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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-27
(54)【発明の名称】改良されたＲＮＡ編集方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20230720BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20230720BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230720BHJP
C40B 40/08 20060101ALI20230720BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
C12N15/12
C12N5/10
C40B40/08
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023501188
(86)(22)【出願日】2021-07-06
(85)【翻訳文提出日】2023-03-03
(86)【国際出願番号】 CN2021104801
(87)【国際公開番号】W WO2022007803
(87)【国際公開日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/100467
(32)【優先日】2020-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522264261
【氏名又は名称】北京▲輯▼因医▲療▼科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＥＤＩＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ （ＢＥＩＪＩＮＧ） ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｆｌｏｏｒ ２，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２， Ｎｏ．２２ Ｋｅｘｕｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｎｇｐｉｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０２２０６， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002000
【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所
(72)【発明者】
【氏名】袁 ▲鵬▼▲飛▼
(72)【発明者】
【氏名】易 ▲澤▼▲軒▼
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 能▲銀▼
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
本願は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む。また、本願は、上記方法に用いるａｒＲＮＡ、上記方法により得られたＲＮＡ及び該ＲＮＡを含む宿主細胞、並びに疾患の治療における上記方法の使用に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、
前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法。
【請求項2】
前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基に直接対向するミスマッチを含む請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの下流残基に直接対向するミスマッチを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記標的残基はアデノシンである請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記上流残基はＧ、Ａ、又はＣから選択される請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記３塩基モチーフはＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＵＡＡ、ＵＡＣ及びＵＡＵから選択される請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチをさらに含む請求項４～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＣＧ、ＵＣＣ、ＣＣＵ又はＡＣＡを含む請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＣＧを含む請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＣ又はＵＣＧを含む請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＣＡ又はＵＣＧを含む請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＧＣＧ又はＧＣＡを含む請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＧＣＧを含む請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＵＣＣ又はＵＣＧを含む請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＣＣＧを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記標的ＲＮＡ中の上流残基はＧ、Ｃ、Ａ及びＵのヌクレオチドから選択され、好ましくはＧ＞Ｃ≒Ａ＞Ｕの順である請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡである請求項４～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である請求項４～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記ａｒＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質をリクルートし、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化する請求項４～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
ＡＤＡＲ触媒ドメインを含む前記融合タンパク質は標的ドメインをさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記ＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質、又は前記ＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする構築物は前記宿主細胞に外来的に導入される請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＡＤＡＲタンパク質は前記宿主細胞に内因的に発現される請求項２０に記載の方法。
【請求項24】
前記標的残基はシチジンであり、前記ａｒＲＮＡは、ＲＮＡに作用しシチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼをリクルートし、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンが位置する３塩基モチーフは、ＧＣＧ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＵ、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＵ、ＣＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＵ及びＵＣＧから選択されるいずれかである請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的シチジンに対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項27】
前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の非標的シチジンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチをさらに含む請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧである請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧ又はＵＣＧを含む請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧを含む請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記３塩基モチーフはＣＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＧを含む請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記標的ＲＮＡ中の上流残基はＧ、Ｃ、Ａ及びＵのヌクレオチドから選択され、好ましくは、Ｇ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕの順である請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは、ＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質に対して遺伝子修飾を行ってＣ－Ｕ触媒活性を得るデアミナーゼである請求項２４～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは標的ドメインをさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記標的ドメインは、ＳＮＡＰ－ｔａｇ、λＮペプチド、又は触媒的に不活性化されたＣａｓ１３タンパク質から選択されるいずれかである請求項２１又は３４に記載の方法。
【請求項36】
前記構築物は、ウイルスベクター、プラスミド、又は線状核酸鎖から選択されるいずれかである請求項２２又は２４に記載の方法。
【請求項37】
前記ａｒＲＮＡの長さが約２０～２６０ヌクレオチドである請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記ａｒＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記相補的なＲＮＡ配列は一本鎖であり、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の二本鎖領域をさらに含む請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記ａｒＲＮＡはＡＤＡＲリクルートドメインをさらに含む請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記ａｒＲＮＡは１つ以上の化学的修飾を含む請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記ａｒＲＮＡはいかなる化学的修飾も含まない請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
前記標的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ前駆体、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ及びスモールＲＮＡから選択されるＲＮＡである請求項１～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
標的ＲＮＡの標的残基で編集を行うことにより、標的ＲＮＡのミスセンス突然変異、早期に出現した終止コドン、異常スプライシング又は可変スプライシングを引き起こすか、又は標的ＲＮＡ中のミスセンス突然変異、早期に出現した終止コドン、異常スプライシング又は可変スプライシングを逆転させる請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
標的ＲＮＡにおける標的残基の編集は、標的ＲＮＡがコードするタンパク質の点突然変異、切断、伸長及び／又は誤った折り畳みをもたらすか、又は標的ＲＮＡの誤ったセンス突然変異、早期に出現した終止コドン、異常スプライシング又は可変スプライシングを逆転させることによって、機能的、全長、正しく折り畳まれた及び／又は野生型のタンパク質を得る請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記宿主細胞は真核細胞である請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記宿主細胞は哺乳動物の細胞である請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記宿主細胞はヒト又はマウス細胞である請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法により製造された編集されたＲＮＡ又は編集されたＲＮＡを含む宿主細胞。
【請求項50】
複数の請求項４９に記載のＲＮＡ又は複数の請求項４９に記載の編集されたＲＮＡの宿主細胞を含むライブラリー。
【請求項51】
請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法によって個体の細胞内の疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体における疾患又は障害を治療又は予防するための方法。
【請求項52】
前記疾患又は障害は、遺伝性遺伝子疾患、又は１つ以上の獲得遺伝子変異に関連する疾患又は障害である請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法で使用されるａｒＲＮＡからなるａｒＲＮＡ。
【請求項54】
請求項５３に記載のａｒＲＮＡを含み、前記ａｒＲＮＡがいかなる化学的修飾も含まないウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖。
【請求項55】
複数の請求項５３に記載のａｒＲＮＡ、又は複数の請求項５４に記載のウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含むライブラリー。
【請求項56】
請求項５３に記載のａｒＲＮＡ又は請求項５４に記載のウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含む組成物。
【請求項57】
請求項５３に記載のａｒＲＮＡ又は請求項５４に記載のウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子編集の分野、具体的には、ＲＮＡ編集の分野に属し、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ｄＲＮＡ、ａｒＲＮＡともいう）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入し、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集することを含む。
【背景技術】
【0002】
ＣＲＩＳＰＲ技術
近年、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＷＯ２０１４０１８４２３Ａ３）をはじめとするゲノム編集技術が急速に発展しており、そして生物や医学の多くの分野に大きな影響を与えた。多くの科学研究者やバイオテクノロジー企業も同技術を臨床に適用することに取り組んでいる。２０１９年９月、北京大学のトウ宏魁教授とその協力者は文章を発表し、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用して幹細胞を編集し、それを患者に戻すことで、エイズと白血病を治療する臨床実験の結果を初めて報道し、ＣＲＩＳＰＲ技術の遺伝子治療への適用に大きな貢献を果たした。
近年、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ、ＷＯ２０１４０１８４２３Ａ３）をはじめとするゲノム編集技術が急速に発展しており、そして生物や医学の多くの分野に大きな影響を与えた。多くの科学研究者やバイオテクノロジー企業も同技術を臨床に適用することに取り組んでいる。２０１９年９月、北京大学のトウ宏魁教授とその協力者は文章を発表し、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用して幹細胞を編集し、それを患者に戻すことで、エイズと白血病を治療する臨床実験の結果を初めて報道し、ＣＲＩＳＰＲ技術の遺伝子治療への適用に大きな貢献を果たした。
【0003】
ＣＲＩＳＰＲ技術には極めて大きな将来性が期待できるが、この技術にも多くの欠点が存在し、これによって、この技術の科学研究段階から臨床治療への応用は困難である。問題の１つは、ＣＲＩＳＰＲ技術で用いられている中心的な役割を果たす酵素であるＣａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲに基づくＤＮＡ編集技術では、外来的に発現されるＣａｓ９や類似の機能を持つ他のヌクレアーゼを導入しなければならず、以下のような問題が生じている。まず、外因性発現を必要とするヌクレアーゼは、一般的に分子量が大きく、それをウイルスベクターを介して体内に送達する効率が大幅に低下する。次に、Ｃａｓ９の発現は複数人の研究で潜在的な発がんリスクがあることが確認された。ｐ５３は最も研究されているがん抑制遺伝子で、Ｈａａｐａｎｉｅｍｉらの研究によると、Ｃａｓ９系はｐ５３によるＤＮＡ損傷を活性化するが（Ｈａａｐａｎｉｅｍｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、ＥｎａｃｈｅらはＣａｓ９タンパク質の過剰発現がｐ５３不活性化突然変異を持つ細胞を選択的に富化することを見出している（Ｅｎａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。さらに、Ａｄｉｋｕｓｕｍａは、Ｃａｓ９により編集されたマウスの受精卵に大断片のＤＮＡ欠損が多数存在することを発見した（Ａｄｉｋｕｓｕｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）。一方、Ｃｕｌｌｏｔらはさらに、Ｃａｓ９により編集されるとゲノム上に百万塩基以上の大きな断片が欠損することを発見し、さらに重要なのは、これら欠損した断片の中に５つのがん原遺伝子と７つのがん抑制遺伝子が含まれていることである（Ｃｕｌｌｏｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。最後に、外来的に発現されたＣａｓ９は、通常、ヒト又は哺乳動物に天然に存在するものではなく、黄色ブドウ球菌又はレンサ球菌のような細菌由来のものであり、これにより、患者の体内で免疫反応を引き起こす可能性がある。Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈらの研究によれば、ヒト血清中にＣａｓ９のＩｇＧ抗体が存在することが明らかになった（Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。これは外因的に発現されるヌクレアーゼを中和させ、それによって本来の活性を失う可能性がある一方、患者自身に損傷、さらには毒性をもたらし、あるいは更なる介入治療を阻害する可能性もある。
【0004】
ＲＮＡレベルでのＡからＩへの編集
ＤＮＡ編集における潜在的なリスクを避けるため、科学者もＲＮＡ編集に強い関心を持っている。ＤＮＡに存在する遺伝情報はＲＮＡに転写され、さらにタンパク質に翻訳されなければ正常な生理機能を発揮できないことが、分子生物学のセントラルドグマと呼ばれている。ＤＮＡレベルの編集に比べ、ＲＮＡレベルの編集は、ゲノム損傷を避けると同時に、最終的な生物機能に変化を与えることができる。よく見られるＲＮＡ編集の１つは、ＡＤＡＲ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）が媒介するアデノシンＡからグアノシンＩへの編集である。マサチューセッツ工科大学の張鋒（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ）教授の研究チームは２０１７年、ＲＥＰＡＩＲ（ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＲＮＡ編集技術が外因的に発現されるＣａｓ１３－ＡＤＡＲ融合タンパク質及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）によっても標的ＲＮＡのＡからＩへの編集を実現できることを報告した（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。この方法では、Ｃａｓ１３がｓｇＲＮＡと結合して標的化機能を発揮し、編集したい部位に融合タンパク質を持っていくと同時に、ＡＤＡＲ脱アミノ化ドメインが触媒作用を発揮し、ＡからＩへの編集を実現する。しかし、この方法はＣＲＩＳＰＲ技術と同様に、外来タンパク質の発現が必要である。外来タンパク質の発現による問題を解決することはできない。
ＤＮＡ編集における潜在的なリスクを避けるため、科学者もＲＮＡ編集に強い関心を持っている。ＤＮＡに存在する遺伝情報はＲＮＡに転写され、さらにタンパク質に翻訳されなければ正常な生理機能を発揮できないことが、分子生物学のセントラルドグマと呼ばれている。ＤＮＡレベルの編集に比べ、ＲＮＡレベルの編集は、ゲノム損傷を避けると同時に、最終的な生物機能に変化を与えることができる。よく見られるＲＮＡ編集の１つは、ＡＤＡＲ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）が媒介するアデノシンＡからグアノシンＩへの編集である。マサチューセッツ工科大学の張鋒（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ）教授の研究チームは２０１７年、ＲＥＰＡＩＲ（ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれるＲＮＡ編集技術が外因的に発現されるＣａｓ１３－ＡＤＡＲ融合タンパク質及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ：ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）によっても標的ＲＮＡのＡからＩへの編集を実現できることを報告した（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）。この方法では、Ｃａｓ１３がｓｇＲＮＡと結合して標的化機能を発揮し、編集したい部位に融合タンパク質を持っていくと同時に、ＡＤＡＲ脱アミノ化ドメインが触媒作用を発揮し、ＡからＩへの編集を実現する。しかし、この方法はＣＲＩＳＰＲ技術と同様に、外来タンパク質の発現が必要である。外来タンパク質の発現による問題を解決することはできない。
【0005】
以上の課題を解決し、核酸編集技術を医療分野へより良く応用するために、特に外来タンパク質の発現に依存しない新しい核酸編集技術を見出すことが急務である。２０１９年７月、北京大学生命科学学院の魏文勝教授の研究チームはＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＲＮＡｓ」という文章を掲載し、新しい核酸編集技術：ＬＥＡＰＥＲ（Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ， Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）を初めて報告した。ＣＲＩＳＰＲ（ＷＯ２０１４０１８４２３Ａ３）及びＲＥＰＡＩＲ技術（ＷＯ２０１９００５８８４Ａ１）との相違点として、この技術は原理的に外因性ヌクレアーゼの過剰発現に依存せず、医学分野へ適用する過程において、更に大きな優位性があることである。しかし、この技術はアデノシンＡからクレアチニンＩへの編集、すなわちアデノシンＡからグアノシンＧへの編集しか実現できない（クレアチニンＩはタンパク質の翻訳中にグアノシンＧと認識されるため）ため、その応用には依然として限界がある。ＣＲＩＳＰＲ技術と同様に、この技術は、内因性ヌクレアーゼを所望の編集部位にリクルートするためのガイドとしてのＲＮＡを必要とする。このガイドＲＮＡはａｒＲＮＡ（ａｄａｒ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＲＮＡ）と命名された。
【0006】
２０１９年１月、Ｔｈｏｒｓｔｅｎ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔの研究チームもＬＥＡＰＥＲと類似している、ＲＥＳＴＯＲＥ（Ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｔｏ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ、ＷＯ２０２０００１７９３Ａ１）と命名された核酸編集技術を報告している。ＬＥＡＰＥＲと同様に、ＲＥＳＴＯＲＥも外来タンパク質に依存しない。しかし、ＬＥＡＰＥＲとの相違点として、まず、ＲＥＳＴＯＲＥ技術は自己免疫の進行と重症度を決定する重要な因子であるＩＦＮ－γの存在を前提にしてこそ高い編集効率を得ることができ（Ｐｏｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、これにより、この技術の医学分野での応用は大きく制限されてしまう。一方、ＲＥＳＴＯＲＥ技術においてもガイドＲＮＡが使用され、使用されるガイドＲＮＡは化学合成されたオリゴヌクレオチドでなければならず、前記合成されたオリゴヌクレオチドはその安定性を保証するために大量の化学的修飾を人為的に導入する必要がある。これらの化学的修飾の中で、一部の修飾は潜在的な毒性や免疫原性が存在する可能性があり、また一部の修飾は同じ塩基鎖の異なる配座を招くことがあり、その結果として、同じ配列のＲＮＡは数十種類の異なる配座の組み合わせを持つことになる。一方、ＬＥＡＰＥＲ技術は化学的に合成されたＲＮＡによって行われるだけでなく、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスなどのベクターを介して患者の細胞内に送達することによって機能を発揮することができ、これにより、送達手段の選択が柔軟で多様化している。
【0007】
ＡからＩへの編集部位の上下流残基又は配列
