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特表2023-532452窒化ケイ素および窒化アルミニウムによるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の迅速な不活性化のためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-28
(54)【発明の名称】窒化ケイ素および窒化アルミニウムによるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２の迅速な不活性化のためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
A01N 59/00 20060101AFI20230721BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20230721BHJP
A01N 59/06 20060101ALI20230721BHJP
C09D 7/61 20180101ALI20230721BHJP
C09D 1/00 20060101ALI20230721BHJP
【ＦＩ】
A01N59/00 Z
A01P3/00
A01N59/06 Z
C09D7/61
C09D1/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022579906
(86)(22)【出願日】2021-04-14
(85)【翻訳文提出日】2022-12-22
(86)【国際出願番号】 US2021027263
(87)【国際公開番号】W WO2022005550
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】63/045,355
(32)【優先日】2020-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．テフロン
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519324710
【氏名又は名称】シントクス テクノロジーズ インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マッケンタイア、ブライアン ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】バル、バジャンジット シン
(72)【発明者】
【氏名】ボック、ライアン エム．
【テーマコード（参考）】
4H011
4J038
【Ｆターム（参考）】
4H011AA04
4H011BB18
4H011DA02
4H011DA14
4J038AA011
4J038HA311
4J038HA431
4J038KA20
4J038MA10
4J038NA27
4J038PB01
(57)【要約】
窒化ケイ素および窒化アルミニウムによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の迅速な不活性化のためのシステム、方法、および物品に関する様々な実施形態が本明細書に開示される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを不活性化するための方法であって、前記方法が、前記ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムを含む物体と接触させることを含み、前記窒化ケイ素または窒化アルミニウムが前記ウイルスに連続的に結合して不活性化する、方法。
【請求項2】
前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムは、前記物体の表面にコーティングとして組み込まれるか、または存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムが約１ｗｔ．％～約３０ｗｔ．％の濃度で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記物体が、紙、厚紙、布地、プラスチック、セラミック、ステンレス鋼、金属、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記物体が、保護ガウン、ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、フェイスシールド、アイプロテクタ、手袋、手術用ガウン、手術用ドレープ、またはキュービクルカーテンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記物体が、フェイスマスクフィルタ、呼吸器フィルタ、空気濾過フィルタ、または空気換気フィルタである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記物体が、ノブ、ハンドル、レール、ベッドフレーム、ベッドトレイ、テーブル、椅子、機器ラック、キャビネット、またはカートである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記物体が前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと少なくとも１分間接触している、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの少なくとも７５％が、前記物体との接触後に不活性化される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの少なくとも９９％が、前記物体と少なくとも１分間接触した後に不活性化される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを不活性化するための方法であって、前記方法が、前記ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含む組成物と接触させることを含み、前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムが前記ウイルスに連続的に結合して不活性化する、方法。
【請求項12】
前記組成物が、スラリー、懸濁液、ゲル、塗料または練り歯磨きを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記組成物が、高接触表面に噴霧されるスラリーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
抗ウイルス特性および抗微生物特性を有する個人用保護具（ＰＰＥ）の物品であって、前記物品の表面の中に埋め込まれた、または上にコーティングされた窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含み、前記窒化ケイ素または窒化アルミニウムが、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに連続的に結合して不活性化するように動作可能である、物品。
【請求項15】
前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムが約１ｗｔ．％～約３０ｗｔ．％の濃度で存在する、請求項１４に記載の物品。
【請求項16】
ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、フェイスおよびアイプロテクタ、または手袋である、請求項１４に記載の物品。
【請求項17】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを、前記物品が前記ウイルスと少なくとも１分間接触したときに不活性化するように動作可能である、請求項１４に記載の物品。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年６月２９日に出願された米国仮出願第６３／０４５，３５５号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
本願は、２０２０年６月２９日に出願された米国仮出願第６３／０４５，３５５号の優先権を主張し、その内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0002】
本開示は、一般に、ウイルスの迅速な不活性化に関し、特に、窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の迅速な捕捉および不活性化のためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【0003】
新規コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、世界的なパンデミックを引き起こし、ウイルス性疾患の表面媒介伝染に対する関心が高まっている。呼吸エアロゾルおよび液滴、および汚染された表面は、人から人へのウイルス拡散を促進し、社会的距離の確保、マスクの着用、手洗い、および定期的な表面消毒の推奨につながる。データは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが、接触後４～７２時間、外科用マスク上で最大７日間、銅、プラスチック、鋼、および厚紙の表面上で生存したままであり得ることを示唆している。これらおよび他の材料に対するウイルス持続性は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患であるＣＯＶＩＤ－１９の社会的および院内伝播のリスクを呈する。現在のウイルス不活性化方法は、エタノールと過酸化水素または次亜塩素酸ナトリウムとの組み合わせなどの化学物質の表面適用を含む。表面への紫外線照射が、別のウイルス消毒戦略である。これらおよび他の提案された抗ウイルス方法論は、ヒト細胞に対するそれらの毒性によって、最終的に制限される。実用的な解決策として、ヒトとの接触に対して安全であり、ウイルスを自発的に不活性化することができる表面が、ウイルス性疾患の拡散を制御するために望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
