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▶ カリスマ セラピューティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-27
(54)【発明の名称】免疫細胞のｍＲＮＡトランスフェクション
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20230720BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230720BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230720BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20230720BHJP
C12N 15/00 20060101ALN20230720BHJP
C12N 5/078 20100101ALN20230720BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z
C12N15/62 Z
C12N5/10
C12N15/13
C12N15/00 100Z
C12N5/078
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022579959
(86)(22)【出願日】2021-06-25
(85)【翻訳文提出日】2023-01-16
(86)【国際出願番号】 US2021039168
(87)【国際公開番号】W WO2021263152
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】63/044,855
(32)【優先日】2020-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521029782
【氏名又は名称】カリスマ セラピューティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】クリチンスキー， マイケル
(72)【発明者】
【氏名】大谷 有美
(72)【発明者】
【氏名】ロス， ケイリー
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD39
4B065CA24
4B065CA44
(57)【要約】
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする修飾メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を送達することによって免疫細胞を修飾する方法及びＣＡＲを含む修飾免疫細胞に関する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
免疫細胞を修飾する方法であって、以下のステップ、すなわち、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を修飾するステップと、
（ｂ）前記ｍＲＮＡを精製するステップと、
（ｃ）前記ｍＲＮＡを前記免疫細胞に送達するステップとを含み、
前記免疫細胞は、マクロファージ、単球または樹状細胞を含み、
前記修飾免疫細胞は、ＣＡＲを含む、前記方法。
【請求項2】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡに修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、及び／またはポリ（Ａ）テールを含めることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記キャップ構造が、ＡＧＣａｐ１、ｍ６ＡＧＣａｐ１、または抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記修飾ヌクレオチドが、シュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍＰｓＵ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記精製するステップが、シリカ膜精製及び／または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記送達するステップが、トランスフェクションを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及び５ｍｏＵを含めることを含み、前記精製するステップが、シリカ膜精製を含み、前記送達するステップが、エレクトロポレーションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含めることを含み、前記精製するステップが、ＨＰＬＣを含み、前記送達するステップが、エレクトロポレーションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及びＮ１ｍＰｓＵを含めることを含み、前記精製するステップが、ＨＰＬＣを含み、前記送達するステップが、エレクトロポレーションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＮ１ｍＰｓＵを含めることを含み、前記精製するステップが、ＨＰＬＣを含み、前記送達するステップが、エレクトロポレーションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含めることを含み、前記精製するステップが、ＨＰＬＣを含み、前記送達するステップが、エレクトロポレーションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記修飾するステップが、ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含むように前記ｍＲＮＡを修飾することを含み、前記精製するステップが、ＨＰＬＣを含み、前記送達するステップが、トランスフェクションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含めることを含み、前記精製するステップが、ＨＰＬＣを含み、前記送達するステップが、トランスフェクションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＮ１ｍＰｓＵを含めることを含み、前記精製するステップが、ＨＰＬＣを含み、前記送達するステップが、トランスフェクションを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及び５ｍｏＵを含めることを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記修飾するステップが、前記ｍＲＮＡにｍ６ＡＧＣａｐ１及び５ｍｏＵを含めることを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記免疫細胞をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理するステップをさらに含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＲＮａｓｅＬ阻害剤がスニチニブを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ＲＮａｓｅＬ阻害剤がＡＢＣＥ１を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記処理するステップが、前記送達するステップの前に行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記免疫細胞を、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養するステップをさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記サイトカインが、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＳＴＮＧＬ、ＬＰＳ、ＣＤ４０アゴニスト、４－１ＢＢリガンド、組換え４－１ＢＢ受容体、ＴＬＲアゴニスト、ベータ－グルカン、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、グルココルチコイド、免疫複合体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記サイトカインがＩＦＮ－βを含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記培養するステップが、前記送達するステップの後に行われる、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記修飾免疫細胞が前記ＣＡＲを発現する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
ＣＡＲ発現が、前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡが送達されたのと同じタイプの修飾免疫細胞におけるＣＡＲ発現と比較して増加する、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記修飾免疫細胞が、前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡが送達されたのと同じタイプの修飾免疫細胞におけるエフェクター活性と比較して、エフェクター活性の増大を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法によって作製された修飾免疫細胞。
【請求項29】
前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、生存率の増加を示す、請求項２８に記載の修飾免疫細胞。
【請求項30】
前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、前記ＣＡＲをコードする前記ｍＲＮＡの発現の増加を示す、請求項２８または請求項２９に記載の修飾免疫細胞。
【請求項31】
前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲ発現の増加を示す、請求項２８～３０のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
【請求項32】
前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、前記ＣＡＲをコードする前記ｍＲＮＡの寿命の延伸を示す、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
【請求項33】
前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、前記ＣＡＲの寿命の延伸を示す、請求項２８～３２のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
【請求項34】
前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、エフェクター活性の増加を示す、請求項２８～３３のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
【請求項35】
前記ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、Ｍ１分極の増加を示す、請求項２８～３４のいずれか１項に記載の修飾免疫細胞。
【請求項36】
１つ以上の修飾ｍＲＮＡであって、修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、ポリＡテール、またはそれらの組み合わせを含む、前記１つ以上の修飾ｍＲＮＡ、及び１つ以上のＲＮａｓｅＬ阻害剤を含む、組成物。
【請求項37】
前記キャップ構造が、ＡＧＣａｐ１またはｍ６ＡＧＣａｐ１を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項38】
前記修飾ヌクレオチドが、シュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）、またはＮ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍＰｓＵ）を含む、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記１つ以上のＲＮａｓｅＬ阻害剤がスニチニブを含む、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記１つ以上のＲＮａｓｅＬ阻害剤がＡＢＣＥ１を含む、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／０４４，８５５号に対する優先権及び利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６３／０４４，８５５号に対する優先権及び利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
免疫療法は、がん、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、全身性アミロイドーシス、プリオン病、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、線維症など、多くの疾患及び障害に対して調査されてきたが、直面している機能的制限は、依然として対処する必要がある。
【0003】
したがって、発現、生存率、及び機能を強化するために最適化された治療方針を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、とりわけ、単球、マクロファージ及び／または樹状細胞を含む免疫細胞を修飾するための方法、システム及び組成物を包含する。いくつかの実施形態では、提供される方法、システム、及び／または組成物は、修飾された免疫細胞の産生の強化及び／または特性の強化を提供する。驚くべきことに、本開示は、修飾ｍＲＮＡ（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの目的の導入遺伝子をコードする５’キャップまたはウリジン修飾ｍＲＮＡ）の使用によって、ヒト単球、マクロファージ及び／または樹状細胞の発現レベル、発現の持続性、及び生存率の有意な増加がもたらされる可能性があるという認識を包含する。さらに、本開示は、インターフェロンベータの使用によって、ＣＡＲまたは他の導入遺伝子をコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたＣＡＲ単球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の発現レベル、発現の持続性、及び機能の有意な増加がもたらされる可能性があるという認識を包含する。本開示はまた、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｅＬ阻害剤）の使用によって、所望のポリヌクレオチド及び／またはポリペプチド（例えば、導入遺伝子）の有意な発現レベルの増加がもたらされる可能性があるという認識を包含する。
【0005】
一態様では、本開示は、免疫細胞を修飾する方法を提供であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を修飾するステップ、ｍＲＮＡを精製するステップ、及びｍＲＮＡを免疫細胞に送達するステップを含み、免疫細胞は、マクロファージ、単球または樹状細胞を含み、修飾免疫細胞はＣＡＲを含む、方法を提供する。
【0006】
いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡに修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、及び／またはポリ（Ａ）テールを含めることを含む。いくつかの実施形態では、キャップ構造は、ＡＧＣａｐ１、ｍ６ＡＧＣａｐ１、または抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍＰｓＵ）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、精製するステップは、シリカ膜精製及び／または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。いくつかの実施形態では、送達するステップは、トランスフェクションを含む。
【0007】
いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及び５ｍｏＵを含めることを含み、精製するステップは、シリカ膜精製を含み、送達するステップは、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含めることを含み、精製するステップは、ＨＰＬＣを含み、送達するステップは、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及びＮ１ｍＰｓＵを含めることを含み、精製するステップは、ＨＰＬＣを含み、送達するステップは、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＮ１ｍＰｓＵを含めることを含み、精製するステップは、ＨＰＬＣを含み、送達するステップは、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含めることを含み、精製するステップは、ＨＰＬＣを含み、送達するステップは、エレクトロポレーションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含むようにｍＲＮＡを修飾することを含み、精製するステップは、ＨＰＬＣを含み、送達するステップは、トランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵを含めることを含み、精製するステップは、ＨＰＬＣを含み、送達するステップは、トランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＮ１ｍＰｓＵを含めることを含み、精製するステップは、ＨＰＬＣを含み、送達するステップは、トランスフェクションを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにＡＧＣａｐ１及び５ｍｏＵを含めることを含む。いくつかの実施形態では、修飾するステップは、ｍＲＮＡにｍ６ＡＧＣａｐ１及び５ｍｏＵを含めることを含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、免疫細胞をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅＬ阻害剤は、スニチニブを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅＬ阻害剤は、ＡＢＣＥ１を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、処理するステップは、送達するステップの前に行われる。
【0010】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、免疫細胞をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＳＴＮＧＬ、ＬＰＳ、ＣＤ４０アゴニスト、４－１ＢＢリガンド、組換え４－１ＢＢ受容体、ＴＬＲアゴニスト、ベータ－グルカン、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、グルココルチコイド、免疫複合体、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－βを含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、培養するステップは、送達するステップの後に行われる。
【0012】
いくつかの実施形態では、本発明の方法によって、ＣＡＲを発現する修飾免疫細胞がもたらされる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ発現は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡが送達されたのと同じタイプの修飾免疫細胞におけるＣＡＲ発現と比較して増加する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡが送達されたのと同じタイプの修飾免疫細胞におけるエフェクター活性と比較して、エフェクター活性の増大を示す。
【0013】
別の態様では、本開示は、本発明の方法によって作製された修飾免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、生存率の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲ発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲの寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、エフェクター活性の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、Ｍ１分極の増加を示す。
【0014】
別の態様では、本開示は、１つ以上の修飾ｍＲＮＡであって、修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、ポリＡテール、またはそれらの組み合わせを含む、１つ以上の修飾ｍＲＮＡ、及び１つ以上のＲＮａｓｅＬ阻害剤を含む組成物を提供する。
【0015】
いくつかの実施形態では、キャップ構造は、ＡＧＣａｐ１またはｍ６ＡＧＣａｐ１を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）、またはＮ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍＰｓＵ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮａｓｅＬ阻害剤は、スニチニブを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮａｓｅＬ阻害剤は、ＡＢＣＥ１を含む。
【0016】
図面は、例示のみを目的としており、限定を目的としていない。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1A】様々な修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡによる、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション後のマクロファージ生存率を示す例示的なグラフを示す。
【図1B】様々な修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡによる、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション後の平均蛍光強度を示す例示的なグラフを示す。
【図1C】様々な修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡによる、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション後の持続性を示す例示的なグラフを示す。
【図2A】様々な修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡによる、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション後のマクロファージ生存率を示す例示的なグラフを示す。
【図2B】様々な修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡによる、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション後のＣＡＲ発現を示す例示的なグラフを示す。
【図2C】様々な修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡによる、エレクトロポレーションまたはトランスフェクション後のＣＡＲ発現を示す例示的なグラフを示す。
【図3A】マクロファージ機能に対するＣＡＲ ｍＲＮＡ修飾の効果を示す例示的なグラフを示す。マクロファージにＣＡＲｍ ＲＮＡをエレクトロポレーションした２日後の腫瘍増殖曲線を示す。
【図3B】マクロファージ機能に対するＣＡＲ ｍＲＮＡ修飾の効果を示す例示的なグラフを示す。４：１のエフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率で、がん細胞をＣＡＲマクロファージと共培養した場合の腫瘍増殖曲線を示す。
【図3C】マクロファージ機能に対するＣＡＲ ｍＲＮＡ修飾の効果を示す例示的なグラフを示す。２：１のエフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率で、がん細胞をＣＡＲマクロファージと共培養した場合の腫瘍増殖曲線を示す。
【図3D】マクロファージ機能に対するＣＡＲ ｍＲＮＡ修飾の効果を示す例示的なグラフを示す。１：１のエフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率で、がん細胞をＣＡＲマクロファージと共培養した場合の腫瘍増殖曲線を示す。
【図4A】サイトカインによる処理後のＣＡＲマクロファージ生存率を示す例示的なグラフを示す。
【図4B】サイトカインによる処理後の表面マーカー平均蛍光強度を示す。
【図4C】サイトカインによる処理後のＣＡＲマクロファージ生存率を示す例示的なグラフを示す。
【図4D】サイトカインによる処理後の表面マーカー平均蛍光強度を示す。
【図4E】サイトカインによる処理後の表面マーカー平均蛍光強度を示す。
【図4F】サイトカインによる処理後の表面マーカー平均蛍光強度を示す。
【図5A】様々な修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、インターフェロンサイトカインで処理した後の、マクロファージ生存率を示す例示的なグラフを示す。
【図5B】様々な修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、インターフェロンサイトカインで処理した後の、ＣＡＲ発現を示す例示的なグラフを示す。
【図5C】様々な修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、インターフェロンサイトカインで処理した後の、平均蛍光強度を示す例示的なグラフを示す。
【図6】インターフェロンサイトカインで処理されたマクロファージにおけるＣＡＲ発現の持続性を示す例示的なグラフを示す。
【図7A】ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、様々なＩＦＮ－β濃度で処理した後の、ＣＡＲマクロファージ生存率、ＣＡＲ発現及び平均蛍光強度を示す例示的なグラフを示す。
【図7B】ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、様々なＩＦＮ－β濃度で処理した後の、Ｍ１マーカーの誘導を示す例示的なグラフを示す。
【図8A】ＣＡＲ ｍＲＮＡによるエレクトロポレーション及びＩＦＮ－βによる処理の２日後のＣＡＲマクロファージＭ２及びＭ１マーカー平均蛍光強度を示す例示的なグラフを示す。
【図8B】ＣＡＲ ｍＲＮＡによるエレクトロポレーション及びＩＦＮ－βによる処理の７日後のＣＡＲマクロファージＭ２及びＭ１マーカー平均蛍光強度を示す例示的なグラフを示す。
【図9A】ＣＡＲマクロファージの抗腫瘍機能を示す例示的なグラフを示す。種々の濃度のＩＦＮ－βによる感作を伴うかまたは伴わない場合で、ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージの結果を示す。
【図9B】ＣＡＲマクロファージの抗腫瘍機能を示す例示的なグラフを示す。様々な修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、ＩＦＮ－βで処理したマクロファージの結果を示す。
【図9C】ＣＡＲマクロファージの抗腫瘍機能を示す例示的なグラフを示す。ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、インターフェロンサイトカインで処理したマクロファージの結果を示す。
【図10】サイトカイン分泌に対するインターフェロンによるＣＡＲマクロファージの処理の効果を示す例示的なグラフを示す。
【図11A】マクロファージにおけるＣＡＲ ｍＲＮＡの持続性及びＣＡＲマクロファージ機能の持続時間に対するインターフェロンによる処理の効果を示す例示的なグラフを示す。インターフェロンサイトカインで処理されたＣＡＲマクロファージにおける生存率及びＣＡＲ発現の試験からの結果を示す。
【図11B】マクロファージにおけるＣＡＲ ｍＲＮＡの持続性及びＣＡＲマクロファージ機能の持続時間に対するインターフェロンによる処理の効果を示す例示的なグラフを示す。ＣＡＲ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、インターフェロンサイトカインで処理したマクロファージで培養したがん細胞からの腫瘍増殖の結果を示す。
【図11C】マクロファージにおけるＣＡＲ ｍＲＮＡの持続性及びＣＡＲマクロファージ機能の持続時間に対するインターフェロンによる処理の効果を示す例示的なグラフを示す。ＣＡＲ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、インターフェロンサイトカインで処理したマクロファージで培養したがん細胞からの腫瘍増殖の結果を示す。
【図12A】マクロファージ生存率、ＣＡＲ発現、Ｍ１マーカー発現、及びＣＡＲマクロファージ機能性に対するインターフェロンによる処理の効果を示す例示的なグラフを示す。ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、インターフェロンで処理されたマクロファージの生存率、ＣＡＲ発現及びＭ１マーカー発現を示す。
【図12B】マクロファージ生存率、ＣＡＲ発現、Ｍ１マーカー発現、及びＣＡＲマクロファージ機能性に対するインターフェロンによる処理の効果を示す例示的なグラフを示す。ＣＡＲ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、インターフェロンサイトカインで処理したマクロファージで培養したがん細胞からの腫瘍殺傷の結果を示す。
【図12C】マクロファージ生存率、ＣＡＲ発現、Ｍ１マーカー発現、及びＣＡＲマクロファージ機能性に対するインターフェロンによる処理の効果を示す例示的なグラフを示す。ＣＡＲ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、インターフェロンサイトカインで処理したマクロファージで培養したがん細胞からの腫瘍殺傷の結果を示す。
【図13】トランスフェクトされたマクロファージに対するＩＦＮ－γの効果を示す例示的なグラフを示す。
【図14A】ＣＡＲマクロファージに対するＲＮａｓｅＬ阻害剤の効果を示す例示的なグラフを示す。ＩＦＮ－γ及びＲＮａｓｅＬ阻害剤スニチニブで処理した後の、トランスフェクトされたマクロファージにおけるｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す。
【図14B】ＣＡＲマクロファージに対するＲＮａｓｅＬ阻害剤の効果を示す例示的なグラフを示す。スニチニブで処理されたＣＡＲマクロファージで培養されたがん細胞の腫瘍増殖曲線を示す。
【図14C】ＣＡＲマクロファージに対するＲＮａｓｅＬ阻害剤の効果を示す例示的なグラフを示す。スニチニブで処理されたＣＡＲマクロファージの腫瘍殺傷活性を示す。
【図15】ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡ及びＲＮａｓｅＬ阻害剤ＡＢＣＥ１をコードするｍＲＮＡを共トランスフェクトしたマクロファージのマクロファージ生存率及びｍＣｈｅｒｒｙ発現を示す例示的なグラフを示す。
【図16】ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ及びＲＮａｓｅＬ阻害剤ＮＳ１をコードするｍＲＮＡを共トランスフェクトしたマクロファージにおけるＣＡＲ発現を示す例示的なグラフを示す。
【図17】ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ及びＲＮａｓｅＬ阻害剤ＡＢＣＥ１またはＲＮａｓｅＬ阻害剤ＮＳ１のいずれかをコードするｍＲＮＡを共トランスフェクトしたマクロファージにおけるＣＡＲ ｍＲＮＡの安定性を示す例示的なグラフを示す。
【図18A】マクロファージ及びＣＡＲマクロファージとＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とのインキュベーション後の腫瘍殺傷能力を示すグラフである。
【図18B】マクロファージ及びＣＡＲマクロファージとＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）とのインキュベーション後のＭ１及びＭ２マーカーの発現誘導を示すグラフである。
【図19A】マクロファージ及びＣＡＲマクロファージと４－１ＢＢとのインキュベーション後の腫瘍殺傷能力を示すグラフである。
【図19B】マクロファージ及びＣＡＲマクロファージと４－１ＢＢとのインキュベーション後のＭ１及びＭ２マーカーの発現誘導を示すグラフである。
【図20A】マクロファージ及びＣＡＲマクロファージと４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）とのインキュベーション後の腫瘍殺傷能力を示すグラフである。
【図20B】マクロファージ及びＣＡＲマクロファージと４－１ＢＢリガンド（４－１ＢＢＬ）とのインキュベーション後のＭ１及びＭ２マーカーの発現誘導を示すグラフである。
【図21】ＣＡＲ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたヒト単球におけるＣＡＲ発現を示す例示的なグラフを示す。
【図22】異種移植固形腫瘍マウスモデルにおいて、ＩＦＮ－β感作がある場合とない場合における、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを介して生成されたＣＡＲマクロファージの有効性を示す例示的なグラフを示す。
【図23】同系固形腫瘍マウスモデルにおいて、ＩＦＮ－β感作がある場合とない場合における、ｍＲＮＡエレクトロポレーションを介して生成されたＣＡＲマクロファージの有効性を示す例示的なグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
定義
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語は、最初に以下に定義される。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、本明細書全体に記載される。本発明の背景を説明し、その実践に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書で参照される刊行物及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語は、最初に以下に定義される。以下の用語及び他の用語の追加の定義は、本明細書全体に記載される。本発明の背景を説明し、その実践に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書で参照される刊行物及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0019】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すように使用している。例として、「１つの要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【0020】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、記載された基準値に類似した値を表す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または特に文脈から明らかでない限り、記載された基準値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に収まる値の範囲を指す（ただし、そのような数値が、取り得る値の１００％を超える場合を除く）。
【0021】
活性化：本明細書で使用される場合、「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激された、またはそのエフェクター機能を発揮するために刺激された、細胞、例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生、食作用、細胞シグナル伝達、標的細胞殺傷、及び／または抗原プロセシング及び提示にも関連している可能性がある。
【0022】
活性化単球／マクロファージ／樹状細胞：本明細書で使用される場合、「活性化単球／マクロファージ／樹状細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているか、またはエフェクター機能を発揮している単球／マクロファージ／樹状細胞を指す。「活性化単球／マクロファージ／樹状細胞」という用語は、とりわけ、エフェクター機能を実行している細胞、または、食作用、サイトカイン分泌、増殖、遺伝子発現の変化、代謝の変化、及びその他の機能を含む、休止状態では見られない何らかの活性を発揮している細胞を指す。
【0023】
薬剤：本明細書で使用される場合、「薬剤」（または「生物学的薬剤」もしくは「治療剤」）という用語は、本明細書に記載の修飾細胞によって発現、放出、分泌、または標的に送達され得る分子を指す。薬剤には、限定されないが、核酸、抗生物質、抗炎症剤、抗体またはその断片、抗体剤またはその断片、成長因子、サイトカイン、酵素、タンパク質（例えば、ＲＮＡｓｅ阻害剤）、ペプチド、融合タンパク質、合成分子、有機分子（例えば、低分子）、炭水化物、脂質、ホルモン、ミクロソーム、その誘導体または変異体、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。薬剤は、標的または標的細胞上に存在する受容体、抗原決定基、または他の結合部位などの任意の細胞部分に結合することができる。薬剤は細胞内に拡散または輸送され、細胞内で作用することがある。
【0024】
抗体：本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、特定の標的抗原への特異的結合をもたらすのに十分であるカノニカルな免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当技術分野において知られているように、天然に産生されるようなインタクト抗体は、互いに会合して「Ｙ字型」構造と一般的に称されるものとなる、２個の同一の重鎖ポリペプチド（各約５０ｋＤ）、及び２個の同一の軽鎖ポリペプチド（各約２５ｋＤ）から構成されている、約１５０ｋＤの四量体薬剤である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）から構成されている。すなわち、アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）の後に、３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙの基部の先端に位置する）が続いている。「スイッチ」として知られている、短い領域は、重鎖可変領域及び定常領域を接続する。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残りに接続する。このヒンジ領域中の２箇所のジスルフィド結合は、インタクト抗体中で２個の重鎖ポリペプチドを互いに接合する。各軽鎖は２つのドメインから構成されている。すなわち、アミノ末端可変（ＶＬ）ドメインの後にカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインが続き、これらは、別の「スイッチ」によって互いから分離している。インタクト抗体四量体は、２つの重鎖－軽鎖二量体から構成されており、これらの二量体において、重鎖及び軽鎖が１つのジスルフィド結合によって互いに結合し、２つの他のジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに接続することにより、二量体同士が接続され、四量体が形成される。また、天然に産生された抗体は、典型的にはＣＨ２ドメインでグリコシル化されている。自然抗体の各ドメインは、２つのベータシート（例えば、３本鎖、４本鎖、または５本鎖のシート）同士がまとまって固まった逆平行ベータバレルになることから形成された「免疫グロブリンフォールド」によって特徴付けられる構造を有する。各可変ドメインは、「相補性決定領域」として知られる３つの超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び４つの若干不変な「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）を含む。自然抗体がフォールドするとき、ＦＲ領域がベータシートを形成してドメインの構造フレームワークとなり、重鎖と軽鎖の両方のＣＤＲループ領域が三次元空間で結合する結果、Ｙ構造の先端に位置する１つの超可変抗原結合部位を作出する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に結合し、例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞などのエフェクター細胞の受容体にも結合する。Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／または他の結合特性は、グリコシル化または他の修飾を介して調節することができる。いくつかの実施形態では、（例えば、ＣＡＲの成分として）本発明に従い産生及び／または利用される抗体は、グリコシル化されたＦｃドメイン、例えば修飾または操作されたグリコシル化を伴うＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、自然抗体中に見出されるものとして、十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む、いずれかのポリペプチド、またはポリペプチドの複合体は、このようなポリペプチドが自然に産生される（例えば、抗原に反応する動物によって生成される）か、遺伝子組換え工学、化学合成、または他の人工システムもしくは方法論によって産生されるかどうかにかかわらず、「抗体」と称される、及び／または「抗体」として使用されることが可能である。いくつかの実施形態では、抗体はポリクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、霊長類抗体、またはヒト抗体に特徴的な定常領域配列を有する。いくつかの実施形態では、抗体配列要素は、当技術分野で公知であるように、ヒト化されたもの、霊長類化されたもの、キメラなどである。さらに、本明細書で使用される「抗体」という用語は、適切な実施形態（別段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り）において、代替的な実施態様において抗体の構造及び機能的特徴を利用するための当技術分野において公知である、または開発されたコンストラクトまたはフォーマットのいずれかを意味し得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従い利用される抗体は、限定するものではないが、インタクトＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体、二重特異性抗体または多特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離されたＣＤＲまたはそれらのセット、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド－Ｆｃ融合物、単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）、ラクダ科抗体、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、一本鎖ダイアボディまたはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、ならびにＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体は、天然に産生された場合には有しているはずの共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合）を欠いている場合がある。いくつかの実施形態では、抗体は、共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療的な部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコールなど］を含むことができる。
【0025】
