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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-31
(54)【発明の名称】前赤内期マラリアワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/39 20060101AFI20230724BHJP
A61K 39/015 20060101ALI20230724BHJP
A61P 33/06 20060101ALI20230724BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20230724BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/06 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20230724BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230724BHJP
C07D 239/49 20060101ALI20230724BHJP
A61K 31/505 20060101ALI20230724BHJP
C07K 14/445 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/30 20060101ALN20230724BHJP
【ＦＩ】
A61K39/39 ZNA
A61K39/015
A61P33/06
A61K9/107
A61K9/19
A61K47/06
A61K47/26
A61K47/22
A61K47/14
A61K47/10
C07D239/49
A61K31/505
C07K14/445
C12N15/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022581611
(86)(22)【出願日】2020-12-01
(85)【翻訳文提出日】2023-02-21
(86)【国際出願番号】 JP2020044675
(87)【国際公開番号】W WO2022003999
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】63/045,540
(32)【優先日】2020-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ２０１９年１２月２日にウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｅａｄｅｒ．ｅｌｓｅｖｉｅｒ．ｃｏｍ／ｒｅａｄｅｒ／ｓｄ／ｐｉｉ／Ｓ００２１９２５８１７４８３３６０？ｔｏｋｅｎ＝６５８６５ＥＥＡ４１Ｃ７Ｂ９ＥＢＥ３９Ｃ７０６９２２１Ｅ５Ｂ０８Ｃ７Ｆ３Ａ３ＤＣＦ３ＤＣ３Ｅ２７８Ｆ２ＡＤ４１Ｃ２１３Ｄ２２８Ｆ７１ＥＣＥＥＢ１ＤＦＤ１５Ｅ６Ｂ３１１４ＣＣ５１４０ＢＤ１Ｆ６Ｆ＆ｏｒｉｇｉｎＲｅｇｉｏｎ＝ｕｓ－ｅａｓｔ－１＆ｏｒｉｇｉｎＣｒｅａｔｉｏｎ＝２０２２１１１６０４３４３１）で公開されたＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙのウェブサイトにて、前赤内期マラリアワクチンに関する研究結果について公開した。
(71)【出願人】
【識別番号】522378317
【氏名又は名称】ピーエイティエイチ
【氏名又は名称原語表記】ＰＡＴＨ
(71)【出願人】
【識別番号】000002912
【氏名又は名称】住友ファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100162695
【弁理士】
【氏名又は名称】釜平 双美
(74)【代理人】
【識別番号】100156155
【弁理士】
【氏名又は名称】水原 正弘
(72)【発明者】
【氏名】キング，シー リヒター
(72)【発明者】
【氏名】ウー，イーミン
(72)【発明者】
【氏名】プリースカット，ジョーダン リー
(72)【発明者】
【氏名】タイゼン，ミケル
(72)【発明者】
【氏名】シン，スシール クマール
(72)【発明者】
【氏名】福島 晃久
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA11
4C076AA30
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB25
4C076BB31
4C076CC06
4C076DD08E
4C076DD08F
4C076DD09E
4C076DD09F
4C076DD34
4C076DD38
4C076DD59
4C076DD60
4C076DD67
4C076FF01
4C076FF11
4C076FF15
4C076FF16
4C085AA03
4C085AA38
4C085EE03
4C085EE06
4C085FF12
4C085FF17
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC42
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA07
4C086MA22
4C086MA44
4C086MA55
4C086MA59
4C086MA63
4C086MA65
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB38
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA22
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
保存安定性および免疫賦活活性に優れた前赤内期マラリアワクチンを提供する。本発明によれば、抗原に対する特異的免疫反応をさらに増強することができ、かつ保存安定性の高いワクチンアジュバントとして（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物と、生物活性を示すマラリアワクチンとを組み合わせることにより、保存安定性および免疫賦活活性に優れた前赤内期マラリアワクチンを提供することが可能となる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトに、医薬上の有効量の医薬組成物Ｉ）およびワクチンＩＩ）の組み合わせを投与することを含む、マラリア感染を阻止するための方法であって、当該医薬組成物Ｉ）が、以下の成分ｉ）～ｖｉ）：ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含み；および
当該ワクチンＩＩ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンである、方法。
【請求項2】
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、組み合わせ医薬。
【請求項3】
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、マラリア用ワクチン製剤。
【請求項4】
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、キット。
【請求項5】
医薬組成物が、水中油型エマルション製剤またはその凍結乾燥製剤である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項6】
親水性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、およびポリソルベート８０）；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０）；またはポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類（例えば、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、およびポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコール）である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項7】
親水性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、またはポリソルベート８０である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項8】
親油性界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、および中鎖トリグリセリド）；グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン、およびトリイソオクタン酸グリセリン）；ショ糖脂肪酸エステル類（例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、およびショ糖パルミチン酸エステル）；またはプロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびモノステアリン酸プロピレングリコール）である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項9】
親油性界面活性剤が、トリオレイン酸ソルビタンである、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項10】
医薬組成物が、トコフェロール（例えば、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロール）；トコフェロール酢酸エステル；およびブチルヒドロキシアニソールからなる群より選択される抗酸化剤Ｂをさらに含む、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項11】
医薬組成物が、α－トコフェロールをさらに含む、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項12】
抗酸化剤Ａが、パルミチン酸アスコルビン酸、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、またはアスコルビン酸である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項13】
抗酸化剤Ａが、アスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸カリウムである、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項14】
賦形剤が、非還元性の糖類（例えば、スクロースおよびトレハロース）または糖アルコール類（例えば、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、およびラクチトール）である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項15】
賦形剤が、スクロースまたはトレハロースである、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【請求項16】
医薬組成物の凍結乾燥製剤を５℃で６ヵ月保存した後の不純物ＵＫ－１．０２の面積百分率の増加量が、５．０％以下である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の組み合わせ医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ワクチンアジュバントとして有用な化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物およびマラリアワクチンの組み合わせ使用、およびマラリア感染を阻止するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
病原体その物を用いるワクチンに比べ、病原体の成分の一部を抗原としたサブユニットワクチンは、化学合成および遺伝子組換えによって製造できることから、当該サブユニットワクチンは、ワクチンの安全性および製造方法の面で優れている。しかしながら、サブユニットワクチンは、病原体その物から製造された生ワクチンまたは不活化ワクチンに比べて免疫賦活活性が低い傾向にある。このことから、エピトープの免疫原性を強化し、ワクチンの免疫賦活活性を向上させるために、ワクチン抗原およびアジュバントを併用する疾患の予防および治療について検討されている。
【0003】
最近、ＴＬＲ７アゴニスト活性を有するアジュバントとして、下記：
で示される（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミド（以下、「化合物Ａ」と称する）が報告されている（特許文献１）。
化合物Ａは、優れたワクチンアジュバント活性を有しているが、実際哺乳動物にワクチンアジュバントとして投与する場合、エマルションなどの製剤処方にすることが求められている。一般的には、エマルション製剤において、製剤の保存安定性を向上するためにアスコルビン酸類などの抗酸化剤を用いることが知られている。しかしながら、アスコルビン酸類などの抗酸化剤が粒度分布を安定化させることは知られていない。
【化1】
化合物Ａは、優れたワクチンアジュバント活性を有しているが、実際哺乳動物にワクチンアジュバントとして投与する場合、エマルションなどの製剤処方にすることが求められている。一般的には、エマルション製剤において、製剤の保存安定性を向上するためにアスコルビン酸類などの抗酸化剤を用いることが知られている。しかしながら、アスコルビン酸類などの抗酸化剤が粒度分布を安定化させることは知られていない。
