(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-31
(54)【発明の名称】核酸の標的化組み込み
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230724BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20230724BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12P21/08
C12N15/09 100
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580050
(86)(22)【出願日】2021-06-23
(85)【翻訳文提出日】2023-02-16
(86)【国際出願番号】 US2021038599
(87)【国際公開番号】W WO2021262798
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】63/043,409
(32)【優先日】2020-06-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】シェン， エイミー
(72)【発明者】
【氏名】ミサギ， シャーラム
(72)【発明者】
【氏名】ラム， シンシア ヤング
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
(57)【要約】
本開示の主題は、組み換えタンパク質の発現に適した標的化組み込み（ＴＩ）宿主細胞であって、それらのゲノムへの外因性核酸コードのランダム組み込み（ＲＩ）をもたらすスーパートランスフェクションに供されたＴＩ宿主細胞と、前記スーパートランスフェクトされたＴＩ宿主細胞を生成する方法及び使用する方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
目的のポリペプチドを発現することのできる宿主細胞であって、ａ）２つの組み換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する第１の目的のポリペプチド及び第１の選択マーカーをコードする標的化組み込み外因性核酸の目的配列（ＳＯＩ）であって、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれている標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩと、
ｂ）第２の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードするランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩであって、宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれている外因性核酸のＳＯＩと
を含み、
ｃ）標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に又は誘導的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に又は誘導的に発現される、
宿主細胞。
【請求項2】
第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとが同一である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項3】
第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが同一である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項4】
１～１０個のランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項5】
標的化遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と、少なくとも約９０％相同である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項6】
宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩをさらに含み、第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩ及び第１の選択マーカーが第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳに隣接し、第２の標的化外因性ＳＯＩ及び第２の選択マーカーが第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳに隣接している、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項7】
目的のポリペプチドが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項8】
宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項１～５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項9】
宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項10】
宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項11】
ＳＯＩ及び選択マーカーの標的化組み込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項１～７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項12】
外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、１１に記載の宿主細胞。
【請求項13】
標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項14】
標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが誘導的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項15】
ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項16】
ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが誘導的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項17】
標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが誘導的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項18】
標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが誘導的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが誘導的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項19】
標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項20】
標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが誘導的に発現される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項21】
目的のポリペプチドを発現させる方法であって、ａ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、宿主細胞を提供すること、
ｂ）（ａ）で供給された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の２つのＲＲＳと一致し、第１の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む核酸を導入すること、
ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ又は同リコンビナーゼをコードする核酸を導入すること、
ｄ）第２の選択マーカーを発現する細胞を選択すること、
ｅ）ランダム組み込みを介して、第２の目的のポリペプチド及び第３の選択マーカーをコードする第２の外因性ＳＯＩを、宿主細胞のゲノム中に導入すること、
ｆ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に又は誘導的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが構成的に又は誘導的に発現されること、
ｇ）第３の選択マーカーを発現する細胞を選択すること、並びに
ｈ）第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するために十分な条件下で宿主細胞を培養すること
を含む方法。
【請求項22】
宿主細胞培養物から、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとが同一である、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
標的化遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と、少なくとも約９０％相同である、請求項２１に記載の方法。
【請求項25】
第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
ＳＯＩのいずれかの標的化組み込みが外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
ＳＯＩの発現が、調節可能なプロモーターによって制御される、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項34】
宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が誘導的に発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項35】
第２の外因性ＳＯＩが構成的に発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項36】
第２の外因性ＳＯＩが誘導的に発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項37】
宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が誘導的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが構成的に発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項38】
宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が誘導的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが誘導的に発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項39】
宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが構成的に発現される、請求項２１に記載の方法。
【請求項40】
宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが誘導的に発現される、請求項２１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，４０９号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，４０９号に対する優先権を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【0002】
配列表
本明細書は、配列表（２０２１年６月２３日に「００Ｂ２０６＿１０９９ＳＬ」という名称の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出）を参照する。００Ｂ２０６＿１０９９ＳＬファイルは２０２１年６月１５日に作成されたものであり、サイズは１，２５１，２００バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に援用される。
本明細書は、配列表（２０２１年６月２３日に「００Ｂ２０６＿１０９９ＳＬ」という名称の．ｔｘｔファイルとして電子的に提出）を参照する。００Ｂ２０６＿１０９９ＳＬファイルは２０２１年６月１５日に作成されたものであり、サイズは１，２５１，２００バイトである。配列表の全内容は、参照により本明細書に援用される。
【0003】
本開示の主題は、組み換えタンパク質の発現に適した標的化組み込み（ＴＩ）宿主細胞であって、それらのゲノムへの外因性核酸コードのランダム組み込み（ＲＩ）をもたらすスーパートランスフェクションに供されたＴＩ宿主細胞と、前記スーパートランスフェクトされたＴＩ宿主細胞を生成する方法及び使用する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
細胞生物学及び免疫学の急速な進歩により、がん、心血管疾患及び代謝疾患を含む様々な疾患のための新規治療用組み換えタンパク質を開発する需要が高まっている。これらバイオ医薬品候補は、一般に、目的のタンパク質を発現することができる市販の細胞株によって製造される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、モノクローナル抗体を生成するように広く適合されている。
【0005】
市販の細胞株を開発するための従来の戦略は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダム組み込みと、続いて目的のポリペプチドを生成する細胞株の選択及び単離とを含む。しかしながら、この手法にはいくつかの不都合な点がある。第１に、そのような組み込みはまれな事象であるだけでなく、ヌクレオチド配列がどこに組み込まれるかに関するランダム性を考慮すると、これらまれな事象は様々な遺伝子発現及び細胞増殖表現型をもたらしうる。「位置効果の多様化」として知られるそのような多様性は、少なくとも部分的に、真核細胞ゲノムに存在する複雑な遺伝子調節ネットワーク、並びに組み込み及び遺伝子発現のための特定のゲノム遺伝子座の利用可能性に起因する。第２に、ランダム組み込み戦略は一般に、宿主細胞のゲノムに組み込まれる遺伝子コピーの数を制御することはできない。実際に、遺伝子増幅法は、高生産細胞を実現するために使用されることが多い。しかしながら、そのような遺伝子増幅は、不安定な細胞増殖及び／又は生成物発現などの望ましくない細胞表現型をもたらしうる。第３に、ランダム組み込みプロセスに固有の組み込み遺伝子座の不均一性のために、目的のポリペプチドの望ましいレベルの発現を示す細胞株を単離するためにトランスフェクション後に数千のクローンをスクリーニングすることは、長時間を要するとともに労力を要する。そのような細胞株を単離した後でさえ、目的のポリペプチドの安定発現は保証されず、安定した市販の細胞株を得るためにはさらなるスクリーニングが必要な場合がある。最後に、ランダム組み込み細胞株から生成されたポリペプチドは、高度な配列多様性を示し、これは、部分的には、目的のポリペプチドの高レベルの発現を選択するために使用される選択剤の変異原性に起因しうる。
【発明の概要】
【0006】
本開示の主題は、一部は、組み換えタンパク質の発現に適した標的化組み込み（ＴＩ）宿主細胞であって、それらのゲノムへの外因性核酸コードのゲノムへのランダム組み込み（ＲＩ）をもたらすスーパートランスフェクションに供されるＴＩ細胞と、前記スーパートランスフェクトされたＴＩ宿主細胞を生成する方法及び使用する方法に関する。本開示の主題は、高い生産性を有する宿主細胞ＴＩ部位を提供するだけでなく、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって宿主細胞の単一のＴＩ遺伝子座に目的の複数の配列を導入する新規方法も提供し、本明細書に概説されるように、細胞を、外因性核酸コードのＴＩ宿主細胞のゲノムへのランダム組み込み（ＲＩ）をもたらすスーパートランスフェクションに供することにより、目的の配列の発現の増加を達成する。
【0007】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現することができる宿主細胞であって、ａ）２つの組み換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する第１の目的のポリペプチド及び第１の選択マーカーをコードする、標的化組み込み外因性核酸目的配列（ＳＯＩ）であって、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれている、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩ；及びｂ）第２の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードするランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩであって、宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれたランダム組み込みＳＯＩを含み、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に又は誘導的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが構成的に又は誘導的に発現される、宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとは同一でありうる。特定の実施形態では、第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとは同一でありうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ランダムに組み込まれた１個から１０個の外因性核酸のＳＯＩを含みうる。特定の実施形態では、標的化遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同でありうる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩをさらに含み、第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩ及び第１の選択マーカーが第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳに隣接し、第２の標的化組み込外因性ＳＯＩ及び第２の選択マーカーが第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳに隣接しうる。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞でありうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞でありうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞でありうる。特定の実施形態では、ＳＯＩ及び選択マーカーの標的化組み込みは、外因性ヌクレアーゼによって促進されうる。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択することができる。特定の実施形態では、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩは、構成的に発現される。特定の実施形態では、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩは、誘導的に発現される。特定の実施形態では、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩは、構成的に又は誘導的に発現される。
【0008】
本開示の主題はまた、目的のポリペプチドを発現させる方法を提供する。特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させる方法であって、ａ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、宿主細胞を提供すること；ｂ）（ａ）で供給された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の２つのＲＲＳと一致し、第１の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む核酸を導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ又は同リコンビナーゼをコードする核酸を導入すること；ｄ）第２の選択マーカーを発現する細胞を選択すること；ｅ）ランダム組込みを介して、第２の目的のポリペプチド及び第３の選択マーカーをコードする第２の外因性ＳＯＩを、宿主細胞のゲノム中に導入すること；ｆ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に又は誘導的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが構成的に又は誘導的に発現されること；ｇ）第３の選択マーカーを発現する細胞を選択すること；並びにｈ）第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するために十分な条件下で宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、このような方法は、宿主細胞培養物から、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを回収することをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとは同一でありうる。特定の実施形態では、標的化遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同でありうる。特定の実施形態では、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択することができる。特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物宿主細胞でありうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞でありうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞でありうる。特定の実施形態では、任意のＳＯＩの標的化組込みは、外因性ヌクレアーゼによって促進することができる。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択することができる。特定の実施形態では、ＳＯＩの発現は、調節可能なプロモーターによって制御することができる。特定の実施形態では、調節可能なプロモーターは、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択することができる。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に発現される。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が誘導的に発現される。特定の実施形態では、第２の外因性ＳＯＩが構成的に発現される。特定の実施形態では、第２の外因性ＳＯＩが誘導的に発現される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】Ａ及びＢは、スーパートランスフェクション発現コンストラクトの概要、及び３つの異なるスーパートランスフェクション手法を示している。
【図2】Ａ～Ｃは、構成的→構成的スーパートランスフェクションプロセスの概要、及び組み合わされたスーパートランスフェクト構成的→構成的ミニプールのプール力価生産性を示している。
【図3】Ａ～Ｆは、高い力価のスーパートランスフェクトクローンを得るための構成的→構成的プールプロセスの単一細胞クローニング、力価、比生産性（Ｑｐ）、増殖、重鎖及び軽鎖ＤＮＡコピー数及びｍＲＮＡレベルの結果を示している。
【図4】Ａ及びＢは、スーパートランスフェクトされた誘導的→構成的プールに関する誘導的→構成的スーパートランスフェクションプロセスの概要、及びプール力価を、スーパートランスフェクトされていない親宿主との比較で示している。
【図5】Ａ～Ｆは、誘導的→構成的スーパートランスフェクトプールのスクリーニングプロセスの単一細胞クローニング、力価、比生産性（Ｑｐ）、増殖、及び重鎖及び軽鎖ＤＮＡコピー数の結果を示している。
【図6】Ａ～Ｆは、上位の構成的→誘導的ミニプールを同定するためのスーパートランスフェクションスクリーニング工程、力価、比生産性（Ｑｐ）、増殖、及び重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡレベルの結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【0010】
特定の実施形態では、本明細書中に記載される宿主細胞、遺伝子コンストラクト（例えば、ベクター）、組成物及び方法は、標的化組み込み（ＴＩ）宿主細胞の開発及び／又は使用において利用することができる。特定の実施形態では、そのようなＴＩ宿主細胞は、宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子又は特定の遺伝子座内に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
【0011】
開示を明確にする目的で、且つ限定を目的とせずに、詳細な説明を以下のサブセクションに分ける。
１．定義
２．組み込み部位
３．外因性ヌクレオチド配列
４．宿主細胞
５．標的化組み込み
６．ＴＩ宿主細胞の調製及び使用
７．生成物
８．例示的な非限定的実施形態
１．定義
２．組み込み部位
３．外因性ヌクレオチド配列
４．宿主細胞
５．標的化組み込み
６．ＴＩ宿主細胞の調製及び使用
７．生成物
８．例示的な非限定的実施形態
【0012】
１．定義
別途指定のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本出願が優先される。好ましい方法及び材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料は、現在開示されている主題の実施又は試験に使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。本明細書に開示される材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図していない。
別途指定のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めて本出願が優先される。好ましい方法及び材料は以下に記載されているが、本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料は、現在開示されている主題の実施又は試験に使用することができる。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が援用される。本明細書に開示される材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図していない。
【0013】
本明細書で使用される、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「有する（ｈａｓ）」、「しうる／することができる（ｃａｎ）」、「含有する／含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、及びこれらの変形は、さらなる作用又は構造物の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、又は単語であることが意図される。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【0014】
本明細書において数値範囲を列挙する場合、間に介在する各数字が同じ程度の精度で明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６及び９に加えて数字７及び８が企図され、６．０～７．０の範囲では、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図される。
【0015】
本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容されうる誤差範囲内を意味し、これは、その値がどのように測定又は決定されるか、即ち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野での１回の実施当たり３以上の標準偏差以内を意味しうる。代替的に、「約」は、所与の値の、最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。代替的に、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味しうる。
【0016】
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、又は特異的に排除されることを可能にする遺伝子でありうる。例えば、限定しないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、その遺伝子の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ、形質転換されていない宿主細胞は、選択的条件下で増殖又は生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、又は二機能性でありうる。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にすることができるのに対し、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞を選択的に排除することを可能にしうる。選択マーカーは、宿主細胞において薬物に対する耐性を付与することができるか、又は代謝若しくは異化の欠陥を補うことができる。原核細胞においては、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を使用することができる。真核細胞において選択マーカーとして有用な耐性遺伝子には、限定されないが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ））の遺伝子、並びにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれる。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号及び国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。
【0017】
選択マーカーは、対応する選択剤の存在下での選択を容易にするだけでなく、通常は細胞中に存在しない分子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅをコードする遺伝子を代替的に提供しうる。そのような遺伝子を保有する細胞は、例えば、コードされたポリペプチドによって放射される蛍光の検出によって、この遺伝子を保有しない細胞と区別されうる。
【0018】
本明細書において使用される用語「動作可能に連結された」は、目的の様式でそれらが機能することを可能にする関係にある、２つ以上の成分の並置を指す。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーがコード配列の転写を調節する役割を果たす場合、そのプロモーター及び／又はエンハンサーはコード配列に動作可能に連結されている。特定の実施形態では、「動作可能に連結されて」いるＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣り合っている。特定の実施形態では、例えば、１つの分泌リーダーと１つのポリペプチドといった２つのタンパク質のコード領域を結合する必要があるとき、これら配列は近接し、隣り合い、且つ同じリーディングフレームに存在する。特定の実施形態では、動作可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置しており、且つコード配列に隣接しうる。特定の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの成分は、隣り合ってはいないが、動作可能に連結されうる。エンハンサーは、それがコード配列の転写を増大させる場合、コード配列に動作可能に連結されている。動作可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、配列内、又は下流に位置することができ、コード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置することができる。動作可能な連結は、当技術分野で既知の組み換え法によって、例えば、ＰＣＲ方法を用いて、及び／又は好都合な制限部位でのライゲーションによって、達成することができる。好都合な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを従来の手順に従って使用することができる。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）は、それが５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に動作可能に連結されている。
