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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-27
(54)【発明の名称】免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの突然変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/57 20060101AFI20230720BHJP
C12N 9/50 20060101ALI20230720BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230720BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230720BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230720BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230720BHJP
C07K 14/315 20060101ALI20230720BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20230720BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230720BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230720BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230720BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230720BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230720BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20230720BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20230720BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230720BHJP
【ＦＩ】
C12N15/57
C12N9/50 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/19
C12N1/21
C12N15/86 Z
C07K14/315
C07K16/00
A61P43/00 111
A61P37/06
A61P43/00 121
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K39/395 P
A61K39/395 U
A61K48/00
A61K35/76
A61K35/768
A61K38/48
A61K39/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022577764
(86)(22)【出願日】2021-06-18
(85)【翻訳文提出日】2023-02-07
(86)【国際出願番号】 CN2021100844
(87)【国際公開番号】W WO2021254479
(87)【国際公開日】2021-12-23
(31)【優先権主張番号】202010557830.X
(32)【優先日】2020-06-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521441168
【氏名又は名称】上海宝済薬業有限公司
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．２８，Ｌｕｏｘｉｎ Ｒｏａｄ，Ｂａｏｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１９０８，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】劉 彦君
(72)【発明者】
【氏名】王 征
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA72X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA33
4B065CA44
4C084AA02
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4C085AA13
4C085AA14
4C085BA01
4C085BB01
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4C085BB42
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE03
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA09
4C087CA12
4C087MA02
4C087NA05
4C087ZB08
4C087ZC19
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの突然変異体を提供する。前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥは、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列と、少なくとも前記アミノ酸配列の位置８、１０、２４、５９、９７及び２８０のうちの１つ又は複数の位置を置換した後に得られた前記突然変異体と、を含み、前記突然変異体の機能は、少なくとも前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの機能を含む。提供する免疫グロブリン分解酵素突然変異体の活性及び熱安定性は、野生型ＩｄｅＥよりも高い。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの突然変異体であって、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥは、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列で構成され、
前記突然変異は、
（１）前記アミノ酸配列の位置８、１０、２４、５９、９７及び２８０のうちの１つ又は複数の位置を置換した後に前記突然変異体を得ること、及び／又は
（２）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥを短縮し、そのＮ末端の最初の１つ、最初の２つ、最初の３つ、最初の４つ、最初の５つ、最初の６つ、最初の７つ、最初の８つ、最初の９つ、最初の１０つ、最初の１１つ、最初の１２つ、最初の１３つ、最初の１４つ、最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸配列を削除すること、及び／又は
（３）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥを短縮し、そのＣ末端の最後の１つ、最後の２つ、最後の３つ、最後の４つ、最後の５つ、最後の６つ、最後の７つ、最後の８つ、最後の９つ又は最後の１０つのアミノ酸配列を削除すること、
からなる群より選ばれ、
前記突然変異体は、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥよりも高い活性を有するか、及び／又は前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥよりも高い熱安定性を有することを特徴とする免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの突然変異体。
【請求項2】
前記突然変異は、（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列の位置８、１０、２４、５９、９７又は２８０を置換すること、及び／又は
（２）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＮ末端の最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸を削除し、好ましくは最初の１８つのアミノ酸を削除すること、及び／又は
（３）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＣ末端の最後の５つ又は最後の１０つのアミノ酸を削除し、好ましくは最後の５つのアミノ酸を削除すること、
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１に記載の突然変異体。
【請求項3】
前記置換は、（１）前記位置８のスレオニンが、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、バリン、アルギニン及びリジンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（２）前記位置１０のアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（３）前記位置２４のスレオニンが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（４）前記位置５９のアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（５）前記位置９７のグルタミン酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、
アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、及び
（６）前記位置２８０のアルギニンが、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、セリン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、トリプトファン、スレオニン、バリン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１又は２に記載の突然変異体。
【請求項4】
前記突然変異体配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～３５のいずれかで示されることを特徴とする請求項３に記載の突然変異体。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項に記載の突然変異体を含むタンパク質。
【請求項6】
前記タンパク質は、前記突然変異体のＮ末端にシグナルペプチドを含み、好ましくは、前記タンパク質は、前記突然変異体のＮ末端に分泌シグナル配列が連結されていて前記分泌配列のＮ末端にメチオニンが連結されているか、及び／又は前記突然変異体のＣ末端にヒスチジンタグが連結されており、より好ましくは、前記タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までメチオニン、分泌シグナル配列及び前記突然変異体で構成されることを特徴とする請求項５に記載のタンパク質。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか１項に記載の突然変異体、あるいは請求項５又は６に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド。
【請求項8】
請求項７に記載のヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の発現ベクターを含むか又は請求項１～４のいずれか１項に記載の突然変異体、あるいは請求項５又は６に記載のタンパク質を発現し、好ましくは大腸菌細胞又は酵母細胞である、宿主細胞。
【請求項10】
免疫グロブリン分解酵素もしくはその突然変異体、あるいは前記免疫グロブリン分解酵素もしくはその突然変異体を含むタンパク質と、任意の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤と、
を含む組成物。
【請求項11】
前記免疫グロブリン分解酵素は、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＳ及びＩｄｅＺから選ばれる請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記免疫グロブリン分解酵素の突然変異体は、請求項１～４のいずれか１項に記載の突然変異体であるか、あるいは、前記免疫グロブリン分解酵素もしくはその突然変異体を含む前記タンパク質は、請求項５又は６に記載のタンパク質である、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項13】
抗体又はＦｃ含有タンパク質をさらに含む請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項14】
前記抗体の標的は、細胞表面タンパク質、サイトカイン、ホルモン、酵素、細胞内メッセンジャー、細胞間メッセンジャー及び免疫チェックポイントからなる群より選ばれる、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
ウィルスベクター薬物をさらに含み、好ましくは、前記ウィルスベクター薬物は、腫瘍溶解性ウィルス、遺伝子治療ウィルス及びウィルスベクターワクチンからなる群より選ばれる請求項１０～１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項16】
血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物をさらに含み、好ましくは、前記の血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物は、ＦｃＲｎ抗体、ＦｃＲｎ高親和性のＦｃ断片変異体からなる群より選ばれる、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項17】
（１）請求項１～４のいずれか１項に記載の突然変異体、あるいは請求項５又は６に記載のタンパク質と、（２）（ａ）薬学的に許容されるベクター又は賦形剤と、（ｂ）抗体又はＦｃ含有タンパク質とからなる群より選ばれる１種又は２種以上、及び／又は
（３）腫瘍溶解性ウィルス、遺伝子治療ウィルス及びウィルスベクターワクチンから選ばれるウィルスベクター薬物、及び／又は
（４）ＦｃＲｎ抗体、ＦｃＲｎ高親和性のＦｃ断片変異体から選ばれる血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物と、
を含む、キット。
【請求項18】
パックＡとパックＢとを含むキットであって、前記パックＡは、請求項１～４のいずれか１項に記載の突然変異体、あるいは請求項５又は６に記載のタンパク質を含有し、
前記パックＢは、
（１）薬学的に許容されるベクター又は賦形剤、（２）抗体又はＦｃ含有タンパク質、及び／又は（３）ウィルスベクター薬物、及び／又は（４）血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物からなる群より選ばれる１種又は２種以上を含有し、
前記ウィルスベクター薬物は、腫瘍溶解性ウィルス、遺伝子治療ウィルス及びウィルスベクターワクチンから選ばれ、前記血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物は、ＦｃＲｎ抗体、ＦｃＲｎ高親和性のＦｃ断片変異体から選ばれることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジー分野に関し、具体的に免疫グロブリン分解酵素の突然変異体に関する。
【背景技術】
【0002】
化膿性レンサ球菌は、人間や畜類によく見られる病原菌の１種であり、自然界及び人間又は動物の口腔咽頭、呼吸器及び腸管中に広く存在している。レンサ球菌感染は、関連疾患を引き起こし、比較的に軽い病症としては、例えば化膿性皮膚炎、咽頭炎が挙げられ、比較的に重篤な疾患としては、敗血症、壊死性筋膜炎及び毒素性ショック症候群が挙げられる。化膿性レンサ球菌に由来する免疫グロブリンＧ分解酵素（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ，ＩｄｅＳ）は、よく見られるＡ型レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ，ＧＡＳ）システインプロテアーゼであり、ＩｇＧを加水分解するエンドペプチダーゼ活性を有する（Ａｇｎｉｓｗａｍｙ Ｊ，Ｌｅｉ Ｂ，Ｍｕｓｓｅｒ Ｊ Ｍら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００４，２７９：５２７８９－５２７９６．Ｌｅｉ Ｂ，ＤｅＬｅｏ Ｆ Ｒ，Ｒｅｉｄ Ｓ Ｄら，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，２００２，７０：６８８０－６８９０．Ｖｏｎ Ｐａｗｅｌ－Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ Ｕ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ｂ Ｐ，Ｂｊｏｒｃｋ Ｌ．．ＥＭＢＯ Ｊ，２００２，２１：１６０７－１６１５．）。病原菌の毒性因子として、抗体の下部ヒンジ領域ＣＨ１及びＣＨ２構造領域を識別してＩｇＧを特異的に分解し、同一のＦ（ａｂ）２及びＦｃ断片を取得でき、ＧＡＳが抗体媒介性食作用及び細胞毒性を避けるのを補助することにより、宿主免疫系のＧＡＳに対する殺傷を弱くすることができる（Ｖｏｎ Ｐａｗｅｌ－Ｒａｍｍｉｎｇｅｎ Ｕ．Ｊ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１２，４：１３２－１４０．Ｓｕ，Ｙ．－Ｆ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１１，４９：１３４－１４２．）。