とりわけ、本開示の様々な態様が考えられ開発されたことは、これらの観察結果を念頭に置いている。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本明細書で提供されるのは、ウイルスを窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムを含む物体と接触させることによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを捕捉および不活性化する方法の実施形態である。
【0006】
いくつかの態様では、物体は窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含んでもよく、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは連続的に結合し（すなわち、捕捉し）、次いでウイルスを不活性化する。例えば、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、コーティングとして物体の表面に存在してもよく、または物体に組み込まれてもよい。いくつかの例では、窒化ケイ素は約１ｗｔ．％～約３０ｗｔ．％の濃度で存在する。
【0007】
いくつかの態様では、物体は、少なくとも１分間または少なくとも３０分間ウイルスと接触し得る。例えば、ウイルスは、物体と少なくとも１分間接触した後、少なくとも７５％不活性化され得る。いくつかの態様では、物体は、紙、厚紙、ポリマー、布地、プラスチック、セラミック、ステンレス鋼、および／または金属を含むことができる。いくつかの態様では、物体は、保護ガウン、ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、フェイスシールド、アイプロテクタ、手袋、手術用ガウン、手術用ドレープ、またはキュービクルカーテンである。いくつかの追加の態様では、物体は、フェイスマスクフィルタ、呼吸器フィルタ、空気濾過フィルタ、または空気換気フィルタである。またさらなる態様では、物体が、ノブ、ハンドル、レール、ベッドフレーム、ベッドトレイ、テーブル、椅子、機器ラック、またはカートである。いくつかの追加の態様では、物体は、スラリー、懸濁液、ゲル、塗料、または練り歯磨きなどの組成物であってもよい。
【0008】
抗ウイルス特性および抗微生物特性を有する個人用保護具（ＰＰＥ）の物品の実施形態も本明細書で提供される。いくつかの態様では、物品は窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含む。窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、物品に組み込まれてもよく、または物品の表面にコーティングされてもよい。いくつかの態様では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、約１ｗｔ．％～約３０ｗｔ．％の濃度で存在してもよい。いくつかの態様では、物品は、ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、フェイスおよびアイプロテクタ、または手袋であり得る。いくつかの例では、物品は、ウイルスと接触すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに結合／捕捉し、次いでウイルスを不活性化するように動作可能である。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
【図2-1】図２Ａ～２Ｄは、銅または窒化物粒子への曝露後に重度の分解を受けたウイルスＲＮＡを示すグラフ表示である。図２Ａおよび図２Ｂでは、ウイルス懸濁液をＣｕ、ＡｌＮおよびＳｉ３Ｎ４粉末に１分間曝露し、ウイルスＮ遺伝子「セット１」および「セット２」プライマーをそれぞれ使用して、上清および粒子上のウイルスＲＮＡを評価した。上清およびペレット試料について収集したデータを、未処理のままにした懸濁液中のウイルスＮ遺伝子ＲＮＡの量と比較して示す。図２Ｃおよび２Ｄでは、ウイルスＮ遺伝子「セット１」および「セット２」プライマーについて、上清をＣｕ、ＡｌＮおよびＳｉ３Ｎ４粉末に１０分間曝露した後のＲＴ－ＰＣＲ試験の結果をそれぞれ示す。統計を、対応のない両側スチューデントのｔ検定（ｎ＝３）に従って挿入図に示す。
【図2-2】同上。
【0011】
【図3-1】図３Ａ～３Ｅは、Ｃｕが細胞を死滅させた細胞生存率に影響を及ぼすことなく、Ｓｉ３Ｎ４がウイルス感染を抑制したことを示す画像である。ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に、（図３Ａ）非曝露ビリオン、およびＳｉ３Ｎ４（図３Ｂ）、ＡｌＮ（図３Ｃ）およびＣｕ（図３Ｄ）に１０分間ＵＴＥ曝露したビリオンを接種した。図３Ｅでは、非接種細胞（「偽感染」細胞として標識）も調製し、比較のために画像化した。固定後、細胞を、抗ＳＡＲＳコロナウイルスエンベロープ抗体（赤色）、Ｆ－アクチンを可視化するファロイジン（緑色）、および核を染色するＤＡＰＩ（青色）で染色した。ｎ＝３の試料を代表する蛍光顕微鏡写真を示す。
【図3-2】同上。
【図3-3】同上。
【0012】
【図4】蛍光顕微鏡写真上で蛍光標識細胞および非標識細胞を計数し、感染させた細胞の百分率および生存細胞の百分率を以下のように計算したことを示すグラフ表示である：感染させた細胞の百分率＝（抗ＳＡＲＳコロナウイルスエンベロープ抗体で染色された細胞の数）／（ＤＡＰＩで染色された細胞の数）×１００；および、生存細胞の百分率＝（ファロイジンで染色された細胞の数）／（ＤＡＰＩで染色された細胞の数）×１００。データは、ｎ＝３のサンプルを表す。＊および＊＊は、対応なしの両側スチューデントのｔ検定により、それぞれｐ＜０．０５および０．０１である（ｎ＝３）；ｎ．ｓ．＝有意でない。
【0013】
【図5-1】図５Ａ～５Ｇは以下のためのラマンスペクトルのグラフ表示である：（ａ）非感染の細胞（図５Ａ）（すなわち、ビリオンに曝露されていない）、ならびに（ｂ）Ｓｉ３Ｎ４（図５Ｂ）、（ｃ）ＡｌＮ（図５Ｃ）および（ｄ）Ｃｕ（図５Ｄ）に１０分間曝露したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンに感染した細胞、図５Ｅにおいて、曝露されていないビリオン（陰性対照）に感染した細胞。図５Ｆでは、曝露されていない、および異なる粒子に１０分間曝露されたビリオンによる感染させた細胞の割合の関数としての２つのトリプトファンＴ１およびＴ２のバンド（それぞれ７５６および８７５ｃｍ－１で）の平均強度のプロット（標識を参照されたい）。インセットでは、酵素的ＩＤＯ反応時のトリプトファンの異化における中間体であるＮ’－ホルミルキヌレニンの構造。図５Ｇにおいて、グラフ表示は、Ｃｕ（ＩＩ）イオンのキレート化時にチロシン（Ｔｙ２バンド）における環振動の消失を正当化し得るチロシン系ペプチドの３つの可能な立体配座を示す。
【図5-2】同上。
【図5-3】同上。
【図5-4】同上。
【0014】
【図6】細胞中のＳｉ３Ｎ４の表面におけるプロトン化アミン基、Ｓｉ－ＮＨ３
＋とリジンのＮ末端Ｃ－ＮＨ３
＋との間の化学的および電荷の類似性（左パネル）、およびＳｉ３Ｎ４（具体的には、プロトン化アミンでは、＋に荷電）の表面の荷電分子種および溶出種ＮＨ３／ＮＨ４
＋とのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの相互作用（中央パネル）を示す概略モデルである。溶出したＮは、固体表面（紫色の部位）に、負に帯電したシラノールと共に発生する３＋の帯電した空孔を残す。溶出される窒素種（すなわち、２’－ヒドロキシル基の脱プロトン化、一過性ペンタホスフェートの形成、および加水分解によるアルカリエステル交換によるＲＮＡ骨格中のホスホジエステル結合の切断）によるＲＮＡ骨格切断をもたらす３段階プロセスを右パネルに示す。プロトン化アミンとリジンのＮ末端との間の類似性が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン不活性化のための非常に効果的な「競合的結合」機構を誘因する可能性があり、一方で溶出したアンモニアがビリオンＲＮＡを複合的な「捕捉および死滅」効果で致命的に分解することに留意されたい。
【0015】
対応する参照符号は、図面の図のうちの要素を示す。図面で使用される見出しは、特許請求の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本開示の様々な実施形態が、以下で詳細に論じられる。具体的な実装形態が論じられるが、これは例示目的のみのために行われることを理解されたい。当業者は、他の構成要素および構成が、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく使用され得ることを認識するであろう。したがって、以下の説明および図面は例示であり、限定として解釈されるべきではない。本開示の完全な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細が記載されている。しかし、特定の事例では、説明を不明瞭にすることを避けるために、周知または通例の詳細は説明されていない。
【0017】
本開示全体に適用される複数の定義がここで提示される。本明細書における「一実施形態」、「実施形態」、または同様の形式化への言及は、実施形態に関連して説明された特定の特徴、構造、動作、または特性が本開示の少なくとも一実施形態に含まれ得ることを意味する。本明細書の様々な箇所における「一実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではなく、他の実施形態と相互排他的な別個のまたは代替の実施形態でもない。さらに、いくつかの実施形態によって示され、他の実施形態によって示されない可能性がある様々な特徴が記載される。
【0018】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それらのオープンで非限定的な意味で使用される。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、複数および単数を包含すると理解される。したがって、「その混合物」という用語はまた、「それらの混合物」に関する。
【0019】
