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特表2023-532966バイヤービリガーモノオキシゲナーゼによるファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-01
(54)【発明の名称】バイヤービリガーモノオキシゲナーゼによるファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換
(51)【国際特許分類】
C12P 5/00 20060101AFI20230725BHJP
C12P 7/28 20060101ALI20230725BHJP
C12N 9/02 20060101ALN20230725BHJP
【ＦＩ】
C12P5/00
C12P7/28
C12N9/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023500078
(86)(22)【出願日】2021-06-30
(85)【翻訳文提出日】2023-03-03
(86)【国際出願番号】 EP2021067983
(87)【国際公開番号】W WO2022003017
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】2010072.3
(32)【優先日】2020-07-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501105842
【氏名又は名称】ジボダン エス エー
(74)【代理人】
【識別番号】100102842
【弁理士】
【氏名又は名称】葛和 清司
(72)【発明者】
【氏名】アイクホルン，エリック
(72)【発明者】
【氏名】ゲーケ，アンドレアス
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AB01
4B064AC33
4B064CA21
4B064CB11
4B064DA20
(57)【要約】
補因子の存在下で、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素とファルネシルアセトンを接触させることを含む、ホモファルネシルアセタートの産生方法。該方法は、ホモファルネシルアセタートをホモファルネソールへ加水分解することをさらに含んでもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）【化1】
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアセタートを、
式（ＩＩ）
【化2】
式中、
Ｒは上記で与えられた意味を有する、
で表されるケトンから産生する方法であって、
該方法が、補因子の存在下において、式（ＩＩ）で表される化合物をバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素と接触させることを含む、前記方法。
【請求項2】
補因子が、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ、またはそれらの組み合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
補因子再生系の存在をさらに含む、請求項１～２に記載の方法。
【請求項4】
補因子再生系が、アルコールデヒドロゲナーゼ酵素とイソプロパノールとの組み合わせである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
請求項１～４に記載の方法であって、該方法が、式（Ｉ）で表されるアセタートを式（ＩＩＩ）【化3】
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアルコールへ加水分解することをさらに含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ホモファルネソール、とりわけ（３Ｅ，７Ｅ）－ホモファルネソール、およびそのエチル誘導体の調製のための新しいプロセスに関する。
【背景技術】
【0002】
ホモファルネソールは、需要の高いフレグランス成分である、(-)-Ambrox（３ａ，６，６，９ａ－テトラメチルドデカヒドロナフト［２，１－ｂ］フラン）の産生のための重要な中間体である。本文献は、ホモファルネソールの調製のためのさまざまなプロセスを説明する。例えば、ホモファルネソールは、Nerolidol（３，７，１１－トリメチルドデカ－１，６，１０－トリエン－３－オール）から出発してホモファルネシル酸アミドを介する冗長なプロセスにおいて合成される(A.F.Barrero et al.,J.Org.Chem.1996,61,2215)。あるいは、ホモファルネソールは、極性溶媒およびハロゲン化パラジウム触媒の存在下において、Nerolidolの脱カルボニル化によって調整されてもよい（ＷＯ９２／０６０６３）。ホモファルネソールの別の産生方法は、ジヒドロフランから出発してホモゲラニオールを介し５段階にわたり、P. Kociensikiら(J. Org. Chem. 1989, 54, 1215)によって説明されている。最近では、ゲラニルアセトンからウィッティヒオレフィン化を介し、これに続くシクロプロパン環の開環およびホルミルオキシ化による、ホモファルネソールの合成が、文献(WO2013/156398)において説明されている。
【0003】
すべての従来知られている方法は、例えば、使用される試薬が高価である、プロセス条件が経済的に魅力がない（例として、温度が０℃未満）、使用される試薬が有毒である、および／または使用される溶媒が可燃性である、などの欠点を有する。
したがって、ホモファルネソールおよびエチルホモファルネソールおよび／またはその前駆体を作製するための、新たなまたは改良された方法を提供することが望まれる。
したがって、ホモファルネソールおよびエチルホモファルネソールおよび／またはその前駆体を作製するための、新たなまたは改良された方法を提供することが望まれる。
【発明の概要】
【0004】
本発明の第１の側面により、式（Ｉ）
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアセタートを、式（ＩＩ）
式中、
Ｒは上記で与えられた意味を有する、
で表されるケトンから産生する方法が提供され、該方法は、補因子の存在下において、式（ＩＩ）で表される化合物をバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素と接触させることを含む。
【化1】
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアセタートを、式（ＩＩ）
【化2】
式中、
Ｒは上記で与えられた意味を有する、
で表されるケトンから産生する方法が提供され、該方法は、補因子の存在下において、式（ＩＩ）で表される化合物をバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素と接触させることを含む。
【0005】
本発明の第２の側面により、式（ＩＩＩ）
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアルコールを、本発明の第１の側面の方法によって得られる式（Ｉ）で表されるアセタートから、加水分解によって産生する方法が提供される。
【化3】
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアルコールを、本発明の第１の側面の方法によって得られる式（Ｉ）で表されるアセタートから、加水分解によって産生する方法が提供される。
【0006】
本発明の第３の側面により、式（ＩＩＩ）で表されるアルコールの生成のための前駆体として、本発明の第１の側面によって得られる、および／または得ることが可能な式（Ｉ）で表されるアセタートの使用が提供され、それは任意で、フレグランス成分の酵素媒介性の産生のための基質として使用される。
【0007】
本発明の任意の側面のある態様は、以下の利点の１以上を提供し得る：
・ホモファルネソール／エチルホモファルネソールの前駆体への異例かつ新規な生物学的経路、
・グリーンケミストリーおよび環境に優しい合成プロセスの履行のための酵素技術の使用。
・ホモファルネソール／エチルホモファルネソールの前駆体への異例かつ新規な生物学的経路、
・グリーンケミストリーおよび環境に優しい合成プロセスの履行のための酵素技術の使用。
【0008】