抗体剤：本明細書で使用される場合、「抗体剤」という用語は、特定の抗原に特異的に結合する薬剤を指す。いくつかの実施形態では、用語は、特異的結合を付与するのに十分な免疫グロブリン構造的要素を含む任意のポリペプチドまたはポリペプチド複合体を包含する。例示的な抗体剤には、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体剤は、マウス、ウサギ、霊長類、またはヒト抗体に特徴的な１つ以上の定常領域配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体剤は、当技術分野で公知であるように、ヒト化されたもの、霊長類化されたもの、キメラなどである１つ以上の抗体配列要素を含むことができる。多くの実施形態では、「抗体剤」という用語は、代替的な実施態様において抗体の構造的及び機能的特徴を利用するための、当技術分野で公知のもしくは開発されたコンストラクトまたはフォーマットの１つ以上を指すために使用される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明に従い利用される抗体剤は、限定するものではないが、インタクトＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体、二重特異性抗体または多特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離されたＣＤＲまたはそれらのセット、一本鎖Ｆｖ、ポリペプチド－Ｆｃ融合物、単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲまたはその断片などのサメ単一ドメイン抗体）、ラクダ科抗体、マスク抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰｓ（商標）」）、一本鎖ダイアボディまたはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮｓ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）、ならびにＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体剤は、天然に産生された場合には有しているはずの共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合）を欠いている場合がある。いくつかの実施形態では、抗体剤は、共有結合的修飾（例えば、グリカンの結合、ペイロード［例えば、検出可能な部分、治療的な部分、触媒部分など］、または他のペンダント基［例えば、ポリエチレングリコールなど］を含むことができる。多くの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者に認識された１つ以上の構造的要素を含むポリペプチドであるか、アミノ酸配列が相補性決定領域（ＣＤＲ）として当業者に認識された１つ以上の構造的要素を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が参照抗体で見られるものに実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドであるか、またはアミノ酸配列が参照抗体で見られるものに実質的に同一である少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ及び／または少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ）を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、配列が同一であるか、または参照ＣＤＲと比較した場合１～５のアミノ酸置換を含むかのいずれかであるという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、参照ＣＤＲとの少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、参照ＣＤＲとの少なくとも９６％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を示すという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合欠失、付加、または置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲのものと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の１～５のアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合欠失、付加、または置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の少なくとも１つのアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲのものと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、含まれたＣＤＲは、含まれたＣＤＲ内の１～５のアミノ酸が参照ＣＤＲと比較した場合欠失、付加、または置換されるが、含まれたＣＤＲが参照ＣＤＲと他の点では同一であるアミノ酸配列を有するという点で、参照ＣＤＲに実質的に同一である。いくつかの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドであるか、またはアミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン結合ドメインに対して相同であるか、または大部分は相同である結合ドメインを有するポリペプチドタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体剤は、アミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドではない、及び／またはアミノ酸配列が免疫グロブリン可変ドメインとして当業者に認識された構造的要素を含むポリペプチドを含まない。いくつかの実施形態では、抗体剤は、免疫グロブリン構造的要素を含まない分子または組成物（例えば、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む受容体または他の天然に存在する分子）であり得るか、またはそれらを含み得る。
【0026】
抗体断片：本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクト抗体の一部を指し、インタクト抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体、及びそれらのヒト及びヒト化バージョンが挙げられる。
【0027】
抗体重鎖：本明細書で使用される場合、「抗体重鎖」という用語は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。
【0028】
抗体軽鎖：本明細書で使用される場合、「抗体軽鎖」という用語は、天然に存在する立体配座にある全抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。
【0029】
合成抗体：本明細書で使用される場合、「合成抗体」という用語は、例えば、本明細書に記載のバクテリオファージによって発現する抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体、及びそのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、または抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ここでＤＮＡまたはアミノ酸配列は、利用可能かつ当技術分野で周知である合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られる。
【0030】
抗原：本明細書で使用される場合、「抗原」または「Ａｇ」という用語は、免疫応答を誘発することができる分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、特異的免疫学的適格細胞の活性化のいずれか、またはその両方が含まれる場合がある。当業者は、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含む任意の高分子が抗原として機能することができることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来することができる。当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書で使用される用語「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要がないことを理解するであろう。本発明は、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むが、これらに限定されないこと、及びこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するために種々の組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要がまったくないことを理解するであろう。抗原を、合成して生成することができるか、または生体試料に由来することができることは容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または体液が含まれるが、これらに限定されない。
【0031】
抗腫瘍効果：本明細書で使用される場合、「抗腫瘍効果」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、平均余命の延伸、またはがん状態に関連する種々の生理学的症状の改善によって明らかになりうる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」はまた、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体の、最初の腫瘍の発生の予防における能力によっても明らかにすることができる。
【0032】
自己由来：本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、後に個体に再導入される同じ個体に由来する任意の材料を指す。
【0033】
同種異系：本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、同じ種の異なる動物に由来する任意の物質（例えば、細胞の集団）を指す。
【0034】
異種：本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、異なる種の動物に由来する任意の物質（例えば、細胞の集団）を指す。
【0035】
がん：本明細書で使用される「がん」という用語は、異常細胞の急速かつ制御不能な増殖を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的に、または血流やリンパ系を介して体の他の部分に広がる可能性がある。種々のがんの例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、がんは、甲状腺髄様癌である。
【0036】
保存的配列修飾：本明細書で使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響または変化を与えないアミノ酸修飾を指す。そのような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、部位特異的変異導入及びＰＣＲ媒介変異導入などの当技術分野で知られている標準的な技術によって、種々の実施形態に適合する抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、変化した抗体を、本明細書に記載の機能アッセイを使用して抗原に結合する能力について試験することができる。
【0037】
共刺激リガンド：本明細書で使用される場合、「共刺激リガンド」という用語は、単球／マクロファージ／樹状細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、増殖、活性化、分化などを含むが、これらに限定されない、単球／マクロファージ／樹状細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を指す。共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７－Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含めることができるが、これらに限定されるものではない。共刺激リガンドはまた、とりわけ、単球／マクロファージ／樹状細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体、例として、限定されるものではないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドも包含する。
【0038】
細胞毒性の：本明細書で使用される場合、「細胞毒性の」または「細胞毒性」という用語は、細胞を殺傷するまたは損傷することを指す。一実施形態では、代謝的に増強された細胞の細胞傷害性が改善され、例えば、マクロファージの細胞溶解活性が増加する。
【0039】
有効量：本明細書で使用される場合、「有効量」及び「治療有効量」は交換可能であり、特定の生物学的結果を達成するのに有効であるか、または製造、治療もしくは予防上の利点を提供する、本明細書において記載される化合物、製剤、材料もしくは組成物の量を指す。このような結果には、当技術分野で好適な任意の手段によって判定される抗腫瘍活性が含まれるが、これらに限定されない。
【0040】
エフェクター機能：本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」または「エフェクター活性」は、免疫細胞の刺激に応答して免疫細胞によって実行される特異的活性を指す。例えば、マクロファージのエフェクター機能は、食作用によって、細胞片、異物、微生物、がん細胞、及びその他の不健康な細胞を飲み込んで消化するものである。
【0041】
コードする：本明細書で使用される場合、「コードする」とは、定義されたヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖もともに、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると称することができる。
【0042】
内因性：本明細書で使用される場合、「内因性」とは、特定の生物、細胞、組織もしくは系の内部に由来するか、またはそれらの内部で産生される任意の物質を指す。
【0043】
外因性：本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、特定の生物、細胞、組織もしくは系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
【0044】
拡大：本明細書で使用される場合、「拡大」という用語は、細胞、例えば、単球、マクロファージ、及び／または樹状細胞の数の増加におけるように、数が増加することを指す。一実施形態では、エクスビボで拡大した単球、マクロファージ、または樹状細胞は、培養物中に最初に存在している数と比較して数が増加する。別の実施形態では、エクスビボで拡大した単球、マクロファージ、または樹状細胞は、培養物中の他の細胞型と比較して数が増加する。いくつかの実施形態では、拡大はインビボで起こり得る。本明細書で使用される「エクスビボ」という用語は、生きている生物（例えば、ヒト）から取り出され、生物の外側で（例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクター内で）増殖された細胞を指す。
【0045】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」という用語は、核酸配列からの任意の遺伝子産物の生成を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は転写物であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列の発現は、以下のうちの１つ以上を含む：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端形成による）、（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳、及び／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【0046】
発現ベクター：本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、発現するヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、コスミド、プラスミド（例えば、裸のものまたはリポソーム中に含まれるもの）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）など、当技術分野で公知のすべてのベクターが含まれる。
【0047】
断片：本明細書で使用される場合、「断片」または「部分」という用語は、全体のうちの別個の部分を含むが、構造全体に見出される１つ以上の部分を欠いている構造を指す。いくつかの実施形態では、断片は、そのような別個の部分からなる。いくつかの実施形態では、断片は、全体に見出される特徴的な構造要素または部分からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体に見出される少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００もしくはそれ以上のモノマー単位（例えば、核酸）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド断片は、ヌクレオチド全体に見出されるモノマー単位（例えば、残基）の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を含むか、またはそれらからなる。物質または実体の全体は、いくつかの実施形態では、全体の「親」と称される場合がある。
【0048】
相同性：本明細書で使用される場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合に互いに「相同」であると考えられる。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％類似している（例えば、関連する化学的性質を持つ残基を対応する位置に含む）場合に互いに「相同」であると考えられる。当業者に理解されるように、相同性の程度を決定するために配列の比較を可能にする様々なアルゴリズムが利用可能であり、これは、例えば、異なる配列でどの残基が互いに「対応する」かを検討する際に、ある配列で指定された長さの、別の配列に対するギャップの許容によることを含む。２つの核酸配列間の相同性パーセントの計算は、例えば、最適な比較目的のための２つの配列を整列させることにより実行され得る（例えば、最適なアラインメントのための第１及び第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のためには非対応配列を無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のための整列した配列の長さは、参照配列の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次に、対応するヌクレオチド位置でのヌクレオチドが比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同じヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一であり、第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と類似のヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で類似している。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列に共通する同一及び類似の位置の数の関数である。
【0049】
同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、特に２つのアミノ酸分子間、例えば２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つのアミノ酸配列が同じ位置に同じ残基を有する場合、例えば、２つのポリペプチド分子のそれぞれの位置がアルギニンによって占められている場合、それらはその位置で同一である。２つのアミノ酸配列が、アラインメントにおいて同じ位置に同じ残基を有する同一性または程度は、多くの場合パーセンテージとして表される。２つのアミノ酸配列間の同一性は、一致している位置または同一である位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、１０アミノ酸長のポリマー中の５つの位置）が同一である場合、２つの配列は５０％同一であり、位置の９０％（例えば、１０のうち９つ）が一致しているかまたは同一である場合、２つのアミノ酸配列は９０％同一である。
【0050】
実質的同一性：本明細書で使用される場合、「実質的同一性」という用語は、アミノ酸配列または核酸配列間の比較を指す。当業者には理解されるように、２つの配列は、それらが対応する位置に同一の残基を含有する場合、一般に「実質的に同一」であると考えられる。当技術分野において周知であるように、アミノ酸配列または核酸配列は、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰ、ギャップＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴなどの市販のコンピュータープログラムで利用可能なものを含む様々なアルゴリズムのいずれかを使用して比較することができる。いくつかの実施形態では、対応する残基の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が、関連する一続きの残基にわたって同一である場合、２つの配列は実質的に同一であると考えられる。いくつかの実施形態では、関連する一続きは完全な配列である。いくつかの実施形態では、関連する一続きは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００またはそれ以上の残基である。ＣＤＲとの関係において、「実質的な同一性」への言及は、通常、参照ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。
【0051】
免疫細胞：本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、免疫応答、例えば免疫応答の促進に関与する細胞を指す。免疫細胞の例には、マクロファージ、単球、樹状細胞、好中球、好酸球、マスト細胞、血小板、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球、またはＢ－リンパ球が含まれるが、これらに限定されない。免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の供給源は、対象から得ることができる。
【0052】
免疫応答：本明細書で使用される場合、「免疫応答」という用語は、リンパ球が抗原分子を異物と同定し、抗体の形成を誘導し、及び／またはリンパ球を活性化して抗原を除去する場合に起こる抗原に対する細胞応答及び／または全身応答を指す。
【0053】
免疫グロブリン：本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン」または「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスを指す。Ｂ細胞によって発現する抗体は、ＢＣＲ（Ｂ細胞受容体）または抗原受容体と称されることがある。このクラスのタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物、気道及び尿生殖路の粘液分泌物などの体分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの対照の一次免疫応答で産生される主要な免疫グロブリンである。これは、凝集、補体結合、及びその他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌及びウイルスに対する防御に重要である。ＩｇＤは抗体機能が判明していない免疫グロブリンであるが、抗原受容体として機能している場合がある。ＩｇＥは、アレルゲンに対する曝露時にマスト細胞及び好塩基球からのメディエーターの放出を引き起こすことによって即時型過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【0054】
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然状態から修飾または除去されたものを指す。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されて」いる。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば宿主細胞などの非天然環境で存在することができる。
【0055】
修飾：本明細書で使用される場合、「修飾」という用語は、本発明の分子または細胞の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、及び機能的など、多くの方法で修飾することができる。細胞は、核酸の導入によって修飾することができる。
【0056】
調節する：本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、治療もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベル及び／または性質と比較して、及び／または他の点では同一であるが治療を受けていない対象における応答のレベル及び／または性質と比較して、対象における応答のレベルの検出可能な増加もしくは低下、及び／または応答の性質の変化を媒介することを指す。この用語は対象、好ましくはヒトにおいて、天然のシグナルもしくは応答を撹乱させ、及び／またはそれに影響を与え、それにより有益な治療応答を媒介することを包含する。
【0057】
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、少なくとも３つのヌクレオチドのポリマーを指す。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、一本鎖部分と二本鎖部分の両方を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のホスホジエステル結合を含む骨格を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合及び非ホスホジエステル結合の両方を含む骨格を含む。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のホスホロチオエートまたは５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合及び／または、例えば「ペプチド核酸」におけるような、１つ以上のペプチド結合を含む骨格を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の、またはすべての天然残基（例えば、アデニン、シトシン、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、グアニン、チミン、ウラシル）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の、またはすべての非天然残基を含む。いくつかの実施形態では、非天然残基は、ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、及びそれらの組み合わせ）を含む。いくつかの実施形態では、非天然残基は、天然残基のものと比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、酵素合成（例えば、相補的鋳型に基づく重合、例えば、インビボまたはインビトロでの、組換え細胞もしくは系における複製、または化学合成による）によって調製され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の残基長である。
【0058】
作動可能に連結した：本明細書で使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、例えば調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を意味し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係へと配置される場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、同じリーディングフレームにおいて、隣接しており、必要な場合、２つのタンパク質コード領域を繋げるためのものである。
【0059】
過剰発現腫瘍抗原：本明細書で使用される場合、「過剰発現」腫瘍抗原または腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織または臓器の内部にある固形腫瘍のような疾患領域からの細胞における腫瘍抗原の発現が、その組織または臓器からの正常細胞における発現のレベルと比べて異常なレベルであることを指す。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍または血液悪性腫瘍を有する患者は、当技術分野で知られている標準的なアッセイによって判定することができる。
【0060】
ポリヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖を指す。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される場合、核酸及びポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、加水分解されて単量体の「ヌクレオチド」になり得るという一般的な知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、非限定的に、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術及びＰＣＲ（商標）などを用いた組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含む、当技術分野において利用可能な任意の手段により、ならびに合成手段により得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0061】
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、典型的にはペプチド結合によって連結される残基（例えば、アミノ酸）の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人間の手の作用によって設計及び／または生成されるように操作されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみまたは非天然アミノ酸のみを含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、または両方を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはそれらの任意の組み合わせで、１つ以上のペンダント基または他の修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸側鎖の修飾またはそれへの結合を含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなペンダント基または修飾は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、ペグ化など、例えばそれらの組み合わせ、からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状であってもよく、及び／または環状部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状ではなく、及び／または環状部分を含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは直鎖状である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ステープルポリペプチドであるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、参照ポリペプチド、活性、または構造の名称に付加され得、そのような場合、これは、関連する活性または構造を共有し、したがってポリペプチドの同じクラスまたはファミリーのメンバーであると考えることができるポリペプチドを指すために本明細書で使用される。そのようなクラスごとに、アミノ酸配列及び／または機能が知られているクラス内の例示的なポリペプチドを本明細書が提供し、及び／または当業者はそれに気付くであろう。いくつかの実施形態では、そのような例示的なポリペプチドは、ポリペプチドのクラスまたはファミリーの参照ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、クラスの参照ポリペプチドと、いくつかの実施形態では、クラス内のすべてのポリペプチドと）、有意な配列相同性または同一性を示し、共通の配列モチーフ（例えば、特徴的な配列要素）を共有し、及び／または共通の活性を共有する（いくつかの実施形態では、同等のレベルで、または指定範囲内で）。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０～４０％であり、多くの場合、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を超える参照ポリペプチドとの全体的な程度の配列相同性または同一性を示し、及び／または、多くの場合９０％、またはさらに９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える非常に高い配列同一性を示す少なくとも１つの領域（例えば、いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素であるか、またはそれを含み得る保存領域）を含む。このような保存領域は、通常、少なくとも３～４個、多くの場合最大２０個以上のアミノ酸を包含し、いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ以上の連続アミノ酸の少なくとも１つの一続きを包含する。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含むか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、複数の断片を含むか、または複数の断片からなり得、そのそれぞれは、目的のポリペプチドに見られるものとは互いに対し異なる空間配置で、同じ親ポリペプチドに見られ（例えば、親に直接連結された断片は、目的のポリペプチドでは空間的に分離されているか、またはその逆である場合があり、及び／または断片は、親とは異なる順序で目的のポリペプチドに存在する場合がある）、したがって、目的のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体である。
【0062】
タンパク質：本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに連結された一連の少なくとも２つのアミノ酸）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含むことができる（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであり得る）、及び／または別途加工あるいは修飾され得る。当業者は、「タンパク質」が、細胞によって産生される完全なポリペプチド鎖（シグナル配列有りまたは無し）であっても、またはその特徴的部分であってもよいことを理解するであろう。当業者は、タンパク質が、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって連結されるか、または他の手段によって会合される２つ以上のポリペプチド鎖を含み得る場合があることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、または両方を含有することができ、かつ当業者に既知の種々のアミノ酸修飾またはアナログのいずれも含有することができる。有用な修飾は、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸、及びそれらの組み合わせを含むことができる。「ペプチド」という用語は、一般的に、約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満、または１０アミノ酸未満の長さを有するポリペプチドを指すように使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、抗体断片、その生物学的に活性な部分、及び／またはその特徴的部分である。
【0063】
シグナル伝達経路：本明細書で使用される場合、「シグナル伝達経路」という用語は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。「細胞表面受容体」という語句には、シグナルを受け取り、細胞の原形質膜を介してシグナルを伝達することができる分子及び分子の複合体が含まれる。
【0064】
単鎖抗体：本明細書で使用される場合、「単鎖抗体」という用語は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖断片が、操作されたアミノ酸の長さを介してＦｖ領域に連結される組換えＤＮＡ技術によって形成された抗体を指す。単鎖抗体を生成する種々の方法が知られており、これには、米国特許第４，６９４，７７８号、Ｂｉｒｄ （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４４２、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４５４、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８－１０４１に記載されているものが含まれる。
【0065】
特異的に結合する：本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、抗体剤などの抗原結合ドメインに関して、特異的抗原を認識するが、試料内の他の分子を実質的には認識しないまたはそれに結合しない抗原結合ドメインまたは抗体剤を指す。例えば、ある種由来の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは抗体剤はまた、１つ以上の種由来の抗原に結合し得る。しかし、そのような種間反応性自体は、抗原結合ドメインまたは抗体剤の特異的なものとしての分類を変更するものではない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインまたは抗体剤は、抗原の異なる対立遺伝子型にも結合し得る。しかし、そのような交差反応性自体は、抗原結合ドメインまたは抗体剤の特異的なものとしての分類を変更するものではない。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語を、抗原結合ドメインまたは抗体剤、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関連して使用することができ、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味してもよい。例えば、抗原結合ドメインまたは抗体剤は、タンパク質全体ではなく特定のタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗原結合ドメインまたは抗体剤がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識化「Ａ」及び抗原結合ドメインまたは抗体剤を含む反応において、エピトープＡ（または遊離した非標識化Ａ）を含有する分子の存在によって、抗体に結合した標識化Ａの量が減少する。
【0066】
刺激：本明細書で使用される場合、「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＦｃＲ複合体、ＴＬＲ複合体、またはＴＣＲ／ＣＤ３複合体）が、例えば、その同族リガンドと結合し、これにより、限定されないが、Ｆｃ受容体機構または合成ＣＡＲを介したシグナル伝達などのシグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。刺激は、ＴＧＦ－ベータのダウンレギュレーション、及び／または細胞骨格構造の再編成など、ある特定の分子の発現の変化を媒介することができる。本明細書で使用される場合、「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合する単球、マクロファージ、または樹状細胞の分子を指す。いくつかの実施形態では、刺激分子は、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）またはＣＤ４０ドメインを含むＦｃＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、刺激分子は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含むＴＬＲ細胞外ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「刺激性リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞など）または腫瘍細胞上に存在する場合、単球、マクロファージ、または樹状細胞上の同族結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と呼ばれる）と特異的に結合し、それによって、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むがこれらに限定されない免疫細胞による応答を媒介するリガンドを指す。刺激性リガンドは当技術分野で周知であり、とりわけ、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンド、抗ｔｏｌｌ様受容体抗体、アゴニスト、及び、単球／マクロファージ受容体に対する抗体を包含する。加えて、インターフェロン－ガンマなどのサイトカインは、マクロファージに対する強力な刺激物質である。
【0067】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、霊長類、実験動物、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、またはイヌ）を指す。いくつかの実施形態では、ヒト対象は、成人、青年、または小児対象である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態、例えば、本明細書で提供されるように治療することができる疾患、障害または状態、例えば、本明細書に列挙されるがんまたは腫瘍に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態に罹患しやすく、いくつかの実施形態では、罹患しやすい対象は、疾患、障害、または状態を発症する素因がある、及び／または（基準対象または基準集団で観察される平均リスクと比較して）リスクの増加を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態の１つ以上の症状を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または状態の特定の症状（例えば、疾患の臨床症状）または特徴を示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態のいずれの症状または特徴も示さない。いくつかの実施形態では、対象は患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または療法が施される及び／または施された個体である。
【0068】
実質的に精製された：本明細書で使用される場合、「実質的に精製された」という用語は、例えば細胞に適用される場合、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞はまた、天然に存在する状態で通常関連する他の細胞型から分離された細胞を指す。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団は、均質な細胞集団を指す。他の例では、この用語は、天然状態で天然に会合している細胞から分離された細胞を単に指す。いくつかの実施形態では、細胞をインビトロで培養する。他の実施形態では、細胞はインビトロで培養されない。
【0069】
標的：本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、提供される方法、システム、及び／または組成物の対象である体内の細胞、組織、器官、または部位、例えば、治療を必要とするか、または、例えば抗体（もしくはその断片）もしくはＣＡＲによって優先的に結合される体内の細胞、組織、器官、または部位を指す。
【0070】
標的部位：本明細書で使用される場合、「標的部位」または「標的配列」という用語は、結合が起こるのに十分な条件下で結合分子が特異的に結合し得る核酸の部分を定義するゲノム核酸配列を指す。
【0071】