本明細書で使用される場合、「約」は、明示的に示されているか否かにかかわらず、整数、分数、パーセンテージなどを含む数値を指す。「約」という用語は、一般に、数値の範囲、例えば、列挙された値の±０．５～１％、±１～５％または±５～１０％を指し、例えば、同じ機能または結果を有する列挙された値と等価と考えられる。
【0020】
本明細書で使用される場合、「窒化ケイ素」という用語は、α－Ｓｉ３Ｎ４、β－Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＹＡｌＯＮ、β－ＳｉＹＡｌＯＮ、ＳｉＹＯＮ、ＳｉＡｌＯＮ、またはそれらの組み合わせを含む。
【0021】
本明細書で使用される場合、「不活性化する」または「不活性化」は、ウイルスを完全に除去するかまたはそれらを非感染性にすることによって、ウイルスが製品または物体を汚染するのを防ぐウイルス不活性化を指す。
【0022】
本明細書で使用される「物体」、「装置」または「構成要素」という用語は、材料、組成物、デバイス、表面コーティング、および／または複合材料を含む。いくつかの例では、装置は、様々な医療機器または機器、検査台、衣類、フィルタ、マスクおよび手袋などの個人用保護具、カテーテル、内視鏡器具、ウイルス持続性が疾患の拡散を促進し得る一般的に触れられる表面などを含み得る。装置は、金属、ポリマー、および／またはセラミック（例えば、窒化ケイ素および／または他のセラミック材料）であってもよい。
【0023】
本明細書で使用される場合、「接触」は、組成物または装置によって影響を受けるように組成物または装置に物理的に接触しているか、または十分に近接していることを意味する。
【0024】
本明細書で使用される場合、「個人用保護具」または「ＰＰＥ」は、病原体または他の有害物質への曝露を最小限に抑えるために人によって着用さもなければ使用される任意のデバイス、物品、または装置を意味する。ＰＰＥの非限定的な例には、ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、アイプロテクタ、フェイスおよびアイプロテクタ、ならびに手袋が含まれる。
【0025】
本明細書で使用される用語は、一般に、開示される主題の文脈内で、および各用語が使用される特定の文脈内で、当該技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本明細書で論じられる用語のいずれか１つまたは複数について代替の言語および同義語を使用することができ、用語が本明細書で詳述または議論されるか否かに特別な重要性は置かれるべきではない。場合によっては、特定の用語の同義語が提示される。１つまたは複数の同義語の列挙は、他の同義語の使用を排除しない。本明細書で論じられる任意の用語の例を含む本明細書のどこかの例の使用は、例示にすぎず、本開示または任意の例示的な用語の範囲および意味をさらに限定することを意図するものではない。同様に、本開示は、本明細書で与えられる様々な実施形態に限定されない。
【0026】
続く説明において、本開示の追加の特徴および利点を述べ、一部は、説明から明らかであるか、または本明細書に開示される原理の実践により知得できる。本開示の特徴および利点は、別添の特許請求の範囲で特に指摘される器具および組み合わせによって実現および取得することができる。本開示のこれらおよび他の特徴は、以下の説明および別添の特許請求の範囲からより完全に明らかになるか、または本明細書で述べる原理の実践によって知得することができる。
【0027】
本明細書で提供されるのは、ウイルスを窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムを含む物体または組成物と接触させることによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを不活性化する方法である。窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムは連続的に結合し（すなわち、キャプチャ）、次いでウイルスを不活性化する（例えば、「キャッチアンドキル」）。
【0028】
窒化ケイ素は独特の表面化学を有し、生体適合性であり、多くの生物医学的用途を提供し、例えば、１）脊椎および歯科インプラントなどにおける同時の骨形成、骨誘導、骨伝導、および静菌、２）異なる機構によるグラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方の死滅、３）ヒトおよび動物のウイルス、細菌、ならびに真菌の不活性化、ならびに４）ポリマーもしくは金属マトリックス複合材、天然もしくは人工の繊維、ポリマー、または窒化ケイ素粉末を含有する金属は、重要な窒化ケイ素の骨修復性、静菌性、抗ウイルス性、および抗真菌性を保持する。
【0029】
窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）は、１９５０年以来多くの産業で使用されている非酸化物セラミック化合物である。Ｓｉ３Ｎ４の製剤は、長期安全性、有効性、および生体適合性が証明されている、頸椎および腰椎固定術における椎間脊椎スペーサとしての使用について、ＦＤＡに認可されている。Ｓｉ３Ｎ４インプラントの臨床データは、同種移植片、チタン、およびポリエーテルエーテルケトンなどの他の脊椎生体材料と有利に比較される。興味深い知見は、Ｓｉ３Ｎ４インプラントは、他のインプラントの材料（２．７％～１８％）と比較して細菌感染の発生率が低い（すなわち、０．００６％未満）ことである。この特性は、アンモニア、アンモニウム、および細菌を阻害する他の反応性窒素種（ＲＮＳ）に変換される微量の窒素を溶出する、Ｓｉ３Ｎ４の複雑な表面生化学を反映している。最近の調査はまた、水性懸濁液中の焼結Ｓｉ３Ｎ４粉末へのウイルス曝露がＨ１Ｎ１（インフルエンザＡ／プエルトリコ／８／１９３４）、ネコカリシウイルスおよびエンテロウイルス（ＥＶ－Ａ７１）を中和したことを見出した。これらの知見に基づいて、Ｓｉ３Ｎ４はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を不活性化することができる可能性がある。
【0030】
窒化ケイ素は、水性培地、または生物学的流体および組織と接触したときに窒素含有種が放出されるため、抗病原性であり得る。窒化ケイ素の表面化学は、以下のように示すことができる。
Ｓｉ３Ｎ４＋６Ｈ２Ｏ→３ＳｉＯ２＋４ＮＨ３
ＳｉＯ２＋２Ｈ２Ｏ→Ｓｉ（ＯＨ）４
Ｓｉ３Ｎ４＋６Ｈ２Ｏ→３ＳｉＯ２＋４ＮＨ３
ＳｉＯ２＋２Ｈ２Ｏ→Ｓｉ（ＯＨ）４
【0031】
窒素は、表面のシラノールが比較的安定であるため、ケイ素よりも速く（数分以内に）溶出する。ウイルスの場合、驚くべきことに、窒化ケイ素は、ゲノムの完全性の喪失およびウイルス不活性化をもたらすアルカリ性エステル交換によるＲＮＡ切断をもたらし得ることが見出された。これはまた、赤血球凝集素の活性を低下させ得る。アンモニアの溶出は、ｐＨの付随する増加と共に、ウイルス、細菌および真菌を不活性化する。実施例に示すように、驚くべきことに、窒化ケイ素および窒化アルミニウムのそれぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を不活性化することが見出された。
【0032】
歴史的に認識されている殺ウイルス剤である銅（Ｃｕ）の使用は、その細胞毒性によって制限される。Ｃｕとは対照的に、Ｓｉ３Ｎ４で作られたセラミックデバイスまたは装置は生体適合性であり、人体に有毒ではない。Ｓｉ３Ｎ４の利点は、材料の汎用性である。したがって、Ｓｉ３Ｎ４は、ポリマー、生物活性ガラス、さらには他のセラミックに組み込まれて、Ｓｉ３Ｎ４の好ましい生体適合性および抗ウイルス特性を保持する複合材料およびコーティングを作製することができる。
【0033】
本開示は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をＳｉ３Ｎ４および窒化アルミニウム（ＡｌＮ）粒子の水性懸濁液および２つの対照（すなわち、銅（Ｃｕ）粒子の懸濁液（陽性対照）およびいずれの抗ウイルス剤も含まないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンの偽懸濁液（陰性対照））に曝露する効果を比較する。ウイルスを含む様々な微生物を不活性化するその周知の能力のために、銅（Ｃｕ）を陽性対照として選択した。窒化アルミニウムは、Ｓｉ３Ｎ４と同様に、水溶液中での表面加水分解が窒素の溶出をもたらし、それに伴ってｐＨが上昇する窒素系化合物であるため、試験に含めた。同等の抗ウイルス現象および抗菌現象は、すべての窒化物系化合物に対して有効であると考えられているので、ＡｌＮを使用して、窒素含有無機材料の抗病原性機構についてのさらなる洞察をもたらした。
【0034】
一般的な材料（例えば、金属、プラスチック、紙、および布地）および接触面（例えば、ノブ、ハンドル、レール、机、およびデスクトップ）におけるヒトコロナウイルスの持続性は、疾患の院内および社会的拡散に寄与し得る。Ｗａｒｎｅｓらは、湿度３０％～４０％の室温で、病原性ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨｕＣｏＶ－２２９Ｅ）は、テフロン、ポリ塩化ビニル、セラミックタイル、ガラス、ステンレス鋼、およびシリコーンゴムなどの様々な材料で少なくとも５日間持続的に生存した後も肺細胞モデルにおいて感染性のままであったことを報告した。これらの研究者らはまた、Ｃｕ表面の模擬の指先汚染のための迅速なＨｕＣｏＶ－２２９Ｅ不活性化（数分以内）を示した。Ｃｕイオン放出および活性酸素種（ＲＯＳ）の生成はウイルス不活性化に関与していた。銅および真鍮の表面との接触時間の増加は、ウイルスＲＮＡのより大きな非特異的断片化をもたらし、不可逆的なウイルス不活性化を示した。より最近になって、Ｄｏｒｅｍａｌｅｎらは、プラスチック、厚紙、ステンレス鋼、さらにはＣｕ表面上で、適用後４～７２時間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの両方の表面安定性を示した。呼吸用Ｎ９５等級マスクは微粒子を吸入する前に捕捉することができるが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス粒子はマスクフィルタ内で最大７日間活性を維持する。したがって、Ｃｕ表面で観察されるようなウイルスの接触での死滅は、疾患緩和の戦略として新たな関心を集めている。
【0035】
