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特表2023-532939チロシンを有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化による疾患の予防、改善または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-01
(54)【発明の名称】チロシンを有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化による疾患の予防、改善または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/175 20160101AFI20230725BHJP
A61K 31/198 20060101ALI20230725BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230725BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20230725BHJP
A61P 25/22 20060101ALI20230725BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20230725BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20230725BHJP
A61P 25/20 20060101ALI20230725BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230725BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20230725BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230725BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230725BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20230725BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20230725BHJP
A23L 2/52 20060101ALI20230725BHJP
A23G 3/36 20060101ALI20230725BHJP
【ＦＩ】
A23L33/175
A61K31/198
A61P25/00
A61P25/08
A61P25/22
A61P25/24
A61P9/10
A61P25/20
A61P3/10
A61P27/06
A61P25/28
A61P35/00
A61K9/20
A61P13/12
A23L2/52
A23L2/00 F
A23G3/36
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022581606
(86)(22)【出願日】2021-06-30
(85)【翻訳文提出日】2023-02-27
(86)【国際出願番号】 KR2021008259
(87)【国際公開番号】W WO2022005201
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】10-2020-0080308
(32)【優先日】2020-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516172857
【氏名又は名称】インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション キョンサン ナショナル ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヒュン・ジュン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ジェ・スン・カン
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ヒュン・ベク
(72)【発明者】
【氏名】スンウン・ジュン
(72)【発明者】
【氏名】サン・ウォン・パク
【テーマコード（参考）】
4B014
4B018
4B117
4C076
4C206
【Ｆターム（参考）】
4B014GB06
4B014GB07
4B014GL09
4B018LB01
4B018LB08
4B018LB10
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD19
4B018ME14
4B117LC04
4B117LK14
4C076AA36
4C076CC01
4C076CC10
4C076CC11
4C076CC17
4C076CC21
4C076CC27
4C076CC40
4C206AA01
4C206AA02
4C206FA53
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA72
4C206NA14
4C206ZA02
4C206ZA05
4C206ZA06
4C206ZA12
4C206ZA15
4C206ZA16
4C206ZA33
4C206ZA36
4C206ZA81
4C206ZB26
4C206ZC35
(57)【要約】
本発明は、チロシンを有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防、改善または治療用組成物に関するものである。本発明の有効成分であるチロシンが低下したＧＳ活性を増進させるだけではなく、脳でのグルタミン、グルタミン酸の含量（割合）及びアンモニアの量を定常状態に回復させる効果があり、第２型糖尿モデルにおけるインスリン敏感度増進、癲癇発作モデルにおける興奮毒性と酸化ストレス抑制効果、脳卒中モデルにおける脳梗塞低減及びＧＳ活性増進効果、ヒト組換えMnSODを用いたチロシンのニトロ化除去効果急性腎不全における効果、及び高アンモニア血症に対する効果があるので、タンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物またはタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または治療用薬学組成物として有用に使用されうる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
チロシンまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項2】
前記タンパク質内のチロシンのニトロ化は、チロシンヒドロキシラーゼ(tyrosine hydroxylase)、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Mn Superoxide dismutase)、Cu/Znスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn Superoxide dismutase)、インスリン受容体βサブユニット(insulin receptor β subunit)、アネキシンIV(annexin IV)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(glutamate dehydrogenase)、3-α-OHステロイドデヒドロゲナーゼ(3-α-OH steroid dehydrogenase)、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ(glutathione S-transferase)、３－ケトアシルＣｏＡチオラーゼ(3-ketoacyl CoA thiolase)、カタラーゼ(catalase)、Ｔａｕタンパク質、ミトコンドリア複合体１(mitochondria complex 1)、α－シヌクレイン(α-synuclein)、アポジダンバック－Ａ１(apolipoprotein-A1)、アミロイド－β(amyloid-β)及びＮＭＤＡ受容体(NMDA receptor)のうち、選択されたいずれか１つのタンパク質内のチロシンのニトロ化であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項3】
前記タンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患は、うつ病(depressive disorder)、不安障害(anxiety disorder)、脳卒中(stroke)、癲癇(epilepsy)、緑内障(glaucoma)、糖尿病(diabetes)、糖尿病網膜症(diabetic retinopathy)、発作(seizure)、肝性脳症(hepaticencephalopathy)、認知機能障害(cognitive impairment)、脳発達障害(brain development impairment)、癌(cancer)、アルツハイマー病(Alzheimer disease)、急性腎障害(Acute kidney injury)及び高アンモニア血症(Hyperammonemia)のうち、選択されたいずれか１であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項4】
前記タンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患は、脳、肝、筋肉、脂肪組織、腎臓組織、膵膓または肺から発生することを特徴とする請求項１に記載のタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項5】
前記組成物は、丸、錠剤(tablet)、カプセル(capsule)、散剤、粉末、顆粒、キャンデー、シロップ及び飲料のうち、選択されたいずれか１つの剤形によって製造されることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項6】
チロシンまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含む、タンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項7】
前記チロシン以外にさらに担体、賦形剤または希釈剤をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項8】
ニトロ化(nitration)チロシンを含むタンパク質にチロシンを処理してニトロ化チロシンからニトロ基を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、チロシンを有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化による疾患の予防、改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
生体内において・ＮＯまたは・ＮＯ誘導代謝物が存在する状態で反応性酸素種の過剰レベルは、過酸化窒素のような窒酸性種の形成を導く。したがって、タンパク質に含まれたアミノ酸のうち、チロシンニトロ化が発生すれば、タンパク質の構造及び機能的変化をもたらしうる。したがって、チロシンニトロ化は、多様な疾病をもたらす原因にもなる。