Ｔ細胞受容体：本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。ＴＣＲは、主要組織適合性複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担う。ＴＣＲは、アルファ（α）及びベータ（β）鎖のヘテロ二量体から構成されるが、一部の細胞ではＴＣＲはガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖から構成される。ＴＣＲは、構造的に類似しているが、異なる解剖学的位置及び機能を有するアルファ／ベータ及びガンマ／デルタ形態で存在しうる。各鎖は、可変ドメインと定常ドメインの２つの細胞外ドメインで構成されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲを含む任意の細胞、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びγδＴ細胞を含む任意の細胞上で修飾することができる。
【0072】
治療的：本明細書で使用される場合、「治療的」という用語は、治療及び／または予防を指す。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
【0073】
トランスフェクトされた：本明細書で使用される場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換、または形質導入した細胞である。この細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。
【0074】
治療する：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状または特徴の部分的または完全な緩和、改善、発症の遅延、阻害、予防、緩和、及び／または発生率及び／または重症度の低下を指す。いくつかの実施形態では、治療は、疾患、障害、及び／または状態の徴候または特徴を示さない対象に施すことができる（例えば、予防的であり得る）。いくつかの実施形態では、治療は、例えば、疾患、障害、及び／または状態に関連する病態を発症するリスクを減少させる目的で、疾患、障害、及び／または状態の初期または軽度の徴候もしくは特徴のみを示す対象に、施すことができる。いくつかの実施形態では、治療は、疾患、障害、または状態の確立された、重度の、及び／または後期の徴候を示す対象に施すことができる。いくつかの実施形態では、治療は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に施すこと、または免疫細胞を、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターと接触させることを含み得る。
【0075】
腫瘍：本明細書で使用される場合、「腫瘍」という用語は、細胞または組織の異常増殖を指す。いくつかの実施形態では、腫瘍は、前がん性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性、及び／または非転移性の細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は、がんに関連しているか、またはがんの兆候である。いくつかの実施形態では、腫瘍は分散性腫瘍または液状腫瘍であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍であり得る。
【0076】
ベクター：本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物を指す。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが当技術分野において公知である。したがって、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド性及び非ウイルス性の化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0077】
本開示の全体を通じて、本発明の種々の態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したと考えるべきである。例えば、１から６までなどの範囲の記述は、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６などの、その範囲内の個々の数だけでなく、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどの、具体的に開示された部分範囲を有すると考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0078】
詳細な説明
免疫細胞
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む修飾免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲを含む免疫細胞は、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）を含む。
免疫細胞
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む修飾免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲを含む免疫細胞は、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）を含む。
【0079】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞集団は、単球、マクロファージ、樹状細胞、及び／またはそれらの前駆体を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞の集団は、単球、マクロファージ、もしくは樹状細胞、または細胞株の精製された集団を含む。
【0080】
いくつかの実施形態では、免疫細胞が活性化され、例えば、免疫細胞は、例えば不活性細胞と比較して、サイトカイン産生、ケモカイン産生、食作用、細胞シグナル伝達、標的細胞殺傷、及び／または抗原提示の増加を示す。いくつかの実施形態では、活性化免疫細胞は、例えば、不活性細胞と比較して、遺伝子発現の変化、例えば、炎症誘発性遺伝子（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、またはＩＬ－１のうちの１、２、３、４、５、６、または７つ）発現の誘導を示す。ある特定の実施形態では、活性化免疫細胞は細胞分裂を受けている。いくつかの実施形態では、免疫細胞の標的エフェクター活性は、ＣＤ４７及び／またはＳＩＲＰα活性の阻害によって増強される。ＣＤ４７及び／またはＳＩＲＰα活性は、免疫細胞を抗ＣＤ４７もしくは抗ＳＩＲＰα抗体で処理することによって、または当業者に公知の任意の方法によって阻害することができる。
【0081】
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、対象から得られる（例えば、単離される）。免疫細胞は自己由来であっても、同種異系または万能ドナーから供給されてもよい。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾臓組織、臍帯、腫瘍、及び／または胚性幹細胞（ＥＳＣ）などの人工多能性幹細胞を含む多くの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ分離などの当業者に公知の任意の数の分離技術を使用して、対象から収集された血液の単位から得ることができる。いくつかの実施形態では、対象の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、様々な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））または培養培地）に再懸濁することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、単球）の濃縮は、プラスチック接着を含む。いくつかの実施形態では、濃縮後の免疫細胞（例えば、単球）の分化は、ＧＭ－ＣＳＦによる刺激を含む。いくつかの実施形態では、白血球アフェレーシス組成物（例えば、ロイコパック）などの血球（例えば、単球、リンパ球、血小板、血漿、及び／または赤血球）を含む組成物を、濃縮のために使用する。いくつかの実施形態では、白血球アフェレーシス組成物（例えば、ロイコパック）は、健康なヒトドナー由来の試料を含む。ある特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、単球）のアフェレーシスに続いて、ＧＭ－ＣＳＦによる動員が行われる。ある特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、単球）の選択は、マイクロビーズ（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙデバイス上のＭＡＣＳ（登録商標）ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）を使用するＣＤ１４陽性選択を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞前駆体（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞の前駆体）を、本明細書に記載の組成物及び方法で使用する。免疫細胞前駆体は、インビボまたはエクスビボで免疫細胞に分化させることができる。免疫前駆細胞の非限定的な例には、造血幹細胞、骨髄系共通前駆細胞、骨髄芽球、単芽球、前単球、またはそれらの中間体が含まれる。例えば、人工多能性幹細胞を使用して、単球、マクロファージ、及び／または樹状細胞を生成することができる。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、末梢血、線維芽細胞、皮膚、角化細胞、腎上皮細胞などの正常なヒト組織に由来する場合がある。自己由来、同種異系、または万能ドナーのｉＰＳＣは、骨髄系統（例えば、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの前駆体）に分化する可能性がある。
【0082】
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、末梢血から、例えば、赤血球を溶解し、リンパ球及び赤血球を枯渇させることにより、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離により単離することができる。代替的には、免疫細胞は、臍帯組織から分離することができる。免疫細胞の特定の下位集団は、陽性または陰性選択技術によってさらに分離することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５６、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１９、またはＣＤ２０を含むがこれらに限定されないある特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。いくつかの実施形態では、例えば陰性選択による免疫細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に固有の表面マーカーを指向する抗体の組み合わせを使用して達成することができる。非限定的な例として、細胞選択はまた、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫接着またはフローサイトメトリーを含み得る。
【0083】
陽性または陰性選択による、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の所望の集団の単離中に、免疫細胞の濃度及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）を変化させることができる。細胞とビーズの最大接触面積を確保するために、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を大幅に減少させることが望ましい場合がある。
【0084】
いくつかの実施形態では、投与前に、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）（例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含む）を炎症促進剤で処理する。いくつかの実施形態では、炎症促進剤による処理は、本明細書に記載の免疫細胞の抗腫瘍活性を増加させる。いくつかの実施形態では、炎症促進剤による処理は、本明細書に記載の免疫細胞におけるＭ１表現型を促進する（例えば、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのスイッチ）。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌ）を含むか、またはＣＤ４０アゴニストである。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、４１ＢＢリガンドアゴニスト（例えば、４－１ＢＢ）を含むか、または４１ＢＢリガンドアゴニストである。
【0085】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）（例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含む）を、炎症促進剤と組み合わせて対象に投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）（例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含む）を、炎症促進剤と実質的に同時に、その前に、またはその後に対象に投与する。いくつかの実施形態では、炎症促進剤による投与は、本明細書に記載の免疫細胞の抗腫瘍活性を増加させる。いくつかの実施形態では、炎症促進剤による投与は、本明細書に記載の免疫細胞におけるＭ１表現型を促進する（例えば、Ｍ２表現型からＭ１表現型へのスイッチ）。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＤ４０Ｌ）を含むか、またはＣＤ４０アゴニストである。いくつかの実施形態では、炎症促進剤は、４１ＢＢリガンドアゴニスト（例えば、４－１ＢＢ）を含むか、または４１ＢＢリガンドアゴニストである。
【0086】
マクロファージ
マクロファージは、病原体または腫瘍細胞などの標的細胞の検出、食作用、及び破壊に特化した免疫細胞である。マクロファージは自然免疫系の強力なエフェクターであり、少なくとも３つの異なる抗腫瘍機能が可能である：死細胞、死にかけている細胞、微生物、がん細胞、細胞残屑、またはその他の異物の食作用、腫瘍細胞に対する細胞毒性、及び適応抗腫瘍免疫応答を調整するための腫瘍抗原の提示。
マクロファージは、病原体または腫瘍細胞などの標的細胞の検出、食作用、及び破壊に特化した免疫細胞である。マクロファージは自然免疫系の強力なエフェクターであり、少なくとも３つの異なる抗腫瘍機能が可能である：死細胞、死にかけている細胞、微生物、がん細胞、細胞残屑、またはその他の異物の食作用、腫瘍細胞に対する細胞毒性、及び適応抗腫瘍免疫応答を調整するための腫瘍抗原の提示。
【0087】
蓄積された証拠は、マクロファージが多数のがんの腫瘍微小環境に豊富に存在し、集合的に腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）と呼ばれる多くの表現型を採用することができることを示唆している。腫瘍微小環境の免疫抑制性によって、通常、より多くのＭ２様ＴＡＭがもたらされ、これは、抗腫瘍免疫応答の一般的な抑制にさらに寄与する。しかし、最近の研究では、ＴＡＭは、炎症誘発性シグナルを介して「再プログラム」されることが可能であること、及びＭ２表現型からよりＭ１表現型へのスイッチが生産的抗腫瘍免疫応答と関連していることが確認されている。内因性ＴＡＭを誘導してＭ１型細胞にスイッチを行い、Ｍ２に覆す（ｓｕｂｖｅｒｔｅｄ）ことができないマクロファージを操作することにより、抗腫瘍免疫療法を大幅に向上させ、このことは、この分野における重要な進歩となる。
【0088】
いくつかの実施形態では、マクロファージは、未分化もしくはＭ０マクロファージを含むか、または未分化もしくはＭ０マクロファージである。ある特定の実施形態では、マクロファージは、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ７１、もしくはＣＣＲ５のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つを含むか、または発現する。種々の刺激にさらされると、Ｍ０マクロファージは、マクロファージ表現型マーカー、サイトカイン産生、及び／またはケモカイン分泌によって同定され得るいくつかの異なる集団に分極化するように誘導される。
【0089】
いくつかの実施形態では、マクロファージは、分極化マクロファージを含むか、または分極化マクロファージである。活性化の古典的な条件下では、Ｍ０マクロファージは、ＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＧＭ－ＣＳＦなどの炎症誘発性シグナルにさらされ、Ｍ１マクロファージに分極化する可能性がある。一般に、Ｍ１マクロファージは、Ｔｈ１及びＴｈ１７Ｔ細胞応答などの炎症誘発性免疫応答に関連している。他の刺激にさらされると、マクロファージが多様な「代替的に活性化された」マクロファージの群またはＭ２マクロファージの群に分極化する可能性がある。
【0090】
いくつかの実施形態では、マクロファージは、Ｍ１マクロファージを含むか、またはＭ１マクロファージである。いくつかの実施形態では、マクロファージは、Ｍ１マクロファージの１つ以上のマーカー（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ ＩＩ、ＩＬ－１Ｒ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ｉＮＯＳ、ＳＯＣＳ３、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ６９、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＩＬ１Ｒ、ＩＦＩＴファミリーメンバー、またはＩＳＧファミリーメンバーのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８）を発現する。
【0091】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、比較的高レベルの１つ以上の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、またはＩＬ３３のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２）またはケモカイン（例えば、ＣＣもしくはＣＸＣケモカインの一方または両方）（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のＣＸＣケモカイン、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８のＣＣケモカイン、例えば、ＣＸ３Ｃケモカインのうちの１つ、例えば、Ｃケモカインの１つまたは両方）を分泌する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、免疫応答及び／または炎症を刺激する。いくつかの実施形態では、マクロファージは、Ｍ２マクロファージ（例えば、Ｍ２ａ、Ｍ２ｂ、Ｍ２ｃ、及びＭ２ｄマクロファージ）を含むか、またはＭ２マクロファージである。Ｍ２ａマクロファージは、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、及び／または真菌感染によって誘導される可能性がある。Ｍ２ｂマクロファージは、ＩＬ－１Ｒリガンド、免疫複合体、及び／またはＬＰＳによって誘導される可能性がある。Ｍ２ｃマクロファージは、ＩＬ－１０及び／またはＴＧＦβによって誘導される可能性がある。Ｍ２ｄマクロファージは、ＩＬ－６及び／またはアデノシンによって誘導される可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、対象における免疫応答を減少させる。いくつかの実施形態では、マクロファージは、Ｍ２マクロファージの１つ以上のマーカー（例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、またはＣＤ２０９のうちの１つ、２つ、または３つ）を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、１つ以上の抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０もしくはＴＧＦβの一方または両方）の分泌の増加を示す
【0092】
いくつかの実施形態では、マクロファージは、少なくとも１つのアップレギュレートされたＭ１マーカー及び／または少なくとも１つのダウンレギュレートされたＭ２マーカーを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭ１マーカー（例えば、ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ８３、ＣＤ６９、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＩＬ１Ｒ、ＩＦＩＴファミリーメンバー、及び／またはＩＳＧファミリーメンバー）が、マクロファージでアップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭ２マーカー（例えば、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、及び／またはＣＤ２０９）がマクロファージでダウンレギュレートされる。
【0093】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、食作用の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、腫瘍細胞に対して細胞毒性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、腫瘍抗原提示の増加（例えば、食作用後の提示）及び／または抗原プロセシングの増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、腫瘍殺傷の増加（例えば、食作用、溶解、アポトーシス、または殺腫瘍サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）の産生による）を示す。
【0094】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、好ましい遺伝子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４０、４１ＢＢＬ、ＴＮＦ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１ｂ、及び／またはＣＸＣＬ１２）の発現増加または好ましくない遺伝子（例えば、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＴＧＦβ、ＩＬ１０、及び／またはＩＬ４）の発現減少の一方または両方を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、ＲＯＳの産生の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、代謝の再プログラミングを示す（例えば、インターフェロンシグナル伝達経路、ＴＨ１経路、ＰＴＥＮシグナル伝達、ＰＩ３Ｋシグナル伝達、ＭＴＯＲシグナル伝達、ＴＬＲシグナル伝達、ＣＤ４０シグナル伝達、４１ＢＢシグナル伝達、４１ＢＢＬシグナル伝達、マクロファージ成熟シグナル伝達、樹状細胞成熟シグナル伝達、ＣＤ３ゼータシグナル伝達、ＦｃＲγシグナル伝達、ＣＤ６４シグナル伝達、ＣＤ３２ａシグナル伝達、ＣＤ３２ｃシグナル伝達、ＣＤ１６ａシグナル伝達、ＴＬＲ１シグナル伝達、ＴＬＲ２シグナル伝達、ＴＬＲ３シグナル伝達、ＴＬＲ４シグナル伝達、ＴＬＲ５シグナル伝達、ＴＬＲ６シグナル伝達、ＴＬＲ７シグナル伝達、ＴＬＲ８シグナル伝達、ＴＬＲ９シグナル伝達、ＡＬＫシグナル伝達、ＡＸＬシグナル伝達、ＤＤＲ２シグナル伝達、ＥＧＦＲシグナル伝達、ＥｐｈＡ１シグナル伝達、ＩＮＳＲシグナル伝達、ｃＭＥＴシグナル伝達、ＭＵＳＫシグナル伝達、ＰＤＧＦＲシグナル伝達、ＰＴＫ７シグナル伝達、ＲＥＴシグナル伝達、ＲＯＲ１シグナル伝達、ＲＯＳ１シグナル伝達、ＲＹＫシグナル伝達、ＴＩＥ２シグナル伝達、ＴＲＫシグナル伝達、ＶＥＧＦＲシグナル伝達、ＣＤ４０シグナル伝達、ＣＤ１９シグナル伝達、ＣＤ２０シグナル伝達、４１ＢＢシグナル伝達、ＣＤ２８シグナル伝達、ＯＸ４０シグナル伝達、ＧＩＴＲシグナル伝達、ＴＲＥＭ－１シグナル伝達、ＴＲＥＭ－２シグナル伝達、ＤＡＰ１２シグナル伝達、ＭＲシグナル伝達、ＩＣＯＳシグナル伝達、ＭｙＤ８８シグナル伝達、Ｖ／Ｉ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖシグナル伝達、ＳＩＲＰαシグナル伝達、ＣＤ４５シグナル伝達、Ｓｉｇｌｅｃ－１０シグナル伝達、ＰＤ１シグナル伝達、ＳＨＰ－１シグナル伝達、ＳＨＰ－２シグナル伝達、ＫＩＲ－２ＤＬシグナル伝達、ＫＩＲ－３ＤＬシグナル伝達、ＮＫＧ２Ａシグナル伝達、ＣＤ１７０シグナル伝達、ＣＤ３３シグナル伝達、ＢＴＬＡシグナル伝達、ＣＤ３２ｂシグナル伝達、ＳＩＲＰβシグナル伝達、ＣＤ２２シグナル伝達、ＰＩＲ－Ｂシグナル伝達、及び／またはＬＩＬＲＢ１シグナル伝達）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、細胞生存メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、細胞死メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、食作用チェックポイントに対する耐性の増加、トラフィキングを助けるためのケモカイン受容体の発現の増加、他の免疫細胞を動員するためのケモカインの発現の増加、ＥＣＭ分解酵素の発現の増加（例えば、腫瘍ＥＣＭを分解し、及び／または抗線維化活性を示すＭＭＰ）、または増殖の増加、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、ＣＡＲ発現の持続時間の改善、細胞表面上でのＣＡＲの安定性の改善、ＣＡＲ発現レベルの増加、またはＣＡＲのバックグラウンド活性の低下のうちの１、２、３、または４つ、を示す。
【0095】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、対象における感染（例えば、感染病原体の）を減少させる。いくつかの実施形態では、感染病原体は、ウイルス、原生動物（例えば、トリパノソーマ、マラリア、またはトキソプラズマ）、細菌（例えば、マイコバクテリウム、サルモネラ、またはリステリア）、真菌（例えば、カンジダ）、またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらである。いくつかの実施形態では、ウイルスには、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、またはＥ型肝炎）、レトロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例、ＨＩＶ１またはＨＩＶ２）、Ｔ細胞白血病ウイルス、リンパ向性ウイルス（例えば、ＨＴＬＶ１またはＨＴＬＶ２）、単純ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型または２型）、エプスタイン－バーウイルス、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、日本脳炎ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）ウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２））、エボラウイルス、西ナイルウイルス、またはそれらのバリアントもしくは組み合わせが含まれる。
【0096】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するマクロファージは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、対象（例えば、神経変性疾患、炎症性疾患、心血管疾患、線維性疾患、アミロイドーシス、またはそれらの組み合わせを有する対象）における少なくとも１つのタンパク質凝集体の形成を食作用を介して減少させ、及び／または既存の凝集体を分解する。いくつかの実施形態では、神経変性疾患は、タウオパチー、シヌクレオパチー、初老期認知症、老人性認知症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ピック病、原発性進行性失語症、前頭側頭型認知症、皮質基底層型認知症、パーキンソン病、レビー小体型認知症、ダウン症候群、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ポリグルタミン病、トリヌクレオチドリピート病、及びプリオン病、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、炎症性疾患は、全身性エリテマトーデス、血管炎、関節リウマチ、歯周炎、潰瘍性大腸炎、副鼻腔炎、喘息、結核、クローン病、慢性感染、遺伝性周期熱、悪性腫瘍、全身性血管炎、嚢胞性線維症、気管支拡張症、表皮水疱症、循環性好中球減少症、免疫不全、マックルウェルズ（ＭＷＳ）病、及び家族性地中海熱（ＦＭＦ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アミロイドーシスは、原発性アミロイドーシス（ＡＬ）、続発性アミロイドーシス（ＡＡ）、家族性アミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、ベータ２ミクログロブリンアミロイドーシス、限局性アミロイドーシス、重鎖アミロイドーシス（ＡＨ）、軽鎖アミロイドーシス（ＡＬ）、原発性全身性アミロイドーシス、ＡｐｏＡＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＩアミロイドーシス、ＡｐｏＡＩＶアミロイドーシス、アポリポタンパク質Ｃ２アミロイドーシス、アポリポタンパク質Ｃ３アミロイドーシス、角膜ラクトフェリンアミロイドーシス、トランスサイレチン関連アミロイドーシス、透析アミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、Ｌｅｃｔ２アミロイドーシス（ＡＬＥＣＴ２）、及びリゾチームアミロイドーシス、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、高血圧性心疾患、メタボリックシンドローム、高血圧症、脳血管疾患、及び心不全、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、線維性疾患は、肺線維症、特発性肺線維症、肝硬変、嚢胞性線維症、強皮症、心臓線維症、放射線誘発性肺損傷、脂肪性肝炎、糸球体硬化症、間質性肺疾患、肝線維症、縦隔線維症、後腹膜腔線維症、骨髄線維症、及び皮膚線維症、からなる群から選択される。
【0097】
単球
単球は、血液、骨髄、及び脾臓内を循環する多能性細胞であり、一般に、定常状態では増殖しない。単球は、直径が約１０～３０μｍの範囲でサイズが大きく異なる。単球の細胞質に対する核の比率は、約２：１から約１：１までの範囲であり得る。通常、単球は、感染時などに血液から組織への移動を媒介するケモカイン受容体及び病原体認識受容体を含む。単球は、炎症性サイトカインを産生し、細胞及び／または毒性分子を取り込み、樹状細胞またはマクロファージに分化することができる。
単球は、血液、骨髄、及び脾臓内を循環する多能性細胞であり、一般に、定常状態では増殖しない。単球は、直径が約１０～３０μｍの範囲でサイズが大きく異なる。単球の細胞質に対する核の比率は、約２：１から約１：１までの範囲であり得る。通常、単球は、感染時などに血液から組織への移動を媒介するケモカイン受容体及び病原体認識受容体を含む。単球は、炎症性サイトカインを産生し、細胞及び／または毒性分子を取り込み、樹状細胞またはマクロファージに分化することができる。
【0098】
いくつかの実施形態では、単球は、１つ以上の表現型マーカーを含むかまたは発現する。ヒト単球細胞の表現型マーカーの例としては、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤｗ１７、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６８、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８９、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９８、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１９、ＣＤｗｌ２ｌｂ、ＣＤｗ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤｗ１２８、ＣＤｗ１３１、ＣＤ１４７、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５７、ＣＤ１６２ ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６８、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１８０、ＣＤ２０６、ＣＤ１３１ａ１、ＣＤ２１３ ２、ＣＤｗ２１０、ＣＤ２２６、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、及びＣＤ２８６、が挙げられるが、これらに限定されない。マウス単球細胞の表現型マーカーの例としては、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、Ｃｄｗ１３１、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、Ｆ４／８０、及びＣＤ４９ｂが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、単球は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、またはＣＤ１６のうちの１つ、２つ、または３つを含む。ある特定の実施形態では、単球は、ＣＤ１４＋ ＣＤ１６－単球、ＣＤ１４＋ ＣＤ１６＋単球、またはＣＤ１４－ ＣＤ１６＋単球を含む。
【0099】
いくつかの実施形態では、単球はマクロファージに分化する。いくつかの実施形態では、単球は樹状細胞（ＤＣ）に分化する。単球は、当技術分野において公知の任意の技術によってマクロファージまたはＤＣに分化することができる。例えば、単球からマクロファージへの分化は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）によって誘導される。単球のＤＣへの分化は、ＩＬ－４と組み合わせた顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）によって誘導することができる。
【0100】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、またはＩＬ－１のうちの１、２、３、４、５、６、または７つ）の分泌の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、食作用の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、生存の向上を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、マクロファージ（例えば、Ｍ１またはＭ２マクロファージ）への分化の増強を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、ＤＣ（例えば、常在性または移動性ＤＣ及び／またはリンパ組織及び非リンパ組織における）への分化の増強を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、腫瘍細胞に対して細胞毒性の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、腫瘍抗原提示の増加（例えば、食作用後の提示）及び／または抗原プロセシングの増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、腫瘍殺傷の増加（例えば、食作用、溶解、アポトーシス、または殺腫瘍サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）の産生による）を示す。
【0101】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、好ましい遺伝子の発現増加または好ましくない遺伝子の発現の減少の一方または両方を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、ＲＯＳの産生の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、代謝の再プログラミングを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、細胞生存メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、細胞死メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、食作用チェックポイントに対する耐性の増加、トラフィキングを助けるためのケモカイン受容体の発現の増加、他の免疫細胞を動員するためのケモカインの発現の増加、ＥＣＭ分解酵素の発現の増加（例えば、腫瘍ＥＣＭを分解し、及び／または抗線維化活性を示すＭＭＰ）、または増殖の増加、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現する単球は、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まない単球と比較して、ＣＡＲ発現の持続時間の改善、細胞表面上でのＣＡＲの安定性の改善、ＣＡＲ発現レベルの増加、またはＣＡＲのバックグラウンド活性の低下のうちの１、２、３、または４つ、を示す。
【0102】
樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始及び自己抗原に対する免疫系の寛容の維持に関与する、骨髄由来の特殊な抗原提示細胞である。樹状細胞は、リンパ器官と非リンパ器官の両方に見られる場合があり、一般にリンパ系または骨髄系から生じると考えられている。
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始及び自己抗原に対する免疫系の寛容の維持に関与する、骨髄由来の特殊な抗原提示細胞である。樹状細胞は、リンパ器官と非リンパ器官の両方に見られる場合があり、一般にリンパ系または骨髄系から生じると考えられている。
【0103】
いくつかの実施形態では、ＤＣは、１つ以上の表現型マーカーを含むかまたは発現する。ＤＣの例示的な表現型マーカーには、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８３、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１４１、ＣＤ２０７、ＣＬＥＣ９ａ、ＣＤ１２３、ＣＤ８５、ＣＤ１８０、ＣＤ１８７、ＣＤ２０５、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、及び部分的にＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８及びＣＤ２０９が含まれるが、これらに限定されない。
【0104】
未成熟ＤＣは、抗原捕捉能力が高いが、Ｔ細胞刺激能力が比較的低いことを特徴とする場合がある。炎症性メディエーターは、ＤＣの成熟を促進する。ＤＣが成熟段階に達すると、抗原捕捉能力の低下及び／またはＴ細胞を刺激する能力の増加など、未成熟ＤＣと比較して特性が劇的に変化する。いくつかの実施形態では、ＤＣは、未成熟ＤＣを含むか、または未成熟ＤＣである。他の実施形態では、ＤＣは成熟ＤＣを含むか、または成熟ＤＣである。
【0105】
理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するようにＤＣ細胞を修飾することにより、成熟ＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、抗原捕捉能力及びＴ細胞刺激の増加を同時に示すことができると考えられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むかまたは発現するＤＣは、腫瘍抗原提示を媒介し、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、腫瘍抗原提示を増加させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、腫瘍Ｔ細胞刺激を媒介し、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、Ｔ細胞刺激を増加させる。
【0106】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、またはＩＬ－１のうちの１、２、３、４、５、６、または７つ）の分泌の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、食作用の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、腫瘍抗原提示の増加（例えば、食作用後の提示）、抗原プロセシングの増加、抗原交差提示の増加、Ｔ細胞感作の増加、及び／またはＴ細胞の刺激を示す。
【0107】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、好ましい遺伝子の発現増加または好ましくない遺伝子の発現の減少の一方または両方を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、ＲＯＳの産生の増加を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、代謝の再プログラミングを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、細胞生存メカニズムの誘導を示す。
【0108】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、細胞死メカニズムの誘導を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、食作用チェックポイントに対する耐性の増加、トラフィキングを助けるためのケモカイン受容体の発現の増加、他の免疫細胞を動員するためのケモカインの発現の増加、ＥＣＭ分解酵素の発現の増加（例えば、腫瘍ＥＣＭを分解し、及び／または抗線維化活性を示すＭＭＰ）、または増殖の増加、のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを含むまたは発現するＤＣは、例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含まないＤＣと比較して、ＣＡＲ発現の持続時間の改善、細胞表面上でのＣＡＲの安定性の改善、ＣＡＲ発現レベルの増加、またはＣＡＲのバックグラウンド活性の低下のうちの１、２、３、または４つ、を示す。
【0109】
免疫細胞の修飾方法
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫細胞を修飾する方法であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を修飾するステップ、（ｂ）核酸を精製するステップ、及び（ｃ）核酸を免疫細胞に送達するステップを含み、免疫細胞は、マクロファージ、単球または樹状細胞を含み、修飾免疫細胞はＣＡＲを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫細胞を修飾する方法を提供であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を修飾するステップ、（ｂ）ｍＲＮＡを精製するステップ、及び（ｃ）ｍＲＮＡを免疫細胞に送達するステップを含み、免疫細胞は、マクロファージ、単球または樹状細胞を含み、修飾免疫細胞はＣＡＲを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫細胞を修飾する方法であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を修飾するステップ、（ｂ）核酸を精製するステップ、及び（ｃ）核酸を免疫細胞に送達するステップを含み、免疫細胞は、マクロファージ、単球または樹状細胞を含み、修飾免疫細胞はＣＡＲを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、免疫細胞を修飾する方法を提供であって、（ａ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を修飾するステップ、（ｂ）ｍＲＮＡを精製するステップ、及び（ｃ）ｍＲＮＡを免疫細胞に送達するステップを含み、免疫細胞は、マクロファージ、単球または樹状細胞を含み、修飾免疫細胞はＣＡＲを含む、方法を提供する。