本発明の論述される任意の特定の１以上の側面に関連して提供される詳細、例および選好は、本明細書にさらに説明され、かつ本発明のすべての側面へ等しく適用されるであろう。本明細書に説明される態様、例および選好の任意の組み合わせは、その全ての実施可能なバリエーションにおいて、本明細書に特段示されないか、または文脈によって明らかに否定されない限り、本発明によって網羅される。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【0010】
詳細な説明
本発明は、線状アルケン鎖を有する式（ＩＩ）で表されるケトンが、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素の存在下で酸化を起こし、その結果としてアセタートを生じ、それがホモファルネソールまたはエチルホモファルネソールなどのアルコールの調製のための前駆体として使用され得るという驚くべき発見に基づく。
ＢＶＭＯ酵素は、ケトンのエステルへの変換を触媒し得ることが知られている。しかしながら、報告されているこれらの酵素は、環状基質（テルペノンおよびベンゾ縮合ケトンを包含する）、脂肪族ケトンおよび脂肪族ヒドロキシケトンに生態系において作用すると説明されているのみである。驚くべきことに、式（ＩＩ）によって定義されるような多価不飽和分枝ケトンが式（Ｉ）で表されるアセタートへ変換されることもまた、ＢＶＭＯ酵素によって触媒されるのであるということが今や発見された。ＢＶＭＯ酵素が多価不飽和分枝ケトンに作用し得ることが報告されている文献はどこにもない。
本発明は、線状アルケン鎖を有する式（ＩＩ）で表されるケトンが、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素の存在下で酸化を起こし、その結果としてアセタートを生じ、それがホモファルネソールまたはエチルホモファルネソールなどのアルコールの調製のための前駆体として使用され得るという驚くべき発見に基づく。
ＢＶＭＯ酵素は、ケトンのエステルへの変換を触媒し得ることが知られている。しかしながら、報告されているこれらの酵素は、環状基質（テルペノンおよびベンゾ縮合ケトンを包含する）、脂肪族ケトンおよび脂肪族ヒドロキシケトンに生態系において作用すると説明されているのみである。驚くべきことに、式（ＩＩ）によって定義されるような多価不飽和分枝ケトンが式（Ｉ）で表されるアセタートへ変換されることもまた、ＢＶＭＯ酵素によって触媒されるのであるということが今や発見された。ＢＶＭＯ酵素が多価不飽和分枝ケトンに作用し得ることが報告されている文献はどこにもない。
【0011】
したがって、式（Ｉ）
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアセタートを、
式（ＩＩ）
式中、
Ｒは上記で与えられた意味を有する、
で表されるケトンから産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、補因子の存在下において、式（ＩＩ）で表される化合物をバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素と接触させることを含む。
【化4】
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表されるアセタートを、
式（ＩＩ）
【化5】
式中、
Ｒは上記で与えられた意味を有する、
で表されるケトンから産生する方法が本明細書で提供され、該方法は、補因子の存在下において、式（ＩＩ）で表される化合物をバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ（ＢＶＭＯ）酵素と接触させることを含む。
【0012】
式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、５Ｅ，９Ｅ－または５Ｚ，９Ｅ－立体配置を有する式（ＩＩ）で表される化合物として、４種の異なる立体異性体の形態で現れる。
【0013】
ある態様において、方法は、式（ＩＩ）で表される５Ｅ，９Ｅ－化合物を式（ＩＩ）で表される任意の他の立体異性体の非存在下でＢＶＭＯ酵素と接触させることを含む。
【0014】
他の態様において、式（ＩＩ）で表される化合物は、例えば、立体異性体の混合物であってもよい。ある態様において、混合物は、式（ＩＩ）で表される５Ｅ，９Ｅ－化合物および式（ＩＩ）で表される１種以上の他の立体異性体を含む。
【0015】
ある態様において、混合物は、式（ＩＩ）で表される５Ｅ，９Ｅ－化合物および式（ＩＩ）で表される５Ｅ，９Ｚ－化合物を含む。
【0016】
ある態様において、混合物は、式（ＩＩ）で表される５Ｅ，９Ｅ－化合物を主成分として含む。主成分とは、混合物中に存在する５Ｅ，９Ｅ－化合物の重量％が式（ＩＩ）で表される５Ｚ，９Ｅ－化合物の重量％より大きいことを意味する。
【0017】
Ｒがメチルの場合、式（ＩＩ）で表される化合物は、Ｅ，Ｅ－ファルネシルアセトン、Ｅ，Ｚ－ファルネシルアセトン、Ｚ，Ｅ－ファルネシルアセトン、Ｚ，Ｚ－ファルネシルアセトンおよびその混合物を網羅するファルネシルアセトンと称されてよい。
Ｒがエチルの場合、式（ＩＩ）で表される化合物は、Ｅ，Ｅ－エチルファルネシルアセトン、Ｅ，Ｚ－エチルファルネシルアセトン、Ｚ，Ｅ－エチルファルネシルアセトン、Ｚ，Ｚ－エチルファルネシルアセトンおよびその混合物を網羅するエチルファルネシルアセトンと称されてよい。
Ｒがメチルである式（ＩＩ）で表される化合物は、市販されている。Ｒがエチルである式（ＩＩ）で表される化合物は、それ自体新規である。それは、実施例１１に説明されている通りの手順に従って、５，９－ジメチルデカ－４，８－ジエナールから合成されてもよい。
Ｒがエチルの場合、式（ＩＩ）で表される化合物は、Ｅ，Ｅ－エチルファルネシルアセトン、Ｅ，Ｚ－エチルファルネシルアセトン、Ｚ，Ｅ－エチルファルネシルアセトン、Ｚ，Ｚ－エチルファルネシルアセトンおよびその混合物を網羅するエチルファルネシルアセトンと称されてよい。
Ｒがメチルである式（ＩＩ）で表される化合物は、市販されている。Ｒがエチルである式（ＩＩ）で表される化合物は、それ自体新規である。それは、実施例１１に説明されている通りの手順に従って、５，９－ジメチルデカ－４，８－ジエナールから合成されてもよい。
【0018】
本明細書で使用される用語「ＢＶＭＯ（バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ）」は、さまざまな酸化反応を触媒し得るモノオキシゲナーゼのことを称し、式（ＩＩ）で表されるケトンの酸化による式（Ｉ）で表されるエステル化合物の産生のためのバイヤービリガー酸化を包含する。
ＢＶＭＯ酵素は、野生型酵素であっても、あるいは改変型酵素であってもよい。本明細書で使用される用語「野生型」は、酵素などのポリペプチド、遺伝子などのポリヌクレオチド、生物、細胞、または任意の他の物質に関連するかどうかにかかわらず、該物質の天然起源の形態のことを称する。本明細書で使用される用語「改変型」は、酵素などのポリペプチド、遺伝子などのポリヌクレオチド、生物、細胞、または任意の他の物質に関連するかどうかにかかわらず、野生型とは異なるものとしての物質のことを称する。野生型物質に対して好適に変更を加えると、改変型物質を産生することもあり、これは遺伝子材料に対する変更、タンパク質材料に対する変更を包含する。遺伝子材料に対する変更は、その材料を野生型とは異なるものにする当該技術分野で既知の任意の遺伝子改変を包含し得る。かかる遺伝子改変の例は、これらに限定されないが、欠失、挿入、置換、融合等々を包含し、これは改変される関連遺伝子（単数または複数）を含有するポリヌクレオチド（単数／複数）上に行われることもある。
ＢＶＭＯ酵素は、野生型酵素であっても、あるいは改変型酵素であってもよい。本明細書で使用される用語「野生型」は、酵素などのポリペプチド、遺伝子などのポリヌクレオチド、生物、細胞、または任意の他の物質に関連するかどうかにかかわらず、該物質の天然起源の形態のことを称する。本明細書で使用される用語「改変型」は、酵素などのポリペプチド、遺伝子などのポリヌクレオチド、生物、細胞、または任意の他の物質に関連するかどうかにかかわらず、野生型とは異なるものとしての物質のことを称する。野生型物質に対して好適に変更を加えると、改変型物質を産生することもあり、これは遺伝子材料に対する変更、タンパク質材料に対する変更を包含する。遺伝子材料に対する変更は、その材料を野生型とは異なるものにする当該技術分野で既知の任意の遺伝子改変を包含し得る。かかる遺伝子改変の例は、これらに限定されないが、欠失、挿入、置換、融合等々を包含し、これは改変される関連遺伝子（単数または複数）を含有するポリヌクレオチド（単数／複数）上に行われることもある。
【0019】