ＤＮＡの編集では、編集された部位は複製によってすべての娘細胞に伝達されるため、ＤＮＡレベルでの編集は、たとえ効率が悪くても、娘細胞のスクリーニングなどによって編集された細胞を富化することができる。これとは異なり、ＲＮＡ編集の過程では、作られた編集は遺伝されない。そのため、ＲＮＡ編集中のオフターゲットサイトは子世代に遺伝することができず、これによりＲＮＡレベルの編集はＤＮＡ編集より安全であり、一方、ＲＮＡ編集の効率はさらに重要になる。ＡからＩへのＲＮＡ編集において、ＲＥＰＡＩＲ（ＷＯ２０１９００５８８４Ａ１）、ＲＥＳＴＯＲＥ（ＷＯ２０２０００１７９３Ａ１）、ＬＥＡＰＥＲ（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）のいずれのシステムも、ＡＤＡＲを触媒反応のキー酵素として用いた。哺乳動物の細胞には、ＡＤＡＲ１（２つの同型、ｐ１１０とｐ１５０）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３（触媒活性なし）の３種類のＡＤＡＲタンパク質が存在する。ＡＤＡＲタンパク質の触媒基質は二本鎖ＲＮＡであり、アデノシン（Ａ）ヌクレオシド塩基から－ＮＨ２基を除去し、Ａをイノシン（Ｉ）に変えることができ、後者はグアノシン（Ｇ）として認識され、その後の細胞生理学的過程、例えば逆転写及び翻訳過程、又は細胞内ウイルスＲＮＡ複製過程においてシチジン（Ｃ）と対合する。ＡＤＡＲの特定の性質のため、いくつかの同様な要素はＲＥＰＡＩＲ、ＲＥＳＴＯＲＥ及びＬＥＡＰＥＲ編集システムのＲＮＡに対する編集効率に影響する。その１つが、編集部位の上下流残基及び配列である。編集されたアデノシンＡ（標的Ａ）、すなわちここでの標的残基は、ｍＲＮＡ中の５’上流と３’下流に隣接する塩基がどの塩基であるかが編集の効率に影響することが明らかである。便宜上、標的残基に隣接する５’上流塩基（上流残基）、標的残基、及び標的残基に隣接する３’下流塩基（下流残基）が５’から３’の順につながったモチーフを「３塩基モチーフ」と呼ぶことにする。標的Ａの上流残基及び下流残基はいずれもＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇであり得るので、前記３塩基モチーフは１６種類の組み合わせ、すなわち、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧを有することができる。ＲＥＰＡＩＲ、ＲＥＳＴＯＲＥ、ＬＥＡＰＥＲシステムでは、３塩基モチーフごとに編集効率が異なり、本明細書では、このように３塩基モチーフごとに編集効率が異なることを「トリプレット選好性」と呼ぶ。
ＤＮＡの編集では、編集された部位は複製によってすべての娘細胞に伝達されるため、ＤＮＡレベルでの編集は、たとえ効率が悪くても、娘細胞のスクリーニングなどによって編集された細胞を富化することができる。これとは異なり、ＲＮＡ編集の過程では、作られた編集は遺伝されない。そのため、ＲＮＡ編集中のオフターゲットサイトは子世代に遺伝することができず、これによりＲＮＡレベルの編集はＤＮＡ編集より安全であり、一方、ＲＮＡ編集の効率はさらに重要になる。ＡからＩへのＲＮＡ編集において、ＲＥＰＡＩＲ（ＷＯ２０１９００５８８４Ａ１）、ＲＥＳＴＯＲＥ（ＷＯ２０２０００１７９３Ａ１）、ＬＥＡＰＥＲ（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）のいずれのシステムも、ＡＤＡＲを触媒反応のキー酵素として用いた。哺乳動物の細胞には、ＡＤＡＲ１（２つの同型、ｐ１１０とｐ１５０）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３（触媒活性なし）の３種類のＡＤＡＲタンパク質が存在する。ＡＤＡＲタンパク質の触媒基質は二本鎖ＲＮＡであり、アデノシン（Ａ）ヌクレオシド塩基から－ＮＨ２基を除去し、Ａをイノシン（Ｉ）に変えることができ、後者はグアノシン（Ｇ）として認識され、その後の細胞生理学的過程、例えば逆転写及び翻訳過程、又は細胞内ウイルスＲＮＡ複製過程においてシチジン（Ｃ）と対合する。ＡＤＡＲの特定の性質のため、いくつかの同様な要素はＲＥＰＡＩＲ、ＲＥＳＴＯＲＥ及びＬＥＡＰＥＲ編集システムのＲＮＡに対する編集効率に影響する。その１つが、編集部位の上下流残基及び配列である。編集されたアデノシンＡ（標的Ａ）、すなわちここでの標的残基は、ｍＲＮＡ中の５’上流と３’下流に隣接する塩基がどの塩基であるかが編集の効率に影響することが明らかである。便宜上、標的残基に隣接する５’上流塩基（上流残基）、標的残基、及び標的残基に隣接する３’下流塩基（下流残基）が５’から３’の順につながったモチーフを「３塩基モチーフ」と呼ぶことにする。標的Ａの上流残基及び下流残基はいずれもＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇであり得るので、前記３塩基モチーフは１６種類の組み合わせ、すなわち、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＡＡＣ、ＡＡＧ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＣＡＣ、ＣＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧを有することができる。ＲＥＰＡＩＲ、ＲＥＳＴＯＲＥ、ＬＥＡＰＥＲシステムでは、３塩基モチーフごとに編集効率が異なり、本明細書では、このように３塩基モチーフごとに編集効率が異なることを「トリプレット選好性」と呼ぶ。
【0008】
ＲＥＰＡＩＲシステムでは、Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲの融合タンパク質を用いているため、このシステムのトリプレット選好性は若干異なっている。図１に示すように（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ， ２０１７）、ＲＥＰＡＩＲシステムは３塩基モチーフＧＡＣに対する編集効率が最も低いのに対し、ＵＡＵに対する編集効率が最も高く、約２～３倍の差がある。
【0009】
ＲＥＳＴＯＲＥシステムでは、著者は３塩基モチーフに対する選好性に関するデータを直接に示していないが、文章では、別の文章を引用し（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、このシステムの選好と一致する可能性があることを記載している（Ｍｅｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。図２に示すように（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）、図中の三角形はＳＡ１Ｑであり、具体的な実施方法は、ヒトＡＤＡＲ１触媒ドメインとヒトＯ６－アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ：Ｏ６－ａｌｋｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ａｌｋｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のＣ末端ドメイン（ＳＮＡＰ－ｔａｇ）を融合し、そして８３５位のアミノ酸でグルタミン酸からグルタミンへの突然変異（Ｅ－Ｑ）を行い、さらにＳＮＡＰ－ｔａｇを介してガイドＲＮＡと共有結合で架橋することである（Ｋｅｐｐｌｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， ２００３；Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。図中のブロックはＳＡ２Ｑであり、具体的な実施方法は、ヒトＡＤＡＲ２触媒ドメインとヒトＯ６－アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ：Ｏ６－ａｌｋｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ－ａｌｋｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）のＣ末端ドメイン（ＳＮＡＰ－ｔａｇ）を融合し、そして１３１０位のアミノ酸でグルタミン酸からグルタミンへの突然変異（Ｅ－Ｑ）を行い、さらにＳＮＡＰ－ｔａｇを介してガイドＲＮＡと共有結合で架橋することである（Ｋｅｐｐｌｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， ２００３；Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。以上より、２つの異なるＡＤＡＲにおいて、そのトリプレット選好性には傾向が類似した有意差が見られる。５’上流残基がＧである場合、すなわちＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧでは、その編集効率は通常他の３塩基モチーフよりはるかに低く、未編集時のレベルにも近いが、ＵＡＧはその中で編集効率が最も高い３塩基モチーフの１つである。図２に示すように、ＵＡＧに対するこのシステムの編集効率は、上流残基がＧである３塩基モチーフに対する編集効率の最大１０倍に達する。
【0010】
ＬＥＡＰＥＲシステムでは、著者はこのシステムのトリプレット選好性を直接にテストした（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。図３に示すように、ＬＥＡＰＥＲシステムでは、ＲＥＳＴＯＲＥシステムと同様に、修飾や修正をしていない完全なＡＤＡＲを採用しているので、ＲＥＳＴＯＲＥシステムと同様のトリプレット選好性を示していることは容易に理解できる。図３から、ＬＥＡＰＥＲシステムでは、最も編集効率が低かったのもＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧの３塩基モチーフであり、その効率がゼロに近く、最も効率の高い３塩基モチーフはＵＡＧであり、ＬＥＡＰＥＲシステムでも、ＵＡＧに対する編集効率は同様に、上流残基がＧである３塩基モチーフに対する編集効率の最大１０倍以上である。以上のように、ＲＥＰＡＩＲシステムでは、外因的に過剰発現されたＣａｓ１３－ＡＤＡＲを用いているため、トリプレット選好性が若干異なっている。一方、ＬＥＡＰＥＲシステムとＲＥＳＴＯＲＥシステムでは、いずれも修飾や変更をしていないＡＤＡＲを採用しているため、そのトリプレット選好性は類似のパターンを呈している。すべての３塩基モチーフの中で、このような修飾や変更をしていないＡＤＡＲで編集した場合、ＵＡＧに対する編集効率が最も高いか、ＵＡＧは最も高いいくつかの３塩基モチーフの１つである。一方、５’上流残基がＧである場合、その編集効率は著しく低下し、さらにはゼロに近く、両者の間には１０倍以上の差がある。これは、従来技術において、内在性ＡＤＡＲを用いてＲＮＡ編集を行うシステムでは、３塩基モチーフ中の５’上流残基がＧである部位をほとんど編集できないことを示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ａｄｉｋｕｓｕｍａ， Ｆ．， Ｐｉｌｔｚ， Ｓ．， Ｃｏｒｂｅｔｔ， Ｍ． Ａ．， Ｔｕｒｖｅｙ， Ｍ．， ＭｃＣｏｌｌ， Ｓ． Ｒ．， Ｈｅｌｂｉｇ， Ｋ． Ｊ．， ．．． ＆ Ｔｈｏｍａｓ， Ｐ． Ｑ． （２０１８）． Ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃａｓ９ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ，５６０（７７１７）， Ｅ８－Ｅ９．
【非特許文献2】Ｃｏｘ， Ｄ． Ｂ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｓ．， Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ． Ｏ．， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｂ．， Ｋｅｌｌｎｅｒ， Ｍ． Ｊ．， Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．， ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｆ． （２０１７）． ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３５８（６３６６）， １０１９－１０２７．
【非特許文献3】Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ， Ｃ． Ｔ．， Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ， Ｐ． Ｓ．， Ｄｅｖｅｒ， Ｄ． Ｐ．， Ｃａｍａｒｅｎａ， Ｊ．， Ｌｅｍｇａｒｔ， Ｖ． Ｔ．， Ｃｒｏｍｅｒ， Ｍ． Ｋ．， ．．． ＆ Ｂｅｈｌｋｅ， Ｍ． Ａ． （２０１９）． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２５（２）， ２４９－２５４．
【非特許文献4】Ｃｕｌｌｏｔ， Ｇ．， Ｂｏｕｔｉｎ， Ｊ．， Ｔｏｕｔａｉｎ， Ｊ．， Ｐｒａｔ， Ｆ．， Ｐｅｎｎａｍｅｎ， Ｐ．， Ｒｏｏｒｙｃｋ， Ｃ．， ．．． ＆ Ｂｉｂｅｙｒａｎ， Ａ． （２０１９）． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｍｅｇａｂａｓｅ－ｓｃａｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１０（１）， １－１４．
【非特許文献5】Ｅｎａｃｈｅ， Ｏ． Ｍ．， Ｒｅｎｄｏ， Ｖ．， Ａｂｄｕｓａｍａｄ， Ｍ．， Ｌａｍ， Ｄ．， Ｄａｖｉｓｏｎ， Ｄ．， Ｐａｌ， Ｓ．， ．．． ＆ Ｔｈｏｒｎｅｒ， Ａ． Ｒ． （２０２０）． Ｃａｓ９ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ｐ５３ ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｓ ｆｏｒ ｐ５３－ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １－７．
【非特許文献6】Ｈａａｐａｎｉｅｍｉ， Ｅ．， Ｂｏｔｌａ， Ｓ．， Ｐｅｒｓｓｏｎ， Ｊ．， Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒ， Ｂ．， ＆ Ｔａｉｐａｌｅ， Ｊ． （２０１８）． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｐ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２４（７）， ９２７－９３０．
【非特許文献7】Ｍｅｒｋｌｅ， Ｔ．， Ｍｅｒｚ， Ｓ．， Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ， Ｐ．， Ｂｌａｈａ， Ａ．， Ｌｉ， Ｑ．， Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， ．．． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． （２０１９）． Ｐｒｅｃｉｓｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３７（２）， １３３－１３８．
【非特許文献8】Ｑｕ， Ｌ．， Ｙｉ， Ｚ．， Ｚｈｕ， Ｓ．， Ｗａｎｇ， Ｃ．， Ｃａｏ， Ｚ．， Ｚｈｏｕ， Ｚ．， ．．． ＆ Ｂａｏ， Ｙ． （２０１９）． Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＲＮＡｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３７（９）， １０５９－１０６９．
【非特許文献9】Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， Ｍｏｓｃｈｒｅｆ， Ｍ．， Ｌｉ， Ｑ．， Ｍｅｒｋｌｅ， Ｔ．， Ｓｅｌｖａｓａｒａｖａｎａｎ， Ｋ． Ｄ．， Ｌｉ， Ｊ． Ｂ．， ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． （２０１８）． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｉｔｈ ＳＮＡＰ－ｔａｇｇｅｄ ＡＤＡＲｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ，１５（７）， ５３５－５３８．
【非特許文献10】Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ Ｋ． （２０１０）． Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７９， ３２１－３４９
【非特許文献11】Ｐａｕｌ Ｖｏｇｅｌ， Ｍａｔｉｎ Ｍｏｓｃｈｒｅｆ， Ｑｉｎ Ｌｉ， Ｔｏｂｉａｓ Ｍｅｒｋｌｅ， Ｋａｒｔｈｉｋａ Ｄ． Ｓｅｌｖａｓａｒａｖａｎａｎ， Ｊｉｎ Ｂｉｌｌｙ Ｌｉ ＆ Ｔｈｏｒｓｔｅｎ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ． （２０１８）． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｉｔｈ ＳＮＡＰ－ｔａｇｇｅｄ ＡＤＡＲｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５， ５３５－５３８ （２０１８）．
【非特許文献12】Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ． Ｏ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ． Ｓ．， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｂ．， Ｋｏｏｂ， Ｊ．， Ｋｅｌｌｎｅｒ， Ｍ． Ｊ．， Ｌａｄｈａ， Ａ．， ．．． ＆ Ｚｈａｎｇ， Ｆ． （２０１９）． Ａ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｏｒ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３６５（６４５１）， ３８２－３８６
【非特許文献13】Ｖｕ， Ｌ． Ｔ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｔ． Ｔ． Ｋ．， Ｍｄ Ｔｈｏｕｆｉｃ， Ａ． Ａ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， ＆ Ｔｓｕｋａｈａｒａ， Ｔ． （２０１６）． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ： ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ， ８７（４）， ５８３－５９３．
【非特許文献14】Ｋｅｐｐｌｅｒ， Ａ．， Ｇｅｎｄｒｅｉｚｉｇ， Ｓ．， Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ， Ｔ．， Ｐｉｃｋ， Ｈ．， Ｖｏｇｅｌ， Ｈ．， ＆ Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｋ． （２００３）． Ａ ｇｅｎｅｒａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２１（１）， ８６－８９
【非特許文献15】Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ．， ＆ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ． Ｆ． （２０１２）． Ａｎ ＲＮＡ－Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ Ｒｅｐａｉｒｓ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ， ５１（４４）， １１１６６－１１１６９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
従来技術では、デアミナーゼを利用したＲＮＡ編集技術システムのトリプレット選好性は、従来のＲＮＡ編集技術の応用範囲を制限していた。例えば、従来のＲＮＡ編集技術は３塩基モチーフ中の上流残基がＧである部位に対してほとんど無策であり、これにより、このシステムの疾患治療への応用が大幅に制限されている。遺伝病の場合、もしその病原遺伝子突然変異の上流残基がちょうどＧであれば、既知のＲＮＡ編集手段を用いて修正と治療を行うことは難しい。一方、本発明が解決しようとする課題は、従来技術において好ましい３塩基モチーフ以外の他の３塩基モチーフ、例えばＵＡＧ以外の３塩基モチーフを対象とし、デアミナーゼを標的ＲＮＡにリクルートして正確に編集するためのリクルートＲＮＡ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＲＮＡ、ｄＲＮＡ又はａｒＲＮＡ）の配列を正確に調整することによって、既存のデアミナーゼに何らの修飾や変更を加えることなくトリプレット選好性の制限をなくし、３塩基モチーフ中の上流残基がＧ又はＣである場合の編集効率を大幅に向上させることである。
【0013】
そのため、一態様では、本願は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法を提供する。
【0014】
いくつかの実施形態では、本願は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基及び下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法を提供する。
【0015】
いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＣである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＣである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＵである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフは、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＵＡＡ、ＵＡＣ、及びＵＡＵから選択される。
【0016】
本願に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基がＧである場合、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基がＧである場合、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基としてＡＣＧ又はＡＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＡＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＵＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＣ又はＵＣＣを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＵＣＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＧＣＧ又はＧＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記相補的なＲＮＡ配列中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＧＣＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＵＣＣ又はＵＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＣＣＧである。
【0017】
いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するシチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）又はウリジン（Ｕ）を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するＣを含む。
【0018】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡとハイブリダイズする際に、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非標的アデノシンに対向するミスマッチヌクレオシドはグアノシンである。
【0019】
いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基は、前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡであり、前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するＣを含み、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡであり、前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するＣを含み、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧであり、前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。
【0020】
本願の上記ＲＮＡ編集方法において、ＲＮＡの編集効率は、従来技術と比較して、少なくとも９０％～１１００％、例えば、少なくとも１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％向上する。
【0021】
いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）によって脱アミノ化される。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは天然ＡＤＡＲ又はその相同タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、修飾されているがアデノシンデアミナーゼ活性を保持しているアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントであり、例えば、天然ＡＤＡＲ又はその相同タンパク質に基づいて１つ以上の部位突然変異によって修飾されているが、アデノシンデアミナーゼ活性を有しているバリアントである。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＡＲ触媒ドメイン又はその相同タンパク質触媒ドメイン、又はアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲタンパク質触媒ドメインを含む融合タンパク質は、突然変異によって触媒活性が失われたＣａｓ１３タンパク質と、ＡＤＡＲ機能ドメイン又はＡＤＡＲ相同タンパク質機能ドメイン又はアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは、前記宿主細胞内に外来的に導入されるか、又は、このデアミナーゼが導入された構築物によって宿主細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲタンパク質触媒ドメインを含む前記融合タンパク質は、λＮペプチドとＡＤＡＲ機能ドメイン又はその相同タンパク質触媒ドメイン、又はアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲタンパク質触媒ドメインを含む前記融合タンパク質は、ＳＮＡＰ－ｔａｇで標識されたＡＤＡＲ又はＳＮＡＰ－ｔａｇで標識されたＡＤＡＲ機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ１及び／又はＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１及びマウスＡＤＡＲ２からなる群から選択される１つ以上のＡＤＡＲである。
【0022】
いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲは前記宿主細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは宿主細胞、例えば真核細胞に天然又は内因的に存在する。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲタンパク質は前記宿主細胞に外来的に導入される。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲ又は前記ＡＤＡＲをコードする構築物は宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記構築物は、線状核酸、プラスミド、ウイルスなどを含むが、これらに限定されない。上記の方法では、前記ＡＤＡＲは、上記天然ＡＤＡＲ、その相同タンパク質、修飾されているがアデノシンデアミナーゼ活性を保持しているアデノシンデアミナーゼの機能的バリアント（例えば、天然ＡＤＡＲ又はその相同タンパク質に基づいて１つ以上の部位突然変異によって修飾されているがアデノシンデアミナーゼ活性を有するバリアント）、又はＡＤＡＲ触媒ドメイン、その相同タンパク質触媒ドメイン若しくはアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、宿主細胞にいずれかのタンパク質を導入することを含まない。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ１及び／又はＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１及びマウスＡＤＡＲ２からなる群から選択される１つ以上のＡＤＡＲである。
【0023】
本願の別の態様は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、前記標的残基はシチジンであり、前記ａｒＲＮＡはＲＮＡに作用するシチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼ（又は「シチジンデアミナーゼ」と称する。本願では、シチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼとシチジンデアミナーゼとは同一の意味を示し、交換して使用することができる）をリクルートし、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼ、又はシチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼをコードするものを含む構築物を宿主細胞に導入する。前記方法では、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、標的残基はシチジン（Ｃ）であり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、前記標的シチジンが位置する３塩基モチーフは、ＧＣＧ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＵ、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＵ、ＣＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、及びＵＣＧから選択されるいずれかである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡの標的残基に対応する位置に、標的残基とのミスマッチを形成するための非対合ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡとハイブリダイズし得る相補的なＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の前記標的シチジンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的シチジンに直接対向するウリジンを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡの非標的部位との１つ以上のミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する非標的編集部位に１つ以上の非対合ヌクレオチドを含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＡであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記下流残基に対向する塩基はＵ又はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＡＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＵ又はＧＵＵを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＡＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＵを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＵＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＡ、ＧＵＡ又はＣＵＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＵＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧ又はＵＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＣＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＧを含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは、ＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質に対して遺伝子修飾を行ってＣからＵへの触媒活性を得るデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記シチジンデアミナーゼは修飾されたＡＤＡＲ２であり、Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、Ｎ５９７Ｉ、Ｌ３３２Ｉ、Ｉ３９８Ｖ、Ｋ３５０Ｉ、Ｍ３８３Ｌ、Ｄ６１９Ｇ、Ｓ５８２Ｔ、Ｖ４４０Ｉ、Ｓ４９５Ｎ、Ｋ４１８Ｅ、Ｓ６６１Ｔから選択される１つ以上の突然変異したＡＤＡＲ２触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、Ｎ５９７Ｉ、Ｌ３３２Ｉ、Ｉ３９８Ｖ、Ｋ３５０Ｉ、Ｍ３８３Ｌ、Ｄ６１９Ｇ、Ｓ５８２Ｔ、Ｖ４４０Ｉ、Ｓ４９５Ｎ、Ｋ４１８Ｅ、Ｓ６６１Ｔのすべての突然変異のＡＤＡＲ２触媒ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは標的ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記標的ドメインは、突然変異によって触媒活性が失われたＣａｓ１３タンパク質、λＮペプチド、ＳＮＡＰ－ｔａｇから選択されるいずれかを含むが、これらに限定されない。変異によって触媒活性が失われたＣａｓ１３タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、変異によって触媒活性が失われたＣａｓ１３タンパク質と、シチジンデアミナーゼ活性を有するＡＤＡＲ２触媒ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは、前記宿主細胞内に外来的に導入されるか、又は、このデアミナーゼが導入された構築物によって宿主細胞内で発現される。
【0027】
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記シチジンデアミナーゼ又は融合タンパク質、又はシチジンデアミナーゼ又は融合タンパク質をコードする構築物を、標的ＲＮＡを含む細胞に導入することを含み、前記シチジンデアミナーゼ又は融合タンパク質をコードする構築物は、線状核酸、プラスミド、ウイルス、及び線状核酸から選択されるいずれかを含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフ中の標的残基はシチジンであり、前記３塩基モチーフの上流残基はＧ、Ｃ、Ａ及びＵのヌクレオチドから選択され、好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕの順である。
【0028】
本願の上記方法によれば、前記ａｒＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は完全に一本鎖である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上（例えば、１、２、３又はそれ以上）の二本鎖領域及び／又は１つ以上のステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは前記相補的なＲＮＡ配列のみからなる。
【0029】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約２０～２６０ヌクレオチドであり、例えば、前記ａｒＲＮＡの長さは、４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０又は１０５～１４０ヌクレオチドのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約６０～２００ヌクレオチド（例えば、約６０～１５０、６５～１４０、６８～１３０、７０～１２０のいずれか）である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはＡＤＡＲリクルートドメインも含む。
【0030】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学的修飾はメチル化及び／又はチオリン酸化、例えば、２’－Ｏ－メチル化（２’－Ｏ－Ｍｅ）及び／又はヌクレオチド間チオリン酸エステル結合を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの首尾の３個又は５個のヌクレオチドは２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含み、及び／又はその首尾の３個、４個又は５個のヌクレオチド間の結合はチオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中のウリジンの１つ以上又はすべてが２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端及び／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端及び／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は、３’－チオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはいかなる化学的修飾も含まない。
【0031】
本発明はまた、本発明に係る標的ＲＮＡを編集する方法により製造された編集されたＲＮＡ又は編集されたＲＮＡを含む宿主細胞を提供する。
【0032】
本発明に係る宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法は個体における疾患又は障害を治療又は予防するために使用することができる。したがって、本発明はまた、本発明に係る宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法のいずれかによって、個体細胞内の前記疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体における疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記疾患又は障害は、遺伝性遺伝子疾患、又は１つ以上の獲得遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患又は障害である。
【0033】
本発明はまた、本発明に係る方法で使用され得るＲＮＡに作用するデアミナーゼをリクルートすることにより、標的ＲＮＡ中の標的残基を脱アミノ化するＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）であって、標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は標的ＲＮＡの上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを含むＲＮＡを提供する。
【0034】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するＣを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする際に、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非標的アデノシンに対向するミスマッチヌクレオシドはグアノシンである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記ａｒＲＮＡは前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＡＣＧ又はＡＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記ａｒＲＮＡは前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＡＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記ａｒＲＮＡは、前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＵＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＣ又はＵＣＣを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記ａｒＲＮＡ中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＵＣＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記ａｒＲＮＡは前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＧＣＧ又はＧＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記ａｒＲＮＡの前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＧＣＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記ａｒＲＮＡは前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＵＣＣ又はＵＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記ａｒＲＮＡ中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＣＣＧである。
【0035】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、約２０～２６０ヌクレオチド、例えば４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０又は１０５～１４０ヌクレオチドのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約６０～２００ヌクレオチド（例えば、約６０～１５０、６５～１４０、６８～１３０、７０～１２０のいずれか）である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはＡＤＡＲリクルートドメインも含む。
【0036】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学的修飾はメチル化及び／又はチオリン酸化、例えば、２’－Ｏ－メチル化（２’－Ｏ－Ｍｅ）及び／又はヌクレオチド間チオリン酸エステル結合を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの首尾の３個又は５個のヌクレオチドは２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含み、及び／又はその首尾の３個、４個又は５個のヌクレオチド間の結合はチオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中のウリジンの１つ以上又はすべてが２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端及び／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端及び／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は３’－チオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはいかなる化学的修飾も含まない。
【0037】
本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡを含み、該ａｒＲＮＡがいかなる化学的修飾も含まないウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を提供する。本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡ、又は本発明に係る上記のいずれかのウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含むライブラリーを提供する。本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡ、又は本発明に係る上記のいずれかのウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡ、又は本発明に係る上記のいずれかのウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡを含む宿主細胞は真核細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0038】
【図1】ＲＥＰＡＩＲシステムのトリプレット選好性（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， ２０１７）である。
【図2】ＳＮＡＰ－ＡＤＡＲシステムのトリプレット選好性（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１８）である。
【図3】ＬＥＡＰＥＲシステムのトリプレット選好性（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）である。
【図4】ＬＥＡＰＥＲシステムの基本的な流れと本例の改良である。
【図5】１６種類の３塩基モチーフを構築するレポーターシステムである。
【図6】従来技術におけるＬＥＡＰＥＲシステムのａｒＲＮＡ設計原則と３塩基モチーフに対応する結果による１６種類の３連続相補的塩基の設計である。
【図7】ＵＡＧ３塩基モチーフレポーターシステムの最初のテストである。
【図8】ＵＡＧ３塩基モチーフレポーターシステムの繰り返し実験である。
【図9】ＬＥＡＰＥＲシステムの文献に報告されたＵＡＧ３塩基モチーフレポーターシステムのテストである（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。
【図10】ＵＡＧ３塩基モチーフの編集効率の測定である。
【図12】本例におけるａｒＲＮＡ設計の改良である。
【図13A】本例に基づいてａｒＲＮＡ設計を改良した後の編集効率の向上であり、３塩基モチーフＧＡＡ（図１３Ａ）、ＧＡＵ（図１３Ｂ）、ＧＡＧ（図１３Ｃ）、ＧＡＣ（図１３Ｄ）に対するａｒＲＮＡ設計の改良を含む。
【図13B】本例に基づいてａｒＲＮＡ設計を改良した後の編集効率の向上であり、３塩基モチーフＧＡＡ（図１３Ａ）、ＧＡＵ（図１３Ｂ）、ＧＡＧ（図１３Ｃ）、ＧＡＣ（図１３Ｄ）に対するａｒＲＮＡ設計の改良を含む。
【図13C】本例に基づいてａｒＲＮＡ設計を改良した後の編集効率の向上であり、３塩基モチーフＧＡＡ（図１３Ａ）、ＧＡＵ（図１３Ｂ）、ＧＡＧ（図１３Ｃ）、ＧＡＣ（図１３Ｄ）に対するａｒＲＮＡ設計の改良を含む。
【図13D】本例に基づいてａｒＲＮＡ設計を改良した後の編集効率の向上であり、３塩基モチーフＧＡＡ（図１３Ａ）、ＧＡＵ（図１３Ｂ）、ＧＡＧ（図１３Ｃ）、ＧＡＣ（図１３Ｄ）に対するａｒＲＮＡ設計の改良を含む。
【図14】Ｒｅｐｏｒｔｅｒ１プラスミドマップ及び配列である。
【図15】ＣからＵへの編集システムのテストを示し、標的残基はＣであり、上流残基及び３連続相補的塩基中の標的Ｃに対向する塩基の変化が編集効率に与える影響をテストしたものである。図においては、「／」は、対応するプラスミドやａｒＲＮＡが添加されておらず、同じ体積の水だけが添加されていることを示している。
【図17】ＣからＵへの編集システムのテストである。ａｒＲＮＡの３連続相補的塩基に標的Ｃとのミスマッチのみがあり、しかも標的Ｃに対応するミスマッチ塩基はＵであり、標的Ｃの上流残基及び下流残基と完全にマッチングした場合のテスト結果である。
【図19A】図１８と図１７で用いた各３塩基モチーフ及び３連続相補的塩基のマッチング解析を示している。図１９Ａの３塩基モチーフ及び３連続相補的塩基は、図１８の結果を得るために用いられ、図１９Ｂの３塩基モチーフ及び３連続相補的塩基は図１７の結果を得るために用いられる。
【図19B】図１８と図１７で用いた各３塩基モチーフ及び３連続相補的塩基のマッチング解析を示している。図１９Ａの３塩基モチーフ及び３連続相補的塩基は、図１８の結果を得るために用いられ、図１９Ｂの３塩基モチーフ及び３連続相補的塩基は図１７の結果を得るために用いられる。
【図20】複数のミスマッチ及び単一のミスマッチの場合の編集効率を、レポートシステムを用いて比較した結果を％ＧＦＰで示すものである。３塩基モチーフ中の標的残基Ｃと対合する塩基はＣであり、標的残基の下流残基に対向する塩基はＵである。図において、「ｍＲＮＡ ５’塩基」は３塩基モチーフの上流残基を示している。言及していない他の塩基については、ｍＲＮＡとａｒＲＮＡは全て厳密に相補対を形成している。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本発明は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。前記ａｒＲＮＡは相補的なＲＮＡ配列を含み、前記相補的なＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成し、ＲＮＡに作用するデアミナーゼをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的残基を脱アミノ化し、該脱アミノ化後に前記残基の塩基型を変化させる。本願は標的ＲＮＡを編集する方法を提供し、ａｒＲＮＡと前記標的ＲＮＡの設計により、ＡＤＡＲを用いた従来技術のＲＮＡ編集システムの、ＡＤＡＲの自然な選好性に適合しないＵＡＧ以外の他の３塩基モチーフに対する編集効率を著しく向上させ、ＲＮＡ編集の応用において従来から編集部位の選択に存在していた制限を無くする。本願の上記方法によれば、ＲＮＡ編集方法による疾患治療の範囲を飛躍的に広げ、効果を向上させることができ、より多くの疾患、例えば遺伝子突然変異に起因する遺伝性疾患がＲＮＡ編集方法により安全かつ効果的に治療されることを可能にする。本願に係る方法及び／又はａｒＲＮＡを使用することにより、将来のＲＮＡ編集療法により治療可能なＧ－＞Ａ突然変異に起因する疾患については、その突然変異部位が位置する３塩基モチーフをより柔軟に選択することができる。例えば、前記突然変異部位が位置する３塩基モチーフがＧＡＵである場合、従来技術の編集効率は治療上の要求を全く達成できないが、本願に係る方法によって達成される編集効率は従来技術の少なくとも１０倍を超える。さらに、適切に改変されたＡＤＡＲタンパク質は、Ｃ－＞ＵのＲＮＡ塩基編集を行うことができるので、本発明の方法は、標的残基がＣである様々な３塩基モチーフに対するＲＮＡ編集システムの編集効率を向上させることもできる。
【0040】
したがって、本願は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法を提供する。
【0041】
本明細書に記載の「標的ＲＮＡ」は予め編集されたＲＮＡである。本願における「塩基」及び「残基」とは、例えば、「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」、「ヒポキサンチン」のような核酸塩基を指す。「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」、「イノシン」という用語は、リボース又はデオキシリボースの糖部分に連結された核酸塩基を指す。「ヌクレオシド」という用語は、リボース又はデオキシリボースに連結された核酸塩基を指す。「ヌクレオチド」とは、それぞれの核酸塩基－リボシル－リン酸エステル又は核酸塩基－デオキシリボシル－リン酸エステルを意味する。アデノシンとアデニン（略称「Ａ」）、グアノシンとグアニン（略称「Ｇ」）、シトシンとシチジン（略称「Ｃ」）、ウラシルとウリジン（略称「Ｕ」）、チミンとチミジン（略称「Ｔ」）、イノシンとヒポキサンチン（略称「Ｉ」）という用語は交換して使用することができ、対応する核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドを指す。核酸鎖内の前のヌクレオチドの３’水酸基及び次のヌクレオチドの５’リン酸は、３’，５’リン酸ジエステル結合を形成し、３’から１つの水酸基－ＯＨを脱離したものは本明細書では「ヌクレオチド残基」又は「残基」と呼ばれる。文脈が明示的に異なる場合を除き、核酸塩基、塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド残基及び残基という用語は交換して使用されることがある。