【0110】
いくつかの実施形態では、本開示は、修飾ｍＲＮＡを免疫細胞に送達することを含む方法であって、ｍＲＮＡはＣＡＲを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、提供される方法は、任意選択で送達するステップの前に、免疫細胞をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、提供される方法は、免疫細胞を、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＳＴＮＧＬ、ＬＰＳ、ＣＤ４０アゴニスト、４－１ＢＢリガンド、組換え４－１ＢＢ受容体、ＴＬＲアゴニスト、ベータ－グルカン、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、グルココルチコイド、免疫複合体、またはそれらの組み合わせ）とともに培養するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－βを含む。
【0111】
核酸の修飾
本開示のいくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、ｍＲＮＡであるか、またはｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡは、非修飾または修飾ｍＲＮＡとして合成され得る。通常、ｍＲＮＡは、安定性を高めるために修飾される。ｍＲＮＡの修飾には、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含めてもよい。したがって、本開示による修飾ｍＲＮＡには、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含めてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを修飾するステップは、ｍＲＮＡに修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、及び／またはポリ（Ａ）テールを含めることを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、ならびにプリン及びピリミジンの修飾ヌクレオチドアナログまたは誘導体として、例えば、１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、シュードウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、β－Ｄ－マンノシル－クエオシン、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、及びホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン及びイノシン、を含むがこれらに限定されない、天然に存在するヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログ（修飾ヌクレオチド）から合成することができる。このようなアナログの調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び米国特許第５，７００，６４２号から当業者に公知であり、これらの開示は参照によりその全体が組み込まれる。
本開示のいくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、ｍＲＮＡであるか、またはｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡは、非修飾または修飾ｍＲＮＡとして合成され得る。通常、ｍＲＮＡは、安定性を高めるために修飾される。ｍＲＮＡの修飾には、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含めてもよい。したがって、本開示による修飾ｍＲＮＡには、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含めてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを修飾するステップは、ｍＲＮＡに修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、及び／またはポリ（Ａ）テールを含めることを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、ならびにプリン及びピリミジンの修飾ヌクレオチドアナログまたは誘導体として、例えば、１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、シュードウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－シュードウラシル、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、β－Ｄ－マンノシル－クエオシン、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、及びホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン及びイノシン、を含むがこれらに限定されない、天然に存在するヌクレオチド及び／またはヌクレオチドアナログ（修飾ヌクレオチド）から合成することができる。このようなアナログの調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、及び米国特許第５，７００，６４２号から当業者に公知であり、これらの開示は参照によりその全体が組み込まれる。
【0112】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ骨格修飾を含み得る。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のホスフェートが化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾には、典型的には、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））、ボラノホスフェート、正に荷電したグアニジニウム基など、からなる群からの修飾が含まれるが、これらに限定されず、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン性基、カチオン性基または中性基で置き換えることを含む。
【0113】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）は、糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾は、含まれるヌクレオチドの糖の化学修飾であり、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン５’－三リン酸、２’－メチルウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びその異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、からなる群から選択される糖修飾が含まれるが、これらに限定されない。
【0114】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含み得る。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。そのような塩基修飾ヌクレオチドの例としては、２－アミノ－６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、２－アミノアデノシン５’－三リン酸、２－チオシチジン５’－三リン酸、２－チオウリジン５’－三リン酸、４－チオウリジン５’－三リン酸、５－アミノアリルシチジン５’－三リン酸、５－アミノアリルウリジン５’－三リン酸、５－ブロモシチジン５’－三リン酸、５－ブロモウリジン５’－三リン酸、５－ヨードシチジン５’－三リン酸、５－ヨードウリジン５’－三リン酸、５－メチルシチジン５’－三リン酸、５－メチルウリジン５’－三リン酸、６－アザシチジン５’－三リン酸、６－アザウリジン５’－三リン酸、６－クロロプリンリボシド５’－三リン酸、７－デアザアデノシン５’－三リン酸、７－デアザグアノシン５’－三リン酸、８－アザアデノシン５’－三リン酸、８－アジドアデノシン５’－三リン酸、ベンズイミダゾールリボシド５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン５’－三リン酸、Ｎ１－メチルグアノシン５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン５’－三リン酸、Ｏ６－メチルグアノシン５’－三リン酸、シュードウリジン５’－三リン酸、ピューロマイシン５’－三リン酸またはキサントシン５’－三リン酸、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍＰｓＵ）、またはそれらの組み合わせを含む。
【0115】
典型的には、ｍＲＮＡ合成は、Ｎ末端（５’）末端への「キャップ」及びＣ末端（３’）末端への「テール」の付加を含む。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供する上で重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。
【0116】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造を含む。５’キャップは通常、以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’三リン酸結合が生成され、グアニンの７－窒素は、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例には、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ）及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ０構造を含む。キャップ０構造は、塩基１及び２に付着したリボースの２’－Ｏ－メチル残基を欠いている。いくつかの実施形態では、キャップはＡＧＣａｐ１構造を含む。ＡＧＣａｐ１構造は、塩基２に２’－Ｏ－メチル残基を有する。いくつかの実施形態では、キャップはＣａｐ２構造を含む。Ｃａｐ２構造は、塩基２及び３の両方に付着した２’－Ｏ－メチル残基を有する。いくつかの実施形態では、キャップ構造は、ＡＧＣａｐ１、ｍ６ＡＧＣａｐ１、または抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ｍＲＮＡは、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びシュードウリジン（ＰｓＵ）を含む修飾ヌクレオチドを含む。
【0117】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）は、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端のポリ（Ａ）テールには、通常、約１０～４００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１００～４００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンヌクレオチド）が含まれる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリ（Ｃ）テールには、通常、約１０～２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のシトシンヌクレオチド、約２０～６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０～４０個のシトシンヌクレオチド）が含まれる。ポリ（Ｃ）テールは、ポリ（Ａ）テールに付加されてもよいし、ポリ（Ａ）テールの代替物であってもよい。
【0118】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡ（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）は、５’及び／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を与える１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０～５００ヌクレオチドの間であり得る。
【0119】
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞内でのｍＲＮＡの位置の安定性に影響を与えるタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０～５００ヌクレオチド以上であり得る。
【0120】
核酸送達
本開示は、とりわけ、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を修飾するための方法であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその断片をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトを免疫細胞に送達することを含む、方法を提供する。方法は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトを送達して、免疫細胞が（ａ）～（ｃ）を含むＣＡＲを含むようにすることを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトは、（ｄ）細胞外リーダードメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外リーダードメイン）、（ｅ）細胞外ヒンジドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ヒンジドメイン）、または（ｆ）細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内共刺激ドメイン）のうちの１つ、２つ、または３つをさらにコードする。
本開示は、とりわけ、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を修飾するための方法であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその断片をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトを免疫細胞に送達することを含む、方法を提供する。方法は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）をコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトを送達して、免疫細胞が（ａ）～（ｃ）を含むＣＡＲを含むようにすることを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトは、（ｄ）細胞外リーダードメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外リーダードメイン）、（ｅ）細胞外ヒンジドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ヒンジドメイン）、または（ｆ）細胞内共刺激ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内共刺激ドメイン）のうちの１つ、２つ、または３つをさらにコードする。
【0121】
本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲをコードする１つ以上の核酸配列を含む核酸コンストラクトは、物理的、化学的、または生物学的方法によって免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸送達の１つ以上の物理的、化学的、または生物学的方法を使用して、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲをコードする１つ以上の核酸配列を導入し、ＣＡＲをコードしない１つ以上の核酸配列を導入することができる。本明細書に記載の核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に導入するための物理的方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、Ｖｉｒｏｍｅｒ媒介トランスフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、メカノトランスダクション（例えば、スクイーズ型技術）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。核酸コンストラクトは、市販の方法、例えば、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（登録商標）（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＣＭ ８３０ ＢＴＸ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ））、Ｍａｘｃｙｔｅ ＳＴＸ（Ｍａｘｃｙｔｅ）、Ｍａｘｃｙｔｅ ＶＬＸ（Ｍａｘｃｙｔｅ）、Ｍａｘｃｙｔｅ ＧＴ（Ｍａｘｃｙｔｅ）、ＣｌｉｎｉＭａｃｓ エレクトロポレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、またはＮｅｏｎ トランスフェクションシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して免疫細胞に導入することができる。核酸コンストラクトはまた、ｍＲＮＡトランスフェクション、例えばカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、リポフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または「遺伝子銃」などの微粒子銃送達システムを用いて免疫細胞に導入することができる（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １２（８）：８６１－７０ （２００１）を参照のこと、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0122】
本明細書に記載の核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）に遺伝子を挿入するために広く使用されるようになっている。ウイルスベクターはまた、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス（例えば、Ａｄｆ５３５）、またはアデノ随伴ウイルスに由来し得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照のこと、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。レンチウイルスなどのレトロウイルスベクターは、導入遺伝子の長期かつ安定な組み込み及び娘細胞におけるその増殖が可能になる長期遺伝子導入を達成するための好適なツールである。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｖｐｘタンパク質とともにパッケージングされる（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際公開番号ＷＯ２０１７／０４４４８７に記載されているように）。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘは、ビリオン関連タンパク質（例えば、ウイルス複製のためのアクセサリータンパク質）を含む。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ－２）によってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘタンパク質は、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）によってコードされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）は、Ｖｐｘタンパク質がパッケージングされたレンチウイルスベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘは、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）の少なくとも１つの抗ウイルス因子を阻害する。いくつかの実施形態では、Ｖｐｘタンパク質がパッケージングされたレンチウイルスベクターは、例えば、Ｖｐｘタンパク質がパッケージングされていないレンチウイルスベクターと比較して、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）のトランスフェクション効率の増大を示す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、例えば、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクター（例えば、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクター、例えば、ヘルパー依存性Ａｄ５Ｆ３５アデノウイルスベクター））によるトランスフェクションの前に、少なくとも１つのＶｐｘ ｍＲＮＡのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションの一方または両方を行う。本明細書に記載の核酸コンストラクトを免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）に導入するための化学的手段には、コロイド分散システム、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質系システム（例えば、油水中エマルジョン、ミセル、混合ミセル、ナノ粒子、リポソーム、及びリポフェクタミン－核酸複合体）が含まれる。
【0123】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸コンストラクトを送達するためのシステムは、脂質系システムである。本明細書に記載の核酸コンストラクトは、リポソームの水性内部に封入され、脂質二重層内に散在し、連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体を形成し、脂質を含む溶液または懸濁液に分散され、脂質と混合され、ミセルと複合体を形成し、またはそうでなければ脂質と会合されてもよい。本明細書に記載の方法で使用する脂質は、天然に存在する脂質または合成脂質であり得る。脂質は商業的供給源から入手することもできる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手することができ、ジセチルホスフェートは、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ、コレステロールは Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロールは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ．）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液は、約－２０℃で保存することができる。
【0124】
核酸精製
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップを含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、当技術分野で公知の任意の標準的な精製方法の使用を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、シリカ膜精製、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＬｉＣｌ沈殿、フェノール－クロロホルム抽出、樹脂ベースの精製、ポリＡ単離、ＲＮｅａｓｙ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、シリカ膜精製を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップを含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、当技術分野で公知の任意の標準的な精製方法の使用を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、シリカ膜精製、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＬｉＣｌ沈殿、フェノール－クロロホルム抽出、樹脂ベースの精製、ポリＡ単離、ＲＮｅａｓｙ、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、シリカ膜精製を含む。いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ）を精製するステップは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。
【0125】
修飾中の免疫細胞の処理及び培養
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞を修飾するプロセス中に免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を処理する１つ以上のステップを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞を修飾するプロセス中に免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を処理する１つ以上のステップを含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターで処理するステップを含む。インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは、種々のエンドソーム自然免疫受容体（Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８）及び細胞質自然免疫受容体（プロテインキナーゼＲＮＡ活性化（ＰＫＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉタンパク質（ＲＩＧ－Ｉ）、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）及び２’－５’－オリゴアデニル酸シンターゼ（ＯＡＳ））によって認識される。これらの異なる経路を介したシグナル伝達は、１型インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１２、及び転写プログラムのカスケードの活性化に関連する炎症を引き起こす。全体として、これらは、特異的免疫応答を誘導する態勢にある炎症誘発性微小環境を作出する。さらに、真核生物の翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）リン酸化による翻訳の減速、リボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅＬ）によるＲＮＡ分解の促進、自己増幅ｍＲＮＡの複製の過剰発現及び阻害などの下流の影響は、薬物動態及びＩＶＴ ｍＲＮＡの薬力学と関連性がある。
【0127】
いくつかの実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターは、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターは、ＲＮａｓｅＬ、ＲＮａｓｅ Ｔ２またはＲＮａｓｅ１阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、インビトロで転写されたｍＲＮＡによって活性化される経路のモジュレーターは、ＲＮａｓｅＬ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅＬ阻害剤は、スニチニブを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅＬ阻害剤は、ＡＢＣＥ１を含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理すると、ＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理されなかった同じタイプの修飾免疫細胞におけるｍＲＮＡ安定性と比較して、修飾免疫細胞におけるｍＲＮＡ安定性が増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理すると、ＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理されなかった同じタイプの修飾免疫細胞におけるＣＡＲ発現と比較して、修飾免疫細胞におけるＣＡＲ発現が増加する。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理すると、ＲＮａｓｅＬ阻害剤で処理されなかった同じタイプの修飾免疫細胞におけるエフェクター活性と比較して、修飾免疫細胞におけるエフェクター活性が増加する。
【0129】
本開示のいくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を処理するステップは、ｍＲＮＡを免疫細胞に送達するステップの前に行われる。
【0130】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養するステップを含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＳＴＮＧＬ、ＬＰＳ、ＣＤ４０アゴニスト、４－１ＢＢリガンド、組換え４－１ＢＢ、ＣＤ１９アゴニスト、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ－１、ＴＬＲ－２、ＴＬＲ－３、ＴＬＲ－４、ＴＬＲ－５、ＴＬＲ－６、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－８またはＴＬＲ－９）、ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、またはＴＧＦ－β３）、糖質コルチコイド、免疫複合体、インターロイキン－１アルファ（ＩＬ－１α）、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、ＴＮＦ－β、ＣＤ１５４、リンホトキシンベータ（ＬＴ－β）、Ａ増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、グルココルチコイド誘導ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＴＡＬＬ－１（腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１３Ｂ－ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦ関連弱アポトーシス誘導因子（ＴＷＥＡＫ）、ＴＮＦ関連活性化誘導サイトカイン（ＴＲＡＮＣＥ）、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、甲状腺ペルオキシダーゼ前駆体（Ｔｐｏ）、ＦＭＳ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ－３Ｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、メロゾイト表面タンパク質（ＭＳＰ）、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン含有タンパク質（ＮＯＤ）リガンド（例えば、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、またはＮＯＤ１／２アゴニスト）、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）リガンド（例えば、５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ、３ｐ－ｈｐＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、またはＰｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ））、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）リガンド（例えば、カードラン、β－グルカン、ＨＫＣＡ、ラミナリン、プスツラン、スクレログルカン、分散性ＷＧＰ、可溶性ＷＧＰ、ザイモザン、ザイモザン劣化、フルフルマン（ｆｕｒｆｕｒｍａｎ）、ｂ－ＧｌｃＣｅｒ、ＧｌｃＣ１４Ｃ１８、ＨＫＭＴ、ＴＤＢ、ＴＤＢ－ＨＳ１５、またはＴＤＭ）、環式ジヌクレオチドセンサーリガンド（例えば、Ｃ－Ｇａｓアゴニストまたはインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）リガンド）、インフラマソーム誘導因子（例えば、ミョウバン、ＡＴＰ、ＣＰＰＤ結晶、ヘモゾイン、ＭＳＵ結晶、ナノＳｉＯ２、ニゲリシン、またはＴＤＢ）、アリール炭化水素（ＡｈＲ）リガンド（例えば、ＦＩＣＺ、インジルビン、ＩＴＥ、またはＬ－キヌレニン）、アルファプロテインキナーゼ１（ＡＬＰＫ１）リガンド、マルチＰＲＲリガンド、ＮＦＫＢ／ＮＦＡＴアクチベーター（例えば、コンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ Ａ）、イオノマイシン、ＰＨＡ－Ｐ、またはＰＭＡ）、またはそれらの組み合わせ、を含む。いくつかの実施形態では、サイトカインは、ＩＦＮ－βを含む。
【0131】
本開示のいくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）を培養するステップは、ｍＲＮＡを免疫細胞に送達するステップの後に行われる。
【0132】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞の生存率が増加する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞のタンパク質（例えば、ＣＡＲ）発現が増加する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、タンパク質（例えば、ＣＡＲ）発現の寿命が延伸する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞のエフェクター活性が増加する。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）をサイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養すると、サイトカインまたは免疫刺激組換えタンパク質とともに培養されなかった同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、修飾免疫細胞のＭ１分極が増加する。
【0133】
修飾免疫細胞
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、本開示の方法によって作製される。
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、本開示の方法によって作製される。
【0134】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、生存率の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の生存率の増加を示す。
【0135】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの発現の少なくとも１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、または２０００％の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの発現の少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍の増加を示す。
【0136】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲ発現の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲ発現の少なくとも１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、１５００％、または２０００％の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲ発現の少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍の増加を示す。
【0137】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲをコードするｍＲＮＡの寿命の少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、または１か月の延伸を示す。
【0138】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲの寿命の延伸を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、ＣＡＲの寿命の少なくとも１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、または１か月の延伸を示す。
【0139】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、エフェクター活性の増加を示す。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％のエフェクター活性の増加を示す。いくつかの実施形態では、エフェクター活性の増加は、サイトカイン産生、ケモカイン産生、食作用、細胞シグナル伝達、標的細胞殺傷、及び／または抗原提示の増加を含む。
【0140】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、Ｍ１分極の増加を示す。いくつかの実施形態では、Ｍ１分極の増加は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＭＨＣ ＩＩ、ＩＬ－１Ｒ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ｉＮＯＳ、ＳＯＣＳ３、ＣＤ８３、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ６９、ＭＨＣ Ｉ、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＩＬ１Ｒ、ＩＦＩＴファミリーメンバー、またはＩＳＧファミリーメンバーを含むＭ１マーカーのレベルの増加を含む。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％のＭ１分極の増加を示す。
【0141】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、Ｍ２分極の減少を示す。いくつかの実施形態では、Ｍ２分極の減少は、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、またはＣＤ２０９を含むＭ２マーカーのレベルの減少を含む。いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞は、ＣＡＲをコードする非修飾ｍＲＮＡを含む同じタイプの修飾免疫細胞と比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％のＭ２分極の減少を示す。
【0142】
アッセイ
免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）における本明細書に記載の核酸コンストラクトの存在を確認するために、様々なアッセイを行うことができる。例えば、そのようなアッセイとしては、サザンブロット法及びノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ等の当業者に周知の分子生物学的アッセイ、ならびに例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット法）による特定のペプチドの存在または不在の検出等の生化学的アッセイが挙げられる。本開示の他のアッセイには、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡法、ＭＳＤサイトカイン分析、質量分析（ＭＳ）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ及び機能アッセイが含まれる。
免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）における本明細書に記載の核酸コンストラクトの存在を確認するために、様々なアッセイを行うことができる。例えば、そのようなアッセイとしては、サザンブロット法及びノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ等の当業者に周知の分子生物学的アッセイ、ならびに例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット法）による特定のペプチドの存在または不在の検出等の生化学的アッセイが挙げられる。本開示の他のアッセイには、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫蛍光顕微鏡法、ＭＳＤサイトカイン分析、質量分析（ＭＳ）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ及び機能アッセイが含まれる。
【0143】
様々なアッセイを実行して、修飾免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ、または樹状細胞）の種々の特徴、例として、限定されるものではないが、免疫細胞の生存率、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の発現、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）の寿命、タンパク質（例えば、ＣＡＲ）の発現、タンパク質（例えば、ＣＡＲ）の寿命、エフェクター活性、及びＭ１分極などを決定することができる。
【0144】
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含む、本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び物質を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法及び物質を本明細書に記載する。
【0145】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現するように操作され、細胞を特異的に標的とし、及び／または抗原に結合する人工細胞表面受容体を指す。ＣＡＲは、例えば、養子細胞移入による治療として使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、単球、マクロファージ、及び／または樹状細胞は、患者から（例えば、血液、腫瘍または腹水から）取り出され、特定の形態の抗原に特異的な受容体を発現するように修飾される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原、例えば腫瘍関連抗原に対して特異的に発現している。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞上で発現するように操作され、細胞を特異的に標的とし、及び／または抗原に結合する人工細胞表面受容体を指す。ＣＡＲは、例えば、養子細胞移入による治療として使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、単球、マクロファージ、及び／または樹状細胞は、患者から（例えば、血液、腫瘍または腹水から）取り出され、特定の形態の抗原に特異的な受容体を発現するように修飾される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原、例えば腫瘍関連抗原に対して特異的に発現している。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
【0146】
いくつかの実施形態では、修飾免疫細胞、例えば、修飾マクロファージ、単球、または樹状細胞は、その中でＣＡＲを発現させることによって生成される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＣＡＲを含み、免疫細胞は、マクロファージ、単球、または樹状細胞を含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外リーダードメイン、１つ以上の細胞外ヒンジドメイン、及び１つ以上の細胞内共刺激ドメインのうちの１つ以上をさらに含み得る。