一例として、グルタミン合成酵素(glutaminesynthetase、GS)は、生体でグルタミン酸とアンモニアを用いてグルタミンを合成する酵素であって、身体の多くの器官で生成され、器官及び全身体の窒素均衡において役割を遂行している。晩成ストレスなどの理由でグルタミン合成酵素が活性窒素に露出されれば、チロシンニトロ化され、グルタミン合成酵素の活性度を低下させて多様な疾患を起こしうる。
一例として、グルタミン合成酵素(glutaminesynthetase、GS)は、生体でグルタミン酸とアンモニアを用いてグルタミンを合成する酵素であって、身体の多くの器官で生成され、器官及び全身体の窒素均衡において役割を遂行している。晩成ストレスなどの理由でグルタミン合成酵素が活性窒素に露出されれば、チロシンニトロ化され、グルタミン合成酵素の活性度を低下させて多様な疾患を起こしうる。
【0003】
最近、骨格筋でのグルタミン合成酵素の過剰発現に基づいた遺伝子療法が急性高アンモニア血症の治療のために提案され、この治療療法の根拠は、一般的に肝疾患患者の筋肉で欠乏されるグルタミン合成酵素を代替するか、増強させて筋肉でグルタミン合成酵素によるアンモニアの除去を増加させることを目的とするものである。
【0004】
一方、韓国公開特許第２０２０－００１８４８８号には、高アンモニア血症を治療するためのグルタミン合成酵素の用途について開示されており、韓国公開特許第２０２０－００３８４８１号には、ストレス関連障害を治療するための組成物が開示されているが、本発明のチロシンを有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化による疾患の予防、改善または治療用組成物について開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、前記のような要求によって導出されたものであって、本発明は、チロシンを有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化による疾患の予防、改善または治療用組成物を提供し、本発明の有効成分であるチロシンがストレスによって生成されたグルタミン合成酵素内のN-tyr含量を減少させるだけではなく、活性が低下したグルタミン合成酵素の活性を増進させ、脳でのグルタミン、グルタミン酸の含量及びアンモニア量を定常状態に回復させる効果があるということを確認し、第２型糖尿モデルにおけるインスリン敏感度増進、癲癇発作モデルにおける興奮毒性と酸化ストレス抑制効果、脳卒中モデルにおける脳梗塞低減及びＧＳ活性増進効果、ヒト組換えMnSODを用いたチロシンのニトロ化除去効果、急性腎不全における効果及び高アンモニア血症に対する効果を確認することで、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0006】
前記目的を達成するために、本発明は、チロシンまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0007】
また、本発明は、チロシンまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0008】
また、本発明は、ニトロ化(nitration)チロシンを含むタンパク質にチロシンを処理してニトロ化チロシンからニトロ基を除去する方法を提供する。
【発明の効果】
【0009】
本発明は、チロシンを有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化による疾患の予防、改善または治療用組成物に関するものである。ストレスによってグルタミン合成酵素の発現量は、変化がないが、ＧＳ内のN-tyrの含量は、統計的に有意に増加し、それにより、ＧＳの活性が低下することを確認し、細胞基盤実験において遊離チロシンが低下したＧＳ活性を増進させるだけではなく、脳でのグルタミン、グルタミン酸の含量（割合）及びアンモニア量を定常状態に回復させる効果があり、第２型糖尿モデルにおけるインスリン敏感度増進、癲癇発作モデルにおける興奮毒性と酸化ストレス抑制効果、脳卒中モデルにおける脳梗塞低減及びＧＳ活性増進効果、ヒト組換えMnSODを用いたチロシンのニトロ化除去効果急性腎不全での効果及び高アンモニア血症に対する効果がある。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）による効果を確認したものであって、（Ａ）は、実験期間中の体重及び飲食摂取量の変化を確認した結果であり、（Ｂ）は、血漿内コルチコステロンの含量変化と血漿及びＰＦＣ（前頭前野）でのROS/RNS含量変化を確認したものであり、（Ｃ）は、ＧＳ含量は、変化がないが、ストレス群のN-tyr含量は、統計的に有意に増加し、ＧＳ活性は、統計的に有意に減少したという結果であり、（Ｄ）は、ＰＦＣ組織破砕物に過酸化窒素及びチロシンを処理した後、in vitro GS活性を確認した結果である。＊、＊＊、＊＊＊は、ＣＴＬに対比して統計的に有意差があるものであり、＊は、ｐ＜０．０５であり、＊＊は、ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。＃は、チロシンを処理していない群に対して、チロシンを処理した群のＧＳ活性が統計的に有意に増加したものであって、ｐ＜０．０５である。
【図2】チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）の体重及び飼料摂取量を確認した結果である。（Ａ）は、一般食餌群（ＮＤ）とチロシン食餌群（ＴＤ）のスケジュールであり、（Ｂ）は、体重変化を確認した結果であり、（Ｃ）は、飼料摂取量を確認した結果である。
【図3】チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）の憂鬱行動を確認したものであって、（Ａ）は、オープンフィールドテスト(Open field test)結果であり、（Ｂ）は、テールサスペンジョンテスト(tail suspension test)、及び（Ｃ）は、ショ糖嗜好性テスト(sucrose preference test)結果である。
【図4】チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）の血漿においてコルチコステロン(corticosterone)の含量（Ａ）及び血漿及びＰＦＣでのROS/RNSに変化量をDCF(dichlorofluorescin)を通じてＴＤによってストレスホルモンと酸化的ストレスが減少したことを確認した結果である（Ｂ,Ｃ）。
【図5】チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）のＰＦＣにおいて、ＧＳの活性（Ａ）、ＧＳの発現量（Ｂ）及びＧＳに含まれたチロシンのニトロ化レベル（Ｃ）を確認した結果である。
【図6】チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）のＰＦＣにおけるグルタミン酸塩、グルタミン、チロシン及びＧＡＢＡ含量を確認した結果である。
【図7】チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）のＰＦＣにおけるアンモニア含量を確認した結果である。
【図8】マウスＰＦＣタンパク質にＯＮＯＯ－を処理してタンパク質のニトロ化を誘導し、チロシンによるニトロ化抑制効果を確認した結果である。
【図9】本発明によるペプチドのニトロ化抑制効果を確認したものであって、Ａは、ＰＦＣ（前頭前野）組織内のニトロチロシンタンパク質に対するウェスタンブロット結果であり、Ｂは、肝組織内のニトロチロシンタンパク質に対するウェスタンブロット結果であり、Ｃは、ＰＦＣ（前頭前野）組織内のグルタミン合成酵素タンパク質に対するウェスタンブロット結果であり、Ｄは、肝組織内のグルタミン合成酵素、インスリン受容体β及びリン酸化インスリン受容体βタンパク質に対するウェスタンブロット結果である。
【図10】高脂肪食餌による第２型糖尿モデルマウスにおいてＬ－チロシンの摂食による体重変化（Ａ）、血糖（Ｂ）及び飼料摂食量（Ｃ）を期間別に確認した結果である。＊＊＊は、一般食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血中グルコース含量が統計的に有意に増加したことを示し、ｐ＜０．００１であり、＃、＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＬ－チロシン含有食餌群(HFD+L-Tyr)の血中グルコース含量が統計的に有意に減少したことを示し、＃は、Ｐ＜０．０５であり、＃＃は、Ｐ＜０．０１である。
【図11】高脂肪食餌による第２型糖尿モデルマウスにおいて、Ｌ－チロシン食餌をしたマウスのブドウ糖耐糖能を確認した結果である。（Ａ）は、経時的な血液中のグルコース含量を示すものであり、（Ｂ）は、（Ａ）における曲線下面積（ＡＵＣ）を示すものである。＊＊、＊＊＊は、一般食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血中グルコース含量が統計的に有意に増加したことを示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１であり、＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＬ－チロシン含有食餌群(HFD+L-Tyr)の血中グルコース含量が統計的に有意に減少したことを示し、ｐ＜０．０５である。
【図12】高脂肪食餌による第２型糖尿モデルマウスにおいて、Ｌ－チロシン食餌をしたマウスのインスリン抵抗性を確認した結果である。（Ａ）は、経時的な血液中のグルコース含量を示すものであり、（Ｂ）は、（Ａ）で曲線下面積（ＡＵＣ）を示すものである。＊、＊＊、＊＊＊は、一般食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血中グルコース含量が統計的に有意に増加したことを示し、＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＬ－チロシン含有食餌群(HFD+L-Tyr)の血中グルコース含量が統計的に有意に減少したことを示し、ｐ＜０．０５である。
【図13】組織内の脂肪蓄積変化（Ａ）及び血漿内ROS/RNS含量変化（Ｂ）を確認した結果である。＊＊＊は、ＮＤ対比でＨＦＤまたは、ＨＦＤ＋Tyrの組織重さ及び血漿内ROS/RNS含量が統計的に有意に増加したことを示し、ｐ＜０．００１であり、＃、＃＃は、ＨＦＤ対比でＨＦＤ＋Tyrの組織重さ及び血漿内ROS/RNS含量が統計的に有意に減少したことを示し、＃は、Ｐ＜０．０５であり、＃＃は、Ｐ＜０．０１である。
【図14】チロシン食餌による発作程度の変化（Ａ）、体重変化（Ｃ）及び生存率（Ｄ）を確認した結果であり、（Ｂ）は、（Ａ）で曲線下面積（ＡＵＣ）を示すものである。＊＊、＊＊＊は、ＮＤ対比で５ｘＬ－Tyrの発作程度が統計的に有意に減少したことを示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。＃は、ＣＴＬの発作前対比で発作後の体重が増加したことを示し、ｐ＜０．０５である。
【図15】カイニン酸を注射して生存したマウスの海馬組織でROS/RNS量的変化（Ａ）及びＧＳ活性度を分析した結果である。（Ａ）において＊＊、＊＊＊は、ＣＴＬ対比でROS/RNSの含量が増加したことを示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１であり、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。＃＃、＃＃＃は、ＫＡ注射し、一般食餌をしたＮＤ群対比でチロシン食餌群のROS/RNSの含量が統計的に有意に減少したことを示し、＃＃は、Ｐ＜０．０１であり、＃＃＃は、Ｐ＜０．００１である。（Ｂ）において＊は、ＫＡ注射し、一般食餌をしたＮＤ群対比でチロシン食餌群のＧＳ活性が統計的に有意に増加したことを示し、ｐ＜０．０５である。