【0042】
本明細書で使用される場合、核酸の「相補」とは、従来のワトソン－クリック塩基対合を介して一方の核酸が他方の核酸と水素結合を形成する能力を意味する。パーセンテージ相補性は、他の核酸分子と水素結合を形成することができる（すなわち、ワトソン－クリック塩基対合）核酸分子中の残基のパーセンテージを表す（例えば、１０個のうち約５、６、７、８、９、１０個はそれぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％相補的である）。「完全に相補」とは、核酸配列の連続するすべての残基が、第２核酸配列の同数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される場合、「実質的に相補」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０又はそれ以上のヌクレオチドの領域内において、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％のいずれかの相補程度、又は厳密な条件下でハイブリダイズした２本の核酸を指す。単一の塩基又は単一のヌクレオチドについては、ワトソン－クリック塩基対合の原則に基づき、ＡとＴ又はＵ、ＣとＧ又はＩが対合する場合、相補又はマッチングと呼ばれ、その逆もまた同様であり、それ以外の塩基対合はすべて非相補又は非マッチングと呼ばれる。
【0043】
「ハイブリダイズ」とは、ポリヌクレオチドの１種以上が反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化された複合体を形成する反応をいう。前記水素結合は、ワトソン－クリック塩基対合、フーグスタイン結合、又は他の配列特異的な方式で発生することができる。所定の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補的配列」と呼ばれる。
【0044】
「ＲＮＡ編集」（ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ）という用語は、ＲＮＡに発生する塩基の挿入、欠損、置換などの現象である。多くのＲＮＡ編集システムによく使用される酵素はＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）、そのバリアント又はその機能ドメインを含む複合体である。ＡＤＡＲタンパク質ファミリーは特定のＲＮＡの二本鎖領域に結合することができ、アデノシン（Ａ）ヌクレオシド塩基から－ＮＨ２基を除去し、Ａをイノシン（Ｉ）に変えることができ、後者は翻訳中にグアノシン（Ｇ）として認識され、その後の細胞翻訳中にシチジン（Ｃ）と対合する。Ａ－＞Ｉ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－ｔｏ－ｉｎｏｓｉｎｅ）のＲＮＡ編集は動物で最も一般的なＲＮＡ編集タイプであり、例えば、トランスクリプトームレベルでアミノ酸配列を変化させたり、ｍＲＮＡせん断、ｍＲＮＡ安定性や環状ＲＮＡ形成などを制御したりするなど、転写レベルと転写後レベルの多種の遺伝子制御機序に広く関与する（Ｎｉｓｈｋｕｒａ Ｋ． ２０１０）。哺乳動物の細胞には、ＡＤＡＲ１（２つのアイソタイプ、ｐ１１０とｐ１５０）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３（触媒活性なし）の３種類のＡＤＡＲタンパク質が存在する。研究者はλＮペプチドをヒトＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２デアミナーゼドメインと融合してλＮ－ＡＤＡＲＤＤシステムを構築し、このシステムはＢｏｘＢステムループとアンチセンスＲＮＡからなる融合ＲＮＡによって誘導でき、特定のＲＮＡ標的を結合できる。この方法により、標的Ａ塩基で標的ＡをＩに編集し（Ａ－Ｃミスマッチを導入）、ＡからＧへのＲＮＡ塩基編集をもたらすことができる。他のＲＮＡ編集方法としては、アンチセンスＲＮＡをＲ／Ｇモチーフ（ＡＤＡＲ－リクルートＲＮＡ足場）に融合させることで、哺乳動物の細胞においてＡＤＡＲ１又はＡＤＡＲ２タンパク質を過剰発現させることにより標的ＲＮＡを編集すること；及びｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲを利用してＲＮＡを正確に標的化して編集することが含まれる。ＲＮＡレベルの編集は、ゲノム損傷を避ける一方で、最終的な生物機能に変化を与えることができる。
【0045】
本明細書では、「デアミナーゼリクルートＲＮＡ」、「ｄＲＮＡ」、「ａｒＲＮＡ」、又は「ＡＤＡＲリクルートＲＮＡ」という用語は交換して使用されてもよく、ＡＤＡＲ、ＡＤＡＲバリアント、又はそのドメインを含むいくつかの複合体をリクルートし、ＲＮＡで標的アデノシンを脱アミノ化するか、又は標的シチジンを脱アミノ化することができるＲＮＡを意味する。本願の文脈において、「標的ＲＮＡ」とは、デアミナーゼリクルートＲＮＡ配列がこれと完全又は実質的に相補的であるように設計されたＲＮＡ配列をいい、標的ＲＮＡに標的残基が含まれる。本明細書では、「標的残基」とはＲＮＡ編集により、例えばＡＤＡＲ酵素やａｒＲＮＡを導入することにより改変されたヌクレオチド残基を指す。標的配列とａｒＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションは、標的残基を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成し、標的残基に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）又はそのバリアントをリクルートし、この酵素又はそのバリアントは標的残基を脱アミノ化する。
【0046】
「３塩基モチーフ」とは、標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）との連続した３塩基モチーフを意味する。本願の文脈における「３塩基モチーフ」では、「標的残基」は「編集部位」に位置するので、特段の記載がない限り、この両方は交換して使用されてもよい。３塩基モチーフ中の上流残基と下流残基は、標的残基に対するＲＮＡ編集がより高い効率で行われ得るか否かを決定することが多い。例えば、ＲＥＰＡＩＲ（ＷＯ２０１９００５８８４Ａ１）、ＲＥＳＴＯＲＥ（ＷＯ２０２０００１７９３Ａ１）、ＬＥＡＰＥＲ（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）などのＲＮＡ編集システムでは、３塩基モチーフごとに編集効率が異なり、本明細書では、このように３塩基モチーフごとに編集効率が異なることを「トリプレット選好性」と呼ぶ。
【0047】
本願では、相補的なＲＮＡ配列中の前記標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフに直接対向する３塩基、すなわち、前記標的残基に直接対向する塩基（本願では「標的塩基」と称する）、前記塩基の５’最近傍残基、及び前記塩基の３’最近傍残基からなる３連続モチーフを「３連続相補的塩基」と呼ぶ。
【0048】
本明細書では、３塩基モチーフと３連続相補的塩基はすべて５’から３’の順序である。
【0049】
本願の方法では、標的ＲＮＡとａｒＲＮＡとがハイブリダイズして標的残基を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成し、この二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域は該ＲＮＡに作用して標的残基を脱アミノ化するデアミナーゼをリクルートする。本発明に係る方法は、ａｒＲＮＡを設計し、前記ａｒＲＮＡ又は前記ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含む。前記ａｒＲＮＡ配列中の相補的なＲＮＡ配列と前記標的ＲＮＡとがハイブリダイズして形成される二本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡに作用するデアミナーゼをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的残基を脱アミノ化することができ、脱アミノ化後に前記残基の塩基型を変化させることができる。脱アミノ化作用により、アデノシン（Ａ）はクレアチニン（Ｉ）に変換され、Ｉはグアノシン（Ｇ）として認識され、ＡからＧへの編集が行われる。同様に、シチジン（Ｃ）は脱アミノ化してウリジン（Ｕ）に変換することができ、ＣからＵへの編集が行われる。
【0050】
例えば図２及び図３に示すように、ＲＮＡ編集にはトリプレット選好性がある。上流残基がグアノシン（Ｇ）である３塩基モチーフに対してより低いトリプレット選好性はＡＤＡＲを基礎とする従来のＲＮＡ編集方法の共通性である。同様に、ＣからＵへの編集においても、公開文献は明らかなトリプレット選好性を示している。このようなトリプレット選好性による制限のため、実際の応用の需要を満たし、高い編集効率を得るために、従来技術におけるデアミナーゼに基づく各種ＲＮＡ編集システムはできるだけトリプレット選好性のより高い３塩基モチーフを選択して編集しなければならない。これは、ＲＮＡ編集の応用範囲を制限している。本願は、ａｒＲＮＡ中の３塩基モチーフに直接対向する塩基にミスマッチをより多く導入することを含むことにより、従来技術におけるＡＤＡＲを用いたＲＮＡ編集システムの、デアミナーゼのトリプレット選好性に合致しない３塩基モチーフ中の標的塩基に対する編集効率を著しく向上させ、従来からのＲＮＡ編集の応用における編集部位選択に関する制限をなくする、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する改良方法を提供する。
【0051】
そのため、一態様では、本願は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成し、ＲＮＡに作用するデアミナーゼをリクルートして標的ＲＮＡ中の標的残基を脱アミノ化する相補的なＲＮＡ配列を含む方法を提供する。前記標的残基は１つの標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは、標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含む。５’から３’まで、前記上流残基、標的残基及び下流残基の順につながった３連続体を「３塩基モチーフ」と呼ぶ。本願では、すべての３塩基モチーフは５’から３’の表現で記載されている。また、前記標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフに対向する相補的なＲＮＡ配列中の３塩基モチーフも５’から３’の順序である。
【0052】
本願は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法を提供する。
【0053】
いくつかの実施形態では、本願は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは、標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基及び下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法を提供する。
【0054】
いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＣである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＣである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＵである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフは、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＵＡＡ、ＵＡＣ、及びＵＡＵから選択される。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣである。いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の上流残基は、Ｇ、Ｃ、Ａ及びＵのヌクレオチドから選択され、好ましくは、Ｇ＞Ｃ≒Ａ＞Ｕの順である。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するシチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）又はウリジン（Ｕ）を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するＣを含む。
【0055】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡとハイブリダイズする際に、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非標的アデノシンに対向するミスマッチヌクレオシドはグアノシンである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＡＣＧ又はＡＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＡＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＵＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＣ又はＵＣＣを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＵＣＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＧＣＧ又はＧＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記相補的なＲＮＡ配列の３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＧＣＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩であるＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＵＣＣ又はＵＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＣＣＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基は、前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡであり、前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するＣを含み、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡであり、前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに直接対向するＣを含み、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧであり、前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である。本願の上記方法によれば、ＲＮＡの編集効率は、従来技術と比較して少なくとも９０％～１１００％、例えば、少なくとも１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％向上する。
【0056】
いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）は、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）によって脱アミノ化される。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは天然ＡＤＡＲ又はその相同タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは修飾されているが、アデノシンデアミナーゼ活性を保持しているアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントであり、例えば、天然ＡＤＡＲ又はその相同タンパク質に基づいて１つ以上の部位突然変異によって修飾されているが、アデノシンデアミナーゼ活性を有しているバリアントである。いくつかの実施形態では、前記アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＡＲ触媒ドメイン又はその相同タンパク質触媒ドメイン、又はアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲタンパク質触媒ドメインを含む融合タンパク質は、突然変異によって触媒活性が失われたＣａｓ１３タンパク質と、ＡＤＡＲ機能ドメイン又はＡＤＡＲ相同タンパク質機能ドメイン又はアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは、前記宿主細胞内に外来的に導入されるか、又は、このデアミナーゼが導入された構築物によって宿主細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲタンパク質触媒ドメインを含む融合タンパク質は、λＮペプチドとＡＤＡＲ機能ドメイン又はその相同タンパク質触媒ドメイン、又はアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントとを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲタンパク質触媒ドメインを含む融合タンパク質は、ＳＮＡＰ－ｔａｇで標識されたＡＤＡＲ又はＳＮＡＰ－ｔａｇで標識されたＡＤＡＲ機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ１及び／又はＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１及びマウスＡＤＡＲ２からなる群から選択される１つ以上のＡＤＡＲである。
【0057】
いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲは宿主細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞、例えば真核細胞に天然又は内因的に存在する。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲタンパク質は宿主細胞に外来的に導入される。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲ又は前記ＡＤＡＲをコードする構築物は宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記構築物は、線状核酸、プラスミド、ウイルスなどを含むが、これらに限定されない。上記の方法では、前記ＡＤＡＲは、前記天然ＡＤＡＲ、その相同タンパク質、修飾されているがアデノシンデアミナーゼ活性を保持しているアデノシンデアミナーゼの機能的バリアント（例えば、天然ＡＤＡＲ又はその相同タンパク質に基づいて１つ以上の部位突然変異によって修飾されているがアデノシンデアミナーゼ活性を有するバリアント）、又はＡＤＡＲ触媒ドメイン、その相同タンパク質触媒ドメイン若しくはアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲ触媒ドメイン、その相同タンパク質触媒ドメイン若しくはアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントを含む融合タンパク質は、標的ドメイン及び前記ＡＤＡＲ触媒ドメイン、その相同タンパク質触媒ドメイン若しくはアデノシンデアミナーゼの機能的バリアントを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、前記標的ドメインは、突然変異によって触媒活性が失われたＣａｓ１３タンパク質、λＮペプチド、ＳＮＡＰ－ｔａｇのいずれかを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１及びマウスＡＤＡＲ２からなる群から選択される１つ以上のＡＤＡＲである。いくつかの実施形態では、前記方法は、宿主細胞にいずれかのタンパク質を導入することを含まない。いくつかの実施形態では、前記ＡＤＡＲはＡＤＡＲ１及び／又はＡＤＡＲ２である。
【0058】
本願の別の態様は、宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’近傍残基（下流残基）と、を含み、標的残基はシチジン（Ｃ）であり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法を提供し、さらに、前記方法は、シチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ又はそれをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼはＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質に対して遺伝子修飾を行ってＣ－Ｕ触媒活性を得るデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは標的ドメインをさらに含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、前記標的シチジンが位置する３塩基モチーフは、ＧＣＧ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＵ、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＵ、ＣＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、及びＵＣＧから選択されるいずれかである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡの標的残基に対応する位置に、標的残基とのミスマッチを形成するための非対合ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡとハイブリダイズし得る相補的なＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の前記標的シチジンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記標的シチジンに直接対向するシチジンを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡの非標的部位との１つ以上のミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する非標的編集部位に１つ以上の非対合ヌクレオチドを含む。実施例４では、３塩基モチーフ中に標的残基のみがミスマッチした場合と、３塩基モチーフ中に複数の残基がミスマッチした場合のそれぞれについて、シチジンからウリジンへの編集効率を測定した結果を図２２に示す。３塩基モチーフの上流残基がＡ又はＵである場合、複数のミスマッチは、標的残基のみがミスマッチした場合と同等の編集効率を達成できるが、３塩基モチーフの上流残基がＧである場合、標的残基のみがミスマッチした場合の編集効率は極めて低く、この場合、より多くのミスマッチを導入することで、ＣからＵへの編集効率を大幅に向上させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記上流残基に直接対向するＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＡＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＵ又はＧＵＵを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＡＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、好ましくは、前記３塩基モチーフに対向するＡＵＵを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＵＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＡ、ＧＵＡ又はＣＵＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＵＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、好ましくは、前記３塩基モチーフに対向するＡＵＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧ又はＵＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、好ましくは、前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＣＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記３塩基モチーフに対向するＡＵＧを含む。いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフ中の標的残基はシチジンであり、前記３塩基モチーフの上流残基はＧ、Ｃ、Ａ及びＵのヌクレオチドから選択され、好ましくはＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕの順である。
【0060】
