特表2023-533160水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-02
(54)【発明の名称】水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するための方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/00 20060101AFI20230726BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20230726BHJP
C07K 1/20 20060101ALI20230726BHJP
C07K 14/04 20060101ALI20230726BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230726BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20230726BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20230726BHJP
【ＦＩ】
C12P21/00 B ZNA
C07K1/18
C07K1/20
C07K14/04
C12N5/10
C12N1/00 B
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022574801
(86)(22)【出願日】2021-07-06
(85)【翻訳文提出日】2023-01-25
(86)【国際出願番号】 KR2021008537
(87)【国際公開番号】W WO2022010213
(87)【国際公開日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】10-2020-0085685
(32)【優先日】2020-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】506379781
【氏名又は名称】グリーン・クロス・コーポレイション
【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】リー， グァン ベ
(72)【発明者】
【氏名】キム， ミ スク
(72)【発明者】
【氏名】イム， ジョン エ
(72)【発明者】
【氏名】チョン， ユ ミン
(72)【発明者】
【氏名】ハン， スン ヨル
(72)【発明者】
【氏名】キム， ジ ヨン
(72)【発明者】
【氏名】ユ， ジ ソン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG32
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064CE11
4B065AA90X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BC03
4B065CA24
4B065CA44
4B065CA45
4H045AA11
4H045BA09
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA10
4H045GA21
4H045GA23
4H045GA25
(57)【要約】
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原の生産のための方法に関する。本発明による水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原の生産のための方法は、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を高収率及び高純度で得ることができる有効な生産方法である。したがって、本方法は、水痘又は帯状疱疹を予防又は治療するためのワクチン組成物として使用するための水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原の生産のために有用である。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原を生産する方法であって、（ａ）ＶＺＶｇＥ抗原を生産する組換え細胞株を培養して培養液を得るステップ、及び
（ｂ）前記培養液を精製するステップを含む方法。
【請求項2】
前記培養液を得るステップ（ａ）が、（ａ－１）前記組換え細胞株に種培養を実行するステップ、及び
（ａ－２）前記種培養を行った前記細胞株に対して生産培養を実行するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記培養液を精製するステップ（ｂ）が、陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するステップ、
疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するステップ、
前記培養液をウイルス不活化剤で処理してウイルスを不活化するステップ、
混合モードクロマトグラフィーを実施するステップ、並びに
濃縮及び濾過を実行するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記培養液を精製するステップ（ｂ）が、（ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するステップ、
（ｂ－２）疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するステップ、
（ｂ－３）前記培養液をウイルス不活化剤で処理してウイルスを不活化し、次いで濃縮及びダイアフィルトレーションを実行するステップ、
（ｂ－４）混合モードクロマトグラフィーを実行して溶出液を得るステップ、並びに
（ｂ－５）前記溶出液を濃縮及びダイアフィルトレーションに供し、次いでナノ濾過を実行するステップを含み、前記ステップが一連の順序で実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＶＺＶｇＥ抗原が、配列番号１によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞株が、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなる遺伝子で形質転換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記種培養を実行するステップ（ａ－１）が、前記ＶＺＶｇＥ抗原生産細胞株を、継代培養、懸濁培養、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つの方法によって培養することである、請求項２に記載の方法。
【請求項8】
前記種培養を実行するステップ（ａ－１）が、前記細胞株を３４℃～３８℃の温度で培養することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項9】
前記生産培養を実行するステップ（ａ－２）が、前記細胞株を３４℃～３５．５℃の温度で培養することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項10】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーでは、塩化ナトリウム濃度が０．１ｍＭ～１５０ｍＭの洗浄緩衝液を使用する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項11】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーでは、塩化ナトリウム濃度が４００ｍＭ～６００ｍＭの溶出緩衝液を使用する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項12】
前記ウイルス不活化剤がリン酸溶液である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項13】
前記ウイルスを不活化するステップがｐＨ２．８～３．２の条件下で実行される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項14】
前記ナノ濾過ステップ（ｂ－５）では、ナノフィルターを用いた濾過系を使用する、請求項４に記載の方法。
【請求項15】
前記ステップ（ｂ－５）の後に、前記ナノ濾過によって得られた濾液を製剤化緩衝液で希釈し、次いで濾過を実行するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するための方法に関する。
【0002】
［背景技術］