【0004】
マラリア原虫Plasmodium falciparumのスポロゾイトの表面タンパクであるＰｆＣＳＰは、３９７アミノ酸からなる前赤内期マラリアワクチンの標的抗原として知られている。しかしながら、正しく折り畳まれたタンパクの形成が困難であるため、ＰｆＣＳＰ４／３８で示される全長ＰｆＣＳＰはほとんどの異種発現系における製造には困難な標的であることが示されてきた（非特許文献１～６）。
【0005】
アジュバント、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）によって強化された免疫原性を獲得しているマラリアワクチンが知られている（非特許文献１）。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）は、化合物Ａとは相違する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】ＷＯ２０１７／０６１５３２
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Gordon, D. M. et al., J Infect Dis 1995; 171, 1576-1585
【非特許文献2】Young, J. F. et al., Science 1985; 228, 958-962
【非特許文献3】Noe, A. R. et al., PLoS One 2014; 9, e107764
【非特許文献4】Schwenk, R. et al., PLoS One 2014; 9, e111020
【非特許文献5】Kedees, M. H. et al., Exp Parasitol 2002; 101, 64-68
【非特許文献6】Plassmeyer, M. L. et al., J Biol Chem 2009; 284, 26951-26963
【非特許文献7】Singh, S. K. et al., Microbial cell factories 2018; 17, 55
【非特許文献8】Singh, S. K. et al., Microbial cell factories 2017; 16, 97
【非特許文献9】Theisen, M. et al., Vaccine 2014; 32, 2623-2630
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、保存安定性および免疫賦活活性に優れた、ワクチンアジュバントとして有用な化合物またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物および前赤内期マラリアワクチンの組み合わせ使用、およびこれらの医薬組成物および前赤内期マラリアワクチンを哺乳動物に投与することを含むマラリア感染を阻止するための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
化合物Ａは、分子中にスクワレン様構造に由来する６個の不飽和結合を有している。化合物Ａの製剤検討をする中で、化合物Ａは、油状組成物としてスクワレンを用いる一般的なエマルション製剤の凍結乾燥製剤とした場合に、化合物Ａの分子内の不飽和結合が酸化され、それにより化合物Ａの含量が低下してしまうことが判明した。そこで実用可能な保存安定性を有するワクチンアジュバントの製剤を提供すべく本発明者らは鋭意検討を行った結果、化合物Ａのエマルション組成物を調製する際に油状組成物としてスクワランを用いることにより、化合物Ａの酸化に対する安定性が高まることを見出した。さらに、アスコルビン酸類などの抗酸化剤を添加することにより、保存安定性、特に化合物Ａ自体の酸化に対する安定性だけでなく、粒度分布の安定性にも優れた製剤処方となることを見出した。
【0010】
本発明者らはまた、ＰｆＣＳＰ４／３８で示される、前赤内期マラリアワクチンとして改良されたＰｆＣＳＰがインビボおよびインビトロ解析の両方で確認されたように抗体の立体構造エピトープを保持し、生物活性を示すことを見出した。
【0011】
化合物Ａを含む医薬組成物およびＰｆＣＳＰ４／３８を含むマラリアワクチンの組み合わせ使用が、保存安定性および免疫賦活活性に優れた前赤内期マラリアワクチンとして有用であることが期待される。
【0012】
すなわち、本発明の態様は以下のとおりである。
［項１］ヒトに、医薬上の有効量の医薬組成物Ｉ）およびワクチンＩＩ）の組み合わせを投与することを含む、マラリア感染を阻止するための方法であって、当該医薬組成物Ｉ）が、以下の成分ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミド（以下、「化合物Ａ」と称する）、またはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含み；および
当該ワクチンＩＩ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンである、方法。
［項１］ヒトに、医薬上の有効量の医薬組成物Ｉ）およびワクチンＩＩ）の組み合わせを投与することを含む、マラリア感染を阻止するための方法であって、当該医薬組成物Ｉ）が、以下の成分ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミド（以下、「化合物Ａ」と称する）、またはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含み；および
当該ワクチンＩＩ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンである、方法。
【0013】
［項２］ ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、組み合わせ医薬。
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、組み合わせ医薬。
【0014】
［項３］ ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸等のアスコルビン酸エステル、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム等のアスコルビン酸の無機塩、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、マラリア用ワクチン製剤。
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸等のアスコルビン酸エステル、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム等のアスコルビン酸の無機塩、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、マラリア用ワクチン製剤。
【0015】
［項４］ ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸等のアスコルビン酸エステル、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム等のアスコルビン酸の無機塩、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、キット。
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸等のアスコルビン酸エステル、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム等のアスコルビン酸の無機塩、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、医薬組成物Ｉ）；および
配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンＩＩ）
を含む、キット。
【0016】
［項５］医薬組成物が、水中油型エマルション製剤またはその凍結乾燥製剤である、項１～４のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0017】
［項６］親水性界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、およびポリソルベート８０）；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０）；またはポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類（例えば、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、およびポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコール）である、項１～５のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0018】
［項７］親水性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、またはポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールである、項１～５のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0019】
［項８］親水性界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、またはポリソルベート８０である、項１～５のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0020】
［項９］親油性界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、および中鎖トリグリセリド）；グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン、およびトリイソオクタン酸グリセリン）；ショ糖脂肪酸エステル類（例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、およびショ糖パルミチン酸エステル）；またはプロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびモノステアリン酸プロピレングリコール）である、項１～８のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0021】
［項１０］親油性界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、またはトリオレイン酸ソルビタンである、項１～８のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0022】
［項１１］親油性界面活性剤が、トリオレイン酸ソルビタンである、項１～８のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0023】
［項１２］医薬組成物が、トコフェロール類（例えば、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロール）；トコフェロール酢酸エステル；およびブチルヒドロキシアニソールからなる群より選択される抗酸化剤Ｂをさらに含む、項１～１１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0024】
［項１３］医薬組成物が、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロールからなる群より選択される抗酸化剤Ｂをさらに含む、項１～１１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0025】
［項１４］医薬組成物が、α－トコフェロールである抗酸化剤Ｂをさらに含む、項１～１１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0026】
［項１５］抗酸化剤Ａが、パルミチン酸アスコルビン酸、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、またはアスコルビン酸である、項１～１４のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0027】
［項１６］抗酸化剤Ａが、アスコルビン酸ナトリウムまたはアスコルビン酸カリウムである、項１～１４のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0028】
［項１７］賦形剤が、非還元性の糖類（例えば、スクロースおよびトレハロース）または糖アルコール類（例えば、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、およびラクチトール）である、項１～１６のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0029】
［項１８］賦形剤が、スクロース、トレハロース、ソルビトール、またはキシリトールである、項１～１６のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0030】
［項１９］賦形剤が、スクロースまたはトレハロースである、項１～１６のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0031】
［項２０］医薬組成物中のスクワランの含量が、化合物Ａの重量の５０倍～５００倍である、項１～１９のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0032】
