知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-02
(54)【発明の名称】タイトジャンクション透過性のモジュレーター
(51)【国際特許分類】
A61K 38/08 20190101AFI20230726BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20230726BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20230726BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230726BHJP
【ＦＩ】
A61K38/08
C07K4/00 ZNA
A61K38/10
A61P43/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2022575980
(86)(22)【出願日】2021-06-11
(85)【翻訳文提出日】2023-02-08
(86)【国際出願番号】 EP2021065842
(87)【国際公開番号】W WO2021250260
(87)【国際公開日】2021-12-16
(31)【優先権主張番号】2009007.2
(32)【優先日】2020-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514007092
【氏名又は名称】ザ ユニバーシティ オブ バース
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100187540
【弁理士】
【氏名又は名称】國枝 由紀子
(72)【発明者】
【氏名】ムルスニー，ランディ
(72)【発明者】
【氏名】タバナー，アリステア
(72)【発明者】
【氏名】アルマンスール，ハレド
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA09
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA23
4C084CA59
4C084NA11
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZC011
4C084ZC012
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA01
4H045BA10
4H045BA16
4H045BA41
4H045BA72
4H045EA20
4H045FA33
4H045FA51
4H045GA25
(57)【要約】
本発明は、上皮細胞間のジャンクションの透過性を調節することができるコンパウンド、および上皮表面を横切る治療薬や診断薬のような物質の送達を促進するためのそれらの使用に関する。特に、本発明は、既知の透過強化剤ＰＩＰ２５０の主要アミノ酸を同定し、より一過性の活性を有する新しい透過強化ペプチドを提供し、したがって、より速い上皮の回復を提供することに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
上皮透過性を増大することができる薬剤であって、長さが５０個以下のアミノ酸のペプチドを含み、前記ペプチドが式Ｉ：ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋ（式Ｉ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列、または式Ｉのコア配列のレトロ－インバーソ型
を含む、薬剤。
【請求項2】
ペプチドが式ＩＩ：ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋ（式ＩＩ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列、または式ＩＩのコア配列のレトロ－インバーソ型
を有する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項3】
薬剤が上皮細胞の形質膜を通過することができる、請求項１または請求項２に記載の薬剤。
【請求項4】
ペプチドが、形質膜を横切る通過を媒介することができる１つまたは複数の追加の配列を含む、請求項３に記載の薬剤。
【請求項5】
ペプチドが、コア配列のＮ末端の残基ｒｒ、および／またはコア配列のＣ末端の残基ｋｒｋを含む、請求項４に記載の薬剤。
【請求項6】
ペプチドが、配列：ｒｒ－ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋｋｒｋ
そのレトロ－インバーソ型、
またはいずれかの機能的断片もしくはバリアント
を含む、またはそれからなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項7】
ｘ３がＤ－Ｐｈｅであり、ｘ５がＤ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項8】
ｘ５がＤ－Ａｌａであり、ｘ３がＤ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項9】
式Ｉのコア配列がａｋｖｋ、ｆｋａｋまたはａｋａｋ、好ましくはａｋｖｋまたはｆｋａｋである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項10】
式ＩＩのコア配列がａｋｖｋｔｋ、ｆｋａｋｔｋ、またはａｋａｋｔｋ、好ましくはａｋｖｋｔｋまたはｆｋａｋｔｋである、請求項２に記載の薬剤。
【請求項11】
ペプチドが、配列：ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ
もしくは
ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ
そのいずれかのレトロ－インバーソ型、
またはその機能的断片もしくはバリアント
を含む、またはそれからなる、請求項１から１０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項12】
式：Ｒ１－Ｚ－Ｒ２
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
Ｒ２はＯＨまたはＮＨ２であり、
Ｚは、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド配列を表す）
を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項13】
Ｈ－ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
または
Ｈ－ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
である、請求項１２に記載の薬剤。
【請求項14】
治療における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項15】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の薬剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項16】
上皮表面を横切って送達される物質をさらに含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
（ｉ）請求項１から１５のいずれか一項に記載の薬剤を含む第１の組成物；および（ｉｉ）上皮表面を横切って送達される物質を含む第２の組成物、
を含む、キット。
【請求項18】
上皮表面の透過性の増大における使用のための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の薬剤または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項19】
上皮表面を横切って物質を送達する方法における使用のための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の薬剤または請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項20】
物質が診断薬または治療薬である、請求項１６、１７または１９のいずれか一項に記載の医薬組成物、キット、または使用のための薬剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、上皮細胞間のジャンクションの透過性を調節することができるコンパウンド、および上皮表面を横切る治療薬や診断薬のような物質の送達を促進するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腸管上皮は半透性隔壁であり、分子量約５００Ｄａ超の大きな親水性分子の吸収を制限している。したがって、治療用ペプチドや水溶性抗生物質など、様々な種類の薬物を経口投与する場合、この隔壁を通過することが大きな障害となる。腸管上皮は単層の細胞で構成されており、腸管内腔からの大きな親水性分子の移動に抵抗し、細胞内を薬物が移動するのを制限しており、経細胞ルートと呼ばれる。このため、大きな親水性分子は、傍細胞間隙と呼ばれる隣接する上皮細胞の間を移動して、腸管内腔から体内に入る可能性がある。傍細胞ルートを通る溶質の移動を妨げる重要な要素は、腸管上皮細胞の頂部頸部に組織され、細胞同士を非常に接近させている複数のタンパク質複合体であり、この複合体はタイトジャンクション（ＴＪ）として知られている［１］。ＴＪタンパク質複合体は、アクチン／ミオシンリングを介して細胞骨格に複合体を固定する密着帯ファミリー（例えば、ＺＯ－１、ＺＯ－２、ＺＯ－３）などの細胞内タンパク質、傍細胞溶質移動を妨げる生体性細胞外隔壁を構築するために組織化されているオクルディン、トリセルリン、クローディンなどの膜貫通タンパク質、ならびに、細胞内および膜貫通タンパク質のＴＪ構成要素の両者を修飾することによって傍細胞隔壁の動的特性を制御している様々な細胞内制御タンパク質で構成されている［２］。
【0003】
上皮の隔壁機能を変化させ、吸収の悪い薬物分子の傍細胞ルートからの取り込みを改善する方法として、多種多様なＴＪモジュレーターが研究されてきた［３］。ＴＪの様々な構成要素が標的とされてきた。合成ペプチドは、オクルディン［４］や特定のクローディンタンパク質の細胞外ドメインを模倣することにより、ＴＪの透過性を増大することが示されている。密着帯毒素、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシン、Ｃ． ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓイオタ毒素などの細菌毒素のアナログは、それぞれＺＯ－１［５］、クローディン－４［６］、およびトリセルリン［７］を破壊することによって透過性を高めることが示されている。カプリン酸ナトリウムは、ＴＪのトリセルリンを減少させることにより透過性を高めることが示されている［８］。さらに多くの透過強化剤がｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で有望視され、一部は臨床試験も行われているが［９］［１０］、これらのアプローチのｉｎ ｖｉｖｏ応用は通常、低いバイオアベイラビリティまたは安全性の懸念によって制限されている［１１］。ＴＪタンパク質の細胞外ドメイン間で起こるタンパク質間相互作用を物理的に破壊したり、混乱させたりする代わりに、ＴＪ機能を動的に制御する制御タンパク質に影響を与えることによって、ＴＪ透過性の特性を変える試みがなされてきた。非特異的ホスファターゼ阻害剤を用いた研究、など（参考文献）。
【0004】
ＴＪ透過性の主要な動的調節制御の１つに、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のＳｅｒ－１９のリン酸化がある。リン酸化されたＭＬＣ（ｐＭＬＣ）は、ＴＪに関連したアクチン／ミオシン細胞骨格の収縮をもたらし、この収縮はＴＪ透過性の特性の上昇につながる［１２］［１３］。ＴＪの透過性は、ｐＭＬＣがリン酸化されていない状態に戻れば、通常の状態に戻るので、この機構の動的な性質が定義される。ＭＬＣのリン酸化は、ミオシン軽鎖キナーゼ（ＭＬＣＫ）とミオシン軽鎖ホスファターゼ（ＭＬＣＰ）という酵素によって制御されており［１４］、通常のＴＪ透過性が低い状態では、ＭＬＣＰが優勢である。慢性炎症の状態では、ＭＬＣＫが優勢となり、そのような病態に関連したＴＪ透過性の上昇をもたらす。より動的な状況では、食事に応答して、ｐＭＬＣのレベルの一時的な増加がＴＪ透過性を高め、必須栄養素を吸収するための第２の機構を提供すると思われる。栄養成分によってＴＪ透過性が一過性に高まるこの動的なプロセスが、経口投与では吸収率の低い薬物の吸収率を高める誘発的な機会を提供する。
【0005】
ＭＬＣＰは、触媒的なプロテインホスファターゼサブユニット（ＰＰ１）、ミオシン標的サブユニット（ＭＹＰＴ１）、機能不明の３８ｋＤａサブユニットからなるホロ酵素である［１５］。さらに、阻害サブユニットであるＣＰＩ－１７は、Ｔｈｒ－３８でリン酸化された状態（ｐＣＰＩ－１７）でＭＬＣＰに結合し、酵素の作用を阻害する［１６］。ＭＹＰＴ１がＰＰ１に結合すると、酵素の基質であるＭＬＣの親和性が飛躍的に高まり、特異性の高いホスファターゼとなる［１７］。ＭＹＰＴ１が結合していない場合、ＰＰ１のＭＬＣ脱リン酸化活性は大幅に低減するため、このタンパク質／タンパク質相互作用はＭＬＣＰが効果的に作用するために不可欠である。ＭＹＰＴ１とＰＰ１には、この相互作用の鍵となるアミノ酸残基と配列が多数同定されている。ＭＹＰＴ１上のＭｅｔ－１からＰｈｅ－３８の配列は、ＰＰ１のＭＬＣに対する特異性を高めるが、全長のＭＹＰＴ１よりもその程度は低いことが示されていた［１８］。また、Ａｓｐ－２３からＰｈｅ－３８までのより短い配列は、ＰＰ１に結合することができるが、特異性は増加しない［１９］。このことから、アミノ酸２３～３８の配列内の残基が結合に必要であり、Ｎ末端がＰＰ１のＭＬＣへの標的化に関与していることが示唆された。具体的には、結合モチーフ３５ＫＶＫＦ３８はＰＰ１とＭＹＰＴ１との結合の鍵となるが、ＭＬＣに対する特異性を高めるには不十分であると思われる。Ｖａｌ－３６とＰｈｅ－３８は、ＰＰ１上の特定の疎水性ポケットに結合するようである［１５］。
【0006】
本発明者らは以前、ＭＬＣＰの相互作用に関わる配列に基づいて合理的に設計された２種類のホスファターゼの透過性阻害剤（ＰＩＰ）ペプチドを研究したことがある。ＰＩＰ６４０はｐＣＰＩ－１７のセグメントに基づき、ＰＩＰ２５０はＭＹＰＴ１上の結合モチーフに基づくものである。どちらのペプチドもｐＭＬＣレベルを増大することにより透過性を高めた［２０］。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、上皮透過性を増大することができるさらなるペプチドであって、先に記載したペプチドＰＩＰ２５０と比較して利点を有するペプチドに関する［２０］。
本発明は、上皮透過性を増大することができる薬剤であって、長さが５０個以下のアミノ酸のペプチドを含み、前記ペプチドが式Ｉ：
ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋ（式Ｉ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列、または式Ｉのコア配列のレトロ－インバーソ型
を含む、薬剤を提供する。
本発明は、上皮透過性を増大することができる薬剤であって、長さが５０個以下のアミノ酸のペプチドを含み、前記ペプチドが式Ｉ：
ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋ（式Ｉ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列、または式Ｉのコア配列のレトロ－インバーソ型
を含む、薬剤を提供する。
【0008】
一部の実施形態では、ペプチドは式ＩＩ：
ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋ（式ＩＩ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列、または式ＩＩのコア配列のレトロ－インバーソ型
を有する。
ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋ（式ＩＩ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列、または式ＩＩのコア配列のレトロ－インバーソ型
を有する。
【0009】
薬剤は、上皮細胞の形質膜を通過することができてもよい。例えば、脂質（例えばコレステロール）のような親油性部分や、カチオン性ポリマーやデンドリマーのような形質膜を横切る通過を増大する能力を有する他の部分で、化学的に修飾されてもよい。
【0010】