【0003】
免疫グロブリンＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ，ＩｇＧ）は、血清の主な抗体成分であり、血清免疫グロブリンの約７５％を占め、生体免疫において主に保護作用を果たし、感染性疾患を有効に予防することができる。保護性作用を有することに加えて、ＩｇＧは、疾患にも関連する。幾つかの自己免疫性疾患において、ＩｇＧ抗体が人体自身の分子と反応し、臓器移植において、ＩｇＧは、急性移植拒絶反応を引き起こし得る。ＩｄｅＳは、ＩｇＧを特異的に分解することにより、ＩｇＧの有すべき機能を失わせて免疫抑制を実現する。
【0004】
現在、臨床に適用されるＩｄｅＳは、活性が良くなく、人体内に既存する抗体が多いという問題が存在する。ＩｄｅＳは、ヒト病原体の毒性因子であり、臨床研究により、普通の人は、正常生理条件下で抗ＩｄｅＳ抗体が検出される比率が１００％に近いため、ＩｄｅＳの使用方式による投与効率が低いとともに、安全性問題が存在する。
【0005】
ＩｄｅＳとの配列相同性が７０％程度のＩｄｅＥプロテアーゼは、ストレプトコッカスエクイズーＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｓｐ．ｅｑｕｉに由来し、ウマの病原菌の１種である（Ｊｏｎａｓ Ｌａｎｎｅｒｇ▲ａ▼ｒｄ，Ｂｅｎｇｔ Ｇｕｓｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，２００６，２６２：２３０－２３５）。ＩｄｅＥとＩｄｅＳの２種類の酵素は、完全に同じ位置でＩｇＧを切断し、切断が高度な再現性及び特異性を有するとともに、非常に類似する基質範囲を有する。ＩｄｅＥは、ウマ病原菌に由来するので、人体内に既存する抗体がＩｄｅＳよりも遥かに低い可能性があると推定され、よりＩｇＧ抗体媒介性疾患を治療及び予防するための免疫抑制剤の開発に適す
る。しかし、野生型ＩｄｅＥがＩｄｅＳと同様に、低活性の問題が存在する。従って、分子設計及び突然変異体選別によりＩｄｅＥの活性を向上させ、臨床使用の投与量を低下させることにより、高投与量細菌由来のタンパク質によるリスクを低下させる。これこそ本発明の実現しようとする目的である。
る。しかし、野生型ＩｄｅＥがＩｄｅＳと同様に、低活性の問題が存在する。従って、分子設計及び突然変異体選別によりＩｄｅＥの活性を向上させ、臨床使用の投与量を低下させることにより、高投与量細菌由来のタンパク質によるリスクを低下させる。これこそ本発明の実現しようとする目的である。
【発明の概要】
【0006】
本発明の第１の態様は、免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの突然変異体であって、
前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥは、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列で構成され、
前記突然変異は、
（１）前記アミノ酸配列の位置８、１０、２４、５９、９７及び２８０のうちの１つ又は複数の位置を置換した後に前記突然変異体を得ること、及び／又は
（２）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥを短縮し、そのＮ末端の最初の１つ、最初の２つ、最初の３つ、最初の４つ、最初の５つ、最初の６つ、最初の７つ、最初の８つ、最初の９つ、最初の１０つ、最初の１１つ、最初の１２つ、最初の１３つ、最初の１４つ、最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸配列を削除すること、及び／又は
（３）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥを短縮し、そのＣ末端の最後の１つ、最後の２つ、最後の３つ、最後の４つ、最後の５つ、最後の６つ、最後の７つ、最後の８つ、最後の９つ又は最後の１０つのアミノ酸配列を削除すること、からなる群より選ばれ、
前記突然変異体は、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥよりも高い活性及び／又は熱安定性を有することを特徴とする免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの突然変異体に関する。
前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥは、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列で構成され、
前記突然変異は、
（１）前記アミノ酸配列の位置８、１０、２４、５９、９７及び２８０のうちの１つ又は複数の位置を置換した後に前記突然変異体を得ること、及び／又は
（２）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥを短縮し、そのＮ末端の最初の１つ、最初の２つ、最初の３つ、最初の４つ、最初の５つ、最初の６つ、最初の７つ、最初の８つ、最初の９つ、最初の１０つ、最初の１１つ、最初の１２つ、最初の１３つ、最初の１４つ、最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸配列を削除すること、及び／又は
（３）前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥを短縮し、そのＣ末端の最後の１つ、最後の２つ、最後の３つ、最後の４つ、最後の５つ、最後の６つ、最後の７つ、最後の８つ、最後の９つ又は最後の１０つのアミノ酸配列を削除すること、からなる群より選ばれ、
前記突然変異体は、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥよりも高い活性及び／又は熱安定性を有することを特徴とする免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの突然変異体に関する。
【0007】
本発明の第２の態様は、本発明の突然変異体を含むタンパク質に関する。前記タンパク質は、前記突然変異体のＮ末端に分泌シグナル配列及び／又はメチオニンが連結されているか、及び／又は前記タンパク質は、前記突然変異体のＣ末端にヒスチジンタグが連結されている。
【0008】
本発明の第３～第５の態様は、本発明の突然変異体又はタンパク質をコードするヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに前記発現ベクターを含むか又は本発明の突然変異体又はタンパク質を発現する宿主細胞に関する。
【0009】
本発明の第６の態様は、本発明の突然変異体又はタンパク質と、薬学的に許容されるベクター又は賦形剤、抗体又はＦｃ含有タンパク質、ウィルスベクター薬物からなる群より選ばれる任意の物質と、を含む組成物又はキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図4】図４は、５０℃の条件下で１ｈ保温した後、５つのＮ末端短縮突然変異体及び野生型ＩｄｅＥによりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの電気泳動図（酵素：基質＝１：１０００）である。
【図12A】図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８によりビーグル犬、ラット、マウス、ウサギ、サル及びブタ血清中でＩｇＧを切断することで産生した切断産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの電気泳動図である。
【図12B】図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８によりビーグル犬、ラット、マウス、ウサギ、サル及びブタ血清中でＩｇＧを切断することで産生した切断産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの電気泳動図である。
【図12C】図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８によりビーグル犬、ラット、マウス、ウサギ、サル及びブタ血清中でＩｇＧを切断することで産生した切断産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの電気泳動図である。
【図12D】図１２Ａ～図１２Ｄは、異なる濃度のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８によりビーグル犬、ラット、マウス、ウサギ、サル及びブタ血清中でＩｇＧを切断することで産生した切断産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
Ｉ．免疫グロブリン分解酵素活性を有する機能性ポリペプチド
本発明の第１の態様は、機能性ポリペプチドを提供し、前記機能性ポリペプチドは、免疫グロブリン分解酵素の活性を有してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に基づく突然変異体を含み、前記突然変異体は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置８、１０、２４、５９、９７及び２８０のうちの１つ又は複数の位置でアミノ酸を置換した後に得られた突然変異体、及び／又は
（２）Ｎ末端の最初の１つ、最初の２つ、最初の３つ、最初の４つ、最初の５つ、最初
の６つ、最初の７つ、最初の８つ、最初の９つ、最初の１０つ、最初の１１つ、最初の１２つ、最初の１３つ、最初の１４つ、最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸配列を削除したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＮ末端短縮突然変異体、及び／又は
（３）Ｃ末端の最後の１つ、最後の２つ、最後の３つ、最後の４つ、最後の５つ、最後の６つ、最後の７つ、最後の８つ、最後の９つ又は最後の１０つのアミノ酸配列を削除したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＣ末端短縮突然変異体、
からなる群より選ばれる。
本発明の第１の態様は、機能性ポリペプチドを提供し、前記機能性ポリペプチドは、免疫グロブリン分解酵素の活性を有してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるアミノ酸配列に基づく突然変異体を含み、前記突然変異体は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置８、１０、２４、５９、９７及び２８０のうちの１つ又は複数の位置でアミノ酸を置換した後に得られた突然変異体、及び／又は
（２）Ｎ末端の最初の１つ、最初の２つ、最初の３つ、最初の４つ、最初の５つ、最初
の６つ、最初の７つ、最初の８つ、最初の９つ、最初の１０つ、最初の１１つ、最初の１２つ、最初の１３つ、最初の１４つ、最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸配列を削除したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＮ末端短縮突然変異体、及び／又は
（３）Ｃ末端の最後の１つ、最後の２つ、最後の３つ、最後の４つ、最後の５つ、最後の６つ、最後の７つ、最後の８つ、最後の９つ又は最後の１０つのアミノ酸配列を削除したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＣ末端短縮突然変異体、
からなる群より選ばれる。
【0012】
本発明に記載の突然変異体は、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの機能を有し、好ましくは、向上したＩｇＧ切断活性及び熱安定性を有する。
【0013】
本発明における用語「免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥよりも高い活性を有する」とは、前記突然変異体の免疫グロブリン分解能力が野生型免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥよりも優れることを指す。
【0014】
本発明における用語「ＩｄｅＥよりも高い熱安定性を有する」とは、前記突然変異体は、ある温度下で一定時間維持した後に、免疫グロブリン分解能力が同じ条件下での野生型免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥよりも優れることを指す。
【0015】
本発明に記載の突然変異体は、好ましくは遺伝子工学組み換え方式により得られる。
【0016】
好ましくは、前記突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示される配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する。
【0017】
より好ましくは、前記位置８、１０、２４、５９、９７又は２８０のアミノ酸を置換し、例えば、得られた突然変異体のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５のいずれかで示される通りであるか、
あるいは、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＮ末端の最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸を削除し、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のいずれかで示される通りであるか、
あるいは、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＣ末端の最後の１つ、最後の５つ、最後の８つ又は最後の１０つのアミノ酸を削除し、例えば、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２４のいずれかで示される通りであるか、
あるいは、前記位置８、１０、２４、５９、９７又は２８０に対して置換を行うとともに、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＮ末端の最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸を削除し、好ましくは、最初の１８つのアミノ酸を削除し、例えば、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２９のいずれかで示される通りであるか、
あるいは、前記位置８、１０、２４、５９、９７又は２８０に対して置換を行うとともに、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＮ末端の最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸を削除するとともに、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＣ末端の最後の１つ、最後の５つ、最後の８つ又は最後の１０つのアミノ酸を削除し、好ましくは、最初の１８つのアミノ酸を削除し、好ましくは最後の５つのアミノ酸を削除し、例えば、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３０～３４のいずれかで示される通りである。
あるいは、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＮ末端の最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸を削除し、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８～２２のいずれかで示される通りであるか、
あるいは、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＣ末端の最後の１つ、最後の５つ、最後の８つ又は最後の１０つのアミノ酸を削除し、例えば、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３～２４のいずれかで示される通りであるか、
あるいは、前記位置８、１０、２４、５９、９７又は２８０に対して置換を行うとともに、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＮ末端の最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸を削除し、好ましくは、最初の１８つのアミノ酸を削除し、例えば、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２９のいずれかで示される通りであるか、
あるいは、前記位置８、１０、２４、５９、９７又は２８０に対して置換を行うとともに、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＮ末端の最初の１５つ、最初の１６つ、最初の１７つ、最初の１８つ又は最初の１９つのアミノ酸を削除するとともに、前記免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥのＣ末端の最後の１つ、最後の５つ、最後の８つ又は最後の１０つのアミノ酸を削除し、好ましくは、最初の１８つのアミノ酸を削除し、好ましくは最後の５つのアミノ酸を削除し、例えば、得られた突然変異体のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３０～３４のいずれかで示される通りである。
【0018】
