ホーム > 特許ランキング > イムノコア リミテッド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-31
(54)【発明の名称】特異的結合分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230724BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230724BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230724BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230724BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20230724BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230724BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230724BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230724BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230724BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230724BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230724BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230724BHJP
A61P 31/06 20060101ALI20230724BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20230724BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230724BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230724BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230724BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230724BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/725 ZNA
C12N15/63 Z
C12N5/10
C07K19/00
C07K16/28
C12P21/08
C12P21/02 C
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
A61K39/395 R
A61K39/395 L
A61P31/06
A61K35/12
A61K47/68
A61K35/17
A61K48/00
A61P37/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023500324
(86)(22)【出願日】2021-07-05
(85)【翻訳文提出日】2023-03-02
(86)【国際出願番号】 EP2021068471
(87)【国際公開番号】W WO2022008418
(87)【国際公開日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】2010329.7
(32)【優先日】2020-07-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510019129
【氏名又は名称】イムノコア リミテッド
【住所又は居所原語表記】９２ Ｐａｒｋ Ｄｒｉｖｅ Ｍｉｌｔｏｎ Ｐａｒｋ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ ＯＸ１４ ４ＲＹ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】レナード サラ
(72)【発明者】
【氏名】パターソン レイチェル
(72)【発明者】
【氏名】デ ソウザ ヴィクトリア アレーナ
(72)【発明者】
【氏名】デンベック マルチン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA98X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA21
4B065BB37
4B065BD15
4B065BD18
4B065CA05
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC31
4C076CC41
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB331
4C085AA14
4C085AA21
4C085BA09
4C085BB23
4C085DD62
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087BC29
4C087CA12
4C087NA13
4C087ZB09
4C087ZB35
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA50
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA29
4H045FA74
4H045GA01
4H045GA15
(57)【要約】
本発明は、結核菌エノイル－ＡＣＰレダクターゼ由来のＨＬＡ－Ｅ制限ペプチドＲＬＰＡＫＡＰＬＬ（配列番号１）に結合する特異的結合分子に関する。上記特異的結合分子は、フレームワーク配列内に包埋されたＣＤＲ配列を含み得る。ＣＤＲ及びフレームワーク配列はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）可変ドメインに対応し得て、天然ＴＣＲ可変ドメインに比較して、非天然突然変異を更に含み得る。本発明の特異的結合分子は、感染性疾患の治療のための新規免疫療法試薬としての使用に特に適している。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＬＡ－Ｅと複合体形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬ（配列番号１）に結合する特性を有する、特異的結合分子。
【請求項2】
ＴＣＲ α鎖可変ドメイン及び／又はＴＣＲ β鎖可変ドメインを含み、これらの各々がＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（式中、ＦＲがフレームワーク領域であり、ＣＤＲが相補性決定領域である）を含む、請求項１に記載の特異的結合分子。
【請求項3】
（ａ）前記α鎖ＣＤＲが以下の配列：ＣＤＲ１－ＤＳＡＩＹＮ、
ＣＤＲ２－ＩＱＳＳＱＲＥ、
ＣＤＲ３－ＣＡＶＴＮＱＡＧＴＡＬＩＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよく、
及び／又は、
（ｂ）前記β鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＭＮＨＥＹ、
ＣＤＲ２－ＳＶＧＡＧＩ、
ＣＤＲ３－ＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＱＦＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよい、
請求項２に記載の特異的結合分子。
【請求項4】
前記α鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：ＦＲ１－配列番号２のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号２のアミノ酸３３～４９、
ＦＲ３－配列番号２のアミノ酸５７～８９、
ＦＲ４－配列番号２のアミノ酸１０３～１１２、
若しくは前記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み、及び／又は、
前記β鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：
ＦＲ１－配列番号３のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号３のアミノ酸３２～４８、
ＦＲ３－配列番号３のアミノ酸５５～９０、
ＦＲ４－配列番号３のアミノ酸１０７～１１５、
若しくは前記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含む、
請求項３に記載の特異的結合分子。
【請求項5】
前記α鎖ＣＤＲ中の突然変異の１つ以上が、配列番号２の番号付けに準拠して、残基２６及び残基２７の間のＰＤＧの挿入、Ｓ２８Ｑ、Ｑ５４Ｋ、Ｎ９４Ｇ、Ｑ９５Ｅ、Ａ９６Ｓ、Ｔ９８Ｖ、Ａ９９Ｙ、Ｌ１００Ｗ、Ｉ１０１Ｖより選択され、及び／又は、
前記β鎖ＣＤＲ中の突然変異の１つ以上が、配列番号３の番号付けに準拠して、Ｎ２８Ｋ、Ｙ３１Ｆ、Ｖ５０Ｌ、Ａ５２Ｖ、Ｇ５３Ｄ、Ｑ１０４Ｌより選択される、
請求項３又は４に記載の特異的結合分子。
【請求項6】
前記α鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、ＣＤＲ１ ＰＤＧＤＱＡＩＹＮ、若しくは、
ＣＤＲ２ ＩＱＳＳＫＲＥ
ＣＤＲ３ ＣＡＶＴＧＥＳＧＶＹＷＶＦ
より選択され、
及び／又は、
前記β鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、
ＣＤＲ１ ＭＫＨＥＦ
ＣＤＲ２ ＳＬＧＶＤＩ
ＣＤＲ３ ＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＬＦＦ
より選択される、請求項３～５のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項7】
前記α鎖中、ＣＤＲ１がＰＤＧＤＱＡＩＹＮであり、ＣＤＲ２がＩＱＳＳＫＲＥであり、ＣＤＲ３がＣＡＶＴＧＥＳＧＶＹＷＶＦであり、前記β鎖中、ＣＤＲ１がＭＫＨＥＦであり、ＣＤＲ２がＳＬＧＶＤＩであり、ＣＤＲ３がＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＬＦＦである、請求項３～６のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項8】
前記α鎖可変ドメインが配列番号６のアミノ酸配列を含み、前記β鎖可変ドメインが配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項9】
（ａ）前記α鎖ＣＤＲが以下の配列：ＣＤＲ１－ＤＲＧＳＱＳ、
ＣＤＲ２－ＩＹＳＮＧＤ、
ＣＤＲ３－ＣＡＶＭＤＳＳＹＫＬＩＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよく、
及び／又は、
（ｂ）前記β鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＳＥＨＮＲ、
ＣＤＲ２－ＦＱＮＥＡＱ、
ＣＤＲ３－ＣＡＳＳＬＡＴＮＥＱＦＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよい、
請求項２に記載の特異的結合分子。
【請求項10】
前記α鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：ＦＲ１－配列番号４のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号４のアミノ酸３３～４９、
ＦＲ３－配列番号４のアミノ酸５６～８８、
ＦＲ４－配列番号４のアミノ酸１０１～１１０、
若しくは前記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み、及び／又は、
前記β鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：
ＦＲ１－配列番号５のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号５のアミノ酸３２～４８、
ＦＲ３－配列番号５のアミノ酸５５～９１、
ＦＲ４－配列番号５のアミノ酸１０４～１１２、
若しくは前記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含む、
請求項９に記載の特異的結合分子。
【請求項11】
前記α鎖ＣＤＲ中の突然変異の１つ以上が、配列番号４の番号付けに準拠して、Ｇ２９Ｒ、Ｑ３１Ｒ、Ｓ９４Ｒ、Ｓ９５Ｅ、Ｋ９７Ｅ、Ｌ９８Ｉ、Ｉ９９Ｓより選択され、及び／又は、
前記β鎖ＣＤＲ中の突然変異の１つ以上が、配列番号５の番号付けに準拠して、Ｅ２８Ｄ、Ｎ５１Ｓ、Ａ９７Ｇ、Ｔ９８Ｐ、Ｆ１０２Ｌより選択される、
請求項９又は１０に記載の特異的結合分子。
【請求項12】
前記α鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、ＣＤＲ１ ＤＲＲＳＲＳ、若しくは、
ＣＤＲ２ ＩＹＳＮＧＤ
ＣＤＲ３ ＣＡＶＭＤＲＥＹＥＩＳＦ
より選択され、
及び／又は、
前記β鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列が、
ＣＤＲ１ ＳＤＨＮＲ
ＣＤＲ２ ＦＱＳＥＡＱ
ＣＤＲ３ ＣＡＳＳＬＧＰＮＥＱＬＦ
より選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項13】
前記α鎖中、ＣＤＲ１がＤＲＲＳＲＳであり、ＣＤＲ２がＩＹＳＮＧＤであり、ＣＤＲ３がＣＡＶＭＤＲＥＹＥＩＳＦであり、前記β鎖中、ＣＤＲ１がＳＤＨＮＲであり、ＣＤＲ２がＦＱＳＥＡＱであり、ＣＤＲ３がＣＡＳＳＬＧＰＮＥＱＬＦである、請求項９～１２のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項14】
前記α鎖可変ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、前記β鎖可変ドメインが、配列番号９のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１及び２並びに請求項９～１３のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項15】
α鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン配列及びβ鎖ＴＲＢＣ１定常ドメイン配列又はＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を有する、α－βヘテロ二量体である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項16】
非天然共有ジスルフィド結合が、前記β鎖の前記定常ドメインの残基に、前記α鎖の前記定常ドメインの残基を連結させる、請求項１５に記載の特異的結合分子。
【請求項17】
タイプ、Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ、Ｖα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβの一本鎖形式であり、Ｖα及びＶβが、それぞれ、ＴＣＲ α及びβ可変領域であり、Ｃα及びＣβが、それぞれ、ＴＣＲ α及びβ定常領域であり、Ｌがリンカー配列である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項18】
前記α鎖可変ドメイン及び抗体の可変ドメインの第１の結合領域を含む、第１のポリペプチド鎖と、前記β鎖可変ドメイン及び前記抗体の可変ドメインの第２の結合領域を含む、第２のポリペプチド鎖と、
を含み、
前記それぞれのポリペプチド鎖が、前記特異的結合分子が、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ（配列番号１）ＨＬＡ－Ｅ複合体及び前記抗体の抗原に同時に結合可能であるように会合する、
請求項１～１４のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項19】
検出可能標識、及び／又は療法剤、及び／又はＰＫ修飾部分と会合している、請求項１～１８のいずれか一項に記載の特異的結合分子。
【請求項20】
抗ＣＤ３抗体が、前記ＴＣＲの前記α鎖又はβ鎖のＣ末端又はＮ末端に共有連結され、ただし、該共有連結はリンカー配列を通じていてもよい、請求項１９に記載の特異的結合分子。
【請求項21】
α鎖可変ドメインが配列番号６及び配列番号７より選択されるアミノ酸配列を含み、β鎖可変ドメインが配列番号８及び配列番号９より選択されるアミノ酸配列を含み、抗ＣＤ３抗体が、配列番号１５～配列番号２７より選択されるリンカー配列を通じて、ＴＣＲ β鎖のＮ末端又はＣ末端に共有連結される、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子。
【請求項22】
配列番号１０若しくは配列番号１３に示されるようなα鎖アミノ酸配列、又は配列番号１０若しくは配列番号１３に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の同一性を有するα鎖アミノ酸配列と、配列番号１１若しくは配列番号１２若しくは配列番号１４に示されるようなβ鎖アミノ酸配列、又は配列番号１１若しくは配列番号１２若しくは配列番号１４に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％の同一性を有するβ鎖アミノ酸配列と、
を含む、請求項２１に記載の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子。
【請求項23】
（ａ）配列番号１０に対応するα鎖アミノ酸配列及び配列番号１１に対応するβ鎖アミノ酸配列、（ｂ）配列番号１０に対応するα鎖アミノ酸配列及び配列番号１２に対応するβ鎖アミノ酸配列、又は、
（ｃ）配列番号１３に対応するα鎖アミノ酸配列及び配列番号１４に対応するβ鎖アミノ酸配列、
を含む、請求項２２に記載の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子。
【請求項24】
請求項１～２３のいずれか一項に記載のＴＣＲ α鎖及び／又はＴＣＲ β鎖をコードする核酸。
【請求項25】
請求項２４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項26】
（ａ）単一オープンリーディングフレーム、若しくは２つの別個のオープンリーディングフレーム中に、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＴＣＲ α及びβ可変鎖をコードする、請求項２５に記載の発現ベクター、又は、（ｂ）請求項１～２３のいずれか一項に記載のＴＣＲの前記α可変鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、及び請求項１～２３のいずれか一項に記載のＴＣＲの前記β可変鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター、
を宿す細胞。
【請求項27】
請求項１～２３のいずれか一項に記載の特異的結合分子を提示する、非天然存在及び／又は精製及び／又は操作細胞、特にＴ細胞。
【請求項28】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の特異的結合分子、又は請求項２１～２３のいずれか一項に記載の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、請求項２４に記載の核酸、請求項２５に記載の発現ベクター、及び／又は請求項２６若しくは２７に記載の細胞を、１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と一緒に含む、医薬組成物。
【請求項29】
好ましくはヒト被験体における、医薬品中で使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の特異的結合分子、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、請求項２４に記載の核酸、請求項２６若しくは２７に記載の細胞、及び／又は請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項30】
好ましくはヒト被験体における、ＴＢを治療する方法において使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の特異的結合分子、又は請求項２１～２３のいずれか一項に記載の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、請求項２４に記載の核酸、請求項２５に記載の発現ベクター、請求項２６若しくは２７に記載の細胞、及び／又は請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項31】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の特異的結合分子、又は請求項２１～２３のいずれか一項に記載の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子を製造する方法であって、ａ）請求項２６又は２７に記載の細胞を、前記特異的結合分子鎖の発現に最適な条件下で維持する工程と、ｂ）前記特異的結合分子鎖を単離する工程とを含む、方法。
【請求項32】
ＴＢを治療する方法であって、治療が必要な被験体に、請求項１～２０のいずれか一項に記載の特異的結合分子又は請求項２１～２３のいずれか一項に記載の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子の療法的有効量を投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）エノイル－ＡＣＰレダクターゼ由来のＨＬＡ－Ｅ制限ペプチドＲＬＰＡＫＡＰＬＬ（配列番号１）に結合する特異的結合分子に関する。上記特異的結合分子は、フレームワーク配列内に包埋されたＣＤＲ配列を含み得る。ＣＤＲ及びフレームワーク配列はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）可変ドメインに対応し得て、天然ＴＣＲ可変ドメインに比較して、非天然突然変異を更に含み得る。本発明の特異的結合分子は、感染性疾患の治療のための新規免疫療法試薬としての使用に特に適している。
【背景技術】
【0002】
結核（ＴＢ）は、世界中で、感染による死亡の主因であり続けている。結核菌（Ｍｔｂ）感染に対する免疫反応は複雑であり、この細菌は、入り組んだ免疫回避機構を発展させてきており、このため、現在の療法で治療するには困難な病原体となっている。したがって、新規療法的介入の喫緊の必要性がある。
【0003】
ＨＬＡ－Ｅは、非古典的ＭＨＣクラス１ｂ分子のファミリーに属し、ＮＫ細胞及びＴ細胞の両方に、限定された数のペプチドを提示することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。恒常性条件下では、ＨＬＡ－Ｅは、免疫監視法として、ＮＫ細胞に他のＨＬＡ分子由来のリーダー配列ペプチドを提示し得て、この場合、リーダー配列提示が欠如していると、ＮＫ細胞によるターゲティング殺細胞が導かれる。しかし、細胞ストレス後、例えば感染中、ＨＬＡ－Ｅはまた、多様な病原体又は自己由来ペプチドも提示し得て、これが次いで、特異的Ｔ細胞によって認識され得る。ＨＬＡ－Ｅによって提示されるペプチドは、ＨＬＡ－Ｅ遺伝子がヒトにおいては実質的に非多型性であり、ヒト集団全体に渡ってこれらの感染をターゲティングし、かつ非常に多型性の古典的ＨＬＡ分子をターゲティングする際に固有の困難を回避する可能性を生じさせるため、療法ターゲットとして、特に魅力的である。