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、主に小児及び青少年に水痘を引き起こすウイルスである。一度感染すると、ＶＺＶは感覚根や脳神経節細胞に休眠状態で数年間残存し、成人期に免疫が低下した際に、再活性化して帯状疱疹を引き起こす。水痘は感染力が非常に強く、一度感染すると発熱や倦怠感を伴った全身の水疱状の発疹が引き起こされる。ほとんどの健常児では、水痘が重篤な状態に進行することは稀で、やがて自然治癒疾患に進行する。しかし、臓器移植又は化学療法を受けた患者では、水痘が重篤な症状に進行する多くの症例が生じることが知られている（Ａｄｒｉａｎａ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ他、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００（７）：１０６８、２００９；Ｊｕｄｉｔｈ Ｂｒｅｕｅｒ他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２０１７、ＤＯＩ：１０．１０８０／１４７６０５８４．２０１７．１３９４８４３）。
水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）は、主に小児及び青少年に水痘を引き起こすウイルスである。一度感染すると、ＶＺＶは感覚根や脳神経節細胞に休眠状態で数年間残存し、成人期に免疫が低下した際に、再活性化して帯状疱疹を引き起こす。水痘は感染力が非常に強く、一度感染すると発熱や倦怠感を伴った全身の水疱状の発疹が引き起こされる。ほとんどの健常児では、水痘が重篤な状態に進行することは稀で、やがて自然治癒疾患に進行する。しかし、臓器移植又は化学療法を受けた患者では、水痘が重篤な症状に進行する多くの症例が生じることが知られている（Ａｄｒｉａｎａ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ他、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００（７）：１０６８、２００９；Ｊｕｄｉｔｈ Ｂｒｅｕｅｒ他、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２０１７、ＤＯＩ：１０．１０８０／１４７６０５８４．２０１７．１３９４８４３）。
【0003】
帯状疱疹は、体のうずきのような全身のうずき及び疼痛の初期症状、又はナイフで刺されたような激しい疼痛を伴う、激しい痒み、ピリピリ感、及び灼熱感の感覚を有する。帯状疱疹は、数日後に水ぶくれができ、皮膚病変が増えるにつれて疼痛が増加し、年配の患者はより激しい疼痛を訴える傾向がある疾患である。帯状疱疹が治癒した場合でも、後遺症として神経痛が残ることがある。６０歳以上の人では、神経痛は断続的な睡眠の原因となることがあり、慢性疲労を訴えたり、軽い接触若しくは摩擦でも激痛を感じたり、うつ状態の原因にさえなったりすることが知られているが、４０歳以下の成人ではこのような神経痛は比較的稀である。
【0004】
岡株を使用して生産された弱毒生ワクチンであるゾスタバックス（ＺＯＳＴＡＶＡＸ）（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ，Ｉｎｃ．）は、帯状疱疹に対する予防ワクチンとして開発された。このワクチンは、ワクチンに大量のウイルスが含まれているので、米国及び韓国では、小児や青少年ではなく、５０歳以上の成人に使用するという条件で承認され、販売されている。近年、ウイルス表面タンパク質（ｇＥ）及びアジュバントで構成されているワクチンが、５０歳以上の成人を対象として、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＳＡによって開発され、臨床試験で予防効果があることが証明された（米国特許第７，９３９，０８４号）。
【0005】
［発明の開示］
技術的課題
したがって、本発明者等は、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原の生産性を、その免疫原性に影響を与えることなく増加させることが可能な方法の研究を行なう一方で、ＶＺＶｇＥ抗原の生産性を改善することができる培養及び精製方法を見出し、そして本発明を完成させた。
技術的課題
したがって、本発明者等は、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原の生産性を、その免疫原性に影響を与えることなく増加させることが可能な方法の研究を行なう一方で、ＶＺＶｇＥ抗原の生産性を改善することができる培養及び精製方法を見出し、そして本発明を完成させた。
【0006】
課題の解決
本発明の一態様では、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原を生産するための方法であって、（ａ）ＶＺＶｇＥ抗原を産生する組換え細胞株を培養して培養液を得るステップ；及び（ｂ）培養液を精製するステップを含む方法を提供する。
本発明の一態様では、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原を生産するための方法であって、（ａ）ＶＺＶｇＥ抗原を産生する組換え細胞株を培養して培養液を得るステップ；及び（ｂ）培養液を精製するステップを含む方法を提供する。
【0007】
培養液を得るステップ（ａ）は、（ａ－１）組換え細胞株に対して種培養を実行するステップ、及び（ａ－２）種培養を行った細胞株に対して生産培養を実行するステップを含んでいてもよい。
【0008】
培養液を精製するステップ（ｂ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するステップ、培養液をウイルス不活化剤で処理してウイルスを不活化するステップ、混合モードクロマトグラフィーを実行するステップ、並びに濃縮及び濾過を実行するステップを含んでいてもよい。
【0009】
本発明の有利な効果
本発明による水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するための方法は、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を高収率及び高純度で得ることができる有効な生産方法である。したがって、この方法は、水痘又は帯状疱疹を予防又は治療するためのワクチン組成物として使用するための水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するのに有用である。
本発明による水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するための方法は、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を高収率及び高純度で得ることができる有効な生産方法である。したがって、この方法は、水痘又は帯状疱疹を予防又は治療するためのワクチン組成物として使用するための水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原を生産するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【0011】
［本発明を実施するための最良の形態］
以下、本発明を詳細に説明する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【0012】
本発明の一態様では、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原を生産する方法であって、（ａ）ＶＺＶｇＥ抗原を産生する組換え細胞株を培養して培養液を得るステップ、及び（ｂ）培養液を精製するステップを含む方法を提供する。
【0013】
本発明では、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原は、国際公開第２０１９／２２５９６２号で開示された水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原の１つであることが好ましい。詳細には、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原（ＭＧｇＥ）は、配列番号１によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく、このポリペプチドは、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなる遺伝子によってコードされていてもよい。
【0014】
配列番号１のアミノ酸配列によって表される水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原は、配列番号３のアミノ酸配列によって表される水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原に由来する水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原バリアントであり、かかる抗原バリアントは水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原の５３７番目のアミノ酸残基でカルボキシ末端が切断されている変種を含む。
