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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-07-31
(54)【発明の名称】治療用タンパク質製剤の安定剤としての代替界面活性剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/00 20060101AFI20230724BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20230724BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230724BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230724BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230724BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20230724BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20230724BHJP
【ＦＩ】
A61K38/00
A61K45/00
A61K39/395 D
A61K39/395 C
A61P43/00 111
A61K47/68
A61K9/08
A61K47/34
A61K47/32
A61K47/26
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023501006
(86)(22)【出願日】2021-07-06
(85)【翻訳文提出日】2023-01-25
(86)【国際出願番号】 EP2021068563
(87)【国際公開番号】W WO2022008468
(87)【国際公開日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】20184503.9
(32)【優先日】2020-07-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ハイツ マーク
(72)【発明者】
【氏名】カーン タリク
(72)【発明者】
【氏名】キエンツ ハナ ソフィア
(72)【発明者】
【氏名】ミューラー クラウディア
(72)【発明者】
【氏名】パフ ジャニーナ ミシェル
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076CC29
4C076DD07E
4C076DD08E
4C076DD09E
4C076DD17E
4C076DD66E
4C076DD70E
4C076EE06E
4C076EE23E
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF04
4C076FF34
4C076FF63
4C084AA17
4C084MA17
4C084NA10
4C084ZC411
4C085AA13
4C085AA21
4C085EE01
4C085EE05
(57)【要約】
本発明は、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤と共に、本明細書で定義されるタンパク質、好ましくは抗体を含む、新規な液体医薬組成物に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質と、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤とを含む、液体医薬組成物。
【請求項2】
前記タンパク質が、抗体；またはイムノコンジュゲート；または抗体断片である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
薬学的に許容され得る賦形剤または担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記界面活性剤（複数種可）が、１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度；または０．００１ｍｇ／ｍＬ～０．０１ｍｇ／ｍＬ；もしくは０．０１ｍｇ／ｍＬ～０．１ｍｇ／ｍＬ；もしくは０．１ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
タンパク質をさらに含む液体医薬組成物の製造における、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤の使用。
【請求項6】
タンパク質を安定化するため、かつ、貯蔵時に前記タンパク質を含む液体医薬組成物中の、可視粒子の形成を防止するための、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、水性タンパク質製剤の分野、特に貯蔵時の可視粒子形成に対するそれらの安定化に関する。
本発明は、水性タンパク質製剤の分野、特に貯蔵時の可視粒子形成に対するそれらの安定化に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
１９８２年に最初に承認された遺伝子組換え生産バイオ医薬品であるＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）により、バイオ医薬品とも呼ばれる遺伝子組換え治療薬としての生物製剤のサクセスストーリーが始まった［１］。今日では、バイオ医薬品は主要な分野であり、ますます多くの製品が開発中であり、急速に成長している市場である［２］。タンパク質は両親媒性高分子であるため、界面に入り込み、そこに蓄積する傾向があり、そこで凝集する可能性がある。したがって、タンパク質は、製品の安定性を保証するために界面および界面応力から保護される必要がある。界面応力は、製品製造の多くの段階（例えば、凍結、解凍、濾過、圧送および充填操作）の間だけでなく、患者への出荷、保管、および投与の間にも起こり得る［３～５］。タンパク質凝集は、顕微鏡可視粒子および／または可視粒子の形成の増加、または薬効もしくは安全性の潜在的損失さえももたらし得る（すなわち、免疫原性反応の場合）。したがって、タンパク質の凝集を防止することによって製剤安定性を維持することが重要である［６～８］。タンパク質凝集を回避するための種々の凝集機構および緩和戦略が特定され、開示された［９］。一般的なアプローチの一つは、配合物に界面活性剤のような賦形剤を添加することである［１０］。界面活性剤は、界面での両親媒性タンパク質の吸着の抑制または低減をもたらす界面応力に対する強力な安定剤である。界面活性剤がどのようにタンパク質を保護するかに関する２つの機構モデル：すなわち（１）界面活性剤－タンパク質複合体の形成、および（２）界面での界面活性剤の優先的競合吸着の主要な機構が開示されている：［４，１１－１４］。
１９８２年に最初に承認された遺伝子組換え生産バイオ医薬品であるＨｕｍｕｌｉｎ（登録商標）により、バイオ医薬品とも呼ばれる遺伝子組換え治療薬としての生物製剤のサクセスストーリーが始まった［１］。今日では、バイオ医薬品は主要な分野であり、ますます多くの製品が開発中であり、急速に成長している市場である［２］。タンパク質は両親媒性高分子であるため、界面に入り込み、そこに蓄積する傾向があり、そこで凝集する可能性がある。したがって、タンパク質は、製品の安定性を保証するために界面および界面応力から保護される必要がある。界面応力は、製品製造の多くの段階（例えば、凍結、解凍、濾過、圧送および充填操作）の間だけでなく、患者への出荷、保管、および投与の間にも起こり得る［３～５］。タンパク質凝集は、顕微鏡可視粒子および／または可視粒子の形成の増加、または薬効もしくは安全性の潜在的損失さえももたらし得る（すなわち、免疫原性反応の場合）。したがって、タンパク質の凝集を防止することによって製剤安定性を維持することが重要である［６～８］。タンパク質凝集を回避するための種々の凝集機構および緩和戦略が特定され、開示された［９］。一般的なアプローチの一つは、配合物に界面活性剤のような賦形剤を添加することである［１０］。界面活性剤は、界面での両親媒性タンパク質の吸着の抑制または低減をもたらす界面応力に対する強力な安定剤である。界面活性剤がどのようにタンパク質を保護するかに関する２つの機構モデル：すなわち（１）界面活性剤－タンパク質複合体の形成、および（２）界面での界面活性剤の優先的競合吸着の主要な機構が開示されている：［４，１１－１４］。
【0003】
証明された安全性および有効性のために、市販されている生物製剤の製剤開発では、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）とも呼ばれる）またはトリブロックコポリマーポロキサマー１８８（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）またはＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（登録商標））の３種の非イオン性界面活性剤が使用されている。ポリソルベート（ＰＳ）は、撹拌および撹拌応力中に存在する空気－水界面［１５，１６］、およびプレフィルドシリンジ中に主に見られるシリコーン油－水界面の両方で優れた安定剤であることが知られている［１７～１９］が、凍結／解凍および凍結乾燥のような他の様々な応力中にも存在する［２０］。したがって、この種類の界面活性剤は、市販品で最も広く使用されている［２１，２２］。しかしながら、ＰＳはまた、主に３つまでの様々な脂肪酸側鎖を有するエトキシル化ソルビタン骨格からなる化学的不均質混合物であり、供給業者とロットとの間の実質的な材料の変動がもたらされる［２３～２５］。これとは別に、ポリソルベートは酸化または加水分解によって分解される可能性があり、これは、（１）タンパク質粒子形成を伴い得る界面応力に対する保護作用またはタンパク質の減少、および／または（２）タンパク質の安定性に対するＰＳ分解物の悪影響に起因する問題を引き起こし得る［２５～２７］。ＰＳ分解に関するさらなる研究により、宿主細胞タンパク質由来の不純物によって引き起こされる可能性のあるエステル結合の酵素的切断が報告された［２８，２９］。加水分解経路および酵素経路はいずれも、溶解度が限定されており、顕微鏡可視粒子および可視粒子を形成する傾向を有する遊離脂肪酸（ＦＦＡ）分解物を発生させ得る［２７，３０，３１］。
【0004】
対照的に、ポロキサマー１８８（Ｐｘ）は、より安定であると報告されており、より疎水性のポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）中間ブロックによって連結された２つの親水性ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）単位からなる［３２，３３］。Ｐｘ１８８のより親水性の性質（ＨＬＢ＞２４）は、ＰＳ８０（ＨＬＢ＝１５．０）と比較して、プレフィルドシリンジ中のシリコーン油水界面のＦｃ融合タンパク質吸着の増加に起因すると仮定された［１９］。Ｐｘ１８８はまた、バイアル中でタンパク質－シリコーン油粒子形成のリスクが高いことが報告されている。タンパク質の分子特性、シリコーン油の量、および製剤構成の他の特徴に応じて、特にプレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）で安定剤としてＰｘ１８８を使用するための課題が提示される可能性があり、これは、ＰＦＳに保存されたバイオ医薬品で検出される粒子の大部分を占める可能性がある潤滑剤としてシリコーン油を使用するためである［８，３４，３５］。
【0005】
最近、いくつかの新しい分子が代替界面活性剤として示唆されている。Ｍａｇｇｉｏは、アルキルサッカライドがインターフェロンおよびＰＳと同等のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を安定化し得ることを報告した［３６，３７］。さらに、アルキルサッカライドは酸化的分解に対して安定であることが報告された［３８］。しかしながら、他の界面活性剤と比較して、アルキルサッカライド界面活性剤の溶血活性はより高く、特にｎ－ドデシル－β－ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ）であるため、治療用途がより困難である［３９］。あまり顕著ではない溶血活性が、それらの合成トレハロース系界面活性剤についてＳｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎらから報告され、これはまた、振盪時にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に対する有望な安定化効果を示した［４０］。Ｋａｔｚらは、ＦＭ１００と呼ばれる新規なアミノ酸系界面活性剤を合成し、ポリソルベート２０および８０ならびにポロキサマー１８８と比較して、撹拌ストレスからＩｇＧおよびアバタセプトを保護する、上記界面活性剤の能力を試験した。ＦＭ１００が、撹拌によって誘発される凝集に対するモデルタンパク質の安定化を増加させながら、３種全ての他の界面活性剤よりも速く界面を安定化することがわかった［４１，４２］。それにもかかわらず、上記界面活性剤のいずれについても、生物製剤の臨床製剤または市販製剤における実施はまだ報告されていない。界面安定剤としてしばしば記載される他のクラスの非イオン性界面活性剤は、Ｂｒｉｊ（登録商標）のような第一級アルコールエトキシレートまたはＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ［４３，４４］のようなアルキルフェノールエトキシレートである。しかしながら、前述の分子のほとんどは、非経口使用について承認されていないか、または反復および一般的な非経口投与の安全性について懸念がある。
【0006】
したがって、薬学的に関連する界面に対する固有の安定性および吸着挙動に関して問題のない代替界面活性剤が必要とされている。特に、最適な製剤安定性を保証しながら製剤開発のためのツールボックスを拡張するために、非経口投与のための確立された界面活性剤の既存の問題を軽減するための新規／代替の界面活性剤を調査する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、治療用タンパク質製剤における安定剤としての新規使用のための既知の界面活性剤を提案することによってこの問題を解決する。より詳細には、本発明者らは、関連する界面で良好なタンパク質安定化効果を有し、酵素分解を起こしにくい必要がある界面活性剤の構造組成物の総合的評価を行った。本発明者らは、疎水性および親水性分子部分に関して広範な構造的多様性を有する界面活性剤について調査を行った（図１参照）。本発明者らはまた、酵素分解に対する安定性およびモデルｍＡｂの熱安定性に対するそれらの影響に関して界面活性剤を分析するためのスクリーニングツールを実施した。長期安定性への悪影響を排除するために、サンプルを５℃、２５℃で最大１８ヶ月間、ならびに４０℃で３ヶ月間保存し、可視粒子および顕微鏡可視粒子、濁度、色、ｐＨ、ｍＡｂモノマーおよびｍＡｂ電荷の変化に関して分析した。ＰＳ２０およびＰｘ１８８を使用する対照を並行して実行した。
【図面の簡単な説明】
【0008】
（図１）この研究において試験された全ての代替界面活性剤のグラフ表示。構造は、親油性部分に従って４つのサブグループ：ｉ）アシル－、ｉｉ）アルキル－、ｉｉｉ）ステロール－基およびｉｖ）他のサブグループに分類される。さらに、分子は、それらの親水性頭部基によって、ｉ）ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）系およびｉｉ）糖系界面活性剤として区別された。マークされた賦形剤（＊）は、ＦＤＡおよびＥＭＡ内のマークされた非経口製剤で使用されている［４５，４６］。
（図２）酵素消化前（－）および酵素消化後（－－－）の親水性非エステル化画分（１）および親油性エステル化画分（２）に分類されるＰＳ２０ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムの代表的図。エステル化画分のメインピーク（親油性）および遊離の非エステル化（親水性）ピークを統合して評価した。
（図３）界面活性剤の分解の度合い。それぞれ０．２５
および０．５
ｍｇ／ｍＬ ＰＣＬ／ＣＡＬＢリパーゼ混合物（１：１）または０．１ｍｍｏｌ水酸化ナトリウム
とのインキュベーションの前
後に、正規化されたエステル主ピーク面積を示す。＊＊エステル主ピークは観察されず、完全に分解した。
（図４Ａ）界面活性剤の存在下でのｍＡｂの熱的立体配座安定性。図は、Ｔｏｎ（Ａ）およびＴｍ１（Ｂ）の３つの個々の測定値の平均値を示す。着色値を有する界面活性剤は、界面活性剤を含まない対照製剤（－）と比較して、熱安定性特性なり低下した。
（図４Ｂ）図４Ａの説明を参照。
（図５Ａ）界面活性剤を含まない対照製剤
ならびに
０．１および
１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤を含む製剤についての顕微鏡可視粒子の累積数≧１０μｍ／ｍＬ。５℃（Ａ）および２５℃（Ｂ）における水平振盪後、５回の構成的凍結融解サイクル（Ｃ）および初期値
と比較した４０℃における１２週間の貯蔵後（Ｄ）のＳＶＰカウント。ＳＶＰが不連続なＹ軸の上部セグメントにある製剤は、ＵＳＰ＜７８７＞基準の最大６，０００個／容器≧１０μｍの粒子を超えていた。
（図５Ｂ）図５Ａの説明を参照。
（図５Ｃ）図５Ａの説明を参照。
（図５Ｄ）図５Ａの説明を参照。
（図６Ａ）異なるストレス条件および界面活性剤濃度
後のＨＭＷＳの増加（面積％）として与えられる可溶性凝集体レベル：（Ａ）５℃または（Ｂ）２５℃、２００ｒｐｍで７日間の水平方向振盪ストレス、（Ｃ）５回の構成的凍結融解サイクル、および（Ｄ）４０℃で１２週間の貯蔵。
（図６Ｂ）図６Ａの説明を参照。
（図６Ｃ）図６Ａの説明を参照。
（図６Ｄ）図６Ａの説明を参照。
（図７Ａ）初期時点でのｍＡｂ製剤
およびプラセボ
１ｍＬ当たり２μｍ以上の顕微鏡可視粒子の累積数。サンプルは、（Ａ）０．１ｍｇ／ｍＬまたは（Ｂ）１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤のいずれかを含有していた。
（図７Ｂ）図７Ａの説明を参照。
（図８Ａ）（Ａ）０．１ｍｇ／ｍＬまたは（Ｂ）１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤を含有する２５℃で保存した製剤のＳＥ－ＨＰＬＣによる代表的なモノマー損失。このグラフでは、主ピーク面積がかなり変化した配合物のみが示され
、標準的な界面活性剤ＰＳ２０
およびＰｘ１８８
と比較される。
（図８Ｂ）図８Ａの説明を参照。
（図９Ａ）ＩＥ－ＨＰＬＣによって測定されたｍＡｂのメインピーク面積の代表的な減少。製剤は、（Ａ）０．１ｍｇ／ｍＬまたは（Ｂ）１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤を含有し、５℃（白抜き記号）、２５℃（半黒塗り記号）および４０℃（黒塗り記号）で保存した。ここでは、メインピーク面積のかなりの減少を示したＣＳ２０（三角形）配合物のみを示し、標準的な界面活性剤ＰＳ２０（正方形）およびＰｘ１８８（円）と比較した。
（図９Ｂ）図９Ａの説明を参照。
（図１０）評価した界面活性剤の物理化学的および構造的特徴ならびにそれらの現在の適用分野。
（図１１－１）ｍＡｂ１のための界面活性剤およびアシル系界面活性剤を含有しない製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１１－２）図１１－１の説明を参照。
（図１１－３）図１１－１の説明を参照。
（図１１－４）図１１－１の説明を参照。
（図１２－１）ｍＡｂ１のためのアルキル系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．２のカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１２－２）図１２－１の説明を参照。
（図１２－３）図１２－１の説明を参照。
（図１２－４）図１２－１の説明を参照。
（図１３－１）ｍＡｂ１のステロール系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．２のカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１３－２）図１３－１の説明を参照。