【0004】
ＨＬＡ－Ｅによって提示される、ペプチドＲＬＰＡＫＡＰＬＬを含むＭｔｂ由来ペプチドをターゲティングするＣＤ８＋ Ｔ細胞が記載されてきており、これらはＭｔｂ又はウシ結核菌（Mycobacterium bovis）感染マクロファージに対する細胞溶解活性を示してきている（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Braud et al., Eur J Immunol 27, 1164-1169 (1997)
【非特許文献2】Sullivan et al., Tissue antigens 72, 415-424 (2008)
【非特許文献3】Caccamo et al., Eur J Immunol 45, 1069-1081 (2015)
【非特許文献4】Joosten et al., PLoS Pathog 6, e1000782 (2010)
【非特許文献5】Prezzemolo et al., Eur J Immunol 48, 293-305 (2018)
【非特許文献6】van Meijgaarden et al., PLoS Pathog 11, e1004671 (2015)
【発明の概要】
【0006】
第１の態様において、本発明は、ＨＬＡ－Ｅと複合体形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬ（配列番号１）に結合する特性を有する、特異的結合分子を提供する。
【0007】
本発明者らは、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅが、慢性疾患に取り組むための、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づく免疫療法介入の理想的なターゲットを提供することを見出した。本発明は、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合する、ＴＣＲ ＣＤＲ及びフレームワーク領域を含む特異的結合分子を、初めて提供する。上記特異的結合分子は、ＴＢの治療に特に望ましい療法特性を有する。
【0008】
ペプチドＲＬＰＡＫＡＰＬＬは、ｉｎｈＡ遺伝子（順序付け遺伝子座名（ordered locus name）、Ｒｖ１４８４、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ９ＷＧＲ１）によってコードされるＭｔｂタンパク質ＮＡＤＨ依存性エノイル－［アシルキャリアータンパク質］レダクターゼ［ＮＡＤＨ］のアミノ酸５３～６１に対応する。このペプチドと複合体形成するＨＬＡ－Ｅ分子は、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１又はＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３であり得る。
【0009】
本発明の特異的結合分子は、ＴＣＲ α鎖可変ドメイン及び／又はＴＣＲ β鎖可変ドメインを含み得て、これらの各々がＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を含み、式中、ＦＲがフレームワーク領域であり、ＣＤＲが相補性決定領域である。
【0010】
特異的結合分子又はその結合断片には、天然ＴＣＲ由来のものに対応し得るＴＣＲ可変ドメインが含まれ得て、又はより好ましくは、ＴＣＲ可変ドメインは操作され得る。天然ＴＣＲ可変ドメインはまた、野生型、天然、親、非突然変異又は足場（scaffold）ドメインとも称され得る。特異的結合分子又は結合断片を使用して、理想的な療法特性、例えばターゲットに対する超生理学的親和性、長い結合半減期、ターゲットに対する高い特異性及び優れた安定性を持つ分子を産生し得る。本発明にはまた、特異的結合分子又はその結合断片及びＴ細胞再指示（redirecting）部分を取り込む、二重特異性、又は二官能性、又は融合分子も含まれる。こうした分子は、Ｔ細胞に再指示し、Ｔ細胞を活性化することによって、ＴＢ感染細胞に対する強力で特異的な反応を仲介し得る。さらに、超生理学的親和性を持つ特異的結合分子の使用は、低レベルのペプチド－ＨＬＡを提示する細菌感染細胞の認識及びクリアランスを容易にする。あるいは、特異的結合分子又は結合断片は、他の療法剤、及び／又は診断剤に融合され得て、及び／又は養子療法のために操作Ｔ細胞中に取り込まれ得る。
【0011】
ＴＣＲドメイン配列は、ＴＣＲ分野の当業者に広く知られ、アクセス可能である、ＩＭＧＴ命名法に準拠して定義され得る。例えば、LeFranc and LeFranc, (2001). "T cell Receptor Factsbook", Academic Press、Lefranc, (2011), Cold Spring Harb Protoc 2011(6): 595-603、Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10O、及びLefranc, (2003), Leukemia 17(1): 260-266を参照されたい。簡潔には、αβ ＴＣＲは、２つのジスルフィド連結鎖からなる。各鎖（α及びβ）は、一般的に、２つのドメイン、即ち可変ドメイン及び定常ドメインを有すると見なされる。短い連結領域が可変ドメイン及び定常ドメインを連結し、典型的にはこれはα可変領域の一部と見なされる。さらに、β鎖は、通常、連結領域の隣に短い多様性領域を含有し、これはまた、典型的にはβ可変領域の一部と見なされる。各鎖の可変ドメインはＮ末端に位置し、フレームワーク配列（ＦＲ）中に埋め込まれた３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＣＤＲは、ペプチド－ＭＨＣ結合のための認識部位を含む。α鎖可変（Ｖα）領域をコードする幾つかの遺伝子及びβ鎖可変（Ｖβ）領域をコードする幾つかの遺伝子があり、これらはそのフレームワーク、ＣＤＲ１配列及びＣＤＲ２配列によって、かつ部分的に定義されるＣＤＲ３配列によって区別される。Ｖα遺伝子及びＶβ遺伝子は、ＩＭＧＴ命名法において、それぞれ、接頭辞ＴＲＡＶ及びＴＲＢＶによって称される（Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54、Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96、LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press）。同様に、α鎖及びβ鎖に関して、それぞれ、ＴＲＡＪ又はＴＲＢＪと称される幾つかの連結又はＪ遺伝子があり、β鎖に関してはＴＲＢＤと称される多様性又はＤ遺伝子がある（Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 107-114、Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 97-106、LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press）。Ｔ細胞受容体鎖の大きな多様性は、多様なＶ遺伝子、Ｊ遺伝子及びＤ遺伝子間で組み合わせ再配置から生じ、これらにはアレル変異体、及び連結多様性が含まれる（Arstila, et al., (1999), Science 286(5441): 958-961、Robins et al., (2009), Blood 114(19): 4099-4107.）。ＴＣＲ α鎖及びβ鎖の定常又はＣ領域は、それぞれ、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣと称される（Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10）。
【0012】
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合分子」は、標的抗原に結合可能な分子を指す。こうした分子は、本明細書に論じられるような幾つかの異なる形式を採用し得る。さらに、本発明の特異的結合分子の断片もまた想定される。断片は、標的抗原への結合を保持する、特異的結合分子の部分を指す。
【0013】
用語「突然変異」は、置換、挿入及び欠失を含む。天然（親、自然、非突然変異、野生型、又は足場とも称される）特異的結合分子に対する突然変異は、有益な療法特性、例えば高親和性、高特異性及び高強度を与え得て、例えば突然変異には、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対する特異的結合分子の結合親和性（ｋＤ）及び／又は結合半減期（Ｔ １／２）を増加させるものが含まれ得る。
【0014】
本発明は、ＨＬＡ－Ｅと複合体を形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬ（配列番号１）に結合する特性を有し、かつＴＣＲ α鎖可変ドメイン及び／又はＴＣＲ β鎖可変ドメインを含み、可変ドメイン各々がＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（式中、ＦＲはフレームワーク領域であり、ＣＤＲは相補性決定領域である）を含む、第１の特異的結合分子であって、
（ａ）α鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＤＳＡＩＹＮ、
ＣＤＲ２－ＩＱＳＳＱＲＥ、
ＣＤＲ３－ＣＡＶＴＮＱＡＧＴＡＬＩＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよく、
及び／又は、
（ｂ）β鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＭＮＨＥＹ、
ＣＤＲ２－ＳＶＧＡＧＩ、
ＣＤＲ３－ＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＱＦＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよい、
第１の特異的結合分子を提供する。
（ａ）α鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＤＳＡＩＹＮ、
ＣＤＲ２－ＩＱＳＳＱＲＥ、
ＣＤＲ３－ＣＡＶＴＮＱＡＧＴＡＬＩＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよく、
及び／又は、
（ｂ）β鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＭＮＨＥＹ、
ＣＤＲ２－ＳＶＧＡＧＩ、
ＣＤＲ３－ＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＱＦＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよい、
第１の特異的結合分子を提供する。
【0015】
第１の特異的結合分子において、α鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下のフレームワーク配列：
ＦＲ１－配列番号２のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号２のアミノ酸３３～４９、
ＦＲ３－配列番号２のアミノ酸５７～８９、
ＦＲ４－配列番号２のアミノ酸１０３～１１２、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得て、及び／又は、
β鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：
ＦＲ１－配列番号３のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号３のアミノ酸３２～４８、
ＦＲ３－配列番号３のアミノ酸５５～９０、
ＦＲ４－配列番号３のアミノ酸１０７～１１５、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得る。
ＦＲ１－配列番号２のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号２のアミノ酸３３～４９、
ＦＲ３－配列番号２のアミノ酸５７～８９、
ＦＲ４－配列番号２のアミノ酸１０３～１１２、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得て、及び／又は、
β鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：
ＦＲ１－配列番号３のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号３のアミノ酸３２～４８、
ＦＲ３－配列番号３のアミノ酸５５～９０、
ＦＲ４－配列番号３のアミノ酸１０７～１１５、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得る。
【0016】
第１の特異的結合分子において、α鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＴＲＡＶ２１＊０１鎖に対応するアミノ酸配列を含み得て、及び／又はβ鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＴＲＢＶ６－５＊０１鎖のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。
【0017】
ＦＲ４領域は、α可変鎖及びβ可変鎖の連結領域（それぞれ、ＴＲＡＪ及びＴＲＢＪ）を含み得る。ＴＲＡＪ領域は、ＴＲＡＪ１５＊０１のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。ＴＲＢＪ領域は、ＴＲＢＪ２－１＊０１のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。
【0018】
第１の特異的結合分子において、ＴＣＲ α鎖可変領域中には少なくとも１つの突然変異があり得る。α鎖ＣＤＲ中には（即ち３つのＣＤＲ全てに渡って総数で）、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０又はそれより多い突然変異があり得る。例えば、α鎖ＣＤＲ中には１０の突然変異があり得る。上記突然変異の１つ以上は、配列番号２の番号付けに準拠して、以下の突然変異から選択され得る：
残基２６及び残基２７の間のＰＤＧの挿入、Ｓ２８Ｑ、Ｑ５４Ｋ、Ｎ９４Ｇ、Ｑ９５Ｅ、Ａ９６Ｓ、Ｔ９８Ｖ、Ａ９９Ｙ、Ｌ１００Ｗ、Ｉ１０１Ｖ。
残基２６及び残基２７の間のＰＤＧの挿入、Ｓ２８Ｑ、Ｑ５４Ｋ、Ｎ９４Ｇ、Ｑ９５Ｅ、Ａ９６Ｓ、Ｔ９８Ｖ、Ａ９９Ｙ、Ｌ１００Ｗ、Ｉ１０１Ｖ。
【0019】
したがって、任意選択で他の突然変異と組み合わせて、これらの突然変異のいずれか又は全てがあり得る。
【0020】
α鎖ＣＤＲ１は、配列ＰＤＧＤＱＡＩＹＮを含み得て、α鎖ＣＤＲ２は、配列ＩＱＳＳＫＲＥを含み得て、及び／又はα鎖ＣＤＲ３は、配列ＣＡＶＴＧＥＳＧＶＹＷＶＦを含み得る。
【0021】
好ましいα鎖において、ＣＤＲ１はＰＤＧＤＱＡＩＹＮであり、ＣＤＲ２はＩＱＳＳＫＲＥであり、ＣＤＲ３はＣＡＶＴＧＥＳＧＶＹＷＶＦである。
【0022】
突然変異α鎖は、任意のβ鎖と対形成し得る。
【0023】
第１の特異的結合分子において、ＴＣＲ β鎖可変領域中には少なくとも１つの突然変異があり得る。β鎖ＣＤＲ中には（即ち３つのＣＤＲ全てに渡って総数で）、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれより多い突然変異があり得る。例えば、β鎖ＣＤＲ中には６つの突然変異があり得る。上記突然変異の１つ以上は、配列番号３の番号付けに準拠して、以下の突然変異から選択され得る：
Ｎ２８Ｋ、Ｙ３１Ｆ、Ｖ５０Ｌ、Ａ５２Ｖ、Ｇ５３Ｄ、Ｑ１０４Ｌ。
Ｎ２８Ｋ、Ｙ３１Ｆ、Ｖ５０Ｌ、Ａ５２Ｖ、Ｇ５３Ｄ、Ｑ１０４Ｌ。
【0024】
β鎖ＣＤＲ１は、配列ＭＫＨＥＦを含み得て、β鎖ＣＤＲ２は、配列ＳＬＧＶＤＩを含み得て、及び／又はβ鎖ＣＤＲ３は、配列ＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＬＦＦを含み得る。
【0025】
好ましいβ鎖において、ＣＤＲ１はＭＫＨＥＦであり、ＣＤＲ２はＳＬＧＶＤＩであり、ＣＤＲ３はＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＬＦＦである。
【0026】
突然変異β鎖は、任意のα鎖と対形成し得る。
【0027】
好ましいＴＣＲ可変領域において、α鎖ＣＤＲ１はＰＤＧＤＱＡＩＹＮであり、ＣＤＲ２はＩＱＳＳＫＲＥであり、ＣＤＲ３はＣＡＶＴＧＥＳＧＶＹＷＶＦであり、β鎖ＣＤＲ１はＭＫＨＥＦであり、ＣＤＲ２はＳＬＧＶＤＩであり、ＣＤＲ３はＣＡＳＳＹＳＩＲＧＳＲＧＥＬＦＦである。
【0028】
あるいは、本発明は、ＨＬＡ－Ｅと複合体を形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬ（配列番号１）に結合する特性を有し、かつＴＣＲ α鎖可変ドメイン及び／又はＴＣＲ β鎖可変ドメインを含み、可変ドメイン各々がＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（式中、ＦＲはフレームワーク領域であり、ＣＤＲは相補性決定領域である）を含む、第２の特異的結合分子であって、
（ａ）α鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＤＲＧＳＱＳ、
ＣＤＲ２－ＩＹＳＮＧＤ、
ＣＤＲ３－ＣＡＶＭＤＳＳＹＫＬＩＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよく、
及び／又は、
（ｂ）β鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＳＥＨＮＲ、
ＣＤＲ２－ＦＱＮＥＡＱ、
ＣＤＲ３－ＣＡＳＳＬＡＴＮＥＱＦＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよい、
第２の特異的結合分子を提供する。
（ａ）α鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＤＲＧＳＱＳ、
ＣＤＲ２－ＩＹＳＮＧＤ、
ＣＤＲ３－ＣＡＶＭＤＳＳＹＫＬＩＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよく、
及び／又は、
（ｂ）β鎖ＣＤＲが以下の配列：
ＣＤＲ１－ＳＥＨＮＲ、
ＣＤＲ２－ＦＱＮＥＡＱ、
ＣＤＲ３－ＣＡＳＳＬＡＴＮＥＱＦＦ、
を含み、ただし、それらの中に１つ以上の突然変異が存在していてもよい、
第２の特異的結合分子を提供する。
【0029】
第２の特異的結合分子において、α鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下のフレームワーク配列：
ＦＲ１－配列番号４のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号４のアミノ酸３３～４９、
ＦＲ３－配列番号４のアミノ酸５６～８８、
ＦＲ４－配列番号４のアミノ酸１０１～１１０、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得て、及び／又は、
β鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：
ＦＲ１－配列番号５のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号５のアミノ酸３２～４８、
ＦＲ３－配列番号５のアミノ酸５５～９１、
ＦＲ４－配列番号５のアミノ酸１０４～１１２、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得る。
ＦＲ１－配列番号４のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号４のアミノ酸３３～４９、
ＦＲ３－配列番号４のアミノ酸５６～８８、
ＦＲ４－配列番号４のアミノ酸１０１～１１０、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得て、及び／又は、
β鎖可変ドメインフレームワーク領域が、以下の配列：
ＦＲ１－配列番号５のアミノ酸１～２６、
ＦＲ２－配列番号５のアミノ酸３２～４８、
ＦＲ３－配列番号５のアミノ酸５５～９１、
ＦＲ４－配列番号５のアミノ酸１０４～１１２、
又は上記配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するそれぞれの配列を含み得る。
【0030】
第２の特異的結合分子において、α鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＴＲＡＶ１２－２＊０２鎖に対応するアミノ酸配列を含み得て、及び／又はβ鎖フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３は、ＴＲＢＶ７－９＊０１鎖のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。
【0031】
ＦＲ４領域は、α可変鎖及びβ可変鎖の連結領域（それぞれ、ＴＲＡＪ及びＴＲＢＪ）を含み得る。ＴＲＡＪ領域は、ＴＲＡＪ１２＊０１のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。ＴＲＢＪ領域は、ＴＲＢＪ２－１＊０１のものに対応するアミノ酸配列を含み得る。
【0032】
第２の特異的結合分子において、ＴＣＲ α鎖可変領域中には少なくとも１つの突然変異があり得る。α鎖ＣＤＲ中には（即ち３つのＣＤＲ全てに渡って総数で）、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又はそれより多い突然変異があり得る。例えば、α鎖ＣＤＲ中には７つの突然変異があり得る。上記突然変異の１つ以上は、配列番号４の番号付けに準拠して、以下の突然変異から選択され得る：
Ｇ２９Ｒ、Ｑ３１Ｒ、Ｓ９４Ｒ、Ｓ９５Ｅ、Ｋ９７Ｅ、Ｌ９８Ｉ、Ｉ９９Ｓ。
Ｇ２９Ｒ、Ｑ３１Ｒ、Ｓ９４Ｒ、Ｓ９５Ｅ、Ｋ９７Ｅ、Ｌ９８Ｉ、Ｉ９９Ｓ。
【0033】
したがって、任意選択で他の突然変異と組み合わせて、上記表中の突然変異のいずれか又は全てがあり得る。
【0034】
α鎖ＣＤＲ１は、配列ＤＲＲ<b>ＳＲ<b>Ｓ（上付き<b>は太字を表す；以下同様。）を含み得て、α鎖ＣＤＲ２は、配列ＩＹＳＮＧＤを含み得て、及び／又はα鎖ＣＤＲ３は、配列ＣＡＶＭＤＲ<b>Ｅ<b>ＹＥ<b>Ｉ<b>Ｓ<b>Ｆを含み得る。
【0035】
好ましいα鎖において、ＣＤＲ１はＤＲＲ<b>ＳＲ<b>Ｓであり、ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤであり、ＣＤＲ３はＣＡＶＭＤＲ<b>Ｅ<b>ＹＥ<b>Ｉ<b>Ｓ<b>Ｆである。
【0036】
突然変異α鎖は、任意のβ鎖と対形成し得る。
【0037】
第２の特異的結合分子において、ＴＣＲ β鎖可変領域中には少なくとも１つの突然変異があり得る。β鎖ＣＤＲ中には（即ち３つのＣＤＲ全てに渡って総数で）、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれより多い突然変異があり得る。例えば、β鎖ＣＤＲ中には５つの突然変異があり得る。上記突然変異の１つ以上は、配列番号５の番号付けに準拠して、以下の突然変異から選択され得る：