本発明の目的に関して、ＢＶＭＯ酵素が宿主細胞内で産生され、および式（ＩＩ）で表されるケトンからその鎖の中に導入されるエステル基を有する式（Ｉ）で表されるアセタート（例として、ファルネシルアセトンからホモファルネシルアセタート）を産生する反応を触媒することができる限り、そのＢＶＭＯは、、特にこれらに限定されないが、Pseudomonas sp.、Rhodococcus sp.、Brevibacterium sp.、Comanonas sp.、Acinetobacter sp.、Arthrobacter sp.、Brachymonas sp.、Themobifida sp.、Gordonia sp.、Pseudooceanicola sp.などの微生物に由来するＢＶＭＯ、より好ましくは、Pseudomonas sp.、Brachymonas sp.、Pseudooceanicola sp.またはAcinetobacter sp.に由来するＢＶＭＯ、ならびに最も好ましくは、Acinetobacter sp.、Pseudomonas sp.（例として、Pseudomonas veronii）、Brachymonas sp.（例として、Brachymonas petroleovorans）またはPseudooceanicola sp.（例として、Pseudooceanicola batsensis）に由来するＢＶＭＯでよい。ある特定の態様において、ＢＶＭＯは、Acinetobacter sp.またはPseudomonas sp.（例として、Pseudomonas veronii）に由来する。ＢＶＭＯコード遺伝子のヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのGenBankなどのデータベースから得られ得る。
【0020】
酵素は、ＥＣ分類にしたがってそれらの機能によって定義されることもある。酵素番号（ＥＣ番号）は、酵素が触媒する化学反応にもとづいた酵素の数値分類体系である。本明細書に説明されている変換を実行するのに好適なＢＶＭＯは、例えば、EC1.4.13クラス（一方のドナーとしてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨをともなって分子酸素の取り込みまたは還元をし、他方のドナー中へ酸素の１原子を取り込む、対をなすドナーに作用する酸化還元酵素）に属する。
【0021】
ＢＶＭＯは、例えば、以下の例において使用される１種以上のＢＶＭＯ酵素であってもよく、これらは例えば、San Diego (USA)のEnzymeWorks, Inc.から得られるEW-103（野生型Acinetobacter sp.のＢＶＭＯ酵素の変異型）、またはGecco Biotech B.V.から得られるMekAがある。
【0022】
バイヤービリガーモノオキシゲナーゼ補因子（ＢＶＭＯ補因子）は、反応の触媒作用中にＢＶＭＯ酵素を補助する補因子である。本明細書で提供される方法において使用されるＢＶＭＯ補因子は、式（ＩＩ）で表されるケトンを式（Ｉ）で表されるアセタートへ変換することを補助するために好適な任意の型であってもよい。補因子は、例えば、無機分子であっても有機分子であってもよい。ＢＶＭＯ補因子は、例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）およびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、またはその組み合わせから選択されてもよい。
好ましくは、ＢＶＭＯ補因子は、ＢＶＭＯ酵素がＮＡＤ（Ｐ）Ｈで飽和しているなどの、ＢＶＭＯに関する開始モル濃度にて反応混合物中に存在する。したがって、好ましくは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ＢＶＭＯ酵素の濃度に少なくとも等しい濃度で、反応混合物中に存在する。
好ましくは、ＢＶＭＯ補因子は、ＢＶＭＯ酵素がＮＡＤ（Ｐ）Ｈで飽和しているなどの、ＢＶＭＯに関する開始モル濃度にて反応混合物中に存在する。したがって、好ましくは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、ＢＶＭＯ酵素の濃度に少なくとも等しい濃度で、反応混合物中に存在する。
【0023】
本発明の一態様においては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは反応混合物中に、約１から１０ｍｇ／ｍｌ、例として１から５ｍｇ／ｍｌの間、または１から４ｍｇ／ｍｌの間の開始濃度で存在する。
【0024】
一般的には、補因子は高価なので化学量論的な量で使用されることはできず、それを再生することが望まれる。さらに、補因子を再生することによって、所望の変換の効率を高めたり、製品の分離を容易にすることが可能であり、それによって、プロセスのコストがさらに低減される。このため、補因子再生系がしばしば使用される。
【0025】
グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生に一般的なものである。例えば、ＧＤＨ酵素はCodexis Inc. (GDH-105、GDH-901、CDX-019)、Johnson Matthey (GDH-101)またはEnzymeWorks (GDH-EW)から市販されている。文献によれば、さらなるＧＤＨ酵素が得られて、例えば、枯草菌からのグルコースデヒドロゲナーゼ(UniProtKB accession number: P12310, E.C. 1.1.1.47, (1986) J. Bacteriol. 1986, 166, 238 - 43)である。ＧＤＨ酵素は一般的に、補因子再生のために、例としてグルコースとの組み合わせで使用され得る。あるいは、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）酵素は、特定のＢＶＭＯ酵素によって触媒される反応を妨げない場合、例としてイソプロパノールと組み合わされる時に、補因子再生に使用され得る。
【0026】
補因子再生において使用され得る他の酵素は、例えば、例として亜りん酸ナトリウムと組み合わせた亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＴＤＨ）がある。
バイヤービリガーモノオキシゲナーゼは、無細胞抽出物などのしかしそれに限定されることのない当該技術分野で既知である任意の好適な形態における反応混合物中に存在するか、または宿主生物細胞内に含有されていてもよく、およびこれらは溶液／懸濁液中の遊離形態、または精製された形態および／または固定化形態（膜上に保持される、またはカラムへ／カラム内で結合される）などのしかしそれに限定されることのない当該技術分野で既知であるいずれの好適なやり方において反応混合物内にあってもよい。好ましくは、ＢＶＭＯは、溶存酸素の相対的なレベルにて産生可能な式（Ｉ）で表されるアセタートの所要の量を産生するのに必要な濃度にて反応混合物中に存在する。
バイヤービリガーモノオキシゲナーゼは、無細胞抽出物などのしかしそれに限定されることのない当該技術分野で既知である任意の好適な形態における反応混合物中に存在するか、または宿主生物細胞内に含有されていてもよく、およびこれらは溶液／懸濁液中の遊離形態、または精製された形態および／または固定化形態（膜上に保持される、またはカラムへ／カラム内で結合される）などのしかしそれに限定されることのない当該技術分野で既知であるいずれの好適なやり方において反応混合物内にあってもよい。好ましくは、ＢＶＭＯは、溶存酸素の相対的なレベルにて産生可能な式（Ｉ）で表されるアセタートの所要の量を産生するのに必要な濃度にて反応混合物中に存在する。
【0027】
一態様において、バイヤービリガーモノオキシゲナーゼは、それが産生された細胞から調製された細胞抽出物として反応混合物中に存在し、ここで、細胞は、好ましくは、ＢＶＭＯ酵素を産生するのに使用された細菌宿主細胞である。細胞抽出物は、宿主細胞を溶解することが可能な任意の好適な手段、これらに限定されないが、超音波処理、ＲＮＡｓｅ／リゾチーム処置、凍結融解処置、またはアルカリ処置を包含する、によって得られてもよい。
好ましくは、細胞抽出物はその後、本明細書で説明する方法においてバイヤービリガーモノオキシゲナーゼの供給源として使用される前に細胞破片を除去するように処置される。細胞溶解液は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段、これらに限定されないが、清澄化した細胞抽出液を得るための、ろ過、遠心分離、または塩類による精製を包含する、によって処置されてもよい。