【0148】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインまたはヒンジ（例えば、ＣＤ８またはＣＤ２８ヒンジドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメインまたはヒンジを含む。本明細書で使用する場合、「スペーサードメイン」または「ヒンジ」という用語は、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、スペーサードメインまたはヒンジは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーは、好ましくは長さが２～１０の間のアミノ酸であり、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間の連結を形成し得る。リンカーの例には、グリシン－セリンダブレットが含まれる。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含む免疫細胞は、安全スイッチ（例えば、オンスイッチ及びオフスイッチ、自殺スイッチ）、論理ゲート、例えば、ＡＮＤゲート（例えば、２つ以上のＣＡＲであって、そのそれぞれが１つ以上のシグナル伝達ドメインを欠いているため、完全な免疫細胞（マクロファージ、単球、または樹状細胞など）の活性化または機能には、両方／すべてのＣＡＲの活性化が必要であるもの）、ＯＲゲート（例えば、２つ以上のＣＡＲであって、そのそれぞれが細胞内ドメイン、例としてＣＤ３ζ及び共刺激ドメインを有するもの）、及び／またはＮＯＴゲート（例えば、２つ以上のＣＡＲであって、そのうちの１つに、それ以外のＣＡＲ（複数可）の機能に拮抗する抑制ドメインが含まれる）を含むがこれらに限定されない１つ以上の制御システムを含み得る。
【0150】
本開示はまた、ＣＡＲをコードする核酸配列（例えば、単離核酸配列）を含む免疫細胞であって、核酸配列は、細胞外ドメインをコードする核酸配列、膜貫通ドメインをコードする核酸配列、及び細胞内ドメインをコードする核酸配列を含み、細胞は、ＣＡＲを発現する単球、マクロファージまたは樹状細胞である、免疫細胞を提供する。
【0151】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫細胞における発現のために、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインなどのＣＡＲの別のドメインに作動可能に連結された細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインをコードする核酸は、膜貫通ドメインをコードする核酸に作動可能に連結され、膜貫通ドメインをコードする核酸は、細胞内ドメインをコードする核酸に作動可能に連結される。
【0152】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを含む免疫細胞のエフェクター活性は、ＣＡＲの抗原結合ドメインに特異的に結合する抗原を含む標的細胞に対して指向される。いくつかの実施形態では、標的細胞に対して指向される標的化エフェクター活性は、食作用、標的化細胞傷害、抗原提示、またはサイトカイン分泌であるか、またはそれらを含む。
【0153】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）において抗食作用シグナル伝達を阻害する少なくとも１つのドメイン（例えば、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または細胞内ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、例えば、ＣＤ４７及び／またはＳＩＲＰα活性の阻害を増強することにより、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）のエフェクター活性を改善する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、例えば、ＣＤ４７に結合し、ドミナントネガティブ受容体として働き、ＳＩＲＰα活性を阻害する（例えば、ＣＤ４７シンク）。いくつかの実施形態では、ＳＩＲＰαに結合する本明細書に記載のＣＡＲは、例えば、活性化受容体を含む（例えば、ＣＤ３ｚ細胞内ドメインを含む）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの少なくとも１つの相互作用を阻害する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、食作用論理ゲートであるか、またはそれを含む。
【0154】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含むまたは発現する）は、ＳＩＲＰα（例えば、ドミナントネガティブＳＩＲＰαまたはＳＩＲＰαの高親和性改変バリアント（例えば、ＣＶ１））、５Ｆ９ ｓｃＦｖ、Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ（例えば、ヒト化Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ）、ＰＤ１（例えば、ドミナントネガティブＰＤ１またはＨＡＣ－Ｉ）、抗ＰＤ１ ｓｃＦｖ（例えば、Ｅ２７またはデュルバルマブ）、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、Ｓｉｇｌｅｃ－９、Ｓｉｇｌｅｃ－１１、及び／またはＳＨＰ－１、のうちの少なくとも１つのバリアントまたは断片を含むまたは発現する。いくつかの実施形態では、バリアントまたは断片は、変異細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、バリアントまたは断片は、少なくとも１つの細胞内ドメインを含まないまたは発現しない（例えば、免疫細胞は、抗ＣＤ４７ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジドメイン、及びＣＤ８膜貫通を含むまたは発現する）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含むまたは発現する）は、例えば阻害チェックポイントをブロックするドミナントネガティブ受容体を含む。
【0155】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ及び／またはＴ２Ａペプチド）と、抗食作用シグナル伝達の少なくとも１つの阻害ドメインを含む少なくとも１つの第２のＣＡＲとをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２のＣＡＲは、ＳＩＲＰα（例えば、ＳＩＲＰαの高親和性改変バリアント（例えば、ＣＶ１））、５Ｆ９ ｓｃＦｖ、Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ（例えば、ヒト化Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ）、またはＣＤ４７結合細胞外ドメインまたはその断片を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの第２のＣＡＲは、ＳＩＲＰα膜貫通ドメインまたはその断片を含む。特定の実施形態では、第２のＣＡＲは、ヒンジドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジドメイン）をさらに含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１つの第２のＣＡＲは、（ｉ）リーダー配列（例えば、ＣＤ８リーダー）、ｉｉ）細胞外ドメイン（例えば、ＳＩＲＰα、ＣＶ１、５Ｆ９ ｓｃＦｖ、またはＢ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ（例えば、ヒト化Ｂ６Ｈ１２ ｓｃＦｖ）細胞外ドメイン）、及びｉｉ）膜貫通ドメイン（例えば、ＳＩＲＰα膜貫通ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａペプチド）及び少なくとも１つのマーカータンパク質（例えば、ＣＤ２０またはその断片、ＣＤ１９またはその断片、ＮＧＦＲまたはその断片、合成ペプチド、及び／または蛍光タンパク質）をさらに含む。
【0156】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲを含むまたは発現する）は、１つ以上のホスファターゼデッド（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅａｄ）ドメイン（例えば、ホスファターゼデッドＳｈｐ１、ホスファターゼデッド７２－５ｐｔａｓｅ（ＩＮＰＰ５Ｅ）、ホスファターゼデッドＳｈｐ２、及び／またはホスファターゼデッドＳＨＩＰ－１ドメイン）及び／または構成的に活性なキナーゼドメイン（例えば、構成的に活性なＬＹＮドメイン）を含むまたは発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ及び／またはＴ２Ａペプチド）及び１つ以上のホスファターゼデッド（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｄｅａｄ）ドメイン（例えば、ホスファターゼデッドＳｈｐ１、ホスファターゼデッド７２－５ｐｔａｓｅ（ＩＮＰＰ５Ｅ）、ホスファターゼデッドＳｈｐ２、及び／またはホスファターゼデッドＳＨＩＰ－１ドメイン）及び／または構成的に活性なキナーゼドメイン（例えば、構成的に活性なＬＹＮドメイン）をさらに含む。
【0157】
細胞外ドメイン
本開示は、細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ細胞外ドメイン、リーダードメイン、抗原結合ドメイン、及びヒンジドメインのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
本開示は、細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ細胞外ドメイン、リーダードメイン、抗原結合ドメイン、及びヒンジドメインのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
【0158】
ＦｃＲ細胞外ドメイン
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン（またはその一部）は、ヒトＦｃＲ細胞外ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン（またはその一部）は、ヒトＦｃＲ細胞外ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
【0159】
ＴＬＲ細胞外ドメイン
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン（またはその一部）は、ヒトＴＬＲ細胞外ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン（またはその一部）は、ヒトＴＬＲ細胞外ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
【0160】
リーダードメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞外リーダードメインをコードする核酸配列を含むが、細胞外リーダードメインは、ＣＡＲが免疫細胞内で発現する前にＣＡＲから切断される。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、ヒト細胞外リーダードメインであるか、またはヒト細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、ＣＤ８細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、刺激または共刺激ドメイン由来のリーダードメインを含む（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８ドメイン）。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、細胞外リーダードメインをコードする核酸配列を含むが、細胞外リーダードメインは、ＣＡＲが免疫細胞内で発現する前にＣＡＲから切断される。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、ヒト細胞外リーダードメインであるか、またはヒト細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、ＣＤ８細胞外リーダードメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外リーダードメインは、刺激または共刺激ドメイン由来のリーダードメインを含む（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８ドメイン）。
【0161】
抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば標的細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、自己免疫疾患、及び／またはがん細胞に関連する抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば標的細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、自己免疫疾患、及び／またはがん細胞に関連する抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、特定の疾患状態に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する抗原を認識する。
【0162】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、目的の腫瘍またはがんに特異的な抗原などの腫瘍抗原に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、１つ以上の抗原がんエピトープを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９及び１９Ａ２４とも称される）、Ｃ型レクチン様分子－１（ＣＬＬ－１またはＣＬＥＣＬ１）、ＣＤ３３、上皮増殖因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）、ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）、Ｔｎ抗原（（Ｔｎ Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））、プロテアーゼ特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）、ＫＩＴ（ＣＤ１１７）、インターロイキン－１３受容体サブユニットα－２（ＩＬ－１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）、メソテリン、インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ－１１Ｒａ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、プロテアーゼセリン２１（テスチシン（Ｔｅｓｔｉｓｉｎ）またはＰＲＳＳ２１）、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、ルイス（Ｙ）抗原、ＣＤ２４、血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ－β）、ステージ特異的胎児抗原－４（ＳＳＥＡ－４）、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、受容体チロシン－プロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、プロスターゼ（Ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）、エフリンＢ２、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ－Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、切断点クラスター領域（ＢＣＲ）及びエーベルソンマウス白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）からなるがん遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ－ａｂｌ）、チロシナーゼ、エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、フコシルＧＭ１、シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）、ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２－３）ｂＤＧａｌｐ（１－４）ｂＤＧｌｃｐ（１－１）Ｃｅｒ）、トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ｏ－アセチル－ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）、葉酸受容体ベータ、腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）、腫瘍内皮マーカー７関連物（ＴＥＭ７Ｒ）、クローディン６（ＣＬＤＮ６）、甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）、Ｇタンパク質共役受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ（ＧＰＲＣ５Ｄ）、染色体Ｘオープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）、ポリシアル酸、胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）、ｇｌｏｂｏＨグリコセラミド（ＧｌｏｂｏＨ）の六糖部分、乳腺分化抗原（ＮＹ－ＢＲ－１）、ウロプラキン２（ＵＰＫ２）、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）、アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）、パンネキシン３（ＰＡＮＸ３）、Ｇタンパク質共役受容体２０（ＧＰＲ２０）、リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ９（ＬＹ６Ｋ）、嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）、ＴＣＲ γ選択的リーディングフレームタンパク質（ＴＡＲＰ）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、がん／精巣抗原１（ＮＹ－ＥＳＯ－１）、がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ－１ａ）、黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異体遺伝子６（ＥＴＶ６－ＡＭＬ）、精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）、Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）、アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ ２）、黒色腫癌精巣抗原－１（ＭＡＤ－ＣＴ－１）、黒色腫癌精巣抗原－２（ＭＡＤ－ＣＴ－２）、Ｆｏｓ関連抗原１、腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）、ｐ５３突然変異体、プロステイン、サバイビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ）、テロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１またはガレクチン８）、Ｔ細胞１によって認識される黒色腫抗原（メランＡまたはＭＡＲＴ１）、ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、肉腫転座切断点、アポトーシスの黒色腫阻害因子（ＭＬ－ＩＡＰ）、ＥＲＧ（膜貫通型プロテアーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）、Ｎ－アセチルグルコサミニル－トランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－３（ＰＡＸ３）、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ｖ－ｍｙｃトリ骨髄細胞腫ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）、ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ－２）、シトクロムＰ４５０ １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）、ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはＢｒｏｔｈｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ Ｓｉｔｅｓ）、Ｔ細胞３によって認識される扁平上皮細胞癌抗原（ＳＡＲＴ３）、ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ－５（ＰＡＸ５）、プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ－ＴＥＳ１）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＬＣＫ）、Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ－４）、滑膜肉腫、Ｘ切断点２（ＳＳＸ２）、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ－１）、腎臓ユビキタス１（ＲＵ１）、腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）、レグマイン、ヒト乳頭腫ウイルスＥ６（ＨＰＶ Ｅ６）、ヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶ Ｅ７）、腸管カルボキシルエステラーゼ、熱ショックタンパク質７０－２突然変異型（ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）、ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＡメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）、ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）、Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）、骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）、ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）、リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）、または免疫グロブリンλ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）、を含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）を含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、ＰＳＭＡを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍抗原は、メソセリンを含む。
【0163】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ミスフォールドタンパク質抗原またはタンパク質凝集体のタンパク質、例として目的の疾患／障害に特異的なタンパク質に結合する。いくつかの実施形態では、疾患／障害は、神経変性疾患／障害、炎症性疾患／障害、心血管疾患／障害、線維性疾患／障害、またはアミロイドーシス（例えば、免疫グロブリン軽鎖またはトランスサイレチンのタンパク質凝集体によって媒介される）である。いくつかの実施形態では、神経変性疾患／障害は、タウオパチー、アシンヌクレオパチー、初老期認知症、老人性認知症、アルツハイマー病（ベータアミロイドのタンパク質凝集体によって媒介される）、第１７染色体に関連するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、ピック病、原発性進行性失語症、前頭側頭型認知症、皮質基底型認知症、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体型認知症、ダウン症候群、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハラーフォルデン・シュパッツ症候群、ポリグルタミン病、トリヌクレオチドリピート病、家族性英国型認知症、致死性家族性不眠症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血（アイスランド型）（ＨＣＨＷ Ａ－Ｉ）、散発性致死性不眠症（ｓＦＩ）、可変プロテアーゼ感受性プリオン病（ＶＰＳＰｒ）、家族性デンマーク型認知症、及びプリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、ＣＪＤ、バリアント・クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）など）、からなる群から選択される。
【0164】
いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、またはそれらの任意の断片、例えばｓｃＦｖであるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、アプタマー、ダーピン（ｄａｒｐｉｎ）、センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、天然に存在する受容体もしくは合成受容体、アフィボディ、または他の改変タンパク質認識分子であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、哺乳動物抗体もしくはその断片であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、全体的または部分的に、ＣＡＲが最終的に使用される同じ種に由来する。例えば、ヒトで使用する場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
【0165】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲを含む、及び／または１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含む免疫細胞は、２つの抗原が存在することを必要とすることによって、オフターゲット及び／またはオンターゲット組織外効果を低減することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、二重特異性ＣＡＲを含み、及び／または１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含み、この場合、ＣＡＲは、単独では修飾細胞の活性化を媒介するには不十分であるが、一緒になると相乗的であり、修飾細胞の活性化を刺激する別個のシグナルを提供する。いくつかの実施形態では、そのような構成は、「ＡＮＤ」論理ゲートと称してもよい。
【0166】
いくつかの実施形態では、二重特異性ＣＡＲを含む、及び／または１つ以上の抗原結合ドメインを含む２つ以上の異なるＣＡＲを含む免疫細胞は、細胞の活性が刺激される前に、１つの抗原が存在し、第２の正常なタンパク質抗原は存在しないことを必要とすることによって、オフターゲット及び／またはオンターゲット組織外効果を低減することができる。いくつかの実施形態では、そのような構成は、「ＮＯＴ」論理ゲートと呼んでもよい。ＡＮＤゲートとは対照的に、ＮＯＴゲートＣＡＲ修飾細胞は、単一の抗原に結合することによって活性化される。しかし、第２の受容体の第２の抗原への結合は、ＣＡＲを介して永続化されている活性化シグナルを無効化するように機能する。典型的には、そのような阻害受容体は、正常組織では豊富に発現するが腫瘍組織には存在しない抗原を標的とする。
【0167】
ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、ヒト細胞外ヒンジドメインであるか、またはヒト細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞外ヒンジドメインは、ＣＤ８ａ細胞外ヒンジドメインまたはＩｇＧ４もしくはＣＤ２８細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、例えば、腫瘍抗原に対する最適なサイズ(例えば、阻害分子の排除を可能にする)、最適な柔軟性、最適なタンパク質フォールディング、最適なタンパク質の安定性、最適な結合、最適なホモ二量体化、及び/またはホモ二量体化の欠如など、ＣＡＲの物理化学的パラメーターを最適化する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、ヒト細胞外ヒンジドメインであるか、またはヒト細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞外ヒンジドメインは、ＣＤ８ａ細胞外ヒンジドメインまたはＩｇＧ４もしくはＣＤ２８細胞外ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ヒンジドメインは、例えば、腫瘍抗原に対する最適なサイズ(例えば、阻害分子の排除を可能にする)、最適な柔軟性、最適なタンパク質フォールディング、最適なタンパク質の安定性、最適な結合、最適なホモ二量体化、及び/またはホモ二量体化の欠如など、ＣＡＲの物理化学的パラメーターを最適化する。
【0168】
膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞外ドメインを細胞内ドメインに接続する膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの１つ以上の他のドメイン（複数可）と天然で関連している。いくつかの実施形態では、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、膜貫通ドメインを修飾して、他の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然に存在する源または合成源のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然に存在する膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒト膜貫通ドメインであるか、またはヒト膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ、ＴＲＬ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＲＬ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲγ、Ｖ／Ｉ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖ、ＳＩＲＰα、ＣＤ４５、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＰＤ１、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＫＩＲ－２ＤＬ、ＫＩＲ－３ＤＬ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ１７０、ＣＤ３３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３２ｂ、ＳＩＲＰβ、ＣＤ２２、ＰＩＲ－Ｂ、ＬＩＬＲＢ１、ＣＤ３６、またはＳｙｋ膜貫通ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、細胞外ドメインを細胞内ドメインに接続する膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの１つ以上の他のドメイン（複数可）と天然で関連している。いくつかの実施形態では、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるために、膜貫通ドメインを修飾して、他の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避することができる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然に存在する源または合成源のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然に存在する膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒト膜貫通ドメインであるか、またはヒト膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ、ＴＲＬ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＲＬ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲγ、Ｖ／Ｉ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖ、ＳＩＲＰα、ＣＤ４５、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＰＤ１、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＫＩＲ－２ＤＬ、ＫＩＲ－３ＤＬ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ１７０、ＣＤ３３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３２ｂ、ＳＩＲＰβ、ＣＤ２２、ＰＩＲ－Ｂ、ＬＩＬＲＢ１、ＣＤ３６、またはＳｙｋ膜貫通ドメインを含む。
【0169】
ＦｃＲ膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、ヒトＦｃＲ膜貫通ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、ヒトＦｃＲ膜貫通ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
【0170】
ＴＬＲ膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、ヒトＴＬＲ膜貫通ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、ヒトＴＬＲ膜貫通ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
【0171】
細胞内ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ヒト細胞内ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメイン及び／または他の細胞質ドメインは、ＣＡＲが発現する細胞（例えば、免疫細胞）の活性化に関与する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、当該ＣＡＲを含む免疫細胞におけるシグナル活性化及び／または伝達に関与する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、ヒト細胞内ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメイン及び／または他の細胞質ドメインは、ＣＡＲが発現する細胞（例えば、免疫細胞）の活性化に関与する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、当該ＣＡＲを含む免疫細胞におけるシグナル活性化及び／または伝達に関与する。
【0172】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、シグナル活性化及び／または伝達に関与する少なくとも１つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激分子及びシグナル伝達ドメインのうちの少なくとも１つであるか、またはそれらのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、二重シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、３つ以上のシグナル伝達ドメインを含む。
【0173】
いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、表面受容体の細胞質部分を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、免疫細胞においてシグナル伝達を開始するように作用する分子を含む。
【0174】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、１つ以上の共刺激分子、例として、ＣＤ３由来の少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、ＦｃイプシロンＲＩガンマ鎖、その任意の誘導体またはバリアント、同じ機能的能力を有するそれらの任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせ、の任意の部分を含む。
【0175】
ＦｃＲ細胞内ドメイン
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、ヒトＦｃＲ細胞内ドメインまたはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、ヒトＦｃＲ細胞内ドメインまたはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ３２ａ（ＦｃγＲＩＩａ）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃγＲＩＩｂ）、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＦｃεＲＩＩ、またはＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）ドメインを含む。
【0176】
ＴＬＲ細胞内ドメイン
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、ヒトＴＬＲ細胞内ドメインもしくはその一部であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、ヒトＴＬＲ細胞内ドメインもしくはその一部であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９ドメインを含む。
【0177】
シグナル伝達ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒト細胞内シグナル伝達ドメインもしくはその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
【0178】
いくつかの実施形態では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＦｃＲ γ、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ１６ａ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＤＤＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＡ１、ＩＮＳＲ、ｃＭＥＴ、ＭＵＳＫ、ＰＤＧＦＲ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＯＲ１、ＲＯＳ１、ＲＹＫ、ＴＩＥ２、ＴＲＫ、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ４０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＴＲＥＭ－１、ＴＲＥＭ－２、ＤＡＰ１２、ＭＲ、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、Ｖ／Ｉ／ＬｘＹｘｘＬ／Ｖ、ＳＩＲＰα、ＣＤ４５、Ｓｉｇｌｅｃ－１０、ＰＤ１、ＳＨＰ－１、ＳＨＰ－２、ＫＩＲ－２ＤＬ、ＫＩＲ－３ＤＬ、ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ１７０、ＣＤ３３、ＢＴＬＡ、ＣＤ３２ｂ、ＳＩＲＰβ、ＣＤ２２、ＰＩＲ－Ｂ、ＬＩＬＲＢ１、Ｓｙｋ、４１ＢＢリガンド（４１ＢＢＬ、ＴＮＦＳＦ９）、ＣＤ２７、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＭ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ２０６、ＣＤ１６３、ＣＤ２０９、デクチン－２、または１つ以上のサイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン（例えば、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ３Ｒ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８Ｒ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１１Ｒ、ＩＬ１２Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１４Ｒ、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＦＮａＲ、ＩＦＮｇＲ、ＴＮＦＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＦ２Ｒ、Ｄａｐ１０、ＣＤ３６、デクチン－１、またはＩＣＯＳＬ細胞内シグナル伝達ドメイン）、を含む。
【0179】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内ドメインは、二重シグナル伝達ドメイン、例として４１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＣＤ１１６受容体ベータ鎖、ＣＳＦ１－Ｒ、ＬＲＰ１／ＣＤ９１、ＳＲ－Ａ１、ＳＲ－Ａ２、ＭＡＲＣＯ、ＳＲ－ＣＬ１、ＳＲ－ＣＬ２、ＳＲ－Ｃ、ＳＲ－Ｅ、ＣＲ１、ＣＲ３、ＣＲ４、デクチン１、ＤＥＣ－２０５、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＣＤ１４、ＣＤ３６、ＬＯＸ－１、ＣＤ１１ｂを、上記の段落に列挙したシグナル伝達ドメインのいずれかと任意の組み合わせで含む。
【0180】
共刺激ドメイン
本明細書で使用される場合、「共刺激分子」または「共刺激ドメイン」は、初期刺激を高めるかまたは弱めるために使用される免疫細胞内の分子を指す。例えば、ＴＬＲなどの病原体関連パターン認識受容体またはＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸は、免疫細胞上の分子であり、それぞれ初期刺激を高めたり弱めたりする。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８６、共通ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、本明細書に記載の他の共刺激分子、それらの任意の誘導体、バリアント、または断片、同じ機能的能力を有する、共刺激分子の任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書で使用される場合、「共刺激分子」または「共刺激ドメイン」は、初期刺激を高めるかまたは弱めるために使用される免疫細胞内の分子を指す。例えば、ＴＬＲなどの病原体関連パターン認識受容体またはＣＤ４７／ＳＩＲＰα軸は、免疫細胞上の分子であり、それぞれ初期刺激を高めたり弱めたりする。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８６、共通ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、本明細書に記載の他の共刺激分子、それらの任意の誘導体、バリアント、または断片、同じ機能的能力を有する、共刺激分子の任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