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、シチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼを標的ＲＮＡにリクルートすることにより、標的ＲＮＡ中の標的シチジン（Ｃ）を脱アミノ化し、ウリジンに変換する。ここで、前記シチジンデアミナーゼは、シチジン脱アミノ活性を有するように修飾された（例えば、１つ以上の部位のアミノ酸欠損又は突然変異によって）アデノシンデアミナーゼ又はアデノシンデアミナーゼ相同タンパク質バリアントである。いくつかの実施形態では、前記シチジン脱アミノ活性を有するように修飾されたアデノシンデアミナーゼは、従来技術、例えばＡｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１９に開示されている、１つ以上の突然変異の、シチジン脱アミノ活性を有するアデノシンデアミナーゼ断片を含む。いくつかの実施形態では、シチジン脱アミノ活性を有するように修飾されたアデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、Ｎ５９７Ｉ、Ｌ３３２Ｉ、Ｉ３９８Ｖ、Ｋ３５０Ｉ、Ｍ３８３Ｌ、Ｄ６１９Ｇ、Ｓ５８２Ｔ、Ｖ４４０Ｉ、Ｓ４９５Ｎ、Ｋ４１８Ｅ、Ｓ６６１Ｔから選択される１つ以上の突然変異を含むＡＤＡＲ２である。いくつかの特定の実施形態では、シチジン脱アミノ活性を有するように修飾されたアデノシンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、Ｎ５９７Ｉ、Ｌ３３２Ｉ、Ｉ３９８Ｖ、Ｋ３５０Ｉ、Ｍ３８３Ｌ、Ｄ６１９Ｇ、Ｓ５８２Ｔ、Ｖ４４０Ｉ、Ｓ４９５Ｎ、Ｋ４１８Ｅ、Ｓ６６１Ｔの突然変異の全てを含むＡＤＡＲ２である。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、Ｎ５９７Ｉ、Ｌ３３２Ｉ、Ｉ３９８Ｖ、Ｋ３５０Ｉ、Ｍ３８３Ｌ、Ｄ６１９Ｇ、Ｓ５８２Ｔ、Ｖ４４０Ｉ、Ｓ４９５Ｎ、Ｋ４１８Ｅ、Ｓ６６１Ｔのすべての突然変異のＡＤＡＲ２触媒ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは標的ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記標的ドメインは、突然変異によって触媒活性が失われたＣａｓ１３タンパク質、λＮペプチド、ＳＮＡＰ－ｔａｇから選択されるいずれかを含むが、これらに限定されない。
【0061】
いくつかの実施形態では、前記方法は、前記シチジンデアミナーゼ、前記融合タンパク質、又は前記アデノシンデアミナーゼ若しくは前記融合タンパク質をコードする構築物を宿主細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、前記構築物は、線状核酸、プラスミド、ウイルスなどを含むが、これらに限定されない。
【0062】
本願の上記方法によれば、前記ａｒＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は完全に一本鎖である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の（例えば、１、２、３又はそれ以上の）の二本鎖領域及び／又は１つ以上のステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは前記相補的なＲＮＡ配列のみからなる。
【0063】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列と標的配列との間に２つ以上のミスマッチが存在する。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列の３連続相補的塩基以外にも、標的配列との間のミスマッチが１つ以上存在する。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列が標的配列とハイブリダイズするとき、１つ以上のゆらぎ対合が発生することがある。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列が標的配列とハイブリダイズするとき、１つ以上の片側突起が生じてもよい。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列が標的配列とハイブリダイズするとき、１つ以上のゆらぎ対及び１つ以上の片側突起が生じてもよい。
【0064】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約２０～２６０ヌクレオチドであり、例えば、前記ａｒＲＮＡの長さは、約３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上のヌクレオチドのうちのいずれか以下である。いくつかの実施形態では、相補的なＲＮＡ配列の長さは、４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０又は１０５～１４０ヌクレオチドのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約６０～２００ヌクレオチド（例えば、約６０～１５０、６５～１４０、６８～１３０、７０～１２０のいずれか）である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはＡＤＡＲリクルートドメインも含む。
【0065】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学的修飾はメチル化及び／又はチオリン酸化、例えば、２’－Ｏ－メチル化（２’－Ｏ－Ｍｅ）及び／又はヌクレオチド間チオリン酸エステル結合を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの首尾の３個又は５個のヌクレオチドは２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含み、及び／又はその首尾の３個又は５個のヌクレオチド間の結合はチオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中のウリジンの１つ以上又はすべてが２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端及び／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端及び／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は、３’－チオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはいかなる化学的修飾も含まない。
【0066】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ前駆体、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、及びスモールＲＮＡから選択されるＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明に係る方法では、標的ＲＮＡの標的残基の編集は、標的ＲＮＡのミスセンス変異、早期に出現した終止コドン、異常スプライシング、又は可変スプライシングを引き起こすか、又は標的ＲＮＡ中のミスセンス突然変異、早期に出現した終止コドン、異常スプライシング、又は可変スプライシングを逆転させることができる。いくつかの実施形態では、本発明に係る方法では、標的ＲＮＡにおける標的残基の編集は、標的ＲＮＡがコードするタンパク質の点突然変異、切断（トランケーション）、伸長、及び／又は誤った折り畳みをもたらすか、又は標的ＲＮＡのミスセンス突然変異、早期に出現した終止コドン、異常スプライシング、又は可変スプライシングを逆転することによって、機能的、全長、正しく折り畳まれた及び／又は野生型のタンパク質を得ることができる。
【0067】
本発明に係る方法によれば、いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は哺乳動物の細胞である。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞はヒト又はマウス細胞である。
【0068】
宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する本発明のいずれかの方法を用いて、編集されたＲＮＡ又は編集されたＲＮＡを含む宿主細胞を作製することができる。したがって、本発明はまた、本発明に係る標的ＲＮＡを編集する方法によって製造された、編集されたＲＮＡ又は編集されたＲＮＡを含む宿主細胞を提供する。
【0069】
本発明に係る宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法は個体における疾患又は障害を治療又は予防するために使用することができる。したがって、本発明はまた、本発明に係る宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法のいずれかによって、個体細胞内の前記疾患又は障害に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体における疾患又は障害を治療又は予防するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記疾患又は障害は、遺伝性遺伝子疾患、又は１つ以上の獲得遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患又は障害である。
【0070】
本発明はまた、本発明に係る方法で使用され得るＲＮＡに作用するデアミナーゼをリクルートすることにより、標的ＲＮＡ中の標的残基を脱アミノ化するＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）であって、標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは、標的ＲＮＡ中の標的残基の５’最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３’最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は標的ＲＮＡの上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを含むＲＮＡを提供する。
【0071】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的とする標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフの標的残基はアデノシンであり、前記標的ＲＮＡ中の上流残基はＧ、Ｃ、Ａ及びＵから選択されるヌクレオチドであり、好ましくはＧ＞Ｃ≒Ａ＞Ｕの順である。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフは、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＵＡＡ、ＵＡＣ、ＵＡＵから選択される。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するシチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）又はウリジン（Ｕ）を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記ａｒＲＮＡは前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンに直接対向するＣを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡとハイブリダイズする際に、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチをさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非標的アデノシンに対向するミスマッチヌクレオシドはグアノシンである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記ａｒＲＮＡは、前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＡＣＧ又はＡＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記ａｒＲＮＡは、前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＡＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記ａｒＲＮＡは、前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＵＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＣ又はＵＣＣを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記ａｒＲＮＡ中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＵＣＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記ａｒＲＮＡは、前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＧＣＧ又はＧＣＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記ａｒＲＮＡの前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＧＣＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記ａｒＲＮＡは前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基であるＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＵＣＣ又はＵＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記ａｒＲＮＡ中の前記３塩基モチーフに直接対向する３連続相補的塩基はＣＣＧである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチを含む。
【0072】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的とする標的ＲＮＡ中の３塩基モチーフ中の標的残基は標的シチジン（Ｃ）と呼ばれるシチジンであってもよい。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧ、Ｃ、Ａ及びＵから選択されるヌクレオチドであり、好ましくは、Ｇ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕの順である。いくつかの実施形態では、前記標的シチジンが位置する３塩基モチーフは、ＧＣＧ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＵ、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＵ、ＣＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、及びＵＣＧから選択されるいずれかである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフの下流残基はＡであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記下流残基に対向する塩基はＵ又はＡである。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＡＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＵ又はＧＵＵを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＡＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＵを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＵＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＡ、ＧＵＡ又はＣＵＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＵＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記３塩基モチーフに対向するＡＵＡを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧ又はＵＣＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧを含む。いくつかの実施形態では、前記３塩基モチーフはＣＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記３塩基モチーフに対向するＡＵＧを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡの標的残基に対応する位置に、標的残基とのミスマッチを形成するための非対合ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡとハイブリダイズし得る相補的なＲＮＡ配列は、前記標的ＲＮＡ中の前記標的シチジンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は、前記標的シチジンに直接対向するシチジンを含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、標的ＲＮＡの非標的部位との１つ以上のミスマッチを形成するために、標的ＲＮＡに対応する非標的編集部位に１つ以上の非対合ヌクレオチドを含む。
【0073】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列は完全に一本鎖である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の（例えば、１、２、３又はそれ以上の）の二本鎖領域と、１つ以上のステムループ領域と、を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の（例えば、１、２、３又はそれ以上の）の二本鎖領域を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の（例えば、１、２、３又はそれ以上の）のステムループ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素をリクルートするための分子内ステムループ構造を形成することができる領域を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素をリクルートするための分子内ステムループ構造を形成し得る領域を含まない。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは前記相補的なＲＮＡ配列のみからなる。
【0074】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列が標的配列とハイブリダイズするとき、１つ以上のゆらぎ対合が生じてもよい。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列が標的配列とハイブリダイズするとき、１つ以上の片側突起が生じてもよい。いくつかの実施形態では、前記相補的なＲＮＡ配列が標的配列とハイブリダイズするとき、１つ以上のゆらぎ対合及び１つ以上の片側突起が生じてもよい。
【0075】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約２０～２６０ヌクレオチドであり、例えば、前記ａｒＲＮＡの長さは、約３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００又はそれ以上のヌクレオチド以上のいずれかである。いくつかの実施形態では、相補的なＲＮＡ配列の長さは、４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～ １６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０又は１０５～１４０ヌクレオチドのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは約６０～２００ヌクレオチド（例えば、約６０～１５０、６５～１４０、６８～１３０、７０～１２０のいずれか）である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはＡＤＡＲリクルートドメインも含む。
【0076】
本発明に係るａｒＲＮＡによれば、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは１つ以上の化学的修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記化学的修飾はメチル化及び／又はチオリン酸化、例えば、２’－Ｏ－メチル化（２’－Ｏ－Ｍｅ）及び／又はヌクレオチド間チオリン酸エステル結合を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの首尾の３個又は５個のヌクレオチドは２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含み、及び／又はその首尾の３個又は５個のヌクレオチド間の結合はチオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中のウリジンの１つ以上又はすべてが２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は２’－Ｏ－Ｍｅ修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡ中の標的ヌクレオシド及び／又は標的ヌクレオシドの５’末端及び／又は３’末端に隣接するヌクレオシド（例えば、５’末端及び／又は３’末端に直接隣接する１つ又は２つのヌクレオシド）は、３’－チオリン酸エステル結合修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡはいかなる化学的修飾も含まない。
【0077】
本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡを含むウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖であって、前記ａｒＲＮＡはいかなる化学的修飾も含まない、ウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を提供する。本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡ、又は本発明に係る上記のいずれかのウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含むライブラリーを提供する。本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡ、又は本発明に係る上記のいずれかのウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含む組成物を提供する。本発明はまた、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡ、又は本発明に係る上記のいずれかのウイルスベクター、プラスミド又は線状核酸鎖を含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明に係る上記のいずれかのａｒＲＮＡを含む前記宿主細胞は真核細胞である。
【実施例】
【0078】
ＬＥＡＰＥＲ技術経路（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）を参照して、標的アデノシン（Ａ）を含む標的ＲＮＡと部分的又は完全に相補的なａｒＲＮＡに外来的に導入し、このＲＮＡを利用して内因性ＡＤＡＲをリクルートして、標的Ａに対してＡからＩへの編集を行った。前記ａｒＲＮＡはインビトロで合成され、長さが７１ｎｔ～１１１ｎｔである。図４に示すように、ＬＥＡＰＥＲのようなＡＤＡＲタンパク質又はその機能ドメインを用いた従来編集技術で使用されているＡＤＡＲタンパク質リクルートＲＮＡよりも、本発明で使用される、ａｒＲＮＡ中の標的配列中の３塩基モチーフに直接対向する３塩基は前記３塩基モチーフに対する相補性が弱く、すなわち、標的Ａとのミスマッチに加えて、ａｒＲＮＡ中の３塩基モチーフに直接対向する３塩基には、上流残基及び／又は下流残基とミスマッチした塩基が含まれている。この変更は、トリプレット選好性を打破し、ＡＤＡＲを用いた従来及び将来の編集方法が、上流残基がＧである３塩基モチーフ又は他のＵＡＧ以外の３塩基モチーフを、より自由かつ効率的に編集することを可能にする。
【0079】
実施例１：３塩基モチーフレポーターシステム及び対応するａｒＲＮＡの構築
まず、１６種類の３塩基モチーフを含むレポーターシステムを構築した。ＬＥＡＰＥＲの文献では、３塩基モチーフがＵＡＧの場合の編集効率の違いをテストしたため（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）、本実施例では、対照の一致性を保つために、ａｒＲＮＡのうち編集部位以外の相補対合が可能な部分は図５に示すようにＬＥＡＰＥＲ文献と同じ配列設計にした。原プラスミドＲｅｐｏｒｔｅｒ１は北京大学生命科学学院の魏文勝教授から贈呈され、プラスミドマップは図１４に示され、前記プラスミドは表４に示す配列を含む。表１に示す１６種類の３塩基モチーフ関連プライマーを合成し、「Ｊ．サムブルック、Ｍ．Ｒ．グリーン、分子クローン実験ガイドライン（第４版），２０１７」に記載の、当分野の研究者によく知られている手法に基づいて、表２に示す材料を用いてＰＣＲ増幅（Ｑ５（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，ＮＥＢ Ｍ０４９２Ｌ）、酵素切断（ＸｂａＩ，ＮＥＢ Ｒ０１４５Ｌ；ＡｓｃＩ，ＮＥＢ Ｒ０５５８Ｌ）、アガロースゲル回収（Ｓｅａｋｅｍ ＬＥ アガロース， Ｌｏｎｚａ ５５０２； ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ０８３２）及びアセンブリ（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｌ）を行い、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ１の元の標的ＲＮＡコード配列の代わりにＲｅｐｏｒｔｅｒ１に組み込み、その後、コンピテント細胞（Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１ Ｐｈａｇｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のＣＤ５０１－０２）に形質転換し、翌日クローンを取り出してシーケンシングを行った。シーケンシングの結果が正しいクローンについてプラスミド抽出を行い、レチノウイルスとしてパッケージングした。異なる３塩基モチーフをコードする遺伝子がパッケージングされたこれらのレチノウイルスを用いて、２９３Ｔ細胞をそれぞれ感染させた。感染４８時間後、異なる３塩基モチーフを含むｍＲＮＡ（標的ＲＮＡ）をそれぞれ転写できる１６種類の２９３Ｔ細胞を得て、すなわち、最終的な３塩基モチーフレポーターシステム細胞を得て、それらの命名は表２に示す３塩基モチーフと同じである。