Ｅ２８Ｄ、Ｎ５１Ｓ、Ａ９７Ｇ、Ｔ９８Ｐ、Ｆ１０２Ｌ。
Ｅ２８Ｄ、Ｎ５１Ｓ、Ａ９７Ｇ、Ｔ９８Ｐ、Ｆ１０２Ｌ。
【0038】
β鎖ＣＤＲ１は、配列ＳＤＨＮＲを含み得て、β鎖ＣＤＲ２は、配列ＦＱＳＥＡＱを含み得て、及び／又はβ鎖ＣＤＲ３は、配列ＣＡＳＳＬＧＰＮＥＱＬＦを含み得る。
【0039】
好ましいβ鎖において、ＣＤＲ１はＳＤＨＮＲであり、ＣＤＲ２はＦＱＳＥＡＱであり、ＣＤＲ３はＣＡＳＳＬＧＰＮＥＱＬＦである。
【0040】
突然変異β鎖は、任意のα鎖と対形成し得る。
【0041】
好ましいＴＣＲ可変領域において、α鎖ＣＤＲ１はＤＲＲ<b>ＳＲ<b>Ｓであり、ＣＤＲ２はＩＹＳＮＧＤであり、ＣＤＲ３はＣＡＶＭＤＲ<b>Ｅ<b>ＹＥ<b>Ｉ<b>Ｓ<b>Ｆであり、β鎖ＣＤＲ１はＳＤＨＮＲであり、ＣＤＲ２はＦＱＳＥＡＱであり、ＣＤＲ３はＣＡＳＳＬＧＰＮＥＱＬＦである。
【0042】
ＣＤＲ内の突然変異（複数の場合もある）は、好ましくは、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対する特異的結合分子の結合親和性又は特異性を改善するが、単離型での安定性改善又は免疫エフェクターに融合された際の強度改善等の他の利点を更に又は別に与え得る。１つ以上の位での突然変異は、例えば相互作用のためにより好ましい角度を提供することによって、同族（cognate）ｐＭＨＣ複合体と隣接位との相互作用に更に又は別に影響を及ぼし得る。突然変異には、非特異的結合の減少、即ちＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅに比較して、別の抗原に対する結合の減少を生じるものが含まれ得る。突然変異には、フォールディング効率及び／又は安定性及び／又は製造可能性を増加させるものが含まれ得る。幾つかの突然変異は、これらの特性の各々に寄与し得て、例えば、他のものは、親和性に寄与し得るが、特異性には寄与し得ず、又は特異性に寄与し得るが、親和性に寄与し得ない。
【0043】
典型的には、標的抗原に対するｐＭ親和性を持つ特異的結合分子を得るには、総数少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５又はそれより多いＣＤＲ突然変異が必要である。標的抗原に対するｐＭ親和性を持つ特異的結合分子を得るには、総数少なくとも５つ、少なくとも１０、又は少なくとも１５のＣＤＲ突然変異が必要であり得る。標的抗原に対するｐＭ親和性を持つ特異的結合分子は、特に、可溶性療法剤として適している。養子療法適用における使用のための特異的結合分子は、標的抗原に対するより低い親和性を有し得て、したがってより少ないＣＤＲ突然変異を有し得て、例えば総数最大１つ、最大２つ、最大５つ又はそれより多いＣＤＲ突然変異を有し得る。幾つかの場合、天然（非突然変異とも称される）特異的結合分子は、突然変異の必要を伴わず、標的抗原に対して十分に高い親和性を有し得る。その天然型にある本発明の特異的結合分子は、好適に、高い親和性及び特異性を有することが注目されてきている。いかなる特定の理論に束縛されることも望ましくないが、本発明者らは、このより高い親和性は、ペプチドＲＬＰＡＫＡＰＬＬが、細菌、即ち非自己供給源に由来するという事実のためであり得ると見なしている。
【0044】
突然変異は、更に又は別に、ＣＤＲの外部のフレームワーク領域内で作製されてもよく、こうした突然変異は、改善された療法特性を生じ得て、例えば結合、及び／又は特異性、及び／又は安定性、及び／又は特異的結合分子の精製可溶性型の収量を改善し得る。例えば、本発明の特異的結合分子は、更に又は別に、所定のＴＲＡＶ鎖及びＴＲＢＶ鎖に関するカノニカルなフレームワーク配列に対して、両方の鎖の一方のＦＲ１のＮ末端に１つ以上の突然変異を含み得る。こうした突然変異は、Ｎ末端メチオニン切断の効率を改善し得る。Ｎ末端開始メチオニンの除去は、しばしば、タンパク質の機能及び安定性のために非常に重要である。不十分な切断は、不均一なタンパク質産物を生じ得て、及び／又は開始メチオニンの存在はヒトにおいて免疫原性であり得るため、療法剤には有害であり得る。幾つかの場合、開始メチオニンは、本発明の特異的結合分子中に存在し得る。
【0045】
本発明の第１の特異的結合分子のα鎖可変ドメインは、配列番号２のフレームワークアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５７～８９、１０３～１１２に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する、それぞれのフレームワークアミノ酸配列を含み得る。本発明の特異的結合分子のβ鎖可変ドメインは、配列番号３のフレームワークアミノ酸残基１～２６、３２～４８、５５～９０、１０７～１１５に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する、それぞれのフレームワークアミノ酸配列を含み得る。あるいは、言及される同一性パーセントは、全体として考慮された際に、フレームワーク配列に渡るものであり得る。
【0046】
本発明の第２の特異的結合分子のα鎖可変ドメインは、配列番号４のフレームワークアミノ酸残基１～２６、３３～４９、５６～８８、１０１～１１０に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する、それぞれのフレームワークアミノ酸配列を含み得る。本発明の特異的結合分子のβ鎖可変ドメインは、配列番号５のフレームワークアミノ酸残基１～２６、３２～４８、５５～９１、１０４～１１２に、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する、それぞれのフレームワークアミノ酸配列を含み得る。あるいは、言及される同一性パーセントは、全体として考慮された際に、フレームワーク配列に渡るものであり得る。
【0047】
α鎖可変ドメインは、配列番号６及び配列番号７（図３ａに示される）のアミノ酸配列のいずれか１つを含み得て、β鎖可変ドメインは、配列番号８及び配列番号９（図３ｂに示される）のアミノ酸配列のいずれか１つを含み得る。
【0048】
例えば、特異的結合分子は、配列番号６及び配列番号８、又は配列番号７及び配列番号９を含み得る。
【0049】
本発明の範囲内には、本明細書に開示される本発明の任意の特異的結合分子の表現型的にサイレントな変異体がある。本明細書で使用される場合、用語「表現型的にサイレントな変異体」は、上述のものに加えて、置換、挿入及び欠失を含む、１つ以上の更なるアミノ酸変化を取り込むＴＣＲ可変ドメインを含む特異的結合分子であって、上記変化（複数の場合もある）を含まない対応する特異的結合分子と類似の表現型を有する特異的結合分子を指すと理解される。この適用の目的のため、特異的結合分子表現型は、結合親和性（ＫＤ及び／又は結合半減期）及び特異性を含む。好ましくは、免疫エフェクターと会合する可溶性特異的結合分子に関する表現型には、結合親和性及び特異性に加えて、免疫活性化の強度及び精製収量が含まれる。さらに、好ましい表現型にはまた、細胞表面上でペプチドＨＬＡ－Ｅ複合体を安定化させる能力も含まれ得る。表現型的にサイレントな変異体は、同一条件下で（例えば２５℃で及び／又は同じＳＰＲチップ上で）測定された際、上記変化（複数の場合もある）を含まない対応する特異的結合分子の測定ＫＤ及び／又は結合半減期の５０％以内、又はより好ましくは３０％、２５％若しくは２０％以内の、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対するＫＤ及び／又は結合半減期を有し得る。適切な条件は、実施例３及び実施例４に更に提供される。
【0050】
さらに、表現型的にサイレントな変異体は、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対する結合及び１つ以上の別のペプチド－ＨＬＡ複合体に対する結合の間で、同じ、又は持続的に同じ療法ウィンドウを保持し得る。表現型的にサイレントな変異体は、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体を提示する細胞及び１つ以上の別のオフターゲットのペプチド－ＨＬＡ複合体を提示する細胞に反応した免疫細胞活性化強度間で、同じ、又は持続的に同じ療法ウィンドウを保持し得る。療法ウィンドウは、正常細胞及び徴候関連細胞株に関して観察される最低有効濃度（「ＬＯＥＬ」）に基づいて計算され得る。療法ウィンドウは、少なくとも１０倍異なるか、少なくとも１００倍異なるか、少なくとも１０００倍異なるか、又はそれより異なり得る。表現型変異体は、以下に更に論じられる連続突然変異誘発技術によって決定されるように、同じ、又は実質的に同じ認識モチーフを共有し得る。
【0051】
当業者に知られるように、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体との相互作用の親和性、及び／又は他の機能特性を改変することなく、上に詳述されるものに比較して、その可変ドメイン中に変化を取り込む特異的結合分子を産生可能であり得る。特に、こうしたサイレント突然変異は、抗原結合に直接は関与しないことが知られる配列の部分（例えばフレームワーク領域及び／又は抗原と接触しないＣＤＲの部分）内に取り込まれ得る。こうした変異体は、本発明の範囲内に含まれる。
【0052】
当業者には明らかであろうように、特異的結合分子の機能特性に実質的に影響を与えることなく、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれより多い残基、Ｃ末端及び／又はＮ末端で提供される配列を切除するか又は伸長することが可能であり得る。Ｃ末端及び／又はＮ末端で提供される配列は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの残基、切除又は伸長され得る。全てのこうした変異体は、本発明によって含まれる。
【0053】
表現型的にサイレントな変異体は、１つ以上の保存的置換及び／又は１つ以上の許容的置換を含有し得る。許容的置換とは、以下に提供されるような保存的の定義内には属さないが、にもかかわらず表現型的にサイレントな置換を意味する。当業者は、多様なアミノ酸が類似の特性を有し、したがって「保存的」であることを知っている。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの１つ以上のこうしたアミノ酸は、しばしば、そのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの望ましい活性を排除することなく、１つ以上の他のこうしたアミノ酸によって置換され得る。
【0054】
したがって、アミノ酸グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンは、しばしば、互いに置換され得る（脂肪族側鎖を有するアミノ酸）。これらのあり得る置換のうち、グリシン及びアラニンを互いに置換するために用い（これらは比較的短い側鎖を有するため）、バリン、ロイシン及びイソロイシンを互いに置換するために用いる（これらは疎水性である、より大きな脂肪族側鎖を有するため）ことが好ましい。しばしば互いに置換され得る他のアミノ酸には、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、並びにシステイン及びメチオニン（イオウ含有側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。本発明の範囲内のアミノ酸置換は、天然存在又は非天然存在アミノ酸を用いて行われ得ることが認識されるべきである。例えば、本明細書において、アラニン上のメチル基はエチル基で置換され得て、及び／又は重要でない変化をペプチド主鎖に加え得ることが意図される。天然又は合成アミノ酸を用いるかどうかにかかわらず、Ｌ－アミノ酸のみが存在することが好ましい。
【0055】
この性質の置換は、しばしば、「保存的」又は「半保存的」アミノ酸置換と称される。本発明はしたがって、上述の通りであるが、特異的結合分子のアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号６のアミノ酸１～１１２、及び／又は配列番号３、配列番号８のアミノ酸１～１１５、及び／又は配列番号４、配列番号７のアミノ酸１～１１０、及び／又は配列番号５、配列番号９のアミノ酸１～１１２を含む特異的結合分子に、少なくとも９０％の同一性、例えば９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するように、配列中に１つ以上の保存的置換及び／又は１つ以上の許容的置換を含むアミノ酸配列のいずれか１つを含む特異的結合分子の使用に拡張される。
【0056】
当該技術分野に知られるような「同一性」は、配列を比較することによって決定されるような、２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、同一性はまた、場合によって、こうした配列のストリング間のマッチによって決定されるような、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いも意味する。２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を測定する幾つかの方法が存在するが、同一性を決定するために一般的に使用される方法は、コンピュータプログラムにおいて体系化されている。
【0057】
２つの配列間の同一性を決定するために好ましいコンピュータプログラムには、限定されるわけではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, et al., Nucleic Acids Research, 12, 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)）、タンパク質配列用のＳＩＭ整列ツール（Xiaoquin Huang and Webb Miller: "A Time-Efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm" Advances in Applied Mathematics, vol. 12 (1991), pp. 337-357）が含まれる。
【0058】
アミノ酸配列を比較するために、ＣＬＵＳＴＡＬプログラム等のプログラムを用いてもよい。このプログラムはアミノ酸配列を比較し、適切なようにいずれかの配列中にスペースを挿入することによって、最適整列を見出す。最適整列のため、アミノ酸同一性又は類似性（同一性に加えてアミノ酸タイプの保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似配列の最長ストレッチを整列し、適合に値を割り当てる。したがって、各々異なるスコアを有する、類似性の幾つかの領域が見出された比較を得ることが可能である。両方のタイプの同一性分析は本発明において意図される。
【0059】
最適比較目的のため、配列を整列し（例えば、配列と最適に整列させるために、第１の配列中にギャップを導入してもよい）、対応する位でアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較することによって、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントが決定される。「最適整列」は、最高の同一性パーセントを生じる２つの配列の整列である。同一性パーセントは、比較している配列中の同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの数によって決定される（即ち、％同一性＝同一位の数／位の総数×１００）。
【0060】
２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当業者に知られる数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。２つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの例は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877におけるように修飾された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムである。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｐプログラムはこうしたアルゴリズムを取り込んでいる。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴｎプログラムで行われ得る。２つのタンパク質配列間の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴｐプログラムで行われ得る。比較目的のため、ギャップ化整列を得るには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるようにギャップ化ＢＬＡＳＴを利用してもよい。あるいは、分子間の離れた関係を検出する反復検索を実行するため、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを用いてもよい（同文献）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ化ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する際、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴｐ及びＢＬＡＳＴｐ）のデフォルトパラメータが使用され得る。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。デフォルトの一般的なパラメータには、例えば、ワードサイズ＝３、期待閾値＝１０が含まれ得る。短いインプット配列に関して、自動的に調整するようにパラメータを選択してもよい。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである。ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、こうしたアルゴリズムを取り込んでいる。当該技術分野に知られる配列分析のための他のアルゴリズムには、Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5に記載されるようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ、並びにPearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8に記載されるＦＡＳＴＡが含まれる。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは、検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。本開示において同一性パーセントを評価する目的のため、デフォルトパラメータを伴うＢＬＡＳＴｐを比較方法論として用いる。さらに、列挙される同一性パーセントがアミノ酸の整数ではない数を提供する場合、即ち、９０％配列同一性を有する２５アミノ酸の配列が「２２．５」の値を提供する場合、得られる値を次の整数に、したがって「２２」に切り捨てる。したがって、提供される例では、２５アミノ酸のうち２２のマッチを有する配列は、９０％配列同一性以内である。
【0061】
保存的及び許容的置換、挿入並びに欠失を含む突然変異は、限定されるわけではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくもの、制限酵素に基づくクローニング、又はライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）法を含む任意の適切な方法を用いて提供される配列内に導入され得る。これらの方法は、多くの標準的な分子生物学テキスト中に詳述される。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び制限酵素に基づくクローニングに関する更なる詳細に関しては、Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rdEd.) CSHL Pressを参照されたい。ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）に関する更なる情報は、Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6に見出され得る。本発明によって提供されるＴＣＲ配列は、固相合成又は当該技術分野に知られる任意の他の適切な方法から得られ得る。
【0062】
本発明の特異的結合分子は、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合する特性を有する。本発明の特異的結合分子は、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対する高い度合いの特異性を示し、したがって療法的使用に特に適している。本発明の特異的結合分子の背景における特異性は、抗原陰性である標的細胞を認識する能力は最小限である一方、抗原陽性である標的細胞を認識し得ることに関する。本発明の特異的結合分子は、ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１又はＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３と標的ペプチドの複合体に結合し得る。
【0063】
特異性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば実施例６～８に記載されるもの等の細胞アッセイにおいて測定され得る。特異性を試験するため、特異的結合分子は可溶性型であり、免疫エフェクターと会合してもよく、及び／又は細胞、例えばＴ細胞の表面上に発現されていてもよい。特異性は、上に定義されるような抗原陽性標的細胞及び抗原陰性標的細胞の存在下で、Ｔ細胞活性化のレベルを測定することによって決定され得る。抗原陰性標的細胞の最小限の認識は、同じ条件下で、かつ療法的に適切なＴＣＲ濃度で測定された際、抗原陽性標的細胞の存在下で生じるレベルの２０％未満、好ましくは１０％未満、好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満のＴ細胞活性化レベルと定義される。免疫エフェクターと会合する可溶性ＴＣＲに関しては、療法的に適切な濃度は、１０－９Ｍ以下の濃度、及び／又は対応するＥＣ５０値若しくはＩＣ５０値よりも最大１００倍、好ましくは最大１０００倍高い濃度と定義され得る。好ましくは、免疫エフェクターと会合する可溶性特異的結合分子に関して、抗原陰性細胞に比較して、抗原陽性細胞に対するＴ細胞活性化の間のＥＣ５０値又はＩＣ５０値の少なくとも１０倍の相違、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１００００倍の相違があり、この相違は、療法ウィンドウと称され得る。さらに又は別に、療法ウィンドウは、正常細胞及び感染細胞に関して観察される最低有効濃度（「ＬＯＥＬ」）に基づいて計算され得る。抗原陽性細胞は、ｗｔペプチド提示に匹敵する抗原提示レベルを得るために適切なペプチド濃度を用いたペプチドパルス処理によって得られ得て、又はこれらは上記ペプチドを天然に提示し得る。好ましくは抗原陽性細胞及び抗原陰性細胞の両方はヒト細胞である。
【0064】
