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▶ ユニバーシティー オブ ヒューストン システムの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-31
(54)【発明の名称】血液脳関門を通過する薬物送達のための化合物
(51)【国際特許分類】
C07K 7/02 20060101AFI20230724BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20230724BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230724BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230724BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230724BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230724BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230724BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20230724BHJP
【ＦＩ】
C07K7/02 ZNA
A61K45/00
A61K47/64
A61P35/00
A61P9/10
A61P9/00
A61P25/28
A61P25/16
A61K38/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022581583
(86)(22)【出願日】2021-06-22
(85)【翻訳文提出日】2023-02-27
(86)【国際出願番号】 US2021038408
(87)【国際公開番号】W WO2022005807
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】63/047,440
(32)【優先日】2020-07-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511248249
【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ ヒューストン システム
(74)【代理人】
【識別番号】100100158
【弁理士】
【氏名又は名称】鮫島 睦
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(74)【代理人】
【識別番号】100136696
【弁理士】
【氏名又は名称】時岡 恭平
(72)【発明者】
【氏名】グオ，ビン
(72)【発明者】
【氏名】ウドゥガマスーリヤ，ダミス ゴミカ
(72)【発明者】
【氏名】リウ，シンリー
(72)【発明者】
【氏名】シュクラ，サトヤ プラカシュ
(72)【発明者】
【氏名】チョ，クァンボク
(72)【発明者】
【氏名】ジョウ，シュエ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC01
4C076CC11
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF34
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA17
4C084BA01
4C084BA17
4C084BA23
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZA02
4C084ZA16
4C084ZA36
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA17
4H045BA50
4H045EA20
4H045FA10
(57)【要約】
本明細書に開示される化合物は、トランスフェリン受容体に結合して血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが可能で、がん、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、またはパーキンソン病などの脳の疾患または障害を治療するのに有用であることが示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の構造：【化1】
【請求項2】
請求項１に記載の化合物および治療剤を含む薬物送達組成物であって、請求項１に記載の化合物が治療剤に結合している、薬物送達組成物。
【請求項3】
治療有効量の請求項２に記載の薬物送達組成物、および、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤、またはそれらの混合物を含む、医薬組成物。
【請求項4】
請求項３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における脳の疾患または障害を予防または治療する方法。
【請求項5】
脳の疾患または障害が、がん、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、またはパーキンソン病である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２０年７月２日に出願された「Compounds for Drug Delivery Across Blood-Brain Barrier」（血液脳関門を通過する薬物送達のための化合物）とのタイトルの米国特許仮出願第６３／０４７，４４０号に対する優先権を主張し、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、血液脳関門を通過する薬物送達に有用な化合物に関する。
【背景技術】
【0003】
脳の疾患は治療が困難である。それらには、脳へのがん転移（肺がん、乳がんなど）、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、およびパーキンソン病が挙げられる。脳は、血液脳関門（blood-brain barrier、ＢＢＢ）によって末梢から保護されており、ＢＢＢは、タイトジャンクションタンパク質を介して堅く相互接続している内皮細胞で構成されている。ほとんどの薬物は、ＢＢＢを通過して脳に入ることができないため、脳の多くの疾患は、治療が困難である。トランスフェリン受容体を標的とすることにより、ＢＢＢを通過させて薬物を送達するためのさまざまな方法が試みられている。トランスフェリン受容体は、脳への鉄の輸送を担っている。トランスフェリン受容体に結合する抗体が開発されている。これらの抗体は、それらを脳に送達するために薬物とコンジュゲートされている。しかしながら、抗体は、送達効率が低いという欠点があり、そして毒性に関与する。
【発明の概要】
【0004】
本開示は、概して、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが可能な化合物、および薬物送達のためのその使用に関する。
【0005】
概して、本開示は、ＢＢＢを通過することが示され、図１に示される構造を有する化合物に関する。図１は、好ましい実施形態による、（Ａ）ＴＲＢＰ６の化学構造、（Ｂ）ＴＲＢＰ３の化学構造、および、（Ｃ）ＴＲＢＰ５の化学構造、を示す。
【0006】
本開示はまた、本明細書に開示されるＢＢＢを通過することが示される化合物を含む薬物送達剤および組成物、および、本明細書に開示されるＢＢＢを通過することが示される化合物を含む薬物送達のための方法、に関する。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】本明細書に記載の好ましい実施形態による、（Ａ）ＴＲＢＰ６の化学構造、（Ｂ）ＴＲＢＰ３の化学構造、および（Ｃ）ＴＲＢＰ５の化学構造、を示す。
【0008】
【図2】例示的な化合物のトランスフェリン受容体への結合を確認するプルダウンアッセイの結果を示す。
【0009】
【図3】テンタゲル（ｔｅｎｔａｇｅｌ）ビーズ上で再合成された例示的な化合物（ＴＲＢＰ６）が、トランスフェリン受容体発現ＨｅＬａ細胞に結合し、トランスフェリン受容体陰性細胞に結合しないことを示す。
【0010】
【図4】Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６の化学構造を示す。
【0011】
【図5】本明細書に記載の好ましい実施形態による、ＢＢＢを通過することができる例示的な化合物（ＴＲＢＰ６）を注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、および３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。
【0012】
【図6】Ａｎｇペプチドを注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、および３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。
【0013】
【図7】本明細書に記載の好ましい実施形態による、ＢＢＢを通過することができる例示的な化合物（ＴＲＢＰ５）を注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、および３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。
【0014】
【図8】本明細書に記載の好ましい実施形態による、ＢＢＢを通過することができる例示的な化合物（ＴＲＢＰ３）を注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、および３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。