本発明の１つの好ましい実施態様において、前記アミノ酸の置換は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置８でのスレオニンが、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、バリン、アルギニン及びリジンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１０でのアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２４でのスレオニンが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置５９でのアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種で置換されるか、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置９７でのグルタミン酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種で置換されるか、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２８０でのアルギニンが、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、セリン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種で置換されるか、
からなる群より選ばれる。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置８でのスレオニンが、システイン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、バリン、アルギニン及びリジンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１０でのアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２４でのスレオニンが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種により置換されるか、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置５９でのアラニンが、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種で置換されるか、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置９７でのグルタミン酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種で置換されるか、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２８０でのアルギニンが、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、セリン、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンのうちのいずれか１種で置換されるか、
からなる群より選ばれる。
【0019】
本発明の１つのより好ましい実施態様において、前記アミノ酸の置換は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置８でのスレオニンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン又はチロシンにより置換されるか、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１０でのアラニンが、リジン又はアルギニンにより置換されるか、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２４でのスレオニンが、アラニン、グリシン又はセリンにより置換されるか、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置５９でのアラニンが、イソロイシン、ロイシン又はバリンにより置換されるか、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置９７でのグルタミン酸が、アスパラギンにより置換されるか、及び／又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２８０でのアルギニンが、ヒスチジン又はリジンにより置換されるか、
からなる群より選ばれる。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置８でのスレオニンが、アスパラギン酸、グルタミン酸、トリプトファン又はチロシンにより置換されるか、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置１０でのアラニンが、リジン又はアルギニンにより置換されるか、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２４でのスレオニンが、アラニン、グリシン又はセリンにより置換されるか、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置５９でのアラニンが、イソロイシン、ロイシン又はバリンにより置換されるか、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置９７でのグルタミン酸が、アスパラギンにより置換されるか、及び／又は
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の位置２８０でのアルギニンが、ヒスチジン又はリジンにより置換されるか、
からなる群より選ばれる。
【0020】
もう１つの好ましい実施態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の５つの、アミノ酸置換して得られた配列を基にして、そのＮ末端の最初の１８つのアミノ酸をさらに削除し、得られた突然変異体のアミノ酸配列
は、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２９で示される通りである。
は、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２９で示される通りである。
【0021】
もう１つの好ましい実施態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６～２９の５つの、アミノ酸置換して得られた配列を基にして、そのＣ末端の５つ又は１０つのアミノ酸を削除し、得られた突然変異体のアミノ酸配列は、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０～３４で示される通りである。
【0022】
もう１つの好ましい実施態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４～１６の３つの突然変異体を基にして、さらに組合せ突然変異を行い、得られた突然変異体のアミノ酸配列は、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で示される通りである。もう１つの好ましい実施態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の５つの、アミノ酸置換して得られた配列を基にして、そのＮ末端の最初の１８つのアミノ酸をさらに削除し、得られた突然変異体のアミノ酸配列は、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２９で示される通りである。
ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６の５つの、アミノ酸置換して得られた配列を基にして、そのＮ末端の最初の１８つのアミノ酸をさらに削除し、得られた突然変異体のアミノ酸配列は、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５～２９で示される通りである。
【0023】
好ましくは、さらに、本発明に記載の突然変異体に対して更なる突然変異を行うことができ、更なる突然変異を行った後に得られた変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するとともに、免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＥの機能を有する。
【0024】
本発明で使用されるＩｄｅＥの完全な配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＦ５７９１０．１として公衆により取得可能であり、その配列は、本明細書においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１として提供される。当該配列は、Ｎ末端メチオニン、３３つのアミノ酸の分泌シグナル配列、ＩｄｅＥコード配列をこの順で含む。Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列は、通常、成熟なＩｄｅＥタンパク質を形成するように除去され、その配列は、本明細書においてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２として提供される。別途説明がない限り、本明細書に記載の免疫グロブリン分解酵素配列におけるアミノ酸の位置に対して番号についての全ての言及は、Ｎ末端から始まるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２における相応する位置の番号に基づく。
【0025】
本発明は、上述した突然変異体を含むタンパク質をさらに提供する。
【0026】
１つの好ましい実施例において、前記タンパク質は、上記突然変異体のＮ末端にシグナルペプチドを含み、好ましくは、前記タンパク質は、前記突然変異体のＮ末端に分泌シグナル配列が連結されて前記分泌配列のＮ末端にメチオニンが連結されているか、及び／又は前記突然変異体のＣ末端にヒスチジンタグが連結されており、より好ましくは、前記タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端までメチオニン、分泌シグナル配列及び前記突然変異体を含むか、又はこれらにより構成される。
【0027】
本発明の第２の態様は、上述したタンパク質又は突然変異体をコードするヌクレオチドを提供する。
【0028】
本発明は、前記ヌクレオチドを含む発現ベクターをさらに提供する。
【0029】
本発明は、上述した発現ベクターを含む宿主細胞、あるいは上述したタンパク質又は突然変異体を発現する宿主細胞をさらに提供する。
【0030】
前記宿主細胞は、本分野において一般的にタンパク質又はポリペプチドを発現するための細胞であってもよく、前記細胞は、大腸菌細胞、酵母細胞などから選ばれる。
【0031】
ＩＩ．薬物組成物
本発明の第３の態様は、免疫グロブリン分解酵素もしくはその突然変異体、又は免疫グロブリン分解酵素もしくはその突然変異体を含むタンパク質と、任意の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤と、を含む組成物を提供する。１つの具体的な実施態様において、前記免疫グロブリン分解酵素は、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＳ及びＩｄｅＺから選ばれる。１つの具体的な実施態様において、前記免疫グロブリン分解酵素の突然変異体は、上述した突然変異体であり、前記タンパク質は、上述した突然変異体を含むタンパク質である。１つの具体的な実施態様において、本発明の組成物は、抗体又はＦｃ含有タンパク質をさらに含む。１つの具体的な実施態様において、前記抗体の標的は、細胞表面タンパク質、サイトカイン、ホルモン、酵素、細胞内メッセンジャー、細胞間メッセンジャー及び免疫チェックポイントからなる群より選ばれる。１つの具体的な実施態様において、本発明の組成物は、ウィルスベクター薬物をさらに含有し、好ましくは、前記ウィルスベクター薬物は、腫瘍溶解性ウィルス、遺伝子治療ウィルス及びウィルスベクターワクチンからなる群より選ばれる。１つの具体的な実施態様において、本発明の組成物は、血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物をさらに含み、好ましくは、前記血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物は、ＦｃＲｎ抗体、ＦｃＲｎ高親和性のＦｃ断片変異体からなる群より選ばれる。
本発明の第３の態様は、免疫グロブリン分解酵素もしくはその突然変異体、又は免疫グロブリン分解酵素もしくはその突然変異体を含むタンパク質と、任意の薬学的に許容されるベクター又は賦形剤と、を含む組成物を提供する。１つの具体的な実施態様において、前記免疫グロブリン分解酵素は、ＩｄｅＥ、ＩｄｅＳ及びＩｄｅＺから選ばれる。１つの具体的な実施態様において、前記免疫グロブリン分解酵素の突然変異体は、上述した突然変異体であり、前記タンパク質は、上述した突然変異体を含むタンパク質である。１つの具体的な実施態様において、本発明の組成物は、抗体又はＦｃ含有タンパク質をさらに含む。１つの具体的な実施態様において、前記抗体の標的は、細胞表面タンパク質、サイトカイン、ホルモン、酵素、細胞内メッセンジャー、細胞間メッセンジャー及び免疫チェックポイントからなる群より選ばれる。１つの具体的な実施態様において、本発明の組成物は、ウィルスベクター薬物をさらに含有し、好ましくは、前記ウィルスベクター薬物は、腫瘍溶解性ウィルス、遺伝子治療ウィルス及びウィルスベクターワクチンからなる群より選ばれる。１つの具体的な実施態様において、本発明の組成物は、血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物をさらに含み、好ましくは、前記血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物は、ＦｃＲｎ抗体、ＦｃＲｎ高親和性のＦｃ断片変異体からなる群より選ばれる。
【0032】
２．１ 抗体の標的
好ましくは、上述した組成物において、前記抗体の標的は、細胞表面タンパク質であってもよく、ＡＦＰ、αｖインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、α４β７インテグリン、ＢＣＭＡ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１２１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＣＥＡ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＡ１Ｘ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＥＤ－Ｂ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、ＦＯＬＲ１、ＧＤ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＧ－７２、５Ｔ４、ＲＯＲ－１、Ｓｃａ－１、ＳＰ、ＶＥＧＦ又はＷＴ１が挙げられるが、これらに限られない。
好ましくは、上述した組成物において、前記抗体の標的は、細胞表面タンパク質であってもよく、ＡＦＰ、αｖインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、α４β７インテグリン、ＢＣＭＡ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１２１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＣＥＡ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＡ１Ｘ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＥＤ－Ｂ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、ＦＯＬＲ１、ＧＤ２、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＧＰＣ３、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ－１、ＨＥＲ－２、ＨＥＲ－３、ＭＡＧＥ－Ａ３、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、ＴＭＥＦＦ２、ＴＡＧ－７２、５Ｔ４、ＲＯＲ－１、Ｓｃａ－１、ＳＰ、ＶＥＧＦ又はＷＴ１が挙げられるが、これらに限られない。
【0033】
前記抗体の標的は、サイトカインであってもよく、インターロイキンＩＬ－１～ＩＬ－１３、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、腫瘍成長因子β（ＴＧＦ－β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）又は顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）が挙げられるが、これらに限られない（ＨｕｍａｎＣｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌら，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９９１を参照）。
【0034】
前記抗体の標的は、ホルモン、酵素、細胞内メッセンジャー及び細胞間メッセンジャーであってもよく、例えばアデニル酸シクラーゼ、グアニル酸シクラーゼ又はホスホリパーゼＣである。
【0035】
前記抗体の標的は、免疫チェックポイントであってもよく、前記免疫チェックポイントとしては、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、Ｓｉｇｌｅｃ１５、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴ
Ａが挙げられる。
Ａが挙げられる。
【0036】
２．２ 標的薬物