特異性は、更に又は別に、特異的結合分子が、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合し、かつ別のペプチド－ＨＬＡ複合体のパネルに結合しない能力に関し得る。これは、例えば、実施例３及び実施例４のＢｉａｃｏｒｅ法によって決定され得る。上記パネルには、ＨＬＡ－Ｅによって提示されることが知られる自己リーダーペプチド、ＨＬＡ－Ａ＊０２と複合体形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチド、又はＨＬＡ－ＥオルソログＭａｍｕ－Ｅによって提示されるＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドが含まれ得る。上記パネルは、少なくとも５つ、好ましくは少なくとも１０の別のペプチド－ＨＬＡ複合体を含有し得る。別のペプチドは、配列番号１と低レベルの配列同一性を共有し得て、天然に又は人工的に提示され得る。別のペプチドは、好ましくは、一般的に発現されるタンパク質及び／又は健康なヒト組織において発現されるタンパク質に由来する。ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対する特異的結合分子の結合は、他の天然に又は人工的に提示されたペプチドＨＬＡ複合体よりも、少なくとも２倍より高く、より好ましくは少なくとも１０倍、又は少なくとも５０倍若しくは少なくとも１００倍より高く、更により好ましくは少なくとも１０００倍より高くてもよい。ＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドの天然変異体は、別のペプチド－ＨＬＡ複合体の定義から排除され得る。
【0065】
特異的結合分子特異性を決定するための別の又は更なるアプローチは、標的ペプチドの連続突然変異誘発、例えばアラニンスキャニングを用いて、特異的結合分子のペプチド認識モチーフを同定することであり得る。結合モチーフの部分を形成する残基は、置換を許容し得ないものである。非許容性置換は、特異的結合分子の結合親和性が、非突然変異ペプチドに関する結合親和性に比較して、少なくとも５０％、又は好ましくは少なくとも８０％減少するペプチド位と定義され得る。こうしたアプローチは、ＴＣＲに関連して、Cameron et al., (2013), Sci Transl Med. 2013 Aug 7; 5 (197): 197ra103及び国際公開第２０１４０９６８０３号に更に記載されるが、こうした方法はまた、本発明の特異的結合分子にも適用され得ることが認識されるであろう。この場合の特異的結合分子特異性は、別のモチーフ含有ペプチド、特にヒトプロテオーム中の別のモチーフ含有ペプチドを同定することと、特異的結合分子に対する結合に関してこれらのペプチドを試験することとによって決定され得る。１つ以上の別のペプチドに対する特異的結合分子の結合は、特異性の欠如を示し得る。この場合、細胞アッセイを通じた特異的結合分子特異性の更なる試験が必要であり得る。ペプチドの中央部分における（アラニン）置換に対する低い許容性は、ＴＣＲが高い特異性を有し、したがって別のペプチドとの交差反応性に関しては低リスクを提示することを示す。
【0066】
本発明の特異的結合分子は、療法試薬としての使用のために理想的な安全性プロファイルを有し得る。この場合、特異的結合分子は可溶性型であり得て、好ましくは免疫エフェクターに融合し得る。適切な免疫エフェクターには、限定されるわけではないが、サイトカイン、例えばＩＬ－２及びＩＦＮ－γ、スーパー抗原及びその突然変異体、ケモカイン、例えばＩＬ－８、血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質、Ｔ細胞又はＮＫ細胞等の免疫細胞上の抗原に結合する、断片、誘導体及び変異体を含む抗体及び抗体様足場（例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８又は抗ＣＤ１６）、並びにＦｃ受容体又は補体活性化因子が含まれる。理想的な安全性プロファイルは、優れた特異性を示すことに加えて、本発明の特異的結合分子が、更なる前臨床安全性試験に合格していてもよいことを意味する。こうした試験の例には、全血の存在下で最小限のサイトカイン放出を確認し、したがってｉｎ ｖｉｖｏで潜在的なサイトカイン放出症候群を引き起こすリスクが低いことを確認する全血アッセイ、及び別のＨＬＡ型の認識に関する低い潜在可能性を確認する同種抗原反応性試験が含まれる。
【0067】
本発明の特異的結合分子は、高収率精製、特に可溶性形式での特異的結合分子の高収率精製に適し得る。収率は、元来の培養体積に比較して、精製プロセス終了時に得られる正しくフォールディングされた物質の量に基づいて決定され得る。高収率は、典型的には、１ｍｇ／Ｌより多い、若しくは２ｍｇ／Ｌより多い、若しくはより好ましくは３ｍｇ／Ｌより多い、若しくは４ｍｇ／Ｌより多い若しくは５ｍｇ／Ｌより多い、又はそれより高い収率を意味する。
【0068】
本発明の或る特定の特異的結合分子は、好ましくは天然ＴＣＲ（非突然変異又は足場ＴＣＲとも称される）よりも大きい（即ち強い）ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に関するＫＤ、例えば１ｐＭ～１μＭの範囲のＫＤを有する。１つの態様において、本発明の特異的結合分子は、約（即ち＋／－１０％）１ｐＭ～約４００ｎＭ、約１ｐＭ～約１０００ｐＭ、約１ｐＭ～約５００ｐＭの複合体に関するＫＤを有する。上記特異的結合分子は、更に又は別に、約１分～約６０時間、約２０分～約５０時間、又は約２０分～約２５時間の範囲の複合体に関する結合半減期（Ｔ１／２）を有し得る。好ましくは、本発明の特異的結合分子は、約１ｐＭ～約５００ｐＭのＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に関するＫＤを有し、及び／又は約２０分～約２５時間の結合半減期を有する。こうした高親和性は、療法剤及び／又は検出可能標識と会合する際の可溶性形式の特異的結合分子に関して好ましい。
【0069】
天然ＴＣＲを含む本発明の特異的結合分子は、約１μＭ～約２００μＭ、若しくは約１μＭ～約１００μＭの複合体に関するＫＤ及び／又は約３秒～約１０分の複合体に関する結合半減期を有し得る。
【0070】
別の態様において、天然ＴＣＲを含む本発明の特異的結合分子は、約５０ｎＭ～約２００μＭ、若しくは約１００ｎＭ～約２μＭの複合体に関するＫＤ及び／又は約３秒～約１２分の複合体に関する結合半減期を有し得る。こうした特異的結合分子は、養子療法適用に好ましい可能性もある。
【0071】
結合親和性（平衡定数ＫＤに反比例する）及び結合半減期（Ｔ１／２と表される）を決定する方法が当業者に知られる。好ましい実施の形態において、結合親和性及び結合半減期は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）又はバイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）を用いて、例えばそれぞれ、ＢＩＡｃｏｒｅ装置又はＯｃｔｅｔ装置を用いて、決定される。好ましい方法は、実施例３及び実施例４に提供される。特異的結合分子の親和性が倍になると、その結果、ＫＤは半分になることが認識されるであろう。Ｔ１／２は、オフ速度（ｋｏｆｆ）によってＩｎ２を割ったものとして計算される。したがって、Ｔ１／２が倍になると、その結果、ｋｏｆｆは半分になる。ＴＣＲに関するＫＤ及びｋｏｆｆ値は、通常、ＴＣＲの可溶性型、即ち細胞質及び膜貫通ドメイン残基を除去するように切除された型（一本鎖ＴＣＲ及び／又は非天然ジスルフィド結合若しくは他の二量体化ドメインを取り込むＴＣＲを含む）に関して測定される。独立の測定間の変動に関して、特に２０時間を超える解離時間を伴う相互作用に関して考慮するため、所定の特異的結合分子の結合親和性及び／又は結合半減期は、同じアッセイプロトコルを用いて数回、例えば３回以上測定し、結果の平均を取ってもよい。２つの試料（即ち２つの異なる特異的結合分子及び／又は同じ特異的結合分子の２つの調製物）の間の結合データを比較するため、実施例３及び実施例４に記載されるもの等、同じアッセイ条件（例えば温度）を用いて、測定を行うことが好ましい。
【0072】
本発明の或る特定の好ましい特異的結合分子は、天然ＴＣＲのものよりも実質的により高い、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対する結合親和性及び／又は結合半減期を有する。天然ＴＣＲの結合親和性を増加させると、そのペプチド－ＭＨＣリガンドに対するＴＣＲの特異性は減少し得て、これはZhao et al., (2007) J.Immunol, 179:9, 5845-5854に立証される。しかし、本発明のこうした特異的結合分子は、天然ＴＣＲよりも実質的により高い結合親和性を有するにもかかわらず、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に対する高レベルの特異性を示す。
【0073】
或る特定の好ましい特異的結合分子は、抗原陽性細胞、特に低レベルの抗原（即ち５～１００程度）を提示する細胞に対して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非常に強力なＴ細胞反応を生じることが可能である。こうした特異的結合分子は、可溶性型であってもよく、抗ＣＤ３抗体等の免疫エフェクターに連結されていてもよい。測定されるＴ細胞反応は、Ｔ細胞活性化マーカー、例えばインターフェロンγ若しくはグランザイムＢの放出、又は標的細胞殺細胞（Ｍｔｂ感染初代細胞の殺細胞を含む）、又はＴ細胞活性化の他の測定値、例えばＴ細胞増殖であり得る。好ましくは、非常に強力な反応は、ｐＭ範囲、即ち１０００ｐＭ以下のＥＣ５０値を持つものである。
【0074】
本発明の特異的結合分子は、ＴＣＲ可変ドメインを含み得る。好ましくは、ＴＣＲ可変ドメインは、α鎖及びβ鎖のヘテロ二量体を含む。あるいは、ＴＣＲ可変ドメインは、γ鎖及びδ鎖のヘテロ二量体を含み得る。幾つかの場合、本発明の特異的結合分子は、ＴＣＲ可変ドメインのホモ二量体、例えばααホモ二量体又はββホモ二量体（又はγγホモ二量体若しくはδδホモ二量体）を含み得る。
【0075】
本発明の特異的結合分子において、可変ドメイン、及び存在する場合に定常ドメイン、及び／又はあらゆる他のドメインは、任意の適切な形式／配置で編成され得る。こうした配置の例は、抗体技術の当業者に既知である。当業者は、抗体及びＴＣＲの間の類似性を知っており、こうした配置をＴＣＲ可変ドメイン及び定常ドメインに適用し得る（Brinkman et al., MAbs. 2017 Feb-Mar; 9(2): 182-212）。例えば、可変ドメインは、モノクローナルＴＣＲ形式で配置され得て、この中では、２つの鎖が、定常ドメイン若しくは可変ドメインのいずれかの内部でジスルフィド結合によって連結されるか、又は可変ドメインが１つ以上の二量体化ドメインに融合される。あるいは、可変ドメインは、１つ以上の定常ドメインの存在下若しくは非存在下、一本鎖形式で配置され得て、又は可変ドメインはディアボディ形式で配置され得る。
【0076】
本発明の特異的結合分子は、少なくとも１つのＴＣＲ定常ドメイン又はその断片、例えばα鎖ＴＲＡＣ定常ドメイン及び／又はβ鎖ＴＲＢＣ１若しくはＴＲＢＣ２定常ドメインを含み得る。当業者に認識されるであろうように、用語ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ１／２はまた、天然多型変異体、例えばＴＲＡＣ ４位のＮからＫへの変異体も含む（Bragado et al International immunology. 1994 Feb;6(2):223-30）。
【0077】
存在する場合、定常ドメインの一方又は両方は、天然定常ドメイン配列に比較して、突然変異、置換又は欠失を含有し得る。定常ドメインは切除されていてもよく、即ち膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインを持たなくてもよい。あるいは、定常ドメインは全長であり得て、これは細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが全て存在することを意味する。ＴＲＡＣドメイン配列及びＴＲＢＣドメイン配列は、ＴＲＡＣのエクソン２のＣｙｓ４及びＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２のエクソン２のＣｙｓ２の間の天然ジスルフィド結合を欠失させる切除又は置換によって修飾され得る。α鎖定常ドメイン配列及び／又はβ鎖定常ドメイン配列（複数の場合もある）は、例えば国際公開第０３／０２０７６３号に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。好ましくは、α定常ドメイン及びβ定常ドメインは、ＴＲＡＣのＴｈｒ４８位及びＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２のＳｅｒ５７位でのシステイン残基の置換によって修飾され得て、上記システインは、ＴＣＲのα定常ドメイン及びβ定常ドメインの間に非天然ジスルフィド結合を形成する。ＴＲＢＣ１又はＴＲＢＣ２には更に、定常ドメインの７５位のシステインからアラニンへの突然変異、及び定常ドメインの８９位のアスパラギンからアスパラギン酸への突然変異が含まれ得る。本発明のαβヘテロ二量体中に存在する細胞外定常ドメインの一方又は両方は、例えば最大１５、又は最大１０、又は最大８アミノ酸又はそれ未満、単数又は複数のＣ末端で更に切除され得る。本発明のαβヘテロ二量体中に存在する細胞外定常ドメインの一方又は両方は、例えば最大１５、又は最大１０、又は最大８アミノ酸、単数又は複数のＣ末端で切除され得る。α鎖細胞外定常ドメインのＣ末端は、８アミノ酸切除され得る。
【0078】
あるいは、全長定常ドメイン又は切除定常ドメインがあるのではなく、ＴＣＲ定常ドメインがなくてもよい。したがって、本発明の特異的結合分子は、ＴＣＲ α鎖及びβ鎖の可変ドメインで構成され得て、任意選択で、本明細書に記載されるような更なるドメインを含む。更なるドメインには、限定されるわけではないが、免疫エフェクタードメイン（例えば抗体ドメイン）、Ｆｃドメイン又はアルブミン結合ドメイン、療法剤又は検出可能標識が含まれる。
【0079】
一本鎖形式には、限定されるわけではないが、Ｖα－Ｌ－Ｖβ、Ｖβ－Ｌ－Ｖα、Ｖα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ、Ｖα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ、又はＶα－Ｃα－Ｌ－Ｖβ－Ｃβ型のαβ ＴＣＲポリペプチドが含まれ、Ｖα及びＶβはそれぞれ、ＴＣＲ α可変領域及びβ可変領域であり、Ｃα及びＣβは、それぞれ、ＴＣＲ α定常領域及びβ定常領域であり、Ｌはリンカー配列である（Weidanz et al., (1998) J Immunol Methods. Dec 1;221(1-2):59-76、Epel et al., (2002), Cancer Immunol Immunother. Nov;51(10):565-73、国際公開第２００４／０３３６８５号、国際公開第９９１８１２９号）。リンカー配列は、柔軟性を制限する可能性がある大きな側鎖を持たないグリシン、アラニン及びセリン等のアミノ酸で、主に構成されている点で、通常、柔軟性である。あるいは、より大きな硬直性を持つリンカーが望ましい可能性もある。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。しばしば、リンカー配列は、長さ約１２未満、例えば１０未満、又は２～１０アミノ酸であろう。リンカーは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸であり得る。本発明のマルチドメイン結合分子に用いられ得る適切なリンカーの例には、限定されるわけではないが、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１８）、ＧＳＧＧＧＰ（配列番号１９）、ＧＧＥＰＳ（配列番号２０）、ＧＧＥＧＧＧＰ（配列番号２１）、及びＧＧＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳ（配列番号２２）（国際公開第２０１０／１３３８２８号に記載される通り）並びにＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２３）が含まれる。更なるリンカーには、以下の配列モチーフ：ＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＴＶＬＲＴ（配列番号２５）、ＴＶＳＳＡＳ（配列番号２６）及びＴＶＬＳＳＡＳ（配列番号２７）の１つ以上を有する配列が含まれ得る。存在する場合、定常ドメインの一方又は両方は全長であり得て、又はこれらは切除され得て、及び／又は上述のような突然変異を含有し得る。好ましくは、一本鎖ＴＣＲは可溶性である。或る特定の実施の形態において、本発明の一本鎖ＴＣＲは、国際公開第２００４／０３３６８５号に記載されるように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有し得る。一本鎖ＴＣＲは、国際公開第２００４／０３３６８５号、国際公開第９８／３９４８２号、国際公開第０１／６２９０８号、Weidanz et al. (1998) J Immunol Methods 221(1-2): 59-76、Hoo et al. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89(10): 4759-4763、Schodin (1996) Mol Immunol 33(9): 819-829に更に記載される。
【0080】
ＴＣＲ可変ドメインは、ディアボディ形式で配置され得る。ディアボディ形式では、２つの一本鎖断片は頭尾配置で二量体化し、タンデムｓｃＦｖに類似の分子量（約５０ｋＤａ）を持つコンパクトな分子を生じる。
【0081】
本発明にはまた、本発明の特異的結合分子を示す粒子、及び粒子ライブラリー内の上記粒子の包含も含まれる。こうした粒子には、限定されるわけではないが、ファージ、酵母細胞、リボソーム、又は哺乳動物細胞が含まれる。こうした粒子及びライブラリーの製造法が当該技術分野に知られる（例えば、国際公開第２００４／０４４００４号、国際公開第０１／４８１４５号、Chervin et al. (2008) J. Immuno. Methods 339.2: 175-184を参照されたい）。
【0082】
本発明の特異的結合分子は、抗原提示細胞及び抗原提示細胞を含有する組織に、検出可能標識又は療法剤を送達するために有用である。したがって、これらは、検出可能標識と（特異的結合分子を用いて、同族抗原を提示する細胞の存在を検出する診断目的のため）、及び／又は免疫エフェクターを含む療法剤と、及び／又は薬物動態学的（ＰＫ）修飾部分と会合（共有的又は別の方式で）していてもよい。
【0083】
ＰＫ修飾部分の例には、限定されるわけではないが、ＰＥＧ（Dozier et al., (2015) Int J Mol Sci. Oct 28;16(10):25831-64及びJevsevar et al., (2010) Biotechnol J.Jan;5(1):113-28）、ＰＡＳ化（Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. Aug;26(8):489-501）、アルブミン及びアルブミン結合ドメイン（Dennis et al., (2002) J Biol Chem. Sep 20;277(38):35035-43）、及び／又は非構造化ポリペプチド（Schellenberger et al., (2009) Nat Biotechnol. Dec;27(12):1186-90）が含まれる。更なるＰＫ修飾部分には、抗体Ｆｃ断片が含まれる。ＰＫ修飾部分は、本発明の特異的結合分子のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長するよう働き得る。
【0084】
免疫グロブリンＦｃドメインを用いる場合、任意の抗体Ｆｃ領域であってもよい。Ｆｃ領域は、細胞表面Ｆｃ受容体及び補体系の幾つかのタンパク質と相互作用する抗体のテール領域である。Ｆｃ領域は、典型的には、２つ又は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４と称される）及びヒンジ領域の両方を有する２つのポリペプチド鎖を含む。２つの鎖はヒンジ領域内のジスルフィド結合によって連結される。免疫グロブリンサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４由来のＦｃドメインは、ＦｃＲｎに結合し、ＦｃＲｎ仲介性リサイクリングを経て、長い循環半減期（３週間～４週間）を提供する。ＩｇＧとＦｃＲｎの相互作用は、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの部分を覆うＦｃ領域中に位置している。本発明で使用するための好ましい免疫グロブリンＦｃには、限定されるわけではないが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４由来のＦｃドメインが含まれる。好ましくは、Ｆｃドメインはヒト配列由来である。Ｆｃ領域にはまた、好ましくは、二量体化を促進するＫｉＨ突然変異、並びに活性化受容体との相互作用を防止する突然変異、即ち機能的にサイレントな分子が含まれ得る。免疫グロブリンＦｃドメインは、任意の適切な順序又は立体配置で、他のドメイン（即ちＴＣＲ可変ドメイン及び／又はＴＣＲ定常ドメイン及び／又は免疫エフェクタードメイン）のＣ末端又はＮ末端に融合されてもよい。免疫グロブリンＦｃは、リンカーを通じて、他のドメイン（即ちＴＣＲ可変ドメイン及び／又はＴＣＲ定常ドメイン及び／又は免疫エフェクタードメイン）の１つ以上に融合されてもよい。リンカー配列は、柔軟性を制限する可能性がある大きな側鎖を持たないグリシン、アラニン及びセリン等のアミノ酸で、主に構成されている点で、通常、柔軟性である。あるいは、より大きな硬直性を持つリンカーが望ましい可能性もある。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。しばしば、リンカー配列は、長さ約１２未満、例えば１０未満、又は２～１０アミノ酸であろう。リンカーは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸であり得る。本発明のマルチドメイン結合分子に用いられ得る適切なリンカーの例には、限定されるわけではないが、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１８）、ＧＳＧＧＧＰ（配列番号１９）、ＧＧＥＰＳ（配列番号２０）、ＧＧＥＧＧＧＰ（配列番号２１）、及びＧＧＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳ（配列番号２２）（国際公開第２０１０／１３３８２８号に記載される通り）並びにＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２３）が含まれる。更なるリンカーには、以下の配列モチーフ：ＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＴＶＬＲＴ（配列番号２５）、ＴＶＳＳＡＳ（配列番号２６）及びＴＶＬＳＳＡＳ（配列番号２７）の１つ以上を有する配列が含まれ得る。免疫グロブリンＦｃをＴＣＲに融合させる場合、リンカーを伴い又は伴わず、α鎖又はβ鎖のいずれに融合してもよい。さらに、Ｆｃの個々の鎖をＴＣＲの個々の鎖に融合させてもよい。
【0085】
