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特表2023-532557神経再生用途を有する組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-07-28

(54)【発明の名称】神経再生用途を有する組成物

(51)【国際特許分類】

A61K 38/40 20060101AFI20230721BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20230721BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20230721BHJP

A61K 38/38 20060101ALI20230721BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20230721BHJP

A61K 38/19 20060101ALI20230721BHJP

A61K 38/17 20060101ALI20230721BHJP

A61K 31/44 20060101ALI20230721BHJP

A61K 31/551 20060101ALI20230721BHJP

A61P 25/16 20060101ALI20230721BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20230721BHJP

A61P 25/14 20060101ALI20230721BHJP

A61P 25/02 20060101ALI20230721BHJP

C07K 14/79 20060101ALI20230721BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20230721BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20230721BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20230721BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20230721BHJP

C12N 15/62 20060101ALI20230721BHJP

【ＦＩ】

A61K38/40 ZNA

A61P25/00

A61P43/00 105

A61K38/38

A61K45/00

A61K38/19

A61K38/17

A61K31/44

A61K31/551

A61P25/16

A61P25/28

A61P25/14

A61P25/02

C07K14/79

C07K16/00

C07K19/00

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022581608

(86)(22)【出願日】2021-07-07

(85)【翻訳文提出日】2023-02-24

(86)【国際出願番号】 EP2021068873

(87)【国際公開番号】W WO2022008609

(87)【国際公開日】2022-01-13

(31)【優先権主張番号】63/049,486

(32)【優先日】2020-07-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】515116009

【氏名又は名称】グリフォルス・ワールドワイド・オペレーションズ・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＩＦＯＬＳＷＯＲＬＤＷＩＤＥＯＰＥＲＡＴＩＯＮＳＬＩＭＩＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】ＧｒａｎｇｅＣａｓｔｌｅＢｕｓｉｎｅｓｓＰａｒｋ，ＧｒａｎｇｅＣａｓｔｌｅ，Ｃｌｏｎｄａｌｋｉｎ，Ｄｕｂｌｉｎ２２，ＩＲＥＬＡＮＤ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部達彦

(72)【発明者】

【氏名】トーマス・バーネット

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド・エー・ロス

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA19

4C084BA02

4C084BA41

4C084BA44

4C084CA36

4C084CA38

4C084DA01

4C084DA37

4C084DC32

4C084DC34

4C084DC35

4C084MA02

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZB22

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC17

4C086BC54

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZB22

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA21

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書に開示されるのは、神経変性事象を被っている患者における新たな神経細胞の生成の促進又は誘導における使用のための、トランスフェリン又はラクトフェリンを含有する医薬組成物である。神経変性事象は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、又は筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患によって引き起こされることがある。理想的には、トランスフェリン及び/又はラクトフェリンは、低い鉄飽和度を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経変性事象を被っている患者における新たな神経細胞の生成を促進する及び/又は誘導する方法であって、
それを必要とする患者に、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択される治療有効量のタンパク質を投与する工程を含む、方法。

【請求項2】

患者に投与される治療有効量のトランスフェリン又はラクトフェリンが、約20%未満の鉄飽和度を有する、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

タンパク質がヒトトランスフェリンである、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】

トランスフェリンが血漿由来又は組換えである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

組換えトランスフェリンが、
i) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列を含むY188F変異体;
ii) 配列番号4に記載されるアミノ酸配列を含むY95F/Y188F変異体;
iii) 配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むY426F/Y517F変異体;及び
iv) これらの組合せ
からなる群から選択される変異体トランスフェリンである、請求項4に記載の方法。

【請求項6】

トランスフェリンが融合タンパク質のドメインであり、融合パートナーが免疫グロブリンFcドメインである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

神経変性事象が、神経変性疾患によって引き起こされる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

神経変性事象が、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、大脳皮質基底核神経節変性症、末梢神経障害、進行性核上性麻痺、脊髄小脳変性症、脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性症、神経原性筋萎縮症、前角細胞変性、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症、亜急性硬化性全脳炎、ハラーホルデン・スパッツ病、拳闘家認知症、ピック病、タウオパチー、シヌクレイン病、並びにそれらの組合せからなる群から選択される神経変性疾患である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質に加えて、治療有効量の血清又は血漿タンパク質を患者に投与する工程を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

血清又は血漿タンパク質と、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質とが、単位的な剤形として投与される、請求項9に記載の方法。

【請求項11】

血清又は血漿タンパク質が、アルブミン、アルファ-1アンチトリプシン/アルファ-1プロテイナーゼ阻害剤、アンチトロンビン、ポリクローナル免疫グロブリン、多特異性免疫グロブリン、C1エステラーゼ阻害剤、トランスサイレチン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項9から10に記載の方法。

【請求項12】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質に加えて、治療有効量の神経形成又は神経栄養化合物又は分子を投与する工程を更に含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

神経形成又は神経栄養化合物又は分子が、NGFスーパーファミリーのメンバー、TGF-βスーパーファミリーのメンバー、ニューロカインスーパーファミリーのメンバー、神経栄養ペプチド、Rhoキナーゼ阻害剤、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。

【請求項14】

神経形成又は神経栄養化合物又は分子が、
配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含む脳由来神経栄養因子、
配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むグリア細胞株由来神経栄養因子、
配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含む毛様体神経栄養因子-1、
配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むPACAP、
trans-4-[(1R)-1-アミノエチル]-N-4-ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド及び薬学的に許容されるその塩、
ヘキサヒドロ-1-(5-イソキノリニル-スルホニル)-1H-1,4-ジアゼピン及び薬学的に許容されるその塩、
並びにそれらの組合せ
からなる群から選択される、請求項12から13に記載の方法。

【請求項15】

神経形成又は神経栄養化合物又は分子と、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質とが、単位的な剤形として投与される、請求項12から14に記載の方法。

【請求項16】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、それを必要とする患者に、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、頭蓋内、肺内、鼻腔内、脊髄内、髄腔内、経皮、経粘膜、経口、膣内、及び直腸内からなる群から選択される投与経路を通して投与される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、神経変性事象によって引き起こされた損傷に局所的に又はその近位に投与される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、患者のトランスフェリンの鉄飽和度を約30%未満に低減させるのに十分な濃度で患者に投与される、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

患者のトランスフェリンの鉄飽和度が、患者の血清又は血漿の試料中で測定される、請求項18に記載の方法。

【請求項20】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、約5mg/kg～約8400mg/kgの濃度で患者に投与される、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、複数回投薬レジメンの一部として患者に投与される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

神経変性事象を被っている患者における神経細胞の発生を刺激する方法であって、
それを必要とする患者に、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択される治療有効量のタンパク質を投与する工程を含む、方法。

【請求項23】

患者に投与される治療有効量のトランスフェリン又はラクトフェリンが、約20%未満の鉄飽和度を有する、請求項22に記載の方法。

【請求項24】

タンパク質がヒトトランスフェリンである、請求項22から23に記載の方法。

【請求項25】

トランスフェリンが血漿由来又は組換えである、請求項22から24に記載の方法。

【請求項26】

組換えトランスフェリンが、
i) 配列番号3に記載されるアミノ酸配列を含むY188F変異体;
ii) 配列番号4に記載されるアミノ酸配列を含むY95F/Y188F変異体;
iii) 配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むY426F/Y517F変異体;及び
iv) それらの組合せ
からなる群から選択される変異体トランスフェリンである、請求項25に記載の方法。

【請求項27】

トランスフェリンが融合タンパク質のドメインであり、融合パートナーが免疫グロブリンFcドメインである、請求項22から26に記載の方法。

【請求項28】

神経変性事象が、神経変性疾患によって引き起こされる、請求項22から27に記載の方法。

【請求項29】

神経変性事象が、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、大脳皮質基底核神経節変性症、末梢神経障害、進行性核上性麻痺、脊髄小脳変性症、脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性症、神経原性筋萎縮症、前角細胞変性、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症、亜急性硬化性全脳炎、ハラーホルデン・スパッツ病、拳闘家認知症、ピック病、タウオパチー、シヌクレイン病、並びにそれらの組合せからなる群から選択される神経変性疾患によって引き起こされる、請求項22から27に記載の方法。

【請求項30】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質に加えて、治療有効量の血清又は血漿タンパク質を患者に投与する工程を更に含む、請求項22から29に記載の方法。

【請求項31】

血清又は血漿タンパク質が、アルブミン、アルファ-1アンチトリプシン/アルファ-1プロテイナーゼ阻害剤、アンチトロンビン、ポリクローナル免疫グロブリン、多特異性免疫グロブリン、C1エステラーゼ阻害剤、トランスサイレチン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項30に記載の方法。

【請求項32】

血清又は血漿タンパク質と、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質とが、単位的な剤形として投与される、請求項30から31に記載の方法。

【請求項33】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質に加えて、治療有効量の神経形成又は神経栄養化合物又は分子を投与する工程を更に含む、請求項22から32に記載の方法。

【請求項34】

神経形成又は神経栄養化合物又は分子が、NGFスーパーファミリーのメンバー、TGF-βスーパーファミリーのメンバー、ニューロカインスーパーファミリーのメンバー、神経栄養ペプチド、Rhoキナーゼ阻害剤、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項33に記載の方法。

【請求項35】

神経形成又は神経栄養化合物又は分子と、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質とが、単位的な剤形として投与される、請求項33から34に記載の方法。

【請求項36】

【請求項37】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、それを必要とする患者に、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、頭蓋内、肺内、鼻腔内、脊髄内、髄腔内、経皮、経粘膜、経口、膣内、及び直腸内からなる群から選択される投与経路を通して投与される、請求項22から36に記載の方法。

【請求項38】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、神経変性事象によって引き起こされた損傷に局所的に又はその近位に投与される、請求項22から37に記載の方法。

【請求項39】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、患者のトランスフェリンの鉄飽和度を約30%未満に低減させるのに十分な濃度で患者に投与される、請求項22から38に記載の方法。

【請求項40】

患者のトランスフェリンの鉄飽和度が、患者の血清又は血漿の試料中で測定される、請求項39に記載の方法。

【請求項41】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、約5mg/kg～約8400mg/kgの濃度で患者に投与される、請求項22から38に記載の方法。

【請求項42】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質が、複数回投薬レジメンの一部として患者に投与される、請求項22から41に記載の方法。

【請求項43】

トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択される治療有効量のタンパク質と、
少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤と
を含む安定な医薬組成物であって、
トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択される治療有効量のタンパク質が、約25%未満の鉄飽和度を有する、
医薬組成物。

【請求項44】

タンパク質がヒトトランスフェリンである、請求項43に記載の医薬組成物。

【請求項45】

トランスフェリンが血漿由来又は組換えである、請求項43から44に記載の医薬組成物。

【請求項46】

組換えトランスフェリンが、
配列番号3に記載されるアミノ酸配列を含むY188F変異体;
配列番号4に記載されるアミノ酸配列を含むY95F/Y188F変異体;
配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むY426F/Y517F変異体;
及び
これらの組合せ
からなる群から選択される変異体トランスフェリンである、請求項45に記載の医薬組成物。

【請求項47】

トランスフェリンが融合タンパク質のドメインであり、融合パートナーが免疫グロブリンFcドメインである、請求項43から46に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、治療用タンパク質及び再生医療の分野でのその使用に関する。特に、本明細書で開示するのは、トランスフェリン及びラクトフェリンの適用、並びに神経前駆細胞又は神経幹細胞の増殖、誘導、及び/又は分化の促進におけるそれらの使用である。

【背景技術】

【0002】

筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、及びパーキンソン病等の神経変性疾患は、進行性の神経細胞死によって特徴付けられる病気であり、高い罹患率、患者の苦痛、低い生活の質、及び高い死亡率を伴っている。人口統計が徐々に高齢に移行するにつれて、社会における神経変性状態の有病率は急上昇している。期待余命は延び続けており、神経変性状態が、将来の世代の主な死亡原因としてがん及び循環器疾患と肩を並べることが想定される。