【図16】カイニン酸によって海馬領域(CA1(A)、CA3(B))の神経細胞数及び同一部位のミクログリア細胞(microglia)活性度を分析した組織免疫化学染色結果である。＊は、ＣＴＬ対比で神経細胞数が減少したか、炎症を誘導するミクログリア細胞の活性が増加したことを示し、ｐ＜０．０５であり、＃は、チロシン食餌群で有意にミクログリア細胞活性が減少したことを示し、ｐ＜０．０５である。
【図17】晩成身体拘束ストレスモデルマウスでＤ－チロシンの認知障害予防効果を確認した結果である。
【図18】エンドセリン－１(Endothelin-1)を用いた脳卒中(stroke)モデルマウスにおいてＬ－チロシンの脳梗塞(brain infarct)低減及びＧＳ活性増進効果を確認した結果である。
【図19】ヒト組換えMnSODを用いたチロシンの脱ニトロ化効果を確認した結果である。＊＊＊は、過酸化窒素（2.1mM PN）群対比でチロシン投与群(L-Tyr, D-Tyr)のMnSOD活性が増加したことを示し、ｐ＜０．００１である。
【図20】急性腎不全に対するチロシンの効果を確認した結果であり、（Ａ）抗酸化作用因子であるNQO-1の遺伝子発現量、（Ｂ）CuZnSOD活性、（Ｃ）MnSOD活性、（Ｄ）ROS/RNS含量及び（Ｅ）腎虚血及び再灌流２４時間後、腎臓組織においてニトロチロシンタンパク質発現量を示すものである。
【図21】腎臓損傷評価指標として血清クレアチニンを測定した結果である。＊、＊＊は、Sham群対比で統計的に有意にクレアチン(creatine)（Ａ）、IL-1β(B)及びIL-6(C)の発現量が増加したことを示し、＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。＃、＃＃は、ＣＭＣ＋ＩＲ群対比でクレアチン(creatine)、ＩＬ－１β及びＩＬ－６の発現量が減少したことを示し、＃は、Ｐ＜０．０５であり、＃＃は、Ｐ＜０．０１である。
【図22】肝性脳症（高アンモニア血症）に対するチロシンの効果を確認した結果である。（Ａ）血中アンモニア含量、（Ｂ）血漿内ALT及び（Ｃ）ニトロ化されたタンパク質含量を確認したウェスタンブロットである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明は、チロシンまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または改善用健康機能食品組成物に関するものである。
【0012】
前記タンパク質内のチロシンのニトロ化は、チロシンヒドロキシラーゼ(tyrosine hydroxylase)、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Mn Superoxide dismutase)、Cu/Znスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn Superoxide dismutase)、インスリン受容体βサブユニット(insulin receptor β subunit)、アネキシンIV (annexin IV)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(glutamate dehydrogenase)、3-α-OHステロイドデヒドロゲナーゼ(3-α-OH steroid dehydrogenase)、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ(glutathione S-transferase)、３－ケトアシルＣｏＡチオラーゼ(3-ketoacyl CoA thiolase)、カタラーゼ(catalase)、Ｔａｕタンパク質、ミトコンドリア複合体１(mitochondria complex 1)、α－シヌクレイン(α-synuclein)、アポジダンバック－Ａ１(apolipoprotein-A1)、アミロイド－β(amyloid-β)及びＮＭＤＡ受容体(NMDA receptor)のうち、選択されたいずれか１つのタンパク質内のチロシンのニトロ化であることが望ましいが、それに限定されるものではない。
【0013】
前記タンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患は、うつ病(depressive disorder)、不安障害(anxiety disorder)、脳卒中(stroke)、癲癇(epilepsy)、緑内障(glaucoma)、糖尿病(diabetes)、糖尿病網膜症(diabetic retinopathy)、発作(seizure)、肝性脳症(hepaticencephalopathy)、認知機能障害(cognitive impairment)、脳発達障害(brain development impairment)、癌(cancer)、アルツハイマー病(Alzheimer disease)、急性腎障害(Acute kidney injury)及び高アンモニア血症(Hyperammonemia)のうち、選択されたいずれか１つであることが望ましいが、それらに限定されない。
【0014】
前記タンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)は、脳、肝、筋肉、脂肪組織、腎臓組織、膵膓または肺で発生するが、それらに限定されるものではない。
【0015】
本発明の有効成分であるチロシンを投与する量は、下記表１に開示した量で投与することが望ましいが、それに制限されるものではない。
【0016】
【表1】
【0017】
前記健康機能食品組成物は、丸、錠剤(tablet)、カプセル(capsule)、散剤、粉末、顆粒、キャンデー、シロップ及び飲料のうち、選択されたいずれか１つによって製造するか、食品の成分として添加して製造され、通常の方法によって適切に製造されうる。
【0018】
本発明の有効成分を添加することができる食品の一例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤のうち、選択されたいずれか１つの形態でもあり、通常の意味での健康機能食品をいずれも含む。
【0019】
前記健康機能食品は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成及び天然風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含有しうる。その他、天然果物ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含有しうる。このような成分は、独立して、または組み合わせによって使用しうる。
【0020】
本発明の健康機能食品組成物は、さまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。前記天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。
【0021】
また、本発明は、チロシンまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含むタンパク質内のチロシンのニトロ化(nitration)による疾患の予防または治療用薬学組成物に関するものである。
【0022】
前記チロシン以外に、さらに薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含みうる。本発明の薬学組成物は、経口または非経口によって投与され、非経口投与時、皮膚外用または腹腔内、直腸、静脈、筋肉または皮下注射方式を選択することが望ましいが、それに限定されるものではない。
【0023】
本発明の薬学組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤されうる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、そのような固形製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース(sucrose)またはラクトース(lactose)、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単なる賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としえは、懸濁剤、内溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤及び懸濁溶剤としては、プロピレングリコール(propyleneglycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用されうる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール(witepsol)、マクロゴ－ル、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されうる。
【0024】
本発明による組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恵み／危険の比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、患者の疾患の種類、重度度、約物の活性、約物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によっても決定される。本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与され、従来の治療剤とは順次または同時に投与され、単一または多重投与されうる。前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定されうる。
【0025】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重度度によって、その範囲が多様に使用されうる。
【0026】
また、本発明は、ニトロ化(nitration)チロシンを含むタンパク質にチロシンを処理してニトロ化チロシンからニトロ基を除去する方法に関するものである。
【実施例】
【0027】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をさらに具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がそれらによって制限されないということは、当該技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【0028】
１．動物モデル
本発明では、７週齢C57BL/6雄マウス２８匹（韓国コアテック）を標準条件（温度２２～２４℃、湿度５０～７０％、午前６時に点灯される１２時間明暗周期）によって飼育し、この際、食餌療法と水を自由に摂取可能にした。本発明で使用した動物は、国立保健院(NIH、Bechesda、MD、USA)の指針による慶尚大学校動物保護及び使用委員会(GNU IACUC)から承認されたプロトコル(GNU-161128-M0068)によって実施した。