驚くべきことに、内因性窒素放出が可能な化合物、例えばＳｉ３Ｎ４およびＡｌＮは、少なくともＣｕと同程度に効果的に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを不活性化することができる。いずれか１つの理論に限定されるものではないが、ＲＮＡ断片化などの複数の抗ウイルス機構が動作可能であり得、ＣｕおよびＡｌＮの場合、直接的な金属イオン毒性があり得る。しかし、ＣｕおよびＡｌＮ上清は細胞溶解を示したが、Ｓｉ３Ｎ４は代謝の変化を引き起こさない可能性がある。Ｓｉ３Ｎ４ウイルス上清に曝露したＶｅｒｏＥ６細胞のラマンスペクトルは、非感染偽細胞のラマンスペクトルのようであった。これらの知見は、Ｓｉ３Ｎ４、ＣｕおよびＡｌＮがすべてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを不活性化することができたが、Ｓｉ３Ｎ４が最も安全であったことを示している。
【0036】
抗ウイルス効果は、電気的引力（インフルエンザウイルスの場合、エンベロープ糖タンパク質ヘマグルチニンへの「競合的結合」を含む）および反応性窒素種（ＲＮＳ）によるウイルスＲＮＡ断片化に関連し得る。これらの現象は、水溶液中の自由電子および負に帯電したシラノールの放出と結合したアンモニア（ＮＨ３）およびアンモニウム（ＮＨ４
＋）の部分を形成するＳｉ３Ｎ４の表面からの窒素のゆっくりと制御された溶出に起因する。
【0037】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス不活性化の状況では、Ｓｉ３Ｎ４の表面化学の２つの重要な側面、（ｉ）Ｓｉ３Ｎ４の表面のプロトン化アミノ基Ｓｉ－ＮＨ３
＋とウイルス上のリジンのＮ末端Ｃ－ＮＨ３
＋との間の類似性、および（ｉｉ）Ｓｉ３Ｎ４加水分解によるガス状アンモニアの溶出が基本的な役割を果たす。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とＳｉ３Ｎ４表面との間の相互作用の概略図を図６（中央パネル）に示す。類似性は、この図の左パネルに示されている。それは、Ｂ型肝炎およびインフルエンザＡなどのいくつかの成功した他の例に起因する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２不活性化への極めて効果的な「競合的結合」アプローチを誘因する。溶出した（ガス状）ＮＨ３の強力な抗ウイルス効果は、ビリオンの浸透およびＲＮＡ骨格との反応に起因する。ＲＮＡは、そのホスホジエステル結合の加水分解を介してアルカリ性エステル交換を受ける。ＲＮＡホスホジエステル結合切断を図６の右パネルに概略的に示す。本研究のＲＴ－ＰＣＲおよび蛍光顕微鏡法の結果は、以前の研究と一致して、両方の機構からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の不活性化への寄与を示唆している。上清またはＳｉ３Ｎ４粒子のいずれかから回収されたウイルスＲＮＡについての図１Ａ～１Ｄに示されるＴＣＩＤ５０の結果、および図２Ａ～２ＤのＲＴ－ＰＣＲデータは、これらの機構に関する重要な情報を提供する。Ｓｉ３Ｎ４への１分間の曝露後に９９％を超える不活性化が達成されたが（図１Ｂ）、Ｓｉ３Ｎ４粒子から回収されたＲＮＡ（図２Ｂ）は本質的に完全に断片化されていたのに対し、上清については部分的なウイルスＲＮＡ断片化のみが観察された（図２Ａ）。なお、Ｃｕについては、逆の効果が見られた。これは、図６の左パネルに示すように、Ｓｉ３Ｎ４の不活性化の機構が、「競合的結合」およびアンモニア中毒の連続的な事象－一種の「捕捉および死滅」シナリオを有していたことを示唆している。Ｓｉ３Ｎ４への１０分間の曝露での完全なＲＮＡ断片化は、窒素溶出がウイルス不活性化をもたらす反応のカスケードを引き起こす重要なプロセスであることを示唆している（図６の右パネルを参照されたい）。
【0038】
いくつかの実施形態では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含む物体、物品、または組成物は、ウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２）に連続的に結合し、次いでウイルスを不活性化するように動作可能であり得る。
【0039】
Ｓｉ３Ｎ４の抗ウイルス効果は、Ｃｕに匹敵し得る。Ｃｕはヒトの健康にとって必須の微量元素であり、Ｃｕ＋とＣｕ２＋との間の酸化還元状態を変化させることによって、いくつかの重要な酵素の電子供与体／受容体であるが、これらの特性は細胞損傷も引き起こす可能性がある。抗ウイルス剤としてのその使用は、アレルギー性皮膚炎、過敏症および多臓器機能障害によって制限される。対照的に、脊椎固定術中の永続的に埋め込まれた材料としてのＳｉ３Ｎ４の安全性は、実験および臨床データによって十分に確立されている。したがって、窒化ケイ素を含む物体、物品、または組成物は、Ｃｕの悪影響なしにＣｕと同様にウイルスを不活性化するのに有効であり得る。
【0040】
Ｓｉ３Ｎ４は、工業材料としてのその能力でよく知られている。荷重支持のＳｉ３Ｎ４人工股関節軸受および脊椎固定用インプラントは、Ｓｉ３Ｎ４の優れた強度および靭性のために、最初に開発された。後の研究は、整形外科用インプラントの設計において好まれるＳｉ３Ｎ４の他の特性、例えば、骨伝導性の向上、静菌性、放射線透過性の改善、インプラント沈下の欠如、および耐摩耗性などを示した。したがって、Ｓｉ３Ｎ４の表面化学、トポグラフィ、および親水性は、二重の効果（すなわち、細菌の付着およびバイオフィルムの形成を同時に防止しながら脊椎の固定を促進するための骨形成活性の上方調節）に寄与する。バイオインプラントとしての実績に加えて、Ｓｉ３Ｎ４の利点は、その製造の汎用性である。Ｓｉ３Ｎ４の焼結粉末は、ポリマー、他のセラミック、バイオガラス、および金属などの他の材料に組み込まれて、モノリシックＳｉ３Ｎ４の指数骨形成特性および抗菌特性を維持する複合構造を作成している。Ｓｉ３Ｎ４の三次元積層堆積は、微生物の疾患の媒介物媒介性の伝播を減少させる医療における保護的な表面の製造を可能にし得る。Ｓｉ３Ｎ４粒子をフェイスマスク、保護ガウン、および手術用ドレープなどの個人用保護具の布地に組み込むことは、医療従事者ならびに患者の安全に寄与し得る。
【0041】
Ｓｉ３Ｎ４は、曝露後数分でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを不活性化する。いずれか１つの理論に限定されるものではないが、作用機序は、窒化アルミニウムなどの微量の表面消毒剤を発現する他の窒素系化合物と共有され得る。
【0042】
いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを結合および不活性化するために使用される物体は、物体の表面の少なくとも一部に窒化ケイ素および／または窒化アルミニウム組成物を含み得るデバイスまたは装置である。窒化ケイ素または窒化アルミニウムコーティングは、粉末として物体の表面に適用されてもよい。いくつかの例では、窒化ケイ素または窒化アルミニウム粉末は、物体の少なくとも一部に充填、埋め込み、または含浸されてもよい。いくつかの実施形態では、粉末は、ミクロン、サブミクロンまたはナノメートルというサイズの範囲の粒子を有し得る。平均粒径は、約１００ｎｍ～約５μｍ、約３００ｎｍ～約１．５μｍ、または約０．６μｍ～約１．０μｍの範囲であり得る。他の実施形態では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムをデバイスに組み込むことができる。例えば、物体は、物体の本体内に窒化ケイ素および／または窒化アルミニウム粉末を組み込むことができる。一実施形態では、デバイスは窒化ケイ素で作製されてもよい。別の実施形態では、物体は窒化アルミニウム製であってもよい。さらに別の実施形態では、物体は、窒化アルミニウムまたは窒化ケイ素粒子のスラリーまたは懸濁液を含むことができる。
【0043】
いくつかの実施形態では、物体は、紙、厚紙、布地、プラスチック、セラミック、ポリマー、ステンレス鋼、金属、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない他の材料をさらに含んでもよい。物体のいくつかの非限定的な例には、手術用ガウン、手術用ドレープ、シューズカバー、キュービクルカーテン、チューブ、衣類、手袋、アイプロテクタ、手術用マスクおよびフェイスシールドを含むマスク、ＰＰＥ、病院検査用および手術台などの台、椅子、ベッドフレーム、ベッドトレイ、デスク、固定具、キャビネット、機器ラック、カート、ハンドル、ノブ、レール、玩具、水フィルタ、ならびにフェイスマスクフィルタ、人工呼吸器フィルタ、空気濾過フィルタ、および空気換気フィルタなどのエアフィルタ、またはエアコンフィルタが含まれ得る。いくつかの例では、フィルタは、空気が感染した肺の内外を移動するときにフィルタ内の抗菌性表面層が肺病原体を捕捉することができるように、麻酔器、換気装置、またはＣＰＡＰ装置の濾過装置内にあってもよい。様々な実施形態において、物体は、医療機器または装置であってもよい。医療用デバイスまたは装置の非限定的な例としては、整形外科用インプラント、脊椎インプラント、椎弓根スクリュー、歯科用インプラント、留置カテーテル、気管内チューブ、大腸内視鏡スコープ、および他の同様のデバイスが挙げられる。
【0044】
他の実施形態では、物体は、スラリー、懸濁液、ゲル、スプレー、塗料、または練り歯磨きを含むがこれらに限定されない窒化ケイ素または窒化アルミニウム粉末をその中に組み込む組成物であってもよい。例えば、次いで表面に塗布される塗料などのスラリーに窒化ケイ素または窒化アルミニウムを添加することにより、抗菌性、抗真菌性、および抗ウイルス性の表面を設けることができる。他の実施形態では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムを任意の適切な分散剤およびスラリー安定剤と共に水と混合し、その後、スラリーを様々な表面に噴霧することによって塗布することができる。分散剤の例は、Ｄｏｌａｐｉｘ Ａ８８である。
【0045】
