒に包装され得る。所与のキット中のキット構成要素が、開示される方法において一緒に使用されるように設計され、適合される場合に有用である。例えば、がんを診断、検出、又は治療するためのキットであって、プライマー、プローブ、抗体、タンパク質、又は機能性ＡＴＡＤ１遺伝子の不在を判定する化合物を含むキットが開示される。

【実施例】

【0058】

Ａ．実施例１
腫瘍抑制遺伝子であるＰＴＥＮは、ヒトがんにおいて最も一般的な欠失遺伝子の１つである（１）。ＰＴＥＮ欠失は、多くの場合、隣接する遺伝子座を含む、第１０ｑ２３染色体上の隣接ＤＮＡの多くのキロ塩基（ｋｂ）を包含する。ＰＴＥＮに最も近い遺伝子のうちの１つは、外側ミトコンドリア膜（ＯＭＭ）上のタンパク質品質制御に関与するＡＡＡ＋ＡＴＰａｓｅをコードするＡＴＡＤ１である（２－６）。ＡＴＡＤ１はヒト及びマウスの生活に不可欠であり、酵母及びヒトを分離する１０億年の進化の間に保存されてきた（６，７）。本明細書では、ＡＴＡＤ１及びＰＴＥＮとの共欠失が、ユビキチンプロテアソームシステム（ＵＰＳ）の機能障害に対して細胞を感作する方法について説明する。ＡＴＡＤ１は、タンパク質品質制御が臨床的に関連する設定で細胞死とどのように相互作用するかを実証するために、ＯＭＭからアポトーシス促進タンパク質ＢＩＭを直接抽出する。

【0059】

ＰＴＥＮ及びＡＴＡＤ１遺伝子座は、ヒトＣｈｒ１０ｑ２３．３１（図１Ａ）上で約４０ｋｂで分離される（８）。この近接性により、ＡＴＡＤ１がＰＴＥＮと共欠失しているかどうかは、ＰＴＥＮ欠失を特徴とすることが知られている前立腺腺がん（ＰｒＡｄ）を有する患者からの腫瘍検体上の免疫組織化学を使用して評価される（９）。ＡＴＡＤ１の状態は、ＰＴＥＮ－ヌル腫瘍を有する３７人の患者からの試料を使用して評価され、ＡＴＡＤ１が半数超で検出不可能であることが分かった（２１／３７）が、１５個全てのＰＴＥＮ陽性対照試料中に保持された（図１Ｂ、図１Ｃ、図５）。タンパク質レベルの所見を裏付けるために、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）を分析した。ＰＴＥＮにおいて深部欠失を有する腫瘍の大部分もまた、ＡＴＡＤ１において深部欠失を有し（図１Ｄ）、これは、複数の種類のがんにおいても同様であった（図１Ｅ）（８）。重要なことに、ＴＣＧＡデータは更に、ＰＴＥＮ欠失の不在下ではＡＴＡＤ１がほとんど欠失されないことを示し（図１Ｄ）、ＡＴＡＤ１には、ＰＴＥＮ及びほとんどの善意の腫瘍抑制剤に見られるものとは異なり、不活性化点変異又は切断が本質的に存在しないことを示した。したがって、ＡＴＡＤ１欠失は、ＰＴＥＮ欠失の発がん性ドライバーへのパッセンジャーでのみである。（図１Ｄ）。ＡＴＡＤ１の喪失は、最大２５％超のＰｒＡｄ、１１％の黒色腫、及び７～８％の膠芽腫及び肺扁平上皮細胞がんを含む、がん全体にわたって高頻度で生じる。したがって、ＡＴＡＤ１の喪失がこれらの腫瘍にどのような影響を与えるかを理解することは、診療所に深い影響を与える可能性がある。

【0060】

ＡＴＡＤ１及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅホモログＭｓｐ１を含むそのホモログは、ＯＭＭ及びペルオキシソームから誤って局在化され又は過剰な膜貫通タンパク質を抽出することによってミトコンドリアの完全性を保護する（１０）。Ｍｓｐ１は更に、ミトコンドリア輸入チャネルであるＴＯＭ複合体において失速したタンパク質を抽出することが示されている（１１，１２）。他の文脈でのミトコンドリア恒常性におけるＡＴＡＤ１の確立された役割を考えると、パッセンジャー遺伝子としてのＡＴＡＤ１の欠失は、腫瘍に独自の脆弱性を付与することができる。このような脆弱性は、腫瘍抑制遺伝子欠失（１３，１４）の「側副致死性」として知られる概念である精密医療のための新規の治療標的を表し得る。

【0061】

そのような脆弱性を発見するために、ゲノム全体のＣＲＩＳＰＲスクリーニングを実施して、ＡＴＡＤ１Δ細胞において選択的に必須である遺伝子を識別した。Ｃａｓ９の一過性発現及びＡＴＡＤ１を標的とする２つの異なるｓｇＲＮＡを使用して、ＰＴＥＮ－ヌルである、２つのクローンＡＴＡＤ１Δ細胞株をＪｕｒｋａｔ細胞内で作製した（図２Ａ）。ＡＴＡＤ１欠失は、基底増殖率に影響を及ぼさなかった（図２Ｂ）。野生型（ＷＴ）Ｊｕｒｋａｔ親細胞株、及び２つのＡＴＡＤ１Δクローン細胞株の各々で３つのスクリーニングを並行して行い、これらの比較により、クローン細胞株に固有の特異性を排除することができた（図２Ｃ）。差分ＣＲＩＳＰＲスコア（ｄＣＳ）は、所与の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡの平均存在量のＬｏｇ２倍変化におけるＷＴとＡＴＡＤ１Δとの間の差異を表し、その遺伝子の欠失が、ＡＴＡＤ１の不在下で細胞適合性に多かれ少なかれ有害であるかどうかの測定基準を提供する。予想どおり、２つのクローン細胞株のｄＣＳ値は有意に相関した（図６Ａ）。Ｐ値を組み合わせて、２つのＡＴＡＤ１Δクローンのうちの１つのみでヒットとしてスコア化した遺伝子にペナルティを課した（１５）。２つの遺伝子がヒットとして出現した。これは、組み合わせたｄＣＳ値が＜－２及びＰａｄｊ＜０．０５であることによって定義される。ＡＣＯＴ１１及びＭＡＲＣＨ５（図２Ｃ、図６Ｂ、図６Ｃ）。ＡＣＯＴ１１は、ミトコンドリア及び細胞質に局在し、長鎖脂肪酸アシル－ＣｏＡを加水分解するアシル－ＣｏＡチオエステラーゼをコードする（１６，１７）。ＭＡＲＣＨ５は、分解のためにいくつかの膜貫通タンパク質を標的とするＯＭＭに局在するユビキチンＥ３リガーゼをコードする（１８－２０）。

【0062】

ＭＡＲＣＨ５は、アポトーシスの開始を調節するためにＯＭＭで機能するプロ及び抗アポトーシスタンパク質からなるＢＣＬ２ファミリーのメンバーの分解を促進することが最近示された（２１－２４）。アポトーシスの調節における重要なステップは、ＢＡＸ／ＢＡＫによるＯＭＭの透過化であり、これにより、シトクロムＣなどのミトコンドリアタンパク質が細胞質内に拡散し、カスパーゼカスケードを活性化させる。ＢＣＬ２、ＢＣＬ－ＸＬ、及びＭＣＬ１を含む抗アポトーシスタンパク質は、基底条件下でＢＡＸ及びＢＡＫに結合し、これらを阻害する（２３）。抗アポトーシスタンパク質の上流には、特定の抗アポトーシスタンパク質を不活性化するか、又はＢＡＸ／ＢＡＫを直接活性化することによってストレスに応答する、プロデスＢＨ３のみのタンパク質（ＢＩＭ、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＢＡＤ、ＰＵＭＡ等を含む）がある（２５）。ＭＡＲＣＨ５の欠失は、ＭＣＬ１、ＮＯＸＡ、及びＢＩＭをＯＭＭ上に蓄積させ、抗アポトーシスＢＣＬ２ファミリーメンバーと結合及び隔離してアポトーシスを誘発するＢＨ３模倣薬に対する感受性を増加させる（２６－２９）。他の人々によって指摘されるように、ＭＡＲＣＨ５及びＭＣＬ１（強力な抗アポトーシスタンパク質をコードする）は同時不可欠であり（図２Ｄ）、これは、それらが同じ経路で機能することを示す（２９，３０）。実際、ＤｅｐＭａｐデータベースによれば、ヒトゲノム全体にわたってＭＣＬ１と最も同時不可欠な遺伝子はＭＡＲＣＨ５であり、逆もまた同様である（３１）。

【0063】

ＡＴＡＤ１及びＭＡＲＣＨ５がスクリーン内で合成致死性であったことは、それらが並行した経路又は機能で作用し得ることを示した。実際、ＡＴＡＤ１欠失は、ＢＣＬ２ファミリーの一部ではないＯＭＭ上の尾部アンカータンパク質であるＦＩＳ１には影響を及ぼさなかったが、ＭＣＬ１及びＢＩＭの存在量（図２Ｅ、図２Ｆ）並びにＭＣＬ１を阻害するＢＨ３模倣物であるＡＭＧ１７６によって誘導されるアポトーシスのためのプライミング細胞を増加させた（図２Ｇ）（３２）。したがって、ＭＡＲＣＨ５と同様に、ＡＴＡＤ１は、ＢＨ３模倣物に対する感受性によって測定されるように、メンバーＢＣＬ２ファミリーを調節し、アポトーシスプライミングに影響を与える。