【0019】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写及び／又は翻訳を指す。特定の実施形態では、所望の生成物の転写レベルは、存在している対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定することができる。例えば、目的の配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲによって又はノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる。特定の実施形態では、目的の配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物活性についてアッセイすることによって、又はそのような活性に依存しないアッセイ、例えば、タンパク質を認識してそれに結合する抗体を使用するウェスタンブロッティング若しくはラジオイムノアッセイを用いることによって、定量することができる。
【0020】
本明細書で「抗体」という用語は、最も広義に使用され、抗体が所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、半抗体、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【0021】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
【0022】
本明細書で使用される場合、「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有しており、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，９１頁（２００７）を参照のこと。）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、それぞれ相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に結合する抗体のＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離されうる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照のこと。
【0023】
本明細書で使用される場合、「重鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖を指す。
【0024】
本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、免疫グロブリン軽鎖を指す。
【0025】
抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、次の５種類の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
【0026】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、その集団を含む個々の抗体は、同一である、及び／又は同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、起こりうるバリアント抗体は例外であり、そのようなバリアントは通常少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明によるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、そのような方法及び本明細書に記載される他の例示的な方法は、モノクローナル抗体を作製するためのものである。
【0027】
「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、即ち、異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
【0028】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すために交換可能に使用される。
【0029】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；並びに、抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
【0030】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
【0031】
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞により生成された抗体のアミノ酸配列、又はヒト抗体レパートリ若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト源由来の抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【0032】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、そのドメイン中ではＣＤＲのすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、場合によっては、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、即ち、その集団を含む個々の抗体は、同一である、及び／又は同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する突然変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じる、起こりうるバリアント抗体は例外であり、そのようなバリアントは通常少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、いずれか特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈すべきではない。
【0033】
「治療用抗体」という用語は、疾患の治療に使用される抗体を指す。治療用抗体は、様々な作用機序を有しうる。治療用抗体は、抗原に関連する標的に結合し、その正常な機能を中和しうる。例えば、がん細胞の生存に必要なタンパク質の活性をブロックするモノクローナル抗体は、細胞死を引き起こす。別の治療用モノクローナル抗体は、抗原に関連する標的に結合し、その正常な機能を活性化しうる。例えば、モノクローナル抗体は、細胞上のタンパク質に結合し、アポトーシスシグナルをトリガーすることができる。また別のモノクローナル抗体は、疾患組織上にのみ発現される標的抗原に結合することができ、化学療法剤又は放射性薬剤といった毒性ペイロード（有効な薬剤）の、モノクローナル抗体へのコンジュゲーションは、毒性ペイロードを患部組織に特異的に送達するための薬剤をつくることができ、健康な組織への害を減少させる。治療用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の一部又は全部ではないにしても少なくとも１つを呈し、その機能は標的抗原への少なくとも特異的な結合を含む。
【0034】
「診断用抗体」という用語は、疾患の診断試薬として使用される抗体を指す。診断用抗体は、特定の疾患に特異的に関連するか、又は特定の疾患において発現の増加を示す標的抗原に結合しうる。診断用抗体は、例えば、患者由来の生体試料中の標的を検出するために、又は患者における腫瘍などの疾患部位の画像診断において、使用されうる。診断用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の一部又は全部ではないにしても少なくとも１つを呈し、その機能は標的抗原への少なくとも特異的な結合を含む。
【0035】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、それには、そのような細胞の子孫も含まれる。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらは、継代数によらず、一次形質転換細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含有していてもよい。元の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は、本明細書に含まれる。
【0036】
「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（即ち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（即ち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基配列によって記載され、それにより、前記塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’～３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれら分子の２つ以上を含む混合ポリマーを含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含する。核酸分子は、線状又は環状でありうる。加えて、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに単鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含みうる。天然に存在しないヌクレオチドの例には、誘導体化された糖若しくはリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基又は化学的に修飾された残基が含まれる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を生成するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ ２ １０１ ８２３Ｂ１を参照されたい）。
【0037】
「単離された」核酸は、自然環境の構成要素から切り離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外又は天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0038】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸を増殖することのできる核酸分子を指す。この用語には、自己複製する核酸構造としてのベクターだけでなく、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターも含まれる。特定の実施形態では、ベクターは、それらが動作可能に連結する核酸の発現を誘導する。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【0039】
本明細書で使用される場合、「相同な配列」という用語は、配列のアラインメントによって決定したとき、有意な配列類似性を共有する配列を指す。例えば、２つの配列は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は９９．９％相同でありうる。アラインメントは、配列を比較し、配列長、配列同一性及び類似性、並びに配列のミスマッチ及びギャップの存在及び長さといった因子に基づいて、一致の統計的有意性を算出する、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＨＭＭＥを含むがこれらに限定されないアルゴリズム及びコンピュータプログラムによって実行される。相同配列は、ＤＮＡ配列及びタンパク質配列の両方に言及することができる。
【0040】
本明細書において使用される場合、用語「隣接する」は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の５’若しくは３’末端、又は両末端に位置していることを指す。隣接ヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列の隣に存在するか、又はそれから所定の距離にあってよい。隣接ヌクレオチド配列の長さには特に制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対又は数千塩基対であってよい。特定の実施形態では、隣接するヌクレオチド配列の長さは、約少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対、少なくとも４，０００塩基対、少なくとも５，０００塩基対、少なくとも６，０００塩基対、少なくとも７，０００塩基対、少なくとも８，０００塩基対、少なくとも９，０００塩基対、少なくとも１０，０００塩基対でありうる。
【0041】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が、宿主細胞に由来せず、従来のＤＮＡ送達方法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法によって宿主細胞に導入されることを示す。「内因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来することを指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を有しうるが、「外因性」配列は、例えば、組み換えＤＮＡ技術によって宿主細胞中に導入される。
【0042】
２．組み込み部位
本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の標的化組み込みに適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞、即ち、ＴＩ宿主細胞のゲノム上の組み込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の標的化組み込みに適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞、即ち、ＴＩ宿主細胞のゲノム上の組み込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
【0043】
「組み込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、宿主細胞のゲノム内の核酸配列を含む。特定の実施形態では、組み込み部位は、宿主細胞のゲノム上の２つの隣り合うヌクレオチド間に存在する。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列をいずれの間にも挿入することのできる一続きのヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、組み込み部位は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置する。特定の実施形態では、組み込み部位は、ＴＩ宿主細胞の内因性遺伝子内に存在する。
【0044】
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0045】
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる遺伝子座は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0046】
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の番号１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、及び４，０００～４，３０１ｂｐが付されたヌクレオチドから選択される位置内に位置する組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の番号１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、及び７００，０００～７２８７８５ｂｐが付されたヌクレオチドから選択される位置内に位置する組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の番号１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、及び４００，０００～４１３，９８３が付されたヌクレオチドから選択される位置内に位置する組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、及び３０，０００～３０，７５７ｂｐが付されたヌクレオチドから選択される位置内に位置する組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、及び６０，０００～６８，９６２ｂｐが付されたヌクレオチドから選択される位置内に位置する組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、及び５０，０００～５１，３２６ｂｐが付されたヌクレオチドから選択される位置内に位置する組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、及び２０，０００～２２，９０４ｂｐが付されたヌクレオチドから選択される位置内に位置する組み込み部位に組み込まれる。
【0047】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５、及びそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0048】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７、及びそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0049】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に動作可能に連結される。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に動作可能に連結されたヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＳＯＩを含む。特定の実施形態では、動作可能に連結されたヌクレオチド配列は、ランダムに組み込まれたＳＯＩと比較して、ＳＯＩの発現レベルを増加させる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ＳＯＩは、ランダムに組み込まれたＳＯＩよりも約２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、又は１０倍高く発現される。
【0050】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５並びにそれらと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の５’側に隣接し、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７並びにそれらと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の３’側に隣接する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’側に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’側に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0051】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチドは、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される配列の全部又は一部とすぐ隣り合う遺伝子座に組み込まれる。
【0052】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の隣りに位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される配列から約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１ｋｂ以内の距離にある。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列と隣り合うヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0053】
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の番号１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、及び４，０００～４，３０１ｂｐが付与されたヌクレオチドから選択される位置と隣り合う組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の番号１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、及び７００，０００～７２８７８５ｂｐが付与されたヌクレオチドから選択される位置と隣り合う組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の番号１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、及び４００，０００～４１３，９８３が付与されたヌクレオチドから選択される位置と隣り合う組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、及び３０，０００～３０，７５７ｂｐが付与されたヌクレオチドから選択される位置と隣り合う組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、及び６０，０００～６８，９６２ｂｐが付与されたヌクレオチドから選択される位置と隣り合う組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、及び５０，０００～５１，３２６ｂｐが付与されたヌクレオチドから選択される位置と隣り合う組み込み部位に組み込まれる。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の番号１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、及び２０，０００～２２，９０４ｂｐが付与されたヌクレオチドから選択される位置と隣り合う組み込み部位に組み込まれる。
【0054】
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組み込み部位を含む遺伝子座は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしない。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組み込み部位を含む遺伝子座は、シス作用性エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーを含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組み込み部位を含む遺伝子座は、遺伝子発現を増強する任意のシス作用性エレメント、例えばプロモーター及びエンハンサーを含まない。
【0055】
特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子内の組み込み部位に組み込まれる。内因性ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子には、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の野生型及びすべての相同配列が含まれる。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の相同配列は、野生型ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同でありうる。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型哺乳動物ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ヒトＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ハムスターＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。
【0056】
特定の実施形態では、組み込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子に動作可能に連結される。特定の実施形態では、組み込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子に隣接する。
【0057】
表１は、例示的なＴＩ宿主細胞組み込み部位を提供する。
【0058】
特定の実施形態では、組み込み部位及び／又は組み込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、実験的に同定することができる。特定の実施形態では、組み込み部位及び／又は組み込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、１つ以上の外因性ヌクレオチド配列に組み込まれた１つ以上のＳＯＩによってコードされる目的のポリペプチドを望ましいレベルで発現する宿主細胞を単離するためのゲノムワイドスクリーニング手法によって同定することができ、外因性配列はそれ自体、宿主細胞のゲノム内の１つ以上の遺伝子座に組み込まれる。特定の実施形態では、組み込み部位及び／又は組み込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、トランスポザーゼに基づくカセット組み込み事象後のゲノムワイドスクリーニング手法によって同定することができる。特定の実施形態では、組み込み部位及び／又は組み込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、ブルートフォースランダム組み込みスクリーニングによって同定することができる。特定の実施形態では、組み込み部位及び／又は組み込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、標的化遺伝子座増幅（ＴＬＡ）、それに続く次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及び全ゲノムＮＧＳなどの従来の配列決定手法によって決定することができる。特定の実施形態では、染色体上の組み込み部位の位置は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析などの従来の細胞生物学的手法によって決定することができる。
【0059】
特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノム内の特定の第１の遺伝子座内の第１組み込み部位に組み込まれた第１の外因性ヌクレオチド配列と、ゲノム内の特定の第２の遺伝子座内の第２の組み込み部位に組み込まれた第２の外因性ヌクレオチド配列とを含む。特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノム内の複数の組み込み部位で組み込まれた複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。
【0060】
特定の実施形態では、本開示のＴＩ宿主細胞は、少なくとも２つの異なる外因性ヌクレオチド配列、例えば、少なくとも１つのＲＲＳを含む外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、２つ以上の外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上のＳＯＩの導入の標的とすることができる。特定の実施形態では、ＳＯＩは同一である。特定の実施形態では、ＳＯＩは異なる。特定の実施形態では、第１の外因性ヌクレオチド配列を含む親ＴＩ宿主細胞は、第１の外因性ヌクレオチド配列の組み込み部位とは異なる組み込み部位に第２の外因性ヌクレオチド配列を含むことができる。
【0061】
特定の実施形態では、組み込み部位は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％又は少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、組み込み部位は、同じ染色体上に存在しうる。特定の実施形態では、組み込み部位は、同じ染色体中で互いに１～１，０００ヌクレオチド、１，０００～１００，０００ヌクレオチド、１００，０００～１，０００，０００ヌクレオチド又はそれを超える範囲内に位置する。特定の実施形態では、組み込み部位は異なる染色体上に存在する。特定の実施形態では、１つの組み込み部位に外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞は、同じ又は異なる組み込み部位に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、又はそれよりも多い外因性ヌクレオチド配列を挿入するために使用することができる。
【0062】
特定の実施形態では、少なくとも２つの組み込み部位のリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）の実現可能性は、各部位について個別に評価することができる。特定の実施形態では、少なくとも２つの組み込み部位のＲＭＣＥの実現可能性は、同時に評価することができる。複数の部位でのＲＭＣＥの実現可能性は、当技術分野で既知の方法により、例えば、ポリペプチド力価又はポリペプチド特異的生産を測定することによって評価することができる。特定の実施形態では、評価は、当技術分野で既知の方法によって、例えば、１つ又は複数のＳＯＩを発現するＴＩ宿主細胞の培養物の力価及び／又は比生産性を評価することによって実施することができる。例示的な培養戦略には、限定されないが、流加振盪フラスコ培養及びバイオリアクター流加培養が含まれる。目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の力価及び比生産性は、当技術分野で既知の方法によって、例えば、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。
【0063】
３．外因性ヌクレオチド配列
外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞に由来しないが、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法などの従来のＤＮＡ送達方法によって、宿主細胞に導入することのできるヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的配列（ＳＯＩ）、例えば目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。しかしながら、特定の実施形態では、本開示との関連で用いられる外因性ヌクレオチド配列は、さらなる核酸配列、例えばＳＯＩの導入を促進する要素、例えば１つ以上の組み換え認識配列（ＲＲＳ）及び１つ以上の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、追加の核酸配列の導入を促進する外因性ヌクレオチド配列は、本明細書では「ランディングパッド」と呼ばれる。したがって、特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は：（１）１つ以上のＳＯＩ、例えば、外因性部位特異的ヌクレアーゼ媒介性（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性）標的化組み込みを介して宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に組み込まれたＳＯＩを含む外因性ヌクレオチド配列；（２）１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列；又は（３）１つ以上のＳＯＩが組み込まれた１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列を含みうる。
外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞に由来しないが、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、又は形質転換法などの従来のＤＮＡ送達方法によって、宿主細胞に導入することのできるヌクレオチド配列である。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的配列（ＳＯＩ）、例えば目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。しかしながら、特定の実施形態では、本開示との関連で用いられる外因性ヌクレオチド配列は、さらなる核酸配列、例えばＳＯＩの導入を促進する要素、例えば１つ以上の組み換え認識配列（ＲＲＳ）及び１つ以上の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、追加の核酸配列の導入を促進する外因性ヌクレオチド配列は、本明細書では「ランディングパッド」と呼ばれる。したがって、特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は：（１）１つ以上のＳＯＩ、例えば、外因性部位特異的ヌクレアーゼ媒介性（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性）標的化組み込みを介して宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に組み込まれたＳＯＩを含む外因性ヌクレオチド配列；（２）１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列；又は（３）１つ以上のＳＯＩが組み込まれた１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列を含みうる。
【0064】