窒化ケイ素または窒化アルミニウムコーティングは、物体の表面に約１ｗｔ．％～約１００ｗｔ．％の濃度で存在してもよい。窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムは、物体の上にコーティングされてもよく、または物体に積層されてもよい。様々な実施形態において、コーティングは、約１ｗｔ．％、２ｗｔ．％、５ｗｔ．％、７．５ｗｔ．％、８．３ｗｔ．％、１０ｗｔ．％、１５ｗｔ．％、１６．７ｗｔ．％、２０ｗｔ．％、２５ｗｔ．％、または約３０ｗｔ．％の窒化ケイ素粉末または窒化アルミニウム粉末を含み得る。いくつかの例では、コーティングは約１０ｗｔ．％～約２０ｗｔ．％の窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含み得る。少なくとも１つの例において、コーティングは約１５ｗｔ．％の窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、約１ｗｔ．％～約１００ｗｔ．％の濃度で物体の表面内に（充填剤として）または表面上に埋め込まれてもよい。様々な実施形態では、物体は約１ｗｔ．％、２ｗｔ．％、５ｗｔ．％、７．５ｗｔ．％、８．３ｗｔ．％、１０ｗｔ．％、１５ｗｔ．％、１６．７ｗｔ．％、２０ｗｔ．％、２５ｗｔ．％、３０ｗｔ．％、３３．３ｗｔ．％、３５ｗｔ．％、４０ｗｔ．％、５０ｗｔ．％、６０ｗｔ．％、７０ｗｔ．％、８０ｗｔ．％、９０ｗｔ．％～１００ｗｔ．％の窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含み得る。いくつかの例では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、約１０ｗｔ．％～約２０ｗｔ．％の濃度で物体の表面上にあってもよい。少なくとも１つの例では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、約１５ｗｔ．％の濃度で物体の表面上にあってもよい。いくつかの態様では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムの濃度は、紙、厚紙、布地、プラスチック、セラミック、ポリマー、ステンレス鋼、および／または金属などの物体の基板の材料に依存し得る。いくつかの実施形態では、物体の基板の材料はポリマーであってもよく、ポリマーは、物体に組み込まれ得る窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムの量に実用上の限界（すなわち、パーコレーションの限界）を有し得る。
【0046】
いくつかの実施形態では、物体は、窒化ケイ素または窒化アルミニウムからなるモノリシックな構成要素であり得る。そのような物体は、内部空隙率を有さない完全に高密度であってもよく、または約１％～約８０％の範囲の空隙率を有する多孔質であってもよい。モノリシックな物体は、医療機器として使用されてもよく、またはウイルスの不活性化が望まれ得る装置で使用されてもよい。
【0047】
いくつかの実施形態では、物体は、限られた期間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと接触し得る。ウイルスを不活性化するために、物体をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと約１分～約２時間接触させてもよい。様々な例では、物体は、少なくとも３０秒間、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、または少なくとも１日の間、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと接触し得る。少なくとも１つの例では、物体は、患者に恒久的に埋め込まれてもよい。少なくとも１つの例では、物体は、ユーザによって外部に着用されてもよい。別の例では、物体は、患者に恒久的に埋め込まれてもよい。さらに別の例では、物体は高接触面であってもよい。さらなる例では、物体は、患者の体液と連続的または持続的に接触していてもよい。体液は、血液であってもよいし、気体（例えば、吸入または呼気ガス）であってもよい。
【0048】
いくつかの実施形態では、ウイルスは、物体と少なくとも１分間、少なくとも５分間、または少なくとも３０分間接触した後、少なくとも７０％不活性化され、少なくとも７５％不活性化され、少なくとも８０％不活性化され、少なくとも８５％不活性化され、少なくとも９０％不活性化され、少なくとも９５％不活性化され、または少なくとも９９％不活性化される。少なくとも１つの例において、ウイルスは、物体との少なくとも１分間の接触後に少なくとも８５％不活性化される。別の例では、ウイルスは、物体と少なくとも３０分間接触した後、少なくとも９９％不活性化される。さらに別の例では、ウイルスは、物体と少なくとも１分間接触した後、少なくとも９９％不活性化される。
【0049】
抗ウイルス特性および抗微生物特性を有する個人用保護具の物品も本明細書に提示される。物品は、物品に組み込まれた窒化ケイ素もしくは窒化アルミニウムを含んでもよく、または窒化ケイ素もしくは窒化アルミニウムは、物品の表面上にコーティングされてもよい。
【0050】
窒化ケイ素または窒化アルミニウムコーティングは、物品の表面に約１ｗｔ．％～約１００ｗｔ．％の濃度で存在してもよい。様々な実施形態において、コーティングは、約１ｗｔ．％、２ｗｔ．％、５ｗｔ．％、７．５ｗｔ．％、８．３ｗｔ．％、１０ｗｔ．％、１５ｗｔ．％、１６．７ｗｔ．％、２０ｗｔ．％、２５ｗｔ．％、または約３０ｗｔ．％の窒化ケイ素粉末または窒化アルミニウム粉末を含み得る。いくつかの例では、コーティングは約１０ｗｔ．％～約２０ｗｔ．％の窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含み得る。少なくとも１つの例において、コーティングは約１５ｗｔ．％の窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、約１ｗｔ．％～約１００ｗｔ．％の濃度で物品の表面内に（充填剤として）または表面上に埋め込まれてもよい。様々な実施形態では、物体は約１ｗｔ．％、２ｗｔ．％、５ｗｔ．％、７．５ｗｔ．％、８．３ｗｔ．％、１０ｗｔ．％、１５ｗｔ．％、１６．７ｗｔ．％、２０ｗｔ．％、２５ｗｔ．％、３０ｗｔ．％、３３．３ｗｔ．％、３５ｗｔ．％、４０ｗｔ．％、５０ｗｔ．％、６０ｗｔ．％、７０ｗｔ．％、８０ｗｔ．％、９０ｗｔ．％～１００ｗｔ．％の窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含み得る。いくつかの例では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、約１０ｗｔ．％～約２０ｗｔ．％の濃度で物品の表面上にあってもよい。少なくとも１つの例では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムは、約１５ｗｔ．％の濃度で物品の表面上にあってもよい。いくつかの態様では、窒化ケイ素または窒化アルミニウムの濃度は、物体の基板の材料に依存し得る。
【0051】
いくつかの実施形態において、物品はＰＰＥである。いくつかの態様では、物品は、ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、フェイスおよびアイプロテクタ、または手袋である。いくつかの態様において、物品は、物品がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと接触したときにウイルスを不活性化するように動作可能である。
【実施例】
【0052】
実施例１：
試験材料の調製
Ｓｉ３Ｎ４、Ｃｕ、およびＡｌＮ粉末を商業的供給源から入手した。Ｓｉ３Ｎ４粉末（公称組成９０ｗｔ．％Ｓｉ３Ｎ４、６ｗｔ．％Ｙ２Ｏ３、および４ｗｔ．％Ａｌ２Ｏ３）を、無機成分の水性混合および噴霧乾燥、それに続く噴霧乾燥顆粒の焼結（約１７００℃、約３時間）、熱間静水圧プレス（Ｎ２中約１６００℃、２時間、１４０ＭＰａ）、水性粉砕および凍結乾燥によって調製した。得られた粉末の平均粒径は０．８±１．０μｍであった。受け取ったままのＣｕ粉末（ＵＳＰグレード９９．５％純度）顆粒を粉砕して、Ｓｉ３Ｎ４に匹敵する粒径を達成した。ＡｌＮ粉末は、受け取ったままで１．２±０．６μｍの平均粒径を有し、これはＳｉ３Ｎ４に匹敵した。
試験材料の調製
Ｓｉ３Ｎ４、Ｃｕ、およびＡｌＮ粉末を商業的供給源から入手した。Ｓｉ３Ｎ４粉末（公称組成９０ｗｔ．％Ｓｉ３Ｎ４、６ｗｔ．％Ｙ２Ｏ３、および４ｗｔ．％Ａｌ２Ｏ３）を、無機成分の水性混合および噴霧乾燥、それに続く噴霧乾燥顆粒の焼結（約１７００℃、約３時間）、熱間静水圧プレス（Ｎ２中約１６００℃、２時間、１４０ＭＰａ）、水性粉砕および凍結乾燥によって調製した。得られた粉末の平均粒径は０．８±１．０μｍであった。受け取ったままのＣｕ粉末（ＵＳＰグレード９９．５％純度）顆粒を粉砕して、Ｓｉ３Ｎ４に匹敵する粒径を達成した。ＡｌＮ粉末は、受け取ったままで１．２±０．６μｍの平均粒径を有し、これはＳｉ３Ｎ４に匹敵した。
【0053】
哺乳動物細胞およびウイルス細胞の調製
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２哺乳動物細胞をウイルスアッセイで使用した。細胞を、Ｇ４１８ジスルフィド（１ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、５％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、加湿雰囲気中５％ＣＯ２／９５％で３７℃に維持した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのストックを、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を用いて３７℃で２日間増殖させた。ウイルス力価を中央組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によってアッセイした。
ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２哺乳動物細胞をウイルスアッセイで使用した。細胞を、Ｇ４１８ジスルフィド（１ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、５％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、加湿雰囲気中５％ＣＯ２／９５％で３７℃に維持した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのストックを、ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を用いて３７℃で２日間増殖させた。ウイルス力価を中央組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によってアッセイした。