【0064】

ＡＴＡＤ１の喪失がアポトーシスプライミングにどのように影響するかについての洞察を得るために、ＢＨ３プロファイリングを実施した（３３）。ここで、透過性細胞を、異なるアポトーシス促進性ＢＨ３のみのタンパク質に由来するＢＨ３ペプチドで処理し、ミトコンドリアからのシトクロムＣ放出を検出することによって、ミトコンドリア外膜透過性（ＭＯＭＰ）を直接測定する（図３Ａ）。Ｈ４神経膠腫細胞をプロファイリングし、これは、ＡＴＡＤ１及びＰＴＥＮの両方を包含するＣｈｒ１０ｑ２３欠失を有し、その中に、安定して再発現されたＡＴＡＤ１、触媒不活性変異体ＡＴＡＤ１Ｅ１９３Ｑ、又は空ベクター（ＥＶ）が存在した。ＥＶ又はＡＴＡＤ１Ｅ１９３Ｑを発現するこれらのＡＴＡＤ１ヌル細胞において、ＢＩＭペプチドは、シトクロムＣの大量放出を引き起こし、一方、ＷＴ ＡＴＡＤ１の発現は、ＢＩＭ媒介性シトクロムＣ放出から細胞を著しく保護した（図３Ｂ）。対照的に、ＰＵＭＡ及びＢＡＤは、ＡＴＡＤ１状態とは無関係に中等度のシトクロムＣ放出を誘導した。アラメチシンは、ＢＡＸ／ＢＡＫ及びＢＨ３のみのタンパク質から独立して作動する合成孔形成ペプチドであり、ＡＴＡＤ１の状態に関係なく等しくシトクロムＣ放出を誘導し、これは、ＡＴＡＤ１がＯＭＭ上の孔形成の下流でのシトクロムＣ放出に影響を及ぼさないことを示す。これらのデータは、ＡＴＡＤ１の不在が、ＢＩＭペプチドに感受性のあるアポトーシスプライミングを増加させることを示す。このプライミングは、細胞が内因性ＢＩＭタンパク質を調節する方法の変化を反映する。ＢＩＭペプチドに加えて、ＡＴＡＤ１が全長ＢＩＭタンパク質から細胞を保護したかどうかを判定するために、テトラサイクリン誘導性ＧＦＰ－ＢＩＭＥＬ融合タンパク質を安定して発現する細胞株を作製した。ＢＩＭは、Ｃ末端膜アンカー（３４～３６）を含む主要な構造的特徴を共有する、３つの主要なアイソフォーム、ＢＩＭＥＬ（優位な形態である「エクストラロング」）、ＢＩＭＬ（「ロング」）、及びＢＩＭＳ（「ショート」）に存在する。ＢＨ３プロファイリング実験と同様に、細胞死の増加及び切断ＰＡＲＰの生成によって証明されるように、ＡＴＡＤ１の喪失は異所性の完全長ＧＦＰ－ＢＩＭに対して細胞を感作した（図３Ｃ、図３Ｄ）。したがって、生化学的及び遺伝子データは、ＡＴＡＤ１欠乏が、強力なアポトーシス促進性ＢＨ３のみのタンパク質であるＢＩＭに対して感受性を有することを示す。

【0065】

ＢＩＭは、既知のＡＴＡＤ１／Ｍｓｐ１基質のいくつかの特徴を有するため、ＡＴＡＤ１の直接的な基質であり得る。すなわち、ＢＩＭは、尾部固定され、本質的に無秩序であり、その膜貫通ドメインに塩基性残基Ｃ末端を有し、プロテアソーム（３７－３９）によって分解される。ＡＴＡＤ１の欠失は、観察された分子量（３４，４０）のシフトに基づいて、ＢＩＭリン酸化状態の変化である可能性がある、わずかに増加したＢＩＭ存在量（図２Ｅ、図２Ｆ）を引き起こした。ＡＴＡＤ１がどのようにＢＩＭ存在量に影響を与えたかを、異所性ＢＩＭでチャレンジされた細胞で調べた。この実験は、細胞死が結果を混乱させるのを防ぐために、ＢＩＭによって誘導されるアポトーシスに耐性のあるＢＡＫ１Δ－Ｊｕｒｋａｔ細胞株（基本的にＢＡＸ－ヌルである）で行った。この関連において、ＡＴＡＤ１の喪失は、異所性ＧＦＰ－ＢＩＭＥＬ、内因性ＢＩＭＥＬの蓄積、及び内因性ＢＩＭＬの蓄積への傾向を引き起こした（図３Ｅ、図７Ｂ）。ＢＩＭがＡＴＡＤ１基質であることと一致し、ＧＦＰ－ＢＩＭＥＬは、ＡＴＡＤ１－ＦＬＡＧとともに共免疫沈降した（図３Ｆ）。ＢＩＭは、プロテアソームによって分解することができ、したがって、急性プロテアソーム阻害が、ＡＴＡＤ１の存在下及び非存在下の両方で、ＢＩＭレベルの堅牢な増加を引き起こしたことが見出された（図３Ｇ）。合わせて、ＡＴＡＤ１欠乏は、ＢＨ３模倣物、ＢＩＭペプチド、及び全長ＢＩＭに対して細胞を感作し、ＢＩＭは、ＡＴＡＤ１ヌル細胞内で過剰に蓄積し、ＢＩＭは、ＡＴＡＤ１と物理的に相互作用する。これらのデータは、ＢＩＭが細胞におけるＡＴＡＤ１基質であるという説得力のある事例を提供する。

【0066】

ＢＩＭがＡＴＡＤ１の直接基質であるかどうかに対処するために、インビトロ抽出アッセイを、ＡＴＡＤ１及びＢＩＭＬで使用した。ＢＩＭＬは、ＢＩＭＥＬよりも可溶性であるが、Ｎ末端近くのドメインを除いて、全ての主要な構造的特徴を共有するために使用された（３４）。全長ＡＴＡＤ１は、精製することができなかった。代わりに、Ｎ末端ＴＭＤをＨｉｓ６タグと入れ替え、これは、Ｈｉｓ－ＡＴＡＤ１をニッケルキレートヘッドグループでドープされたリポソームに固定した（「Ｎｉ Ｌｉｐｏｓ」；図３Ｈ）。この抽出アッセイでは、ＡＴＡＤ１／Ｍｓｐ１によってリポソームから抽出されるＴＡタンパク質は、可溶性ＧＳＴタグ付きシャペロンによって結合され、グルタチオンカラム上で精製され、ウェスタンブロットによって検出される（３９）。このインビトロアッセイにおいて、Ｈｉｓ－ＡＴＡＤ１は、リポソームから３ｘＦＬＡＧ－ＢＩＭＬを直接的かつ効率的に抽出した（図３Ｉ）。予想どおり、この活性はＡＴＰ依存性であり（レーン１７～２０）、触媒不活性変異体であるＡＴＡＤ１Ｅ１９３Ｑを使用した場合には消失した（レーン１～４）。Ｎｉキレート脂質（「Ｍｉｔｏ Ｌｉｐｏｓ；」レーン５～８）を省略することにより、ＢＩＭの抽出がブロックされ、ＡＴＡＤ１が、その抽出酵素活性のために膜アンカーを必要とすることが示された。重要なことに、ＡＴＡＤ１は、別のＴＡタンパク質であるＦｉｓ１を抽出しなかった（レーン９～１２）。したがって、ＡＴＡＤ１はＢＩＭを特異的に抽出するが、全てのＴＡタンパク質を抽出するわけではない。（３８）。

【0067】

Ｎｉ－Ｈｉｓアンカー戦略は、酵母ホモログＭｓｐ１の全長（ＦＬ）又は同様にＨｉｓタグ付けされたバージョンのいずれかを使用することによって検証された（図７Ｂ）。ＦＬ－Ｍｓｐ１及びＨｉｓ－Ｍｓｐ１の両方とも、ＡＴＡＤ１及びＭｓｐ１の生化学的保存に沿って、ＢＩＭ（図７Ｃ、図７Ｄ）を抽出した。このアッセイの基質選択性を、Ｍｓｐ１及び一連の陽性及び陰性対照ＴＡタンパク質を使用して検証した（図７Ｅ）。全ての実験において、これらの実験は、ＡＴＡＤ１が脂質膜からＢＩＭを直接的かつ特異的に抽出することを示す。

【0068】

ＢＩＭは、ＭＡＲＣＨ５の喪失又はプロテアソーム阻害剤による治療などのストレス因子によって誘導されるユビキチンプロテアソームシステム（ＵＰＳ）の機能障害時に蓄積される（４１）。Ｄｅｌ（１０ｑ２３）細胞内のプロテアソーム阻害剤でＵＰＳ機能不全を誘導することは、ＢＩＭを増加させ、ＡＴＡＤ１の不在を利用することができる。実際に、ボルテゾミブ及びカーフィルゾミブは、Ｄｅｌ１０ｑ２３細胞（ＳＷ１０８８及びＨ４神経膠腫及びＲＰＭＩ７９５１黒色腫）における生存率の損失を強力かつ迅速に誘導し、これはＡＴＡＤ１の発現によって緩和された（図４Ａ、図４Ｂ；図８Ａ～図８Ｅ）。利用可能なＤｅｌ（１０ｑ２３）前立腺がん細胞株は存在しないが、ＰＣ３細胞はＰＴＥＮ－ヌル及びＡＴＡＤ１－ヘミ接合である（図８Ｆ）。ボルテゾミブに感作されたＰＣ３細胞中のＡＴＡＤ１の残りの対立遺伝子の欠失、一方でＡＴＡＤ１の過剰発現（ただしＡＴＡＤ１Ｅ１９３Ｑではない）は、ボルテゾミブに対する耐性を増加させた（図８Ｇ～図８Ｉ）。したがって、ＡＴＡＤ１は、ＵＰＳ機能不全の状況での細胞生存率にとって非常に重要である。