好ましくは、細胞抽出物はその後、本明細書で説明する方法においてバイヤービリガーモノオキシゲナーゼの供給源として使用される前に細胞破片を除去するように処置される。細胞溶解液は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段、これらに限定されないが、清澄化した細胞抽出液を得るための、ろ過、遠心分離、または塩類による精製を包含する、によって処置されてもよい。
【0028】
補因子再生系は、ＢＶＭＯ補因子が式（ＩＩ）で表されるケトンを式（Ｉ）で表されるアセタートへ変換することを補助するために使用された後に、ＢＶＭＯ補因子を再生する役割を果たす。補因子再生系は、補因子の還元型（例えば、ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨ）を例えば再生することもある。本明細書で説明される方法において使用される補因子再生系は、ＢＶＭＯ酵素によって式（ＩＩ）で表されるケトンを式（Ｉ）で表されるアセタートへ（例として、ファルネシルアセトンをホモファルネシルアセタートへ）変換することにおいて有用であるＢＶＭＯ補因子を再生するために好適である任意のタイプであってもよい。
このように、式（ＩＩ）で表されるケトンから式（Ｉ）で表されるアセタートを産生する方法がさらなる側面において提供され、その方法は、補因子および補因子再生系の存在下で、式（ＩＩ）で表されるケトンをＢＶＭＯ酵素と接触させることを含む。
このように、式（ＩＩ）で表されるケトンから式（Ｉ）で表されるアセタートを産生する方法がさらなる側面において提供され、その方法は、補因子および補因子再生系の存在下で、式（ＩＩ）で表されるケトンをＢＶＭＯ酵素と接触させることを含む。
【0029】
１つの特定の態様において、補因子再生系は、ＡＤＨ／イソプロパノール補因子再生系である。
別の特定の態様において、補因子再生系は、ＧＤＨ／グルコース補因子再生系である。
別の特定の態様において、補因子再生系は、ホスファイトデヒドロゲナーゼ／ホスファイト補因子再生系である。
ＡＤＨ／イソプロパノール補因子再生系を使用することは、ＧＤＨ／グルコース系と比較して、反応媒体の酸性化がないという利点がある。
式（ＩＩ）で表されるケトンから式（Ｉ）で表されるアセタートを産生する方法は、式（ＩＩ）で表されるケトンを式（Ｉ）で表されるアセタートへ変換できるようにさせる、時間、温度、ｐＨおよび可溶化剤の条件下で実施される。
別の特定の態様において、補因子再生系は、ＧＤＨ／グルコース補因子再生系である。
別の特定の態様において、補因子再生系は、ホスファイトデヒドロゲナーゼ／ホスファイト補因子再生系である。
ＡＤＨ／イソプロパノール補因子再生系を使用することは、ＧＤＨ／グルコース系と比較して、反応媒体の酸性化がないという利点がある。
式（ＩＩ）で表されるケトンから式（Ｉ）で表されるアセタートを産生する方法は、式（ＩＩ）で表されるケトンを式（Ｉ）で表されるアセタートへ変換できるようにさせる、時間、温度、ｐＨおよび可溶化剤の条件下で実施される。
【0030】
反応混合物のｐＨは、４から９、好ましくは７から９（約８．５のｐＨを包含する）の範囲であってよく、反応混合物へバッファの添加、またはｐＨ補正によって維持され得る。この目的のための例示的なバッファは、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ、またはＧｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨバッファである。
【0031】
温度は、検討されるＢＶＭＯ酵素の場合、約１５℃から約６０℃の間であり、例えば約１５℃から約５０℃まで、または約１５℃から約４５℃まで、または約３０℃から約６０℃まで、または約３５℃から約５５℃までである。温度は、生物変換プロセス中に、一定に保ち得るし、あるいは変更させ得る。
本明細書で提供される方法は、式（Ｉ）で表される化合物の精製、および／または式（ＩＩ）で表される任意の未反応化合物からの分離をさらに含むこともある。例えば、式（Ｉ）で表される化合物は、溶媒抽出（例として、メチルベンゼン、ヘキサン、ｔｅｒｔ．ブチルメチルエーテル（ｔＢＭＥ））および／または蒸留により精製されることもある。
本明細書で提供される方法は、式（Ｉ）で表される化合物の精製、および／または式（ＩＩ）で表される任意の未反応化合物からの分離をさらに含むこともある。例えば、式（Ｉ）で表される化合物は、溶媒抽出（例として、メチルベンゼン、ヘキサン、ｔｅｒｔ．ブチルメチルエーテル（ｔＢＭＥ））および／または蒸留により精製されることもある。
【0032】
本発明のさらなる側面において、式（Ｉ）で表される化合物は、さらに反応させられることもある。例えば、式（Ｉ）で表される化合物は、式（ＩＩＩ）
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表される化合物へ加水分解されることもある。
【化6】
式中、
Ｒはメチルまたはエチルである、
で表される化合物へ加水分解されることもある。
【0033】
ある態様において、加水分解は生体触媒で行われ、任意で同じ反応ブロス中で行われることもある。
あるいは、式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは精製後に、例として炭酸カリウムが存在するメタノール溶液中で、化学的に加水分解され得る。
このようにして得られたアルコールは、例えば、生体触媒による変換のための基質として使用されることもある。
あるいは、式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは精製後に、例として炭酸カリウムが存在するメタノール溶液中で、化学的に加水分解され得る。
このようにして得られたアルコールは、例えば、生体触媒による変換のための基質として使用されることもある。
【0034】
ある態様において、Ｒがメチルである式（ＩＩＩ）で表される化合物は、ＳＨＣ（スクアレンホペンシクラーゼ(Squalene Hopene Cyclase)）酵素の存在下で、(-)-Ambroxへ変換されることもある。
ある態様において、Ｒがエチルである式（ＩＩＩ）で表される化合物は、エチルアンブロフィックス（これは、WO2021/110858においてより詳細に説明されている）へ変換されることもある。
本明細書に説明されている例は、本開示を例示するものであり、それに限定することを意図するものではない。本開示の異なる態様が、本開示にしたがって説明されている。本開示の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に説明および図示された技術へ、多くの改変および変化がなされてもよい。したがって、例は例示に過ぎず、本開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
ある態様において、Ｒがエチルである式（ＩＩＩ）で表される化合物は、エチルアンブロフィックス（これは、WO2021/110858においてより詳細に説明されている）へ変換されることもある。
本明細書に説明されている例は、本開示を例示するものであり、それに限定することを意図するものではない。本開示の異なる態様が、本開示にしたがって説明されている。本開示の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に説明および図示された技術へ、多くの改変および変化がなされてもよい。したがって、例は例示に過ぎず、本開示の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【0035】
例
例１：ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析、変換率の計算
１μｌの溶媒相（溶媒抽出サンプル）を３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍのZebron ZB-5カラムに注入（スプリット比３）する。カラムは定流量（４ｍｌ／ｍｉｎ、Ｈ２）にて、温度勾配：１００℃、２００℃へ１５℃／ｍｉｎ、２４０℃へ１２０℃／ｍｉｎ、２４０℃にて４分、をつけて展開した。入口温度：２５０℃、検出器温度：２５０℃(Thermo Trace 1310 ＧＣ装置)
例１：ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析、変換率の計算
１μｌの溶媒相（溶媒抽出サンプル）を３０ｍ×０．３２ｍｍ×０．２５μｍのZebron ZB-5カラムに注入（スプリット比３）する。カラムは定流量（４ｍｌ／ｍｉｎ、Ｈ２）にて、温度勾配：１００℃、２００℃へ１５℃／ｍｉｎ、２４０℃へ１２０℃／ｍｉｎ、２４０℃にて４分、をつけて展開した。入口温度：２５０℃、検出器温度：２５０℃(Thermo Trace 1310 ＧＣ装置)