【0015】
５３７番目のアミノ酸残基でカルボキシ末端が切断されている変種とは、アミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシ末端（Ｃ末端）の方向に、１番目から５３７番目のアミノ酸残基が残り、５３８番目のアミノ酸残基からカルボキシ末端までの連続するアミノ酸残基が切断されていることを意味する。
【0016】
ＶＺＶｇＥ抗原を産生する細胞株は、配列番号２によって表されるヌクレオチド配列からなるＶＺＶｇＥ抗原をコードする遺伝子で形質転換された細胞株であってもよい。細胞株は、このＶＺＶｇＥ抗原をコードする遺伝子を含有する発現ベクターを有していていもよい。本発明の一実施形態では、発現ベクターは、韓国特許第１５９１８２３号で開示されたｐＭＳＩＤ２ベクターを含む発現ベクターであってもよい。しかし、発現ベクターには、ＶＺＶｇＥ抗原の細胞株へのトランスフェクションに適している限り、任意のベクターを制限なく使用することができる。
【0017】
本明細書で使用したように、「ベクター」という用語は、宿主細胞に導入されて組換えられ、宿主細胞のゲノムに挿入され得るか、又はエピソームとして自発的に複製することができるヌクレオチド配列を含む核酸手段を意味する。適切な発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーなどの発現調節要素、並びに膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含み、それらの目的に応じて様々に作製することができる。開始コドン及び終止コドンは、標的タンパク質をコードする遺伝子構築物が個体に投与されたときに個体において作用しなければならず、コード配列とインフレームでなければならない。
【0018】
本発明の一実施形態によるベクターでトランスフェクト又は形質転換された宿主細胞又は非ヒト宿主対象は、ベクターで遺伝子改変されている宿主細胞又は非ヒト宿主対象であってもよい。本明細書で使用したように、「遺伝子改変された」という用語は、宿主細胞、非ヒト宿主対象、先祖、又は親が、それ自体のゲノムに加えて、宿主細胞、非ヒト宿主対象、先祖、又は親に入れられた、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチド又はベクターを含むことを意味する。さらに、本発明の一実施形態によるポリヌクレオチド又はベクターは、遺伝子改変された宿主細胞又は非ヒト宿主対象において、独立した分子として、詳細には複製可能な分子として、そのゲノムの外側に存在することができるか、又は宿主細胞又は非ヒト宿主対象のゲノムに安定的に挿入され得る。
【0019】
本発明の一実施形態による宿主細胞は、真核細胞である。真核細胞には、真菌細胞、植物細胞、又は動物細胞が含まれる。真菌細胞の例には、酵母、詳細にはサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）の酵母、より詳細にはサッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含めることができる。さらに、動物細胞の例には、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が含まれ、動物細胞の特定の例には、ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ、Ｕ２－ＯＳＨｅｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＯＬＴ－４、Ｊｕｒｋａｔ、ＰＣ－１２、ＰＣ－３、ＩＭＲ、ＮＴ２Ｎ、Ｓｋ－ｎ－ｓｈ、ＣａＳｋｉ、Ｃ３３Ａなどが含まれる。さらに、当技術分野で周知の適切な細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）などの細胞株寄託機関から入手することができる。
【0020】
本発明によるＶＺＶｇＥ抗原は、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物、及びトランスジェニック動物などの様々な種類の生物において発現させることができる。好ましくは、タンパク質治療剤に関する規制及び生産されたタンパク質がその天然の形態に類似している必要があるという事実を考慮して、哺乳動物細胞を使用することができる。哺乳動物細胞の例には、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／Ｏミエローマ細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞（ヒト羊水由来細胞）、ＣＯＳ細胞などが含まれる。本発明の一実施形態によれば、哺乳動物細胞としてＣＨＯＤＧ４４細胞を使用することができる。
【0021】
本発明による発現ベクターを上記の細胞株に導入するために、当技術分野で公知の技術を使用することができ、その例には、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿が含まれる。
【0022】
詳細には、培養液を得るステップ（ａ）は、（ａ－１）組換え細胞株に対して種培養を実行するステップ、及び（ａ－２）種培養を行った細胞株に対して生産培養を実行するステップを含んでいてもよい。
【0023】
本明細書で使用したように、「種培養」という用語は、細胞株を大量に得ることを目的とした培養を意味する。種培養は、細胞数を最も活発に増加させる温度条件で実行することができる。言い換えると、種培養は、細胞株について一定数の細胞が得られるように実行することができる。
【0024】
本明細書で使用したように、「生産培養」という用語は、組換えタンパク質を生産することを目的とした細胞株の大量培養を意味する。
【0025】
種培養を実行するステップ（ａ－１）は、ＶＺＶｇＥ抗原生産細胞株を、継代培養、懸濁培養、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つの方法によって培養することであってもよい。例えば、ＶＺＶｇＥ抗原産生細胞株の種培養は、継代培養及び懸濁培養によって実行することができ、その生産培養は懸濁培養によって実行することができる。
【0026】
本明細書で使用したように、「継代培養」という用語は、細胞株を培養周期に応じて同じか又は異なる新鮮な培地に移しながら細胞株を培養する方法を意味する。
【0027】
本発明の一実施形態では、継代培養は、細胞株を同じ新鮮な培地に１～７日、２～５日、又は３～４日の間隔で移して接種することによって実施することができる。ここで、接種する細胞数は、２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬ、３×１０５細胞／ｍＬ～４×１０５細胞／ｍＬ、又は４×１０５細胞／ｍＬであってもよいが、これらに限定されない。さらに、継代培養におけるＣＯ２濃度は、４．０％～６．０％、４．５％～５．５％、又は５．０％であってもよいが、これらに限定されない。
【0028】
本明細書で使用したように、「懸濁培養」という用語は、細胞を培養液に懸濁する培養方法を意味する。血液細胞又は腹水中のがん細胞など、インビボにおいても懸濁状態で増殖する細胞に対しては、震盪又は回転を行うことなく懸濁培養を実施することができるが、ほとんどの場合、攪拌翼を回転させるか（攪拌培養）、各培養瓶を震盪するか（震盪培養）、又はインキュベーターを回転させる（回転培養）ことによって懸濁培養を実施することができる。
【0029】
本発明の一実施形態では、懸濁培養は、８６ｒｐｍ～９６ｒｐｍ、８８ｒｐｍ～９４ｒｐｍ、又は９０ｒｐｍ～９２ｒｐｍの攪拌速度条件で実施することができるが、攪拌速度はこれに限定されない。懸濁培養において接種する細胞数は、２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬ、３×１０５細胞／ｍＬ～４×１０５細胞／ｍＬ、又は４×１０５細胞／ｍＬであってもよいが、これらに限定されない。さらに、ｐＨは、ｐＨ６．７～ｐＨ７．１、又はｐＨ６．８～ｐＨ７．０であってもよい。さらに、溶存酸素濃度は、１０％～９０％、２０％～８０％、又は３０％～６０％であってもよいが、これらに限定されない。
【0030】