本発明では、７週齢C57BL/6雄マウス２８匹（韓国コアテック）を標準条件（温度２２～２４℃、湿度５０～７０％、午前６時に点灯される１２時間明暗周期）によって飼育し、この際、食餌療法と水を自由に摂取可能にした。本発明で使用した動物は、国立保健院(NIH、Bechesda、MD、USA)の指針による慶尚大学校動物保護及び使用委員会(GNU IACUC)から承認されたプロトコル(GNU-161128-M0068)によって実施した。
【0029】
２．血漿及び前頭前野(prefrontal cortex; PFC)試料準備
脳の血液とＰＦＣ試料は、それぞれＣＯ２ガスで痲酔されたマウスからサンプリングした。マウス血液は、午前９時～１１時に採取してＫ３ＥＤＴＡでコーティングされた真空容器に収集した。血漿は、４℃で５００×ｇで１０分間遠心分離して獲得し、ＰＦＣ試料は、重さをはかった後、Bullet組織破鎖機を用いて組織を破鎖し、４℃で１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。前記獲得した血漿と組織破砕物(lysate)は、使用前まで－８０℃で保管した。
脳の血液とＰＦＣ試料は、それぞれＣＯ２ガスで痲酔されたマウスからサンプリングした。マウス血液は、午前９時～１１時に採取してＫ３ＥＤＴＡでコーティングされた真空容器に収集した。血漿は、４℃で５００×ｇで１０分間遠心分離して獲得し、ＰＦＣ試料は、重さをはかった後、Bullet組織破鎖機を用いて組織を破鎖し、４℃で１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。前記獲得した血漿と組織破砕物(lysate)は、使用前まで－８０℃で保管した。
【0030】
３．コルチコステロン(corticosterone)及びROS/RNS(reactive oxygen species/reactive nitrogen species)確認
１０μｇの破砕物をＧＳアッセイ緩衝液（５０ｍＭのイミダゾール－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０ｍＭＬ－グルタミン、２５ｍＭのヒドロキシルアミン、２５ｍＭのヒ酸ナトリウム(sodium arsenate)、２ｍＭのＭｎＣｌ２及び０．１６ｍＭのＡＤＰ）５０ｍｌに混合して３７℃で１時間インキュベーションした。
１０μｇの破砕物をＧＳアッセイ緩衝液（５０ｍＭのイミダゾール－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０ｍＭＬ－グルタミン、２５ｍＭのヒドロキシルアミン、２５ｍＭのヒ酸ナトリウム(sodium arsenate)、２ｍＭのＭｎＣｌ２及び０．１６ｍＭのＡＤＰ）５０ｍｌに混合して３７℃で１時間インキュベーションした。
【0031】
混合後、停止緩衝液（９０ｍＭのＦｅＣｌ３、１．８ＮのＨＣｌ及び１．４５％trichloroacetic acid）５０μｌを添加して反応を停止させ、ＧＳによるグルタミン(glutamine)及びヒドロキシルアミン(hydroxylamine)反応から合成されたγ－グルタミルヒドロキサム酸(γ-glutamylhydroxamate)をマイクロプレートリーダーを用いて５６０ｎｍで測定した。
【0032】
ウェスタンブロット及び免疫沈降(IP)-WBを用いてＧＳ及びTyr-nitriation GSのレベルをそれぞれ測定し、Tyr-nitriation GSの免疫沈降分析は、抗－３－ニトロチロシン抗体(ab61392, Abcam, Cambridge, UK)及びタンパク質Ａ／Ｇプラスアガロス(Santa Cruz, Dallas, TX, USA)を用いて製造社のプロトコルによって実施し、ＧＳのウェスタンブロットは、抗-GS(1:5000、Abcam)を用いて実施した。
【0033】
実施例１．晩成不動姿勢ストレス(Chronic immobilization stress; CIS)による行動分析、グルタミン合成酵素（ＧＳ）活性変化及びＧＳ内のnitration-チロシンの含量確認
動物モデルは、２グループ（正常群、ストレス群）に分け、ストレス群は、毎日２時間（午後２～４時）個別的に拘束器具に強制動員して晩成的不動姿勢ストレスを１５日間与え、隔日に体重変化と飼料摂取量を測定した。
動物モデルは、２グループ（正常群、ストレス群）に分け、ストレス群は、毎日２時間（午後２～４時）個別的に拘束器具に強制動員して晩成的不動姿勢ストレスを１５日間与え、隔日に体重変化と飼料摂取量を測定した。
【0034】
以後、動物を犠牲させて血漿内コルチコステロン(corticosterone)含量変化を確認し、血漿及びＰＦＣでのROS/RNSを確認した。コルチコステロンの含量は、ＥＬＩＳＡキット(Cayman)を用いて製造社の方法によって実施し、ROS/RNSは、ROS/RNSアッセイキット(Cell Biolabs, San Diego, CA, USA)を用いて製造社の方法によって実施した。
【0035】
その結果、図１に開示したように、ストレスを加えない対照群（ＣＴＬ）に比べて、晩成ストレスを加えたストレス群（ＳＴＲ）の体重は、７日～１５日間減少する傾向を示したが、飼料摂取量は、ほとんど差がないと示され、コルチコステロン含量とROS/RNSも統計的に有意に増加した。
【0036】
一方、対照群対比でストレス群のグルタミン合成酵素（ＧＳ）の発現量は減少しておらず、ＧＳ内のチロシンがニトロ化されたレベルが統計的に有意に増加しただけではなく、ＧＳ活性が統計的に有意に減少したことを確認した。
【0037】
また、１０μｇのPFC(prefrontal cortex)組織破砕物に０．００３１～０．４５ｍｇ／ｍｌのチロシンを添加して混合し、１０分間氷でインキュベーションし、過酸化窒素（ＰＮ）を前記組織破砕物の１０倍の体積になるように混合した後、１０分間インキュベーションした後in vitro GS 活性を確認した結果、チロシン濃度の増加によってＧＳ活性も増加することを確認した。
【0038】
実施例２．チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）の体重及び飼料摂取量変化確認
動物モデルは、２グループ（正常群、ストレス群）に分け、ストレス群は、毎日２時間（午後２～４時）個別的に拘束器具に強制動員し、晩成的不動姿勢ストレスを１５日間与え、隔日で体重変化と飼料摂取量を測定した。
動物モデルは、２グループ（正常群、ストレス群）に分け、ストレス群は、毎日２時間（午後２～４時）個別的に拘束器具に強制動員し、晩成的不動姿勢ストレスを１５日間与え、隔日で体重変化と飼料摂取量を測定した。
【0039】
前記正常群及びストレス群は、栄養均衡が合う一般食餌群と本発明のチロシン(tyrosin)が補充（１８１．２ｍｇ／ｋｇ）された食餌群に再び分類して給与した。
【0040】
その結果、図２に開示したように、チロシン食餌如何による体重の変化または飼料摂取量の差はないと確認された。
【0041】
以後、OFT(Open field test)、TST(tail suspension test)及びSPT(sucrose preference test)を含む行動分析を実施した。
【0042】
ＯＦＴ（オープンフィールドテスト）は、四角形箱（６０×６０×２０ｃｍ）で遂行し、マウスを、箱の中央領域（３０×３０ｃｍ）に配置し、その動作を５分間追跡し、総移動距離、中央地域での持続時間、中央地域への進入試図頻度数を測定した。
【0043】
ＴＳＴ（テールサスペンジョンテスト法）は、マウスを水平棒がある箱で個別的にぶら下げて、動かない持続時間を測定するために６分間動きを追跡した。
【0044】
ＳＰＴ（ショ糖嗜好性テスト）は、４８時間０．１Ｍのショ糖(sucrose)及び水を提供して習慣を入れた後、２４時間０．１Ｍのショ糖(sucrose)及び水を提供せず、以後、６時間０．１Ｍのショ糖(sucrose)及び水を提供し、３時間０．１Ｍのショ糖(sucrose)及び水の位置を変更した。
【0045】
次いで、ショ糖及び水の消費量を測定し、ショ糖選好総消費量対比で提供したショ糖の割合で計算した。
【0046】
その結果、図３に開示したように、オープンフィールドテストにおいて、正常群（ＣＴＬ）対比でストレス群（ＳＴＲ）が中央地域に滞留する時間、動く距離、中心に移動する回数が減少したが、ストレス群のうち、一般式が（ＮＤ）群に比べてチロシン食餌群（ＴＤ）の中央地域に滞留する時間、動く距離、中心に移動する回数が増加したことを確認した。
【0047】
また、テールサスペンジョンテスト（ＴＳＴ）においてストレス群の一般食餌群（ＮＤ）は、動かない時間が正常群（ＣＴＬ）に比べて、統計的に有意に増加し（ｐ＜０．０５）、これに対比して、チロシン食餌群は、動かない時間が統計的に有意に減少した（ｐ＜０．０５）。
【0048】
また、ショ糖嗜好性テストでも、ストレス群のショ糖選好度が正常群に比べて統計的に有意に減少したが（ｐ＜０．００１）、ストレス群の一般食餌群対比で本発明のチロシン食餌群のショ糖選好度は、統計的に有意に増加した（ｐ＜０．０１）。
【0049】
以後、動物を犠牲させて確認した血漿において、コルチコステロン含量を確認した結果、図４に開示したように、ストレスによってコルチコステロン含量が増加したが、ストレス群の一般食餌群対比でチロシン食餌群ではコルチコステロンの含量が統計的に有意に減少したことを確認し（＃、ｐ＜０．０５）、血漿とＰＦＣ組織でROS/RNSを確認した結果、ストレス群の一般食餌群対比でチロシン食餌群では、ROS/RNSが統計的に有意に減少したことを確認した（＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５）。
【0050】
一方、対照群対比でストレス群の一般式が（ＮＤ）及びチロシン食餌（ＴＤ）２つともグルタミン合成酵素（ＧＳ）の発現量は類似に示されたが、ストレスによってＧＳ活性は減少したが、ストレス群で一般食餌群に対比してチロシン食餌群は、ＧＳ活性が統計的に有意に増加し、ＧＳ内のN-tyr(nitraionチロシン）の含量がストレスによって統計的に有意に増加したが、チロシン食餌群は、一般式がストレス群に比べて統計的に有意にN-tyrの含量が減少した（図５）。
【0051】
実施例３．チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）のＰＦＣにおけるグルタミン酸塩、グルタミン、チロシン及びＧＡＢＡ含量確認
ＰＦＣにおいてアミノ酸（グルタミン酸塩、グルタミン、チロシン）及びＧＡＢＡの含量を液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で定量した。
ＰＦＣにおいてアミノ酸（グルタミン酸塩、グルタミン、チロシン）及びＧＡＢＡの含量を液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で定量した。
【0052】
まず、ＰＦＣ組織を破鎖して組織の上澄液を取って内部標準物質（Ｌ－Ｇｌｕ－ｄ５）と移動相で希釈した。希釈した試料を５個に分注してＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステム(Agilent 6460)に注入した。カラムは、SeQuant ZIC（登録商標）-HILICカラム(2.1×100mm, 3.5μm, 100Å)を使用し、移動相は、０．１％ギ酸を含むアセトニトリル(acetonitrile)を使用して濃度勾配を与えて分離した。
【0053】
アミノ酸検出は、複数反応監視検出法を用いた(Gluのm/z 148→84, Glnのm/z 147→84, GABAのm/z 104→87及び内部標準物質のm/z 153→88）。
【0054】