【0036】
ファルネシルアセトン変換率を、記録された基質と産物のピーク面積から、以下のように計算した。
変換率（％）：１００×（産物ピーク面積／（産物ピーク面積＋基質ピーク面積）
変換率（％）：１００×（産物ピーク面積／（産物ピーク面積＋基質ピーク面積）
【0037】
例２：エチオンアミドモノオキシゲナーゼ（ＥｔｈＡ）を用いたファルネシルアセトンのＢＶＭＯ反応
ＥｔｈＡ(GenBank: AAK48336.1, UniProtKB P9WNF8, Fraaije et al. 2004, J. Biol. Chem. 279(5), 3354)産生用の、プラスミドで形質転換したE. coli TOP10を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２００μｇ／ｍｌのＦＡＤで補充された２００ｍｌＬＢ培地においてＯＤ６５０ｎｍ ０．７５まで培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した。０．２％のアラビノースを加えることによって酵素産生の誘導をその後引き起こした。ファルネシルアセトン（０．１％）を培養物へ加え、３０℃にてさらに２３ｈの間インキュベーションした。培養物をサンプリングし、メチル－ｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を用いて抽出し、基質および産物の含有量をＧＣ分析した。反応産物の同一性を、ＧＣ－ＭＳ分析によって確認した。ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換率は、２セットの独立した実験において２～５％であった。
ＥｔｈＡ(GenBank: AAK48336.1, UniProtKB P9WNF8, Fraaije et al. 2004, J. Biol. Chem. 279(5), 3354)産生用の、プラスミドで形質転換したE. coli TOP10を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２００μｇ／ｍｌのＦＡＤで補充された２００ｍｌＬＢ培地においてＯＤ６５０ｎｍ ０．７５まで培養（３７℃、２００ｒｐｍ）した。０．２％のアラビノースを加えることによって酵素産生の誘導をその後引き起こした。ファルネシルアセトン（０．１％）を培養物へ加え、３０℃にてさらに２３ｈの間インキュベーションした。培養物をサンプリングし、メチル－ｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を用いて抽出し、基質および産物の含有量をＧＣ分析した。反応産物の同一性を、ＧＣ－ＭＳ分析によって確認した。ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換率は、２セットの独立した実験において２～５％であった。
【0038】
例３：シクロペンタデカノンモノオキシゲナーゼ（ＣＰＤＭＯ）を用いたファルネシルアセトンのＢＶＭＯ反応
ＣＰＤＭＯ(GenBank AB232538.1, UniProtKB Q1T7B5)産生用の、ｐＪ４０１由来のプラスミドを用いて形質転換したE. coli BL21(DE3)細胞からＣＰＤＭＯを産生した。
２００ｍｌ ＬＢ培地培養物（５０ｇ／ｍｌ カナマイシン）を、一晩の種培養物から播種し、ＯＤ６５０ｎｍ ０．５００～０．６００まで２８℃、１６０ｒｐｍにて約３．５ｈの間インキュベートした。酵素産生の誘導のために、ＩＰＴＧを０．８ｍＭまで加えた。培養物を、２８℃、１６０ｒｐｍにてさらに３～４ｈの間インキュベートした。遠心分離によって細胞を採取し、洗浄した。回収した細胞ペレットを２．５ｍｌの反応バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ９．０）中で懸濁し、細胞を超音波処理によって破砕した。超音波処理した材料に最後に１６．５ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０を加え、結果としてＣＰＤＭＯ粗酵素調製物とした。酵素活性を測定するために、９５０μｌの粗ＣＰＤＭＯ酵素調製物へ１０μｌのファルネシルアセトンおよび４０μｌの５０ｍＭ ＮＡＤＨを加えた。反応物を３０℃にて３ｈの間インキュベートし、ＭＴＢＥを用いて抽出し、ＧＣ分析した。ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換率は、約７％であった。
ＣＰＤＭＯ(GenBank AB232538.1, UniProtKB Q1T7B5)産生用の、ｐＪ４０１由来のプラスミドを用いて形質転換したE. coli BL21(DE3)細胞からＣＰＤＭＯを産生した。
２００ｍｌ ＬＢ培地培養物（５０ｇ／ｍｌ カナマイシン）を、一晩の種培養物から播種し、ＯＤ６５０ｎｍ ０．５００～０．６００まで２８℃、１６０ｒｐｍにて約３．５ｈの間インキュベートした。酵素産生の誘導のために、ＩＰＴＧを０．８ｍＭまで加えた。培養物を、２８℃、１６０ｒｐｍにてさらに３～４ｈの間インキュベートした。遠心分離によって細胞を採取し、洗浄した。回収した細胞ペレットを２．５ｍｌの反応バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ９．０）中で懸濁し、細胞を超音波処理によって破砕した。超音波処理した材料に最後に１６．５ｍｌの５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０を加え、結果としてＣＰＤＭＯ粗酵素調製物とした。酵素活性を測定するために、９５０μｌの粗ＣＰＤＭＯ酵素調製物へ１０μｌのファルネシルアセトンおよび４０μｌの５０ｍＭ ＮＡＤＨを加えた。反応物を３０℃にて３ｈの間インキュベートし、ＭＴＢＥを用いて抽出し、ＧＣ分析した。ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換率は、約７％であった。
【0039】
例４：EnzymeWorksのＢＶＭＯ酵素を用いたファルネシルアセトンのＢＶＭＯ反応
酵素供給者であるEnzymeWorks, Inc, (http://www.enzymeworking.com)から入手可能な８種のバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ酵素を、ファルネシルアセトンをホモファルネシルアセタートへ変換するそれらの能力について試験した。反応物は、１００ｍＭのグリシン／ＮａＯＨバッファ（ｐＨ９．０）中に、２ｇ／ｌのファルネシルアセトン、２５ｍＭのグルコース、１ｍＭのＮＡＤＰ、２ｇ／ｌのＢＶＭＯ酵素、２ｇ／ｌのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含有していた。反応物を、穏やかに振とう（７０ｒｐｍ）しながら３０℃にて２４ｈの間インキュベートした。０．５ｍｌの反応物を１．５ｍｌのＭＴＢＥを用いて抽出し、ＧＣ分析した。EW-103ＢＶＭＯを用いて２４ｈで、ファルネシルアセトン変換率は約５０％であった。
酵素供給者であるEnzymeWorks, Inc, (http://www.enzymeworking.com)から入手可能な８種のバイヤービリガーモノオキシゲナーゼ酵素を、ファルネシルアセトンをホモファルネシルアセタートへ変換するそれらの能力について試験した。反応物は、１００ｍＭのグリシン／ＮａＯＨバッファ（ｐＨ９．０）中に、２ｇ／ｌのファルネシルアセトン、２５ｍＭのグルコース、１ｍＭのＮＡＤＰ、２ｇ／ｌのＢＶＭＯ酵素、２ｇ／ｌのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を含有していた。反応物を、穏やかに振とう（７０ｒｐｍ）しながら３０℃にて２４ｈの間インキュベートした。０．５ｍｌの反応物を１．５ｍｌのＭＴＢＥを用いて抽出し、ＧＣ分析した。EW-103ＢＶＭＯを用いて２４ｈで、ファルネシルアセトン変換率は約５０％であった。
【0040】
例５：Gecco-BiotechのＢＶＭＯ酵素を用いたファルネシルアセトンのＢＶＭＯ反応
Gecco Biotech (http://www.gecco-biotech.com/)が供給するＢＶＭＯ酵素（野生型または変異型酵素）を、ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換へ適用した。ＢＶＭＯ酵素を、亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＴＤＨ）との精製融合タンパク質として提供した。２０ｍＭのファルネシルアセトン（約５ｇ／ｌ）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファ（１ｍｌ反応容積）中で、２０μＭのＢＶＭＯ、１ｍＭのＮＡＤＰおよび１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ３．５Ｈ２Ｏの存在下で、２０時間２４℃にて反応させた。