まず、１６種類の３塩基モチーフを含むレポーターシステムを構築した。ＬＥＡＰＥＲの文献では、３塩基モチーフがＵＡＧの場合の編集効率の違いをテストしたため（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）、本実施例では、対照の一致性を保つために、ａｒＲＮＡのうち編集部位以外の相補対合が可能な部分は図５に示すようにＬＥＡＰＥＲ文献と同じ配列設計にした。原プラスミドＲｅｐｏｒｔｅｒ１は北京大学生命科学学院の魏文勝教授から贈呈され、プラスミドマップは図１４に示され、前記プラスミドは表４に示す配列を含む。表１に示す１６種類の３塩基モチーフ関連プライマーを合成し、「Ｊ．サムブルック、Ｍ．Ｒ．グリーン、分子クローン実験ガイドライン（第４版），２０１７」に記載の、当分野の研究者によく知られている手法に基づいて、表２に示す材料を用いてＰＣＲ増幅（Ｑ５（登録商標） Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，ＮＥＢ Ｍ０４９２Ｌ）、酵素切断（ＸｂａＩ，ＮＥＢ Ｒ０１４５Ｌ；ＡｓｃＩ，ＮＥＢ Ｒ０５５８Ｌ）、アガロースゲル回収（Ｓｅａｋｅｍ ＬＥ アガロース， Ｌｏｎｚａ ５５０２； ＧｅｎｅＪＥＴ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ０８３２）及びアセンブリ（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標） ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ， ＮＥＢ Ｅ２６２１Ｌ）を行い、Ｒｅｐｏｒｔｅｒ１の元の標的ＲＮＡコード配列の代わりにＲｅｐｏｒｔｅｒ１に組み込み、その後、コンピテント細胞（Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１ Ｐｈａｇｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のＣＤ５０１－０２）に形質転換し、翌日クローンを取り出してシーケンシングを行った。シーケンシングの結果が正しいクローンについてプラスミド抽出を行い、レチノウイルスとしてパッケージングした。異なる３塩基モチーフをコードする遺伝子がパッケージングされたこれらのレチノウイルスを用いて、２９３Ｔ細胞をそれぞれ感染させた。感染４８時間後、異なる３塩基モチーフを含むｍＲＮＡ（標的ＲＮＡ）をそれぞれ転写できる１６種類の２９３Ｔ細胞を得て、すなわち、最終的な３塩基モチーフレポーターシステム細胞を得て、それらの命名は表２に示す３塩基モチーフと同じである。
【0080】
ａｒＲＮＡ中の３塩基モチーフの上流残基及び／又は下流残基とのミスマッチが、その中のある特定の３塩基モチーフに対する編集効率を向上させることができるか否かをテストするために、本実施例では、化学合成により１６種類のａｒＲＮＡを合成したが、設計原則はｍＲＮＡにおける３塩基モチーフ中の標的Ａの３’下流５５ｎｔから５’上流２５ｎｔまでのＲＮＡ断片をとり、一本鎖ＲＮＡを逆相補することであり、ここで、３塩基モチーフ中の標的Ａに対応する塩基はＣである。ａｒＲＮＡにおける他の塩基が変化しない場合、上流残基及び下流残基に対応する塩基がそれぞれＡ、Ｃ、Ｇ又はＵから選ばれる１つであり、上流残基に対応するこれら４種類の塩基と下流残基に対応するこれら４種類の塩基との異なる組み合わせにより４×４＝１６種類のａｒＲＮＡが得られた。その具体的な配列を表３に示す。
【0081】
実施例２：各ａｒＲＮＡによるＵＡＧ３塩基モチーフの編集効率のＧＦＰ陽性割合での比較
図５に示すように、実施例１に記載の１６種類の標的ＲＮＡは、標的配列の３’末端にＧＦＰ緑色蛍光タンパク質核酸配列を有する。この配列は正常であれば正しく翻訳され、緑色蛍光を発光することができる。しかし、３塩基モチーフがＵＡＧの場合、ＵＡＧは終止コドンであるため、翻訳がそこで停止し、ＧＦＰへの翻訳ができなくなる。本実施例では、ＵＡＧ３塩基モチーフのＡをＬＥＡＰＥＲシステムで編集する。編集が成功すると、ＵＡＧはＵＩＧに変換され、ＵＩＧは翻訳中にＵＧＧとして認識され、翻訳が終了しなくなり、下流のＧＦＰが正常に翻訳されるようになる。したがって、ＧＦＰ陽性割合から、各ａｒＲＮＡの編集効率を大まかに判断することができる。
図５に示すように、実施例１に記載の１６種類の標的ＲＮＡは、標的配列の３’末端にＧＦＰ緑色蛍光タンパク質核酸配列を有する。この配列は正常であれば正しく翻訳され、緑色蛍光を発光することができる。しかし、３塩基モチーフがＵＡＧの場合、ＵＡＧは終止コドンであるため、翻訳がそこで停止し、ＧＦＰへの翻訳ができなくなる。本実施例では、ＵＡＧ３塩基モチーフのＡをＬＥＡＰＥＲシステムで編集する。編集が成功すると、ＵＡＧはＵＩＧに変換され、ＵＩＧは翻訳中にＵＧＧとして認識され、翻訳が終了しなくなり、下流のＧＦＰが正常に翻訳されるようになる。したがって、ＧＦＰ陽性割合から、各ａｒＲＮＡの編集効率を大まかに判断することができる。
【0082】
本研究のすべてのテストはＲＮＡｉ ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １３７７８１５０）を使用して、実施例１に記載の１６種類のａｒＲＮＡをそれぞれ細胞にトランスフェクションし、具体的なステップは以下のとおりである。
Ｉ．細胞培養には１０％ＦＢＳ（Ｖｉｓｔｅｃｈ ＳＥ１００－０１１）を含有するＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３０２４３．０１）を用いた。レポーターシステム細胞は１５００００細胞／ウェルで１２ウェルプレートに接種した。この時点を０時とした。
ＩＩ．細胞継代後２４時間、ＲＮＡｉ ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １３７７８１５０）を用いて１２．５ｐｍｏｌのａｒＲＮＡを各ウェルにトランスフェクションした。トランスフェクションのステップはサプライヤーの取扱書を参照する。
ＩＩＩ．細胞継代後７２時間、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５３０００５４）を用いて各ウェルの細胞をそれぞれ消化し、フローサイトメータでＦＩＴＣチャネル強度を解析した。
Ｉ．細胞培養には１０％ＦＢＳ（Ｖｉｓｔｅｃｈ ＳＥ１００－０１１）を含有するＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３０２４３．０１）を用いた。レポーターシステム細胞は１５００００細胞／ウェルで１２ウェルプレートに接種した。この時点を０時とした。
ＩＩ．細胞継代後２４時間、ＲＮＡｉ ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １３７７８１５０）を用いて１２．５ｐｍｏｌのａｒＲＮＡを各ウェルにトランスフェクションした。トランスフェクションのステップはサプライヤーの取扱書を参照する。
ＩＩＩ．細胞継代後７２時間、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５３０００５４）を用いて各ウェルの細胞をそれぞれ消化し、フローサイトメータでＦＩＴＣチャネル強度を解析した。
【0083】
前記細胞はＵＡＧ３塩基モチーフを含むｍＲＮＡを転写する２９３Ｔ細胞である。ａｒＲＮＡで細胞を７２時間（トランスフェクション後４８時間）培養して、フローサイトメータでＦＩＴＣチャネル強度を解析した。結果を図７に示し、ここで、ＵＴは何もトランスフェクションしない対照であり、ＶｅｃｈはＲＮＡｉ ＭＡＸトランスフェクション試薬を加えるが何のｄＲＮＡもトランスフェクションしない対照である。
【0084】
その後、この実験を繰り返した。
【0085】
実験結果を図８に示す。１回目の実験では、ａｒＲＮＡは乾燥粉末を直接溶解し、溶解後－８０℃で保存した。繰り返し実験では、ａｒＲＮＡは－８０℃での一回凍結融解を経たため、全体的な効率は多少低下したが、最初のテストと比べ、結果の全体的な傾向は変わらなかった。ここで、ａｒＲＮＡＲａｎはランダムＲＮＡ配列をトランスフェクションした対照である。
【0086】
従来技術では、本実施例と同様のレポーターシステムを用いたＬＥＡＰＥＲシステムによるＵＡＧ３塩基モチーフの編集効率の結果を図９に示す（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。図９においては、横軸番号はａｒＲＮＡ配列名であり、図７、図８における横軸名の添字部分に対応している。比較の便宜上、図７、図８におけるａｒＲＮＡと図９におけるａｒＲＮＡの並び順は一致している。本実施例では、化学合成されたａｒＲＮＡをトランスフェクションに用いているが、図９ではプラスミドトランスフェクションを用いているので、本実施例では、全体的な編集効率は高いが、図９の全体的な傾向と同様である。すなわち、３塩基モチーフがＵＡＧである場合、ａｒＲＮＡ中の標的Ａに対応する塩基がＣであり、上流残基Ｕと下流残基Ｇに対応する塩基がそれぞれＵとＧと対合するＡとＣであるとき、最も効率が高く、すなわち、対応するａｒＲＮＡはａｒＲＮＡＣＣＡである。一方、３塩基モチーフがＵＡＧである場合、ａｒＲＮＡにおいてその上流残基Ｕと下流残基Ｇに対応する塩基が他の非対合塩基である場合、編集効率は著しく向上するどころか、逆に低下する。
【0087】
ＵＡＧ３塩基モチーフの編集については、本実施例における研究結果は、ａｒＲＮＡにおいて３塩基モチーフに対応する３塩基に非マッチング部分を多く導入することで編集効率を向上させることができないという文献報告とほぼ一致している。
【0088】
実施例３：ＧＡＮ３塩基モチーフのＲＮＡ編集効率の測定
本実施例では、ＵＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧの３塩基モチーフをそれぞれ含むレポーターシステム細胞に対して、それぞれ１６種類のａｒＲＮＡをトランスフェクションしたが、トランスフェクションのステップは実施例２と同じである。
本実施例では、ＵＡＧ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧの３塩基モチーフをそれぞれ含むレポーターシステム細胞に対して、それぞれ１６種類のａｒＲＮＡをトランスフェクションしたが、トランスフェクションのステップは実施例２と同じである。
【0089】
７２ｈ（トランスフェクション後４８ｈ）後、ＴＲＩＺＯＬでサンプルを収集し、ＲＮＡを抽出し（ＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ，ａｍｂｉｏｎ ＲＥＦ１５５９６０２６）、ＲＮＡ １μｇを取って逆転写し、逆転写系（ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ，ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製 ＡＴ３１１－０２）は２０μＬであった。逆転写産物１μＬを取り、以下のプライマー対を用いて、ｇｇａｇｔｇａｇｔａｃｇｇｔｇｔｇｃＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）、ｇａｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）（小文字はＨｉ－Ｔｏｍキットで要求されたプライマーリンカーを表す）ＰＣＲ増幅を行い、Ｈｉ－Ｔｏｍキットでライブラリーを構築した（ノボジーン社、ＲＥＦＰＴ０４５）。
【0090】
その後、次のようなステップで次世代シーケンシングを行い、編集部位におけるＡ－＞Ｇの編集効率を解析した。
【0091】
ｉ．Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシング
構築した配列ライブラリーについて、ＮｏｖａＳｅｑ６０００プラットフォームを通じてＰＥ１５０方式でハイスループットシーケンシングを行った。
構築した配列ライブラリーについて、ＮｏｖａＳｅｑ６０００プラットフォームを通じてＰＥ１５０方式でハイスループットシーケンシングを行った。
【0092】
ｉｉ．シーケンシングデータ処理
ハイスループットシーケンシングで得られた生データをｆａｓｔｐ（ｖ０．１９．６）で品質制御を行い、低品質配列、リンガー付き配列、ｐｏｌｙＧなどを含む配列をフィルタリングした。得られた高品質シーケンシングデータについて、独自に開発した分割スクリプトを用いて、対応するｂａｒｃｏｄｅ配列に従って各サンプルに分割された。ＢＷＡ（ｖ０．７．１７－ｒ１１８８）ソフトウェアを使用して増幅されたターゲット領域の配列と照合し、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ１．９）によるフォーマット変換でＢＡＭファイルを生成し、照合情報を統計し、予め並べ替えてインデックスを作成した。
ハイスループットシーケンシングで得られた生データをｆａｓｔｐ（ｖ０．１９．６）で品質制御を行い、低品質配列、リンガー付き配列、ｐｏｌｙＧなどを含む配列をフィルタリングした。得られた高品質シーケンシングデータについて、独自に開発した分割スクリプトを用いて、対応するｂａｒｃｏｄｅ配列に従って各サンプルに分割された。ＢＷＡ（ｖ０．７．１７－ｒ１１８８）ソフトウェアを使用して増幅されたターゲット領域の配列と照合し、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ１．９）によるフォーマット変換でＢＡＭファイルを生成し、照合情報を統計し、予め並べ替えてインデックスを作成した。
【0093】
ｉｉｉ．編集効率解析
ＪＡＣＵＳＡ（ｖ１．３．０）ソフトウェアを用いてすべての潜在的なＲＮＡ編集部位を検出し、使用されるパラメータはｃａｌｌ－１ －ａ Ｂ，Ｒ，Ｄ，Ｉ，Ｙ，Ｍ：４ －Ｃ ＡＣＧＴ －ｃ ２ －ｐ １ －Ｐ ＵＮＳＴＲＡＮＤＥＤ －Ｒ －ｕ ＤｉｒＭｕｌｔ－ＣＥである。対照サンプルと処理サンプルの両方に出現する高頻度点突然変異をフィルタリングした後、Ａ－＞Ｇ突然変異以外の平均突然変異頻度の３倍を閾値とし、編集部位のうちＡ－＞Ｇ突然変異頻度が閾値を上回る部分を真の標的ＡのＧへの突然変異頻度とした。
ＪＡＣＵＳＡ（ｖ１．３．０）ソフトウェアを用いてすべての潜在的なＲＮＡ編集部位を検出し、使用されるパラメータはｃａｌｌ－１ －ａ Ｂ，Ｒ，Ｄ，Ｉ，Ｙ，Ｍ：４ －Ｃ ＡＣＧＴ －ｃ ２ －ｐ １ －Ｐ ＵＮＳＴＲＡＮＤＥＤ －Ｒ －ｕ ＤｉｒＭｕｌｔ－ＣＥである。対照サンプルと処理サンプルの両方に出現する高頻度点突然変異をフィルタリングした後、Ａ－＞Ｇ突然変異以外の平均突然変異頻度の３倍を閾値とし、編集部位のうちＡ－＞Ｇ突然変異頻度が閾値を上回る部分を真の標的ＡのＧへの突然変異頻度とした。
【0094】
ＵＡＧ３塩基モチーフに対する実験結果を図１０に示す。図から明らかなように、編集効率が最も高いのは従来技術で報告された原則に従って設計されたａｒＲＮＡ配列、すなわち標的塩基のみにミスマッチがあるａｒＲＮＡＣＣＡである。これは、これまでのＧＦＰ実験の結果と一致している。
【0095】
一方、従来技術では、編集効率が極めて低い３塩基モチーフ：ＧＡＮ（但し、Ｎは４種類のリボヌクレオチドのうちのいずれかである）に対して、本発明のａｒＲＮＡ設計方式は予想外の編集効率を示し、結果は図１１に示される。本発明のａｒＲＮＡ設計方式は、特にＧＡＵに対する効率が顕著である。ｍＲＮＡ配列に含まれる３塩基モチーフがＧＡＵである場合、従来技術の一般的な方法に基づいて設計されたａｒＲＮＡＡＣＣは編集効率がほとんどないが、これは文献の報告と一致している。しかし、相補性を弱めると、ａｒＲＮＡ中の３塩基モチーフ中の５’上流残基Ｇに対向する塩基が非対合塩基、すなわちＣ以外の他の塩基、例えばａｒＲＮＡＡＣＧを用いるときであっても、編集効率を大幅に向上させることができる。図１１Ａに示すように、前記向上の幅は従来技術に既存の設計（ａｒＲＮＡＡＣＣ）の１０倍を超えるのに対し、従来技術に基づいて設計されたａｒＲＮＡＡＣＣはこれまでの報告と一致しており、編集効率が極めて低い。また、３塩基モチーフＧＡＵに対しては、本例におけるａｒＲＮＡＡＣＡ、ａｒＲＮＡＣＣＵ、ａｒＲＮＡＵＣＣなど、３塩基モチーフとの相補性を適切に弱めたａｒＲＮＡＡＣＣ設計は、従来技術に既存の設計ａｒＲＮＡよりも、明らかにより高い編集効率を示す。なお、３塩基モチーフＧＡＵについて、ａｒＲＮＡ中の標的Ａに対向する塩基がＣ、下流残基に対向する塩基が下流残基Ｕの相補的塩基Ａ、上流残基Ｇに対向するミスマッチ塩基がＧである場合（すなわち、ａｒＲＮＡＡＣＧ）、効率が最も高い。
【0096】
同様に、３塩基モチーフＧＡＣに対しても、３塩基モチーフとの相補性を適切に弱めたａｒＲＮＡも予想外に高い編集効率を示した。図１１Ｃの棒グラフに示すように、従来技術に既存の原則に基づいて設計されたａｒＲＮＡＧＣＣは編集効率がほとんどなく、より多くのミスマッチが導入されているａｒＲＮＡＧＣＧ及びａｒＲＮＡＧＣＡは編集効率が大幅に向上した。さらに、３塩基モチーフＧＡＣに対しては、ａｒＲＮＡ中の標的Ａに対向する塩基がＣ、下流残基に対向する塩基が下流残基Ｃの相補的塩基Ｇ、上流残基Ｇに対向する塩基がミスマッチ塩基Ｇである場合（すなわち、ａｒＲＮＡＧＣＧ）は、効率が最も高い。
【0097】
これと同様に、３塩基モチーフＧＡＧの編集（図１１Ｂ）において、従来技術に既存パターンに従って設計されたａｒＲＮＡＣＣＣは効率が最も高いものではなく、相補性を適切に弱めたａｒＲＮＡＣＣＧ及びａｒＲＮＡＣＣＡの方は編集効率が格段に高い。前述の３塩基モチーフＧＡＵとＧＡＣの場合と同様に、３塩基モチーフＧＡＧに対しては、ａｒＲＮＡ中の標的Ａに対向する塩基がＣ、下流残基に対向する塩基が下流残基Ｇの相補的塩基Ｃ、上流残基Ｇに対向する塩基がミスマッチ塩基Ｇである場合（すなわち、ａｒＲＮＡＣＣＧ）は効率が最も高い。
【0098】
同様に、ＧＡＡについては、従来技術に既存のパターンに従って設計されたａｒＲＮＡＵＣＣは編集効率が高くないが、ａｒＲＮＡ中の標的Ａに対向する塩基がＣ、下流残基Ａに対向する塩基が相補的塩基Ｕ、上流残基Ｇに対向する塩基がミスマッチ塩基Ａである場合、すなわちａｒＲＮＡＵＣＡの場合は、編集効率が向上する。
【0099】
以上の結果をさらに確認するために、ｍＲＮＡがＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧの３塩基モチーフである場合について実験を繰り返した。繰り返し実験では、特定の３塩基モチーフごとに、３種類のａｒＲＮＡ設計のみを繰り返した。
【0100】
１．既存技術に従って設計されたａｒＲＮＡ、すなわち標的Ａに対向する塩基はＣであり、残りの２つの塩基の設計はいずれも塩基相補対合の原則に合致し、この場合、標的Ａの上流残基Ｇと対合する塩基はＣである。
２．本発明の設計に従って、標的Ａの上流残基Ｇと対合する塩基をＡとする。
３．本発明の設計に従って、標的Ａの上流残基Ｇと対合する塩基をＧとする。
２．本発明の設計に従って、標的Ａの上流残基Ｇと対合する塩基をＡとする。
３．本発明の設計に従って、標的Ａの上流残基Ｇと対合する塩基をＧとする。
【0101】
図１３に示すように、３塩基モチーフがＧＡＡ、ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＧのいずれであっても、標的残基Ａの上流残基Ｇと対合する塩基がＡである場合、編集効率がある程度向上し、一方、標的残基Ａの上流残基Ｇと対合する塩基がＧである場合、編集効率が最も高いことが明らかになった。さらに、標的残基Ａの上流残基Ｇの対合塩基を既存技術のＣからＧに変更した場合、各３塩基モチーフに対する効率向上の倍数はＧＡＵ＞ＧＡＣ≒ＧＡＡ＞ＧＡＧとなる。一方、標的残基Ａの上流残基Ｇと対合する塩基を従来技術のＣからＡに変更した場合、各３塩基モチーフに対する効率向上の倍数はＧＡＣ＞ＧＡＵ≒ＧＡＧ≒ＧＡＡである。
【0102】
従来技術の文献報告によると、３塩基配列ＧＡＵ、ＧＡＣ、ＧＡＡは編集効率が最も弱い３つであり、しかも効率はゼロに近いため（図３）、ＲＮＡ編集の過程では、できるだけ避けるべきである。本発明では、３塩基モチーフに対するより多くのミスマッチ塩基をａｒＲＮＡに革新的に導入することにより、この制限を打破した。本発明の実施例によれば、ａｒＲＮＡ中の３塩基モチーフに対向する３塩基のうち、標的Ａに対向する塩基がＣであり、上流及び／又は下流残基に対向する塩基がミスマッチ塩基である場合、編集効率は大幅に向上し得る。また、上流残基がＧの場合には、下流残基に対向する塩基が相補的塩基であることが多いが、上流残基Ｇに対向するものがミスマッチ塩基Ａの場合、編集効率が高く、上流残基Ｇに対向するものがミスマッチ塩基Ｇの場合、編集効率が最も高くなる。
【0103】
実施例４：ＣからＵへのＲＮＡ編集のトリプレット選好性の研究
ｉ．突然変異型ＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔの構築
ＲＥＳＵＣＥ技術（ＷＯ２０１９０７１０４８Ａ９）を参照して、ＡＤＡＲ２触媒ドメインの突然変異誘発を行い、突然変異部位はこの文献のｒ１６と同じである（ｄＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、Ｎ５９７Ｉ、Ｌ３３２Ｉ、Ｉ３９８Ｖ、Ｋ３５０Ｉ、Ｍ３８３Ｌ、Ｄ６１９Ｇ、Ｓ５８２Ｔ、Ｖ４４０Ｉ、Ｓ４９５Ｎ、Ｋ４１８Ｅ、Ｓ６６１Ｔ） ｒ１６， ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｓ／ｓｅｑ－１９Ｙｔｗｗｈ０ｉ０ｖＳＩｂｙＸＹＺ９５）。従来のＤＮＡ合成技術によって、ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２プラスミドベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２プラスミド骨格は魏文勝教授の実験室から恵贈）のＡＤＡＲ２ ＸｍａＩ酵素切断部位からＡｓｃＩ酵素切断部位までの間の配列をインビトでＤＮＡ合成し、上記の突然変異を含め、上記２つの制限酵素によって、原プラスミドｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２における対応する断片を酵素切断結合により新たに合成したＤＮＡ断片に置き換え、置換後のプラスミドをｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６と命名し、それにＲＥＳＣＵＥ技術（ＷＯ２０１９０７１０４８Ａ９）を参照して触媒ドメインを突然変異した、ＡＤＡＲ２－ｒ１６と命名したＡＤＡＲ２遺伝子を含む。ＡＤＡＲ２－ｒ１６全長ｃＤＮＡ配列は表６のとおりである。次世代レンチウイルスパッケージングジシステム（ｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ はＡｒｔｈｕｒ Ｎｉｅｎｈｕｉｓ ＆ Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓａｌｍｏｎ から恵贈（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ３５６１６ ； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：３５６１６ ； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿３５６１６）； ｐＣＭＶＲ８．７４ は Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏから惠贈 （Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ２２０３６ ； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：２２０３６ ； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿２２０３６））によって、ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６をレンチウイルスにパッケージングし、２９３Ｔ細胞に感染させ、４８時間後に１０μｇ／ｍＬ最終濃度のＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｂ９３００）で耐性スクリーニングを行った。スクリーニング後に生存する細胞をＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔとした。
ｉ．突然変異型ＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔの構築
ＲＥＳＵＣＥ技術（ＷＯ２０１９０７１０４８Ａ９）を参照して、ＡＤＡＲ２触媒ドメインの突然変異誘発を行い、突然変異部位はこの文献のｒ１６と同じである（ｄＡＤＡＲ２（Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、Ｎ５９７Ｉ、Ｌ３３２Ｉ、Ｉ３９８Ｖ、Ｋ３５０Ｉ、Ｍ３８３Ｌ、Ｄ６１９Ｇ、Ｓ５８２Ｔ、Ｖ４４０Ｉ、Ｓ４９５Ｎ、Ｋ４１８Ｅ、Ｓ６６１Ｔ） ｒ１６， ｈｔｔｐｓ：／／ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ．ｃｏｍ／ｓ／ｓｅｑ－１９Ｙｔｗｗｈ０ｉ０ｖＳＩｂｙＸＹＺ９５）。従来のＤＮＡ合成技術によって、ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２プラスミドベクター（ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２プラスミド骨格は魏文勝教授の実験室から恵贈）のＡＤＡＲ２ ＸｍａＩ酵素切断部位からＡｓｃＩ酵素切断部位までの間の配列をインビトでＤＮＡ合成し、上記の突然変異を含め、上記２つの制限酵素によって、原プラスミドｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２における対応する断片を酵素切断結合により新たに合成したＤＮＡ断片に置き換え、置換後のプラスミドをｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６と命名し、それにＲＥＳＣＵＥ技術（ＷＯ２０１９０７１０４８Ａ９）を参照して触媒ドメインを突然変異した、ＡＤＡＲ２－ｒ１６と命名したＡＤＡＲ２遺伝子を含む。ＡＤＡＲ２－ｒ１６全長ｃＤＮＡ配列は表６のとおりである。次世代レンチウイルスパッケージングジシステム（ｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ はＡｒｔｈｕｒ Ｎｉｅｎｈｕｉｓ ＆ Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓａｌｍｏｎ から恵贈（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ３５６１６ ； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：３５６１６ ； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿３５６１６）； ｐＣＭＶＲ８．７４ は Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏから惠贈 （Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ２２０３６ ； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：２２０３６ ； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿２２０３６））によって、ｐＬｅｎｔｉ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６をレンチウイルスにパッケージングし、２９３Ｔ細胞に感染させ、４８時間後に１０μｇ／ｍＬ最終濃度のＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｂ９３００）で耐性スクリーニングを行った。スクリーニング後に生存する細胞をＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔとした。