細胞培養、特に動物細胞培養により組換えタンパク質を生産する場合、培養期間を延長するにつれて生産性が増加するように細胞増殖に適した温度で培養を実行して、その後は細胞分裂周期を停止させ、したがって組換えタンパク質生産への切り替えが達成されるように細胞増殖に適した温度よりも低い温度で培養を実行することが一般的である（「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ α－ａｍｉｄａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｂｙ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｋ他、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、３１巻、８５～９４；及び「Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｌｏｗ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ：Ｃｌｏｎａｌ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ」Ｙｏｏｎ Ｓ Ｋ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ、２００４、２０巻、１６８３～１６８８）。しかし、本発明者等は、ＶＺＶｇＥ抗原を生産するための細胞株培養の場合、培養温度を変化させずに細胞株増殖に適した温度よりも低い温度で生産培養を実行するか、種培養及び／又は生産培養を一定温度条件下で実行するか、又は種培養及び生産培養を一定の低温条件下で実行することが、収率及び純度の点で有利であることを突き止めた。
【0031】
詳細には、種培養を実行するステップ（ａ－１）は、細胞株を３４℃～３８℃の温度で培養することを含んでいてもよい。さらに、生産培養を実行するステップ（ａ－２）は、細胞株を３４℃～３５．５℃の温度で培養することを含んでいてもよい。例えば、細胞株に３６℃～３８℃、３６．５℃～３７．５℃、又は３７℃の温度で種培養を行い、その後、種培養を行った細胞株に３４℃～３５．５℃、３４．５℃～３５．５℃、又は３５℃の温度で生産培養を行ってもよい。さらに、細胞株に３４℃～３５．５℃、３４．５℃～３５．５℃、又は３５℃の温度で種培養を行い、その後、種培養を行った細胞株に３４℃～３５．５℃、３４．５℃～３５．５℃、又は３５℃の温度で生産培養を行ってもよい。さらに、細胞株に３４℃～３５．５℃の温度範囲内の一定温度で種培養及び生産培養を行ってもよい。
【0032】
本発明の一実施形態では、生産培養は、懸濁培養によって実行することができる。ここで、懸濁培養は、６２ｒｐｍ～７２ｒｐｍ、６４ｒｐｍ～７０ｒｐｍ、又は６６ｒｐｍ～６８ｒｐｍの攪拌速度条件で実行することができるが、攪拌速度はこれに限定されない。懸濁培養において接種する細胞数は、２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬ、３×１０５細胞／ｍＬ～４×１０５細胞／ｍＬ、又は４×１０５細胞／ｍＬであってもよいが、これらに限定されない。上記の細胞数は、ＶＺＶｇＥ抗原の生産培養に最適な細胞密度に対応している。細胞密度が２×１０５細胞／ｍＬ未満の場合、細胞数が少なすぎるため得られるタンパク質量が少なく、細胞密度が５×１０５細胞／ｍＬを超える場合は、細胞片などの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）も多く生成され、精製工程で薬事基準を満たす濃度までＨＣＰを除去することが困難であるという問題がある。さらに、ｐＨは、ｐＨ６．７～ｐＨ７．１、又はｐＨ６．８～ｐＨ７．０であってもよい。さらに、溶存酸素濃度は、１０％～９０％、２０％～８０％、又は３０％～６０％であってもよいが、これらに限定されない。
【0033】
本発明の一実施形態では、培養は、フラスコ又はバイオリアクターで実行することができる。しかし、本発明はこれらに限定されない。フラスコ及びバイオリアクターの種類並びに培養条件は、当業者が通常調整できる範囲内で変更することができる。詳細には、動物細胞の懸濁培養が可能なウェーブバイオリアクター、攪拌タンクバイオリアクターなどを使用することができ、培養液は、ＣＯ２又は炭酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウムなどの塩基溶液を使用して、ｐＨ６．８～７．２にｐＨ調整して使用することができる。しかし、本発明はこれらに限定されない。
【0034】
例えば、種培養は、細胞株を震盪フラスコに接種し、継代培養及び懸濁培養を実施して、一定数の細胞を得ることによって実行することができ、生産培養は、一定数の細胞が得られた細胞株をバイオリアクターに接種し、懸濁培養を実施して、組換えタンパク質を得ることによって実行することができる。
【0035】
培養液を精製するステップ（ｂ）は、陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するステップ、培養液をウイルス不活化剤で処理してウイルスを不活化するステップ、混合モードクロマトグラフィーを実行するステップ、並びに濃縮及び濾過を実行するステップを含んでいてもよい。クロマトグラフィー工程、ウイルス不活化工程、並びに濃縮及び濾過工程は、最適な生産収率を達成するために、様々な順序で実行することができる。
【0036】
本発明の一実施形態では、培養液を精製するステップ（ｂ）は、（ｂ－１）陰イオン交換クロマトグラフィーを実行するステップ、（ｂ－２）疎水性相互作用クロマトグラフィーを実行するステップ、（ｂ－３）培養液をウイルス不活化剤で処理してウイルスを不活化し、次いで濃縮及びダイアフィルトレーションを実行するステップ、（ｂ－４）混合モードクロマトグラフィーを実行して溶出液を得るステップ、並びに（ｂ－５）溶出液を濃縮及びダイアフィルトレーションに供し、次いでナノ濾過を実行するステップを含んでいてもよく、ステップは一連の順序で実行される。
【0037】
さらに、培養液精製ステップ（ｂ）の前に、培養液から細胞片を除去するための処理工程を培養液に行ってもよい。例えば、培養液に濾過を行うことによって得られた培養濾液に精製ステップを行ってもよい。ここで、濾過に使用した濾材はデプスフィルターであってもよい。さらに、濾材の孔径は、１μｍ以下、０．５μｍ以下、０．４５μｍ以下、０．３μｍ以下、０．２５μｍ以下、又は０．２μｍ以下であってもよく、様々な直径の濾材の混合物を使用することができる。
【0038】
本明細書で使用したように、「クロマトグラフィー」という用語は、特定の緩衝条件下で、混合物中の目的の溶質、例えば、目的のタンパク質を他の溶質から分離する工程を意味し、分離は、ｐＩ、疎水性、サイズ、及び構造などの溶質の特性により、程度の差はあるが強く溶質を吸着又は保持する吸着剤によって、混合物の浸出によって達成される。
【0039】
培養液精製ステップ（ｂ）では、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、培養液又は培養濾液中に含有されている液体培地組成物及び不純物の除去を導くことができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＤＥＡＥセルロース、Ｐｏｒｏｓ ＰＩ２０、ＰＩ５０、ＨＱ１０、ＨＱ ２０、ＨＱ５０、Ｄ５０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭｏｎｏＱ、ＭｉｎｉＱ、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ及び３ＯＱ、Ｑ、ＤＥＡＥ及びＡＮＸ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、ＱセファロースＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸＴＭ及びＱセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＷＰ ＰＥＩ、ＷＰ ＤＥＡＭ、ＷＰ ＱＵＡＴ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）、Ｈｙｄｒｏｃｅｌｌ ＤＥＡＥ及びＨｙｄｒｏｃｅｌｌ ＱＡ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．）、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ Ｑ、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ ＤＥＡＥ及びＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ（Ｂｉｏｒａｄ）などの樹脂を使用して実施することができるが、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ樹脂が好ましい。
【0040】
さらに、カラムをｐＨ７．０±０．２に平衡化した後、精製する培養液を１５０±１５ｃｍ／ｈｒの流速で添加することができる。樹脂の種類、ｐＨ、及び流速などの条件は、前述の条件に限定されることはなく、当業者が通常調整できる範囲内で変更することができる。
【0041】
