(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-28
(54)【発明の名称】ＩＬ－５結合分子、その調製方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230721BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230721BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230721BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230721BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230721BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230721BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230721BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230721BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230721BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230721BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230721BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230721BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20230721BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230721BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230721BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230721BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20230721BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230721BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20230721BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230721BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61P37/08
A61P11/06
A61P17/00
A61P19/02
A61P11/00
A61P7/00
A61P7/06
A61P13/12
A61P31/06
G01N33/53 P
C07K16/24
C07K16/46
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580478
(86)(22)【出願日】2021-02-24
(85)【翻訳文提出日】2022-12-23
(86)【国際出願番号】 CN2021077650
(87)【国際公開番号】W WO2022037031
(87)【国際公開日】2022-02-24
(31)【優先権主張番号】202010843501.1
(32)【優先日】2020-08-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】522500387
【氏名又は名称】南京融捷康生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＣＯＲＥ ＢＩＯＴＥＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ０７， １６ Ｔｒｅｅ－Ｈｏｕｓｅ， Ｔａｎｍｉ Ｒｄ．， Ｊｉａｎｇｂｅｉ Ｎｅｗ Ａｒｅａ Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１００００， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002871
【氏名又は名称】弁理士法人坂本国際特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】蘇 志鵬
(72)【発明者】
【氏名】孟 巾果
(72)【発明者】
【氏名】張 雲
(72)【発明者】
【氏名】王 樂飛
(72)【発明者】
【氏名】姚 堯
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB17
4C085BB50
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA71
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
ＩＬ－５結合分子、その調製方法及びその使用が記載される。結合分子は、以下の相補性決定領域：配列番号４３～４９で示される配列のいずれかから選択されるＣＤＲ１のアミノ酸配列、配列番号５０～５６で示される配列のいずれかから選択されるＣＤＲ２のアミノ酸配列、及び配列番号５７～６２で示される配列のいずれかから選択されるＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。結合分子はＩＬ－５に特異的に結合し、ＩＬ－５によって誘導される細胞増殖を効果的に阻害することができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－５に特異的に結合することができ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む免疫グロブリン単一可変領域の少なくとも１つを含むＩＬ－５結合分子であって、ＣＤＲ１は配列番号４３～４９で示される配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２は配列番号５０～５６で示される配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ３は配列番号５７～６２で示される配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する、ＩＬ－５結合分子。
【請求項2】
前記相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列が以下の（１）～（１３）のいずれかで示される、請求項１に記載のＩＬ－５結合分子であって：（１）配列番号４３、５６及び５８、
（２）配列番号４９、５１及び６０、
（３）配列番号４７、５６及び５７、
（４）配列番号４５、５４及び５７、
（５）配列番号４６、５０及び６１、
（６）配列番号４７、５６及び６２、
（７）配列番号４８、５６及び５７、
（８）配列番号４５、５３及び５７、
（９）配列番号４４、５５及び５７、
（１０）配列番号４３、５６及び５９、
（１１）配列番号４３、５２及び５９、
（１２）配列番号４７、５６及び５９、並びに
（１３）配列番号４７、５２及び５９；
好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含むフレームワーク領域を更に含み、
ＦＲ１は配列番号６３～６８で示される配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、ＦＲ２は配列番号６９～７２で示される配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、ＦＲ３は配列番号７３～８６で示される配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、ＦＲ４は配列番号８７で示されるアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変領域の前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３は、以下の（１４）～（２８）のいずれかで示される配列を有する、ＩＬ－５結合分子：
（１４）配列番号６５、７２及び８５、
（１５）配列番号６５、７２及び８２、
（１６）配列番号６４、７１及び８６、
（１７）配列番号６５、７２及び７３、
（１８）配列番号６５、７２及び８４、
（１９）配列番号６６、６９及び８３、
（２０）配列番号６８、７２及び７６、
（２１）配列番号６６、６９及び７９、
（２２）配列番号６３、７２及び８５、
（２３）配列番号６７、７０及び８０、
（２４）配列番号６５、７２及び７８、
（２５）配列番号６５、７２及び７７、
（２６）配列番号６７、７０及び８１、
（２７）配列番号６５、７２及び７４、並びに
（２８）配列番号６５、７２及び７５。
【請求項3】
前記免疫グロブリン単一可変領域がＶＨＨであり；好ましくは、前記ＶＨＨが配列番号１～１２で示される配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し；
好ましくは、前記ＶＨＨがヒト化ＶＨＨであり；及び
好ましくは、前記ヒト化ＶＨＨが配列番号１３～２１で示される配列のいずれかから選択される配列を有する、請求項２に記載のＩＬ－５結合分子。
【請求項4】
前記ＶＨＨに連結された免疫グロブリンＦｃ領域を更に含む、請求項１～３のいずれかに記載のＩＬ－５結合分子。
【請求項5】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がヒト免疫グロブリンＦｃ領域であり、好ましくは、前記ヒト免疫グロブリンＦｃ領域がヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である、請求項４に記載のＩＬ－５結合分子。