【0003】

執筆時点では、例外なく、神経変性疾患の作用を治癒又は逆転させることができる承認された治療は存在しない。ある特定の状況では、疾患の進行を遅延させる承認薬が存在する。例えば、リルゾール(RILUTEK)及びエダラボン(RADICAVA)は、疾患の進行を遅延させる、筋萎縮性側索硬化症の治療に承認された2つの療法であるが、疾患が一旦発症したら、該分子はその症状を逆転させることはない。

【0004】

治癒的な療法がないことを考慮すれば、商業的に承認された大半の治療が、対症療法、とりわけ、パーキンソン病及び運動障害にはドーパミン作動性治療、認知症の行動的及び心理的症状には抗精神病薬、並びに疼痛の対処には鎮痛薬等、に焦点を合わせていることは驚くには当たらない。

【0005】

神経保護は、神経変性疾患の対処に対する代替の非回復的手法である。科学文献及び特許文献には、神経変性疾患によって引き起こされる損傷を制限し、その衰弱進行を遅らせようとする神経保護化合物及び分子についての報告が多数存在する。

【0006】

そのような一例は、Grifols Worldwide Operations Ltd社名義の米国特許公開第2016008437号であり、これは、幾つかの変性疾患状態において低酸素誘導因子(HIF)の活性を調節することによって神経保護作用を発揮するものとして、アポ-トランスフェリンとホロ-トランスフェリンとの混合物を開示している。同様に、HealthPartners Research Foundation社の国際特許出願公開番号WO2006/20727は、虚血患者における再灌流の有害作用に対する神経保護応答を誘発するために低酸素誘導因子-1αのモジュレーターとしてデフォロキサミンを使用することを提案している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】米国特許公開第2016008437号

【特許文献2】国際特許出願公開番号WO2006/20727

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ceriottiら、Improved direct specific determination of serum iron and total iron-binding capacity Clin Chem. 1980、26(2)、327～31頁

【非特許文献2】Manleyら、Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 2009、14、61～74頁

【非特許文献3】L von Bonsdorffら、Transferrin、第21章、301～310頁、Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use、J. Bertoliniら編、Wiley、2013 [印刷物ISBN:9780470924310 オンラインISBN:9781118356807]

【非特許文献4】Arvidssonら、2002、Nat. Med.、8、963～970頁

【非特許文献5】Kokaia及びLindvall、2003、Curr. Opin. Neurobiol.、13、127～132頁

【非特許文献6】Kernieら、2010、Neurobiol. Disease、37、267～274頁

【非特許文献7】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第21版、2005、D.B. Troy編、Lippincott Williams & Wilkins、フィラデルフィア

【非特許文献8】Encyclopedia of Pharmaceutical Technology、J. Swarbrick及びJ. C. Boylan編、1988～1999、Marcel Dekker、ニューヨーク

【非特許文献9】Pfeifferら、Am J Clin Nutr 2017、106(補遺)、1606S～14S

【非特許文献10】Agholme、2010. J. of Alzheimer's Disease. 第20巻:1p069～108

【非特許文献11】Dybergら、2017. PNAS 第114巻(32)、E6603～E6612

【非特許文献12】Dayemら. Biologically synthesized silver nanoparticles induce neuronal differentiation of SH-SY5Y cells via modulation of reactive oxygen species, phosphatases, and kinase signaling pathways. Biotechnol. J. 2014、9、934～943頁

【非特許文献13】Fagerstromら. Protein Kinase C-epsilon Implicated in Neurite Outgrowth in Differentiating Human Neuroblastoma Cells. Cell Growth & Differentiation 第7巻、775～785頁、1996年6月

【非特許文献14】Yuanら The Mood Stabilizer Valproic Acid Activates Mitogen-activated Protein Kinases and Promotes Neurite Growth. JBC 第276巻、第34号、8月24日発行、31674～31683頁、2001

【非特許文献15】Tatroら Modulation of Glucocorticoid Receptor Nuclear Translocation in Neurons by Immunophilins FKBP51 and FKBP52: Implications for Major Depressive Disorder. Brain Res. 2009年8月25日; 1286: 1～12頁

【非特許文献16】Laifenfeldら Norepinephrine alters the expression of genes involved in neuronal sprouting and differentiation: relevance for major depression and antidepressant mechanisms. Journal of Neurochemistry、2002、83、1054～1064頁

【非特許文献17】Cavarecら In Vitro Screening for Drug-Induced Depression and/or Suicidal Adverse Effects: A New Toxicogenomic Assay Based on CE-SSCP Analysis of HTR2C mRNA Editing in SH-SY5Y Cells. Neurotoxicity Research. 2013年1月、第23巻、第1号、49～62頁

【非特許文献18】Jamsaら The retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor differentiated SH-SY5Y cell line as a model for Alzheimer's disease-like tau phosphorylation. Biochemical and Biophysical Research Communications 319 (2004) 993～1000頁

【非特許文献19】Seidelら Induced Tauopathy in a Novel 3D-Culture Model Mediates Neurodegenerative Processes: A Real-Time Study on Biochips. PLOS One. (2012年11月)第7巻第11号. e49150

【非特許文献20】Karchら Extracellular Tau Levels Are Influenced by Variability in Tau That Is Associated with Tauopathies. JBC 第287巻、第51巻、42751～42762頁、2012年12月14日

【非特許文献21】Pettiferら Guanosine protects SH-SY5Ycells against b-amyloid-induced apoptosis. NeuroReport 2004 15(5):833～836頁

【非特許文献22】Taniiら Alzheimer's Disease Presenilin-1 Exon 9 Deletion And L250s Mutations Sensitize SH-SY5Y Neuroblastoma Cells To Hyperosmotic Stress-Induced Apoptosis. Neuroscience 第95巻、第2号、593～601頁、2000

【非特許文献23】Liら Beta-amyloid induces apoptosis in human-derived neurotypic SH-SY5Y cells. Brain Res. 1996年11月4日;738(2):196～204頁

【非特許文献24】Leeら Hexanucleotide Repeats in ALS/FTD Form Length-Dependent RNA Foci, Sequester RNA Binding Proteins, and Are Neurotoxic. Cell Reports 5、1178～1186頁、2013年12月12日

【非特許文献25】Fargら C9ORF72, implicated in amytrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia, regulates endosomal trafficking. Human Molecular Genetics、2014、第23巻、第13号

【非特許文献26】Nonakaら Phosphorylated and ubiquitinated TDP-43 pathological inclusions in ALS and FTLD-U are recapitulated in SH-SY5Y cells. FEBS Letters 583 (2009) 394～400頁

【非特許文献27】Xingら Protective effects and mechanisms of Ndfipl on SH-SY5Y cell apoptosis in an in vitro Parkinson's disease model. Genetics and Molecular Research 15 (2): gmr.15026963

【非特許文献28】Jungら Rosiglitazone protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against MPP+ induced cytotoxicity via inhibition of mitochondrial dysfunction and ROS production. Journal of the Neurological Sciences 253 (2007) 53～60頁

【非特許文献29】Choiら Signaling Pathway Analysis of MPP+-treated Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells. Biotechnology and Bioprocess Engineering 19: 332～340頁(2014)

【非特許文献30】Palomoら Silencing of frataxin gene expression triggers p53-.dependent apoptosis in human neuron-like cells. Human Molecular Genetics、2011、第20巻、第14号 2807～2822頁

【非特許文献31】Banez-Coronelら A Pathogenic Mechanism in Huntington's Disease Involves Small CAG-Repeated RNAs with Neurotoxic Activity. Neuroscience Research 第53巻、第3号、2005年11月、241～249頁

【非特許文献32】Vidoniら Resveratrol protects neuronal-like cells expressing mutant Huntingtin from dopamine toxicity by rescuing ATG4-mediated autophagosome formation. Neurochemistry International 117 (2018) 174～187頁

【非特許文献33】Vidoniら Dopamine exacerbates mutant Huntingtin toxicity via oxidative mediated inhibition of autophagy in SH-SY5Y neuroblastoma cells: Beneficial effects of anti-oxidant therapeutics. Neurochemistry International 101 (2016) 132～143頁

【非特許文献34】Olsenら Examination of mesenchymal stem cell-mediated RNAi transfer to Huntington's disease affected neuronal cells for reduction of huntingtin. Molecular and Cellular Neuroscience 49 (2012) 271～281頁

【非特許文献35】Azari及びReynolds、「In Vitro Models for neurogenesis」. Cold Spring Harb Perspect Biol 2016、8、a021279

【非特許文献36】Silvaら、2009. Biochimica et Biophysica Acta、第1794巻、1449～1458頁

【非特許文献37】Chowdhuryら、2013. ACS Chem. Biol. 第8巻、1488頁

【非特許文献38】Houltonら、2019. Frontiers in Neurosci.、第13巻、論文790

【非特許文献39】Weissmiller及びWu、2012. Translational Neurodegeneration、第1巻:14

【非特許文献40】Apfel、2001. Clin Chem Lab Med.、第39巻(4)、351頁

【非特許文献41】Sedelisら、Behavioural Brain Research 125 (2001)、109～122頁

【非特許文献42】; Przedborski及びVila、Clinical Neuroscience Research 1 (2001)、407～418頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上記にもかかわらず、神経変性疾患及び状態の衰弱作用を治癒又は逆転させるポテンシャルを有する臨床候補には不十分であることは一目瞭然である。承認された臨床療法は、疾患の症状に対処することに限られており、神経保護作用及び経路を介する状態の進行を遅らせることに留まらない治療に対するニーズは依然として満たされていない。神経損傷を治癒させる又は少なくとも部分的に逆転させる能力を有する革新的技術は未だに実現されておらず、したがって極めて望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0010】

「含む(comprise)/含むこと(comprising)」という単語及び「有すること(having)/含むこと(including)」という単語は、本発明に関連して本明細書で使用される場合、述べられた特徴、完全体、工程、又は成分の存在を指定するために使用されるが、1つ若しくは複数の他の特徴、完全体、工程、成分、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。

【0011】

本明細書に開示される特定の実施形態は単独で読まれるべきではないこと、及び本明細書は、開示される実施形態が個々に読まれるのではなく、互いに組み合わせて読まれることを意図していることを、当業者であれば理解するはずである。したがって、各実施形態は、本明細書に開示される他の実施形態を修正する又は制限するための基礎としての役割を果たすことがある。

【0012】

濃度、量、及び他の数値データは、本明細書において範囲の形式で表現又は提示されていることがある。そのような範囲の形式は、便宜上及び簡潔さのために使用されるに過ぎず、よってその範囲の限界として明記された数値だけを含むのでなく、その範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲も、各数値及び部分範囲が明記されているかのように含まれると柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例示として、「10～100」の数値範囲は、10～100の明記された値だけを含むのではなく、表示範囲内の個々の値及び部分範囲も含むと解釈されるべきである。よって、この数値範囲に含まれるのは、10、11、12、13...97、98、99、100等の個々の値、並びに10～40、25～40、及び50～60等の部分範囲である。この同じ原則が、「少なくとも10」等の1つの数値しか記載していない範囲に適用される。更に、そのような解釈は、範囲の幅又は記載されている特性に係わりなく適用されるものとする。

【0013】

治療方法
第1の態様では、本発明は、神経変性事象を被っている患者における新たな神経細胞の生成を促進する及び/又は誘導する方法であって、それを必要とする患者に、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択される治療有効量のタンパク質を投与する工程を含む方法を提供する。