【0015】
【図9-1】本明細書に記載の好ましい実施形態によるＴＲＢＰ６の誘導体の化学構造を示し、（Ａ）二量体、および（Ｂ）三量体を示す。
【図9-2】本明細書に記載の好ましい実施形態によるＴＲＢＰ６の誘導体の化学構造を示し、（Ｃ）四量体、および（Ｄ）環状二量体を示す。
【0016】
【図10】ＴＲＢＰ６のＨＰＬＣクロマトグラムを示し、（Ａ）ＰＤＡクロマトグラム、および（Ｂ）ＰＤＡスペクトルを示す。
【0017】
【図11】異なる時間間隔での、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）およびヒト血漿（ｎ＝３）中のＴＲＢＰ－６ペプトイドの安定性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本開示は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することが示される化合物、および薬物送達におけるその使用に関する。
【0019】
したがって、本明細書に開示される好ましい実施形態は、下記の構造：
で示される、血液脳関門を通過することが可能な化合物に関する。
【化1】
【0020】
トランスフェリン受容体への３つの例示的な化合物の結合は、プルダウンアッセイで確認された。図２に結果を示す。トランスフェリン受容体陽性または陰性のＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物を、ＲＩＰＡバッファーを使用して抽出し、続いて、ＴＲＢＰ３、ＴＲＢＰ５、またはＴＲＢＰ６をコンジュゲートしたビーズと、４℃で一晩、インキュベートした。次いで、ビーズをＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、結合タンパク質を１％ＳＤＳで溶出した。次いで、得られた溶解物を、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに適用し、トランスフェリン受容体に対する抗体をウェスタンブロッティング分析に供した。
【0021】
テンタゲル（ｔｅｎｔａｇｅｌ）ビーズ上で化合物を再合成し、それらをトランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞およびトランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞と別々に、ならびにこれらの細胞の混合物とともに、インキュベートすることによって、オンビーズ２色コンビナトリアル細胞スクリーニングを実施した。ビーズは、トランスフェリン受容体陽性のＨｅＬａ細胞に特異的に結合した。図３に結果を示し、左側の列に細胞が示され、右側の列に細胞とのインキュベーション後のＴＲＢＰ６を含むビーズが示される。
【0022】
Ｃｙ５．５蛍光色素をマウスの脳に送達するこれらの化合物の活性を調べた。図４は、ペプチドＣｙ５．５－ＴＲＢＰ６の化学構造を示す。Ｃｙ５．５標識ペプトイドまたはＣｙ５．５－Ａｎｇペプチドを、ＣＤ－１マウスに静脈内注射し（２５ｎｍｏｌ／マウス、化合物ごとにｎ＝４）、ＩＶＩＳイメージング装置を用いて、画像化した。マウスを、３０分に屠殺し、心臓を１０ｍＬのＰＢＳで灌流し、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）イメージングのために血液と臓器を採取した。図５～８に示すように、化合物ＴＲＢＰ３、ＴＲＢＰ５、およびＴＲＢＰ６は、Ｃｙ５．５を脳に効果的に送達した。ＴＲＢＰ６の脳送達の有効性は、よく研究されているＡｎｇｉｏｐｅｐ－２（Ａｎｇ）ペプチドなどを含めた他の化合物よりもはるかに高い。
【0023】
さらなる好ましい実施形態は、ＢＢＢを通過することが可能な３つの例示的な化合物の誘導体に関する。可能性のある誘導体として、化合物の、二量体、三量体、四量体、および環状二量体が挙げられ、例えば、ＴＲＢＰ６について、図９（図９－１および図９－２）に示される。
【0024】
本明細書に記載のＢＢＢを通過することが可能な例示的な化合物は、異なる幾何異性体形態および鏡像異性体形態で存在していてもよく、これらの別の異性体の純粋な形態および混合物の両方が本発明の範囲に含まれ、生理学的に機能し得るまたは薬理学的に許容されるその塩と誘導体またはプロドラッグも含まれる。これらの代替の形態の生成は、当業者の能力の範囲内である。
【0025】
本発明はまた、薬物または治療剤に結合した本明細書に記載のＢＢＢを通過することが可能な例示的な化合物を含む、薬物送達組成物に関する。本発明はまた、ＢＢＢを通過させて薬物または治療剤を送達する方法であって、本明細書に記載のＢＢＢを通過することが可能な例示的な化合物を、薬物または治療剤と結合させて、例示的な薬物送達組成物を生成し、その後、本明細書に開示される好ましい実施形態にしたがって、対象に例示的な薬物送達組成物を投与するステップを含む、方法にも関する。好ましい実施形態において、薬物または治療薬は、がん、虚血性脳卒中、アルツハイマー病、およびパーキンソン病などの、脳の疾患または障害の予防または治療に有用であり得る。
【0026】
本発明の別の態様において、本明細書に開示される好ましい実施形態による例示的な薬物送達組成物の治療有効量を含む医薬組成物であって、薬物または治療剤に結合した本明細書に記載のＢＢＢを通過することが可能な例示的な化合物、および、薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、担体、緩衝剤または安定剤を含む、医薬組成物が提供される。「治療有効量」は、脳の疾患または障害に対して予防または治療効果を示すのに十分である例示的な薬物送達組成物の量として理解されるべきである。投与の実際の量、割合および時間経過は、疾患または障害、対象、および作用の性質および重症度に依存する。治療の処方は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内である。薬学的に許容される賦形剤、アジュバント、担体、緩衝剤または安定剤は、無毒であるべきであり、有効成分の有効性を妨げてはならない。担体または他の材料の正確な特質は、経口、舌下、鼻腔内、または皮内、皮下、または静脈内注射などの注射、または乾燥粉末吸入などであり得る、投与経路に依存する。
【0027】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であり得る。錠剤は、固体担体またはアジュバントを含み得る。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液、または、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。カプセルは、ゼラチンなどの固体担体を含み得る。静脈内、皮内または皮下の注射の場合、活性成分は、パイロジェンフリーで、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲル液、または乳酸リンゲル液などの等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤が、必要に応じて含まれてもよい。
【0028】
別の態様において、対象への投与のために上記で定義されるＢＢＢを通過させて薬物または治療剤を送達するための、治療有効量の例示的な薬物送達組成物の、医薬の製造における使用が提供される。
【0029】
本明細書を通して使用される「薬理学的に許容される塩」との用語は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸、シュウ酸、マロン酸、サリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、アスコルビン酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、イソエトン酸（isoethonic acid）など、および、炭酸カリウム、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム、アンモニア、トリエチルアミン、トリエタノールアミンなどから形成される、任意の酸または塩基由来の塩を意味すると解釈されるべきである
【0030】
「プロドラッグ」との用語は、不活性または活性が極めて低い形態で投与される、薬理学的物質を意味する。投与されると、プロドラッグは、インビボで活性な代謝物に代謝される。
【0031】
「治療有効量」との用語は、非毒性であるが、所望の治療効果を提供するのに十分な薬物の量を意味する。「有効な」量は、個体の年齢および全身状態、投与される特定の濃度および組成などに応じて、対象ごとに異なる。したがって、正確な有効量を規定することが可能であるとは限らない。しかしながら、個々の場合における適切な有効量は、通常の実験を行うことで当業者により決定することができる。さらに、有効量は、治療上有効な範囲内となる量の薬物を送達するために、製剤を容易に適用するのに十分な範囲内にある濃度である。
【0032】
本発明のさらなる態様は、例示としてのみ与えられる以下の記載から明らかになるであろう。
【実施例】
【0033】
実施例１
図１に示されるトランスフェリン受容体に結合する小分子化合物は、ペプトイドライブラリーを用いたオンビーズ２色（ＯＢＴＣ）コンビナトリアル細胞スクリーニングを実施することによって確認した。
図１に示されるトランスフェリン受容体に結合する小分子化合物は、ペプトイドライブラリーを用いたオンビーズ２色（ＯＢＴＣ）コンビナトリアル細胞スクリーニングを実施することによって確認した。
【0034】
化学薬剤および試薬
テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ）ＭＢ ＮＨ２レジン（粒子径：１４０～１７０μｍ、担持容量：０．２～０．３ｍｍｏｌ／ｇ、５２０，０００ビーズ／ｇ）は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）から購入した。リンクアミド（ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ）レジン（粒子サイズ：１００～２００メッシュ、担持容量：０．３～０．６ｍｍｏｌ／ｇ）は、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ、米国）から購入した。すべてのＦｍｏｃ保護アミノ酸および２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、すべての第一級アミン、ブロモ酢酸、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、トリイソプロピルシアリン（ＴＩＳ）、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸、アセトニトリル（ＡＣＮ）、塩酸（ＨＣｌ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＭＡ、米国）から入手した。ＧＩＢＣＯ酵素フリー細胞解離バッファー、およびＱｔｒａｃｋｅｒ細胞標識キットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）から入手した。末端システイン（ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹＣ）を有するＡｎｇｉｏｐｅｐ－２ペプチド（Ａｎｇ）は、ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓでカスタムメイドした。シアニン５．５マレイミドは、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅから購入した。商業的供給元からのすべての化学試薬および溶媒は、さらに精製することなく使用した。固相合成用の反応容器として、５ｍｌのディスポーザブル反応カラム（Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧ、Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用した。マイクロ波条件下でのペプトイドの合成は、１０００Ｗマイクロ波オーブンにおいて１０％出力で実施した。すべての精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、米国）で行った。マススペクトルは、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ質量分析計で記録した。
テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ）ＭＢ ＮＨ２レジン（粒子径：１４０～１７０μｍ、担持容量：０．２～０．３ｍｍｏｌ／ｇ、５２０，０００ビーズ／ｇ）は、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ ＧｍｂＨ（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）から購入した。リンクアミド（ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ）レジン（粒子サイズ：１００～２００メッシュ、担持容量：０．３～０．６ｍｍｏｌ／ｇ）は、Ｃｈｅｍ－Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、ＩＬ、米国）から購入した。すべてのＦｍｏｃ保護アミノ酸および２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、すべての第一級アミン、ブロモ酢酸、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、トリイソプロピルシアリン（ＴＩＳ）、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸、アセトニトリル（ＡＣＮ）、塩酸（ＨＣｌ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＭＡ、米国）から入手した。ＧＩＢＣＯ酵素フリー細胞解離バッファー、およびＱｔｒａｃｋｅｒ細胞標識キットは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）から入手した。末端システイン（ＴＦＦＹＧＧＳＲＧＫＲＮＮＦＫＴＥＥＹＣ）を有するＡｎｇｉｏｐｅｐ－２ペプチド（Ａｎｇ）は、ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅｓでカスタムメイドした。シアニン５．５マレイミドは、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅから購入した。商業的供給元からのすべての化学試薬および溶媒は、さらに精製することなく使用した。固相合成用の反応容器として、５ｍｌのディスポーザブル反応カラム（Ｉｎｔａｖｉｓ ＡＧ、Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用した。マイクロ波条件下でのペプトイドの合成は、１０００Ｗマイクロ波オーブンにおいて１０％出力で実施した。すべての精製は、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、米国）で行った。マススペクトルは、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸をマトリックスとして使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ Ｐｒｏ質量分析計で記録した。
【0035】
ライブラリー合成
ライブラリーの基本構造は、２つのアミノ酸とそれに続く６ｍｅｒのさまざまなペプトイド領域で構成される。テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ）ＭＢ ＮＨ２（１４０～１７０μｍ；置換：０．２～０．３ｍｍｏｌ／ｇレジン；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，ドイツ）６ｇを、５ｍｌ反応カラム（各カラムに２００ｍｇのレジン）において、室温で３０分間、ＤＭＦで膨潤させた。ＤＭＦを反応容器から取り出し、レジンをまず、１０．０当量のＤＩＰＥＡの存在下、カップリング試薬として５．０当量のＨＢＴＵおよび５．０当量のＨＯＢｔを使用して、一晩振盪して、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（５．０当量）にカップリングさせた。Ｆｍｏｃ基を、２０％ピペリジンのＤＭＦ液で、１０分間２回、レジンを処理することにより、除去した。レジンを洗浄した後、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを加え（反応時間２．０時間）、Ｆｍｏｃ基を前述のように除去した。残りの合成は、スプリットプール合成プロトコルを用いて実施した。ライブラリーのために合計１０種類のアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、アリルアミン、イソブチルアミン、２－メトキシエチルアミン、３－イソプロポキシプロピルアミン、β－アラニン、（Ｒ）－（＋）－α－メチルベンジルアミン、４－メトキシベンジルアミン、ピペロニルアミン、およびフルフリルアミン、が選択された。レジンを、マイクロ波で促進するペプトイド合成ステップのために、１０バッチ（３０個の反応カラム）に均等に分配した。反応容器のそれぞれを、１．０Ｍのブロモ酢酸の無水ＤＭＦ液（１．０ｍｌ）、および１．５ＭのＤＩＣの無水ＤＭＦ液（１．０ｍｌ）で処理し、３０秒間穏やかに振盪し、１５秒間、１０％の出力に設定したマイクロ波（１０００Ｗ）にかけた。ビーズを再度３０秒間振とうし、上記のようにもう１回マイクロ波にかけた。反応カラムを取り出し、ＤＭＦで洗浄した（２．０ｍｌ×１０回）。次いで、各反応バッチを、一級アミンの２．０Ｍ溶液１．０ｍｌ（アミン当たり３つの反応カラム（１バッチ））で処理し、２５℃で２．０時間、振盪機に置いた。レジンを洗浄し、プールし、再度１０バッチ（３０個の反応カラム）に均等に分け、次のペプトイド残基の添加に供した。６ｍｅｒのペプトイド領域が完了するまで、この手順を繰り返した。合成の最後に、ビーズをＤＣＭで洗浄し（２．０ｍｌ×３回）、２．５ｍｌの９５％ＴＦＡ、２．５％水および２．５％ＴＩＳで、振盪機により２時間処理して、側鎖保護を除去し、１０％ジイソプロピルエチルアミンのＤＭＦ液で中和した。反応容器を取り出し、ＤＭＦで洗浄し（２．０ｍｌ×３回）、無水ＤＭＦ中、４℃で保管した。