【請求項6】
請求項１～５のいずれかに記載のＩＬ－５結合分子をコードし、好ましくは、前記核酸が配列番号２２～４２で示される配列のいずれかから選択される配列を有する、単離された核酸。
【請求項7】
請求項６に記載の単離された核酸を含む組換えベクター。
【請求項8】
請求項７に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
【請求項9】
請求項８に記載の宿主細胞を培養してＩＬ－５結合分子を得ることを含む、ＩＬ－５結合分子の調製方法。
【請求項10】
コンジュゲーション成分と、請求項１～５のいずれかに記載のＩＬ－５結合分子とを含む、ＩＬ－５タンパク質に結合させるためのコンジュゲートであって、前記コンジュゲーション成分が前記結合分子にコンジュゲートし、
前記コンジュゲーション成分が検出のためのマーカー及び／又は化合物を含み、
好ましくは、前記検出のためのマーカーが放射性元素である、コンジュゲート。
【請求項11】
請求項１～５のいずれかに記載のＩＬ－５結合分子を含む、ＩＬ－５タンパク質の検出のためのキット。
【請求項12】
疾患を治療するためのＩＬ－５を標的とする薬物の調製における、請求項１～５のいずれかに記載のＩＬ－５結合分子の使用であって、好ましくは、前記疾患が、喘息、アレルギー性皮膚炎、湿疹、関節炎、疱疹、慢性特発性蕁麻疹、硬皮症、肥厚性瘢痕、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、特発性肺線維症、川崎病、鎌状赤血球症、グレーブス病、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ぶどう膜炎、結核、及び腎疾患のいずれから選択される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療バイオテクノロジーの分野に関し、特にＩＬ－５に対する結合分子、その調製方法及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトインターロイキン５は、ＩＬ－５とも呼ばれ、ＩＬ－１３及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）と共に、造血及び炎症に関与するサイトカインである。３つのサイトカインはすべて、好酸球の産生、機能及び生存を促進し、従って、炎症性疾患に影響を与えることができる。例えば、好酸球は、喘息、アトピー性皮膚炎及びアレルギー性鼻炎に対してエフェクターとして主に機能する。
【0003】
症候性喘息患者からの肺組織及び気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）中における増加したＩＬ－５ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルと共に、好酸球特異的サイトカインとして、ＩＬ－５が大部分の研究者に注目されている。ＩＬ－５レベルとアレルゲン刺激と疾患活動との間に相関関係があることも、研究者によって観察された。しかし、ＩＬ－５に加えて、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－３も喘息における好酸球の産生及び活性化に機能し、アレルギー性炎症が起こる場所でＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－３が合成されていることが示されたことは明らかである。これらのサイトカインの発現は、浸潤性好酸球の総数及び好酸球活性化の程度の増加に役立つことができる。これらのサイトカインは、異なる段階での好酸球浸潤に機能することも可能である。抗原チャレンジを受けた患者からの最新の動力学データとして、ＩＬ－５レベルは２～７日目に増加し、ＧＭ－ＣＳＦレベルは２日目にピークに達して１６日目も上昇が継続したことが示された。
【0004】
ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－３は、細胞表面受容体に結合することで、好酸球及び他の正常細胞及び癌細胞を刺激する。細胞表面受容体には、３つの受容体で共有されるリガンド特異的なα鎖及び鎖（βｃ）が含まれる。各受容体のα鎖との結合は、受容体活性化の最初のステップである。しかし、α鎖との結合だけでは、活性化には不十分である。続いて、リガンドがβｃをリクルートし、その後、以下に示す２つの主要な機能的結果を有するステップが続く。第１に、それによって、ＩＬ－５、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－３の結合が実質的に不可逆的になり、その後、受容体の完全な活性化がもたらされる。これらの受容体の主要なシグナル伝達成分として、βｃがＪＡＫ－２、ＳＴＡＴ－５及び他のシグナル伝達分子の活性化を導き、最終的にはＩＬ－５に通常伴われる過剰な細胞活性、ＧＭ－ＣＳＦ及びＩＬ－３の刺激、例えば好酸球の接着等を導き、その結果、脱顆粒及び細胞毒性がもたらされ、細胞生存率が延びる。
【0005】
好酸球活性化のためのサイトカインの活性を阻害又は拮抗するために、研究者は３つの主要な方法を試した。それらの方法の１つは、関連するサイトカインに対する抗体を使用する。例えば、ＩＬ－５に対する抗体がアレルゲン誘発性喘息の動物モデルで用いられる。この方法は、気道及び気管支への好酸球の流入による高応答を防ぐ点で比較的長期間作用性の効果を示した。しかし、高い親和性、ＩＬ－５特異的抗体、及びＩＬ－５を標的とする薬剤が依然として不足している。この観点で、本発明が提供される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、ＩＬ－５結合分子、その調製方法及びその使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明は下記のように実現される。
第１の側面に従って、本発明の実施態様は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む免疫グロブリン単一可変領域の少なくとも１つを含むＩＬ－５結合分子を提供する。
第１の側面に従って、本発明の実施態様は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む免疫グロブリン単一可変領域の少なくとも１つを含むＩＬ－５結合分子を提供する。
【0008】
ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４３～４９で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５０～５６で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７～６２で示される配列のいずれかから選択される。
【0009】
第２の側面に従って、本発明の実施態様は、前記の実施態様のＩＬ－５結合分子をコードする単離された核酸を提供する。
【0010】
第３の側面に従って、本発明の実施態様は、前記の実施態様の単離された核酸を含む組換えベクターを提供する。
【0011】
第４の側面に従って、本発明の実施態様は、前記の実施態様の組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0012】
第５の側面に従って、本発明の実施態様は、前記の実施態様の宿主細胞を培養してＩＬ－５結合分子を得ることを含むＩＬ－５結合分子の調製方法を提供する。
【0013】
第６の側面に従って、本発明の実施態様は、コンジュゲーション成分と、前記の実施態様のＩＬ－５結合分子とを含む、ＩＬ－５タンパク質に結合させるためのコンジュゲートであって、
コンジュゲーション成分はＩＬ－５結合分子にコンジュゲートし、及びコンジュゲーション成分は検出のためのマーカー及び／又は化合物を含む、コンジュゲートを提供する。
コンジュゲーション成分はＩＬ－５結合分子にコンジュゲートし、及びコンジュゲーション成分は検出のためのマーカー及び／又は化合物を含む、コンジュゲートを提供する。
【0014】
第７の側面に従って、本発明の実施態様は、前記の実施態様のＩＬ－５結合分子を含むＩＬ－５を検出するためのキットを提供する。
【0015】
第８の側面に従って、本発明の実施態様は、疾患を治療するためのＩＬ－５を標的とする薬剤の調製における、前記の実施態様のＩＬ－５結合分子の使用が提供される。
【発明の効果】
【0016】
本発明は、以下の有利な効果を有する。
本発明の実施態様は、ＩＬ－５結合分子、その調製方法及びその使用を提供する。結合分子は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む免疫グロブリン単一可変領域の少なくとも１つを含む。ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４３～４９で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５０～５６で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７～６２で示される配列のいずれかから選択される。結合分子は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、ＩＬ－５で誘導される細胞増殖を効果的に阻害することができ、ＩＬ－５関連疾患の予防、診断及び／又は治療のために使用することができる。