【0014】

当業者であれば、非常に多い哺乳動物鉄結合タンパク質のうち、トランスフェリン及びラクトフェリンが61%の配列同一性を有するトランスフェリンファミリーの関連タンパク質であることを理解するであろう。幾つかの重複する機能及び補完的機能に加えて、トランスフェリン及びラクトフェリンは、幾つかの相互に排他的な機能も示す。本発明は、その範囲内に全ての野生型哺乳動物トランスフェリンタンパク質を含むが、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含むヒトトランスフェリン(UniProtKB配列番号Q06AH7)が特に好ましい。同様に、本発明は、その範囲内に全ての野生型哺乳動物ラクトフェリンタンパク質を含むが、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含むヒトラクトフェリン(UniProtKB配列番号P02788)が特に好ましい。

【0015】

野生型トランスフェリンタンパク質は、2つの相同なローブ(N-及びC-ローブ)を含有し、各ローブが単一の鉄原子に結合する。したがって、各野生型トランスフェリン分子は、分子当たり2つまでの鉄原子又はイオンに結合することができる。同様に、各野生型ラクトフェリン分子は、類似した様式で分子当たり2つの鉄原子に結合することができる。

【0016】

トランスフェリン及びラクトフェリンは、自然源から抽出することができるか、又は代替的に組換え生産/製造プロセスを使用して製造することもできる。適切な自然源は、それぞれヒト血漿又はヒト乳汁であり得る。

【0017】

「トランスフェリン」とは、本明細書では治療有効量の:
・野生型(哺乳動物、好ましくはヒト)トランスフェリンタンパク質、
・その機能的変異体、
・その機能的断片、又は
・それらの組合せ
を意味すると解釈される。

【0018】

トランスフェリン、その機能的変異体、又はその機能的断片の鉄飽和度は約50%以下であってもよい。好ましくは、鉄飽和度は約40%以下である。一実施形態では、鉄飽和度は約30%以下である。例えば、鉄飽和度は、約20%以下、例えば、約10%以下であってもよい。幾つかの実施形態では、鉄飽和度は約5%以下である。尚更なる実施形態では、鉄飽和度は約1%未満であってもよい。いかなる誤解も避けるために、本明細書でX%未満と提示される範囲には0～X%が含まれ、すなわち、鉄が全く結合していないトランスフェリン、0%の鉄飽和度が含まれる。

【0019】

本明細書で使用される場合、「アポ-トランスフェリン」とは、1%未満の鉄飽和度を有するトランスフェリンを意味するものとする。同様に、「ホロ-トランスフェリン」とは、99%以上の鉄飽和度を有するトランスフェリンを意味するものとする。

【0020】

当業者であれば、既知のトランスフェリン濃度を有する試料中の総鉄レベルを定量することによって、過度の負担なくトランスフェリンの鉄飽和レベルを容易に決定することができることを理解するであろう。試料中の総鉄レベルは、当技術分野で公知の幾つかの方法のうちのいずれか1つによって測定することができる。

【0021】

適切な例として、以下のものが挙げられる:
・比色アッセイ - 鉄は、フェロジンと酢酸緩衝液中のFe²⁺との間の反応において形成された紫色の錯体の強度を562nmで測定することによって定量化する。チオ尿素又は他の化学物質をCu²⁺等の汚染金属と錯体を形成するために添加することがあり、それはフェロジンにも結合し、鉄の値が誤って高くなることがある。Ceriottiら、Improved direct specific determination of serum iron and total iron-binding capacity Clin Chem. 1980、26(2)、327～31頁(その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
・誘導結合プラズマ原子発光分光分析法(ICP-AES) - 試料中の金属の質量百分率を定量化する発光分光法である。ICP-AESは、プラズマ(陽イオン及び自由電子からなるイオン化気体)を使用して試料中の金属原子/イオンを励起し、その特定の金属に典型的な電磁放射線の発光波長を分析することに基づいている。この技法は、当業者の技術常識の範囲内の標準的な分析法ではあるが、ICP-AESについての更なる情報は、Manleyら、Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 2009、14、61～74頁(その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)に見出すことができる。

【0022】

本発明の治療方法を目的として試料の鉄含有量を決定する好ましい方法は、ICP-AESである。次いで、トランスフェリンタンパク質濃度、試料の総鉄含有量、及び野生型トランスフェリンが2つの鉄結合部位を有することに基づいて、トランスフェリンの鉄飽和度を算出する。野生型ヒトトランスフェリン(分子量79,750)は、2つの鉄原子に結合することができるので、1gのトランスフェリンを含有する試料は1.4mgの鉄によって100%飽和することとなる。

【0023】

特定の試料のトランスフェリン濃度がわからない場合、それは種々のよく特徴付けられた免疫学的(ELISA、比濁法)及び非免疫学的方法(吸光度、AU480化学アッセイ)によって容易に決定することができる。

【0024】

執筆時点では、トランスフェリンは、世界のいずれの主要管轄区域でも医薬として認可されていない。したがって、トランスフェリンには薬局方モノグラフが存在していない。鉄飽和度等のトランスフェリンの物理的性質についての更なる情報は、当業者が参考にする主な参考書から得ることができる。L von Bonsdorffら、Transferrin、第21章、301～310頁、Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use、J. Bertoliniら編、Wiley、2013 [印刷物ISBN:9780470924310 オンラインISBN:9781118356807]を参照されたい。その内容は参照により本明細書に組み込まれ、当業者の技術常識の範囲内であるとみなされる。

【0025】

「ラクトフェリン」とは、本明細書では治療有効量の:
・野生型(哺乳動物、好ましくはヒト)ラクトフェリンタンパク質、
・その機能的変異体、
・その機能的断片、又は
・それらの組合せ
を意味すると解釈される。

【0026】

ラクトフェリン、その機能的変異体、又はその機能的断片の鉄飽和度は約50%以下であってもよい。好ましくは、鉄飽和度は約40%以下である。一実施形態では、鉄飽和度は約30%以下である。例えば、鉄飽和度は、約20%以下、例えば、約10%以下であってもよい。幾つかの実施形態では、鉄飽和度は約5%以下である。尚更なる実施形態では、鉄飽和度は約1%未満であってもよい。

【0027】

本明細書で使用される場合、「アポ-ラクトフェリン」とは、1%未満の鉄飽和度を有するラクトフェリンを意味するものとする。同様に、「ホロ-ラクトフェリン」とは、99%以上の鉄飽和度を有するラクトフェリンを意味するものとする。ラクトフェリンの鉄含有量及び飽和レベルは、上で詳細に考察したトランスフェリンのものと同様に測定することができる。

【0028】

トランスフェリン及びラクトフェリンという用語の使用において、本明細書は、その範囲内にトランスフェリン及びラクトフェリンの組換え誘導体を含んでおり、それらの組換え誘導体は、組換えタンパク質の構造又は疎水性親水性指標の性質を野生型タンパク質に対して実質的に変えるおそれのない1つ若しくは複数の置換、1つ若しくは複数の欠失、又は1つ若しくは複数の挿入で、配列番号1及び2にそれぞれ略述したヒトタンパク質の野生型アミノ酸配列と異なっている。本発明の範囲内のトランスフェリン及びラクトフェリンの組換えバリアントは、加えて、PEG化、グリコシル化、ポリシアリル化、又はそれらの組合せ等の少なくとも1つの翻訳後修飾を含んでもよい。

【0029】

一実施形態では、本発明は、配列番号1及び2における野生型タンパク質に対して1つ又は複数の保存的置換を有する、トランスフェリン及びラクトフェリンの組換えバリアントを企図している。「保存的置換」とは、あるアミノ酸が同様の性質を有する別のアミノ酸に置換されたものであって、ペプチド化学の当業者であれば、そのポリペプチドの二次構造及び疎水性親水性指標の性質が実質的に変化しないと予測するような別のアミノ酸に置換されたものである。一般に、以下のアミノ酸の群の中での変化は、保存的変化を表す:(1) ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr; (2) cys、ser、tyr、thr; (3) val、ile、leu、met、ala、phe; (4) lys、arg、his; 及び(5) phe、tyr、trp、his。

【0030】

例えば、本発明の治療方法の範囲内の組換えトランスフェリン又はラクトフェリンは、それぞれ配列番号1及び配列番号2に略述した野生型ヒトトランスフェリン及びヒトラクトフェリンタンパク質と少なくとも90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の相同性を有し得る。

【0031】

更なる実施形態では、本発明は、それらの構造を維持するが、該タンパク質が鉄結合ドメイン、例えば、N-ローブ、C-ローブの一方若しくは他方、又はそれらの組合せに鉄を結合させない、特定の変異型のトランスフェリン及び/又はラクトフェリンを含む。

【0032】

本発明の範囲内のトランスフェリン変異体には、限定するものではないが、以下が含まれる:
i) Y188F変異体Nローブ(配列番号3);
ii) Y95F/Y188F変異体Nローブ(配列番号4);及び
iii) Y426F/Y517F変異体Cローブ(配列番号5)。

【0033】

当業者であれば、組換えタンパク質が、タンパク質の発現、生産、及び精製の技術分野で周知の標準的技法を利用して得ることができることを理解するであろう。目的の組換えタンパク質の核酸配列は、選ばれた宿主細胞、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌での発現に適した任意の発現ベクターに挿入することができる。

【0034】

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語はタンパク質発現構築物を宿主細胞に導入する能力がある実体を指す。幾つかの発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製し、それによってタンパク質発現構築物によるタンパク質発現が増大する。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、それは、追加のDNAセグメントをその中にライゲーションし得る環状二本鎖DNAループを指す。他のベクターとして、コスミド、細菌人工染色体(BAC)及び酵母人工染色体(YAC)、フォスミド、ファージ及びファージミドが挙げられる。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のDNAセグメントをウイルスゲノム中にライゲーションし得る。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞内で自律複製する能力がある(例えば、宿主細胞内で機能する複製開始点を有するベクター)。他のベクターは、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それによって宿主ゲノムと共に複製される。更にまた、ある種の好ましいベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を誘導する能力がある。

【0035】

適切な細菌細胞として、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、シュードモナス属(Pseudomonas spp.)、ストレプトミセス属(Streptomyces spp.)、及びブドウ球菌属(Staphylococcus spp.)が挙げられる。適切な酵母細胞として、サッカロミセス属(Saccharomyces spp.)、ピキア属(Pichia spp.)、及びクリベロマイセス属(Kuyveromyces spp.)が挙げられる。適切な昆虫細胞として、カイコ(Bombyx mori)、ヨトウガ(Mamestra brassicae)、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)、及びキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に由来するものが挙げられる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、限定するものではないが、CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O及びT47D、NS0、CRL7O3O、HsS78Bst、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、ヒトアデノウイルス形質転換293細胞(例えば、HEK293)、PER.C6、マウスL-929細胞、HaKハムスター細胞株、スイス、Balb-c、又はNIHマウス由来のマウス3T3細胞、及びCV-1 細胞株細胞が挙げられる。

【0036】

本発明は、任意の他のタンパク質、タンパク質断片、タンパク質ドメイン、ペプチド、小分子、又は他の化学物質にコンジュゲート又は融合した野生型及び組換えトランスフェリン及びラクトフェリンタンパク質の使用も企図している。例えば、適切な融合又はコンジュゲーションパートナーとして、血清アルブミン(例えば、ウシ、ウサギ、又はヒト)、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子(免疫グロブリンFcドメインが含まれる)、チログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド、若しくは他の病原性細菌からのトキソイド、又は弱毒化毒素誘導体、サイトカイン、ケモカイン、グルカゴン様ペプチド-1、エキセンディン-4、XTEN、或いはそれらの組合せが挙げられる。

【0037】

本発明の一実施形態では、本発明の方法に使用されるトランスフェリン及びラクトフェリンタンパク質は、向上したin-vivo半減期を有する融合タンパク質であり、この場合、
・野生型(哺乳動物、好ましくはヒト)トランスフェリン又はラクトフェリンタンパク質が、免疫グロブリンFcドメイン及びアルブミンから選択される融合パートナーに融合している;又は
・本発明の方法の範囲内の変異体トランスフェリン又はラクトフェリンタンパク質が、免疫グロブリンFcドメイン及びアルブミンから選択される融合パートナーに融合している。