好ましくは、Ｆｃ領域はＩｇＧ１サブクラス又はＩｇＧ４サブクラス由来であり得る。２つの鎖は、ＣＨ２定常ドメイン及びＣＨ３定常ドメイン、並びにヒンジ領域の全て又は部分を含み得る。ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のヒンジ領域に実質的に又は部分的に対応し得る。ヒンジは、コアヒンジドメインの全て又は一部及び下部ヒンジ領域の全て又は一部を含み得る。好ましくは、ヒンジ領域は、２つの鎖を連結する少なくとも１つのジスルフィド結合を含有する。
【0086】
Ｆｃ領域は、ＷＴ配列に比較して突然変異を含み得る。突然変異には、置換、挿入及び欠失が含まれる。こうした突然変異は、望ましい療法特性を導入する目的のために行われ得る。例えば、ヘテロ二量体化を促進するため、ノブズ・イントゥ・ホールズ（ＫｉＨ）突然変異をＣＨ３ドメイン内に操作してもよい。この場合、一方の鎖は大きな突出残基（即ちノブ）、例えばＹを含有するように操作され、他方の鎖は相補的ポケット（即ちホール）を含有するように操作される。ＫｉＨ突然変異に適した位が当該技術分野に知られる。さらに又は別に、Ｆｃγ受容体への結合を抑止するか若しくは減少させる、及び／又はＦｃＲｎへの結合を増加させる、及び／又はＦａｂアーム交換を防止する、又はプロテアーゼ部位を除去する突然変異を導入してもよい。さらに又は別に、突然変異は製造可能性を改善する、例えばグリコシル化部位を除去するか又は改変する。
【0087】
ＰＫ修飾部分はまた、アルブミン結合ドメインであってもよく、これはまた、半減期を伸長するよう作用し得る。当該技術分野に知られるように、アルブミンは、部分的に、腎閾値より高いそのサイズのため、かつＦｃＲｎを通じたその特異的相互作用及びリサイクリングにより、１９日間の長い循環半減期を有する。アルブミンへの付着は、療法分子のｉｎ ｖｉｖｏでの循環半減期を改善する既知の戦略である。アルブミンは、特異的アルブミン結合ドメインの使用を通じて非共有的に、又はコンジュゲート化若しくは直接遺伝子融合によって共有的に付着され得る。半減期改善のため、アルブミンへの付着を利用している療法分子の例は、Sleep et al., Biochim Biophys Acta. 2013 Dec;1830(12):5526-34に提供される。
【0088】
アルブミン結合ドメインは、任意の既知のアルブミン結合部分を含めて、アルブミンに結合可能な任意の部分であり得る。アルブミン結合ドメインは、アルブミンに特異的に結合する内因性リガンド又は外因性リガンド、有機小分子、脂肪酸、ペプチド及びタンパク質より選択され得る。好ましいアルブミン結合ドメインの例には、短いペプチド、例えば、Dennis et al., J Biol Chem. 2002 Sep 20;277(38):35035-43に記載されるもの（例えばペプチドＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ）、アルブミンに結合するよう操作されたタンパク質、例えば抗体、抗体断片及び抗体様足場、例えばGSKによって市販されるＡｌｂｕｄａｂ（商標）（O'Connor-Semmes et al., Clin Pharmacol Ther. 2014 Dec;96(6):704-12）及びAblynxによって市販されるＮａｎｏｂｏｄｙ（商標）（Van Roy et al., Arthritis Res Ther. 2015 May 20;17:135）、並びに天然に見られるアルブミン結合ドメインに基づくタンパク質、例えばストレプトコッカスタンパク質Ｇタンパク質（Stork et al., Eng Des Sel. 2007 Nov;20(11):569-76）、例えばAffibodyによって市販されるＡｌｂｕｍｏｄ（商標）が含まれる。好ましくは、アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。ヒトアルブミンに対するアルブミン結合ドメインの親和性は、ピコモルからマイクロモルの範囲であり得る。ヒト血清中のアルブミンが非常に高濃度である（３５ｍｇ／ｍｌ～５０ｍｇ／ｍｌ、およそ０．６ｍＭ）ことを考慮すると、ｉｎ ｖｉｖｏでは、アルブミン結合ドメインの実質的に全てがアルブミンに結合すると計算される。
【0089】
アルブミン結合部分は、任意の適切な順序又は立体配置で、他のドメイン（即ちＴＣＲ可変ドメイン及び／又はＴＣＲ定常ドメイン及び／又は免疫エフェクタードメイン）のＣ末端又はＮ末端に融合されてもよい。アルブミン結合部分は、リンカーを通じて、他のドメイン（即ちＴＣＲ可変ドメイン及び／又はＴＣＲ定常ドメイン及び／又は免疫エフェクタードメイン）の１つ以上に融合されてもよい。リンカー配列は、柔軟性を制限する可能性がある大きな側鎖を持たないグリシン、アラニン及びセリン等のアミノ酸で、主に構成されている点で、通常、柔軟性である。あるいは、より大きな硬直性を持つリンカーが望ましい可能性もある。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。しばしば、リンカー配列は、長さ約１２未満、例えば１０未満、又は２～１０アミノ酸であろう。リンカーは、長さ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０アミノ酸であり得る。本発明のマルチドメイン結合分子に用いられ得る適切なリンカーの例には、限定されるわけではないが、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１８）、ＧＳＧＧＧＰ（配列番号１９）、ＧＧＥＰＳ（配列番号２０）、ＧＧＥＧＧＧＰ（配列番号２１）、及びＧＧＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳ（配列番号２２）（国際公開第２０１０／１３３８２８号に記載される通り）並びにＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２３）が含まれる。更なるリンカーには、以下の配列モチーフ：ＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＴＶＬＲＴ（配列番号２５）、ＴＶＳＳＡＳ（配列番号２６）及びＴＶＬＳＳＡＳ（配列番号２７）の１つ以上を有する配列が含まれ得る。アルブミン結合部分がＴＣＲに連結されている場合、リンカーを伴い又は伴わず、α鎖又はβ鎖のいずれに連結されていてもよい。
【0090】
診断目的のための検出可能標識には、例えば、蛍光標識、放射標識、酵素、核酸プローブ及び造影剤試薬が含まれる。
【0091】
幾つかの目的のため、本発明の特異的結合分子は、幾つかの特異的結合分子を含む複合体に凝集されて、多価特異的結合分子複合体を形成してもよい。多価特異的結合分子複合体の産生に用いられ得る多量体化ドメインを含有する幾つかのヒトタンパク質がある。例えば、単量体ｓｃＦｖ断片に比較して、増加した血清持続性及び有意に減少したオフ速度を示すｓｃＦｖ抗体断片の四量体を産生するために利用されてきているｐ５３の四量体化ドメインがある（Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392）。ヘモグロビンもまた、この種の適用に使用され得る四量体化ドメインを有する。本発明の多価特異的結合分子複合体は、本発明の非多量体天然（親、自然、非突然変異野生型、又は足場とも称される）Ｔ細胞受容体ヘテロ二量体に比較して、複合体に対して、増進された結合能を有し得る。したがって、本発明の特異的結合分子の多価複合体もまた、本発明内に含まれる。本発明によるこうした多価特異的結合分子複合体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで、特定の抗原を提示する細胞を追跡するか又はターゲティングするために特に有用であり、また、こうした使用を有する更なる多価特異的結合分子複合体の産生のための中間体としても有用である。
【0092】
本発明の特異的結合分子と会合し得る療法剤には、免疫調節剤及びエフェクター、放射性化合物、酵素（例えばパーフォリン）又は化学療法剤（例えばシスプラチン）が含まれる。療法効果が所望の位置で発揮されることを確実にするため、化合物が緩慢に放出されるように、療法剤は、特異的結合分子に連結されたリポソーム又は他のナノ粒子構造内にあってもよい。これは、体内の輸送中の損傷効果を防ぎ、適切な抗原提示細胞に特異的結合分子が結合した後に、療法剤が最大効果を有することを確実にするであろう。
【0093】
適切な療法剤の例には、限定されるわけではないが、
抗Ｔ細胞又はＮＫ細胞決定基抗体（例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８又は抗ＣＤ１６）を含む、抗体又はその断片；
抗体様結合特性を持つ別のタンパク質足場（例えばＤＡＲＰｉｎ）；
免疫刺激剤、即ち免疫反応を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ等のサイトカイン；
例えばＩＬ－８、血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質等のケモカイン；
補体経路活性化因子又はＦｃ受容体；
チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ－Ｌ１をターゲティングするもの；
小分子細胞傷害剤、即ち、７００ダルトン未満の分子量を有し、哺乳動物細胞を殺す能力を持つ化合物。こうした化合物はまた、細胞傷害効果を有することが可能な毒性金属も含有し得る。さらに、これらの小分子細胞傷害剤にはまた、プロドラッグ、即ち生理学的条件下で崩壊するか又は変換されて細胞傷害剤を放出する化合物も含まれることを理解されたい。こうした細胞傷害剤の例には、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラケルマイシン（rachelmycin）、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーナトリウムフォトフリンＩＩ（sorfimer sodiumphotofrin II）、テモゾロミド、トポテカン、トリメトリエートアーボレート（trimetreate arbourate）、オーリスタチンＥ、ビンクリスチン及びドキソルビシンが含まれる；
ペプチド細胞傷害剤、即ち哺乳動物細胞を殺す能力を持つタンパク質又はその断片。例えばリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ；
放射性核種、即ちα粒子若しくはβ粒子、又はγ線の１つ以上の同時放出を伴って崩壊する、元素の不安定同位体。例えばヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５並びにアスタチン２１３。キレート剤を用いて、これらの放射性核種のＴＣＲ又はその多量体への会合を促進してもよい；
スーパー抗原及びその突然変異体；
ペプチド－ＨＬＡ複合体であって、上記ペプチドが一般的なヒト病原体、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来である、ペプチド－ＨＬＡ複合体；
異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチド；
が含まれる。
抗Ｔ細胞又はＮＫ細胞決定基抗体（例えば抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８又は抗ＣＤ１６）を含む、抗体又はその断片；
抗体様結合特性を持つ別のタンパク質足場（例えばＤＡＲＰｉｎ）；
免疫刺激剤、即ち免疫反応を刺激する免疫エフェクター分子。例えば、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ等のサイトカイン；
例えばＩＬ－８、血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質等のケモカイン；
補体経路活性化因子又はＦｃ受容体；
チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ１又はＰＤ－Ｌ１をターゲティングするもの；
小分子細胞傷害剤、即ち、７００ダルトン未満の分子量を有し、哺乳動物細胞を殺す能力を持つ化合物。こうした化合物はまた、細胞傷害効果を有することが可能な毒性金属も含有し得る。さらに、これらの小分子細胞傷害剤にはまた、プロドラッグ、即ち生理学的条件下で崩壊するか又は変換されて細胞傷害剤を放出する化合物も含まれることを理解されたい。こうした細胞傷害剤の例には、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラケルマイシン（rachelmycin）、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーナトリウムフォトフリンＩＩ（sorfimer sodiumphotofrin II）、テモゾロミド、トポテカン、トリメトリエートアーボレート（trimetreate arbourate）、オーリスタチンＥ、ビンクリスチン及びドキソルビシンが含まれる；
ペプチド細胞傷害剤、即ち哺乳動物細胞を殺す能力を持つタンパク質又はその断片。例えばリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼ；
放射性核種、即ちα粒子若しくはβ粒子、又はγ線の１つ以上の同時放出を伴って崩壊する、元素の不安定同位体。例えばヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５並びにアスタチン２１３。キレート剤を用いて、これらの放射性核種のＴＣＲ又はその多量体への会合を促進してもよい；
スーパー抗原及びその突然変異体；
ペプチド－ＨＬＡ複合体であって、上記ペプチドが一般的なヒト病原体、例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来である、ペプチド－ＨＬＡ複合体；
異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチド；
が含まれる。
【0094】
好ましいのは、免疫エフェクターと会合した（通常、任意の適切な立体配置でのα鎖若しくはβ鎖、又は両方のＮ末端又はＣ末端への融合による）本発明の可溶性特異的結合分子である。ＴＣＲのＮ末端は、免疫エフェクターポリペプチドのＣ末端に連結されてもよい。
【0095】
特に好ましい免疫エフェクターは、抗ＣＤ３抗体、又は上記抗ＣＤ３抗体の機能的断片若しくは変異体である。本明細書で使用される場合において、用語「抗体」は、こうした断片及び変異体を含む。抗ＣＤ３抗体の例には、限定されるわけではないが、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ－１、ＢＭＡ－０３１及び１２Ｆ６が含まれる。本明細書に記載される組成物及び方法において使用するために適した抗体断片及び変異体／類似体には、ミニボディ、ディアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｄｓＦｖ及びｓｃＦｖ断片が含まれる。抗体という用語に含まれる更なる例には、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）（ラクダ科（camelid）（例えばラクダ又はラマ（llama））抗体由来の合成一本鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む、Ablynx（ベルギー）によって市販される構築物）、親和性成熟一本鎖免疫グロブリン可変重鎖ドメイン若しくは免疫グロブリン可変軽鎖ドメインを含むＤｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Domantis、ベルギー）、及び抗体様結合特性を示す別のタンパク質足場、例えば操作プロテインＡ足場を含むＡｆｆｉｂｏｄｙ（Affibody、スウェーデン）、又は操作アンチカリンを含むＡｎｔｉｃａｌｉｎ（Pieris、ドイツ）、又は設計されたアンキリンリピートタンパク質を含むＤＡＲＰｉｎ（Molecular Partners、スイス）が含まれる。
【0096】
融合分子の好ましい配置の例には、国際公開第２０１０１３３８２８号、国際公開第２０１９０１２１３８号及び国際公開第２０１９０１２１４１号に記載されるものが含まれる。
【0097】
本発明の特異的結合分子は、
α鎖可変ドメイン及び抗体の可変ドメインの第１の結合領域を含む第１のポリペプチド鎖と、
β鎖可変ドメイン及び上記抗体の可変ドメインの第２の結合領域を含む第２のポリペプチド鎖と、
を含み得て、
それぞれのポリペプチド鎖は、特異的結合分子が、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体及び該抗体の抗原に同時に結合可能であるように会合する。
α鎖可変ドメイン及び抗体の可変ドメインの第１の結合領域を含む第１のポリペプチド鎖と、
β鎖可変ドメイン及び上記抗体の可変ドメインの第２の結合領域を含む第２のポリペプチド鎖と、
を含み得て、
それぞれのポリペプチド鎖は、特異的結合分子が、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体及び該抗体の抗原に同時に結合可能であるように会合する。
【0098】
本明細書にはまた、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖を含む分子群より選択される二重特異性ポリペプチド分子であって、第１のポリペプチド鎖が、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第１の結合領域（ＶＤ１）と、
ＭＨＣ会合ペプチドエピトープに特異的に結合するＴＣＲの可変ドメインの第１の結合領域（ＶＲ１）と、
上記ドメインを連結する第１のリンカー（ＬＩＮＫ１）と、
を含み、
第２のポリペプチド鎖が、ＭＨＣ会合ペプチドエピトープに特異的に結合するＴＣＲの可変ドメインの第２の結合領域（ＶＲ２）と、
ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第２の結合領域（ＶＤ２）と、
上記ドメインを連結する第２のリンカー（ＬＩＮＫ２）と、
を含み、
上記第１の結合領域（ＶＤ１）及び上記第２の結合領域（ＶＤ２）が会合して、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に結合する第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）を形成し、
上記第１の結合領域（ＶＲ１）及び上記第２の結合領域（ＶＲ２）が会合して、上記ＭＨＣ会合ペプチドエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）を形成し、
上記２つのポリペプチド鎖が、ヒトＩｇＧヒンジドメイン及び／又はヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその二量体化部分に融合し、かつ、
上記２つのポリペプチド鎖が、上記ヒンジドメイン及び／又はＦｃドメインの間の共有及び／又は非共有結合によって連結され、かつ、
上記二重特異性ポリペプチド分子が、細胞表面分子及びＭＨＣ会合ペプチドエピトープに同時に結合可能であり、二重特異性ポリペプチド分子に関して、２つのポリペプチド鎖中の結合領域の順序が、ＶＤ１－ＶＲ１及びＶＲ２－ＶＤ２若しくはＶＤ１－ＶＲ２及びＶＲ１－ＶＤ２、又はＶＤ２－ＶＲ１及びＶＲ２－ＶＤ１若しくはＶＤ２－ＶＲ２及びＶＲ１－ＶＤ１より選択され、該ドメインがＬＩＮＫ１又はＬＩＮＫ２のいずれかによって連結され、ＭＨＣ会合ペプチドエピトープがＲＬＰＡＫＡＰＬＬであり、ＭＨＣがＨＬＡ－Ｅ＊０１である、
二重特異性ポリペプチド分子も提供される。
ＭＨＣ会合ペプチドエピトープに特異的に結合するＴＣＲの可変ドメインの第１の結合領域（ＶＲ１）と、
上記ドメインを連結する第１のリンカー（ＬＩＮＫ１）と、
を含み、
第２のポリペプチド鎖が、ＭＨＣ会合ペプチドエピトープに特異的に結合するＴＣＲの可変ドメインの第２の結合領域（ＶＲ２）と、
ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に特異的に結合する抗体の可変ドメインの第２の結合領域（ＶＤ２）と、
上記ドメインを連結する第２のリンカー（ＬＩＮＫ２）と、
を含み、
上記第１の結合領域（ＶＤ１）及び上記第２の結合領域（ＶＤ２）が会合して、ヒト免疫エフェクター細胞の細胞表面抗原に結合する第１の結合部位（ＶＤ１）（ＶＤ２）を形成し、
上記第１の結合領域（ＶＲ１）及び上記第２の結合領域（ＶＲ２）が会合して、上記ＭＨＣ会合ペプチドエピトープに結合する第２の結合部位（ＶＲ１）（ＶＲ２）を形成し、
上記２つのポリペプチド鎖が、ヒトＩｇＧヒンジドメイン及び／又はヒトＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその二量体化部分に融合し、かつ、
上記２つのポリペプチド鎖が、上記ヒンジドメイン及び／又はＦｃドメインの間の共有及び／又は非共有結合によって連結され、かつ、
上記二重特異性ポリペプチド分子が、細胞表面分子及びＭＨＣ会合ペプチドエピトープに同時に結合可能であり、二重特異性ポリペプチド分子に関して、２つのポリペプチド鎖中の結合領域の順序が、ＶＤ１－ＶＲ１及びＶＲ２－ＶＤ２若しくはＶＤ１－ＶＲ２及びＶＲ１－ＶＤ２、又はＶＤ２－ＶＲ１及びＶＲ２－ＶＤ１若しくはＶＤ２－ＶＲ２及びＶＲ１－ＶＤ１より選択され、該ドメインがＬＩＮＫ１又はＬＩＮＫ２のいずれかによって連結され、ＭＨＣ会合ペプチドエピトープがＲＬＰＡＫＡＰＬＬであり、ＭＨＣがＨＬＡ－Ｅ＊０１である、
二重特異性ポリペプチド分子も提供される。
【0099】
特異的結合分子及び抗ＣＤ３抗体の連結は、共有又は非共有付着を通じてであり得る。共有付着は、直接、又はリンカー配列を通じて間接的であり得る。リンカー配列は、柔軟性を制限する可能性がある大きな側鎖を持たないグリシン、アラニン及びセリン等のアミノ酸で、主に構成されている点で、通常、柔軟性である。あるいは、より大きな硬直性を持つリンカーが望ましい可能性もある。リンカー配列の使用可能な又は最適な長さは、容易に決定され得る。しばしば、リンカー配列は、長さ約１２未満、例えば１０未満、又は２～１０アミノ酸であろう。本発明のマルチドメイン結合分子に用いられ得る適切なリンカーの例には、限定されるわけではないが、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１７）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１８）、ＧＳＧＧＧＰ（配列番号１９）、ＧＧＥＰＳ（配列番号２０）、ＧＧＥＧＧＧＰ（配列番号２１）、及びＧＧＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳ（配列番号２２）（国際公開第２０１０／１３３８２８号に記載される通り）並びにＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号２３）が含まれる。更なるリンカーには、以下の配列モチーフ：ＧＧＧＳ（配列番号２４）、ＴＶＬＲＴ（配列番号２５）、ＴＶＳＳＡＳ（配列番号２６）及びＴＶＬＳＳＡＳ（配列番号２７）の１つ以上を有する配列が含まれ得る。
【0100】
本発明の抗ＣＤ３特異的結合分子融合構築物の特定の実施の形態には、α鎖が配列番号６及び配列番号７のアミノ酸配列を含むＴＣＲ可変ドメインで構成され、及び／又はβ鎖が配列番号８及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＴＣＲ可変ドメインで構成される、α鎖及びβ鎖対形成が含まれる。上記α鎖及びβ鎖は、非天然ジスルフィド結合を含む定常領域を更に含み得る。α鎖の定常ドメインから８つのアミノ酸が切除され得る。α鎖及び／又はβ鎖のＮ末端又はＣ末端は、配列番号１５～配列番号２７より選択されるリンカーを通じて、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ抗体断片に融合され得る。こうした抗ＣＤ３特異的結合分子融合構築物の或る特定の好ましい実施の形態は、添付の図４に提供される。