Gecco Biotech (http://www.gecco-biotech.com/)が供給するＢＶＭＯ酵素（野生型または変異型酵素）を、ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの変換へ適用した。ＢＶＭＯ酵素を、亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＴＤＨ）との精製融合タンパク質として提供した。２０ｍＭのファルネシルアセトン（約５ｇ／ｌ）を、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファ（１ｍｌ反応容積）中で、２０μＭのＢＶＭＯ、１ｍＭのＮＡＤＰおよび１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ３．５Ｈ２Ｏの存在下で、２０時間２４℃にて反応させた。
【0041】
下表においてまとめた結果は、使用したＢＶＭＯ酵素に応じて、ファルネシルアセトン変換率が３から５２％の間であることを示した。
表中に使用した略語は、n.a.：該当しない、STMO：ステロイドモノオキシゲナーゼ、PAMO：フェニルアセトンモノオキシゲナーゼ、HAPMO：４－ヒドロキシアセトフェノンモノオキシゲナーゼ、ACMO：アセトンモノオキシゲナーゼ、CPDMO：シクロペンタデカノン１，２－モノオキシゲナーゼである。
表中に使用した略語は、n.a.：該当しない、STMO：ステロイドモノオキシゲナーゼ、PAMO：フェニルアセトンモノオキシゲナーゼ、HAPMO：４－ヒドロキシアセトフェノンモノオキシゲナーゼ、ACMO：アセトンモノオキシゲナーゼ、CPDMO：シクロペンタデカノン１，２－モノオキシゲナーゼである。
【表1】
【0042】
例６：ＢＶＭＯ酵素EW-103の補因子要件
EW-103ＢＶＭＯを用いて、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとの両方がファルネシルアセトン変換において補因子として作用し得るかどうかを調査した。
反応は、７．６ｍＭのファルネシルアセトン、１ｍＭの補因子、２ｍｇ／ｍｌのＢＶＭＯEW-103、２ｍｇ／ｍｌのＧＤＨおよび２５ｍＭのグルコースを用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．５）中で行った（５ｍｌ容量、Heidolph Synthesis 1、３０℃、９００ｒｐｍ）。１つの反応においては、ＮＡＤＰがＮＡＤによって置換された。ファルネシルアセトン変換は、補因子としてのＮＡＤＨによってサポートされていたが、驚くべきことに、２時間のインキュベーション後に、約２０％の変換率にて突然停止した。ＮＡＤＰＨを補因子として使用した場合には、ほぼ同じ時間において完全なファルネシルアセトン変換を得た。
２種の異なるグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素を使用するとともに、増大したＮＡＤ濃度（１、２および５ｍＭ）にて反応を繰り返した。適用したＮＡＤ濃度、および使用したＧＤＨ酵素とは関係なく、ファルネシルアセトン変換は約２０％にて停止したが、ＮＡＤＰＨが補因子である場合は再び完全変換を達成した（図１参照）。
EW-103ＢＶＭＯを用いて、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとの両方がファルネシルアセトン変換において補因子として作用し得るかどうかを調査した。
反応は、７．６ｍＭのファルネシルアセトン、１ｍＭの補因子、２ｍｇ／ｍｌのＢＶＭＯEW-103、２ｍｇ／ｍｌのＧＤＨおよび２５ｍＭのグルコースを用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．５）中で行った（５ｍｌ容量、Heidolph Synthesis 1、３０℃、９００ｒｐｍ）。１つの反応においては、ＮＡＤＰがＮＡＤによって置換された。ファルネシルアセトン変換は、補因子としてのＮＡＤＨによってサポートされていたが、驚くべきことに、２時間のインキュベーション後に、約２０％の変換率にて突然停止した。ＮＡＤＰＨを補因子として使用した場合には、ほぼ同じ時間において完全なファルネシルアセトン変換を得た。
２種の異なるグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）酵素を使用するとともに、増大したＮＡＤ濃度（１、２および５ｍＭ）にて反応を繰り返した。適用したＮＡＤ濃度、および使用したＧＤＨ酵素とは関係なく、ファルネシルアセトン変換は約２０％にて停止したが、ＮＡＤＰＨが補因子である場合は再び完全変換を達成した（図１参照）。
【0043】
例７：補因子再生系
補因子再生用に、グルコースまたはイソプロパノールを使用する場合のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の使用を想定し得る。イソプロパノールおよびアセトンに対するEW-103の感度を試験して、ＧＤＨ／グルコースではなくＡＤＨ／イソプロパノールを使用する可能性を調査した。
７．６ｍＭのファルネシルアセトン（２ｇ／ｌ）、１ｍＭのＮＡＤＰ、２ｇ／ｌのＢＶＭＯEW-103、２ｇ／ｌのＧＤＨおよび２５ｍＭのグルコースを用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．５）中で行った（５ｍｌ、Heidolph Synthesis 1、３０℃、９００ｒｐｍ）反応において、イソプロパノールまたはアセトンを５％および１０％（ｖ／ｖ）まで加えた。
反応物へ５％イソプロパノールまたはアセトンを加えても、ファルネシルアセトン変換率に影響はなかった。イソプロパノールまたはアセトンを１０％まで加えた場合、ファルネシルアセトン変換率は低下した。反応物が１０％イソプロパノールを含有する場合、ファルネシルアセトン変換率は２４ｈでほんの６４％程度であった。EW-103ＢＶＭＯは、アセトンを加えることに対して感度がより低く：１０％アセトンを含有する反応においては２４ｈでファルネシルアセトン変換率が８０％であった（図２参照）。
補因子再生用に、グルコースまたはイソプロパノールを使用する場合のグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の使用を想定し得る。イソプロパノールおよびアセトンに対するEW-103の感度を試験して、ＧＤＨ／グルコースではなくＡＤＨ／イソプロパノールを使用する可能性を調査した。
７．６ｍＭのファルネシルアセトン（２ｇ／ｌ）、１ｍＭのＮＡＤＰ、２ｇ／ｌのＢＶＭＯEW-103、２ｇ／ｌのＧＤＨおよび２５ｍＭのグルコースを用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．５）中で行った（５ｍｌ、Heidolph Synthesis 1、３０℃、９００ｒｐｍ）反応において、イソプロパノールまたはアセトンを５％および１０％（ｖ／ｖ）まで加えた。
反応物へ５％イソプロパノールまたはアセトンを加えても、ファルネシルアセトン変換率に影響はなかった。イソプロパノールまたはアセトンを１０％まで加えた場合、ファルネシルアセトン変換率は低下した。反応物が１０％イソプロパノールを含有する場合、ファルネシルアセトン変換率は２４ｈでほんの６４％程度であった。EW-103ＢＶＭＯは、アセトンを加えることに対して感度がより低く：１０％アセトンを含有する反応においては２４ｈでファルネシルアセトン変換率が８０％であった（図２参照）。
【0044】
この結果は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）／イソプロパノール補因子再生系を使用する可能性を示した。ＡＤＨ酵素は、多くの酵素製造業者および供給業者から入手可能である（例として、Codexis Inc.からのKRED-P2-H07）。
【0045】