【0054】
実施例２：
ウイルスアッセイ
１５重量パーセント（１５ｗｔ．％）のＳｉ３Ｎ４、Ｃｕ、およびＡｌＮ粉末を１ｍＬのＰＢＳ（－）に別々に分散させ、続いてウイルス懸濁液（２０μＬ中２×１０５のＴＣＩＤ５０）を添加した。Ｃｕ粉末の密度がより高いため、その体積分率はＳｉ３Ｎ４の約１／３であった。混合は、４℃でゆっくりと手で回転させることによって１および１０分間行った。曝露後、粉末を遠心分離（２４００ｒｐｍ、２分間）によってペレット化し、続いて０．１μｍの培地に通して濾過した。上清を回収し、ＴＣＩＤ５０アッセイ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試験、および蛍光イメージングに供した。抗ウイルス粉末を含まない偽の上清を含んで３連で実験を行った。９６ウェルプレート中のＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞のコンフルエントな単層に、０．５％のＦＢＳ ＤＭＥＭ（すなわち、維持培地）で１０倍段階希釈した各ウイルス懸濁液５０μＬ／ウェルを接種した。３７℃で１時間のウイルス吸着を、１０分ごとに傾けて行った。その後、５０μＬ／ウェルの維持培地を添加した。プレートを５％ＣＯ２／９５％加湿雰囲気中で３７℃で４日間インキュベートした。感染させた細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を位相差顕微鏡下で観察した。その後、１０μＬ／ウェルのグルタルアルデヒドを添加し、続いて０．５％のクリスタルバイオレットで染色することによって、細胞を固定した。ＴＣＩＤ５０はリード－ミュンヒ法に従って計算した。
ウイルスアッセイ
１５重量パーセント（１５ｗｔ．％）のＳｉ３Ｎ４、Ｃｕ、およびＡｌＮ粉末を１ｍＬのＰＢＳ（－）に別々に分散させ、続いてウイルス懸濁液（２０μＬ中２×１０５のＴＣＩＤ５０）を添加した。Ｃｕ粉末の密度がより高いため、その体積分率はＳｉ３Ｎ４の約１／３であった。混合は、４℃でゆっくりと手で回転させることによって１および１０分間行った。曝露後、粉末を遠心分離（２４００ｒｐｍ、２分間）によってペレット化し、続いて０．１μｍの培地に通して濾過した。上清を回収し、ＴＣＩＤ５０アッセイ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ試験、および蛍光イメージングに供した。抗ウイルス粉末を含まない偽の上清を含んで３連で実験を行った。９６ウェルプレート中のＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞のコンフルエントな単層に、０．５％のＦＢＳ ＤＭＥＭ（すなわち、維持培地）で１０倍段階希釈した各ウイルス懸濁液５０μＬ／ウェルを接種した。３７℃で１時間のウイルス吸着を、１０分ごとに傾けて行った。その後、５０μＬ／ウェルの維持培地を添加した。プレートを５％ＣＯ２／９５％加湿雰囲気中で３７℃で４日間インキュベートした。感染させた細胞の細胞変性効果（ＣＰＥ）を位相差顕微鏡下で観察した。その後、１０μＬ／ウェルのグルタルアルデヒドを添加し、続いて０．５％のクリスタルバイオレットで染色することによって、細胞を固定した。ＴＣＩＤ５０はリード－ミュンヒ法に従って計算した。
【0055】
ウイルスＲＮＡアッセイ
粉末への曝露後、１４０μＬの上清をウイルスＲＮＡ抽出に使用した。遠心分離し、濾過した粉末の表面からもＲＮＡを抽出した。ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉキットを用いてＲＮＡ精製を行った。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、１６μＬの単離ＲＮＡのアリコートを逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲを、２つの特異的ウイルスＮ遺伝子セットについてのＳｔｅｐ－Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムプライマー／プローブを使用して行った。各２０μＬの反応混合物は、４μＬのｃＤＮＡ、８．８ｐｍｏｌの各プライマー、２．４ｐｍｏｌのプローブおよび１０μＬのＧｏＴａｑ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲマスターミックスを含有していた。増幅プロトコルは、９５℃で３秒間の変性ならびに６０℃で２０秒間のアニーリングおよび伸長の５０サイクルからなった。
粉末への曝露後、１４０μＬの上清をウイルスＲＮＡ抽出に使用した。遠心分離し、濾過した粉末の表面からもＲＮＡを抽出した。ＱＩＡａｍｐ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉキットを用いてＲＮＡ精製を行った。ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、１６μＬの単離ＲＮＡのアリコートを逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲを、２つの特異的ウイルスＮ遺伝子セットについてのＳｔｅｐ－Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムプライマー／プローブを使用して行った。各２０μＬの反応混合物は、４μＬのｃＤＮＡ、８．８ｐｍｏｌの各プライマー、２．４ｐｍｏｌのプローブおよび１０μＬのＧｏＴａｑ Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲマスターミックスを含有していた。増幅プロトコルは、９５℃で３秒間の変性ならびに６０℃で２０秒間のアニーリングおよび伸長の５０サイクルからなった。
【0056】
免疫化学的蛍光アッセイ
カバーガラス上のＶｅｒｏ Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に２００μＬのウイルス上清を接種した。３７℃で１時間のウイルス吸着後、細胞をＣＯ２インキュベーター内で維持培地と７時間インキュベートした。感染した細胞の検出のために、これらの細胞をＴＢＳ（２０ｍＭ のＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、室温（ＲＴ）で１０分間４％ＰＦＡで固定し、続いてＲＴで５分間、ＴＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘで膜透過処理した。細胞を、ＲＴで６０分間、ＴＢＳ中２％スキムミルクでブロックし、ＲＴで６０分間、抗ＳＡＲＳコロナウイルスエンベロープ（ウサギ）抗体（希釈＝１：１００）で染色した。緩衝液で洗浄した後、細胞をＡｌｅｘａ ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００）およびＡｌｅｘａ ４８８ファロイジン（１：５０）と共に暗所、ＲＴで６０分間インキュベートした。ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを封入剤として使用した。染色を蛍光顕微鏡ＢＺＸ７１０下で観察した。総細胞数および感染させた細胞数を、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して得た。
カバーガラス上のＶｅｒｏ Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞に２００μＬのウイルス上清を接種した。３７℃で１時間のウイルス吸着後、細胞をＣＯ２インキュベーター内で維持培地と７時間インキュベートした。感染した細胞の検出のために、これらの細胞をＴＢＳ（２０ｍＭ のＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ）で洗浄し、室温（ＲＴ）で１０分間４％ＰＦＡで固定し、続いてＲＴで５分間、ＴＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘで膜透過処理した。細胞を、ＲＴで６０分間、ＴＢＳ中２％スキムミルクでブロックし、ＲＴで６０分間、抗ＳＡＲＳコロナウイルスエンベロープ（ウサギ）抗体（希釈＝１：１００）で染色した。緩衝液で洗浄した後、細胞をＡｌｅｘａ ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５００）およびＡｌｅｘａ ４８８ファロイジン（１：５０）と共に暗所、ＲＴで６０分間インキュベートした。ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔを封入剤として使用した。染色を蛍光顕微鏡ＢＺＸ７１０下で観察した。総細胞数および感染させた細胞数を、Ｋｅｙｅｎｃｅ ＢＺ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して得た。
【0057】
ラマン分光アッセイ
Ｖｅｒｏ Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、ガラスの場所において２００μＬの各ウイルス懸濁液で感染させた。３７℃で１時間のウイルス吸着後、感染させた細胞をＣＯ２インキュベーター中の維持培地で４時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した。蒸留水で２回洗浄した後、感染させた細胞を風乾し、ラマンマイクロプローブ分光計を使用してその場で分析した。ラマンスペクトルは、２０倍光学レンズを備えた高感度分光器を使用して収集した。これは、二次元の共焦点撮像を伴う顕微鏡測定モードで動作した。光回路内のホログラフィックノッチフィルタを使用して、１０ｍＷで動作する５３２ｎｍ励起源を介して１．５ｃｍ－１のスペクトル分解能を効率的に達成した。ラマン発光を、空冷電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器（１０２４×２５６ピクセル）に接続された単一のモノクロメーターを使用してモニターした。取得時間は１０秒に固定した。３０のスペクトルを収集し、各分析時点について平均した。ラマンスペクトルを、市販のソフトウェアを使用してガウス－ローレンツサブバンドに、デコンボリューションした。