（図１３－３）図１３－１の説明を参照。
（図１４－１）ｍＡｂ１のためのクラス「その他」の界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ目に見える粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１４－２）図１４－１の説明を参照。
（図１４－３）図１４－１の説明を参照。
（図１４－４）図１４－１の説明を参照。
（図１４－５）図１４－１の説明を参照。
（図１４－６）図１４－１の説明を参照。
（図１５－１）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のための界面活性剤およびアシル系界面活性剤を含有しない製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１５－２）図１５－１の説明を参照。
（図１６）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のためのアルキル系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１７）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のステロール系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１８－１）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のためのクラス「その他」の界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１８－２）図１８－１の説明を参照。
（図１８－３）図１８－１の説明を参照。
（図２）酵素消化前（－）および酵素消化後（－－－）の親水性非エステル化画分（１）および親油性エステル化画分（２）に分類されるＰＳ２０ＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラムの代表的図。エステル化画分のメインピーク（親油性）および遊離の非エステル化（親水性）ピークを統合して評価した。
（図３）界面活性剤の分解の度合い。それぞれ０．２５
（図４Ａ）界面活性剤の存在下でのｍＡｂの熱的立体配座安定性。図は、Ｔｏｎ（Ａ）およびＴｍ１（Ｂ）の３つの個々の測定値の平均値を示す。着色値を有する界面活性剤は、界面活性剤を含まない対照製剤（－）と比較して、熱安定性特性なり低下した。
（図４Ｂ）図４Ａの説明を参照。
（図５Ａ）界面活性剤を含まない対照製剤
（図５Ｂ）図５Ａの説明を参照。
（図５Ｃ）図５Ａの説明を参照。
（図５Ｄ）図５Ａの説明を参照。
（図６Ａ）異なるストレス条件および界面活性剤濃度
（図６Ｂ）図６Ａの説明を参照。
（図６Ｃ）図６Ａの説明を参照。
（図６Ｄ）図６Ａの説明を参照。
（図７Ａ）初期時点でのｍＡｂ製剤
（図７Ｂ）図７Ａの説明を参照。
（図８Ａ）（Ａ）０．１ｍｇ／ｍＬまたは（Ｂ）１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤を含有する２５℃で保存した製剤のＳＥ－ＨＰＬＣによる代表的なモノマー損失。このグラフでは、主ピーク面積がかなり変化した配合物のみが示され
（図８Ｂ）図８Ａの説明を参照。
（図９Ａ）ＩＥ－ＨＰＬＣによって測定されたｍＡｂのメインピーク面積の代表的な減少。製剤は、（Ａ）０．１ｍｇ／ｍＬまたは（Ｂ）１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤を含有し、５℃（白抜き記号）、２５℃（半黒塗り記号）および４０℃（黒塗り記号）で保存した。ここでは、メインピーク面積のかなりの減少を示したＣＳ２０（三角形）配合物のみを示し、標準的な界面活性剤ＰＳ２０（正方形）およびＰｘ１８８（円）と比較した。
（図９Ｂ）図９Ａの説明を参照。
（図１０）評価した界面活性剤の物理化学的および構造的特徴ならびにそれらの現在の適用分野。
（図１１－１）ｍＡｂ１のための界面活性剤およびアシル系界面活性剤を含有しない製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１１－２）図１１－１の説明を参照。
（図１１－３）図１１－１の説明を参照。
（図１１－４）図１１－１の説明を参照。
（図１２－１）ｍＡｂ１のためのアルキル系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．２のカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１２－２）図１２－１の説明を参照。
（図１２－３）図１２－１の説明を参照。
（図１２－４）図１２－１の説明を参照。
（図１３－１）ｍＡｂ１のステロール系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．２のカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１３－２）図１３－１の説明を参照。
（図１３－３）図１３－１の説明を参照。
（図１４－１）ｍＡｂ１のためのクラス「その他」の界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ目に見える粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。
ｄ値は、３つの個々の測定値の平均として与えられる（標準偏差＜０．４）。
ｅ振盪実験により、２～３個の分析されたバイアルの平均値が示される。２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液の表面張力は７３ｍＮ・ｍ－１である。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
ｎ．ａ．＝未分析。
（図１４－２）図１４－１の説明を参照。
（図１４－３）図１４－１の説明を参照。
（図１４－４）図１４－１の説明を参照。
（図１４－５）図１４－１の説明を参照。
（図１４－６）図１４－１の説明を参照。
（図１５－１）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のための界面活性剤およびアシル系界面活性剤を含有しない製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１５－２）図１５－１の説明を参照。
（図１６）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のためのアルキル系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１７）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のステロール系界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１８－１）ｍＡｂ２およびｍＡｂ３のためのクラス「その他」の界面活性剤を含有する製剤の製剤属性。
ａ可視粒子は、ｉ）０個の粒子、ｉｉ）１～５個の粒子、ｉｉｉ）６～１０個の粒子、およびｉｖ）１０個を超える粒子の４つの群に分類される。
ｂ濁度は、ｉ）０～３ＮＴＵ、ｉｉ）３超～６ＮＴＵ、ｉｉｉ）６超～１８ＮＴＵ、およびｉｖ）１８超ＮＴＵの４つの群に分類される。
ｃカラーは、Ｐｈ．Ｅｕｒのカラースケール値に従って、以下の４つのグループに分類される：２．２．２：ｉ）９～７、ｉｉ）６～５、ｉｉｉ）４～３およびｉｖ）２～１。クラスｉｉ、ｉｉｉ、ｉｖの結果を灰色でマークした。色が濃いほど、クラスが高くなり、ストレス試験の結果は悪くなる。
（図１８－２）図１８－１の説明を参照。
（図１８－３）図１８－１の説明を参照。
【発明を実施するための形態】
【0009】
発明の詳細な説明
非経口使用のために承認された界面活性剤は、以下の２つの構造的欠点を有する：（１）分子内のエステルリンカーは、目に見える遊離脂肪酸粒子の形成をもたらし得る宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）による酵素分解を起こしやすくする、または（２）電荷が、おそらく電荷－電荷相互作用によってｍＡｂの不安定化をもたらすと報告されている［５６］。したがって、これらの構造的構成要素を試験するために２つのスクリーニング手段を調査した。これにより、潜在的な代替界面活性剤の迅速な特定が可能になり、多数の可能な候補の評価が容易になった。
非経口使用のために承認された界面活性剤は、以下の２つの構造的欠点を有する：（１）分子内のエステルリンカーは、目に見える遊離脂肪酸粒子の形成をもたらし得る宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）による酵素分解を起こしやすくする、または（２）電荷が、おそらく電荷－電荷相互作用によってｍＡｂの不安定化をもたらすと報告されている［５６］。したがって、これらの構造的構成要素を試験するために２つのスクリーニング手段を調査した。これにより、潜在的な代替界面活性剤の迅速な特定が可能になり、多数の可能な候補の評価が容易になった。
【0010】
生物製剤市場は急速に成長しており、タンパク質、特に抗体の長期安定性を予測するためのスクリーニング手段の開発が重要になっている。タンパク質の安定性を予測するいくつかの生物物理学的特徴付け技術が知られている［４７，４８］。中でも、立体配座安定性の最大化は、治療用タンパク質のアンフォールディングおよび凝集を防止することによって長期の薬物製品品質を維持する高い影響を有すると考えられている。スクリーニング技術としては、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）またはｎａｎｏＤＳＦ（示差走査熱量測定）による等温化学変性（ＩＣＤ）もしくは熱変性条件下での固有のタンパク質蛍光の測定が適用される［４９］。ｐＨ、緩衝系および賦形剤組成物はタンパク質の固有の配座安定性に影響を及ぼし得るので、これらのスクリーニングは、初期製剤開発において行われることが多い［５０］。
【0011】
第２の事前スクリーニング手段として、ナノＤＳＦ測定を調べた。治療関連界面活性剤濃度が１ｍｇ／ｍＬ以下では、ほとんどの試験された代替界面活性剤は、ＴｏｎおよびＴｍのわずかな変化を示しただけであった。
【0012】
本発明者らは、酵素消化に対する様々な界面活性剤のエステル安定性を評価するための容易かつ迅速な方法を確立した。本発明者らは、界面活性剤は、おそらく酵素活性中心との立体干渉によって、その親油性骨格のサイズに応じて酵素分解の程度が異なることを見出した。
【0013】
さらに、本発明者らは、界面応力時だけでなく、長期保存中にもステロール系界面活性剤の構造活性関係を確立した。小さく柔軟な構造は、嵩高い界面活性剤と比較して、例えば振盪中の界面での高速変化時のタンパク質安定化においてより効果的であることが明らかになった。ポリマー界面活性剤：ポロキサマー、テトロニック、およびポリビニルアルコールについても、撹拌応力時に同様の基挙動が見られた。
【0014】
本発明は、驚くべきことに、界面活性剤ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＳＬを、前記タンパク質を含む液体組成物中で確立されたＰＳ２０、ＰＳ８０およびＰｘ１８８と同等または優れたタンパク質安定化効果を示すことを特定したものである。
【0015】
したがって、一実施形態では、本発明は、タンパク質と、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤とを含む、液体医薬組成物を提供する。
【0016】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質と、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤とを含む水性医薬組成物を提供する。
【0017】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質と、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤とを含む水性医薬組成物を提供する。
【0018】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質と、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤とを含む水性医薬組成物を提供する。
【0019】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質と、ＴＭＮ－６および１５－Ｓ－１５から選択される１種以上の界面活性剤とを含む水性医薬組成物を提供する。
【0020】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質が薬学的活性成分である、前述の組成物のいずれかを提供する。一態様では、前記組成物は、処置を必要とする患者の疾患の処置に使用するためのものである。
【0021】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質が、抗体；またはイムノコンジュゲート；または抗体断片である、前述の組成物のいずれかを提供する。
【0022】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質が本明細書で定義される抗体産物のいずれかに含まれる抗体である、前述の組成物のいずれかを提供する。
【0023】
別の実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤または担体をさらに含む前述の組成物のいずれかを提供する。
【0024】
別の実施形態では、本発明は、界面活性剤が１ｍｇ／ｍＬ未満の濃度、または０．００１ｍｇ／ｍＬ～０．０１ｍｇ／ｍＬ；もしくは０．０１ｍｇ／ｍＬ～０．１ｍｇ／ｍＬ；もしくは０．１ｍｇ／ｍＬ～１．０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で存在する、前述の組成物のいずれかを提供する。一実施形態では、本発明による界面活性剤は、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＴＰＧＳおよび／またはＰＶＡである。別の実施形態では、本発明による界面活性剤は、１ｍｇ／ｍＬまたは０．１ｍｇ／ｍＬの濃度の１５－Ｓ－１５および／またはＴＭＮ－６である。
【0025】
別の実施形態では、本発明は、タンパク質が、水性タンパク質または抗体製剤に適用可能であることが当業者に知られている任意の濃度で存在する、上述の組成物のいずれかを提供する。一実施形態では、特にタンパク質がヒト医薬品としての使用について承認された抗体である場合、抗体はそれらの承認された濃度のいずれかで存在する。前記承認された濃度に関する情報は、例えば、所定の薬物の添付文書または製品特性の要約（ＳｍＰＣ）で当業者は容易に入手可能である。別の実施形態では、タンパク質、特に抗体は、５～２００ｍｇ／ｍｌ、または５～１００ｍｇ／ｍｌ、または１０～２５ｍｇ／ｍｌの濃度で本発明による組成物中に存在する。
【0026】
さらに別の実施形態では、本発明は、タンパク質をさらに含む液体医薬組成物の製造における、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤の使用を提供する。
【0027】
さらに別の実施形態では、本発明は、タンパク質をさらに含む液体医薬組成物の製造における、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤の使用を提供する。
【0028】
さらに別の実施形態では、本発明は、タンパク質をさらに含む液体医薬組成物の製造における、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤の使用を提供する。
【0029】
さらに別の実施形態では、本発明は、タンパク質をさらに含む液体医薬組成物の製造におけるＴＭＮ－６および１５－Ｓ－１５から選択される１種以上の界面活性剤の使用を提供する。
【0030】
別の態様では、本発明は、本明細書で定義される抗体を含む水性医薬組成物の製造のための前述の使用のいずれかを提供する。一態様では、前記組成物は、抗体または多重特異性もしくは二重特異性抗体を有効成分として含む承認された医薬である。別の実施形態では、本発明は、タンパク質を安定化し、かつ、貯蔵時に前記タンパク質を含む液体医薬組成物中の可視粒子の形成を防止するための、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤の使用を提供する。別の実施形態では、液体医薬組成物は、活性成分として１種以上のタンパク質を含む。
【0031】
さらに、別の実施形態では、本発明は、本明細書で前述した液体医薬組成物のいずれかで使用するための、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、およびＳＬから選択される１種以上の界面活性剤を提供する。一実施形態では、前記使用は、前記液体医薬組成物に含まれるタンパク質を安定化し、かつ、貯蔵時に前記組成物中の可視粒子の形成を防止することを意味する。
【0032】
さらに別の実施形態では、本発明は、市販の抗体製剤中のＰＳ２０、ＰＳ８０またはポロキサマー１８８を置換するための、本明細書で定義される１種以上の界面活性剤、好ましくはＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５および／またはＳＬを提供する。別の実施形態では、１５－Ｓ－１５を使用して、本明細書で定義される抗体を含む水性医薬組成物中のＰＳ２０、ＰＳ８０またはポロキサマー１８８のいずれかを置き換え得る。別の実施形態では、ＴＰＧＳ、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、ＴＭＮ－６およびＳＬを使用して、本明細書で定義される抗体を含む水性医薬組成物中のポロキサマー１８８を置き換え得る。
【0033】
さらに別の実施形態では、本発明は、医薬を製造するための、本明細書で定義される１種以上の界面活性剤の使用を提供する。一態様では、前記医薬は、その認可された用途のために界面活性剤による安定化を必要とする任意の活性成分を含む水性医薬製剤である。別の態様では、１種以上の界面活性剤は、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５およびＳＬから独立して選択される。
【0034】
さらに別の態様では、本発明は、本発明による界面活性剤を同定するための、本明細書に開示されるスクリーニング方法を単独でまたは組み合わせて提供する。一実施形態では、スクリーニング方法は、添付の実施例に開示されている通りである。
【0035】
本明細書において「ｍＡｂ１」と称される抗体は、ＩＮＮペルツズマブを有する抗体である。ペルツズマブは、例えば、商標名ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）で市販されている。ペルツズマブは、例えば、欧州特許第２２３８１７２号にも開示されている。したがって、一実施形態では、「ペルツズマブ」（または「Ｍａｂ ２Ｃ４」は、それぞれ欧州特許第２２３８１７２号明細書に開示されているように、配列番号３および４の可変軽および可変重アミノ酸配列を含む抗体を指す。ペルツズマブがインタクトな抗体である場合、ペルツズマブは、欧州特許第２２３８１７２号に開示されているように、それぞれ配列番号１５および１６の軽鎖および重鎖アミノ酸配列を含む。
【0036】
本明細書において「ｍＡｂ２」と称される抗体は、ＩＮＮオビヌツズマブを有する抗体である。オビヌツズマブは、例えば、商品名ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）／ＧＡＺＹＶＡＲＯ（登録商標）で市販されている。オビヌツズマブの配列情報は、例えばＷＨＯによって、推奨されるＩＮＮのリスト（Ｌｉｓｔ ６５，ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ１，２０１１）に公開されている。オビヌツズマブに関するさらなる情報は、例えば、国際公開第２００５／０４４８５９号（Ｂ－ＨＨ６は重鎖構築物であり、Ｂ－ＫＶ１は軽鎖構築物である）においても入手可能である。配列情報については、国際公開第２００５／０４４８５９号の表２および３も参照されたい。