【0181】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性であるドメインであり得る。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、特定の免疫細胞型（例えば、本明細書で提供される修飾免疫細胞）に対して内因性ではないドメインであり得る。
【0182】
本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル」は、免疫細胞上のＣＡＲの活性化などの一次シグナルと組み合わせて、免疫細胞の活性化をもたらすシグナルを指す。
【0183】
切断ペプチド
本明細書で使用される場合、切断ペプチドとは、細胞内で組換えタンパク質の切断を誘導することができるペプチドを指す。いくつかの実施形態では、切断ペプチドは２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、切断ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＴ２Ａペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つ以上の切断ペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸はまた、１つ以上の細胞内ドメインをコードする１つ以上の核酸配列、及び１つ以上のペプチド剤を含む１つ以上の核酸配列を含み、核酸の翻訳は、切断ペプチドによって１つ以上のペプチド剤から分離された１つ以上の細胞内ドメインを含むタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ＣＡＲをコードする１つ以上の核酸に作動可能に連結され、第２のプロモーターは、ペプチド剤をコードする１つ以上の核酸に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択で１つ以上のペプチド剤を含む核酸配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列をさらに含む。ＩＲＥＳ配列は、翻訳の開始を促進するｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始する任意のウイルス、染色体または人工的に設計された配列であり得る。
本明細書で使用される場合、切断ペプチドとは、細胞内で組換えタンパク質の切断を誘導することができるペプチドを指す。いくつかの実施形態では、切断ペプチドは２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、切断ペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＴ２Ａペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つ以上の切断ペプチドをコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、切断ペプチドをコードする核酸配列を含む核酸はまた、１つ以上の細胞内ドメインをコードする１つ以上の核酸配列、及び１つ以上のペプチド剤を含む１つ以上の核酸配列を含み、核酸の翻訳は、切断ペプチドによって１つ以上のペプチド剤から分離された１つ以上の細胞内ドメインを含むタンパク質をもたらす。いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ＣＡＲをコードする１つ以上の核酸に作動可能に連結され、第２のプロモーターは、ペプチド剤をコードする１つ以上の核酸に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び任意選択で１つ以上のペプチド剤を含む核酸配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列をさらに含む。ＩＲＥＳ配列は、翻訳の開始を促進するｍＲＮＡへのキャップ非依存性リボソーム結合を開始する任意のウイルス、染色体または人工的に設計された配列であり得る。
【0184】
ペプチド剤
本明細書で使用される場合、ペプチド剤は、免疫細胞においてＣＡＲと共発現するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ペプチド剤を、ＣＡＲの化学量論的バランス及び最適なシグナル伝達を確保するために、ＣＡＲと共発現させる。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、同一のペプチド剤とホモ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、異なるペプチド剤とヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つ以上のペプチド剤をコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、ＦｃＲガンマ鎖であるか、またはＦｃＲガンマ鎖を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、任意のペプチド、タンパク質、受容体、分泌抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、またはナノボディ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮ－γ、ＧＭＣＳＦ、またはＭＣＳＦのうちの１つ以上）、ＣＤ４０－Ｌ、ドミナントネガティブＳＩＲＰα、ドミナントネガティブＰＤ１、ドミナントネガティブＣＤ４５、ドミナントネガティブＳＩＧＬＥＣ１０、またはドミナントネガティブＬＩＬＲＢを含む。
本明細書で使用される場合、ペプチド剤は、免疫細胞においてＣＡＲと共発現するペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ペプチド剤を、ＣＡＲの化学量論的バランス及び最適なシグナル伝達を確保するために、ＣＡＲと共発現させる。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、同一のペプチド剤とホモ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、異なるペプチド剤とヘテロ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、１つ以上のペプチド剤をコードする１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、ＦｃＲガンマ鎖であるか、またはＦｃＲガンマ鎖を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、任意のペプチド、タンパク質、受容体、分泌抗体またはその断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、またはナノボディ）を含む。いくつかの実施形態では、ペプチド剤は、１つ以上のサイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦ－α、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮ－γ、ＧＭＣＳＦ、またはＭＣＳＦのうちの１つ以上）、ＣＤ４０－Ｌ、ドミナントネガティブＳＩＲＰα、ドミナントネガティブＰＤ１、ドミナントネガティブＣＤ４５、ドミナントネガティブＳＩＧＬＥＣ１０、またはドミナントネガティブＬＩＬＲＢを含む。
【0185】
Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメイン及びＦｃＲ細胞外ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの膜貫通ドメインはＦｃＲ膜貫通ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの細胞内ドメインはＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、１つ以上の細胞外結合ドメイン、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインのうちの１つ以上は、ヒトＦｃＲドメインであるか、またはヒトＦｃＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＦｃＲを構成する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＦｃＲの一部を構成する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインの一部を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメイン及びＦｃＲ細胞外ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの膜貫通ドメインはＦｃＲ膜貫通ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの細胞内ドメインはＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、１つ以上の細胞外結合ドメイン、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインのうちの１つ以上は、ヒトＦｃＲドメインであるか、またはヒトＦｃＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＦｃＲを構成する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメイン、ＦｃＲ膜貫通ドメイン、及びＦｃＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＦｃＲの一部を構成する。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞外ドメインは、全長ＦｃＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ膜貫通ドメインは、全長ＦｃＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＦｃＲ細胞内ドメインは、全長ＦｃＲ細胞内ドメインの一部を含む。
【0186】
Ｔｏｌｌ様抗原受容体（ＴＬＲ）
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメイン及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）細胞外ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの膜貫通ドメインはＴＬＲ膜貫通ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの細胞内ドメインはＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、１つ以上の細胞外結合ドメイン、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインのうちの１つ以上は、ヒトＴＬＲドメインであるか、またはヒトＴＬＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＴＬＲを構成する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＴＬＲの一部を構成する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインの一部を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原結合ドメイン及びＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）細胞外ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの膜貫通ドメインはＴＬＲ膜貫通ドメインを含み、及び／またはＣＡＲの細胞内ドメインはＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端まで、１つ以上の細胞外結合ドメイン、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインのうちの１つ以上は、ヒトＴＬＲドメインであるか、またはヒトＴＬＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＴＬＲを構成する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメイン、ＴＬＲ膜貫通ドメイン、及びＴＬＲ細胞内ドメインが一緒になって、全長ＴＬＲの一部を構成する。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞外ドメインは、全長ＴＬＲ細胞外ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ膜貫通ドメインは、全長ＴＬＲ膜貫通ドメインの一部を含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ細胞内ドメインは、全長ＴＬＲ細胞内ドメインの一部を含む。
【0187】
核酸コンストラクト
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたはその断片をコードする核酸分子を提供する。免疫細胞は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、外因性核酸分子）を含むことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲをコードする核酸分子は、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）を含む。
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたはその断片をコードする核酸分子を提供する。免疫細胞は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲをコードする核酸分子（例えば、外因性核酸分子）を含むことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣＡＲをコードする核酸分子は、（ａ）細胞外ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞外ドメイン）、（ｂ）膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載の膜貫通ドメイン）、及び（ｃ）細胞内ドメイン（例えば、本明細書に記載の細胞内ドメイン）を含む。
【0188】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、型によってはイントロン（複数可）を含み得る程度までイントロンを含み得る。「コードする」とは、定義されたヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）配列または定義されたアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおいて他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として働く、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどの、ポリヌクレオチドにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性ならびにそれに起因する生物学的特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって細胞または他の生体系においてタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり通常は配列表に示されるヌクレオチド配列であるコード鎖も、非コード鎖もともに、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として用いられ、タンパク質、またはその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。
【0189】
「作動可能に連結した」または「転写制御」という用語は、異種核酸配列の発現をもたらす、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は、互いに隣接することができ、２つのタンパク質コード領域を繋げることが必要な場合、同じリーディングフレームにある。
【0190】
本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたはその断片をコードする核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたはその断片をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物を含むか、またはそれである。いくつかの実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたはその断片をコードするＤＮＡコンストラクトを含むか、またはそれである。
【0191】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのすべてまたは断片は、例えば、細胞（例えば、哺乳動物細胞）における発現のために、コドン最適化核酸分子によってコードされる。例えば米国特許第５，７８６，４６４号及び第６，１１４，１４８号に開示されているように、様々なコドン最適化法が当技術分野で知られており、そのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0192】
本明細書に記載の核酸の発現は、ＣＡＲポリペプチドまたはその断片をコードする核酸を発現ベクターのプロモーターに作動可能に連結することによって達成することができる。例示的なプロモーター（例えば、構成的プロモーター）には、伸長因子－１αプロモーター（ＥＦ－１α）プロモーター、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）プロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、またはクレアチンキナーゼプロモーター、が含まれるが、これらに限定されない。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ベクターはまた、転写開始の頻度を制御するために、追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーを含むことができる。
【0193】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲまたはその断片をコードする核酸分子を含むベクターは、ウイルスベクターを含むか、またはウイルスベクターである。ウイルスベクター技術は当技術分野で周知であり、記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ２０１２， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ｖｏｌｕｍｅｓ １－４， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹにおいて）。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクター）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターはレンチウイルスベクターを含む（例えば、米国特許第９，１４９，５１９号または国際公開第ＷＯ２０１７／０４４４８７に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0194】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターを含む。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡを含むウイルスの大きな科である。アデノウイルスは、宿主の細胞機構を使用してウイルスのＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を合成しながら、宿主細胞の核内で複製を行う。アデノウイルスは、複製細胞及び非複製細胞の両方に影響を与えて、大型の導入遺伝子を収容すること、及び宿主細胞ゲノムに組み込まれることなくタンパク質をコードすることが当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、Ａｄ２ベクターまたはＡｄ５ベクター（例えば、Ａｄ５ｆ３５アデノウイルスベクター、例えば、ヘルパー依存性Ａｄ５Ｆ３５アデノウイルスベクター）を含む。
【0195】
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶ系は、一般に当技術分野でよく知られている（例えば、Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７（６）：１１１０－１７（１９９４）、Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（１３）：６０９４－９８（１９９２）、Ｃｕｒｉｅｌ，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎ，１３（２－３）：１４１－６４（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５８：９７－１２９（１９９２）、及びＡｓｏｋａｎ Ａ， ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２０（４）：６９９－７０８（２０１２）を参照のこと）。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを生成し、使用する方法は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記載されている。
【0196】
ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（例えば、ＡＡＶ３Ｂ）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、ならびにそのバリアントを含むいくつかのＡＡＶ血清型が特徴付けられている。一般に、任意のＡＡＶ血清型を使用して、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲを送達することができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、特定の組織に対する向性を有する。
【0197】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して高レベルの正確なゲノム編集を促進し、相同組換え（ＨＲ）中にドナー鋳型ＤＮＡとして機能することが最近示されている。
【0198】
いくつかの実施形態では、ベクターはガンマレトロウイルスベクターを含む（例えば、Ｔｏｂｉａｓ Ｍａｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．， “Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ” Ｖｉｒｕｓｅｓ． ２０１１ Ｊｕｎ；３（６）： ６７７－７１３、に記載のもの、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例示的なガンマレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）、及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）、ならびにそれらに由来するベクターが含まれる。
【0199】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲ、及び第２のＣＡＲ、例えば本明細書に記載の異なるＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び第２のＣＡＲをコードする２つ以上の核酸配列は、単一の核酸分子によって、例えば、同じフレーム内で単一のポリペプチド鎖としてコードされる。いくつかの実施形態では、２つ以上のＣＡＲは、１つ以上の切断ペプチド部位（例えば、自動切断部位または細胞内プロテアーゼの基質）によって分離されている。特定の実施形態では、切断ペプチドは、ブタテスコウイルス－１（Ｐ２Ａ）ペプチド、ゾセアアジグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａ型ウイルス（Ｅ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）ペプチド、またはそのバリアントを含む。
【0200】
いくつかの実施形態では、ベクターは、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載の少なくとも１つのＣＡＲをコードする少なくとも１つの核酸配列、及び、ＣＡＲ、例えば本明細書に記載のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ、ＩＬ－１２、ＩＦＮ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、及び／またはＩＬ－１）または本明細書に記載の刺激リガンド（例えば、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０））、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ－Ｌ、ＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及び／またはＢ７－Ｈ３リガンド）と共発現する少なくとも１つの遺伝子をコードする少なくとも１つの核酸を含む。
【0201】
医薬組成物
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【0202】
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、１つ以上の修飾ｍＲＮＡであって、修飾ヌクレオチド、５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に対する改変、キャップ構造、ポリＡテール、またはそれらの組み合わせを含む、１つ以上の修飾ｍＲＮＡ、及び１つ以上のＲＮａｓｅＬ阻害剤を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＡＧＣａｐ１またはｍ６ＡＧＣａｐ１キャップ構造を含む１つ以上の修飾ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、シュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）、またはＮ１－メチル－シュードウリジン（Ｎ１ｍＰｓＵ）を含む修飾ヌクレオチドを含む１つ以上の修飾ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、スニチニブを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＡＢＣＥ１を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ｍ６－ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージを含み、ｍＲＮＡはＣＡＲをコードし、マクロファージはＩＦＮ－βとともに培養され、ＩＦＮ－βとともにマクロファージを培養すると、同一のｍＲＮＡでトランスフェクトされたがＩＦＮ－βとともに培養されていないマクロファージと比較して、ＣＡＲ発現、ＣＡＲ持続性、ＣＡＲマクロファージ機能、Ｍ１表現型、Ｍ２誘導因子に対する耐性、またはそれらの組み合わせが向上する。
【0203】
「治療有効量」、「免疫学的有効量」、「抗免疫応答有効量」、または「免疫応答阻害有効量」が示されている場合、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、免疫応答、及び状態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。
【0204】
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、もしくはマンニトールなどの炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、またはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化物質、ＥＤＴＡやグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、血清及び凍結防止剤などの防腐剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、医薬組成物は汚染物質を実質的に含まない、例えば、検出可能なレベルの汚染物質（例えばエンドトキシン）は存在しない。
【0205】
本明細書に記載の医薬組成物は、治療または予防すべき疾患、障害、または状態に適した様式で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患、障害、または状態のタイプ及び重症度などの要因によって決定されるが、適切な投与量は臨床試験によって決定され得る。
【0206】
本明細書に記載の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体の剤形、例として、液体溶液（例えば、注射用及び注入用溶液）、分散液または懸濁液、リポソーム、及び座薬などが含まれる。好ましい組成物は、注射用または注入用溶液であり得る。本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、経動脈、または腹腔内投与用に製剤化することができる。
【0207】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内）投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内注入または注射用に製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、筋肉内または皮下注射用に製剤化される。本明細書に記載の医薬組成物は、免疫療法で一般に公知の注入技術を使用して投与するために製剤化することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄ． ３１９：１６７６， １９８８、を参照のこと、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0208】
本発明で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口的に投与された」という用語は、通常は注射または注入による、経腸及び局所投与以外の投与様式を指し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、腫瘍内、及び胸骨内注射及び注入を含むがこれらに限定されない。
【0209】
本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は、約１０４～約１０９細胞／ｋｇ体重（例えば、約１０５～約１０６細胞／ｋｇ体重）の投与量で投与することができ、これらの範囲内のすべての整数値を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）の用量は、少なくとも約１×１０６、約１．１×１０６、約２×１０６、約３．６×１０６、約５×１０６、１×１０７、約１．８×１０７、約２×１０７、約５×１０７、約１×１０８、約２×１０８、約５×１０８、約１×１０９、約２×１０９、または約５×１０９細胞を含む。本明細書に記載の医薬組成物は、ある特定の投与量で複数回投与することもできる。特定の患者に最適な投与量及び治療レジーム（ｒｅｇｉｍｅ）は、患者を疾患、障害、または状態の徴候について監視し、適宜に治療を調整することによって、当業者によって容易に決定され得る。
【0210】
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を対象に投与し、続いて血液を再採取し（またはアフェレーシスを実施し）、収集した免疫細胞を活性化し、活性化された免疫細胞を対象に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、複数回、例えば数週間ごとに実行することができる。免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、約１０ｃｃから約４００ｃｃまでの採血から活性化することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、約２０ｃｃ、約３０ｃｃ、約４０ｃｃ、約５０ｃｃ、約６０ｃｃ、約７０ｃｃ、約８０ｃｃ、約９０ｃｃ、または約１００ｃｃの採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載の複数回の採血及び再注入を含む方法を、ある特定の免疫細胞集団に対して選択することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、第２の治療と組み合わせて（例えば、前、同時、または後に）投与される。例えば、第２の治療法には、抗ウイルス療法（例えば、シドフォビル、インターロイキン－２、シタラビン（ＡＲＡ－Ｃ）、またはナタリズマブ）、キメラ抗原受容体－Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）－Ｔ細胞療法、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、ＦＫ５０６抗体、またはグルココルチコイド）、アンタゴニスト（例えば、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニスト、ＣＤ４７アンタゴニスト、ＳＩＲＰαアンタゴニスト、ＣＤ４０アゴニスト、ＣＳＦ１／ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト、またはＳＴＩＮＧアゴニストのうちの１つ以上）、または免疫除去剤（例えば、抗ＣＤ５２抗体（例えば、アレムツズマブ）、抗ＣＤ３抗体、サイトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、または照射）、が含まれるが、これらに限定されない。
【0211】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、化学療法剤（例えば、フルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはリツキサン）を使用する骨髄移植またはリンパ球除去療法と組み合わせて（例えば、その前、それと同時、またはその後に）投与される。ある特定の実施形態では、対象は、高用量化学療法による標準治療とその後の末梢血幹細胞移植を受ける。ある特定の実施形態では、移植後、対象は、本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物の注入を受ける。本明細書に記載の医薬組成物は、手術前または手術後に投与することができる。
【0212】
対象に投与される任意の前述の療法の投与量は、治療される疾患、障害、または状態により、また特定の対象に基づいて、変化する。ヒトへの投与のための投与量のスケーリングは、当技術分野で認められている慣行に従って行うことができる。例えば、アレムツズマブの用量は、一般に、成人に対して約１ｍｇ～約１００ｍｇであり、通常、約１日～約３０日の間の期間、毎日投与され、例えば、１日あたり約１ｍｇ～約１０ｍｇの日用量である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１２０，７６６号に記載されているように）。
【0213】
治療方法
本開示は、とりわけ、対象における疾患または障害（例えば、本明細書に記載の疾患または障害）を治療する方法であって、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を送達することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物の治療有効量を、疾患または障害を有する対象に投与する。本明細書に記載の医薬組成物は、対象の疾患もしくは障害を治療するため、または対象の免疫応答を刺激するための医薬の製造に使用するためのものであり得る。
本開示は、とりわけ、対象における疾患または障害（例えば、本明細書に記載の疾患または障害）を治療する方法であって、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を送達することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物の治療有効量を、疾患または障害を有する対象に投与する。本明細書に記載の医薬組成物は、対象の疾患もしくは障害を治療するため、または対象の免疫応答を刺激するための医薬の製造に使用するためのものであり得る。
【0214】
本明細書に記載の方法で治療される対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒト（例えば、本明細書に記載の疾患もしくは障害を有する、または有するリスクのある患者）であり得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）は、対象に関して自己由来、同種異系、または異種であり得る。本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載の投与レジメンに従って、単独で、または１つ以上の治療剤、手順、または治療方針と組み合わせて対象に投与することができる。
【0215】
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物は、腫瘍またはがんに関連する疾患、神経変性疾患または障害、炎症性疾患または障害、心血管疾患または障害、線維性疾患または障害、アミロイドーシスに関連する疾患、及びそれらの組み合わせ、を治療または予防するために使用することができる。
【0216】
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を用いて、対象のがんまたは腫瘍を治療する（例えば、低減させる、阻害する、またはその進行を遅延させることのうちの１つ以上）方法が提供される。対象は、がんの成人型または小児型を有する可能性がある。がんは、初期、中期、もしくは後期段階にあるか、または転移性がんであり得る。がんとしては、固形腫瘍、血液癌（例えば、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫などの骨髄腫）、または転移病変を挙げることができるが、これらに限定されない。固形腫瘍の例としては、種々の器官系の悪性腫瘍、例えば、肉腫及び癌腫、例えば、腺癌、例として、肺、乳房、卵巣、リンパ系、胃腸（例えば結腸）、肛門、生殖器及び尿生殖路（例えば、腎臓、尿路上皮、膀胱細胞、前立腺）、咽頭、ＣＮＳ（例えば、脳、神経またはグリア細胞）、頭頸部、皮膚（例えば、黒色腫、例えば皮膚黒色腫）、膵臓、及び骨（例えば、脊索腫）を侵すものなど、が挙げられる。
【0217】
いくつかの実施形態では、がんは、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮及び／または非扁平上皮組織に関する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、またはＮＳＣＬＣ腺癌）、または小細胞肺癌（ＳＣＬＣ））、皮膚癌（例えば、メルケル細胞癌または黒色腫（例えば、進行性黒色腫））、卵巣癌、中皮腫、膀胱癌、軟部組織肉腫（例えば、血管周囲細胞腫（ＨＰＣ））、骨癌（骨肉腫）、腎臓癌（例えば、腎癌（例えば、腎細胞癌））、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、胆管癌、肉腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、前立腺癌、乳癌（例えば、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、またはＨｅｒ２／ｎｅｕの１つ、２つまたはすべてを発現しない乳癌、例えば、トリプルネガティブ乳癌）、大腸癌（例えば、再発性大腸癌または転移性大腸癌、例えば、マイクロサテライト不安定性大腸癌、マイクロサテライト安定性大腸癌、ミスマッチ修復熟練（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）大腸癌、またはミスマッチ修復欠損大腸癌）、鼻咽頭癌、十二指腸癌、子宮内膜癌、膵臓癌、頭頸部癌（例えば、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ））、肛門癌、胃食道癌、甲状腺癌（例えば、甲状腺未分化癌）、子宮頸癌（例えば、子宮頸部扁平上皮細胞癌）、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）（例えば、非定型肺カルチノイド腫瘍））、リンパ増殖性疾患（例えば、移植後リンパ増殖性疾患）、リンパ腫（例えば、Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫）、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫）、または白血病（例えば、骨髄性白血病またはリンパ性白血病）、から選択される。
【0218】
いくつかの実施形態では、がんは、脳腫瘍、例えば膠芽腫、神経膠肉腫、または再発性脳腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、膵臓癌、例えば、進行膵臓癌である。いくつかの実施形態では、がんは、皮膚癌、例えば、黒色腫（例えば、ステージＩＩ～ＩＶ黒色腫、ＨＬＡ－Ａ２陽性黒色腫、切除不能黒色腫、または転移性黒色腫）、またはメルケル細胞癌である。いくつかの実施形態では、がんは、腎癌、例えば腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、転移性腎細胞癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、例えば転移性乳癌またはステージＩＶ乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。いくつかの実施形態では、がんは、ウイルス関連癌である。いくつかの実施形態では、がんは、肛門管癌（例えば、肛門管の扁平上皮癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、子宮頸癌（例えば、子宮頸部の扁平上皮癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、胃癌（例えば、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）陽性胃癌、または胃癌もしくは胃食道接合部癌）である。いくつかの実施形態では、がんは、頭頸部癌（例えば、ＨＰＶ陽性及び陰性頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ））である。いくつかの実施形態では、がんは、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）である。いくつかの実施形態では、がんは、大腸癌、例えば、再発性大腸癌、転移性大腸癌、例えば、マイクロサテライト不安定性大腸癌、マイクロサテライト安定性大腸癌、ミスマッチ修復熟練大腸癌、またはミスマッチ修復欠損大腸癌、である。
【0219】
いくつかの実施形態では、がんは、血液癌である。いくつかの実施形態では、がんは、白血病、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性白血病、または急性白血病である。いくつかの実施形態では、がんは、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫、リンパ球性リンパ腫、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）（例えば、再発性もしくは難治性ＨＬまたはＤＬＢＣＬ）である。いくつかの実施形態では、がんは、骨髄腫、例えば多発性骨髄腫である。
【0220】
本明細書に記載の免疫細胞（例えば、マクロファージ、単球、または樹状細胞）を含む医薬組成物を使用して、対象における免疫応答を増強または調節することができる。一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、対象（例えば、本明細書に記載の疾患もしくは障害を有する、またはそのリスクがある対象）における免疫応答を増強、刺激、または増加させる。ある特定の実施形態では、対象は、免疫不全であるか、またはそのリスクがある。例えば、対象は、化学療法及び／または放射線療法を受けているかまたは受けたことがある。
【0221】