あるいは、ペプチド自体が、さらなる化学的修飾を受けることなく、形質膜を通過することが可能であってもよい。したがって、ペプチドは、形質膜を横切る通過を媒介することができる１つまたは複数の追加の配列を含んでもよい。このような配列は、「ＣＰＰ」（細胞浸透性ペプチド）配列と呼ばれることがある。したがって、ペプチドは、１つまたは複数のＣＰＰ配列を含んでもよい。
【0011】
本明細書に記載されるペプチドＰＩＰ２５１およびＰＩＰ２５２は、それぞれのコア配列のＮ末端およびＣ末端に付加的な配列を有する。これらの付加的な配列は、複数の正に荷電した残基を含み、特に、形質膜を横切る通過を媒介すると信じられている。
【0012】
したがって、ペプチドは、コア配列のＮ末端および／またはＣ末端に１つまたは複数の正に荷電した残基（例えば、関連するＤまたはＬ配置におけるＬｙｓまたはＡｒｇ）を含んでもよい。
【0013】
例えば、ペプチドは、コア配列のＮ末端の残基ｒｒ、および／またはコア配列のＣ末端の残基ｋｒｋを含んでもよい。
したがって、ペプチドは、配列：
ｒｒ－ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋｋｒｋ
そのレトロ－インバーソ型、
またはいずれかの機能的断片もしくはバリアント
を含んでもよく、またはからなってもよい。
したがって、ペプチドは、配列：
ｒｒ－ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋｋｒｋ
そのレトロ－インバーソ型、
またはいずれかの機能的断片もしくはバリアント
を含んでもよく、またはからなってもよい。
【0014】
機能的断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から切断されることがある。式Ｉまたは式ＩＩ（またはそのレトロ－インバーソ型）のコア配列は維持されることが理解されるであろう。
【0015】
機能的バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または挿入によって、上記の配列（またはそのレトロ－インバーソ型）のうちの１つと異なってもよい。それは、５個以下の位置、例えば４個以下の位置、３個以下の位置、２個以下の位置、または１個以下の位置で、上記の配列と異なってもよい。式Ｉまたは式ＩＩ（またはそのレトロ－インバーソ型）のコア配列は変化しなくてもよいことが理解されるであろう。
【0016】
機能的断片またはバリアントは、上皮透過性を増大する活性を保持することになる。また、形質膜を通過する能力を保持することもできるが、ペプチドが膜通過を容易にする適切な化学的修飾を含む場合には、その必要はない。
【0017】
一部の実施形態では、ｘ３はＤ－Ｐｈｅであり、ｘ５はＤ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される。
一部の実施形態では、ｘ５はＤ－Ａｌａであり、ｘ３はＤ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される。
一部の実施形態では、ｘ５はＤ－Ａｌａであり、ｘ３はＤ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される。
【0018】
一部の実施形態では、式Ｉのコア配列はａｋｖｋ、ｆｋａｋまたはａｋａｋ、好ましくはａｋｖｋまたはｆｋａｋである。
一部の実施形態では、式ＩＩのコア配列はａｋｖｋｔｋ、ｆｋａｋｔｋ、またはａｋａｋｔｋ、好ましくはａｋｖｋｔｋまたはｆｋａｋｔｋである。
一部の実施形態では、式ＩＩのコア配列はａｋｖｋｔｋ、ｆｋａｋｔｋ、またはａｋａｋｔｋ、好ましくはａｋｖｋｔｋまたはｆｋａｋｔｋである。
【0019】
したがって、ペプチドは、配列：
ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ
もしくは
ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ
そのいずれかのレトロ－インバーソ型、
またはその機能的断片もしくはバリアント
を含んでもよく、またはからなってもよい。
ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ
もしくは
ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ
そのいずれかのレトロ－インバーソ型、
またはその機能的断片もしくはバリアント
を含んでもよく、またはからなってもよい。
【0020】
ペプチドは、長さが５０個以下のアミノ酸残基、例えば４０個以下のアミノ酸残基、３０個以下のアミノ酸残基、２０個以下のアミノ酸残基、１５個以下のアミノ酸残基、例えば長さが１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸残基である。
【0021】
ペプチドは、少なくとも５残基の長さ、例えば、少なくとも６残基、少なくとも７残基、少なくとも８残基、少なくとも９残基、少なくとも１０残基または少なくとも１１残基の長さであり、例えば、少なくとも１０残基または少なくとも１１残基の長さである。
【0022】
一部の実施形態では、ペプチドは、１０から２０残基の間の長さ、例えば、１０から１５残基の間の長さである。
ペプチドは、式：
Ｒ１－Ｚ－Ｒ２
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
Ｒ２はＯＨまたはＮＨ２であり、
Ｚは、本明細書に記載のペプチド配列を表す）
を有することがある。
ペプチドは、式：
Ｒ１－Ｚ－Ｒ２
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
Ｒ２はＯＨまたはＮＨ２であり、
Ｚは、本明細書に記載のペプチド配列を表す）
を有することがある。
【0023】
本発明の特に好ましい薬剤は、
Ｈ－ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
および
Ｈ－ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
である。
Ｈ－ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
および
Ｈ－ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
である。
【0024】
本発明の薬剤、具体的にはその薬剤のペプチド成分は、上皮透過性を増大することができる。特に、上皮細胞間のタイトジャンクションの透過性を増大することができ、特に、消化管または気道の上皮透過性を高めることができる。
【0025】
理論に拘束されることを望まないが、ペプチド成分、より詳細には式Ｉのコア配列は、ＰＰ１とＭＹＰＴ１との間の相互作用を、例えばＰＰ１に結合することによって阻害することができると考えられている。
【0026】
本薬剤は、特定の物質と一緒に上皮に投与されると、当該関連する上皮を通過する当該物質の通過を増大することができる。
本発明の薬剤は、ＰＩＰ２５０のような既知の透過強化剤と比較して、ある種の望ましい特性を示す。例えば、上皮は、ＰＩＰ２５０で処置した場合よりも本発明の薬剤で処置した場合の方が、ベースライン透過性への早い回復を示す場合がある。したがって、上皮のタイトジャンクションがより短い時間開いたままであり、所望の物質の通過を可能にするが、毒素または病原体のような不要な物質が上皮を通過する時間を短縮するので、本発明の薬剤は、治療効果または診断効果と毒性との間のより良いバランスを示す可能性がある。
本発明の薬剤は、ＰＩＰ２５０のような既知の透過強化剤と比較して、ある種の望ましい特性を示す。例えば、上皮は、ＰＩＰ２５０で処置した場合よりも本発明の薬剤で処置した場合の方が、ベースライン透過性への早い回復を示す場合がある。したがって、上皮のタイトジャンクションがより短い時間開いたままであり、所望の物質の通過を可能にするが、毒素または病原体のような不要な物質が上皮を通過する時間を短縮するので、本発明の薬剤は、治療効果または診断効果と毒性との間のより良いバランスを示す可能性がある。
【0027】
本発明は、さらに、治療における使用のための本明細書に記載の薬剤を提供する。
本発明はさらに、本明細書に記載の薬剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、標的上皮細胞の形質膜を横切る薬剤の通過を許容または促進するように製剤化されてもよい。例えば、それはリポソーム製剤であってもよい。
本発明はさらに、本明細書に記載の薬剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。組成物は、標的上皮細胞の形質膜を横切る薬剤の通過を許容または促進するように製剤化されてもよい。例えば、それはリポソーム製剤であってもよい。
【0028】
組成物は、上皮表面を横切って送達される物質をさらに含んでもよい。
本発明は、
（ｉ）本明細書に記載される薬剤を含む第１の組成物；および
（ｉｉ）上皮表面を横切って送達される物質を含む第２の組成物、
を含む、キットをさらに提供する。
本発明は、
（ｉ）本明細書に記載される薬剤を含む第１の組成物；および
（ｉｉ）上皮表面を横切って送達される物質を含む第２の組成物、
を含む、キットをさらに提供する。
【0029】
第１および第２の組成物は、必要に応じて、医薬製剤であってもよく、それぞれ独立して、薬学的に許容される担体を含んでもよい。
本発明は、医薬の製造のための本明細書に記載の薬剤の使用をさらに提供する。
本発明は、医薬の製造のための本明細書に記載の薬剤の使用をさらに提供する。
【0030】
本発明は、上皮表面の透過性の増大における使用のための、本明細書に記載の薬剤または医薬組成物をさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載の薬剤または医薬組成物の有効量を上皮に投与することを含む、上皮表面の透過性増大の方法をさらに提供する。
本発明は、本明細書に記載の薬剤または医薬組成物の有効量を上皮に投与することを含む、上皮表面の透過性増大の方法をさらに提供する。
【0031】
本発明は、上皮表面を横切って物質を送達する方法における使用のための、本明細書に記載の薬剤または医薬組成物をさらに提供する。本方法は、薬剤または医薬組成物と共に前記物質を投与することを含んでもよい。
【0032】
本発明は、本明細書に記載の薬剤または医薬組成物と共に前記物質を投与することを含む、上皮表面を横切って物質を送達する方法をさらに提供する。
本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。
本方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。
【0033】
物質は、診断薬や治療薬、あるいは上皮表面に導入することが望ましい他の物質であってもよい。
物質は、ペプチド性であってもよい。本明細書で使用される「ペプチド性」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の直鎖で構成されているか、またはそれを含むコンパウンドを含み、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質が含まれる。「ペプチド」という用語は、２個から５０個の間の連続したアミノ酸からなる分子に対して使用され、「ポリペプチド」は、５０個を超える連続したアミノ酸からなる分子に対して使用される。タンパク質という用語は、ポリペプチドと互換的に使用されることがあるが、共有結合または非共有結合によって結合した１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドの複合体も包含することがある。
物質は、ペプチド性であってもよい。本明細書で使用される「ペプチド性」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の直鎖で構成されているか、またはそれを含むコンパウンドを含み、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質が含まれる。「ペプチド」という用語は、２個から５０個の間の連続したアミノ酸からなる分子に対して使用され、「ポリペプチド」は、５０個を超える連続したアミノ酸からなる分子に対して使用される。タンパク質という用語は、ポリペプチドと互換的に使用されることがあるが、共有結合または非共有結合によって結合した１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドの複合体も包含することがある。
【0034】
物質は、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸であってもよい。例えば、アプタマーであってもよいし、遺伝子治療薬であってもよい。
あるいは、物質は、非ペプチド性有機分子を含む、他の任意の適切な分子であってもよい。物質は、低分子、すなわち分子量が５００Ｄａ以下であっても、高分子（５００Ｄａ超）であってもよい。
あるいは、物質は、非ペプチド性有機分子を含む、他の任意の適切な分子であってもよい。物質は、低分子、すなわち分子量が５００Ｄａ以下であっても、高分子（５００Ｄａ超）であってもよい。
【0035】
本発明の薬剤は、消化管、例えば腸や胃でタンパク質分解を受けるようなタンパク質性の治療薬の経口送達に特に使用されることが見出される場合がある。
本発明は、そのような組合せが明らかに許されないか、または明示的に回避される場合を除き、記載された態様と好ましい特徴の組合せを含む。
本発明は、そのような組合せが明らかに許されないか、または明示的に回避される場合を除き、記載された態様と好ましい特徴の組合せを含む。
【0036】
次に、本発明の原理を示す実施形態および実験について、添付の図を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】５ｍＭ ＰＩＰ２５０～２５４シリーズがｉｎ ｖｉｔｒｏのＣａｃｏ－２単層のＴＥＥＲに与える影響の図である。Ａ）Ｐｈｅ－Ｐ３（ＰＩＰ２５０）をアラニン（ＰＩＰ２５１）またはアスパラギン酸（ＰＩＰ２５３）に変更した場合の効果。Ｂ）Ｖａｌ－Ｐ５（ＰＩＰ２５０）をアラニン（ＰＩＰ２５２）またはアスパラギン酸（ＰＩＰ２５４）に変更した場合の効果。一元配置ＡＮＯＶＡは、Ａ）、Ｂ）ともにデータセット間で有意差を示した（ｐ＜０．０５）。ＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１およびＰＩＰ２５２のデータセットは、ボンフェローニ事後検定で対照と有意に異なった（ｐ＜０．０５）。ＰＩＰ２５３とＰＩＰ２５４は有意差なし。
【図2】５ｍＭで試験したＰＩＰ２５０～２５４シリーズが、Ａ）Ｃａｃｏ－２単層を通過する４ｋＤａ蛍光デキストランの見かけの透過性（ＰＡＰＰ）、Ｂ）リン酸化ミオシン軽鎖（ｐＭＬＣ）と総ＭＬＣの比に与える影響の図である。データは平均値±ＳＤである（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５は、対応なし、両側ｔ検定により対照と比較した。
【図3】ＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１、またはＰＩＰ２５２の洗い流し後、Ａ）Ｃａｃｏ－２単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）およびＢ）Ｃａｃｏ－２単層を通過する４ｋＤａ蛍光デキストランの見かけの透過性（ＰＡＰＰ）の回復の図である。Ｃａｃｏ－２単層は、５ｍＭの試験ペプチドを１８０分間頂部に添加して処理し、次いで９０分間ＴＥＥＲの読み取りをモニターするか、その期間の終わりにＰＡＰＰについて調べた。↑ペプチドが洗い流された点データは平均値土ＳＤである（ｎ＝３）。＊ｐ＜０．０５は、対応なし、両側ｔ検定により対照と比較した。
【図4】ＰＩＰ２５０シリーズを腔内に注入した後のゲンタマイシンの血清濃度の図である。データは平均値±ＳＤである。ｎ＝３。
【図5-1】ＰＩＰ２５０シリーズペプチド注入後に遅延して腔内注入した後の血清ゲンタマイシン濃度の図である。Ａ）他のグラフから算出したＡＵＣの概要。Ｂ）ＰＩＰ２５０注入後、０分、３０分、６０分遅れて注入した後のゲンタマイシン濃度。Ｃ）ＰＩＰ２５１注入後、０分、３０分、６０分遅れて注入した後のゲンタマイシン濃度。Ｄ）ＰＩＰ２５２注入後、０分、３０分、６０分遅れて注入した後のゲンタマイシン濃度。データは平均値＋ＳＤである。ｎ＝３。
【図5-2】ＰＩＰ２５０シリーズペプチド注入後に遅延して腔内注入した後の血清ゲンタマイシン濃度の図である。Ａ）他のグラフから算出したＡＵＣの概要。Ｂ）ＰＩＰ２５０注入後、０分、３０分、６０分遅れて注入した後のゲンタマイシン濃度。Ｃ）ＰＩＰ２５１注入後、０分、３０分、６０分遅れて注入した後のゲンタマイシン濃度。Ｄ）ＰＩＰ２５２注入後、０分、３０分、６０分遅れて注入した後のゲンタマイシン濃度。データは平均値＋ＳＤである。ｎ＝３。