【0037】
本明細書において「ｍＡｂ３」と称される抗体は、臨床試験中の治験薬の二重特異性抗体断片である。
【0038】
本明細書で使用される場合、「界面活性剤」という用語は、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、およびＳＬを意味する。
【0039】
ＴＰＧＳは、トコフェルソラン（Ｄ－α－トコフェロールポリエチレングリコールスクシネート）である。
【0040】
ＰＶＡはポリ（ビニルアルコール）４－８８である。
【0041】
Ｔ１１０７は、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）１１０７（エチレンジアミンテトラキス（プロポキシレート－ブロック－エトキシレート）テトロール）である。
【0042】
Ｐｘ３３８は、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ３３８（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）である。
【0043】
Ｐｘ４０７は、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）である。
【0044】
ＴＭＮ－６は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＴＭＮ－６（８ＥＯ単位を有する分岐した第二級アルコールエトキシレート）である。
【0045】
１５－Ｓ－１５は、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）１５－Ｓ－１５（１５ＥＯ単位を有する二級アルコールエトキシレート）である。
【0046】
Ｃｈｏｌ－ＰＥＧはｍＣｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ＰＥＧ２０００であり、
【0047】
ＳＬは、ＲＥＷＯＦＥＲＭＳＬＯＮＥ（ソフォロリピッドの水溶液（１７－［２－Ｏ－（６－Ｏ－アセチル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシル）－６－Ｏ－アセチル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシルオキシ］－９－オクタデセン酸）ラクトン－および酸型）である。
【0048】
本明細書で使用される場合、「貯蔵」という用語は、当業者によって通常に適用される条件下で液体医薬製剤を維持することを意味する。一態様では、前記貯蔵は、最大６ヶ月、または１２ヶ月、または１８ヶ月、または２４ヶ月、または３０ヶ月の時間を含む。別の態様では、前記貯蔵は、前記液体医薬組成物を、規制当局によって承認されたその貯蔵寿命まで、そのような規制当局によっても承認された条件（例えば、温度）下で維持することを含む。一態様では、そのような貯蔵寿命および貯蔵条件は、例えば、承認されたタンパク質ベースの薬物に付随する添付文書に見出し得る。
【0049】
「液体医薬組成物」という用語は、好ましくは薬学的使用のための水性組成物、製剤または剤形を意味する。一実施形態では、前記液体医薬組成物は、治療用タンパク質の非経口適用のためのものである。別の実施形態では、本発明による液体医薬組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤または担体と共に１種以上の治療用タンパク質を含む。このような賦形剤は、一般に当業者に公知である。一実施形態では、「賦形剤」という用語は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬組成物または製剤中の成分を指す。賦形剤としては、緩衝液、抗酸化剤を含む安定剤、または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0050】
「医薬組成物」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態であり、医薬組成物が投与される対象に対して許容できないほどに毒性である追加の成分を含まない調製物、製剤または剤形を指す。
【0051】
「薬学的に許容され得る担体」という用語は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬組成物または製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、本明細書で定義する添加物が含まれるが、これに限定されない。
【0052】
「緩衝液」という用語は、例えば医薬調製物の開発などの有機化学または薬学の当業者に周知である。本書で使用される緩衝液は、酢酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ヒスチジン、リン酸塩、トリス、グリシン、アスパラギン酸塩、およびグルタミン酸塩緩衝系を意味する。さらに、この実施形態においては、前記緩衝液のヒスチジン濃度は５～５０ｍＭである。
【0053】
「安定剤」という用語は、例えば医薬調製物の開発などの有機化学または薬学の当業者に周知である。本発明による安定剤は、糖、糖アルコール、糖誘導体、またはアミノ酸からなる群から選択される。一態様では、安定剤は、（１）スクロース、トレハロース、シクロデキストリン、ソルビトール、マンニトール、グリシン、または／および（２）メチオニン、および／または（３）アルギニン、またはリジンである。さらに別の態様では、前記安定剤の濃度は、それぞれ、（１）５００ｍＭまで、または（２）５～２５ｍＭ、または／および（３）３５０ｍＭまでである。
【0054】
本書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、任意の治療上関連するポリペプチドを意味する。一実施態様では、タンパク質という用語は抗体を意味する。別の実施形態では、タンパク質という用語はイムノコンジュゲート意味する。
【0055】
本明細書における、「抗体」という用語は最も広い意味で用いられ、種々の抗体クラスもしくは構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、これらの抗体のいずれかは、ヒト抗体であり、またはヒト化されている。別の実施形態では、本発明による抗体は、ヒト抗体であり、またはヒト化されており、単一または二重特異性抗体、好ましくはＩｇＧクラスのモノクローナル抗体である。前記抗体はまた、種々のＩｇＧクラスからの構造要素の組み合わせを含み得るか、または例えば細胞溶解剤もしくは受容体リガンドなどの薬理活性を有する部分に結合され得る。別の態様では、抗体は、アレムツズマブ（ＬＥＭＴＲＡＤＡ（登録商標））、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標））、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標）、２Ｃ４，Ｏｍｎｉｔａｒｇ社）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、アブシキシマブ（ＲＥＯＰＲＯ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、アポリズマブ、アセリズマブ、アトリズマブ、バピネオズマブ、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（登録商標））、バビツキシマブ、ベリムマブ（ＢＥＮＬＹＳＴＡ（登録商標））ブリアンキヌマブ、カナキヌマブ（ＩＬＡＲＩＳ（登録商標））、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール（ＣＩＭＺＩＡ（登録商標））、シドフシツズマブ、シズツズマブ、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレネズマブ、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（登録商標））、ダロツズマブ、デノスマブ（ＰＲＯＬＩＡ（登録商標）、ＸＧＥＶＡ（登録商標））、エクリズマブ（ＳＯＬＩＲＩＳ（登録商標））、エファリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ、エミシズマブ（ＨＥＭＬＩＢＲＡ（登録商標））、フェルビズマブ、フォントリズマブ、ゴリムマブ（ＳＩＭＰＯＮＩ（登録商標））、イピリムマブ、イムガツズマブ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ルカツムマブ、ルリズマブペコール、ルムレツズマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、モガムリズマブ、モタビズマブ、モトビズマブ、ムロノマブ、ナタリズマブ（ＴＹＳＡＢＲＩ（登録商標））、ネシツムマブ（ＰＯＲＴＲＡＺＺＡ（登録商標））、ニモツズマブ（ＴＨＥＲＡＣＩＭ（登録商標））、ノロビズマブ、ヌマビズマブ、オロキズマブ、オマリズマブ（ＸＯＬＡＩＲ（登録商標））、オナルツズマブ（ＭｅｔＭＡｂとしても知られる）、パリビズマブ（ＳＹＮＡＧＩＳ（登録商標））、パスコリズマブ、ペクフシツズマブ、ペクツズマブ、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、ペキセリズマブ、プリリキシマブ、ラリビズマブ、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、レスリビズマブ、レスリズマブ、レシビズマブ、ロバツムマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、セリバンツマブ、シファリムマブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ（ＳＹＬＶＡＮＴ（登録商標））、シプリズマブ、ソンツズマブ、タドシズマブ、タリズマブ、テフィバズマブ、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＲＡ（登録商標））、トラリズマブ、ツクシツズマブ、ウマビズマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ（ＳＴＥＬＡＲＡ（登録商標））、ベドリズマブ（ＥＮＴＹＶＩＯ（登録商標））、ビシリズマブ、ザノリムマブ、ザルツムマブ、オビヌツズマブ（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標））から選択される「抗体産物」である。さらに別の実施形態では、抗体は、ペルツズマブまたはオビヌツズマブである。
【0056】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；ならびに、抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントの総説については、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
【0057】
抗体の「クラス」とは、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。ある特定の態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプのものである。特定の態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ変異を有するＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプのものである。ある特定の態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善するためにヒンジ領域にＳ２２８Ｐ変異を有するＩｇＧ４アイソタイプのものである。免役グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、ａ、ｄ、ｅ、ｇ、およびｍと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのいずれかに割り当てられ得る。
【0058】
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により産生される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源由来の抗体のアミノ酸に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
【0059】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、およびヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、そのドメイン中ではＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応することになる。ヒト化抗体は、必要に応じて、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けた抗体を指す。
【0060】
本明細書で使用される場合、「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列において超可変性であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを指す。一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨにあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬにある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；ならびに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））。
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））；ならびに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５（１９９６））。
【0061】
特に指示がない限り、ＣＤＲは、上記のＫａｂａｔらに従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、または、任意の他の科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
【0062】
「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害剤を含むがこれらに限定されない、１つ以上の異種分子に結合された抗体のことである。
【0063】
「個体」または「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、サル）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、個体または対象はヒトである。
【0064】
「単離」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）法によって決定される場合、純度が９５％または９９％より高くなるまで精製される。抗体純度を評価する方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９～８７（２００７）を参照されたい。
【0065】
一態様では、本明細書で使用される場合、「貯蔵」または「安定性」に関連する「長期」という用語は、本明細書で定義される任意の市販の抗体製品の認可された貯蔵寿命の終わりまでを意味する。別の態様では、「長期」という用語は、一般に本明細書で定義される抗体について、５年まで、または３年まで、または２４ヶ月まで、または１８ヶ月まで、または１２ヶ月まで、または６ヶ月まで、または３ヶ月までを意味する。「貯蔵」という用語は、抗体、特に本明細書で定義される認可された抗体産物のいずれかを貯蔵するために通常必要とされる、例えば温度および湿度などの条件を含む。そのような条件は当業者に周知である。そのような条件への言及は、例えば、本明細書で定義される抗体産物のうちの市販製品の添付文書または製品特性（ＳｍＰＣ）の要約に見出し得る。
【0066】
Ａ．キメラ抗体およびヒト化抗体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれらから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体はキメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１－６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のそれらから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【0067】
特定の態様において、キメラ抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減する一方で、親非ヒト抗体の特異性および親和性は保持するようにヒト化される。通常、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ以上の可変ドメインを含み、ＦＲ（またはその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
【0068】
ヒト化抗体およびその作製方法は、例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）、ならびに例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、および同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５～３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グリフトを記載）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９～４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）；ならびにＯｓｂｏｕｒｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）およびＫｌｉｍｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングの「ガイドセレクション」アプローチを記載）にさらに記載されている。
【0069】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；およびＰｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、ＡｌｍａｇｒｏおよびＦｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；およびＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）およびＲｏｓｏｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）。
【0070】
Ｂ．ヒト抗体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技法を使用して作製され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０～４５９（２００８）に記載されている。
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技法を使用して作製され得る。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋおよびｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８－７４（２００１）およびＬｏｎｂｅｒｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０～４５９（２００８）に記載されている。