さらに、陰イオン交換クロマトグラフィーでは、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ以下、０．１ｍＭ～１５０ｍＭ、１０ｍＭ～１５０ｍＭ、又は１００ｍＭ～１５０ｍＭの洗浄緩衝液を使用することができる。さらに、塩化ナトリウム濃度が４００ｍＭ～６００ｍＭ、４５０ｍＭ～５５０ｍＭ、又は５００ｍＭの溶出緩衝液を使用することができる。塩化ナトリウム濃度が上記範囲内である洗浄緩衝液及び溶出緩衝液を使用して精製を実行する場合、ＶＺＶｇＥ抗原を含有する培養液中の不純物含有量を最小限に抑えることができる。
【0042】
培養液精製ステップ（ｂ）では、疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、液体培地組成物及び不純物を除去するために使用することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ブチルＦＦ、ブチルＨＰ、オクチルＦＦ、フェニルＦＦ、フェニルＨＰ、フェニルＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）、フェニルＦＦ（ｌｏｗ ｓｕｂ）、カプトフェニルＩｍｐＲｅｓ、カプトフェニル（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）、カプトオクチル、カプトブチルＩｍｐＲｅｓ、カプトブチル（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＬ）（登録商標）スーパーブチル－５５０Ｃ、トヨパール（登録商標）ヘキシル－６５０Ｃ、ブチル－６５０Ｃ、フェニル－６５０Ｃ、ブチル６００Ｍ、フェニル－６００Ｍ、ＰＰＧ－６００Ｍ、ブチル－６５０Ｍ、フェニル－６５０Ｍ、エーテル－６５０Ｍ、ブチル－６５０Ｓ、フェニル－６５０Ｓ、エーテル－６５０Ｓ、ＴＳＫｇｅｌフェニル－５ＰＷ、ＴＳＫｇｅｌエーテル－５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの樹脂を使用して実施することができるが、トヨパール（登録商標）ブチル－６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が好ましい。
【0043】
さらに、カラムをｐＨ７．０±０．２に平衡化した後、精製する培養液、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液を１００±１０ｃｍ／ｈｒの流速で添加することができる。ここで、精製前に、１～１０Ｍ、２～８Ｍ、３～７Ｍ、又は５Ｍの塩化ナトリウムを精製する溶液に添加してもよい。さらに、塩化ナトリウムを含有している洗浄緩衝液を使用してもよいし、塩化ナトリウムを含有していない溶出緩衝液を使用してもよい。樹脂の種類、ｐＨ、及び流速などの条件は、前述の条件に限定されることはなく、当業者が通常調整できる範囲内で変更することができる。
【0044】
培養液精製ステップ（ｂ）は、培養液をウイルス不活化剤で処理してウイルスを不活化するステップを含んでいてもよい。ウイルス不活化工程は、精製するＶＺＶｇＥ抗原を含有する溶液中の潜在的なエンベロープウイルスの不活化を導くことができる。
【0045】
詳細には、ウイルス不活化剤はリン酸溶液であってもよい。例えば、溶出液のｐＨがｐＨ２．８～ｐＨ３．２、ｐＨ２．９～ｐＨ３．１、又はｐＨ３．０に調整されるように、ウイルス不活化剤を疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出液に添加してもよい。ウイルス不活化ステップでは、ｐＨが２．８未満の場合、ＶＺＶｇＥ抗原の構造が変性することがあり、ｐＨが３．２を超える場合、ウイルスが不活化されないことがある。
【0046】
培養液精製ステップ（ｂ）では、混合モードクロマトグラフィーを実行することができる。混合モードクロマトグラフィーは、ＶＺＶｇＥ抗原を含有する溶液から二量体及び不純物の除去を導くことができる。混合モードクロマトグラフィーは、ＢＡＫＥＲＢＯＮＤ ＡＢＸ（登録）（Ｊ．Ｂａｋｅｒ）、セラミックハイドロキシアパタイトタイプＩ及びＩＩ、並びにフッ化ハイドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）、並びにＭＥＰ及びＭＢＩ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等の樹脂を使用して実行することができるが、セラミックハイドロキシアパタイトが好ましい。
【0047】
さらに、カラムをｐＨ７．０±０．２に平衡化した後、精製する培養液、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出液に濃縮及び濾過を実行することによって得られた溶液を１００±１０ｃｍ／ｈｒの流速で添加することができる。混合モードクロマトグラフィーでは、樹脂の種類、緩衝液、及びｐＨなどの条件は前述の条件に限定されず、当業者が通常調整できる範囲内で変更することができる。
【0048】
培養液精製ステップ（ｂ）は、濃縮及び濾過を実行するステップを含んでいてもよい。濃縮及び濾過工程は、培養液の精製工程中に複数回実行することができ、各クロマトグラフィーステップの間、クロマトグラフィーステップとウイルス不活化ステップとの間、又はクロマトグラフィーステップ若しくはウイルス不活化ステップの後に実行することができる。
【0049】
例えば、混合モードクロマトグラフィーを実行する前に、濃縮及び濾過を実行して混合モードクロマトグラフィーに適した条件を有する溶液を得ることができる。例えば、ＶＺＶｇＥ画分の濃縮は、限外濾過及び／又はダイアフィルトレーションによって達成することができ、１つ又は複数のタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ステップを含むことができる。
【0050】
さらに、混合モードクロマトグラフィーを実行した後に、濃縮及び濾過を実行してＶＺＶｇＥ抗原濃度を調整することができる。ここで、濾液のｐＨ及び導電率が所望の値に達するまでダイアフィルトレーションを実行してもよく、その後限外濾過を使用してタンパク質濃度を調整してもよい。
【0051】
さらに、培養液精製ステップ（ｂ）は、濃縮及び濾過した混合モードクロマトグラフィーの溶出液にナノ濾過を実行するステップを含んでいてもよい。ここで、ナノ濾過には、ナノフィルターを用いた濾過系を使用してもよい。ＶＺＶｇＥ抗原を含有する溶液からウイルスを分離するために、ナノ濾過は、例えば、７５ｎｍ、５０ｎｍ未満、又は１５ｎｍ未満の孔径を有するナノフィルターを使用して実行することができる。
【0052】
培養液精製ステップ（ｂ）は、ナノ濾過によって得られた濾液を製剤化緩衝液で希釈し、次いで濾過を実行するステップをさらに含んでいてもよい。ここで、濾過は、孔径が０．０５～０．８μｍ、０．０７～０．６μｍ、又は０．１～０．４μｍのマイクロフィルターを使用して実行することができる。
【0053】
培養液精製ステップ（ｂ）中にナノ濾過によって得られた濾液を希釈し、マイクロフィルターを使用して濾過した場合、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は９９．５％以上の収率でタンパク質を得ることができる。さらに、精製培養液中のＨＣＰ含有量は、約１８０ｐｐｍ以下、１７０ｐｐｍ以下、１６０ｐｐｍ以下、１５０ｐｐｍ以下、１００ｐｐｍ以下、８０ｐｐｍ以下、７０ｐｐｍ以下、６０ｐｐｍ以下、５０ｐｐｍ以下、３０ｐｐｍ以下、１０ｐｐｍ以下であってもよい。
【0054】
本発明の様式
以後、以下の実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲はそれらに限定されない。
以後、以下の実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、例示のみを目的としており、本発明の範囲はそれらに限定されない。
【0055】
実施例１．水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原のための発現ベクターの構築及び形質転換
国際公開第２０１９／２２５９６２号で開示された水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原バリアント遺伝子（ＭＧｇＥ；配列番号２）は、韓国特許第１５９１８２３号で開示されたｐＭＳＩＤ２ベクターにクローニングされ、ｐＭＳＩＤ２－ＭＧｇＥ発現ベクターを構築した（図２）。次に、発現ベクターを、合成培地（ＣＤＭ４ＣＨＯ（＋０／２０ｎＭ ＭＴＸ；メトトレキサート）に適合しているＣＨＯ ＤＧ４４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）宿主細胞にトランスフェクトし、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原（ＭＧｇＥ；配列番号１）を強く発現する細胞株（ＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４）を作製した。