【0069】

アポトーシス細胞死は、細胞におけるプロテアソーム阻害剤毒性の基礎となる多くの機序の１つにすぎない（４２～４４）。我々のシステムにおいて、ボルテゾミブは、Ｄｅｌ１０ｑ２３－ＥＶ細胞において堅牢なアポトーシスを誘導したが、ＡＴＡＤ１再発現細胞においては最小限であった（図４Ｃ、図４Ｄ）。ＡＴＡＤ１の存在又は不在下で同じ程度に蓄積されたポリユビキチン化タンパク質は、ＡＴＡＤ１が、タンパク質毒性傷害自体を最小限に抑えるのではなく、細胞がタンパク質毒性ストレスにどのように反応するかに影響することを示す。次いで、ＡＴＡＤ１が、いくつかのアポトーシス非依存性経路を介してプロテアソーム阻害剤感受性に影響を及ぼすかどうかを尋ねた。その場合、ＡＴＡＤ１の再発現及びカスパーゼ阻害（アポトーシスをブロックする）は、プロテアソーム阻害剤毒性を軽減するための付加効果を有するであろう。顕著なことに、ＡＴＡＤ１再発現は、ボルテゾミブで処理したＤｅｌ１０ｑ２３細胞におけるカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ－ｆｍｋを用いた治療を実質的にフェノコピーした（図４Ｅ～図４Ｇ）。更に、ｚＶＡＤの付加効果は、ＡＴＡＤ１再発現細胞において最小限であり、ＡＴＡＤ１及びｚＶＡＤがプロテアソーム阻害の下流の同じ経路で作用することを示唆した（図４Ｈ）。要するに、これらの結果は、プロテアソーム阻害中のＡＴＡＤ１の保護効果が、アポトーシスによってのみ説明され得ることを示す。

【0070】

腫瘍増殖に対するＡＴＡＤ１の効果を、皮下異種移植片モデルを使用してインビボで評価した。ＳＷ１０８８は、低いクローン形成能を有するＤｅｌ１０ｑ２３グリオーマ細胞株であり、ＳＣＩＤマウスにおいて非腫瘍性である（４５，４６）。したがって、ＥＶで形質導入したＳＷ１０８８細胞は、注射した１７匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのうち１７匹において腫瘍を形成することに失敗した。顕著なことに、ＡＴＡＤ１再発現細胞は、注射された１８匹のマウスのうちの１７匹において触知可能な腫瘍を増殖させた（図４Ｉ、図４Ｊ）。この効果は、単純には増殖の違いで説明することはできない。なぜなら、ＡＴＡＤ１は培養物中のＳＷ１０８８細胞の増殖速度に影響しないからである（図４Ｋ）。したがって、ＡＴＡＤ１は、分解のためにＢＩＭを抽出し、タンパク質毒性ストレス誘導型アポトーシスから保護するという知見と一致して、ＡＴＡＤ１はインビボでＰＴＥＮヌル細胞において完全な生存促進役割を果たす。

【0071】

プロアポトーシスＢＣＬ２タンパク質と抗アポトーシスＢＣＬ２タンパク質の微妙なバランスは、常に細胞生存を脅かす。これらのタンパク質がどのように活性化されるかは集中的に研究されているが、それらがどのように分解されるかについてはあまり知られていない。ＡＴＡＤ１は、ＵＰＳ機能不全の間に蓄積されるＯＭＭ局在のＢＩＭを直接的かつ具体的に抽出する。ＡＴＡＤ１損失がＵＰＳ機能不全に感受性を与えるという調査結果は、Ｄｅｌ１０ｑ２３腫瘍を有する何千人ものがん患者に重大な臨床的影響を与える可能性がある。

【0072】

アポトーシスのために細胞をプライミングしているにもかかわらず、ＡＴＡＤ１の喪失ががんで非常に頻繁に起こることは、直感に反するように思われるかもしれない。ＡＴＡＤ１が欠失されるたびに、ＰＴＥＮも欠失されることを覚えておく必要がある。ＰＴＥＮ喪失は、ＦＯＸＯ３Ａを阻害することによってＢＣＬ２Ｌ１１（ＢＩＭ）の転写を減少させること、及び直接リン酸化によってＢＡＤを不活性化することを含む、強力な生存促進効果を有するＡＫＴを活性化する（４７，４８）。したがって、ＰＴＥＮの共欠失は、ＡＴＡＤ１の喪失によって誘導されるアポトーシスプライミングのいくつかを緩衝し得る。加えて、アポトーシスのために細胞をプライミングする遺伝的病変は、がんに対して常に選択されるわけではない。それどころか、強力ながん遺伝子（ＭＹＣパラログを含む）は、アポトーシスプライミングを誘導することができるが、それでも（４９，５０）に対して強く選択される。ＡＴＡＤ１の喪失が何らかの状況下で有益である可能性を排除することはできないが、私たちのデータは圧倒的に生存促進要因としての役割を支持している。

【0073】

更に、アポトーシスに対するＡＴＡＤ１の効果は、ＵＰＳ機能不全を超えて、より広範な生理学的文脈に及ぶ可能性が高い。ＡＴＡＤ１（マウスにおける「トラーゼ」）は、アポトーシスに関連付けられることは報告されていないが、酸素及びグルコース欠乏（ＯＧＤ）に応答して神経細胞死を防止する因子（抗アポトーシスＢｃｌ－ｘＬを含む）の遺伝子スクリーニングを介して哺乳動物で最初に発見された（５１）。前調整レジメンは、Ａｔａｄ１の発現を増加させ、その後、Ａｔａｄ１は、後続のＯＧＤから細胞を保護した。生存促進シグナルに応答するＡＴＡＤ１の発現の増加は、細胞が他の文脈においてもアポトーシス促進性ＢＩＭを中和するのを助けることができる。更に、虚血性脳卒中の中大脳動脈閉塞マウスモデルにおいて、Ａｔａｄ１はＢｃｌ２及びＢｃｌ－ｘＬをフェノコピーし、Ａｔａｄ１又はＢｃｌ２の欠失は悪化し、Ａｔａｄ１、Ｂｃｌ２、又はＢｃｌ２ｌ１（Ｂｃｌ－ｘＬをコードする）の過剰発現は、神経細胞死を減少させる（５２－５５）。加えて、保存されたシステイン残基のニトロシル化がＡＴＡＤ１を不活性化することが最近発見された（５６）。これは、損傷した組織内の反応性窒素種がＡＴＡＤ１を不活性化して、ＢＩＭ媒介性アポトーシスを誘発する機構を提供し得る。したがって、ＢＩＭの拮抗作用は、ＡＭＰＡ受容体の調節因子としてのその確立された機能に加えて、インビボにおけるＡＴＡＤ１／トラーゼの神経保護機能に寄与し得る。ＡＴＡＤ１調節及び機能のメカニズム及び原理を定義することは、アポトーシス感受性の理解を再形成するだけでなく、ＰＴＥＮ／ＡＴＡＤ１共欠失腫瘍及びそれ以降における深刻な臨床的影響の可能性を有する。

【0074】

材料及び方法：
主な連絡先
リソース及び試薬に関する詳細情報及び請求は、主な連絡先であるＪａｒｅｄ Ｒｕｔｔｅｒ（[e-mail]）に宛てに提出して頂ければ、満足のいく回答が得られるであろう。

【0075】

材料の入手可能性
本試験で生成された全ての特有の／安定した試薬は、請求により主な連絡先から制限なく入手可能である。

【0076】

データ及びコードの入手可能性
本試験中に生成されたＣＲＩＳＰＲスクリーニングデータは、補足資料で入手可能である。

【0077】

実験モデル及び対象の詳細
ＡＴＡＤ１ノックアウト細胞株
Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１ヒトＴ－ＡＬＬ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５２）を、１０％ ＦＢＳ及び１００ Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を有するＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。細胞を、製造業者の仕様に従ってＬｏｎｚａ ＳＥ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ４Ｄ－ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒＴＭ Ｘ Ｋｉｔ Ｌを使用し、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞用に最適化されたプロトコルを使用して、エレクトロポレーションした。ＡＴＡＤ１を標的とするｓｇＲＮＡをコードするＰｘ４５８由来のプラスミドを、エレクトロポレーションを介してＪｕｒｋａｔ細胞において一過性に発現させた。３日後、ＧＦＰ＋細胞を選別し（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ）、９６ウェルプレートに単一細胞としてプレーティングした。クローン細胞株を増殖させ、採取し、ノックアウト検証されたモノクローナル抗体（ＮｅｕｒｏＭａｂ）を使用して、免疫ブロットを介してＡＴＡＤ１欠失について評価した。

【0078】

ＰＣ３細胞を、ＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２－ＧＦＰ（ＬＣｖ２Ｇ）、又はｓｇＡＴＡＤ１を有するＬＣｖ２Ｇ（ガイド配列＃１）をコードするレンチウイルスで形質導入した。形質導入の３日後、ＧＦＰ＋細胞を選別し（ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ）、ポリクローナル集団として維持した。上記のように免疫ブロットによって編集を確認した。