【0071】
ヒト抗体は、抗原投与に応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部分を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照されたい。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術を記載する、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；ならびにＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。そのような動物によって生成されるインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに改変されてもよい。
【0072】
ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製し得る。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫およびマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１～６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：８６（１９９１）を参照されたい）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法には、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）およびＮｉ、Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ、２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものが含まれる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）はまた、ＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、２０（３）：９２７－９３７（２００５）ならびにＶｏｌｌｍｅｒｓおよびＢｒａｎｄｌｅｉｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。
【0073】
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージ・ディスプレイ・ライブラリから選択される可変ドメイン配列を単離することによって生成し得る。その後、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせられ得る。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術を以下に記載する。
【0074】
Ｃ．抗体誘導体
ある特定の態様では、本書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むように、さらに改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であっても、異なった分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義される条件下で治療に使用されるかどうか等を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
ある特定の態様では、本書で提供される抗体は、当技術分野で公知であり容易に入手可能なさらなる非タンパク質性部分を含むように、さらに改変され得る。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、任意の分子量であってもよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であり、複数のポリマーが付着している場合には、それらは同じ分子であっても、異なった分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数および／または種類は、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が定義される条件下で治療に使用されるかどうか等を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【0075】
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体などの１つ以上の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）された本明細書の抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、またはそれらの断片）、または放射性同位体などの１つ以上の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）された本明細書の抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
【0076】
一態様において、イムノコンジュゲートは、前述の治療薬の１つ以上に抗体が結合した、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、一以上の治療薬に、リンカーを使用して接続される。治療剤および薬物およびリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概観は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３～１９（２０１６）に記載されている。
【0077】
別の態様では、イムノコンジュゲートは、本明細書に記載されるように、酵素活性毒素またはこれらの断片に結合する抗体を含む。これらは以下に限定されるわけではないが、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにトリコテセンを含む。
【0078】
別の態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされ、放射性コンジュゲートを形成する、本書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、およびＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性物質が検出のために使用される場合、それは、シンチグラフィ研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、または核磁気共鳴（ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＮＭＲ）イメージング（別名、磁気共鳴イメージング、ＭＲＩ）のためのスピンラベル、例えば再びヨウ素１２３、ヨウ素１３１、インジウム１１１、フッ素１９、炭素１３、窒素１５、酸素１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄を含んでいてもよい。
【0079】
抗体と細胞毒性剤とのコンジュゲートは、例えば、各種の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる：Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ等）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジル等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネート等）、および二活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン等）。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製し得る。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体にラジヌクレオチドを共役させるための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の放出を促進する「開裂性リンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－～１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用されてもよい。
【0080】
本明細書におけるイムノコンジュゲートまたはＡＤＣは、限定されないが、市販（例：米国イリノイ州ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から）されている、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣおよびスルホ－ＳＭＰＢ、ならびにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明確に意図している。
【0081】
Ｅ．多重特異性抗体
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
ある特定の態様では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製することができる。
【0082】
多重特異性抗体を作製するための技法としては、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）および「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号およびＡｔｗｅｌｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が挙げられる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）；２つ以上の抗体または断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）および国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）；および一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；および例えばＴｕｔｔら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製し得る。
【0083】
例えば、「オクトパス抗体」を含め、３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、またはＤＶＤ－Ｉｇもまたここに含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号および国際公開第２００８／０２４７１５号を参照されたい）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、および国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体またはその抗原結合断片はまた、２つの異なる抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用性（Ｄｕａｌ Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」を含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号および国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照されたい）。
【0084】
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ以上の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形態で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号および国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）または完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒら，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、およびＫｌｅｉｎら，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０）も参照）を交換することによってもたらされ得る。一態様では、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」との用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作し得る。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５を参照のこと。
【0085】
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で公知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓら，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照）。
【0086】
Ｆ．組換え方法および組成物
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法および組成物を用いて製造することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法および組成物を用いて製造することができる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
【0087】
天然抗体または天然抗体断片の場合、２つの核酸が必要であり、１つは軽鎖またはその断片用で、もう１つは重鎖またはその断片用である。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖（一または複数））をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上、または異なる発現ベクター上にあってもよい。
【0088】
４つの核酸が必要とされるヘテロ二量体の重鎖を有する二重特異性抗体の場合、１つは第１の軽鎖のため、１つは第１のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第１の重鎖のため、１つは第２の軽鎖のため、および１つは第２のヘテロモノマーＦｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖のためのものである。４つの核酸は、１つ以上の核酸分子または発現ベクターの中に含まれ得る。このような核酸は、第１のＶＬを含むアミノ酸配列および／または第１のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列および／または第２のＶＬを含むアミノ酸配列および／または抗体の第２のヘテロモノマーＦｃ領域を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の第１および／もしくは第２の軽鎖ならびに／または第１および／もしくは第２の重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上または異なる発現ベクター上にあってもよく、通常、これらの核酸は、２つまたは３つの発現ベクター上に位置しており、すなわち、１つのベクターは、これらの核酸のうち、２つ以上を含んでいてもよい。これらの二重特異性抗体の例は、クロス（Ｃｒｏｓｓ）Ｍａｂである（例えば、Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７～１１９１を参照されたい）。例えば、ＥＵインデックスナンバリングによれば、ヘテロモノマー重鎖の一方はいわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃの一方）を含み、他方はいわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖならびに場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃ）（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９６）７３を参照されたい）を含む。
【0089】
抗体の組換え産生に関しては、例えば、上述の抗体をコードする核酸が単離され、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞内での発現のために、一または複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離することができ、一般的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定し得る。
【0090】
抗体コード化ベクターのクローニングまたは発現のための適切な宿主細胞としては、本明細書に記載される原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合には、細菌中で生成されうる。細菌中での抗体断片およびポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、米国特許第５，７８９，１９９号、および米国特許第５，８４０，５２３号を参照されたい。Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｉｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００３），ｐｐ．２４５－２５４，ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉも参照されたい）発現の後、抗体を、可溶性画分において細菌細胞のペーストから単離して、さらに精製し得る。
【0091】
原核生物に加えて、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌株および酵母株を含めた糸状菌類または酵母などの有用真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｔ．Ｕ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（２００４）１４０９－１４１４；およびＬｉ，Ｈ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４（２００６）２１０－２１５を参照されたい。
【0092】
（グリコシル化）抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物および脊椎動物）からも得られる。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。多くのバキュロウイルス株が同定されており、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために、これを昆虫細胞と組み合わせて使用してもよい。
【0093】
植物細胞培養物も、宿主として利用し得る。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、米国特許第６，０４０，４９８号、米国特許第６，４２０，５４８号、米国特許第７，１２５，９７８号および米国特許第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載している）を参照。
【0094】