その結果、図６に開示したように、ＰＦＣでストレス群の一般食餌群は、正常群対比でグルタミン酸塩、グルタミン、チロシン及びＧＡＢＡの含量が減少し、それに対して、チロシン食餌群は、正常群レベル以上にグルタミン酸塩、グルタミン、チロシン及びＧＡＢＡの含量が増加したことを確認した。
【0055】
実施例４．チロシン食餌（ＴＤ）をした晩成不動姿勢ストレス（ＣＩＳ）誘導群（ＳＴＲ）のＰＦＣにおけるアンモニア含量変化
組織が溶けないように、－２０℃以下において、ＰＦＣ組織重さを測定した後、１．５ｍｌチューブに組織重さ１０ｍｇ当たり１００μｌのRIPA(proteinase inhibitor cocktail, PIC含む)と適当な数のガラスビードを入れ、ブレットブレンダー(bullet blender)を用いて３０秒間２回組織を破鎖した。組織破砕物をスピンダウン(spin down)して新たな１．５ｍｌチューブに移し、１分間超音波を用いて組織粉砕した。１２,０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離後、上澄液を新たな１．５ｍｌチューブに移し、試験に使用するまで、－８０℃で保管した。前記過程において、ＰＦＣ組織重さ測定を除いた全過程は、４℃で実施した。アンモニアアッセイキット(Ammonia assay kit: Sigma-Aldrich, Cat Num. AA0100)から提供されるアンモニア標準溶液(10μg/ml=588μM提供)を水で希釈して0(blank control), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0μg/mlで製造し、ＰＦＣ組織破砕物は、ＰＢＳ緩衝液で２倍希釈した。
組織が溶けないように、－２０℃以下において、ＰＦＣ組織重さを測定した後、１．５ｍｌチューブに組織重さ１０ｍｇ当たり１００μｌのRIPA(proteinase inhibitor cocktail, PIC含む)と適当な数のガラスビードを入れ、ブレットブレンダー(bullet blender)を用いて３０秒間２回組織を破鎖した。組織破砕物をスピンダウン(spin down)して新たな１．５ｍｌチューブに移し、１分間超音波を用いて組織粉砕した。１２,０００ｒｐｍにおいて１５分間遠心分離後、上澄液を新たな１．５ｍｌチューブに移し、試験に使用するまで、－８０℃で保管した。前記過程において、ＰＦＣ組織重さ測定を除いた全過程は、４℃で実施した。アンモニアアッセイキット(Ammonia assay kit: Sigma-Aldrich, Cat Num. AA0100)から提供されるアンモニア標準溶液(10μg/ml=588μM提供)を水で希釈して0(blank control), 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0μg/mlで製造し、ＰＦＣ組織破砕物は、ＰＢＳ緩衝液で２倍希釈した。
【0056】
前記アンモニアアッセイキットで提供するアンモニアアッセイ試薬１００μｌにＰＢＳ緩衝液で２倍希釈した試料１０μｌ（組織５μｇに相応）を入れ、常温で５分間インキュベーションした。同時にアンモニアアッセイ試薬１００μｌに対し、標準溶液１０μｌを入れ、常温で５分間インキュベーションした。ＰＦＣ組織破砕物緩衝液(RIPA+PIC)による干渉影響を補正するために、ＰＢＳ緩衝液で２倍希釈したRIPA+PICを緩衝液ブランク対照群として使用した。５分後、マイクロリーダーを用いて３４０ｎｍで吸光度を測定した(Ainitial)。
【0057】
Ｌ－グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(glutamate dehydrogenase)溶液１０μｌを入れ、常温で５分間インキュベーションした後、３４０ｎｍで吸光度を測定した(Afinal)。
【0058】
DA340nm(Afinal-Ainitial)を求め、標準の場合、ブランク対照群のDA340nmを、試料の場合には、緩衝液ブランク対照群のDA340nmを差し引いた。
【0059】
標準の結果値を用いて線状回帰(linear regression)を求め、それを用いてサンプルのアンモニア濃度を計算した。
【0060】
その結果、図７にストレス群の一般食餌をした場合、正常群に比べて、アンモニア含量が増加し、それに対比して、本発明のチロシン食餌をした群は、正常群と類似したレベルでアンモニア含量が減少したことを確認した。
【0061】
実施例５．in vitro ニトロ化(nitration)抑制効果分析
【0062】
マウスＰＦＣタンパク質に ＯＮＯＯ－を処理してタンパク質のニトロ化を誘導し、チロシンによるニトロ化抑制効果を確認した。その結果、図８に開示したようにチロシンの濃度依存的にタンパク質のニトロ化が抑制されることを確認し、ニトロ化抑制効果は、Ｌ－チロシン及びＤ－チロシンが両方とも類似したレベルと示された。
【0063】
また、本発明によるチロシンのニトロ化抑制効果をマウスの脳と肝組織破砕物(lysate)を用いて分析した。ＣＯ２ガスで痲酔されたマウスから前頭前野(prefrontal cortex, PFC)及び肝(liver)組織をそれぞれ採取して重さを測定した後、組織破鎖機を用いて組織を破鎖し、４℃、１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄液を取ってＰＦＣ及び肝組織破砕物(lysate)を得た。前記組織破砕物にタンパク質のニトロ化を誘導するペルオキシナイトライト(Peroxynitrite、PN)を添加し、グルタミン（Ｑ）、Ｌ－チロシン（Ｌ－Ｙ）及びＤ－チロシン（Ｄ－Ｙ）を２ｍＭの濃度でそれぞれ添加した後、５秒間ボルテックス(vortex)して混合し、氷で１０分間反応させた。以後、抗ニトロチロシン抗体（１：１,０００）、抗グルタミン合成酵素抗体（１：５,０００）、抗インスリン受容体β抗体（１：１,０００）または抗リン酸化インスリン受容体β抗体（１：１,０００）を用いてウェスタンブロットを遂行した。
【0064】
その結果、ＰＮによってＰＦＣ及び肝組織内のチロシンニトロ化が増加したタンパク質が増加したことを確認し、グルタミン合成酵素（ＧＳ）とインスリン受容体βサブユニット（ＩＲｂ）以外の複数のタンパク質のニトロ化が増加したことを複数のバンドのウェスタンブロット結果で確認した。ＰＮによってチロシンニトロ化が増加したタンパク質は、チロシン（Ｙ）が末端に位置したペプチド処理によってニトロ化が減少したことを確認した（図９Ａ、９Ｂ）。ＰＦＣと肝組織で各処理群のタンパク質量の差がないということをＧＳとＩＲｂとの発現によって確認した。しかし、ＩＲｂは、ＰＮにニトロ化されてリン酸化された形態が減少したことを、リン酸化－ＩＲｂ（ＩＲｂ－ｐ）のウェスタンブロットで確認した（図９Ｃ、９Ｄ）。
【0065】
実施例６．高脂肪食餌第２型糖尿モデルマウスにおけるＬ－チロシンのインスリン敏感度増進効果の確認
（１）高脂肪食餌第２型糖尿モデル確立
３週齢C57BL/6マウス雄２７匹を１週間飼育環境に適応させた後、３グループに分けてそれぞれ正常食餌(ND、normal diet;10kcal%fat、熱量3.85kcal/g)、高脂肪食餌(HFD、high fat diet;60kcal% fat、熱量5.24kcal/g)、Ｌ－チロシン(L-Tyr)添加高脂肪食餌（HFD+L-Tyr;181mgのＬ－チロシン／ｋｇ含む）を提供し、水と飼料は、自由に摂取可能にした。３ヶ月間２日ごとに体重と飼料摂取量を測定し、１週ごとに血糖を測定した。
（１）高脂肪食餌第２型糖尿モデル確立
３週齢C57BL/6マウス雄２７匹を１週間飼育環境に適応させた後、３グループに分けてそれぞれ正常食餌(ND、normal diet;10kcal%fat、熱量3.85kcal/g)、高脂肪食餌(HFD、high fat diet;60kcal% fat、熱量5.24kcal/g)、Ｌ－チロシン(L-Tyr)添加高脂肪食餌（HFD+L-Tyr;181mgのＬ－チロシン／ｋｇ含む）を提供し、水と飼料は、自由に摂取可能にした。３ヶ月間２日ごとに体重と飼料摂取量を測定し、１週ごとに血糖を測定した。
【0066】
その結果、図１０に開示したように、体重は、漸進的に増加し、同日付を基準に、ＨＦＤ及びHFD+L-Tyrグループの体重がＮＤよりもさらに重いことを確認し、ＨＦＤ及びHFD+L-Tyrグループの体重変化は、類似したレベルと示された。飼料摂取量には、グループ間差がほとんどなく、期間による差も発生しておらず、血糖は、正常食餌群（ＮＤ）に比べてＨＦＤ群の血糖が統計的に有意に増加し、ＨＦＤ群対比でHFD+L-Tyr群の血糖が統計的に有意に減少した。
【0067】
（２）ブドウ糖耐糖能検査
１×ＰＢＳにＤ－グルコースを溶解させて４０％Ｄ－グルコース溶液を準備した。１６時間禁食したマウスの血糖を測定した後、体重１ｋｇ当たり２ｇのグルコースを腹腔注射するために、数式１によってグルコース溶液を腹腔注射した。
（数式１）
グルコース注射量（μｌ）＝体重（ｇ）×５
１×ＰＢＳにＤ－グルコースを溶解させて４０％Ｄ－グルコース溶液を準備した。１６時間禁食したマウスの血糖を測定した後、体重１ｋｇ当たり２ｇのグルコースを腹腔注射するために、数式１によってグルコース溶液を腹腔注射した。
（数式１）
グルコース注射量（μｌ）＝体重（ｇ）×５
【0068】
一例として、体重４５ｇであるマウスには、４０％グルコース溶液２２５μｌを注射した。グルコース溶液を腹腔注射した後、３０、６０、９０及び１２０分時点に血糖を測定した。
【0069】
その結果、図１１に開示したように正常食餌群（ＮＤ）に対比して、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血液中のグルコース含量が統計的に有意に増加し、これに対比して、本発明のＬ－チロシン(L-Tyr)添加高脂肪食餌群(HFD+L-Tyr)は、血液中のグルコース含量が減少した。
【0070】
（３）インスリン抵抗性試験
インスリンを生理食塩水で希釈して０．１５Ｕ／ｍｌ溶液を準備した。６時間禁食したマウスの血糖を測定した後、インスリンを腹腔注射した（０．７５Ｕ／体重（ｋｇ））。インスリンを腹腔注射した後、１５、３０、６０及び９０分時点に血糖を測定した。
（数式２）
インスリン注射量（μｌ）＝体重（ｇ）×５
インスリンを生理食塩水で希釈して０．１５Ｕ／ｍｌ溶液を準備した。６時間禁食したマウスの血糖を測定した後、インスリンを腹腔注射した（０．７５Ｕ／体重（ｋｇ））。インスリンを腹腔注射した後、１５、３０、６０及び９０分時点に血糖を測定した。
（数式２）
インスリン注射量（μｌ）＝体重（ｇ）×５
【0071】
その結果、図１２に開示したように正常食餌群（ＮＤ）に対比して、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血液中のグルコース含量が統計的に有意に増加し、これに対比して、本発明のＬ－チロシン(L-Tyr)添加高脂肪食餌群(HFD+L-Tyr)は、血液中のグルコース含量が減少した。
【0072】
（４）組織内の脂肪蓄積変化及び血漿内ROS/RNS含量変化確認
アベルチン(Avertin)でマウスを痲酔し、心臓を介して血液を採取して真空採血器(Vacutainer)のＥＤＴＡと反応させた後１,５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、血漿を分離した。ＰＢＳと４％パラフォルムアルデヒド(paraformaldehyde;PFA)を心臓を通じて灌流して組織を固定し、各組織を摘出してＰＦＡに保管した。