特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞のゲノム中の１つ以上の組み込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つ以上の組み込み部位に組み込まれる。例えば、限定しないが、少なくとも１つの外因性核酸配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同な１つ以上の遺伝子座に組み込むことができる。
【0065】
３．１ ランディングパッド
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組み換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは異種特異的である、即ち、同じリコンビナーゼによって認識されない。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。特定の実施態様では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ又は第２のＲＲＳとは異なっている。特定の実施形態では、３つのＲＲＳはすべて異種特異的である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、複数のＲＲＳを含む。特定の実施形態では、複数の２つ以上のＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、２つ以上のＲＲＳは異種特異性である。特定の実施形態では、各ＲＲＳは、異なるリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施形態では、ＲＲＳの総数のサブセットは、同種特異性であり、即ち、同じリコンビナーゼによって認識され、ＲＲＳの総数のあるサブセットは、異種特異性であり、即ち、同じリコンビナーゼによって認識されない。特定の実施形態では、ＲＲＳ又は複数のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択されうる。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組み換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳはリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳは異種特異的である、即ち、同じリコンビナーゼによって認識されない。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。特定の実施態様では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ又は第２のＲＲＳとは異なっている。特定の実施形態では、３つのＲＲＳはすべて異種特異的である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、複数のＲＲＳを含む。特定の実施形態では、複数の２つ以上のＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、２つ以上のＲＲＳは異種特異性である。特定の実施形態では、各ＲＲＳは、異なるリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施形態では、ＲＲＳの総数のサブセットは、同種特異性であり、即ち、同じリコンビナーゼによって認識され、ＲＲＳの総数のあるサブセットは、異種特異性であり、即ち、同じリコンビナーゼによって認識されない。特定の実施形態では、ＲＲＳ又は複数のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択されうる。
【0066】
特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、１つのＲＲＳ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳ、並びに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接し、即ち、第１のＲＲＳが選択マーカーの上流の５’側に位置し、第２のＲＲＳが下流の３’側に位置している。特定の実施態様では、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’末端に隣接し、第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端の隣りに位置する。
【0067】
特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは、いずれもＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは、いずれもＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは異種特異的である。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）は、選択マーカーの５’側に位置しており、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’側に位置している。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施態様では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施態様では、第１の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、同じ向きに位置決めされている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、両方が順方向又は逆方向に向いている。特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、反対の向きに位置決めされている。
【0068】
特定の実施形態では、選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、又はマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子でありうる。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、又はＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーでありうる。特定の実施形態では、選択マーカーは、少なくとも２つの選択マーカーを含む融合コンストラクトでありうる。特定の実施形態では、選択マーカー又は選択マーカーの断片をコードする遺伝子は、異なる選択マーカー又はその断片をコードする遺伝子に融合されうる。
【0069】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接する２つの選択マーカーを含み、第１の選択マーカーは、第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、２つの選択マーカーは両方とも、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、並びにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、及びマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される。特定の実施形態では、第１の選択マーカーは、グルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なっている。
特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に動作可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに動作可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに動作可能に連結されている。
特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に動作可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに動作可能に連結されている。特定の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに動作可能に連結されている。
【0070】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及びＩＲＥＳを含み、ＩＲＥＳは選択マーカーに動作可能に連結されている。特定の実施形態では、ＩＲＥＳに動作可能に連結された選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＩＲＥＳに動作可能に連結される選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接する２つの選択マーカー及びＩＲＥＳを含み、ＩＲＥＳは第２の選択マーカーに動作可能に連結されている。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接する３つの選択マーカー及びＩＲＥＳを含み、ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに動作可能に連結されている。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接する３つの選択マーカー及びＩＲＥＳを含み、ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに動作可能に連結されている。特定の実施形態では、第３の選択マーカーは、第１又は第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、プロモーターに動作可能に連結された第１の選択マーカー及びＩＲＥＳに動作可能に連結された第２の選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモーターに動作可能に連結されたグルタミン合成酵素選択マーカー及びＩＲＥＳに動作可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに動作可能に連結されたチミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカー並びにＩＲＥＳに動作可能に連結されたＧＦＰ選択マーカーを含む。
【0071】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している。特定の実施形態では、３つのＲＲＳはすべて同一である。特定の実施態様では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ又は第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、３つのＲＲＳはすべて異種特異的である。
【0072】
３．２ 目的の配列（ＳＯＩ）
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び少なくとも１つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ又はそれを超えるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＳＯＩは同一である。特定の実施形態では、ＳＯＩは異なっている。
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び少なくとも１つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ又はそれを超えるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＳＯＩは同一である。特定の実施形態では、ＳＯＩは異なっている。
【0073】
特定の実施形態では、ＳＯＩは、単鎖抗体又はその断片をコードする。特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体重鎖配列又はその断片をコードする。特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体軽鎖配列又はその断片をコードする。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、第２の抗体重鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、第１の抗体軽鎖配列又はその断片をコードするＳＯＩ、及び抗体軽鎖配列又はその断片をコードする第２のＳＯＩを含む。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードするＳＯＩの数は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの所望の発現レベルを達成するように、例えば所望の量の二重特異性抗体生産を達成するように選択することができる。特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードする個々のＳＯＩは、例えば、単一の組み込み部位に存在する単一の外因性核酸配列に、単一の組み込み部位に存在する複数の外因性核酸配列に、又はＴＩ宿主細胞内の異なる組み込み部位に組み込まれた複数の外因性核酸配列に、組み込むことができる。
【0074】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、ＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカー又は少なくとも１つの外因性ＳＯＩの隣りに位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び２つのＲＲＳを含む。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは同一である。特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは異なっている。特定の実施形態では、第１の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は、選択マーカーの５’に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカー及び外因性ＳＯＩの３’に位置する。
【0075】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ及び２つの外因性ＳＯＩを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１のＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間に位置し、第２のＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１のＳＯＩと第２のＳＯＩとは異なっている。特定の実施態様では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ又は第２のＲＲＳとは異なっている。特定の実施形態では、３つのＲＲＳはすべて異種特異的である。特定の実施形態では、第１のＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３部位であり、第２のＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ部位であり、第３のＲＲＳはＬｏｘＦａｓ部位である。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、１つの外因性ＳＯＩ、及び１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、ＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３との間に位置し、選択マーカーは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、２つの外因性ＳＯＩ、及び１つの選択マーカーを含む。特定の実施形態では、第１のＳＯＩ及び選択マーカーは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間に位置し、第２のＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。
【0076】
特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、目的のポリペプチドをコードする。そのような目的のポリペプチドは、抗体、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、ワクチンタンパク質、又は治療機能を有するタンパク質を含む群から選択することができるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、抗体又はその抗原結合断片をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）又はＦｃ融合タンパク質をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（又は複数のＳＯＩ）は、標準抗体をコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（又は複数のＳＯＩ）は、半抗体、例えば、限定されないが、本開示の抗体Ｂ、Ｑ、Ｔ及びｍＡｂＩをコードする。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（又は複数のＳＯＩ）は、複合抗体をコードする。特定の実施形態では、複合抗体は、二重特異性抗体、例えば、本開示の二重特異性分子Ａ、二重特異性分子Ｂ、二重特異性分子Ｃ、又は二重特異性分子Ｄでありうるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、少なくとも１つのシス作用性エレメント、例えば、プロモーター又はエンハンサーに動作可能に連結される。特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、ＣＭＶプロモーターに動作可能に連結される。
【0077】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳと、２つのＲＲＳの間に位置する少なくとも２つの外因性ＳＯＩとを含む。特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。特定の実施形態では、抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳの間に位置する。
【0078】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ及び少なくとも２つの外因性ＳＯＩを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間に位置し、少なくとも１つのＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施態様では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳ又は第２のＲＲＳとは異なっている。特定の実施形態では、３つのＲＲＳはすべて異種特異的である。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間に位置し、第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間に位置し、第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間に位置し、第１の抗体の１本の軽鎖、並びに第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、第１の抗体の１本の重鎖及び３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間に位置し、第１の抗体の２本の軽鎖、並びに第２の抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施形態では、複数の抗体の重鎖及び軽鎖のコピーの異なる組み合わせをコードするＳＯＩは、第１のＲＲＳと第３のＲＲＳのＲＲＳとの間、並びに第３のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。
【0079】
特定の実施形態では、ＳＯＩの数は、ＳＯＩを発現する宿主細胞の力価及び／又は比生産性を増加させるように選択される。例えば、限定しないが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又はそれを超えるＳＯＩの組み込みは、力価及び／又は比生産性の増加をもたらすことができる。
【0080】
抗体発現に関連して、ＳＯＩをコードするさらなる重鎖又は軽鎖を含めると、力価及び／又は比生産性を増加させることができる。例えば、限定しないが、コピー数を１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードする配列（ＨＬ）から１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードする配列（ＨＬＬ）に増加させると、力価及び／又は比生産性の増加を達成することができる。同様に、以下の実施例で概説するように、ＨＬＬ（３つのＳＯＩ）からＨＬＬ－ＨＬ（５つのＳＯＩ）又はＨＬＬ－ＨＬＬ（６つのＳＯＩ）に増加させると、力価及び／又は比生産性の増加を提供することができる。加えて、コピー数をＨＬＬ－ＨＬ（５つのＳＯＩ）又はＨＬＬ－ＨＬＨＬ（７つのＳＯＩ）に増加させることにより、力価及び／又は比生産性の増加を提供することができ。重鎖及び軽鎖のＳＯＩコピー数のさらなる選択肢には、限定されないが、ＨＨＬ；ＨＨＬ－Ｈ；ＨＬＬ－Ｈ；ＨＨＬ－ＨＨ；ＨＨＬ－ＨＬ；ＨＨＬ－ＬＬ；ＨＬＬ－ＨＨ；ＨＬＬ－ＨＬ；ＨＬＬ－ＬＬ；ＨＨＬ－ＨＨＬ；ＨＨＬ－ＨＨＨ；ＨＨＬ－ＨＬＬ；ＨＨＫ－ＬＬＬ；ＨＬＬ－ＨＨＬ；ＨＬＬ－ＨＨＨ；ＨＬＬ－ＬＬＬ；ＨＨＬ－ＨＨＨＬ；ＨＨＬ－ＨＨＨＨ；ＨＨＬ－ＨＨＬＬ；ＨＨＬ－ＨＬＬＬ；ＨＨＬ－ＬＬＬＬ；ＨＬＬ－ＨＨＨＬ；ＨＬＬ－ＨＨＨＨ；ＨＬＬ－ＨＬＬＬ；及びＨＬＬ－ＬＬＬＬが含まれる。特定の実施形態では、追加のコピーの包含は単一のゲノム遺伝子座で起こるが、特定の実施形態では、ＳＯＩコピーは２つ以上の遺伝子座に組み込むことができ、例えば、複数のコピーを単一の遺伝子座に組み込むことができ、１つ以上のコピーを１つ以上の追加の遺伝子座に組み込むことができる。
【0081】
特定の実施形態では、ＳＯＩの位置、例えば、１つのＳＯＩが別のＳＯＩに対して３’又は５’に位置するかどうかは、ＳＯＩを発現する宿主細胞の力価及び／又は比生産性を高めるように選択される。例えば、限定しないが、抗体生成に関連して、重鎖及び軽鎖ＳＯＩの組み込み位置は、力価及び／又は比生産性の増加をもたらすことができる。特定の実施形態では、重鎖と軽鎖のＳＯＩの相対的な位置は、ＳＯＩのコピー数に変化がなくとも、力価及び比生産性に影響を与えることができる。
【0082】
４．宿主細胞
本開示の主題は、ヌクレオチド配列の標的化組み込み及び目的のポリペプチドの発現に適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２及びそれらと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される内因性の遺伝子、又は宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含み、遺伝子座は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分、並びに配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本開示の主題は、ヌクレオチド配列の標的化組み込み及び目的のポリペプチドの発現に適した宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２及びそれらと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される内因性の遺伝子、又は宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含み、遺伝子座は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分、並びに配列番号１～７及びそれと少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0083】
特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
【0084】
特定の実施形態では、宿主細胞は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胚腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３又は２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるような、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される。
【0085】
特定の実施形態では、宿主細胞は、細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、一定数の世代にわたって培養された細胞株である。特定の実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。
【0086】
特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、発現レベルが特定のレベルに維持され、１０、２０、３０、５０、１００、２００又は３００世代にわたって２０％未満で増加又は減少する場合、安定である。特定の実施形態では、いかなる選択もせずに培養物を維持することができる場合、目的のポリペプチドの発現は安定である。特定の実施形態では、目的の遺伝子のポリペプチド生成物が約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、又は約１６ｇ／Ｌに達する場合、目的のポリペプチドの発現は高い。
【0087】
本開示の主題はまた、目的のポリペプチドを生成するための方法に関する。特定の実施形態では、このような方法は：ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分、並びに配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、宿主細胞を提供することと；ｂ）ａ）の細胞を、ＳＯＩを発現させるために適した条件下で培養し、そこから目的のポリペプチドを回収することとを含む。特定の実施形態では、このような方法は：ａ）宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分、並びに配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３のＲＲＳと隣接しており、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び第３のＲＲＳと隣接している、宿主細胞を提供することと；ｂ）ａ）の細胞を、ＳＯＩを発現させるために適した条件下で培養し、そこから目的のポリペプチドを回収することとを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供することと；ｂ）ａ）の細胞を、ＳＯＩを発現させるために適した条件下で培養し、そこから目的のポリペプチドを回収することとを含む。特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供することであって、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３のＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び第３のＲＲＳに隣接する、宿主細胞を提供することと；ｂ）ａ）の細胞を、ＳＯＩを発現させるために適した条件下で培養し、そこから目的のポリペプチドを回収することとを含む。
【0088】
特定の実施形態では、目的のポリペプチドが生成されて細胞培養培地中に分泌される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、宿主細胞内で発現及び保持される。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、宿主細胞膜で発現、挿入、及び保持される。
【0089】
目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション又は注入を含むがこれらに限定されない従来の細胞生物学的方法によって宿主細胞に導入することができる。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、脂質ベースのトランスフェクション法、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション法、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション法、又はナノ粒子ベースのトランスフェクションを含む化学ベースのトランスフェクション法によって、宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス媒介形質導入を含むがこれらに限定されないウイルス媒介形質導入によって、宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチド又はベクターは、遺伝子銃媒介注入によって宿主細胞に導入される。特定の実施形態では、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方は、本明細書中に記載される方法を使用して宿主細胞に導入される。
【0090】
５．標的化組み込み
標的化組み込みは、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムの１つ以上の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組み込みは、１つ以上のＲＲＳを認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組み込みは、相同組み換えによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組み込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてＨＤＲ及び／又はＮＨＥＪによって媒介される。
標的化組み込みは、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムの１つ以上の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施形態では、標的化組み込みは、１つ以上のＲＲＳを認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組み込みは、相同組み換えによって媒介される。特定の実施形態では、標的化組み込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてＨＤＲ及び／又はＮＨＥＪによって媒介される。
【0091】
特定の実施形態では、標的化組み込みは、ランダム組み込みと組み合わせることができる。特定の実施形態では、標的化組み込みに続いてランダム組み込みを行うことができる。特定の実施形態では、ランダム組み込みは、当技術分野において既知の任意の方法又はシステムにより媒介されうる。特定の実施形態では、ランダム組み込みは、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）エレクトロポレーションシステムにより媒介される。
【0092】
５．１．リコンビナーゼ媒介組み換えを介した標的化組み込み
「組み換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組み換え事象のために必要且つ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳは、組み換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めるために使用することができる。
「組み換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識され、リコンビナーゼに媒介された組み換え事象のために必要且つ十分である、ヌクレオチド配列である。ＲＲＳは、組み換え事象が起こると考えられるヌクレオチド配列中の位置を定めるために使用することができる。
【0093】
特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。
【0094】
特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識されうる。特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識されうる。
【0095】
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組み換えを実施するためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組み換えを実施するためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰ又はＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組み換えを実施するためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰ又はφＣ３１ ａｔｔＢ部位である場合の特定の実施形態では、宿主細胞は、組み換えを実施するためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。リコンビナーゼは、酵素のコード配列を含む発現ベクターを使用して、宿主細胞に導入することができる。
【0096】