国際公開第２０１９／２２５９６２号で開示された水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）表面タンパク質（ｇＥ）抗原バリアント遺伝子（ＭＧｇＥ；配列番号２）は、韓国特許第１５９１８２３号で開示されたｐＭＳＩＤ２ベクターにクローニングされ、ｐＭＳＩＤ２－ＭＧｇＥ発現ベクターを構築した（図２）。次に、発現ベクターを、合成培地（ＣＤＭ４ＣＨＯ（＋０／２０ｎＭ ＭＴＸ；メトトレキサート）に適合しているＣＨＯ ＤＧ４４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）宿主細胞にトランスフェクトし、水痘帯状疱疹ウイルス表面タンパク質抗原（ＭＧｇＥ；配列番号１）を強く発現する細胞株（ＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４）を作製した。
【0056】
実施例１．１．抗原及び細胞株に応じたタンパク質生産性の確認
抗原及び細胞株の種類に応じたタンパク質生産性を確認するために、実施例１で構築したｐＭＳＩＤ２－ＭＧｇＥ発現ベクター及び韓国特許第１３５７２０４号で開示された切断型ｇＥ抗原（ＧＳＫｇＥ；配列番号４）をコードする遺伝子をｐＭＳＩＤ２ベクターにクローニングすることによって構築したｐＭＳＩＤ２－ＧＳＫｇＥ発現ベクターをそれぞれ、合成培地（ＣＤ ｆｏｒｔｉ ＣＨＯ（＋５０ｎＭ ＭＴＸ））に適合させたＣＨＯ－Ｓ宿主細胞にトランスフェクトして、細胞株（ＭＧｇＥ－ＣＨＯ－Ｓ及びＧＳＫｇＥ－ＣＨＯ－Ｓ）を作製した。
抗原及び細胞株の種類に応じたタンパク質生産性を確認するために、実施例１で構築したｐＭＳＩＤ２－ＭＧｇＥ発現ベクター及び韓国特許第１３５７２０４号で開示された切断型ｇＥ抗原（ＧＳＫｇＥ；配列番号４）をコードする遺伝子をｐＭＳＩＤ２ベクターにクローニングすることによって構築したｐＭＳＩＤ２－ＧＳＫｇＥ発現ベクターをそれぞれ、合成培地（ＣＤ ｆｏｒｔｉ ＣＨＯ（＋５０ｎＭ ＭＴＸ））に適合させたＣＨＯ－Ｓ宿主細胞にトランスフェクトして、細胞株（ＭＧｇＥ－ＣＨＯ－Ｓ及びＧＳＫｇＥ－ＣＨＯ－Ｓ）を作製した。
【0057】
ＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４、ＭＧｇＥ－ＣＨＯ－Ｓ、及びＧＳＫｇＥ－ＣＨＯ－Ｓをそれぞれ合成培地で６日間培養した後、ＶＧＶｇＥの発現レベルをウェスタンブロッティング及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって調べた。
【0058】
結果として、図３及び図４を参照すると、ＭＧｇＥはＣＨＯ－Ｓ細胞株においてＧＳＫｇＥよりも優れた生産性を示し、ＭＧｇＥはＣＨＯ ＤＧ４４細胞株においてＣＨＯ－Ｓ細胞株よりもはるかに優れた生産性を示した。特に、ＭＧｇＥは、ＣＤＭ４ＣＨＯ（＋２０ｎＭ ＭＴＸ）培地に適合しているＣＨＯ ＤＧ４４（Ｓ）細胞株において最高の生産性を示した。
【0059】
実施例２．ＭＧｇＥ生産のための培養方法の確立
実施例２．１．細胞株の一定数の細胞を得るための種培養
実施例１で作製したＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株を５００ｍＬフラスコ中の全量１００ｍＬに３×１０５細胞／ｍＬ以上で接種し、３６℃～３８℃及び４％～６％ＣＯ２の条件下で培養した。その後、フラスコの容量を増やしながら２～４日間隔で細胞株を２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬで全量２００ｍＬ～８００ｍＬに接種するステップを繰り返し、一定数の細胞を得た。フラスコ内で得られた細胞をバイオリアクターに２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬの濃度で接種し、その後３６℃～３８℃、ｐＨ６．７～ｐＨ７．１、溶存酸素１０％～９０％、及び攪拌速度８６ｒｐｍ～９６ｒｐｍの条件下で懸濁培養を実施した。このようにして、一定数の細胞が得られた。
実施例２．１．細胞株の一定数の細胞を得るための種培養
実施例１で作製したＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株を５００ｍＬフラスコ中の全量１００ｍＬに３×１０５細胞／ｍＬ以上で接種し、３６℃～３８℃及び４％～６％ＣＯ２の条件下で培養した。その後、フラスコの容量を増やしながら２～４日間隔で細胞株を２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬで全量２００ｍＬ～８００ｍＬに接種するステップを繰り返し、一定数の細胞を得た。フラスコ内で得られた細胞をバイオリアクターに２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬの濃度で接種し、その後３６℃～３８℃、ｐＨ６．７～ｐＨ７．１、溶存酸素１０％～９０％、及び攪拌速度８６ｒｐｍ～９６ｒｐｍの条件下で懸濁培養を実施した。このようにして、一定数の細胞が得られた。
【0060】
実施例２．２．ＭＧｇＥ抗原の生産培養
一定数の細胞が実施例２．１で得られたＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株をバイオリアクターに２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬの細胞濃度で接種し、その後３４℃～３５．５℃の温度、ｐＨ６．７～ｐＨ７．１、溶存酸素１０％～９０％、及び攪拌速度６２ｒｐｍ～７２ｒｐｍの条件下で懸濁培養を実施した。
一定数の細胞が実施例２．１で得られたＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株をバイオリアクターに２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬの細胞濃度で接種し、その後３４℃～３５．５℃の温度、ｐＨ６．７～ｐＨ７．１、溶存酸素１０％～９０％、及び攪拌速度６２ｒｐｍ～７２ｒｐｍの条件下で懸濁培養を実施した。
【0061】
実施例２．３．ＭＧｇＥ抗原の定量
以下の実施例では、ＭＧｇＥ抗原の含有量を測定するためにＥＬＩＳＡを実行した。詳細には、ＶＺＶｇＥ抗体（カタログ番号ｓｃ－１７５４９、２００μｇ／ｍＬ）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、得られたものをウェル当たり１００μＬで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加した。一晩インキュベ－ション（コーティング）を４℃で実行した。プレートを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄した後、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを再度洗浄した後、希釈試料を添加して２時間インキュベートした。次に、プレートを再度洗浄した。培養液試料それぞれを遠心分離した後、上清を－２０℃以下で保存した。試料は測定１時間前に室温で解凍して使用した。ＶＺＶｇＥ抗体（カタログ番号ｓｃ－５６９９５、１００μｇ／ｍＬ）を１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ウェル当たり１００μＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した。次に、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１／１０００の濃度に希釈した後、プレートにウェル当たり１００μＬで添加した。プレートは室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３，３，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をプレートに添加してＨＲＰ反応を誘導した。次に、プレートにウェル当たり１ＮＨ２ＳＯ４を１００μＬ分注して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光度を検量線の式に代入し、得られた値に希釈係数を掛けることによって、試料の含有量を計算した。