【図6】ＰＩＰペプチドで処置したＣａｃｏ－２単層由来の溶解物におけるオクルディンのウエスタンブロットから測定したバンド強度の図である。データは、対照＝１００として正規化した。データは平均値＋ＳＤである。ｎ＝３＊ｐ＜０．０５は、両側、対応なし、ｔ検定により対照と比較した。
【図7】ＰＩＰペプチドのＰＰ１への結合の図である。
【図8】ＰＩＰペプチドによるＭＹＰＴ１のＰＰ１への結合の阻害の図である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
次に、本発明の態様および実施形態について、添付の図を参照しながら説明する。さらなる態様および実施形態は、当業者には明らかであろう。本文中で言及された全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0039】
本発明は、内因性制御機構を利用してタイトジャンクションの動的開閉を制御することにより、上皮内の隣接細胞間の傍細胞ルートを開く戦略の開発に基づく。特定の細胞標的を標的とし、それらの標的に対して特異的に作用するように設計されたペプチドコンパウンドの提供に関する戦略である。
【0040】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、天然に存在するアミノ酸に対する従来の３文字および１文字のコードが使用されている、すなわち、
Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｃ（Ｃｙｓ）およびＰ（Ｐｒｏ）。
Ａ（Ａｌａ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｗ（Ｔｒｐ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｙ（Ｔｙｒ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｃ（Ｃｙｓ）およびＰ（Ｐｒｏ）。
【0041】
本文脈における「天然に存在する」とは、標準的な遺伝暗号によってコードされた２０種類のアミノ酸を意味し、タンパク質原性アミノ酸と呼ばれることもある。
１文字コードを使用する場合、Ｄ立体配置のアミノ酸残基には小文字を、Ｌ立体配置のアミノ酸残基には大文字を使用する。キラルではないアミノ酸残基（グリシンなど）については、どちらを使用してもよい。３文字コードを使用する場合、通常、ＤまたはＬ立体配置を明示的に表示する。表示されていない場合は、Ｄ立体配置が仮定される。
１文字コードを使用する場合、Ｄ立体配置のアミノ酸残基には小文字を、Ｌ立体配置のアミノ酸残基には大文字を使用する。キラルではないアミノ酸残基（グリシンなど）については、どちらを使用してもよい。３文字コードを使用する場合、通常、ＤまたはＬ立体配置を明示的に表示する。表示されていない場合は、Ｄ立体配置が仮定される。
【0042】
所与のアミノ酸配列に適用する場合、「レトロ－インバーソ」という用語は、同じ残基を含む代替形態を示すために用いられ、反対の立体配置（ＬまたはＤ）で、Ｎ末端からＣ末端までの残基の順序が逆であるものを示す。この用語は、Ｌ型残基からなる従来のペプチドの逆配列の全Ｄ体バージョンを指すためにしばしば用いられる。しかし、本明細書では、全Ｄ体ペプチドは全Ｌ体ペプチドよりもタンパク質分解に対してかなり抵抗性であるため、特に消化管での使用を意図したペプチドの場合、ペプチドは典型的に全Ｄ体である。したがって、「レトロ－インバーソ」という用語は、所与の配列の逆配列の全Ｌ体バージョンを示すために使用される。全Ｌ体ペプチドは、気道や他の上皮の文脈での使用に、より適していると考えられる。
【0043】
ペプチド骨格のＮ末端およびＣ末端に存在する末端基は、それぞれＲ１およびＲ２と指定されることがある。したがって、Ｒ１はＮ末端のアミノ基の窒素原子に結合し、Ｒ２はＣ末端のカルボニル炭素原子に結合している。
【0044】
Ｒ１は、水素（「Ｈ」または「Ｈｙ」）、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルである。
したがって、例えば、Ｒ１＝水素（「Ｈ－」または「Ｈｙ－」）は、Ｎ末端に遊離の第一級アミノ基があることを示す。（Ｎ末端のアミノ基の他の水素原子は、Ｒ１の性質にかかわらず、一般に不変である。）
Ｒ２は、典型的には「－ＯＨ」または「－ＮＨ２」であり、それぞれＣ末端のカルボキシル（ＣＯＯＨ）基またはアミド（ＣＯＮＨ２）基を示す。
したがって、例えば、Ｒ１＝水素（「Ｈ－」または「Ｈｙ－」）は、Ｎ末端に遊離の第一級アミノ基があることを示す。（Ｎ末端のアミノ基の他の水素原子は、Ｒ１の性質にかかわらず、一般に不変である。）
Ｒ２は、典型的には「－ＯＨ」または「－ＮＨ２」であり、それぞれＣ末端のカルボキシル（ＣＯＯＨ）基またはアミド（ＣＯＮＨ２）基を示す。
【0045】
本発明の一部の実施形態において、Ｒ１はＨ（またはＨｙ）であり、Ｒ２はＮＨ２である。
【0046】
上皮
本明細書に記載の薬剤および組成物を使用して、上皮、すなわち「上皮表面」と呼ばれることがある上皮細胞の１つまたは複数の層の透過性を高めることができる。
この表面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏの表面であってもよい。
本明細書に記載の薬剤および組成物を使用して、上皮、すなわち「上皮表面」と呼ばれることがある上皮細胞の１つまたは複数の層の透過性を高めることができる。
この表面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏの表面であってもよい。
【0047】
非限定的な例は、消化管（例えば、口、食道（ｅｏｓｏｈａｇｕｓ）、胃、小腸、大腸、直腸または肛門の上皮）、気道（例えば、鼻腔、咽頭、喉頭、気管、細気管支または肺の上皮）の上皮、または角膜、子宮頸部もしくは膣の上皮を含むがこれに限定しない他の適切な上皮を含む。
上皮細胞の不死化細胞株、例えば、すぐ上に記載した上皮細胞型の細胞株が特に企図される。
上皮細胞の不死化細胞株、例えば、すぐ上に記載した上皮細胞型の細胞株が特に企図される。
【0048】
対象
本発明の薬剤、組成物および方法は、タイトジャンクションを有する上皮を有するあらゆる種の対象に適用される場合がある。哺乳動物対象が特に好ましい。対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、ネコ科（例えば、ネコ）、イヌ科（例えば、イヌ）、ウマ科（例えば、ウマ）、ウシ科（例えば、ウシ）、ヤギ科（例えば、ヤギ）、ヒツジ科（例えば、ヒツジ）、その他の飼育動物、家禽、実験動物、霊長類（例えば、旧世界ザル、新世界ザル、類人猿またはヒト）を含む、任意の哺乳動物種であってもよい。
本発明の薬剤、組成物および方法は、タイトジャンクションを有する上皮を有するあらゆる種の対象に適用される場合がある。哺乳動物対象が特に好ましい。対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ目（例えば、ウサギ）、ネコ科（例えば、ネコ）、イヌ科（例えば、イヌ）、ウマ科（例えば、ウマ）、ウシ科（例えば、ウシ）、ヤギ科（例えば、ヤギ）、ヒツジ科（例えば、ヒツジ）、その他の飼育動物、家禽、実験動物、霊長類（例えば、旧世界ザル、新世界ザル、類人猿またはヒト）を含む、任意の哺乳動物種であってもよい。
【0049】
送達のための物質
本発明の薬剤は、典型的には、上皮を横切って送達するための物質と共に投与される。薬剤および送達のための物質は、同じ組成物（例えば、混合物）または別々の組成物中に用意される場合がある。
本発明の薬剤は、典型的には、上皮を横切って送達するための物質と共に投与される。薬剤および送達のための物質は、同じ組成物（例えば、混合物）または別々の組成物中に用意される場合がある。
【0050】
一部の実施形態では、それらが同じ組成物中に用意されることが典型的に望ましいであろう。しかし、特定の成分によっては、例えば、それらが製剤のために相容れない要件を有する場合、これは可能でない場合がある。したがって、他の実施形態では、それらが別々の組成物中に用意されることが望ましい場合がある。
【0051】
別々の組成物に製剤化される場合、それらは典型的に、実質的に同じ部位に投与されるであろう。これらは、同じ経路または異なる経路で投与される場合がある。典型的には、それらは互いに１時間以内、例えば互いに３０分以内、１５分以内、５分以内または１分以内に、例えば実質的に同時に投与されるであろう。それらが同時に投与されない場合、上皮を横切って送達される物質を導入する前に、関連する上皮の透過性にその効果を発揮する時間を有するように、本発明の薬剤を最初に送達することが有利である場合がある。
【0052】
本発明の薬剤は、低分子、ペプチド性物質（ペプチド、ポリペプチド、タンパク質）、核酸、その他の有機高分子など、様々な物質を、上皮を横切って送達するために使用される場合がある。
【0053】
送達のための物質は、治療薬または診断薬であってもよい。
ペプチド性治療薬には、ホルモンおよびホルモン受容体の他のアゴニスト、例えばインスリンおよびそのアナログ、ＧＬＰ－１およびエキセンディン－４およびそのアナログなどの他のＧＬＰ－１受容体アゴニスト、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、オクトレオチド、カルシトニンおよびエリスロポエチンなどのソマトスタチンおよびそのアナログが含まれる場合がある。ペプチド性治療薬は、サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキンなど）、ケモカイン、インターフェロン、抗生物質、抗体を含んでもよい。
ペプチド性治療薬には、ホルモンおよびホルモン受容体の他のアゴニスト、例えばインスリンおよびそのアナログ、ＧＬＰ－１およびエキセンディン－４およびそのアナログなどの他のＧＬＰ－１受容体アゴニスト、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、オクトレオチド、カルシトニンおよびエリスロポエチンなどのソマトスタチンおよびそのアナログが含まれる場合がある。ペプチド性治療薬は、サイトカイン（ＧＭ－ＣＳＦ、インターロイキンなど）、ケモカイン、インターフェロン、抗生物質、抗体を含んでもよい。
【0054】
治療用ペプチドの具体例としては、以下のものが挙げられ、これらのいずれもが、本発明の組成物および方法の文脈において採用される場合がある。
【0055】
【表1-1】
【0056】
【表1-2】
【0057】
核酸治療薬は、ＤＮＡ、ＲＮＡを問わず、任意の適切な核酸を含んでもよい。核酸治療薬は、プラスミドやウイルスベクターなどの遺伝子治療薬およびアプタマーを含んでもよい。
【0058】
その他の有機分子としては、脂質、オリゴ糖や多糖類などの炭水化物、アミノグリコシド系抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）などの抗生物質を含むあらゆる種類の薬物分子を含んでもよい。
【0059】
物質は、抗体であってもよい。「抗体」という用語は、抗体の機能的断片もしくは誘導体、または合成抗体もしくは合成抗体断片を含むように使用される。抗体は、治療または診断の目的で採用される場合がある。
【0060】
モノクローナル抗体技術に関する今日の技術に鑑みれば、抗体はほとんどの抗原に対して調製され得る。抗原結合部分は、抗体の一部（例えば、Ｆａｂ断片）または合成抗体断片（例えば、単鎖Ｆｖ断片［ｓｃＦｖ］）であってもよい。選択された抗原に対する適切なモノクローナル抗体は、例えば「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ Ｚｏｌａ、（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９８８）、および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ、（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２）、に開示されているような既知の技術によって調製される場合がある。キメラ抗体は、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、（１９８８、８ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＲＩＣＭＰ７１６４９１６ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｐａｒｔ ２、７９２～７９９）によって論じられている。
【0061】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、特に有用であり、抗原上の単一のエピトープを特異的に標的とする均質な抗体集団である。
ＦａｂおよびＦａｂ２フラグメントなどの抗体の抗原結合断片も、遺伝子操作された抗体および抗体断片と同様に使用／提供される場合がある。抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与しており、この事実は初期のプロテアーゼ消化実験によって初めて認識された。齧歯類の抗体の「ヒト化」によって、さらなる確認がなされた。得られる抗体が齧歯類由来の抗体の抗原特異性を保持するように齧歯類由来の可変ドメインとヒト由来の定常ドメインを融合させてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８１、６８５１～６８５５）。
ＦａｂおよびＦａｂ２フラグメントなどの抗体の抗原結合断片も、遺伝子操作された抗体および抗体断片と同様に使用／提供される場合がある。抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは抗原認識に関与しており、この事実は初期のプロテアーゼ消化実験によって初めて認識された。齧歯類の抗体の「ヒト化」によって、さらなる確認がなされた。得られる抗体が齧歯類由来の抗体の抗原特異性を保持するように齧歯類由来の可変ドメインとヒト由来の定常ドメインを融合させてもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８１、６８５１～６８５５）。
【0062】
抗原特異性が可変ドメインによって与えられ、定常ドメインとは無関係であることは、全て１つまたは複数の可変ドメインを含む抗体断片の細菌発現に関する実験から知られている。これらの分子には、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０４１）、Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１０３８）、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが可動性オリゴペプチドを介して結合している単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、４２３；Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ ８５、５８７９）、および単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４）などがある。特異的結合部位を保持した抗体断片の合成に関わる技術の総説は、ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９、２９３～２９９に記載されている。
【0063】
「ｓｃＦｖ分子」とは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、例えば、可動性オリゴペプチドによって共有結合されている分子を意味する。
Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂ抗体断片は、いずれもＥ．ｃｏｌｉで発現され、分泌させることが可能であり、前記断片を容易に大量に産生することができる。抗体全体、およびＦ（ａｂ’）２断片は「二価」である。「二価」とは、当該抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が、２つの抗原結合部位を有することを意味する。一方、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ断片は、１つの抗原結合部位のみを有する一価のものである。
Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂ抗体断片は、いずれもＥ．ｃｏｌｉで発現され、分泌させることが可能であり、前記断片を容易に大量に産生することができる。抗体全体、およびＦ（ａｂ’）２断片は「二価」である。「二価」とは、当該抗体およびＦ（ａｂ’）２断片が、２つの抗原結合部位を有することを意味する。一方、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ断片は、１つの抗原結合部位のみを有する一価のものである。