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組み換え系は、多くの生物学的実験系において広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する、３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内組み換え及び分子間組み換えの両方を媒介することができる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐの逆方向反復に隣接する８ｂｐの非パリンドロームコア領域で構成されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは、１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内での組み換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介組み換えは、高い効率で起こり、他のいかなる宿主因子も必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上に同じ向きで配置されている場合、Ｃｒｅ媒介組み換えは、それら２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列を、共有結合的に閉じた環として切除する。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上に逆向きの位置で配置されている場合、Ｃｒｅ媒介組み換えは、それら２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の向きを逆にする。ＬｏｘＰ配列は、異なる染色体上に配置されて、異なる染色体間の組み換えを促進することもできる。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上に存在する場合、且つ一方のＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅ媒介組み換えの結果、環状ＤＮＡ配列の組み込えが生じる。
【0097】
特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、変異体ＬｏｘＰ配列である。変異体ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ媒介組み込み又は置換の効率を高めるために開発された。特定の実施形態では、変異体ＬｏｘＰ配列は、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、及びＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列では、左側の１３ｂｐの反復で５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列は、右の１３ｂｐ反復中で５ｂｐが変異している。野生型ＬｏｘＰ配列及び変異体ＬｏｘＰ配列の両方は、Ｃｒｅ依存性組み換えを媒介することができる。
【0098】
ＦＬＰ－ＦＲＴ部位特異的組み換え系は、Ｃｒｅ－Ｌｏｘシステムに類似している。それは、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μｍプラスミドに由来するフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼを含む。ＦＬＰはまた、チロシンファミリー部位特異的リコンビナーゼに属する。ＦＲＴ配列は、各々が８ｂｐのスペーサーに隣接する１３ｂｐの２つの回文配列からなる３４ｂｐの配列である。ＦＬＰは、１３ｂｐの回文配列に結合し、８ｂｐスペーサー内のＤＮＡ破壊、交換及びライゲーションを媒介する。Ｃｒｅリコンビナーゼと同様に、２つのＦＲＴ配列の位置及び配向によって、ＦＬＰ媒介組み換えの結果が決定される。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、変異体ＦＲＴ配列である。野生型及び変異体のＦＲＴ配列の両方は、ＦＬＰ依存性組み換えを媒介することができる。特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、限定されないが、タモキシフェン応答性受容体ドメイン配列などの応答性受容体ドメイン配列に融合される。
【0099】
Ｂｘｂ１及びφＣ３１はセリンリコンビナーゼファミリーに属する。それらはいずれもバクテリオファージに由来し、溶原性を確立して細菌ゲノムへのファージゲノムの部位特異的組み込みを促進するために、これらバクテリオファージによって使用される。これらのインテグラーゼは、ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列と呼ばれる短い（４０～６０ｂｐ）ＤＮＡ基質間の部位特異的組み換え事象を触媒し、その配列は、それぞれファージＤＮＡ及び細菌ＤＮＡ上に位置する元々の付着部位である。組み換え後、２つの新しい配列が形成され、これらはａｔｔＬ配列及びａｔｔＲ配列と呼ばれ、各々がａｔｔＰ及びａｔｔＢに由来する半分の配列を含む。組み換えはまた、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間で起こり、組み込まれたファージを細菌ＤＮＡから切り出すことができる。両方のインテグラーゼは、さらなる宿主因子の助けを借りずに組み換えを触媒しうる。補助因子がまったく存在しない場合、これらインテグラーゼは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間の一方向性の組み換えを、８０％を上回る効率で媒介する。これらのインテグラーゼによって認識されうる短いＤＮＡ配列及び一方向性組み換えのために、これら組み換え系は、遺伝子工学の目的のために広く使用されているＣｒｅ－ＬｏｘＰ系及びＦＲＴ－ＦＬＰ系の補完物として開発された。
【0100】
「一致ＲＲＳ」及び「同種特異性ＲＲＳ」という用語は、２つのＲＲＳ間で組み換えが起こることを示す。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは同じである。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＬｏｘＰ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、どちらのＲＲＳも、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは、異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識されうる。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。特定の実施形態では、第１の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２の一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
【0101】
特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、ベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む、即ち、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳがベクター上の第１のＲＲＳと一致し、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳがベクター上の第２のＲＲＳと一致する。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及びベクター上の第１のＲＲＳは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及びベクター上の第２のＲＲＳと同一である。そのような「単一ベクターＲＭＣＥ」戦略の非限定的な例を図２Ａに示す。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及びベクター上の第１のＲＲＳは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及びベクター上の第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施形態では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及びベクター上の第１のＲＲＳは、いずれもＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及びベクター上の第２のＲＲＳは、いずれもＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。
【0102】
特定の実施形態では、「２ベクターＲＭＣＥ」戦略が用いられる。例えば、限定されないが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）との間に存在する構成を含むことができ、第１のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第３及び第２のＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む。２ベクターＲＭＣＥ戦略の例を図４に示す。そのような例において、ＲＲＳ１、ＲＲＳ２及びＲＲＳ３は、異種特異的であり、例えば、それらは互いに交差反応しない。いくつかの実施形態では、１つのベクター（前方）は、ＲＲＳ１、第１のＳＯＩ及びプロモーターに続いて、開始コドン及びＲＲＳ３を（この順序で）含む。他方のベクター（後方）は、開始コドン（ＡＴＧ）を含まないマーカーのコード配列に融合したＲＲＳ３、ＳＯＩ２及びＲＲＳ２を（この順で）含む。融合タンパク質のインフレーム翻訳を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列との間に追加のヌクレオチドが挿入されてもよい。いくつかの実施形態では、第１のＳＯＩは抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第２のＳＯＩは抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質である。特定の実施形態では、第１のＳＯＩ及び第２のＳＯＩによってコードされる抗体が対合して、多重特異性、例えば二重特異性抗体を形成する。
【0103】
このような２ベクターＲＭＣＥ戦略では、ＲＲＳの各対間に適切な数のＳＯＩを組み込むことにより、８つ以上のＳＯＩの導入が可能になる。
【0104】
単一ベクター及び２ベクターＲＭＣＥはいずれも、１つ以上のドナーＤＮＡ分子を宿主細胞のゲノムの所定の部位における一方向組み込み、及びドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡカセットと、組み込み部位が残存する宿主ゲノム上のＤＮＡカセットとの正確な交換を可能にする。ＤＮＡカセットは、少なくとも１つの選択マーカー（但し、特定の２ベクターＲＭＣＥの例では、本明細書で概説するように「分割選択マーカー」を使用できる）、及び／又は少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを特徴とする。ＲＭＣＥは、二重組み換えクロスオーバー事象を伴い、この事象は、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間で、リコンビナーゼによって触媒される。ＲＭＣＥは、ＳＯＩ又は選択マーカーのコピーを宿主細胞のゲノムの所定の遺伝子座に導入するように設計されている。１回のみのクロスオーバー事象を伴う組み換えとは異なり、ＲＭＣＥは、原核生物のベクター配列が宿主細胞のゲノムに導入されないように実行することができるので、宿主の免疫又は防御機制の望ましくないトリガーを低減及び／又は防止する。ＲＭＣＥの手順を、複数のＤＮＡカセットに繰り返すことができる。
【0105】
特定の実施形態では、標的化組み込みは、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーと隣り合う１つのＲＲＳを含む１つの外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞のゲノムの所定の部位に組み込まれる１つのクロスオーバー組み換え事象によって達成される。特定の実施形態では、標的化組み込みは、１回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーを含むＤＮＡカセットが、宿主細胞のゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組み込みは、２回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーを各々が含む２つの異なるＤＮＡカセットが、いずれも宿主細胞のゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、標的化組み込みは、複数回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ又は少なくとも１つの選択マーカーを各々が含む複数のベクター由来のＤＮＡカセットが、宿主細胞のゲノムの所定の部位に組み込まれる。特定の実施形態では、選択マーカーは、両方のＲＭＣＥの組み込みが選択マーカーの発現を可能にするように、一部が第１のベクター上でコードされ、一部が第２のベクター上でコードされうる。このような系の例を図４に示している。
【0106】
特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介組み換えを介した標的化組み込みは、原核生物ベクターに由来する配列に沿って宿主細胞のゲノムの１つ以上の所定の組み込み部位に組み込まれた選択マーカー又は１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介組み換えを介した標的化組み込みは、原核生物ベクター由来の配列を含まない宿主細胞のゲノムの１つ以上の所定の組み込み部位に組み込まれた選択マーカー又は１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。
【0107】
５．２ 相同組み換え、ＨＤＲ、又はＮＨＥＪを介した標的化組み込み
本開示の主題はまた、相同組み換えによって、又は外因性部位特異的ヌクレアーゼとそれに続くＨＤＲ若しくはＮＨＥＪによって媒介される標的化組み込みに関する。
本開示の主題はまた、相同組み換えによって、又は外因性部位特異的ヌクレアーゼとそれに続くＨＤＲ若しくはＮＨＥＪによって媒介される標的化組み込みに関する。
【0108】
相同組み換えは、広範な配列相同性を共有するＤＮＡ分子間の組み換えである。それは、二本鎖ＤＮＡ破壊のエラーのない修復を誘導するために使用することができ、減数分裂中に配偶子の配列多様性を生成する。相同組み換えは、２つの相同ＤＮＡ分子間の遺伝情報の交換を伴うので、染色体上の遺伝子の全体的な配置を変化させない。相同組み換えの間、ニック又は破壊が二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に形成され、続いて単鎖ＤＮＡ末端による相同ｄｓＤＮＡ分子の侵入、相同配列の対形成、ホリディジャンクションを形成するための分岐移動、及び最終的なホリディジャンクションの分離が起こる。
【0109】
二本鎖破壊（ＤＳＢ）は、ＤＮＡ損傷の最も深刻な形態であり、そのようなＤＮＡ損傷の修復は、すべての生物体におけるゲノム完全性の維持に不可欠である。ＤＳＢを修復するためには２つの主な修復経路がある。第１の修復経路は相同指向性修復（ＨＤＲ）経路であり、相同組み換えはＨＤＲの最も一般的な形態である。ＨＤＲは細胞内に存在する相同ＤＮＡの存在を必要とするので、この修復経路は通常、細胞周期のＳ期及びＧ２期において活性であり、新しく複製された姉妹染色分体が相同鋳型として利用可能である。ＨＤＲはまた、ＤＮＡ複製中に崩壊した複製フォークを修復するための主要な修復経路である。ＨＤＲは、比較的エラーのない修復経路と考えられている。ＤＳＢの第２の修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。ＮＨＥＪは、相同ＤＮＡ鋳型を必要とせずに、破壊されたＤＮＡの末端が一緒に連結される修復経路である。
【0110】
標的化組み込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼに続いてＨＤＲによって促進されうる。これは、特定の標的ゲノム部位にＤＳＢを導入することにより、相同組み換えの頻度を高めることができるためである。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択することができる。
【0111】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びＴＡＬＥＮシステムは、最も容易な構築及び高い効率を提供する２つのゲノム編集ツールである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、侵入バクテリオファージに対する細菌の免疫防御機制として同定された。Ｃａｓは、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって誘導されると、細胞内の特定のヌクレオチド配列と会合し、例えば単鎖破壊、ＤＳＢ、及び／又は点突然変異の１つ又は複数を行なうことによって、そのヌクレオチド配列内又はその周囲のＤＮＡを編集することのできるヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであり、ＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）のＤＮＡ結合ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインから構成される。ＤＮＡ結合ドメインのモノマーの高度可変残基領域に存在するアミノ酸を変化させることによって、様々なヌクレオチド配列を標的とする異なる人工ＴＡＬＥＮを作製することができる。ＤＮＡ結合ドメインはその後、ヌクレアーゼを標的配列に向け、ＤＳＢを作成する。
【0112】
相同組み換え又はＨＤＲによる標的化組み込みは、組み込み部位に対する相同配列の存在を含む。特定の実施形態では、相同配列は、ベクター上に存在する。特定の実施形態では、相同配列は、ポリヌクレオチド上に存在する。
【0113】
特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのベクターは、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つコンティグ配列の一部分を含む内因性配列、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子、又は少なくとも１つの選択マーカーに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのベクターは、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分を含む内因性配列、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子、又は少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組み込みのためのベクターは、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分、並びにＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組み込みのためのベクターは、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列、又はＤＮＡカセットに隣接するＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ベクターヌクレオチド配列は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組み込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、及びプラスミドからなる群から選択される。
【0114】
特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのポリヌクレオチドは、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つコンティグ配列の一部分の内因性配列、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子、又は少なくとも１つの選択マーカーに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのポリヌクレオチドは、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子、又は少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組み込みのためのポリヌクレオチドは、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組込みのためのポリヌクレオチドは、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つコンティグ配列の一部分の内因性配列、又はＤＮＡカセットに隣接するＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子と相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。特定の実施形態では、隣接するヌクレオチド配列は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される遺伝子、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。
【0115】
特定の実施形態では、相同組み換えは、補助因子を何ら用いることとなく実行される。特定の実施形態では、相同組み換えは、組み込み可能なベクターの存在によって促進される。特定の実施形態では、組み込みベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター及び組み込みファージベクターからなる群から選択される。
【0116】
５．３ 調節された標的化組み込み
主にコードされるタンパク質が発現困難であるために、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多い。発現困難なタンパク質の低い発現レベルは、原因を特定するのが困難な種々の原因を有しうる。１つの可能性は、宿主細胞中で発現するタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現系を使用して、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、毒性タンパク質を発現させることができる。これらの系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないが、テトラサイクリン又はそのアナログ、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）などの小分子が培養物に付加された場合にのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用を緩和することができ、培養物が生成前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。特定の実施形態では、調節された標的化組み込み（ＲＴＩ）系は、特定の遺伝子座、例えば１つ以上のＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに動作可能に連結された調節プロモーター下で転写されるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＲＴＩ系を使用して、発現困難な分子、例えば、限定されないが、抗体の低いタンパク質発現の根本原因を決定することができる。特定の実施形態では、ＲＴＩ系におけるＳＯＩの発現を選択的に停止する能力を使用して、ＳＯＩの発現を観察された有害作用に結び付けることができる。
主にコードされるタンパク質が発現困難であるために、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多い。発現困難なタンパク質の低い発現レベルは、原因を特定するのが困難な種々の原因を有しうる。１つの可能性は、宿主細胞中で発現するタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現系を使用して、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合、毒性タンパク質を発現させることができる。これらの系では、発現困難なタンパク質の発現は、制御因子、例えば、限定されないが、テトラサイクリン又はそのアナログ、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）などの小分子が培養物に付加された場合にのみ促進される。毒性タンパク質の発現を調節することにより、毒性作用を緩和することができ、培養物が生成前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。特定の実施形態では、調節された標的化組み込み（ＲＴＩ）系は、特定の遺伝子座、例えば１つ以上のＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに動作可能に連結された調節プロモーター下で転写されるＳＯＩを含む。特定の実施形態では、ＲＴＩ系を使用して、発現困難な分子、例えば、限定されないが、抗体の低いタンパク質発現の根本原因を決定することができる。特定の実施形態では、ＲＴＩ系におけるＳＯＩの発現を選択的に停止する能力を使用して、ＳＯＩの発現を観察された有害作用に結び付けることができる。
【0117】
特定の実施形態では、発現困難な分子の根本原因の分析中に転写及び細胞株多様性の影響を最小限に抑えるために、調節された標的化組み込み（ＲＴＩ）系を使用することができる。例えば、限定しないが、ＴＩ宿主におけるＳＯＩの発現は、調節因子、例えばドキシサイクリンの培養物への付加によってトリガーすることができる。特定の実施形態では、ＲＴＩベクターは、テトラサイクリン調節プロモーターを利用してＳＯＩを発現し、これは、例えば、ＲＲＳを含む外因性核酸配列中に組み込むことができ、ＲＲＳ自体は宿主細胞のゲノム内の組み込み部位に組み込まれ、ＳＯＩの調節された発現を可能にする。
特定の実施形態では、コントロール細胞株と比較して、ＳＯＩ、例えば治療用抗体のタンパク質発現が低いことの１つ又は複数の根本原因をうまく決定するために、本開示に記載されるＲＴＩ系を使用することができる。特定の実施形態では、ＲＴＩ細胞株におけるＳＯＩ、例えば治療用抗体の発現が相対的に低いことが確認されたら、タンパク質翻訳阻害剤処理、例えば、Ｄｏｘ及びシクロヘキシミドを活用することによって、ＳＯＩの細胞内蓄積及び分泌レベルを評価することができる。
特定の実施形態では、コントロール細胞株と比較して、ＳＯＩ、例えば治療用抗体のタンパク質発現が低いことの１つ又は複数の根本原因をうまく決定するために、本開示に記載されるＲＴＩ系を使用することができる。特定の実施形態では、ＲＴＩ細胞株におけるＳＯＩ、例えば治療用抗体の発現が相対的に低いことが確認されたら、タンパク質翻訳阻害剤処理、例えば、Ｄｏｘ及びシクロヘキシミドを活用することによって、ＳＯＩの細胞内蓄積及び分泌レベルを評価することができる。
【0118】
５．４ 調節された系
本開示の主題はまた、ＴＩで使用するための調節された系に関する。例えば、限定しないが、そのような調節は、転写抑制因子又は活性化因子と構成的プロモーター又は最小プロモーターとの調節されたカップリングによってｍＲＮＡ合成をブロック又は活性化するための遺伝子スイッチに基づきうる。特定の非限定的な実施形態では、抑制は、例えば、転写開始を立体的にブロックするリプレッサータンパク質に結合することによって、又は転写サイレンサーを介して転写を能動的に抑制することによって、達成されうる。特定の非限定的な実施形態では、哺乳動物又はウイルスのエンハンサーレス最小プロモーターの活性化は、活性化ドメインへの調節されたカップリングによって達成されうる。
本開示の主題はまた、ＴＩで使用するための調節された系に関する。例えば、限定しないが、そのような調節は、転写抑制因子又は活性化因子と構成的プロモーター又は最小プロモーターとの調節されたカップリングによってｍＲＮＡ合成をブロック又は活性化するための遺伝子スイッチに基づきうる。特定の非限定的な実施形態では、抑制は、例えば、転写開始を立体的にブロックするリプレッサータンパク質に結合することによって、又は転写サイレンサーを介して転写を能動的に抑制することによって、達成されうる。特定の非限定的な実施形態では、哺乳動物又はウイルスのエンハンサーレス最小プロモーターの活性化は、活性化ドメインへの調節されたカップリングによって達成されうる。
【0119】
特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件付きカップリングは、外部刺激に応答してプロモーターに結合するアロステリックタンパク質を使用することによって達成されうる。特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件付きカップリングは、隔離タンパク質から放出され、したがって標的プロモーターに結合することのできる細胞内受容体を使用することによって達成されうる。特定の実施形態では、転写抑制因子又は転写活性化因子の条件付きカップリングは、化学的に誘導された二量化剤を使用することによって達成されうる。
【0120】
特定の実施形態では、本開示のＴＩ系で使用されるアロステリックタンパク質は、抗生物質、細菌クオラムセンシングメッセンジャー、異化産物、又は例えば低温若しくは熱といった温度などの培養パラメーターに応答して転写活性を調節するタンパク質でありうる。特定の実施形態では、そのようなＲＴＩ系は、例えば、代替炭素源の異化遺伝子を制御する細菌抑制因子が哺乳動物細胞に移入されている異化産物に基づくものでありうる。特定の実施形態では、標的プロモーターの抑制は、リプレッサーＣｙｍＲのクマート（ｃｕｍａｔｅ）応答性結合によって達成されうる。特定の実施形態では、異化産物に基づく系は、単純ヘルペスＶＰ１６転写活性化ドメインに融合した、原核生物リプレッサーＨｄｎｏＲの６－ヒドロキシニコチン応答性結合によるキメラプロモーターの活性化に依存しうる。
【0121】
特定の実施形態では、ＴＩ系は、クオラムセンシング分子による集団内及び集団間のコミュニケーションを管理する原核生物に由来するクオラムセンシングベースの発現系でありうる。これらクオラムセンシング分子は、標的細胞中の受容体に結合し、同族プロモーターに対する受容体の親和性を調節し、特異的レギュロンスイッチの開始をもたらす。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、Ｎ－（３－オキソ－オクタノイル）－ホモセリンラクトンとすることができ、その存在下で、ＴｒａＲ－ｐ６５融合タンパク質が、ＴｒａＲ特異的オペレーター配列に融合した最小プロモーターからの発現を活性化する。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ＳＣＢ１の非存在下でその同族オペレーターＯＳｃｂＲに結合するストレプトマイセス・セリカラーＡ３（２）ＳｃｂＲ抑制因子に基づく系におけるブチロラクトンＳＣＢ１（ラセミ２－（１’－ヒドロキシ－６－メチルヘプチル）－３－（ヒドロキシメチル）ブタノリド）とすることができる。特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ＲＴＩ系で使用されるホモセリン由来誘導因子とすることができ、緑膿菌クオラムセンシング抑制因子ＲｈｌＲ及びＬａｓＲがＳＶ４０Ｔ抗原核局在化配列及び単純ヘルペスＶＰ１６ドメインに融合され、特定のオペレーター配列（ｌａｓボックス）を含むプロモーターを活性化しうる。
【0122】
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩ系で使用されるアロステリックタンパク質を調節する誘導分子は、クマート、イソプロピル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、マクロライド、６－ヒドロキシニコチン、ドキシサイクリン、ストレプトグラミン、ＮＡＤＨ、テトラサイクリンとすることができるが、これらに限定されない。
【0123】
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩ系で使用される細胞内受容体は、細胞質又は核受容体とすることができる。特定の実施形態では、本開示のＲＴＩ系は、小分子を使用することによるタンパク質の隔離及び阻害からの転写因子の放出を利用することができる。特定の実施形態では、本開示のＲＴＩ系は、ステロイド調節に依存することができ、ホルモン受容体は、サイトゾルにおいてＨＳＰ９０から放出されうる天然又は人工の転写因子に融合され、核内に移動し、選択されたプロモーターを活性化する。特定の実施形態では、内因性ステロイドホルモンによるクロストークを回避するために、合成ステロイドアナログによって調節される変異体受容体を使用することができる。特定の実施形態では、受容体は、４－ヒドロキシタモキシフェンに応答性のエストロゲン受容体バリアント又はＲＵ４８６によって誘導可能なプロゲステロン受容体変異体とすることができる。特定の実施形態では、ヒト核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に基づく核受容体由来ロシグリタゾン応答性転写スイッチを、本開示のＲＴＩ系に使用することができる。特定の実施形態では、ステロイド応答性受容体のバリアントは、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈとすることができ、これは、修飾されたトウヒノシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）エクジソン受容体及びＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及びＶＰ１６トランス活性化因子に融合されたマウスレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に基づく。合成エクジソンの存在下において、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈバリアントは、Ｇａｌ４応答エレメントのいくつかの反復配列に融合した最小プロモーターに結合し、これを活性化することができる。