［項２１］医薬組成物中のスクワランの含量が、化合物Ａの重量の１００倍～４００倍である、項１～１９のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0033】
［項２２］医薬組成物中のスクワランの含量が、化合物Ａの重量の２００倍～３００倍である、項１～１９のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0034】
［項２３］医薬組成物中の親水性界面活性剤の含量が、化合物Ａの重量の０．５倍～２５０倍である、項１～２２のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0035】
［項２４］医薬組成物中の親水性界面活性剤の含量が、化合物Ａの重量の５倍～１００倍である、項１～２２のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0036】
［項２５］医薬組成物中の親水性界面活性剤の含量が、化合物Ａの重量の１０倍～５０倍である、項１～２２のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0037】
［項２６］医薬組成物中の親油性界面活性剤の含量が、化合物Ａの重量の０．５倍～２５０倍である、項１～２５のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0038】
［項２７］医薬組成物中の親油性界面活性剤の含量が、化合物Ａの重量の５倍～１００倍である、項１～２５のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0039】
［項２８］医薬組成物中の親油性界面活性剤の含量が、化合物Ａの重量の１０倍～５０倍である、項１～２５のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0040】
［項２９］医薬組成物中の抗酸化剤Ａの含量が、アスコルビン酸ナトリウムの重量に換算して算出すると化合物Ａの重量の０．５倍～５００倍である、項１～２８のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0041】
［項３０］医薬組成物中の抗酸化剤Ａの含量が、アスコルビン酸ナトリウムの重量に換算して算出すると化合物Ａの重量の２．５倍～２５０倍である、項１～２８のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0042】
［項３１］医薬組成物中の抗酸化剤Ａの含量が、アスコルビン酸ナトリウムの重量に換算して算出すると化合物Ａの重量の５倍～１００倍である、項１～２８のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0043】
［項３２］医薬組成物中の賦形剤の含量が、化合物Ａの重量の５０倍～１０００倍である、項１～３１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0044】
［項３３］医薬組成物中の賦形剤の含量が、化合物Ａの重量の１００倍～７５０倍である、項１～３１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0045】
［項３４］医薬組成物中の賦形剤の含量が、化合物Ａの重量の２００倍～６２５倍である、項１～３１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0046】
［項３５］医薬組成物中の抗酸化剤Ｂの含量が、化合物Ａの重量の５倍～２５０倍である、項１２～３４のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0047】
［項３６］医薬組成物中の抗酸化剤Ｂの含量が、化合物Ａの重量の１２．５倍～１２５倍である、項１２～３４のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0048】
［項３７］医薬組成物中の抗酸化剤Ｂの含量が、化合物Ａの重量の２５倍～５０倍である、項１２～３４のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0049】
［項３８］化合物Ａの重量が、化合物Ａを含まない医薬組成物の凍結乾燥物の重量の０．０００１倍～０．６５倍である、項１～３７のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0050】
［項３９］化合物Ａの重量が、化合物Ａを含まない医薬組成物の凍結乾燥物の重量の０．０００２倍～０．３５倍である、項１～３７のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0051】
［項４０］化合物Ａの重量が、化合物Ａを含まない医薬組成物の凍結乾燥物の重量の０．０００５倍～０．０６５倍である、項１～３７のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0052】
［項４１］製造直後の医薬組成物のエマルションおよび凍結乾燥製剤として２５℃で６ヵ月保存後に復水した医薬組成物のエマルションの粒子径Ｄ９０値が、１０００ｎｍ以下である、項５～４０のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0053】
［項４２］医薬組成物の凍結乾燥製剤を５℃で６ヵ月保存した後の不純物ＵＫ－１．０２の面積百分率値の増加量が、５．０％以下である、項５～４１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0054】
［項４３］医薬組成物の凍結乾燥製剤を５℃で６ヵ月保存した後の不純物ＵＫ－１．０２の面積百分率値の増加量が、１．０％以下である、項５～４１のいずれか１項に記載の方法、組み合わせ医薬、ワクチン製剤、またはキット。
【0055】
［項４４］ヒトに、医薬上有効な量の医薬組成物Ｉ）を医薬上有効な量のワクチンＩＩ）と組み合わせて投与することを含む、マラリア感染を阻止するための方法であって、当該医薬組成物Ｉ）は、以下の成分ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えばＬ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含み；および
当該ワクチンＩＩ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンである、方法。
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えばＬ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含み；および
当該ワクチンＩＩ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含むマラリアワクチンである、方法。
【0056】
［項４５］マラリアワクチンと組み合わせてマラリア感染を阻止するのに用いるための医薬組成物であって、当該医薬組成物は、以下の成分ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含み；および
当該マラリアワクチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含む、医薬組成物。
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含み；および
当該マラリアワクチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含む、医薬組成物。
【0057】
［項４６］医薬組成物と組み合わせてマラリア感染を阻止するのに用いるためのマラリアワクチンであって、当該マラリアワクチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原を含み；および
当該医薬組成物は、以下の成分ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、マラリアワクチン。
当該医薬組成物は、以下の成分ｉ）～ｖｉ）：
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、マラリアワクチン。
【発明の効果】
【0058】
本発明によれば、抗原に対する特異的免疫反応をさらに増強することができ、かつ保存安定性の高いワクチンアジュバントとしての医薬組成物および均質かつ生物活性を示すマラリアワクチンを組み合わせることにより、保存安定性および免疫賦活活性に優れた前赤内期マラリアワクチンを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0059】
【図1】図１は、ｍＡｂ １Ｅ８に対して反応性である完全な反復領域（４ ＮＶＤＰ／３８ ＮＡＮＰ）を含むＰｆＣＳＰ４／３８のスキーム図を示す。シグナルペプチド（ＳＰ）の位置、ＮＶＤＰおよびＮＡＮＰタンパクユニットを含む中央反復領域、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを示す。４つのＣ末端システインを線で示し、これらは立体構造ｍＡｂ １Ａ６に反応性である。配列は、Ｎ末端システインとともにＮ末端を省略し、Ｔｙｒ２６で開始し、Ｃ末端のＧＰＩアンカーの前（Ｓｅｒ３８３）で終了する。組換えＰｆＣＳＰ４／３８タンパクはＮ末端にベクターでコードされたアミノ酸残基Ａ－Ｅ－Ｒ－Ｓを、Ｃ末端に短いフレキシブルなリンカー（Ｇ－Ｇ－Ｓ）に次いで６つのヒスチジンタグを含む。
【0060】
【0061】
【0062】
【図4】図４は、抗ＰｆＣＳＰ４／３８抗体が（Ａ、Ｂ）スポロゾイト滑走運動、（Ｃ、Ｄ）トラバーサルおよび（Ｅ、Ｆ）肝細胞浸潤を阻害したことを示す。ＰｆＣＳＰ４／３８特異的抗体（Ａ，ＣおよびＥ）またはｍＡｂ ２Ａ１０（Ｂ，ＤおよびＦ）を含むマウスポリクローナル血清をナイーブマウス血清に対して正規化した。血清中のマウスポリクローナル（ＰｆＣＳＰ４／３８）ＩｇＧの開始濃度はスポロゾイトＥＬＩＳＡによりまず決定し、ＥＬＩＳＡではｍＡｂ２Ａ１０で生成した検量線を用いて、血清特異的光学密度値を４パラメータ曲線フィッティングプログラムで濃度値に変換した。アッセイ特異的ＩＣ５０濃度値は、存在するポリクローナルＰｆＣＳＰ４／３８抗体の決定した開始濃度に基づき、血清の連続希釈物を用いて推定した。ｍＡｂ ２Ａ１０濃度は精製ＩｇＧからのものである。ＩＣ５０は４パラメータモデルおよび最小２乗法を用いてロジスティック回帰により計算し、最適値を決定した。各ｙ値の最小値をゼロに設定し、最大値を１００％に設定した。ｐＡｂ：ポリクローナル抗体。
【発明を実施するための形態】
【0063】
医薬組成物
本発明において、医薬組成物としては、化合物Ａ、スクワラン、アスコルビン酸類の抗酸化剤Ａおよび賦形剤Ａを含むエマルションの凍結乾燥製剤が挙げられる。凍結乾燥前のエマルション製剤および凍結乾燥製剤を復水したエマルション製剤も本発明に含まれる。
本発明の医薬組成物において、活性成分として含有する化合物Ａは、フリー体であっても、その医薬的に許容される酸付加塩または塩基付加塩であってもよい。当該酸付加塩としては、例えば無機酸または有機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、およびマレイン酸など）との酸付加塩が挙げられる。当該塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。また、本発明における化合物Ａまたはその医薬的に許容される塩は、水和物および溶媒和物の形で存在することもあるので、それらの化合物も本発明における化合物Ａまたはその医薬的に許容される塩に含まれる。それらの詳細および製造法については、特許文献１に記載されており、化合物Ａまたはその医薬的に許容される塩は、例えば、特許文献１に記載の方法にしたがって製造することができる。
本発明の医薬組成物において、化合物Ａの含量は、化合物Ａのフリー体の含量として記載している。よって、化合物Ａがその医薬的に許容される塩として用いられる場合の含量は、化合物Ａの重量に塩の重量を加えた重量に換算して算出される。
本発明において、医薬組成物としては、化合物Ａ、スクワラン、アスコルビン酸類の抗酸化剤Ａおよび賦形剤Ａを含むエマルションの凍結乾燥製剤が挙げられる。凍結乾燥前のエマルション製剤および凍結乾燥製剤を復水したエマルション製剤も本発明に含まれる。
本発明の医薬組成物において、活性成分として含有する化合物Ａは、フリー体であっても、その医薬的に許容される酸付加塩または塩基付加塩であってもよい。当該酸付加塩としては、例えば無機酸または有機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、およびマレイン酸など）との酸付加塩が挙げられる。当該塩基付加塩としては、例えばナトリウム塩およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。また、本発明における化合物Ａまたはその医薬的に許容される塩は、水和物および溶媒和物の形で存在することもあるので、それらの化合物も本発明における化合物Ａまたはその医薬的に許容される塩に含まれる。それらの詳細および製造法については、特許文献１に記載されており、化合物Ａまたはその医薬的に許容される塩は、例えば、特許文献１に記載の方法にしたがって製造することができる。
本発明の医薬組成物において、化合物Ａの含量は、化合物Ａのフリー体の含量として記載している。よって、化合物Ａがその医薬的に許容される塩として用いられる場合の含量は、化合物Ａの重量に塩の重量を加えた重量に換算して算出される。
【0064】