【0104】
ｉｉ．ＢＦＰレポーターシステムの構築
ＢＦＰレポーターシステムは参考文献（Ｖｕ， Ｌ． Ｔ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｔ． Ｔ． Ｋ．， Ｍｄ Ｔｈｏｕｆｉｃ， Ａ． Ａ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， ＆ Ｔｓｕｋａｈａｒａ， Ｔ． （２０１６）． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ： ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ， ８７（４）， ５８３－５９３）を参照して構築し、すべてのＢＦＰｃＤＮＡ配列はインビトロでＤＮＡ合成され、具体的な配列は表７に示される。ＢＦＰ ｃＤＮＡ配列はＣＭＶプロモーターよりも後のマルチクローニング部位を通じてｐＣＤＨ－ＣＭＶプラスミドベクターにクローニングされた（ｐＣＤＨ－ＣＭＶプラスミド骨格はＫａｚｕｈｉｒｏ Ｏｋａから恵贈、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ７２２６５； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：７２２６５； ＲＲＩＤ： Ａｄｄｇｅｎｅ＿７２２６５）。レポーターシステムのＣからＵへの編集部位はＢＦＰ配列の１９９位の塩基Ｃであり、１９９位、２００位、２０１位はＣＡＣであり、６６位のヒスチジンに対応している。
該配列は１９８位、１９９位、２００位の塩基が順にＣＣＡであり、ＢＦＰ－ＣＣＡと命名され、Ｃ＊と略称される。１９９位の塩基ＣをＲＮＡレベルで脱アミノ化してＵに編集すると、６６位のアミノ酸が変わり、ＢＦＰ蛍光タンパク質が従来の青色蛍光から緑色蛍光に変わり、これによって、フローサイトメータＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）でチャネルシグナルを検出できる。一方、１９８位ヌクレオチドはＣからＡ、Ｔ、Ｇに突然変異した後、それがコードに関与する６５位アミノ酸コドンＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＧがすべてトレオニンをコードするため、この位の突然変異は同義突然変異である。これにより、このレポーターシステムは、ｍＲＮＡにおける１９９位標的残基の上流残基が異なる塩基である場合、ＣからＵへの編集の効率を同時に測定し、比較することができる。部位特異的突然変異誘発キット（Ｑ５（登録商標） Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＮＥＢ Ｅ０５５４Ｓ）を用いて１９８位の塩基に突然変異を導入し、１９８位、１９９位、２００位の３つの位置の塩基については、ＧＣＡである場合をＢＦＰ－ＧＣＡと命名し、略語をＧ＊とし、ＡＣＡである場合をＢＦＰ－ＡＣＡと命名し、略語をＡ＊とし、ＴＣＡである場合をＢＦＰ－ＴＣＡと命名し、略語をＴ＊とした。１９９位のＣはＴに突然変異し、ＣＴＡの場合、ＢＦＰ－ＣＵＡと命名し、略語をＣＵＡとした。上記で構築したＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡ、ＢＦＰ－ＣＣＡの４種類のプラスミドを次世代レンチウイルスパッケージングシステム（前述のＡＤＡＲ２－ｒ１６レンチウイルスパッケージング条件と同じ）によりレンチウイルスにパッケージングした。２９３ＴやＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔを感染させ、４８ｈ後に５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：１０１３１０３５）や１０μｇ／ｍＬ最終濃度のＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｂ９３００）で耐性スクリーニングを行い、スクリーニング後に生存する細胞をそれぞれ２９３Ｔ－ＧＣＡ、２９３Ｔ－ＡＣＡ、２９３Ｔ－ＴＣＡ、２９３Ｔ－ＣＣＡとＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＧＣＡ、ＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＡＣＡ、ＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＴＣＡ、ＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＣＣＡと命名した。
ＢＦＰレポーターシステムは参考文献（Ｖｕ， Ｌ． Ｔ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｔ． Ｔ． Ｋ．， Ｍｄ Ｔｈｏｕｆｉｃ， Ａ． Ａ．， Ｓｕｚｕｋｉ， Ｈ．， ＆ Ｔｓｕｋａｈａｒａ， Ｔ． （２０１６）． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ： ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｖｉｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ ｄｒｕｇ ｄｅｓｉｇｎ， ８７（４）， ５８３－５９３）を参照して構築し、すべてのＢＦＰｃＤＮＡ配列はインビトロでＤＮＡ合成され、具体的な配列は表７に示される。ＢＦＰ ｃＤＮＡ配列はＣＭＶプロモーターよりも後のマルチクローニング部位を通じてｐＣＤＨ－ＣＭＶプラスミドベクターにクローニングされた（ｐＣＤＨ－ＣＭＶプラスミド骨格はＫａｚｕｈｉｒｏ Ｏｋａから恵贈、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＃ ７２２６５； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：７２２６５； ＲＲＩＤ： Ａｄｄｇｅｎｅ＿７２２６５）。レポーターシステムのＣからＵへの編集部位はＢＦＰ配列の１９９位の塩基Ｃであり、１９９位、２００位、２０１位はＣＡＣであり、６６位のヒスチジンに対応している。
該配列は１９８位、１９９位、２００位の塩基が順にＣＣＡであり、ＢＦＰ－ＣＣＡと命名され、Ｃ＊と略称される。１９９位の塩基ＣをＲＮＡレベルで脱アミノ化してＵに編集すると、６６位のアミノ酸が変わり、ＢＦＰ蛍光タンパク質が従来の青色蛍光から緑色蛍光に変わり、これによって、フローサイトメータＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）でチャネルシグナルを検出できる。一方、１９８位ヌクレオチドはＣからＡ、Ｔ、Ｇに突然変異した後、それがコードに関与する６５位アミノ酸コドンＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＴ、ＡＣＧがすべてトレオニンをコードするため、この位の突然変異は同義突然変異である。これにより、このレポーターシステムは、ｍＲＮＡにおける１９９位標的残基の上流残基が異なる塩基である場合、ＣからＵへの編集の効率を同時に測定し、比較することができる。部位特異的突然変異誘発キット（Ｑ５（登録商標） Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ， ＮＥＢ Ｅ０５５４Ｓ）を用いて１９８位の塩基に突然変異を導入し、１９８位、１９９位、２００位の３つの位置の塩基については、ＧＣＡである場合をＢＦＰ－ＧＣＡと命名し、略語をＧ＊とし、ＡＣＡである場合をＢＦＰ－ＡＣＡと命名し、略語をＡ＊とし、ＴＣＡである場合をＢＦＰ－ＴＣＡと命名し、略語をＴ＊とした。１９９位のＣはＴに突然変異し、ＣＴＡの場合、ＢＦＰ－ＣＵＡと命名し、略語をＣＵＡとした。上記で構築したＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡ、ＢＦＰ－ＣＣＡの４種類のプラスミドを次世代レンチウイルスパッケージングシステム（前述のＡＤＡＲ２－ｒ１６レンチウイルスパッケージング条件と同じ）によりレンチウイルスにパッケージングした。２９３ＴやＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔを感染させ、４８ｈ後に５００μｇ／ｍＬのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：１０１３１０３５）や１０μｇ／ｍＬ最終濃度のＢｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ Ｂ９３００）で耐性スクリーニングを行い、スクリーニング後に生存する細胞をそれぞれ２９３Ｔ－ＧＣＡ、２９３Ｔ－ＡＣＡ、２９３Ｔ－ＴＣＡ、２９３Ｔ－ＣＣＡとＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＧＣＡ、ＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＡＣＡ、ＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＴＣＡ、ＡＤＡＲ２－ｒ１６－ＣＣＡと命名した。
【0105】
ｉｉｉ．ａｒＲＮＡの設計合成
本実施例においては、「ａｒＲＮＡ」という用語は、本明細書におけるすべての「ｄＲＮＡ」という用語と同じ意味を有し、交換して使用することができる。本実施例では、ａｒＲＮＡは、３塩基モチーフ中の標的残基に対向する塩基がａｒＲＮＡの中間に位置し、５’上流及び３’下流が同じ長さで両側に延びている。本実施例では、合成長の制限から、まず、長さが９１ｎｔのＲＮＡを選択してインビトロ合成を行い、４６位のヌクレオチド（標的塩基）の違いに応じて、４６位のヌクレオチドがそれぞれＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃである場合、合成された４種類のａｒＲＮＡをそれぞれＡ＊、Ｕ＊、Ｇ＊、Ｃ＊と略称した。合成された４種類のａｒＲＮＡの具体的な配列は次の表５に示す。ＬＥＡＰＥＲ技術設計方法（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）とは異なり、本実験では、４本のａｒＲＮＡの設計は標的残基Ｃに対向する標的塩基、すなわち４６位のＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃのみを変化させたが、ａｒＲＮＡの４７位（レポーターシステムの１９８位に対応する）の塩基は４本のａｒＲＮＡではすべて突然変異導入前のＢＦＰ配列すなわちＣＣＡに従って設計された。その後、３塩基モチーフの標的残基がシチジンであり、‘下流残基がアデノシンである場合、それぞれ異なる３連続相補的塩基を含むａｒＲＮＡを合成し、具体的な配列を表８に示す。ａｒＲＮＡの４６位のヌクレオチドはＵに固定されており、４５位、４７位のヌクレオチドはそれぞれＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるため、合計１６種類がある。各ａｒＲＮＡは以下の原則に基づいて命名する。すべてのａｒＲＮＡ命名は「ａｒＲＮＡ」で始まり、以降、下付き文字の方式でａｒＲＮＡの３連続相補的塩基を示す。ｍＲＮＡ標的残基Ｃに対応するａｒＲＮＡ標的塩基がＵであることに基づいて、３連続相補的塩基が表示され、前記３連続相補的塩基の表示順序は５’－３’である。例えば、ａｒＲＮＡは、３塩基モチーフＣＣＡに対して、標的残基Ｃの上流残基がＣであり、対応するａｒＲＮＡの標的塩基の３’最近傍残基がＧであり、標的残基Ｃに対応するａｒＲＮＡ標的塩基がＵであり、標的残基Ｃの下流残基がＡであり、対応するａｒＲＮＡの標的塩基の５’最近傍残基がＵであれば、ａｒＲＮＡに含まれる３連続相補的塩基はＵＵＧであり、このとき、命名規則により、このアンチセンスＲＮＡはａｒＲＮＡＵＵＧと命名される。第１ロットで合成されたＡ＊、Ｕ＊、Ｇ＊、Ｃ＊の４種類のａｒＲＮＡと第２ロットで合成された１６種類のＲＮＡの命名規則の統一を行うため、第１ロットで合成されたＡ＊、Ｕ＊、Ｇ＊、Ｃ＊の４種類のａｒＲＮＡはその後の実験でそれぞれａｒＲＮＡＵＡＧ、ａｒＲＮＡＵＵＧ、ａｒＲＮＡＵＧＧ、ａｒＲＮＡＵＣＧと命名された。なお、２回の実験では、最初に合成されたａｒＲＮＡＵＵＧと２回目に合成されたａｒＲＮＡＵＵＧは、２本の配列がまったく同じであるが、２つの異なるロットで合成された。
本実施例においては、「ａｒＲＮＡ」という用語は、本明細書におけるすべての「ｄＲＮＡ」という用語と同じ意味を有し、交換して使用することができる。本実施例では、ａｒＲＮＡは、３塩基モチーフ中の標的残基に対向する塩基がａｒＲＮＡの中間に位置し、５’上流及び３’下流が同じ長さで両側に延びている。本実施例では、合成長の制限から、まず、長さが９１ｎｔのＲＮＡを選択してインビトロ合成を行い、４６位のヌクレオチド（標的塩基）の違いに応じて、４６位のヌクレオチドがそれぞれＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃである場合、合成された４種類のａｒＲＮＡをそれぞれＡ＊、Ｕ＊、Ｇ＊、Ｃ＊と略称した。合成された４種類のａｒＲＮＡの具体的な配列は次の表５に示す。ＬＥＡＰＥＲ技術設計方法（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）とは異なり、本実験では、４本のａｒＲＮＡの設計は標的残基Ｃに対向する標的塩基、すなわち４６位のＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃのみを変化させたが、ａｒＲＮＡの４７位（レポーターシステムの１９８位に対応する）の塩基は４本のａｒＲＮＡではすべて突然変異導入前のＢＦＰ配列すなわちＣＣＡに従って設計された。その後、３塩基モチーフの標的残基がシチジンであり、‘下流残基がアデノシンである場合、それぞれ異なる３連続相補的塩基を含むａｒＲＮＡを合成し、具体的な配列を表８に示す。ａｒＲＮＡの４６位のヌクレオチドはＵに固定されており、４５位、４７位のヌクレオチドはそれぞれＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃであるため、合計１６種類がある。各ａｒＲＮＡは以下の原則に基づいて命名する。すべてのａｒＲＮＡ命名は「ａｒＲＮＡ」で始まり、以降、下付き文字の方式でａｒＲＮＡの３連続相補的塩基を示す。ｍＲＮＡ標的残基Ｃに対応するａｒＲＮＡ標的塩基がＵであることに基づいて、３連続相補的塩基が表示され、前記３連続相補的塩基の表示順序は５’－３’である。例えば、ａｒＲＮＡは、３塩基モチーフＣＣＡに対して、標的残基Ｃの上流残基がＣであり、対応するａｒＲＮＡの標的塩基の３’最近傍残基がＧであり、標的残基Ｃに対応するａｒＲＮＡ標的塩基がＵであり、標的残基Ｃの下流残基がＡであり、対応するａｒＲＮＡの標的塩基の５’最近傍残基がＵであれば、ａｒＲＮＡに含まれる３連続相補的塩基はＵＵＧであり、このとき、命名規則により、このアンチセンスＲＮＡはａｒＲＮＡＵＵＧと命名される。第１ロットで合成されたＡ＊、Ｕ＊、Ｇ＊、Ｃ＊の４種類のａｒＲＮＡと第２ロットで合成された１６種類のＲＮＡの命名規則の統一を行うため、第１ロットで合成されたＡ＊、Ｕ＊、Ｇ＊、Ｃ＊の４種類のａｒＲＮＡはその後の実験でそれぞれａｒＲＮＡＵＡＧ、ａｒＲＮＡＵＵＧ、ａｒＲＮＡＵＧＧ、ａｒＲＮＡＵＣＧと命名された。なお、２回の実験では、最初に合成されたａｒＲＮＡＵＵＧと２回目に合成されたａｒＲＮＡＵＵＧは、２本の配列がまったく同じであるが、２つの異なるロットで合成された。
【0106】
ｉｖ．標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡのテスト
ＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔを３０００００個の細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、接種してから２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔでトランスフェクションし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：Ｌ３００００１５）、トランスフェクションのステップは取扱書に従って行い、取扱書に従って異なるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬濃度を用いて繰り返し試験を２回行い、Ｒｅｐｅａｔ１は３．７５μＬ、Ｒｅｐｅａｔ２は７．５μＬのウェル当たりトランスフェクション試薬濃度とした。ウェルあたり、ＢＦＰ及び関連プラスミド、すなわちＢＦＰ－ＧＣＡ（Ｇ＊と略称）、ＢＦＰ－ＡＣＡ（Ａ＊と略称）、ＢＦＰ－ＴＣＡ（Ｔ＊と略称）、ＢＦＰ－ＣＵＡ（ＣＵＡと略称）を２．５μｇ添加し、合成したガイドＲＮＡを２５ｐｍｏｌ添加し、トランスフェクション後４８ｈ、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣチャンネルのシグナル強度を検出した。陽性細胞平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の統計結果を図１５に示す。
図１５では、ｍＲＮＡ列は対応するウェルに添加されたＢＦＰレポータープラスミドを示し、ａｒＲＮＡ列は対応するウェルに添加されたａｒＲＮＡを示している。ＢＦＰレポートシステムでは、１９８、１９９、２００の３塩基は元の配列ではＣＣＡであり、一方、１９８位のＣがＡ、Ｔ又はＧに変更されると、いずれも６５位のアミノ酸はトレオニンになるので、ＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＣＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡの４種類の異なるレポーターシステムでは、１９８位の違いは本来のタンパク質機能の変化をもたらさない。図１５に示すように、ａｒＲＮＡを何も加えない場合、レポーターシステムのバックグラウンドＧＦＰシグナルＭＦＩは約５×１０４である（レポーターシステムはＵ＊、ａｒＲＮＡは／と表記されており、レポーターシステムはＡ＊、ａｒＲＮＡは／と表記されている）。一方、ＤＮＡレベルの点突然変異により、１９９位のＣをＴに変異させた場合（ｍＲＮＡ中の３塩基モチーフはＣＵＡ）、ＧＦＰシグナルＭＦＩは約２．４×１０６～３．１×１０６となり、バックグラウンド値の約１００倍の高値になる。したがって、１９９位のＣがＲＮＡレベルですべてＵになると、ＧＦＰシグナルＭＦＩは約１００倍上昇することが示された。
一方、ａｒＲＮＡを添加すると、ＤＮＡレベルで１９９位のＣを不変とした上で、図１５に示すように、最終的なＧＦＰシグナルＭＦＩは最大５×１０５を超えるまで向上することができ、蛍光強度は１９９位のＣ点がＴに変異した後の蛍光強度の約２０％であった。この編集能力及び塩基選好性をさらに決定するために、以上の実験をさらに設計して繰り返し、その結果を図１６に示し、実験条件は、繰り返し１と繰り返し２の両方に３．７５μＬのトランスフェクション試薬を用いた以外、図１５の実験とほぼ一致した。すなわち、３塩基モチーフがＧＣＡとＣＣＡである場合、対応するａｒＲＮＡがＵ＾（ａｒＲＮＡＵＵＧ）の場合の効率はＣ＾（ａｒＲＮＡＵＣＧ）の場合の効率よりも高い。図１５と比較すると、図１６では、同じ実験条件では、ＭＦＩは２倍近く低下しているが、これは、図１５ではａｒＲＮＡを乾燥粉末で溶解した直後に実験しているのに対し、図１６では図１５の実験用のａｒＲＮＡ溶液を－８０℃で一度凍結融解してから実験しているためである。ただし、最大値は図１５より低くなっているが、図１６の実験は、図１５の最も編集効率の高い４つの結果をほぼ再現したものであり、効率は同じ傾向にあることが分かった。本実施例の試験設計条件では、ａｒＲＮＡ中の３連続相補的塩基の５’末端塩基をＵ、３’末端塩基をＧに固定して、３連続相補的塩基中の標的Ｃに対向する塩基のみに重点を置いて研究を行った結果、３連続相補的塩基の中間残基Ｕ＾＞Ｃ＾の編集効率という結論が得られ、３塩基モチーフ中の上流残基を変化させると、出願人は３塩基モチーフＧＣＡの最高編集効率がＣＣＡの最高効率より大きいことを発見した。
ＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔを３０００００個の細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに接種し、接種してから２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔでトランスフェクションし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：Ｌ３００００１５）、トランスフェクションのステップは取扱書に従って行い、取扱書に従って異なるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００トランスフェクション試薬濃度を用いて繰り返し試験を２回行い、Ｒｅｐｅａｔ１は３．７５μＬ、Ｒｅｐｅａｔ２は７．５μＬのウェル当たりトランスフェクション試薬濃度とした。ウェルあたり、ＢＦＰ及び関連プラスミド、すなわちＢＦＰ－ＧＣＡ（Ｇ＊と略称）、ＢＦＰ－ＡＣＡ（Ａ＊と略称）、ＢＦＰ－ＴＣＡ（Ｔ＊と略称）、ＢＦＰ－ＣＵＡ（ＣＵＡと略称）を２．５μｇ添加し、合成したガイドＲＮＡを２５ｐｍｏｌ添加し、トランスフェクション後４８ｈ、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣチャンネルのシグナル強度を検出した。陽性細胞平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の統計結果を図１５に示す。
図１５では、ｍＲＮＡ列は対応するウェルに添加されたＢＦＰレポータープラスミドを示し、ａｒＲＮＡ列は対応するウェルに添加されたａｒＲＮＡを示している。ＢＦＰレポートシステムでは、１９８、１９９、２００の３塩基は元の配列ではＣＣＡであり、一方、１９８位のＣがＡ、Ｔ又はＧに変更されると、いずれも６５位のアミノ酸はトレオニンになるので、ＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＣＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡの４種類の異なるレポーターシステムでは、１９８位の違いは本来のタンパク質機能の変化をもたらさない。図１５に示すように、ａｒＲＮＡを何も加えない場合、レポーターシステムのバックグラウンドＧＦＰシグナルＭＦＩは約５×１０４である（レポーターシステムはＵ＊、ａｒＲＮＡは／と表記されており、レポーターシステムはＡ＊、ａｒＲＮＡは／と表記されている）。一方、ＤＮＡレベルの点突然変異により、１９９位のＣをＴに変異させた場合（ｍＲＮＡ中の３塩基モチーフはＣＵＡ）、ＧＦＰシグナルＭＦＩは約２．４×１０６～３．１×１０６となり、バックグラウンド値の約１００倍の高値になる。したがって、１９９位のＣがＲＮＡレベルですべてＵになると、ＧＦＰシグナルＭＦＩは約１００倍上昇することが示された。
一方、ａｒＲＮＡを添加すると、ＤＮＡレベルで１９９位のＣを不変とした上で、図１５に示すように、最終的なＧＦＰシグナルＭＦＩは最大５×１０５を超えるまで向上することができ、蛍光強度は１９９位のＣ点がＴに変異した後の蛍光強度の約２０％であった。この編集能力及び塩基選好性をさらに決定するために、以上の実験をさらに設計して繰り返し、その結果を図１６に示し、実験条件は、繰り返し１と繰り返し２の両方に３．７５μＬのトランスフェクション試薬を用いた以外、図１５の実験とほぼ一致した。すなわち、３塩基モチーフがＧＣＡとＣＣＡである場合、対応するａｒＲＮＡがＵ＾（ａｒＲＮＡＵＵＧ）の場合の効率はＣ＾（ａｒＲＮＡＵＣＧ）の場合の効率よりも高い。図１５と比較すると、図１６では、同じ実験条件では、ＭＦＩは２倍近く低下しているが、これは、図１５ではａｒＲＮＡを乾燥粉末で溶解した直後に実験しているのに対し、図１６では図１５の実験用のａｒＲＮＡ溶液を－８０℃で一度凍結融解してから実験しているためである。ただし、最大値は図１５より低くなっているが、図１６の実験は、図１５の最も編集効率の高い４つの結果をほぼ再現したものであり、効率は同じ傾向にあることが分かった。本実施例の試験設計条件では、ａｒＲＮＡ中の３連続相補的塩基の５’末端塩基をＵ、３’末端塩基をＧに固定して、３連続相補的塩基中の標的Ｃに対向する塩基のみに重点を置いて研究を行った結果、３連続相補的塩基の中間残基Ｕ＾＞Ｃ＾の編集効率という結論が得られ、３塩基モチーフ中の上流残基を変化させると、出願人は３塩基モチーフＧＣＡの最高編集効率がＣＣＡの最高効率より大きいことを発見した。
【0107】
ｖ．トリプレット選好性テスト
その後の結果の一致性を向上させるために、ｉｉ．ＢＦＰレポーターシステムの構築に記載されているように、出願人は、ＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡ、ＢＦＰ－ＣＣＡの４種類のプラスミドを、レンチウイルスパッケージングによりＡＤＡＲ２－ｒ１６のない一般的な２９３Ｔ、及びＡＤＡＲ２－ｒ１６を安定的に組み込んだ２９３Ｔに組み込み、ステップと命名はｉｉ．ＢＦＰレポーターシステムの構築を参照した。レポーターシステムはすでに細胞ゲノムに組み込まれているため、トリプレット選好性テストでのａｒＲＮＡのトランスフェクションと標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストでのａｒＲＮＡのトランスフェクションは異なるトランスフェクション試薬を採用した。標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストでのａｒＲＮＡのトランスフェクションはプラスミドを同時にトランスフェクションする必要があるため、以上のようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を採用し、トリプレット選好性テストでは、ａｒＲＮＡをトランスフェクションするだけでよく、トランスフェクションプラスミドが不要であるため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：１３７７８１００）を採用した。異なるレポーターシステムを持つ２９３Ｔ又はＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔを、１５００００個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルに接種し、接種後２４時間、ＲＮＡｉＭＡＸ試薬で１５ｐｍｏｌのａｒＲＮＡをトランスフェクションし、トランスフェクション後４８ｈ、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣチャンネルのシグナル強度を検出し、ＧＦＰ＋細胞の割合を統計した。