【0124】
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩ系は、同族オペレーターと融合した最小コアプロモータの活性化のために、ＤＮＡ結合タンパク質の化学的に誘導された二量化及び転写活性化因子を利用することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩ系は、ＦＲＢとＦＫＢＰのラパマイシン調節二量化を利用することができる。この系では、ＦＲＢはｐ６５トランス活性化因子に融合され、ＦＫＢＰは、操作された最小インターロイキン－１２プロモーターの上流に配置される同族オペレーター部位に特異的なジンクフィンガードメインに融合される。特定の実施形態では、ＦＫＢＰは変異しうる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩ系は、細菌ジャイレースＢサブユニット（ＧｙｒＢ）を利用することができ、ＧｙｒＢは、抗生物質クーママイシンの存在下で二量化し、ノボビオシンで解離する。
【0125】
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩ系は、調節されたｓｉＲＮＡ発現のために使用されうる。特定の実施形態では、調節されたｓｉＲＮＡ発現系は、テトラサイクリン、マクロライド、又はＯＦＦ型及びＯＮ型ＱｕｏＲｅｘ系とすることができる。特定の実施形態では、ＲＴＩ系は、５’非翻訳領域にヘアピン構造を形成することによって翻訳開始をブロックするツメガエル末端オリゴピリミジン要素（ＴＯＰ）を利用することができる。
【0126】
特定の実施形態では、本開示に記載されるＲＴＩ系は、気相制御発現、例えばアセトアルデヒド誘導調節（ＡＩＲ）システムを利用することができる。ＡＩＲシステムは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＡｌｃＲ転写因子を使用することができ、これは、非毒性濃度の気体又は液体のアセトアルデヒドの存在下で、最小ヒトサイトメガロウイルスのプロモーターに融合したＡｌｃＲに特異的なオペレーターから組み立てられたＰＡＩＲプロモーターを特異的に活性化する。
【0127】
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩ系は、Ｔｅｔオン又はＴｅｔオフシステムを利用することができる。そのようなシステムでは、１つ以上のＳＯＩの発現は、テトラサイクリン又はそのアナログであるドキシサイクリンによって調節することができる。
【0128】
特定の実施形態では、本開示のＲＴＩ系は、ＰＩＰオン又はＰＩＰオフシステムを利用することができる。そのようなシステムでは、ＳＯＩの発現は、例えば、プリスチナマイシン、テトラサイクリン及び／又はエリスロマイシンによって調節することができる。
【0129】
６．ＴＩ宿主細胞の調製及び使用
本開示の主題は、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組み込みのための方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、その後のＳＯＩの標的化組み込みに適した宿主細胞を生成するための、外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への組み込みに関する。特定の実施形態では、前記方法は、リコンビナーゼ媒介組み換えを含む。特定の実施形態では、前記方法は、相同組み換え、ＨＤＲ及び／又はＮＨＥＪを含む。
本開示の主題は、宿主細胞への外因性ヌクレオチド配列の標的化組み込みのための方法に関する。特定の実施形態では、本方法は、その後のＳＯＩの標的化組み込みに適した宿主細胞を生成するための、外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への組み込みに関する。特定の実施形態では、前記方法は、リコンビナーゼ媒介組み換えを含む。特定の実施形態では、前記方法は、相同組み換え、ＨＤＲ及び／又はＮＨＥＪを含む。
【0130】
特定の実施形態では、本開示の主題は、外因性ヌクレオチド配列の同じ宿主細胞へのランダム組み込みと組み合わせた、外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への標的化組み込みのための方法に関する。特定の実施形態では、方法は、同じ又は異なるＳＯＩのランダム組み込みと組み合わせた、その後のＳＯＩの標的化組み込みに適した宿主細胞を生成するための、外因性ヌクレオチド配列の宿主細胞への組み込みに関する。特定の実施形態では、前記方法は、リコンビナーゼ媒介組み換えを含む。特定の実施形態では、前記方法は、相同組み換え、ＨＤＲ及び／又はＮＨＥＪを含む。
【0131】
６．１ リコンビナーゼ媒介組み換えを使用したＴＩ宿主細胞の調製
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること；ｂ）ａ）で供給された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること；並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること；ｂ）ａ）で供給された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること；並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0132】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される内因性遺伝子内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で供給された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること、並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0133】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第１のＤＮＡカセットを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第２のＤＮＡカセットを含むベクターを導入すること、ｃ）ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを１回実施するリコンビナーゼを導入することで、並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0134】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は：ａ）コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列内の部位、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される遺伝子に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第１のＤＮＡカセットを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること；ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第２のＤＮＡカセットを含むベクターを導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識し、ＲＭＣＥを１回実施するリコンビナーゼを導入すること；並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0135】
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一でも異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべてのＲＲＳが異種特異的である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを導入すること、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼを導入すること、並びにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、上流で第１のＳＯＩに隣接し、下流でＲＲＳに隣接するように位置決めされたコドンＡＴＧに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0136】
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一でも異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列内の部位、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される遺伝子に組み込まれた外因性配列ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべてのＲＲＳが異種特異的である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼを導入すること、並びにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、上流で第１のＳＯＩに隣接し、下流でＲＲＳに隣接するように位置決めされたコドンＡＴＧに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0137】
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一でも異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列と、又は配列番号１～７と、少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳとを含む第１のＤＮＡカセットを含み、３つすべてのＲＲＳが異種特異的である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、第２のＤＮＡカセットを含む第１のベクターを導入することであって、第２のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む、第１のベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供された細胞中に、第３のＤＮＡカセットを含む第２のベクターを導入することであって、第３のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む、第２のベクターを導入すること、ｄ）ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを２回実施する１つ以上のリコンビナーゼを導入すること、並びにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、上流で第１のＳＯＩに隣接し、下流でＲＲＳに隣接するように位置決めされたコドンＡＴＧに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0138】
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的ポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一でも異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列内の部位、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される遺伝子に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳとを含む第１のＤＮＡカセットを含み、３つすべてのＲＲＳが異種特異的である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、第２のＤＮＡカセットを含む第１のベクターを導入することであって、第２のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む、第１のベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供された細胞中に、第３のＤＮＡカセットを含む第２のベクターを導入することであって、第３のＤＮＡカセットが、第１のＤＮＡカセットの第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む、第２のベクターを導入すること、ｄ）ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを２回実施する１つ以上のリコンビナーゼを導入すること、並びにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、上流で第１のＳＯＩに隣接し、下流でＲＲＳに隣接するように位置決めされたコドンＡＴＧに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0139】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列から選択された配列、又は配列番号１～７の配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーと隣り合う１つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること、並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0140】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は：ａ）コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列内の部位、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される遺伝子に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーと隣り合う１つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること；ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーと隣り合う１つのＲＲＳを含む第２のＲＲＳカセットを含むベクターを導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること；並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0141】
本開示の主題はまた、目的のポリペプチドを生成する方法に関し、方法は、ａ）本明細書に記載されるＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するために適した条件下でａ）のＴＩ宿主細胞を培養することを含む。
【0142】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること、並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0143】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列内の部位、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される遺伝子に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること；ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること、並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0144】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、３つのＲＲＳを含むベクターを導入することであって、ベクターの第１のＲＲＳが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳと一致し、ベクターの第２のＲＲＳが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の選択マーカーが、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置している、ベクターを導入すること、ｃ）ベクター及び組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の両方において第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること、並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ宿主細胞を選択し、それにより、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0145】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の内因性配列内の部位、又はＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列からなる群から選択される遺伝子に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、３つのＲＲＳを含むベクターを導入することであって、ベクターの第１のＲＲＳが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳと一致し、ベクターの第２のＲＲＳが、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の選択マーカーが、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する、ベクターを導入すること、ｃ）ベクター及び組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の両方で第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳを認識するリコンビナーゼを導入すること、並びにｄ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ宿主細胞を選択し、それにより、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0146】
６．２ 相同組み換え、ＨＤＲ又はＮＨＥＪを使用した宿主細胞の標的化修飾のための方法
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ＴＩ宿主細胞中にベクターを導入することであって、ベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、ベクターを導入すること、ｃ）ゲノム遺伝子座に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離するために選択マーカーを選択し、目的のポリペプチドを発現させることを含む。特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ＴＩ宿主細胞中にベクターを導入することであって、ベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、ベクターを導入すること、ｃ）ゲノム遺伝子座に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離するために選択マーカーを選択し、目的のポリペプチドを発現させることを含む。特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
【0147】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入することであって、ポリヌクレオチドが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、ポリヌクレオチドを導入すること、ｃ）ゲノムの遺伝子座に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離するために選択マーカーを選択し、目的のポリペプチドを発現させることを含む。特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
【0148】
特定の実施形態では、相同組み換えは、組み込みベクターによって促進される。特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組み込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／又はトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、及びプラスミドからなる群から選択される。特定の実施形態では、トランスポゾンは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾン系でありうる。
【0149】
特定の実施形態では、組み込みは、外因性ヌクレアーゼによって促進される。特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
【0150】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ＴＩ宿主細胞中にベクターを導入することであって、ベクターが、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又はＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーを含む、ベクターを導入すること、ｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0151】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ＴＩ宿主細胞中にポリヌクレオチドを導入することであって、ポリヌクレオチドが、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又はＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーを含む、ポリヌクレオチドを導入すること、ｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組み込みに適切なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0152】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）宿主細胞中にベクターを導入することであって、ベクターが、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又はＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳ及び少なくとも１つの選択マーカーが、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する、ベクターを導入すること、並びにｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0153】
特定の実施形態では、本開示は、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの遺伝子座を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）宿主細胞中にポリペプチドを導入することであって、ポリペプチドが、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又はＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同なヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡカセットが３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳ及び少なくとも１つの選択マーカーが、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する、ポリペプチドを導入すること、並びにｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的化組み込みに適したＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0154】
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内の部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、１つ以上の遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ、又は同リコンビナーゼをコードする核酸を導入すること、並びに第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0155】
特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一でも異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの１つ以上の遺伝子座内の部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、１つ以上の遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１のＲＲＳ及び第２のＲＲＳと、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳとを含み、すべてのＲＲＳが異種特異的である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、少なくとも１つの組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供された細胞中に、少なくとも１つの組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２のベクターを導入すること、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼ、又は同リコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入すること、並びにｅ）第２の選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、少なくとも１つの第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、上流で第１のＳＯＩに隣接し、下流でＲＲＳに隣接するように位置決めされたコドンＡＴＧに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0156】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞のゲノムの１つ以上の遺伝子座内の部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、１つ以上の遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が１つ以上のＲＲＳを含む、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに動作可能に連結された少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ又は同リコンビナーゼをコードする核酸を導入すること、並びにｄ）誘導物質の存在下で外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0157】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させるための方法を提供し、この方法は、ａ）２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩと、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内に組み込まれた調節可能なプロモーターとを含む宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、宿主細胞を提供すること；並びにｂ）ＳＯＩを発現させるために適した条件下で細胞を培養し、そこから目的のポリペプチドを回収することを含む。
【0158】
特定の実施形態では、本開示は、第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチド（第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとは同一でも異なっていてもよい）を発現するＴＩ宿主細胞を調製するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの遺伝子座内の部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供することであって、遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、外因性ヌクレオチド配列が、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、及び第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する第３のＲＲＳを含み、すべてのＲＲＳが異種特異的である、ＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに動作可能に連結された少なくとも１つの第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１のベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供された細胞中に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列上の第２のＲＲＳ及び第３のＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに動作可能に連結された少なくとも１つの第２のＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）ＲＲＳを認識する１つ以上のリコンビナーゼ、又は同リコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入すること、並びにｅ）誘導物質の存在下で少なくとも第１の外因性ＳＯＩ及び第２の外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択し、それにより、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。特定の実施形態では、第１のベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１のベクターは、上流で第１のＳＯＩに隣接し、下流でＲＲＳに隣接するように位置決めされたコドンＡＴＧに動作可能に連結されたプロモーター配列を含み、第２のベクターは、上流でＲＲＳに隣接し、下流で第２のＳＯＩに隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0159】
７．生成物
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子、例えば目的のポリペプチドの発現のために使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用することができる。このようなポリペプチドの非限定的な例には、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、抗体は、治療用抗体である。特定の実施形態では、抗体は、診断用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子、例えば目的のポリペプチドの発現のために使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば哺乳動物のポリペプチドの発現のために使用することができる。このようなポリペプチドの非限定的な例には、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、抗体は、治療用抗体である。特定の実施形態では、抗体は、診断用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【0160】