【0079】

Ｄｅｌ１０ｑ２３細胞株におけるＡＴＡＤ１再発現
Ｈ４及びＰＣ３細胞を、Ｃ末端フラグ及びＨＡタグを有するＡＴＡＤ１をコードするレトロウイルス（ＰＱＣＸＩＰ転写プラスミド）で形質導入した。形質導入から２日後、細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシンで４日間選択した。ＲＰＭＩ７９５１及びＳＷ１０８８細胞は、レトロウイルス感染に対して不応性であり、代わりに、ＡＴＡＤ１－ＦＬＡＧをコードするレンチウイルス（ｐＬｅｎｔｉ－Ｂｌａｓｔ転写プラスミド）で形質導入し、８μｇ／ｍＬのブラストサイジンで６日間選択した。細胞は、解凍時に選択的抗生物質（ピューロマイシン又はブラスチジン）を含有する培地中で増殖させたが、選択的抗生物質を含有する培地を使用して実験を実施しなかった。

【0080】

１．方法の詳細
ｉ．免疫組織化学
ＡＴＡＤ１（ＮｅｕｒｏＭａｂ ＃７５－１５７マウスモノクローナル抗体を使用）
ＡＴＡＤ１免疫組織化学染色を、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の４ミクロン厚切片上で行った。切片を空気乾燥させ、次いで６０℃のオーブンで３０分間溶融させた。スライドをＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ（商標）ＩＩＩ自動染色器具（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ．）にロードし、Ｂｏｎｄ（商標）Ｄｅｗａｘ溶液で脱パラフィン化した。実施した抗原回収は、Ｂｏｎｄ（商標）Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｂｕｆｆｅｒ ２（ＥＲ２、ｐＨ８．０）で２０分間、９５℃で行った。１：４００のＡＴＡＤ１一次抗体濃度を、室温で３０分のインキュベーション時間で適用した。陽性シグナルは、ＤＡＢ（３－３’ジアミノベンジジン）を色原体として利用して、ヤギ抗マウス／抗ウサギ二次ＨＲＰ／ポリマー検出システムであるＢｏｎｄ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ－ＤＡＢを使用して可視化した。組織切片をヘマトキシリンで１０分間対比染色した。スライドを免疫染色剤から取り出し、ｄＨ２Ｏ／ＤＡＷＮ（商標）混合物中に配置した。切片を脱イオン水及びＤＡＷＮ（商標）溶液の混合物中で穏やかに洗浄して、非結合試薬を除去した。全ての洗浄混合物を除去するまで、スライドを脱イオン水中で穏やかにすすいだ。スライドを、グレーディングされたエタノール中で脱水し、キシレン中で洗浄し、次いでカバースリップした。

【0081】

ＰＴＥＮ（ウサギ抗ヒトモノクローナル抗体を使用）：クローン１３８Ｇ６、カタログ番号９５５９Ｌ、細胞シグナル伝達、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）。

【0082】

ＰＴＥＮ免疫組織化学染色を、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の４ミクロン厚切片上で行った。切片を空気乾燥させ、次いで６０℃のオーブンで３０分間溶融させた。スライドをＶｅｎｔａｎａ ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（商標）Ｕｌｔｒａ自動染色器具（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）にロードし、ＥＺ Ｐｒｅｐ溶液で脱パラフィン化した。実施した抗原回収を、圧力鍋（ＢｉｏＣａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）中のクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で４分間、１００℃で行った後、高温緩衝液中で３０分間冷却した。１：５０のＰＴＥＮ一次抗体濃度を、室温で２時間のインキュベーション時間で適用した。ベンタナ増幅キットを適用して抗体シグナルを増加させた。陽性シグナルは、ＤＡＢ（３－３’ジアミノベンジジン）を色原体として利用して、ヤギ抗マウス／抗ウサギ二次ＨＲＰ／ポリマー検出システムであるＵｌｔｒａＶｉｅｗ ＤＡＢ検出キットを使用して可視化した。組織切片をヘマトキシリンで１６分間対比染色した。スライドを免疫染色剤から取り出し、ｄＨ２Ｏ／ＤＡＷＮ（商標）混合物中に配置した。切片を脱イオン水及びＤＡＷＮ（商標）溶液の混合物中で穏やかに洗浄して、自動化された器具によって適用される非結合試薬及びカバースリップ油を除去した。全ての洗浄混合物を除去するまで、スライドを脱イオン水中で穏やかにすすいだ。スライドを、グレーディングされたエタノール中で脱水し、キシレン中で洗浄し、次いでカバースリップした。

【0083】

ｉｉ．細胞培養
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）及び１００Ｕ／ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐで、ＲＰＭＩ１６４０中で培養した。細胞を定期的に数え、典型的には約１．５ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度で分割したが、常に３ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度に達する前に分割した。次の培地中のサブコンフルエント培養物中に接着細胞株を維持した。ＲＰＭＩ１６４０（ＰＣ３），ＤＭＥＭ（Ｈ４、ＳＷ１０８８），ＥＭＥＭ（ＲＰＭＩ７９５１）（全ては１０％ＦＢＳ及び１００μ／ｍＬ Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有している）

【0084】

ｉｉｉ．クローニング
全てのクローニングは、従来のＰＣＲ／制限酵素「カット＆ペースト」方法を介して実施し、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって検証した。

【0085】

ＡＴＡＤ１構築物：
ＡＴＡＤ１－ＦＬＡＧ／ＨＡ及びＡＴＡＤ１Ｅ１９３Ｑ－ＦＬＡＧ／ＨＡをコードするレトロウイルスプラスミドを以前に公表した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２０１４）。レンチウイルスベクターは、ｐＬｅｎｔｉ－ＢＬＡＳＴ骨格を使用して、上記のレトロウイルスベクターからＡＴＡＤ１ ＣＤＳをＰＣＲ増幅することによって作製したが、ＨＡタグを終止コドンで置き換えることによって構築物を切断した。

【0086】

ＧＦＰ－ＢＩＭ構築物：
ｐＬＶＸＴｅｔ－Ｏｎｅベクターをタカラから購入した。ＥＧＦＰのコード配列をＰＣＲ増幅し、ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩ部位を使用してＭＣＳにライゲーションした。ＥＧＦＰ－ＢＩＭＥＬの融合物を、ＳＯＥｉｎｇ ＰＣＲを使用して生成し、ＡｇｅＩ／ＢａｍＨＩ部位を使用してライゲーションした。ＥＧＦＰ－ＢＩＭＥＬも一過性トランスフェクションのためにｐＥＧＦＰ－Ｃ３にライゲーションした。

【0087】

ｉｖ．Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ生存率アッセイ
生存率は、いくつかの修正を加えて、製造業者の推奨に従って、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって判定した。細胞を、白色壁及び透明底を有する９６ウェルプレート中、１００μＬ中、５ｘ１０３細胞／ウェルの密度でプレーティングした（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３６１０）。Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬を再構成し、滅菌ＰＢＳを使用して１：４に希釈し、１０ｍＬのアリコート中で、－２０℃で保存した。示されている各実験について、少なくとも２つの独立した実験を行い、各実験を、ＰＣ３細胞におけるＡＴＡＤ１過剰発現実験（図Ｓ４Ｉ）を除いて、３つの生物学的複製物を用いて行った。ＰＣ３細胞におけるＡＴＡＤ１過剰発現実験は、それぞれ２つの生物学的複製物を有していた。９６ウェルプレートの外側ウェルは、エッジ効果の懸念により、培地で満たされたが、細胞で満たされなかった。発光を、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２マイクロプレートリーダーを用いて測定した。発光値を各プレート上で、同じプレート上の未処理細胞に対して正規化し、パーセントで表した。

【0088】

ｖ．クリスタルバイオレット染色
１２又は６ウェルプレートで培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で、３０分間室温で固定した。ウェルをｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、次いで、２０％メタノール中の０．１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット溶液で３０分間、室温で染色した。ウェルを再びｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、反転させて乾燥させ、プレートをｉＰｈｏｎｅ Ｘを使用して白色の背景に対して撮影した。定量化のために、氷酢酸を各ウェルに添加して染料を溶出させ、プレートを回転シェーカー上の室温で３０分間インキュベートした。吸光度を、Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２マイクロプレートリーダーを使用して５９０ｎｍにて測定し、各プレート上の同じ遺伝子型の未処理細胞に由来する値に正規化した。

【0089】

ｖｉ．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法
細胞を、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ８３４０，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ０４９０６８４５００１）に直接スクレイピングすることにより、細胞全体の溶解物を調製し、１０分ごとにボルテックスしながら氷上で３０分間インキュベートし、次いで１６，０００ｇで、１０分間４℃で回転させて、不溶性物質を除去した。上清を溶解物として保存した。ＷＣＬ、ＰＭＳ、及び／又は粗製ミトコンドリア画分を、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ２３２２５）を介して総タンパク質含有量について正規化した。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥ又はＴｒｉｓ－グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＸＰ０４２０５ＢＯＸ）によって分解し、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ（抽出アッセイ）膜に移した。製造業者の推奨に従って主要リソース表に列挙されている示された一次抗体を用いて免疫ブロット法を行い、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ又はＡｚｕｒｅ Ｃ５００（抽出アッセイ）によって分析した。Ａｚｕｒｅ Ｃ５００の検出器には、機能していないように見えるピクセルの列がいくつか存在することに注意されたい。これにより、一部の画像に細い垂直白線が表示される。これは、コントラストを過度に調整することで、生データファイルで簡単に見ることができる。