本発明において、エマルションまたはエマルション製剤とは、水中油型または油中水型エマルションを意味する。好ましくは、水中油型エマルションである。油状組成物と水性溶液の重量比として、好ましくは、１：９９～１５：８５であり、より好ましくは、２：９８～１０：９０であり、さらに好ましくは、３：９７～９：９１であり、またさらに好ましくは、４：９６～７：９３である。本発明のエマルション製剤において、化合物Ａは、油状組成物中に溶解して存在している。
本発明の凍結乾燥製剤とは、本発明のエマルション製剤における水を凍結乾燥条件下にて除去した製剤を意味する。凍結乾燥製剤の重量に対して２倍～２０倍の重量の注射用水を用いて復水することによって、エマルション製剤とすることができる。
本発明の凍結乾燥製剤とは、本発明のエマルション製剤における水を凍結乾燥条件下にて除去した製剤を意味する。凍結乾燥製剤の重量に対して２倍～２０倍の重量の注射用水を用いて復水することによって、エマルション製剤とすることができる。
【0065】
本発明において、親水性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、およびポリソルベート８０）；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０）；およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類（例えば、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、およびポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコール）が挙げられる。好ましくは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、およびポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコールであり、さらに好ましくは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、およびポリソルベート８０であり、特に好ましくは、ポリソルベート８０である。
本発明の医薬組成物において、親水性界面活性剤の含量は、化合物Ａの重量の０．５倍～２５０倍であり、好ましくは５倍～１００倍であり、より好ましくは１０倍～５０倍である。
本発明の医薬組成物において、親水性界面活性剤の含量は、化合物Ａの重量の０．５倍～２５０倍であり、好ましくは５倍～１００倍であり、より好ましくは１０倍～５０倍である。
【0066】
本発明において、親油性界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、および中鎖トリグリセリド）；グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン、およびトリイソオクタン酸グリセリン）；ショ糖脂肪酸エステル類（例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、およびショ糖パルミチン酸エステル）；およびプロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびモノステアリン酸プロピレングリコール）が挙げられる。好ましくは、ソルビタン脂肪酸エステル、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、およびトリオレイン酸ソルビタンであり、さらに好ましくは、トリオレイン酸ソルビタンである。
本発明の医薬組成物において、親油性界面活性剤の含量は、化合物Ａの重量の０．５倍～２５０倍であり、好ましくは５倍～１００倍であり、より好ましくは１０倍～５０倍である。
本発明の医薬組成物において、親油性界面活性剤の含量は、化合物Ａの重量の０．５倍～２５０倍であり、好ましくは５倍～１００倍であり、より好ましくは１０倍～５０倍である。
【0067】
本発明の医薬組成物において、油状組成物としては、スクワランが用いられる。本発明の医薬組成物の製剤検討において、エマルション製剤の油状組成物として一般的なスクワレンを用いた場合と比べて、スクワランを用いた場合に化合物Ａの酸化に対する安定性が高まることから、本発明の医薬組成物においては油状組成物としてスクワランを用いるのが好ましい。本発明の医薬組成物において、スクワランの含量は、化合物Ａの重量の５０倍～５００倍であり、好ましくは１００倍～４００倍であり、より好ましくは２００倍～３００倍である。
【0068】
本発明において、抗酸化剤Ａとしては、アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）；アスコルビン酸の無機酸塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、およびアスコルビン酸カルシウム）；およびアスコルビン酸が挙げられる。好ましくは、パルミチン酸アスコルビン酸、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、およびアスコルビン酸であり、さらに好ましくは、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カリウムである。
本発明の医薬組成物において、抗酸化剤Ａの含量は、化合物Ａの重量の０．５倍～５００倍であり、好ましくは２．５倍～２５０倍であり、より好ましくは５倍～１００倍であり、ここで、その含量は、アスコルビン酸ナトリウムに換算して、すなわち、抗酸化剤Ａであるアスコルビン酸（アスコルビン酸誘導体）をアスコルビン酸ナトリウムの重量に換算することによって算出される。
本発明の医薬組成物において、抗酸化剤Ａの含量は、化合物Ａの重量の０．５倍～５００倍であり、好ましくは２．５倍～２５０倍であり、より好ましくは５倍～１００倍であり、ここで、その含量は、アスコルビン酸ナトリウムに換算して、すなわち、抗酸化剤Ａであるアスコルビン酸（アスコルビン酸誘導体）をアスコルビン酸ナトリウムの重量に換算することによって算出される。
【0069】
本発明において、賦形剤Ａとしては、非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）が挙げられる。好ましくは、非還元性の糖類（例えば、スクロース、トレハロース）および糖アルコール類（例えば、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、およびラクチトール）であり、さらに好ましくは、スクロース、トレハロース、ソルビトール、およびキシリトールであり、さらにより好ましくは、スクロースおよびトレハロースであり、特に好ましくは、スクロースである。
本発明の医薬組成物において、賦形剤Ａの含量は、化合物Ａの重量の５０倍～１０００倍であり、好ましくは１００倍～７５０倍であり、より好ましくは２００倍～６２５倍である。
本発明の医薬組成物において、賦形剤Ａの含量は、化合物Ａの重量の５０倍～１０００倍であり、好ましくは１００倍～７５０倍であり、より好ましくは２００倍～６２５倍である。
【0070】
本発明において、抗酸化剤Ｂとしては、トコフェロール類（例えば、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロール）；トコフェロール酢酸エステル；およびブチルヒドロキシアニソールが挙げられる。好ましくは、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロールであり、さらに好ましくは、α－トコフェロールである。
本発明の医薬組成物において、抗酸化剤Ｂの含量は、化合物Ａの重量の５倍～２５０倍であり、好ましくは１２．５倍～１２５倍であり、より好ましくは２０倍～５０倍であり、さらに好ましくは２５倍～５０倍である。
本発明の医薬組成物において、抗酸化剤Ｂの含量は、化合物Ａの重量の５倍～２５０倍であり、好ましくは１２．５倍～１２５倍であり、より好ましくは２０倍～５０倍であり、さらに好ましくは２５倍～５０倍である。
【0071】
本発明において、凍結乾燥製剤は、エマルションをバイアルに充填し、凍結乾燥機を用いて通常の製造条件下で凍結乾燥を行うことにより製造することができる。当該製造条件は限定されるものではないが、具体的には、例えば、－４０℃付近で凍結させた後、庫内を真空に減圧し、同時に、庫内の温度を－２０℃に上昇させて、約１０～８０時間乾燥させた上で、庫内の温度を２５℃に上昇させて約１０～３０時間乾燥させる条件が挙げられる。
【0072】
本発明の医薬組成物の一の態様として、
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤Ａ；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、エマルションの凍結乾燥製剤が挙げられる。
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウムおよびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤Ａ；
ｖ）親水性界面活性剤；および
ｖｉ）親油性界面活性剤
を含む、エマルションの凍結乾燥製剤が挙げられる。
【0073】
本発明の医薬組成物の別の態様として、
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、およびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤Ａ；
ｖ）親水性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、およびポリソルベート８０）；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０）；およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類（例えば、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、およびポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコール）；
ｖｉ）親油性界面活性剤、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、および中鎖トリグリセリド）；グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン、およびトリイソオクタン酸グリセリン）；ショ糖脂肪酸エステル類（例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、およびショ糖パルミチン酸エステル）；プロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびモノステアリン酸プロピレングリコール）；および
ｉｉｉ’）トコフェロール類（例えば、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロール）、トコフェロール酢酸エステル、およびブチルヒドロキシアニソールからなる群より選択される抗酸化剤Ｂ
を含む、エマルションの凍結乾燥製剤が挙げられる。
ｉ）（４Ｅ，８Ｅ，１２Ｅ，１６Ｅ，２０Ｅ）－Ｎ－｛２－［｛４－［（２－アミノ－４－｛［（３Ｓ）－１－ヒドロキシヘキサン－３－イル］アミノ｝－６－メチルピリミジン－５－イル）メチル］ベンジル｝（メチル）アミノ］エチル｝－４，８，１２，１７，２１，２５－ヘキサメチルヘキサコサ－４，８，１２，１６，２０，２４－ヘキサンアミドまたはその医薬的に許容される塩；
ｉｉ）スクワラン；
ｉｉｉ）アスコルビン酸エステル類（例えば、Ｌ－アスコルビン酸ステアリン酸エステルおよびパルミチン酸アスコルビン酸）、アスコルビン酸の無機塩（例えば、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸ナトリウム、およびアスコルビン酸カルシウム）、およびアスコルビン酸からなる群より選択される抗酸化剤Ａ；
ｉｖ）非還元性の糖類および糖アルコール類（ただし、マンニトールは除く）からなる群より選択される賦形剤Ａ；
ｖ）親水性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、およびポリソルベート８０）；ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類（例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、およびポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０）；およびポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール類（例えば、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、ポリオキシエチレン（５４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１２４）ポリオキシプロピレン（３９）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール、およびポリオキシエチレン（２００）ポリオキシプロピレン（７０）グリコール）；
ｖｉ）親油性界面活性剤、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、および中鎖トリグリセリド）；グリセリン脂肪酸エステル類（例えば、グリセリン脂肪酸エステル、モノステアリン酸グリセリン、モノミリスチン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン、およびトリイソオクタン酸グリセリン）；ショ糖脂肪酸エステル類（例えば、ショ糖脂肪酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル、およびショ糖パルミチン酸エステル）；プロピレングリコール脂肪酸エステル類（例えば、プロピレングリコール脂肪酸エステルおよびモノステアリン酸プロピレングリコール）；および