特定の実施形態では、本明細書における定義に包含されるポリペプチドの例には、例えば、レニンなどの哺乳動物ポリペプチド；ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ－１－抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体化ホルモン；グルカゴン；レプチン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼ又はヒト尿若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ；腫瘍壊死因子受容体、例えば、デスレセプター５及びＣＤ１２０；ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂ－リンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）；増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ－ラクタマーゼ；ＤＮａｓｅ；ＩｇＥ；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ－４；インヒビン；アクチビン；血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）；血管内皮成長因子ファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及びＰ１ＧＦ）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｄ、及びそれらの二量体）；線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、及びＦＧＦ９；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子の受容体、例えば、１つ又は複数のＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３）、１つ又は複数の上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４ 受容体）、１つ又は複数の血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（例えば、ＰＤＧＦＲ－α及びＰＤＧＦＲ－β）、並びに１つ又は複数の線維芽細胞増殖因子受容体；ＴＩＥリガンド（アンジオポイエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）、アンジオポイエチン受容体、例えば、ＴＩＥ１及びＴＩＥ２；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、ニューロトロフィン－５、若しくはニューロトロフィン－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、若しくはＮＴ－６）、又は神経成長因子、例えば、ＮＧＦ－ｂ；トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、又はＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－ベータ；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）；ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、及びＣＤ２０；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４；インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－ベータ、及びインターフェロン－ガンマ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ；サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０；ミッドカイン；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４、及びＶＣＡＭ；エフリン；Ｂｖ８；デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）；Ｄｅｌ－１；ＢＭＰ９；ＢＭＰ１０；ホリスタチン；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）；Ａｌｋ１；Ｒｏｂｏ４；ＥＳＭ１；パールカン；ＥＧＦ様ドメインマルチプル７（ＥＧＦＬ７）；ＣＴＧＦ及びそのファミリーのメンバー；トロンボスポンジン、例えば、トロンボスポンジン１及びトロンボスポンジン２；コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＸＶＩＩＩ；ニューロピリン、例えば、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２；プレイオトロフィン（ＰＴＮ）；プログラニュリン；プロリフェリン；Ｎｏｔｃｈタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４；セマフォリン、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、及びＳｅｍａ３Ｆ；腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣がん抗原）；イムノアドヘシン；並びに上述のポリペプチドのいずれかの断片及び／又はバリアント、並びに、例えば、上述のタンパク質のいずれかを含む１つ以上のタンパク質に結合する抗体断片を含む、抗体が含まれる。
【0161】
特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性又は多重特異性のポリペプチド、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体の様々な分子形式が当技術分野で既知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。本明細書にさらに含まれる特定の種類の多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性型不変成分、例えば、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるためのＣＤ３とに同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。二重特異性抗体形式のさらなる例には、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーにより融合された、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号及び国際公開第２００８／１１９５６７号、ＮＮａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照のこと）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９、２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（“ＴａｎｄＡｂ”；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、さらなる安定化のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、及び全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子である、いわゆるトリオマブ（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０）に概説）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、特定のＴ細胞二重特異性抗体形式は、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
【0162】
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、構成的に又は調節して、目的の治療用タンパク質又は分子を発現させながら、シャペロン、タンパク質修飾酵素、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡ又は他のタンパク質若しくはペプチドの発現のために使用することができる。
【0163】
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現されるポリペプチドは、例えば、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１ ０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ １Ａ、ＩＬ １Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１ ０、ＩＬ １１、ＩＬ １２Ａ、ＩＬ １２Ｂ、ＩＬ １３、ＩＬ １４、ＩＬ １５、ＩＬ １６、ＩＬ １７、ＩＬ １７Ｂ、ＩＬ １８、ＩＬ １９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ １１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯ．ｋからなる群から選択されるサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカイン受容体を含むが、これらに限定されないいずれかのタンパク質に結合しうるか、又はそれと相互作用しうる。
【0164】
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現されるポリペプチドは、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ １３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ １５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ １６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ １７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ １８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ １９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ １０（ＩＰ １０）、ＣＸＣＬ １１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ １２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ １３、ＣＸＣＬ １４、ＣＸＣＬ １６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ １（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質に結合しうるか、又はそれと相互作用しうる。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現されるポリペプチドは、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（即ち、卵巣がん抗原）、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；アミロイドベータ；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＳＬＧ６５９；ＡＳＰＨＤ１（１を含有するアスパラギン酸ベータ－ヒドロキシラーゼドメイン；ＬＯＣ２５３９８２）；ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞－活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形態形成蛋白質受容体－ＩＢ型）；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；ブレビカン；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１－３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）；ＳＬＣ；エクソダス－２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン－７）；ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラステリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ １８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；補体因子Ｄ；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌種由来増殖因子）；ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシン Ｂ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質共役受容体）；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥｐｈＢ２Ｒ；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）；ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ホスファターゼアンカータンパク質１ａを含有するＳＨ２ドメイン）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（イプシロン）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ－ａｌｐｈａ１；ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）；ＧＥＤＡ；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ－ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（Ｇｅｌｓｏｌｉｎ）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミン及びヒスタミン受容体；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原）；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ－ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ－ｌ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ－１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０Ｒα；ＩＬ２１Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ－２２ｃ；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；インフルエンザＡ；インフルエンザＢ；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；
ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ラマ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ－Ｅ，ＳＣＡ－２，ＴＳＡ－１）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧ又はＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ－２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ－６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソセリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性ホスフェートトランスポーター３ｂ）；ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；ＯＸ４０；Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン作動性受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（銀ホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ－ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７つのトロンボスポンジンリピート（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短細胞質ドメイン，（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（前立腺の６つの膜貫通上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、前立腺２の６つの膜貫通上皮抗原、６つの膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのホリスタチン様ドメイン１を有する膜貫通タンパク質；トモレグリン－１）；ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（薬指タンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体潜在的カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；及び／又はＺＦＰＭ２に結合するか、又はそれと相互作用しうる。
ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ラマ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５），ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ－Ｅ，ＳＣＡ－２，ＴＳＡ－１）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧ又はＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ミッドカイン；ＭＥＦ；ＭＩＰ－２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ－６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソセリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性ホスフェートトランスポーター３ｂ）；ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；ＯＸ４０；Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン作動性受容体Ｐ２Ｘリガンド開口型イオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（銀ホモログ；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ－ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、ｓｅｍａドメイン、７つのトロンボスポンジンリピート（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短細胞質ドメイン，（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（前立腺の６つの膜貫通上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子１、前立腺がん関連タンパク質１、前立腺２の６つの膜貫通上皮抗原、６つの膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定上の膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのホリスタチン様ドメイン１を有する膜貫通タンパク質；トモレグリン－１）；ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（薬指タンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体潜在的カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；及び／又はＺＦＰＭ２に結合するか、又はそれと相互作用しうる。
【0165】
特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞及び方法により生成される抗体（又は二重特異性抗体）の標的分子には、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）、又はＨｓ．７３７９２）；ＣＤ３３；ＣＤ３４；ＣＤ６４；ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）；ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファｖ／ベータ３インテグリンであって、そのアルファ又はベータサブユニットを含むもの（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；成長因子、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ；組織因子（ＴＦ）；アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）；ＴＮＦアルファ、インターロイキン、例えば、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ１７ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥ；血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ－４、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどが含まれる。特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、補体タンパク質Ｃ５（例えば、ヒトに特異的に結合する抗Ｃ５アゴニスト抗体）に特異的に結合する抗体（又は二重特異性抗体などの多重特異性抗体）を生成するために使用することができる。
【0166】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、インフルエンザウイルスＢ血液凝集素、即ち、「ｆｌｕＢ」に特異的に結合する抗体（又は二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、インフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａ系統に由来する血液凝集素に結合する抗体、インフルエンザＢウイルスのビクトリア系統に由来する血液凝集素に結合する抗体、インフルエンザＢウイルスの祖先系統に由来する血液凝集素に結合する抗体、又はインフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａ系統、ビクトリア系統、及び祖先系統に由来する血液凝集素とｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで結合する抗体）を生成するために使用することができる。抗ＦｌｕＢ抗体に関するさらなる詳細は、国際公開第２０１５／１４８８０６号に記載されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0167】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成される抗体（又は二重特異性抗体）は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１又はＬＲＰ－８又はトランスフェリン受容体と、ベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１又はＢＡＣＥ２）、アルファ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、タウ－セクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイドベータペプチド、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ｐ７５ ＮＴＲ、ＣＤ４０、及びカスパーゼ－６からなる群から選択される少なくとも１つの標的とに結合する。
【0168】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成される抗体は、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体はＲＧ７８７６である。
【0169】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成されるポリペプチドは、標的化免疫サイトカインである。特定の実施形態では、標的化免疫サイトカインは、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態では、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７８１３である。特定の実施形態では、標的化免疫サイトカインは、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。特定の実施形態では、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。
【0170】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＣＥＡ、及び少なくとも１つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、腫瘍標的化サイトカイン及び少なくとも１つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ２ｖ（即ち、インターロイキン２バリアント）に融合され、ＩＬ１系免疫サイトカイン、及び少なくとも１つの追加の標的分子に結合する。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、Ｔ細胞二重特異性抗体（即ち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー又はＢｉＴＥ）である。
【0171】
特定の実施形態では、本明細書で提供される方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ－１アルファ及びＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１２及びＩＬ－１Ｓ；ＩＬ－１３及びＩＬ－９；ＩＬ－１３及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－５；ＩＬ－５及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－１ベータ；ＩＬ－１３及びＩＬ－２５；ＩＬ－１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ－１３及びＭＤＣ；ＩＬ－１３及びＭＥＦ；ＩＬ－１３及びＴＧＦ－～；ＩＬ－１３及びＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１２及びＴＷＥＡＫ；ＩＬ－１３及びＣＬ２５；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３及びＡＤＡＭＳ；ＩＬ－１３及びＰＥＤ２；ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ；ＣＥＡ及びＣＤ３；ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ１３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ－Ｓ及びＩＬ－６；ＣＤ２０及びＢＲ３；ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１ベータ；ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ－１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８、ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２、ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ－４、ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０、ＴＮＦａ及びＩＬ－１２ｐ４０、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン、ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５、ＶＥＧＦ及びＩＬ－８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ－１４及びＩＬ－１３、ＩＬ－１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－６Ｒ並びにＴＮＦＲ１及びＩＬ－１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ－４及びＢＴＮ０２；ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭ Ａ；ＮｇＲ及びＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭ Ａ；ＰＯＬ－ｌ及びＣＴＬＡ－４；並びにＲＧＭ Ａ及びＲＧＭ Ｂから選択される少なくとも２つの標的分子に結合する。
【0172】
特定の実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＲＧ７８０２である。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関するさらなる詳細は、国際公開第２０１４／１２１７１２号に提供されており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0173】
特定の実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体二重特異性抗体は、Ｃｒｏｓｓｍａｂである。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体は、ＲＧ７７１６である。
【0174】
特定の実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＲＧ７２２１である。特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。
【0175】
他の多くの抗体及び／又は他のタンパク質が、本開示においては宿主細胞によって発現されてよく、上記の一覧は限定的であることを意味しない。
【0176】
本開示の宿主細胞は、製造規模での目的の分子の生成に用いることができる。治療用タンパク質又は他のタンパク質の「製造規模」での生成は、生成されるタンパク質及び必要性に応じて、約４００Ｌ～約８０，０００Ｌの範囲の細胞培養物を利用する。典型的には、そのような製造規模での生成は、約４００Ｌから約２５，０００Ｌの細胞培養物サイズを利用する。この範囲内において、４，０００Ｌ、約６，０００Ｌ、約８，０００、約１０，０００、約１２，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、又は約１６，０００Ｌといった特定の細胞培養物サイズが利用されうる。
【0177】
特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性又は多重特異性のポリペプチド、例えば二重特異性抗体である。
【0178】
本開示の宿主細胞は、現行の細胞培養法で使用されている非ＴＩ細胞と比較して、より短い時間枠で大量の目的の分子の生成に用いることができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、現行の細胞培養法で使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の品質を改善するために用いることができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、細胞ストレス及びクローン不安定性を経時的に引き起こしうる生成物によって引き起こされうる慢性毒性を防止することによって、シードトレイン安定性を高めるために使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、急性毒性生成物の最適な発現のために使用することができる。
【0179】
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞、ＴＩ系は、細胞培養プロセスの最適化及び／又はプロセス開発に使用することができる。
【0180】
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養方法で使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の生成を約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、又は約１０週間早めるために使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養方法で使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的の分子の採取を約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、又は約１０週間早めるために使用することができる。