本発明の実施態様は、ＩＬ－５結合分子、その調製方法及びその使用を提供する。結合分子は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む免疫グロブリン単一可変領域の少なくとも１つを含む。ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４３～４９で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５０～５６で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７～６２で示される配列のいずれかから選択される。結合分子は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、ＩＬ－５で誘導される細胞増殖を効果的に阻害することができ、ＩＬ－５関連疾患の予防、診断及び／又は治療のために使用することができる。
【0017】
本発明の実施態様の技術的解決手段をより明確に説明するために、以下に、実施態様を記載するために必要とされる添付の図面を簡単に説明する。以下の添付の図面には、本発明のいくつかの実施態様のみが示され、これらの図面は発明の範囲の限定と考えることはできないことは理解されるべきである。当業者は、創造的な労力無しに、依然として添付の図面から他の図面を引き出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】実施例１におけるヒト組換えＩＬ－５タンパク質のゲル電気泳動解析の結果を示す。
【図2】実施例１におけるナノボディライブラリーのスクリーニング後の組換えＩＬ－５タンパク質の濃縮を示す。Ｐ／Ｎは、「バイオパニング中の陽性ウェルから溶出したファージでＴＧ１細菌を感染した後に増殖したモノクローナル細菌の数」／「陰性ウェルから溶出したファージでＴＧ１細菌を感染した後に増殖したモノクローナル細菌の数」である。このパラメータは濃縮の間に徐々に増加する。Ｉ／Ｅは、「各ラウンドでのバイオパニング中の陽性ウェルに加えたファージの総量」／「バイオパニング中の陽性ウェルから溶出されたファージの総量」である。このパラメータは濃縮の間に徐々に１に近づく。
【図3】実施例２における抗体株１Ｂ３及び２Ｂ３のヒト化変異体のそれぞれのアラインメントの結果を示す。
【図4】検証例１における実施例１で得られた大腸菌で発現された１２株の抗体のＩＬ－５との結合の分析結果を示す。
【図5】検証例２におけるＴａｂ１とＴａｂ２のＩＬ－５との結合の用量反応関係を示すグラフである。
【図6】検証例２における対照抗体１（Ｔａｂ１）及び対照抗体２（Ｔａｂ２）で中和されたＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞の増殖の用量反応関係を示すグラフである。
【図7】検証例３における実施例３で得られたＩＬ－５特異的Ｆｃ融合単一ドメイン抗体で中和されたＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞の増殖の用量反応関係を示すグラフである。
【図8】検証例３における実施例３で得られた異なるヒト化Ｆｃ融合単一ドメイン抗体で中和されたＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞の増殖の用量反応関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の実施態様の目的、技術的解決手段及び利点をより明確にするために、以下に本発明の実施態様における技術的解決手段を明確に、完全に説明する。実施例に具体的な条件が明記されていない場合、通常の条件又はメーカーが推奨する条件に従って実行する。製造者の記載がない試薬又は装置は全て、市販で入手できる一般的な製品である。
【0020】
＜用語の定義＞
本明細書において「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）は、ナノボディとも呼ばれ、軽鎖を自然に含まず、重鎖の１つの可変領域（ＶＨＨ）のみを含む抗体である。
本明細書において「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）は、ナノボディとも呼ばれ、軽鎖を自然に含まず、重鎖の１つの可変領域（ＶＨＨ）のみを含む抗体である。
【0021】
本明細書において「ヒト化抗体」は、標的抗体（例えば、動物抗体）の重鎖可変領域とヒト抗体の定常領域とを融合させた抗体、又は標的抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ１～３の配列）をヒト抗体の可変領域中に移植して得られた抗体、又は標的抗体にヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ１～４）の特徴に従ったアミノ酸変異を行って得られる抗体を意味する。ヒト化抗体は、合成で又は部位特異的変異誘発で得ることができる。
【0022】
本明細書において「二重特異性抗体」は、２つの抗原を同時に認識することができる小さな二価二重特異性抗体断片である。Hollinger et alは、抗原Ａの抗体の軽鎖可変領域（ＶＬＡ）の遺伝子を抗原Ｂの抗体の重鎖可変領域（ＶＨＢ）に短いペプチド分子で連結して、同様に、ＶＨＡをＶＬＢに連結し、二組のキメラ遺伝子をバイシストロニックな発現プラスミドに導入して、二重特異性抗体の発現プラスミドを構築した。発現後、ＶＬＡ－ＶＨＢをＶＨＡ－ＶＬＢに交差結合して、二重特異性抗体を形成させた。本出願において、二価抗体で認識することができる抗原の１つは、ＩＬ－５タンパク質である。二価抗体で認識することができる他の抗原は、既存の抗原のいずれかから選択され得る。
【0023】
本明細書において「多価抗体」は、マルチ抗体とも呼ばれ、様々な抗原を同時に認識する（二重特異性抗体と同様に）ことができる改変された構造を有する抗体（二重特異性抗体と同様に）を意味する。本発明において、多価抗体で認識することができる抗原の１つは、ＩＬ－５タンパク質である。
【0024】
本明細書に記載された「ＣＤＲ」は、抗体の相補性決定領域である。抗体は、通常、２つの可変領域：重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。重鎖可変領域又は軽鎖可変領域は、通常、３つのＣＤＲを含む。
【0025】
＜実施態様＞
本発明の実施態様は、ＩＬ－５結合分子を提供する。ＩＬ－５結合分子は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む免疫グロブリン単一可変領域の少なくとも１つを含み、
ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４３～４９で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５０～５６で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７～６２で示される配列のいずれかから選択される。
本発明の実施態様は、ＩＬ－５結合分子を提供する。ＩＬ－５結合分子は、ＩＬ－５に特異的に結合することができ、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む免疫グロブリン単一可変領域の少なくとも１つを含み、
ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号４３～４９で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号５０～５６で示される配列のいずれかから選択され、ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５７～６２で示される配列のいずれかから選択される。
【0026】
好ましくは、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、以下の（１）～（１３）のいずれかで示される：
（１）配列番号４３、５６及び５８、
（２）配列番号４９、５１及び６０、
（３）配列番号４７、５６及び５７、
（４）配列番号４５、５４及び５７、
（５）配列番号４６、５０及び６１、
（６）配列番号４７、５６及び６２、
（７）配列番号４８、５６及び５７、
（８）配列番号４５、５３及び５７、
（９）配列番号４４、５５及び５７、
（１０）配列番号４３、５６及び５９、
（１１）配列番号４３、５２及び５９、
（１２）配列番号４７、５６及び５９、並びに
（１３）配列番号４７、５２及び５９。
（１）配列番号４３、５６及び５８、
（２）配列番号４９、５１及び６０、
（３）配列番号４７、５６及び５７、
（４）配列番号４５、５４及び５７、
（５）配列番号４６、５０及び６１、
（６）配列番号４７、５６及び６２、
（７）配列番号４８、５６及び５７、
（８）配列番号４５、５３及び５７、
（９）配列番号４４、５５及び５７、
（１０）配列番号４３、５６及び５９、
（１１）配列番号４３、５２及び５９、
（１２）配列番号４７、５６及び５９、並びに
（１３）配列番号４７、５２及び５９。
【0027】
任意の実施態様において、免疫グロブリン単一可変領域は、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４を含むフレームワーク領域を更に含む。単一領域抗体の構造は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である。
【0028】
ＦＲ１のアミノ酸配列は配列番号６３～６８で示される配列のいずれかから選択され、ＦＲ２のアミノ酸配列は配列番号６９～７２で示される配列のいずれかから選択され、ＦＲ３のアミノ酸配列は配列番号７３～８６で示される配列のいずれかから選択され、ＦＲ４のアミノ酸配列は配列番号８７で示される。
【0029】
好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変領域の前記フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２及びＦＲ３は、以下の（１４）～（２８）のいずれかで示される配列を有する：
（１４）配列番号６５、７２及び８５、
（１５）配列番号６５、７２及び８２、
（１６）配列番号６４、７１及び８６、
（１７）配列番号６５、７２及び７３、
（１８）配列番号６５、７２及び８４、
（１９）配列番号６６、６９及び８３、
（２０）配列番号６８、７２及び７６、