ｉｉｉ’）トコフェロール類（例えば、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロール）、トコフェロール酢酸エステル、およびブチルヒドロキシアニソールからなる群より選択される抗酸化剤Ｂ
を含む、エマルションの凍結乾燥製剤が挙げられる。
【0074】
本発明の医薬組成物のまた別の態様として、抗酸化剤としてｉｉｉ’）トコフェロール類（例えば、α－トコフェロール、β－トコフェロール、γ－トコフェロール、およびδ－トコフェロール）を含むが、ｉｉｉ）の抗酸化剤Ａを含まない凍結乾燥製剤が挙げられる。当該トコフェロール類として、好ましくは、α－トコフェロールである。
本発明の医薬組成物において、トコフェロールの含量は、化合物Ａの重量の５倍～２５０倍であり、好ましくは１２．５倍～１２５倍であり、より好ましくは２０倍～５０倍であり、さらにより好ましくは２５倍～５０倍である。
当該医薬組成物において、さらなる抗酸化剤として、チオ硫酸ナトリウムまたはブチルヒドロキシアニソールを含んでいてもよい。
本発明の医薬組成物において、トコフェロールの含量は、化合物Ａの重量の５倍～２５０倍であり、好ましくは１２．５倍～１２５倍であり、より好ましくは２０倍～５０倍であり、さらにより好ましくは２５倍～５０倍である。
当該医薬組成物において、さらなる抗酸化剤として、チオ硫酸ナトリウムまたはブチルヒドロキシアニソールを含んでいてもよい。
【0075】
本発明の医薬組成物において、化合物Ａの重量は、化合物Ａを含まない医薬組成物の凍結乾燥物の重量の０．０００１倍～０．６５倍であり、好ましくは０．０００２～０．３５倍であり、より好ましくは０．０００５倍～０．０６５倍である。
【0076】
本発明の医薬組成物において、油滴の粒子径Ｄ９０値は、製造工程中または製造直後のエマルションの粒子径Ｄ９０値が１０００ｎｍ以下、好ましくは３００ｎｍ以下である。製造直後のエマルションとしては、例えば、製造後３０秒以内のエマルションが挙げられる。凍結乾燥製剤として保存した後に復水した医薬組成物のエマルションの油滴の粒子径Ｄ９０値は、好ましくは、５℃または２５℃で６ヵ月保存後に復水したエマルションの油滴の粒子径Ｄ９０値が１０００ｎｍ以下である。
【0077】
本発明の医薬組成物において、油滴の粒子径Ｄ９０値は、エマルションに含まれる油滴粒子の粒度分布を示す代表値の一つであり、散乱強度基準による９０％粒子径を意味する。一般的には、粒子径Ｄ９０値は、動的光散乱式粒度分布測定装置、レーザー回折式粒度分布測定装置、または画像処理式粒度分布測定装置を用いて測定し、算出される。本発明において、粒子径Ｄ９０値は、動的光散乱式粒度分布測定装置：Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Malvern Instruments）で測定した際の値を意味する。
【0078】
本発明の医薬組成物において、不純物ＵＫ－１．０２は、高速液体クロマトグラフィーを用いた類縁物質の評価において検出される代表的な不純物の一つである。特に、それは、Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌカラム（Ｗａｔｅｒｓ製Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ＸＰ Ｃｏｌｕｍｎ、４．６ｍｍｘ７５ｍｍ、２．５μｍ、型番：１８６００６１３４）を用いて、純水、アセトニトリル、メタノール、およびトリフルオロ酢酸を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法により、化合物Ａとして０．４～２μｇ相当量を注入し、２２０ｎｍの波長で分光学的に測定した際に、化合物Ａの１．０２倍の溶出時間に検出される不純物を意味する。測定条件の詳細については、以下のとおりである。
移動相A:0.1% トリフルオロ酢酸水溶液
移動相B:0.06% トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／メタノール混合溶液(8:2)
送液条件：
移動相A:0.1% トリフルオロ酢酸水溶液
移動相B:0.06% トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／メタノール混合溶液(8:2)
送液条件：
【表1】
【0079】
本発明の医薬組成物の保存安定性としては、本発明の医薬組成物の凍結乾燥製剤を５℃で６ヵ月保存した後の不純物ＵＫ－１．０２の面積百分率値における増加量が、保存開始時の５．０％以下、好ましくは１．０％以下であることを意味する。面積百分率は、実測値で比較している。
【0080】
本発明の医薬組成物は、調製した水中油型エマルションを乳化した後に無菌ろ過フィルターを用いて無菌ろ過を行い、凍結乾燥した状態で保存される。無菌ろ過をする際に、目詰まりを避け効率よくろ過するために、粒子径Ｄ９０値が１０００ｎｍ以下であることが好ましい。
【0081】
本発明の医薬組成物は、復水した後のエマルションの粒子径が変化しない範囲で、他の添加剤をさらに含んでいてもよい。投与時に、本発明の医薬組成物は、復水した後のエマルションの粒子径が変化しない範囲で、ワクチン抗原（本明細書において、「ワクチン」とも称される）を含む製剤と混合して投与してもよい。本発明の医薬組成物および当該ワクチン抗原の混合方法および混合比は限定されるものではないが、例えば、復水したエマルション製剤と、等容量のワクチン抗原を含む製剤を、バイアル中で転倒混和することによって混合することができる。
【0082】
本発明の医薬組成物は、化合物Ａを含む凍結乾燥製剤およびワクチン抗原を含むキットとして提供することができる。
【0083】
本発明の医薬組成物は、投与時に凍結乾燥製剤の重量の２倍～２０倍の注射用水で復水し、さらにワクチン抗原を含む製剤と混合して投与することができる。本発明の医薬組成物の一回当たりの投与量は、化合物Ａの重量として１ｎｇ～２５０ｍｇ、好ましくは１ｎｇ～５０ｍｇである。同時に投与するワクチン抗原の種類または投与される対象の年齢によって異なるが、一回投与であってもよく、一回または複数回、追加投与されてもよい。
【0084】
本発明の医薬組成物の保存安定性は、下記の試験例にしたがって評価した。
【0085】
ワクチン抗原
本明細書におけるワクチン抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原であってもよい。本明細書において用語「実質的に同一」の配列は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するいずれかの配列を意味する。本発明のワクチン抗原の一の態様として、完全長ＰｆＣＳＰ抗原を含むマラリアワクチンが含まれる。別の態様として、ワクチン抗原は、配列番号１で表される配列を有するヒスチジンタグＰｆＣＳＰ４／３８（ここで、Ｎ末端の４アミノ酸残基Ａ－Ｅ－Ｒ－Ｓのいずれかおよび／またはＣ末端の９アミノ酸残基Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｈ－Ｈ－Ｈ－Ｈ－Ｈ－Ｈは適宜修飾、欠失または置換されていてもよく、または少なくとも１つのアミノ酸がこれらの残基に適宜挿入されていてもよい）の抗原を含むワクチンである。また別の態様として、ワクチン抗原は、配列番号２で表される配列を有するＰｆＣＳＰ４／３８（ここで、Ｎ末端の４アミノ酸残基Ａ－Ｅ－Ｒ－Ｓのいずれかおよび／またはＣ末端の３アミノ酸残基Ｇ－Ｇ－Ｓは適宜修飾、欠失または置換されていてもよく、または少なくとも１つのアミノ酸がこれらの残基に適宜挿入されていてもよい）の抗原を含むワクチンである。さらに別の態様として、ワクチン抗原は、ＰｆＣＳＰ２６－３８３に対応する配列番号３で表される配列を有するＰｆＣＳＰ４／３８の抗原を含むワクチンである。
本明細書におけるワクチン抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号３またはそれらと実質的に同一のいずれかの配列で表される配列を含む抗原であってもよい。本明細書において用語「実質的に同一」の配列は、配列番号１、配列番号２または配列番号３で表される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有するいずれかの配列を意味する。本発明のワクチン抗原の一の態様として、完全長ＰｆＣＳＰ抗原を含むマラリアワクチンが含まれる。別の態様として、ワクチン抗原は、配列番号１で表される配列を有するヒスチジンタグＰｆＣＳＰ４／３８（ここで、Ｎ末端の４アミノ酸残基Ａ－Ｅ－Ｒ－Ｓのいずれかおよび／またはＣ末端の９アミノ酸残基Ｇ－Ｇ－Ｓ－Ｈ－Ｈ－Ｈ－Ｈ－Ｈ－Ｈは適宜修飾、欠失または置換されていてもよく、または少なくとも１つのアミノ酸がこれらの残基に適宜挿入されていてもよい）の抗原を含むワクチンである。また別の態様として、ワクチン抗原は、配列番号２で表される配列を有するＰｆＣＳＰ４／３８（ここで、Ｎ末端の４アミノ酸残基Ａ－Ｅ－Ｒ－Ｓのいずれかおよび／またはＣ末端の３アミノ酸残基Ｇ－Ｇ－Ｓは適宜修飾、欠失または置換されていてもよく、または少なくとも１つのアミノ酸がこれらの残基に適宜挿入されていてもよい）の抗原を含むワクチンである。さらに別の態様として、ワクチン抗原は、ＰｆＣＳＰ２６－３８３に対応する配列番号３で表される配列を有するＰｆＣＳＰ４／３８の抗原を含むワクチンである。
【0086】
スケーラブルな乳酸連鎖球菌発現系は、後で精製および解析される、ＰｆＣＳＰ４／３８構築物を発現するのに用いてもよい。ＰｆＣＳＰ４／３８はインビボおよびインビトロ解析の両方で確認されたように抗体の立体構造エピトープを保持し、天然の分子と同様の機能的な免疫原性をもたらしうる（試験例４～７）。
【0087】
組み合わせ医薬／組み合わせ療法
本発明の前赤内期マラリアワクチンは、ワクチン抗原およびアジュバントであるＴＬＲ７アゴニスト活性を有する化合物Ａを含む医薬組成物を組み合わせることにより、ＩｇＧ２（Ｔｈ１）抗体の誘導能が高められ、優れたワクチン活性を示しうる。当該組み合わせ使用は、ワクチン抗原と医薬組成物を同時に投与することまたは所定の時間間隔で別々に投与することを含んでいてもよい。一の態様として、そのような組み合わせの同時使用には、ワクチン抗原および医薬組成物を含む組み合わせ医薬が含まれる。本明細書において、当該組み合わせ医薬はまた、「アジュバント製剤」または「ワクチン製剤」と称してもよい。別の態様として、当該組み合わせ使用には、ワクチン抗原および医薬組成物を含むキットが含まれる。
本発明において、医薬組成物、ワクチン抗原、組み合わせ医薬、およびキットの投与経路は、疾患、対象の状態、および標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該投与経路としては、例えば、非経口投与、具体的には、血管内投与（例えば、静脈内投与）、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、および経皮投与が挙げられる。
本発明において、医薬組成物、ワクチン抗原、および組み合わせ医薬の剤形の例として、注射剤、例えば、プレフィルドシリンジが挙げられる。
本発明において、アジュバント製剤の各投与に要する投与量、投与レジメン、および時間は、対象の年齢および標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該アジュバント製剤は、１回投与または接種してもよく、あるいは、初回投与後に所定の期間でさらに投与してもよい。初回投与から追加投与までの期間は、例えば、２０日から３年、好ましくは３ヵ月から２年、より好ましくは６ヶ月から１年の任意の期間であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の組み合わせ使用における一回当たりの前赤内期マラリアワクチン抗原の投与量は、１μｇ～２００μｇであってもよく、好ましくは１０μｇ～３０μｇであってもよく、より好ましくは１５μｇであってもよいが、これらに限定されるものではない。アジュバント製剤の１回の投与量は、例えば０．５ｍＬである。
本発明の組み合わせ使用における一回当たりの化合物Ａを含む医薬組成物の投与量は、化合物Ａの重量の１ｎｇ～２５０ｍｇであってもよく、好ましくは１ｎｇ～５０ｍｇであってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の前赤内期マラリアワクチンは、ワクチン抗原およびアジュバントであるＴＬＲ７アゴニスト活性を有する化合物Ａを含む医薬組成物を組み合わせることにより、ＩｇＧ２（Ｔｈ１）抗体の誘導能が高められ、優れたワクチン活性を示しうる。当該組み合わせ使用は、ワクチン抗原と医薬組成物を同時に投与することまたは所定の時間間隔で別々に投与することを含んでいてもよい。一の態様として、そのような組み合わせの同時使用には、ワクチン抗原および医薬組成物を含む組み合わせ医薬が含まれる。本明細書において、当該組み合わせ医薬はまた、「アジュバント製剤」または「ワクチン製剤」と称してもよい。別の態様として、当該組み合わせ使用には、ワクチン抗原および医薬組成物を含むキットが含まれる。
本発明において、医薬組成物、ワクチン抗原、組み合わせ医薬、およびキットの投与経路は、疾患、対象の状態、および標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該投与経路としては、例えば、非経口投与、具体的には、血管内投与（例えば、静脈内投与）、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経鼻投与、および経皮投与が挙げられる。
本発明において、医薬組成物、ワクチン抗原、および組み合わせ医薬の剤形の例として、注射剤、例えば、プレフィルドシリンジが挙げられる。