【0038】

一実施形態では、好ましい融合パートナーは免疫グロブリンFcドメインである。例えば、免疫グロブリンFcドメインは、定常重鎖免疫グロブリンドメインの少なくとも一部分を含んでもよい。定常重鎖免疫グロブリンドメインは、好ましくは、CH2及びCH3ドメインと任意選択でヒンジ領域の少なくとも一部分とを含むFc断片である。免疫グロブリンFcドメインは、IgG、IgM、IgD、IgA、若しくはIgE免疫グロブリンFcドメイン、又はそれらに由来する修飾免疫グロブリンFcドメインであってもよい。好ましくは、免疫グロブリンFcドメインは、定常IgG免疫グロブリンFcドメインの少なくとも一部分を含む。IgG免疫グロブリンFcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4 Fcドメイン、又はそれらの修飾Fcドメインから選択されてもよい。

【0039】

一実施形態では、融合タンパク質は、IgG1 Fcドメインに融合したトランスフェリンを含んでもよい。一実施形態では、融合タンパク質は、IgG1 Fcドメインに融合したトランスフェリン変異体を含んでもよい。

【0040】

神経変性事象
驚くべきことに、本発明者らは、トランスフェリン及びラクトフェリンが神経前駆細胞及び/又は神経幹細胞からの神経細胞の発生を刺激するのに極めて有効であったという点で、両方のタンパク質が鉄の結合/細胞への鉄の送達以外に予想外の治療的役割を有することを発見した。よって、本発明は、神経変性事象を被っている患者における神経細胞の発生を刺激する方法であって、
それを必要とする患者に、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択される治療有効量のタンパク質を投与する工程を含む方法を提供する。

【0041】

本明細書で使用される場合、「神経細胞の発生を刺激すること」という用語は、トランスフェリン又はラクトフェリンが、新たな神経細胞を産生するように患者における神経前駆細胞及び/又は神経幹細胞に直接的又は間接的作用を及ぼすことを意味するために利用される。本発明の一般性を限定することを望むものではないが、トランスフェリン又はラクトフェリンを投与すると、トランスフェリン又はラクトフェリンに曝されなかった神経前駆細胞/神経幹細胞と比較して、
i) 患者内の神経前駆細胞及び/若しくは神経幹細胞の増殖、又は
ii) 神経前駆細胞及び/若しくは神経幹細胞の分化を誘導して、分化した神経細胞にすること
のうちの少なくとも1つが、結果的に増大すると推察される。

【0042】

「神経細胞」とは、本明細書では、限定するものではないが、グリア細胞、及び神経細胞を含む神経系の全ての細胞が含まれる。一実施形態では、本発明の方法で言及される神経細胞とは神経細胞であり、トランスフェリン及びラクトフェリンは、新たな神経細胞の神経形成を増強する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「神経変性事象」という用語は、神経細胞の構造及び/又は機能の喪失を引き起こし、神経細胞の死滅を含む事象を指す。該事象は、即座の神経細胞の損傷又は死滅を引き起こす孤立した単発の事象/発生であり得る。或いは、該事象は、神経細胞の損傷又は死滅のレベルの増加を徐々に招く、連続的又は慢性の事象であり得る。特定の実施形態では、神経変性事象は、脳及び/又は脊髄において構造の喪失、機能の喪失、又は神経細胞(又はニューロン)の死滅を引き起こし、脳及び/又は脊髄における損傷及び機能障害をもたらす。

【0044】

一実施形態では、神経変性事象は神経変性疾患によって引き起こされる。「神経変性疾患」とは、脳、脊髄、中枢神経系、及び/又は末梢神経系における神経機能の喪失に至るニューロンの機能障害及び/又は死滅によって特徴付けられる任意の疾患を意味する。本発明の範囲内の神経変性疾患は、慢性又は急性であり得る。

【0045】

本発明の範囲内の神経変性疾患の非限定的な例として、パーキンソン病、前頭側頭型認知症、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、びまん性レビー小体病、レビー小体型認知症、脱髄性疾患、例えば、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、大脳皮質基底核神経節変性症、末梢神経障害、進行性核上性麻痺、脊髄小脳変性症、脊髄性運動失調症、フリードライヒ運動失調症、小脳皮質変性症、神経原性筋萎縮症、前角細胞変性、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症、亜急性硬化性全脳炎、ハラーホルデン・スパッツ病、拳闘家認知症、ピック病、タウオパチー、シヌクレイン病、並びにそれらの組合せが挙げられる。

【0046】

一実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、及びハンチントン病からなる群から選択されてもよい。例えば、神経変性疾患は、パーキンソン病であってもよい。

【0047】

非限定的/非拘束的な理論として、神経変性傷害又は損傷が、神経幹細胞をそのような傷害又は損傷の部位へ移動させることが知られている。Arvidssonら、2002、Nat. Med.、8、963～970頁; Kokaia及びLindvall、2003、Curr. Opin. Neurobiol.、13、127～132頁; 及びKernieら、2010、Neurobiol. Disease、37、267～274頁を参照されたい。本発明者らは、患者内のトランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せの濃度を増加させることによって、そのような分子が身体自体の神経再生修復機序を増強する及び/又は促進することができると推察する。トランスフェリン及びラクトフェリンは、当業者に公知の任意の従来の薬物送達手段によって、神経変性傷害又は損傷の部位へ直接的又は間接的に投与することができる。

【0048】

上の段落内に開示される特定の実施形態は単独で読まれるべきではないこと、及び本明細書は、これらの実施形態が個々に開示されているのではなく、他の実施形態と組み合わせて開示されることを意図していることを、当業者であれば理解するはずである。例えば、開示される実施形態の各々は、実施形態の各々と、又はそこに開示される実施形態の任意の順序の2つ以上と明示的に組み合わされているとして読まれるべきである。

【0049】

併用療法
本発明の方法は、トランスフェリン及び/又はラクトフェリンと併用して補助的な活性化合物及び分子を使用することも企図している。補助的な活性化合物及び分子は、単位剤形として、すなわち、治療しようとする対象への単位的な投薬量として意図される物理的に別個の単位として、トランスフェリン又はラクトフェリンと共に製剤化することができる。或いは、補助的な活性化合物及び分子は、キットオブパーツとして提供することができ、:
・トランスフェリン及び/若しくはラクトフェリンとは別々に段階的な若しくは連続的な投薬パターンで投与される;又は
・異なる剤形から同時に共投与される。

【0050】

例えば、本発明の方法は、トランスフェリン及び/又はラクトフェリンと併用して他の血清又は血漿ベースのタンパク質を投与することを企図している。本発明の範囲内の血清又は血漿タンパク質には、ヒト血漿等の適切な血漿源から精製されたもの、及び組換え製造技法を使用して調製されたものが含まれる。例えば、血清又は血漿タンパク質は、アルブミン(例えば、ALBUTEIN)、アルファ-1アンチトリプシン/アルファ-1プロテイナーゼ阻害剤(例えば、PROLASTIN)、アンチトロンビン(例えば、THROMBATE III)、ポリクローナル免疫グロブリン(IgG、IgA、及びそれらの組合せ)、多特異性免疫グロブリン(IgM)、C1エステラーゼ阻害剤(例えば、BERINERT)、トランスサイレチン、及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。

【0051】

本発明の範囲内の例示的なポリクローナル免疫グロブリンとして、市販されるポリクローナルIgG製剤、例えば、FLEBOGAMMA DIF 5%及び10%、GAMUNEX-C 10%、BIVIGAM 10%、GAMMAGARD Liquid 10%等が挙げられる。

【0052】

本発明の範囲内の例示的な多特異性免疫グロブリン(IgM)として、多特異性IgMを含有する市販される免疫グロブリン製剤、例えば、PENTAGLOBIN又はTRIMODULINが挙げられる。

【0053】

一実施形態では、血清又は血漿タンパク質は、アルブミン、アンチトロンビン、アルファ-1アンチトリプシン、C1エステラーゼ阻害剤、及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。例えば、血清又は血漿タンパク質は、アンチトロンビン、アルファ-1アンチトリプシン、及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。特定の実施形態では、治療有効量のアルファ-1アンチトリプシンが、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質に加えて患者に投与される。特定の実施形態では、治療有効量のアンチトロンビンが、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質に加えて患者に投与される。

【0054】

本発明の方法はまた、既知の神経形成/神経栄養化合物及び分子を、トランスフェリン及び/又はラクトフェリンと併用して投与することを提供する。例えば、本発明の方法は、神経形成/神経栄養タンパク質、ペプチド、及び小分子を、トランスフェリン及び/又はラクトフェリンと共に投与することを企図している。

【0055】

適切な神経形成及び/又は神経栄養化合物及び分子は、BDNF(脳由来神経栄養因子;NGFスーパーファミリー;配列番号6)、GNDF(グリア細胞株由来神経栄養因子;TGF-βスーパーファミリー;配列番号7)、CNTF(毛様体(cilliary)神経栄養因子-1;ニューロカインスーパーファミリー;配列番号8)、PACAP(脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドのアミノ酸1～38;配列番号9)、Y-27632及び薬学的に許容されるその塩[trans-4-[(1R)-1-アミノエチル]-N-4-ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミド]、ファスジル及び薬学的に許容されるその塩[ヘキサヒドロ-1-(5-イソキノリニル-スルホニル)-1H-1,4-ジアゼピン]、並びにそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。

【0056】

当業者であれば、本発明が、上に列挙した化合物及び分子の各々の、トランスフェリン及びラクトフェリンの各々への共有結合コンジュゲートもその範囲内に企図していることを理解するであろう。更に、本発明が、上に列挙したタンパク質及びペプチドの各々の、トランスフェリン及びラクトフェリンの各々との組換え融合タンパク質もその範囲内に企図していることを理解するであろう。

【0057】

一実施形態では、トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せは、本発明の治療方法に利用される総タンパク質含有量の少なくとも20重量%を構成してもよい。例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せは、本発明の併用療法に利用される総タンパク質含有量の約30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、93重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、又は99重量%以上を構成してもよい。

【0058】

【0059】

本発明の医薬組成物
更なる態様では、本発明はまた、神経変性事象を被っている患者における新たな神経細胞の生成に使用するための、トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せを含む医薬組成物を提供する。

【0060】

本発明の医薬組成物は、少なくとも1つの薬学的に許容される担体を任意選択で更に含んでもよい。少なくとも1つの薬学的に許容される担体は、補助剤及びビヒクルから選択されてもよい。少なくとも1つの薬学的に許容される担体には、所望の特定の剤形に適した、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、他の液体ビヒクル、分散助剤、懸濁助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤、乳化剤、保存剤が含まれる。

【0061】

適切な担体は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第21版、2005、D.B. Troy編、Lippincott Williams & Wilkins、フィラデルフィア、及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology、J. Swarbrick及びJ. C. Boylan編、1988～1999、Marcel Dekker、ニューヨーク(それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。そのような担体又は希釈剤の好ましい例として、限定するものではないが、水、生理食塩水、リンゲル液、グリコール、デキストロース溶液、緩衝液(リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、及びソルビン酸カリウム等)、及び5%ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば、飽和植物性脂肪酸のグリセリド混合物、及び不揮発性油(ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びダイズ油等)も、投与経路に応じて使用されてもよい。

【0062】

本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように製剤化される。全身的使用の場合、本発明の医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、脳内、頭蓋内、肺内、鼻腔内、脊髄内、髄腔内、経皮、経粘膜、経口、膣内、及び直腸内からなる群から選択される従来の経路による投与のために製剤化することができる。

【0063】

一実施形態では、非経口投与が好ましい投与経路である。医薬組成物は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、密封された袋、又は複数回投与バイアルに封入されてもよい。一実施形態では、静脈注射としての投与が好ましい投与経路である。製剤は、点滴によって連続的に、又はボーラス注射によって投与することができる。