Ｖｅｒｏ Ｅ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、ガラスの場所において２００μＬの各ウイルス懸濁液で感染させた。３７℃で１時間のウイルス吸着後、感染させた細胞をＣＯ２インキュベーター中の維持培地で４時間インキュベートし、４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した。蒸留水で２回洗浄した後、感染させた細胞を風乾し、ラマンマイクロプローブ分光計を使用してその場で分析した。ラマンスペクトルは、２０倍光学レンズを備えた高感度分光器を使用して収集した。これは、二次元の共焦点撮像を伴う顕微鏡測定モードで動作した。光回路内のホログラフィックノッチフィルタを使用して、１０ｍＷで動作する５３２ｎｍ励起源を介して１．５ｃｍ－１のスペクトル分解能を効率的に達成した。ラマン発光を、空冷電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器（１０２４×２５６ピクセル）に接続された単一のモノクロメーターを使用してモニターした。取得時間は１０秒に固定した。３０のスペクトルを収集し、各分析時点について平均した。ラマンスペクトルを、市販のソフトウェアを使用してガウス－ローレンツサブバンドに、デコンボリューションした。
【0058】
統計分析
スチューデントのｔ検定により、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ｎ＝３、および０．０１のｐ値で、統計学的有意性を判定した。
スチューデントのｔ検定により、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ｎ＝３、および０．０１のｐ値で、統計学的有意性を判定した。
【0059】
実施例３：
中央組織培養感染量
１５ｗｔ．％のＳｉ３Ｎ４、Ｃｕ、およびＡｌＮ粉末のＴＣＩＤ５０アッセイの結果を図１Ａ～１Ｄに示す。１分および１０分の不活性化時間が、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂ、ならびに図１Ｃおよび図１Ｄに示される。陰性対照と比較して、３つの粉末はすべて、２回の曝露時間にわたってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン（＞９９％）の不活性化に有効であった。
中央組織培養感染量
１５ｗｔ．％のＳｉ３Ｎ４、Ｃｕ、およびＡｌＮ粉末のＴＣＩＤ５０アッセイの結果を図１Ａ～１Ｄに示す。１分および１０分の不活性化時間が、それぞれ図１Ａおよび図１Ｂ、ならびに図１Ｃおよび図１Ｄに示される。陰性対照と比較して、３つの粉末はすべて、２回の曝露時間にわたってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン（＞９９％）の不活性化に有効であった。
【0060】
ＲＮＡ遺伝子断片化
ウイルスＲＮＡが上清および粉末の両方への曝露から断片化されたかどうかを調べるために、ウイルスのＲＮＡのＮ個の遺伝子セットに対してＲＴ－ＰＣＲ試験を行った。結果を、それぞれ１分間および１０分間の曝露について、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図２Ｃおよび図２Ｄに示す。再び、上清への曝露の１分後の陰性対照と比較して、ＣｕについてはＲＮＡのほぼ完全な断片化が観察されたが、ＡｌＮによって有意な損傷が引き起こされ、Ｓｉ３Ｎ４によってより少ない程度であった。上清への１０分間の曝露後、ＲＮＡの実質的な切断が３つの材料すべてについて見られた。Ｃｕは依然として最も多くの断片化を示したが、Ｓｉ３Ｎ４は同様の有効性を示し、ＡｌＮは１分間の曝露条件と本質的に同一であった。ウイルスＲＮＡは、曝露の１分でペレット粉末から抽出されたＲＮＡに基づいて、３つすべての材料について実質的に検出不能であった（図２Ａおよび図２Ｂを参照されたい）。この結果は、上清中のウイルスＲＮＡの減少が、粉末へのＲＮＡの付着によるものではなく、むしろ直接的な分解によるものであったことを示唆している。
ウイルスＲＮＡが上清および粉末の両方への曝露から断片化されたかどうかを調べるために、ウイルスのＲＮＡのＮ個の遺伝子セットに対してＲＴ－ＰＣＲ試験を行った。結果を、それぞれ１分間および１０分間の曝露について、図２Ａおよび図２Ｂ、ならびに図２Ｃおよび図２Ｄに示す。再び、上清への曝露の１分後の陰性対照と比較して、ＣｕについてはＲＮＡのほぼ完全な断片化が観察されたが、ＡｌＮによって有意な損傷が引き起こされ、Ｓｉ３Ｎ４によってより少ない程度であった。上清への１０分間の曝露後、ＲＮＡの実質的な切断が３つの材料すべてについて見られた。Ｃｕは依然として最も多くの断片化を示したが、Ｓｉ３Ｎ４は同様の有効性を示し、ＡｌＮは１分間の曝露条件と本質的に同一であった。ウイルスＲＮＡは、曝露の１分でペレット粉末から抽出されたＲＮＡに基づいて、３つすべての材料について実質的に検出不能であった（図２Ａおよび図２Ｂを参照されたい）。この結果は、上清中のウイルスＲＮＡの減少が、粉末へのＲＮＡの付着によるものではなく、むしろ直接的な分解によるものであったことを示唆している。
【0061】
免疫蛍光試験
次いで、ＴＣＩＤ５０アッセイおよび遺伝子断片化の結果を確認するために、抗ＳＡＲＳコロナウイルスエンベロープ抗体（赤色）、生存細胞中のＦ－アクチンを染色するファロイジン（緑色）、および細胞核染色のためのＤＡＰＩ（青色）を使用する免疫蛍光イメージングを使用した。図３Ａ～３Ｄは、（ａ）非曝露ビリオン（すなわち、陰性対照）および（ｂ）Ｓｉ３Ｎ４、（ｃ）ＡｌＮ、および（ｄ）Ｃｕの１０分間曝露ビリオンの上清を接種したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞集団を表す蛍光顕微鏡写真を示す。図３Ｅは、ウイルスを接種しなかった細胞（「偽感染」細胞として標識されている）を示す。陰性対照（図３Ａ）の赤色スポットは、ビリオンがＶｅｒｏ６Ｅ細胞の代謝に侵入してハイジャックしたことを実証した。これは、正常な代謝機能を示した偽感染させた細胞（図３Ｅ）とは対照的である。
次いで、ＴＣＩＤ５０アッセイおよび遺伝子断片化の結果を確認するために、抗ＳＡＲＳコロナウイルスエンベロープ抗体（赤色）、生存細胞中のＦ－アクチンを染色するファロイジン（緑色）、および細胞核染色のためのＤＡＰＩ（青色）を使用する免疫蛍光イメージングを使用した。図３Ａ～３Ｄは、（ａ）非曝露ビリオン（すなわち、陰性対照）および（ｂ）Ｓｉ３Ｎ４、（ｃ）ＡｌＮ、および（ｄ）Ｃｕの１０分間曝露ビリオンの上清を接種したＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞集団を表す蛍光顕微鏡写真を示す。図３Ｅは、ウイルスを接種しなかった細胞（「偽感染」細胞として標識されている）を示す。陰性対照（図３Ａ）の赤色スポットは、ビリオンがＶｅｒｏ６Ｅ細胞の代謝に侵入してハイジャックしたことを実証した。これは、正常な代謝機能を示した偽感染させた細胞（図３Ｅ）とは対照的である。
【0062】
注目すべきことに、Ｓｉ３Ｎ４および程度は低いがＡｌＮ由来の上清を接種した細胞は、ほとんど感染を伴わずにほぼ正常な機能を示した。逆に、Ｃｕ上清を接種した細胞は本質的に死んでいた（すなわち、Ｆ－アクチンの完全な欠如、図３Ｄ）、ただし核に存在する青赤染色に基づくと、ビリオンがいくつかの核をハイジャックしたように見えることから、それらは生存している死ぬ前の段階であった可能性がある。これは、細胞溶解がウイルス感染の結果であるだけでなく、細胞内遊離Ｃｕイオンからの毒性効果にも起因することを示唆している。図３Ａ～３Ｅからの比色の結果の定量化を図４に示す。これらのデータは、陰性対照からの生存しているＶｅｒｏＥ６細胞の約３５％がビリオンに感染したが、Ｓｉ３Ｎ４およびＡｌＮからの上清を接種した細胞の２％および８％のみがそれぞれ感染したことを実証している。Ｃｕの上清を接種した細胞の定量的評価は、それらの早すぎる死のために評価することができなかった。
【0063】
ラマン分光法
ラマン分光法により、様々な上清に曝露されたＶｅｒｏＥ６細胞を調べて、感染およびイオン（すなわち、ＣｕおよびＡｌ）毒性による生化学的な細胞変化を評価した。図５Ａ～図５Ｇは、（ａ）非感染ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞、ならびに（ｂ）Ｓｉ３Ｎ４、（ｃ）ＡｌＮ、（ｄ）Ｃｕ（陽性対照）、および（ｅ）抗ウイルスなしの化合物（陰性対照）に１０分間曝露したビリオンを含有する上清を接種した細胞についての、７００～９００ｃｍ－１の周波数範囲におけるラマンスペクトルを示す。基本的に重要なのは、トリプトファンのインドール環の環呼吸およびＨの切り取りの振動バンドである（７５６および８７５ｃｍ－１で、それぞれＴ１およびＴ２と標識付け）。トリプトファンは、タンパク質合成および様々な免疫学的機能のための分子の生成において重要な役割を果たす。その立体異性体は、細胞膜内にタンパク質を固定するのに役立ち、その異化物は免疫抑制機能を有する。トリプトファンの異化作用は、ウイルス感染によって引き起こされる。これは、過剰反応性免疫応答から宿主細胞を保護するインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の酵素活性を介して起こる。ＩＤＯはトリプトファンをキヌレニンに、次いでＮ’－ホルミル－キヌレニンに還元する。ＩＤＯ活性の増加はトリプトファンを枯渇させる。したがって、トリプトファンバンド（Ｔ１およびＴ２）の強度は、これらの生化学的変化の指標である。Ｃｕで処理された試料を除いて、図５Ｆに示されるデータは、感染させた細胞の画分と相関する結合トリプトファンバンドの指数関数的減少を示す。（明確にするために、Ｎ’－ホルミル－キヌレニンの化学構造を挿入図に示す）。銅の異常は、その毒性のさらなる証拠を提供する。ＶｅｒｏＥ６細胞はトリプトファンを消費してＣｕ２＋を還元し、それをＣｕ＋として安定化した。