【0064】
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者によく知られている他の材料との組合せで、本明細書に記載されるような薬剤を含む医薬組成物を提供する。「担体」という用語は、文脈が他に要求しない限り、これらの選択肢のいずれかを包含するために使用される。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害すべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存する場合があり、任意の適切な経路による場合がある。
本発明は、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者によく知られている他の材料との組合せで、本明細書に記載されるような薬剤を含む医薬組成物を提供する。「担体」という用語は、文脈が他に要求しない限り、これらの選択肢のいずれかを包含するために使用される。このような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害すべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存する場合があり、任意の適切な経路による場合がある。
【0065】
本発明に関する医薬組成物には、経口、非経口吸入（様々なタイプの定量投与、加圧エアゾル、ネブライザーまたは注入器によって生成される場合がある微粒子ダストまたはミストを含む）、直腸および局所（皮膚、経皮、経粘膜、頬、舌下および眼内を含む）投与に適したものがあるが、最も適した経路は、例えば、レシピエントの状態および障害に依存してもよい。
【0066】
組成物は、便利なことに、単位剤形で提示され、薬学の技術分野でよく知られている方法のいずれかによって調製される場合がある。全ての方法は、活性成分を、１つまたは複数の付属成分を構成する医薬担体と会合させるステップを含む。一般に製剤は、活性成分を液体担体または細かく分割された固体担体またはその両方と均一かつ密接に会合させ、その後、必要に応じて製品を所望の製剤に成形することによって調製される。
【0067】
経口投与に適した本発明の組成物は、それぞれが所定量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの個別単位として、散剤または顆粒剤として、水性液体または非水性液体中の液剤または懸濁剤として、あるいは水中油型液体乳剤または油中水型液体乳剤として提示される場合がある。また、活性成分は、ボーラス、舐剤またはペーストとして提示される場合がある。様々な薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、標準的な製剤学の専門書、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｊ．およびＨａｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ、第１０号、付録、４２：２Ｓ、１９８８、も参照されたい。
【0068】
錠剤は圧縮または成型により、必要に応じて１つまたは複数の副成分とともに作製することができる。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの自由に流動する形態の活性成分を、必要に応じて結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、滑沢剤、表面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することにより調製される場合がある。成型錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状コンパウンドの混合物を適切な機械で成型することにより作製される場合がある。錠剤は、必要に応じて被覆されるか、または溝を刻まれてもよく、その中の活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化されてもよい。本発明のコンパウンドは、例えば、即時放出または持続放出に適した形態で投与することができる。即時放出または持続放出は、本発明のコンパウンドを含む適切な医薬組成物の使用により達成することができる。本発明のコンパウンドは、経口投与のために、治療用高分子および高荷電コンパウンドの細胞膜を横切る輸送、特に小腸での輸送を促進する送達剤または担体とともに、製剤化することができる。そのような送達剤または担体は、さらに、胃腸（ＧＩ）管通過中のペプチドの酵素分解を阻害してもよく、および／または製剤は、そのような分解から保護する追加の薬剤を含んでもよい。本発明のコンパウンドはまた、リポソーム的に投与することができる。
【0069】
経口投与のための例示的な組成物には、例えば、かさを付与するための微晶質セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、粘度増強剤としてのメチルセルロース、および当技術分野で知られているような甘味料または香味料を含むことができる懸濁液、および、例えば、微晶質セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または当該技術分野で知られているような他の賦形剤、結合剤、伸展剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤を含むことができる即時放出錠剤が挙げられる。本発明のペプチドはまた、舌下および／または頬への投与により口腔を通して送達することができる。成型錠剤、圧縮錠剤または凍結乾燥錠剤が、使用されてもよい例示的な形態である。例示的な組成物には、マンニトール、ラクトース、スクロースおよび／またはシクロデキストリンなどの速溶性希釈剤とともに本発明のコンパウンドを製剤化したものが含まれる。また、このような製剤には、セルロース（アビセル）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子量賦形剤も含まれる場合がある。このような製剤は、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸コポリマー（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ）などの粘膜接着を補助する賦形剤、およびポリアクリルコポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４）などの放出制御する薬剤も含むことができる。滑沢剤、流動促進剤、香料、着色剤および安定剤も、製造および使用の容易さのために添加されてもよい。
【0070】
含有させることができる賦形剤は、例えば、タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿製剤である。所望により、医薬組成物は、例えば酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンなどの湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などの非毒性の補助物質を少量含有する場合もある。
【0071】
鼻腔エアロゾルまたは吸入投与のための例示的な組成物は、生理食塩水中の溶液を含み、これは、例えば、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、および／または当該技術分野で知られているような他の可溶化剤または分散剤を含有することができる。好都合には、鼻腔エアロゾルまたは吸入投与のための組成物において、本発明のコンパウンドは、適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体を使用して、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形で送達される。加圧エアロゾルの場合には、定量された量を送達するためのバルブを提供することにより、投与単位は決定され得る。吸入器または注入器で使用するための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、コンパウンドの粉末混合物と、例えばラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤を含むように製剤化することができる。１つの具体的な非限定的な例では、本発明のコンパウンドは、アクチュエータとしても知られるエアロゾルアダプタを通じて、定量バルブからエアロゾルとして投与される。必要に応じて、安定剤も含まれ、および／または肺深部送達のための多孔質粒子が含まれる（例えば、米国特許第６，４４７，７４３号参照）。
【0072】
直腸投与用の製剤は、ココアバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールなどの通常の担体を用いた保形浣腸または坐剤として提示される場合がある。このような担体は、通常、常温では固体であるが、直腸腔内で液化および／または溶解して薬物を放出する。
【0073】
口腔内、例えば頬側または舌下に局所投与するための製剤としては、スクロースとアカシアまたはトラガカントなどの香味料ベースで活性成分を含むロゼンジ剤、およびゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアカシアなどのベースで活性成分を含むトローチ剤が挙げられる。局所投与用の例示的な組成物は、プラスチベース（ポリエチレンでゲル化した鉱油）のような局所用担体を含む。
【0074】
医薬組成物は、腸溶性コーティングを有する剤形を含んでもよい。腸溶性コーティングは、小腸で行われるように吸収を制御するために、錠剤、カプレット剤およびカプセル剤などの経口医薬組成物に施されるコーティングである。腸溶性コーティングは、通常、剤形の表面に施され、胃の強酸性ｐＨでは安定した表面を示すが、小腸の比較的塩基性の高い環境では急速に分解されるようになっている。腸溶性コーティングに使用される材料には、脂肪酸、ワックス、シェラック、プラスチックおよび植物繊維がある。
【0075】
本発明が、小腸の上皮を横切る経口投与での第２の治療薬の送達の文脈で使用される場合、治療薬がさもなければ胃の環境で分解されるならば、腸溶性コーティングが使用されてもよい。このようなコーティングは、第２の治療薬が胃に刺激を与える場合、酸に不安定な場合（例えば、エソメプラゾールなどの特定のアゾールは酸に不安定）、または第２の治療薬が胃に存在する酵素によって分解されると予想されるタンパク質またはペプチド（例えば、インシュリン、ＧＬＰ－１またはその誘導体、またはアナログ）の場合に特に有用であることがある。
【0076】
したがって、本発明の第２の態様に記載の医薬組成物は、腸溶性コーティングを有する固体剤形を含んでいてもよく、本発明の他の態様もまた、このようなコーティングを利用する、または関連する場合がある。
【0077】
好ましい単位剤形製剤は、活性成分の、本明細書に記載された有効量、またはその適切な分量を含むものである。
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤のタイプに関して当該技術分野で慣用されている他の薬剤を含んでもよく、例えば、経口投与に適したものは香味料を含んでもよいことが理解されるべきである。
上記で特に言及した成分に加えて、本発明の製剤は、当該製剤のタイプに関して当該技術分野で慣用されている他の薬剤を含んでもよく、例えば、経口投与に適したものは香味料を含んでもよいことが理解されるべきである。
【0078】
また、本発明の薬剤は、好適には、徐放性システムとして投与される。本発明の徐放システムの好適な例は、好適な高分子材料、例えば、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックス；好適な疎水性材料、例えば、許容できる油中のエマルジョンとして；またはイオン交換樹脂；および本発明のコンパウンドの難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩、を含む。徐放性システムは、経口；直腸；非経口；大槽内；膣内；腹腔内；局所、例えば粉末、軟膏、ゲル、ドロップまたは経皮パッチとして；頬側（ｂｕｃａｌｌｙ）；または口腔もしくは鼻腔スプレーとして投与されることがある。
【0079】
投与のための調製物は、本発明の薬剤の制御された放出を与えるように好適に製剤化することができる。例えば、医薬組成物は、生分解性ポリマー、多糖類ゼリー化ポリマーおよび／または生体接着性ポリマー、両親媒性ポリマー、本発明のペプチドの粒子の界面特性を変更することができる薬剤の１つまたは複数を含む粒子の形態であってもよい。これらの組成物は、活性物質の制御された放出を可能にする特定の生体適合性の特徴を示す。米国特許第５，７００，４８６号を参照されたい。
【0080】
本発明のペプチドまたは医薬組成物の治療上有効な量は、単一のパルス投与として、ボーラス投与として、または時間をかけて投与されるパルス投与として投与される場合がある。したがって、パルス投与では、本発明のペプチドまたは組成物のボーラス投与が提供され、その後、時間の経過に続いて第２のボーラス投与が提供される。具体的な非限定的な例では、本発明のコンパウンドのパルス投与は、１日の経過中に、１週間の経過中に、または１ヶ月の経過中に投与される。
【0081】
医薬組成物は、標的上皮細胞の形質膜を横切る薬剤（またはペプチド）の通過を促進する薬剤、例えばリポソーム形成剤を含んでもよい。このような薬剤の存在は、薬剤自体がＣＰＰ配列または適切な化学的修飾を欠く場合に特に望ましい。しかしながら、細胞浸透を補助する薬剤は、そのような配列または化学的修飾の有無に関係なく存在していてもよい。そのような薬剤は、コレステロールなどの脂質、胆汁酸、カチオン性ポリマー、およびデンドリマーを含む。また、ナノ粒子製剤が採用されてもよい。例えば、Ｗａｎｇら、ＡＡＰＳ Ｊ．２０１０ １２月、１２（４）：４９２～５０３、を参照されたい。
【0082】
投与は、好ましくは「治療上有効な量」であり、これは個体に利益を示すのに十分な量である。実際の投与量、投与速度、投与期間は、処置する疾患の性質と重症度に依存する。処置の処方、例えば投与量などの決定は、一般開業医および他の医師の責任範囲であり、一般的には、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、その他開業医に知られている要因を考慮する。上記の技術やプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ出版、に掲載されている。
【0083】
処置条件
本明細書に記載される薬剤および組成物は、適切な治療薬と共に投与される場合、疾患、障害または他の状態の処置のために使用される場合がある。治療薬を離散的な上皮の位置に送達する能力は、粘膜下腔への局所的な送達ももたらすであろう。
本明細書に記載される薬剤および組成物は、適切な治療薬と共に投与される場合、疾患、障害または他の状態の処置のために使用される場合がある。治療薬を離散的な上皮の位置に送達する能力は、粘膜下腔への局所的な送達ももたらすであろう。
【0084】
状態は、上皮表面またはその近傍に局在し、その上皮表面を介した治療薬の投与が有効である場合がある。
例えば、状態は、炎症状態の喘息や線維症、気道の感染症、肺疾患、気道のがんを含む、気道の状態であってもよい。
例えば、状態は、炎症状態の喘息や線維症、気道の感染症、肺疾患、気道のがんを含む、気道の状態であってもよい。
【0085】
状態は、消化管の状態であってよく、特に、消化管固有層およびそれに続く肝門血管床への指向性送達から利益を得る可能性のある状態であってもよい。例としては、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、大腸炎、セリアック病）、胃腸の感染症、および消化管のがんが挙げられる。
【0086】
肝臓に影響を及ぼす状態では、消化管を経由して肝門血管床に直接送達することも有効である場合がある。
あるいは、状態は、がん、自己免疫状態（例えば、関節リウマチ）、代謝性疾患（例えば、１型または２型にかかわらず糖尿病）、病原体による感染（例えば、敗血症を含む細菌またはウイルス感染などの微生物感染）、低身長、高カルシウム血症、骨粗鬆症などの、気道または消化管を介した治療薬の投与によって利益を得る全身状態であってもよい。
あるいは、状態は、がん、自己免疫状態（例えば、関節リウマチ）、代謝性疾患（例えば、１型または２型にかかわらず糖尿病）、病原体による感染（例えば、敗血症を含む細菌またはウイルス感染などの微生物感染）、低身長、高カルシウム血症、骨粗鬆症などの、気道または消化管を介した治療薬の投与によって利益を得る全身状態であってもよい。