【0101】
【表1】
【0102】
抗ＣＤ３に連結された好ましい特異的結合分子は、配列番号１３及び配列番号１４を含む。
【0103】
やはり本発明の範囲内に含まれるのは、上記抗ＣＤ３－ＴＣＲ融合構築物の機能的変異体（表現型的にサイレントな変異体としても知られる）である。上記機能的変異体は、好ましくは、参照配列に対して少なくとも９０％の同一性、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するが、にもかかわらず機能的に同等である。
【0104】
更なる態様において、本発明は、本発明の特異的結合分子又は特異的結合分子抗ＣＤ３融合体をコードする核酸を提供する。幾つかの実施の形態において、核酸はｃＤＮＡである。幾つかの実施の形態において、核酸はｍＲＮＡ、例えばｍＲＮＡにコードされる二重特異性分子であり得る（Stadler et al., Nat Med. 2017 Jul;23(7):815-817）。幾つかの実施の形態において、本発明は、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。幾つかの実施の形態において、本発明は、本発明の特異的結合分子のβ鎖可変ドメインをコードする配列を含む核酸を提供する。核酸は非天然存在及び／又は精製及び／又は操作核酸であり得る。核酸配列は、利用する発現系に従って、コドン最適化されていてもよい。当業者に知られるように、発現系には、大腸菌（E. coli）等の細菌細胞、若しくは酵母細胞、若しくは哺乳動物細胞、若しくは昆虫細胞が含まれ得て、又はこれらは細胞不含発現系であり得る。幾つかの実施の形態において、分子はｍＲＮＡにコードされる二重特異性抗体であり得る。
【0105】
別の態様において、本発明は、本発明の核酸を含むベクターを提供する。好ましくは、ベクターはＴＣＲ発現ベクターである。適切なＴＣＲ発現ベクターには、例えば、γ－レトロウイルスベクター、又はより好ましくはレンチウイルスベクターが含まれる。更なる詳細は、Zhang 2012及び該文献中の参考文献に見られ得る（Zhang et al,. Adv Drug Deliv Rev. 2012 Jun 1; 64(8): 756-762）。
【0106】
本発明はまた、本発明のベクター、好ましくはＴＣＲ発現ベクターを宿す細胞も提供する。適切な細胞には、哺乳動物細胞、好ましくは免疫細胞、更により好ましくはＴ細胞が含まれる。ベクターは、単一オープンリーディングフレーム、又は２つの別個のオープンリーディングフレームで、それぞれ、α鎖及びβ鎖をコードする本発明の核酸を含み得る。別の態様は、本発明の特異的結合分子のα鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、及び本発明の特異的結合分子のβ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクターを宿す細胞を提供する。こうした細胞は、養子療法に特に有用である。本発明の細胞は、単離及び／又は組換え及び／又は非天然存在及び／又は操作細胞であり得る。
【0107】
本発明の特異的結合分子は、養子療法に有用性を有するため、本発明には、本発明の特異的結合分子を提示する非天然存在及び／又は精製及び／又は操作細胞、特にＴ細胞が含まれる。本発明はまた、本発明の特異的結合分子を提示するＴ細胞の拡大集団も提供する。本発明の特異的結合分子をコードする核酸（例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ）でＴ細胞を形質移入するために適した幾つかの方法がある（例えばRobbins et al., (2008) J Immunol. 180: 6116-6131を参照されたい）。本発明の特異的結合分子を発現するＴ細胞は、ＴＢ感染の養子療法に基づく治療において使用するために適切であろう。当業者に知られるであろうように、養子療法を実行し得る幾つかの適切な方法がある（例えば、Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4)を参照されたい）。
【0108】
当該技術分野に既知であるように、本発明の特異的結合分子を含むものを含む、タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ産生は、翻訳後修飾を生じ得る。グリコシル化はこうした修飾の１つであり、ポリペプチド鎖中の定義されたアミノ酸へのオリゴ糖部分の共有結合を含む。例えば、アスパラギン残基、又はセリン／スレオニン残基は、オリゴ糖付着のための既知の位置である。特定のタンパク質のグリコシル化状態は、タンパク質配列、タンパク質コンホメーション及び或る特定の酵素の利用可能性を含む、幾つかの要因に応じる。さらに、グリコシル化状態（即ちオリゴ糖タイプ、共有結合及び付着総数）は、タンパク質機能に影響を及ぼし得る。したがって、組換えタンパク質を産生する際、グリコシル化の制御がしばしば望ましい。グリコシル化制御は、抗体に基づく療法剤を改善するために用いられてきている（Jefferis et al., (2009) Nat Rev Drug Discov Mar;8(3):226-34.）。本発明の特異的結合分子に関して、グリコシル化は、例えば特定の細胞株（限定されるわけではないが、哺乳動物細胞株、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞を含む）を用いることによって、又は化学修飾によって、制御され得る。グリコシル化は薬物動態を改善し得て、免疫原性を減少させ得て、かつ天然ヒトタンパク質をより緊密に模倣し得るため、こうした修飾が望ましい可能性もある（Sinclair and Elliott, (2005) Pharm Sci.Aug; 94(8):1626-35）。幾つかの場合、翻訳後修飾を制御し及び／又は修飾するため、突然変異を導入してもよい。
【0109】
本発明の特異的結合分子（好ましくは、検出可能標識若しくは療法剤と会合するか、又は形質移入されたＴ細胞上に発現される）を患者に投与するため、本発明の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、発現ベクター又は細胞は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体又は賦形剤と一緒に、無菌医薬組成物の一部として提供され得る。この医薬組成物は、任意の適切な型（患者に該組成物を投与する所望の方法に応じる）であり得る。該組成物は、単位投薬型で提供され得て、一般的に、密封容器中で提供され、キットの一部として提供され得る。こうしたキットには、通常（必ずしもではないが）、使用のための説明書が含まれる。キットには、複数の上記単位投薬型が含まれ得る。
【0110】
医薬組成物は、任意の適切な経路、例えば非経口（皮下、筋内、クモ膜下腔内又は静脈内を含む）、経腸（経口又は直腸を含む）、吸入又は鼻内経路による投与のために適応し得る。こうした組成物は、医薬業に知られる任意の方法によって、例えば活性成分を無菌条件下で担体（複数の場合もある）又は賦形剤（複数の場合もある）と混合することによって調製され得る。
【0111】
本発明の物質の投薬量は、治療しようとする疾患又は障害、治療しようとする個体の年齢及び状態等に応じて、広い制限間で多様であり得て、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子に適切な用量範囲は、２５ｎｇ／ｋｇ～５０μｇ／ｋｇ又は１μｇ～１ｇの範囲であり得る。医師は、使用されるべき適切な投薬量を最終的に決定するであろう。適切な投薬措置の例は、国際公開第２０１７２０８０１８号に提供される。
【0112】
本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、医薬組成物、ベクター、核酸及び細胞は、実質的に純粋な型で、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％純粋で提供され得る。
【0113】
本発明にやはり提供されるのは、
好ましくはＴＢ感染を治療する方法において使用するための、医薬品中の使用のための本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞、
ＴＢ感染を治療するための薬剤製造における本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞の使用、
ＴＢ感染を治療する方法であって、治療の必要がある被験体に、療法的有効量の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子を投与する工程を含む、方法、
本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を含む、ヒト被験体に投与するための注射可能配合物、
である。
好ましくはＴＢ感染を治療する方法において使用するための、医薬品中の使用のための本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞、
ＴＢ感染を治療するための薬剤製造における本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞の使用、
ＴＢ感染を治療する方法であって、治療の必要がある被験体に、療法的有効量の特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子を投与する工程を含む、方法、
本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞を含む、ヒト被験体に投与するための注射可能配合物、
である。
【0114】
本発明の特異的結合分子、特異的結合分子－抗ＣＤ３融合分子、核酸、医薬組成物又は細胞は、注射、例えば静脈内、皮下、又は直接腫瘍内注射によって投与され得る。
【0115】
治療法には、別個に、組み合わせて、又は連続して、ＴＢ感染の治療に適したものを含む１つ以上の更なる抗細菌剤を投与する工程が更に含まれ得る。
【0116】
本発明の各態様の好ましい特徴は、変更すべきところは変更して、他の態様各々に関しても当てはまる。本明細書に言及される先行技術文書は、法律によって許容される最高の度合いまで、引用することにより本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【0117】
【図1】ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合する野生型可溶性ＴＣＲのα鎖及びβ鎖のアミノ酸配列を示す図である。ＣＤＲ配列を下線で示す。
【図2】ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体を認識する野生型可溶性のＴＣＲに関するＢｉａｃｏｒｅ結合データを示す図である。
【図3】（Ａ）突然変異ＴＣＲ α、及び（Ｂ）β可変ドメインのアミノ酸配列例を示す図である。ＣＤＲを下線で示し、野生型配列に対する突然変異を太字で示す。
【図4】突然変異ＴＣＲ可変ドメインを取り込むＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質のアミノ酸配列例を示す図である。
【図5】ＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドでパルス処理した後、かつＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体の存在下での、経時的なＫ５６２細胞上のＨＬＡ－Ｅの表面レベルを示す図である。
【図6】ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体及び（Ａ）ＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドパルス処理ＴＨＰ１－ＫＯ細胞又は（Ｂ）ｉｎｈＡ遺伝子で形質導入された細胞のいずれかの存在下で、インターフェロンγ放出によって決定されるような、Ｔ細胞の強力な活性化を示す図である。
【図7】ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体及び（Ａ）多様なＨＬＡアレル由来のリーダーペプチド、ある範囲の相同ペプチド、及び他の微生物由来の既知のＨＬＡ－Ｅペプチドでパルス処理した細胞又は（Ｂ）多様なＨＬＡ型を発現する抗原陰性癌細胞株のパネルのいずれかの存在下で、インターフェロンγ放出によって決定されるような、Ｔ細胞活性化の欠如を示す図である。
【図8】ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体の存在下でのＴ細胞による、（Ａ）カスパーゼ３／７放出によって決定されるような、抗原形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、又は（Ｂ）アデニル酸キナーゼ放出（相対発光として示される）によって決定されるような、Ｍｔｂ感染単球の特異的殺細胞を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0118】
本発明は以下の限定されない実施例に更に記載される。
【実施例】
【0119】
実施例１：全長ｉｎｈＡ遺伝子で形質導入された細胞による、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体の直接同定及び定量化
マイコバクテリアタンパク質エノイルレダクターゼ（ｉｎｈＡ）由来のペプチドＲＬＰＡＫＡＰＬＬは、全Ｍｔｂゲノムに渡って、ＨＬＡ－Ｅに対する最強の予測結合親和性を有する。このペプチドは以前、潜在性Ｍｔｂ感染ドナーにおいて、Ｔ細胞反応を誘発することが示されてきており（非特許文献４）、このペプチドをターゲティングするＴ細胞クローンは、Ｍｔｂ感染細胞を殺すことが示されてきている（非特許文献５、非特許文献６）。ＲＬＰＡＫＡＰＬＬがプロセシングされて、細胞内のＨＬＡ－Ｅ上に装填され得るかどうかを調べるため、恒常的にＨＬＡ－Ｅを発現している２つのリンパ細胞株において、全長ｉｎｈＡ遺伝子を異所的に発現させた。
マイコバクテリアタンパク質エノイルレダクターゼ（ｉｎｈＡ）由来のペプチドＲＬＰＡＫＡＰＬＬは、全Ｍｔｂゲノムに渡って、ＨＬＡ－Ｅに対する最強の予測結合親和性を有する。このペプチドは以前、潜在性Ｍｔｂ感染ドナーにおいて、Ｔ細胞反応を誘発することが示されてきており（非特許文献４）、このペプチドをターゲティングするＴ細胞クローンは、Ｍｔｂ感染細胞を殺すことが示されてきている（非特許文献５、非特許文献６）。ＲＬＰＡＫＡＰＬＬがプロセシングされて、細胞内のＨＬＡ－Ｅ上に装填され得るかどうかを調べるため、恒常的にＨＬＡ－Ｅを発現している２つのリンパ細胞株において、全長ｉｎｈＡ遺伝子を異所的に発現させた。
【0120】
方法
ｎｅｔＭＨＣｐａｎ４．０ペプチド－ＨＬＡ結合予測アルゴリズムを用いて、ペプチド結合親和性を評価した（Jurtz et al., J Immunol 199, 3360-3368 (2017)）。免疫精製及び定量化のため、レンチウイルス形質導入を用いて、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／β２Ｍ（Ａ２Ｂ２Ｍ）及びｉｎｈＡを、恒常的にＨＬＡ－Ｅを発現するＴＨＰ１及びＵ９３７細胞（Ｕ９３７－ＨＬＡ－Ｅヘテロ接合、ＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３ヘテロ接合）において、異所的に発現させた。供給業者の指示に従って細胞を培養し、採取し、分析まで－８０℃で保存した。連続抗ＨＬＡ－Ｅ抗体を用いた免疫親和性によってＨＬＡ複合体を精製した。簡潔には、非イオン性界面活性剤ＮＰ－４０を含有する緩衝剤中で細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去し、プロテインＡ（Ａ＊０２）又はプロテイン（Ｅ）－セファロース上に固定されたＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体及びＨＬＡ－Ｅ特異的抗体を含有する樹脂上に上清を通過させた。カラムを洗浄し、０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に複合体を溶出させた。免疫精製物質を脱塩し、真空遠心分離によって体積を減少させた後、０．１％ＴＦＡ、５％アセトニトリル中で再構成して、ＬＣ－ＰＲＭ－ＭＳによって分析した。ペプチドをＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００トラップカラム（１００μｍ×２０ｍｍ、ThermoFisher）上に装填し、Ｅａｓｙｓｐｒａｙカラム（７５μｍ×５００ｍｍ、ThermoFisher）を用いて分離した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（ThermoFisher）上、以下の設定を用いて、データを獲得した。四重極単離（２００ｍ／ｚ～１２００ｍ／ｚ範囲）後、フルＭＳ１スキャンを１２０Ｋ解像度（ＡＧＣ ３Ｅ５、５０ｍｓ）で記録した。標的ペプチドの前駆体イオンを、ｔＭＳによるＭＳ２のため選択した（ターゲティング化ＭＳ）。四重極単離を１．２Ｄａに、ＨＣＤフラグメント化を２８ＮＣＥにセットし、ＭＳ２スペクトルを６０Ｋ解像度で、Ｏｒｂｉｔｒａｐに記録した（ＡＧＣ １Ｅ６、１２０ｍｓ）。方法には、予期されるペプチド溶出時間周囲に配置した１５分間のウィンドウを伴い、開始／終了時間を含めた。安定同位体標識（ＳＩＬ）ペプチド（JPT technologies）を、分析直前に、１００フェントモルの正確なモル量で、各試料内に導入した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅソフトウェアを用いて、データを分析した。標的ペプチドの定量的概算のため、天然及びＳＩＬペプチド種由来の３つのフラグメントイオンのＬＣ面積を、１０ｐｐｍ質量許容差で抽出した。以下の設定：ベースラインウィンドウ１５０、エリアノイズ係数１、ピークノイズ係数１を用いて、ピーク積分を可能にした。ＳＩＬ及び天然ペプチドの間の面積比を用いて、各フラグメントイオンに関して、天然ペプチドのモル量を計算した。３つのフラグメントイオンのモル量を平均し、細胞数に関して考慮した後、コピー数を計算した。
ｎｅｔＭＨＣｐａｎ４．０ペプチド－ＨＬＡ結合予測アルゴリズムを用いて、ペプチド結合親和性を評価した（Jurtz et al., J Immunol 199, 3360-3368 (2017)）。免疫精製及び定量化のため、レンチウイルス形質導入を用いて、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／β２Ｍ（Ａ２Ｂ２Ｍ）及びｉｎｈＡを、恒常的にＨＬＡ－Ｅを発現するＴＨＰ１及びＵ９３７細胞（Ｕ９３７－ＨＬＡ－Ｅヘテロ接合、ＴＨＰ１－ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３ヘテロ接合）において、異所的に発現させた。供給業者の指示に従って細胞を培養し、採取し、分析まで－８０℃で保存した。連続抗ＨＬＡ－Ｅ抗体を用いた免疫親和性によってＨＬＡ複合体を精製した。簡潔には、非イオン性界面活性剤ＮＰ－４０を含有する緩衝剤中で細胞を溶解し、遠心分離によって細胞破片を除去し、プロテインＡ（Ａ＊０２）又はプロテイン（Ｅ）－セファロース上に固定されたＨＬＡ－Ａ＊０２特異的抗体及びＨＬＡ－Ｅ特異的抗体を含有する樹脂上に上清を通過させた。カラムを洗浄し、０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中に複合体を溶出させた。免疫精製物質を脱塩し、真空遠心分離によって体積を減少させた後、０．１％ＴＦＡ、５％アセトニトリル中で再構成して、ＬＣ－ＰＲＭ－ＭＳによって分析した。ペプチドをＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ １００トラップカラム（１００μｍ×２０ｍｍ、ThermoFisher）上に装填し、Ｅａｓｙｓｐｒａｙカラム（７５μｍ×５００ｍｍ、ThermoFisher）を用いて分離した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計（ThermoFisher）上、以下の設定を用いて、データを獲得した。四重極単離（２００ｍ／ｚ～１２００ｍ／ｚ範囲）後、フルＭＳ１スキャンを１２０Ｋ解像度（ＡＧＣ ３Ｅ５、５０ｍｓ）で記録した。標的ペプチドの前駆体イオンを、ｔＭＳによるＭＳ２のため選択した（ターゲティング化ＭＳ）。四重極単離を１．２Ｄａに、ＨＣＤフラグメント化を２８ＮＣＥにセットし、ＭＳ２スペクトルを６０Ｋ解像度で、Ｏｒｂｉｔｒａｐに記録した（ＡＧＣ １Ｅ６、１２０ｍｓ）。方法には、予期されるペプチド溶出時間周囲に配置した１５分間のウィンドウを伴い、開始／終了時間を含めた。安定同位体標識（ＳＩＬ）ペプチド（JPT technologies）を、分析直前に、１００フェントモルの正確なモル量で、各試料内に導入した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅソフトウェアを用いて、データを分析した。標的ペプチドの定量的概算のため、天然及びＳＩＬペプチド種由来の３つのフラグメントイオンのＬＣ面積を、１０ｐｐｍ質量許容差で抽出した。以下の設定：ベースラインウィンドウ１５０、エリアノイズ係数１、ピークノイズ係数１を用いて、ピーク積分を可能にした。ＳＩＬ及び天然ペプチドの間の面積比を用いて、各フラグメントイオンに関して、天然ペプチドのモル量を計算した。３つのフラグメントイオンのモル量を平均し、細胞数に関して考慮した後、コピー数を計算した。
【0121】
結果
定量的プロテオミクスは、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１複合体が、細胞あたり２０コピー～５０コピーの間のコピー数で、両方の細胞株の表面上に存在し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレル上のＲＬＰＡＫＡＰＬＬ提示の証拠はほとんどないことを示した。両方の細胞株における、或る範囲のＨＬＡリーダー配列の同時定量化は、これらの既知のＨＬＡ－Ｅリガンドに匹敵するレベルで、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬが提示されることを示した。データを以下の表に要約する。
定量的プロテオミクスは、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１複合体が、細胞あたり２０コピー～５０コピーの間のコピー数で、両方の細胞株の表面上に存在し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１アレル上のＲＬＰＡＫＡＰＬＬ提示の証拠はほとんどないことを示した。両方の細胞株における、或る範囲のＨＬＡリーダー配列の同時定量化は、これらの既知のＨＬＡ－Ｅリガンドに匹敵するレベルで、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬが提示されることを示した。データを以下の表に要約する。
【0122】
【表2】
【0123】
これらのデータは、異所性に発現されたｉｎｈＡタンパク質の細胞プロセシングが、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１複合体を生じ、したがってＭｔｂ抗原で形質導入された細胞によるＨＬＡ－Ｅ上に提示されたＭｔｂ由来ペプチドの最初の直接的な同定及び定量化を示すことを確認した。これらのデータは、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドは細胞内で生成され、検出可能なコピー数でＨＬＡ－Ｅ分子によって提示されることを立証する。したがって、ペプチドＨＬＡ－Ｅ複合体は、普遍的なＴＣＲに基づく免疫療法の有望なターゲットである。