アベルチン(Avertin)でマウスを痲酔し、心臓を介して血液を採取して真空採血器(Vacutainer)のＥＤＴＡと反応させた後１,５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、血漿を分離した。ＰＢＳと４％パラフォルムアルデヒド(paraformaldehyde;PFA)を心臓を通じて灌流して組織を固定し、各組織を摘出してＰＦＡに保管した。
【0073】
血漿内活性酸素／窒素(ROS/RNS)濃度は、血漿をＰＢＳに３倍希釈した後、Oxiselect ROS/RNSアッセイキット(Cell Biolabs)を使用しておすすめの実験方法通りに測定した。
【0074】
その結果、ＨＦＤ動物モデルでチロシンが全般的な肝の脂肪蓄積を減少させ、腎臓周辺脂肪組織の量は、統計的に有意に減少させたことを確認し、正常食餌群（ＮＤ）に対比して、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血漿内ROS/RNSレベルが統計的に有意に増加し、これに対比して、本発明のＬ－チロシン(L-Tyr)添加高脂肪食餌群(HFD+L-Tyr)は、血漿内ROS/RNSレベルが統計的に有意に減少した（図１３）。
【0075】
実施例７．カイニン酸(Kainic acid)で発作を誘発させた癲癇発作モデルマウスにおけるＬ－チロシンの興奮毒性と酸化ストレス抑制効果確認
カイニン酸（ＫＡ）で発作を誘発させた癲癇発作動物モデルを用いてチロシンの文塁打メートの興奮毒性抑制効果を確認した。マウスを７日間チロシンの量を異なって摂取させた動物に同一量のカイニン酸を腹腔注射して発作程度を確認した。
カイニン酸（ＫＡ）で発作を誘発させた癲癇発作動物モデルを用いてチロシンの文塁打メートの興奮毒性抑制効果を確認した。マウスを７日間チロシンの量を異なって摂取させた動物に同一量のカイニン酸を腹腔注射して発作程度を確認した。
【0076】
（１）癲癇発作
４週齢ＩＣＲ雄マウスに１週間正常食餌またはＬ－チロシン含有食餌を提供し、水と飼料は、自由に摂取可能とした。
正常食餌(ND):AIN-93G
1×L-Tyr:181mg/kgのL-Tyrを含むAIN-93G
3×L-Tyr:543mg/kgのL-Tyrを含むAIN-93G
5×L-Tyr:905mg/kgのL-Tyrを含むAIN-93G
カイニン酸(Kainic acid: KA, Abcam)を湯煎で加熱しつつ生理食塩水に溶解して９ｍｇ／ｍｌカイニン酸溶液を準備し、カイニン酸溶液を腹腔注射し(30mg/kg)、２時間、発作程度と症状を記録した。発作程度判断は、下記表２の基準によって適用し、カイニン酸注射前と、２４時間後の体重を測定して比べた。
４週齢ＩＣＲ雄マウスに１週間正常食餌またはＬ－チロシン含有食餌を提供し、水と飼料は、自由に摂取可能とした。
正常食餌(ND):AIN-93G
1×L-Tyr:181mg/kgのL-Tyrを含むAIN-93G
3×L-Tyr:543mg/kgのL-Tyrを含むAIN-93G
5×L-Tyr:905mg/kgのL-Tyrを含むAIN-93G
カイニン酸(Kainic acid: KA, Abcam)を湯煎で加熱しつつ生理食塩水に溶解して９ｍｇ／ｍｌカイニン酸溶液を準備し、カイニン酸溶液を腹腔注射し(30mg/kg)、２時間、発作程度と症状を記録した。発作程度判断は、下記表２の基準によって適用し、カイニン酸注射前と、２４時間後の体重を測定して比べた。
【0077】
また、カイニン酸を注射し、２４時間後、生存したマウスの脳生組織を摘出するか、ＰＦＡ灌流で組織固定後、脳を摘出した。
【0078】
【表2】
【0079】
その結果、発作程度がチロシン含量によって差等的に軽減することを確認しており、実験群間の体重変化はないと示された（図１４）。また、チロシンを摂食していない動物の場合、カイニン酸による強い発作現象で１２０分を超えることができず、死ぬ個体が発生したが、チロシンの摂食量によってマウスが死ぬ現象も改善されることを確認し、９００ｍｇ／ｋｇ（食餌重さ）のチロシンが含まれた飼料を摂取したマウスの場合、いずれも生存した。
【0080】
（２）ROS/RNS測定
脳組織中、海馬を組織質量10mg当たりRIPA buffer 100μl (proteinase/phosphatase inhibitor含む）を入れ、ガラスビード及びBullet Blenderを用いて１分間粉砕した。12,000×g、４℃で１５分間遠心分離上澄液を分離し、ＰＢＳに１０倍希釈してROS/RNS測定に使用した。ROS/RNS濃度は、Oxiselect ROS/RNSアッセイキット(Cell Biolabs)を使用し、おすすめの実験方法によって測定した。
脳組織中、海馬を組織質量10mg当たりRIPA buffer 100μl (proteinase/phosphatase inhibitor含む）を入れ、ガラスビード及びBullet Blenderを用いて１分間粉砕した。12,000×g、４℃で１５分間遠心分離上澄液を分離し、ＰＢＳに１０倍希釈してROS/RNS測定に使用した。ROS/RNS濃度は、Oxiselect ROS/RNSアッセイキット(Cell Biolabs)を使用し、おすすめの実験方法によって測定した。
【0081】
カイニン酸を注射して生存したマウスの海馬組織のROS/RNS量的変化とＧＳ活性度を分析した結果、ROS/RNSの量がカイニン酸によって増加したが、チロシンを摂食させたマウスでは、対照群レベルに減少した（図１５）。
【0082】
（３）グルタミン合成酵素（ＧＳ）活性測定
９６ウェルプレートに海馬溶解物２μｌを入れ、５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）をさらに入れ、５０μｌに合わせた。ＧＳ活性アッセイ緩衝液(50mM imidazole-HCl、pH6.8、25mMのＬ－グルタミン、12.5mMのヒドロキシルアミン、12.5mMのヒ酸ナトリウム(sodium arsenate)、１ｍＭのＭｎＣｌ２及び０．０８ｍＭのＡＤＰ）５０μｌを入れ、３７℃で３０～６０分間反応させた。
９６ウェルプレートに海馬溶解物２μｌを入れ、５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）をさらに入れ、５０μｌに合わせた。ＧＳ活性アッセイ緩衝液(50mM imidazole-HCl、pH6.8、25mMのＬ－グルタミン、12.5mMのヒドロキシルアミン、12.5mMのヒ酸ナトリウム(sodium arsenate)、１ｍＭのＭｎＣｌ２及び０．０８ｍＭのＡＤＰ）５０μｌを入れ、３７℃で３０～６０分間反応させた。
【0083】
反応終了後、空ウェルに標準物質であるγ－グルタミルヒドロキサム酸(γ-glutamylhydroxamate)を０．３９１～２５．０ｍＭの濃度になるように添加した。試料と標準物質に１００μｌの反応停止液（９０ｍＭのＦｅＣｌ３、１．８ＮのＨＣｌ及び１．４５％（ｗ／Ｖ）卜リクロロ酢酸（trichloroacetic acid）を添加し、５６０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【0084】
標準曲線との比較を通じて各サンプルのＧＳ活性を求めた。ＧＳ活性は、最終生産物であるγ－グルタミルヒドロキサム酸の生成量で表現し、単位は、μM/min/μg proteinである。
【0085】
その結果、図１５に開示したようにＧＳ活性がカイニン酸によって減少したが、チロシンを摂食させたマウスでは、対照群レベル以上に増加した。
【0086】
（４）組織免疫染色(Immunohistochemistry、IHC)
ＰＢＳとＰＦＡを心臓を通じて灌流し、脳を摘出してＰＦＡに１５時間以上、後固定した。ＰＢＳで１０分間３回洗浄し、振動ミクロトーム(vibratome)で４０μｍ厚さに脳組織切片を獲得した。
ＰＢＳとＰＦＡを心臓を通じて灌流し、脳を摘出してＰＦＡに１５時間以上、後固定した。ＰＢＳで１０分間３回洗浄し、振動ミクロトーム(vibratome)で４０μｍ厚さに脳組織切片を獲得した。
【0087】
３％ウシ血清アルブミン(bovine serum albumin)を溶解させたＩＨＣ緩衝液(0.3% Triton X-100を含むＰＢＳ）に前記獲得した脳切片を室温で１時間ブロッキングした後、４℃で１次抗体(anti-NeuN (Millipore, MAB377, 1:500), anti-Iba1 (Wako, 019-19741, 1:200))と１５時間以上反応させた（３％ＢＳＡを含むＩＨＣ緩衝液）。ＩＨＣ緩衝液で１０分ずつ３回洗浄し、蛍光標識された２次抗体(anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488(Invitrogen, 1:1000), anti-Rabbit IgG AlexaFluor594 (Invitrogen, 1:000))と室温で２時間反応させた（３％ＢＳＡを含むＩＨＣ緩衝液）。ＩＨＣ緩衝液で１０分ずつ３回洗浄し、シラン(silane)コーティングされたガラススライドに切片を固定した。ＤＡＰＩが含まれたanti-fade溶液を切片に載せてカバーガラスを覆って乾燥した。蛍光顕微鏡で撮影したイメージの信号密度をイメージＪ分析プログラムを用いて分析した。
【0088】
カイニン酸によって誘発された発作モデルの脳組織を検査した結果、カイニン酸によって海馬領域(CA1、CA3)の神経細胞数が減少し、同一部位のミクログリア細胞(microglia)活性度が増加したが、チロシンを摂取した場合、神経細胞の数が保持され、炎症反応によってミクログリア細胞の活性が減少したことを確認した（図１６）。
【0089】
実施例８．晩成身体拘束ストレスモデルマウスでＤ－チロシンの認知障害予防効果確認
（１）晩成身体拘束ストレスモデル準備
C57BL/6雄マウス（７週齢）２８匹を２グループに分けて正常食餌(AIN-93G)またはＤ－チロシン(D-Tyr)含有食餌(181mg D-Tyr/kg AIN-93G)を１週間提供した。水と飼料は、自由に摂取可能にし、１週に二回体重と飼料摂取量を測定した。
（１）晩成身体拘束ストレスモデル準備
C57BL/6雄マウス（７週齢）２８匹を２グループに分けて正常食餌(AIN-93G)またはＤ－チロシン(D-Tyr)含有食餌(181mg D-Tyr/kg AIN-93G)を１週間提供した。水と飼料は、自由に摂取可能にし、１週に二回体重と飼料摂取量を測定した。
【0090】
８週齢から２週間、一日２時間ずつ２００ｌｕｘ照明条件で晩成身体拘束ストレス(chronic immobilization stress, CIS)を加えた。対照群（ＣＴＬ）、D-Tyr摂食対照群(CTL+D-Tyr)、晩成ストレス群（ＳＴＲ）、D-Tyr摂食晩成ストレス群(STR+D-Tyr)に分類し、各グループ当たり動物は、７匹で構成した。
【0091】
（２）認知機能試験
２週間のＣＩＳ終了後、認知機能試験を実施した。適応期間を含め、全試験期間の間、D-Tyr含有摂食を提供したグループと一般飼料摂食群の認知機能とを比較するために、長期記憶能力を試す事物認知機能試験(object recognition test, ORT)と事物位置認知機能試験(object location recognition test, OLT)を遂行した。
２週間のＣＩＳ終了後、認知機能試験を実施した。適応期間を含め、全試験期間の間、D-Tyr含有摂食を提供したグループと一般飼料摂食群の認知機能とを比較するために、長期記憶能力を試す事物認知機能試験(object recognition test, ORT)と事物位置認知機能試験(object location recognition test, OLT)を遂行した。
【0092】