脊椎動物細胞も、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９－７４に記載されるような２９３細胞または２９３Ｔ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３（１９８０）２４３－２５２に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３（１９８２）４４－６８に記載）、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７（１９８０）４２１６～４２２０）を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびに骨髄腫細胞株、例えば、Ｙ０、ＮＳ０およびＳｐ２／０が挙げられる。抗体産生に適したある特定の哺乳動物宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．およびＷｕ，Ａ．Ｍ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２４８巻、Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ（２００４）、２５５～２６８頁を参照されたい。
【0095】
ここで、本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【0096】
材料および方法
材料
ＰＣＬ（シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ）およびＣＡＬＢ（コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来の組換え体であるリパーゼＢカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（シュタインハイム、ドイツ）から購入した。使用したモデルＩｇＧ１モノクローナル抗体は、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ（スイスバーゼル）から提供され、ｐＨ ７．０の２４０ｍＭスクロース（Ｐｆａｎｔｉｅｈｌ Ｉｎｃ．（米国イリノイ州））を含む２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（味の素株式会社、東京、日本）中２５ｍｇ／ｍＬ（ｍＡｂ１）、ｐＨ６．０の２４０ｍＭスクロースを含む１７ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中２５ｍｇ／ｍＬ（ｍＡｂ２）およびｐＨ６．０の２４０ｍＭスクロースを含む１０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬ（ｍＡｂ３）でそれぞれ製剤化した。
材料
ＰＣＬ（シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａ）由来のリパーゼ）およびＣＡＬＢ（コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来の組換え体であるリパーゼＢカンジダ・アンタルクティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（シュタインハイム、ドイツ）から購入した。使用したモデルＩｇＧ１モノクローナル抗体は、Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ（スイスバーゼル）から提供され、ｐＨ ７．０の２４０ｍＭスクロース（Ｐｆａｎｔｉｅｈｌ Ｉｎｃ．（米国イリノイ州））を含む２０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（味の素株式会社、東京、日本）中２５ｍｇ／ｍＬ（ｍＡｂ１）、ｐＨ６．０の２４０ｍＭスクロースを含む１７ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中２５ｍｇ／ｍＬ（ｍＡｂ２）およびｐＨ６．０の２４０ｍＭスクロースを含む１０ｍＭ Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中１０ｍｇ／ｍＬ（ｍＡｂ３）でそれぞれ製剤化した。
【0097】
スクリーニングされた界面活性剤は、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＨＳ１５（ＨＳ１５、ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＲＨ４０（ＲＨ４０、ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）、ポリソルベート２０（ＰＳ２０；Ｃｒｏｄａ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、スネイス、英国）、ポリソルベート８０ＨＸ２（ＰＳ ８０；日油株式会社、東京、日本）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（アンモニウム塩）（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、アラバスター、アラバマ州）、Ｒｅｗｏｆｅｒｍ（登録商標）ＳＬ ＯＮＥ（ＳＬ；Ｅｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、エッセン、ドイツ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）ＣＳ２０（ＣＳ２０；ＢＡＳＦ（ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ））、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）１５－Ｓ－１５（１５－Ｓ－１５；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＴＭＮ－６（ＴＭＮ－６；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）、Ｅｃｏｓｕｒｆ（商標）ＥＨ－９（ＥＨ－９；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）、ノナノイル－Ｎ－メチルグルカミド（ＭＥＧＡ－９；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）およびデカノイル－Ｎ－ヒドロキシエチルグルカミド（ＨＥＧＡ－１０；Ａｎａｔｒａｃｅ、マウミー、オハイオ州）、デオキシコール酸ナトリウム（ＮａＤＣ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）、グリココール酸ナトリウム水和物（ＮａＧＣ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、シュタインハイム、ドイツ）、Ｃｈｏｂｉｍａｌｔ／コレステロール－β－Ｄ－マルトピラノシル－（１→６）－β－Ｄ－マルトピラノシド（Ｃｈｏｂｉ；Ａｎａｔｒａｃｅ、マウミー、オハイオ）、ｍコレステロール－ＰＥＧ２０００（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ；Ｎａｎｏｃｓ Ｉｎｃ、ニューヨーク）、デオキシ－ＢｉｇＣＨＡＰ（ＤＢＣ；Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ノースヨーク、カナダ）、α－トコフェリル－ポリエチレングリコール－１０００－スクシネート（ＴＰＧＳ，Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ノースヨーク、カナダ）；Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８（Ｐｘ１８８；ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェン、ドイツ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ３３８（Ｐｘ３３８；ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェンス、ドイツ）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ４０７（Ｐｘ４０７；ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェンス、ドイツ）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）１１０７（Ｔ１１０７；ＢＡＳＦ、ルートヴィヒスハーフェンス、ドイツ）、またはポリビニルアルコール４－８８（ＰＶＡ；Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）により供給される。
【0098】
メタノール（ＭｅＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）および酢酸アンモニウムなどの他の全ての試薬は分析グレードのものであり、ダルムシュタット、メルクのＭｅｒｃｋ ＫＧａ ＫＧａから入手した。
【0099】
方法
酵素エステル加水分解に対する界面活性剤安定性の測定
０．４ｍｇ／ｍＬの各界面活性剤を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、合計０．２５または０．５ｍｇ／ｍＬのＰＣＬおよびＣＡＬＢの１：１リパーゼ混合物と共に室温で６時間インキュベートした。両者ともカルボキシルエステルヒドロラーゼの群に属し、ＰＳ２０を加水分解し得るバイオプロセスからの重要な不純物として以前に報告されている［５１］。酵素分解がないかまたは無視できる酵素分解の場合、ＮａＯＨを使用した化学エステル加水分解を陽性対照として実施した。このために、界面活性剤を０．１ｍｍｏｌのＮａＯＨと共に室温で６時間インキュベートした。
酵素エステル加水分解に対する界面活性剤安定性の測定
０．４ｍｇ／ｍＬの各界面活性剤を、２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）中、合計０．２５または０．５ｍｇ／ｍＬのＰＣＬおよびＣＡＬＢの１：１リパーゼ混合物と共に室温で６時間インキュベートした。両者ともカルボキシルエステルヒドロラーゼの群に属し、ＰＳ２０を加水分解し得るバイオプロセスからの重要な不純物として以前に報告されている［５１］。酵素分解がないかまたは無視できる酵素分解の場合、ＮａＯＨを使用した化学エステル加水分解を陽性対照として実施した。このために、界面活性剤を０．１ｍｍｏｌのＮａＯＨと共に室温で６時間インキュベートした。
【0100】
界面活性剤の分解に続いて、圧力２５ｐｓｉおよびドリフトチューブ温度９５℃でキャリアガスとして窒素を使用するＷａｔｅｒｓ２４２４蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）（米国ミルフォード州ウォーターズ）を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５装置を使用した逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を行った。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ（登録商標）Ｃ１８（２）１００Å（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、米国）を固定相として使用した。界面活性剤の分析は、０．７ｍｌ／分の一定流量、２５μｌの注入体積、５℃のサンプル温度、および３５℃のカラム温度で、表１に示すプログラムを用いた二成分勾配溶出を用いて行った。溶離液Ａは２％酢酸水溶液、溶離液ＢはＭｅＯＨ中２％酢酸からなっていた。
【0101】
【表1】
【0102】
典型的なクロマトグラムを図２に示す。文献に報告されているように、ピークは親水性／非エステル化画分（１）ならびに親油性のエステル化画分（２）に分類された［５２～５４］。Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）３ソフトウェアを用いてデータ処理を行った。種々の界面活性剤をより適切に比較するために、界面活性剤の分解度を正規化されたエステル主ピーク面積として報告し、分解前の初期エステル主ピーク面積を１００％に設定した。結果は、０．１５以下の標準偏差を有する３つの個々の測定値の平均として与えられる。
【0103】
界面活性剤の存在下での熱配座タンパク質安定性の評価
Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．Ｐｌｅｘ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて、タンパク質のコンフォメーション安定性を調べた。この装置により、少量の溶液を使用することによって、芳香族トリプトファンおよびチロシン残基からの固有のタンパク質蛍光の変化の無標識蛍光分析が可能になる。熱により誘導されるタンパク質アンフォールディングを、５％のレーザー出力で３３０ｎｍおよび３５０ｎｍにおける発光シフトを検出することによってモニタリングした。ｎａｎｏＤＳＦグレードの標準的なキャピラリーチップ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ミュンヘン、ドイツ）を、０．０１、０．１、１または１０ｍｇ／ｍＬの特定の界面活性剤のいずれかと配合された２５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂを含有する１０μＬの新たに調製した（ｔ０）製剤で満たした。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、電荷がおそらく電荷担体相互作用によってタンパク質の不安定化をもたらすことが報告されているので、陽性対照とした［５５～５７］。サンプルを、０．５℃／分の一定の加熱勾配で２５℃から９５℃まで加熱した。ＰＲ．ＳｔａｂｉｌｉｔｙＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ミュンヘン、ドイツ）は、融解曲線の開始（Ｔｏｎ）および第１の転移点（Ｔｍ１）温度を自動的に計算した。報告されたデータは、３つの個々の測定値の平均値である。
Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．Ｐｌｅｘ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）を用いて、タンパク質のコンフォメーション安定性を調べた。この装置により、少量の溶液を使用することによって、芳香族トリプトファンおよびチロシン残基からの固有のタンパク質蛍光の変化の無標識蛍光分析が可能になる。熱により誘導されるタンパク質アンフォールディングを、５％のレーザー出力で３３０ｎｍおよび３５０ｎｍにおける発光シフトを検出することによってモニタリングした。ｎａｎｏＤＳＦグレードの標準的なキャピラリーチップ（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ミュンヘン、ドイツ）を、０．０１、０．１、１または１０ｍｇ／ｍＬの特定の界面活性剤のいずれかと配合された２５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂを含有する１０μＬの新たに調製した（ｔ０）製剤で満たした。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、電荷がおそらく電荷担体相互作用によってタンパク質の不安定化をもたらすことが報告されているので、陽性対照とした［５５～５７］。サンプルを、０．５℃／分の一定の加熱勾配で２５℃から９５℃まで加熱した。ＰＲ．ＳｔａｂｉｌｉｔｙＡｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ミュンヘン、ドイツ）は、融解曲線の開始（Ｔｏｎ）および第１の転移点（Ｔｍ１）温度を自動的に計算した。報告されたデータは、３つの個々の測定値の平均値である。
【0104】
界面活性剤の存在下での機械的ストレスおよび熱安定性後のタンパク質安定性の評価
０．１および１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤を用いて、材料の項に記載のモデルｍＡｂの配合物中で界面活性剤性能スクリーニングを行った。配合後、液体サンプルを０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（商標）ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）フィルタユニットを通して無菌的にフィルタにかけ、６ｍＬのタイプ１ガラスバイアルに充填し、Φ２０ｍｍテフロン（登録商標）コーティング血清ストッパ（大京精工株式会社、東京、日本）により栓を閉じた。栓を閉じたバイアルを、アルミニウムキャップ（Ｉｎｆｏｃｈｒｏｍａ ＡＧ、ゴールダウ，スイス）を使用してクリンプした。対応するプラセボ製剤を同じように調製し、製剤化し、それぞれの対照として使用した。
０．１および１ｍｇ／ｍＬの界面活性剤を用いて、材料の項に記載のモデルｍＡｂの配合物中で界面活性剤性能スクリーニングを行った。配合後、液体サンプルを０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（商標）ＧＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）フィルタユニットを通して無菌的にフィルタにかけ、６ｍＬのタイプ１ガラスバイアルに充填し、Φ２０ｍｍテフロン（登録商標）コーティング血清ストッパ（大京精工株式会社、東京、日本）により栓を閉じた。栓を閉じたバイアルを、アルミニウムキャップ（Ｉｎｆｏｃｈｒｏｍａ ＡＧ、ゴールダウ，スイス）を使用してクリンプした。対応するプラセボ製剤を同じように調製し、製剤化し、それぞれの対照として使用した。
【0105】
ｍＡｂの安定性に対する界面活性剤の効果を評価するために、製剤を撹拌および様々な凍結融解サイクルのような様々な界面応力条件に曝露した。バイアルを水平に置き、５℃および２５℃で遮光した状態で７日間、２００ｒｐｍの一定速度で振盪機（ＨＳ ２６０ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｏｄｅｌ；ＩＫＡ Ｗｅｒｋｅ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ；シュタウフェン、ドイツ）内で振盪応力を行った。凍結融解（Ｆ／Ｔ）ストレスは、バイアルを－２０℃での凍結および５℃での融解の５回の連続サイクルに曝露することによって行った。
【0106】
液体タンパク質製剤を５℃で最大２４ヶ月（ｍｏ）、２５℃／６０％相対湿度（ｒＨ）で６ヶ月間および４０℃／７５％ｒＨで１２週間保存することによって、熱安定性データを生成した。サンプルを、初期時点（ｔ０）ならびに１ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、１２ヶ月後、１８ヶ月後および２４ヶ月後に、以下に記載される分析方法を用いて分析した。
【0107】
可視粒子（Ｅ／Ｐ）
強化目視検査は、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ ９０－Ｔ機（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｋｔ シュヴァーベン、ドイツ）を使用して前述のように実施した［５８］。粒子の数を以下の４つのクラスに分類した：クラス（Ｉ）は０個の粒子に相当し、クラス（ＩＩ）は１～５個の粒子に相当し、クラス（ＩＩＩ）は６～１０個の粒子に相当し、クラス（ＩＶ）は１０個を超える粒子に相当する。
強化目視検査は、Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｖ ９０－Ｔ機（Ｓｅｉｄｅｎａｄｅｒ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｂａｕ ＧｍｂＨ、Ｍａｒｋｔ シュヴァーベン、ドイツ）を使用して前述のように実施した［５８］。粒子の数を以下の４つのクラスに分類した：クラス（Ｉ）は０個の粒子に相当し、クラス（ＩＩ）は１～５個の粒子に相当し、クラス（ＩＩＩ）は６～１０個の粒子に相当し、クラス（ＩＶ）は１０個を超える粒子に相当する。