好ましくは、上述した組成物は、標的薬物又は化学療法薬又は免疫チェックポイント遮断剤をさらに含み、前記標的薬物は、エピジェネティック薬物、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤及びチロシンキナーゼ阻害剤から選ばれ、前記化学療法薬は、免疫抑制剤、プロテアソーム阻害剤、細胞毒性薬及び細胞周期非特異的薬物から選ばれ、前記免疫チェックポイント遮断剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体から選ばれ、前記エピジェネティック薬物は、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、前記ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤は、例えばＴｒｉｃｉｂｉｎｅであり、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えばスニチニブであり、前記免疫抑制剤は、例えばシクロホスファミドであり、前記プロテアソーム阻害剤は、例えばボルテゾミブであり、前記免疫抑制剤は、例えばサリドマイド、ポマリドミドであり、前記細胞毒性薬は、例えばゲムシタビン、テモゾロミドであり、前記細胞周期非特異的薬物は、例えばミトキサントロンである。
好ましくは、上述した組成物は、標的薬物又は化学療法薬又は免疫チェックポイント遮断剤をさらに含み、前記標的薬物は、エピジェネティック薬物、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤及びチロシンキナーゼ阻害剤から選ばれ、前記化学療法薬は、免疫抑制剤、プロテアソーム阻害剤、細胞毒性薬及び細胞周期非特異的薬物から選ばれ、前記免疫チェックポイント遮断剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体から選ばれ、前記エピジェネティック薬物は、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、前記ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤は、例えばＴｒｉｃｉｂｉｎｅであり、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えばスニチニブであり、前記免疫抑制剤は、例えばシクロホスファミドであり、前記プロテアソーム阻害剤は、例えばボルテゾミブであり、前記免疫抑制剤は、例えばサリドマイド、ポマリドミドであり、前記細胞毒性薬は、例えばゲムシタビン、テモゾロミドであり、前記細胞周期非特異的薬物は、例えばミトキサントロンである。
【0037】
２．３ 血液ＩｇＧレベルを低下できる薬物
好ましくは、上述した組成物において、前記血液ＩｇＧレベルを低下できるポリペプチド薬物は、血液ＩｇＧとＦｃＲｎタンパク質との結合を遮断することができる。好ましくは、前記ポリペプチドとヒトＦｃＲｎタンパク質との親和性が、血液ＩｇＧとヒトＦｃＲｎタンパク質との親和性よりも高い。前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から選ばれる。好ましくは、前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ断片変異体を含み、前記変異体は、ＦｃとＦｃＲｎとの親和性を向上できる突然変異を含み、前記突然変異は、好ましくは、ＹＴＥ、ＹＴＥＫＦ、ＬＳ、ＮＨＳであり、前記抗体Ｆｃ断片は、例えばＥｆｇａｒｔｉｇｉｍｏｄである。前記変異体は、単量体、二量体、多量体であってもよい。本発明に利用可能な前記ＹＴＥ、ＹＴＥＫＦ、ＬＳ、ＮＨＳ等突然変異であって、前記突然変異の位置はそれぞれＤａｌｌ’Ａｃｑｕａらが述べた通り（ＷＦ，Ｄ．Ａ．ら（２００２）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：１９５０）１６９（９）：５１７１－５１８０．）、Ｌｅｅらが述べた通りである（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．ら（２０１９）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：５０３１．）。前記突然変異の対象は、ヒトＩｇＧから選ばれ、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から選ばれる。
好ましくは、上述した組成物において、前記血液ＩｇＧレベルを低下できるポリペプチド薬物は、血液ＩｇＧとＦｃＲｎタンパク質との結合を遮断することができる。好ましくは、前記ポリペプチドとヒトＦｃＲｎタンパク質との親和性が、血液ＩｇＧとヒトＦｃＲｎタンパク質との親和性よりも高い。前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から選ばれる。好ましくは、前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ断片変異体を含み、前記変異体は、ＦｃとＦｃＲｎとの親和性を向上できる突然変異を含み、前記突然変異は、好ましくは、ＹＴＥ、ＹＴＥＫＦ、ＬＳ、ＮＨＳであり、前記抗体Ｆｃ断片は、例えばＥｆｇａｒｔｉｇｉｍｏｄである。前記変異体は、単量体、二量体、多量体であってもよい。本発明に利用可能な前記ＹＴＥ、ＹＴＥＫＦ、ＬＳ、ＮＨＳ等突然変異であって、前記突然変異の位置はそれぞれＤａｌｌ’Ａｃｑｕａらが述べた通り（ＷＦ，Ｄ．Ａ．ら（２００２）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：１９５０）１６９（９）：５１７１－５１８０．）、Ｌｅｅらが述べた通りである（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．ら（２０１９）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：５０３１．）。前記突然変異の対象は、ヒトＩｇＧから選ばれ、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４から選ばれる。
【0038】
本発明に利用可能な他のＦｃ断片変異体において、前記変異体は、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらが述べた突然変異（ＷＦ，Ｄ．Ａ．ら（２００２）．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．：１９５０）１６９（９）：５１７１－５１８０．）、Ｓｈａｎらが述べた突然変異（Ｓｈａｎ，Ｌ．ら（２０１６）．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １１（８）：ｅ０１６０３４５．）、Ｌｅｅらが述べた突然変異（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．ら（２０１９）．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ １０（１）：５０３１．）、Ｍａｃｋｎｅｓｓらが述べた突然変異（Ｍａｃｋｎｅｓｓ，Ｂ．Ｃ．ら（２０１９）．ＭＡｂｓ １１（７）：１２７６－１２８８．）、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅらが述べた突然変異（Ｄｕｍｅｔ Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅ，Ｐｏｔｔｉｅｒ Ｊ▲ｅ▼ｒ▲ｅ▼ｍｙ，Ｇｏｕｉｌｌｅｕｘ－Ｇｒｕａｒｔ Ｖａｌ▲ｅ▼ｒｉｅら，ＭＡｂｓ，２０１９，１１：１３４１－１３５０．）を含むが、これらに限られない。
【0039】
好ましくは、前記ポリペプチドは、抗体Ｆｃ断片変異体を含み、前記変異体は、ＦｃとＦｃγＲとの親和性を向上できる突然変異を含み、前記変異体は、好ましくはＳ２３９Ｄ／Ｉ３２２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３２２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ、Ｒ２１
４Ｋ突然変異であり、前記変異体は、好ましくはフコースで修飾されていない。前記変異体は、単量体、二量体、多量体であってもよい。本発明に利用可能な他のＦｃ断片変異体であって、前記変異体は、Ｗａｎｇらが述べた突然変異体（Ｗａｎｇ Ｘｉｎｈｕａ．，Ｍａｔｈｉｅｕ Ｍａｒｙ．，Ｂｒｅｚｓｋｉ Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ．（２０１８）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，９（１），６３－７３．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３２３８－０１７－０４７３－８）を含むが、これらに限られない。
４Ｋ突然変異であり、前記変異体は、好ましくはフコースで修飾されていない。前記変異体は、単量体、二量体、多量体であってもよい。本発明に利用可能な他のＦｃ断片変異体であって、前記変異体は、Ｗａｎｇらが述べた突然変異体（Ｗａｎｇ Ｘｉｎｈｕａ．，Ｍａｔｈｉｅｕ Ｍａｒｙ．，Ｂｒｅｚｓｋｉ Ｒａｎｄａｌｌ Ｊ．（２０１８）．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｌｌ，９（１），６３－７３．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３２３８－０１７－０４７３－８）を含むが、これらに限られない。
【0040】
好ましくは、上述したＦｃとＦｃＲｎとの親和性を向上できる変異体は、ＦｃとＦｃγＲとの親和性を向上できる突然変異を同時に含んでいる。前記変異体は、単量体、二量体、多量体であってもよい。
【0041】
好ましくは、前記の薬物組成物において、前記ポリペプチドは、抗ＦｃＲｎ抗体から選ばれ、前記抗体は、例えばＮｉｐｏｃａｌｉｍａｂ、Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ、ＲＶＴ－１４０１、ＨＢＭ９１６１、ＡＬＸＮ１８３０、ＳＹＮＴ００１、Ｎｉｒｓｅｖｉｍａｂである。
【0042】
好ましくは、前記の薬物組成物において、前記ポリペプチドは、ＦｃＲｎに特異的に結合できる小ペプチド断片から選ばれ、前記小ペプチド断片の長さが１０～７０個アミノ酸であり、前記小ペプチド断片は、例えばＡＢＹ－０３９である。
【0043】
好ましくは、前記ポリペプチドは、ＦｃＲｎに特異的に結合できるＦｃ多量体から選ばれ、前記Ｆｃ多量体は、例えばＧＬ－２０４５、Ｍ２３０、ＰＲＩＭ、ＨｅｘａＧａｒｄ（商標）、ＣＳＬ７７７、Ｈｅｘａｖａｌｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｂｙ ＵＣＢである。
【0044】
好ましくは、前記ポリペプチドは、Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙらが述べたポリペプチド断片（Ｓｏｃｋｏｌｏｓｋｙ Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｔ，Ｓｚｏｋａ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｃ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，２０１５，９１：１０９－２４）を含むが、これらに限られない。
【0045】
２．４ ウィルスベクター薬物
好ましくは、上述した組成物において、前記ウィルスベクター薬物において、前記ウィルスベクター薬物に用いられるウィルスは、ｓｓＤＮＡウィルス、ｄｓＤＮＡウィルス、ｓｓＲＮＡウィルス又はｄｓＲＮＡウィルスから選ばれるか、及び／又は前記ウィルスベクター薬物に用いられるウィルスは、野生型ウィルス株又は自然弱毒株、遺伝子工学選択的弱毒株、遺伝子搭載型ウィルス株、遺伝子転写標的型ウィルス株から選ばれる。
好ましくは、上述した組成物において、前記ウィルスベクター薬物において、前記ウィルスベクター薬物に用いられるウィルスは、ｓｓＤＮＡウィルス、ｄｓＤＮＡウィルス、ｓｓＲＮＡウィルス又はｄｓＲＮＡウィルスから選ばれるか、及び／又は前記ウィルスベクター薬物に用いられるウィルスは、野生型ウィルス株又は自然弱毒株、遺伝子工学選択的弱毒株、遺伝子搭載型ウィルス株、遺伝子転写標的型ウィルス株から選ばれる。
【0046】
好ましくは、前記野生型ウィルス株又は自然弱毒株は、ニューカッスル病ウィルス、レオウィルス、ムンプスウィルス、ウエストナイルウィルス、アデノウイルス、ワクシニアウィルス等から選ばれる。
【0047】
好ましくは、前記遺伝子工学選択的弱毒株は、鍵遺伝子が人工により削除されてウィルス複製の腫瘍選択性を実現するものであり、例えば、チミジンキナーゼ（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ， ＴＫ）によりノックアウトされた遺伝子で操作された単純ヘルペスウィルスＩ（ＨＳＶ－１）であり、前記遺伝子工学選択的弱毒株は、例えばＯＮＹＸ－０１５、Ｇ２０７である。ＯＮＹＸ－０１５は、Ｅ１ｂ領域において８２７ｂｐが削除されているとともに、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質に対する遺伝子において点変異が行われ、その発現遺伝子を中途で終止させ、Ｅ１Ｂ５５Ｋタンパク質を発現できなくなる。Ｇ２０７は、γ３４．５遺伝子が削除されており、当該遺伝子はＨＳＶ－１の神経毒性決定要素である。
【0048】
好ましくは、前記遺伝子搭載型ウィルス株には外来遺伝子が搭載され、前記外来遺伝子は、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）であり、前記遺伝子搭載型ウィルス株は、例えばＪＸ－５９４又はＴ－ＶＥＣである。
【0049】
好ましくは、前記遺伝子転写標的型ウィルス株は、すなわち、ウィルス必須遺伝子の前に組織又は腫瘍特異的プロモーターを挿入することで腫瘍溶解性ウィルスの腫瘍細胞内での複製を制御し、前記遺伝子転写標的型ウィルス株は、例えばＧ９２Ａである。
【0050】
好ましくは、上述した薬物組成物において、前記ｓｓＤＮＡウィルスは、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）から選ばれ、好ましくは、前記パルボウイルスはＨ－１ＰＶウィルスである。
【0051】
好ましくは、前記ｄｓＤＮＡウィルスは、単純ヘルペスウィルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏ ｖｉｒｕｓ）、ｐｏｘｖｉｒｕｓから選ばれ、より好ましくは、前記単純ヘルペスウィルスは、Ｉ型単純ヘルペスウィルスＨＳＶ－１であり、例えばＲ３６１６、Ｔ－ＶＥＣ、ＨＦ１０、Ｇ２０７、ＮＶ１０２０、ＯｒｉｅｎＸ０１０であり、前記ｐｏｘｖｉｒｕｓは、Ｐｅｘａ－Ｖｅｃ（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅ）、ＪＸ－５９４（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓｅ）、ＧＬ－ＯＮＣ１、Ｍｙｘｏｍａから選ばれ、前記アデノウイルスは、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、ＤＮＸ－２４０１、Ｃ－ＲＥＶ、ＮＧ－３４８、ＰｒｏｓＡｔａｋ、ＣＧ００７０、ＡＤＶ－ＴＫ、ＥＤＳ０１、ＫＨ９０１、Ｈ１０１、Ｈ１０３、ＶＣＮ－０１、Ｔｅｌｏｍｅｌｙｓｉｎ（ＯＢＰ－３０１）から選ばれる。
【0052】
好ましくは、前記ｓｓＲＮＡウィルスは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ、ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓから選ばれ、好ましくは、前記Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓは、ＣＡＶＡＴＡＫ、ＰＶＳ－ＲＩＰＯ、ＣＶＡ２１（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ＲＩＧＶＩＲから選ばれ、前記ａｌｐｈａｖｉｒｕｓは、Ｍ１、Ｓｉｎｄｂｉｓ ＡＲ３３９、Ｓｅｍｌｉｋｉ
Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓから選ばれ、前記Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓは、Ｔｏｃａ５１１から選ばれ、前記Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓは、ＭＶ－ＮＩＳ、ＰＶ７０１（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）から選ばれ、前記Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓは、ＶＳＶ－ＩＦＮβ、ＭＧ１－ＭＡＧＥＡ３、ＶＳＶ－ＧＰから選ばれる。
Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓから選ばれ、前記Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓは、Ｔｏｃａ５１１から選ばれ、前記Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓは、ＭＶ－ＮＩＳ、ＰＶ７０１（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）から選ばれ、前記Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓは、ＶＳＶ－ＩＦＮβ、ＭＧ１－ＭＡＧＥＡ３、ＶＳＶ－ＧＰから選ばれる。
【0053】