いくつかの実施形態では、対象は、炎症性障害（例えば、慢性または急性炎症性障害）を発症しているか、または発症するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象は、自己免疫疾患もしくは障害を発症しているか、または発症するリスクがある。本明細書に記載の方法で治療することができる例示的な自己免疫疾患としては、アルツハイマー病、喘息（例えば、気管支喘息）、アレルギー（例えば、アトピー性アレルギー）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、アテローム性動脈硬化症、ベーチェット病、セリアック病、心筋症、クローン病、肝硬変、糖尿病、糖尿病性網膜症、湿疹、線維筋痛症、線維筋炎、糸球体腎炎、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ギラン・バレー症候群、溶血性貧血、多発性硬化症、重症筋無力症、変形性関節症、多発性軟骨炎、乾癬、関節リウマチ、敗血症、脳卒中、血管炎、人工呼吸器誘発性肺損傷、移植拒絶、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、白斑、またはウェゲナー肉芽腫症、が挙げられるが、これらに限定されない。
【0222】
本明細書に記載の医薬組成物の投与は、任意の都合のよい方法（例えば、注射、摂取、輸液、吸入、埋込み、または移植）で行うことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、注射または注入によって投与される。本明細書に記載の医薬組成物は、患者に、経動脈、皮下、静脈内、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、または腹腔内投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内に）投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、筋肉内または皮下注射によって投与される。本明細書に記載の医薬組成物は、対象の炎症部位、局所疾患部位、リンパ節、臓器、腫瘍、または感染部位に直接注射することができる。
【0223】
本開示は、以下の実施例によってさらに説明される。本実施例は、説明のみを目的として提供されている。それらの実施例は、本開示の範囲または内容を何らかの形で限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【0224】
以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物をどのように作製及び使用するかを当業者に説明するために提供され、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。
【0225】
方法
マクロファージへの単球の分化
本開示の例示的な方法では、正常なドナーのアフェレーシス由来のロイコパックを、Ｅｌｕｔｒａ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ）を使用する水簸、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）もしくはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する細胞分離に供して、赤血球、血小板、リンパ球、及び顆粒球を減少させた。製造業者の指示に従って、水簸を使用して単球を濃縮するか、またはＭＡＣＳ ＣＤ１４＋選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して正の選択を行った。フローサイトメトリーを使用して、選択前及び選択後（正及び負の画分）の純度及び生存率を試験した。選択されたＣＤ１４＋単球は、最長７日間でマクロファージに分化した。分化したマクロファージを５～７日目に採取し、凍結培地で凍結保存するか、未処理で実験に使用した。場合によっては、細胞を、単球状態で選択後に利用した。
マクロファージへの単球の分化
本開示の例示的な方法では、正常なドナーのアフェレーシス由来のロイコパックを、Ｅｌｕｔｒａ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ）を使用する水簸、またはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）もしくはＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｌｕｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する細胞分離に供して、赤血球、血小板、リンパ球、及び顆粒球を減少させた。製造業者の指示に従って、水簸を使用して単球を濃縮するか、またはＭＡＣＳ ＣＤ１４＋選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して正の選択を行った。フローサイトメトリーを使用して、選択前及び選択後（正及び負の画分）の純度及び生存率を試験した。選択されたＣＤ１４＋単球は、最長７日間でマクロファージに分化した。分化したマクロファージを５～７日目に採取し、凍結培地で凍結保存するか、未処理で実験に使用した。場合によっては、細胞を、単球状態で選択後に利用した。
【0226】
エレクトロポレーション
本開示の例示的な方法では、未処理のまたは解凍したヒトマクロファージを解凍し、エレクトロポレーションの１日前に３７℃で一晩培養した。マクロファージを収集し、ＰＢＳで洗浄した。生細胞は、ＮＣ２００で計数した。Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してトランスフェクトされたマクロファージの場合、１ｅ＋６個のマクロファージあたり５０ｎＭ～３００ｎＭのｍＲＮＡを、氷上でエレクトロポレーション緩衝液中で混合した。マクロファージには、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍまたはＭａｘｃｙｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を氷上で１０分間保持した。細胞を収集し、計数し、さらに使用するためにマクロファージ培養培地で培養した。その後、細胞をプレートに移し、回収のために３７℃で１５分間静置した。さらなる使用のために、マクロファージ培養培地を含む６ウェルプレートに細胞をプレーティングした。
本開示の例示的な方法では、未処理のまたは解凍したヒトマクロファージを解凍し、エレクトロポレーションの１日前に３７℃で一晩培養した。マクロファージを収集し、ＰＢＳで洗浄した。生細胞は、ＮＣ２００で計数した。Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用してトランスフェクトされたマクロファージの場合、１ｅ＋６個のマクロファージあたり５０ｎＭ～３００ｎＭのｍＲＮＡを、氷上でエレクトロポレーション緩衝液中で混合した。マクロファージには、Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍまたはＭａｘｃｙｔｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を氷上で１０分間保持した。細胞を収集し、計数し、さらに使用するためにマクロファージ培養培地で培養した。その後、細胞をプレートに移し、回収のために３７℃で１５分間静置した。さらなる使用のために、マクロファージ培養培地を含む６ウェルプレートに細胞をプレーティングした。
【0227】
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ）または類似の試薬を使用して、生存率を評価した。さらに、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して、細胞生存率を評価した。
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ）または類似の試薬を使用して、生存率を評価した。さらに、ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して、細胞生存率を評価した。
【0228】
初代ヒトマクロファージは、２段階染色プロトコル：ヒトＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２タンパク質－Ｈｉｓタグ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ、１０００４－Ｈ０８Ｈ－１００）一次染色、続いてＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２）及び抗－ＨｉｓタグＡＰＣ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＩＣ０５０Ａ）二次染色、を使用して、ＣＡＲ－ＨＥＲ２発現について試験した。ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２３０２）を、単球、マクロファージ、またはＦｃ受容体を発現する単球細胞株のＦＡＣＳ染色に使用した。マクロファージの純度は、以下のパネル：抗ＣＤ１１ｂ ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０１３０６）、抗ＣＤ１４ ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０１８３８）、抗ＣＤ３ ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１１－００３８－４２）、抗ＣＤ１９ ＰＥ－ＣＹ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５－０１９８－４２）、抗ＣＤ６６ｂ ＰｅｒＣＰ－ＣＹ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５１０８）、抗ＣＤ５６ ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１８３３４）、及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ（Ｌ／Ｄ ａｑｕａ）Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｌ３４９５７）、を使用して試験した。分化のための播種前に、ＣＤ１４ ＭＡＣＳ選択後の単球純度を試験するために、同じパネルを使用した。初代ヒトマクロファージのＭ１／Ｍ２マーカーは、以下のパネル：抗ＣＤ１１Ｂ ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０１３０６）、抗ＣＤ８０ ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５２２５）、抗ＣＤ８６ ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５４４０）、抗ＣＤ２０６ ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３２１１２６）、抗ＣＤ１６３ ＡＰＣ－ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３３６２２）、抗ＨＬＡ－ＤＲ ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０７６４２）、抗ＨＬＡ ＡＢＣ ＰＥ／ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１１４３０）、及びＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット、で検出された。
【0229】
機能アッセイ
標的がん細胞とＣＡＲマクロファージの共培養
ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ ＧＦＰを安定に発現するＨＥＲ２＋乳癌細胞（ＣＲＬ２３５１）またはＨＥＲ２＋卵巣癌細胞（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ ＃４４７５）などの標的細胞を使用した。以下に記載するように、ＣＡＲによって標的とされる同族抗原を発現する追加の細胞株を評価した。ＣＡＲマクロファージを、示された期間、示された比率で標的細胞と共培養した。インビトロでの抗腫瘍効果を定量化するために、約１時間ごとに培養ウェルの緑色蛍光強度を監視するＩｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、標的がん細胞の相対数を測定した。ＣＡＲマクロファージの抗腫瘍活性を、対照マクロファージまたは標的細胞単独と比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、データをグラフ化し、統計分析を実行した。
標的がん細胞とＣＡＲマクロファージの共培養
ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｇｒｅｅｎ ＧＦＰを安定に発現するＨＥＲ２＋乳癌細胞（ＣＲＬ２３５１）またはＨＥＲ２＋卵巣癌細胞（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ ＃４４７５）などの標的細胞を使用した。以下に記載するように、ＣＡＲによって標的とされる同族抗原を発現する追加の細胞株を評価した。ＣＡＲマクロファージを、示された期間、示された比率で標的細胞と共培養した。インビトロでの抗腫瘍効果を定量化するために、約１時間ごとに培養ウェルの緑色蛍光強度を監視するＩｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、標的がん細胞の相対数を測定した。ＣＡＲマクロファージの抗腫瘍活性を、対照マクロファージまたは標的細胞単独と比較した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、データをグラフ化し、統計分析を実行した。
【0230】
インターフェロン（ＩＦＮ）によるＣＡＲマクロファージの処理
ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション後、マクロファージを、１０～３００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、またはＩＦＮ－γ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むマクロファージ培養培地で、示されているように４～２４時間培養した。示された時間の後、ＩＦＮ含有培地を洗い流した。さらなる分析のために、ＩＦＮ感作ＣＡＲマクロファージを使用した。
ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション後、マクロファージを、１０～３００ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、またはＩＦＮ－γ（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含むマクロファージ培養培地で、示されているように４～２４時間培養した。示された時間の後、ＩＦＮ含有培地を洗い流した。さらなる分析のために、ＩＦＮ感作ＣＡＲマクロファージを使用した。
【0231】
炎症誘発性因子によるＣＡＲマクロファージの処理
ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション後、２ｅ＋６個のマクロファージを、様々な濃度の炎症誘発性メディエーターを含むマクロファージ培養培地で培養した。典型的な炎症誘発性メディエーターには以下が含まれる：４～４８時間の、ＴＬＲ１／２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、ＬＰＳ－ＥＫ標準（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２由来のリポ多糖））、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、ＦＬＡ－ＳＴ標準）（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリン））、ＴＬＲ６／２アゴニスト（例えば、ＦＳＬ－１）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、ｓｓＲＮＡ４０／ＬｙｏＶｅｃ）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、ＩＦＮ－γ ２０ｎｇ／ｍＬ、ＴＮＦ－α ２０ｎｇ／ｍＬ、β－グルカン、組換えヒトＣＤ４０リガンド、組換えヒト４１ＢＢリガンド、組換えヒト４１ＢＢ受容体、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｃＧＡＳアゴニスト、及びその他の炎症誘発性メディエーター（サイトカイン、アゴニスト、抗体、小分子、ペプチド）。示された時間後に培地を洗い流し、感作ＣＡＲマクロファージをさらなる分析に使用した。
ＣＡＲ ｍＲＮＡのトランスフェクション後、２ｅ＋６個のマクロファージを、様々な濃度の炎症誘発性メディエーターを含むマクロファージ培養培地で培養した。典型的な炎症誘発性メディエーターには以下が含まれる：４～４８時間の、ＴＬＲ１／２アゴニスト（例えば、Ｐａｍ３ＣＳＫ４）、ＴＬＲ３アゴニスト（例えば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ４アゴニスト（例えば、ＬＰＳ－ＥＫ標準（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２由来のリポ多糖））、ＴＬＲ５アゴニスト（例えば、ＦＬＡ－ＳＴ標準）（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のフラジェリン））、ＴＬＲ６／２アゴニスト（例えば、ＦＳＬ－１）、ＴＬＲ７アゴニスト（例えば、イミキモド）、ＴＬＲ８アゴニスト（例えば、ｓｓＲＮＡ４０／ＬｙｏＶｅｃ）、ＴＬＲ９アゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、ＩＦＮ－γ ２０ｎｇ／ｍＬ、ＴＮＦ－α ２０ｎｇ／ｍＬ、β－グルカン、組換えヒトＣＤ４０リガンド、組換えヒト４１ＢＢリガンド、組換えヒト４１ＢＢ受容体、ＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ１２、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ｃＧＡＳアゴニスト、及びその他の炎症誘発性メディエーター（サイトカイン、アゴニスト、抗体、小分子、ペプチド）。示された時間後に培地を洗い流し、感作ＣＡＲマクロファージをさらなる分析に使用した。
【0232】
マクロファージ表現型の評価（Ｍ１／Ｍ２）
初代ヒトマクロファージのＭ１／Ｍ２マーカーは、以下のパネル：抗ＣＤ１１Ｂ ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０１３０６）、抗ＣＤ８０ ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５２２５）、抗ＣＤ８６ ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５４４０）、抗ＣＤ２０６ ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３２１１２６）、抗ＣＤ１６３ ＡＰＣ－ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３３６２２）、抗ＨＬＡ－ＤＲ ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０７６４２）、抗ＨＬＡ ＡＢＣ ＰＥ／ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１１４３０）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット、で検出された。サイトカイン産生（ＩＬ１２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１ｂ、ＭＣＰ－１、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、及びその他のヒトサイトカイン）を、製造元の推奨に従ってＭＳＤ機器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、下記のように処理されたマクロファージ（対照またはＣＡＲ）から収集された上清で評価した。場合によっては、マクロファージを、示されたエフェクター対標的比で抗原担持標的細胞と共培養した。
初代ヒトマクロファージのＭ１／Ｍ２マーカーは、以下のパネル：抗ＣＤ１１Ｂ ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０１３０６）、抗ＣＤ８０ ＢＶ６０５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５２２５）、抗ＣＤ８６ ＢＶ７１１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５４４０）、抗ＣＤ２０６ ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３２１１２６）、抗ＣＤ１６３ ＡＰＣ－ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３３３６２２）、抗ＨＬＡ－ＤＲ ＢＶ７８５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０７６４２）、抗ＨＬＡ ＡＢＣ ＰＥ／ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１１４３０）、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット、で検出された。サイトカイン産生（ＩＬ１２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１ｂ、ＭＣＰ－１、ＩＬ１０、ＩＬ４、ＩＬ１３、及びその他のヒトサイトカイン）を、製造元の推奨に従ってＭＳＤ機器（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用して、下記のように処理されたマクロファージ（対照またはＣＡＲ）から収集された上清で評価した。場合によっては、マクロファージを、示されたエフェクター対標的比で抗原担持標的細胞と共培養した。
【0233】
ｍＣｈｅｒｒｙ発現の検出
ヒト単球またはマクロファージにおける蛍光レポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙのトランスフェクション効率、発現の持続性、及び発現の強度を、示された期間、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でリアルタイムライブ顕微鏡を使用して評価した。
ヒト単球またはマクロファージにおける蛍光レポーター遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙのトランスフェクション効率、発現の持続性、及び発現の強度を、示された期間、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）でリアルタイムライブ顕微鏡を使用して評価した。
【0234】
スニチニブによるマクロファージの処理
マクロファージを、ｍＲＮＡエレクトロポレーションまたはトランスフェクションの前に、０～１０μＭのスニチニブ（ＲＮＡｓｅ－Ｌ阻害剤）で２時間処理した。コード化導入遺伝子の発現レベル及び発現の持続性を、上記の方法を用いて評価した。
マクロファージを、ｍＲＮＡエレクトロポレーションまたはトランスフェクションの前に、０～１０μＭのスニチニブ（ＲＮＡｓｅ－Ｌ阻害剤）で２時間処理した。コード化導入遺伝子の発現レベル及び発現の持続性を、上記の方法を用いて評価した。
【0235】
リアルタイムＰＣＲ
コード化導入遺伝子（ＣＡＲなど）のリアルタイムＰＣＲは、標準的な方法を使用して実行した。手短に言えば、Ａｍｂｉｏｎ ＲｉｂｏＰｕｒｅ ＲＮＡ精製キット（ＡＭ１９２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＲＮＡを単離し、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（１７０８８４１、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して逆転写させた。定量的ＰＣＲでは、鋳型ｃＤＮＡ、プライマー、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎプライマー／プローブ、及びＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（４３６９０１６、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造元の指示に従って使用した。
コード化導入遺伝子（ＣＡＲなど）のリアルタイムＰＣＲは、標準的な方法を使用して実行した。手短に言えば、Ａｍｂｉｏｎ ＲｉｂｏＰｕｒｅ ＲＮＡ精製キット（ＡＭ１９２４、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＲＮＡを単離し、ＲＴ－ｑＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（１７０８８４１、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して逆転写させた。定量的ＰＣＲでは、鋳型ｃＤＮＡ、プライマー、Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎプライマー／プローブ、及びＴａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（４３６９０１６、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造元の指示に従って使用した。
【0236】
ＣＡＲ発現の持続時間の決定
フローサイトメトリー
本開示の例示的な方法では、５０，０００個のＣＡＲマクロファージを９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ発現を測定するために、Ｈｉｓタグ付き組換えＨＥＲ２タンパク質を、ＢＳＡを補充したＰＢＳなどの緩衝液とともに細胞に加え、インキュベートした。次いで、細胞を３００×ｇで５分間スピンダウンし、次いで上清を除去した。次に、ＰＢＳ中で５分間、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ４２２３０２）などのＦｃブロッキング溶液を使用して、Ｆｃ受容体をブロックした。Ｆｃブロッキングに続いて、細胞生存率及び他の表面マーカー用の染色を行うことができる。例えば、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＬ３４９５７）を使用して、細胞の生存率を決定することができる。さらに、ＨｉｓタグＡＰＣコンジュゲート抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＩＣ０５０Ａ）などの抗Ｈｉｓ抗体を加えた。ＣＡＲの発現を、フローサイトメトリーによって、すなわち、最初に単一細胞集団のゲーティング、続いて生細胞の選択、最後に細胞のＡＰＣ蛍光の測定によって決定した。ＣＡＲを発現する細胞は、抗Ｈｉｓ抗体にさらされていない対照細胞よりもＡＰＣチャネルで明るくなる。ＣＡＲ陽性細胞の明るさは発現の程度を決定し、経時的に繰り返し測定することでＣＡＲの発現を経時的に追跡することができた。
フローサイトメトリー
本開示の例示的な方法では、５０，０００個のＣＡＲマクロファージを９６ウェルプレートのウェルにプレーティングした。抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ発現を測定するために、Ｈｉｓタグ付き組換えＨＥＲ２タンパク質を、ＢＳＡを補充したＰＢＳなどの緩衝液とともに細胞に加え、インキュベートした。次いで、細胞を３００×ｇで５分間スピンダウンし、次いで上清を除去した。次に、ＰＢＳ中で５分間、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ４２２３０２）などのＦｃブロッキング溶液を使用して、Ｆｃ受容体をブロックした。Ｆｃブロッキングに続いて、細胞生存率及び他の表面マーカー用の染色を行うことができる。例えば、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＬ３４９５７）を使用して、細胞の生存率を決定することができる。さらに、ＨｉｓタグＡＰＣコンジュゲート抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログＩＣ０５０Ａ）などの抗Ｈｉｓ抗体を加えた。ＣＡＲの発現を、フローサイトメトリーによって、すなわち、最初に単一細胞集団のゲーティング、続いて生細胞の選択、最後に細胞のＡＰＣ蛍光の測定によって決定した。ＣＡＲを発現する細胞は、抗Ｈｉｓ抗体にさらされていない対照細胞よりもＡＰＣチャネルで明るくなる。ＣＡＲ陽性細胞の明るさは発現の程度を決定し、経時的に繰り返し測定することでＣＡＲの発現を経時的に追跡することができた。
【0237】
免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡法
本開示の例示的な方法では、細胞を、ガラススライド上で適切に培養した。次に培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次に、４％パラホルムアルデヒドまたはメタノールを使用して、細胞を固定した。固定液中でのインキュベーション時間は、固定液の独自性に依存していた。適切な時間が経過したら、固定液を除去し、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄した。細胞内染色が必要な場合は、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログＢＰ１５１－１００）で細胞をインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中のＢＳＡなどのブロッキング溶液を細胞に加え、６０分間ブロッキングさせた。次にブロッキング溶液を除去し、細胞を洗浄した。製造元の指示に従って蛍光色素コンジュゲート抗体を希釈し、細胞に一晩結合させた。次に抗体溶液を除去し、細胞を洗浄した。最後に、ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＰ３６９６６）などの封入溶液を細胞に適用し、カバーガラスをその上に置いた。これを、イメージングの前に２４時間乾燥させた。イメージングは、蛍光顕微鏡を介して実行した。ＣＡＲを発現する細胞は、フルオロフォアの適切なチャネルで、ＣＡＲを発現していない細胞よりも明るかった。
本開示の例示的な方法では、細胞を、ガラススライド上で適切に培養した。次に培地を除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次に、４％パラホルムアルデヒドまたはメタノールを使用して、細胞を固定した。固定液中でのインキュベーション時間は、固定液の独自性に依存していた。適切な時間が経過したら、固定液を除去し、細胞を再度ＰＢＳで３回洗浄した。細胞内染色が必要な場合は、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログＢＰ１５１－１００）で細胞をインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。次いで、ＰＢＳ中のＢＳＡなどのブロッキング溶液を細胞に加え、６０分間ブロッキングさせた。次にブロッキング溶液を除去し、細胞を洗浄した。製造元の指示に従って蛍光色素コンジュゲート抗体を希釈し、細胞に一晩結合させた。次に抗体溶液を除去し、細胞を洗浄した。最後に、ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＰ３６９６６）などの封入溶液を細胞に適用し、カバーガラスをその上に置いた。これを、イメージングの前に２４時間乾燥させた。イメージングは、蛍光顕微鏡を介して実行した。ＣＡＲを発現する細胞は、フルオロフォアの適切なチャネルで、ＣＡＲを発現していない細胞よりも明るかった。
【0238】
ＲＴ－ＰＣＲ
本開示の例示的な方法では、マクロファージを溶解し、製造業者の説明書に従って１ステップキットＲＴＰＣＲキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１１７３２－０２０）を使用して、ＲＮＡを収集した。ＣＡＲに特異的なプライマーをアッセイに使用した。ＣＡＲのｍＲＮＡを含むマクロファージは、ＲＴＰＣＲアッセイでシグナルを示したが、形質導入されていないマクロファージはシグナルを示した。
本開示の例示的な方法では、マクロファージを溶解し、製造業者の説明書に従って１ステップキットＲＴＰＣＲキット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）ワンステップｑＲＴ－ＰＣＲキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ１１７３２－０２０）を使用して、ＲＮＡを収集した。ＣＡＲに特異的なプライマーをアッセイに使用した。ＣＡＲのｍＲＮＡを含むマクロファージは、ＲＴＰＣＲアッセイでシグナルを示したが、形質導入されていないマクロファージはシグナルを示した。
【0239】
ＣＡＲエフェクター細胞機能の決定
本開示の例示的な方法では、ＣＡＲ導入遺伝子を、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または化学修飾ｍＲＮＡ）によるエレクトロポレーション／トランスフェクションを介して、またはレンチウイルス、アデノウイルスまたは代替ウイルスベクターによるウイルス形質導入を介して、単球またはマクロファージに導入した。ＣＡＲの発現を、フローサイトメトリー、リアルタイムＰＣＲ、または蛍光顕微鏡による抗原特異的染色を使用して確認する。これらの技術は、ＣＡＲの発現の強度及び速度論を決定するためにも使用することができる。マクロファージの表面に発現するＣＡＲコンストラクトを、標的陽性細胞株に対する腫瘍食作用アッセイ及び／または腫瘍殺傷アッセイにおける活性について試験する。標的細胞の食作用及び／または殺傷を引き起こすコンストラクトを、サイトカイン分泌、ケモカイン分泌、免疫細胞動員能力、表現型変化（すなわち、Ｍ１／Ｍ２への自己分極）、及びＴ細胞刺激／抗原提示機能について試験した。
本開示の例示的な方法では、ＣＡＲ導入遺伝子を、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または化学修飾ｍＲＮＡ）によるエレクトロポレーション／トランスフェクションを介して、またはレンチウイルス、アデノウイルスまたは代替ウイルスベクターによるウイルス形質導入を介して、単球またはマクロファージに導入した。ＣＡＲの発現を、フローサイトメトリー、リアルタイムＰＣＲ、または蛍光顕微鏡による抗原特異的染色を使用して確認する。これらの技術は、ＣＡＲの発現の強度及び速度論を決定するためにも使用することができる。マクロファージの表面に発現するＣＡＲコンストラクトを、標的陽性細胞株に対する腫瘍食作用アッセイ及び／または腫瘍殺傷アッセイにおける活性について試験する。標的細胞の食作用及び／または殺傷を引き起こすコンストラクトを、サイトカイン分泌、ケモカイン分泌、免疫細胞動員能力、表現型変化（すなわち、Ｍ１／Ｍ２への自己分極）、及びＴ細胞刺激／抗原提示機能について試験した。
【0240】
食作用アッセイ
フロー食作用アッセイ（細胞）
本開示の例示的な方法において、標的陽性腫瘍細胞及び標的陰性腫瘍細胞は、製造者の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＣ３４５５４）で標識化されるか、または細胞は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現するように操作された。次に、ＣＡＲ発現マクロファージ及び対照マクロファージを、マクロファージ：腫瘍細胞比１：１でＵ底９６ウェルプレートにプレーティングし、４時間培養した。インキュベーションの終わりに、細胞をウェルから取り出し、フローサイトメトリー用に染色した。パネルには、生存率色素及びマクロファージ特異的マーカー、例としてＣＤ１１ｂが含まれていた。生細胞をゲーティングすると、ＣＤ１１ｂ／ＣＦＳＥ二重陽性である細胞は、細胞を貪食したと推定されるマクロファージであった。ＣＡＲマクロファージは、ＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、標的陽性腫瘍細胞とともに培養すると、二重陽性細胞のパーセンテージが増加するはずである。標的ベースの食作用の特異性は、標的に対して陰性の細胞で培養された対照マクロファージを使用して試験した。
フロー食作用アッセイ（細胞）
本開示の例示的な方法において、標的陽性腫瘍細胞及び標的陰性腫瘍細胞は、製造者の指示に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）ＣＦＳＥ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＣ３４５５４）で標識化されるか、または細胞は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現するように操作された。次に、ＣＡＲ発現マクロファージ及び対照マクロファージを、マクロファージ：腫瘍細胞比１：１でＵ底９６ウェルプレートにプレーティングし、４時間培養した。インキュベーションの終わりに、細胞をウェルから取り出し、フローサイトメトリー用に染色した。パネルには、生存率色素及びマクロファージ特異的マーカー、例としてＣＤ１１ｂが含まれていた。生細胞をゲーティングすると、ＣＤ１１ｂ／ＣＦＳＥ二重陽性である細胞は、細胞を貪食したと推定されるマクロファージであった。ＣＡＲマクロファージは、ＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、標的陽性腫瘍細胞とともに培養すると、二重陽性細胞のパーセンテージが増加するはずである。標的ベースの食作用の特異性は、標的に対して陰性の細胞で培養された対照マクロファージを使用して試験した。
【0241】
フロー食作用アッセイ（ビーズ）
本開示の例示的な方法では、ポリスチレンビーズをＣＡＲの標的または無関係のタンパク質で機能化した。さらに、これらのビーズを、ｐＨ反応性色素であるｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ、ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＰ３６６００）で標識化した。酸性化すると、色素の蛍光レベルが上昇した。次に、ビーズを、ＣＡＲマクロファージ及び形質導入されていないマクロファージとともに培養した。一定期間後、マクロファージを取り出し、フローサイトメトリー用に、生存率色素及びマクロファージ特異的マーカー、例としてＣＤ１１ｂを使用して染色した。生細胞をゲーティングすると、ＣＤ１１ｂ／ｐＨｒｏｄｏ二重陽性である細胞は、ビーズを貪食したと推定されるマクロファージと考えられた。ＣＡＲマクロファージは、ＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、標的陽性ビーズとともに培養すると、二重陽性細胞のパーセンテージが増加するはずである。標的ベースの食作用の特異性は、標的に対して陰性のビーズで培養された対照マクロファージを使用して試験した。
本開示の例示的な方法では、ポリスチレンビーズをＣＡＲの標的または無関係のタンパク質で機能化した。さらに、これらのビーズを、ｐＨ反応性色素であるｐＨｒｏｄｏ（商標）Ｒｅｄ、ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＰ３６６００）で標識化した。酸性化すると、色素の蛍光レベルが上昇した。次に、ビーズを、ＣＡＲマクロファージ及び形質導入されていないマクロファージとともに培養した。一定期間後、マクロファージを取り出し、フローサイトメトリー用に、生存率色素及びマクロファージ特異的マーカー、例としてＣＤ１１ｂを使用して染色した。生細胞をゲーティングすると、ＣＤ１１ｂ／ｐＨｒｏｄｏ二重陽性である細胞は、ビーズを貪食したと推定されるマクロファージと考えられた。ＣＡＲマクロファージは、ＣＡＲを含まないマクロファージと比較して、標的陽性ビーズとともに培養すると、二重陽性細胞のパーセンテージが増加するはずである。標的ベースの食作用の特異性は、標的に対して陰性のビーズで培養された対照マクロファージを使用して試験した。
【0242】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（細胞）
本開示の例示的な方法では、ＧＦＰのような蛍光タンパク質を発現する標的陽性腫瘍細胞を、９６ウェルプレートにおいてＣＡＲマクロファージ及び形質導入されていないマクロファージとともに培養した。エフェクターマクロファージと標的腫瘍細胞との間の比率を、０：１Ｅ：Ｔである標的細胞のみの対照の他に、１０：１Ｅ：Ｔから１：１０Ｅ：Ｔまで変化させた。マクロファージの数は、ウェルあたり１０ｅ３マクロファージで一定に保った。４時間ごとに経時的な蛍光の変化を測定して、培養中に発生した腫瘍細胞の殺傷量を決定した。さらに、画像分析技術を使用して、培養物中のマクロファージの位置を決定し、腫瘍細胞を貪食したマクロファージの数を決定した。
本開示の例示的な方法では、ＧＦＰのような蛍光タンパク質を発現する標的陽性腫瘍細胞を、９６ウェルプレートにおいてＣＡＲマクロファージ及び形質導入されていないマクロファージとともに培養した。エフェクターマクロファージと標的腫瘍細胞との間の比率を、０：１Ｅ：Ｔである標的細胞のみの対照の他に、１０：１Ｅ：Ｔから１：１０Ｅ：Ｔまで変化させた。マクロファージの数は、ウェルあたり１０ｅ３マクロファージで一定に保った。４時間ごとに経時的な蛍光の変化を測定して、培養中に発生した腫瘍細胞の殺傷量を決定した。さらに、画像分析技術を使用して、培養物中のマクロファージの位置を決定し、腫瘍細胞を貪食したマクロファージの数を決定した。
【0243】
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（ビーズ）
本開示の例示的な方法では、ＣＡＲのタンパク質標的を担持するｐＨｒｏｄｏ機能化ビーズを、９６ウェルプレートのウェル内のＣＡＲマクロファージ及び形質導入されていないマクロファージの両方に加えた。マクロファージをウェルあたり２０ｅ３の濃度でプレーティングし、ビーズを５：１のビーズ対マクロファージ比で加える。ｐＨｒｏｄｏの蛍光を、３０分ごとに５時間測定した。最初の時点と１時間の時点との間の蛍光の増加の比率を使用して、発生した食作用の量を決定した。ＣＡＲマクロファージは、形質導入されていない対照よりも蛍光の変化が大きいと予想された。
本開示の例示的な方法では、ＣＡＲのタンパク質標的を担持するｐＨｒｏｄｏ機能化ビーズを、９６ウェルプレートのウェル内のＣＡＲマクロファージ及び形質導入されていないマクロファージの両方に加えた。マクロファージをウェルあたり２０ｅ３の濃度でプレーティングし、ビーズを５：１のビーズ対マクロファージ比で加える。ｐＨｒｏｄｏの蛍光を、３０分ごとに５時間測定した。最初の時点と１時間の時点との間の蛍光の増加の比率を使用して、発生した食作用の量を決定した。ＣＡＲマクロファージは、形質導入されていない対照よりも蛍光の変化が大きいと予想された。
【0244】
マウスモデル
異種移植マウスモデル
本開示の例示的な方法では、ＮＳＧＳ（ＮＳＧ－ＳＧＭ３）マウスに対し、腹膜癌腫症をモデル化するために、腹腔内投与を介して、ＨＥＲ２＋ヒト卵巣癌であるＳＫＯＶ３でチャレンジした。マウスを、ＩＦＮ－β感作がある場合及びない場合（または陰性対照）において、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたヒトＣＡＲマクロファージで処理した。腫瘍量を、生物発光イメージングを介して監視した。
異種移植マウスモデル
本開示の例示的な方法では、ＮＳＧＳ（ＮＳＧ－ＳＧＭ３）マウスに対し、腹膜癌腫症をモデル化するために、腹腔内投与を介して、ＨＥＲ２＋ヒト卵巣癌であるＳＫＯＶ３でチャレンジした。マウスを、ＩＦＮ－β感作がある場合及びない場合（または陰性対照）において、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたヒトＣＡＲマクロファージで処理した。腫瘍量を、生物発光イメージングを介して監視した。
【0245】
同系マウスモデル
ＢＡＬＢ－Ｃ免疫適格マウスに、皮下注射により、ＨＥＲ２＋大腸癌のモデルであるＣＴ２６－ＨＥＲ２を移植した。腫瘍が移植されると、マウスを、ＩＦＮ－β感作がある場合及びない場合（または陰性対照）において、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージで処理した。腫瘍量を、腫瘍塊のキャリパー測定によって監視した。
ＢＡＬＢ－Ｃ免疫適格マウスに、皮下注射により、ＨＥＲ２＋大腸癌のモデルであるＣＴ２６－ＨＥＲ２を移植した。腫瘍が移植されると、マウスを、ＩＦＮ－β感作がある場合及びない場合（または陰性対照）において、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージで処理した。腫瘍量を、腫瘍塊のキャリパー測定によって監視した。
【0246】
実施例１：初代ヒトマクロファージにおける発現及び生存率に対するｍＲＮＡ修飾の効果