【0108】
濁度（乳濁度および透明度）
濁度は、ＳｔａｂｌＣａｌ（登録商標）較正キット（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ）で較正された２１００ ＡＮ濁度計（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ、デュッセルドルフ、ドイツ）を用い、文献に以前に記載されているように、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．１に従って測定した。結果を、比濁法濁度単位（ＮＴＵ）として示した［５８，５９］。
濁度は、ＳｔａｂｌＣａｌ（登録商標）較正キット（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ）で較正された２１００ ＡＮ濁度計（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ、デュッセルドルフ、ドイツ）を用い、文献に以前に記載されているように、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．１に従って測定した。結果を、比濁法濁度単位（ＮＴＵ）として示した［５８，５９］。
【0109】
比色
溶液の比色は、ＬＩＣＯ ６９０比色計（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ）によって評価した分類は、Ｐｈ．Ｅｕｒ２．２．２に記載のカラースケールに従って行った［６０］。ここで示すデータは、Ｐｈ．Ｅｕｒ２．２．２のカラースケール値による色の変化の程度を示す。クラス（Ｉ）は、９、８、７、または無色のカラースケール値に相当する；クラス（ＩＩ）は、６または５のカラースケール値に相当する；クラス（ＩＩＩ）は４または３のカラースケール値に相当する；クラス（ＩＶ）は２または１のカラースケール値に相当する。
溶液の比色は、ＬＩＣＯ ６９０比色計（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ）によって評価した分類は、Ｐｈ．Ｅｕｒ２．２．２に記載のカラースケールに従って行った［６０］。ここで示すデータは、Ｐｈ．Ｅｕｒ２．２．２のカラースケール値による色の変化の程度を示す。クラス（Ｉ）は、９、８、７、または無色のカラースケール値に相当する；クラス（ＩＩ）は、６または５のカラースケール値に相当する；クラス（ＩＩＩ）は４または３のカラースケール値に相当する；クラス（ＩＶ）は２または１のカラースケール値に相当する。
【0110】
光の不明瞭さ
顕微鏡可視粒子（ＳＶＰ）の計数は、ＨＩＡＣ ９７０３＋液体粒子計数システム（Ｓｋａｎ ＡＧ、アルシュヴィル、スイス）およびＰｈａｒｍＳｐｅｃ ３（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ）ソフトウェアを使用して光遮蔽によって測定した。適用された測定技術は、Ｐｈ．Ｅｕｒ２．９．１９［６１］およびＵＳＰ＜７８７＞［６２］に記載された方法から適合させた。システムをサンプル溶液ですすいだ後、サンプル体積０．２ｍＬで４回実行した。最後の累積粒子数は、最後の３つの測定値から平均±ＳＤ（標準偏差）を計算することによって得た。２、５、１０および２５μｍ以上のＳＶＰを測定し、溶液１ｍＬ当たりの累積数として示した。
顕微鏡可視粒子（ＳＶＰ）の計数は、ＨＩＡＣ ９７０３＋液体粒子計数システム（Ｓｋａｎ ＡＧ、アルシュヴィル、スイス）およびＰｈａｒｍＳｐｅｃ ３（Ｈａｃｈ Ｌａｎｇｅ ＧｍｂＨ）ソフトウェアを使用して光遮蔽によって測定した。適用された測定技術は、Ｐｈ．Ｅｕｒ２．９．１９［６１］およびＵＳＰ＜７８７＞［６２］に記載された方法から適合させた。システムをサンプル溶液ですすいだ後、サンプル体積０．２ｍＬで４回実行した。最後の累積粒子数は、最後の３つの測定値から平均±ＳＤ（標準偏差）を計算することによって得た。２、５、１０および２５μｍ以上のＳＶＰを測定し、溶液１ｍＬ当たりの累積数として示した。
【0111】
サイズ排除高速クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）
可溶性ｍＡｂ凝集体の検出は、以下、高分子量体（ＨＭＷＳ）、モノマーおよび低分子量体（ＬＭＷｓ）と呼ばれ、ＳＥ－ＨＰＬＣで分析した。利用したシステムは、２４８７ＵＶ検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣ装置（両方とも、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を有していた。オートサンプラー温度を５℃に設定し、システムに合計１００μｇのｍＡｂを負荷した。ＴＳＫＧ ３０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，シュトゥットガルト，ドイツ）を用い、オーブン温度２５℃、移動相２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４および２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．０、流速０．５ｍＬ／分で分離を行った。信号検出を２８０ｎｍの波長で実行し、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用してピーク面積パーセントを計算した。
可溶性ｍＡｂ凝集体の検出は、以下、高分子量体（ＨＭＷＳ）、モノマーおよび低分子量体（ＬＭＷｓ）と呼ばれ、ＳＥ－ＨＰＬＣで分析した。利用したシステムは、２４８７ＵＶ検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ２６９５ ＨＰＬＣ装置（両方とも、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を有していた。オートサンプラー温度を５℃に設定し、システムに合計１００μｇのｍＡｂを負荷した。ＴＳＫＧ ３０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，シュトゥットガルト，ドイツ）を用い、オーブン温度２５℃、移動相２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４および２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．０、流速０．５ｍＬ／分で分離を行った。信号検出を２８０ｎｍの波長で実行し、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用してピーク面積パーセントを計算した。
【0112】
イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＨＰＬＣ）
ｍＡｂの電荷の不均一性を、２４８９ＵＶ検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ｅ ２６９５ ＨＰＬＣ装置（両方とも、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用するＩＥ－ＨＰＬＣによって評価した。ｍＡｂをカルボキシペプチダーゼで消化し、５０μｇを４×２５０ｍｍ ＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国マサチューセッツ州）に１．０ｍＬ／分の流速で、３４℃のカラム温度を用いて注入した。ｍＡｂ断片の溶出は、イオン強度が増加する溶媒（移動相Ａ：２０ｍＭ ＭＥＳ，１ｍＭ Ｎａ－ＥＤＴＡ／移動相Ｂ：２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＭＥＳ，１ｍＭ Ｎａ－ＥＤＴＡ，ｐＨ６．０）を用いて行った。信号検出を２８０ｎｍの波長で行い、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）をデータ処理に使用した。主ピークの減少は、貯蔵時間に対する総ピーク面積（面積％）の百分率として報告した。
ｍＡｂの電荷の不均一性を、２４８９ＵＶ検出器を備えたＡｌｌｉａｎｃｅ ｅ ２６９５ ＨＰＬＣ装置（両方とも、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）を使用するＩＥ－ＨＰＬＣによって評価した。ｍＡｂをカルボキシペプチダーゼで消化し、５０μｇを４×２５０ｍｍ ＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国マサチューセッツ州）に１．０ｍＬ／分の流速で、３４℃のカラム温度を用いて注入した。ｍＡｂ断片の溶出は、イオン強度が増加する溶媒（移動相Ａ：２０ｍＭ ＭＥＳ，１ｍＭ Ｎａ－ＥＤＴＡ／移動相Ｂ：２５０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ ＭＥＳ，１ｍＭ Ｎａ－ＥＤＴＡ，ｐＨ６．０）を用いて行った。信号検出を２８０ｎｍの波長で行い、Ｅｍｐｏｗｅｒ ３ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｄａｔａ Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミルフォード、マサチューセッツ州）をデータ処理に使用した。主ピークの減少は、貯蔵時間に対する総ピーク面積（面積％）の百分率として報告した。
【0113】
表面張力測定
表面張力の測定は、Ａｍｒｅｉｎら［６３］によって記載された方法に従って液体処理ステーションによって行った。簡単に説明すると、測定は、液滴質量とサンプルの表面張力との間の相関関係に依存する。この研究のために、完全に自動化された液体処理ステーションＦｒｅｅｄｏｍ ３８４ ＥＶＯ ２００（Ｔｅｃａｎ、クライルスハイム、ドイツ）は分析天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、コロンバス、米国）を装備していた。システムは、密閉された１ｍＬの丸底ＬｏＢｉｎｄ（登録商標）Ｄｅｅｐｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルグ、ドイツ）から１００μＬ・ｓ－１でサンプルを吸引するステンレス固定チップを含む。分析天秤に取り付けた第２の丸底ディープウェルプレート９６／５００μＬ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルグ、ドイツ）にサンプルを３μＬ・ｓ－１で分注した。Ｍａｔｌａｂ Ｒ２０１７ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ナティック、米国）に記載された完全自動化ルーチンを使用して、重量を連続的に記録した。水の表面張力（７２．６ｍＮ／ｍ）を計算の基準として使用した。サンプルの３つの個々の測定値（ｔ０）の平均を表面張力として報告する。
表面張力の測定は、Ａｍｒｅｉｎら［６３］によって記載された方法に従って液体処理ステーションによって行った。簡単に説明すると、測定は、液滴質量とサンプルの表面張力との間の相関関係に依存する。この研究のために、完全に自動化された液体処理ステーションＦｒｅｅｄｏｍ ３８４ ＥＶＯ ２００（Ｔｅｃａｎ、クライルスハイム、ドイツ）は分析天秤（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ、コロンバス、米国）を装備していた。システムは、密閉された１ｍＬの丸底ＬｏＢｉｎｄ（登録商標）Ｄｅｅｐｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルグ、ドイツ）から１００μＬ・ｓ－１でサンプルを吸引するステンレス固定チップを含む。分析天秤に取り付けた第２の丸底ディープウェルプレート９６／５００μＬ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルグ、ドイツ）にサンプルを３μＬ・ｓ－１で分注した。Ｍａｔｌａｂ Ｒ２０１７ｂ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ、ナティック、米国）に記載された完全自動化ルーチンを使用して、重量を連続的に記録した。水の表面張力（７２．６ｍＮ／ｍ）を計算の基準として使用した。サンプルの３つの個々の測定値（ｔ０）の平均を表面張力として報告する。
【0114】
バックグラウンド膜イメージング（ＢＭＩ）による、顕微鏡可視粒子（ＳＶＰ）の計数
顕微鏡可視粒子（ＳＶＰ）のカウントを、タンパク質の第２のセット、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３について、Ｈｏｒｉｚｏｎ機器（ＨａｌｏＬａｂｓ、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）でＢＭＩによって測定した。システムは、画像化のためのサンプルを受け入れる０．４μｍの孔径を有するポリカーボネート製の９６ウェル膜フィルタプレート（Ｈａｌｏ Ｌａｂｓ）で動作する。層流下で、メンブレンフィルタープレートの各ウェルに５０μＬの注射用水を添加し、プレートを３５０ｍｂａｒで真空引きし、ウェルをバックグラウンド情報のために測定した。続いて、４０μｌのサンプルを上記プレートの各ウェルに移し、３５０ｍｂａｒで真空引きし、５０μＬの注射用水で洗浄し、３５０ｍｂａｒで再び真空引きした。最終的にウェルを測定し、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖｕｅソフトウェアで画像分析を行った。粒子のカウントは、３回の測定の平均およびフィルタプレートの被覆率の最大６．４％として報告される。
顕微鏡可視粒子（ＳＶＰ）のカウントを、タンパク質の第２のセット、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３について、Ｈｏｒｉｚｏｎ機器（ＨａｌｏＬａｂｓ、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）でＢＭＩによって測定した。システムは、画像化のためのサンプルを受け入れる０．４μｍの孔径を有するポリカーボネート製の９６ウェル膜フィルタプレート（Ｈａｌｏ Ｌａｂｓ）で動作する。層流下で、メンブレンフィルタープレートの各ウェルに５０μＬの注射用水を添加し、プレートを３５０ｍｂａｒで真空引きし、ウェルをバックグラウンド情報のために測定した。続いて、４０μｌのサンプルを上記プレートの各ウェルに移し、３５０ｍｂａｒで真空引きし、５０μＬの注射用水で洗浄し、３５０ｍｂａｒで再び真空引きした。最終的にウェルを測定し、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｖｕｅソフトウェアで画像分析を行った。粒子のカウントは、３回の測定の平均およびフィルタプレートの被覆率の最大６．４％として報告される。
【0115】
実施例１：
１．）酵素エステル加水分解に対する界面活性剤安定性の測定
少量の共精製された宿主細胞タンパク質によるポリソルベート加水分解は、長期のタンパク質製剤安定性にとって大きな課題であるので、０．２５および０．５ｍｇ／ｍＬの２つのモデルリパーゼ、ＰＣＬおよびＣＡＬＢの存在下でエステル安定性を試験するためのアッセイを開発した。図２は、酵素消化前（実線）および酵素消化後（破線）のＰＳ２０の代表的なクロマトグラムを示す。
１．）酵素エステル加水分解に対する界面活性剤安定性の測定
少量の共精製された宿主細胞タンパク質によるポリソルベート加水分解は、長期のタンパク質製剤安定性にとって大きな課題であるので、０．２５および０．５ｍｇ／ｍＬの２つのモデルリパーゼ、ＰＣＬおよびＣＡＬＢの存在下でエステル安定性を試験するためのアッセイを開発した。図２は、酵素消化前（実線）および酵素消化後（破線）のＰＳ２０の代表的なクロマトグラムを示す。
【0116】
【表2】
【0117】
消化前、親水性画分は７～８分の間のより低い保持時間で溶出し（表２）、以下の順序で平均ポリエチレンオキシドサブユニットのサイズが増加するにつれて増加する：ＨＳ１５（１５ＰＥＯ単位）＜ＰＳ２０（２０ＰＥＯ単位）＜ＴＰＧＳ（２３ＰＥＯ単位）＜ＲＨ４０（４０ＰＥＯ単位）＜Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ（４５ＰＥＯ単位）。画分（１）のより広いピーク形状は、ＰＥＯ部分のポリマー特性および異なるポリマー鎖の関連するサイズ分布によって説明され得る。エステル化の程度（モノ－、ジ－および部分的にトリ－およびテトラ－エステルの存在）による化学的により不均一な組成ＰＳ２０、ＨＳ１５およびＲＨ４０のために、親油性部分画分（２）は複数の後続ピークとして溶出したが、ＴＰＧＳおよびＣｈｏｌ－ＰＥＧについては１つのピークのみが得られた（データは示さず）［２４］。後者の２種の界面活性剤については、以前の親油性が化学的により均質であると思われる。
【0118】
リパーゼ混合物とインキュベーションした後、ＰＳ２０について得られたクロマトグラムは、親水性画分の増加（１）および親油性画分の完全な喪失（２）（図２破線）を示し、これは全てのエステル結合が開裂したことを明確に示す。図３は、０．２５および０．５ｍｇ／ｍＬのリパーゼ混合物を用いた酵素加水分解による界面活性剤分解の程度を示す。ＰＳ２０、ＨＳ１５およびＲＨ４０については、強い酵素的加水分解が観察された（＞９５％）。試験した２つのリパーゼ濃度間で分解度の差は観察されなかった。対照的に、ＴＰＧＳおよびＣｈｏｌ－ＰＥＧについては、試験した両方のリパーゼ混合物についてごくわずかな酵素的加水分解が示された（＜０．３％）。この試験の「偽陽性」の結果を除外するために、０．１ｍｍｏｌのＮａＯＨを用いた化学加水分解を行った。これらの条件下で、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧのエステル結合は完全に加水分解され（１００％）、これは画分（２）の消失によって示されたが、ＴＰＧＳは部分的にしか加水分解されなかった（画分（２）の６８％が残っていた）。
【0119】
データにより、ＨＳ１５およびＲＨ４０界面活性剤が実験中にＰＳ２０と同程度の分解をもたらしたことが示された。ポリソルベートの酵素的エステル加水分解は、タンパク質製剤内の主要な課題であるため、ＰＳ２０と同等の分解を伴う界面活性剤がその後の研究で使用された。
【0120】
界面活性剤の存在下での熱配座タンパク質安定性の評価
立体配座安定性の最大化は、治療用タンパク質のアンフォールディングおよび凝集を防止することによって、長期の製剤品質および／または安定性を増加させることが報告されている。ハイスループットおよび低体積スクリーニング技術は、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）または等温化学変性（ＩＣＤ）もしくは熱変性条件下でｎａｎｏＤＳＦ（示差走査熱量測定）によって固有のタンパク質蛍光を測定するものである［４９］。タンパク質の立体配座安定性に対する界面活性剤の悪影響を排除するために、熱ＤＳＦ測定を行った。ＣＨ２、ＣＨ３およびＦａｂを含むｍＡｂのマルチドメイン構造の特徴的な立体配座は、それらの結合能および治療有効性にとって重要である。ｍＡｂの場合、特定のドメインの独立した段階的なアンフォールディングが推定され、一般にＣＨ２が最も安定性が低く、ＦａｂおよびＣＨ３が続くと推定される［４８］。
立体配座安定性の最大化は、治療用タンパク質のアンフォールディングおよび凝集を防止することによって、長期の製剤品質および／または安定性を増加させることが報告されている。ハイスループットおよび低体積スクリーニング技術は、ＤＳＣ（示差走査熱量測定）または等温化学変性（ＩＣＤ）もしくは熱変性条件下でｎａｎｏＤＳＦ（示差走査熱量測定）によって固有のタンパク質蛍光を測定するものである［４９］。タンパク質の立体配座安定性に対する界面活性剤の悪影響を排除するために、熱ＤＳＦ測定を行った。ＣＨ２、ＣＨ３およびＦａｂを含むｍＡｂのマルチドメイン構造の特徴的な立体配座は、それらの結合能および治療有効性にとって重要である。ｍＡｂの場合、特定のドメインの独立した段階的なアンフォールディングが推定され、一般にＣＨ２が最も安定性が低く、ＦａｂおよびＣＨ３が続くと推定される［４８］。