本発明において、アジュバント製剤の各投与に要する投与量、投与レジメン、および時間は、対象の年齢および標的部位などの条件に応じて適宜選択することができる。当該アジュバント製剤は、１回投与または接種してもよく、あるいは、初回投与後に所定の期間でさらに投与してもよい。初回投与から追加投与までの期間は、例えば、２０日から３年、好ましくは３ヵ月から２年、より好ましくは６ヶ月から１年の任意の期間であってもよいが、これらに限定されるものではない。
本発明の組み合わせ使用における一回当たりの前赤内期マラリアワクチン抗原の投与量は、１μｇ～２００μｇであってもよく、好ましくは１０μｇ～３０μｇであってもよく、より好ましくは１５μｇであってもよいが、これらに限定されるものではない。アジュバント製剤の１回の投与量は、例えば０．５ｍＬである。
本発明の組み合わせ使用における一回当たりの化合物Ａを含む医薬組成物の投与量は、化合物Ａの重量の１ｎｇ～２５０ｍｇであってもよく、好ましくは１ｎｇ～５０ｍｇであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【0088】
以下、本発明を実施例、参考例、比較例、および試験例により説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【0089】
本明細書において、スクワランとして「スクワラン（和光純薬製）」、「スクワラン（岸本特殊肝油工業所製）」、または「スクワラン（マルハニチロ製）」を用い；スクワレンとして「スクワレン（和光純薬製）」、「スクワレン（岸本特殊肝油工業所製）」、または「スクワレン（マルハニチロ製）」を用い；アスコルビン酸ナトリウムとして「アスコルビン酸ナトリウム（和光純薬製）」または「Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（協和ファーマケミカル製）」を用い；α－トコフェロールとして「α－トコフェロール（三菱ケミカルフーズ製）」または「オール－ｒａｃ－α－トコフェロール ＥＭＰＲＯＶＥ（登録商標） ESSENTIAL Ph Eur,BP,USP,E 307（メルク製）」を用い；トリオレイン酸ソルビタンとして「Ｓｐａｎ８５（シグマアルドリッチ製）」、「Ｒｈｅｏｄｏｌ ＳＰ－Ｏ３０Ｖ（花王ケミカル製）」、または「Ｓｐａｎ８５（ＣＲＯＤＡ製）」を用い；ポリソルベート８０として「ＰＳ８０（ＧＳ）（日油製）」、「ポリソルベート８０（ＨＸ２）（日油製）」、「Ｔｗｅｅｎ８０（メルク製）」、または「Ｔｗｅｅｎ８０ ＨＰ－ＬＱ－（ＨＭ）（ＣＲＯＤＡ製）」を用い；スクロースとして「スクロース（ナカライテスク製）」または「賦形剤としての使用に適当なスクロース（低エンドトキシン）ＥＭＰＲＯＶＥ（登録商標） exp Ph Eur,BP,JP,NF（メルク製）」を用い；注射用水として「注射用大塚蒸留水（大塚製薬工場製）」を用い；パルミチン酸アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、およびチオ硫酸ナトリウムは、和光純薬製のものを使用した。
【0090】
略語
ＢＣＡ：ビシンコニン酸
ＣＶ：カラム容量
Ｄａ：ダルトン
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法
ＥＰＡ：緑膿菌エキソプロテインＡ
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ｋＤａ：キロダルトン
ＬＤＳ：ドデシル硫酸リチウム
ＭＥＳ：２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＩ：感染多重度
ＭＳ：質量分析法
Ｎｉ－ＮＴＡ：ニッケル－ニトリロ三酢酸
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥ：サイズ排除
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＭＦＡ：標準的膜供給アッセイ
ＢＣＡ：ビシンコニン酸
ＣＶ：カラム容量
Ｄａ：ダルトン
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法
ＥＰＡ：緑膿菌エキソプロテインＡ
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ｋＤａ：キロダルトン
ＬＤＳ：ドデシル硫酸リチウム
ＭＥＳ：２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸
ＭＯＩ：感染多重度
ＭＳ：質量分析法
Ｎｉ－ＮＴＡ：ニッケル－ニトリロ三酢酸
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＥ：サイズ排除
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＭＦＡ：標準的膜供給アッセイ
【0091】
凍結乾燥組成物の調製
実施例１～１６、比較例１～３
表１～４の組成となるように化合物Ａを油性成分に溶解した。油性成分は、以下のとおりである：スクワラン、トリオレイン酸ソルビタン、およびα－トコフェロール（実施例１～９および１５）；スクワランおよびトリオレイン酸ソルビタン（実施例１０～１３）；スクワラン、トリオレイン酸ソルビタン、α－トコフェロール、およびパルミチン酸アスコルビル（実施例１４）；スクワラン、トリオレイン酸ソルビタン、α－トコフェロール、およびブチルヒドロキシアニソール（実施例１６）；スクワレン、トリオレイン酸ソルビタン、およびα－トコフェロール（比較例１～３）。表１～４の組成となるように注射用水に水性成分（実施例１～３、１４、１６におけるスクロースおよびポリソルベート８０；実施例４～１３におけるスクロース、ポリソルベート８０、およびアスコルビン酸ナトリウム；実施例１５におけるスクロース、ポリソルベート８０、およびチオ硫酸ナトリウム）を溶解後、それに上記油性組成物を加えた。混合物を予備混合し、超高圧乳化分散機を用いて乳化分散させた。得られた反応物を０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、凍結乾燥した。各バイアルを常圧にて窒素ガスでパージした後、ゴム栓で密封し、凍結乾燥組成物である実施例１～１６および比較例１～３を得た。
実施例１～１６、比較例１～３
表１～４の組成となるように化合物Ａを油性成分に溶解した。油性成分は、以下のとおりである：スクワラン、トリオレイン酸ソルビタン、およびα－トコフェロール（実施例１～９および１５）；スクワランおよびトリオレイン酸ソルビタン（実施例１０～１３）；スクワラン、トリオレイン酸ソルビタン、α－トコフェロール、およびパルミチン酸アスコルビル（実施例１４）；スクワラン、トリオレイン酸ソルビタン、α－トコフェロール、およびブチルヒドロキシアニソール（実施例１６）；スクワレン、トリオレイン酸ソルビタン、およびα－トコフェロール（比較例１～３）。表１～４の組成となるように注射用水に水性成分（実施例１～３、１４、１６におけるスクロースおよびポリソルベート８０；実施例４～１３におけるスクロース、ポリソルベート８０、およびアスコルビン酸ナトリウム；実施例１５におけるスクロース、ポリソルベート８０、およびチオ硫酸ナトリウム）を溶解後、それに上記油性組成物を加えた。混合物を予備混合し、超高圧乳化分散機を用いて乳化分散させた。得られた反応物を０．２μｍの滅菌フィルターを通してろ過した後、ガラス製バイアルに１ｍＬずつ充填し、凍結乾燥した。各バイアルを常圧にて窒素ガスでパージした後、ゴム栓で密封し、凍結乾燥組成物である実施例１～１６および比較例１～３を得た。
【表2】
【表3】
【表4】
【表5】
【0092】
［試験例１］製造工程中の粒子径の評価
凍結乾燥組成物の製造工程において、乳化後で凍結乾燥前のエマルションに含まれる油滴粒子の粒度分布を、以下の方法にしたがって測定した。
注射用水を用いてエマルションを１０倍に希釈し、動的光散乱式粒子径分布測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ）を用いて、散乱強度基準の９０％粒子径（Ｄ９０）を測定した。実施例１～１６および比較例１～３のＤ９０（ｎｍ）を表５に示す。
凍結乾燥組成物の製造工程において、乳化後で凍結乾燥前のエマルションに含まれる油滴粒子の粒度分布を、以下の方法にしたがって測定した。
注射用水を用いてエマルションを１０倍に希釈し、動的光散乱式粒子径分布測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ）を用いて、散乱強度基準の９０％粒子径（Ｄ９０）を測定した。実施例１～１６および比較例１～３のＤ９０（ｎｍ）を表５に示す。
【表6】
【0093】
［試験例２］安定性評価（１）
以下の方法にしたがって、調製した凍結乾燥組成物について、保存開始時ならびに５℃および２５℃の恒温庫内で６ヶ月保存後の粒度分布を測定した。
実施例１～１６および比較例１～３で調製した凍結乾燥組成物の各バイアルに１ｍＬの注射用水を加えて復水した。次いで、１００μＬの復水後の溶液をマイクロピペットを用いて採取し、９００μＬの注射用水と混合した。次いで、動的光散乱式粒子径分布測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ）を用いて、散乱強度基準の９０％粒子径（Ｄ９０）を測定した。保存前後の実施例１～１６および比較例１～３のＤ９０（ｎｍ）を表６に示す。
試験結果より、抗酸化剤としてアスコルビン酸類を含む実施例４～１４の処方は、５℃および２５℃の恒温庫内で６ヵ月保存後の粒度分布が、保存開始時の値から変化が少なく、粒度分布の安定性が高いことを示した。
以下の方法にしたがって、調製した凍結乾燥組成物について、保存開始時ならびに５℃および２５℃の恒温庫内で６ヶ月保存後の粒度分布を測定した。
実施例１～１６および比較例１～３で調製した凍結乾燥組成物の各バイアルに１ｍＬの注射用水を加えて復水した。次いで、１００μＬの復水後の溶液をマイクロピペットを用いて採取し、９００μＬの注射用水と混合した。次いで、動的光散乱式粒子径分布測定装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ）を用いて、散乱強度基準の９０％粒子径（Ｄ９０）を測定した。保存前後の実施例１～１６および比較例１～３のＤ９０（ｎｍ）を表６に示す。
【表7】
試験結果より、抗酸化剤としてアスコルビン酸類を含む実施例４～１４の処方は、５℃および２５℃の恒温庫内で６ヵ月保存後の粒度分布が、保存開始時の値から変化が少なく、粒度分布の安定性が高いことを示した。
【0094】
［試験例３］安定性評価（２）
以下の方法にしたがって、保存開始時ならびに５℃の恒温庫内で６ヶ月保存後の不純物の量（Ｕｋ－１．０２の面積百分率値）を測定した。Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌカラム（Ｗａｔｅｒｓ製Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ＸＰ Ｃｏｌｕｍｎ、４．６ｍｍｘ７５ｍｍ、２．５μｍ、型番：１８６００６１３４）を用いて、純水、アセトニトリル、メタノール、およびトリフルオロ酢酸を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法により、化合物Ａとして０．４～２μｇ相当量を注入し、２２０ｎｍの波長で分光学的にその量を検出した。測定条件の詳細については、以下のとおりである。
移動相Ａ：0.1% トリフルオロ酢酸水溶液
移動相Ｂ：0.06% トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／メタノール混合溶液(8:2)
送液条件：
本方法で測定したピーク面積および溶出時間を用い、化合物Ａの１．０２倍の溶出時間に検出される不純物ピーク（Ｕｋ－１．０２）の面積百分率値を以下の式により算出した。
Ｕｋ－１．０２の面積百分率値（％）＝Ｕｋ－１．０２のピーク面積／類縁物質および化合物Ａの総ピーク面積ｘ１００
保存前後の実施例１～１６および比較例１～３の不純物ピーク（Ｕｋ－１．０２）の面積百分率値（％）を表７に示す。
試験結果より、抗酸化剤としてアスコルビン酸類を含む実施例４～１４の処方は、５℃の恒温庫内で６ヶ月保存後の不純物の値（Ｕｋ－１．０２の面積百分率値）が低く、保存安定性が高いことを示した。油性成分としてスクワランを含有する実施例１～３の処方および油性成分としてスクワレンを含有する比較例１～３の処方を比較すると、油性成分としてスクワランを含む処方の方が、不純物の値（Ｕｋ－１．０２の面積百分率値）が低いことから、スクワランが化合物Ａの抗酸化安定性に寄与しており、スクワランを含む処方は保存安定性（reservation stability）が高い処方であると言える。
以下の方法にしたがって、保存開始時ならびに５℃の恒温庫内で６ヶ月保存後の不純物の量（Ｕｋ－１．０２の面積百分率値）を測定した。Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌカラム（Ｗａｔｅｒｓ製Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｐｈｅｎｙｌ－Ｈｅｘｙｌ ＸＰ Ｃｏｌｕｍｎ、４．６ｍｍｘ７５ｍｍ、２．５μｍ、型番：１８６００６１３４）を用いて、純水、アセトニトリル、メタノール、およびトリフルオロ酢酸を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法により、化合物Ａとして０．４～２μｇ相当量を注入し、２２０ｎｍの波長で分光学的にその量を検出した。測定条件の詳細については、以下のとおりである。
移動相Ａ：0.1% トリフルオロ酢酸水溶液
移動相Ｂ：0.06% トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／メタノール混合溶液(8:2)
送液条件：
【表8】
本方法で測定したピーク面積および溶出時間を用い、化合物Ａの１．０２倍の溶出時間に検出される不純物ピーク（Ｕｋ－１．０２）の面積百分率値を以下の式により算出した。