（２１）配列番号６６、６９及び７９、
（２２）配列番号６３、７２及び８５、
（２３）配列番号６７、７０及び８０、
（２４）配列番号６５、７２及び７８、
（２５）配列番号６５、７２及び７７、
（２６）配列番号６７、７０及び８１、
（２７）配列番号６５、７２及び７４、並びに
（２８）配列番号６５、７２及び７５。
（１４）配列番号６５、７２及び８５、
（１５）配列番号６５、７２及び８２、
（１６）配列番号６４、７１及び８６、
（１７）配列番号６５、７２及び７３、
（１８）配列番号６５、７２及び８４、
（１９）配列番号６６、６９及び８３、
（２０）配列番号６８、７２及び７６、
（２１）配列番号６６、６９及び７９、
（２２）配列番号６３、７２及び８５、
（２３）配列番号６７、７０及び８０、
（２４）配列番号６５、７２及び７８、
（２５）配列番号６５、７２及び７７、
（２６）配列番号６７、７０及び８１、
（２７）配列番号６５、７２及び７４、並びに
（２８）配列番号６５、７２及び７５。
【0030】
好ましくは、免疫グロブリン単一可変領域はＶＨＨである。
好ましくは、前記ＶＨＨのアミノ酸配列は、配列番号１～１２で示される配列のいずれかから選択される。
好ましくは、前記ＶＨＨのアミノ酸配列は、配列番号１～１２で示される配列のいずれかから選択される。
【0031】
好ましくは、前記ＶＨＨは、ヒト化ＶＨＨである。
好ましくは、ヒト化ＶＨＨの配列は、配列番号１３～２１で示される配列のいずれかから選択される。
好ましくは、ヒト化ＶＨＨの配列は、配列番号１３～２１で示される配列のいずれかから選択される。
【0032】
好ましくは、結合分子は、ＶＨＨに連結された免疫グロブリンＦｃ領域を更に含む。
好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。
好ましくは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である。
好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域である。
好ましくは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【0033】
本発明の実施態様は、前記の実施態様のいずれかのＩＬ－５結合分子をコードする、単離された核酸を提供する。
好ましくは、核酸の配列は、配列番号２２～４２で示される配列のいずれかから選択される。
好ましくは、核酸の配列は、配列番号２２～４２で示される配列のいずれかから選択される。
【0034】
本発明の実施態様は、前記の実施態様のいずれかの単離された核酸を含む組換えベクターを提供する。任意の実施態様において、組換えベクターは、プラスミド、ファージ、又はウイルスベクターであることができる。
【0035】
本発明の実施態様は、前記の実施態様の組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。任意の実施態様において、宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であることができる。
【0036】
本発明の実施態様は、前記の実施態様の宿主細胞を培養してＩＬ－５結合分子を得ることを含む、ＩＬ－５結合分子の調製法を提供する。
【0037】
前記の実施態様のいずれかで記載された結合分子は、人工合成で調製するか、又はそのコード遺伝子を先に合成して生物学的発現を行って得ることができる。
【0038】
本発明の実施態様は、コンジュゲーション成分と、前記の実施態様のいずれかのＩＬ－５結合分子とを含む、ＩＬ－５タンパク質に結合させるためのコンジュゲートを提供する。コンジュゲーション成分は前記結合分子にコンジュゲートし、及びコンジュゲーション成分は検出のためのマーカー及び／又は化合物を含む。
好ましくは、検出のためのマーカーは放射性元素である。
好ましくは、検出のためのマーカーは放射性元素である。
【0039】
本発明の実施態様は、前記の実施態様のいずれかのＩＬ－５結合分子を含む、ＩＬ－５タンパク質の検出のためのキットを提供する。
【0040】
更に、本発明の実施態様は、疾患を治療するためのＩＬ－５を標的とする薬物の調製における、ＩＬ－５結合分子の使用を提供する。
【0041】
好ましくは、前記疾患は、喘息、アレルギー性皮膚炎、湿疹、関節炎、疱疹、慢性特発性蕁麻疹、硬皮症、肥厚性瘢痕、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、特発性肺線維症、川崎病、鎌状赤血球症、グレーブス病、シェーグレン症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性溶血性貧血、バレット食道、自己免疫性ぶどう膜炎、結核、及び腎疾患のいずれから選択される。
【実施例】
【0042】
以下において、本発明の特徴及び性能を実施例によりさらに詳しく説明する。
【0043】
実施例１
抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体の調製
Ａ．ヒト組換えＩＬ－５タンパク質の発現ベクターの構築
ＮＣＢＩ中の検索によってＩＬ－５のコード配列をＮＭ_０００８７９．２のアクセッション番号で得た。コード配列でのコーディングによって、ＮＰ_０００８７０．１のアクセッション番号を有するアミノ酸配列が提供された。ＴＭＨＭＭ及びＳＭＡＲＴウェブサイト上で、ＮＰ_０００８７０．１に対応するアミノ酸配列の膜貫通領域及び細胞外端のそれぞれの分析を行った。分析結果から、ＩＬ－５タンパク質が膜貫通領域を持たない分泌タンパク質であり、１～１９位にシグナルペプチドを有し、全長で１３４アミノ酸を有することが示された。遺伝子合成によって、ＩＬ－５タンパク質の２０～１３４位のアミノ酸をコードする核酸配列を、ベクターｐｃＤＮＡ３．４にクローニングした。構築した担体をＳａｎｇｅｒシーケンシングし、元の配列をアラインメントした。好結果の検証の後、組換えプラスミドをバッチで抽出し、エンドトキシンを除去し、標的タンパク質の発現及び精製のために懸濁された２９３Ｆ細胞に遺伝子導入した。精製されたヒト組換えＩＬ－５タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を図１に示す。図１中、マーカーは標準タンパク質分子量勾配を示し、ｈｒＩＬ－５－ｃＨｉｓはカルボキシ末端にヒスチジンタグを有するヒト組換えＩＬ－５タンパク質を示す。
抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体の調製
Ａ．ヒト組換えＩＬ－５タンパク質の発現ベクターの構築
ＮＣＢＩ中の検索によってＩＬ－５のコード配列をＮＭ_０００８７９．２のアクセッション番号で得た。コード配列でのコーディングによって、ＮＰ_０００８７０．１のアクセッション番号を有するアミノ酸配列が提供された。ＴＭＨＭＭ及びＳＭＡＲＴウェブサイト上で、ＮＰ_０００８７０．１に対応するアミノ酸配列の膜貫通領域及び細胞外端のそれぞれの分析を行った。分析結果から、ＩＬ－５タンパク質が膜貫通領域を持たない分泌タンパク質であり、１～１９位にシグナルペプチドを有し、全長で１３４アミノ酸を有することが示された。遺伝子合成によって、ＩＬ－５タンパク質の２０～１３４位のアミノ酸をコードする核酸配列を、ベクターｐｃＤＮＡ３．４にクローニングした。構築した担体をＳａｎｇｅｒシーケンシングし、元の配列をアラインメントした。好結果の検証の後、組換えプラスミドをバッチで抽出し、エンドトキシンを除去し、標的タンパク質の発現及び精製のために懸濁された２９３Ｆ細胞に遺伝子導入した。精製されたヒト組換えＩＬ－５タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析結果を図１に示す。図１中、マーカーは標準タンパク質分子量勾配を示し、ｈｒＩＬ－５－ｃＨｉｓはカルボキシ末端にヒスチジンタグを有するヒト組換えＩＬ－５タンパク質を示す。
【0044】
発現され精製されたヒト組換えＩＬ－５のタンパク質の純度は約９０%であることが、図１から分かる。この実施例で得られたＩＬ－５タンパク質はラクダの免疫及び抗体スクリーニングに用いられた。
【0045】
Ｂ．抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体ライブラリーの構築
ステップＡで得た精製されたヒト組換えＩＬ－５タンパク質６００μｇを等体積のフロイント完全アジュバントと混合し、週に１回、合計７回、Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｌｘａ Ｂａｃｔｒｉａｎラクダを免疫した。初回免疫を除き、残りの６回の免疫は組換えＩＬ－５タンパク質とフロイント不完全アジュバントの等体積の混合物３００μｇを用いて行って、ラクダ内に抗ＩＬ－５抗体を産生させた。
ステップＡで得た精製されたヒト組換えＩＬ－５タンパク質６００μｇを等体積のフロイント完全アジュバントと混合し、週に１回、合計７回、Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ａｌｘａ Ｂａｃｔｒｉａｎラクダを免疫した。初回免疫を除き、残りの６回の免疫は組換えＩＬ－５タンパク質とフロイント不完全アジュバントの等体積の混合物３００μｇを用いて行って、ラクダ内に抗ＩＬ－５抗体を産生させた。
【0046】
免疫後、ラクダの末梢血リンパ球１００ｍＬを採取し、リンパ球からＲＮＡを抽出した。抽出した全ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを鋳型としてネスティッドＰＣＲによって重鎖抗体可変領域（ＶＨＨ）を増幅した。次いで、ｐＭＥＣＳベクターと増幅されたＶＨＨ断片を制限エンドヌクレアーゼを用いてそれぞれ消化し、消化された断片とベクターを連結した。連結した断片をコンピテント細胞ＴＧ１に形質転換し、ＩＬ－５タンパク質のファージディスプレイライブラリーを構築した。ライブラリー（組換えＴＧ１細胞）の大きさは約１×１０９であると決定した。
【0047】