【0064】

本発明の医薬組成物は、単位剤形(unit dosage unit form)として、すなわち、治療しようとする対象への単位的な投薬量として意図される物理的に別個の単位として提供されてもよい。

【0065】

注射用の使用に適した医薬組成物として、滅菌水性液剤(水溶性の場合)又は分散剤、及び滅菌注射用液剤又は分散剤を即時調製するための滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与の場合、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、CREMOPHOR EL、又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。全ての場合において、組成物は滅菌されていなければならず、且つ容易な注射針通過性が存在する程度に流動的であるべきである。

【0066】

本発明の組成物は、製造及び保存の条件下で安定であるべきである。更にまた、組成物は、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、及び適切なそれらの混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。

【0067】

微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって実現することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖類(例えば、マンニトール、ソルビトール等)、多価アルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを含めることによってもたらすことができる。

【0068】

本発明の医薬組成物の滅菌注射用溶液は、必要量の活性分子を適正な溶媒中に上で考察したような成分のうちの1つ又は組合せと共に組み込み、続いて滅菌濾過することによって調製することができる。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末剤の場合、調製方法として真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられ、それによって活性成分に任意の所望の追加成分を加えた粉末が、事前に滅菌濾過したその溶液から得られる。

【0069】

任意の従来の媒体又は薬剤が本発明の活性分子と不適合である場合を除いて、組成物中でのそれらの使用は、本発明の範囲内であることが企図される。

【0070】

一実施形態では、トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せは、本発明の医薬組成物の総タンパク質含有量の少なくとも20重量%を構成してもよい。例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せは、本発明の医薬組成物の総タンパク質含有量の約30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、75重量%、80重量%、85重量%、90重量%、93重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、又は99重量%以上を構成してもよい。

【0071】

【0072】

投薬
上で考察したように、本発明者らは、神経変性傷害又は損傷の部位の近位のトランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せの濃度を増加させることによって、そのような分子が身体自体の神経再生修復機序を増強する及び/又は促進することができると推察する。トランスフェリン及びラクトフェリンは、当業者に公知の任意の従来の薬物送達手段によって神経変性傷害又は損傷の部位に直接的又は間接的に投与することができるであろう。例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せは、脳内、頭蓋内、脊髄内、及び髄腔内からなる群から選択される従来の経路によって、神経変性事象によって引き起こされた損傷に局所的に又はその近位に投与することができるであろう。例えば、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せは、外科的介入の間に局所的に投与されてもよい。

【0073】

或いは、トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せは、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、肺内、鼻腔内、経皮、経粘膜、経口、膣内、及び直腸内からなる群から選択される投与経路によって、神経変性傷害又は損傷の部位に間接的に送達することができるであろう。

【0074】

いかなる誤解も避けるために、本明細書ではトランスフェリンの鉄飽和度レベルを2つの別々の異なる文脈で述べていることをこの場で明確にしておく:
a) 第1の文脈では、略述したように、本明細書は、患者に投与しようとする医薬組成物中の精製された外因性トランスフェリンの鉄飽和度について述べている。この場合では、精製された外因性トランスフェリンの鉄飽和度レベルは、誘導結合プラズマ原子発光分光分析を使用して決定することができる(しかし、比色法等の他の方法も使用することができる)。
b) すぐこの後でより詳細に考察する第2の文脈では、本明細書は、外因性トランスフェリンを含有する医薬組成物が患者に投与された後の、患者における、すなわち患者の血漿又は血清中の、生理的トランスフェリンの鉄飽和度を測定することについて述べている。

【0075】

通常の生理的条件下では、血漿中の実質的に全ての鉄はトランスフェリンに結合しており、得られる生理的トランスフェリンの鉄飽和度はおよそ30%である。実施例6(下記参照)において、本発明者らは、30%未満の鉄飽和度を有するトランスフェリンによって予想外の神経再生作用が得られることを実証した。非限定的な仮説として、外因性トランスフェリン(低い鉄飽和度を有する)を含有する医薬組成物を患者に投与することによって、患者の血漿中のトランスフェリンの生理的濃度が増加し、その結果として生理的トランスフェリンの鉄飽和度が30%未満に低下することになることが想定される。よって、生理的トランスフェリンが神経再生作用を活用することが可能になる。当然、1%未満の鉄飽和度を有する外因性トランスフェリンの方が、鉄飽和度40%を有する外因性トランスフェリンより有効である可能性が高いであろう。

【0076】

したがって、一実施形態では、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質は、患者の(患者の血清又は血漿試料中の)トランスフェリンの鉄飽和度を約30%未満に低減させるのに十分な濃度で患者に投与される。好ましくは、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質は、患者の(患者の血清又は血漿試料中の)トランスフェリンの鉄飽和度を約20%未満、例えば、約10%未満に低減させるのに十分な濃度で患者に投与される。トランスフェリン、ラクトフェリン、又はそれらの組合せは、このレベルの血清又は血漿トランスフェリン鉄飽和度を実現するために、用量調整に基づく投薬レジメンを使用して患者に投与されてもよい。

【0077】

当業者であれば、患者の血清又は血漿中のトランスフェリン鉄飽和度レベルの測定が、上で考察したような比色方法論を使用して典型的に行われる通例のアッセイであることを理解するであろう。血漿又は血清の鉄含有量は、鉄との呈色錯体を形成するための色素源としてフェレン又はフェロジンを用いる比色反応を使用することによって、化学分析器で測定される。分析される試料は、2つの値を生じる:
・試料の鉄含有量(すなわち、試料中のトランスフェリンに結合した鉄)、及び不飽和鉄結合能(UIBC、すなわち、試料中のトランスフェリン上の非占有鉄結合部位の数)。
・総鉄結合能(TIBC)は、試料の鉄含有量とUIBCとの合計である。
・トランスフェリン飽和度(%)は、[(試料の鉄含有量/TIBC)×100]として決定される。

【0078】

患者の血清又は血漿中のトランスフェリン鉄飽和度レベルを測定するための比色アッセイの作業は技術常識であり、更なる情報は、Pfeifferら、Am J Clin Nutr 2017、106(補遺)、1606S～14S(その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)等の様々な文献レビューに見出すことができる。

【0079】

本発明の方法の尚更なる実施形態では、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質は、約5mg/kg～約8400mg/kgの濃度で患者に投与することができる。例えば、約10mg/kg～約7000mg/kg、例えば、約20mg/kg～約6000mg/kg、例えば、約50mg/kg～約5000mg/kg。幾つかの実施形態では、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質は、約50mg/kg～約1000mg/kgの濃度で患者に投与することができる。適切には、該タンパク質は、約50mg/kg～約500mg/kg、例えば、約50mg/kg～約250mg/kg、例えば、約50mg/kg～約150mg/kgの濃度で投与することができる。

【0080】

一実施形態では、本発明の方法は、トランスフェリン、ラクトフェリン、及びそれらの組合せから選択されるタンパク質を、それを必要とする患者に複数回投薬レジメンの一部として投与する工程を含んでもよい。例えば、投与期間の1日目の初回用量に約50mg/kg～約5000mg/kg、続いて複数回投薬の期間中に用量当たり約50mg/kg～約1000mg/kg。例えば、投与期間の1日目の初回用量に約50mg/kg～約1000mg/kg、続いて複数回投薬の期間中に用量当たり約50mg/kg～約500mg/kg。例えば、投与期間の1日目の初回用量に約50mg/kg～約500mg/kg、続いて複数回投薬の期間中に用量当たり約50mg/kg～約250mg/kg。例えば、投与期間の1日目の初回量に約50mg/kg～約250mg/kg、続いて複数回投薬の期間中に用量当たり約50mg/kg～約250mg/kg。複数回投薬の期間は、総累積用量まで約3～約30回の投与を含んでもよい。複数回投薬の期間は、約1～約30週であってもよい。複数回の部分用量が、約1日～約30日の間隔で投与されてもよい。

【0081】

【0082】

本発明の追加的な特徴及び利点は、添付の図面においてより明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0083】

【図1AB】図１Ａ：アポ-トランスフェリンに応答した、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長の誘導を示すグラフである。図１Ｂ：アポ-トランスフェリンに応答した、SH-SY5Y細胞における増殖の誘導を示すグラフである。

【図1CD】図１Ｃ：アポ-トランスフェリンに応答した、SH-SY5Y細胞におけるβ-III-チューブリンタンパク質濃度の増加を示す画像である。図１Ｄ：アポ-トランスフェリンに応答した、SH-SY5Y細胞におけるβ-III-チューブリンタンパク質濃度の増加を示すグラフである。

【図2】初代ヒト神経前駆細胞がβ-III-チューブリンタンパク質陽性ニューロン及びGFAPタンパク質陽性アストロサイト細胞になるのをアポ-トランスフェリンが誘導することを実証するグラフである。

【図3A】アポ-トランスフェリンに対する様々な濃度のメシル酸デフェロキサミンの、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に及ぼす作用をプロットしたグラフである。

【図3B】低減した鉄結合能を有するトランスフェリン変異体の、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長の促進に及ぼす効力を示すグラフである。

【図4】様々な異なるタンパク質の、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に及ぼす作用をプロットしたグラフである。

【図5】プロリルヒドロキシラーゼ阻害剤であるIOX2の、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に及ぼす作用をプロットしたグラフである。

【図6】SH-SY5Y細胞における神経突起伸長の促進におけるトランスフェリンの効力に及ぼす鉄飽和度の役割を示すグラフである。

【図7】他の神経栄養タンパク質/ペプチド断片と併用したアポ-トランスフェリンの、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に及ぼす作用をプロットしたグラフである。

【図8】小分子Y-27632と併用したアポ-トランスフェリンの、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に及ぼす作用をプロットしたグラフである。

【図9】マウスにおけるMPTP誘導性パーキンソン病におけるアポ-トランスフェリンの陽性の再生作用を実証するグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0084】

本発明の詳細な実施例
本明細書に以下に開示される実施例は一般化された実施例を表しているに過ぎず、本発明を再現することができる他の構成及び方法が可能であり、本発明によって包含されることが、当業者には容易に明らかであるはずである。

【実施例1】

【0085】

アポ-トランスフェリン(ApoTf)は、SH-SY5Y細胞において分化及び神経突起伸長を用量応答的に誘導する
トランスフェリンは、細胞培養及びin-vivoにおいて鉄を栄養素として細胞に送達するために利用される。これは、典型的には、ホロ-トランスフェリン(HoloTf)の、トランスフェリン受容体1(TfR1)であるその同族受容体CD71への結合及びそれによるエンドサイトーシスの作用を通して達成される。トランスフェリンは、典型的には、代謝活性を促進し、持続させる手段として鉄を細胞に供給すると考えられている。本発明者らは、驚くべきことに、トランスフェリンタンパク質の非鉄含有型であるアポ-トランスフェリンが、極めて一般的なニューロン研究モデルであるSH-SY5Y細胞の分化を誘導することを見出した。神経細胞分化の誘導は、Agholme、2010. J. of Alzheimer's Disease. 第20巻:1p069～108;及びDybergら、2017. PNAS 第114巻(32)、E6603～E6612の手順に従って、神経突起形成の形態学的パラメーター(神経細胞分化、神経細胞の健康及び機能のマーカーとして典型的に使用される主要な要素)によって評価した。

【0086】

未分化のSH-SY5Y細胞を、96ウェルの透明底プレート中で、0.1%FBSを含有する培地中に播種した。無血清基本培地は、SH-SY5Y細胞の供給業者(Sigma社、カタログ番号94030304-1VL)によって推奨される通りに利用した。細胞の播種から24時間後に、ApoTfの3×ストック溶液(無血清基本培地中の最終濃度はx軸に示す)を細胞に添加した。ApoTfは、プールされたヒト血漿から得て精製し、0.2mg/mLの最終濃度で投薬した。細胞を6日間分化させた。神経突起成長を画像化及び画像解析によって評価した。解析の時点で、Tubulin Tracker (Molecular Probes社、T34075)及びHoechst 33342 (Molecular Probes社 #H3570)核染色剤の10×溶液を調製した。