ＯＲＴ：適応(habituation)、親和(familiarization)、試験(test)の三段階で構成した。試験箱に一日１０分ずつ二日間適応させ、３日目の親和段階には、２つの同じ事物を１０分間探索するようにした。マウスを試験箱に入れるときは、物体のない壁側を眺めるように入れた。４日目の試験段階には、２つの事物のうち、１つを新たな事物に交換し、１０分間探索するようにするが、最初５分間の記録をデータとして使用した。事物認知機能指数（ＤＩ）は、下記数式３で算出した。
（数式３）
DI(Descrimination Index)＝［新規事物探索時間－見慣れた事物探索時間］／［新規事物探索時間＋見慣れた事物探索時間］
（数式３）
DI(Descrimination Index)＝［新規事物探索時間－見慣れた事物探索時間］／［新規事物探索時間＋見慣れた事物探索時間］
【0093】
ＯＬＴ：ＯＲＴ遂行２４時間後に見慣れた事物の位置を変更し、５分間探索するようにした。前記事物認知機能指数（ＤＩ）と同じ方法で、全体事物探索時間中、位置が移動された事物を探索する時間の割合を計算して事物位置認知機能指数を算出した。
【0094】
晩成ストレス軽度認知障害動物モデルを用いてチロシンの認知機能保護効能を確認するために、マウスにチロシンが添加された飼料を提供しながら、晩成ストレス（１４日）を加えた結果、体重及び飼料摂取量は、チロシン含有如何による差が現われておらず、ＯＲＴでは、統計的有意差が確認できず、ＯＬＴでは、ストレスによって低下した認知機能がチロシンの摂取によって対照群レベルに保持可能にしたということを確認した（図１７）。
【0095】
実施例９．エンドセリン－１(Endothelin-1)を用いた脳卒中(stroke)モデルマウスにおいてＬ－チロシンの脳梗塞(brain infarct)と酸化ストレス低減効果確認
（１）脳卒中モデルマウス準備
８週齢C57BL/6雄マウスに１週間以上正常食餌またはＬ－チロシン含有食餌を提供し、水と飼料は、自由に摂取可能にした。
正常食餌（ＮＤ）：AIN-93G
L-Tyr:905mg/kgL-Tyrを含むAIN-93G
（１）脳卒中モデルマウス準備
８週齢C57BL/6雄マウスに１週間以上正常食餌またはＬ－チロシン含有食餌を提供し、水と飼料は、自由に摂取可能にした。
正常食餌（ＮＤ）：AIN-93G
L-Tyr:905mg/kgL-Tyrを含むAIN-93G
【0096】
（２）エンドセリン－１(Endothelin-1)準備及び定位手術(stereotaxic surgery)
３次蒸溜水にエンドセリン－１(Endothelin-1)を入れ（２μｇ／μｌ）、強力にvortex後、４℃で約１０分間超音波を用いて完全に溶解させた。
３次蒸溜水にエンドセリン－１(Endothelin-1)を入れ（２μｇ／μｌ）、強力にvortex後、４℃で約１０分間超音波を用いて完全に溶解させた。
【0097】
痲酔剤アバチン（avertin：マウス重さ２５ｇ当たり０．５ｍｌ）を腹腔注射してマウスを痲酔させた後、定位手術を通じて２μｇのエンドセリン－１(Endothelin-1)を大脳の運動皮質領域（bregmaを中心にAP 1.5mm, ML -1.5mm, DV 1.8mm）に注入した。１分当たり０．３μｌの速度で注入し、注入完了後、約５分間針をそのまま置いてエンドセリン－１(Endothelin-1)が十分に組織に吸収されるようにした。皮膚縫合後に元のケージで回復させた。
【0098】
（３）組織染色
ＰＢＳとＰＦＡを心臓を通じて灌流し、脳を摘出してＰＦＡに１５時間以上後固定した。ＰＢＳで１０分間３回ウォシングし、vibratomeで４０μｍ厚さに脳組織切片を切り取り、エンドセリン－１(Endothelin-1)を注入した地点で４枚ずつの切片をsilaneコーティングされたガラススライドに固定した。乾燥した切片は、０．１％cresyl violet溶液に５分間浸漬した後、３次蒸溜水に２回浸漬して染色液を洗浄した。１００％エタノールに２～３秒間浸漬し、脱水させた後、キシレンに５秒間２回洗浄した。Mount溶液を塗布した後、カバーグラスで覆って乾燥させた。染色された切片試料を光学顕微鏡で観察し、保存されたイメージを対象にイメージＪプログラムを用いて脳梗塞部位の面積を算出した。
ＰＢＳとＰＦＡを心臓を通じて灌流し、脳を摘出してＰＦＡに１５時間以上後固定した。ＰＢＳで１０分間３回ウォシングし、vibratomeで４０μｍ厚さに脳組織切片を切り取り、エンドセリン－１(Endothelin-1)を注入した地点で４枚ずつの切片をsilaneコーティングされたガラススライドに固定した。乾燥した切片は、０．１％cresyl violet溶液に５分間浸漬した後、３次蒸溜水に２回浸漬して染色液を洗浄した。１００％エタノールに２～３秒間浸漬し、脱水させた後、キシレンに５秒間２回洗浄した。Mount溶液を塗布した後、カバーグラスで覆って乾燥させた。染色された切片試料を光学顕微鏡で観察し、保存されたイメージを対象にイメージＪプログラムを用いて脳梗塞部位の面積を算出した。
【0099】
（４）グルタミン合成酵素（ＧＳ）活性測定
９６ウェルプレートに大脳運動皮質 lysate 2μｌを入れ、50 mM imidazol-HCl buffer (pH 6.8)をさらに入れ、５０μｌに合わせた。ＧＳ活性 assay buffer (50 mM imidazole-HCl, pH 6.8, 25 mM L-glutamine, 12.5 mM hydroxylamine, 12.5 mM sodium arsenate, 1 mM MnCl2 and 0.08 mM ADP)５０μｌを入れ、３７゜で３０－６０分間反応させた。
９６ウェルプレートに大脳運動皮質 lysate 2μｌを入れ、50 mM imidazol-HCl buffer (pH 6.8)をさらに入れ、５０μｌに合わせた。ＧＳ活性 assay buffer (50 mM imidazole-HCl, pH 6.8, 25 mM L-glutamine, 12.5 mM hydroxylamine, 12.5 mM sodium arsenate, 1 mM MnCl2 and 0.08 mM ADP)５０μｌを入れ、３７゜で３０－６０分間反応させた。
【0100】
反応終了後、空ウェルに標準物質であるγ-glutamylhydroxamate(0.391~25.0mM)を入れた。試料と標準物質に１００μｌの反応停止液(90mM FeCl3, 1.8N HCl及び1.45%卜リクロロ酢酸（trichloroacetic acid））を入れ、５６０ｎｍ波長で吸光度を測定し、標準曲線との比較を通じて各試料のＧＳ活性を求めた。ＧＳ活性最終生産物であるγ-glutamylhydroxamateの生成量で表現し、単位は、μM/min/μg proteinである。
【0101】
エンドセリン－１(Endothelin-1)をマウス脳のmotor cortexに注入して血管性脳卒中を誘導した実験結果、endothelinを投与した実験群ではsalineを投与した対照群に比べて梗塞体積(infarct volume)が急増し、チロシンを９００ｍｇ／ｋｇ（飼料重さ）の容量で摂食させた実験群でinfarct volumeが減少したことを確認した。また、組織のＧＳ活性度が対照群に比べてエンドセリン－１(Endothelin-1)によって減少したが、tyr食餌によってＧＳの活性が保持されることを確認することができる（図１８）。
【0102】
実施例１０．ヒト組換えMnSODを用いたチロシンの脱ニトロ化効果確認
１）ペルオキシナイトライト(Peroxynitrite)定量
ペルオキシナイトライト(Peroxynitrite)を0.3M NaOHに４０倍希釈して３０２ｎｍで吸光度を測定し、ペルオキシナイトライト(Peroxynitrite)のモル吸光係数(ε302 = 1670 M-1cm-1)を用いて定量した。
１）ペルオキシナイトライト(Peroxynitrite)定量
ペルオキシナイトライト(Peroxynitrite)を0.3M NaOHに４０倍希釈して３０２ｎｍで吸光度を測定し、ペルオキシナイトライト(Peroxynitrite)のモル吸光係数(ε302 = 1670 M-1cm-1)を用いて定量した。
【0103】
２）ＳＯＤ活性測定
ＳＯＤ活性測定は、Thermofisher社のＳＯＤ非色反応活性キットを用いた。標準ＳＯＤに範囲内のヒト組換えMnSOD、ペプチドとペルオキシナイトライトを混合し、氷で１０分間反応させた。標準ＳＯＤまたは反応させた混合物１０μｌとキットで提供する気質溶液５０μｌを９６ウェルプレートに入れ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。キットで提供するキサンチン酸化酵素２５μｌを入れ、常温で２０分間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。２次測定吸光度から１次測定吸光度を差し引いたデータを用いてＳＯＤ活性を測定した。
ＳＯＤ活性測定は、Thermofisher社のＳＯＤ非色反応活性キットを用いた。標準ＳＯＤに範囲内のヒト組換えMnSOD、ペプチドとペルオキシナイトライトを混合し、氷で１０分間反応させた。標準ＳＯＤまたは反応させた混合物１０μｌとキットで提供する気質溶液５０μｌを９６ウェルプレートに入れ、４５０ｎｍで吸光度を測定した。キットで提供するキサンチン酸化酵素２５μｌを入れ、常温で２０分間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。２次測定吸光度から１次測定吸光度を差し引いたデータを用いてＳＯＤ活性を測定した。
【0104】
その結果、ＳＯＤは、生体内の活性窒素種によってＳＯＤ活性が低下した。MnSODの活性度は、Peroxynitriteによって減少するが、添加したTyr(L-、D-form)にＳＯＤ活性が保持されることを確認した（図１９）。
【0105】
実施例１１．急性腎不全に対するTyrの効果確認
（１）動物実験
２３～２５ｇの雄性C57BL/6マウス（コアテック）を温度と湿度とが一定に保持される無菌飼育室で自由に水と飼料とを摂取するようにし、１）対照群(Sham)、２）調剤溶媒処置腎虚血及び再灌流誘発群(CMC+IR)、3)L-tyrosine処置腎虚血及び再灌流誘発群(L-Tyr+IR)など３個実験群に分けた。
（１）動物実験
２３～２５ｇの雄性C57BL/6マウス（コアテック）を温度と湿度とが一定に保持される無菌飼育室で自由に水と飼料とを摂取するようにし、１）対照群(Sham)、２）調剤溶媒処置腎虚血及び再灌流誘発群(CMC+IR)、3)L-tyrosine処置腎虚血及び再灌流誘発群(L-Tyr+IR)など３個実験群に分けた。
【0106】
Ｌ－チロシン(100mg/kg)は、０．５％CMC(carboxymethyl cellulose)に懸濁した。Ｌ－チロシンまたは調剤溶媒ＣＭＣを４日間、一日１回経口投与し、４日目経口投与３０分後、腎虚血を誘発した。腎虚血は、腹部を切開し、Muller atraumatic vascular clampを用いて両側腎茎(renal pedicle)を鉗子して誘発し、２５分虚血後、clampを除去して再灌流した。対照群(Sham)は、鉗子を通じた虚血誘発を除いた全ての手術過程を同一に施行した。再灌流後２４時間に実験動物を犠牲させて心臓から血液を採取し、組織を摘出した。
【0107】
（２）血清クレアチニン
採取した血液を３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離し、Jaffe法を用いて血中クレアチニンを測定した。Jaffe法は、５１０ｎｍ波長で血漿試料をピクリン酸と反応して測定した吸光度と、ｌ６０％酢酸で反応を終了させた後に測定した吸光度との差でクレアチニン量を計算してｍｇ／ｄｌ単位で示した。