ライブラリーの基本構造は、２つのアミノ酸とそれに続く６ｍｅｒのさまざまなペプトイド領域で構成される。テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ）ＭＢ ＮＨ２（１４０～１７０μｍ；置換：０．２～０．３ｍｍｏｌ／ｇレジン；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ，ドイツ）６ｇを、５ｍｌ反応カラム（各カラムに２００ｍｇのレジン）において、室温で３０分間、ＤＭＦで膨潤させた。ＤＭＦを反応容器から取り出し、レジンをまず、１０．０当量のＤＩＰＥＡの存在下、カップリング試薬として５．０当量のＨＢＴＵおよび５．０当量のＨＯＢｔを使用して、一晩振盪して、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ（５．０当量）にカップリングさせた。Ｆｍｏｃ基を、２０％ピペリジンのＤＭＦ液で、１０分間２回、レジンを処理することにより、除去した。レジンを洗浄した後、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを加え（反応時間２．０時間）、Ｆｍｏｃ基を前述のように除去した。残りの合成は、スプリットプール合成プロトコルを用いて実施した。ライブラリーのために合計１０種類のアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、アリルアミン、イソブチルアミン、２－メトキシエチルアミン、３－イソプロポキシプロピルアミン、β－アラニン、（Ｒ）－（＋）－α－メチルベンジルアミン、４－メトキシベンジルアミン、ピペロニルアミン、およびフルフリルアミン、が選択された。レジンを、マイクロ波で促進するペプトイド合成ステップのために、１０バッチ（３０個の反応カラム）に均等に分配した。反応容器のそれぞれを、１．０Ｍのブロモ酢酸の無水ＤＭＦ液（１．０ｍｌ）、および１．５ＭのＤＩＣの無水ＤＭＦ液（１．０ｍｌ）で処理し、３０秒間穏やかに振盪し、１５秒間、１０％の出力に設定したマイクロ波（１０００Ｗ）にかけた。ビーズを再度３０秒間振とうし、上記のようにもう１回マイクロ波にかけた。反応カラムを取り出し、ＤＭＦで洗浄した（２．０ｍｌ×１０回）。次いで、各反応バッチを、一級アミンの２．０Ｍ溶液１．０ｍｌ（アミン当たり３つの反応カラム（１バッチ））で処理し、２５℃で２．０時間、振盪機に置いた。レジンを洗浄し、プールし、再度１０バッチ（３０個の反応カラム）に均等に分け、次のペプトイド残基の添加に供した。６ｍｅｒのペプトイド領域が完了するまで、この手順を繰り返した。合成の最後に、ビーズをＤＣＭで洗浄し（２．０ｍｌ×３回）、２．５ｍｌの９５％ＴＦＡ、２．５％水および２．５％ＴＩＳで、振盪機により２時間処理して、側鎖保護を除去し、１０％ジイソプロピルエチルアミンのＤＭＦ液で中和した。反応容器を取り出し、ＤＭＦで洗浄し（２．０ｍｌ×３回）、無水ＤＭＦ中、４℃で保管した。
【0036】
細胞およびｓｉＲＮＡ形質導入
細胞株ＨｅＬａは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＨｅＬａ細胞は、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、３７℃、５％ＣＯ２で、維持した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションでは、トランスフェクションの１日前に、ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍ細胞培養皿に播種し（２．５×１０６／ｄｉｓｈ）、製造元の指示に従って、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用い、ヒトＴＦＲＣ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃａｔ＃ Ｍ－００３９４１－０２－００１０）で、２４時間、処理した。
細胞株ＨｅＬａは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。ＨｅＬａ細胞は、１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で、３７℃、５％ＣＯ２で、維持した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションでは、トランスフェクションの１日前に、ＨｅＬａ細胞を１０ｃｍ細胞培養皿に播種し（２．５×１０６／ｄｉｓｈ）、製造元の指示に従って、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用い、ヒトＴＦＲＣ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｃａｔ＃ Ｍ－００３９４１－０２－００１０）で、２４時間、処理した。
【0037】
コンビナトリアルライブラリースクリーニングのためのオンビーズ２色結合アッセイ
約５０，０００個のペプトイドライブラリービーズを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（培地）で２回洗浄し、ポリプロピレンチューブ内で１．０ｍｌ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で１．０時間インキュベートした。トランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞およびトランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞を、３７℃で２０分間、プレートあたり２．０ｍｌのＧＩＢＣＯ酵素フリー細胞解離バッファーを用いて培養プレートから取り出した。細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁した。細胞を計数し、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに、培地１．０ｍｌに１．０×１０６個の細胞で、分配した。次いで、細胞標識手順を以下のように実施した：各１．０μｌのＱｔｒａｃｋｅｒ試薬Ａおよび試薬Ｂを、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中で混合し、室温で５．０分間インキュベートした。０．２ｍｌの培地を各チューブに加え、３０秒間ボルテックスした。１．０×１０６個の細胞を、標識溶液を含む各チューブに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。トランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞は、Ｑｔｒａｃｋｅｒ６５５（赤色）で標識し、トランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞は、Ｑｔｒａｃｋｅｒ５６５（緑色）で標識した。細胞を２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁した。標識された細胞を、カラーカメラを備えたＢＸ－５１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＰＡ）のロングパスフィルターで可視化した。細胞タイプをどちらも完全に混合し、数回ピペッティングして塊を壊した。２．０ｍｌの細胞懸濁液混合物を、５０，０００個のビーズを含有するチューブに添加し、穏やかに振盪しながら室温で１．０時間インキュベートした。インキュベーション中、ビーズへの細胞の結合を約１５分間隔で時々チェックして、平衡化しすぎないようにし、ビーズへの細胞の非特異的結合を増加させた。ビーズをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で２回穏やかに洗浄し、ロングパスフィルターを使用して蛍光顕微鏡で可視化した。
約５０，０００個のペプトイドライブラリービーズを、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（培地）で２回洗浄し、ポリプロピレンチューブ内で１．０ｍｌ（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）で１．０時間インキュベートした。トランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞およびトランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞を、３７℃で２０分間、プレートあたり２．０ｍｌのＧＩＢＣＯ酵素フリー細胞解離バッファーを用いて培養プレートから取り出した。細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁した。細胞を計数し、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブに、培地１．０ｍｌに１．０×１０６個の細胞で、分配した。次いで、細胞標識手順を以下のように実施した：各１．０μｌのＱｔｒａｃｋｅｒ試薬Ａおよび試薬Ｂを、１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中で混合し、室温で５．０分間インキュベートした。０．２ｍｌの培地を各チューブに加え、３０秒間ボルテックスした。１．０×１０６個の細胞を、標識溶液を含む各チューブに加え、３７℃で６０分間インキュベートした。トランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞は、Ｑｔｒａｃｋｅｒ６５５（赤色）で標識し、トランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞は、Ｑｔｒａｃｋｅｒ５６５（緑色）で標識した。細胞を２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁した。標識された細胞を、カラーカメラを備えたＢＸ－５１蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＰＡ）のロングパスフィルターで可視化した。細胞タイプをどちらも完全に混合し、数回ピペッティングして塊を壊した。２．０ｍｌの細胞懸濁液混合物を、５０，０００個のビーズを含有するチューブに添加し、穏やかに振盪しながら室温で１．０時間インキュベートした。インキュベーション中、ビーズへの細胞の結合を約１５分間隔で時々チェックして、平衡化しすぎないようにし、ビーズへの細胞の非特異的結合を増加させた。ビーズをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で２回穏やかに洗浄し、ロングパスフィルターを使用して蛍光顕微鏡で可視化した。
【0038】
シーケンシングのためのビーズの単離および調製