【0124】
実施例２：ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合する野生型ＴＣＲの同定
可溶性ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体を用いてパニングしたＴＣＲファージライブラリーから２つの野生型ＴＣＲを同定し、続いて可溶性ＴＣＲとして調製した。
可溶性ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体を用いてパニングしたＴＣＲファージライブラリーから２つの野生型ＴＣＲを同定し、続いて可溶性ＴＣＲとして調製した。
【0125】
方法
以前記載されるように（例えば国際公開第２０１５１３６０７２号を参照されたい）、ＴＣＲファージライブラリーを調製し、パニングした。続いて、α及びβ ＴＣＲ配列をクローニングし、以前記載されるように、可溶性αβヘテロ二量体として調製した（Boulter et al., Protein Eng 16, 707-711 (2003)及び国際公開第０３／０２０７６３号）。簡潔には、可溶性ＴＣＲのα細胞外領域及びβ細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を、標準法を用いて、発現プラスミド内に別個にクローニングし、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ）内に別個に形質転換した。発現のため、１％グリセロール（＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及び３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した自己誘導培地中、３７℃で２時間、細胞を増殖させた後、温度を３０℃に下げ、一晩インキュベーションした。採取した細胞ペレットをＴｒｉｔｏｎ溶解緩衝液タンパク質抽出試薬（Merck Millipore）で溶解した。封入体ペレットを遠心分離によって回収し、Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ）中で２回洗浄し、最後に界面活性剤不含緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ）中に再懸濁した。再フォールディングのため、封入体をまず混合し、可溶化／変性緩衝液（６Ｍグアニジン－塩酸、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴ）内で希釈した後、３７℃で３０分間インキュベーションした。さらに再フォールディング緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１、８００ｍＭ又は４００ｍＭ Ｌ－アルギニンＨＣＬ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、４Ｍ尿素、６．５ｍＭシステアミン塩酸及び１．９ｍＭシスタミン二塩酸）内で更に希釈することによって、再フォールディングを開始した。次いで、再フォールディングされた混合物を再フォールディング１Ｌあたり１０Ｌ Ｈ２Ｏに対して、５℃±３℃で１８時間～２０時間透析した。この後、透析緩衝液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１（１０Ｌ）で２回置換し、更に１５時間透析を続けた。次いで、透析混合物を、０．４５μｍセルロースフィルターを通じて濾過した。次いで、試料をＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱ陰イオン交換カラムに適用し、結合したタンパク質を、６カラム体積に渡って、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１中の０ｍＭ～５００ｍＭ ＮａＣｌの勾配で溶出した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってピーク分画を同定した後、プールし、濃縮する。次いで、濃縮試料を、ダルベッコのＰＢＳ緩衝液中であらかじめ平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラム（GE Healthcare）に適用する。ピーク分画をプールし、濃縮する。
以前記載されるように（例えば国際公開第２０１５１３６０７２号を参照されたい）、ＴＣＲファージライブラリーを調製し、パニングした。続いて、α及びβ ＴＣＲ配列をクローニングし、以前記載されるように、可溶性αβヘテロ二量体として調製した（Boulter et al., Protein Eng 16, 707-711 (2003)及び国際公開第０３／０２０７６３号）。簡潔には、可溶性ＴＣＲのα細胞外領域及びβ細胞外領域をコードするＤＮＡ配列を、標準法を用いて、発現プラスミド内に別個にクローニングし、大腸菌株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ）内に別個に形質転換した。発現のため、１％グリセロール（＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及び３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）を補充した自己誘導培地中、３７℃で２時間、細胞を増殖させた後、温度を３０℃に下げ、一晩インキュベーションした。採取した細胞ペレットをＴｒｉｔｏｎ溶解緩衝液タンパク質抽出試薬（Merck Millipore）で溶解した。封入体ペレットを遠心分離によって回収し、Ｔｒｉｔｏｎ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ）中で２回洗浄し、最後に界面活性剤不含緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ）中に再懸濁した。再フォールディングのため、封入体をまず混合し、可溶化／変性緩衝液（６Ｍグアニジン－塩酸、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＤＴＴ）内で希釈した後、３７℃で３０分間インキュベーションした。さらに再フォールディング緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１、８００ｍＭ又は４００ｍＭ Ｌ－アルギニンＨＣＬ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、４Ｍ尿素、６．５ｍＭシステアミン塩酸及び１．９ｍＭシスタミン二塩酸）内で更に希釈することによって、再フォールディングを開始した。次いで、再フォールディングされた混合物を再フォールディング１Ｌあたり１０Ｌ Ｈ２Ｏに対して、５℃±３℃で１８時間～２０時間透析した。この後、透析緩衝液を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１（１０Ｌ）で２回置換し、更に１５時間透析を続けた。次いで、透析混合物を、０．４５μｍセルロースフィルターを通じて濾過した。次いで、試料をＰＯＲＯＳ（商標）５０ＨＱ陰イオン交換カラムに適用し、結合したタンパク質を、６カラム体積に渡って、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．１中の０ｍＭ～５００ｍＭ ＮａＣｌの勾配で溶出した。ＳＤＳ ＰＡＧＥによってピーク分画を同定した後、プールし、濃縮する。次いで、濃縮試料を、ダルベッコのＰＢＳ緩衝液中であらかじめ平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬゲル濾過カラム（GE Healthcare）に適用する。ピーク分画をプールし、濃縮する。
【0126】
結果
可溶性ＷＴ ＴＣＲのアミノ酸配列を、配列番号２及び配列番号３（それぞれ、ＴＣＲ１α及びβ鎖）、並びに配列番号４及び配列番号５（それぞれ、ＴＣＲ２α及びβ鎖）に提供する（図１）。
可溶性ＷＴ ＴＣＲのアミノ酸配列を、配列番号２及び配列番号３（それぞれ、ＴＣＲ１α及びβ鎖）、並びに配列番号４及び配列番号５（それぞれ、ＴＣＲ２α及びβ鎖）に提供する（図１）。
【0127】
実施例３：可溶性ＷＴ ＴＣＲの生物物理特性及び特異性
上に同定される配列を含む可溶性ＷＴ ＴＣＲを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体、並びに多様な別のｐＭＨＣ複合体に対する結合に関して評価した。
上に同定される配列を含む可溶性ＷＴ ＴＣＲを、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体、並びに多様な別のｐＭＨＣ複合体に対する結合に関して評価した。
【0128】
方法
まず、可溶性ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１及びＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３ペプチド複合体を調製した。簡潔には、ＨＬＡ－Ｅ重鎖（膜貫通ドメインを含まず、Ｃ末端ビオチン化タグ、ＡｖｉＴａｇ（商標）配列ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥを取り込む）及びβ２ｍを、封入体として、大腸菌において別個に発現させ、続いて変性させた。重鎖、β２ｍ及び関心対象のペプチド（Peptide Protein Research Ltd）を、再フォールディング緩衝液（４００ｍＭ Ｌ－Ａｒｇ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３．１ｍＭシスタミン、７．２ｍＭシステアミン）中、３０：５：２の重鎖：β２ｍ：ペプチドの最終モル比で、一緒に再フォールディングさせた。次いで、以前記載されるように、陰イオン交換後、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて、可溶性再フォールディングｐＨＬＡを精製した（Garboczi, Proc Natl Acad Sci U S A 89, 3429-3433 (1992)）。ビオチン化複合体に関して、陰イオン交換後、ＳＥＣの前に、製造者の指示に従って（Ａｖｉｄｉｔｙ ＢｉｒＡ－５００キット）、（O'Callaghan C et al. Analytical biochemistry 266, 9-15 (1999)）に記載されるように、ビオチン－タンパク質リガーゼ（ＢｉｒＡ）で、複合体をその３’ビオチンタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）のビオチン化に供した。同様の方式で別のｐＭＨＣ複合体を調製した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標） Ｔ２００を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ｐＨＬＡ複合体への精製可溶性ＷＴ ＴＣＲの結合分析を行った。簡潔には、ストレプトアビジンカップリングＣＭ５センサーチップ上に、ビオチン化同族ｐＨＬＡを固定した。フローセル１に遊離ビオチンを単独で装填し、これは対照表面として作用した。Ｐ２０界面活性剤（０．００５％）を含有するダルベッコのＰＢＳ緩衝液（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）中、Ｔ２００に関して１０μＬ／分～３０μＬ／分の流速で、２５℃で全ての測定を実行した。定常状態親和性分析を用いて、結合プロファイルを決定した。２０μＭ～５０μＭの間の範囲の最高濃度でＴＣＲを注入した後、連続２倍希釈を用い、７回又は１１回注入した。ラングミュア結合を仮定してＫＤ値を計算し、１：１結合モデルを用いてデータを分析した（定常状態親和性分析用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．３．０）。
まず、可溶性ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１及びＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３ペプチド複合体を調製した。簡潔には、ＨＬＡ－Ｅ重鎖（膜貫通ドメインを含まず、Ｃ末端ビオチン化タグ、ＡｖｉＴａｇ（商標）配列ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥを取り込む）及びβ２ｍを、封入体として、大腸菌において別個に発現させ、続いて変性させた。重鎖、β２ｍ及び関心対象のペプチド（Peptide Protein Research Ltd）を、再フォールディング緩衝液（４００ｍＭ Ｌ－Ａｒｇ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．１、２ｍＭ ＥＤＴＡ、３．１ｍＭシスタミン、７．２ｍＭシステアミン）中、３０：５：２の重鎖：β２ｍ：ペプチドの最終モル比で、一緒に再フォールディングさせた。次いで、以前記載されるように、陰イオン交換後、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を用いて、可溶性再フォールディングｐＨＬＡを精製した（Garboczi, Proc Natl Acad Sci U S A 89, 3429-3433 (1992)）。ビオチン化複合体に関して、陰イオン交換後、ＳＥＣの前に、製造者の指示に従って（Ａｖｉｄｉｔｙ ＢｉｒＡ－５００キット）、（O'Callaghan C et al. Analytical biochemistry 266, 9-15 (1999)）に記載されるように、ビオチン－タンパク質リガーゼ（ＢｉｒＡ）で、複合体をその３’ビオチンタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）のビオチン化に供した。同様の方式で別のｐＭＨＣ複合体を調製した。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標） Ｔ２００を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ｐＨＬＡ複合体への精製可溶性ＷＴ ＴＣＲの結合分析を行った。簡潔には、ストレプトアビジンカップリングＣＭ５センサーチップ上に、ビオチン化同族ｐＨＬＡを固定した。フローセル１に遊離ビオチンを単独で装填し、これは対照表面として作用した。Ｐ２０界面活性剤（０．００５％）を含有するダルベッコのＰＢＳ緩衝液（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）中、Ｔ２００に関して１０μＬ／分～３０μＬ／分の流速で、２５℃で全ての測定を実行した。定常状態親和性分析を用いて、結合プロファイルを決定した。２０μＭ～５０μＭの間の範囲の最高濃度でＴＣＲを注入した後、連続２倍希釈を用い、７回又は１１回注入した。ラングミュア結合を仮定してＫＤ値を計算し、１：１結合モデルを用いてデータを分析した（定常状態親和性分析用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．３．０）。
【0129】
結果
可溶性ＷＴ ＴＣＲ及びＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３複合体の相互作用に関する結合特性を以下の表に示す。
可溶性ＷＴ ＴＣＲ及びＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３複合体の相互作用に関する結合特性を以下の表に示す。
【0130】
【表3】
【0131】
ＴＣＲ２は、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０１に対して匹敵する結合を示した。ＴＣＲ１及びＴＣＲ２の両方は、１５超の一般的に提示されるＨＬＡ－Ａ＊０２ペプチドのプール、ＨＬＡ－Ｅ＊０１によって提示される多様なリーダーペプチド、ＨＬＡ－Ａ＊０２と複合体形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチド、又はＨＬＡ－ＥオルソログＭａｍｕ－Ｅと複合体形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬを含む、別のｐＭＨＣ複合体の認識を全く示さなかった。図２は、ＴＣＲ２に関する代表的な結合データを示す。
【0132】
これらのデータは、２つの野生型ＴＣＲが標的ｐＭＨＣ複合体に強くかつ特異的に結合し、したがって、療法剤発展に特に有用であることを立証する。
【0133】
実施例４：ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合する高親和性可溶性ＴＣＲ及びＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質の生成
上記実施例中に記載される可溶性野生型ＴＣＲをテンプレートとして用いて、特異性を保持しながら、標的ペプチドＨＬＡ－Ｅ複合体に関する結合親和性増加を生じる突然変異を同定した。続いて、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ断片に融合した可溶性ＴＣＲを含む二重特異性融合タンパク質として、可溶性高親和性ＴＣＲを調製した。
上記実施例中に記載される可溶性野生型ＴＣＲをテンプレートとして用いて、特異性を保持しながら、標的ペプチドＨＬＡ－Ｅ複合体に関する結合親和性増加を生じる突然変異を同定した。続いて、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ断片に融合した可溶性ＴＣＲを含む二重特異性融合タンパク質として、可溶性高親和性ＴＣＲを調製した。
【0134】
方法
定方向（directed）分子進化及びファージディスプレイ選択を用いて、高親和性ＴＣＲを生成した（Li et al., Nat Biotechnol 23, 349-354 (2005)）。以前記載されるように（Liddy et al., Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nat Med 18, 980-987 (2012)）、二重特異性融合タンパク質を調製した。柔軟なリンカーを通じて、ヒト化ＣＤ３特異的ｓｃＦｖに、高親和性ＴＣＲ β鎖を融合させた。以前記載されるように、生じた融合タンパク質のα鎖及びβ鎖を封入体として大腸菌中で発現させ、再フォールディングさせ、精製した（Boulter et al., Protein Eng 16, 707-711 (2003)）。
定方向（directed）分子進化及びファージディスプレイ選択を用いて、高親和性ＴＣＲを生成した（Li et al., Nat Biotechnol 23, 349-354 (2005)）。以前記載されるように（Liddy et al., Monoclonal TCR-redirected tumor cell killing. Nat Med 18, 980-987 (2012)）、二重特異性融合タンパク質を調製した。柔軟なリンカーを通じて、ヒト化ＣＤ３特異的ｓｃＦｖに、高親和性ＴＣＲ β鎖を融合させた。以前記載されるように、生じた融合タンパク質のα鎖及びβ鎖を封入体として大腸菌中で発現させ、再フォールディングさせ、精製した（Boulter et al., Protein Eng 16, 707-711 (2003)）。
【0135】
ＢＩＡｃｏｒｅ （商標） ８Ｋ系を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、精製高親和性ＴＣＲ及び融合タンパク質の結合分析を行った。簡潔には、ビオチン化同族ｐＨＬＡをストレプトアビジンカップリングＣＭ５センサーチップ上に固定した。フローセル１に遊離ビオチンを単独で装填し、これは対照表面として作用した。Ｐ２０界面活性剤（０．００５％）を含有するダルベッコのＰＢＳ緩衝液（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）中、８Ｋに関して５０μＬ／分～６０μＬ／分の流速で、２５℃で全ての測定を実行した。単一サイクル動力学分析を用いて、結合プロファイルを決定した。単一サイクル動力学に関して、可溶性高親和性ＴＣＲ又は融合分子を、１００ｎＭ～１０００ｎＭの範囲の最高濃度で注入した後、連続２倍希釈を用い、４回注入した。ラングミュア結合を仮定してＫＤ値を計算し、１：１結合モデルを用いてデータを分析した（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖ２．０．１５．１２９３３）。解離期を単一指数減衰等式に適合させて、半減期の計算を可能にした。平衡定数ＫＤをｋｏｆｆ／ｋｏｎより計算した。
【0136】
結果
高親和性ＴＣＲ可変ドメインのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６及び配列番号７並びに配列番号８及び配列番号９に提供する（図３）。ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０～配列番号１４に提供する（図４）。ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体及びＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３複合体の間の相互作用に関する結合特性を以下の表に示す。
高親和性ＴＣＲ可変ドメインのアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号６及び配列番号７並びに配列番号８及び配列番号９に提供する（図３）。ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１０～配列番号１４に提供する（図４）。ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体及びＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３複合体の間の相互作用に関する結合特性を以下の表に示す。
【0137】
【表4】
【0138】
ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質は各々、ＨＬＡ－Ｅに結合したリーダーペプチドに関して、少なくとも１０００倍弱いＫＤを示した。
【0139】
これらのデータは、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質が、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に関して、ナノモル未満の親和性及び数時間の結合半減期を有し、高レベルの特異性を保持することを示す。
【0140】
実施例５：ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質は、細胞表面ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体を安定化する
細胞表面ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合しこれを安定化する能力に関して、パルスチェイス実験において、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）を検証した（challenged）。