以下の実施例では、ＭＧｇＥ抗原の含有量を測定するためにＥＬＩＳＡを実行した。詳細には、ＶＺＶｇＥ抗体（カタログ番号ｓｃ－１７５４９、２００μｇ／ｍＬ）をＰＢＳで１μｇ／ｍＬの濃度に希釈した後、得られたものをウェル当たり１００μＬで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加した。一晩インキュベ－ション（コーティング）を４℃で実行した。プレートを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で３回洗浄した後、２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ溶液で１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを再度洗浄した後、希釈試料を添加して２時間インキュベートした。次に、プレートを再度洗浄した。培養液試料それぞれを遠心分離した後、上清を－２０℃以下で保存した。試料は測定１時間前に室温で解凍して使用した。ＶＺＶｇＥ抗体（カタログ番号ｓｃ－５６９９５、１００μｇ／ｍＬ）を１μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、ウェル当たり１００μＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した。次に、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１／１０００の濃度に希釈した後、プレートにウェル当たり１００μＬで添加した。プレートは室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、３，３，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をプレートに添加してＨＲＰ反応を誘導した。次に、プレートにウェル当たり１ＮＨ２ＳＯ４を１００μＬ分注して反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光度を検量線の式に代入し、得られた値に希釈係数を掛けることによって、試料の含有量を計算した。
【0062】
実験実施例１．培養温度変化後の生産性の確認
培養温度変化がＭＧｇＥ抗原の生産性に及ぼす影響を確認するため、生産培養ステップ中に細胞が十分に増殖したと判断された時点で、実施例２．１で一定数の細胞が得られたＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株を、２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬの細胞濃度でバイオリアクターに接種し、懸濁培養を行った。その後、細胞株の細胞濃度がそれぞれ約６０×１０５細胞／ｍＬ、８０×１０５細胞／ｍＬ、１５０×１０５細胞／ｍＬに達したとき、培養温度を３２℃に低下させて生産培養を実施した。さらに、実施例２．１で一定の細胞数が得られたＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株を３７℃の一定温度条件で生産培養し、その後ＭＧｇＥ抗原生産性を比較した（表１、図５Ａ及び図５Ｂ参照のこと）。
培養温度変化がＭＧｇＥ抗原の生産性に及ぼす影響を確認するため、生産培養ステップ中に細胞が十分に増殖したと判断された時点で、実施例２．１で一定数の細胞が得られたＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株を、２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬの細胞濃度でバイオリアクターに接種し、懸濁培養を行った。その後、細胞株の細胞濃度がそれぞれ約６０×１０５細胞／ｍＬ、８０×１０５細胞／ｍＬ、１５０×１０５細胞／ｍＬに達したとき、培養温度を３２℃に低下させて生産培養を実施した。さらに、実施例２．１で一定の細胞数が得られたＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株を３７℃の一定温度条件で生産培養し、その後ＭＧｇＥ抗原生産性を比較した（表１、図５Ａ及び図５Ｂ参照のこと）。
【0063】
【表1】
【0064】
結果として、表１並びに図５Ａ及び５Ｂを参照すると、温度変化が生じた場合、細胞株が生存している培養時間が長くなるのに対して、ＭＧｇＥ抗原生産性（ｑＰ）はむしろ一定温度条件の場合よりも低かったことがわかった。
【0065】
このことは、ＭＧｇＥ抗原の生産培養中、ＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株の培養温度を温度変化させずに一定範囲内に維持した場合、生産性が改善されることを示唆している。
【0066】
実験実施例２．生産温度に応じたＭＧｇＥ抗原生産性の確認
実施例２．２におけるＭＧｇＥ抗原の生産培養ステップでは、細胞濃度２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬでバイオリアクターに接種したＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株に、３３℃～３７℃の範囲内で選択した一定温度条件下で生産培養を行った（表２、図６Ａ及び６Ｂ）。
実施例２．２におけるＭＧｇＥ抗原の生産培養ステップでは、細胞濃度２×１０５細胞／ｍＬ～５×１０５細胞／ｍＬでバイオリアクターに接種したＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株に、３３℃～３７℃の範囲内で選択した一定温度条件下で生産培養を行った（表２、図６Ａ及び６Ｂ）。
【0067】
【表2】
【0068】
結果として、表２並びに図６Ａ及び６Ｂを参照すると、一般的なＣＨＯ細胞が増殖するために適した温度である３７℃よりも低い低温培養条件下（３４℃～３５．５℃の一定温度条件）では、培養期間が長くなり、生産性が増加した。さらに、３３．５℃以下の条件下では、細胞増殖が低下し、生産性は減少した。一方、ｑＰは培養細胞数に関係しているという観点から、ｑＰの値が３３℃で高く計算されたのは、生産性が低いにも関わらず、細胞数が他のバッチと比較して非常に少ないからであった（積算ＶＣＤ値を参照）。すなわち、３４℃～３５．５℃の低温条件は、ＭＧｇＥ－ＣＨＯ ＤＧ４４細胞株においてＭＧｇＥ抗原生産の著しい改善を引き起こすことがわかった。
【0069】
実施例３．ＭＧｇＥ抗原の精製
実施例３．１．回収及び清澄化
実験実施例２における生産培養のための条件である３５℃で培養した培養液（ＭＧ１１２０）については、培養液中の細胞片を除去するため、デプスフィルター（ＣＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して回収及び清澄化を実行した。
実施例３．１．回収及び清澄化
実験実施例２における生産培養のための条件である３５℃で培養した培養液（ＭＧ１１２０）については、培養液中の細胞片を除去するため、デプスフィルター（ＣＯＨＣ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）を使用して回収及び清澄化を実行した。
【0070】
濾過中の圧力条件は０．９ｂａｒ以下に維持し、細胞片を除去することによって得られた濾液は０．４５±０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ＩＩ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過して培養濾液を得た。
【0071】
実施例３．２．陰イオン交換クロマトグラフィー－洗浄緩衝液及び溶出緩衝液中の塩化ナトリウム濃度に応じた収率の比較
陰イオン交換クロマトグラフィーを実行して、実施例３．１で得られた培養濾液中に含有される液体培地組成物及び不純物を除去した。
陰イオン交換クロマトグラフィーを実行して、実施例３．１で得られた培養濾液中に含有される液体培地組成物及び不純物を除去した。
【0072】
詳細には、カラムにＱセファロースＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＳＡ）樹脂を充填し、次いで平衡化緩衝液を使用して７．０±０．２のｐＨに平衡化した。次に、実施例３．１で得られた培養濾液を、流量が１５０±１５ｃｍ／ｈｒになるようにカラムに添加した。その後、カラムを平衡化緩衝液及び塩化ナトリウムを含有する洗浄緩衝液で順次洗浄した。その後、塩化ナトリウムを含有する溶出緩衝液を使用してＭＧｇＥ抗原を溶出し、収集した。
【0073】
洗浄緩衝液及び溶出緩衝液に含有される塩化ナトリウムの濃度を変化させた場合、陰イオン交換クロマトグラフィーステップにおける収率を比較した。
【0074】
詳細には、陰イオン交換クロマトグラフィーは、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、又は２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する洗浄緩衝液及び５００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する溶出緩衝液を使用して実行した（表３）。
【0075】
【表3】
【0076】