蛍光標識された赤色の細胞を含む単一のビーズを、対物倍率１０倍の蛍光顕微鏡を使用して識別し、中型サイズのピペットチップを備えた２０μｌピペットによって手動で取り出した。選ばれたビーズを１．０％ＳＤＳで３回洗浄し、同じ溶液で４５分間煮沸して、結合した細胞とタンパク質を取り除いた。最後にビーズを水で３回洗浄した。ビーズから化合物を切断し、ＭＳ／ＭＳシーケンシング用のものを調製するために、切断溶液を調製した。そのために、３０μｌのＣＮＢｒ（ＡＣＮ中５．０Ｍ）を、１．０ｍｌの０．１ＮのＨＣｌに加えた。５０μｌの切断溶液を、単一の単離されたビーズを含む１．５ｍｌチューブに添加した。チューブを２５℃で４．０時間インキュベートした。凍結乾燥機（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、溶液を蒸発させ、切断された化合物を２０μｌの水に懸濁した。ＭＳ／ＭＳシーケンスデータを、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ ５８００機器を使用して取得した。
蛍光標識された赤色の細胞を含む単一のビーズを、対物倍率１０倍の蛍光顕微鏡を使用して識別し、中型サイズのピペットチップを備えた２０μｌピペットによって手動で取り出した。選ばれたビーズを１．０％ＳＤＳで３回洗浄し、同じ溶液で４５分間煮沸して、結合した細胞とタンパク質を取り除いた。最後にビーズを水で３回洗浄した。ビーズから化合物を切断し、ＭＳ／ＭＳシーケンシング用のものを調製するために、切断溶液を調製した。そのために、３０μｌのＣＮＢｒ（ＡＣＮ中５．０Ｍ）を、１．０ｍｌの０．１ＮのＨＣｌに加えた。５０μｌの切断溶液を、単一の単離されたビーズを含む１．５ｍｌチューブに添加した。チューブを２５℃で４．０時間インキュベートした。凍結乾燥機（ＳＰ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を使用して、溶液を蒸発させ、切断された化合物を２０μｌの水に懸濁した。ＭＳ／ＭＳシーケンスデータを、ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦ ５８００機器を使用して取得した。
【0039】
このスクリーニング実験において、３つの「ヒット」が確認された。図１にその化合物を示しており、１つは、ＴＲＢＰ６（トランスフェリン受容体結合ペプトイド＃６）として識別される。
【0040】
インビトロプルダウンアッセイ
トランスフェリン受容体の発現またはトランスフェリン受容体のノックダウンがされたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡバッファー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を使用して抽出し、続いて、ＴＲＢＰ６、ＴＲＢＰ３、およびＴＲＢＰ５がコンジュゲートしたビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、ビーズをＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、結合タンパク質を１％ＳＤＳにより９５℃で５分間溶出した。次いで、得られた溶解物を、４×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ローディングバッファー）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合した。次いで、サンプルを８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに適用した。そして、ゲルをウェスタンブロッティング分析にかけた。
トランスフェリン受容体の発現またはトランスフェリン受容体のノックダウンがされたＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物を、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を添加したＲＩＰＡバッファー（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）を使用して抽出し、続いて、ＴＲＢＰ６、ＴＲＢＰ３、およびＴＲＢＰ５がコンジュゲートしたビーズと共に４℃で一晩インキュベートした。次いで、ビーズをＲＩＰＡバッファーで３回洗浄し、結合タンパク質を１％ＳＤＳにより９５℃で５分間溶出した。次いで、得られた溶解物を、４×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（ローディングバッファー）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と混合した。次いで、サンプルを８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに適用した。そして、ゲルをウェスタンブロッティング分析にかけた。
【0041】
ウエスタンブロット分析
細胞をＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳのＰＢＳ液）で溶解した。完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を、使用前に溶解バッファーに添加した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した。タンパク質サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをＰＢＳＴ中の５％脱脂乳で一晩ブロックし、一次抗体とインキュベートし、続いて、適切なホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートした。標的タンパク質のシグナルを、Ｉｍｍｕｎ－Ｓｔａｒ ＨＲＰ ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で記録した。抗ｈＴｆＲ（ヒトトランスフェリン受容体）抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．から購入した（Ｃａｔ＃ＡＦ２４７４）。
細胞をＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ－４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳのＰＢＳ液）で溶解した。完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を、使用前に溶解バッファーに添加した。タンパク質濃度は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＤＣタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した。タンパク質サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンをＰＢＳＴ中の５％脱脂乳で一晩ブロックし、一次抗体とインキュベートし、続いて、適切なホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートした。標的タンパク質のシグナルを、Ｉｍｍｕｎ－Ｓｔａｒ ＨＲＰ ｐｅｒｏｘｉｄｅ Ｌｕｍｉｎｏｌ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で記録した。抗ｈＴｆＲ（ヒトトランスフェリン受容体）抗体は、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．から購入した（Ｃａｔ＃ＡＦ２４７４）。
【0042】
図２に結果を示す。そこでは、トランスフェリン受容体への結合が、３つの例示的な化合物において見られる。
【0043】
オンビーズ２色結合スクリーニング結果の検証
ＭＳ／ＭＳシーケンシングで化合物（ＴＲＢＰ６）を同定した後、テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ）ＭＢ ＮＨ２ビーズで再合成した。２５，０００個のビーズ（ＴＲＢＰ６化合物を含む）の３つのチューブをそれぞれ、洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで１．０時間インキュベートすることによって、調製した。セクション４で説明した方法に従って、２００万個の細胞についてそれぞれ、Ｑｔｒａｃｋｅｒ６５５を使用して、トランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞を赤色に染色し、Ｑｔｒａｃｋｅｒ５６５を使用して、トランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞を緑色に染色した。１００万個のトランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞（赤色細胞）を１．０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２５，０００個のビーズを含むチューブに加えた。１００万個のトランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞（緑色細胞）を１．０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２５，０００個のビーズを含む別のチューブに加えた。細胞の混合物を作るために、０．５×１０６個の赤色細胞と０．５×１０６個の緑色細胞を一緒に混合し、１．０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２５，０００個のビーズを含む第３のチューブに加えた。細胞をビーズと共に室温で１．０時間インキュベートした。ビーズをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で２回穏やかに洗浄し、ロングパスフィルターを使用して蛍光顕微鏡で可視化した。