【0090】

ｖｉｉ．共免疫沈降
Ｈ４細胞（ＥＶ又はＡＴＡＤ１－ＷＴ－ＦＬＡＧ／ＨＡを発現する）を、２０μＭのｚＶＡＤ－ｆｍｋの存在下で、１０ｃｍプレートのための１０μｇのプラスミドであるｐＥＧＦＰ－Ｃ３（ＧＦＰ－ＢＩＭ）中のｐＥＧＦＰ－Ｃ３（ＧＦＰ）又はＧＦＰ－ＢＩＭＥＬでトランスフェクトした。一過性発現は一晩（１４～１６時間）進行した。細胞を冷たいＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテル及び１％チャップを補充したＨＮ緩衝液（ＨＮＣ緩衝液）で溶解した。磁気抗ＦＬＡＧビーズ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）をＨＮＣ緩衝液で平衡化し、次いで溶解物と混合した（１０％体積を入力として除去した後）。ビーズ－溶解物混合物を、回転子上で、４℃で２～４時間インキュベートした。ビーズをＨＮＣ緩衝液で３回洗浄し、次いで３０μＬの１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中で、６５℃で１０分間加熱した。

【0091】

ｖｉｉｉ．細胞計数
細胞を、ＢｉｏＲａｄ ＴＣ２０細胞カウンターを使用してカウントした。カウントを行う際には、培養液から少なくとも２つの試料を採取し、平均値を記録した。

【0092】

ｉｘ．ＣＲＩＳＰＲ画面
Ｊｕｒｋａｔ細胞（野生型親細胞、ＡＴＡＤ１ＫＯ ＃１、及びＡＴＡＤ１ＫＯ ＃２）を、Ｃａｓ９及びピューロマイシン耐性カセットもコードしたゲノム全体のレンチウイルスｓｇＲＮＡライブラリ（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃１００００００１００；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５）でスピンフィクションによって形質導入した。形質導入を最適化して、およそ３０％の形質導入効率を達成し、細胞をピューロマイシン（０．５μｇ／ｍＬ）で３日間選択し、ピューロマイシンなしで２日間回復させ、次いで、スクリーニング期間中、より低用量のピューロマイシン（０．２μｇ／ｍＬ）で維持した。細胞の初期試料（８ｘ１０７）を収集し、ピューロマイシン選択のエンドポイントで凍結した（形質導入後６日）。次いで、細胞を１４個の累積集団倍加のために培養中で維持した。細胞を２日ごとに通過させ、２ｘ１０５細胞／ｍＬの密度で新しいフラスコに播種した。１４個体群の倍加後、代表的な試料を収集した（８ｘ１０７個の細胞）。他の箇所に記載されているように（Ａｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１９）、細胞ペレットをＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐを使用して処理し、ｓｇＲＮＡ配列をＰＣＲによって増幅し、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ ＦａｃｉｌｉｔｙでＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ＮＧＳによって４０サイクルにわたって増幅子を配列決定した。

【0093】

シークケンシングリードを、１の擬似カウントを与えられたｓｇＲＮＡライブラリに整列させ、各ｓｇＲＮＡの存在量を以前に記載されたように計算した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５；Ｋａｎａｒｅｋ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１８）。各試料からのカウントを、深度を配列決定するために正規化した。５０未満のリードを有するｓｇＲＮＡ、及び最初の参照データセットにおける４未満のｓｇＲＮＡを有する遺伝子を、下流分析から省略した。最終参照集団と初期参照集団との間の各ｓｇＲＮＡの存在量のｌｏｇ２倍の変化を計算し、各遺伝子のＣＲＩＳＰＲスコアを定義するために使用した。ＣＲＩＳＰＲスコアは、所与の遺伝子を標的とする全てのｓｇＲＮＡの存在量における平均ｌｏｇ２倍の変化である。所与の遺伝子を標的とする全てのｓｇＲＮＡの分布を、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｖ試験を用いてｓｇＲＮＡ分布全体に対して試験し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を用いてｐ値を調整した。ＡＴＡＤ１Δクローンにおける遺伝子必須性とＷＴ対照における遺伝子必須性の直接的な比較を達成するために、適切に表されなかったｓｇＲＮＡを両群で省略した（すなわち、初期時点で＜５０リード）。このステップは、存在量におけるｓｇＲＮＡの変化のペア分析を可能にし、ある遺伝的背景において「スコア化」されたが、別の遺伝的背景においてその効果を評価することができない所与のｓｇＲＮＡを含むことを回避する。各ＡＴＡＤ１Δクローンについての差分ＣＲＩＳＰＲスコア（ｄＣＳ）を、以下のように各遺伝子について計算した。ＣＳＡＴＡＤ１Δ－ＣＳＡＴＡＤ１－ＷＴ。２つのｄＣＳ値の平均を合計し、「ｄＣＳ複合」として提示する。一方のクローンでは「ヒット」としてスコア付けられたが、他方ではスコア付けられなかった遺伝子は、クローンのアーチファクト又は単純な実験誤差を反映する可能性がある。これらの遺伝子は、Ｒパッケージ「ｍｅｔａｐ」（Ｄｅｗｅｙ Ｍ，２０２０）を使用したメタ分析のために、フィッシャー法（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ａ．，１９３４；「ｌｏｇｓの和」又は「カイ二乗」法としても知られる）を介して、２つのクローンのＱ値（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正Ｐ値）を組み合わせることによって分析においてペナルティを受けた。データを解析し、Ｒバージョン４及びＲＳｔｕｄｉｏバージョン１．１．４４２を使用してプロットした。

【0094】

ｘ．ＢＨ３－プロファイリング
ＢＨ３－プロファイリングは、ＦＡＣＳベースの方法を使用して実施し、前述のように細胞におけるシトクロムＣ放出／保持を直接監視した（Ｒｙａｎ ａｎｄ Ｌｅｔａｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３）。

【0095】

ｘｉ．蛍光顕微鏡
ＳＷ１０８８細胞（ＥＶ又はＡＴＡＤ１－ＷＴを発現する）を８チャンバースライド上で増殖させ、撮像の２日前にチャンバ当たり５ｘ１０３個の細胞で播種した。画像化の前夜（１２時間）、細胞を１０ ｎＭのボルテゾミブ（ＢＴＺ）で処理するか、又は未処理であった。翌朝、チャンバをＰＢＳで２回洗浄し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２０分間ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（２０ｎＭ）で染色した。細胞を培地で２回洗浄した後、４０×及び１００×対物レンズ（油浸）を備えたＡｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１イメージングシステム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）上で即座に撮像した。少なくとも３０個の細胞を、各条件について撮像し、ｎ＝２の別々の実験のために繰り返した。

【0096】

ｘｉｉ．マウス異種移植片
ＳＷ１０８８細胞（ＥＶ又はＡＴＡＤ１－ＦＬＡＧで形質導入）を、上記のように正常な培養条件下で増殖させた。細胞（３ｘ１０６）をＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標））と１：１で混合し、マウス１匹当たり１本の脇腹に注入した。マウスは、１３～１５週齢の雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤであった。腫瘍体積を、Ｂｉｏｐｔｉｃｏｎ ＴｕｍｏｒＩｍａｇｅｒを使用して隔週でモニタリングした。動物実験は、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ ＩＡＣＵＣと一致していた。

【0097】

ｘｉｉｉ．細菌の形質転換
クローニングのために、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を、製造業者によって提供されるマニュアルに従って形質転換し、ＬＢ寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた。レンチウイルスベクター及びレトロウイルスベクターのクローニングには、ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅコンピテント細胞を使用した（ＮＥＢ Ｃ３０４０Ｉ）。

【0098】

ｘｉｖ．Ｅ．ｃｌｏｎｉ（クローニ）細胞
クローニングのために、Ｅ ｃｌｏｎｉ１０Ｇコンピテント細胞を、製造業者（Ｌｕｃｉｇｅｎ）が提供するマニュアルに従って形質転換し、ＬＢ寒天プレート上で、３７℃で一晩増殖させた。

【0099】

ｘｖ．ＢＬ２１－ＤＥ３ ｐＲＩＬ細胞
タンパク質発現のために、ｐＲＩＬプラスミド及びタンパク質発現ベクターを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を、０．６～１．０のＯＤ６００まで、３７℃の優れたブロス中で増殖させた。培養物を１ｍＭの最終濃度でイソプロピル－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、更に３～４時間、室温で増殖させた。

【0100】

ｘｖｉ．可溶性構築物の産生
Δ１－３２Ｍｓｐ１及びΔ１－３９ＡＴＡＤ１：
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｓｐ１（Δ１～３２）の可溶性領域をコードする遺伝子を、ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、Ｎ末端６ｘＨｉｓタグ、続いてＴＥＶプロテアーゼ切断部位をコードするｐＥＴ２８ａ誘導体（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＡＴＡＤ１（Δ１－３９）の可溶性領域を、ＡＴＡＤ１ ｃＤＮＡを含有するプラスミド（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からＰＣＲ増幅した。全ての挿入及び欠失を、標準的なＰＣＲ技術によって行った。部位特異的変異誘発をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲによって実行した。全ての構築物をＤＮＡ配列決定によって検証した。