結果として、表３を参照すると、洗浄緩衝液中の塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの場合、ＭＧｇＥ当たりの不純物の含有量が最も低かった。
【0077】
したがって、陰イオン交換クロマトグラフィーは、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する洗浄緩衝液及び４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する溶出緩衝液を使用して実行した（表４）。
【0078】
【表4】
【0079】
結果として、表４を参照すると、５００ｍＭの塩化ナトリウムを含有する溶出緩衝液を使用した場合、ＭＧｇＥ当たりの不純物の含有量が最も低かった。
【0080】
したがって、ＭＧｇＥ抗原の精製ステップ中の陰イオン交換クロマトグラフィーにおける洗浄緩衝液及び溶出緩衝液に含有される塩化ナトリウムの最適濃度はそれぞれ、１５０ｍＭ及び５００ｍＭである。
【0081】
実施例３．３．疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、実施例３．２で得られた陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液に対して実行し、それまで除去されなかった液体培地組成物及び不純物を除去した。
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、実施例３．２で得られた陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液に対して実行し、それまで除去されなかった液体培地組成物及び不純物を除去した。
【0082】
詳細には、カラムにトヨパールブチル－６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）樹脂を充填し、次いで平衡化緩衝液を使用して７．０±０．２のｐＨに平衡化した。次に、実施例３．２で得られた陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出液に塩化ナトリウム５Ｍを添加し、結果として得られたものを流速が１００±１０ｃｍ／ｈｒになるようにカラムに添加した。その後、カラムを平衡化緩衝液及び塩化ナトリウム１Ｍを含有する洗浄緩衝液で順次洗浄した。その後、塩化ナトリウムを含有しない溶出緩衝液を使用してＭＧｇＥ抗原を溶出し、収集した。
【0083】
実施例３．４．ウイルス不活化
ＭＧｇＥ抗原を含有する溶液中の潜在的なエンベロープウイルスを不活化するために、溶媒を添加してウイルス不活化ステップを実行した。
ＭＧｇＥ抗原を含有する溶液中の潜在的なエンベロープウイルスを不活化するために、溶媒を添加してウイルス不活化ステップを実行した。
【0084】
詳細には、実施例３．３で得られた疎水性相互作用クロマトグラフィーの溶出液にリン酸を添加して、溶出液のｐＨを３．０±０．２に調整し、室温で１００±２０ｒｐｍで３０分間（対照）攪拌し、ウイルスを不活化した。次に、リン酸二ナトリウムを使用してｐＨを６．５±０．５に調整した。
【0085】
さらに、ウイルス不活化時間を６０分、９０分、１２０分に変化させて、ＭＧｇＥ抗原の安定性を調べた（表５）。
【0086】
【表5】
【0087】
結果として、表５を参照すると、１２０分の不活化でも、ＭＧｇＥ抗原の含有量及び純度に有意な変化は生じなかった。したがって、ウイルス不活化に有効なｐＨ３．０の条件下では、ウイルス不活化時間が１２０分の場合でもＭＧｇＥは安定していた。
【0088】
実施例３．５．１回目の濃縮及びダイアフィルトレーション
実施例３．４で得られた溶媒添加したＭＧｇＥ抗原含有溶液から低分子イオンを除去し、溶液を混合モードクロマトグラフィー工程に適した状態にするため、１回目の濃縮及びダイアフィルトレーションステップを実行した。
実施例３．４で得られた溶媒添加したＭＧｇＥ抗原含有溶液から低分子イオンを除去し、溶液を混合モードクロマトグラフィー工程に適した状態にするため、１回目の濃縮及びダイアフィルトレーションステップを実行した。
【0089】
詳細には、溶剤添加したＭＧｇＥ抗原含有溶液に、限外濾過／ダイアフィルトレーション系（Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（５０Ｋ））を使用して限外濾過を行い、濾液は次の工程である混合モードクロマトグラフィー工程のための平衡化緩衝液を使用して、濾液のｐＨが７．２±０．２、伝導度が２．５ｍＳ／ｃｍ以下になるまでダイアフィルトレーションを行った。
【0090】
実施例３．６．混合モードクロマトグラフィー
実施例３．５で得られた透析及び／又は濃縮を行ったＭＧｇＥ抗原含有溶液に、混合モードクロマトグラフィーを実行し、溶液から二量体及び不純物を除去した。
実施例３．５で得られた透析及び／又は濃縮を行ったＭＧｇＥ抗原含有溶液に、混合モードクロマトグラフィーを実行し、溶液から二量体及び不純物を除去した。
【0091】
詳細には、カラムにセラミックハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）樹脂を充填し、次いで平衡化緩衝液を使用して７．２±０．２のｐＨに平衡化した。次に、実施例３．５で得られた透析及び／又は濃縮を行ったＭＧｇＥ抗原含有溶液を流速が１００±１０ｃｍ／ｈｒとなるようにカラムに添加し、非吸着溶液を収集した。その後、収集のためにカラムを平衡化緩衝液で洗浄した。
【0092】
実施例３．７．２回目の濃縮及びダイアフィルトレーション
実施例３．６で得られた混合モードクロマトグラフィーの非吸着溶液中のタンパク質濃度を調整し、溶液をナノ濾過工程に適した条件にするために、２回目の濃縮及びダイアフィルトレーションステップを実行した。
実施例３．６で得られた混合モードクロマトグラフィーの非吸着溶液中のタンパク質濃度を調整し、溶液をナノ濾過工程に適した条件にするために、２回目の濃縮及びダイアフィルトレーションステップを実行した。
【0093】
混合モードクロマトグラフィーの非吸着溶液に限外濾過／ダイアフィルトレーション系（Ｓａｒｔｏｃｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（５０Ｋ））を行い、濾液は次の工程であるナノ濾過工程のための平衡化緩衝液を使用して、濾液のｐＨが７．４±０．２、伝導度が１５．５ｍＳ／ｃｍ以上になるまでダイアフィルトレーションを行った。その後、得られたものを限外濾過によってタンパク質濃度７．０±０．５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【0094】
実施例３．８．ナノ濾過
ナノ濾過はウイルス除去ステップであり、ナノフィルター（Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ、Ａｓａｈｉ）を使用し、製剤化緩衝液を使用してｐＨを７．４±０．２に平衡化した。
ナノ濾過はウイルス除去ステップであり、ナノフィルター（Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎ、Ａｓａｈｉ）を使用し、製剤化緩衝液を使用してｐＨを７．４±０．２に平衡化した。
【0095】
次に、実施例３．７で得られた透析及び濃縮を行ったＭＧｇＥ抗原含有溶液をナノフィルターに１．０±０．２ｂａｒの圧力条件で通過させてウイルスを除去した後、ナノフィルターを平衡化緩衝液で洗浄した。ナノ濾過によって得られた濾液及び洗浄液を一緒に混合した後、タンパク質濃度を測定した。
【0096】
実施例３．９．希釈及び濾過
実施例３．８でナノ濾過によって得られた濾液を製剤化緩衝液でタンパク質濃度が５．０±０．５ｍｇ／ｍＬになるように希釈した後、０．２μｍフィルターを使用して濾過を実行した。
実施例３．８でナノ濾過によって得られた濾液を製剤化緩衝液でタンパク質濃度が５．０±０．５ｍｇ／ｍＬになるように希釈した後、０．２μｍフィルターを使用して濾過を実行した。
【0097】
その後、得られたＭＧｇＥ抗原含有溶液を分注し、－２０℃以下で保存した。
実験実施例３．各精製ステップの収率評価
精製ステップの各ステップの収率は、実施例３の各ステップのＭＧｇＥ抗原の含有量を測定することによって調べた（表６）。表６のＭＧｇＥのタンパク質含有量に関して、回収及び清澄化及び陰イオン交換クロマトグラフィーステップを行った＊印の各培養液はＥＬＩＳＡ試験で測定し、その後のステップの培養液はＵＶで測定した。
実験実施例３．各精製ステップの収率評価
精製ステップの各ステップの収率は、実施例３の各ステップのＭＧｇＥ抗原の含有量を測定することによって調べた（表６）。表６のＭＧｇＥのタンパク質含有量に関して、回収及び清澄化及び陰イオン交換クロマトグラフィーステップを行った＊印の各培養液はＥＬＩＳＡ試験で測定し、その後のステップの培養液はＵＶで測定した。
【0098】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6a】
【図6b】
【配列表】
【国際調査報告】