ＭＳ／ＭＳシーケンシングで化合物（ＴＲＢＰ６）を同定した後、テンタゲル（ＴｅｎｔａＧｅｌ）ＭＢ ＮＨ２ビーズで再合成した。２５，０００個のビーズ（ＴＲＢＰ６化合物を含む）の３つのチューブをそれぞれ、洗浄し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで１．０時間インキュベートすることによって、調製した。セクション４で説明した方法に従って、２００万個の細胞についてそれぞれ、Ｑｔｒａｃｋｅｒ６５５を使用して、トランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞を赤色に染色し、Ｑｔｒａｃｋｅｒ５６５を使用して、トランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞を緑色に染色した。１００万個のトランスフェリン受容体陽性ＨｅＬａ細胞（赤色細胞）を１．０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２５，０００個のビーズを含むチューブに加えた。１００万個のトランスフェリン受容体陰性ＨｅＬａ細胞（緑色細胞）を１．０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２５，０００個のビーズを含む別のチューブに加えた。細胞の混合物を作るために、０．５×１０６個の赤色細胞と０．５×１０６個の緑色細胞を一緒に混合し、１．０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に懸濁し、２５，０００個のビーズを含む第３のチューブに加えた。細胞をビーズと共に室温で１．０時間インキュベートした。ビーズをＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で２回穏やかに洗浄し、ロングパスフィルターを使用して蛍光顕微鏡で可視化した。
【0044】
図３に結果を示す。この図において、細胞は左の列に示され、細胞とのインキュベーション後のＴＲＢＰ６を含むビーズは右の列に示されている。ビーズは、赤色細胞との結合のみを示し、緑色細胞との結合は示さなかったため、ＯＢＴＣスクリーニング結果の所見が検証された。
【0045】
動物
メスのＣＤ－１マウス（６～８週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、組織分布研究に使用した。すべての手順は、ヒューストン大学のアニマルケアオペレーションによって承認され、動物のケアと使用に関する機関のガイドラインに従って実施した。
メスのＣＤ－１マウス（６～８週齢）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、組織分布研究に使用した。すべての手順は、ヒューストン大学のアニマルケアオペレーションによって承認され、動物のケアと使用に関する機関のガイドラインに従って実施した。
【0046】
化合物ＴＲＢＰ６の合成
ＴＲＢＰ６は、リンクアミド（ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ）レジンで合成した。１００ｍｇのレジンを５ｍＬの反応カラムに入れ、レジンを、使用１．０時間前に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で膨潤させ、２．０ｍｌの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で、レジンを１０分ずつ２回、処理することにより、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。１０．０当量のＤＩＰＥＡの存在下で一晩、カップリング試薬として５．０当量のＨＢＴＵおよび５．０当量のＨＯＢｔを使用して、まずレジンをＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨにカップリングさせた。上記の方法でＦｍｏｃを除去した。後続のアミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを、同じペプチド結合プロトコル（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ）を使用して導入し、ＤＭＦで１０回洗浄した。上記のようにＦｍｏｃ基を除去した後、マイクロ波アシスト合成プロトコルの下で２段階のペプトイドカップリング手順（アシル化およびアミノ化）を用いて、６つのペプトイド残基をカップリングさせた。アシル化の段階では、ビーズを、１．０Ｍのブロモ酢酸（１．０ｍＬ）および１．５ＭのＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１．０ｍＬ）で処理し、１０％の出力でマイクロ波にかけ（２×１５秒）、その間に３０秒間穏やかに振とうした。ＤＭＦで洗浄後、ビーズを、１．０ｍＬの２－メトキシエチルアミン（２．０Ｍ）で処理し、２５℃で２時間振とうして、カップリングを行った。この手順を何度か繰り返して、残りの５つの残基：それぞれ、イソブチルアミン、（Ｒ）－（＋）－α－メチルベンジルアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、３－イソプロポキシプロピルアミン、およびＮ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、を結合させた。最後に、ビーズをジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄し、切断の前に、真空下で乾燥させた。次いで、ビーズを、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５％／２．５％／２．５％）の切断カクテルで２．０時間、処理した。次いで、粗化合物を、ＨＰＬＣを用いて精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。
ＴＲＢＰ６は、リンクアミド（ｒｉｎｋ ａｍｉｄｅ）レジンで合成した。１００ｍｇのレジンを５ｍＬの反応カラムに入れ、レジンを、使用１．０時間前に、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で膨潤させ、２．０ｍｌの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で、レジンを１０分ずつ２回、処理することにより、Ｆｍｏｃ基を脱保護した。１０．０当量のＤＩＰＥＡの存在下で一晩、カップリング試薬として５．０当量のＨＢＴＵおよび５．０当量のＨＯＢｔを使用して、まずレジンをＦｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨにカップリングさせた。上記の方法でＦｍｏｃを除去した。後続のアミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨを、同じペプチド結合プロトコル（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ）を使用して導入し、ＤＭＦで１０回洗浄した。上記のようにＦｍｏｃ基を除去した後、マイクロ波アシスト合成プロトコルの下で２段階のペプトイドカップリング手順（アシル化およびアミノ化）を用いて、６つのペプトイド残基をカップリングさせた。アシル化の段階では、ビーズを、１．０Ｍのブロモ酢酸（１．０ｍＬ）および１．５ＭのＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１．０ｍＬ）で処理し、１０％の出力でマイクロ波にかけ（２×１５秒）、その間に３０秒間穏やかに振とうした。ＤＭＦで洗浄後、ビーズを、１．０ｍＬの２－メトキシエチルアミン（２．０Ｍ）で処理し、２５℃で２時間振とうして、カップリングを行った。この手順を何度か繰り返して、残りの５つの残基：それぞれ、イソブチルアミン、（Ｒ）－（＋）－α－メチルベンジルアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、３－イソプロポキシプロピルアミン、およびＮ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、を結合させた。最後に、ビーズをジクロロメタン（ＤＣＭ）で洗浄し、切断の前に、真空下で乾燥させた。次いで、ビーズを、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５％／２．５％／２．５％）の切断カクテルで２．０時間、処理した。次いで、粗化合物を、ＨＰＬＣを用いて精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより分析した。
【0047】
化合物Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６の合成
Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６の合成は、ＴＲＢＰ６について記載したものと同様のプロトコルを使用して行った。Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６についてのアミノ酸残基の配列は、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、およびＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨであり、Ｆｍｏｃ基の除去は毎回、２．０ｍｌの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回、レジンを処理することにより行った。次に、マイクロ波アシスト合成プロトコルを使用して、６つのペプトイド残基をカップリングさせた。６つのペプトイド配列は、それぞれ、２－メトキシエチルアミン、イソブチルアミン、（Ｒ）－（＋）－α－メチルベンジルアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、３－イソプロポキシプロピルアミン、およびＮ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミンであった。ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５％／２．５％／２．５％）で２．０時間処理することにより、化合物をビーズから切断した。システイン結合ＴＲＢＰ６誘導体は、ＨＰＬＣを使用して混合物を精製し、これに、シアニン５．５マレイミドを、チオール－マレイミドカップリングプロトコルを使用して、それらを水中で１：１の当量比で混合することによってカップリングさせ、溶液のｐＨを７に調整することによって得られた。混合物を４℃で一晩撹拌した。混合物をＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで分析して、Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６を得た。
Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６の合成は、ＴＲＢＰ６について記載したものと同様のプロトコルを使用して行った。Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６についてのアミノ酸残基の配列は、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、およびＦｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨであり、Ｆｍｏｃ基の除去は毎回、２．０ｍｌの２０％ピペリジンＤＭＦ溶液で１０分間ずつ２回、レジンを処理することにより行った。次に、マイクロ波アシスト合成プロトコルを使用して、６つのペプトイド残基をカップリングさせた。６つのペプトイド配列は、それぞれ、２－メトキシエチルアミン、イソブチルアミン、（Ｒ）－（＋）－α－メチルベンジルアミン、Ｎ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミン、３－イソプロポキシプロピルアミン、およびＮ－Ｂｏｃ－１，４－ブタンジアミンであった。ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５％／２．５％／２．５％）で２．０時間処理することにより、化合物をビーズから切断した。システイン結合ＴＲＢＰ６誘導体は、ＨＰＬＣを使用して混合物を精製し、これに、シアニン５．５マレイミドを、チオール－マレイミドカップリングプロトコルを使用して、それらを水中で１：１の当量比で混合することによってカップリングさせ、溶液のｐＨを７に調整することによって得られた。混合物を４℃で一晩撹拌した。混合物をＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで分析して、Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６を得た。
【0048】
図４に、Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６の化学構造を示す。
【0049】
Ｃｙ５．５－Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（Ｃｙ５．５－Ａｎｇ）の合成
Ａｎｇペプチドを、シアニン５．５マレイミドと水中で１：１のモル比で混合し、０．５ＭのＥＤＴＡを加えた。反応混合物のｐＨを塩酸（１Ｎ）で６．９～７．０に調整した。反応物を４℃で一晩撹拌し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによってモニタリングした。反応の完了後、混合物を凍結乾燥し、分取ＨＰＬＣを使用して精製して、目的の化合物Ｃｙ５．５－Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（３８．５％）を青色粉末として得た。
Ａｎｇペプチドを、シアニン５．５マレイミドと水中で１：１のモル比で混合し、０．５ＭのＥＤＴＡを加えた。反応混合物のｐＨを塩酸（１Ｎ）で６．９～７．０に調整した。反応物を４℃で一晩撹拌し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによってモニタリングした。反応の完了後、混合物を凍結乾燥し、分取ＨＰＬＣを使用して精製して、目的の化合物Ｃｙ５．５－Ａｎｇｉｏｐｅｐ－２（３８．５％）を青色粉末として得た。
【0050】
ＣＤ－１マウスにおけるインビボ生体内分布研究
Ｃｙ５．５標識ペプトイドと対照Ｃｙ５．５－Ａｎｇの生体内分布研究を、健康なメスのＣＤ－１マウス（６～８週齢、１群あたりｎ＝４）で実施した。蛍光標識されたペプトイドおよびＣｙ５．５－Ａｎｇを、１００μｌの生理食塩水に調製し（マウス１匹あたり、２５ｎｍｏｌのＣｙ５．５－ＴＲＢＰを含む生理食塩水１００μｌ）、尾静脈からマウスに静脈内注射した。ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、蛍光シグナルの全身イメージングを、５分、１５分、および３０分において測定した。３０分において、マウスを安楽死させ、マウスの左心室を介して、４／ｍｌ／ｍｉｎの流速で１０ｍＬの１０％ヘパリン化ＰＢＳで脳を灌流した。灌流の前に、虹彩ハサミを使用して右心房を小さく切開した。脳灌流後、エクスビボイメージングのために、重要な臓器（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、血液および血漿）を収集した。蛍光強度を、励起波長６６０ｎｍ、最大発光波長７１０ｎｍで測定した。目的の臓器の領域（ＲＯＩ）を測定し、Ｌｉｖｉｎｇ画像ソフトウェアを使用して分析した。実験のデータは平均±ＳＤとして表され、ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって分析した。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｃ．、バージョン７．０４）で行い、ｐ＜０．０５の場合、結果は統計的に有意であるとみなした。
Ｃｙ５．５標識ペプトイドと対照Ｃｙ５．５－Ａｎｇの生体内分布研究を、健康なメスのＣＤ－１マウス（６～８週齢、１群あたりｎ＝４）で実施した。蛍光標識されたペプトイドおよびＣｙ５．５－Ａｎｇを、１００μｌの生理食塩水に調製し（マウス１匹あたり、２５ｎｍｏｌのＣｙ５．５－ＴＲＢＰを含む生理食塩水１００μｌ）、尾静脈からマウスに静脈内注射した。ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、蛍光シグナルの全身イメージングを、５分、１５分、および３０分において測定した。３０分において、マウスを安楽死させ、マウスの左心室を介して、４／ｍｌ／ｍｉｎの流速で１０ｍＬの１０％ヘパリン化ＰＢＳで脳を灌流した。灌流の前に、虹彩ハサミを使用して右心房を小さく切開した。脳灌流後、エクスビボイメージングのために、重要な臓器（脳、心臓、肺、肝臓、脾臓、血液および血漿）を収集した。蛍光強度を、励起波長６６０ｎｍ、最大発光波長７１０ｎｍで測定した。目的の臓器の領域（ＲＯＩ）を測定し、Ｌｉｖｉｎｇ画像ソフトウェアを使用して分析した。実験のデータは平均±ＳＤとして表され、ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析によって分析した。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｉｎｃ．、バージョン７．０４）で行い、ｐ＜０．０５の場合、結果は統計的に有意であるとみなした。
【0051】
統計分析
特に断りのない限り、データは平均±ＳＥＭとして表す。データはスチューデントｔ検定によって分析し、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であるとみなした。ｐ値は、正確なｐ値として表されるか、一般に、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１として表される。
特に断りのない限り、データは平均±ＳＥＭとして表す。データはスチューデントｔ検定によって分析し、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であるとみなした。ｐ値は、正確なｐ値として表されるか、一般に、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、および＊＊＊ｐ＜０．００１として表される。
【0052】
図５は、ＢＢＢを通過することが可能な例示的な化合物、Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ６を注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、ならびに３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。注射後３０分で、ＴＲＢＰ６は、他の化合物（十分に研究されたＡｎｇペプチドを含む）よりも優れた脳への送達効率を示した。
【0053】
図６は、Ｃｙ５．５－Ａｎｇペプチドを注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、ならびに３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。
【0054】