好ましくは、前記ｄｓＲＮＡウィルスは、Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓから選ばれ、好ましくは、前記Ｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓは、Ｐｅｌａｒｅｏｒｅｐ、レオウィルス（Ｒｅｏｌｙｓｉｎ）、ワクシニアウィルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、ムンプスウィルス、ヒト免疫不全症ウィルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）から選ばれ、好ましくは、前記ＲＮＡウィルスは、レオウィルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）、コクサッキーウィルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ）、ポリオウィルス（ｐｏｌｉｏ ｖｉｒｕｓ）、セネカバレーウィルス（ｓｅｎｅｃａ ｖａｌｌｅｙ ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウィルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウィルス（ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎ウィルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザウィルスから選ばれる。
【0054】
好ましくは、上述した薬物組成物において、前記腫瘍溶解性ウィルスは、外来遺伝子を発現し、前記外来遺伝子は、好ましくは二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ，ＢｉＴＥ）、ｓｃＦｖ断片、サイトカイン、ケモカインである。前記ＢｉＴＥは、ＣＤ３等の、Ｔ細胞を活性化する分子に結合する
ことができ、同時に、癌細胞表面の抗原標的に結合することができる。前記ｓｃＦｖは、免疫チェックポイントを標的とする。前記免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、Ｓｉｇｌｅｃ１５、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡを含む。前記サイトカイン、ケモカインは、例えばＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、可溶型ＣＤ８０、ＣＣＬ３である。
ことができ、同時に、癌細胞表面の抗原標的に結合することができる。前記ｓｃＦｖは、免疫チェックポイントを標的とする。前記免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、Ｓｉｇｌｅｃ１５、４－１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡを含む。前記サイトカイン、ケモカインは、例えばＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、可溶型ＣＤ８０、ＣＣＬ３である。
【0055】
２．５ 遺伝子治療薬物
好ましくは、上述した組成物において、前記遺伝子治療ウィルスは、外来遺伝子を発現し、前記外来遺伝子は遺伝子欠陥疾患に必要なタンパク質をコードし、前記タンパク質は、酸性α－グルコシダーゼ、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２、α－ガラクトシダーゼ、アルギノコハク酸シンターゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼＡ、Ｃｌプロテアーゼ阻害剤又はＣｌエステラーゼ阻害剤、グルコース－６－ホスファターゼ、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン放出因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、血管内皮成長因子、アンジオポイエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、結合組織成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、形質転換成長因子ａ、血小板由来成長因子、インスリン成長因子ＩとＩＩ、ＴＧＦ、骨形態形成タンパク質、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィンＮＴ－３とＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、レクチン、ｎｅｔｒｉｎ－１とｎｅｔｒｉｎ－２、肝細胞成長因子、ｅｐｈｒｉｎｓ、チロシンヒドロキシラーゼ、トロンボポエチン、インターロイキン（ＩＬ－１からＩＬ－３６等）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子ａとｂ、インターフェロンａ／ｂ／ｇ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、凝固（凝固）因子（因子ＸＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、タンパク質Ｃ等）、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロブリン、α－グロブリン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属トランスポーター（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症（ＡＲＳＡ）に関与する酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ｂ－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸ホルモンから選ばれる。
好ましくは、上述した組成物において、前記遺伝子治療ウィルスは、外来遺伝子を発現し、前記外来遺伝子は遺伝子欠陥疾患に必要なタンパク質をコードし、前記タンパク質は、酸性α－グルコシダーゼ、銅輸送ＡＴＰａｓｅ２、α－ガラクトシダーゼ、アルギノコハク酸シンターゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼＡ、Ｃｌプロテアーゼ阻害剤又はＣｌエステラーゼ阻害剤、グルコース－６－ホスファターゼ、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン放出因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、血管内皮成長因子、アンジオポイエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、結合組織成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、形質転換成長因子ａ、血小板由来成長因子、インスリン成長因子ＩとＩＩ、ＴＧＦ、骨形態形成タンパク質、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィンＮＴ－３とＮＴ４／５、毛様体神経栄養因子、グリア細胞由来神経栄養因子、ニューロトロフィン、レクチン、ｎｅｔｒｉｎ－１とｎｅｔｒｉｎ－２、肝細胞成長因子、ｅｐｈｒｉｎｓ、チロシンヒドロキシラーゼ、トロンボポエチン、インターロイキン（ＩＬ－１からＩＬ－３６等）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子ａとｂ、インターフェロンａ／ｂ／ｇ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンド、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、単鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、凝固（凝固）因子（因子ＸＩＩＩ、因子ＩＸ、因子ＶＩＩＩ、因子Ｘ、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩａ、タンパク質Ｃ等）、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロブリン、α－グロブリン、スペクトリン、α－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、金属トランスポーター（ＡＴＰ７Ａ又はＡＴＰ７）、スルファミダーゼ、リソソーム蓄積症（ＡＲＳＡ）に関与する酵素、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ｂ－２５グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼ、分岐鎖ケト酸ホルモンから選ばれる。
【0056】
好ましくは、上述した組成物において、前記遺伝子治療ウィルスは外来遺伝子を持ち、前記外来遺伝子コードは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス分子、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム及びｓｈＲＮＡの阻害性核酸から選ばれる。前記阻害性核酸は、ポリヌクレオチドリピート疾患に関連する遺伝子に結合し、当該遺伝子の転写物又は当該遺伝子の転写物のポリヌクレオチドがリピートする。前記疾患遺伝子コード関連タンパク質であって、前記タンパク質は、ハンチントンタンパク質（ＨＴＴ）、球脊髄性筋萎縮症におけるＸ染色体上のアンドロゲン受容体、ヒトＡｔａｘｉｎ－１／－２／－３／－７、Ｃａｖ２．１Ｐ／Ｑ電位依存性カルシウムチャネル（ＣＡＣＮＡ１Ａ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質、Ａｔａｘｉｎ８逆鎖（ＡＴＸＮ８０Ｓ）、脊髄小脳失調症におけるセリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ａ ５５ｋＤａ調節サブユニットＢベータアイソフォーム（１、２、３、６、７、８、１２１７型）、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ症候群における脆弱性１）、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、脆弱ＸＥ精神遅滞におけるＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞２）又はＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２、筋強直
性ジストロフィーにおけるミオトニン－プロテインキナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）、Ｆｒａｔａｘｉｎから選ばれる。前記疾患遺伝子は、スーパーオキシドディスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の突然変異体、パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の病理発生に関与する遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）、ＰＣＳＫ９、ＨＩＶ感染症関連遺伝子（ＨＩＶＴａｔ、ＴＡＲ、ＨＩＶＴＡＲ、ＣＣＲ５）、インフルエンザウィルス感染症におけるＡ型インフルエンザウィルスゲノム／遺伝子配列、ＳＡＲＳ感染症における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウィルスゲノム／遺伝子配列、呼吸器合胞体ウイルス感染症における呼吸器合胞体ウィルスゲノム／遺伝子配列、エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列、Ｂ型及びＣ型肝炎感染症におけるＢ型及びＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列、ＨＳＶ感染症における単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウィルスＢ３感染症におけるコクサッキーウィルスＢ３ゲノム／遺伝子配列、原発性ジストニアにおけるｔｏｒｓｉｎＡ（ＴＯＲ１Ａ）のような遺伝子の病原性アレルのサイレンシング（アレル特異的サイレンシング）、移植における汎クラスＩ及びＨＬＡ対立遺伝子、常染色体優性遺伝網膜色素変性症における突然変異体、及びロドプシン遺伝子から選ばれる。
性ジストロフィーにおけるミオトニン－プロテインキナーゼ（ＭＴ－ＰＫ）、Ｆｒａｔａｘｉｎから選ばれる。前記疾患遺伝子は、スーパーオキシドディスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子の突然変異体、パーキンソン病及び／又はアルツハイマー病の病理発生に関与する遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ（ＡＰＯＢ）、ＰＣＳＫ９、ＨＩＶ感染症関連遺伝子（ＨＩＶＴａｔ、ＴＡＲ、ＨＩＶＴＡＲ、ＣＣＲ５）、インフルエンザウィルス感染症におけるＡ型インフルエンザウィルスゲノム／遺伝子配列、ＳＡＲＳ感染症における重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウィルスゲノム／遺伝子配列、呼吸器合胞体ウイルス感染症における呼吸器合胞体ウィルスゲノム／遺伝子配列、エボラ感染症におけるエボラフィロウイルスゲノム／遺伝子配列、Ｂ型及びＣ型肝炎感染症におけるＢ型及びＣ型肝炎ウイルスゲノム／遺伝子配列、ＨＳＶ感染症における単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ゲノム／遺伝子配列、コクサッキーウィルスＢ３感染症におけるコクサッキーウィルスＢ３ゲノム／遺伝子配列、原発性ジストニアにおけるｔｏｒｓｉｎＡ（ＴＯＲ１Ａ）のような遺伝子の病原性アレルのサイレンシング（アレル特異的サイレンシング）、移植における汎クラスＩ及びＨＬＡ対立遺伝子、常染色体優性遺伝網膜色素変性症における突然変異体、及びロドプシン遺伝子から選ばれる。
【0057】
ＩＩＩ．製品
本発明は、上述した突然変異体又はタンパク質と治療剤とを含有し、前記治療剤は、ウィルスベクター薬物、抗体、血液ＩｇＧレベルを低下できるポリペプチド薬物から選ばれる製品をさらに提供する。
本発明は、上述した突然変異体又はタンパク質と治療剤とを含有し、前記治療剤は、ウィルスベクター薬物、抗体、血液ＩｇＧレベルを低下できるポリペプチド薬物から選ばれる製品をさらに提供する。
【0058】
本発明は、キット又は薬学的パックをさらに提供し、前記キットは、１）前記の突然変異体を含む治療有効量の薬物と、２）ウィルスベクター薬物、抗体、血液ＩｇＧレベルを低下できるポリペプチド薬物から選ばれる治療有効量の治療剤であって、前記ウィルスベクター薬物は、好ましくは腫瘍溶解性ウィルス、遺伝子治療ウィルスである治療剤と、を含む。前記キットは、３）標的薬物又は化学療法薬又は免疫チェックポイント遮断剤をさらに含んでもよい。前記標的薬物は、エピジェネティック薬物、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤、及びチロシンキナーゼ阻害剤から選ばれ、前記化学療法薬は、免疫抑制剤、プロテアソーム阻害剤、細胞毒性薬及び細胞周期非特異的薬物から選ばれ、前記免疫チェックポイント遮断剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体から選ばれ、前記エピジェネティック薬物は、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、前記ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤は、例えばＴｒｉｃｉｂｉｎｅであり、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えばスニチニブであり、前記免疫抑制剤は、例えばシクロホスファミドであり、前記プロテアソーム阻害剤は、例えばボルテゾミブであり、前記免疫抑制剤は、例えばサリドマイド、ポマリドミドであり、前記細胞毒性薬は、例えばゲムシタビン、テモゾロミドであり、前記細胞周期非特異的薬物は、例えばミトキサントロンである。
【0059】
前記キット又は薬学的パックは、パックＡ及びパックＢを含み、前記パックＡは、治療有効量の上述した突然変異体又はタンパク質を含み、前記パックＢは、治療有効量の治療剤を含み、前記治療剤は、ウィルスベクター薬物、抗体、血液ＩｇＧレベルを低下できるポリペプチド薬物から選ばれ、前記ウィルスベクター薬物は、好ましくは腫瘍溶解性ウィルス、遺伝子治療ウィルスである。前記薬学的パックは、パックＣをさらに含んでもよい。前記パックＣは、標的薬物又は化学療法薬又は免疫チェックポイント遮断剤を含む。前記標的薬物は、エピジェネティック薬物、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤、及びチロシンキナーゼ阻害剤から選ばれ、前記化学療法薬は、免疫抑制剤、プロテアソーム阻害剤、細胞毒性薬及び細胞周期非特異的薬物から選ばれ、前記免疫チェックポイント遮断剤は、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＭ－３抗
体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体から選ばれ、前記エピジェネティック薬物は、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、前記ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤は、例えばＴｒｉｃｉｂｉｎｅであり、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えばスニチニブであり、前記免疫抑制剤は、例えばシクロホスファミドであり、前記プロテアソーム阻害剤は、例えばボルテゾミブであり、前記免疫抑制剤は、例えばサリドマイド、ポマリドミドであり、前記細胞毒性薬は、例えばゲムシタビン、テモゾロミドであり、前記細胞周期非特異的薬物は、例えばミトキサントロンである。