【0121】
アンフォールディングの開始温度（Ｔｏｎ）および最初の融解転移（Ｔｍ１）である安定性を示すパラメータを、０．０１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ（図４参照）の範囲の濃度の界面活性剤の存在下でモデルｍＡｂについて測定した。界面活性剤を添加していないｍＡｂの値（Ｔｏｎ＝６１．５±０．３、Ｔｍ１＝７７．７±０．１）を基準とし、データをヒートマップとして提示した：色が濃いほど、界面活性剤の存在によるそれぞれの温度の低下が強い。一般に、試験した条件の大部分は、治療に関連する界面活性剤濃度内でｍＡｂの立体配座安定性に有意な効果を示さなかった。
【0122】
予想通り、ＳＤＳは、界面活性剤を含まない参照配合物と比較して、濃度依存的な不安定化効果を示した。濃度が高いほど、ＴｏｎおよびＴｍ１の減少は両者で大きくなる。タンパク質の立体構造安定性の強力な不安定化剤であることが知られているＳＤＳを陽性対照として使用した［５５～５７］。ＳＤＳと同様に、ＮａＤＣ、ＮａＧＣおよびｍＰＥＧ－ＤＳＰＥのような負電荷を有する界面活性剤について、既に０．１およびｍｇ／ｍＬのより低い濃度で、熱配座安定性の大きな低下が観察された。しかしながら、Ｔ１１０７のような正に荷電した分子については、立体配座安定性パラメータは影響を受けないままであった。８．７の等電点（ｐＩ）を有するモデルｍＡｂは、ｐＨ７．０の選択された配合条件で全体的に正の正味電荷を有するので、ｍＡｂと負に帯電した界面活性剤との間の電荷－電荷相互作用が、観察された、帯電した界面活性剤の異なる挙動をもたらすと仮定し得る。別の興味深い知見は、１ｍｇ／ｍＬ以上（ＣｈｏｂｉおよびＴＰＧＳ）および１０ｍｇ／ｍＬ（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ）の濃度の非イオン性ステロール系（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＣｈｏｂｉ）またはビタミンＥ系（ＴＰＧＳ）界面活性剤を添加すると、Ｔｏｎがわずかな上昇することであった。界面活性剤ストック溶液を測定し、かなりの蛍光シグナルを示さなかったので、蛍光シグナルの干渉の可能性は除外された。したがって、これらの界面活性剤がｍＡｂの天然状態をわずかなに安定化させる効果がある可能性がより高い。対照的に、ＤＢＣはまた、非イオン性ステロール系界面活性剤も、Ｔｏｎ（１および１０ｍｇ／ｍＬ）およびＴｍ１（１０ｍｇ／ｍＬ）わずかに減少した。この現象は、以下のようなステロール基修飾またはグルカミド官能基の存在のいずれかにおいて異なる構造特性によって説明され得る：（ｉ）ＤＢＣは、ステロール構造の３位に遊離ヒドロキシル基を含有し（ＮａＤＣおよびＮａＧＣと同様）、一方、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＣｈｏｂｉは、この位置に立体的により大きな官能基を保持し、（ｉｉ）ＤＢＳは、ステロール構造の２０位に立体的に大きな親水性グルコンアミド官能化を含有し、一方、ＣｈｏｂｉおよびＣｈｏｌ－ＰＥＧについては、この位置の元の疎水性コレステロール構造は変化しないままであった。後者は、親水性部分としてのグルコナミド官能化を共通して有するＤＢＣ、ＭＥＧＡ－９およびＨＥＧＡ－１０を比較すると、Ｔｏｎ（１および１０ｍｇ／ｍＬ）およびＴｍ１（１０ｍｇ／ｍＬ）に対する同程度の不安定化効果によって裏付けられると思われる。
【0123】
開環型の糖構造および閉環型の糖構造を含む全ての界面活性剤の影響を比較すると、ＤＢＣ、ＭＥＧＡ－９およびＨＥＧＡ－１０、ならびにＳＬについて、高濃度でのｍＡｂの立体配座安定性に対する不安定化効果が明らかになったが、Ｃｈｏｂｉは、開環型糖立体配座および閉環型糖立体配座との間に関係は示されなかった。
【0124】
アルコールエトキシレートの比較により、試験した全ての濃度でＣＳ２０の立体配座不安定化効果がないことが明らかになった。Ｔｏｎのわずかな減少（１および１０ｍｇ／ｍＬ）が以下の順序で観察された：１５－Ｓ－１５＝ＥＨ－９＜ＴＭＮ－６、一方、Ｔｍ１は全て１０ｍｇ／ｍＬで同様の減少を示した。観察された違いは、構造的観点から以下のように説明され得る：（ｉ）直鎖（ＣＳ２０）対分枝アルコールエトキシレート（１５－Ｓ－１５，ＥＨ－９，ＴＭＮ－６）、それぞれ、第一級対第二級アルコールエトキシレート、または（ｉｉ）平均ＰＥＯサブユニットの数の減少（ＣＳ２０（２０～２４ＰＥＯサブユニット）＞１５－Ｓ－１５（１５ＰＥＯサブユニット）＞ＥＨ－９（９ＰＥＯサブユニット）＞ＴＭＮ－６（６ＰＥＯサブユニット）。しかしながら、ＣＳ２０は、医薬品グレードの品質で利用可能であった唯一のアルコールエトキシレートであり、したがって、３つの他の分子と比較して純度がより高いことが想定され得る。遊離アルキル残基のような残留不純物もまた、ポリソルベートについて周知の現象である配座不安定化効果をもたらす可能性がある。
【0125】
スクリーニングされた界面活性剤のサブセット（立体配座安定性に影響を示すいくつかを含む）を次のスクリーニングに取り込み、長期試験中だけでなく機械的および熱的ストレス後のｍＡｂの安定性に対する影響を評価した。このハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の予測特性を明らかにするために、潜在的に性能を有する界面活性剤のいくつか：ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＳＬおよびＤＢＣを以下の界面活性剤の性能スクリーニングにさらに含めた。
【0126】
実施例２：別の界面活性剤性能スクリーニング
１．界面活性剤の存在下での機械的ストレスおよび熱安定性後のタンパク質安定性の評価
ｍＡｂの安定性に対する機械的／界面応力の影響を、撹拌および凍結融解研究を行って試験した。さらに、配合物の熱安定性を試験した。可視粒子（ＶＰ）、色および濁度などの試験された属性について収集されたデータを４つのカテゴリに分類し、ヒートマップとして提示することを可能にした。多くのＶＰ、強い色の変化または高い濁度のようなより好ましくない属性を有する製剤は、より高いクラスに分類され、種々の灰色の強度でマークされた（より暗い強度はパラメータのより強い変化に等しい）。
１．界面活性剤の存在下での機械的ストレスおよび熱安定性後のタンパク質安定性の評価
ｍＡｂの安定性に対する機械的／界面応力の影響を、撹拌および凍結融解研究を行って試験した。さらに、配合物の熱安定性を試験した。可視粒子（ＶＰ）、色および濁度などの試験された属性について収集されたデータを４つのカテゴリに分類し、ヒートマップとして提示することを可能にした。多くのＶＰ、強い色の変化または高い濁度のようなより好ましくない属性を有する製剤は、より高いクラスに分類され、種々の灰色の強度でマークされた（より暗い強度はパラメータのより強い変化に等しい）。
【0127】
試験した界面活性剤レベルを０．１および１ｍｇ／ｍＬで一定に保った。読みやすくするために、界面活性剤を、疎水性部分に基づいて、以下の４つのサブグループに分類した：（ｉ）アシル系、（ｉｉ）アルキル系、（ｉｉｉ）ステロール系、および（ｉｖ）その他。界面活性剤を含まない（図１１参照）、ＰＳ２０（図１１参照）またはＰｘ１８８（図１４参照）のいずれかを含有する配合物を、代替界面活性剤の性能を評価するための指針として使用した。
【0128】
アシル基
アシルを有する群では、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥは、プラセボ製剤では見られなかった多くのＶＰおよび高い濁度値で著しく不良な結果を示した。この現象は主に１ｍｇ／ｍＬ製剤で認められたため、その理由は、ｍＡｂの立体配座安定性を低下させる既に記載された電荷－電荷相互作用である可能性がある（図４）。さらに、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥは、ステロール系界面活性剤に見られるような比較的高いＤＳＴを有する。ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥは、臨界ミセル濃度が低く（ＣＭＣ：１×１０－６Ｍ）、比較的小さい柔軟な構造を有するので、これらの知見は予想外であった。理論に束縛されるものではないが、説明は、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥおよびｍＡｂの電荷－電荷相互作用であり得、界面に存在する界面活性剤分子の量が少なく、拡散性が低く、見かけの分子量が高くなることが考えられる。さらに、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥミセルの緩やかな分解も関与し、界面安定性特性の低下をもたらし得る。一方、ＳＬは、ほとんどの試験中により良好な結果を示し、ＶＰ、濁度およびＤＳＴに関しての結果（図１１）はＰＳ２０と同等であった。ＳＬは、おそらく振盪時に１ｍｇ／ｍＬでかなり安定性が向上しており、ここでは、１０％を超えるＨＭＷＳの変化は、より低い界面活性剤濃度でかなり増加した（図６）。予備スクリーニングでは、ＳＬおよびｍＰＥＧ－ＤＳＰＥはいずれも、より高い濃度で立体配座不安定化効果を示したが、より低い濃度では効果がないか、またはわずかな効果しか示さなかった（図４および図５）。予備スクリーニングからの所見を予測尺度として検証するために、熱ストレス試験の結果と比較した。ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥの場合、結果はこれらの所見を支持するようである。この界面活性剤については、０．１ｍｇ／ｍＬではなく１ｍｇ／ｍＬの製剤のみが、ＳＶＰが大幅に増加し、濁度が増加した。
アシルを有する群では、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥは、プラセボ製剤では見られなかった多くのＶＰおよび高い濁度値で著しく不良な結果を示した。この現象は主に１ｍｇ／ｍＬ製剤で認められたため、その理由は、ｍＡｂの立体配座安定性を低下させる既に記載された電荷－電荷相互作用である可能性がある（図４）。さらに、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥは、ステロール系界面活性剤に見られるような比較的高いＤＳＴを有する。ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥは、臨界ミセル濃度が低く（ＣＭＣ：１×１０－６Ｍ）、比較的小さい柔軟な構造を有するので、これらの知見は予想外であった。理論に束縛されるものではないが、説明は、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥおよびｍＡｂの電荷－電荷相互作用であり得、界面に存在する界面活性剤分子の量が少なく、拡散性が低く、見かけの分子量が高くなることが考えられる。さらに、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥミセルの緩やかな分解も関与し、界面安定性特性の低下をもたらし得る。一方、ＳＬは、ほとんどの試験中により良好な結果を示し、ＶＰ、濁度およびＤＳＴに関しての結果（図１１）はＰＳ２０と同等であった。ＳＬは、おそらく振盪時に１ｍｇ／ｍＬでかなり安定性が向上しており、ここでは、１０％を超えるＨＭＷＳの変化は、より低い界面活性剤濃度でかなり増加した（図６）。予備スクリーニングでは、ＳＬおよびｍＰＥＧ－ＤＳＰＥはいずれも、より高い濃度で立体配座不安定化効果を示したが、より低い濃度では効果がないか、またはわずかな効果しか示さなかった（図４および図５）。予備スクリーニングからの所見を予測尺度として検証するために、熱ストレス試験の結果と比較した。ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥの場合、結果はこれらの所見を支持するようである。この界面活性剤については、０．１ｍｇ／ｍＬではなく１ｍｇ／ｍＬの製剤のみが、ＳＶＰが大幅に増加し、濁度が増加した。
【0129】
ＰＳ２０を含む対照製剤では、可視粒子が少量見られた。両方の濃度であるが、特に０．１ｍｇ／ｍＬのＰＳ２０は、全ての印加応力中に良好な安定化効果を示した。一方、Ｐｘ１８８製剤は、ほとんどのストレス試験において、特に低い界面活性剤濃度での振盪中に多くの大きなタンパク質粒子を含有していた。両化合物の動的表面張力（ＤＳＴ）を比較すると、１ｍｇ／ｍＬで顕著な差が観察されたが、より低い界面活性剤濃度では観察されなかった（図１１）。
【0130】
アルキル基
特に高濃度でより多量のＶＰおよび濁度を有するアルキル系界面活性剤では、別の群の現象が見られた（図１２）。これらの粒子はプラセボ製剤でもしばしば観察され、大量の２μ以上のＳＶＰを有するＥＨ－９製剤で顕著に認められた（図７）。不溶性不純物が存在する可能性があり、この群のＶＰを説明し得るが、さらなる調査は行わなかった。例外はＣＳ２０であり、医薬品グレードで利用可能なこの群の唯一の界面活性剤であった。ここで、試験した両方の濃度は、初期時点で可視粒子がなかった。１５－Ｓ－１５についても同様の知見が得られた。１ｍｇ／ｍＬのＣＳ２０製剤は、ＶＰおよび濁度の増加を伴う高温条件で分解が増加した（図１２）。さらに、ＳＶＰ（図７）およびＨＭＷＳ（図６Ｄ）の増加が観察された。分解理論は、１Ｈ－ＮＭＲ測定によって裏付けられた（データは示さず）。ＴＭＮ－６は良好に機能し、ストレス試験または長期保存中にタンパク質の品質属性に実質的な影響を示さなかった。より高い（１ｍｇ／ｍＬ）製剤について濁度の増加が観察された。他の界面活性剤群と比較して、アルキル系化合物は、界面での高い充填密度をもたらすこれらの界面活性剤の柔軟な構造によって説明され得る最も低いＤＳＴを示した。それにもかかわらず、溶解度の問題により、ストレス試験の結果を解釈することが困難となり、潜在的な不純物およびそれらの影響を特定するためにさらなる調査が必要である。したがって、代替界面活性剤としてのこれらの分子の性能評価が容易になるであろう。要約すると、１５－Ｓ－１５およびＴＭＮ－６は全て、適用された界面応力および熱応力後に許容可能な品質を示し（特に０．１ｍｇ／ｍＬ製剤について）、場合によってはＰＳ２０よりもわずかに優れていた。
特に高濃度でより多量のＶＰおよび濁度を有するアルキル系界面活性剤では、別の群の現象が見られた（図１２）。これらの粒子はプラセボ製剤でもしばしば観察され、大量の２μ以上のＳＶＰを有するＥＨ－９製剤で顕著に認められた（図７）。不溶性不純物が存在する可能性があり、この群のＶＰを説明し得るが、さらなる調査は行わなかった。例外はＣＳ２０であり、医薬品グレードで利用可能なこの群の唯一の界面活性剤であった。ここで、試験した両方の濃度は、初期時点で可視粒子がなかった。１５－Ｓ－１５についても同様の知見が得られた。１ｍｇ／ｍＬのＣＳ２０製剤は、ＶＰおよび濁度の増加を伴う高温条件で分解が増加した（図１２）。さらに、ＳＶＰ（図７）およびＨＭＷＳ（図６Ｄ）の増加が観察された。分解理論は、１Ｈ－ＮＭＲ測定によって裏付けられた（データは示さず）。ＴＭＮ－６は良好に機能し、ストレス試験または長期保存中にタンパク質の品質属性に実質的な影響を示さなかった。より高い（１ｍｇ／ｍＬ）製剤について濁度の増加が観察された。他の界面活性剤群と比較して、アルキル系化合物は、界面での高い充填密度をもたらすこれらの界面活性剤の柔軟な構造によって説明され得る最も低いＤＳＴを示した。それにもかかわらず、溶解度の問題により、ストレス試験の結果を解釈することが困難となり、潜在的な不純物およびそれらの影響を特定するためにさらなる調査が必要である。したがって、代替界面活性剤としてのこれらの分子の性能評価が容易になるであろう。要約すると、１５－Ｓ－１５およびＴＭＮ－６は全て、適用された界面応力および熱応力後に許容可能な品質を示し（特に０．１ｍｇ／ｍＬ製剤について）、場合によってはＰＳ２０よりもわずかに優れていた。
【0131】
ステロール基
興味深いことに、ほとんどのステロール系界面活性剤は、安定化効果を示さなかったか、または安定化効果は無視できる程度であった。振盪ストレス後、これらの製剤は、比較的多量のＶＰ、高い濁度、およびＣｈｏｂｉの場合には色の強い変化さえ示した。不溶性不純物が存在する可能性があり、この群のＶＰを説明し得るが、さらなる調査は行わなかった。振盪時の最も強い粒子形成は、Ｃｈｏｂｉで見られた。この製剤は、界面活性剤を含まない製剤と同様の挙動を示すことさえある。さらに、両配合物の動的表面張力は約７３ｍＮ／ｍと同程度であった。ＤＳＴは、界面活性剤が界面内の凝集力をどれだけ効果的に乱し得るか、界面における変化、例えば振盪中の変化にどれだけ強く適応し得るかを記述している。Ｃｈｏｂｉおよび対照製剤の両製剤の高いＤＳＴは、界面でのタンパク質安定化効果が少ないことを示し、振盪研究の結果を再び説明し得る。界面活性剤を含まないＣｈｏｂｉ製剤および対照製剤の両方についてのＦ／Ｔ研究でも、界面での欠損安定化効果が見られる。一般に、ほとんどの界面活性剤では、凍結融解応力に対して少量のＶＰで良好な安定化効果が示された。データから、より高いＤＳＴ値についてＶＰの増加に伴うＤＳＴと振盪試験の結果との間のいくらかの相関関係があることが示唆された。界面活性剤／不純物の溶解度または界面活性剤－タンパク質相互作用などの他の要因もＶＰ形成に影響を及ぼし得るので、さらなる調査が必要である。Ｃｈｏｂｉの他に、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＤＢＣも、特に撹拌後に粒子が形成され、比較的高いＤＳＴ値を示した。しかしながら、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧは、全ての試験条件、特により高い１ｍｇ／ｍＬ製剤条件で良好なタンパク質品質属性（すなわち、ＨＭＷＳおよびＩＥ－ＨＰＬＣ主ピークの損失）をもたらした。振盪ストレス試験後に肉眼で見える粒子が観察されたが、試験条件は実際に観察されたよりもはるかに厳しく、結果はＰｘ１８８対照に匹敵した。さらに、１ｍｇ／ｍＬのＤＢＣを用いた装置は、最初に多くの粒子を示し（図１３）、プラセボ製剤では溶解性の問題を示した。ＶＰにもかかわらず、１０μｍを超えるＳＶＰ（図５）および可溶性凝集体（図６）は、特に２５℃で実施した場合、振盪後に増加した。さらに、ＣｈｏｂｉおよびＤＢＣは、ＵＳＰ＜７８７＞基準である容器あたり１０μｍ以上の粒子が最大６，０００個を超えた。一方、Ｆ／Ｔおよび熱応力は、ＨＭＷＳまたはＳＶＰに著しい増加を示さなかった。
興味深いことに、ほとんどのステロール系界面活性剤は、安定化効果を示さなかったか、または安定化効果は無視できる程度であった。振盪ストレス後、これらの製剤は、比較的多量のＶＰ、高い濁度、およびＣｈｏｂｉの場合には色の強い変化さえ示した。不溶性不純物が存在する可能性があり、この群のＶＰを説明し得るが、さらなる調査は行わなかった。振盪時の最も強い粒子形成は、Ｃｈｏｂｉで見られた。この製剤は、界面活性剤を含まない製剤と同様の挙動を示すことさえある。さらに、両配合物の動的表面張力は約７３ｍＮ／ｍと同程度であった。ＤＳＴは、界面活性剤が界面内の凝集力をどれだけ効果的に乱し得るか、界面における変化、例えば振盪中の変化にどれだけ強く適応し得るかを記述している。Ｃｈｏｂｉおよび対照製剤の両製剤の高いＤＳＴは、界面でのタンパク質安定化効果が少ないことを示し、振盪研究の結果を再び説明し得る。界面活性剤を含まないＣｈｏｂｉ製剤および対照製剤の両方についてのＦ／Ｔ研究でも、界面での欠損安定化効果が見られる。一般に、ほとんどの界面活性剤では、凍結融解応力に対して少量のＶＰで良好な安定化効果が示された。データから、より高いＤＳＴ値についてＶＰの増加に伴うＤＳＴと振盪試験の結果との間のいくらかの相関関係があることが示唆された。界面活性剤／不純物の溶解度または界面活性剤－タンパク質相互作用などの他の要因もＶＰ形成に影響を及ぼし得るので、さらなる調査が必要である。Ｃｈｏｂｉの他に、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＤＢＣも、特に撹拌後に粒子が形成され、比較的高いＤＳＴ値を示した。しかしながら、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧは、全ての試験条件、特により高い１ｍｇ／ｍＬ製剤条件で良好なタンパク質品質属性（すなわち、ＨＭＷＳおよびＩＥ－ＨＰＬＣ主ピークの損失）をもたらした。振盪ストレス試験後に肉眼で見える粒子が観察されたが、試験条件は実際に観察されたよりもはるかに厳しく、結果はＰｘ１８８対照に匹敵した。さらに、１ｍｇ／ｍＬのＤＢＣを用いた装置は、最初に多くの粒子を示し（図１３）、プラセボ製剤では溶解性の問題を示した。ＶＰにもかかわらず、１０μｍを超えるＳＶＰ（図５）および可溶性凝集体（図６）は、特に２５℃で実施した場合、振盪後に増加した。さらに、ＣｈｏｂｉおよびＤＢＣは、ＵＳＰ＜７８７＞基準である容器あたり１０μｍ以上の粒子が最大６，０００個を超えた。一方、Ｆ／Ｔおよび熱応力は、ＨＭＷＳまたはＳＶＰに著しい増加を示さなかった。