図７は、ＢＢＢを通過することが可能な例示的な化合物、Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ５を注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、ならびに３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。
【0055】
図８は、ＢＢＢを通過することが可能な例示的な化合物、Ｃｙ５．５－ＴＲＢＰ３を注射したマウスについての、５分、１５分、および３０分の、ならびに３０分の灌流後のエクスビボでの、蛍光強度のＩＶＩＳ画像を示す。
【0056】
実施例２
水への溶解性
ＴＲＢＰ－６ペプトイドの溶解性は、滴定によって測定した。簡単に言うと、ＴＲＢＰ－６の正確な量（５ｍｇ）を、透明な１．５ｍｌエッペンドルフチューブに測った。固形物が完全に溶解し、溶液が透明になるまで、ＤＩ水をチューブに滴下して加えた（～５μｌ／滴）。溶解性は、ペプトイド量とＤＩ水総量との比率として計算した。１０μｌ中４．９６ｍｇの濃度（４９６ｍｇ／ｍｌ）において、ＴＲＢＰ－６は完全に溶解したままである。したがって、ＴＲＢＰ－６の水溶解性は４９６ｍｇ／ｍｌより高く、水溶性が高いと考えられる。ＴＲＢＰ－６の水への溶解性を以下に示す。
水への溶解性
ＴＲＢＰ－６ペプトイドの溶解性は、滴定によって測定した。簡単に言うと、ＴＲＢＰ－６の正確な量（５ｍｇ）を、透明な１．５ｍｌエッペンドルフチューブに測った。固形物が完全に溶解し、溶液が透明になるまで、ＤＩ水をチューブに滴下して加えた（～５μｌ／滴）。溶解性は、ペプトイド量とＤＩ水総量との比率として計算した。１０μｌ中４．９６ｍｇの濃度（４９６ｍｇ／ｍｌ）において、ＴＲＢＰ－６は完全に溶解したままである。したがって、ＴＲＢＰ－６の水溶解性は４９６ｍｇ／ｍｌより高く、水溶性が高いと考えられる。ＴＲＢＰ－６の水への溶解性を以下に示す。
【表1】
【0057】
ＨＰＬＣ分析
ＲＰ－ＨＰＬＣを、ＬＣ－２０Ａ液体クロマトグラフィーシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本）で実施した。詳細には、ＨＰＬＣシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＤ溶媒送出ポンプ、ＳＩＬ－２０Ａオートサンプラー、およびＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ ＵＶ／Ｖｉｓ検出器で構成された。ＴＲＢＰ－６ペプトイドを、室温で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用して分析した。移動相は、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡの水溶液）、および溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡのアセトニトリル液、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸）から構成された。１０μｌのＴＲＢＰ－６ペプトイド溶液（ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、１：１中、３５０μｇ／ｍｌ）のアリコートを、ＨＰＬＣシステムに注入した。ＴＲＢＰ－６について、流速１ｍｌ／ｍｉｎのアイソクラティック法を、３０％Ｂ液で１５分間適用した。検出波長は２２０ｎｍに設定した。データを取得し、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓバージョン５．９２で処理した。ＴＲＢＰ－６のＨＰＬＣクロマトグラムは、図１０に示しており、すなわち、（Ａ）ＰＤＡクロマトグラム、および（Ｂ）ＰＤＡスペクトルを示す。図１０（Ａ）は、上記のＨＰＬＣ法によって得られたＴＲＢＰ－６（保持時間ｔＲ＝４．９０４ｍｉｎ）のＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムであり、合成したＴＲＢＰ－６の純粋性を示している。図１０（Ｂ）は、ＴＲＢＰ－６をＨＰＬＣカラムに注入して得たＴＲＢＰ－６のＵＶ吸収スペクトルをプロットしたもので、ＴＲＢＰ－６の最大ＵＶ吸光度の波長（λｍａｘ＝２１６ｎｍ）を示している。
ＲＰ－ＨＰＬＣを、ＬＣ－２０Ａ液体クロマトグラフィーシステム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、日本）で実施した。詳細には、ＨＰＬＣシステムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＤ溶媒送出ポンプ、ＳＩＬ－２０Ａオートサンプラー、およびＳｈｉｍａｄｚｕ ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ ＵＶ／Ｖｉｓ検出器で構成された。ＴＲＢＰ－６ペプトイドを、室温で、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（登録商標）ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用して分析した。移動相は、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡの水溶液）、および溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡのアセトニトリル液、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸）から構成された。１０μｌのＴＲＢＰ－６ペプトイド溶液（ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ、１：１中、３５０μｇ／ｍｌ）のアリコートを、ＨＰＬＣシステムに注入した。ＴＲＢＰ－６について、流速１ｍｌ／ｍｉｎのアイソクラティック法を、３０％Ｂ液で１５分間適用した。検出波長は２２０ｎｍに設定した。データを取得し、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓバージョン５．９２で処理した。ＴＲＢＰ－６のＨＰＬＣクロマトグラムは、図１０に示しており、すなわち、（Ａ）ＰＤＡクロマトグラム、および（Ｂ）ＰＤＡスペクトルを示す。図１０（Ａ）は、上記のＨＰＬＣ法によって得られたＴＲＢＰ－６（保持時間ｔＲ＝４．９０４ｍｉｎ）のＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムであり、合成したＴＲＢＰ－６の純粋性を示している。図１０（Ｂ）は、ＴＲＢＰ－６をＨＰＬＣカラムに注入して得たＴＲＢＰ－６のＵＶ吸収スペクトルをプロットしたもので、ＴＲＢＰ－６の最大ＵＶ吸光度の波長（λｍａｘ＝２１６ｎｍ）を示している。
【0058】
ＰＢＳ、ｐＨ７．４における安定性
ＴＲＢＰ－６ペプトイドを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で、３５０μｇ／ｍｌに希釈した。溶液を穏やかに振とうしながら３７℃の水浴中でインキュベートした。アリコート（５０μｌ）を異なる時間間隔（０、１、３、６、９、２４時間）で、ＴＲＢＰ－６溶液から抜き取った。各時点で、分析のために１０μｌの溶液をＨＰＬＣに注入した。再現性を調べるために、実験は３回実施した。下記の表は、さまざまな時間間隔でのＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＴＲＢＰ－６ペプトイドの量を示している。
ＴＲＢＰ－６ペプトイドを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で、３５０μｇ／ｍｌに希釈した。溶液を穏やかに振とうしながら３７℃の水浴中でインキュベートした。アリコート（５０μｌ）を異なる時間間隔（０、１、３、６、９、２４時間）で、ＴＲＢＰ－６溶液から抜き取った。各時点で、分析のために１０μｌの溶液をＨＰＬＣに注入した。再現性を調べるために、実験は３回実施した。下記の表は、さまざまな時間間隔でのＰＢＳ、ｐＨ７．４中のＴＲＢＰ－６ペプトイドの量を示している。
【0059】
ヒト血漿における安定性
濃度５ｍｇ／ｍｌのＴＲＢＰ－６ペプトイドのＰＢＳ溶液を、ヒト血漿で１．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。ヒト血漿中、３７℃で、０、１、３、６、９、および２４時間インキュベートした後、５０μｌの混合物を１５０μｌの冷アセトニトリルでクエンチし、１４８０００ｒｐｍ×２０分で遠心分離した。上清（１００μｌ）をＨＰＬＣで測定した。アッセイは３回実施した。下記の表は、さまざまな時間間隔でのヒト血漿中のＴＲＢＰ－６ペプトイドの量を示している。このデータは、ＴＲＢＰ－６の優れた安定性を支持している。
濃度５ｍｇ／ｍｌのＴＲＢＰ－６ペプトイドのＰＢＳ溶液を、ヒト血漿で１．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。ヒト血漿中、３７℃で、０、１、３、６、９、および２４時間インキュベートした後、５０μｌの混合物を１５０μｌの冷アセトニトリルでクエンチし、１４８０００ｒｐｍ×２０分で遠心分離した。上清（１００μｌ）をＨＰＬＣで測定した。アッセイは３回実施した。下記の表は、さまざまな時間間隔でのヒト血漿中のＴＲＢＰ－６ペプトイドの量を示している。このデータは、ＴＲＢＰ－６の優れた安定性を支持している。
【表2】
【0060】
図１１は、さまざまな時間間隔での、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中およびヒト血漿中（ｎ＝３）の、ＴＲＢＰ－６ペプトイドの安定性を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】