【0181】
特定の実施形態では、本実施形態の宿主細胞は、従来の細胞培養方法に使用される非ＴＩ細胞と比較して、目的分子の凝集レベルを減少させるために用いることができる。
【0182】
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ランダム組み込み宿主細胞に対して、目的の１つ又は複数のポリペプチドの発現の増加を達成するために使用することができる。例えば、限定しないが、本開示の宿主細胞は、少なくとも３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌの又はそれを超える力価での標準抗体及び半抗体の発現、並びに少なくとも１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌの又はそれよりも大きい多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体の発現を達成するために使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ランダム組み込み宿主細胞に対して、二重特異性含有量の増加を達成することができる。例えば、限定しないが、本開示の宿主細胞は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％又はそれを超える二重特異性含有量を達成することができる。
【0183】
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、治療分子の選択されたサブユニットの構成的発現及び同じ治療分子の他の異なるサブユニットの調節された発現のために使用することができる。特定の実施形態では、治療分子は、融合タンパク質でありうる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、完全に組み立てられた抗体分子の発現及び分泌における各抗体サブユニットの役割及び効果を理解するために使用することができる。
【0184】
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、調査ツールとして使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、様々な細胞における問題のある分子の低タンパク質発現の根本原因を突き止めるための診断ツールとして使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、観察された現象又は細胞挙動を細胞における導入遺伝子発現に直接結び付けるために使用することができる。本開示の宿主細胞はまた、観察された挙動が細胞において可逆的であるか否かを実証するために使用することができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞を利用して、細胞における１つ又は複数の導入遺伝子の転写及び発現に関する問題を同定し、軽減することができる。
【0185】
特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、発現困難な分子の導入遺伝子サブユニット、例えば、限定されないが、抗体のＨＣ及びＬＣサブユニットを、ＴＩ系の平均分子のものと交換して、問題となる１つ又は複数のサブユニットを同定するために使用することができる。特定の実施形態では、次いでアミノ酸配列解析を使用して、低タンパク質発現の原因でありうるアミノ酸残基又は領域を突き止めてこれに焦点を当てることができる。特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ａ）２つの組み換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する第１の目的のポリペプチド及び第１の選択マーカーをコードする、標的化組み込み外因性核酸の目的配列（ＳＯＩ）であって、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれている、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩと、ｂ）第２の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードするランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩであって、宿主細胞のゲノムに少なくとも１回組み込まれている、外因性核酸のＳＯＩとを含む目的のポリペプチドを発現させるために使用することができ、ｃ）標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に発現されるか又は誘導発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に発現されるか又は誘導発現される。特定の実施形態では、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩは、構成的に発現される。特定の実施形態では、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩは、誘導的に発現される。特定の実施形態では、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩは、構成的に発現される。特定の実施形態では、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩは誘導的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩは構成的に発現される。特定の実施形態では、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩは構成的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩは構成的に発現される。特定の実施形態では、標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩは構成的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩは誘導的に発現される。
【0186】
特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現させる方法であって、ａ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、宿主細胞を提供すること；ｂ）（ａ）で供給された細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の２つのＲＲＳと一致し、第１の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む核酸を導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ又は同リコンビナーゼをコードする核酸を導入すること；ｄ）第２の選択マーカーを発現する細胞を選択すること；ｅ）ランダム組込みを介して、第２の目的のポリペプチド及び第３の選択マーカーをコードする第２の外因性ＳＯＩを、宿主細胞のゲノムに導入すること；ｆ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に又は誘導的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが構成的に又は誘導的に発現されること；ｇ）第３の選択マーカーを発現する細胞を選択すること；並びにｈ）第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するために十分な条件下で宿主細胞を培養することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に発現される。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が誘導的に発現される。特定の実施形態では、第２の外因性ＳＯＩが構成的に発現される。特定の実施形態では、第２の外因性ＳＯＩが誘導的に発現される。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は誘導的に発現され、第２の外因性ＳＯＩは構成的に発現される。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は構成的に発現され、第２の外因性ＳＯＩは構成的に発現される。特定の実施形態では、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は構成的に発現され、第２の外因性ＳＯＩは誘導的に発現される。
【0187】
８．例示的な非限定的実施形態
Ａ．目的のポリペプチドを発現することのできる宿主細胞であって：ａ）２つの組み換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する目的の第１のポリペプチド及び第１の選択マーカーをコードする、標的化組み込み外因性核酸の目的の配列（ＳＯＩ）であって 宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれている標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩ；ｂ）第２の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩであって、少なくとも１回宿主細胞のゲノムに組み込まれているランダム組み込みＳＯＩを含み、ｃ）標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に又は誘導的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に又は誘導的に発現される、宿主細胞。
Ａ．目的のポリペプチドを発現することのできる宿主細胞であって：ａ）２つの組み換え認識配列（ＲＲＳ）に隣接する目的の第１のポリペプチド及び第１の選択マーカーをコードする、標的化組み込み外因性核酸の目的の配列（ＳＯＩ）であって 宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれている標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩ；ｂ）第２の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩであって、少なくとも１回宿主細胞のゲノムに組み込まれているランダム組み込みＳＯＩを含み、ｃ）標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に又は誘導的に発現され、ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩが、構成的に又は誘導的に発現される、宿主細胞。
【0188】
Ａ１．第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとが同一である、Ａに記載の宿主細胞。
【0189】
Ａ２．第１の選択マーカーと第２の選択マーカーとが同一である、Ａの宿主細胞。
【0190】
Ａ３．ランダム組み込み外因性核酸のＳＯＩを１から１０個含む、Ａに記載の宿主細胞。
【0191】
Ａ４．標的化遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、Ａに記載の宿主細胞。
【0192】
Ａ４．１．標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ａ４に記載の宿主細胞。
【0193】
Ａ４．２．標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ａ４に記載の宿主細胞。
【0194】
Ａ４．３．標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ａ４に記載の宿主細胞。
【0195】
Ａ４．４．標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ａ４に記載の宿主細胞。
【0196】
Ａ４．５．標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ａ４に記載の宿主細胞。
【0197】
Ａ４．６．標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ａ４に記載の宿主細胞。
【0198】
Ａ４．７．標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ａ４に記載の宿主細胞。
Ａ５．宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた少なくとも１つの第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩと、宿主細胞のゲノムの１つ以上の第二の遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチドのＳＯＩをコードする少なくとも１つの第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩとを含む、Ａ～Ａ４のいずれかに記載の宿主細胞。
Ａ５．宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた少なくとも１つの第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩと、宿主細胞のゲノムの１つ以上の第二の遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチドのＳＯＩをコードする少なくとも１つの第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩとを含む、Ａ～Ａ４のいずれかに記載の宿主細胞。
【0199】
Ａ６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0200】
Ａ６．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0201】
Ａ６．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第３の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0202】
Ａ６．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第４の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0203】
Ａ６．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第５の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0204】
Ａ６．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第６の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0205】
Ａ６．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第７の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0206】
Ａ７．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0207】
Ａ７．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0208】
Ａ７．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0209】
Ａ７．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0210】
Ａ７．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0211】
Ａ７．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0212】
Ａ７．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0213】
Ａ８．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0214】
Ａ８．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0215】
Ａ８．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0216】
Ａ８．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0217】
Ａ８．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0218】
Ａ８．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0219】
Ａ８．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0220】
Ａ９．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0221】
Ａ９．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0222】
Ａ９．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0223】
Ａ９．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0224】
Ａ９．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0225】
Ａ９．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0226】
Ａ９．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0227】
Ａ１０．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0228】
Ａ１０．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0229】
Ａ１０．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0230】
Ａ１０．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0231】
Ａ１０．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0232】
Ａ１０．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0233】
Ａ１０．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0234】
Ａ１１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0235】
Ａ１１．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0236】
Ａ１１．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0237】
Ａ１１．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0238】
Ａ１１．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0239】
Ａ１１．５． 第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0240】
Ａ１１．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0241】
Ａ１２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0242】
Ａ１２．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0243】
Ａ１２．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0244】
Ａ１２．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0245】
Ａ１２．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0246】
Ａ１２．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0247】
Ａ１２．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0248】
Ａ１３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＬＯＣ１０７９７７０６２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0249】
Ａ１４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＬＯＣ１００７６８８４５遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0250】
Ａ１５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＩＴＰＲ２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0251】
Ａ１６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＥＲＥ６７０００．１遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0252】
Ａ１７．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＵＢＡＰ２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0253】
Ａ１８．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＭＴＭＲ２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0254】
Ａ１９．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ａ５に記載の宿主細胞。
【0255】
Ａ２０．目的のポリペプチドが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、Ａ～Ａ１９のいずれかに記載の宿主細胞。
【0256】
Ａ２１．宿主細胞が哺乳動物宿主細胞である、Ａ～Ａ１９のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0257】
Ａ２２．宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、Ａ２１に記載の宿主細胞。
【0258】
Ａ２３．宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ａ２２に記載の宿主細胞。
【0259】
Ａ２４．ＳＯＩ及び選択マーカーの標的化組み込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、Ａ～Ａ２０のいずれか１つに記載の宿主細胞。
【0260】
Ａ２５．外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ａ２４に記載の宿主細胞。
【0261】
Ｂ．目的のポリペプチドを発現させる方法であって、ａ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供することであって、外因性ヌクレオチド配列が第１の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む、宿主細胞を提供すること；ｂ）（ａ）で提供された細胞に、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の２つのＲＲＳと一致し、第１の目的のポリペプチド及び第２の選択マーカーをコードする第１の外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む核酸を導入すること；ｃ）ＲＲＳを認識するリコンビナーゼ又は同リコンビナーゼをコードする核酸を導入すること；ｄ）第２の選択マーカーを発現する細胞を選択すること；ｅ）ランダム組込みを介して、第２の目的のポリペプチド及び第３の選択マーカーをコードする第２の外因性ＳＯＩを、宿主細胞のゲノムに導入すること；ｆ）宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列が構成的に又は誘導的に発現され、第２の外因性ＳＯＩが構成的に又は誘導的に発現されること；ｇ）第３の選択マーカーを発現する細胞を選択すること；並びにｈ）第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを発現するために十分な条件下で宿主細胞を培養することを含む方法。
【0262】
Ｂ１．第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドを宿主細胞培養物から回収することをさらに含む、Ｂに記載の方法。
【0263】
Ｂ２．第１の目的のポリペプチドと第２の目的のポリペプチドとが同一である、Ｂに記載の方法。
【0264】
Ｂ３．標的化遺伝子座が、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のうちの１つのコンティグ配列の一部分の配列、又は配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、Ｂに記載の方法。
【0265】
Ｂ３．１．標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｂ３に記載の方法。
【0266】
Ｂ３．２．標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｂ３に記載の方法。
【0267】
Ｂ３．３．標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｂ３に記載の方法。
【0268】
Ｂ３．４．標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｂ３に記載の方法。
【0269】
Ｂ３．５．標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｂ３に記載の方法。
【0270】
Ｂ３．６．標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｂ３に記載の方法。
【0271】
Ｂ３．７．標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含む、Ｂ３に記載の方法。
【0272】
Ｂ４．宿主細胞が、宿主細胞のゲノムの標的化遺伝子座内に組み込まれた少なくとも１つの第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩと、宿主細胞のゲノムの１つ以上の第２の遺伝子座内に組み込まれた第２の目的のポリペプチドのＳＯＩをコードする少なくとも１つの第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩとを含む、Ｂ～Ｂ３のいずれかに記載の方法。
【0273】
Ｂ５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0274】
Ｂ５．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0275】
Ｂ５．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0276】
Ｂ５．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0277】
Ｂ５．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0278】
Ｂ５．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0279】
Ｂ５．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0280】
Ｂ６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0281】
Ｂ６．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0282】
Ｂ６．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0283】
Ｂ６．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。Ｋ７．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0284】
Ｂ６．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0285】
Ｂ６．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0286】
Ｂ７．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0287】
Ｂ７．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0288】
Ｂ７．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0289】
Ｂ７．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0290】
Ｂ７．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0291】
Ｂ７．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
Ｂ７．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
Ｂ７．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0292】
Ｂ８．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0293】
Ｂ８．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0294】
Ｂ８．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0295】
Ｂ８．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0296】
Ｂ８．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0297】
Ｂ８．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0298】
Ｂ８．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0299】
Ｂ９．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0300】
Ｂ９．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0301】
Ｂ９．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0302】
Ｂ９．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0303】
Ｂ９．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0304】
Ｂ９．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0305】
Ｂ９．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0306】
Ｂ１０．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0307】
Ｂ１０．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0308】
Ｂ１０．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0309】
Ｂ１０．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0310】
Ｂ１０．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0311】
Ｂ１０．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0312】
Ｂ１０．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0313】
Ｂ１１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又は配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0314】
Ｂ１１．１．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号１のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0315】