Ｃ．抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体のスクリーニング
ステップＢで得た組換えＴＧ１細胞２００μＬを２×ＴＹ培地に接種して培養した。培養中に４０μＬのヘルパーファージＶＣＳＭ１３を添加してＴＧ１細胞を感染させ、一晩培養してファージを増幅させた。翌日、ＰＥＧ／ＮａＣｌでファージを沈殿させ、増幅させたファージを遠心分離で回収し、増幅されたファージライブラリーを得た。
ステップＢで得た組換えＴＧ１細胞２００μＬを２×ＴＹ培地に接種して培養した。培養中に４０μＬのヘルパーファージＶＣＳＭ１３を添加してＴＧ１細胞を感染させ、一晩培養してファージを増幅させた。翌日、ＰＥＧ／ＮａＣｌでファージを沈殿させ、増幅させたファージを遠心分離で回収し、増幅されたファージライブラリーを得た。
【0048】
ＮａＨＣＯ３（１００ｍＭ，ｐＨ８．３）中に希釈されたＩＬ－５タンパク質５００μｇを４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレートにコンンジュゲートさせた。陰性対照ウェルも提供された。２日目に、２００μＬの３％脱脂乳を加えて、室温で２時間阻害した。阻害の後、１００μＬの増幅されたファージライブラリー（約２×１０１１ファージ粒子）を加えて、室温で１時間作用させた。その作用から１時間後、プレートをＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、非結合ファージを洗浄した。ＩＬ－５タンパク質に特異的に結合するファージを最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬでトリプシンで解離させ、対数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞に感染させた。感染された大腸菌ＴＧ１細胞を３７℃で１時間培養し、次のスクリーニングのためのファージを製造し回収した。同じスクリーニングプロセスを別のラウンドで繰り返し、徐々に濃縮させることができた。１０倍以上の濃縮効率として、濃縮の効果を図２及び表１に示す。
【0049】
【表1】
【0050】
Ｄ．ファージＥＬＩＳＡによるＩＬ－５に対する特異的陽性クローンのスクリーニング
濃縮効率が１０倍以上である場合、スクリーニングされた陽性クローンから４００個の単一コロニーを選択し、９６深ウェルプレート中、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＢ培地に接種した。ブランク対照も提供された。プレートを３７℃で対数増殖期まで培養した。次に、最終濃度１ｍＭでＩＰＴＧを加えて、２８℃で一晩培養した。
濃縮効率が１０倍以上である場合、スクリーニングされた陽性クローンから４００個の単一コロニーを選択し、９６深ウェルプレート中、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＴＢ培地に接種した。ブランク対照も提供された。プレートを３７℃で対数増殖期まで培養した。次に、最終濃度１ｍＭでＩＰＴＧを加えて、２８℃で一晩培養した。
【0051】
浸透圧破裂によって、抗体粗抽出物を得た。ヒト組換えＩＬ－５タンパク質をＮａＨＣＯ３（１００ｍＭ，ｐＨ８．３）に希釈し、１００μｇのヒト組換えＩＬ－５タンパク質をＥＬＩＳＡプレート中、４℃で一晩コーティングした。１００μＬの得られた抗体粗抽出物をＥＬＩＳＡプレートに移し、そこに抗原（組換えＩＬ－５タンパク質）を加え、室温で１時間培養した。未結合抗体をＰＢＳＴで洗浄した。１：２００００希釈のマウス抗ＨＡタグ抗体（サーモフィッシャー）１００μＬを加え、室温で１時間培養した。未結合抗体をＰＢＳＴで洗浄した。１：２００００希釈の抗ウサギＨＲＰコンジュゲート（西洋ワサビパーオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体，サーモフィッシャー）１００μＬを加え、室温で１時間培養した。未結合抗体をＰＢＳＴで洗浄した。西洋ワサビパーオキシダーゼ発色溶液を加え、３７℃で１５分間反応させ、停止液を加えてマイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍの吸収を測定した。サンプルウェルの光学濃度（ＯＤ）が対照ウェルのＯＤより５倍を超える時、サンプルウェルを陽性クローンウェルと決定した。プラスミド抽出とシークエンシングのために、陽性クローンウェル中の細菌を、撹拌機上の１００μｇ／μＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地に移した。配列アラインメントソフトウェアＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて各クローンの遺伝子配列を分析した。同一のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を有する株を同一のクローンとし、異なる配列を有する株を異なるクローンとした。最終的に、ＩＬ－５タンパク質特異的単一ドメイン抗体を得た。単一ドメイン抗体は、ＶＨＨ全体を形成するＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のアミノ酸配列を有する。得られた単一ドメイン抗体の組換えプラスミド（陽性プラスミド、標的配列）を、原核生物系で発現させて、最終的に単一ドメイン抗体タンパク質を得ることができる。
【0052】
Ｅ．宿主大腸菌中のＩＬ－５タンパク質特異的単一ドメイン抗体の精製及び発現
ステップＤのシークエンシング分析によって得られた異なるクローンの陽性プラスミド（ｐＭＥＣＳ－ＶＨＨ）を、大腸菌ＨＢ２１５１に電気穿孔した。これをＬＢ＋ａｍｐ＋グルコース培養プレート（すなわち、アンピシリン及びグルコースを含有する）に広げて、３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを選択し、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬ中で接種し、攪拌機上で３７℃で一晩培養した。１ｍＬの一晩後の培養液を３３０ｍＬのＴＢ培地に接種し、撹拌機上で３７℃で培養した。分光光度計を用いて、波長６００ｎｍの吸収を測定し、ＯＤ６００として記録した。ＯＤ６００値が０．６～０．９の範囲で測定された時、１ＭのＩＰＴＧを加えて、撹拌機上で２８℃で一晩培養した。大腸菌を遠心分離で回収した。浸透圧破裂によって、抗体粗抽出物を得た。アフィニティークロマトグラフィーでＮｉカラムを通して抗体を精製した。精製された単一ドメイン抗体を表２に示す。
ステップＤのシークエンシング分析によって得られた異なるクローンの陽性プラスミド（ｐＭＥＣＳ－ＶＨＨ）を、大腸菌ＨＢ２１５１に電気穿孔した。これをＬＢ＋ａｍｐ＋グルコース培養プレート（すなわち、アンピシリン及びグルコースを含有する）に広げて、３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを選択し、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬ中で接種し、攪拌機上で３７℃で一晩培養した。１ｍＬの一晩後の培養液を３３０ｍＬのＴＢ培地に接種し、撹拌機上で３７℃で培養した。分光光度計を用いて、波長６００ｎｍの吸収を測定し、ＯＤ６００として記録した。ＯＤ６００値が０．６～０．９の範囲で測定された時、１ＭのＩＰＴＧを加えて、撹拌機上で２８℃で一晩培養した。大腸菌を遠心分離で回収した。浸透圧破裂によって、抗体粗抽出物を得た。アフィニティークロマトグラフィーでＮｉカラムを通して抗体を精製した。精製された単一ドメイン抗体を表２に示す。
【0053】
【表2】
【0054】
実施例２
抗ＩＬ－５単一ドメイン抗体のヒト化
単一ドメイン抗体のヒト化のために、タンパク質表面上のアミノ酸のヒト化及びユニバーサルフレームワークの移植によって、ヒト化を行った。
抗ＩＬ－５単一ドメイン抗体のヒト化
単一ドメイン抗体のヒト化のために、タンパク質表面上のアミノ酸のヒト化及びユニバーサルフレームワークの移植によって、ヒト化を行った。
【0055】
以下のステップで、タンパク質表面上のアミノ酸のヒト化を行った。参照として相同配列を有するＮｂＢｃＩＩ１０抗体（ＰＤＢアクセッション番号：３ＤＷＴ）を用い、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ及びモデリングソフトウェアーを用いて抗体株１Ｂ３及び２Ｂ３に対してホモロジーモデリングを行った。タンパク質三次元構造に従って、アミノ酸の溶媒に対する相対的アクセス性を計算した。
【0056】
以下の特定のステップで、ＶＨＨのヒト化のためのユニバーサルフレームワークの移植を行った。まず、配列相同性に従って、ナノボディＮｂＢｃＩＩ１０（ＰＤＢアクセッション番号：３ＤＷＴ）に基づいて、ヒト抗体ＤＰ－４７を参照してタンパク質表面上のアミノ酸をヒト化して、ＦＧＬＡとしてＶＨＨ配列フレームワーク－２のいくつかのアミノ酸を改変することで、ＶＨＨのヒト化のためのユニバーサルフレームワークｈ－ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡ（ＰＤＢアクセッション番号：３ＥＡＫ）を設計し、提供された。フレームワークとして直接用いられるｈ－ＮｂＢｃＩＩ１０ＦＧＬＡのＣＤＲを、抗体株１Ｂ３及び２Ｂ３のＣＤＲでそれぞれ置き換えて、抗体のヒト化を完了した。
【0057】
抗体株１Ｂ３及び２Ｂ３をヒト化して、５つのヒト化抗体株変異体を得た。表３及び表４は、これらのヒト化変異体の配列番号とアミノ酸の変化を示す。アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムで番号が付けられた。表３及び表４の中の「○」は、ナノボディクローンのその位置に変異（置換）が存在することを示す。具体的には、例えば、「Ｓ１１Ｌ」は、１１位でＳ（セリン）がＬ（ロイシン）に置換されていることを意味し、「Ｓ６６Ｔ」は、６６位でＳ（セリン）がＴ（トレオニン）に置換されていることを意味する。図３はヒト化された配列のアラインメントの結果を示す。