１ｍＭのＮＡＤＰＨ、１ｇ／ＬのＢＶＭＯEW-103、０．５ｇ／ＬのＡＤＨ（Codexis KRED-P2-H07）、３５ｍＭのイソプロパノールの存在下で、８ｇ／ｌのファルネシルアセトン（３０．５ｍＭ）を用いて、５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌバッファ（ｐＨ８．５）（総容積１５０ｍＬ）中で行った反応において、ＡＤＨ／イソプロパノール補因子再生系の使用を確認した。ファルネシルアセトン変換率は、２４時間で約７５％であった。この反応構成において、１ｇのEW-103ＢＶＭＯ酵素を用いて、約６ｇのファルネシルアセトンをホモファルネシルアセタートへ変換した。この変換収率は、ＧＤＨ／グルコース補因子再生系を使用した同様の実験操業において、およびそこで１ｇのＢＶＭＯEW-103酵素が３．６ｇのファルネシルアセトンしか変換できなかったことよりも、高かった。
【0046】
例８：ＢＶＭＯファルネシルアセトン変換の反応産物
使用したＢＶＭＯ酵素によるファルネシルアセトン変換の産物として、ホモファルネシルアセタートをＧＣ－ＭＳ分析によって同定した。
いくつかの反応において、興味深くかつ驚いたことに、反応産物としてホモファルネシルアセタートおよびホモファルネソールの両方の産生を観察した。これは、例としてリパーゼ（使用した酵素凍結乾燥物または細胞抽出物中に存在する）によって触媒されたＢＶＭＯ非依存性反応に起因するホモファルネシルアセタート加水分解の結果であると考える。これはさらには調査しなかったが、ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの酸化ステップ、およびそれに続くホモファルネシルアセタートのホモファルネソールへの加水分解は、ＢＶＭＯ触媒反応と、例として適当なホモファルネシルアセタートのリパーゼ触媒加水分解と組み合わせた、および適正な反応条件を適用したワンポット反応において触媒され得ることが考えられ得る。
使用したＢＶＭＯ酵素によるファルネシルアセトン変換の産物として、ホモファルネシルアセタートをＧＣ－ＭＳ分析によって同定した。
いくつかの反応において、興味深くかつ驚いたことに、反応産物としてホモファルネシルアセタートおよびホモファルネソールの両方の産生を観察した。これは、例としてリパーゼ（使用した酵素凍結乾燥物または細胞抽出物中に存在する）によって触媒されたＢＶＭＯ非依存性反応に起因するホモファルネシルアセタート加水分解の結果であると考える。これはさらには調査しなかったが、ファルネシルアセトンのホモファルネシルアセタートへの酸化ステップ、およびそれに続くホモファルネシルアセタートのホモファルネソールへの加水分解は、ＢＶＭＯ触媒反応と、例として適当なホモファルネシルアセタートのリパーゼ触媒加水分解と組み合わせた、および適正な反応条件を適用したワンポット反応において触媒され得ることが考えられ得る。
【0047】
例９：プロセス関連反応条件および変換収率
EW-103ＢＶＭＯを用いたファルネシルアセトン変換を、９ｇ／ｌのＢＶＭＯEW-103、３．２ｇ／ｌのＡＤＨKRED-P2-H07および１．５ｇ／ｌのＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）を用いて、２７ｇ／ｌのイソプロパノール（０．４４Ｍ）の存在下で１０６ｇ／ｌの基質（０．４Ｍ）にて行った。３０℃にて５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌバッファ（ｐＨ８．５）中で、一定攪拌で反応を行った。反応サンプルをＭＴＢＥで抽出し、ＧＣ分析した。４８時間の反応後、ファルネシルアセトン変換率は約７０％であって、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたり８ｇのファルネシルアセトンの変換収率に相当する。
EW-103ＢＶＭＯを用いたファルネシルアセトン変換を、９ｇ／ｌのＢＶＭＯEW-103、３．２ｇ／ｌのＡＤＨKRED-P2-H07および１．５ｇ／ｌのＮＡＤＰＨ（２ｍＭ）を用いて、２７ｇ／ｌのイソプロパノール（０．４４Ｍ）の存在下で１０６ｇ／ｌの基質（０．４Ｍ）にて行った。３０℃にて５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌバッファ（ｐＨ８．５）中で、一定攪拌で反応を行った。反応サンプルをＭＴＢＥで抽出し、ＧＣ分析した。４８時間の反応後、ファルネシルアセトン変換率は約７０％であって、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたり８ｇのファルネシルアセトンの変換収率に相当する。
【0048】
２７ｇ／ｌのイソプロパノール（０．４４Ｍ）の存在下で１０６ｇ／ｌの基質（０．４Ｍ）にて、他の反応パラメータを変化させながら、さらなる反応を行った：ＢＶＭＯ、ＡＤＨ、およびＮＡＤＰＨ濃度を、以下のように設定した：
（１）４５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、５ｍＭ、または
（２）５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、０．５ｍＭ
おおよそ２４時間の反応後、（１）においてファルネシルアセトンの変換率は８６．２％であって、ＭＴＢＥを用いて抽出した反応サンプルから判断する限りでは、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたり２ｇのファルネシルアセトンの変換収率を表す。（２）においては、ＭＴＢＥを用いて抽出した反応サンプルから判断する限りでは、ファルネシルアセトンの変換率は５９％であって、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたり約１２．５ｇのファルネシルアセトンが変換された変換収率に相当する。
この結果は、約２４時間でＢＶＭＯ酵素（例として、ＢＶＭＯEW-103）を用いてファルネシルアセトンを完全に変換する可能性が高く、かつ基質比率に対しての酵素を注意深く設定することで、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたりで変換される基質のグラム数として定義する変換収率、および１ｇのＢＶＭＯ酵素あたりのファルネシルアセトン変換率と反応時間の観点から定義する産生能が増大することを証明している。
（１）４５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、５ｍＭ、または
（２）５ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌ、０．５ｍＭ
おおよそ２４時間の反応後、（１）においてファルネシルアセトンの変換率は８６．２％であって、ＭＴＢＥを用いて抽出した反応サンプルから判断する限りでは、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたり２ｇのファルネシルアセトンの変換収率を表す。（２）においては、ＭＴＢＥを用いて抽出した反応サンプルから判断する限りでは、ファルネシルアセトンの変換率は５９％であって、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたり約１２．５ｇのファルネシルアセトンが変換された変換収率に相当する。
この結果は、約２４時間でＢＶＭＯ酵素（例として、ＢＶＭＯEW-103）を用いてファルネシルアセトンを完全に変換する可能性が高く、かつ基質比率に対しての酵素を注意深く設定することで、１ｇのＢＶＭＯ酵素あたりで変換される基質のグラム数として定義する変換収率、および１ｇのＢＶＭＯ酵素あたりのファルネシルアセトン変換率と反応時間の観点から定義する産生能が増大することを証明している。
【0049】
例１０：ＢＶＭＯ酵素を用いたエチルファルネシルアセトンの変換
エチルファルネシルアセトン（４種異性体の混合物）をEnzymeWorksのＢＶＭＯEW-103を用いてＢＶＭＯ酸化に供した。反応物（５ｍｌ容量）は、５０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨバッファ（ｐＨ９．０）中に、２ｇ／ｌの基質、２ｇ／ｌのＢＶＭＯ酵素、０．５ｇ／ｌのＮＡＤＰ、４．５ｇ／ｌのグルコース、２ｇ／ｌのＧＤＨを含有していた。反応物を、３０℃、６５０ｒｐｍにて、インキュベートした（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １装置）。反応物を開始後５、１２．５、４８ｈでサンプリングし、抽出（０．７ｍｌのＭＴＢＥに対して０．６ｍｌの反応物）し、ＧＣ－ＦＩＤによって基質／産物の含有量を分析した。４種の異性体基質ピークから４種の反応産物を認めた。ＧＣ－ＭＳ分析によって、エチルファルネシルアセトンがホモエチルファルネシルアセタートへ変換されたことを認めた。全体として２５～３０％の変換率を観察した。