細胞表面ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体に結合しこれを安定化する能力に関して、パルスチェイス実験において、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）を検証した（challenged）。
【0141】
方法
安定してＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３を発現するＫ５６２細胞を２６℃で２４時間培養した後、１０μｇ／ｍＬ ＲＬＰＡＫＡＰＬＬで、２６℃で１６時間パルス処理した。次いで、細胞を３７℃で２時間インキュベーションした後、０．０９μＭ ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体を含む又は含まないＲ１０に再懸濁し、３７℃に戻した。全てのインキュベーション工程を５％ＣＯ２で行った。１５分、２時間、及び４時間の間隔で試料を採取し、直ちに１回洗浄し、抗ヒトＨＬＡ－Ｅ－ＰＥ（３Ｄ１２、BioLegend、米国カリフォルニア州サンディエゴ）又は抗マウスＩｇＧ１－ＰＥ（ＭＯＰＣ－２１、BD Pharmingen、米国カリフォルニア州サンディエゴ）で、４℃で３０分間染色した。試料を２回洗浄し、次いでＳｏｎｙ ＳＨ８００Ｓ（Sony Biotechnology、米国カリフォルニア州）を用いて直ちに分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（FlowJoLLC、米国オレゴン州アッシュランド）で血球計数器ファイルを分析した。
安定してＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３を発現するＫ５６２細胞を２６℃で２４時間培養した後、１０μｇ／ｍＬ ＲＬＰＡＫＡＰＬＬで、２６℃で１６時間パルス処理した。次いで、細胞を３７℃で２時間インキュベーションした後、０．０９μＭ ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体を含む又は含まないＲ１０に再懸濁し、３７℃に戻した。全てのインキュベーション工程を５％ＣＯ２で行った。１５分、２時間、及び４時間の間隔で試料を採取し、直ちに１回洗浄し、抗ヒトＨＬＡ－Ｅ－ＰＥ（３Ｄ１２、BioLegend、米国カリフォルニア州サンディエゴ）又は抗マウスＩｇＧ１－ＰＥ（ＭＯＰＣ－２１、BD Pharmingen、米国カリフォルニア州サンディエゴ）で、４℃で３０分間染色した。試料を２回洗浄し、次いでＳｏｎｙ ＳＨ８００Ｓ（Sony Biotechnology、米国カリフォルニア州）を用いて直ちに分析し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（FlowJoLLC、米国オレゴン州アッシュランド）で血球計数器ファイルを分析した。
【0142】
結果
ｉｎｈＡ５３－６１ペプチドでパルス処理した後、経時的に、Ｋ５６２細胞上の表面ＨＬＡ－Ｅを監視すると、評価した全ての時点で、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体の存在下でＨＬＡ－Ｅレベルがより高いことが明らかになった（図５）。
ｉｎｈＡ５３－６１ペプチドでパルス処理した後、経時的に、Ｋ５６２細胞上の表面ＨＬＡ－Ｅを監視すると、評価した全ての時点で、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体の存在下でＨＬＡ－Ｅレベルがより高いことが明らかになった（図５）。
【0143】
これらのデータは、細胞表面ＲＬＰＡＫＡＰＬＬ ＨＬＡ－Ｅ複合体が、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質に結合されたのち、半減期の増加を示し、したがって、これらのＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質が、細胞表面上のそのターゲットに結合するだけでなく、その持続性をより長い時間維持する潜在能力があり、これが殺細胞増加につながり得ることを示唆する。
【0144】
実施例６：ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質は、標的細胞に対する強力なＴ細胞活性化を仲介する
一本鎖ＨＬＡ－Ｅ二量体を形質導入した、標的ペプチドパルス処理ＴＨＰ１－ＫＯ細胞（ＣＲＩＳＰＲでＢ２Ｍ及びＣＴＩＩＡを欠失させたもの）の存在下で、Ｔ細胞（ＰＢＭＣ）を特異的に活性化する能力に関して、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ及びａ５０ｂ４１）を試験した。インターフェロンγをＴ細胞活性化の測定値として用いた。
一本鎖ＨＬＡ－Ｅ二量体を形質導入した、標的ペプチドパルス処理ＴＨＰ１－ＫＯ細胞（ＣＲＩＳＰＲでＢ２Ｍ及びＣＴＩＩＡを欠失させたもの）の存在下で、Ｔ細胞（ＰＢＭＣ）を特異的に活性化する能力に関して、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ及びａ５０ｂ４１）を試験した。インターフェロンγをＴ細胞活性化の測定値として用いた。
【0145】
方法
製造者の推奨（BD Biosciences）に従って、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。簡潔には、標的細胞をウェルあたり５×１０４細胞で、３つ組でプレーティングし、ウェルあたり５×１０４細胞のＰＢＭＣとインキュベーションした。ペプチドパルス処理実験に関しては、標的細胞を多様な濃度のペプチド（Peptide Protein Research Ltd）と２時間インキュベーションし、徹底的に洗浄した後、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合分子と一緒にプレーティングした。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした後、ＩＦＮγ検出し、ＢＤ ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り装置（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓｅｒｉｅｓ ５分析装置、Cellular Technology Ltd、米国オハイオ州シェイカーハイツ）を用いてスポットを定量化した。
製造者の推奨（BD Biosciences）に従って、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。簡潔には、標的細胞をウェルあたり５×１０４細胞で、３つ組でプレーティングし、ウェルあたり５×１０４細胞のＰＢＭＣとインキュベーションした。ペプチドパルス処理実験に関しては、標的細胞を多様な濃度のペプチド（Peptide Protein Research Ltd）と２時間インキュベーションし、徹底的に洗浄した後、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合分子と一緒にプレーティングした。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベーションした後、ＩＦＮγ検出し、ＢＤ ＥＬＩＳｐｏｔ読み取り装置（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ Ｓｅｒｉｅｓ ５分析装置、Cellular Technology Ltd、米国オハイオ州シェイカーハイツ）を用いてスポットを定量化した。
【0146】
結果
いずれのアレルを発現するＴＨＰ－１－Ｅ細胞に対してもＩＦＮγ反応が観察され、Ｅ＊０１：０１に関しては１ｎＭ未満、Ｅ＊０１：０３に関しては２０ｐＭのＥＣ５０値であり（図６ａ）、非常に低いペプチド用量でも観察された。ａ５０ｂ４１に関してもまた、同様の反応が見られた。ｉｎｈＡ遺伝子で形質導入されたＴＨＰ－１－Ｅ、Ｕ９３７、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＡ５４９細胞（＋）に対してもまた反応が検出され、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）は、Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ｅと複合体形成した内因性に提示されるＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドに対して再指示することが立証された（図６ｂ）。対照的に、非形質導入細胞（－）は、融合タンパク質仲介性Ｔ細胞再指示の補助に失敗した。非結合性（ＮＢ）ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体を陰性対照として用いた。
いずれのアレルを発現するＴＨＰ－１－Ｅ細胞に対してもＩＦＮγ反応が観察され、Ｅ＊０１：０１に関しては１ｎＭ未満、Ｅ＊０１：０３に関しては２０ｐＭのＥＣ５０値であり（図６ａ）、非常に低いペプチド用量でも観察された。ａ５０ｂ４１に関してもまた、同様の反応が見られた。ｉｎｈＡ遺伝子で形質導入されたＴＨＰ－１－Ｅ、Ｕ９３７、ＨＥＫ２９３Ｔ及びＡ５４９細胞（＋）に対してもまた反応が検出され、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）は、Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ｅと複合体形成した内因性に提示されるＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドに対して再指示することが立証された（図６ｂ）。対照的に、非形質導入細胞（－）は、融合タンパク質仲介性Ｔ細胞再指示の補助に失敗した。非結合性（ＮＢ）ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体を陰性対照として用いた。
【0147】
これらのデータは、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質が、ペプチド発現標的細胞に対して、強力なＴ細胞活性化を仲介し得ることを示す。
【0148】
実施例７：ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質は、特異的Ｔ細胞活性化を仲介する
全てのＨＬＡアレル由来のリーダーペプチド、或る範囲の相同ペプチド、及び他の微生物由来の既知のＨＬＡ－Ｅペプチドでパルス処理した細胞に対するＴ細胞活性化を仲介する能力に関して、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）を試験した。さらに、多様なＨＬＡ型を発現する抗原陰性癌細胞株のパネルに対してもまた、Ｔ細胞活性化を評価した。
全てのＨＬＡアレル由来のリーダーペプチド、或る範囲の相同ペプチド、及び他の微生物由来の既知のＨＬＡ－Ｅペプチドでパルス処理した細胞に対するＴ細胞活性化を仲介する能力に関して、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）を試験した。さらに、多様なＨＬＡ型を発現する抗原陰性癌細胞株のパネルに対してもまた、Ｔ細胞活性化を評価した。
【0149】
方法
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを上述のように行った。
ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを上述のように行った。
【0150】
結果
試験した全ての代替ペプチドＨＬＡ複合体は、ＩＦＮγ放出の誘発に失敗し、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬに対するＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）の特異性を更に立証した（図７ａ）。さらに、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）は、多様なＨＬＡ型を発現する抗原陰性癌細胞株パネルと共培養されたＰＢＭＣによるＩＦＮγ放出を誘導しなかった（図７ｂ）。
試験した全ての代替ペプチドＨＬＡ複合体は、ＩＦＮγ放出の誘発に失敗し、ＲＬＰＡＫＡＰＬＬに対するＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）の特異性を更に立証した（図７ａ）。さらに、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）は、多様なＨＬＡ型を発現する抗原陰性癌細胞株パネルと共培養されたＰＢＭＣによるＩＦＮγ放出を誘導しなかった（図７ｂ）。
【0151】
総合すると、これらのデータは、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）が、ＨＬＡ－Ｅと複合体形成したＲＬＰＡＫＡＰＬＬペプチドを提示する細胞を特異的に認識することを立証する。
【0152】
実施例８：ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質は、抗原発現細胞及びＭｔｂ感染初代細胞の殺細胞を仲介する
カスパーゼ又はアデニル酸キナーゼ放出アッセイを用いて、細胞死を測定することによって、抗原形質導入細胞又はＭｔｂ感染初代ヒト単球のいずれか、及び自己ＰＢＭＣの共培養における有効性に関して、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）を試験した。
カスパーゼ又はアデニル酸キナーゼ放出アッセイを用いて、細胞死を測定することによって、抗原形質導入細胞又はＭｔｂ感染初代ヒト単球のいずれか、及び自己ＰＢＭＣの共培養における有効性に関して、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）を試験した。
【0153】
方法
ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生存細胞分析系（Essen Bioscience、英国ニューアーク）を用い、ｉｎｈＡ＋ ＨＥＫ２９３Ｔターゲット及び健康なドナー由来のＰＢＭＣを用いて殺細胞アッセイを行った。簡潔には、標的細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ色素（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド）で染色し、１０：１のエフェクター対ターゲット比（Ｅ：Ｔ）で、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体の濃度を増加させながら、平底９６ウェルプレート中に、ＰＢＭＣと一緒にプレーティングした。汎Ｔ細胞及びＮＫ細胞を用いた実験において、これらのエフェクターを、それぞれ、５：１及び１：１のＥ：Ｔで添加した。ＩｎｃｕＣｙｔｅカスパーゼ３／７緑色アポトーシスアッセイ試薬（Essen Bioscience）を添加してアポトーシスを追跡し、３時間ごとに画像を撮影しながら、３７℃／５％ＣＯ２でプレートを培養した。標的細胞集団を標識するために用いられたＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄプローブと重複する、カスパーゼ－３／７緑色試薬からのシグナルを同定する画像分析マスクを用いてアポトーシスを測定し、アポトーシス事象数／ｍｍ２を計算した。分析マスクには、サイズ及び偏心フィルター（eccentricity filter）が含まれ、分析からエフェクター細胞を排除した。ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ（アデニル酸キナーゼ放出を測定する）に関しては、４：１のエフェクター対ターゲット比の、ＰＢＭＣエフェクター細胞及びＴＨＰ－１ ＫＯ ｓｃＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３標的細胞で、９６ウェル丸底プレート中、共培養をセットアップした。ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）又はそれぞれのモノクローナルＴＣＲのいずれかの存在下で、異なる比のｉｎｈＡ陽性細胞及びｉｎｈＡ陰性標的細胞をＰＢＭＣと培養した。４８時間後、製造者のプロトコルに従って、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ非崩壊性細胞傷害性バイオアッセイキット（Lonza、スイス）を用いて上清を分析して、アデニル酸キナーゼを検出した。溶解パーセントの計算に関しては、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）１００％溶解試薬の添加後に１００％溶解対照を測定した。健康なドナーＰＢＭＣから初代単球を単離し、０．１の感染多重度でＭｔｂ株Ｈ３７Ｒｖに感染させた。細胞を細菌と一緒に４８時間インキュベーションし、洗浄し、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体を含み又は含まず、自己ＰＢＭＣとの共培養を確立した。上述のように、感染２４時間又は４８時間後、上清に対してＴｏｘｉＬｉｇｈｔを行った。
ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３生存細胞分析系（Essen Bioscience、英国ニューアーク）を用い、ｉｎｈＡ＋ ＨＥＫ２９３Ｔターゲット及び健康なドナー由来のＰＢＭＣを用いて殺細胞アッセイを行った。簡潔には、標的細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ色素（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド）で染色し、１０：１のエフェクター対ターゲット比（Ｅ：Ｔ）で、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体の濃度を増加させながら、平底９６ウェルプレート中に、ＰＢＭＣと一緒にプレーティングした。汎Ｔ細胞及びＮＫ細胞を用いた実験において、これらのエフェクターを、それぞれ、５：１及び１：１のＥ：Ｔで添加した。ＩｎｃｕＣｙｔｅカスパーゼ３／７緑色アポトーシスアッセイ試薬（Essen Bioscience）を添加してアポトーシスを追跡し、３時間ごとに画像を撮影しながら、３７℃／５％ＣＯ２でプレートを培養した。標的細胞集団を標識するために用いられたＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄプローブと重複する、カスパーゼ－３／７緑色試薬からのシグナルを同定する画像分析マスクを用いてアポトーシスを測定し、アポトーシス事象数／ｍｍ２を計算した。分析マスクには、サイズ及び偏心フィルター（eccentricity filter）が含まれ、分析からエフェクター細胞を排除した。ＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイ（アデニル酸キナーゼ放出を測定する）に関しては、４：１のエフェクター対ターゲット比の、ＰＢＭＣエフェクター細胞及びＴＨＰ－１ ＫＯ ｓｃＨＬＡ－Ｅ＊０１：０３標的細胞で、９６ウェル丸底プレート中、共培養をセットアップした。ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）又はそれぞれのモノクローナルＴＣＲのいずれかの存在下で、異なる比のｉｎｈＡ陽性細胞及びｉｎｈＡ陰性標的細胞をＰＢＭＣと培養した。４８時間後、製造者のプロトコルに従って、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ非崩壊性細胞傷害性バイオアッセイキット（Lonza、スイス）を用いて上清を分析して、アデニル酸キナーゼを検出した。溶解パーセントの計算に関しては、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）１００％溶解試薬の添加後に１００％溶解対照を測定した。健康なドナーＰＢＭＣから初代単球を単離し、０．１の感染多重度でＭｔｂ株Ｈ３７Ｒｖに感染させた。細胞を細菌と一緒に４８時間インキュベーションし、洗浄し、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合体を含み又は含まず、自己ＰＢＭＣとの共培養を確立した。上述のように、感染２４時間又は４８時間後、上清に対してＴｏｘｉＬｉｇｈｔを行った。
【0154】
結果
ＨＬＡ－Ｅ特異的ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）は、健康なドナーＰＢＭＣに再指示して、用量依存方式で、抗原形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を溶解させ、抗原陽性細胞の特異的殺細胞は、融合タンパク質が０．０３ｎＭ濃度まで下がっても観察された（図８ａ）。殺細胞は、共培養の１２時間から観察され、最高濃度のＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質であってさえ、抗原陰性細胞の細胞溶解は検出されなかった。Ｍｔｂ感染単球に関しては、共培養中のアデニル酸キナーゼの放出の有意な増加が検出され（図８ｂ）、これはＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）によって誘導された感染細胞に対する細胞性細胞溶解性反応に起因する。非結合性抗ＣＤ３ドメインを含有する修飾ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質で処理した同じ共培養で、特異的細胞死が欠如しており、観察されるＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質仲介性細胞傷害活性において、Ｔ細胞が主要な役割を果たすことが確認された。
ＨＬＡ－Ｅ特異的ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）は、健康なドナーＰＢＭＣに再指示して、用量依存方式で、抗原形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を溶解させ、抗原陽性細胞の特異的殺細胞は、融合タンパク質が０．０３ｎＭ濃度まで下がっても観察された（図８ａ）。殺細胞は、共培養の１２時間から観察され、最高濃度のＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質であってさえ、抗原陰性細胞の細胞溶解は検出されなかった。Ｍｔｂ感染単球に関しては、共培養中のアデニル酸キナーゼの放出の有意な増加が検出され（図８ｂ）、これはＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質（ａ４２ｂ２０Ｕ）によって誘導された感染細胞に対する細胞性細胞溶解性反応に起因する。非結合性抗ＣＤ３ドメインを含有する修飾ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質で処理した同じ共培養で、特異的細胞死が欠如しており、観察されるＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質仲介性細胞傷害活性において、Ｔ細胞が主要な役割を果たすことが確認された。
【0155】
これらのデータは、ＴＣＲ－抗ＣＤ３融合タンパク質が、抗原形質導入細胞及びＭｔｂ感染細胞の殺細胞を誘導する免疫反応を仲介し得ることを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】