【0058】
【表3】
【0059】
【表4】
【0060】
実施例３
Ｆ．ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の真核細胞発現ベクターの構築
実施例１のステップＤでスクリーニングされた単一ドメイン抗体の核酸配列を、サンガーのシーケンシング方法で得た。配列合成によってコドン最適化された上記の塩基配列を、改変されたベクターＲＪＫ－Ｖ４－ｈＦＣに導入した。
Ｆ．ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の真核細胞発現ベクターの構築
実施例１のステップＤでスクリーニングされた単一ドメイン抗体の核酸配列を、サンガーのシーケンシング方法で得た。配列合成によってコドン最適化された上記の塩基配列を、改変されたベクターＲＪＫ－Ｖ４－ｈＦＣに導入した。
【0061】
ＲＪＫ－Ｖ４－ｈＦＣは、ナノボディのユニバーサル標的ベクターであり、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからの市販ベクターｐｃＤＮＡ３．４（ベクターの情報は、https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcDNA3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdfで得られる）でヒトＩｇＧの重鎖コード配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＢ７７６８３８．１）のＦｃ断片を融合することで得られる。ベクターは、ＩｇＧ重鎖のヒンジＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。具体的な改変は以下の通りである。
【0062】
ｐｃＤＮＡ３．４中のＸｂａＩ及びＡｇｅＩ制限酵素切断部位を選択した。オーバーラップＰＣＲによってマルチクローニング部位（ＭＣＳ）及び６×ＨｉｓタグをそれぞれＦｃ断片コード配列の５’末端及び３’末端に導入した。ＸｂａＩ及びＡｇｅＩ制限酵素切断部位を有する一対のプライマーを用いたＰＣＲによって上記断片を増幅した。制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＡｇｅＩを用いて、ｐｃＤＮＡ３．４とプライマーに由来するＸｂａＩ及びＡｇｅＩ制限酵素切断部位を有する増幅された断片をそれぞれ消化した。消化されたベクター及び導入された断片を、Ｔ４リガーゼを用いて連結し、その後、連結された生成物を大腸菌中に形質転換し、増幅し、シーケンシングで検証し、組換え真核細胞発現ベクターを得た。
【0063】
構築された組換え真核細胞発現ベクターをＤＨ５α大腸菌中に形質転換し、プラスミドマキシプレップ抽出で培養し、エンドトキシンを除去した。マキシプレップ抽出されたプラスミドをシーケンシングによって同定した。確認された組換えベクターを、続く真核細胞中の遺伝子導入及び発現のために用いた。
【0064】
Ｇ．懸濁されたＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞中のＩＬ－５タンパク質特異的単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の発現
遺伝子導入の３日前に２．５×１０５／ｍＬの濃度でＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を継代し、発展させた。計算で必要な体積中の細胞を、１２０ｍＬ（最終体積）のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。細胞を約４×１０６～６×１０６生細胞／ｍＬの濃度で培養した。遺伝子導入の前日に、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）を３．５×１０６生細胞／ｍＬに希釈し、一晩培養した。遺伝子導入の当日、細胞密度と生細胞百分率を測定した。遺伝子導入の前に、細胞密度が約７×１０６～１０×１０６生細胞／ｍＬに達するべきである。３７℃に予熱された新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地で細胞を６×１０６生細胞／ｍＬに希釈した。計算で必要な体積中の細胞を、１００ｍＬ（最終体積）の新鮮な予熱されたＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。振とうフラスコを穏やかに上下ひっくり返して転回することで、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を均一に混合し、３．７ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、振とうし、均一に混合した。ステップＦで得たプラスミドＤＮＡを４ｍＬの冷えたＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、振とうし、均一に混合した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＣＨＯ／プラスミドＤＮＡの混合物を室温で３分間培養し、振とうフラスコを穏やかに振とうさせながら、調製された細胞懸濁液に穏やかに加えた。３７℃、８％ＣＯ２を含む加湿空気中で、細胞を振とう培養した。遺伝子導入の１日後（１８～２２時間後）、６００μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサー及び２４ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯフィードを加えた。遺伝子導入の約８日後（細胞生存率が７０％未満であった）、上清を回収した。
遺伝子導入の３日前に２．５×１０５／ｍＬの濃度でＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を継代し、発展させた。計算で必要な体積中の細胞を、１２０ｍＬ（最終体積）のＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。細胞を約４×１０６～６×１０６生細胞／ｍＬの濃度で培養した。遺伝子導入の前日に、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）を３．５×１０６生細胞／ｍＬに希釈し、一晩培養した。遺伝子導入の当日、細胞密度と生細胞百分率を測定した。遺伝子導入の前に、細胞密度が約７×１０６～１０×１０６生細胞／ｍＬに達するべきである。３７℃に予熱された新鮮なＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地で細胞を６×１０６生細胞／ｍＬに希釈した。計算で必要な体積中の細胞を、１００ｍＬ（最終体積）の新鮮な予熱されたＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。振とうフラスコを穏やかに上下ひっくり返して転回することで、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬を均一に混合し、３．７ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、振とうし、均一に混合した。ステップＦで得たプラスミドＤＮＡを４ｍＬの冷えたＯｐｔｉＰＲＯ（商標）培地で希釈し、振とうし、均一に混合した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＣＨＯ／プラスミドＤＮＡの混合物を室温で３分間培養し、振とうフラスコを穏やかに振とうさせながら、調製された細胞懸濁液に穏やかに加えた。３７℃、８％ＣＯ２を含む加湿空気中で、細胞を振とう培養した。遺伝子導入の１日後（１８～２２時間後）、６００μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯエンハンサー及び２４ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯフィードを加えた。遺伝子導入の約８日後（細胞生存率が７０％未満であった）、上清を回収した。
【0065】
Ｈ．懸濁された２９３Ｆ細胞中の抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の発現
遺伝子導入の３日前に、２．５×１０５／ｍＬの濃度で２９３Ｆ細胞を継代し、発展させた。計算で必要な体積中の細胞を、１２０ｍＬ（最終体積）の新鮮な予熱されたＯＰＭ－２９３ＣＤ０５培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。細胞を約２×１０６～３×１０６生細胞／ｍＬの濃度まで培養した。遺伝子導入の当日、細胞密度と生細胞百分率を測定した。遺伝子導入の前に、細胞密度が約２×１０６～３×１０６生細胞／ｍＬに達するべきである。予熱されたＯＰＭ－２９３ＣＤ０５培地で細胞を１×１０６生細胞／ｍＬに希釈した。計算で必要な体積中の細胞を、１００ｍＬ（最終体積）の新鮮な予熱された培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地でＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）試薬を希釈し、振とうし、ピペッティングで均一に混合した。ステップＦで得たプラスミドＤＮＡを４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈し、振とうし、均一に混合し、０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過し、室温で５分間培養した。希釈されたＰＥＩ試薬を希釈されたＤＮＡに加え、上下ひっくり返して転回して、均一に混合した。ＰＥＩ／プラスミドＤＮＡの混合物を室温で１５～２０分間培養し、振とうフラスコを穏やかに振とうさせながら、調製された細胞懸濁液に穏やかに加えた。３７℃で５％ＣＯ２中、１２０ｒｐｍで細胞を振とう培養した。遺伝子導入の２４時間及び７２時間の後、５ｍＬのＯＰＭ－ＣＨＯＰＦＦ０５フィードを加えた。遺伝子導入の約７日後（細胞生存率が７０％未満であった）、上清を回収した。