【0101】

可溶性Ｍｓｐ１、ＡＴＡＤ１、又はそれらの変異体をコードするプラスミドを、前述のように精製した（Ｗｏｈｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。プラスミドを、ｐＲＩＬプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、０．６～１．０のＯＤ６００まで３７℃で優れたブロスで発現させ、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、更に３～４時間室温で増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、０．０５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフッ化物（ＰＭＳＦ）及び５００Ｕのユニバーサルヌクレアーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）を補充したＭｓｐ１ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、２００ｍＭのＫＡｃ、２０ｍＭのイミダゾール、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。上清を４℃で１８，５００ ｘ ｇで３０分間遠心分離することにより単離し、重力カラム上でＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー（Ｐｉｅｒｃｅ）により精製した。Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を１０カラム体積（ＣＶ）のＭｓｐ１ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、次に１０ＣＶのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（３０ｍＭのイミダゾールを含むＭｓｐ１ Ｌｙｓｉｓ緩衝液）で洗浄した後、２５０ｍＭのイミダゾールを補充したＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで溶出した。可溶性ＡＴＡＤ１の精製には、タンパク質を安定化するためのＡＴＰの添加も含まれていた。超音波処理後、及びニッケル樹脂からの溶出後に、ＡＴＰを２ｍＭの最終濃度まで添加した。

【0102】

タンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、２００ｍＭのＫＡｃ、１ｍＭのＤＴＴ中のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって更に精製した。ピーク画分をプールし、３０ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルター（Ｐｉｅｒｃｅ）中で５～１５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、アリコートを液体窒素中でフラッシュ凍結させ、－８０℃で保存した。計算された消滅係数（Ｅｘｐａｓｙ）を使用して、タンパク質濃度をＡ２８０によって判定した。

【0103】

ｘｖｉｉ．ＧＳＴ－ＳＧＴＡ及びＧＳＴ－カルモジュリン：
ＧＳＴタグ付きＳＧＴＡを発現させ、前述のように精製した（Ｍａｔｅｊａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。元のカルモジュリンプラスミドは、Ｈｅｇｄｅラボの一種のギフトであった（Ｓｈａｏ ａｎｄ Ｈｅｇｄｅ，２０１１）。カルモジュリンを、標準的な方法によってｐＧＥＸ６ｐ１プラスミドにクローニングした。ＧＳＴ－ＳＧＴＡ及びＧＳＴ－カルモジュリンを、可溶性Ｍｓｐ１構築物について上記のように発現させた。細胞を遠心分離によって採取し、０．０５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのＰＭＳＦ及び５００Ｕのユニバーサルヌクレアーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）を補充したＳＧＴＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール）中に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。上清を４℃で１８，５００ ｘ ｇで３０分間遠心分離することにより単離し、重力カラム上でＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ（グルタチオン）親和性クロマトグラフィー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）により精製した。樹脂を２０カラム体積（ＣＶ）のＳＧＴＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、次いで、１０ｍＭの還元されたグルタチオンを補充した３ＣＶのＳＧＴＡ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（溶解バッファ）で溶出した。タンパク質を、２０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ，０．１ｍＭのＴＣＥＰ中のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって更に精製した。ピーク画分をプールし、３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｓｐｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）中で１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、アリコートを液体窒素中でフラッシュ凍結させ、－８０°Ｃで保存した。計算された消滅係数（Ｅｘｐａｓｙ）を使用して、タンパク質濃度をＡ２８０によって判定した。

【0104】

ｘｖｉｉｉ．膜タンパク質の産生
ＢＩＭ及びＦｉｓ１：
ホモサピエンスＢｉｍＬ又はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｆｉｓ１ ＴＭＤ ＋／－５隣接アミノ酸（残基１２６～１５５）を、前述のＳｕｍｏＴＭＤ構築物（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｗｏｈｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）のＳｅｃ２２ＴＭＤの代わりにクローニングした。これらの構築物は、Ｎ末端Ｈｉｓ６及び３ｘＦｌａｇタグ、並びにＣ末端オプシングリコシル化部位（１１残基）を有する。３Ｃプロテアーゼ部位を、標準的なＰＣＲ法によってＨｉｓタグの直後に添加した。結果として得られる構築物は、Ｈｉｓ６－３Ｃ－３ｘＦｌａｇ－Ｓｕｍｏ－トロンビンＢｉｍＬ－Ｏｐｓｉｎ及びＨｉｓ６－３Ｃ－３ｘＦｌａｇ－Ｓｕｍｏ－トロンビン－Ｆｉｓ１（１２６～１５５）－Ｏｐｓｉｎである。

【0105】

ＳｕｍｏＴＭＤの発現プラスミドを、ｐＲＩＬプラスミドを含有するＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、０．６～０．８のＯＤ６００まで３７℃の優れたブロスで発現させ、培養物を０．４ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、更に３～４時間、２０℃で増殖させた。細胞を遠心分離によって採取し、０．０５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのＰＭＳＦ及び５００Ｕのユニバーサルヌクレアーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ）を補充したＳｕｍｏＴＭＤ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（溶解緩衝液）（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのイミダゾール、１０％のグリセロール）中に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。膜タンパク質を、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＤＭ）を１％の最終濃度に添加することによって可溶化し、４℃で３０’にわたって揺動した。溶解物を４℃で１時間、３５，０００ ｘ ｇで遠心分離することによって洗浄し、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。

【0106】

Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を１０カラム体積（ＣＶ）のＳｕｍｏＴＭＤ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（洗浄緩衝液）１（５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのイミダゾール、５ｍＭのβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、１０％のグリセロール、０．１％のＤＤＭ）で洗浄した。次いで、樹脂を１０ＣＶのＳｕｍｏＴＭＤ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（洗浄緩衝液）２（３００ｍＭのＮａＣｌ及び２５ｍＭのイミダゾールを除いて、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（洗浄緩衝液）１と同じ）及び１０ＣＶのＳｕｍｏＴＭＤ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（洗浄緩衝液）３（１５０ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのイミダゾールとともに、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（洗浄緩衝液）１と同じ）で洗浄し、次いで３ＣＶのＳｕｍｏＴＭＤ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（溶出緩衝液）（２５０ｍＭのイミダゾールを除いて、Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（洗浄緩衝液）３と同じ）で溶出した。

【0107】

タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＢＭＥ、１０％のグリセロール、０．１％のＤＤＭ中のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ＧＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって更に精製した。ピーク画分をプールし、３０ｋＤａのＭＷＣＯスピン濃縮器（Ｐｉｅｒｃｅ）中で濃縮した。次いで、試料を３Ｃプロテアーゼと１：１００の比率で、４℃で一晩インキュベートし、Ｈｉｓタグを除去した。翌日、試料をＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（溶解緩衝液）中で平衡化したＮｉ－ＮＴＡ樹脂に流し、３Ｃプロテアーゼ、Ｈｉｓタグ、及び未切断タンパク質を除去した。フロースルーを液体窒素中で収集し、等分し、フラッシュ凍結し、－８０℃で保管した。計算された消滅係数（Ｅｘｐａｓｙ）を使用して、Ａ２８０によってタンパク質濃度を判定した。

【0108】

Ｍｓｐ１：
全長Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｍｓｐ１をゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｐＥＴ２１ｂ誘導体にサブクローニングし、可溶性構築物について上記のように発現させた。細胞を超音波処理により溶解し、不溶性画分を、４℃で１時間、１４０，０００ ｘ ｇで遠心分離して採取した。１％ ＤＤＭを含有するＭｓｐ１ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ）中で１６時間再可溶化した後、全ての緩衝液が０．０５％ ＤＤＭを含有したことを除いて、洗剤可溶性上清を１４２，０００ ｘ ｇで４５分間遠心分離することによって単離し、可溶性構築物について上記のようにＮｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー及びＳＥＣにより精製した。ピーク画分を、１００ｋＤａのＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中に濃縮した。計算された消滅係数（Ｅｘｐａｓｙ）を用いて、Ａ２８０によってタンパク質濃度を判定し、液体窒素中でアリコートをフラッシュ凍結させた。

【0109】

ｘｉｘ．プロテオリポソームにおけるＭｓｐ１活性の再構築
リポソーム調製
酵母外側ミトコンドリア膜の脂質組成を模倣するリポソームを、記載のとおりに調製した（Ｋａｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡単に述べると、鶏卵ホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ ８４００５１Ｃ）、鶏卵ホスファチジルエタノールアミン（Ａｖａｎｔｉ ８４００２１Ｃ）、ウシ肝臓ホスファチジルイノシトール（Ａｖａｎｔｉ ８４００４２Ｃ）、合成ＤＯＰＳ（Ａｖａｎｔｉ ８４００３５Ｃ）、及び合成ＴＯＣＬ（Ａｖａｎｔｉ ７１０３３５Ｃ）のクロロホルム原料を、４８：２８：１０：１０：４のモル比で１ｍｇのＤＴＴと混合することにより、２５ｍｇの脂質フィルムを調製した。１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－［Ｎ－（５－アミノ－１－カルボキシペンチル）イミノ二酢酸）スクシニル］ニッケル塩（Ａｖａｎｔｉ ７９０４０４）を２％のモル比で使用し、ＤＯＰＳを１０％から８％に低下させたことを除いて、ニッケルリポソームを上述のように作製した。

【0110】

クロロホルムを窒素の穏やかな蒸気下で蒸発させ、次いで真空（＜１ｍＴｏｒｒ）上に一晩放置した。脂質フィルムをリポソーム緩衝液（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ＫＯＨ ｐＨ７．５、１５％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に再懸濁して２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にし、次いで液体窒素で５回凍結融解サイクルを行った。リポソームを、６０℃で２００ｎｍフィルターを通して１５回押し出し、単回使用のアリコートに分配し、液体窒素中でフラッシュ凍結させた。