ラマン分光法により、様々な上清に曝露されたＶｅｒｏＥ６細胞を調べて、感染およびイオン（すなわち、ＣｕおよびＡｌ）毒性による生化学的な細胞変化を評価した。図５Ａ～図５Ｇは、（ａ）非感染ＶｅｒｏＥ６／ＴＭＰＲＳＳ２細胞、ならびに（ｂ）Ｓｉ３Ｎ４、（ｃ）ＡｌＮ、（ｄ）Ｃｕ（陽性対照）、および（ｅ）抗ウイルスなしの化合物（陰性対照）に１０分間曝露したビリオンを含有する上清を接種した細胞についての、７００～９００ｃｍ－１の周波数範囲におけるラマンスペクトルを示す。基本的に重要なのは、トリプトファンのインドール環の環呼吸およびＨの切り取りの振動バンドである（７５６および８７５ｃｍ－１で、それぞれＴ１およびＴ２と標識付け）。トリプトファンは、タンパク質合成および様々な免疫学的機能のための分子の生成において重要な役割を果たす。その立体異性体は、細胞膜内にタンパク質を固定するのに役立ち、その異化物は免疫抑制機能を有する。トリプトファンの異化作用は、ウイルス感染によって引き起こされる。これは、過剰反応性免疫応答から宿主細胞を保護するインドールアミン－２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の酵素活性を介して起こる。ＩＤＯはトリプトファンをキヌレニンに、次いでＮ’－ホルミル－キヌレニンに還元する。ＩＤＯ活性の増加はトリプトファンを枯渇させる。したがって、トリプトファンバンド（Ｔ１およびＴ２）の強度は、これらの生化学的変化の指標である。Ｃｕで処理された試料を除いて、図５Ｆに示されるデータは、感染させた細胞の画分と相関する結合トリプトファンバンドの指数関数的減少を示す。（明確にするために、Ｎ’－ホルミル－キヌレニンの化学構造を挿入図に示す）。銅の異常は、その毒性のさらなる証拠を提供する。ＶｅｒｏＥ６細胞はトリプトファンを消費してＣｕ２＋を還元し、それをＣｕ＋として安定化した。
【0064】
アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンの環伸長振動によるラマンシグナルは、７２５、７９５、６８０および７４８ｃｍ－１で見られ、図５Ａ～５ＥではそれぞれＡ、Ｃｙ１、Ｇ、およびＴｈと標識されている）。これらのバンドは、ウイルス曝露後に保存された。しかし、Ｃｕ曝露ビリオンに感染した細胞では、それぞれＴｙ１およびＴｙ２と標識された６４２および８３２ｃｍ－１のチロシンを表す系統に異常があった。チロシンの環呼吸バンドＴｙ２は、他の試料と比較して非常に弱かった（図５Ｄを図５Ｂと共に参照されたい）。逆に、Ｃ－Ｃ結合関連Ｔｙ１シグナルは強いままであった。これは、チロシンの芳香環がＣｕイオンをキレートしたことを示唆している。これは、Ｃ－Ｃシグナルが変化しないままチロシン環呼吸モードのみが減少した理由を説明する。チロシン中の３つの可能なＣｕ（ＩＩ）キレート配座を図５Ｇに示す。
【0065】
ＡｌＮ（図５Ｃ）で処理したビリオンに曝露したＶｅｒｏＥ６細胞では、トリプトファンＴ１およびＴ２バンドは保存されたが、ＤＮＡシトシン（図５Ａ～５ＥにおいてＣｙ２およびＣｙ３としてそれぞれ標識されている）の環屈曲に起因する６１５および約７００ｃｍ－１のバンドはほとんど消失した。それらの消失は、進行性のヌクレオソーム間ＤＮＡ切断または複合体の形成のいずれかによるものであり、両方とも毒性に関連する。シトシンシグナルの損失は、Ａｌイオンによる毒性効果として解釈されるが、銅よりもはるかに重要ではない。Ａｌ３
＋は、ヌクレオチド塩基中のカルボニルＯおよび／またはＮ環ドナーと相互作用し、キレート化によってＰＯ２基の骨格および／またはＧ－Ｃ塩基対のグアニンＮ－７部位に選択的に結合する。
【0066】
中程度から重度の毒性をもたらしたＣｕおよびＡｌＮの上清へのＶｅｒｏＥ６細胞の曝露とは異なり、Ｓｉ３Ｎ４はトリプトファン、チロシンおよびシトシンの修飾を引き起こさなかった。Ｓｉ３Ｎ４ウイルス上清のスペクトルの形態は、非感染偽懸濁液のものと密接に一致した（図５Ａおよび５Ｂを参照されたい）。
【0067】
上記から、特定の実施形態を図示および説明してきたが、当業者には明らかであるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく様々な修正を行うことができることを理解されたい。そのような変更および修正は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲および教示内にある。
【0068】
いくつかの実施形態を説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な修正、代替の構成、および均等物を使用することができることが当業者によって認識されるであろう。さらに、本発明を不必要に不明瞭にすることを避けるために、いくつかの周知のプロセスおよび要素は記載されていない。したがって、上記の説明は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0069】
当業者は、ここに開示される実施形態が限定ではなく例として教示することを理解するであろう。したがって、上記の説明に含まれる、または添付の図面に示される事項は、例示的なものとして解釈されるべきであり、限定的な意味で解釈されるべきではない。以下の特許請求の範囲は、本明細書に記載されたすべての一般的および特定の特徴、ならびに本方法およびシステムの範囲のすべての記述を包含することを意図しており、これらは、言語の問題として、それらの間にあると言われる場合がある。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図3-3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図6】
【手続補正書】
【提出日】2023-01-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを不活性化するための方法であって、前記方法が、前記ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムを含む物体と接触させることを含み、前記窒化ケイ素または窒化アルミニウムが前記ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスに連続的に結合して不活性化する、方法。
【請求項2】
前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムは、前記物体の表面にコーティングとして組み込まれるか、または存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムが１ｗｔ．％～３０ｗｔ．％の濃度で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記物体が、紙、厚紙、布地、プラスチック、セラミック、ステンレス鋼、金属、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記物体が、保護ガウン、ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、フェイスシールド、アイプロテクタ、手袋、手術用ガウン、手術用ドレープ、またはキュービクルカーテンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記物体が、フェイスマスクフィルタ、呼吸器フィルタ、空気濾過フィルタ、または空気換気フィルタである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記物体が、ノブ、ハンドル、レール、ベッドフレーム、ベッドトレイ、テーブル、椅子、機器ラック、キャビネット、またはカートである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記物体が前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスと少なくとも１分間接触している、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの少なくとも７５％が、前記物体との接触後に不活性化される、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの少なくとも９９％が、前記物体と少なくとも１分間接触した後に不活性化される、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを不活性化するための方法であって、前記方法が、前記ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスを窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含む組成物と接触させることを含み、前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムが前記ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスに連続的に結合して不活性化する、方法。
【請求項12】
前記組成物が、スラリー、懸濁液、ゲル、塗料または練り歯磨きを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記組成物が、高接触表面に噴霧されるスラリーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
抗ウイルス特性および抗微生物特性を有する個人用保護具（ＰＰＥ）の物品であって、前記物品の表面の中に埋め込まれた、または上にコーティングされた窒化ケイ素または窒化アルミニウムを含み、前記窒化ケイ素または窒化アルミニウムが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに連続的に結合して不活性化するように動作可能である、物品。
【請求項15】
前記窒化ケイ素および／または窒化アルミニウムが１ｗｔ．％～３０ｗｔ．％の濃度で存在する、請求項１４に記載の物品。
【請求項16】
ボディカバー、ヘッドカバー、シューズカバー、フェイスマスク、フェイスおよびアイプロテクタ、または手袋である、請求項１４に記載の物品。
【請求項17】
前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを、前記物品が前記ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ウイルスと少なくとも１分間接触したときに不活性化するように動作可能である、請求項１４に記載の物品。
【国際調査報告】