【0087】

簡潔に述べれば、DMSOに溶解させたTubulin TrackerをPluronic F-127で1:1に希釈し、HBSS中で更に希釈して10×溶液を生成した。Hoechst 33342をHBSS-Tubulin Tracker溶液に10μg/mLで添加して、10×核染色剤を生成した。この10×染色溶液(10μL)を処理済みアッセイウェルに直接添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、110μLの0.4%トリパンブルーをアッセイウェルに直接添加し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。各画像について青(核)及び緑(チューブリン)の蛍光チャネルで9枚の画像/ウェルを取得した。

【0088】

画像を得た後、MetaExpress Neurite Outgrowth解析モジュール(Molecular Devices社)を使用して、細胞、細胞体を特定し、神経突起を定量化した。各試験ウェル中の細胞の数が異なることを考慮して、神経突起の分岐の総数を画像化した細胞の総数で割った。非処理対照細胞を1の値に設定し、全ての他の処理を非処理対照に対して相対的に示すことによって、伸長の倍率変化を決定した。

【0089】

図1Aから、アポ-トランスフェリンが神経突起伸長を用量依存的に誘導することができたことが明白である。アポ-トランスフェリンを徐々に最大0.8mg/mLまで増加させると、SH-SY5Y細胞において伸長応答が向上した。この現象は、主にホロ-又は鉄担持型のトランスフェリンで作用する、トランスフェリンの既知の機能とは直観的に反するものである。

【0090】

図1Bは、アポ-トランスフェリンが細胞数の濃度依存的増加を誘導することを示している。細胞数の増加は、試験した最大用量の0.8mg/mLのアポ-トランスフェリンまでの、細胞増殖の増加を示すものである。

【0091】

図1Cは、0.1mg/mL ApoTfで処理したSH-SY5Y細胞(下のパネル)の、非処理対照(上のパネル)に対する視覚的比較を提供する。左のパネルは、Hoechst 33342での核染色を示す。右の画像は、細胞体及び神経突起のチューブリン染色を示す。図1Cから、ApoTfが、細胞増殖の促進、及びその後の/同時の神経突起/チューブリン伸長の誘導の促進に及ぼす重大な作用を有していたことが明らかである。

【0092】

加えて、図1Dに示すように、アポ-トランスフェリンで処理すると、ニューロンの従来のマーカーである、十分に特徴付けられたβ-III-チューブリンタンパク質の増加が引き起こされたことが見出された。この実験では、SH-SY5Y細胞は、上記のように分化させた。解析の時点で、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、β-III-チューブリン(R&D Systems社、MAB1195)に対して染色し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。画像解析は、β-III-チューブリンが染色された細胞の蛍光強度を評価することによって行った。単独の二次抗体からのバックグラウンドを全ての値から引いた。表示条件での値を「β-III-チューブリン染色強度」として標準偏差と共に示す。

【0093】

SH-SY5Y細胞
「SH-SY5Y細胞」とは、本明細書では、SK-N-SH神経芽細胞腫細胞株に由来するサブクローニングされた細胞株を意味する。この細胞は、特定の化合物を添加することによって様々なタイプの機能的神経細胞に変換することができるので、神経変性障害のモデルとしての役割を果たしている。加えて、SH-SY5Y細胞株は、神経変性過程、神経毒性、及び神経保護に関する神経細胞分化、代謝、及び機能の解析を含めた、実験的な神経学的研究に広く使用されている。

【0094】

本明細書で以降に略述するのは、様々な神経変性障害の予測モデルとしてのSH-SY5Y細胞株に言及する論文審査された引用文献である。この一覧は、本発明者らによる先行技術の承認を構成するものではなく、むしろ神経変性障害の予測モデルとしてのSH-SY5Y細胞株の有用性についての当業者の知識を説明する役割を果たすものである。

【0095】

神経形成
Dayemら. Biologically synthesized silver nanoparticles induce neuronal differentiation of SH-SY5Y cells via modulation of reactive oxygen species, phosphatases, and kinase signaling pathways. Biotechnol. J. 2014、9、934～943頁。
Fagerstromら. Protein Kinase C-epsilon Implicated in Neurite Outgrowth in Differentiating Human Neuroblastoma Cells. Cell Growth & Differentiation 第7巻、775～785頁、1996年6月。

【0096】

気分安定化(うつ病)
Yuanら The Mood Stabilizer Valproic Acid Activates Mitogen-activated Protein Kinases and Promotes Neurite Growth. JBC 第276巻、第34号、8月24日発行、31674～31683頁、2001。
Tatroら. Modulation of Glucocorticoid Receptor Nuclear Translocation in Neurons by Immunophilins FKBP51 and FKBP52: Implications for Major Depressive Disorder. Brain Res. 2009年8月25日; 1286: 1～12頁。
Laifenfeldら Norepinephrine alters the expression of genes involved in neuronal sprouting and differentiation: relevance for major depression and antidepressant mechanisms. Journal of Neurochemistry、2002、83、1054～1064頁。
Cavarecら In Vitro Screening for Drug-Induced Depression and/or Suicidal Adverse Effects: A New Toxicogenomic Assay Based on CE-SSCP Analysis of HTR2C mRNA Editing in SH-SY5Y Cells. Neurotoxicity Research. 2013年1月、第23巻、第1号、49～62頁。

【0097】

タウオパチー(アルツハイマー病、FTD、及び他の異常なTauを伴う神経変性疾患)
Jamsaら The retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor differentiated SH-SY5Y cell line as a model for Alzheimer's disease-like tau phosphorylation. Biochemical and Biophysical Research Communications 319 (2004) 993～1000頁。
Seidelら Induced Tauopathy in a Novel 3D-Culture Model Mediates Neurodegenerative Processes: A Real-Time Study on Biochips. PLOS One. (2012年11月)第7巻第11号. e49150。
Karchら Extracellular Tau Levels Are Influenced by Variability in Tau That Is Associated with Tauopathies. JBC 第287巻、第51巻、42751～42762頁、2012年12月14日。

【0098】

アルツハイマー病
Pettiferら Guanosine protects SH-SY5Ycells against b-amyloid-induced apoptosis. NeuroReport 2004 15(5):833～836頁。
Taniiら Alzheimer's Disease Presenilin-1 Exon 9 Deletion And L250s Mutations Sensitize SH-SY5Y Neuroblastoma Cells To Hyperosmotic Stress-Induced Apoptosis. Neuroscience 第95巻、第2号、593～601頁、2000。
Liら Beta-amyloid induces apoptosis in human-derived neurotypic SH-SY5Y cells. Brain Res. 1996年11月4日;738(2):196～204頁。

【0099】

ALS及び前頭側頭型認知症
Leeら Hexanucleotide Repeats in ALS/FTD Form Length-Dependent RNA Foci, Sequester RNA Binding Proteins, and Are Neurotoxic. Cell Reports 5、1178～1186頁、2013年12月12日。
Fargら C9ORF72, implicated in amytrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia, regulates endosomal trafficking. Human Molecular Genetics、2014、第23巻、第13号。
Nonakaら Phosphorylated and ubiquitinated TDP-43 pathological inclusions in ALS and FTLD-U are recapitulated in SH-SY5Y cells. FEBS Letters 583 (2009) 394～400頁。

【0100】

パーキンソン病
Xingら Protective effects and mechanisms of Ndfipl on SH-SY5Y cell apoptosis in an in vitro Parkinson's disease model. Genetics and Molecular Research 15 (2): gmr.15026963。
Jungら Rosiglitazone protects human neuroblastoma SH-SY5Y cells against MPP+ induced cytotoxicity via inhibition of mitochondrial dysfunction and ROS production. Journal of the Neurological Sciences 253 (2007) 53～60頁。
Choiら Signaling Pathway Analysis of MPP+-treated Human Neuroblastoma SH-SY5Y Cells. Biotechnology and Bioprocess Engineering 19: 332～340頁(2014)。

【0101】

フリードライヒ運動失調症
Palomoら Silencing of frataxin gene expression triggers p53-.dependent apoptosis in human neuron-like cells. Human Molecular Genetics、2011、第20巻、第14号 2807～2822頁。

【0102】

ハンチントン病
Banez-Coronelら A Pathogenic Mechanism in Huntington's Disease Involves Small CAG-Repeated RNAs with Neurotoxic Activity. Neuroscience Research 第53巻、第3号、2005年11月、241～249頁。
Vidoniら Resveratrol protects neuronal-like cells expressing mutant Huntingtin from dopamine toxicity by rescuing ATG4-mediated autophagosome formation. Neurochemistry International 117 (2018) 174～187頁。
Vidoniら Dopamine exacerbates mutant Huntingtin toxicity via oxidative mediated inhibition of autophagy in SH-SY5Y neuroblastoma cells: Beneficial effects of anti-oxidant therapeutics. Neurochemistry International 101 (2016) 132～143頁。
Olsenら Examination of mesenchymal stem cell-mediated RNAi transfer to Huntington's disease affected neuronal cells for reduction of huntingtin. Molecular and Cellular Neuroscience 49 (2012) 271～281頁。

【実施例2】

【0103】

初代ヒト神経前駆細胞におけるβ-III-チューブリン及びGFAPタンパク質濃度に及ぼすApoTfの作用
ApoTfの神経形成作用は、成人の神経形成の別の確立されたモデルである初代ヒト大脳皮質由来神経前駆細胞にも適用する(Azari及びReynolds、「In Vitro Models for neurogenesis」. Cold Spring Harb Perspect Biol 2016、8、a021279を参照されたい)。図2A及び図2Bに示すように、アポ-トランスフェリンは、初代ヒト大脳由来神経前駆細胞の培養物からニューロンに分化した細胞の百分率(β-III-チューブリン陽性細胞%、2A)及びアストロサイトに分化した細胞の百分率(GFAP陽性細胞%、2B)を、アポ-トランスフェリンを含まない細胞に対して劇的に増加させる。

【0104】

ニューロスフェアとして維持された神経前駆細胞は、Lonza社(PT-2599)から得た。ニューロスフェアの凍結バイアルから細胞を解凍し、Human NeuroCult(商標)NS-A Complete Proliferation培地(Stemcell Technologies社)中で2週間培養した。ニューロスフェアを単一の細胞に分離し、アッセイプレートのラミニン被覆ウェルにプレーティングした。神経前駆細胞を、10分の1の濃度の推奨される増殖用補助剤を含有するNeuroCult(商標)NS-A 基本培地中に、ApoTf(0.8mg/mL)の非存在下又は存在下で72時間播種した。解析の時点で、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、β-III-チューブリン(R&D Systems社、MAB1195)及びGFAP(Invitrogen社、PA3-16727)に対して染色し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。画像解析は、β-III-チューブリン又はGFAPについて陽性に染色されている細胞の相対数を評価することによって行った。表示条件での値を、「β-III-チューブリン陽性%」細胞(図2A)又は「GFAP陽性%」細胞(図2B)として標準偏差と共に示す。

【実施例3】

【0105】

鉄キレート化だけがApoTfによる神経形成の作用様式ではない
メシル酸デフェロキサミン(DFO)は、鉄過剰症の臨床診療に利用される小分子の鉄キレート剤である。ApoTfと同様に、DFOは、鉄に対して高い親和性結合定数を有するが、単一の鉄結合部位しか有さない。DFOの神経突起伸長に及ぼす作用について調査した。ApoTfは、その機能的用量曲線の底に近い濃度で試験し、神経突起伸長を誘導するDFOの能力と比較した。2.4μM(0.2mg/mL)で試験したApoTfは2つの鉄結合部位を有することから、単一の鉄結合部位を有する4.8μMのDFOと同等である。