Ｕｋ－１．０２の面積百分率値（％）＝Ｕｋ－１．０２のピーク面積／類縁物質および化合物Ａの総ピーク面積ｘ１００
保存前後の実施例１～１６および比較例１～３の不純物ピーク（Ｕｋ－１．０２）の面積百分率値（％）を表７に示す。
【表9】
試験結果より、抗酸化剤としてアスコルビン酸類を含む実施例４～１４の処方は、５℃の恒温庫内で６ヶ月保存後の不純物の値（Ｕｋ－１．０２の面積百分率値）が低く、保存安定性が高いことを示した。油性成分としてスクワランを含有する実施例１～３の処方および油性成分としてスクワレンを含有する比較例１～３の処方を比較すると、油性成分としてスクワランを含む処方の方が、不純物の値（Ｕｋ－１．０２の面積百分率値）が低いことから、スクワランが化合物Ａの抗酸化安定性に寄与しており、スクワランを含む処方は保存安定性（reservation stability）が高い処方であると言える。
【0095】
ワクチン抗原の製造
［実施例１７］ＰｆＣＳＰ４／３８の製造および精製
乳酸連鎖球菌発現構築物（ＰｆＣＳＰ４／３８）
ジスルフィド結合タンパクの異種発現のためによく確立されたホストであるグラム陽性乳酸連鎖球菌（非特許文献７～９）を、４つのシステインおよび完全な３８ ＮＡＮＰおよび４ ＮＶＤＰの繰り返しを含む組換えＰｆＣＳＰ４／３８の製造に用いた。コドンは、（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ドイツ）により合成し、乳酸連鎖球菌におけるタンパク発現のためにｐＳＳ１プラスミドベクターに挿入した、４ ＮＤＶＰおよび３８ ＮＡＮＰリピート（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００１３５１０８６．１）３Ｄ７を含むＰｆＣＳＰ２６－３８３を最適化した。Ｃ末端にて３つのアミノ酸（ＧＧＳ）で分けられた、６つのヒスチジンタグを含む最終構築物は、ＰｆＣＳＰ４／３８と称し、シークエンシングにより確認し、エレクトロポレーション法により乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３に形質転換した（図１、配列番号１）。
［実施例１７］ＰｆＣＳＰ４／３８の製造および精製
乳酸連鎖球菌発現構築物（ＰｆＣＳＰ４／３８）
ジスルフィド結合タンパクの異種発現のためによく確立されたホストであるグラム陽性乳酸連鎖球菌（非特許文献７～９）を、４つのシステインおよび完全な３８ ＮＡＮＰおよび４ ＮＶＤＰの繰り返しを含む組換えＰｆＣＳＰ４／３８の製造に用いた。コドンは、（ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ドイツ）により合成し、乳酸連鎖球菌におけるタンパク発現のためにｐＳＳ１プラスミドベクターに挿入した、４ ＮＤＶＰおよび３８ ＮＡＮＰリピート（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００１３５１０８６．１）３Ｄ７を含むＰｆＣＳＰ２６－３８３を最適化した。Ｃ末端にて３つのアミノ酸（ＧＧＳ）で分けられた、６つのヒスチジンタグを含む最終構築物は、ＰｆＣＳＰ４／３８と称し、シークエンシングにより確認し、エレクトロポレーション法により乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３に形質転換した（図１、配列番号１）。
【0096】
ＰｆＣＳＰ４／３８の発現および精製
乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３におけるＰｆＣＳＰ４／３８タンパクの発現をスクリーニングした。簡潔には、乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３／ＰｆＣＳＰ４／３８構築物を４％グリセロールリン酸、５％グルコースおよび１μｇ／ｍＬエリスロマイシンを補った５ｍＬ ＬＡＢ培地中３０℃にて終夜培養した。培養液の上清を４℃にて３０分間９，０００ｇで遠心分離することにより浄化し、クマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびウェスタン・ブロッティングにより分析した。乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３／ＰｆＣＳＰ４／３８は、穏やかに撹拌しながら（１５０ｒｐｍ）、ｐＨを６．５±０．２に維持し、１Ｌラボスケールのバイオリアクタ（ＢＩＯＦＬＯ３１０、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３０℃にて終夜発酵させた。細胞不含培養ろ液を１０倍に濃縮し、ＱｕｉｘＳｔａｎｄ卓上系（Ｈｏｌｌｏｗファイバーカートリッジ カットオフ３０，０００Ｄａ、表面積６５０ｃｍ２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に緩衝液交換した。緩衝液交換した物質を５ｍＬ Ｎｉ＋２－ ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に適用した。結合タンパクを流速４ｍＬ／分、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中７００ｍＭイミダゾール、段階勾配で溶出した。溶出フラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより純度を分析し、プールし、ポリッシングおよびホスト細胞タンパクを除去するために５ｍＬカチオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）にさらに適用した。ＩＥＣカラムからの結合タンパクをＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）の段階勾配溶出により溶出し、純粋なＰｆＣＳＰ４／３８を含むフラクションをＶＩＶＡスピンカラム １０ｋＤａカットオフ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＵＫ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で濃縮し、－８０℃にて冷凍した。１Ａ６および１Ｅ８でのＳＤＳＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング分析に基づき、フラクションをプールした。
乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３におけるＰｆＣＳＰ４／３８タンパクの発現をスクリーニングした。簡潔には、乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３／ＰｆＣＳＰ４／３８構築物を４％グリセロールリン酸、５％グルコースおよび１μｇ／ｍＬエリスロマイシンを補った５ｍＬ ＬＡＢ培地中３０℃にて終夜培養した。培養液の上清を４℃にて３０分間９，０００ｇで遠心分離することにより浄化し、クマシー染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルおよびウェスタン・ブロッティングにより分析した。乳酸連鎖球菌ＭＧ１３６３／ＰｆＣＳＰ４／３８は、穏やかに撹拌しながら（１５０ｒｐｍ）、ｐＨを６．５±０．２に維持し、１Ｌラボスケールのバイオリアクタ（ＢＩＯＦＬＯ３１０、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３０℃にて終夜発酵させた。細胞不含培養ろ液を１０倍に濃縮し、ＱｕｉｘＳｔａｎｄ卓上系（Ｈｏｌｌｏｗファイバーカートリッジ カットオフ３０，０００Ｄａ、表面積６５０ｃｍ２、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に緩衝液交換した。緩衝液交換した物質を５ｍＬ Ｎｉ＋２－ ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）に適用した。結合タンパクを流速４ｍＬ／分、ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）中７００ｍＭイミダゾール、段階勾配で溶出した。溶出フラクションをＳＤＳ－ＰＡＧＥにより純度を分析し、プールし、ポリッシングおよびホスト細胞タンパクを除去するために５ｍＬカチオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）にさらに適用した。ＩＥＣカラムからの結合タンパクをＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．０（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ）の段階勾配溶出により溶出し、純粋なＰｆＣＳＰ４／３８を含むフラクションをＶＩＶＡスピンカラム １０ｋＤａカットオフ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＵＫ）、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌおよび１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で濃縮し、－８０℃にて冷凍した。１Ａ６および１Ｅ８でのＳＤＳＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング分析に基づき、フラクションをプールした。
【0097】
タンパク質濃度測定
ＢＣＡタンパクアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）によりタンパク質濃度を測定し、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）によりエンドトキシン含量を定量した。
ＢＣＡタンパクアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）によりタンパク質濃度を測定し、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＡＬ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）によりエンドトキシン含量を定量した。
【0098】
［試験例４］ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
サンプルを６Ｘ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）サンプル緩衝液で希釈し、９８℃にて８分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４－１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に最終容量２０μＬ／ウェルにて充填した。ゲルは１５０－２００Ｖにて５０分間、１Ｘ ＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液中にて実行し、クマシーまたはインスタントブルータンパク染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ，英国）のいずれかで染色した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに次いで、タンパクを抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ドイツ）またはモノクローナル抗体１Ａ６および１Ｅ８によるウェスタンブロットのためにニトロセルロース膜上に移した。立体構造（１Ａ６）および非立体構造（１Ｅ８）モノクローナル抗体はＧｅｎｎｏｖａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐｕｎｅ，インド）により製造された完全長ＰｆＣＳＰで免疫付与し、ＰＡＴＨ，米国により本試験に供した。膜は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中１％スキムミルク中、室温にて１時間遮断した。一次抗体はＴＢＳＴ中ｍＡｂ １Ａ６または１Ｅ８（２．０ｍｇ／ｍｌ）１μｇ／ｍｌにて加え、室温１時間でインキュベーションした。膜をＴＢＳＴ（３Ｘ ５分間）で洗浄し、二次抗体はＴＢＳＴ中１：４，０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ複合体（ＤＡＫＯ，デンマーク）として室温１時間でインキュベーションした。膜をＴＢＳＴ（３Ｘ ５分間）で再洗浄し、ＨＲＰキット（ＳＥＲＡ ＣＡＲＥ，米国）を用いて展開させた（図２）。
サンプルを６Ｘ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）サンプル緩衝液で希釈し、９８℃にて８分間加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４－１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に最終容量２０μＬ／ウェルにて充填した。ゲルは１５０－２００Ｖにて５０分間、１Ｘ ＭＯＰＳ ＳＤＳランニング緩衝液中にて実行し、クマシーまたはインスタントブルータンパク染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ，英国）のいずれかで染色した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥに次いで、タンパクを抗Ｈｉｓ－ＨＲＰ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ドイツ）またはモノクローナル抗体１Ａ６および１Ｅ８によるウェスタンブロットのためにニトロセルロース膜上に移した。立体構造（１Ａ６）および非立体構造（１Ｅ８）モノクローナル抗体はＧｅｎｎｏｖａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐｕｎｅ，インド）により製造された完全長ＰｆＣＳＰで免疫付与し、ＰＡＴＨ，米国により本試験に供した。膜は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳＴ）を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中１％スキムミルク中、室温にて１時間遮断した。一次抗体はＴＢＳＴ中ｍＡｂ １Ａ６または１Ｅ８（２．０ｍｇ／ｍｌ）１μｇ／ｍｌにて加え、室温１時間でインキュベーションした。膜をＴＢＳＴ（３Ｘ ５分間）で洗浄し、二次抗体はＴＢＳＴ中１：４，０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ複合体（ＤＡＫＯ，デンマーク）として室温１時間でインキュベーションした。膜をＴＢＳＴ（３Ｘ ５分間）で再洗浄し、ＨＲＰキット（ＳＥＲＡ ＣＡＲＥ，米国）を用いて展開させた（図２）。