体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｓｉｇｌｅｃ１５抗体、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体から選ばれ、前記エピジェネティック薬物は、例えばヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、前記ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路を標的とする阻害剤は、例えばＴｒｉｃｉｂｉｎｅであり、前記チロシンキナーゼ阻害剤は、例えばスニチニブであり、前記免疫抑制剤は、例えばシクロホスファミドであり、前記プロテアソーム阻害剤は、例えばボルテゾミブであり、前記免疫抑制剤は、例えばサリドマイド、ポマリドミドであり、前記細胞毒性薬は、例えばゲムシタビン、テモゾロミドであり、前記細胞周期非特異的薬物は、例えばミトキサントロンである。
【0060】
当該キットは、治療有効量の上述した突然変異体又はタンパク質と治療有効量の治療剤の投与（例えば、投与量情報、投与時間間隔情報）に関する説明書を含んでもよい。前記治療剤は、ウィルスベクター薬物、抗体、血液ＩｇＧレベルを低下できるポリペプチド薬物から選ばれ、前記ウィルスベクター薬物は、好ましくは腫瘍溶解性ウィルスである。
【0061】
十分確立した発現系によってウィルスベクター薬物を製造することができる。幾つかの方法の例は、哺乳類細胞発現系を利用してウィルス粒子を生成し、例えば、ＨＥＫ２９３細胞を使用してアデノウイルス種のウィルスベクター薬物を生産することができる（Ｆｒｅｅｄｍａｎ Ｊｏｓｈｕａ Ｄ， Ｄｕｆｆｙ Ｍａｒｇａｒｅｔ Ｒ， Ｌｅｉ－Ｒｏｓｓｍａｎｎ Ｊａｎｅｔ他， Ａｎ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ．［Ｊ］ ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ２０１８， ７８：６８５２－６８６５．）。
【0062】
薬物ベクターは、液体であってもよく、かつ、薬物組成物は、溶液の形であってもよい。液体ベクターは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤及び圧縮組成物の調製に用いられる。活性成分は、薬学的に許容される液体ベクター、例えば水、有機溶媒、両者の混合物又は薬学的に許容される油もしくは脂肪に溶解又は懸濁することができる。
【0063】
非経口投与用の薬物組成物は、滅菌状態、実質的に等張で、発熱物質を含まず、ＦＤＡ又は同様の団体のＧＭＰに従って調製する。水、油、生理食塩水、グリセロール又はエタノールなどの滅菌液であってよい薬物ベクターを含む生理的に許容される希釈剤中の注射用量の溶液又は懸濁液物質として、ウィルスベクター薬物を投与することができる。さらに、例えば湿潤剤又は乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が組成物中に存在してよい。薬物組成物の他の成分は、石油、動物、植物、又は合成起源の成分、例えばピーナッツ油、大豆油、及び鉱油である。一般に、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコールは、特に注射溶液に好ましい液体ベクターである。活性成分の徐放を可能にするような形式で製剤化され得るデポー注射又はインプラント調製物の形で、ウィルスベクター薬物を投与することができる。典型的には、組成物は液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射用として調製され、注射前に溶液中、又は懸濁液中、液体賦形剤中に適した固体型に調製することもできる。
【0064】
別途定義がない限り、本明細書において用いる全ての技術及び科学用語も本発明が所属する分野の通常の技術者に一般に理解されいる意味と同じ意味を有する。本発明の実施又は測定において本明細書において前述したものと同様又は等価のあらゆる方法、装置及び材料を用いることができるが、以下、好ましい方法、装置及び材料を説明する。
【0065】
用語「ヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖形態の、デオキ
シリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを表す。別段の制限がなければ、本用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類縁体を含有する核酸を包含する。別段の制限がなければ、本用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類縁体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）を含む、オリゴヌクレオチド類縁体も表す。別段の記載がなければ、ある核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント（縮重コドン置換を含むが、これに限定されない。）及び相補的配列並びに明示的に記されている配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された一又は複数（又は全て）のコドンの三番目の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５０８１（１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８（１９８５）； ａｎｄ Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
シリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを表す。別段の制限がなければ、本用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類縁体を含有する核酸を包含する。別段の制限がなければ、本用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類縁体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）を含む、オリゴヌクレオチド類縁体も表す。別段の記載がなければ、ある核酸配列は、保存的に修飾されたそのバリアント（縮重コドン置換を含むが、これに限定されない。）及び相補的配列並びに明示的に記されている配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、選択された一又は複数（又は全て）のコドンの三番目の位置が混合された塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９： ５０８１（１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５－２６０８（１９８５）； ａｎｄ Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。
【0066】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するように本明細書において互いに読み替えられている。すなわち、ポリペプチドに関する記載は、同様にペプチドの記載及びタンパク質の記載に当てはまり、逆もまた同じである。前記用語は、自然発生アミノ酸ポリマー、及び１以上のアミノ酸残基が天然にコードされないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーにあてはまる。本明細書において使用されるように、前記用語は、アミノ酸残基がペプチド共有結合により連結されている完全長タンパク質（すなわち抗原）を含むあらゆる長さのアミノ酸鎖を包含する。
【0067】
用語「宿主細胞」とは、挿入のために使用される方法、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ－接合（ｆ－ｍａｔｉｎｇ）又は組換え宿主細胞を作製するための本分野で公知の他の方法にかかわらず、本発明のヌクレオチドを含む細胞を指す。外来ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター、例えば、プラスミドとして維持されることができ、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれることができる。
【0068】
用語「形質転換」とは、異種ＤＮＡ配列を宿主細胞又は生体に導入する方法を指す。
【0069】
用語「発現」とは、内因性遺伝子又はトランスジェニックの細胞における転写及び／又は翻訳を指す。
【0070】
本発明の積極的な効果は以下の通りである。本発明は、活性及び／又は熱安定性が野生型ＩｄｅＥより高く、活性がＩｄｅＳ及びＩｄｅＺよりも高い（ヒトＩｇＧを切断する場合にＩｄｅＳ及びＩｄｅＺよりも有効であり、活性がＩｄｅＳの２倍近く、ＩｄｅＺの４倍超えである）免疫グロブリン分解酵素突然変異体を提供する。
【実施例】
【0071】
以下、実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明は、上述した実施例の範囲内に限定されない。下記の実施例において、具体的な条件を明記しなかった試験方法について、通常の方法及び条件、又は商品説明書に従って選択する。
【0072】
実施例１．突然変異体ライブラリーの設計及び発現
野生型ＩｄｅＥタンパク質配列の突然変異体ライブラリーを設計及び構築し、選別によりその中から４０つの突然変異体菌株を得た。
野生型ＩｄｅＥタンパク質配列の突然変異体ライブラリーを設計及び構築し、選別によりその中から４０つの突然変異体菌株を得た。
【0073】
コドン最適化した後に野生型ＩｄｅＥタンパク質配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコ
ードするポリヌクレオチド配列を合成し、Ｎ末端シグナルペプチド配列及びＣ末端６×ヒスチジンタグを添加し、配列を合成した後、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入し、正しく配列決定した後に、野生型ＩｄｅＥ発現用の組み換えプラスミドを得た。野生型ＩｄｅＥ発現用のプラスミドを基にして、突然変異体ライブラリーに必要なディジェネレートプライマーを設計し、オリジナル野生型の配列を増幅し、増幅後に配列をベクターに挿入して突然変異体ライブラリー用の組み換えプラスミドを得た。野生型及び突然変異体ライブラリー用の組み換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ電気的に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガロースプレートに接種した。コロニーが生育するとなるまで３７℃で一晩培養した。単一コロニーを拾って、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地 ２００μｌに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地
１ｍｌに接種し、３７℃で４ｈ培養した後に、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、引き続き３０℃で一晩培養した。一晩培養した後、遠心によりその上清を収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて突然変異体発現上清中の突然変異体タンパク質の濃度を評価した。
ードするポリヌクレオチド配列を合成し、Ｎ末端シグナルペプチド配列及びＣ末端６×ヒスチジンタグを添加し、配列を合成した後、ｐＥＴ３２ａ発現ベクターに挿入し、正しく配列決定した後に、野生型ＩｄｅＥ発現用の組み換えプラスミドを得た。野生型ＩｄｅＥ発現用のプラスミドを基にして、突然変異体ライブラリーに必要なディジェネレートプライマーを設計し、オリジナル野生型の配列を増幅し、増幅後に配列をベクターに挿入して突然変異体ライブラリー用の組み換えプラスミドを得た。野生型及び突然変異体ライブラリー用の組み換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ電気的に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガロースプレートに接種した。コロニーが生育するとなるまで３７℃で一晩培養した。単一コロニーを拾って、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地 ２００μｌに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地
１ｍｌに接種し、３７℃で４ｈ培養した後に、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加して、引き続き３０℃で一晩培養した。一晩培養した後、遠心によりその上清を収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて突然変異体発現上清中の突然変異体タンパク質の濃度を評価した。
【0074】
実施例２．突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の評価
各突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性を評価するために、ＥＬＳＩＡに基づく活性測定方法を構築した。測定原理は、ヒトＩｇＧ１特異性抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、その後、相当する濃度の突然変異体タンパク質を含有する上清サンプルをヒトＩｇＧ１とともにウェル中でインキュベートした。抗体Ｆｃ部分に対して特異性を有するヒトＩｇＧ１検出抗体を用いて、ウェルに結合する完全又は切断不完全なヒトＩｇＧ１の量を測定した。ウェルに供した上清における突然変異体タンパク質の濃度が同じである場合、突然変異体タンパク質のヒトＩｇＧ１切断活性が高いほど、ウェルに結合する完全なヒトＩｇＧ１抗体が少なくなり、得られたシグナルが少なくなる。異なる濃度のＩｇＧ１と、対応する検出シグナルとの関係により、ＩｇＧ１検量線を作製することができ、検量線に基づいて完全又は切断不完全なＩｇＧ１の量を算出し、さらに、切断完全なＩｇＧ１の量を算出した。元のＩｇＧ１に占める切断完全なＩｇＧ１の割合で突然変異体活性の高低を評価した。
各突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性を評価するために、ＥＬＳＩＡに基づく活性測定方法を構築した。測定原理は、ヒトＩｇＧ１特異性抗原でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、その後、相当する濃度の突然変異体タンパク質を含有する上清サンプルをヒトＩｇＧ１とともにウェル中でインキュベートした。抗体Ｆｃ部分に対して特異性を有するヒトＩｇＧ１検出抗体を用いて、ウェルに結合する完全又は切断不完全なヒトＩｇＧ１の量を測定した。ウェルに供した上清における突然変異体タンパク質の濃度が同じである場合、突然変異体タンパク質のヒトＩｇＧ１切断活性が高いほど、ウェルに結合する完全なヒトＩｇＧ１抗体が少なくなり、得られたシグナルが少なくなる。異なる濃度のＩｇＧ１と、対応する検出シグナルとの関係により、ＩｇＧ１検量線を作製することができ、検量線に基づいて完全又は切断不完全なＩｇＧ１の量を算出し、さらに、切断完全なＩｇＧ１の量を算出した。元のＩｇＧ１に占める切断完全なＩｇＧ１の割合で突然変異体活性の高低を評価した。
【0075】
実施例１において得られた上清中の突然変異体タンパク質の濃度を相当なレベルにするために、同じローディング量でＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出を行い、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅを用いて電気泳動プロファイルにおける目標タンパク質バンドの光学濃度値を分析し、ローディング量が同じである場合、プロファイル中の目標タンパク質バンドの光学濃度値が高いほど、濃度が高くなる。ＩｄｅＥ上清を対照として、その他の突然変異体の上清を濃縮又は希釈し、突然変異体タンパク質バンドの光学濃度値を全てＩｄｅＥ対照の光学濃度値とほとんど一致させた。
【0076】
上清中のタンパク質の濃度を相当なレベルに調整した後、以下の方法に従ってＥＬＩＳＡ検出を行った。ＥＬＩＳＡプレートを２μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ１（トラスツズマブ）特異性抗原（品番：ＱＲＥ－１０４、瑞安生物）により２～８℃でコーティングして一晩過ごし、その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％トゥイーン２０）で洗浄し、洗浄後のＥＬＩＳＡプレートを２％ＢＳＡ（ＰＢＳで調製）により３７℃で２ｈ密閉し、密閉した後、ＰＢＳＴで洗浄した。
【0077】
検量線の作製：
２００ｎｇ／ｍｌのトラスツズマブを反応緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）により１：２の割合で～３．１２５ｎｇ／ｍｌとなるまで勾配希釈し、異なる濃度のトラスツズマブ １００μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、基質（トラスツズマブ）検量線で作製した。
２００ｎｇ／ｍｌのトラスツズマブを反応緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）により１：２の割合で～３．１２５ｎｇ／ｍｌとなるまで勾配希釈し、異なる濃度のトラスツズマブ １００μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、基質（トラスツズマブ）検量線で作製した。
【0078】
切断反応：
タンパク質の濃度を調整した後の上清を反応緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で５倍に希釈し、１００ｎｇ／ｍｌのトラスツズマブ ５０μｌと、希釈後の上清 ５０μｌとをＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。