【0106】

未分化のSH-SY5Y細胞は、実施例1に記載したように播種し、処理した。神経突起成長は、画像化及び画像解析によって評価した。解析の時点で、Tubulin Tracker (Molecular Probes社、T34075)及びHoechst 33342 (Molecular Probes社 #H3570)核染色剤の10×溶液を調製した。簡潔に述べれば、DMSOに溶解させたTubulin TrackerをPluronic F-127で1:1に希釈し、HBSS中で更に希釈して10×溶液を生成した。Hoechst 33342をHBSS-Tubulin Tracker溶液に10μg/mLで添加して、10×核染色剤を生成した。この10×染色溶液(10μL)を処理済みアッセイウェルに直接添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、110μLの0.4%トリパンブルーをアッセイウェルに直接添加し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。各画像について青(核)及び緑(チューブリン)の蛍光チャネルで9枚の画像/ウェルを取得した。画像を得た後、MetaExpress Neurite Outgrowth解析モジュール(Molecular Devices社)を使用して、細胞体を特定し、神経突起を定量化した。細胞の数が異なることを考慮して、神経突起の分岐の総数を画像化した細胞の総数で割った。非処理対照細胞を1の値に設定し、全ての他の処理を非処理対照に対して相対的に示すことによって、伸長の倍率変化を決定した。ApoTfは、プールされたヒト血漿から得て精製し、0.2mg/mLの最終濃度で投薬した。メシル酸デフェロキサミン(DFO)はTocris社(カタログ番号5764)から得て、製造業者の推奨によって再懸濁させ、保存した。神経形成特性について評価したDFOの濃度はx軸に示す。

【0107】

図3Aから、DFOが1～3μMの間で最大の神経突起伸長を示し、その濃度を超えるとほとんど神経突起形成が行われないのに対して、ApoTfは、9.9μM(0.8mg/mL; 20μMの鉄結合部位)に及んでも分化が増大し続けることがわかる。これらのデータから、鉄キレート化は神経突起伸長にある役割を果たし得るが、それは主要な作用機序ではなく、ApoTfの別の未確認の機能的側面もその神経形成能に役割を果たしているに違いないことが示唆される。

【0108】

本発明者らは、N末端鉄結合部位の変異によってトランスフェリンの鉄結合活性が低減しても神経形成を媒介するのに十分であるかどうかを決定しようと更に努めた。

【0109】

未分化のSH-SY5Y細胞は、実施例1に記載したように処理した。神経突起成長は、画像化及び画像解析によって評価した。解析の時点で、Tubulin Tracker (Molecular Probes社、T34075)及びHoechst 33342 (Molecular Probes社 #H3570)核染色剤の10×溶液を調製した。簡潔に述べれば、DMSOに溶解させたTubulin TrackerをPluronic F-127で1:1に希釈し、HBSS中で更に希釈して10×溶液を生成した。Hoechst 33342をHBSS-Tubulin Tracker溶液に10μg/mLで添加して、10×核染色剤を生成した。この10×染色溶液(10μL)を処理済みアッセイウェルに直接添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、110μLの0.4%トリパンブルーをアッセイウェルに直接添加し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。各画像について青(核)及び緑(チューブリン)の蛍光チャネルで9枚の画像/ウェルを取得した。画像を得た後、MetaExpress Neurite Outgrowth解析モジュール(Molecular Devices社)を使用して、細胞体を特定し、神経突起を定量化した。細胞の数が異なることを考慮して、神経突起の分岐の総数を画像化した細胞の総数で割った。非処理対照を1の値に設定し、全ての他の処理を非処理対照に対して相対的に示すことによって、伸長の倍率変化を決定した。全てのタンパク質は、0.2mg/mLの最終濃度で投薬した。

【0110】

血漿由来ヒト血清アルブミン(pdHSA)及びApoTfは、プールされたヒト血漿から得て精製した。組換えApoTf (rec ApoTf;配列番号1)、及びN-ローブ変異体Tf (N-mut rec ApoTf;配列番号4)は、293-6E細胞からの細胞培養発現によって得た。

【0111】

簡潔に述べれば、野生型ヒトトランスフェリン(配列番号1)及びN-ローブ変異体ヒトトランスフェリン(配列番号4)配列を、N末端6xHISタグ及びTEV切断部位を含有する哺乳動物発現プラスミドにクローニングした。これらの発現プラスミドを293-6E細胞株にトランスフェクトし、その後細胞培養上清からタンパク質を収集した。タンパク質をNI-NTAカラムで精製し、洗浄後に溶出した。TurboTEVプロテアーゼを使用して、トランスフェリンタンパク質からN末端6xHISタグ及び追加のアミノ酸を切断した。TEV切断に続いて、2回目のNi-NTA捕捉カラムによって、トランスフェリンタンパク質を、切断された6xHISタグ及び切断されていないタンパク質から分離した。次いでNi-NTA捕捉カラムのフロースルー画分を低pH処理に供して、これらのタンパク質に結合して残存している可能性のある鉄をいずれも除去し、緩衝液をPBS pH 7.4に交換し、濃縮し、滅菌濾過して最終用途用とした。

【0112】

図3Bから、血漿由来ヒト血清アルブミン(pdHSA)が神経形成に影響を与えなかったことがわかる。しかし、ApoTf及び組換えApoTfは両方とも、SH-SY5Yの神経形成を誘導した。低減した鉄結合能を有するApoTf変異体(N-mut rec ApoTf) は、SH-SY5Y細胞の分化の誘導においてApoTf及びrec ApoTfのそれとほぼ等しかった。鉄結合だけがApoTfの神経形成ポテンシャルの作用機序ではないと思われる。

【実施例4】

【0113】

SH-SY5Yに及ぼす神経形成作用はアポ-トランスフェリン及びアポ-ラクトフェリンに特異的である
実施例3からApoTfの神経形成能における鉄キレート化の役割が不明確であることが見出されたために、本発明者らは、他の鉄結合タンパク質もSH-SY5Y細胞の神経形成を媒介することができるかどうかを決定した。

【0114】

未分化のSH-SY5Y細胞は、実施例1に記載したように処理した。神経突起成長は、画像化及び画像解析によって評価した。解析の時点で、Tubulin Tracker (Molecular Probes社、T34075)及びHoechst 33342 (Molecular Probes社 #H3570)核染色剤の10×溶液を調製した。簡潔に述べれば、DMSOに溶解させたTubulin TrackerをPluronic F-127で1:1に希釈し、HBSS中で更に希釈して10×溶液を生成した。Hoechst 33342をHBSS-Tubulin Tracker溶液に10μg/mLで添加して、10×核染色剤を生成した。この10×染色溶液(10μL)を処理済みアッセイウェルに直接添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、110μLの0.4%トリパンブルーをアッセイウェルに直接添加し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。各画像について青(核)及び緑(チューブリン)の蛍光チャネルで9枚の画像/ウェルを取得した。画像を得た後、MetaExpress Neurite Outgrowth解析モジュール(Molecular Devices社)を使用して、細胞体を特定し、神経突起を定量化した。細胞の数が異なることを考慮して、神経突起の分岐の総数を画像化した細胞の総数で割った。非処理対照を1の値に設定し、全ての他の処理を非処理対照に対して相対的に示すことによって、伸長の倍率変化を決定した。BSAはSigma社から得た。rHSAはAlbumedix社から得た。ApoTf及びHoloTfは、プールされたヒト血漿から得て精製した。アポ-フェリチン(ウマ)はSigma社から得た。アポ-ラクトフェリンはAthens Research & Technology社から得た。全てのタンパク質は、0.2mg/mLの最終濃度で投薬した。

【0115】

図4から、ウシ血清アルブミン(BSA)も、低親和性鉄結合型のヒト血清アルブミンも、いずれも神経形成に影響を与えなかったことがわかる。低親和性鉄結合型のヒト血清アルブミン(rHSA)についての更なる情報については、Silvaら、2009. Biochimica et Biophysica Acta、第1794巻、1449～1458頁を参照されたい。鉄飽和型のトランスフェリンであるホロ-トランスフェリン(HoloTf)も、SH-SY5Y細胞の分化を誘導することができなかった。

【0116】

驚くべきことに、複数の鉄結合部位を有する別の高親和性鉄結合タンパク質であるフェリチンの鉄欠乏型であるアポ-フェリチンが、SH-SY5Y細胞の分化の誘導において無効であった。これによって、鉄結合だけがApoTfの神経形成ポテンシャルの作用機序であるという仮説が推進される。予想外なことに、アポ-ラクトフェリンもこれらの細胞の分化を誘導した。アポ-ラクトフェリンは、アポ-トランスフェリンの構造的及び機能的同族体であるが、血漿ではなく母乳に見出される。

【0117】

アポ-ラクトフェリンはアポ-トランスフェリンと61%の同一性を有しているのに対して、アポ-フェリチン及びヒト血清アルブミン(HSA)は、アポ-トランスフェリン又はアポ-ラクトフェリンのいずれにも構造的に無関係である。

【実施例5】

【0118】

ApoTfに誘導されるSH-SY5Y細胞の分化は低酸素誘導因子1α(HIF-1α)を通さない
ApoTf及びHoloTfは両方とも、関連する神経保護作用に至るHIF-1αの産生を誘導することができることが報告されている(Grifols Worldwide Operations limited社によるUS2016008437、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)。これは、ニューロンが死滅する前では有益な特質ではあるが、神経保護は、神経細胞が死滅したら患者に利益をもたらさない。その一方で、神経形成は、新たな神経細胞を再生することができるので、傷害の後でも患者に利益をもたらす。

【0119】

ApoTfがHIF経路以外の神経形成を媒介するという前提の実証において、本発明者らは、よく知られる、高度に特異的なプロリルヒドロキシラーゼ(PHD2)阻害剤をSH-SY5Y細胞分化アッセイで試験した。PHD2の小分子阻害剤であるIOX2 (N-[[1,2-ジヒドロ-4-ヒドロキシ-2-オキソ-1-(フェニルメチル)-3-キノリニル]カルボニル]-グリシン)は、PHD2に及ぼすその作用を通してHIF経路を活性化することが知られている。Chowdhuryら、2013. ACS Chem. Biol. 第8巻、1488頁を参照されたい。IOX2は、PHD2の阻害に22nMというIC₅₀を有しており、未分化のSH-SY5Yにおいて1μM程度の低濃度でHIF-1αの上方制御を誘導することができる(Ross、US2016008437、上記)。

【0120】

未分化のSH-SY5Y細胞は、実施例1に記載したように播種し、処理した。神経突起成長は、画像化及び画像解析によって評価した。解析の時点で、Tubulin Tracker (Molecular Probes社、T34075)及びHoechst 33342 (Molecular Probes社 #H3570)核染色剤の10×溶液を調製した。簡潔に述べれば、DMSOに溶解させたTubulin TrackerをPluronic F-127で1:1に希釈し、HBSS中で更に希釈して10×溶液を生成した。Hoechst 33342をHBSS-Tubulin Tracker溶液に10μg/mLで添加して、10×核染色剤を生成した。この10×染色溶液(10μL)を処理済みアッセイウェルに直接添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、110μLの0.4%トリパンブルーをアッセイウェルに直接添加し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。各画像について青(核)及び緑(チューブリン)の蛍光チャネルで9枚の画像/ウェルを取得した。画像を得た後、MetaExpress Neurite Outgrowth解析モジュール(Molecular Devices社)を使用して、細胞体を特定し、神経突起を定量化した。細胞の数が異なることを考慮して、神経突起の分岐の総数を画像化した細胞の総数で割った。非処理対照を1の値に設定し、全ての他の処理を非処理対照に対して相対的に示すことによって、伸長の倍率変化を決定した。ApoTfは、プールされたヒト血漿から得て精製し、0.2mg/mLの最終濃度で投薬した。IOX2は、Tocris社(カタログ番号4451)から得て、製造業者の推奨によって再懸濁させ、保存した。