採取した血液を３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離し、Jaffe法を用いて血中クレアチニンを測定した。Jaffe法は、５１０ｎｍ波長で血漿試料をピクリン酸と反応して測定した吸光度と、ｌ６０％酢酸で反応を終了させた後に測定した吸光度との差でクレアチニン量を計算してｍｇ／ｄｌ単位で示した。
【0108】
（３）定量的リアルタイム重合酵素反応
Trizol方法で腎臓組織からtotal RNAを抽出し、Revert Aid逆転写システム（Thermofisher）を使用してcDNAを合成した。iQ SYBR Green Super mix(Bio-Rad)を使用してCFX Connect Real-Time PCRシステム(Bio-Rad)で定量的ＰＣＲを遂行した。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。実験に使用したプライマーは、表３に開示した。
Trizol方法で腎臓組織からtotal RNAを抽出し、Revert Aid逆転写システム（Thermofisher）を使用してcDNAを合成した。iQ SYBR Green Super mix(Bio-Rad)を使用してCFX Connect Real-Time PCRシステム(Bio-Rad)で定量的ＰＣＲを遂行した。ハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。実験に使用したプライマーは、表３に開示した。
【0109】
【表3】
【0110】
（４）ウェスタンブロット
腎臓組織をＲＩＰＡ緩衝液で均質化し、１６,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上澄液を収集してＢＣＡ法でタンパク質を定量した。SDS-PAGEで電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレンに移動させ、５％脱脂粉乳でブロッキングした。以後、ニトロ－チロシン及びβ-actin１次抗体及び相応する２次抗体を反応させた後、ＥＣＬ法でChemiDoc XRS+システム(Bio-Rad)で分析した。
腎臓組織をＲＩＰＡ緩衝液で均質化し、１６,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上澄液を収集してＢＣＡ法でタンパク質を定量した。SDS-PAGEで電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレンに移動させ、５％脱脂粉乳でブロッキングした。以後、ニトロ－チロシン及びβ-actin１次抗体及び相応する２次抗体を反応させた後、ＥＣＬ法でChemiDoc XRS+システム(Bio-Rad)で分析した。
【0111】
ROS(Reactive oxygen species)またはRNS(reactive nitrogen species)による酸化的ストレスは、腎虚血及び再灌流損傷による急性腎不全の主要メカニズムであり、抗酸化因子の増加は、腎虚血及び再灌流損傷を抑制するのに重要である。腎虚血及び再灌流２４時間後の腎臓組織において抗酸化作用因子であるNQO-1の遺伝子発現を測定した結果、Ｌ－チロシン投与は、NQO-1の遺伝子発現を調剤溶媒投与群に比べて、統計的に有意に増加させた（＃、ｐ＜０．０１）。ミトコンドリアにおいてROS/RNSの含量もＩＲによって約６倍以上増加したが、Tyrによって抑制されているということを確認した。MnSODとCu/Zn SODの活性度がＩＲによって減少したが、Tyrによって回復することを確認した。腎虚血及び再灌流２４時間後の腎臓組織においてニトロチロシンタンパク質がsham群に比べて増加し、そのような増加は、L-tyrosine投与によって顕著に減少した（図２０）。
【0112】
また、図２１に開示したように腎臓損傷評価指標として血清クレアチニンを測定した結果、血清クレアチニンは、腎虚血及び再灌流２４時間後のsham群に比べて、約５．９倍増加し、そのような増加は、L-tyrosine投与によって統計的に有意に抑制され、腎虚血及び再灌流損傷による急性腎不全の主要発病メカニズムであって、炎症反応を確認するために腎臓組織で炎症性サイトカイン（IL-1b及びIL-6）の遺伝子発現を測定した結果では、腎虚血及び再灌流２４時間後のIL-1b及びIL-6遺伝子発現がsham群に比べて増加し、そのような増加は、L-tyrosine投与によって統計的に有意に抑制された。
【0113】
実施例１２．Azoxymethanを用いた肝性脳症（高アンモニア血症）に対するTyrの効能実験
（１）動物実験
雄性１３週C57BL/6マウス（コアテック）を温度及び湿度が一定に保持される無菌飼育室で自由に水と飼料を摂取させ、（１）対照群(Control)、（２）Carboxymethyl cellulose＋Azoxymethanｅ処置群(CMC+AOM )、（３）Ｌ－チロシン＋AOM処置群(L-Tyr+AOM)など３個実験群に分けた。Ｌ－チロシン(100mg/kg)は、０．５％CMC(carboxymethyl cellulose)に懸濁した。Ｌ－チロシンまたは調剤溶媒ＣＭＣを４日間、一日１回経口投与し、４日目経口投与２時間後、AOM(100mg/kg、100ml)を腹腔注射した。AOMを投与し、１２時間後、脱水を予防するために、０．５％グルコースを含む生理食塩水２００ｍｌを腹腔注射し、４時間後、実験動物を犠牲させて心臓から血液を採取し、肝組織を摘出した。
（１）動物実験
雄性１３週C57BL/6マウス（コアテック）を温度及び湿度が一定に保持される無菌飼育室で自由に水と飼料を摂取させ、（１）対照群(Control)、（２）Carboxymethyl cellulose＋Azoxymethanｅ処置群(CMC+AOM )、（３）Ｌ－チロシン＋AOM処置群(L-Tyr+AOM)など３個実験群に分けた。Ｌ－チロシン(100mg/kg)は、０．５％CMC(carboxymethyl cellulose)に懸濁した。Ｌ－チロシンまたは調剤溶媒ＣＭＣを４日間、一日１回経口投与し、４日目経口投与２時間後、AOM(100mg/kg、100ml)を腹腔注射した。AOMを投与し、１２時間後、脱水を予防するために、０．５％グルコースを含む生理食塩水２００ｍｌを腹腔注射し、４時間後、実験動物を犠牲させて心臓から血液を採取し、肝組織を摘出した。
【0114】
（２）血中アンモニア分析
血中アンモニア量は、単一波長反射測定法分析用測定器であるPocketChem BA PA-4140(Arkray, Japan)を使用して測定した。検査紙に血液を２０μｌ滴下し、室温で３分間反応させ、測定器に挿入して６３５ｎｍ（ＬＥＤ）波長で吸光度を測定して結果をμｇ／ｄｌ単位で示した。
血中アンモニア量は、単一波長反射測定法分析用測定器であるPocketChem BA PA-4140(Arkray, Japan)を使用して測定した。検査紙に血液を２０μｌ滴下し、室温で３分間反応させ、測定器に挿入して６３５ｎｍ（ＬＥＤ）波長で吸光度を測定して結果をμｇ／ｄｌ単位で示した。
【0115】
（３）血漿ALT分析
肝細胞損傷の血液指標であるALT(alanine aminotransferase)は、採取した血液を３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離し、ChemiLab GPTアッセイキット(IVD-LAB, Korea)を使用して測定した。Ｋｉｔの標準測定法によって分光光度計の３４０ｎｍ波長で吸光度を測定し、結果をＵ／Ｌ単位で示した。
肝細胞損傷の血液指標であるALT(alanine aminotransferase)は、採取した血液を３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離し、ChemiLab GPTアッセイキット(IVD-LAB, Korea)を使用して測定した。Ｋｉｔの標準測定法によって分光光度計の３４０ｎｍ波長で吸光度を測定し、結果をＵ／Ｌ単位で示した。
【0116】
（４）Western blot
肝組織をＲＩＰＡ緩衝液で均質化し、１６,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上澄液を収集してＢＣＡ法でタンパク質量を定量した。SDS-PAGEに電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレンに移動させ、５％脱脂粉乳でブロッキングした。以後、ニトロ－チロシン及びβ-actin１次抗体及び相応する２次抗体を反応させた後、ＥＣＬ法でChemiDoc XRS+システム(Bio-Rad)で分析した。
肝組織をＲＩＰＡ緩衝液で均質化し、１６,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した後、上澄液を収集してＢＣＡ法でタンパク質量を定量した。SDS-PAGEに電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレンに移動させ、５％脱脂粉乳でブロッキングした。以後、ニトロ－チロシン及びβ-actin１次抗体及び相応する２次抗体を反応させた後、ＥＣＬ法でChemiDoc XRS+システム(Bio-Rad)で分析した。
【0117】
アンモニアは、アミノ酸と核酸の主代謝物であり、アンモニアを尿素に転換させる尿素回路の主要酵素が肝細胞にのみ存在し、アンモニア濃度を低めるＧＳとＳＯＤ、活性酸素を除去するcatalaseなども肝組織に豊富に存在するので、肝臓を経て脳に上がる血管の血中アンモニア濃度変化は、肝性脳症に重要な指標となる。AOMによる急性肝性脳症モデルにおいて、血中アンモニアを測定した結果、CMC+AOM処置群は、正常対照群に比べて血中アンモニア濃度が６．７倍増加し、L-tyrosine投与は、AOMによる血中アンモニア増加を統計的に有意に抑制した。肝実質細胞の損傷は、細胞質に存在するALTの血中遊離を誘発し、その濃度が増加するので、その酵素の活性を測定することは、肝損傷の程度を知り得る直接的な指標である。AOMによる急性肝性脳症モデルにおいて、血漿内ALTを測定した結果、CMC+AOM処置群は、血漿ALTが対照群に比べて約６５倍増加し、L-tyrosine投与は、AOMによる血漿ALT増加を統計的に有意に抑制した。AOM投与１６時間後の肝組織において、ニトロチロシンタンパク質が対照群に比べて増加し、そのような増加は、L-tyrosine投与によって顕著に減少し、その結果は、Tyrが肝に存在するタンパク質のnitrationを抑制して肝に流入されたアンモニアを除去可能にするという証拠となった（図２２）。
【0118】
(統計処理)
本発明の全てのデータは、平均±SEMで示し、Dunnetts Multiple Comparison Testを用いた一元配置分散分析(ANOVA)またはGraphPadプリズム５(GraphPad Software)を用いたスチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）で統計分析された。
本発明の全てのデータは、平均±SEMで示し、Dunnetts Multiple Comparison Testを用いた一元配置分散分析(ANOVA)またはGraphPadプリズム５(GraphPad Software)を用いたスチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）で統計分析された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】