タンパク質の濃度を調整した後の上清を反応緩衝液（１０ｍＭ ＰＢ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）で５倍に希釈し、１００ｎｇ／ｍｌのトラスツズマブ ５０μｌと、希釈後の上清 ５０μｌとをＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。
【0079】
ＥＬＩＳＡプレートを３７℃で１ｈ振とうしながらインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後に、さらに４０ｎｇ／ｍｌのＧｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ＨＲＰ（品番：３１４１３、Ｔｈｅｒｍｏ）をウェルプレートに添加し、３７℃で１ｈ振とうしながらインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後にＴＭＢをＨＲＰの発色基質として添加して１５ｍｉｎインキュベートし、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４で終了させた。エライザで４５０ｎｍにおける吸光度を検出した。基質検量線に基づいて、異なる測定用ウェル中の完全又は切断不完全なトラスツズマブの濃度を算出し、さらに、元のトラスツズマブに占める切断完全なトラスツズマブの割合を算出し、これをもって異なる突然変異体の活性を評価した。
【0080】
各突然変異体活性の野生型ＩｄｅＥ活性に対する倍数関係を表１に示す。実施例１において選別により得られた４０つの突然変異体は、いずれも野生型ＩｄｅＥよりも高い活性を有し、そのうち、１５つの突然変異体の活性が野生型ＩｄｅＥの２倍又は２倍以上であった。
【0081】
【表1】
【0082】
実施例３ 突然変異体の熱安定性に対する評価
表１に示す、活性が野生型ＩｄｅＥの２倍又は２倍以上である１５つの突然変異体から、１２つの突然変異体を選択してその熱安定性を検出した。活性の検出方法を以下に示す。
表１に示す、活性が野生型ＩｄｅＥの２倍又は２倍以上である１５つの突然変異体から、１２つの突然変異体を選択してその熱安定性を検出した。活性の検出方法を以下に示す。
【0083】
野生型又は各突然変異体の上清を２つの部分に分けて、それぞれ４℃及び５０℃の条件下で１ｈ保温し、保温後に、実施例２におけるＥＬＩＳＡ方法に従って野生型又は各突然変異体の活性を検出し、５０℃で保温した後の活性／４℃で保温した後の活性を用いて、野生型又は各突然変異体の５０℃条件下で１ｈ保温した後の残存活性パーセンテージ（％
）を算出し、これをもって野生型と各突然変異体の熱安定性を比較した。
）を算出し、これをもって野生型と各突然変異体の熱安定性を比較した。
【0084】
突然変異体活性の野生型ＩｄｅＥに対する熱安定性の倍数関係を表２に示す。表２に示すように、１２つの突然変異体はいずれも野生型よりも高い熱安定性を有し、そのうち、７つの突然変異体の熱安定性が野生型の３倍以上であった。
【0085】
【表2】
【0086】
実施例４ 単一部位突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
表１及び表２に示すＴ８Ｄ、Ｔ８Ｗ、Ｔ２４Ａ、Ａ５９Ｌ、Ａ５９Ｖ、Ｅ９７Ｄ及びＲ２８０Ｈの７つの「活性が野生型ＩｄｅＥの２倍以上であり、熱安定性が野生型ＩｄｅＥの３倍以上である」単一部位突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性を検出した。
表１及び表２に示すＴ８Ｄ、Ｔ８Ｗ、Ｔ２４Ａ、Ａ５９Ｌ、Ａ５９Ｖ、Ｅ９７Ｄ及びＲ２８０Ｈの７つの「活性が野生型ＩｄｅＥの２倍以上であり、熱安定性が野生型ＩｄｅＥの３倍以上である」単一部位突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性を検出した。
【0087】
１． 突然変異体の発現及び精製
実施例１における上述した５つの単一部位突然変異体の形質転換用プレートからそれぞれ１つのシングルコロニーを拾って、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地 ３ｍｌに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地 ５０ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ６００が０．４～０．６となるまで培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、引き続き３０℃で一晩培養した。一晩培養した後、遠心により上清を収集した。上清をさらにＩＤＡ－Ｎｉ磁性アガロースビーズで精製し、精製、溶離後のタンパク質を限外ろ過遠心管でさらにＰＢＳ緩衝系中へ培地交換した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製後の突然変異体タンパク質の純度を評価した。ＯＤ２８０を検出し、吸光係数に基づいて精製後の突然変異体タンパク質の濃度を算出した。
実施例１における上述した５つの単一部位突然変異体の形質転換用プレートからそれぞれ１つのシングルコロニーを拾って、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地 ３ｍｌに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。一晩培養した後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地 ５０ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ６００が０．４～０．６となるまで培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、引き続き３０℃で一晩培養した。一晩培養した後、遠心により上清を収集した。上清をさらにＩＤＡ－Ｎｉ磁性アガロースビーズで精製し、精製、溶離後のタンパク質を限外ろ過遠心管でさらにＰＢＳ緩衝系中へ培地交換した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥで精製後の突然変異体タンパク質の純度を評価した。ＯＤ２８０を検出し、吸光係数に基づいて精製後の突然変異体タンパク質の濃度を算出した。
【0088】
２． 突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
ＳＤＳ－ＰＡＧＥで表示される各種の突然変異体の異なる濃度でヒトＩｇＧ１に対して産生した切断産物によって、異なる突然変異体の野生型ＩｄｅＥに対するヒトＩｇＧ１切断活性の高低をさらに評価した。精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．００２ｍｇ／ｍＬ及び０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。異なる濃度の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥで表示される各種の突然変異体の異なる濃度でヒトＩｇＧ１に対して産生した切断産物によって、異なる突然変異体の野生型ＩｄｅＥに対するヒトＩｇＧ１切断活性の高低をさらに評価した。精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．００２ｍｇ／ｍＬ及び０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。異なる濃度の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0089】
図１は、７つの単一部位突然変異体及び野生型ＩｄｅＥによりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：１０００）を示す。図２は、７つの単一部位突然変異体及び野生型ＩｄｅＥによりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：２０００）を示す。７つの単一部位突然変異
体は、０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ１を切断する効果がいずれも０．００２ｍｇ／ｍｌの野生型ＩｄｅＥに劣らず、７つの単一部位突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性が野生型ＩｄｅＥの２倍以上であることがわかった。
体は、０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度でＩｇＧ１を切断する効果がいずれも０．００２ｍｇ／ｍｌの野生型ＩｄｅＥに劣らず、７つの単一部位突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性が野生型ＩｄｅＥの２倍以上であることがわかった。
【0090】
実施例５ Ｎ末端短縮突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性及び熱安定性の比較
野生型ＩｄｅＥを基にしてＮ末端の最初の１５つ（Ｄ１－Ｖ１５）、最初の１６つ（Ｄ１－Ｐ１６）、最初の１７つ（Ｄ１－Ｈ１７）、最初の１８つ（Ｄ１－Ｑ１８）および最初の１９つのアミノ酸（Ｄ１－Ｉ１９）をそれぞれ削除し、５つのＮ末端短縮突然変異体を構築した（表３を参照）。
野生型ＩｄｅＥを基にしてＮ末端の最初の１５つ（Ｄ１－Ｖ１５）、最初の１６つ（Ｄ１－Ｐ１６）、最初の１７つ（Ｄ１－Ｈ１７）、最初の１８つ（Ｄ１－Ｑ１８）および最初の１９つのアミノ酸（Ｄ１－Ｉ１９）をそれぞれ削除し、５つのＮ末端短縮突然変異体を構築した（表３を参照）。
【0091】
【表3】
【0092】
１． 突然変異体の発現及び精製
実施例１の方法に従って表３における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
実施例１の方法に従って表３における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
【0093】
２． 突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．００２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応した。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．００２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応した。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0094】
図３は、５つの短縮突然変異体によりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：１０００）を示す。５つの短縮突然変異体の切断活性はいずれも野生型ＩｄｅＥと明らかな差異がなかった。
【0095】
３． 突然変異体の熱安定性の比較
精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０℃の条件下で１ｈ保温し、保温後にさらに０．００２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０℃の条件下で１ｈ保温し、保温後にさらに０．００２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0096】
図４は、５０℃の条件下で１ｈ保温した後に５つの短縮突然変異体及び野生型ＩｄｅＥによりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：１０００）を示す。５０℃で加熱処理した後に５つの短縮突然変異体の残存活性は明らかに野生型よりも高く、５つの短縮突然変異体のいずれも野生型に対して熱安定性が明らかに向上したことがわかった。
【0097】
実施例６ Ｃ末端短縮突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
野生型ＩｄｅＥを基にしてＣ末端の最後の５つ（Ｗ３１１－Ｓ３１５）及び最後の１０つのアミノ酸（Ｓ３０６－Ｓ３１５）をそれぞれ削除し、２つのＣ末端短縮突然変異体を構築した（表４を参照）。
野生型ＩｄｅＥを基にしてＣ末端の最後の５つ（Ｗ３１１－Ｓ３１５）及び最後の１０つのアミノ酸（Ｓ３０６－Ｓ３１５）をそれぞれ削除し、２つのＣ末端短縮突然変異体を構築した（表４を参照）。
【0098】
【表4】
【0099】
１． 突然変異体の発現及び精製
実施例１の方法に従って表４における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
実施例１の方法に従って表４における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
【0100】
２． 突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．００２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
精製後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ０．００２ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0101】
図５は、２つのＣ末端短縮突然変異体によりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：１０００）を示す。２つの短縮突然変異体の切断活性がいずれも野生型ＩｄｅＥよりも２倍以上高かった。
【0102】
実施例７ 組合せ突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性及び熱安定性の比較
Ｔ２４Ａ、Ａ５９Ｌ、Ａ５９Ｖ、Ｅ９７ＤおよびＲ２８０Ｈの５つの単一部位突然変異体を基にしてそれぞれ最初の１８つ（Ｄ１－Ｑ１８）アミノ酸を削除し、５つの組合せ突然変異体を構築した（表５を参照）。
Ｔ２４Ａ、Ａ５９Ｌ、Ａ５９Ｖ、Ｅ９７ＤおよびＲ２８０Ｈの５つの単一部位突然変異体を基にしてそれぞれ最初の１８つ（Ｄ１－Ｑ１８）アミノ酸を削除し、５つの組合せ突然変異体を構築した（表５を参照）。
【0103】
【表5】
【0104】
１． 突然変異体の発現及び精製
実施例１の方法に従って表５における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
実施例１の方法に従って表５における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
【0105】
２． 突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
精製後の突然変異体をそれぞれ０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
精製後の突然変異体をそれぞれ０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0106】
図６は、５つの組合せ突然変異体によりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：２０００）を示す。図６と図２の切断効果を比較したところ、５つの短縮突然変異体および単一部位組合せ突然変異体の切断活性は明らかな差異がなく、組合せ突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性は同様に野生型ＩｄｅＥの２倍以上であることがわかった。
【0107】
３． 突然変異体の熱安定性の比較
精製後の突然変異体をそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０℃の条件下で１ｈ保温し、保温後にさらに０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５
０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
精製後の突然変異体をそれぞれ０．１ｍｇ／ｍｌに希釈し、５０℃の条件下で１ｈ保温し、保温後にさらに０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５
０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0108】
図７は、５０℃の条件下で１ｈ保温した後に５つの組合せ突然変異体によりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：２０００）を示す。図８及び図７の切断効果を比較したところ、５つの組合せ突然変異体は、５０℃で加熱処理した後の活性が少し低下しただけであり、５つの組合せ突然変異体は野生型に対して熱安定性も明らかに向上したことがわかった。
【0109】
実施例８ Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体とＩｄｅＳ及びＩｄｅＺの活性の比較
実施例７で精製されたＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体を順次に～２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬおよび１．２５μｇ／ｍｌに希釈した。ＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標），品番：Ａ０－ＦＲＩ－０２０，Ｇｅｎｏｖｉｓ）をその標識に従ってそれぞれ～２Ｕ／μｌ、１Ｕ／μｌ、０．５Ｕ／μｌ、０．２５Ｕ／μｌおよび０．１２５Ｕ／μｌに希釈した。ＩｄｅＺ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ－Ｚ（登録商標），品番：Ａ０－ＦＲＺ－０２０，Ｇｅｎｏｖｉｓ）をそれぞれ０．４Ｕ／μｌ、０．２Ｕ／μｌ、０．１Ｕ／μｌ、０．０５Ｕ／μｌ及び０．０２５Ｕ／μｌに希釈した。異なる濃度の突然変異体、ＩｄｅＳ又はＩｄｅＺをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