【0099】
［試験例５］動物および免疫原性試験ならびに抗体測定
２つのインビボ動物試験をマウスで行った。最初の試験のために、雌６～８週齢ＣＤ－１マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，デンマーク）を、最初の免疫付与前７日間デンマーク、コペンハーゲン大学パナム実験動物施設センターにて飼育した。動物免疫付与に関するすべての手順は欧州および国内規制に準拠した。８匹のマウスの群を、３週間間隔で３回、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に吸着させた１０μｇのＰｆＣＳＰ４／３８で皮下注射により免疫付与した。ワクチン製剤は使用直前に作製した。３回の免疫付与の２週間後（５６日目）に採取した血清を用いて反応を測定した。
ＰｆＣＳＰ４／３８に対する血漿抗体レベルは酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡潔には、マイクロタイタープレートを０．３３μｇ／ｍＬの組換えタンパクでコーティングし、希釈サンプル（１：２００）でインキュベーションした。結合抗体をＨＲＰ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＤＡＫＯ，デンマーク）で検出した（図３）。
免疫原性はまた、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に代えて、アジュバントとして８１１０μｇの実施例６の組成物（１０μｇの化合物Ａに相当）を用いて同様に測定してもよい。
２つのインビボ動物試験をマウスで行った。最初の試験のために、雌６～８週齢ＣＤ－１マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ，デンマーク）を、最初の免疫付与前７日間デンマーク、コペンハーゲン大学パナム実験動物施設センターにて飼育した。動物免疫付与に関するすべての手順は欧州および国内規制に準拠した。８匹のマウスの群を、３週間間隔で３回、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に吸着させた１０μｇのＰｆＣＳＰ４／３８で皮下注射により免疫付与した。ワクチン製剤は使用直前に作製した。３回の免疫付与の２週間後（５６日目）に採取した血清を用いて反応を測定した。
ＰｆＣＳＰ４／３８に対する血漿抗体レベルは酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡潔には、マイクロタイタープレートを０．３３μｇ／ｍＬの組換えタンパクでコーティングし、希釈サンプル（１：２００）でインキュベーションした。結合抗体をＨＲＰ複合ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＤＡＫＯ，デンマーク）で検出した（図３）。
免疫原性はまた、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に代えて、アジュバントとして８１１０μｇの実施例６の組成物（１０μｇの化合物Ａに相当）を用いて同様に測定してもよい。
【0100】
［試験例６］インビトロスポロゾイト滑走運動アッセイ
カバーグラスベース付き平底オプティカルボトム９６ウェルプレートを抗ＰｆＣＳＰモノクローナル抗体（３ＳＰ２，Ｒａｄｂｏｕｄｕｍｃ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎから得た）で４℃にて終夜インキュベーションした。ブロッキング中、２Ａ１０の５倍希釈物またはポリクローナルマウス血清（ＰｆＣＳＰ４／３８抗体含有）をスポロゾイトでプレインキュベーションした後、プレート上に二重に移した。３０００ｒｐｍにて１０分間のスピンの後、スポロゾイトを９０分間３７℃／５％ＣＯ２にてプレート上でインキュベーションした後、滑走運動性を測定した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ５．０３にてプロットした。ウェルごとに得た２５の個別画像から作成した縫合画像上にあるピクセル数はその特定のウェルにあるＰｆＣＳＰ４／３８の量の尺度であり、そのためピクセル数の違いはスポロゾイトの滑走跡表面の違いとして解することができる（図４Ａ～４Ｂ）。
カバーグラスベース付き平底オプティカルボトム９６ウェルプレートを抗ＰｆＣＳＰモノクローナル抗体（３ＳＰ２，Ｒａｄｂｏｕｄｕｍｃ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎから得た）で４℃にて終夜インキュベーションした。ブロッキング中、２Ａ１０の５倍希釈物またはポリクローナルマウス血清（ＰｆＣＳＰ４／３８抗体含有）をスポロゾイトでプレインキュベーションした後、プレート上に二重に移した。３０００ｒｐｍにて１０分間のスピンの後、スポロゾイトを９０分間３７℃／５％ＣＯ２にてプレート上でインキュベーションした後、滑走運動性を測定した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ５．０３にてプロットした。ウェルごとに得た２５の個別画像から作成した縫合画像上にあるピクセル数はその特定のウェルにあるＰｆＣＳＰ４／３８の量の尺度であり、そのためピクセル数の違いはスポロゾイトの滑走跡表面の違いとして解することができる（図４Ａ～４Ｂ）。
【0101】
［試験例７］インビトロスポロゾイトトラバーサルおよびヒトヘパトーマ細胞株の感染性アッセイ
ＨＣ－０４ヒトヘパトーマ細胞株をBiodefense and Emerging Infections Research Resources Repository（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）の一部としてＭＲ４を通じて取得し、培養した。トラバーサルは新たに解剖した熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＮＦ５４スポロゾイトを用いて行った。簡潔には、スポロゾイトをモノクローナル２Ａ１０またはＰｆＣＳＰ４／３８抗体を含むマウスポリクローナル血清で３０分間プレインキュベーションした。スポロゾイト／抗体サンプルを、テトラメチルローダミン（Ｒｈ）標識デキストランとともに、３８４ウェルプレート上に播種したＨＣ－０４細胞に二重に加えた（ウェルあたり１０，０００スポロゾイトおよび１２，５００ＨＣ－０４細胞）。スポロゾイトを５％ＣＯ２中、３７℃にて２時間ＨＣ－０４細胞をトラバースさせた後、ＰＢＳにて洗浄した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２にて蛍光レベルを測定した。データ分析はＧｒａｐｈＰａｄ ｖｅｒｓｉｏｎ５．０３にて行った。トラバーサル阻害をアッセイ対照に対して正規化し、ＩＣ５０は４パラメータモデルおよび最小２乗法を用いてロジスティック回帰により計算し、最適値を決定した（図４Ｃ～４Ｄ）。インビトロ初代ヒト肝細胞浸潤および成熟を少し適応させて行った。凍結保存した初代ヒト肝細胞をＴｅｂｕ－ｂｉｏ（ドナーＨＣ１０－１０）から得、コラーゲンコーティングした９６ウェル透明底ブラックプレート中にて２日間ウェルあたり５０，０００細胞の密度で解凍し、播種した。ウェルあたり５０，０００の新たに解剖したＰｆＮＦ５４スポロゾイトをモノクローナル２Ａ１０またはＰｆＣＳＰ４／３８抗体を含むマウスポリクローナル血清と３０分間混合し、その後、混合物を肝細胞上に移した。クイックスピン（１９００ｇにて１０分間）の後、プレートを５％ＣＯ２中３７℃下に移した。浸潤の３時間後、培地を正常肝細胞培地でリフレッシュした。サンプルは、毎日肝細胞培地でリフレッシュして二重で試験した。スポロゾイト浸潤の４日後、肝細胞を４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定した。ウェルをウサギ抗ＰｆＨＳＰ７０、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識ヤギ抗ウサギＩｇＧおよび４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ（ＢｉｏＴｅｋ）上の自動化ハイコンテントイメージングおよびＦＩＪＩイメージングソフトウェアを用いることにより、肝細胞の総数および陽性染色（感染）肝細胞数を決定した。データ分析をＧｒａｐｈＰａｄ ｖｅｒｓｉｏｎ５．０３にて行った。浸潤阻害はアッセイ対照に対して正規化し、ＩＣ５０は４パラメータモデルおよび最小２乗法を用いてロジスティック回帰により計算し、最適値を決定した（図４Ｅ～４Ｆ）。
ＨＣ－０４ヒトヘパトーマ細胞株をBiodefense and Emerging Infections Research Resources Repository（ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）の一部としてＭＲ４を通じて取得し、培養した。トラバーサルは新たに解剖した熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）ＮＦ５４スポロゾイトを用いて行った。簡潔には、スポロゾイトをモノクローナル２Ａ１０またはＰｆＣＳＰ４／３８抗体を含むマウスポリクローナル血清で３０分間プレインキュベーションした。スポロゾイト／抗体サンプルを、テトラメチルローダミン（Ｒｈ）標識デキストランとともに、３８４ウェルプレート上に播種したＨＣ－０４細胞に二重に加えた（ウェルあたり１０，０００スポロゾイトおよび１２，５００ＨＣ－０４細胞）。スポロゾイトを５％ＣＯ２中、３７℃にて２時間ＨＣ－０４細胞をトラバースさせた後、ＰＢＳにて洗浄した。Ｂｉｏｔｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ２にて蛍光レベルを測定した。データ分析はＧｒａｐｈＰａｄ ｖｅｒｓｉｏｎ５．０３にて行った。トラバーサル阻害をアッセイ対照に対して正規化し、ＩＣ５０は４パラメータモデルおよび最小２乗法を用いてロジスティック回帰により計算し、最適値を決定した（図４Ｃ～４Ｄ）。インビトロ初代ヒト肝細胞浸潤および成熟を少し適応させて行った。凍結保存した初代ヒト肝細胞をＴｅｂｕ－ｂｉｏ（ドナーＨＣ１０－１０）から得、コラーゲンコーティングした９６ウェル透明底ブラックプレート中にて２日間ウェルあたり５０，０００細胞の密度で解凍し、播種した。ウェルあたり５０，０００の新たに解剖したＰｆＮＦ５４スポロゾイトをモノクローナル２Ａ１０またはＰｆＣＳＰ４／３８抗体を含むマウスポリクローナル血清と３０分間混合し、その後、混合物を肝細胞上に移した。クイックスピン（１９００ｇにて１０分間）の後、プレートを５％ＣＯ２中３７℃下に移した。浸潤の３時間後、培地を正常肝細胞培地でリフレッシュした。サンプルは、毎日肝細胞培地でリフレッシュして二重で試験した。スポロゾイト浸潤の４日後、肝細胞を４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで固定した。ウェルをウサギ抗ＰｆＨＳＰ７０、次いでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４標識ヤギ抗ウサギＩｇＧおよび４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。Ｃｙｔａｔｉｏｎ（ＢｉｏＴｅｋ）上の自動化ハイコンテントイメージングおよびＦＩＪＩイメージングソフトウェアを用いることにより、肝細胞の総数および陽性染色（感染）肝細胞数を決定した。データ分析をＧｒａｐｈＰａｄ ｖｅｒｓｉｏｎ５．０３にて行った。浸潤阻害はアッセイ対照に対して正規化し、ＩＣ５０は４パラメータモデルおよび最小２乗法を用いてロジスティック回帰により計算し、最適値を決定した（図４Ｅ～４Ｆ）。
【産業上の利用可能性】
【0102】
化合物Ａ、またはその医薬的に許容される塩を含む医薬組成物は、ワクチンアジュバントとして保存安定性および免疫賦活活性が高く、当該医薬組成物とマラリアワクチンとの組み合わせ使用は、マラリア感染を阻止するのに有用であり得る。
【配列表フリーテキスト】
【0103】
配列番号１
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配列番号２
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配列番号３
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配列番号２
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配列番号３
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【国際調査報告】