ドナーマクロファージ（ＨＣ１５３４４４及び／またはＨＣ１５６３０８）をＣＤ１４＋単球から分化させ、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションまたはトランスフェクションした。ｍＣｈｅｒｒｙｍ ＲＮＡには、ＡＧＣａｐ１、ｍ６ＡＧＣａｐ１、または抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含むバリアントキャップ構造、及びシュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、または５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）を含む修飾ヌクレオチドなどの例示的な修飾が含まれていた。ｍＲＮＡ発現及び細胞生存率を、トランスフェクション後１日目または１５日目にＦＡＣＳによって検出した。
ドナーマクロファージ（ＨＣ１５３４４４及び／またはＨＣ１５６３０８）をＣＤ１４＋単球から分化させ、ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションまたはトランスフェクションした。ｍＣｈｅｒｒｙｍ ＲＮＡには、ＡＧＣａｐ１、ｍ６ＡＧＣａｐ１、または抗リバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）を含むバリアントキャップ構造、及びシュードウリジン（ＰｓＵ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、または５－メチルシチジン／シュードウリジン（５ｍｅＣ ＰｓＵ）を含む修飾ヌクレオチドなどの例示的な修飾が含まれていた。ｍＲＮＡ発現及び細胞生存率を、トランスフェクション後１日目または１５日目にＦＡＣＳによって検出した。
【0247】
ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡバリアントは、エレクトロポレーションした場合、マクロファージの生存率に影響を及ぼさなかったが、ｍＲＮＡをトランスフェクションしたマクロファージの生存率は、バリアントに応じて３６％から７０％の範囲であった（図１Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞のパーセンテージは、エレクトロポレーションされた細胞ではほぼ１００％、トランスフェクトされた細胞では７０～９０％であった（データは示していない）。ｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度（細胞あたりに発現するｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の数を表す）は、ｍＲＮＡ修飾及びトランスフェクト方法に依存していた（図１Ｂ）。ＡＧＣａｐ１は、エレクトロポレーションされた細胞でより大きなｍＣｈｅｒｒｙ強度を生成したが、ＰｓＵ修飾及びＨＰＬＣ精製により、トランスフェクトされた細胞でより大きなｍＣｈｅｒｒｙ強度が生成された。
【0248】
図１Ｃに示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ ＲＮＡの持続性は、ｍＲＮＡ修飾及び使用したｍＲＮＡ送達方法に依存していた。ｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡは、エレクトロポレーションされたマクロファージと比較して、トランスフェクトされたマクロファージでより長く持続した。ＡＧＣａｐ１を含むｍＲＮＡは、エレクトロポレーションされた細胞でｍ６ＡＧＣａｐ１ ｍＲＮＡよりも良好に持続した。ＨＰＬＣ精製は、エレクトロポレーションされた細胞よりもトランスフェクトされた細胞に大きな影響を与えた。
【0249】
実施例２：マクロファージの生存率に対するＣＡＲ ｍＲＮＡ修飾の効果
ドナーマクロファージ（ＨＣ１５３４４４）をＣＤ１４＋単球から分化させ、マクロファージをエレクトロポレーションまたはトランスフェクションを用いてＣＡＲをコードするｍＲＮＡ（ＣＡＲ ｍＲＮＡ）をトランスフェクトした。ＨＥＲ２細胞外ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードするｍＲＮＡを使用した。ＣＡＲ発現及び細胞生存率は、１日目にＦＡＣＳによって検出した。
ドナーマクロファージ（ＨＣ１５３４４４）をＣＤ１４＋単球から分化させ、マクロファージをエレクトロポレーションまたはトランスフェクションを用いてＣＡＲをコードするｍＲＮＡ（ＣＡＲ ｍＲＮＡ）をトランスフェクトした。ＨＥＲ２細胞外ドメイン及びＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードするｍＲＮＡを使用した。ＣＡＲ発現及び細胞生存率は、１日目にＦＡＣＳによって検出した。
【0250】
図２Ａに示されるように、ｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたマクロファージの例示的な生存率は、評価されたすべてのｍＲＮＡ修飾について＞８０％であった。Ｖｉｒｏｍｅｒ ｍＲＮＡをトランスフェクションしたマクロファージは、ほとんどのＣＡＲ発現マクロファージ及び未処理マクロファージで＞９０％の生存率を示したが、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むｍＲＮＡならびに５ｍｏＵ修飾を含むｍＲＮＡをトランスフェクションしたマクロファージの生存率は６５％であった。さらに、図２Ｂに示すように、エレクトロポレーションされたマクロファージでは、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡによって、ＣＡＲ発現が最も高くなった。ｍＲＮＡをトトランスフェクションしたマクロファージでは、ｍ６ＡＧＣａｐ１、Ｎ１ｍＰｓＵ、及び／またはＰｓＵ修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡによって、ＣＡＲ発現が最も高くなった。図２Ｃに示すように、ｍＲＮＡ５’Ｃａｐからｍ６ＡＧＣａｐ１への最適化、及びウラシルからシュードウラシル（ＰｓＵ）への修飾により、ヒトマクロファージでのＣＡＲ発現が約３倍増加した。
【0251】
実施例３：マクロファージ機能に対するＣＡＲ ｍＲＮＡ修飾の効果
ヒトマクロファージをＣＤ１４＋単球から分化させ、マクロファージにＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ（ＣＡＲ ｍＲＮＡ）をエレクトロポレーションした。エフェクター（ＣＡＲマクロファージ）と標的（がん細胞）の比率が５：１になるように、ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしてから２日後に、蛍光標識化ＨＥＲ２＋乳癌細胞（ＣＲＬ２３５１）を、ＣＡＲマクロファージと共培養した。
ヒトマクロファージをＣＤ１４＋単球から分化させ、マクロファージにＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡ（ＣＡＲ ｍＲＮＡ）をエレクトロポレーションした。エフェクター（ＣＡＲマクロファージ）と標的（がん細胞）の比率が５：１になるように、ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしてから２日後に、蛍光標識化ＨＥＲ２＋乳癌細胞（ＣＲＬ２３５１）を、ＣＡＲマクロファージと共培養した。
【0252】
図３Ａに示されるように、ｍ６ＡＧＣａｐ１ＰｓＵ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージは、Ａｄ５ｆ３５を形質導入したマクロファージに匹敵する強力な殺傷活性を示した。ｍ６ＡＧＣａｐ１ＰｓＵ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージは、５ｍｏＵ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージと比較して、最高の標的細胞殺傷活性を示した（図３Ｂ～３Ｄ）。これらの結果はまた、最適化ｍＲＮＡ修飾をトランスフェクトしたマクロファージは、標的（がん細胞）に対するエフェクター（ＣＡＲ－Ｍ）の比率が低くても、抗腫瘍活性がより高いことを示している。
【0253】
実施例４：Ｍ１分極はｍＲＮＡの持続性及びマクロファージ／ＣＡＲ－マクロファージ機能を強化する
ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ヒトマクロファージにエレクトロポレーションした。Ｍ１表現型を誘導するサイトカイン、例としてＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＦＮ－ガンマプラスリポ多糖（ＬＰＳ）、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６、またはＳＴＩＮＧリガンド（ＳＴＩＮＧ－Ｌ）とともに、細胞を最長４８時間培養し、その後サイトカインを洗い流し、新しい培地を加えた。ＣＡＲ発現及びＭ１マーカー発現は、トランスフェクション後２日目及び７日目に測定した。マクロファージがトランスフェクトされた２日後に、蛍光標識化ＨＥＲ２＋乳癌細胞（ＣＲＬ２３５１）を、ＨＥＲ２ ＣＡＲマクロファージと共培養した。がん細胞の増殖は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で４時間ごとに蛍光を介して監視した。エフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率は５：１であった。
ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ヒトマクロファージにエレクトロポレーションした。Ｍ１表現型を誘導するサイトカイン、例としてＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＩＦＮ－ガンマ、ＩＦＮ－ガンマプラスリポ多糖（ＬＰＳ）、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－６、またはＳＴＩＮＧリガンド（ＳＴＩＮＧ－Ｌ）とともに、細胞を最長４８時間培養し、その後サイトカインを洗い流し、新しい培地を加えた。ＣＡＲ発現及びＭ１マーカー発現は、トランスフェクション後２日目及び７日目に測定した。マクロファージがトランスフェクトされた２日後に、蛍光標識化ＨＥＲ２＋乳癌細胞（ＣＲＬ２３５１）を、ＨＥＲ２ ＣＡＲマクロファージと共培養した。がん細胞の増殖は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で４時間ごとに蛍光を介して監視した。エフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率は５：１であった。
【0254】
図４Ａに示すように、試験したインターフェロンサイトカインは、２日目にＣＡＲトランスフェクトマクロファージの生存率の低下をもたらさなかった。驚くべきことに、ＩＦＮ－βで処理されたマクロファージは、対照培地、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－γで処理されたマクロファージよりも高いＣＡＲ発現を示した（図４Ｂ）。図４Ｃに示すように、インターフェロンサイトカインでマクロファージを処理しても、７日目にＣＡＲトランスフェクトマクロファージの生存率の低下をもたらさなかった。驚くべきことに、ＩＦＮ－βで処理されたマクロファージは、対照培地、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－γで処理されたマクロファージよりも高いＣＡＲ発現を示した、すなわち、ＩＦＮ－βが、ヒトマクロファージにおけるＣＡＲなどのｍＲＮＡコード導入遺伝子の発現期間を改善することを示している（図４Ｄ）。さらに、ｍＲＮＡをトランスフェクトしたＣＡＲマクロファージをＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、またはＩＦＮ－γで処理すると、Ｍ１表現型が誘導され（ＣＤ８６発現に基づく、図４Ｅ）、Ｍ２マーカーが減少した（ＣＤ１６３発現に基づく、図４Ｆ）。ＩＦＮ－βは、評価されたインターフェロンのうちの最も強いＭ１表現型をもたらし、Ｍ１表現型は処理後少なくとも７日間持続した（図４Ｅ）。
【0255】
実施例５：ＣＡＲ発現、ＣＡＲマクロファージ機能、Ｍ１表現型マーカー及びサイトカイン産生に対するＩＦＮ処理の効果
インターフェロン処理が、異なる修飾を含むｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージに異なる影響を与えるかどうかを決定するために、５つの異なるｍＲＮＡ修飾も試験した。異なるｍＲＮＡ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ヒトマクロファージにエレクトロポレーションした。ＣＡＲ発現及びＭ１マーカーは、エレクトロポレーション後４日目にフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）によって検出した。次に、４日目のＣＡＲマクロファージ細胞を、Ｎｕｃ－Ｌｉｇｈｔ標識化ＨＥＲ２＋乳癌細胞株（ＣＲＬ２３５１）と、エフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率５：１で共培養した。がん細胞の増殖を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で４時間ごとに蛍光を介して監視した。
インターフェロン処理が、異なる修飾を含むｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージに異なる影響を与えるかどうかを決定するために、５つの異なるｍＲＮＡ修飾も試験した。異なるｍＲＮＡ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ヒトマクロファージにエレクトロポレーションした。ＣＡＲ発現及びＭ１マーカーは、エレクトロポレーション後４日目にフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）によって検出した。次に、４日目のＣＡＲマクロファージ細胞を、Ｎｕｃ－Ｌｉｇｈｔ標識化ＨＥＲ２＋乳癌細胞株（ＣＲＬ２３５１）と、エフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率５：１で共培養した。がん細胞の増殖を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で４時間ごとに蛍光を介して監視した。
【0256】
図５Ａに示されるように、ＩＦＮ－β処理をした場合またはしない場合において、すべての評価された化学物質をトランスフェクトしたマクロファージは、高い生存率を示した。ＡＧＣａｐ１またはｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵまたはＮ１ｍＰｓＵ修飾ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージは、発現のレベルが最も高く、ＩＦＮ－βによって、４日目のすべての修飾についてＣＡＲを発現する細胞のパーセンテージがわずかに改善された（図５Ｂ）。しかし、ＩＦＮ－β処理により、評価されたすべてのｍＲＮＡ修飾のＣＡＲ ＭＦＩに基づいて、細胞あたりに発現するＣＡＲの数が著しく増加し、ｍ６ＡＧＣａｐ１／ＰｓＵ共修飾ｍＲＮＡの発現が最も高くなった（図５Ｃ）。
【0257】
ＣＡＲ持続性に対するＩＦＮ－βの影響をさらに評価するために、ＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするｍ６ＡＧＣａｐ１／ＰｓＵ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたヒトマクロファージを、２日目及び７日目に評価した。ＩＦＮ－β処理によって、ＩＦＮ－βで処理されていないＣＡＲマクロファージと比較して、７日目にＣＡＲ発現率が大幅に改善された（図６）。
【0258】
ＣＡＲ発現の改善に対するＩＦＮ－β処理の効果を検証し、ＩＦＮ－β濃度を最適化するために、Ｍ６ＡＧＣａｐ１／ＰｓＵ修飾ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージを、０、３、１０、３０、または１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－βで４時間処理し、エレクトロポレーション後４日目及び７日目に、生存率、ＣＡＲパーセンテージ、及びＣＡＲ ＭＦＩを評価した。ヒトマクロファージによるＣＡＲ発現に対するＩＦＮ－β用量依存効果が観察された（図７Ａ）。実施例４に記載したように、ＣＡＲマクロファージをＩＦＮ－βで処理するとＭ１表現型が誘導されたので、効果が用量依存的であるかどうかを決定するためにさらなる実験を行った。図７Ｂに示すように、Ｍ１マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲの誘導は、ＩＦＮ－βの用量依存的であった。
【0259】
マクロファージ表現型は可塑性があると考えられており、ＩＬ－１０などの免疫抑制性サイトカインはＭ２表現型を誘導することが知られていることを考慮して、ＩＦＮ－β処理または未処理ＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡトランスフェクトマクロファージに対するＩＬ－１０処理の影響を評価した。ＩＦＮ－β処理ＣＡＲマクロファージはＩＬ－１０の影響に抵抗し、Ｍ２マーカーＣＤ１６３を発現しなかったが、代わりにＭ１マーカーＣＤ８６の発現を、ＩＬ－１０による処理後４８時間（図８Ａ）、及び処理後７日間保持した（図８Ｂ）。ＩＦＮ－β感作ＣＡＲマクロファージは、他のＭ２誘導因子にも抵抗した。
【0260】
ＩＦＮ－βによる感作を伴うかまたは伴わない場合で、ＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージの抗腫瘍機能を評価するために、形質導入されていない（ＵＴＤ）マクロファージまたはＣＡＲマクロファージを、０、３、１０、３０、または１００ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－βで４時間または２０時間感作した。次に、これらのエフェクター細胞を、ＨＥＲ２＋乳癌細胞株ＣＲＬ２３５１－ＧＦＰと、３：１または１．５：１のエフェクター対標的比で共培養し、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡を使用してＧＦＰ発現に基づいて抗腫瘍活性を測定した。ＩＦＮ－β感作により、ＣＡＲマクロファージが、がん細胞を殺傷する能力が改善した（図９Ａ）。ＩＦＮ－β処理が修飾を含むｍＲＮＡでＣＡＲマクロファージの抗腫瘍活性を改善したかどうかを評価するために、ＩＦＮ－β処理を伴うかまたは伴わない場合で、独自の修飾を含むｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたマクロファージの抗腫瘍活性を評価した。ＩＦＮ－β処理によって、５ｍｏＵ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたものを除くすべてのＣＡＲマクロファージの抗腫瘍活性が改善された（図９Ｂ）。改善されたｍＲＮＡトランスフェクトＣＡＲマクロファージの抗腫瘍効果がすべてのインターフェロンに普遍的であるかまたはインターフェロンベータのみに普遍的であるかどうかを評価するために、Ｍ６ＡＧＣａｐ１／ＰｓＵ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたマクロファージを、ＩＦＮ－アルファ、ベータ、またはガンマで処理し、それらのがん細胞殺傷能力を評価した。ＩＦＮ－βで処理されたＣＡＲマクロファージには、ＩＦＮ－αまたはＩＦＮ－γよりも大きな効果があり、がん細胞殺傷が最も高かった（図９Ｃ）。
【0261】
マクロファージのインターフェロン処理が他の抗腫瘍機能を改善するかどうかを評価するために、ＨＥＲ２＋乳癌細胞との共培養後のインターフェロン処理または未処理ｍＲＮＡトランスフェクトＨＥＲ２ ＣＡＲマクロファージのサイトカイン分泌を評価した。ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含む１５０ｎＭ ＨＥＲ２ ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ヒトマクロファージにエレクトロポレーションした。ＨＥＲ２＋乳癌細胞（ＣＲＬ２３５１）を、マクロファージにＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトした後、３：１のエフェクター（ＣＡＲマクロファージ）対標的（がん細胞）の比率でＣＡＲマクロファージと共培養した。がん細胞とマクロファージを共培養してから４８時間後に上清を収集し、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）装置を使用してサイトカインレベルを測定した。図１０に示すように、マクロファージをＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、またはＩＦＮ－γで処理すると、マクロファージからのサイトカインＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦαの分泌が増加した。
【0262】
インターフェロンによる処理がマクロファージにおけるＣＡＲ ｍＲＮＡの持続性をさらに改善できるかどうか、及びＣＡＲマクロファージの機能性を拡張できるかどうかを決定するために、追加の研究を実施した。ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含む３００ｎＭ ＣＡＲ ｍＲＮＡを、ヒトマクロファージにエレクトロポレーションした。細胞を２０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮとともに２４時間培養した後、細胞を洗浄してサイトカインを除去した。ＣＡＲ発現を、トランスフェクション後２日目にフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）によって検出した。次に、細胞を、Ｎｕｃ－Ｌｉｇｈｔ標識化ＨＥＲ２＋乳癌細胞株（ＣＲＬ２３５１）と、エフェクター対標的の比率３：１で共培養した。がん細胞の増殖を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で蛍光を介して監視した。マクロファージにおけるＣＡＲ発現及びＭ１マーカーは、トランスフェクション後７日目にフローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）によって検出した。
【0263】
図１１Ａに示されるように、ＣＡＲ ｍＲＮＡによるトランスフェクションの２日後、ＣＡＲマクロファージの生存率及びＣＡＲ発現は、ＩＦＮ－γで処理されたマクロファージを除いて非常に高かった。さらに、図１１Ｂ及び図１１Ｃに示すように、ＩＦＮ処理によって、ＣＡＲマクロファージの標的細胞殺傷活性が高まった。図１１Ｃは、がん細胞とマクロファージを７２時間共培養した後の標的細胞の殺傷を示す。ＩＦＮによる処理はまた、マクロファージの生存率、ＣＡＲの発現、Ｍ１マーカーの発現、及びＣＡＲマクロファージの機能に影響を与えた。図１２Ａに示すように、トランスフェクトされたマクロファージをＩＦＮ－βで処理すると、インターフェロンで処理されなかったマクロファージと比較して、細胞生存率、ＨＥＲ２ ＣＡＲの発現、及びＭ１マーカーＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲの発現が７日後の時点で増加していた。図１２Ａは、すべてのマクロファージが７日目に高い生存率を示していたが、ＩＦＮ－βで処理されたマクロファージでは、有意差でＣＡＲの発現レベルが最も高かったことを示す。図１２Ｂは、エレクトロポレーションの７日後にがん細胞殺傷アッセイで試験されたすべてのＣＡＲマクロファージのうち、ＩＦＮ－βで処理されたマクロファージでは、がん殺傷レベルが最も高かった（腫瘍増殖の減少が最も大きい）ことを示している。マクロファージをエレクトロポレーションした７日後、マクロファージを標的がん細胞と７２時間共培養した。図１２Ｃに示すように、すべてのインターフェロンは、インターフェロンで処理されていないＣＡＲマクロファージと比較して、ＣＡＲマクロファージのがん細胞殺傷活性を改善した。
【0264】
実施例６：トランスフェクトされたマクロファージはＩＦＮγに対して感受性がある
ヒトマクロファージに、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵまたはＮ１ｍＰｓＵ修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、次いで異なる用量のＩＦＮ－γで１日間培養した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で監視した。図１３Ａに示すように、マクロファージにｍＲＮＡをトランスフェクトすると、ＩＦＮ－γによってｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの発現が減少した。
ヒトマクロファージに、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵまたはＮ１ｍＰｓＵ修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡをトランスフェクトし、次いで異なる用量のＩＦＮ－γで１日間培養した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で監視した。図１３Ａに示すように、マクロファージにｍＲＮＡをトランスフェクトすると、ＩＦＮ－γによってｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡの発現が減少した。
【0265】
インビトロ転写ｍＲＮＡは、種々のエンドソーム自然免疫受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、ＴＬＲ７、及びＴＬＲ８）及び細胞質自然免疫受容体（プロテインキナーゼＲＮＡ活性化（ＰＫＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉタンパク質（ＲＩＧ－Ｉ）、メラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）及び２’－５’－オリゴアデニル酸シンターゼ（ＯＡＳ））によって認識されることが以前に示されている。これらの異なる経路を介したシグナル伝達は、１型インターフェロン（ＩＦＮ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＬ－１２、及び転写プログラムのカスケードの活性化に関連する炎症を引き起こす。全体として、これらは、特異的免疫応答を誘導する態勢にある炎症誘発性微小環境を作出する。さらに、真核生物の翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）リン酸化による翻訳の減少、リボヌクレアーゼＬ（ＲＮａｓｅＬ）によるＲＮＡ分解の促進、自己増幅ｍＲＮＡ複製の過剰発現及び阻害などの下流の影響はすべて、ＩＶＴ ｍＲＮＡの薬物動態及び薬力学と関連性がある。
【0266】
ＴＬＲ経路を介したＩＦＮ－γの活性化によって、２’－５’－オリゴアデニル酸（２－５Ａ）を生成する２’－５’－オリゴアデニル酸シンターゼ（ＯＡＳ）が活性化される可能性があり、これによって次にＲＮａｓｅＬが活性化される可能性があり、ＲＮＡ分解及びアポトーシスがもたらされる可能性がある。
【0267】
実施例７：ＣＡＲマクロファージに対するＲＮａｓｅＬ阻害剤、スニチニブ及びＡＢＣＥ１の効果
ＲＮａｓｅＬ阻害剤が、トランスフェクトされたｍＲＮＡのＩＦＮ－γ誘導不安定性を救済できるかどうかを決定するために、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡのトランスフェクションの２時間前に、ヒトマクロファージを１μＭのスニチニブ（ＲＮａｓｅＬ阻害剤）で処理した。次に、トランスフェクトされた細胞を異なる投与量のＩＦＮ－γで１日間培養した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で監視した。図１４Ａに示すように、スニチニブによって、ｍＲＮＡのＩＦＮ－γ誘導分解が救済された。
ＲＮａｓｅＬ阻害剤が、トランスフェクトされたｍＲＮＡのＩＦＮ－γ誘導不安定性を救済できるかどうかを決定するために、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡのトランスフェクションの２時間前に、ヒトマクロファージを１μＭのスニチニブ（ＲＮａｓｅＬ阻害剤）で処理した。次に、トランスフェクトされた細胞を異なる投与量のＩＦＮ－γで１日間培養した。ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブイメージング顕微鏡で監視した。図１４Ａに示すように、スニチニブによって、ｍＲＮＡのＩＦＮ－γ誘導分解が救済された。
【0268】
ＲＮＡｓｅ Ｌ阻害によって、ｍＲＮＡトランスフェクトＣＡＲマクロファージの抗腫瘍機能を改善できるかどうかを評価するために、マクロファージを、修飾を含むｍＲＮＡでトランスフェクトし、スニチニブで前処理した後、がん細胞殺傷アッセイにおいてエフェクター細胞として評価した。１ｎＭスニチニブで前処理されたＣＡＲマクロファージは、スニチニブで前処理されていないＣＡＲマクロファージ、またはスニチニブで処理された、もしくは処理されていない非トランスフェクト対照マクロファージよりもがん細胞殺傷が高かった（図１４Ｂ）。４８時間のＣＲＬ２３５１乳癌細胞殺傷アッセイにおけるスニチニブ感作ＣＡＲマクロファージの改善されたがん殺傷能力を図１４Ｃに示す。
【0269】
別のＲＮａｓｅＬ阻害剤（ＲＬＩまたはＡＢＣＥ１）の効果も試験して、概念をさらに検証した。ヒトマクロファージに、ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むｍＣｈｅｒｒｙをコードするｍＲＮＡと、ＡＢＣＥ１をコードするｍＲＮＡとを共トランスフェクトした。
【0270】
図１５に示されるように、エレクトロポレーションの４８時間後、ＡＢＣＥ１共発現によって、目的のｍＲＮＡコード導入遺伝子の発現が有意に改善された。ＡＢＣＥ１を共トランスフェクトしたマクロファージの生存率は影響を受けず、高いままであった。ＡＢＣＥ１共トランスフェクションにより、ｍＣｈｅｒｒｙの発現が約２倍増加し、スニチニブで前処理すると、この効果がさらに高まった。
【0271】
実施例８：遺伝的にコードされたＲＮａｓｅＬ阻害剤のＣＡＲマクロファージに対する効果
他の遺伝的にコードされたＲＮａｓｅＬ阻害剤によってＣＡＲ発現を改善できるかどうかを評価するために、修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡとＮＳ１をコードするｍＲＮＡとの共トランスフェクションを評価した。ＮＳ１は、ＮＳ１Ａタンパク質をコードするインフルエンザＡ由来の遺伝子である。図１６に示されるように、ＡＢＣＥ１とＣＡＲ ｍＲＮＡまたはＮＳ１とＣＡＲ ｍＲＮＡの共トランスフェクションによって、対照遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙとＣＡＲの共トランスフェクションと比較して、ＣＡＲ発現のレベルが増加した。ＮＳ１共トランスフェクションによって、ＡＢＣＥ１共トランスフェクションよりも高いＣＡＲ発現がもたらされた。
他の遺伝的にコードされたＲＮａｓｅＬ阻害剤によってＣＡＲ発現を改善できるかどうかを評価するために、修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡとＮＳ１をコードするｍＲＮＡとの共トランスフェクションを評価した。ＮＳ１は、ＮＳ１Ａタンパク質をコードするインフルエンザＡ由来の遺伝子である。図１６に示されるように、ＡＢＣＥ１とＣＡＲ ｍＲＮＡまたはＮＳ１とＣＡＲ ｍＲＮＡの共トランスフェクションによって、対照遺伝子ｍＣｈｅｒｒｙとＣＡＲの共トランスフェクションと比較して、ＣＡＲ発現のレベルが増加した。ＮＳ１共トランスフェクションによって、ＡＢＣＥ１共トランスフェクションよりも高いＣＡＲ発現がもたらされた。
【0272】
ＡＢＣＥ１及び／またはＮＳ１がＣＡＲ発現に影響を与えるメカニズムを評価するために、修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするエレクトロポレーションされたｍＲＮＡの減衰をＲＴ－ｑＰＣＲによって評価した。８時間でのＣＡＲプラスｍＣｈｅｒｒｙ ｍＲＮＡ、ＣＡＲプラスＡＢＣＥ１ ｍＲＮＡ、またはＣＡＲプラスＮＳ１ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージにおけるＣＡＲ ｍＲＮＡの相対存在量を、２時間でのＣＡＲ ｍＲＮＡの存在量と比較した。図１７に示すように、ｍＣｈｅｒｒｙ（陰性対照）を共トランスフェクトしたＣＡＲ ｍＲＮＡのレベルは６時間で５０％を超えて低下したが、ＡＢＣＥ１ ｍＲＮＡまたはＮＳ１ ｍＲＮＡを共トランスフェクトしたＣＡＲ ｍＲＮＡのレベルは上昇し続けた。
【0273】
実施例９：マクロファージの感作
Ｈｅｒ２－ゼータＣＡＲ発現マクロファージを生成するために、初代ヒトマクロファージを、９０×１０６細胞／ｍＬの濃度で３００ｎＭ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ）を含有するＥＰ緩衝液（ＭａｘＣｙｔｅ）に懸濁した。１００μＬの細胞混合物をエレクトロポレーションカセット（ＯＣ１００ｘ２、ＭａｘＣｙｔｅ）に加え、実験Ｔ細胞１設定を使用してエレクトロポレーションを行った。細胞をカセットから取り出し、ＵｐＣｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上の２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する３ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
Ｈｅｒ２－ゼータＣＡＲ発現マクロファージを生成するために、初代ヒトマクロファージを、９０×１０６細胞／ｍＬの濃度で３００ｎＭ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ）を含有するＥＰ緩衝液（ＭａｘＣｙｔｅ）に懸濁した。１００μＬの細胞混合物をエレクトロポレーションカセット（ＯＣ１００ｘ２、ＭａｘＣｙｔｅ）に加え、実験Ｔ細胞１設定を使用してエレクトロポレーションを行った。細胞をカセットから取り出し、ＵｐＣｅｌｌプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上の２０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する３ｍＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【0274】
組換えＣＤ４０リガンド（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、４－１ＢＢリガンド（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び４－１ＢＢ受容体（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、分子グレードの水に再懸濁して、ストック濃度１００μｇ／ｍＬにした。次にストック溶液を使用して、ＰＢＳで２～０．００２μｇ／ｍＬの範囲の使用液を作成した。使用液１００μＬを９６ウェルプレートのウェルに加え、室温で４時間放置した。
【0275】
プレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間放置した。細胞をプレートから剥がし、ＮＣ－２００自動細胞カウンター（Ｃｈｅｍｏｍｔｅｃｈ）を使用して計数し、１０％ＦＢＳを含むＴｅｘＭＡＣＳ培地に再懸濁させた。タンパク質コーティングプレートをＰＢＳで２回洗浄した後、１０％ＦＢＳを含む最終体積１００μＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地にマクロファージを加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。３時間後、核ＧＦＰを発現するＣＲＬ－２３５１細胞１０，０００個を、各ウェルに加えた。ＧＭ－ＣＳＦの最終濃度は、すべてのウェルで１０ｎｇ／ｍＬであった。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞溶解を検出した。腫瘍細胞死を、時間０に対するウェルあたりの積分ＧＦＰ強度によって計算した。
【0276】
細胞表面タンパク質の検出のために、マクロファージを、アゴニスト分子でコーティングされたウェルの最終体積２００μＬのＴｅｘＭＡＣＳ培地＋１０％ＦＢＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ中にプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。細胞を、３００μＬ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で３０分間インキュベートし、染色のために９６ウェル丸底プレートに移した。細胞を、２０μｇ／ｍＬ Ｈｅｒ２－Ｈｉｓを含有するＦＡＣＳ緩衝液中で室温にて２０分間インキュベートした後、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸで室温にて１０分間インキュベートした。表面タンパク質染色は、以下のパネルを使用して行った：ＣＤ８０－ＦＩＴＣ、ＣＤ８６－ＰＥ、ＣＤ１６３－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＣＤ２０６－ＢＶ４２１、抗Ｈｉｓ－ＡＰＣ、Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ水溶液。表面タンパク質発現の検出は、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を使用して完了させた。
【0277】
ＣＡＲマクロファージをＣＤ４０Ｌで処理すると、マクロファージ及びＣＡＲマクロファージの腫瘍殺傷能力が有意に改善された（図１８Ａ）。ＣＤ４０Ｌによる感作はまた、ＣＡＲ ｍＲＮＡをトランスフェクトしたマクロファージにおいてＭ１表現型を誘導した（図１８Ｂ）。４－１ＢＢ及び４－１ＢＢＬによる処理によって、ＣＤ４０Ｌほど強力ではないが、同様の結果がもたらされた（図１９Ａ～１９Ｂ及び図２０Ａ～Ｂ）。これらの結果は、ＣＤ４０ＬなどのＣＤ４０アゴニストによるＣＡＲマクロファージの前処理または感作により有効性が向上する場合があり、ＣＡＲマクロファージをＣＤ４０アゴニストとともに含む併用療法により有効性が向上する場合があることを示している。
【0278】
実施例１０：ヒト単球に対するｍＲＮＡ修飾の効果
修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡのヒト単球への送達も評価した。具体的には、Ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、５人のヒトドナー由来の単球にエレクトロポレーションした。図２１に示すように、強度とパーセンテージの両方で高いＣＡＲ発現が達成された。
修飾を含むＣＡＲ ｍＲＮＡのヒト単球への送達も評価した。具体的には、Ｍ６ＡＧＣａｐ１及びＰｓＵ修飾を含むＨＥＲ２ ＣＡＲをコードするｍＲＮＡを、５人のヒトドナー由来の単球にエレクトロポレーションした。図２１に示すように、強度とパーセンテージの両方で高いＣＡＲ発現が達成された。
【0279】
実施例１１：異種移植固形腫瘍マウスモデルにおけるｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージの有効性
異種移植固形腫瘍マウスモデルにおけるｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージの有効性を評価するために、５つの群を使用した。研究群には、非治療、モック治療群、ＩＦＮ－βを伴うモック治療群、ｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ－ＣＡＲ）治療群、及びＩＦＮ－βを伴うｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ－ＣＡＲ＋ＩＦＮｂ）治療群が含まれていた。
異種移植固形腫瘍マウスモデルにおけるｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージの有効性を評価するために、５つの群を使用した。研究群には、非治療、モック治療群、ＩＦＮ－βを伴うモック治療群、ｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ－ＣＡＲ）治療群、及びＩＦＮ－βを伴うｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ－ＣＡＲ＋ＩＦＮｂ）治療群が含まれていた。
【0280】
ＮＳＧＳマウスに、６ｅ５ ＳＫＯＶ３細胞を注射した（１群あたりｎ＝５マウス）。続いて、マウスを、図２２の矢印によって示されるように、０、４、及び８日目に腹腔内注射によって８ｅ６個のマクロファージで治療した。腫瘍量は、ＩＶＩＳイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用する生物発光イメージングによって測定した。マウスを、２～３日ごとに画像化した。
【0281】
図２２に示されるように、ｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージまたはＩＦＮ－βで刺激されたｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージで治療されたマウスは、対照と比較して、腫瘍増殖の抑制を示した。
【0282】
実施例１２：同系固形腫瘍マウスモデルにおける、ｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージの有効性
同系固形腫瘍マウスモデルにおけるｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージの有効性を評価するために、５つの群を使用した。研究群には、非治療群、モック治療群、ＩＦＮ－βを伴うモック治療群、ｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ ＣＡＲ）治療群、及びＩＦＮ－βを伴うｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ ＣＡＲ＋ＩＦＮｂ）治療群が含まれていた。
同系固形腫瘍マウスモデルにおけるｍＲＮＡエレクトロポレーションによって生成されたＣＡＲマクロファージの有効性を評価するために、５つの群を使用した。研究群には、非治療群、モック治療群、ＩＦＮ－βを伴うモック治療群、ｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ ＣＡＲ）治療群、及びＩＦＮ－βを伴うｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージ（ｍＲＮＡ ＣＡＲ＋ＩＦＮｂ）治療群が含まれていた。
【0283】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、７．５ｅ５個のＣＴ２６－ＨＥＲ２結腸癌細胞を皮下注射した（１群あたりｎ＝１２～１３匹のマウス）。腫瘍注射の１２日後（平均腫瘍質量が５０ｍｍ３になると）、約３ｅ６個のマクロファージを腫瘍内注射した。１６日目及び２０日目に追加のマクロファージを注射した（１回の注射につきマウス１匹あたり約３ｅ６個、図２３に矢印で示す）。隔週でキャリパーを使用して腫瘍体積を測定し、以下の式を使用して腫瘍体積を推定した：腫瘍体積＝長さ×幅＾２／２、式中、長さは腫瘍の最大直径を表し、幅は垂直方向の腫瘍直径を表す。
【0284】
図２３に示すように、ＩＦＮ－β処理ｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージを受けたマウスのほぼ８０％がそれらの腫瘍を拒絶したが、モック、ＩＦＮ－β処理モック、またはｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージを用いたマウスの約６０％が腫瘍を拒絶した。ＩＦＮ－β感作ｍＲＮＡ ＣＡＲ－マクロファージによって、陰性対照と比較して腫瘍の増殖が有意に抑制された。特に、免疫適格性マウスモデルとの関係では、ＩＦＮ－β感作ｍＲＮＡ ＣＡＲマクロファージは、ｍＲＮＡ ＣＡＲマクロファージまたはＩＦＮ－β感作対照マクロファージよりも優れており、このことは、ＣＡＲ操作とＩＦＮ－β感作の間の相乗効果を示している。
【0285】
均等物
当業者は、本開示に対する様々な変更、修正、及び改良が当業者には容易に想起されることが理解されるべきである。そのような変更、修正、及び改良は、本開示の一部であることを意図しており、本発明の精神及び範囲内であることを意図している。したがって、前述の説明及び図面は単なる例であり、本開示に記載されているいずれの発明も以下の特許請求の範囲によってさらに詳細に説明されている。
当業者は、本開示に対する様々な変更、修正、及び改良が当業者には容易に想起されることが理解されるべきである。そのような変更、修正、及び改良は、本開示の一部であることを意図しており、本発明の精神及び範囲内であることを意図している。したがって、前述の説明及び図面は単なる例であり、本開示に記載されているいずれの発明も以下の特許請求の範囲によってさらに詳細に説明されている。
【0286】
当業者は、本明細書に記載のアッセイまたは他のプロセスで得られた値に起因する偏差または誤差の典型的な基準を理解するであろう。本発明の背景を説明し、その実践に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書で参照される刊行物、ウェブサイト、及び他の参考資料は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図21】
【図22】
【図23】
【国際調査報告】