実施例７で精製されたＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体を順次に～２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬおよび１．２５μｇ／ｍｌに希釈した。ＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標），品番：Ａ０－ＦＲＩ－０２０，Ｇｅｎｏｖｉｓ）をその標識に従ってそれぞれ～２Ｕ／μｌ、１Ｕ／μｌ、０．５Ｕ／μｌ、０．２５Ｕ／μｌおよび０．１２５Ｕ／μｌに希釈した。ＩｄｅＺ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ－Ｚ（登録商標），品番：Ａ０－ＦＲＺ－０２０，Ｇｅｎｏｖｉｓ）をそれぞれ０．４Ｕ／μｌ、０．２Ｕ／μｌ、０．１Ｕ／μｌ、０．０５Ｕ／μｌ及び０．０２５Ｕ／μｌに希釈した。異なる濃度の突然変異体、ＩｄｅＳ又はＩｄｅＺをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0110】
図８は、異なる濃度のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体及びＩｄｅＳによりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図を示す。電気泳動図における酵素タンパク質バンドから、レーン番号１のＩｄｅＳ酵素の濃度がレーン番号７と番号８のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体酵素の濃度の間にあり、これにより、レーン番号３のＩｄｅＳ酵素の濃度がレーン番号９と番号１０のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体酵素の濃度の間にあり、レーン番号３のＩｇＧ１の酵素切断効果がレーン番号１０と番号１１の間にあると帰納でき、これにより、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性がＩｄｅＳの２倍に近いと推定できる。
【0111】
図９は、異なる濃度のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体及びＩｄｅＺによりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図を示す。電気泳動図における酵素タンパク質バンドから、レーン番号１のＩｄｅＺ酵素の濃度がレーン番号７のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体酵素の濃度より高いと判定でき、これにより、レーン番号３のＩｄｅＺ酵素の濃度がレーン番号９のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体酵素の濃度よりも高く、すなわち、レーン番号１１のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体酵素の濃度の４倍を超え、また、レーン番号３のＩｇＧ１の酵素切断効果がレーン番号１１に近いと帰納でき、これにより、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性がＩｄｅＺの４倍を超えることがわかった。
【0112】
実施例９ Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の体外検出
Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体及びヒトＩＶＩｇを添加して処理されたマウス血清又は血漿中の完全又は一回切断したＩＶＩｇの量を検出することでＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体のヒトＩｇＧ１に対する体外切断活性を評価した。表６に従って異なる群のマウス血清又は血漿酵素切断系を調製した。
Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体及びヒトＩＶＩｇを添加して処理されたマウス血清又は血漿中の完全又は一回切断したＩＶＩｇの量を検出することでＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体のヒトＩｇＧ１に対する体外切断活性を評価した。表６に従って異なる群のマウス血清又は血漿酵素切断系を調製した。
【0113】
【表6】
【0114】
ヨード酢酸処理群において、ヨード酢酸の作用は、ＩｇＧ分解酵素の活性を抑制することである。
【0115】
系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。２０μｌのサンプルを拾って同じ体積２×ＳＤＳ非還元ローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0116】
図１０は、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体がマウス血清及び血漿においてヒトＩＶＩｇを切断することで産生した切断産物の電気泳動図を示す。その結果、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８は、マウス血清及び血漿のいずれにおいてもヒトＩＶＩｇを有効に切断できることを示した。
【0117】
Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体を添加して処理されたマウス又はヒト血清を検出することでＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体がヒトＩｇＧ１に対する体外切断活性を有するか否かを評価した。表７に従って、異なる群のマウス又はヒト血清酵素切断系を構築した。
【0118】
【表7】
【0119】
系を３７℃で２４ｈ反応させた。２０μｌのサンプルを拾って同じ体積の２×ＳＤＳ還元性ローディング緩衝液と混合し、さらに１×ＳＤＳ還元性ローディング緩衝液で２０倍に希釈し、７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0120】
図１１は、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体がマウス及びヒト血清において産生した切断産物の電気泳動図を示す。その結果、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８は、ヒト血清において切断を行って２５ｋＤのＦｃ断片の産生が顕著に見られ、これに対して、マウス血清中では当該断片が見られなかったことを示し、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８は、ヒト血清中のＩｇＧ１を有効に特異的切断できるが、マウス血清中のＩｇＧ１に対する切断活性が非常に低いか、あるいは切断活性がないことがわかった。
【0121】
実施例１０ Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体により異なる種属の免疫グロブリンを切断
Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体と、異なる種属の動物血清又は血漿を添加して完全又は一回切断したＩｇＧの量を検出することでＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体の異なる種属動物血清の免疫グロブリンに対する体外切断活性を評価した。表８及び表９に従って、異なる種属の血清又は抗体酵素切断系を構築した。
Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体と、異なる種属の動物血清又は血漿を添加して完全又は一回切断したＩｇＧの量を検出することでＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体の異なる種属動物血清の免疫グロブリンに対する体外切断活性を評価した。表８及び表９に従って、異なる種属の血清又は抗体酵素切断系を構築した。
【0122】
【表8】
【0123】
系を３７℃で１時間反応させ、酵素切断産物をＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出を行った。
【0124】
【表9】
【0125】
図１２Ａ～１２Ｄは、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体の異なる種の血清及び抗体における効果を示す。その結果、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８は、イヌＩｇＧ、ウサギＩｇＧ及びマウスＩｇＧ２ａを有効に切断できるが、マウスＩｇＧ１を切断できず、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８は、ウサギ、イヌ及びサル血清ＩｇＧを有効に切断でき、その中、ウサギ血清ＩｇＧに対する切断効果が最も良く、ブタ血清ＩｇＧに対する切断効果が良くなく、ラット及びマウス血清ＩｇＧがほとんど切断されなかった。
【0126】
実施例１１ 人体内でＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体に対する既存抗体が少ない
当該測定は、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体とＩｄｅＳとの抗Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８／ＩｄｅＳ抗体結合の競争に基づく。測定用酵素及びヒト血清のプレインキュベートにより、抗Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８／ＩｄｅＳ抗体及びＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体がＩｄｅＳと結合可能にした。
当該測定は、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体とＩｄｅＳとの抗Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８／ＩｄｅＳ抗体結合の競争に基づく。測定用酵素及びヒト血清のプレインキュベートにより、抗Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８／ＩｄｅＳ抗体及びＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体がＩｄｅＳと結合可能にした。
【0127】
Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体とＩｄｅＳをウェルプレートでコーティングして一晩過ごし、その後、ＰＢＳＴで洗浄して２％ＢＳＡ密閉液中で１時間密閉し、徐々に希釈した測定すべき突然変異体をＩｄｅＳ及びヒト血清とともに混合プレートを製造し、混合プ
レートを室温下で１時間振とうしながらインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後にビオチンでマークされたＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体及びＩｄｅＳを添加し、さらにＳＡ－ＨＲＰを添加し、ＴＭＢで発色させて示度を読んだ。得られた約８０人の血サンプル中での既存のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８抗体及びＩｄｅＳ抗体の状況を並列比較した。
レートを室温下で１時間振とうしながらインキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した後にビオチンでマークされたＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体及びＩｄｅＳを添加し、さらにＳＡ－ＨＲＰを添加し、ＴＭＢで発色させて示度を読んだ。得られた約８０人の血サンプル中での既存のＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８抗体及びＩｄｅＳ抗体の状況を並列比較した。
【0128】
その結果、表１０に示すように、ＩｄｅＳは、正常ヒト血清中での既存抗体の割合が約９０％と高いが、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体の場合は約２０％に過ぎない。体内でＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体の既存抗体がＩｄｅＳよりも明らかに少なく、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体の免疫原性がより低く、より体内投与に有利であることが証明された。
【0129】
【表10】
【0130】
実施例１２ Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の体内検出
無菌条件下でヒトＩＶＩｇ（ヒト免疫グロブリンを静脈内注射）を２匹のマウス（２匹のマウスが並行試験であり、マウスの番号が１及び２である）に腹腔内注射し、注射投与量が１ｇ／ｋｇであった。ヒトＩＶＩｇを注射してから２４ｈ後、さらにＩｇＧ分解酵素（Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８）を５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウスに静脈内注射し、２匹のマウスにＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８を注射した後の０ｈ、１５ｍｉｎ、２ｈ、６ｈ及び２４ｈで採血して血清サンプルを収集した。２０μｌの血清サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳ非還元ローディング緩衝液と混合した後、さらに１×ＳＤＳ非還元性ローディング緩衝液で２０倍に希釈し、７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出を行った。
無菌条件下でヒトＩＶＩｇ（ヒト免疫グロブリンを静脈内注射）を２匹のマウス（２匹のマウスが並行試験であり、マウスの番号が１及び２である）に腹腔内注射し、注射投与量が１ｇ／ｋｇであった。ヒトＩＶＩｇを注射してから２４ｈ後、さらにＩｇＧ分解酵素（Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８）を５ｍｇ／ｋｇの投与量でマウスに静脈内注射し、２匹のマウスにＥ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８を注射した後の０ｈ、１５ｍｉｎ、２ｈ、６ｈ及び２４ｈで採血して血清サンプルを収集した。２０μｌの血清サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳ非還元ローディング緩衝液と混合した後、さらに１×ＳＤＳ非還元性ローディング緩衝液で２０倍に希釈し、７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出を行った。
【0131】
図１３は、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８がマウス体内で異なる時間内でヒトＩＶＩｇを切断することで産生した切断産物の電気泳動図を示す。その結果、Ｅ９７Ｄ＿ｄｅｌ１８は、マウス体内でのＩＶＩｇ切断効果が顕著であり、１５ｍｉｎで酵素を完全に切断した。
【0132】
実施例１３ 組合せ突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
上述した突然変異体を基にして、６種の組合せ突然変異体をさらに構築し、前記突然変異体の配列を表１１に示す。
上述した突然変異体を基にして、６種の組合せ突然変異体をさらに構築し、前記突然変異体の配列を表１１に示す。
【0133】
【表11】
【0134】
１． 突然変異体の発現及び精製
実施例１の方法に従って表１１における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
実施例１の方法に従って表１１における突然変異体ポリヌクレオチド配列を合成し、突然変異体発現用組み換えプラスミドを構築し、大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）へ形質転換した。実施例４における方法に従って精製突然変異体タンパク質を製造した。
【0135】
２．突然変異体のヒトＩｇＧ１切断活性の比較
精製後の突然変異体をそれぞれ０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
精製後の突然変異体をそれぞれ０．００１ｍｇ／ｍＬに希釈した。希釈後の突然変異体又は野生型ＩｄｅＥをそれぞれ５０μｌ拾って、２ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブを含有する反応系 ５０μｌに添加して切断反応を開始させ、反応系を３７℃で３０ｍｉｎ反応させた。サンプルを同じ体積の２×ＳＤＳローディング緩衝液と混合した後に７５℃で５ｍｉｎ水浴させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで切断産物を検出した。
【0136】
図１４Ａ及び１４Ｂは、６つの組合せ突然変異体によりヒトＩｇＧ１を切断することで産生した切断産物の電気泳動図（酵素：基質＝１：２０００）を示す。
【0137】
本発明は、上記実施例によって本発明の詳細な方法を説明したが、本発明は上記詳細な方法に限定されるわけではなく、すなわち、上記詳細な方法のみにより実施しなければならないことを意味するものではないことを出願人より声明する。当業者にとって、本発明に対する如何なる改善、本発明に係る製品の各原料に対する均等置換及び補助成分の添加、具体的な形態に対する選択などは、いずれも本発明の保護範囲及び開示範囲に属することを理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【配列表】
【国際調査報告】