ａｒＲＮＡの３連続相補的塩基に標的Ｃとのミスマッチだけがあり、しかも標的Ｃに対応するミスマッチ塩基がＵであり、標的Ｃの上流残基と下流残基と完全にマッチングしている場合（すなわち、レポーターシステムがＢＦＰ－ＧＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＣであり、レポーターシステムがＢＦＰ－ＡＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＵであり、レポーターシステムがＢＦＰ－ＴＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＡであり、レポーターシステムがＢＦＰ－ＣＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＧである）、テスト結果を図１７に示す。図においては、未処理はａｒＲＮＡを添加しない対照、ランダムＲＮＡ配列はランダム配列ＲＮＡを９１ｎｔ添加した対照（具体的な配列は表８ Ｒａｎ－９１を参照）、ａｒＲＮＡは上記の規則でマッチングした対応ａｒＲＮＡを添加したものを表す。図１７より、３連続塩基がＴＣＡやＡＣＡの場合、このシステムは編集効率が高く、３連続塩基がＧＣＡやＣＣＡの場合、編集効率はゼロに近いことが分かった。
３連続塩基のテスト結果は本研究に大きな迷惑を与えた。図１５のテストでは、標的ＣがＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇの４種類の異なる塩基に対応する場合を含んでいるが、図１７のテストでは、Ｃが全てＵに対合するので、図１５に対応する実験でａｒＲＮＡ標的Ｃに対応する塩基がＵの場合のデータを個別に抽出して図を再度作成して、図１８とした。図１７と比較すると、２回の実験の結論には明らかな矛盾が見られる。両図の統計方式は一致していないが、同バッチ実験での傾向は明らかに異なり、図１５のデータから作り直した図では、明らかにＧＣＡとＣＣＡの効率が高く、図１７では、明らかにＴＣＡとＡＣＡの効率が高い。
その後の結果の一致性を向上させるために、ｉｉ．ＢＦＰレポーターシステムの構築に記載されているように、出願人は、ＢＦＰ－ＧＣＡ、ＢＦＰ－ＡＣＡ、ＢＦＰ－ＴＣＡ、ＢＦＰ－ＣＣＡの４種類のプラスミドを、レンチウイルスパッケージングによりＡＤＡＲ２－ｒ１６のない一般的な２９３Ｔ、及びＡＤＡＲ２－ｒ１６を安定的に組み込んだ２９３Ｔに組み込み、ステップと命名はｉｉ．ＢＦＰレポーターシステムの構築を参照した。レポーターシステムはすでに細胞ゲノムに組み込まれているため、トリプレット選好性テストでのａｒＲＮＡのトランスフェクションと標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストでのａｒＲＮＡのトランスフェクションは異なるトランスフェクション試薬を採用した。標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストでのａｒＲＮＡのトランスフェクションはプラスミドを同時にトランスフェクションする必要があるため、以上のようにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を採用し、トリプレット選好性テストでは、ａｒＲＮＡをトランスフェクションするだけでよく、トランスフェクションプラスミドが不要であるため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：１３７７８１００）を採用した。異なるレポーターシステムを持つ２９３Ｔ又はＡＤＡＲ２－ｒ１６－２９３Ｔを、１５００００個の細胞／ウェルの密度で１２ウェルに接種し、接種後２４時間、ＲＮＡｉＭＡＸ試薬で１５ｐｍｏｌのａｒＲＮＡをトランスフェクションし、トランスフェクション後４８ｈ、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣチャンネルのシグナル強度を検出し、ＧＦＰ＋細胞の割合を統計した。
ａｒＲＮＡの３連続相補的塩基に標的Ｃとのミスマッチだけがあり、しかも標的Ｃに対応するミスマッチ塩基がＵであり、標的Ｃの上流残基と下流残基と完全にマッチングしている場合（すなわち、レポーターシステムがＢＦＰ－ＧＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＣであり、レポーターシステムがＢＦＰ－ＡＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＵであり、レポーターシステムがＢＦＰ－ＴＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＡであり、レポーターシステムがＢＦＰ－ＣＣＡの場合、ａｒＲＮＡにおいてそれに相補的な３連続相補的塩基はＵＵＧである）、テスト結果を図１７に示す。図においては、未処理はａｒＲＮＡを添加しない対照、ランダムＲＮＡ配列はランダム配列ＲＮＡを９１ｎｔ添加した対照（具体的な配列は表８ Ｒａｎ－９１を参照）、ａｒＲＮＡは上記の規則でマッチングした対応ａｒＲＮＡを添加したものを表す。図１７より、３連続塩基がＴＣＡやＡＣＡの場合、このシステムは編集効率が高く、３連続塩基がＧＣＡやＣＣＡの場合、編集効率はゼロに近いことが分かった。
３連続塩基のテスト結果は本研究に大きな迷惑を与えた。図１５のテストでは、標的ＣがＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇの４種類の異なる塩基に対応する場合を含んでいるが、図１７のテストでは、Ｃが全てＵに対合するので、図１５に対応する実験でａｒＲＮＡ標的Ｃに対応する塩基がＵの場合のデータを個別に抽出して図を再度作成して、図１８とした。図１７と比較すると、２回の実験の結論には明らかな矛盾が見られる。両図の統計方式は一致していないが、同バッチ実験での傾向は明らかに異なり、図１５のデータから作り直した図では、明らかにＧＣＡとＣＣＡの効率が高く、図１７では、明らかにＴＣＡとＡＣＡの効率が高い。
【0108】
ｖｉ．編集部位の５’上流の非マッチングの予期しない発見
２回の実験結果の矛盾は、我々の予想を完全に裏切ったものであった。何度も繰り返したり２回のａｒＲＮＡを詳細に比較したりしたところ、意外に２回の実験中のＲＮＡ設計の微妙な違いを発見し、再現させた。図１９Ａに示すように、図１８で用いたｍＲＮＡ３塩基モチーフとａｒＲＮＡ３連続相補的塩基との対合関係を示し、図１９Ｂには、図１７で用いたｍＲＮＡ３塩基モチーフとａｒＲＮＡ３連続相補的塩基との対合関係を示す。比較すると、両者の違いは、前者（図１９Ａ）は標的Ｃの上流残基に対向するａｒＲＮＡ塩基がＧであり、標的Ｃの上流残基がＣの場合以外は上流残基とａｒＲＮＡがミスマッチを形成しており、一方、後者（図１９Ｂ）は標的Ｃの上流残基に対向するａｒＲＮＡ塩基がすべて厳密に相補的塩基であることにある。したがって、これらの矛盾の原因は、３連続相補的塩基の上流残基とａｒＲＮＡとのミスマッチがトリプレット選好性の変化に繋がると推測される。
以上の推測をさらに検証するために、ｉｖ．標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストで合成されたａｒＲＮＡと、ｖ．トリプレット選好性テストで合成されたａｒＲＮＡを合わせてテストを行い、またＧＦＰパーセンテージとＭＦＩを統計した。テスト条件は、ｖ．トリプレット選好性テストと完全に一致した。ここでは、図２０及び図２１では、上段の図はいずれもｉｖ．標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストで合成されたａｒＲＮＡのテスト結果であり、下断の図はいずれもｖ．トリプレット選好性テストで合成されたａｒＲＮＡのテスト結果である。対応するａｒＲＮＡの添加は上記のｉｖ、ｖの２回テストと同じにした。図２０（％ＧＦＰ）、図２１（ＭＦＩ）に示すように、繰り返し１と繰り返し２は独立した２回の実験である。図２０と図２１から、両図は統計方式が異なるにもかかわらず、類似の傾向を持っていることがわかった。上段の図では、ＧＣＡとＣＣＡは高い編集効率を持っているが、ＴＣＡとＡＣＡは低い効率を持っており、これはｉｖ．標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストの結論と一致している。下段の図では、ＴＣＡとＡＣＡの方は効率が高い一方、ＧＣＡとＣＣＡは効率がほぼゼロであり、これはｖ．トリプレット選好性テストの結果と一致している。したがって、一見矛盾しているように見える２つの結論は、実際にはａｒＲＮＡの設計方式の違いによるものであるという我々の推測が裏付けられた。ＧＣＡという３塩基モチーフについては、既存の技術でａｒＲＮＡを設計すると編集効率がほぼゼロになるが、Ｇ－Ｇミスマッチを追加すると編集効率が著しく向上することも意外に発見された。
２回の実験結果の矛盾は、我々の予想を完全に裏切ったものであった。何度も繰り返したり２回のａｒＲＮＡを詳細に比較したりしたところ、意外に２回の実験中のＲＮＡ設計の微妙な違いを発見し、再現させた。図１９Ａに示すように、図１８で用いたｍＲＮＡ３塩基モチーフとａｒＲＮＡ３連続相補的塩基との対合関係を示し、図１９Ｂには、図１７で用いたｍＲＮＡ３塩基モチーフとａｒＲＮＡ３連続相補的塩基との対合関係を示す。比較すると、両者の違いは、前者（図１９Ａ）は標的Ｃの上流残基に対向するａｒＲＮＡ塩基がＧであり、標的Ｃの上流残基がＣの場合以外は上流残基とａｒＲＮＡがミスマッチを形成しており、一方、後者（図１９Ｂ）は標的Ｃの上流残基に対向するａｒＲＮＡ塩基がすべて厳密に相補的塩基であることにある。したがって、これらの矛盾の原因は、３連続相補的塩基の上流残基とａｒＲＮＡとのミスマッチがトリプレット選好性の変化に繋がると推測される。
以上の推測をさらに検証するために、ｉｖ．標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストで合成されたａｒＲＮＡと、ｖ．トリプレット選好性テストで合成されたａｒＲＮＡを合わせてテストを行い、またＧＦＰパーセンテージとＭＦＩを統計した。テスト条件は、ｖ．トリプレット選好性テストと完全に一致した。ここでは、図２０及び図２１では、上段の図はいずれもｉｖ．標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストで合成されたａｒＲＮＡのテスト結果であり、下断の図はいずれもｖ．トリプレット選好性テストで合成されたａｒＲＮＡのテスト結果である。対応するａｒＲＮＡの添加は上記のｉｖ、ｖの２回テストと同じにした。図２０（％ＧＦＰ）、図２１（ＭＦＩ）に示すように、繰り返し１と繰り返し２は独立した２回の実験である。図２０と図２１から、両図は統計方式が異なるにもかかわらず、類似の傾向を持っていることがわかった。上段の図では、ＧＣＡとＣＣＡは高い編集効率を持っているが、ＴＣＡとＡＣＡは低い効率を持っており、これはｉｖ．標的Ｃに対向するアンチセンスＲＮＡテストの結論と一致している。下段の図では、ＴＣＡとＡＣＡの方は効率が高い一方、ＧＣＡとＣＣＡは効率がほぼゼロであり、これはｖ．トリプレット選好性テストの結果と一致している。したがって、一見矛盾しているように見える２つの結論は、実際にはａｒＲＮＡの設計方式の違いによるものであるという我々の推測が裏付けられた。ＧＣＡという３塩基モチーフについては、既存の技術でａｒＲＮＡを設計すると編集効率がほぼゼロになるが、Ｇ－Ｇミスマッチを追加すると編集効率が著しく向上することも意外に発見された。
【0109】
以上の発見は、３塩基モチーフに他の非マッチング配列を導入することで、編集効率がさらに向上するのではないかということを示唆している。この示唆の下で、ａｒＲＮＡ上の標的Ｃに対向する塩基がＵであることを基にして、ａｒＲＮＡ３連続相補的塩基と３塩基配列の標的塩基の上流残基及び／又は下流残基の対向位置により多くの突然変異を導入した。上流残基に対向する塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇであってもよく、下流残基に対向する塩基はＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇであってもよいので、その３連続相補的塩基は合計１６種類、すなわち、ＡＵＡ、ＡＵＵ、ＡＵＣ、ＡＵＧ、ＵＵＡ、ＵＵＵ、ＵＵＣ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＧである。そこで、以上の１６種類の３連続相補的塩基を含むａｒＲＮＡを合成し、その３連続相補的塩基に基づいて１６種類の対応するａｒＲＮＡを命名し、具体的な配列を表８に示した。この１６種類の異なるａｒＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸを通じて以前に構築した８種類のレポーターを含む細胞株、すなわち、ＢＦＰ－ＡＣＡ－２９３ＴとＢＦＰ－ＡＣＡ－２９３Ｔ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６（図２２Ｂ）；ＢＦＰ－ＴＣＡ－２９３ＴとＢＦＰ－ＴＣＡ－２９３Ｔ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６（図２２Ａ）；ＢＦＰ－ＣＣＡ－２９３ＴとＢＦＰ－ＣＣＡ－２９３Ｔ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６（図２２Ｄ）；ＢＦＰ－ＧＣＡ－２９３ＴとＢＦＰ－ＧＣＡ－２９３Ｔ－ＡＤＡＲ２－ｒ１６（図２２Ｃ）にトランスフェクションし、トランスフェクション条件、テスト時間は図１７における関連実験と同様であった。４つの図中の対照は同一のサンプルであり、「９１ｎｔランダム配列」は、ランダム配列９１ｎｔを添加した対照であり、「ベクターのみ」はＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬のみを添加しＲＮＡを含まない対照、「Ｏｐｔｉ－ＤＭＥＭ培地」は同体積のＯｐｔｉ－ＤＭＥＭのみを添加しＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬を含まない対照、「未処理」はトランスフェクションを行わない対照であり、ここで、ａｒＲＮＡＵＡＧ、ａｒＲＮＡＵＵＧ、ａｒＲＮＡＵＣＧ、ａｒＲＮＡＵＧＧは、それぞれＣＣＡ－ａｒＲＮＡＵＡＧ、ＣＣＡ－ａｒＲＮＡＵＵＧ、ＣＣＡ－ａｒＲＮＡＵＣＧ、ＣＣＡ－ａｒＲＮＡＵＧＧと完全に同一の配列を持つが、２つの異なるロットで合成された。
【0110】
図２２に示すように、複数のミスマッチを導入するための好ましい項目、すなわち、３塩基モチーフがＡＣＡである場合、ａｒＲＮＡ中の３連続相補的塩基がＡＵＵ又はＧＵＵである方が編集効率が高く、３連続相補的塩基がＡＵＵである方が比較的に高く、３塩基モチーフがＵＣＡ（プラスミド中ではＴＣＡ）である場合、ａｒＲＮＡ中の３連続相補的塩基がＡＵＡ、ＧＵＡ又はＣＵＡである方が、編集効率がより高く、３連続相補的塩基がＡＵＡである方が、編集効率がさらに高く、３塩基モチーフがＧＣＡである場合、ａｒＲＮＡ中の３連続相補的塩基がＵＵＧ又はＵＣＧである方が、編集効率が高く、ＵＵＧである方が編集効率がより高く、３塩基モチーフがＣＣＡである場合、ａｒＲＮＡ中の３連続相補的塩基がＡＵＧである方が、編集効率がより高い。
【0111】
さらに、標的ＲＮＡ中の上流残基が異なると、編集効率が異なることがある。本発明の適用範囲及び３塩基モチーフの好ましい順序をより良く定義するために、本実施例では、また、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチがある場合の編集効率と、標的残基のみがミスマッチした場合の編集効率とを比較する。結果も図２２にも示されているが、３塩基モチーフの上流残基がＡ又はＵの場合、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチがあると、標的残基のみがミスマッチした場合と同等の編集効率が得られることが分かった。例えば、３塩基モチーフがＡＣＡである場合、標的残基と単一の塩基ミスマッチのみを有する３連続相補的塩基ＵＵＵは、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを有するＡＵＵ及びＧＵＵと同等の編集効率を有し、３塩基モチーフがＵＣＡである場合、標的残基と単一のミスマッチのみを有する３連続相補的塩基ＵＵＡは、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを有するＡＵＡと同等の編集効率を有する。一方、３塩基モチーフがＧＣＡである場合、標的残基と単一の塩基ミスマッチのみを有する３連続相補的塩基のＵＵＣ効率は０に近く、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを有するＵＵＧ及びＵＣＧの編集効率はＵＵＣの数倍から１０倍以上である。３塩基モチーフがＣＣＡである場合、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチが導入されたＡＵＧも、ＵＣＧと近似した編集効率を有する。このことから、編集効率向上量順に、３塩基モチーフ中の上流残基とのミスマッチの好ましい順位はＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕであり、すなわち、３塩基モチーフの上流残基がＧである場合、前記上流残基とミスマッチしたＧを導入することにより、編集効率を著しく向上させることができる。
【0112】
なお、図２２のデータは同じロット試験から得られ、同じ実験条件と検出方法を採用しているため、ＣからＵへのＲＮＡ編集技術によるＡＣＡ、ＵＣＡ、ＣＣＡ、ＧＣＡの４種類の異なる３塩基モチーフの編集効率を水平に比較することが容易である。図２２に示すように、３塩基モチーフでは、ＡＣＡ、ＵＣＡともに最高効率は１０％ＧＦＰ＋程度であり、一方、ＧＣＡの場合、標的塩基とのミスマッチだけがあれば、編集効率は０に近く、標的塩基のミスマッチに加えて、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを導入すれば、編集効率は６～８％ＧＦＰ＋まで向上するが、ＣＣＡの場合、上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを導入しても、いずれも最高効率は２．５％ＧＦＰ＋を超えない。
【産業上の利用可能性】
【0113】
本例は既存のＲＮＡ編集技術におけるＧＡＵ、ＧＡＣなどの３塩基モチーフの編集効率が低すぎるという制限を突破し、Ｇで始まる３塩基モチーフをかなり効率的に編集することができ、これにより、従来ＲＮＡ編集技術ではＧＡＵ、ＧＡＣなどの部位に対して対策がないという現状を打破し、従来技術におけるＡＤＡＲを用いたＲＮＡ編集システム、例えばＬＥＡＰＲ（ＷＯ２０２００７４００１Ａ１）、ＲＥＳＴＯＲＥ（ＷＯ２０２０００１７９３Ａ１）など、ＡＤＡＲの自然な選好性に合致しないＵＡＧ以外の他の３塩基モチーフに対する編集効率を著しく向上させた。また、本願に係る技術的解決手段は、既存のＲＮＡ編集技術においてＧＣＡなどの３塩基モチーフの編集効率が低すぎるという制限を突破し、従来のＲＥＳＣＵＥ技術（ＷＯ２０１９０７１０４８Ａ９）のＧＣＡ３塩基モチーフ編集の低効率に比べ、追加の塩基ミスマッチを導入することでＧＣＡに対する編集能力を大幅に向上させた。本例は、従来からＲＮＡ編集応用に存在する編集部位選択の制限を打破した。例えば疾患治療法の開発に関しては、本発明は、遺伝子の変異に起因するより多くの遺伝性疾患を、ＲＮＡ編集の方法により、より安全かつ効率的に治療することを可能にする。
【0114】
配列表
【0115】
【表1】
【0116】
【表2】
【0117】
【表3】
【0118】
【表4】
【0119】
【表5】
【0120】
【表6】
【0121】
【表7】
【0122】
【表8】
【0123】
【表9】
【0124】
【表10】
【0125】
【表11】
【0126】
【表12】
【0127】
【表13】
【0128】
【表14】
【0129】
【表15】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図22D】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-03-22
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
宿主細胞の標的残基の位置で標的ＲＮＡを編集する方法であって、デアミナーゼリクルートＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は該ａｒＲＮＡをコードする構築物を宿主細胞に導入することを含み、
前記ａｒＲＮＡは標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的なＲＮＡ配列を含み、前記標的残基は１つの３塩基モチーフに位置しており、前記３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中の標的残基の５'最近傍残基（上流残基）と、標的残基と、標的ＲＮＡ中の標的残基の３'最近傍残基（下流残基）と、を含み、前記３塩基モチーフはＵＡＧではなく、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡの上流残基及び／又は下流残基に直接対向するミスマッチを含む方法。
【請求項2】
前記標的残基はアデノシンである請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記上流残基はＧ、Ａ、又はＣから選択され、好ましくは、前記３塩基モチーフはＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、ＧＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＵＡＡ、ＵＡＣ及びＵＡＵから選択され、更に好ましくは、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに直接対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記３塩基モチーフはＧＡＵであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＣＧ、ＵＣＣ、ＣＣＵ又はＡＣＡを含み、前記３塩基モチーフはＧＡＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＣＡ、ＣＣＧ、ＣＣＣ又はＵＣＧを含む、前記３塩基モチーフはＧＡＣであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＧＣＧ又はＧＣＡを含み、及び／又は前記３塩基モチーフはＧＡＧであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＣＣＧ、ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＵＣＣ又はＵＣＧを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧ又はＡであり、好ましくは、前記３塩基モチーフの下流残基は前記相補的なＲＮＡ中の対向する塩基と厳密に相補的である、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記ａｒＲＮＡは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質をリクルートし、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化し、好ましくは、ＡＤＡＲ触媒ドメインを含む前記融合タンパク質は標的ドメインをさらに含み、更に好ましくは、ＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質、又はＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする構築物は前記宿主細胞に外来的に導入され、更に好ましくは、ＡＤＡＲタンパク質は前記宿主細胞に内因的に発現される、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記標的残基はシチジンであり、前記ａｒＲＮＡは、ＲＮＡに作用しシチジンデアミナーゼ活性を有するデアミナーゼをリクルートし、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンを脱アミノ化し、好ましくは、前記標的ＲＮＡ中の標的シチジンが位置する３塩基モチーフは、ＧＣＧ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＵ、ＡＣＧ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＵ、ＣＣＧ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＵ及びＵＣＧから選択されるいずれかであり、更に好ましくは、前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンに対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の前記標的シチジンに対向するシチジン、アデノシン又はウリジンを含み、好ましくは、記相補的なＲＮＡ配列は前記標的ＲＮＡ中の非標的シチジンにそれぞれ対向する１つ以上のミスマッチをさらに含み、更に好ましくは、前記３塩基モチーフの上流残基はＧであり、前記相補的なＲＮＡ中の前記上流残基に対向する塩基はＧである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記３塩基モチーフはＧＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＵＵＧ又はＵＣＧを含み、及び／又は前記３塩基モチーフはＣＣＡであり、前記相補的なＲＮＡ配列は前記３塩基モチーフに対向するＡＵＧを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは、ＡＤＡＲタンパク質又はＡＤＡＲ触媒ドメインを含む融合タンパク質に対して遺伝子修飾を行ってＣ－Ｕ触媒活性を得るデアミナーゼであり、好ましくは、シチジンデアミナーゼ活性を有する前記デアミナーゼは標的ドメインをさらに含み、更に好ましくは、前記標的ドメインは、ＳＮＡＰ－ｔａｇ、λＮペプチド、又は触媒的に不活性化されたＣａｓ１３タンパク質から選択されるいずれかである、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記宿主細胞は真核細胞であり、好ましくは、前記宿主細胞は哺乳動物の細胞であり、更に好ましくは、前記宿主細胞はヒト又はマウス細胞である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法により製造された編集されたＲＮＡ又は編集されたＲＮＡを含む宿主細胞。
【請求項13】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法で使用されるａｒＲＮＡ。
【請求項14】
請求項１３に記載のａｒＲＮＡを複数含むライブラリー。
【請求項15】
請求項１３に記載のａｒＲＮＡを含む組成物。
【国際調査報告】