【0111】

プロテオリポソームの調製
全長Ｍｓｐ１を用いた抽出アッセイについては、１μＭのＭｓｐ１、１μＭのＴＡタンパク質（ＳｕｍｏＴＭＤ）、及び２ｍｇ／ｍＬのミトコンドリアリポソームをＲｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（再構成用緩衝液）（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ＫＯＨ ｐＨ７．５、２００ｍＭの酢酸カリウム、７ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、１０％のスクロース、０．０１％のアジ化ナトリウム、及び０．１％のデオキシビッグチャップ）中に混合することによってプロテオリポソームを調製した（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。可溶性Ｍｓｐ１／ＡＴＡＤ１を用いた抽出アッセイのために、１μＭのＴＡタンパク質（ＳｕｍｏＴＭＤ）、及び２ｍｇ／ｍＬのニッケルリポソームをＲｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（再構成用緩衝液）に混合することによって、プロテオリポソームを調製した。２５ｍｇのバイオビーズを添加し、試料を４℃で１６時間回転させることによって洗剤を除去した。バイオビーズを除去した後、非組み込みＴＡタンパク質を、再構築物を過剰（５μＭ）ＧＳＴ－ＳＧＴＡ及びＧＳＴ－カルモジュリンでインキュベートし、グルタチオンスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃１６１０３）に通すことによって予め洗浄し、フロースルーを収集し、すぐに変位アッセイに使用した。

【0112】

ｘｘ．抽出アッセイ
抽出アッセイは、６０μＬの予めクリアされたプロテオリポソーム、５μＭのＧＳＴ－ＳＧＴＡ、５μＭのカルモジュリン、及び２ｍＭのＡＴＰを含有し、最終体積をＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（抽出緩衝液）（５０ｍＭのＨｅｐｅｓ ＫＯＨ ｐＨ７．５、２００ｍＭの酢酸カリウム、７ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、０．１μＭの塩化カルシウム）で２００μＬに調整した。試料を３０℃で３５分間インキュベートし、次いでグルタチオンスピンカラムに充填した。カラムをＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（抽出緩衝液）で４回洗浄し、２０ｍＭのグルタチオン（ｐＨ８．５）を補充した同じ緩衝液で溶出した。試料を無染色ゲル上にロードし、画像化した後、ＰＶＤＦ膜に移し、主要リソース表に示されるようにブロットした。再構築効率及びウエスタンブロッティングのばらつきを考慮するために、野生型Ｍｓｐ１を用いた新しい再構築及び変位アッセイを、各変異体Ｍｓｐ１と並行して行った。図は、Ｎ＞３の個別の再構成を示す。「入力」レーンは、「溶出」レーンに対して５倍希釈されていることに注意されたい。

【0113】

ｘｘｉ．定量化と統計解析
ウェスタンブロットバンド強度を、ＩｍａｇｅＪを使用して推定した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。再構築効率及びウエスタンブロッティングのばらつきを考慮するために、野生型Ｍｓｐ１を用いた新しい再構築及び変位アッセイを、各Ｍｓｐ１変異体と並行して行った。図は、Ｎ＞３の個別の再構成を示す。変位効率は、「溶出」レーンにおけるＴＡタンパク質の量を、「入力」レーンにおける基質の量と比較することによって定量化した。