【0087】
投与される物質は、そのような状態の予防または処置に有用である任意の薬剤であってもよい。例えば、消化管を介したインスリンまたはＧＬＰ－１（または他のＧＬＰ－１受容体アゴニスト）の送達は、糖尿病（１型または２型）および他の代謝障害の処置に特に有用である場合がある。抗生物質（例えば、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシド系抗生物質）は敗血症を含む細菌感染症の処置に有用であり、オクトレオチドおよび他のソマトスタチンアナログは成長ホルモン産生腫瘍（例えば、先端巨大症）の処置に有用であり、カルシトニンは高カルシウム血症または骨粗鬆症の処置に有用である場合がある。化学療法剤は、適切ながんの治療のために投与される場合がある。当業者であれば、多数の他の潜在的な用途を認識するであろう。
【0088】
塩および溶媒和物
本明細書に記載される薬剤は、薬学的に許容される塩などの適切な塩の形態で提供されてもよい。適切な塩は、有機または無機の酸または塩基と形成されるものを含む。薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびイセチオン酸と形成されるものが含まれる。シュウ酸のような他の酸は、それ自体は薬学的に許容されないが、本発明のコンパウンドおよびその薬学的に許容される塩を得るための中間体として有用である場合がある。塩基との薬学的に許容される塩は、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウム塩およびナトリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩、ならびに有機塩基との塩、例えばジシクロヘキシルアミンおよびＮ－メチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｍｉｎｅ）が含まれる。
本明細書に記載される薬剤は、薬学的に許容される塩などの適切な塩の形態で提供されてもよい。適切な塩は、有機または無機の酸または塩基と形成されるものを含む。薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、クエン酸、酒石酸、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびイセチオン酸と形成されるものが含まれる。シュウ酸のような他の酸は、それ自体は薬学的に許容されないが、本発明のコンパウンドおよびその薬学的に許容される塩を得るための中間体として有用である場合がある。塩基との薬学的に許容される塩は、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウム塩およびナトリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム塩およびマグネシウム塩、ならびに有機塩基との塩、例えばジシクロヘキシルアミンおよびＮ－メチル－Ｄ－グルコサミン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｇｌｕｃｏｍｉｎｅ）が含まれる。
【0089】
有機化学の技術に精通した人であれば、多くの有機化合物が、それらが反応する溶媒、あるいはそれらが沈殿または結晶化する溶媒と錯体を形成することができることを理解するだろう。このような錯体は、「溶媒和物」として知られている。例えば、水との錯体は、「水和物」として知られている。本発明は、本発明のコンパウンドの溶媒和物を提供する。
【0090】
ペプチド合成
本発明のペプチドは、従来の方法論、例えば、個々のアミノ酸からの合成、特に自動ペプチド合成機を用いた段階的合成、ネイティブペプチドの修飾、または組換え製造技術などを含むがこれらに限定されない、ペプチドを製造する任意の適切な技術によって製造することができる。
本発明のペプチドは、従来の方法論、例えば、個々のアミノ酸からの合成、特に自動ペプチド合成機を用いた段階的合成、ネイティブペプチドの修飾、または組換え製造技術などを含むがこれらに限定されない、ペプチドを製造する任意の適切な技術によって製造することができる。
【実施例】
【0091】
材料と方法
ペプチド合成
ペプチドは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手したイソロイシンを除き、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手したアミノ酸誘導体を用いて、（Ｆｍｏｃ）－ＳＰＰＳプロセスで合成した。最初のアミノ酸は、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミドと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（１００～２００メッシュ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）にカップリングさせた。その後のカップリングはＡｃｔｉｖｏ Ｐ－１１ペプチド合成機でＰｙＢＯＰを使用して行った。脱保護は、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して行った。ジエチルエーテルで沈殿させる前に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン、水（９５：２．５：２．５）を用いてペプチドを樹脂から切断した。粗ペプチドを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（２５０×１０ｍｍ、孔径５μｍ）と水とアセトニトリル（ともに０．１％ＴＦＡ含有）のグラジエント移動相を用いたＨＰＬＣにより、流速２．５ｍＬ／分で精製した。ペプチドの同一性を検証するために、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）したＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ｍｉｃｒＯＴＯＦ質量分析計で、高分解能飛行時間型質量スペクトルを取得した。精製ペプチドは凍結乾燥し、－２０℃で保存した。
ペプチド合成
ペプチドは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手したイソロイシンを除き、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手したアミノ酸誘導体を用いて、（Ｆｍｏｃ）－ＳＰＰＳプロセスで合成した。最初のアミノ酸は、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミドと１－ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡ樹脂（１００～２００メッシュ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）にカップリングさせた。その後のカップリングはＡｃｔｉｖｏ Ｐ－１１ペプチド合成機でＰｙＢＯＰを使用して行った。脱保護は、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンを使用して行った。ジエチルエーテルで沈殿させる前に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリイソプロピルシラン、水（９５：２．５：２．５）を用いてペプチドを樹脂から切断した。粗ペプチドを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８カラム（２５０×１０ｍｍ、孔径５μｍ）と水とアセトニトリル（ともに０．１％ＴＦＡ含有）のグラジエント移動相を用いたＨＰＬＣにより、流速２．５ｍＬ／分で精製した。ペプチドの同一性を検証するために、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）したＢｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ ｍｉｃｒＯＴＯＦ質量分析計で、高分解能飛行時間型質量スペクトルを取得した。精製ペプチドは凍結乾燥し、－２０℃で保存した。
【0092】
Ｃａｃｏ－２細胞培養
不死化ヒト腸管上皮細胞株（Ｃａｃｏ－２）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）中で維持した。Ｃａｃｏ－２細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）ポリエステルメンブレンフィルター（直径１２ｍｍ、孔径０．４μｍ）上に７×１０４／ウェルの密度で播種した。新鮮な培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）の供給は２日おきに実施した。これらの研究には、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞３５０Ω・ｃｍ２のＣａｃｏ－２単層を使用し、固定パドル電極とボルトメーター（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて測定したこのようなＴＥＥＲ値は、通常Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）フィルターへの播種後１５～１８日目で達成された。
不死化ヒト腸管上皮細胞株（Ｃａｃｏ－２）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）中で維持した。Ｃａｃｏ－２細胞をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）ポリエステルメンブレンフィルター（直径１２ｍｍ、孔径０．４μｍ）上に７×１０４／ウェルの密度で播種した。新鮮な培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）の供給は２日おきに実施した。これらの研究には、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＞３５０Ω・ｃｍ２のＣａｃｏ－２単層を使用し、固定パドル電極とボルトメーター（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて測定したこのようなＴＥＥＲ値は、通常Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）フィルターへの播種後１５～１８日目で達成された。
【0093】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ輸送アッセイ
１０ｍｇ／ｍＬ４ｋＤａ蛍光デキストラン（Ｓｉｇｍａ）の頂部から基部へのフラックスを行い、傍細胞透過性に対するＰＩＰペプチドの影響を評価した。頂部（２００μＬ）および基部（５００μＬ）コンパートメント培地を新鮮なＨＢＳＳで置換し、ＴＥＥＲ測定が得られたときに３０分間平衡化させて、単層完全性を確保した。蛍光デキストランを頂部に適用した後、設定した時間（通常０、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０分）ごとに基部コンパートメントの体積を収集し、毎回新鮮なＨＢＳＳで置換した。頂部および基部コンパートメントの蛍光は、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。３時間後、頂部コンパートメント蛍光デキストラン／ペプチド溶液を除去し、ＰＢＳで置換し、ＴＥＥＲ値をさらに３０分間記録し、単層回復をモニターした。ＴＥＥＲ値はブランクフィルターの測定値を差し引いて計算し、その単層の初期ＴＥＥＲ値に対するパーセンテージとして正規化した。
１０ｍｇ／ｍＬ４ｋＤａ蛍光デキストラン（Ｓｉｇｍａ）の頂部から基部へのフラックスを行い、傍細胞透過性に対するＰＩＰペプチドの影響を評価した。頂部（２００μＬ）および基部（５００μＬ）コンパートメント培地を新鮮なＨＢＳＳで置換し、ＴＥＥＲ測定が得られたときに３０分間平衡化させて、単層完全性を確保した。蛍光デキストランを頂部に適用した後、設定した時間（通常０、１５、３０、６０、９０、１２０、１８０分）ごとに基部コンパートメントの体積を収集し、毎回新鮮なＨＢＳＳで置換した。頂部および基部コンパートメントの蛍光は、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｏｒｔｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定した。３時間後、頂部コンパートメント蛍光デキストラン／ペプチド溶液を除去し、ＰＢＳで置換し、ＴＥＥＲ値をさらに３０分間記録し、単層回復をモニターした。ＴＥＥＲ値はブランクフィルターの測定値を差し引いて計算し、その単層の初期ＴＥＥＲ値に対するパーセンテージとして正規化した。
【0094】
動物
ｉｎ ｖｉｖｏ実験には、体重２５０～３００ｇの雄のＷｉｓｔａｒラットを使用した。ラットをＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈの屋内で飼育した。ラットを１２／１２時間の明暗サイクルで飼育した。実験は光周期の中間点±３時間で行った。ラットは、実験開始までの間、自由に餌と水にアクセスできた。実験後、ラットを濃度が増大するＣＯ２に曝露して安楽死させた。
ｉｎ ｖｉｖｏ実験には、体重２５０～３００ｇの雄のＷｉｓｔａｒラットを使用した。ラットをＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈの屋内で飼育した。ラットを１２／１２時間の明暗サイクルで飼育した。実験は光周期の中間点±３時間で行った。ラットは、実験開始までの間、自由に餌と水にアクセスできた。実験後、ラットを濃度が増大するＣＯ２に曝露して安楽死させた。
【0095】
ｉｎ ｖｉｖｏ腔内注入（ＩＬＩ）
ラットを５％吸入イソフルランで麻酔した。麻酔が達成されると、ラットを麻酔を維持するためにノーズコーンに移した。２ｃｍの切開を使用して、腹腔にアクセスした。腸の十分な部分を切除して空腸の位置を確認し、２５Ｇの注射針を用いてその内腔に直接試験物質を注入した。試験終了時の組織採取のため、永久マーカーを使用して、注射部位に隣接する腸間膜を確認した。
ラットを５％吸入イソフルランで麻酔した。麻酔が達成されると、ラットを麻酔を維持するためにノーズコーンに移した。２ｃｍの切開を使用して、腹腔にアクセスした。腸の十分な部分を切除して空腸の位置を確認し、２５Ｇの注射針を用いてその内腔に直接試験物質を注入した。試験終了時の組織採取のため、永久マーカーを使用して、注射部位に隣接する腸間膜を確認した。
【0096】
ＬＣＭＳ／ＭＳ用血清サンプルの採取
尾静脈または門脈から血液サンプル（１００μＬ）を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに採取し、室温で２０分間凝固させた。２０００×ｇで１０分間遠心分離した後、凝固した血液から採取した血清をアセトニトリルと１：３の割合で混合し、４℃で一晩放置してタンパク質を沈殿させた。サンプルは２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収してＬＣＭＳ／ＭＳで分析した。
尾静脈または門脈から血液サンプル（１００μＬ）を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに採取し、室温で２０分間凝固させた。２０００×ｇで１０分間遠心分離した後、凝固した血液から採取した血清をアセトニトリルと１：３の割合で混合し、４℃で一晩放置してタンパク質を沈殿させた。サンプルは２０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収してＬＣＭＳ／ＭＳで分析した。
【0097】
ｉｎ ｖｉｖｏでのゲンタマイシンの輸送
ラットに１０ｍｇ／ｋｇのゲンタマイシンを、２０ｍＭのＰＩＰ２５０シリーズペプチドの有無で、ＩＬＩによって投与した。ＩＬ後１５分から９０分までに採取した血液サンプルについて、ゲンタマイシンを分析した。別の実験では、ＰＩＰ２５０シリーズペプチドを単独で注射し、３０分または６０分の遅延後にゲンタマイシンを単独で注射した。血液サンプルを、以前に記載したように採取し、分析した。
ラットに１０ｍｇ／ｋｇのゲンタマイシンを、２０ｍＭのＰＩＰ２５０シリーズペプチドの有無で、ＩＬＩによって投与した。ＩＬ後１５分から９０分までに採取した血液サンプルについて、ゲンタマイシンを分析した。別の実験では、ＰＩＰ２５０シリーズペプチドを単独で注射し、３０分または６０分の遅延後にゲンタマイシンを単独で注射した。血液サンプルを、以前に記載したように採取し、分析した。
【0098】
ゲンタマイシンの血清濃度のＬＣＭＳ／ＭＳ分析
サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５四重極飛行時間型ＬＣ／ＭＳ装置を用いて分析した。１０μＬのゲンタマイシンサンプルをＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに注入し、２０２ｎｍで検出した。サンプルをエレクトロスプレーイオン化によりイオン化し、サンプル中のゲンタマイシンを質量／電荷分析により確認した。定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅで行った。
サンプルを、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５四重極飛行時間型ＬＣ／ＭＳ装置を用いて分析した。１０μＬのゲンタマイシンサンプルをＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに注入し、２０２ｎｍで検出した。サンプルをエレクトロスプレーイオン化によりイオン化し、サンプル中のゲンタマイシンを質量／電荷分析により確認した。定量は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅで行った。
【0099】
ウェスタンブロッティング
２００μＬのＲＩＰＡバッファーと１０μＬのプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を使用して調製したＣａｃｏ－２単層の溶解物を、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れ、４０００×ｇで１０分間遠心して上清を取り除き、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離するまで－８０℃で保存した。タンパク質サンプルをローディングバッファーと１：１で混合し、９５℃で５分間加熱して変性させ、２０μＬを分析のためにロードした。分離したタンパク質を、３０Ｖで７５分間、ニトロセルロース膜に転写した。膜をＴＢＳ－Ｔ中の５％ウシ血清アルブミンで２時間ブロックした後、ＴＢＳ－Ｔで希釈した一次抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次いで蛍光標識２次抗体と室温で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、Ｌｉｃｏｒイメージングシステムを使用して分析した。
２００μＬのＲＩＰＡバッファーと１０μＬのプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を使用して調製したＣａｃｏ－２単層の溶解物を、１．５ｍＬエッペンドルフチューブに入れ、４０００×ｇで１０分間遠心して上清を取り除き、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離するまで－８０℃で保存した。タンパク質サンプルをローディングバッファーと１：１で混合し、９５℃で５分間加熱して変性させ、２０μＬを分析のためにロードした。分離したタンパク質を、３０Ｖで７５分間、ニトロセルロース膜に転写した。膜をＴＢＳ－Ｔ中の５％ウシ血清アルブミンで２時間ブロックした後、ＴＢＳ－Ｔで希釈した一次抗体を用いて４℃で一晩インキュベートした。膜をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次いで蛍光標識２次抗体と室温で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、Ｌｉｃｏｒイメージングシステムを使用して分析した。
【0100】
結合アッセイ
ＰＢＳ－Ｔで希釈したＨｉｓ－タグ付きＰＰ１をニッケルでコートしたウェルで１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ビオチン化ＰＩＰペプチドまたはＭＹＰＴ１のアミノ酸１～２９９の濃度を増大させながら、ウェルをインキュベートした。ウェルをＰＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合したストレプトアビジンを用いて１時間インキュベートした。ウェルを前回と同様に洗浄し、プレートの蛍光を読み取った（Ｅｘ：４８０ｎｍ、Ｅｍ：５１０ｎｍ）。
ＰＢＳ－Ｔで希釈したＨｉｓ－タグ付きＰＰ１をニッケルでコートしたウェルで１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。ビオチン化ＰＩＰペプチドまたはＭＹＰＴ１のアミノ酸１～２９９の濃度を増大させながら、ウェルをインキュベートした。ウェルをＰＢＳ－Ｔで再度３回洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８に結合したストレプトアビジンを用いて１時間インキュベートした。ウェルを前回と同様に洗浄し、プレートの蛍光を読み取った（Ｅｘ：４８０ｎｍ、Ｅｍ：５１０ｎｍ）。
【0101】
ＭＹＰＴ１との結合アッセイを、濃度が増大するＰＩＰペプチドの存在下で繰り返し、ＭＹＰＴ１とペプチドとの間の競合を測定した。
【0102】
データ処理
グラフと統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニ事後検定を使用したＧｒａｐＰａｄＰｒｓｉｍソフトウェアを用いて実施した。
グラフと統計解析は、一元配置ＡＮＯＶＡとボンフェローニ事後検定を使用したＧｒａｐＰａｄＰｒｓｉｍソフトウェアを用いて実施した。
【0103】
結果
ペプチド修飾の理論的根拠
ＰＩＰ２５０は、ＰＰ１とＭＹＰＴ１との相互作用を阻害するように設計された。ＭＹＰＴ１上のＰＰ１結合モチーフ、３５ＫＶＫＦ３８、および隣接するアミノ酸を基にして設計された。結合モチーフは保持されたままに、隣接する負に荷電したアスパラギン酸残基を正に荷電したアルギニン残基に置換して、ペプチドを細胞浸透性ペプチドに類似させた［２３］。Ｌ－アミノ酸の配列を逆にしてＤ－アミノ酸に置換する戦略（すなわちレトロインバーソ）を使用して、側鎖の順序と配向を維持しながらペプチドの安定性を高めた。レトロインバーソ配列への置換は、ＰＰ１との相互作用に関与すると予想されるアミノ酸を基に行われた。例えば、ＭＹＰＴ１上のＰｈｅ－３８とＶａｌ－３６は、結合時にＰＰ１上の疎水性ポケットと会合する。これらの残基はＰＰ１上のＰｈｅ－Ｐ３およびＶａｌ－Ｐ５と類似しており、本研究の焦点である。フェニルアラニンとバリンは疎水性の側鎖を持つアミノ酸である。この性質が、これらのアミノ酸がＰＰ１の疎水性ポケットに結合することに関与していることがある。この仮説を検証するために、負に荷電したアスパラギン酸を使用して、ペプチドＰＩＰ２５３とＰＩＰ２５４のＰｈｅ－Ｐ３またはＶａｌ－Ｐ５をそれぞれ置換した。これらのアミノ酸が疎水性だけでなく特異的に必要とされているかどうかを評価するために、アラニンも使用してペプチドＰＩＰ２５１とＰＩＰ２５２のＰｈｅ－Ｐ３またはＶａｌ－Ｐ５をそれぞれ置換した（表１）。
ペプチド修飾の理論的根拠
ＰＩＰ２５０は、ＰＰ１とＭＹＰＴ１との相互作用を阻害するように設計された。ＭＹＰＴ１上のＰＰ１結合モチーフ、３５ＫＶＫＦ３８、および隣接するアミノ酸を基にして設計された。結合モチーフは保持されたままに、隣接する負に荷電したアスパラギン酸残基を正に荷電したアルギニン残基に置換して、ペプチドを細胞浸透性ペプチドに類似させた［２３］。Ｌ－アミノ酸の配列を逆にしてＤ－アミノ酸に置換する戦略（すなわちレトロインバーソ）を使用して、側鎖の順序と配向を維持しながらペプチドの安定性を高めた。レトロインバーソ配列への置換は、ＰＰ１との相互作用に関与すると予想されるアミノ酸を基に行われた。例えば、ＭＹＰＴ１上のＰｈｅ－３８とＶａｌ－３６は、結合時にＰＰ１上の疎水性ポケットと会合する。これらの残基はＰＰ１上のＰｈｅ－Ｐ３およびＶａｌ－Ｐ５と類似しており、本研究の焦点である。フェニルアラニンとバリンは疎水性の側鎖を持つアミノ酸である。この性質が、これらのアミノ酸がＰＰ１の疎水性ポケットに結合することに関与していることがある。この仮説を検証するために、負に荷電したアスパラギン酸を使用して、ペプチドＰＩＰ２５３とＰＩＰ２５４のＰｈｅ－Ｐ３またはＶａｌ－Ｐ５をそれぞれ置換した。これらのアミノ酸が疎水性だけでなく特異的に必要とされているかどうかを評価するために、アラニンも使用してペプチドＰＩＰ２５１とＰＩＰ２５２のＰｈｅ－Ｐ３またはＶａｌ－Ｐ５をそれぞれ置換した（表１）。
【0104】
【表2】
【0105】
ＴＥＥＲに及ぼすＰｈｅ－Ｐ３またはＶａｌ－Ｐ５修飾の影響
いずれの場合も、これらのペプチドは５ｍＭでコンフルエントな分極Ｃａｃｏ－２単層の頂部表面に適用して試験した。Ｐｈｅ－Ｐ３をアラニンに置換したＰＩＰ２５１では、ＴＥＥＲを６２．７％に低下させたが、ＰＩＰ２５０で見られたＴＥＥＲに対する効果よりもわずかに小さいが、有意差はなかった（図１Ａ）。一方、Ｐｈｅ－Ｐ３をグルタミン酸に置換したＰＩＰ２５３では、ＴＥＥＲはベースラインの８８％に低下し、ＰＩＰ２５０とは統計的に異なる結果となった（図１Ａ）。Ｖａｌ－Ｐ５のアラニン残基での置換（ＰＩＰ２５２）は、ＴＥＥＲがベースラインの６６％に低下し、元のＰＩＰ２５０と同様の結果を示したが、Ｖａｌ－Ｐ５のアスパラギン酸での置換（ＰＩＰ２５４）は、ＴＥＥＲがベースラインの８５％にしか低下しないペプチドとなった（図１Ｂ）。
いずれの場合も、これらのペプチドは５ｍＭでコンフルエントな分極Ｃａｃｏ－２単層の頂部表面に適用して試験した。Ｐｈｅ－Ｐ３をアラニンに置換したＰＩＰ２５１では、ＴＥＥＲを６２．７％に低下させたが、ＰＩＰ２５０で見られたＴＥＥＲに対する効果よりもわずかに小さいが、有意差はなかった（図１Ａ）。一方、Ｐｈｅ－Ｐ３をグルタミン酸に置換したＰＩＰ２５３では、ＴＥＥＲはベースラインの８８％に低下し、ＰＩＰ２５０とは統計的に異なる結果となった（図１Ａ）。Ｖａｌ－Ｐ５のアラニン残基での置換（ＰＩＰ２５２）は、ＴＥＥＲがベースラインの６６％に低下し、元のＰＩＰ２５０と同様の結果を示したが、Ｖａｌ－Ｐ５のアスパラギン酸での置換（ＰＩＰ２５４）は、ＴＥＥＲがベースラインの８５％にしか低下しないペプチドとなった（図１Ｂ）。
【0106】
Ｐｈｅ３またはＶａｌ５の変化が透過性とｐＭＬＣレベルに及ぼす影響
ＰＩＰ２５０～２５４シリーズによって誘導されるＴＥＥＲの変化が傍細胞溶質の移動に及ぼす影響を評価するために、Ｃａｃｏ－２細胞単層を通過する４ｋＤａ蛍光デキストランの見かけの透過性（ＰＡＰＰ）を測定した（図２Ａ）。未処置のＣａｃｏ－２単層のＰＡＰＰは０．６０×１０－５ｃｍ／ｓであった。ＰＩＰ２５０を頂部に適用すると、ＰＡＰＰは１．６５×１０－５ｃｍ／ｓに増加した。ＰＩＰ２５１はＰＡＰＰを１．６８×１０－５ｃｍ／ｓに、ＰＩＰ２５２は１．４７×１０－５ｃｍ／ｓに増加させた。ＰＩＰ２５３適用後のＰＡＰＰは０．８７×１０－５ｃｍ／ｓであり、ＰＩＰ２５４適用後は０．５１×１０－５ｃｍ／ｓであった。対応のない両側ｔ検定により、ＰＩＰ２５０（ｐ＝０．００６）、ＰＩＰ２５１（ｐ＝０．００６）、ＰＩＰ２５２（ｐ＝０．００５）の効果は未処置の対照と著しく異なり、ＰＩＰ２５３とＰＩＰ２５４は対照との有意差を示さないことが示された。
ＰＩＰ２５０～２５４シリーズによって誘導されるＴＥＥＲの変化が傍細胞溶質の移動に及ぼす影響を評価するために、Ｃａｃｏ－２細胞単層を通過する４ｋＤａ蛍光デキストランの見かけの透過性（ＰＡＰＰ）を測定した（図２Ａ）。未処置のＣａｃｏ－２単層のＰＡＰＰは０．６０×１０－５ｃｍ／ｓであった。ＰＩＰ２５０を頂部に適用すると、ＰＡＰＰは１．６５×１０－５ｃｍ／ｓに増加した。ＰＩＰ２５１はＰＡＰＰを１．６８×１０－５ｃｍ／ｓに、ＰＩＰ２５２は１．４７×１０－５ｃｍ／ｓに増加させた。ＰＩＰ２５３適用後のＰＡＰＰは０．８７×１０－５ｃｍ／ｓであり、ＰＩＰ２５４適用後は０．５１×１０－５ｃｍ／ｓであった。対応のない両側ｔ検定により、ＰＩＰ２５０（ｐ＝０．００６）、ＰＩＰ２５１（ｐ＝０．００６）、ＰＩＰ２５２（ｐ＝０．００５）の効果は未処置の対照と著しく異なり、ＰＩＰ２５３とＰＩＰ２５４は対照との有意差を示さないことが示された。
【0107】
Ｃａｃｏ－２単層にＰＩＰ２５０を適用した後、ＭＬＣに対するｐＭＬＣの比は、同じ処置をした未処置（対照）単層と比較して、著しく増加した（図２Ｂ）。ＰＩＰ２５１およびＰＩＰ２５２処置もまた、ＭＬＣに対するｐＭＬＣの比を増加させたが、その程度は親ＰＩＰ２５０よりも小さかった。ＰＩＰ２５３とＰＩＰ２５４はＭＬＣに対するｐＭＬＣの比を著しく増加させなかった。
【0108】
洗い流し後の回復は、Ｐｈｅ３またはＶａｌ５の変化に影響される
Ｃａｃｏ－２単層を５ｍＭのＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１、またはＰＩＰ２５２で１８０分間処置し、次いで洗い流し後のＴＥＥＲの回復をモニターした（図３Ａ）。ＰＩＰ２５０で処置したＣａｃｏ－２単層は、洗い流し時に最初のＴＥＥＲ値の約５０％であり、洗い流し後のＴＥＥＲレベルは、洗い流し後９０分までに回復することができなかった。具体的には、ＰＩＰ２５０では、ＴＥＥＲは最初のベースラインの４９％であり、洗浄後９０分では５４％であった。比較すると、ＰＩＰ２５１はＴＥＥＲをベースラインの５８％まで低下させ、９０分後には９４％まで回復させた。この時点では、もはやベースラインとの統計的な差はなかった。ＰＩＰ２５２はＴＥＥＲをベースラインの５５％まで低下させ、洗い流し９０分後にはベースラインの７０％までわずかに回復したが、ベースラインとの統計的な差は残っていた。さらに、ＰＩＰ２５０ペプチドの洗い流しから９０分後のＣａｃｏ－２単層を通過する４ｋＤａ蛍光デキストランのＰＡＰＰを調べ、ＰＩＰ２５１およびＰＩＰ２５２のものと比較した（図３Ｂ）。対照ウェルのＰＡＰＰは０．０５×１０－６ｃｍ／ｓであった。ＰＩＰ２５０およびＰＩＰ２５２ウェルのＰＡＰＰはそれぞれ０．２１および０．１９×１０－６ｃｍ／ｓで、依然として対照とは統計的に異なっていた。しかし、ＰＩＰ２５１ウェルのＰＡＰＰは、０．０７×１０－６ｃｍ／ｓで対照との統計的な差はなかった。修飾されたＰＡＰＰおよびＴＥＥＲのこれらの結果は、ＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１、ＰＩＰ２５２はＴＥＥＲを同程度に低下させ、傍細胞透過性を高めるが、ＰＩＰ２５１の作用はより迅速に可逆的であることが示唆された。
Ｃａｃｏ－２単層を５ｍＭのＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１、またはＰＩＰ２５２で１８０分間処置し、次いで洗い流し後のＴＥＥＲの回復をモニターした（図３Ａ）。ＰＩＰ２５０で処置したＣａｃｏ－２単層は、洗い流し時に最初のＴＥＥＲ値の約５０％であり、洗い流し後のＴＥＥＲレベルは、洗い流し後９０分までに回復することができなかった。具体的には、ＰＩＰ２５０では、ＴＥＥＲは最初のベースラインの４９％であり、洗浄後９０分では５４％であった。比較すると、ＰＩＰ２５１はＴＥＥＲをベースラインの５８％まで低下させ、９０分後には９４％まで回復させた。この時点では、もはやベースラインとの統計的な差はなかった。ＰＩＰ２５２はＴＥＥＲをベースラインの５５％まで低下させ、洗い流し９０分後にはベースラインの７０％までわずかに回復したが、ベースラインとの統計的な差は残っていた。さらに、ＰＩＰ２５０ペプチドの洗い流しから９０分後のＣａｃｏ－２単層を通過する４ｋＤａ蛍光デキストランのＰＡＰＰを調べ、ＰＩＰ２５１およびＰＩＰ２５２のものと比較した（図３Ｂ）。対照ウェルのＰＡＰＰは０．０５×１０－６ｃｍ／ｓであった。ＰＩＰ２５０およびＰＩＰ２５２ウェルのＰＡＰＰはそれぞれ０．２１および０．１９×１０－６ｃｍ／ｓで、依然として対照とは統計的に異なっていた。しかし、ＰＩＰ２５１ウェルのＰＡＰＰは、０．０７×１０－６ｃｍ／ｓで対照との統計的な差はなかった。修飾されたＰＡＰＰおよびＴＥＥＲのこれらの結果は、ＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１、ＰＩＰ２５２はＴＥＥＲを同程度に低下させ、傍細胞透過性を高めるが、ＰＩＰ２５１の作用はより迅速に可逆的であることが示唆された。
【0109】
ｉｎ ｖｉｖｏにおけるゲンタマイシンの吸収促進
ゲンタマイシンは、経口バイオアベイラビリティが低い、４７８Ｄａの水溶性抗生物質である。実際、ゲンタマイシンを単独でラットの空腸に腔内注入（ＩＬＩ）しても、血清中レベルは検出されなかった（データは示していない）。ゲンタマイシンとＰＩＰペプチドであるＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１、ＰＩＰ２５２をＩＬＩで同時投与すると、いずれもゲンタマイシンの血清濃度が上昇し、ＴＭＡＸは約４５分であった（図４）。ゲンタマイシンＣＭＡＸはＰＩＰ２５０との共注入後に３．７９μｇ／ｍＬ、ＰＩＰ２５１との共注入後に１．６３μｇ／ｍＬ、ＰＩＰ２５２との共注入後に３．６２μｇ／ｍＬであった。