遺伝子導入の３日前に、２．５×１０５／ｍＬの濃度で２９３Ｆ細胞を継代し、発展させた。計算で必要な体積中の細胞を、１２０ｍＬ（最終体積）の新鮮な予熱されたＯＰＭ－２９３ＣＤ０５培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。細胞を約２×１０６～３×１０６生細胞／ｍＬの濃度まで培養した。遺伝子導入の当日、細胞密度と生細胞百分率を測定した。遺伝子導入の前に、細胞密度が約２×１０６～３×１０６生細胞／ｍＬに達するべきである。予熱されたＯＰＭ－２９３ＣＤ０５培地で細胞を１×１０６生細胞／ｍＬに希釈した。計算で必要な体積中の細胞を、１００ｍＬ（最終体積）の新鮮な予熱された培地を含む５００ｍＬの振とうフラスコに移した。４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地でＰＥＩ（１ｍｇ／ｍＬ）試薬を希釈し、振とうし、ピペッティングで均一に混合した。ステップＦで得たプラスミドＤＮＡを４ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈し、振とうし、均一に混合し、０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過し、室温で５分間培養した。希釈されたＰＥＩ試薬を希釈されたＤＮＡに加え、上下ひっくり返して転回して、均一に混合した。ＰＥＩ／プラスミドＤＮＡの混合物を室温で１５～２０分間培養し、振とうフラスコを穏やかに振とうさせながら、調製された細胞懸濁液に穏やかに加えた。３７℃で５％ＣＯ２中、１２０ｒｐｍで細胞を振とう培養した。遺伝子導入の２４時間及び７２時間の後、５ｍＬのＯＰＭ－ＣＨＯＰＦＦ０５フィードを加えた。遺伝子導入の約７日後（細胞生存率が７０％未満であった）、上清を回収した。
【0066】
Ｉ．抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質の精製
ステップＧ又はＨで得られたＦｃ融合タンパク質の発現上清を、０．４５μｍのディスポザブルフィルターヘッドで濾過して、不溶性不純物を除去した。タンパク質精製装置を用いて、ヒトＦｃ融合タンパク質のプロテインＡへの結合に基づいて、プロテインＡにコンジュゲートされたアガロース充填剤を有するアフィニティークロマトグラフィーで濾液を精製した。プロテインＡが事前に充填されたカラムに濾液を１ｍＬ／分の流量で流した。このステップで濾液中の標的タンパク質が充填剤に結合する。低塩バッファーと高塩バッファーで、カラムに結合した不純物タンパク質を洗浄した。カラムに結合した標的タンパク質を低ｐＨバッファーで溶出させた。中和のためにｐＨ９．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液に、溶出された溶液を速やかに加えた。
ステップＧ又はＨで得られたＦｃ融合タンパク質の発現上清を、０．４５μｍのディスポザブルフィルターヘッドで濾過して、不溶性不純物を除去した。タンパク質精製装置を用いて、ヒトＦｃ融合タンパク質のプロテインＡへの結合に基づいて、プロテインＡにコンジュゲートされたアガロース充填剤を有するアフィニティークロマトグラフィーで濾液を精製した。プロテインＡが事前に充填されたカラムに濾液を１ｍＬ／分の流量で流した。このステップで濾液中の標的タンパク質が充填剤に結合する。低塩バッファーと高塩バッファーで、カラムに結合した不純物タンパク質を洗浄した。カラムに結合した標的タンパク質を低ｐＨバッファーで溶出させた。中和のためにｐＨ９．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液に、溶出された溶液を速やかに加えた。
【0067】
中和されたタンパク質溶液を透析し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った。９５％以上の純度及び０．５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度を有するタンパク質を低温保存し、使える状態にした。
【0068】
検証例１
実施例１で提供されたＩＬ－５タンパク質特異的単一ドメイン抗体の用量反応関係の決定
５０μＬの１μｇ／ｍＬのＩＬ－５タンパク質をＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄した。２００μＬの５％牛乳を加え、３７℃で１時間阻害した。実施例１で得られたＩＬ－５タンパク質特異的単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を２μｇ／ｍＬに希釈し、次いで５倍勾配で希釈して合計８つの濃度勾配とした。プレートを洗浄した。５０μＬの抗体をデュプリケートのプレートに加え、３７℃で１時間培養した。プレートを洗浄した。５０μＬのマウス抗ＨＡタグＨＲＰ二次抗体を加え、３７℃で３０分間培養した。プレートを複数回、洗浄した。５０μＬの常温で保存されたＴＭＢを加えて、室温で暗所で１５分間、反応させた。５０μＬの停止溶液（１Ｎ ＨＣｌ）を加えた。マイクロプレートリーダーを用いて結果物を測定し、記録した。曲線をプロットした。最大効果の５０％の濃度（ＥＣ５０）は、最大効果の５０％を示す濃度であり、計算した。その結果を図４及び表５に示す。
実施例１で提供されたＩＬ－５タンパク質特異的単一ドメイン抗体の用量反応関係の決定
５０μＬの１μｇ／ｍＬのＩＬ－５タンパク質をＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄した。２００μＬの５％牛乳を加え、３７℃で１時間阻害した。実施例１で得られたＩＬ－５タンパク質特異的単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を２μｇ／ｍＬに希釈し、次いで５倍勾配で希釈して合計８つの濃度勾配とした。プレートを洗浄した。５０μＬの抗体をデュプリケートのプレートに加え、３７℃で１時間培養した。プレートを洗浄した。５０μＬのマウス抗ＨＡタグＨＲＰ二次抗体を加え、３７℃で３０分間培養した。プレートを複数回、洗浄した。５０μＬの常温で保存されたＴＭＢを加えて、室温で暗所で１５分間、反応させた。５０μＬの停止溶液（１Ｎ ＨＣｌ）を加えた。マイクロプレートリーダーを用いて結果物を測定し、記録した。曲線をプロットした。最大効果の５０％の濃度（ＥＣ５０）は、最大効果の５０％を示す濃度であり、計算した。その結果を図４及び表５に示す。
【0069】
【表5】
【0070】
検証例２
ヒトＩＬ－５タンパク質を標的とするツール抗体（Ｔａｂ）の発現及び精製
Ｔａｂ１（対照抗体１）及びＴａｂ２（対照抗体２）を得た。Ｔａｂ１は、ＵＳ７９８２００５Ｂ２に示される配列を有するｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂである。Ｔａｂ２は、ＵＳ６０５６９５７に示される配列を有するｒｅｓｌｉｚｕｍａｂである。
ヒトＩＬ－５タンパク質を標的とするツール抗体（Ｔａｂ）の発現及び精製
Ｔａｂ１（対照抗体１）及びＴａｂ２（対照抗体２）を得た。Ｔａｂ１は、ＵＳ７９８２００５Ｂ２に示される配列を有するｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂである。Ｔａｂ２は、ＵＳ６０５６９５７に示される配列を有するｒｅｓｌｉｚｕｍａｂである。
【0071】
哺乳動物細胞発現システムのためのコドン最適化のために、検索されたＴａｂ１及びＴａｂ２の配列がＧｅｎｅｒａｌ Ｂｉｏｌ （Ａｎｈｕｉ） Ｃｏ．，Ｌｔｄ．に委託され、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングされた。
【0072】
耐性のためにスクリーニングされたプラスミド－陽性細菌が増幅され、プラスミドミディプレップキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７４０４１２．５０）を用いてプラスミドを抽出した。１００ｍＬの細胞当たり１００μｇのプラスミド（５０μｇの重鎖及び５０μｇの軽鎖）を加え、ＰＥＩを用いて２９３Ｆ細胞（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号１２３３８０２６＋Ｆ－６８，Ｔｈｅｒｍｏ，カタログ番号２４０４００３２）中で一時的に遺伝子導入し、発現させた。遺伝子導入から６～２４時間後に、５体積％の１０％ペプトロン（シグマ，カタログ番号Ｐ０５２１－１００Ｇ）を加え、８％ＣＯ２で１３０ｒｐｍで約７～８日間培養した。細胞生存率が５０％に低下した時、発現上清を回収し、プロテインＡ（ＧＥ，カタログ番号１７－５４３８－０２）重力カラムで精製した。ＰＢＳ透析後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを用いて濃度を測定し、ＳＥＣで純度を特定し、間接ＥＬＩＳＡで結合を検証した。本方法によって得られたＴａｂ抗体は、２ｍｇ／ｍＬ以上の濃度と９４％以上の純度を有する。ＩＬ－５タンパク質（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ，カタログ番号ＣＳ３３）への結合のＥＣ５０を図５及び表６に示す。
【0073】
【表6】
【0074】
ヒト組換えＩＬ－５タンパク質で誘導され、ツール抗体（Ｔａｂ）で中和されたＴＦ－１細胞増殖の実験
ヒト組換えＩＬ－５タンパク質で誘導されたＴＦ－１細胞増殖の実験：
蘇生後３～４代で継代したＴＦ－１細胞を、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に接種した。ヒトＩＬ－５タンパク質を最大濃度５００ｎｇ／ｍＬの溶液で構成し、５倍勾配で希釈した。勾配希釈されたＩＬ－５タンパク質溶液を細胞培養培地と等体積で細胞培養ウェルに加えた。７２時間の培養後、発光細胞生存率検出キットを用いて細胞生存率を検出した。ＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞増殖のＥＣ８０を検出結果に従って計算した。ＥＣ８０（最大効果の８０％の濃度）は、最大効果の８０％を示す濃度である。