【0121】

図5から、IOX2処理した細胞において神経突起伸長も分化も観察されなかったことが明白である。4μMという極めて高い濃度のIOX2であっても、作用は何も観察できなかった(SH-SY5YにおいてHIF-1αを誘導するとUS2016008437で報告された濃度より4倍高く、ChowdhuryがPHD2タンパク質に対するIC₅₀として決定した濃度より180倍超高い)。これらのデータを、HoloTfでの神経形成の欠如(実施例4)を合わせると、HIF-1αがSH-SY5Y細胞の分化に役割を果たしていないことが示される。

【実施例6】

【0122】

トランスフェリンの効力における鉄飽和度の役割
Table 1(表1)に略述するような様々な純度及び鉄飽和量を有するApoTfを、それらの神経形成ポテンシャルについて評価した。トランスフェリン試料は、当業者に公知の手順/方法論に従って調製した。それらは、L von Bonsdorffら、Transferrin、21章の21.4節、301～310頁、Production of Plasma Proteins for Therapeutic Use、 J. Bertoliniら編、Wiley、2013 [印刷物ISBN:9780470924310 |オンラインISBN:9781118356807](それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる)に詳述されている。

【0123】

タンパク質純度は、SDS-PAGEによって決定した。鉄飽和レベルは、Manleyら、J Biol Inorg Chem (2009) 14:61～74頁(その内容は、参照により本明細書に組み込まれる)に略述される手順に従ってICP-AESを使用して決定した。

【0124】

【表1】

【0125】

【0126】

図6Aは、0.2mg/mLの最終濃度で投薬した、Table 1(表1)に略述した純度及び鉄含有量のApoTf A～Dの、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に及ぼす作用をプロットしたものである。図6Bは、0.2mg/mLの最終濃度で投薬した、様々な鉄飽和レベル(X軸に列挙)を有するトランスフェリンの、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に及ぼす作用をプロットしたものである。

【0127】

ApoTf(<0.3%飽和度)及びHoloTf(100%飽和度)は、von Bonsdorff(上記参照)に略述されるように、プールされたヒト血漿からトランスフェリンを精製した後に調製した。ApoTfとHoloTfとを混合することによって様々な鉄飽和含有量を生成して、図6Bにプロットした表示飽和百分率を生成した。

【0128】

図6Aから、タンパク質純度が94%しかない試料であっても、全てのApoTf調製物(ApoTf A～D)がSH-SY5Yの神経形成分化を誘導可能であったことがわかる。図6Bは、鉄飽和度がSH-SY5Y細胞の分化を誘導するトランスフェリンの能力に及ぼす作用の程度を示している。この実施例では、少なくとも99%のタンパク質純度を有するApoTf又はHoloTfを様々な比率で混合して、鉄飽和度/含有量の作用を決定した。30%未満の鉄飽和含有量を有するトランスフェリンは、神経形成ポテンシャルを示した。

【実施例7】

【0129】

アポ-トランスフェリンは神経栄養タンパク質及びペプチド因子と相乗的に作用して分化を誘導する
幾つかの神経栄養タンパク質因子は、神経変性状態及び外傷性脳損傷後の神経形成を刺激するための臨床用途に検討されている。Houltonら、2019. Frontiers in Neurosci.、第13巻、論文790; Weissmiller及びWu、2012. Translational Neurodegeneration、第1巻:14; Apfel、2001. Clin Chem Lab Med.、第39巻(4)、351頁を参照されたい。

【0130】

3つの神経栄養スーパーファミリーからのタンパク質を、ApoTfと併用した機能について試験した。これらの神経栄養タンパク質は、BDNF(脳由来神経栄養因子;NGFスーパーファミリー)、GNDF(グリア細胞株由来神経栄養因子;TGF-βスーパーファミリー)、及びCNTF(毛様体神経栄養因子-1;ニューロカインスーパーファミリー)である。加えて、別の既知の神経栄養ペプチドであるPACAP(脳下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチドのアミノ酸1～38)をApoTfと併用した機能について評価した。

【0131】

【0132】

図7A～7Dにおいて、ApoTfを0.1mg/mLの最終濃度で、単独又は表示神経栄養因子と併用して投薬した。(A) BDNFは、Peprotech社(カタログ番号450-02)から得て25ng/mLで投薬した。(B) GDNFは、Peprotech社(カタログ番号450-10)から得て1000ng/mLで投薬した。(C) CNTFは、Peprotech社(カタログ番号450-13)から得て250ng/mLで投薬した。(D) PACAPは、Tocris社(カタログ番号1186)から得て200nMで投薬した。略語SFは、無血清培地を表す。

【0133】

図7A～7Dの各々を概観すると、神経栄養因子の各々及びペプチド断片が、SH-SY5Y細胞の分化を異なる程度に誘導したことは明らかである。BDNFのように、ApoTfの非存在下では試験した濃度の神経栄養因子によって分化が誘導されない事例もあった。提示した実験の全てにおいて、ApoTfと併用した神経栄養因子は、単独で試験した該分子よりも多くの分化を誘導した。予想外なことに、ApoTfは、SH-SY5Y細胞における神経突起伸長に対して、他の神経栄養因子及びペプチドとの相乗作用を呈する。

【実施例8】

【0134】

アポ-トランスフェリンは神経形成小分子と相乗的に作用して分化を誘導する
非タンパク質ベースの神経形成小分子化合物と共に作用するApoTfの能力を実施例7で試験した。ApoTfを神経形成化合物Y-27632 [trans-4-[(1R)-1-アミノエチル]-N-4-ピリジニルシクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド]と併用して評価した。Y-27632は、Rock1及びRock2 (Rhoキナーゼ)阻害剤である。小分子によるRock1及び2の阻害には、SH-SY5Y細胞を含めた神経細胞分化を誘導する既知の能力がある。Dybergら、2017. PNAS 第114巻(32)、E6603～E6612を参照されたい。

【0135】

未分化のSH-SY5Y細胞は、実施例1に記載したように処理した。神経突起成長は、画像化及び画像解析によって評価した。解析の時点で、Tubulin Tracker (Molecular Probes社、T34075)及びHoechst 33342 (Molecular Probes社 #H3570)核染色剤の10×溶液を調製した。簡潔に述べれば、DMSOに溶解させたTubulin TrackerをPluronic F-127で1:1に希釈し、HBSS中で更に希釈して10×溶液を生成した。Hoechst 33342をHBSS-Tubulin Tracker溶液に10μg/mLで添加して、10×核染色剤を生成した。この10×染色溶液(10μL)を処理済みアッセイウェルに直接添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーションに続いて、110μLの0.4%トリパンブルーをアッセイウェルに直接添加し、Molecular Devices Nano撮像装置で画像化した。各画像について青(核)及び緑(チューブリン)の蛍光チャネルで9枚の画像/ウェルを取得した。画像を得た後、MetaExpress Neurite Outgrowth解析モジュール(Molecular Devices社)を使用して、細胞体を特定し、神経突起を定量化した。細胞の数が異なることを考慮して、神経突起の分岐の総数を画像化した細胞の総数で割った。非処理対照を1の値に設定し、全ての他の処理を非処理対照に対して相対的に示すことによって、伸長の倍率変化を決定した。ApoTfは、0.1mg/mLの最終濃度で、単独又は表示小分子と併用して投薬した。Y-27632は、Tocris社(カタログ番号1254)から得て50μMで投薬した。

【0136】

図8は、Y-27632自体が強い神経形成化合物であるが、ApoTfの存在下で神経形成作用は相乗的であり、どちらかの分子が単独で呈する作用を超えた作用を示したことを示している。幾つかの既知のタンパク質、ペプチド、及び小分子神経形成実体と相乗的に作用するApoTfの能力は、予想外で驚くべき発見である。

【実施例9】

【0137】

パーキンソン病のマウスモデルにおけるアポ-トランスフェリン処理による歩行及び動作の向上
上のin-vitroでの結果が成功裏に陽性の臨床作用になることを例証するために、本発明者らは、パーキンソン病のマウスモデルで本療法の実証実験を行った。マウスに1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン(MPTP)を投与して、黒質中のドーパミン作動性ニューロンを破壊し、マウスにおけるパーキンソン病を誘導した。更なる詳細については、Sedelisら、Behavioural Brain Research 125 (2001)、109～122頁; Przedborski及びVila、Clinical Neuroscience Research 1 (2001)、407～418頁を参照されたい。

【0138】

ドーパミン作動性ニューロンの破壊は、動物の動作に悪影響を及ぼす。マウスの動作及び歩行は、映像解析によって測定することができる。図9に示すように、MPTPに曝露されたマウスでは、対照マウスに対して動作及び歩行の実質的な変化が観察可能であった(n=15)。実施例1～8での知見と一致して、マウスにおけるMPTP誘導性パーキンソン病は、ApoTfの投与によって有意に改善された(n=15)。図9は、ApoTfが罹病したマウスにおける運動機能障害を大幅に向上させ、マウスを対照動物まで有効に正常化したという点で、ApoTfの神経再生性を実証している。

【0139】

動物実験は、国立フィンランド動物実験委員会(the national Animal Experiment Board of Finland)によって認可されたライセンスに規定される通りに、実験動物の管理及び使用についての国立衛生研究所(ベセスダ、MD、USA)のガイドラインに従って、Charles River Laboratories社(フィンランド)で行った。8～12週齢のC57Bl/6Jマウスは、標準温度(22±1℃)で、光を制御した環境(7am～8pmまで点灯)内に収容し、食物及び水を自由に摂取させた。

【0140】

MPTPの溶液は、MPTP塩酸塩を滅菌生理食塩水に2.42mg/mLで溶解させることによって調製した。これは、2.0mg/mLの活性化合物に相当する。パーキンソン病を誘導するために、MPTPを20mg/kgで1日2回腹腔内注射することによって与えた。MPTP注射、又は対照マウスには生理食塩水単独を、4時間の間隔で連続する2日(0日目及び1日目)に与えた。

【0141】

ApoTfタンパク質は、pH7.4の滅菌PBS中、51.5mg/mLの濃度で投与した。マウスに腹腔内注射によってApoTfを350mg/kgで投薬するか、又は対照マウスにPBS単独を投薬した。ApoTfは1～7日目に1日1回与え、最初のApoTf処理用量は1日目の最後のMPTP用量から1時間後に与えた。

【0142】

マウスは、7日目にMotorater(TSE Systems GmbH社、バート・ホンブルク、ドイツ)試験システムを使用する運動学的歩行解析に供した。動物は、その7amから8pmの間の明サイクルの間に試験した。動作及び歩行解析セッションの前に、取り込んだ映像のデータ解析を容易にするためにマウスの体の31箇所に印を付けた。高速カメラ(300fps)を使用して、下側及び両側の3つの異なる方向から動作を取り込んだ。

【0143】

取り込んだ各マウスの映像は、まずソフトウェア読込み可能な形式に変換した。生データを得るために、体の印を追跡し、3つの方向の各々を関連付けた。その後、Charles River Discovery Research Service Finland社によって開発されたオーダーメイドのソフトウェアを使用して、異なる歩行パターン及び動作を抽出した。歩行パターン及び動作解析は、限定するものではないが、ストライド時間、ストライドの間のスイング時間、速度、ステップ幅、姿勢、及び肢間の協調を含めた、100の異なるパラメーターを評価した。データは、主成分分析(PCA)を使用することによって解析した。総合的歩行解析は、各マウスの全てのパラメーターのPCAに基づくものであり、得られた値は、対照マウスとMPTPマウス又はMPTPプラスApoTfマウスとの間の「距離」として測定される総合的な差異を示す。対照マウス(対照)を0の値に設定し、MPTPのみのマウス(MPTP)、又は続けてApoTf処理したMPTPマウス(MPTP→ApoTf)について「対照からの距離」を示す。値は平均+/-SEM(n=15)として示す。

【0144】

配列
前文で言及された配列をfasta形式で以下に略述する。

【0145】

配列番号1: ヒトトランスフェリン[UniProt Q06AH7]タンパク質配列

【化1】