ゲンタマイシンは、経口バイオアベイラビリティが低い、４７８Ｄａの水溶性抗生物質である。実際、ゲンタマイシンを単独でラットの空腸に腔内注入（ＩＬＩ）しても、血清中レベルは検出されなかった（データは示していない）。ゲンタマイシンとＰＩＰペプチドであるＰＩＰ２５０、ＰＩＰ２５１、ＰＩＰ２５２をＩＬＩで同時投与すると、いずれもゲンタマイシンの血清濃度が上昇し、ＴＭＡＸは約４５分であった（図４）。ゲンタマイシンＣＭＡＸはＰＩＰ２５０との共注入後に３．７９μｇ／ｍＬ、ＰＩＰ２５１との共注入後に１．６３μｇ／ｍＬ、ＰＩＰ２５２との共注入後に３．６２μｇ／ｍＬであった。
【0110】
ＰＩＰペプチド注入に続く遅延注入後のゲンタマイシンの吸収
ＰＩＰ２５０およびＰＩＰ２５２と比較して、ＰＩＰ２５１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの休薬後は上皮の隔壁特性がより迅速に回復したので、ＰＩＰペプチドの３０分後または６０分後に腔内注入した場合のゲンタマイシンの吸収の程度を、共注入と比較して、これらのペプチドの作用の持続性をｉｎ ｖｉｖｏで調べる一連の研究が行われた。まず、薬物動態プロファイルから算出した全体のＡＵＣ値を比較のために示す（図５Ａ）。ＰＩＰ２５０とゲンタマイシンを共注入した場合、ＡＵＣは１５５μｇ／ｍＬ・分となり、ＰＩＰ２５０の３０分後または６０分後にゲンタマイシンを注入した場合は、それぞれ５８４μｇ／ｍＬ・分と６８．６μｇ／ｍＬ・分となった。ＰＩＰ２５１とゲンタマイシンを共注入した場合のＡＵＣは９７．７μｇ／ｍＬ・分となり、ＰＩＰ２５１の３０分後にゲンタマイシンを注入した場合は３２．９μｇ／ｍＬ・分となった。ＰＩＰ２５２とゲンタマイシンを共注入した場合のＡＵＣは１２７．４μｇ／ｍＬ・分となり、ＰＩＰ２５２の３０分後にゲンタマイシンを注入した場合は８．６μｇ／ｍＬ・分となった。ＰＩＰ２５０の３０分後に注入した場合、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは１０．０３μｇ／ｍＬであり、共注入後の３．７９μｇ／ｍＬと比較してより高濃度になった（図５Ｂ）。ＰＩＰ２５０の６０分後に注入すると、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは１．４６μｇ／ｍＬに減少する。ＰＩＰ２５１の３０分後に注入した場合、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは０．６４μｇ／ｍＬであり、共注入後の１．６３μｇ／ｍＬと比較してより低濃度になった（図５Ｃ）。ＰＩＰ２５２の３０分後に注入した場合、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは０．１９μｇ／ｍＬであり、共注入後の３．７９μｇ／ｍＬと比較してより低濃度になった（図５Ｄ）。
ＰＩＰ２５０およびＰＩＰ２５２と比較して、ＰＩＰ２５１のｉｎ ｖｉｔｒｏでの休薬後は上皮の隔壁特性がより迅速に回復したので、ＰＩＰペプチドの３０分後または６０分後に腔内注入した場合のゲンタマイシンの吸収の程度を、共注入と比較して、これらのペプチドの作用の持続性をｉｎ ｖｉｖｏで調べる一連の研究が行われた。まず、薬物動態プロファイルから算出した全体のＡＵＣ値を比較のために示す（図５Ａ）。ＰＩＰ２５０とゲンタマイシンを共注入した場合、ＡＵＣは１５５μｇ／ｍＬ・分となり、ＰＩＰ２５０の３０分後または６０分後にゲンタマイシンを注入した場合は、それぞれ５８４μｇ／ｍＬ・分と６８．６μｇ／ｍＬ・分となった。ＰＩＰ２５１とゲンタマイシンを共注入した場合のＡＵＣは９７．７μｇ／ｍＬ・分となり、ＰＩＰ２５１の３０分後にゲンタマイシンを注入した場合は３２．９μｇ／ｍＬ・分となった。ＰＩＰ２５２とゲンタマイシンを共注入した場合のＡＵＣは１２７．４μｇ／ｍＬ・分となり、ＰＩＰ２５２の３０分後にゲンタマイシンを注入した場合は８．６μｇ／ｍＬ・分となった。ＰＩＰ２５０の３０分後に注入した場合、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは１０．０３μｇ／ｍＬであり、共注入後の３．７９μｇ／ｍＬと比較してより高濃度になった（図５Ｂ）。ＰＩＰ２５０の６０分後に注入すると、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは１．４６μｇ／ｍＬに減少する。ＰＩＰ２５１の３０分後に注入した場合、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは０．６４μｇ／ｍＬであり、共注入後の１．６３μｇ／ｍＬと比較してより低濃度になった（図５Ｃ）。ＰＩＰ２５２の３０分後に注入した場合、ゲンタマイシンのＣＭＡＸは０．１９μｇ／ｍＬであり、共注入後の３．７９μｇ／ｍＬと比較してより低濃度になった（図５Ｄ）。
【0111】
タイトジャンクションタンパク質レベルの変化
分極Ｃａｃｏ－２単層をＰＩＰ２５０またはＰＩＰ２５２で９０分間処置すると、オクルディンのレベルはそれぞれ対照レベルの６５．８％と６１．４％に著しく低下した。ＰＩＰ２５１処置では、オクルディンは対照の８４．１％まで低下したが、これは統計学的に有意ではなかった。
分極Ｃａｃｏ－２単層をＰＩＰ２５０またはＰＩＰ２５２で９０分間処置すると、オクルディンのレベルはそれぞれ対照レベルの６５．８％と６１．４％に著しく低下した。ＰＩＰ２５１処置では、オクルディンは対照の８４．１％まで低下したが、これは統計学的に有意ではなかった。
【0112】
プロテインホスファターゼ１へのペプチドの結合
ペプチドＰＩＰ２５０はＰＰ１に結合し、その結果ＭＹＰＴ１とＰＰ１がＭＬＣＰを形成する際の結合を阻害するように設計された。ＰＩＰ２５０がＰＰ１と結合することを確認し、結合親和性に対する単一のアミノ酸修飾の影響を評価するために、ペプチド／タンパク質相互作用の結合曲線アッセイを行った。Ｈｉｓタグ付きＰＰ１をニッケルコートしたプレートに固定化し、ビオチン化ペプチドとインキュベートし、蛍光ラベルしたストレプトアビジンで検出した。ＰＰ１に結合するペプチドの結合曲線を図７に示す。ＰＩＰ２５０は計算上のＫＤが６１０μＭでＰＰ１に結合した。バリンまたはフェニルアラニンの置換は、結合を完全に失うことなく、結合親和性を低下させた。ＰＩＰ２５１（Ｐｈｅ→Ａｌａ）とＰＩＰ２５２（Ｖａｌ→Ａｌａ）の計算上のＫＤ値はそれぞれ１２８２と７２４μＭであった。ＭＹＰＴ１～２９９のＰＰ１への結合も同じアッセイで評価され、ＫＤは４９ｎＭと著しく高い結合親和性を有していた。
ペプチドＰＩＰ２５０はＰＰ１に結合し、その結果ＭＹＰＴ１とＰＰ１がＭＬＣＰを形成する際の結合を阻害するように設計された。ＰＩＰ２５０がＰＰ１と結合することを確認し、結合親和性に対する単一のアミノ酸修飾の影響を評価するために、ペプチド／タンパク質相互作用の結合曲線アッセイを行った。Ｈｉｓタグ付きＰＰ１をニッケルコートしたプレートに固定化し、ビオチン化ペプチドとインキュベートし、蛍光ラベルしたストレプトアビジンで検出した。ＰＰ１に結合するペプチドの結合曲線を図７に示す。ＰＩＰ２５０は計算上のＫＤが６１０μＭでＰＰ１に結合した。バリンまたはフェニルアラニンの置換は、結合を完全に失うことなく、結合親和性を低下させた。ＰＩＰ２５１（Ｐｈｅ→Ａｌａ）とＰＩＰ２５２（Ｖａｌ→Ａｌａ）の計算上のＫＤ値はそれぞれ１２８２と７２４μＭであった。ＭＹＰＴ１～２９９のＰＰ１への結合も同じアッセイで評価され、ＫＤは４９ｎＭと著しく高い結合親和性を有していた。
【0113】
ＰＰ１へのペプチドの結合がＭＹＰＴ１の結合を阻害するのに十分であるかどうかを評価するため、ＭＹＰＴ１／ＰＰ１結合アッセイを、ＰＩＰペプチドの濃度を増大させながら繰り返した。ペプチドによるＭＹＰＴ１結合の阻害を図８に示す。ＰＩＰ２５０は、ＭＹＰＴ１のＰＰ１への結合を用量依存的に阻害した。ＰＩＰ２５０のＫｉは１５５μＭと算出された。
【0114】
【表3】
【0115】
考察
ＰＩＰ２５０を用いた実験の結果は、このペプチドに関する以前のデータ［２０］と一致する。データはまた、重要なアミノ酸残基の置換が、ＭＬＣのリン酸化状態を変化させ、Ｃａｃｏ－２単層の透過性を増大するというペプチドの活性に影響を与えることを示す。Ｐｈｅ３とＶａｌ５の両方がペプチド活性に重要であるように思われる。これらの疎水性アミノ酸のいずれかを、荷電した親水性側鎖を持つアミノ酸に置換すると、単層とｐＭＬＣに対するペプチドの効果を妨げる。しかし、これらの残基を別の疎水性残基に置換すると、ペプチドの単層への作用には、わずかな影響があるかまたはほとんどなく、ペプチドのｐＭＬＣの増加もわずかに低下する。このことから、これらの残基の疎水性がＭＬＣＰとの会合に重要な因子であることが示唆される。
ＰＩＰ２５０を用いた実験の結果は、このペプチドに関する以前のデータ［２０］と一致する。データはまた、重要なアミノ酸残基の置換が、ＭＬＣのリン酸化状態を変化させ、Ｃａｃｏ－２単層の透過性を増大するというペプチドの活性に影響を与えることを示す。Ｐｈｅ３とＶａｌ５の両方がペプチド活性に重要であるように思われる。これらの疎水性アミノ酸のいずれかを、荷電した親水性側鎖を持つアミノ酸に置換すると、単層とｐＭＬＣに対するペプチドの効果を妨げる。しかし、これらの残基を別の疎水性残基に置換すると、ペプチドの単層への作用には、わずかな影響があるかまたはほとんどなく、ペプチドのｐＭＬＣの増加もわずかに低下する。このことから、これらの残基の疎水性がＭＬＣＰとの会合に重要な因子であることが示唆される。
【0116】
アミノ酸を変えて疎水性を保持したＰＩＰ２５１とＰＩＰ２５２は、Ｃａｃｏ－２透過性に対して同様の効果を示すが、ＭＬＣリン酸化に対する効果はわずかに低下した。このことから、ペプチドがＭＬＣＰを阻害するためには疎水性側鎖があれば十分であるが、その効果が若干低下していることが示唆される。ｐＭＬＣの増加が低いことはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＰＩＰ媒介性の透過性に大きな影響を与えないようである。しかしながら、フェニルアラニンをアラニンに置換すると、ペプチドを洗い流した後の単層膜の回復速度が著しく増加するように見え、結合親和性が弱くなることが示唆された。洗い流してから１時間後、ＰＩＰ２５０で処置した単層は、対照と比較してＰＡＰＰが著しく増加し、ＴＥＥＲが低下していることが依然として示された。一方、ＰＩＰ２５１で処置した単層は、対照と同程度のＰＡＰＰとＴＥＥＲに回復していた。また、ＰＩＰ２５２を洗い流すとＴＥＥＲがいくらか回復したが、これはＰＡＰＰの減少には対応しなかった。３種類のペプチドは全てＭＬＣＰと同様の方法で相互作用するが、ＰＩＰ２５０の方が酵素との相互作用が強く、洗い流した後もより長く会合しているという可能性がある。ＰＩＰ２５１とＭＬＣＰの相互作用が弱ければ弱いほど、より迅速に解離し、ベースラインの生理状態に早く戻ることができる可能性がある。この結果から、ＰＩＰ２５２は洗い流し後の解離という点では、ＰＩＰ２５０とＰＩＰ２５１との間のどこかにあることが示唆される。実際、ペプチドとＰＰ１との結合アッセイから得られたデータはこの仮説を支持する。それぞれのペプチドはＰＰ１に結合し、ＰＩＰ２５０が最も親和性が高く、次にＰＩＰ２５２、次いでＰＩＰ２５１の順に結合する。最も重要なことは、ペプチドはＭＹＰＴ１の最初の２９９アミノ酸断片のＰＰ１への結合を阻害することができることである。再度、ＰＩＰ２５０がこの相互作用を阻害する上で最も有効であり、ＰＩＰ２５２はＰＩＰ２５１よりも有効であった。これらのペプチドの設計の理論的根拠は、ＭＹＰＴ１がＰＰ１に結合してＭＬＣＰを形成するのをこれらのペプチドが阻害することであり、したがって、ペプチドがＭＹＰＴ１を置換する能力がその作用の鍵であることである。低い効能でＭＹＰＴ１をＰＰ１から置換することで、修飾ペプチドＰＩＰ２５２とＰＩＰ２５１はより一過性の効果をもつ場合があるようである。
【0117】
ｉｎ ｖｉｖｏで試験した場合、ＰＩＰ２５０は、空腸への共注入後にゲンタマイシンの血中への送達を促進した。ＰＩＰ２５１は、ゲンタマイシンの送達も促進したが、一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータは、ＰＩＰ２５１の効果はＰＩＰ２５０に比べてほとんど減少していないことを示し、ｉｎ ｖｉｖｏでは、ゲンタマイシンのレベルはＡＵＣが９０．５μｇ／ｍＬ・分で、ＰＩＰ２５０の１５５μｇ／ｍＬ・分に比べ明らかに低い。ＰＩＰ２５０よりも低いものの、ＰＩＰ２５１を媒介性のゲンタマイシンの吸収は皮下投与のゲンタマイシンとよく比較される。ＰＩＰ２５２とゲンタマイシンの共注入はＰＩＰ２５１よりも多くのゲンタマイシンを送達し、ＡＵＣは１２７．４μｇ／ｍＬ・分となった。このＡＵＣと投与されたゲンタマイシンの用量を用いて、相対的バイオアベイラビリティ（ＦＲＥＬ）は以下の式：
ＦＲＥＬ＝（（ＡＵＣＩＬＩ×ＤＳＣ）／（ＡＵＣＳＣ×ＤＩＬＩ））×１００
で算出することができる。
ＦＲＥＬ＝（（ＡＵＣＩＬＩ×ＤＳＣ）／（ＡＵＣＳＣ×ＤＩＬＩ））×１００
で算出することができる。
【0118】
これにより、ＦＲＥＬは、ＰＩＰ２５０が３６．５％、ＰＩＰ２５１が２１．３％、ＰＩＰ２５２が３１．０％となる。
３０分後、ゲンタマイシンの血清濃度はｉｎ ｖｉｖｏで試験した３つのペプチドの全てで同様であり、いずれもゲンタマイシンの中程度の上昇を示す。次いで、３０分から４５分の間に、ゲンタマイシンとＰＩＰ２５０またはＰＩＰ２５２を注入した動物では急激な濃度の上昇が見られるが、ＰＩＰ２５１では見られない。このことは、ＰＩＰ２５０とＰＩＰ２５２によって誘導される透過性の上昇には２段階あり、ＰＩＰ２５１では第２段階が存在しないことを示唆する。このことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのオクルディンレベルに対するペプチドの影響と相関している。ＰＩＰ２５０とＰＩＰ２５２は処置後、ｃａｃｏ－２細胞で検出されるオクルディン量を著しく低下させる。ＰＩＰ２５１はそれほどでもないが、オクルディンを低下させるようである。これは、オクルディンの下方制御が原因で、ＰＩＰ２５０とＰＩＰ２５２によりゲンタマイシン濃度がより上昇する可能性があることを示唆する。ＰＩＰ２５１とＰＩＰ２５２はｐＭＬＣに同程度の効果を示すが、オクルディンレベルには有意差があることから、副次的な作用機序が関与していることが示唆される。
３０分後、ゲンタマイシンの血清濃度はｉｎ ｖｉｖｏで試験した３つのペプチドの全てで同様であり、いずれもゲンタマイシンの中程度の上昇を示す。次いで、３０分から４５分の間に、ゲンタマイシンとＰＩＰ２５０またはＰＩＰ２５２を注入した動物では急激な濃度の上昇が見られるが、ＰＩＰ２５１では見られない。このことは、ＰＩＰ２５０とＰＩＰ２５２によって誘導される透過性の上昇には２段階あり、ＰＩＰ２５１では第２段階が存在しないことを示唆する。このことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのオクルディンレベルに対するペプチドの影響と相関している。ＰＩＰ２５０とＰＩＰ２５２は処置後、ｃａｃｏ－２細胞で検出されるオクルディン量を著しく低下させる。ＰＩＰ２５１はそれほどでもないが、オクルディンを低下させるようである。これは、オクルディンの下方制御が原因で、ＰＩＰ２５０とＰＩＰ２５２によりゲンタマイシン濃度がより上昇する可能性があることを示唆する。ＰＩＰ２５１とＰＩＰ２５２はｐＭＬＣに同程度の効果を示すが、オクルディンレベルには有意差があることから、副次的な作用機序が関与していることが示唆される。
【0119】
ＰＩＰ２５０とゲンタマイシンの注入の間に３０分の遅延があった後でも、血中のゲンタマイシンの量は共注入の場合より著しく多い。このことは、ＰＩＰ２５０が持つ効果は３０分後にも増大していることを示唆する。ＰＩＰ２５１とゲンタマイシンの遅延時間が同じ場合、血中のゲンタマイシンの量は共注入と比較して少なくなっている。ＰＩＰ２５０とゲンタマイシンの注入の間に６０分の遅延があった後でも、３０分の遅延のＰＩＰ２５１よりも高いゲンタマイシンの吸収がある。これらのデータは、ＰＩＰ２５０がＰＩＰ２５１およびＰＩＰ２５２よりも注入後長い時間効果を発揮していることを示唆しており、ＰＩＰ２５０と比較してＰＩＰ２５１およびＰＩＰ２５２の回復プロファイルが改善されていることを示すｉｎ ｖｉｔｒｏのデータと一致している。興味深いことに、ＰＩＰ２５２はｉｎ ｖｉｔｒｏでは部分的な回復しか示さなかったが、ｉｎ ｖｉｖｏでは最も良好な回復を示した。
【0120】
臨床的に使用するためには、透過強化剤は生理的状態に確実に戻る一過性の作用が必要であり、したがって透過性の増加は、上皮の完全性に長期的または持続的な影響を与えることなく、薬物送達の時間に限定される。本データは、ＰＩＰ２５１とＰＩＰ２５２がゲンタマイシンの吸収を促進することを示唆している。ＰＩＰ２５１はＰＩＰ２５０よりもかなり効果が低いように見えるが、静止状態への回復時間が短い。ＰＩＰ２５２はＰＩＰ２５０と同程度にゲンタマイシンの送達を促進するが、３０分後の回復が改善されており、したがってＰＩＰ２５１より若干優れているようである。
【0121】