ヒト組換えＩＬ－５タンパク質で誘導されたＴＦ－１細胞増殖の実験：
蘇生後３～４代で継代したＴＦ－１細胞を、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に接種した。ヒトＩＬ－５タンパク質を最大濃度５００ｎｇ／ｍＬの溶液で構成し、５倍勾配で希釈した。勾配希釈されたＩＬ－５タンパク質溶液を細胞培養培地と等体積で細胞培養ウェルに加えた。７２時間の培養後、発光細胞生存率検出キットを用いて細胞生存率を検出した。ＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞増殖のＥＣ８０を検出結果に従って計算した。ＥＣ８０（最大効果の８０％の濃度）は、最大効果の８０％を示す濃度である。
【0075】
Ｔａｂで中和されたヒトＩＬ－５タンパク質で誘導されたＴＦ－１細胞増殖の実験：
蘇生後３～４代で継代したＴＦ－１細胞を、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に接種した。Ｔａｂ１及びＴａｂ２を１０μｇ／ｍＬの溶液で構成し、５倍勾配で希釈した。勾配希釈されたＴａｂを増殖実験で得られたＥＣ８０濃度でＩＬ－５と１：１で混合して、混合溶液を得た。混合溶液を細胞培養培地と等体積で細胞培養ウェルに加えた。７２時間の培養後、発光細胞生存率検出キットを用いて細胞生存率を検出した。ＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞増殖を中和するＴＡｂ１及びＴａｂ２のＥＣ５０濃度を検出結果に従って計算した。その結果を図６及び表７に示す。
蘇生後３～４代で継代したＴＦ－１細胞を、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に接種した。Ｔａｂ１及びＴａｂ２を１０μｇ／ｍＬの溶液で構成し、５倍勾配で希釈した。勾配希釈されたＴａｂを増殖実験で得られたＥＣ８０濃度でＩＬ－５と１：１で混合して、混合溶液を得た。混合溶液を細胞培養培地と等体積で細胞培養ウェルに加えた。７２時間の培養後、発光細胞生存率検出キットを用いて細胞生存率を検出した。ＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞増殖を中和するＴＡｂ１及びＴａｂ２のＥＣ５０濃度を検出結果に従って計算した。その結果を図６及び表７に示す。
【0076】
【表7】
【0077】
検証例３
抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質で中和されたＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞の増殖の検出
蘇生後３～４代で継代したＴＦ－１細胞を、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に接種した。Ｔａｂ１、Ｔａｂ２及び実施例３－Ｉで提供された単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質を１０μｇ／ｍＬの溶液で構成し、５倍勾配で希釈した。勾配希釈されたＴａｂ及び単一ドメイン抗体を増殖実験で得られたＥＣ８０濃度でＩＬ－５タンパク質と１：１で混合して、混合溶液を得た。混合溶液を細胞培養培地と等体積で細胞培養ウェルに加えた。７２時間の培養後、発光細胞生存率検出キットを用いて細胞生存率を検出した。ＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞増殖を中和する異なる単一ドメイン抗体のＥＣ５０濃度を検出結果に従って計算した。その結果を図７～８及び表８～９に示す。
抗ＩＬ－５タンパク質単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質で中和されたＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞の増殖の検出
蘇生後３～４代で継代したＴＦ－１細胞を、１００００細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に接種した。Ｔａｂ１、Ｔａｂ２及び実施例３－Ｉで提供された単一ドメイン抗体のＦｃ融合タンパク質を１０μｇ／ｍＬの溶液で構成し、５倍勾配で希釈した。勾配希釈されたＴａｂ及び単一ドメイン抗体を増殖実験で得られたＥＣ８０濃度でＩＬ－５タンパク質と１：１で混合して、混合溶液を得た。混合溶液を細胞培養培地と等体積で細胞培養ウェルに加えた。７２時間の培養後、発光細胞生存率検出キットを用いて細胞生存率を検出した。ＩＬ－５誘導ＴＦ－１細胞増殖を中和する異なる単一ドメイン抗体のＥＣ５０濃度を検出結果に従って計算した。その結果を図７～８及び表８～９に示す。
【0078】
【表8】
【0079】
【表9】
【0080】
ＩＬ－５結合分子のアフィニティー動力学の検出
ＳＤバッファーの構成：ウシ血清アルブミン及びＴｗｅｅｎ２０の質量（又は体積）分率がそれぞれ０．１％及び０．０２％となるように、ウシ血清アルブミン及びＴｗｅｅｎ２０の適量を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。ＩＬ－５結合分子をＳＤバッファー中、１０μｇ／ｍＬの濃度で構成させた。
抗原使用液の構成：抗原を、ＳＤバッファー中、２００ｎＭに構成させ、その後、２倍勾配で希釈し、合計５つの濃度勾配が設定された。更に１つのＳＤバッファーのブランク対照も提供された。０．１Ｍのグリシン保存溶液の適量を脱イオン水中で１０倍に希釈し、均一に混合して、再生溶液を得た。Ｏｃｔｅｔ９６及びその支援コンピュータ中のＤａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｏｎソフトウェアをオンにした。適量の７５％エタノールと共にレンズ用紙を用いて、取込みプローブの底面と側面を洗浄した。装置を１５分間以上、予熱した。
センサーのプリウェッティング：試験前にセンサーをＳＤバッファー中に１０分間以上、浸漬した。その後、試験操作のために、ベースライン→抗体→ベースライン→抗原の結合→抗原の解離→センサーの再生の手順に従って、機械手順を設定した。
ＳＤバッファーの構成：ウシ血清アルブミン及びＴｗｅｅｎ２０の質量（又は体積）分率がそれぞれ０．１％及び０．０２％となるように、ウシ血清アルブミン及びＴｗｅｅｎ２０の適量を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。ＩＬ－５結合分子をＳＤバッファー中、１０μｇ／ｍＬの濃度で構成させた。
抗原使用液の構成：抗原を、ＳＤバッファー中、２００ｎＭに構成させ、その後、２倍勾配で希釈し、合計５つの濃度勾配が設定された。更に１つのＳＤバッファーのブランク対照も提供された。０．１Ｍのグリシン保存溶液の適量を脱イオン水中で１０倍に希釈し、均一に混合して、再生溶液を得た。Ｏｃｔｅｔ９６及びその支援コンピュータ中のＤａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｏｎソフトウェアをオンにした。適量の７５％エタノールと共にレンズ用紙を用いて、取込みプローブの底面と側面を洗浄した。装置を１５分間以上、予熱した。
センサーのプリウェッティング：試験前にセンサーをＳＤバッファー中に１０分間以上、浸漬した。その後、試験操作のために、ベースライン→抗体→ベースライン→抗原の結合→抗原の解離→センサーの再生の手順に従って、機械手順を設定した。
【0081】
具体的に試験したＩＬ－５結合分子のアフィニティー動力学パラメーターを表１０に示す。
【0082】
【表10】
【0083】
ＫＤは親和性定数であり、単位はモル（Ｍ）である。
Ｋａは結合速度定数であり、単位はモル時間の逆数（１／Ｍｓ）である。
Ｋｄは解離速度定数であり、単位は時間の逆数である。
Ｒ２はフィット度合、つまり実測曲線とフィット曲線がどれだけ一致しているかを示すものである。Ｒ２が１に近いほど、フィット値が実測値に近くなる。本システムでは、Ｒ２は少なくとも０．９５よりも大きいものとする。
Ｘ２はシステムで測定した値を反映する統計的パラメータである。Ｘ２は３よりも小さいものとし、Ｘ２が小さいほど測定値の信頼性が高くなる。
その他の誤差値は対応するパラメータの誤差値であり、対応するパラメータより１桁（１０倍）小さいか、それより小さいものとする。
Ｋａは結合速度定数であり、単位はモル時間の逆数（１／Ｍｓ）である。
Ｋｄは解離速度定数であり、単位は時間の逆数である。
Ｒ２はフィット度合、つまり実測曲線とフィット曲線がどれだけ一致しているかを示すものである。Ｒ２が１に近いほど、フィット値が実測値に近くなる。本システムでは、Ｒ２は少なくとも０．９５よりも大きいものとする。
Ｘ２はシステムで測定した値を反映する統計的パラメータである。Ｘ２は３よりも小さいものとし、Ｘ２が小さいほど測定値の信頼性が高くなる。
その他の誤差値は対応するパラメータの誤差値であり、対応するパラメータより１桁（１０倍）小さいか、それより小さいものとする。
【0084】
この結果から、ツール抗体に比べて、クローン１Ｂ３は僅かに小さいアフィニティー動力学定数を有し、残りのクローンは僅かに大きいアフィニティー動力学定数を有し、試験したサンプルの間でアフィニティー動力学定数に有意な差は見られず、統計的有意差は無かったことが示された。
【0085】
本明細書に記載されたものは、単に本発明の好ましい実施形態であり、本発明を限定することは意図されていない。当業者は、本発明に種々の変更及び改変を行うことができる。本発明の精神及び原則の範囲内で行われるあらゆる改変、等価な置換又は改善は、本発明の保護範囲に含まれるものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】