【0132】
ステロール系界面活性剤に関する以前の研究では、界面で好ましい立体配座を形成するために剛性で嵩高いステロール環構造が長期間適合していることが報告された。界面活性剤の配向は、剛直な骨格を有するより大きな界面活性剤ではより複雑であり、したがって、平衡表面張力に達するまでの時間が長い（２時間超）ことが報告された［６４，６５］。このデータは、本発明者らの振盪実験の結果を裏付けている。ステロール系界面活性剤は、例えば振盪中に、界面での変化に迅速に反応しないことがある。
【0133】
その他
この群には、ポリマー界面活性剤、ポロキサマー、ポロキサミンおよびポリビニルアルコールならびにトコフェロール系化合物ＴＰＧＳが含まれる。この群内の全ての製剤は、より高い界面活性剤濃度でより低い量のＶＰおよび濁度値を示した（図１４）。１ｍｇ／ｍＬ製剤をストレス振盪すると、ＳＶＰ（図５）および可溶性凝集体（図６）がかなり少なくなった。興味深いことに、Ｐｘ１８８について最も強い粒子形成が見られた。データでは、界面応力からｍＡｂを保護する能力に対するポロキサマーおよびポロキサミンのＨＬＢの依存性が示唆されている。ＨＬＢが２７超と比較的高いＰｘ１８８およびＰｘ３３８と比較して、Ｐｘ４０７（ＨＬＢ：２２）およびＴ１１０７（ＨＬＢ：１８－２３）のストレス試験の結果は、既に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で、かなり良好であった。化合物のＨＬＢおよび分子量が異なるため、動的表面張力がわずかに異なることが予想された。しかしながら、市販のサンプルは、ＤＳＴ測定の結果を説明し得る平均的な分子量およびＨＬＢを有する分子混合物の不均一な組成物である。一般に、この群の界面活性剤のＤＳＴは比較的高く、特に低い界面活性剤濃度では安定化効果が低いことを説明し得る。モル比（ｍＡｂ：界面活性剤）をＰＳ２０参照配合物と比較すると、ポリマー界面活性剤は、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ約１：０．００４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、１：０．０４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の約１０倍低いモル比を有することに留意すべきである。これらの知見はまた、振盪時の安定化効果が低いことを説明し得る。
この群には、ポリマー界面活性剤、ポロキサマー、ポロキサミンおよびポリビニルアルコールならびにトコフェロール系化合物ＴＰＧＳが含まれる。この群内の全ての製剤は、より高い界面活性剤濃度でより低い量のＶＰおよび濁度値を示した（図１４）。１ｍｇ／ｍＬ製剤をストレス振盪すると、ＳＶＰ（図５）および可溶性凝集体（図６）がかなり少なくなった。興味深いことに、Ｐｘ１８８について最も強い粒子形成が見られた。データでは、界面応力からｍＡｂを保護する能力に対するポロキサマーおよびポロキサミンのＨＬＢの依存性が示唆されている。ＨＬＢが２７超と比較的高いＰｘ１８８およびＰｘ３３８と比較して、Ｐｘ４０７（ＨＬＢ：２２）およびＴ１１０７（ＨＬＢ：１８－２３）のストレス試験の結果は、既に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で、かなり良好であった。化合物のＨＬＢおよび分子量が異なるため、動的表面張力がわずかに異なることが予想された。しかしながら、市販のサンプルは、ＤＳＴ測定の結果を説明し得る平均的な分子量およびＨＬＢを有する分子混合物の不均一な組成物である。一般に、この群の界面活性剤のＤＳＴは比較的高く、特に低い界面活性剤濃度では安定化効果が低いことを説明し得る。モル比（ｍＡｂ：界面活性剤）をＰＳ２０参照配合物と比較すると、ポリマー界面活性剤は、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ約１：０．００４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、１：０．０４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の約１０倍低いモル比を有することに留意すべきである。これらの知見はまた、振盪時の安定化効果が低いことを説明し得る。
【0134】
むしろ予想外であったのは、１ｍｇ／ｍＬのＴＰＧＳを含む製剤の品質が良好であったことである。ビタミンＥ系界面活性剤ＴＰＧＳはまた、ステロール系界面活性剤と同様の剛直な環構造を有するが、アルキル鎖がさらに結合している。さらに、ステロール系界面活性剤について既に見られた両方の濃度についてほぼ一定であったかなり高いＤＳＴも示した。したがって、振盪応力後の同等の結果が予想されたが、興味深いことに、１ｍｇ／ｍＬのＴＰＧＳがＶＰ、ＳＶＰおよびＨＭＷＳに関して非常に良好に機能した。ＤＳＴの測定は、振盪時の粒子形成の傾向についての信頼できる予測を常に与えるとは限らないと思われ、さらなる調査が必要である。
【0135】
要約すると、１ｍｇ／ｍＬのＳＬ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、およびＰｘ４０７を含む製剤は、全ての適用された応力および貯蔵条件に対して許容される品質であった。さらに、この濃度では、ＰＶＡおよびＴＰＧＳを含む製剤は、優れた製品品質で非常に良好な安定化効果を示した。約６０ｍＮ／ｍのＤＳＴは比較的高かったが、これらの化合物は有望な代替界面活性剤候補である。１５－Ｓ－１５およびＴＭＮ－６は、より低い界面活性剤濃度（０．１ｍｇ／ｍＬ）で、全ての印加応力および貯蔵条件で許容可能な品質を示した。
【0136】
２．）長期タンパク質安定性
長期保存条件下では、タンパク質の安定性に対する潜在的な悪影響は除外されるべきであった。したがって、製剤の安定性を、肉眼で見える粒子および顕微鏡可視粒子の形成、色および濁度の変化ならびにモノマー含有量（図１１－１４）に関して、５℃および２５℃で６ヶ月間の貯蔵について評価した。
長期保存条件下では、タンパク質の安定性に対する潜在的な悪影響は除外されるべきであった。したがって、製剤の安定性を、肉眼で見える粒子および顕微鏡可視粒子の形成、色および濁度の変化ならびにモノマー含有量（図１１－１４）に関して、５℃および２５℃で６ヶ月間の貯蔵について評価した。
【0137】
界面活性剤を含まない製剤を参照としてさらに使用し、代替の界面活性剤製剤を、悪影響を及ぼさないことが知られている確立された界面活性剤ＰＳ２０およびＰｘ１８８と比較した。界面活性剤を含まない参照配合物は、両温度で６ヶ月間貯蔵した後に多量のＶＰを示した。さらに、２５℃での貯蔵における１０μｍ以上のＳＶＰ含有量は、初期と比較してわずかに増加した。ＰＳ２０についても同様の結果が見られた。ここで、ＶＰの形成は、特に高濃度および高温で観察されたが、ＳＶＰ量は増加しなかった（図１１）。Ｐｘ１８８の濃度が０．１ｍｇ／ｍＬであるストレス試験製剤の結果とは対照的に、長期保存では、全ての分析中に両温度で良好な安定性を示した。Ｇｒａｐｅｎｔｉｎらは、長期保存時の液体ｍＡｂバイアル製剤中のＰＳ２０およびＰｘ１８８の同等の安定化結果を示した［６６］。
【0138】
３種全ての参照配合物は、色、濁度およびモノマー含有量の変化を示さなかった（図１１および図１２）。しかし、ほとんどの製剤は、これらの試験中に大きな変化を示さなかったことに留意する必要がある。光遮蔽によって測定された、顕微鏡可視粒子の数は、一般に低レベルであり、報告された値は、薬局方ＵＳＰ＜７８７＞およびＰｈ．Ｅｕｒ２．９．１９．に従って許容される最大数よりも有意に低い。ＳＶＰレベルのわずかな増加が、前述の熱分解によって説明され得る高温でのＣＳ２０配合物について観察された。ＳＶＰに加えて、より高い濁度およびＳＥ－ＨＰＬＣによるモノマー含有量の減少が観察された（図８）。さらに、ＣＳ２０製剤のＩＥ－ＨＰＬＣにより、高いストレス温度条件でＰＳ２０およびＰｘ１８８を有する参照製剤と比較して、主ピーク面積が減少することが明らかになった（図９）。これは、ＣＳ２０分解産物によってｍＡｂの分解が開始したことが示唆され得る。
【0139】
高濃度のアルキル界面活性剤ＴＭＮ－６およびＥＨ－９についても濁度の増加が観察された。事前に記載された現象は、潜在的な不純物または界面活性剤自体の溶解度の問題に起因する可能性がある。それらの小さく柔軟な構造のために、これらの界面活性剤の界面応力に対する良好な性能を想定し得るが、ＰＳ２０について既に記載されているように酸化分解のより強い傾向も想定し得る［２５，２６］。残念ながら、特に高濃度での溶解度の問題は、粒子の観点から性能の解釈を困難にする。
【0140】
本研究では、長期安定性と立体配座安定性との間の相関を確認し得なかった。ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥおよびＳＬ製剤のＶＰ量は両方の濃度で高かったが、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥではなくＳＬのみが、より高い濃度でモノマー含有量のわずかな減少を示した（図８）。構造安定性がわずかに低下した第三の界面活性剤であるＤＢＣを含む処方の評価も、高い濃度で溶解性に問題が生じるため、非常に重要であった。要約すると、本発明者らの場合の事前スクリーニング（図４）で観察されたＴｏｎのわずかな変化は、これまでのところタンパク質安定性に対する予測特性を有していない。
【0141】
一般に、「その他」の群の界面活性剤は、ＶＰおよびＳＶＰが低く、高いモノマー含有量での長期保存時に良好な結果を示した。例外は、両濃度で高温でＶＰ形成が観察されたが５℃では観察されなかったＰＶＡ配合物である。２～８℃の周囲貯蔵温度での代替界面活性剤としてのＰＶＡの性能について記述するために、さらなる時点を分析する必要がある。
【0142】
界面応力試験の結果とは対照的に、特に低濃度での長期保存時のステロール系界面活性剤の安定化特性は非常に良好であった。この界面活性剤群は、界面に吸着するのにより多くの時間を必要とし、したがって、振盪中に存在する速い界面変化時にタンパク質を同様に保護できないか、または十分に安定化するためにより高い濃度を必要とすると思われる。しかしながら、界面活性剤が界面に吸着するのに十分な時間を有する場合、界面活性剤はその安定化効果を発現し得る。それにもかかわらず、製剤（ＤＰ）は輸送中に機械的応力にさらされるため、試験されたステロール系界面活性剤のほとんどは、確立された界面活性剤ＰＳ２０およびＰｘ１８８の代替物として適切ではない。
【0143】
３）機械的ストレスおよび熱安定性後の界面活性剤選択の存在下でのｍＡｂ２およびｍＡｂ３のタンパク質安定性の評価
本発明者らはさらに、タンパク質製剤を安定化させる効率に関して、選択された一連の界面活性剤（ＰＳ２０、ＰＳ８０、ＳＬ、１５－Ｓ－１５、ＴＭＮ－６、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、Ｐｘ１８８、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、Ｔ１１０７、ＰＶＡおよびＴＰＧＳ）について検討する。それぞれ２５ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの濃度の２種の異なるｍＡｂ（２および３）の存在下での低レベルの０．１ｍｇ／ｍＬ界面活性剤を試験した。ＰＳ２０（図１５）およびＰｘ１８８（図１８）界面活性剤に対して、ＰＳ８０を添加して、一補足対照を含めた。この補足試験は、機械的および熱的ストレス下での２つの他のｍＡｂの安定性に対する第１のスクリーニング（すなわち、本明細書におけるｍＡｂ１について）からの有望な界面活性剤候補のプラスの効果を確認するために設定された。条件は前述のものと同一であり、５℃および２５℃で７日間２００ｒｐｍで振盪し、－２０℃～５℃の５回の凍結／解凍サイクルを行い、５℃、２５℃および４０℃で４週間保存する。
本発明者らはさらに、タンパク質製剤を安定化させる効率に関して、選択された一連の界面活性剤（ＰＳ２０、ＰＳ８０、ＳＬ、１５－Ｓ－１５、ＴＭＮ－６、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、Ｐｘ１８８、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、Ｔ１１０７、ＰＶＡおよびＴＰＧＳ）について検討する。それぞれ２５ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの濃度の２種の異なるｍＡｂ（２および３）の存在下での低レベルの０．１ｍｇ／ｍＬ界面活性剤を試験した。ＰＳ２０（図１５）およびＰｘ１８８（図１８）界面活性剤に対して、ＰＳ８０を添加して、一補足対照を含めた。この補足試験は、機械的および熱的ストレス下での２つの他のｍＡｂの安定性に対する第１のスクリーニング（すなわち、本明細書におけるｍＡｂ１について）からの有望な界面活性剤候補のプラスの効果を確認するために設定された。条件は前述のものと同一であり、５℃および２５℃で７日間２００ｒｐｍで振盪し、－２０℃～５℃の５回の凍結／解凍サイクルを行い、５℃、２５℃および４０℃で４週間保存する。
【0144】
ＰＳ２０およびＰＳ８０は、特にｍＡｂ３の場合、振盪およびＦ／Ｔなどの機械的ストレス条件においてタンパク質を十分に保護するが、ＰＳ２０製剤の高温での４週間の貯蔵は、ｍＡｂ２の場合、多数の肉眼で見えない粒子を生じる（図１５）。
【0145】
アルキル界面活性剤群、特に１５－Ｓ－１５では、ＨＣＰによる分解のリスクがより低いｍＡｂ２およびｍＡｂ３について、これらの機械的ストレス条件で良好な保護作用を示す（図１６）。１５－Ｓ－１５は、既知のより低い立体配座タンパク質安定性を有する二重特異性抗体断片を含む３種の異なるｍＡｂ（ｍＡｂ３）について、ポリソルベートＰＳ２０およびＰＳ８０ならびにＰｘ１８８と比較して同等または優れたタンパク質保護作用を示し得た。これらの知見により、１５－Ｓ－１５は代替界面活性剤として非常に有望な候補ことがわかった。アルキルクラスから試験した別の界面活性剤であるＴＭＮ－６は、ｍＡｂ２に対して良好な保護作用を示したが、ｍＡｂ３の機械的および熱的ストレス後に多くのＶＰが観察された。
【0146】
ＰＳ２０およびＰＳ８０と比較して、界面活性剤ＳＬ、ＰＶＡ、ポロキサマーＰｘ３３８およびＰｘ４０７、Ｔ１１０７およびＴＰＧＳは振盪条件下で同様に機能しなかったが、Ｐｘ１８８と比較して、ｍＡｂ２の保護作用は、より少ないＶＰ、特に２５℃でより良好であった（図１５および図１８）。ｍＡｂ３の場合、これらの界面活性剤およびＰｘ１８８との間のＶＰカウントの差は観察されず、それらが全てかなり高いカウントを示した。しかし、これらの界面活性剤とｍＡｂ３を４週間以上保存した場合のＶＰ数は、Ｐｘ１８８と比較して全般的に低い。Ｃｈｏｌ－ＰＥＧの場合、Ｐｘ１８８と比較して優れた保護作用を示す上記の傾向は観察されなかった（図１７）。ＳＶＰの傾向はわずかに異なり、ｍＡｂ３配合物がいくつかの界面活性剤間、特に振盪条件でＳＶＰ数に劇的な差を有する場合、全ての界面活性剤およびｍＡｂ２配合物は同じ範囲にある。さらに、振盪条件におけるｍＡｂ３について、本発明者らは、ＰＶＡ、Ｐｘ４０７、Ｔ１１０７およびＴＰＧＳがＰｘ１８８よりも低いカウントを示し、ＴＰＧＳがＰＳ２０およびＰＳ８０に近い範囲でさえあることを観察する（図１５および図１８）。
【0147】
可溶性ｍＡｂ凝集体に関して、条件および界面活性剤の大部分は、ｍＡｂ２については同じ量のＨＭＷＳを示し、ｍＡｂ３については大きな違いが示されたのは２つのみであった。ｍＡｂ３についての４０°Ｃでの貯蔵は、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、Ｔ１１０７、ＰＶＡおよびＴＰＧＳがポリソルベートよりもＨＭＷＳが少なく（図１７および図１８）、ＳＬは、ｍＡｂ３について全体的に最も低いＨＭＷＳ量を有する可溶性凝集体に対して驚くべき効果を有するが、依然として高いＳＶＰカウントが存在することを示す（図１５）。
【0148】
界面活性剤候補、タンパク質および条件のこの選択からの一般的な結果として、１５－Ｓ－１５は、広範囲の製剤および試験した全てのｍＡｂにおいてＰＳ２０、ＰＳ８０およびＰｘ１８８と同等であるか、優れているので、最も効率的な界面活性剤の１つとして同定し得る。ＴＰＧＳ、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、ＴＭＮ－６およびＳＬは、機械的ストレスの間、ポリソルベートと比較して、特にｍＡｂ３と比較して保護作用は低かったが、性能はＰｘ１８８と同等またはそれより良好であった。さらに、界面活性剤Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＰＶＡ、Ｔ１１０７およびＴＰＧＳを、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３について、ｍＡｂ１についての最初のスクリーニングで見られる理想的な範囲よりも低い界面活性剤濃度で試験したが、それでもなお、Ｐｘ１８８よりも良好な保護作用を示した。１５－Ｓ－１５およびＴＭＮ－６の場合、ｍＡｂ１に見られる理想的な濃度範囲は、両方の界面活性剤がそれらの全体的な保護作用を保持しているｍＡｂ２およびｍＡｂ３の試験にも使用された。最初の試験（すなわち、ｍＡｂ１）からのＣｈｏｌ－ＰＥＧの陽性性能は、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３では確認されなかった。実際、この第２の試験において、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３の保護作用は、ほとんどの条件においてＰｘ１８８と比較して低かった（図１７）。
【0149】
要約すると、本発明は、例えば図１に示すような界面活性剤クラスまたはサブグループ全体に基づいて、タンパク質製剤の安定性に対する正の効果を特定しなかった。驚くべきことに、ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｔ１１０７、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、１５－Ｓ－１５、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＳＬを用いて、本発明は、確立されたＰＳ２０、ＰＳ８０およびＰｘ１８８よりも同等または優れたタンパク質安定化効果を示す９種の界面活性剤を同定した。特に、１ｍｇ／ｍＬのＴＰＧＳおよびＰＶＡは、界面および熱ストレス条件の両方において、少量のＶＰ、ＳＶＰおよびＨＭＷＳで非常に良好な安定化特性を示した。しかし、従来の界面活性剤Ｐｘ１８８と比較して、１ｍｇ／ｍＬのＰｘ３３８、Ｐｘ４０７、Ｔ１１０７、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧおよびＳＬを含有する製剤も、ほとんどの印加応力および安定性中に、より少ない量のＶＰおよびＳＶＰで優れた安定化効果を示した。ＳＬ製剤は、高温での長期貯蔵後にモノマー含有量のわずかな減少を示したが、意図された貯蔵条件が２～８°Ｃであるので、これらの界面活性剤はＰＳ２０およびＰｘ１８８の潜在的な代替物と考えられる。１５－Ｓ－１５およびＴＭＮ－６製剤の場合、ＰＳ２０に匹敵する良好なタンパク質安定化特性を提供するには、さらに低い界面活性剤濃度で十分であった。また、ｍＡｂ２およびｍＡｂ３の存在下でも、０．１ｍｇ／ｍＬの１５－Ｓ－１５のより低い濃度は、全ての界面活性剤の最良の安定化特性を提供し、ＰＳ２０およびＰＳ８０を超えている。ＴＰＧＳ、ＰＶＡ、Ｐｘ３３８、Ｐｘ４０７、ＴＭＮ－６、ＳＬ、Ｔ１１０７はＰｘ１８８よりも良好または同等である。
【0150】
参考文献
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図14-4】
【図14-5】
【図14-6】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【国際調査報告】