Ｂ１１．２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号２のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0316】
Ｂ１１．３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号３のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0317】
Ｂ１１．４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号４のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0318】
Ｂ１１．５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号５のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0319】
Ｂ１１．６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号７のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な配列を含み、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、配列番号６のすべて又は一部分と少なくとも９０％相同な少なくとも１つの配列を含む、Ｂ４に記載の方法。
【0320】
Ｂ１２．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＬＯＣ１０７９７７０６２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ｂ４に記載の方法。
【0321】
Ｂ１３．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＬＯＣ１００７６８８４５遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ｂ４に記載の方法。
【0322】
Ｂ１４．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＩＴＰＲ２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ｂ４に記載の方法。
【0323】
Ｂ１５．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＥＲＥ６７０００．１遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ｂ４に記載の方法。
【0324】
Ｂ１６．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＵＢＡＰ２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ｂ４に記載の方法。
【0325】
Ｂ１７．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＭＴＭＲ２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ｂ４に記載の方法。
【0326】
Ｂ１８．第１の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、ＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子内の組み込み部位であり、第２の標的化組み込み外因性核酸のＳＯＩの標的化遺伝子座が、以下の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びそれらと少なくとも約９０％相同な配列から選択される遺伝子内の組み込み部位である、Ｂ４に記載の方法。
【0327】
Ｂ１９．第１の目的のポリペプチド及び第２の目的のポリペプチドが、単鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）及びＦｃ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項Ｂ～Ｂ１８のいずれかに記載の方法。
【0328】
Ｂ２０．宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、Ｂ～Ｂ１９のいずれか１つに記載の方法。
【0329】
Ｂ２１．宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、又はマウス宿主細胞である、Ｌ２０に記載の方法。
【0330】
Ｂ２２．宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、又はＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｌ２１に記載の方法。
【0331】
Ｂ２３．ＳＯＩのいずれかの標的化組み込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、Ｂ～Ｂ２２のいずれかに記載の方法。
【0332】
Ｂ２４．外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及びクラスター化されて規則的に間隔があいた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）に関連する（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ｂ２３に記載の方法。
【0333】
Ｂ２５．ＳＯＩの発現が、調節可能なプロモーターによって制御される、Ｂ～Ｂ２４のいずれかに記載の方法。
【0334】
Ｂ２６．調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、Ｂ２５に記載の方法。
【実施例】
【0335】
以下の実施例は、本明細書で開示される主題の例示にすぎず、いかなる意味でも制限とみなすべきではない。
【0336】
材料及び方法
ｍＡｂ Ｘスーパートランスフェクションベクターの構築：選択のためのＧＳの発現を指示するＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社独自の抗体発現ベクター中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下において、ｍＡｂ Ｘの重鎖及び軽鎖遺伝子をクローニングすることにより、構成的抗体の発現コンストラクトを生成した。上記コンストラクトを変更し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをＣＭＶテトラサイクリン－オペレーター（ＣＭＶ‐ＴＯ）プロモーターで置き換えることにより、ベクターコンストラクトを生成した。加えて、ベクターコンストラクトを生成するために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター下のＴｅｔＲコンストラクトもベクターバックボーン中にクローニングした。次いで、ｍＡｂ Ｘの重鎖及び軽鎖遺伝子をその後ＣＭＶ‐ＴＯプロモーターの３’にクローニングし、誘導可能な抗体発現ベクターを生成した（図１Ａ）。
ｍＡｂ Ｘスーパートランスフェクションベクターの構築：選択のためのＧＳの発現を指示するＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社独自の抗体発現ベクター中のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下において、ｍＡｂ Ｘの重鎖及び軽鎖遺伝子をクローニングすることにより、構成的抗体の発現コンストラクトを生成した。上記コンストラクトを変更し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをＣＭＶテトラサイクリン－オペレーター（ＣＭＶ‐ＴＯ）プロモーターで置き換えることにより、ベクターコンストラクトを生成した。加えて、ベクターコンストラクトを生成するために、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター下のＴｅｔＲコンストラクトもベクターバックボーン中にクローニングした。次いで、ｍＡｂ Ｘの重鎖及び軽鎖遺伝子をその後ＣＭＶ‐ＴＯプロモーターの３’にクローニングし、誘導可能な抗体発現ベクターを生成した（図１Ａ）。
【0337】
細胞培養：組み込みモノクローナル抗体ｍＡｂ－Ｘを分泌する細胞株を、ピューロマイシン選択マーカーを利用するＴＩ ＣＨＯ－Ｋ１宿主から得た。安定した構成的ｍＡｂ－Ｘ ＴＩ細胞株及び安定した誘導可能なｍＡｂ－Ｘ ＴＩ細胞株の両方を、選択薬剤としてピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）を含む独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの無血清培地中で培養した。すべての培養物は、３７℃において５％ ＣＯ２で１５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。細胞を、２～４日毎に４×１０５細胞／ｍＬの播種密度で継代した。ｍＡｂ－Ｘのこれら安定した構成的細胞株及び安定した誘導的細胞株を、以降親細胞株と呼ぶ。
【0338】
安定したプール及びミニプールスーパートランスフェクションの生成：ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸトランスフェクションシステムが、トランスフェクションプロセスのために使用された。安定したスーパートランスフェクトプールの生成のために、親宿主をＭａｘｃｙｔｅによりトランスフェクトし、細胞を、２つのフラスコに分け、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）選択培地を含む懸濁培養物中で２～３週間にわたり選択した。安定したスーパートランスフェクトミニプールの生成のために、親宿主をトランスフェクトし、細胞を、３８４ウェルプレートに１ウェル当たり１２５０細胞で播種し、ＭＳＸ選択培地中で２～３週間にわたり選択した２５％を上回る培養密度のミニプールを採取し、９６ウェルプレートに広げた。
【0339】
プール及びミニプールのスクリーニング
回収したプールを、流加培養生成アッセイを実施することによりスクリーニングし、単一細胞クローニング（ＳＣＣ）を実施するための最良のプールを選択した。ミニプールは、ミニプールの上清を収集することで力価を評価することによりスクリーニングし、ＨＴＲＦ（ホモジニアス時間分解蛍光）アッセイのために提出した。ミニプールは、力価により順位付けし、上位のミニプールを選択した。以下に記載されるのは、３つのスーパートランスフェクション手法のための各ミニプールスクリーニングプロセスである：
回収したプールを、流加培養生成アッセイを実施することによりスクリーニングし、単一細胞クローニング（ＳＣＣ）を実施するための最良のプールを選択した。ミニプールは、ミニプールの上清を収集することで力価を評価することによりスクリーニングし、ＨＴＲＦ（ホモジニアス時間分解蛍光）アッセイのために提出した。ミニプールは、力価により順位付けし、上位のミニプールを選択した。以下に記載されるのは、３つのスーパートランスフェクション手法のための各ミニプールスクリーニングプロセスである：
【0340】
構成的→構成的
１０５６個のミニプールを、ＨＴＲＦによってスクリーニングし、上位４８個のミニプールに絞り込んだ。ミニプール＃１～２４を組み合わせてプール１を生成し、ミニプール＃２５～４８を組み合わせてプール２を生成した。次いでプール１及びプール２を、流加培養生成アッセイにおいてさらに評価した。
１０５６個のミニプールを、ＨＴＲＦによってスクリーニングし、上位４８個のミニプールに絞り込んだ。ミニプール＃１～２４を組み合わせてプール１を生成し、ミニプール＃２５～４８を組み合わせてプール２を生成した。次いでプール１及びプール２を、流加培養生成アッセイにおいてさらに評価した。
【0341】
誘導的→構成的
ミニプールは生成せず、スーパートランスフェクション及びＭＳＸでの選択後にプールを２つのみ生成した。回収したプールを、流加培養生成アッセイのためにさらに培養した。
ミニプールは生成せず、スーパートランスフェクション及びＭＳＸでの選択後にプールを２つのみ生成した。回収したプールを、流加培養生成アッセイのためにさらに培養した。
【0342】
構成的→誘導的
１７６個のミニプールを、ＨＴＲＦによってスクリーニングし、上位４個のミニプールに絞り込んだ。４つすべてのミニプールを、流加培養生成アッセイにおいて評価した。
１７６個のミニプールを、ＨＴＲＦによってスクリーニングし、上位４個のミニプールに絞り込んだ。４つすべてのミニプールを、流加培養生成アッセイにおいて評価した。
【0343】
単一細胞のクローニング
プールは、１細胞／ウェルを、独自の社内サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの選択培地を充填した３８４ウェルプレートに播種することによりクローニングされた単一細胞（ＳＣＣ）であった。３週間後、クローン回収率について各条件を分析した。２５％を上回る培養密度のクローンが、回収クローンとして特徴づけられた。クローンを、９６ウェルプレート中に採り、力価に基づいて、複数回のクローンスクリーニングによりスクリーニングして、最終的に上位８個の単一細胞クローンに絞り込んだ。構成的→構成的及び誘導的→構成的両方のスーパートランスフェクション手法により３５２個の単一細胞クローンをスクリーニングし、上位８個のクローンに絞り込んだ。構成的→誘導的スーパートランスフェクション手法では、ＳＣＣは実施されなかった。
プールは、１細胞／ウェルを、独自の社内サプリメントを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの選択培地を充填した３８４ウェルプレートに播種することによりクローニングされた単一細胞（ＳＣＣ）であった。３週間後、クローン回収率について各条件を分析した。２５％を上回る培養密度のクローンが、回収クローンとして特徴づけられた。クローンを、９６ウェルプレート中に採り、力価に基づいて、複数回のクローンスクリーニングによりスクリーニングして、最終的に上位８個の単一細胞クローンに絞り込んだ。構成的→構成的及び誘導的→構成的両方のスーパートランスフェクション手法により３５２個の単一細胞クローンをスクリーニングし、上位８個のクローンに絞り込んだ。構成的→誘導的スーパートランスフェクション手法では、ＳＣＣは実施されなかった。
【0344】
流加生成アッセイ：
１４日間の生成アッセイの間に、増殖、生存率、生存能力、及び力価などのパラメーターを評価した。細胞を、独自の無血清生成培地における生成の０日目に３ｘ１０６細胞／ｍＬで播種し、続いて３日目に３５℃に温度シフトした。３、７、及び１０日目に、培養物に対し、ドキシサイクリンを含む又は含まない独自の供給物を加えた。収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を収集し、分析した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を決定した。生存率パーセント及び生細胞数を、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ生死細胞オートアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してモニタリングした。
１４日間の生成アッセイの間に、増殖、生存率、生存能力、及び力価などのパラメーターを評価した。細胞を、独自の無血清生成培地における生成の０日目に３ｘ１０６細胞／ｍＬで播種し、続いて３日目に３５℃に温度シフトした。３、７、及び１０日目に、培養物に対し、ドキシサイクリンを含む又は含まない独自の供給物を加えた。収集細胞培養液（ＨＣＣＦ）を収集し、分析した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を決定した。生存率パーセント及び生細胞数を、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ生死細胞オートアナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してモニタリングした。
【0345】
デジタルドロップレットＰＣＲによる遺伝子コピー数
デジタルドロップレットＰＣＲアッセイを、プローブ（ｄＵＴＰなし）キット（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）用のｄｄＰＣＲＴＭ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用して実施した。ｄｄＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、９００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、２５０μＭプローブ、３単位のＨａｅＩＩＩ制限酵素及び試料ＤＮＡを含む各ｄｄＰＣＲ反応。室温で１０分間インキュベートした後、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて液滴を生成した。ＰＣＲ熱サイクル条件は、９５℃で１０分間、続いて９４℃で３０秒間及び６０℃で１分間の４０サイクル、次いで９８℃で１０分間で酵素を失活させた。ＰＣＲ反応後、液滴をＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で読み取った。データを収集し、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。ＨＣ及びＬＣ遺伝子コピー数を、参照遺伝子であるＢａｘ及びアルブミンの規定コピー数に基づいて正規化した。この試験で使用したプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。プライマーの配列を以下に列挙する：
デジタルドロップレットＰＣＲアッセイを、プローブ（ｄＵＴＰなし）キット（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ）用のｄｄＰＣＲＴＭ Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用して実施した。ｄｄＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、９００ｎＭフォワードプライマー、９００ｎＭリバースプライマー、２５０μＭプローブ、３単位のＨａｅＩＩＩ制限酵素及び試料ＤＮＡを含む各ｄｄＰＣＲ反応。室温で１０分間インキュベートした後、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて液滴を生成した。ＰＣＲ熱サイクル条件は、９５℃で１０分間、続いて９４℃で３０秒間及び６０℃で１分間の４０サイクル、次いで９８℃で１０分間で酵素を失活させた。ＰＣＲ反応後、液滴をＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で読み取った。データを収集し、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔソフトウェアを使用して分析した。ＨＣ及びＬＣ遺伝子コピー数を、参照遺伝子であるＢａｘ及びアルブミンの規定コピー数に基づいて正規化した。この試験で使用したプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。プライマーの配列を以下に列挙する：
【0346】
この試験で使用したプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。プライマーの配列を以下に列挙する。
【0347】
定量的リアルタイムＰＣＲ：
細胞から抽出された全ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃ ７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して単離し、ＤＮａｓｅ（Ｃａｔ＃７９２５４、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅキット、Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）で処理して、残留ＤＮＡがあればすべて除去した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、製造者の説明書に従ってユニバーサルｑＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（Ｃａｔ＃４３９２９３８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を使用して実施し、抗体重鎖及び軽鎖のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるアルブミンのｍＲＮＡレベルに正規化した。
細胞から抽出された全ＲＮＡを、製造者のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｃａｔ＃ ７４１０４、Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して単離し、ＤＮａｓｅ（Ｃａｔ＃７９２５４、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅキット、Ｑｉａｇｅｎ、ＵＳＡ）で処理して、残留ＤＮＡがあればすべて除去した。ｑＲＴ－ＰＣＲを、製造者の説明書に従ってユニバーサルｑＲＴ－ＰＣＲマスターミックス（Ｃａｔ＃４３９２９３８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）を使用して実施し、抗体重鎖及び軽鎖のｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子であるアルブミンのｍＲＮＡレベルに正規化した。
【0348】
ＲＴ－ＰＣＲに使用されたプライマー及びプローブ配列は以下の通りである。
ＨＣ‐２フォワードプライマー：ＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣ
ＨＣ‐２リバースプライマー：ＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＧＴＡＧＧＡＣＡＧＣ
ＨＣプローブ：ＦＡＭ‐ＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣ‐ＴＡＭＲＡ．
ＬＣ‐２フォワードプライマー：ＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣ
ＬＣ‐２リバースプライマー：ＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＣ．
ＬＣプローブ：ＦＡＭ‐ＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡ‐ＴＡＭＲＡ
アルブミンフォワードプライマー：ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＡＣ ＴＧ
アルブミンリバースプライマー：ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＣＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＡ
アルブミンプローブＦＡＭ－ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＣＣ ＣＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＣ－ＴＡＭＲＡ
ＨＣ‐２フォワードプライマー：ＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣ
ＨＣ‐２リバースプライマー：ＴＡＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＧＴＡＧＧＡＣＡＧＣ
ＨＣプローブ：ＦＡＭ‐ＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣ‐ＴＡＭＲＡ．
ＬＣ‐２フォワードプライマー：ＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣ
ＬＣ‐２リバースプライマー：ＣＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＣ．
ＬＣプローブ：ＦＡＭ‐ＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡ‐ＴＡＭＲＡ
アルブミンフォワードプライマー：ＴＴＣ ＧＴＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＡＣ ＴＧ
アルブミンリバースプライマー：ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＣＴ ＴＧＴ ＧＴＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＡ
アルブミンプローブＦＡＭ－ＣＴＧ ＴＧＣ ＡＡＡ ＡＣＡ ＡＧＡ ＡＣＣ ＣＧＡ ＡＡＧ ＡＡＡ ＣＣ－ＴＡＭＲＡ
【0349】
実施例１：スーパートランスフェクション発現コンストラクトの概要
２つの発現コンストラクトを、ｍＡｂ Ｘのスーパートランスフェクションのために使用した。構成ベクターが、ｍＡｂＸの安定した構成的ランダム組み込み細胞株を生成するために使用され、誘導ベクターが、ｍＡｂＸの安定した誘導的ランダム組み込み細胞株を生成するために使用された（図１Ａ）。スーパートランスフェクション法の３つの異なるバージョンを使用した。バージョン１（構成的→構成的）は、構成的ｍＡｂ Ｘベクターを使用してｍＡｂ Ｘを構成的に発現する宿主をスーパートランスフェクトする。バージョン２（誘導的→構成的）は、誘導ｍＡｂＸ ベクターを使用してｍＡｂ Ｘを構成的に発現する宿主をスーパートランスフェクトする。バージョン３（構成的→誘導的）は、構成ｍＡｂ Ｘベクターを使用してｍＡｂ Ｘを誘導的に発現する宿主をスーパートランスフェクトする（図１Ｂ）。
２つの発現コンストラクトを、ｍＡｂ Ｘのスーパートランスフェクションのために使用した。構成ベクターが、ｍＡｂＸの安定した構成的ランダム組み込み細胞株を生成するために使用され、誘導ベクターが、ｍＡｂＸの安定した誘導的ランダム組み込み細胞株を生成するために使用された（図１Ａ）。スーパートランスフェクション法の３つの異なるバージョンを使用した。バージョン１（構成的→構成的）は、構成的ｍＡｂ Ｘベクターを使用してｍＡｂ Ｘを構成的に発現する宿主をスーパートランスフェクトする。バージョン２（誘導的→構成的）は、誘導ｍＡｂＸ ベクターを使用してｍＡｂ Ｘを構成的に発現する宿主をスーパートランスフェクトする。バージョン３（構成的→誘導的）は、構成ｍＡｂ Ｘベクターを使用してｍＡｂ Ｘを誘導的に発現する宿主をスーパートランスフェクトする（図１Ｂ）。
【0350】
実施例２：構成的→構成的スーパートランスフェクション
材料及び方法のセクションに記載した、トランスフェクションから安定したプール生成までのスクリーニング工程を、構成的→構成的スーパートランスフェクション手法の間に実施して、上位のミニプールを同定した（図２Ａ）。ＨＴＲＦ力価スクリーニングから同定された上位４８個の構成的→構成的ミニプールのミニプールの生産性を評価した。次いでミニプールを２つのプールに組み合わせ、生成アッセイにおいて評価した。ミニプール１～２４を組み合わせてプール１を作製し、ミニプール２５～４８を組み合わせてプール２を作製した（図２Ｂ）。スーパートランスフェクトされた構成的→構成的ミニプール（プール１及びプール２）の組み合わせのプール力価の生産性を、スーパートランスフェクトされていない親宿主と比較した（図２Ｃ）。
材料及び方法のセクションに記載した、トランスフェクションから安定したプール生成までのスクリーニング工程を、構成的→構成的スーパートランスフェクション手法の間に実施して、上位のミニプールを同定した（図２Ａ）。ＨＴＲＦ力価スクリーニングから同定された上位４８個の構成的→構成的ミニプールのミニプールの生産性を評価した。次いでミニプールを２つのプールに組み合わせ、生成アッセイにおいて評価した。ミニプール１～２４を組み合わせてプール１を作製し、ミニプール２５～４８を組み合わせてプール２を作製した（図２Ｂ）。スーパートランスフェクトされた構成的→構成的ミニプール（プール１及びプール２）の組み合わせのプール力価の生産性を、スーパートランスフェクトされていない親宿主と比較した（図２Ｃ）。
【0351】
材料及び方法のセクションに記載の単一細胞クローニング及びスクリーニング工程を、ｍＡｂ Ｘの安定した構成的→構成的単一細胞クローンを同定するために使用した（図３Ａ）。上位８個の構成的→構成的スーパートランスフェクトｍＡｂ Ｘクローンとスーパートランスフェクトされていない親宿主とについて、１４日目の力価（図３Ｂ）、１４日目の比生産性（Ｑｐ）（図３Ｃ）、及び１４日目の増殖（生細胞濃度の積分（ＩＶＣＣ）により表される）（図３Ｄ）を評価した。上位８個の構成的→構成的スーパートランスフェクトクローンと親宿主とに由来する重鎖及び軽鎖のＤＮＡコピー数（図３Ｅ）、及び上位８個の構成的→構成的スーパートランスフェクトクローンと親宿主との重鎖及び軽鎖のｍＲＮＡレベル（図３Ｆ）を評価した。
【0352】
実施例３：誘導的→構成的スーパートランスフェクション
２つの誘導的→構成的安定プールを、スーパートランスフェクション及びＭＳＸでの選択により、材料及び方法のセクションに記載のようにして生成した（図４Ａ）。スーパートランスフェクトされた誘導的→構成的プールのプール力価を、スーパートランスフェクトされていない親宿主との比較で評価した。非誘導（Ｄｏｘなし）及び誘導（Ｄｏｘあり）両方の生成力価を、スーパートランスフェクトされた２つのプールについて評価した（図４Ｂ）。これらプールを、その後単一細胞のクローニングのために使用した。
２つの誘導的→構成的安定プールを、スーパートランスフェクション及びＭＳＸでの選択により、材料及び方法のセクションに記載のようにして生成した（図４Ａ）。スーパートランスフェクトされた誘導的→構成的プールのプール力価を、スーパートランスフェクトされていない親宿主との比較で評価した。非誘導（Ｄｏｘなし）及び誘導（Ｄｏｘあり）両方の生成力価を、スーパートランスフェクトされた２つのプールについて評価した（図４Ｂ）。これらプールを、その後単一細胞のクローニングのために使用した。
【0353】
ｍＡｂ Ｘの上位８個の安定した誘導的→構成的単一細胞クローンを、材料及び方法のセクションに記載のようにして同定した（図５Ａ）。誘導（Ｄｏｘあり）及び非誘導（Ｄｏｘなし）条件下での上位８個のクローンのスクリーニング力価（ＨＴＲＦによる）を評価した（図５Ａ）。誘導条件下において、クローンは、非誘導条件と比較してより高い力価を有する。誘導（Ｄｏｘあり）及び非誘導（Ｄｏｘなし）条件下における上位８個の誘導的→構成的スーパートランスフェクトｍＡｂ Ｘクローン、及びスーパートランスフェクトされていない親宿主の、１４日目の力価（図５Ｃ）、１４日目のＱｐ（図５Ｄ）、及び１４日目のＩＶＣＣ（図５Ｅ）を評価した。上位８個の誘導的→構成的スーパートランスフェクトクローン及び親宿主由来の重鎖及び軽鎖ＤＮＡコピー数を評価した（図５Ｆ）。いくつかのクローンでは、転写抑制因子の発現が徐々に減少することにより、誘導時に力価がわずかに上昇しただけのように思われた。しかしながら、これら細胞株は、スーパートランスフェクション後にトリガーされたより高い発現要求に徐々に適応することができたため、転写抑制因子発現のこのような漸減により、親細胞株と比較して有意により高い構成力価を有するスーパートランスフェクト細胞株の単離が可能となったと考えられる。
【0354】
実施例４：構成的→誘導的スーパートランスフェクション
材料及び方法のセクションに記載のスクリーニング工程を、上位構成的→誘導的ミニプールを同定するために実施した（図６Ａ）。誘導（Ｄｏｘあり）及び非誘導（Ｄｏｘなし）条件下での上位４個のミニプールのスクリーニング力価（ＨＴＲＦによる）を評価した（図６Ｂ）。力価は、非誘導条件と比較して、誘導条件下で有意により高い。誘導（Ｄｏｘあり）及び非誘導（Ｄｏｘなし）条件下における上位４個の構成的→誘導的スーパートランスフェクトｍＡｂ Ｘミニプール、及びスーパートランスフェクトされていない親宿主の、１４日目の力価（図６Ｃ）、１４日目のＱｐ（図６Ｄ）、及び１４日目のＩＶＣＣ（図６Ｅ）を評価した。上位４個の構成的→誘導的スーパートランスフェクトミニプール（誘導）及び親宿主の重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡレベルを評価した（図６Ｆ）。
材料及び方法のセクションに記載のスクリーニング工程を、上位構成的→誘導的ミニプールを同定するために実施した（図６Ａ）。誘導（Ｄｏｘあり）及び非誘導（Ｄｏｘなし）条件下での上位４個のミニプールのスクリーニング力価（ＨＴＲＦによる）を評価した（図６Ｂ）。力価は、非誘導条件と比較して、誘導条件下で有意により高い。誘導（Ｄｏｘあり）及び非誘導（Ｄｏｘなし）条件下における上位４個の構成的→誘導的スーパートランスフェクトｍＡｂ Ｘミニプール、及びスーパートランスフェクトされていない親宿主の、１４日目の力価（図６Ｃ）、１４日目のＱｐ（図６Ｄ）、及び１４日目のＩＶＣＣ（図６Ｅ）を評価した。上位４個の構成的→誘導的スーパートランスフェクトミニプール（誘導）及び親宿主の重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡレベルを評価した（図６Ｆ）。
【0355】
図示及び特許請求される様々な実施形態に加えて、本開示の主題は、ここに開示及び特許請求された特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の適切な組み合わせを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせることができる。本開示の主題の特定の実施形態の前述の説明は、例証及び説明を目的として提示されている。網羅的であること、又は本開示の主題を開示されたそれらの実施形態に限定することは、意図されていない。
【0356】
本開示の主題の趣旨又は範囲を逸脱することなく、本開示の主題の組成物及び方法に様々な修正及び変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内の修正及び変形を含むことが意図されている。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】