エチルファルネシルアセトン（４種異性体の混合物）をEnzymeWorksのＢＶＭＯEW-103を用いてＢＶＭＯ酸化に供した。反応物（５ｍｌ容量）は、５０ｍＭのグリシン／ＮａＯＨバッファ（ｐＨ９．０）中に、２ｇ／ｌの基質、２ｇ／ｌのＢＶＭＯ酵素、０．５ｇ／ｌのＮＡＤＰ、４．５ｇ／ｌのグルコース、２ｇ／ｌのＧＤＨを含有していた。反応物を、３０℃、６５０ｒｐｍにて、インキュベートした（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １装置）。反応物を開始後５、１２．５、４８ｈでサンプリングし、抽出（０．７ｍｌのＭＴＢＥに対して０．６ｍｌの反応物）し、ＧＣ－ＦＩＤによって基質／産物の含有量を分析した。４種の異性体基質ピークから４種の反応産物を認めた。ＧＣ－ＭＳ分析によって、エチルファルネシルアセトンがホモエチルファルネシルアセタートへ変換されたことを認めた。全体として２５～３０％の変換率を観察した。
【0050】
反応産物であるホモエチルファルネシルアセタートを、例として、例えばリパーゼ酵素を使用してさらに加水分解すると、エチルホモファルネソールを産生し、これはスクアレンホペンシクラーゼ（Squalene Hopene Cyclase（ＳＨＣ））酵素を用いてEthylambrofixへ環化するための基質である。
【0051】
例１１：エチルファルネシルアセトン
ジエチルエーテル中の臭化エチルマグネシウム（３Ｍ、１７５ｍＬ、５２５ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）中の５，９－ジメチルデカ－４，８－ジエナル（Ｅ／Ｚ混合物、７８．８ｇ、４３７ｍｍｏｌ）の溶液へ、－５０℃にて３０分の間滴加した。添加完了後、冷却槽を取り除き、混合物を１時間攪拌した。その後、それを２Ｍ ＨＣｌ水溶液（２００ｍＬ）に注ぎ、混合物をメチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、１５０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を、水および希釈したＮａＣｌ水溶液でｐＨ中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。ろ過およびロータリーエバポレータ内の溶媒の除去後、無色透明の液体を得て（７９．２ｇ、８６％）、これをアセトン（２００ｍＬ）に溶解した。０℃へ冷却後、ジョーンズ試薬（Ｈ２ＳＯ４水溶液中に４ＭのＣｒＯ３、９４．１ｍＬ）を滴加し、その間に温度が４３℃へ上昇し、混合物は緑褐色に変じた。添加終了後、混合物を室温にて１ｈの間攪拌し、その後、ジョーンズ試薬の追加量（３０ｍＬ）を加え、２０分間攪拌を続け、その後、２－プロパノール（２０ｍＬ）を加えた。上記の通りワークアップおよび抽出を行い、透明な黄色液体（７４．８ｇ）を生じ、これを１０ｃｍビグリューカラム上で９１～９５℃（０．０９ｍｂａｒ）にて蒸留し、わずかに黄色の透明オイルとして７，１１－ジメチルドデカ－６，１０－ジエン－３－オン（５０．１ｇ、６４％、Ｅ／Ｚ混合物）を生じた。
ジエチルエーテル中の臭化エチルマグネシウム（３Ｍ、１７５ｍＬ、５２５ｍｍｏｌ、１．２当量）の溶液を、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）中の５，９－ジメチルデカ－４，８－ジエナル（Ｅ／Ｚ混合物、７８．８ｇ、４３７ｍｍｏｌ）の溶液へ、－５０℃にて３０分の間滴加した。添加完了後、冷却槽を取り除き、混合物を１時間攪拌した。その後、それを２Ｍ ＨＣｌ水溶液（２００ｍＬ）に注ぎ、混合物をメチルｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、１５０ｍＬ）を用いて抽出した。有機層を、水および希釈したＮａＣｌ水溶液でｐＨ中性まで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。ろ過およびロータリーエバポレータ内の溶媒の除去後、無色透明の液体を得て（７９．２ｇ、８６％）、これをアセトン（２００ｍＬ）に溶解した。０℃へ冷却後、ジョーンズ試薬（Ｈ２ＳＯ４水溶液中に４ＭのＣｒＯ３、９４．１ｍＬ）を滴加し、その間に温度が４３℃へ上昇し、混合物は緑褐色に変じた。添加終了後、混合物を室温にて１ｈの間攪拌し、その後、ジョーンズ試薬の追加量（３０ｍＬ）を加え、２０分間攪拌を続け、その後、２－プロパノール（２０ｍＬ）を加えた。上記の通りワークアップおよび抽出を行い、透明な黄色液体（７４．８ｇ）を生じ、これを１０ｃｍビグリューカラム上で９１～９５℃（０．０９ｍｂａｒ）にて蒸留し、わずかに黄色の透明オイルとして７，１１－ジメチルドデカ－６，１０－ジエン－３－オン（５０．１ｇ、６４％、Ｅ／Ｚ混合物）を生じた。
【0052】
ＴＨＦ（１００ｍＬ）中の７，１１－ジメチルドデカ－６，１０－ジエン－３－オン（３４．０ｇ、１６３ｍｍｏｌ）の溶液を、－５℃にて３０分の間、新たに準備したＴＨＦ中の臭化ビニルマグネシウムの溶液（０．９Ｍ、２２８ｍｍｏｌ、１．４当量）へ加えた。その結果得られた混合物を、２０分間室温にて攪拌し、その後、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液（１５０ｍＬ）を加えることによって加水分解した。上記の通りさらにワークアップを行い、透明な黄色液体（３７．５ｇ）を生じ、これを１０ｃｍビグリューカラム上で蒸留（９０℃／０．０７ｍｂａｒにて蒸留）することによって精製して３－エチル－７，１１－ジメチルドデカ－１，６，１０－トリエン－３－オール（１２．０ｇ、３１％，無色透明な液体、ＧＣによるＥ／Ｚ比５：４）を生じた。
【0053】
この産物（１２．０ｇ、５０．８ｍｍｏｌ）へ、２－メトキシプロペン（７．３３ｇ、１０２ｍｍｏｌ、２当量）およびリン酸（１０ｍｇ）を加えた。混合物をオートクレーブ容器中に入れ、３ｈの間１７０℃にて攪拌した。室温まで冷却した後、上述と同量の２－メトキシプロペンおよびリン酸を加え、その混合物を１８ｈの間１７０℃にて攪拌した。室温まで冷却した後、混合物をロータリーエバポレータ内で濃縮して茶色の液体（１４．９１ｇ）を生じ、これをクーゲルロールオーブン内で１５０℃／０．０５ｍｂａｒにて蒸留して透明な黄色の液体（１２．６６ｇ）を生じ、これをヘプタン／ＭＴＢＥ（９５：５）を用いてシリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィーによってさらに精製して無色の液体（Ｅ／Ｚ異性体の混合物、ＧＣによれば３１／２６／２５／１８％）として６－エチル－１０，１４－ジメチルペンタデカ－５，９，１３－トリエン－２－オン（６．５１ｇ、４６％）を生じた。
【0054】
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz): 4.88 - 5.37 (m, 3 H), 2.46 (d, J=7.8 Hz, 2 H), 2.29 (br d, J=7.8 Hz, 2 H), 2.15 (s, 3 H), 1.96 - 2.11 (m, 10 H), 1.67 - 1.73 (m, 5 H), 1.60 - 1.65 (m, 4 H), 0.94 - 1.03 (m, 3 H). 13C-NMR (CDCl3, 101 MHz): 208.8 (s), 208.7 (s), 142.3 (s), 142.2 (s), 142.1 (s), 135.3 (s), 135.2 (s), 135.1 (s), 135.0 (s), 131.5 (s), 131.3 (s), 131.3 (s), 124.7 (d), 124.3 (d), 124.2 (d), 124.0 (d), 122.0 (d), 121.6 (d), 121.5 (d), 44.1 (t), 39.7 (t), 39.7 (t), 36.8 (t), 36.5 (t), 32.0 (t), 32.0 (t), 31.9 (t), 30.6 (t), 30.3 (t), 30.0 (q), 29.9 (q), 29.5 (t), 26.9 (t), 26.8 (t), 26.7 (t), 26.7 (t), 26.6 (t), 26.6 (t), 25.7 (q), 25.7 (q), 23.4 (q), 23.4 (q), 23.1 (t), 23.1 (t), 22.7 (t), 22.2 (t), 22.1 (t), 17.7 (q), 17.6 (q), 16.0 (q), 16.0 (q), 14.1 (q), 13.2 (q), 13.2 (q), 12.8 (q). MS (EI, 70eV): 276 (M+, <1), 218(<1), 207(<1), 149(10), 136(15), 121(28), 107(10), 95(16), 81(36), 69(89), 55(15), 43(100).
【図1】
【図2】
【国際調査報告】