【0114】

当業者は、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の実施形態に対する多くの等価物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、又は確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
参考文献
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９．Ｃｈｕｎｇ ＪＨ，Ｄｅｗａｌ Ｎ，Ｓｏｋｏｌ Ｅ，Ｍａｔｈｅｗ Ｐ，Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｒ，Ｍｉｌｌｉｓ ＳＺ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｔｕｍｏｒｓ．ＪＣＯ Ｐｒｅｃｉｓ Ｏｎｃｏｌ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１９ Ｍａｙ １０［ｃｉｔｅｄ ２０２０ Ｍａｙ １］；出典：ｈｔｔｐｓ：／／ａｓｃｏｐｕｂｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／ｐｄｆ／１０．１２００／ＰＯ．１８．００２８３
１０．Ｗｅｉｒ ＮＲ，Ｋａｍｂｅｒ ＲＡ，Ｍａｒｔｅｎｓｏｎ ＪＳ，Ｄｅｎｉｃ Ｖ．Ｔｈｅ ＡＡＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｓｐ１ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｅｘｃｅｓｓ ｔａｉｌ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ．ｅＬｉｆｅ．２０１７ Ｓｅｐ １４；６：ｅ２８５０７．
１１．Ｗｅｉｄｂｅｒｇ Ｈ，Ａｍｏｎ Ａ．ＭｉｔｏＣＰＲ－Ａ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ ｔｈａｔ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｏｒｔ ｓｔｒｅｓｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１８ Ａｐｒ １３［ｃｉｔｅｄ ２０２０ Ａｐｒ ２４］；３６０（６３８５）．出典：ｈｔｔｐｓ：／／ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３６０／６３８５／ｅａａｎ４１４６
１２．Ｂａｓｃｈ Ｍ，Ｗａｇｎｅｒ Ｍ， Ｒｏｌｌａｎｄ Ｓ，Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ Ａ，Ｚｅｎｇ Ｒ，Ｋｈｏｓｒａｖｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｓｐ１ ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｒｅｓｔｅｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｍｐｏｒｔ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０２０ Ｆｅｂ １２；３１（８）：７５３－６７．
１３．Ｍｕｌｌｅｒ ＦＬ，Ａｑｕｉｌａｎｔｉ ＥＡ，ＤｅＰｉｎｈｏ ＲＡ．Ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ：Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５ Ｎｏｖ １；１（３）：１６１－７３．
１４．Ｍｕｌｌｅｒ ＦＬ，Ｃｏｌｌａ Ｓ，Ａｑｕｉｌａｎｔｉ Ｅ，Ｍａｎｚｏ Ｖ，Ｇｅｎｏｖｅｓｅ Ｇ，Ｌｅｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｓｓｅｎｇｅｒ Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２ Ａｕｇ １６；４８８（７４１１）：３３７－４２．
１５．Ｄｅｗｅｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ．ｍｅｔａｐ：ｍｅｔａ－ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｖａｌｕｅｓ．Ｒ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １４．２０２０；
１６．Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｌａｔｈａｍ Ｊ，Ｚｈａｏ Ｈ，Ｂｉｓｏｆｆｉ Ｍ，Ｆａｒｅｌｌｉ Ｊ，Ｄｕｎａｗａｙ－Ｍａｒｉａｎｏ Ｄ．Ｈｕｍａｎ Ｂｒｏｗｎ Ｆａｔ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ Ｖａｒｉａｎｔ ２ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｔａｌｙｔｉｃ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２ Ｓｅｐ ４；５１（３５）：６９９０－９．
１７．Ｂｅｋｅｏｖａ Ｃ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ－Ｐｕｌｌｉｎｇｅｒ Ｌ，Ｂｏｙｅ Ｋ，Ｂｏｏｓ Ｆ，Ｓｈａｒｐａｄｓｋａｙａ Ｙ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｈａｖｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｉｓｓｕｅ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ＣｏＡ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｕｎｉｑｕｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｏｌｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１９ Ｄｅｃ １３；２９４（５０）：１９０３４－４７．
１８．Ｎａｋａｍｕｒａ Ｎ，Ｋｉｍｕｒａ Ｙ，Ｔｏｋｕｄａ Ｍ，Ｈｏｎｄａ Ｓ，Ｈｉｒｏｓｅ Ｓ．ＭＡＲＣＨ－Ｖ ｉｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ ２－ ａｎｄ Ｄｒｐ１－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｌｅ ｔｏ ｃｈａｎｇｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２００６ Ａｕｇ １；７（１０）：１０１９－２２．
１９．Ｃｈｅｒｏｋ Ｅ，Ｘｕ Ｓ，Ｌｉ Ｓ，Ｄａｓ Ｓ，Ｍｅｌｔｚｅｒ ＷＡ，Ｚａｌｚｍａｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｍｆｆ ａｎｄ Ｄｒｐ１ ｉｎ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ＭＡＲＣＨ５－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉＤ４９ ａｎｄ Ｍｃｌ１ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１６ Ｄｅｃ ８；２８（３）：３９６－４１０．
２０．Ｙｏｎａｓｈｉｒｏ Ｒ，Ｉｓｈｉｄｏ Ｓ，Ｋｙｏ Ｓ，Ｆｕｋｕｄａ Ｔ，Ｇｏｔｏ Ｅ，Ｍａｔｓｕｋｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ｐｌａｙｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｎａｍｉｃｓ．ＥＭＢＯ Ｊ．２００６ Ａｕｇ ９；２５（１５）：３６１８－２６．
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２２．Ｌｅｔａｉ Ａ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．２０１７；１（１）：２７５－９４．
２３．Ｃｚａｂｏｔａｒ ＰＥ，Ｌｅｓｓｅｎｅ Ｇ，Ｓｔｒａｓｓｅｒ Ａ，Ａｄａｍｓ ＪＭ．Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｔｈｅ ＢＣＬ－２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｊａｎ；１５（１）：４９－６３．
２４．Ｌｌａｍｂｉ Ｆ，Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕ Ｔ，Ｔａｉｔ ＳＷＧ，Ｂｏｕｃｈｉｅｒ－Ｈａｙｅｓ Ｌ，Ｔｅｍｉｒｏｖ Ｊ，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ＬＬ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｕｎｉｆｉｅｄ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＢＣＬ－２ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆａｍｉｌｙ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１１ Ｎｏｖ １８；４４（４）：５１７－３１．
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２６．Ｄｊａｊａｗｉ ＴＭ，Ｌｉｕ Ｌ，Ｇｏｎｇ Ｊ，Ｈｕａｎｇ ＡＳ，Ｌｕｏ Ｍ，Ｘｕ Ｚ，ｅｔ ａｌ．ＭＡＲＣＨ５ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＭＴＣＨ２ ｔｏ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｔｕｒｎｏｖｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＭＣＬ１：ＮＯＸＡ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２０２０ Ｆｅｂ ２４；１－１６．
２７．Ｈａｓｃｈｋａ ＭＤ，Ｋａｒｂｏｎ Ｇ， Ｓｏｒａｔｒｏｉ Ｃ，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ ＫＬ，Ｌｕｏ Ｘ，Ｖｉｌｌｕｎｇｅｒ Ａ．ＭＡＲＣＨ５－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＣＬ１／ＮＯＸＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｄｅｆｉｎｅｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｎｔｉｍｉｔｏｔｉｃ ｄｒｕｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０２０ Ｆｅｂ ３［ｃｉｔｅｄ ２０２０ Ａｐｒ １９］；出典：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓ４１４１８－０２０－０５０３－６
２８．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ａ，Ａｎｄｒｏｎａｃｈｅ Ａ，Ｌｉ Ｙ－Ｃ，Ｗａｄｅ Ｍ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭＡＲＣＨ５ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｂｒｏｇａｔｅｓ ＭＣＬ１－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＢＨ３ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｖｉａ ＮＯＸＡ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６ Ｆｅｂ ２１；７（１３）：１５９８６－６００２．
２９．Ａｒａｉ Ｓ，Ｖａｒｋａｒｉｓ Ａ，Ｎｏｕｒｉ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｓ，Ｘｉｅ Ｌ，Ｂａｌｋ ＳＰ．ＭＡＲＣＨ５ ｍｅｄｉａｔｅｓ ＮＯＸＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＭＣＬ１ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｄｒｉｖｅｎ ｂｙ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｍａｃｌｅｏｄ ＫＦ，Ｍｕｒｐｈｙ ＭＥ，ｅｄｉｔｏｒｓ．ｅＬｉｆｅ．２０２０ Ｊｕｎ ２；９：ｅ５４９５４．
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３１．Ｗａｎｇ Ｔ，Ｙｕ Ｈ，Ｈｕｇｈｅｓ ＮＷ，Ｌｉｕ Ｂ，Ｋｅｎｄｉｒｌｉ Ａ，Ｋｌｅｉｎ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｇｅｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｅｔｈａｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｒａｓ．Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｆｅｂ ２３；１６８（５）：８９０－９０３．ｅ１５．
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３６．Ｃｈｉ Ｘ，Ｎｇｕｙｅｎ Ｄ，Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ ＪＭ，Ｏｓｔｅｒｌｕｎｄ ＥＪ，Ｌｉｕ Ｑ，Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙｌ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂｉｍ ｅｎａｂｌｅｓ ｂａｘ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｕｎｐｒｉｍｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｄｏｔｓｃｈ Ｖ，Ｃｏｌｅ ＰＡ，Ｄｏｔｓｃｈ Ｖ，Ｂｏｒｎｅｒ Ｃ，ｅｄｉｔｏｒｓ．ｅＬｉｆｅ．２０２０ Ｊａｎ ２４；９：ｅ４４５２５．
３７．Ｃａｓｔａｎｚｏ ＤＴ，ＬａＦｒａｎｃｅ Ｂ，Ｍａｒｔｉｎ Ａ．Ｔｈｅ ＡＡＡ ＋ ＡＴＰａｓｅ Ｍｓｐ１ ｉｓ ａ ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｓｅ ｗｉｔｈ ｒｏｂｕｓｔ ｕｎｆｏｌｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２０２０ Ｊｕｎ ３０；１１７（２６）：１４９７０－７．
３８．Ｌｉ Ｌ，Ｚｈｅｎｇ Ｊ，Ｗｕ Ｘ，Ｊｉａｎｇ Ｈ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＡＡＡ－ＡＴＰａｓｅ Ｍｓｐ１ ｄｅｔｅｃｔｓ ｍｉｓｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｔａｉｌ－ａｎｃｈｏｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ｄｕａｌ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．２０１９ Ａｐｒ １；２０（４）：ｅ４６９８９．
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４８．Ｄａｔｔａ ＳＲ，Ｄｕｄｅｋ Ｈ，Ｔａｏ Ｘ，Ｍａｓｔｅｒｓ Ｓ，Ｆｕ Ｈ，Ｇｏｔｏｈ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｋｔ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤ Ｃｏｕｐｌｅｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｓｉｇｎａｌｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ－Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｄｅａｔｈ Ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ｃｅｌｌ．１９９７ Ｏｃｔ １７；９１（２）：２３１－４１．
４９．Ｍａｓｏｎ ＫＤ，Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇ ＣＪ，Ｓｃｏｔｔ ＣＬ，Ｗｅｉ ＡＨ，Ｃｏｒｙ Ｓ，Ｈｕａｎｇ ＤＣＳ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｃｌ－２ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ＡＢＴ－７３７ ａｇａｉｎｓｔ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ Ｍｙｃ－ｄｒｉｖｅｎ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．２００８ Ｎｏｖ １８；１０５（４６）：１７９６１－６．
５０．Ｄａｍｍｅｒｔ ＭＡ，Ｂｒａｇｅｌｍａｎｎ Ｊ，Ｏｌｓｅｎ ＲＲ，Ｂｏｈｍ Ｓ，Ｍｏｎｈａｓｅｒｙ Ｎ，Ｗｈｉｔｎｅｙ ＣＰ，ｅｔ ａｌ．ＭＹＣ ｐａｒａｌｏｇ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｒｃｈｅｓｔｒａｔｅｓ ａ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１９ Ｄｅｃ［ｃｉｔｅｄ ２０１９ Ａｕｇ ４］；１０（１）．出典：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｓ４１４６７－０１９－１１３７１－ｘ
５１．Ｄａｉ Ｃ，Ｌｉａｎｇ Ｄ，Ｌｉ Ｈ，Ｓａｓａｋｉ Ｍ，Ｄａｗｓｏｎ ＴＭ，Ｄａｗｓｏｎ ＶＬ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｄｅｌｉ ＭＡ，ｅｄｉｔｏｒ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ．２０１０ Ｎｏｖ ２４；５（１１）：ｅ１５００８．
５２．Ｚｈａｎｇ Ｊ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｓｈｅｒｂｉｎｉ Ｏ，Ｋｅｕｓｓ ＭＪ，Ｕｍａｎａｈ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＡＡＡ＋ＡＴＰａｓｅ Ｔｈｏｒａｓｅ ｉｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｊｕｒｙ．Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．２０１９ Ｓｅｐ １；３９（９）：１８３６－４８．
５３．Ｍａｒｔｉｎｏｕ Ｊ－Ｃ，Ｄｕｂｏｉｓ－Ｄａｕｐｈｉｎ Ｍ，Ｓｔａｐｌｅ ＪＫ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ Ｉ，Ｆｒａｎｋｏｗｓｋｉ Ｈ，Ｍｉｓｓｏｔｔｅｎ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＣＬ－２ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｎｅｕｒｏｎｓ ｆｒｏｍ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｎｅｕｒｏｎ．１９９４ Ｏｃｔ １；１３（４）：１０１７－３０．
５４．Ｐａｒｓａｄａｎｉａｎ ＡＳ，Ｃｈｅｎｇ Ｙ，Ｋｅｌｌｅｒ－Ｐｅｃｋ ＣＲ，Ｈｏｌｔｚｍａｎ ＤＭ，Ｓｎｉｄｅｒ ＷＤ．Ｂｃｌ－ｘＬ ｉｓ ａｎ Ａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｆｏｒ Ｐｏｓｔｎａｔａｌ ＣＮＳ Ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９８ Ｆｅｂ １；１８（３）：１００９－１９．
５５．Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ Ｂｒａｄ Ｒ．Ｓ．，Ｒｅｕｔｅｎｓ Ｄａｖｉｄ Ｃ．，Ｓｏｂｅｙ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｇ．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｓｔｒｏｋｅ．２００９ Ｍａｙ １；４０（５）：ｅ３３１－９．
５６．Ｕｍａｎａｈ ＧＫＥ，Ｇｈａｓｅｍｉ Ｍ，Ｙｉｎ Ｘ，Ｃｈａｎｇ Ｍ，Ｋｉｍ ＪＷ，Ｚｈａｎｇ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＡＭＰＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｓ－Ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｏｒａｓｅ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＳＦ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０２０ Ｎｏｖ ３［ｃｉｔｅｄ ２０２０ Ｄｅｃ １３］；３３（５）．出典：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ａｂｓｔｒａｃｔ／Ｓ２２１１－１２４７（２０）３１３１８－８

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D-E】

【図2F-G】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図4J】

【図4K】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図8G】

【図8H】

【図8I】

【国際調査報告】