総合すると、これらのデータは、ＰＩＰ２５２はＰＩＰ２５０と同様の透過性強化のプロファイルを持つが、回復時間が著しく優れていることを示す。このことから、ＰＩＰ２５２はこれまで試験されたペプチドの中で最も有望な一過性透過強化剤の候補となる。
【0122】
上述の説明、特許請求の範囲、または添付図面において、特定の形態や開示した機能を実現するものとして記載された特徴、および開示した結果を得るための方法や手順は、適宜、そのような特徴を分離してまたは組み合わせて、本発明を様々な形態で実現するために利用されてもよい。
【0123】
本発明については、上記した例示的な実施形態と関連付けて記載してきたが、当業者であれば、ここで開示した内容を得た時に、数多くの同様な修正や変形が明らかであろう。したがって、上記にある本発明の例示的な実施形態は、あくまでも例示的なものであり、本発明を限定するものではないものと見なされる。本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、記載した実施形態に多様な変化を行ってよい。
【0124】
誤解を避けるために、本明細書で提供される理論的説明は、読者の理解を向上させる目的で提供されるものである。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも拘束されることを希望しない。
【0125】
本明細書で用いる全ての節の見出しは構成のみを目的としており、記載された対象物を限定するものとみなされるべきではない。
特許請求の範囲を含め、本明細書を通じて、文脈上特に必要とされない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」、ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などの変形形態は、記載の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。
特許請求の範囲を含め、本明細書を通じて、文脈上特に必要とされない限り、単語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｉｎｃｌｕｄｅ」、ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などの変形形態は、記載の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが他の任意の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を排除しないことを意味すると理解されるであろう。
【0126】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないと指示されない限り、複数形の参照対象を含むことに注意しなければならない。範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして本明細書中で表されてもよい。このような範囲を表示する場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または別の特定の値までを含む。同様に、前に「約」を付けて値を近似値として表す場合、その特定の値が別の実施形態を形成すると理解される。数値に関連する「約」という用語は任意であり、例えば±１０％を意味する。
【0127】
参考文献
本発明および本発明が属する技術の状態をより十分に記載し、開示するために、多数の刊行物を上記に引用する。これらの文献の完全な引用は、以下に提供される。これらの各文献の全体は、本明細書に組み込まれる。
1. Anderson, J.M. and C.M. Van Itallie, Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2009. 1(2): p. a002584.
2. Zihni, C., et al., Tight junctions: from simple barriers to multifunctional molecular gates. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2016. 17(9): p. 564-580.
3. Maher, S., R.J. Mrsny, and D.J. Brayden, Intestinal permeation enhancers for oral peptide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 2016. 106: p. 277-319.
4. Wong, V. and B.M. Gumbiner, A synthetic peptide corresponding to the extracellular domain of occludin perturbs the tight junction permeability barrier. Journal of Cell Biology, 1997. 136(2): p. 399-409.
5. Fasano, A., et al., The enterotoxic effect of zonula occludens toxin on rabbit small intestine involves the paracellular pathway.Gastroenterology, 1997. 112(3): p. 839-846.
6. Freedman, J.C., A. Shrestha, and B.A. McClane, Clostridium perfringens Enterotoxin: Action, Genetics, and Translational Applications.Toxins, 2016. 8(3).
7. Krug, S.M., et al., Angubindin-1, a novel paracellular absorption enhancer acting at the tricellular tight junction. Journal of Controlled Release, 2017. 260: p. 1-11.
8. Krug, S.M., et al., Sodium caprate as an enhancer of macromolecule permeation across tricellular tight junctions of intestinal cells. Biomaterials, 2013. 34(1): p. 275-282.
9. Lemmer, H.J.R. and J.H. Hamman, Paracellular drug absorption enhancement through tight junction modulation. Expert Opinion on Drug Delivery, 2013. 10(1): p. 103-114.
10. Kondoh, M. and K. Yagi, Tight junction modulators: Promising candidates for drug delivery. Current Medicinal Chemistry, 2007. 14(23): p. 2482-2488.
11. McCartney, F., J.P. Gleeson, and D.J. Brayden, Safety concerns over the use of intestinal permeation enhancers: A mini-review.Tissue Barriers, 2016. 4(2).
12. Shen, L., et al., Myosin light chain phosphorylation regulates barrier function by remodeling tight junction structure. J Cell Sci, 2006. 119(Pt 10): p. 2095-106.
13. Turner, J.R., et al., Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with myosin light-chain phosphorylation. Am J Physiol, 1997. 273(4): p. C1378-85.
14. Cunningham, K.E. and J.R. Turner, Myosin light chain kinase: pulling the strings of epithelial tight junction function. Ann N Y Acad Sci, 2012. 1258: p. 34-42.
15. Terrak, M., et al., Structural basis of protein phosphatase 1 regulation. Nature, 2004. 429(6993): p. 780-4.
16. Eto, M., Regulation of Cellular Protein Phosphatase-1 (PP1) by Phosphorylation of the CPI-17 Family, C-kinase-activated PP1 Inhibitors. Journal of Biological Chemistry, 2009. 284(51): p. 35273-35277.
17. Pinheiro, A.S., et al., Structural signature of the MYPT1-PP1 interaction. J Am Chem Soc, 2011. 133(1): p. 73-80.
18. Tanaka, J., et al., Interaction of myosin phosphatase target subunit 1 with the catalytic subunit of type 1 protein phosphatase.Biochemistry, 1998. 37(47): p. 16697-16703.
19. Toth, A., et al., Study of the subunit interactions in myosin phosphatase by surface plasmon resonance. Eur J Biochem, 2000. 267(6): p. 1687-97.
20. Taverner, A., et al., Enhanced paracellular transport of insulin can be achieved via transient induction of myosin light chain phosphorylation. Journal of Controlled Release, 2015. 210: p. 189-197.
21. Almansour, K., et al., Mechanistic studies of a cell-permeant peptide designed to enhance myosin light chain phosphorylation in polarized intestinal epithelia. J Control Release, 2018. 279: p. 208-219.
22. Almansour, K., et al., An intestinal paracellular pathway biased toward positively-charged macromolecules. J Control Release, 2018. 288: p. 111-125.
23. Kristensen, M. and H.M. Nielsen, Cell-Penetrating Peptides as Carriers for Oral Delivery of Biopharmaceuticals. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2016. 118(2): p. 99-106.
標準的な分子生物学的手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、を参照されたい。
本発明および本発明が属する技術の状態をより十分に記載し、開示するために、多数の刊行物を上記に引用する。これらの文献の完全な引用は、以下に提供される。これらの各文献の全体は、本明細書に組み込まれる。
1. Anderson, J.M. and C.M. Van Itallie, Physiology and function of the tight junction. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2009. 1(2): p. a002584.
2. Zihni, C., et al., Tight junctions: from simple barriers to multifunctional molecular gates. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2016. 17(9): p. 564-580.
3. Maher, S., R.J. Mrsny, and D.J. Brayden, Intestinal permeation enhancers for oral peptide delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, 2016. 106: p. 277-319.
4. Wong, V. and B.M. Gumbiner, A synthetic peptide corresponding to the extracellular domain of occludin perturbs the tight junction permeability barrier. Journal of Cell Biology, 1997. 136(2): p. 399-409.
5. Fasano, A., et al., The enterotoxic effect of zonula occludens toxin on rabbit small intestine involves the paracellular pathway.Gastroenterology, 1997. 112(3): p. 839-846.
6. Freedman, J.C., A. Shrestha, and B.A. McClane, Clostridium perfringens Enterotoxin: Action, Genetics, and Translational Applications.Toxins, 2016. 8(3).
7. Krug, S.M., et al., Angubindin-1, a novel paracellular absorption enhancer acting at the tricellular tight junction. Journal of Controlled Release, 2017. 260: p. 1-11.
8. Krug, S.M., et al., Sodium caprate as an enhancer of macromolecule permeation across tricellular tight junctions of intestinal cells. Biomaterials, 2013. 34(1): p. 275-282.
9. Lemmer, H.J.R. and J.H. Hamman, Paracellular drug absorption enhancement through tight junction modulation. Expert Opinion on Drug Delivery, 2013. 10(1): p. 103-114.
10. Kondoh, M. and K. Yagi, Tight junction modulators: Promising candidates for drug delivery. Current Medicinal Chemistry, 2007. 14(23): p. 2482-2488.
11. McCartney, F., J.P. Gleeson, and D.J. Brayden, Safety concerns over the use of intestinal permeation enhancers: A mini-review.Tissue Barriers, 2016. 4(2).
12. Shen, L., et al., Myosin light chain phosphorylation regulates barrier function by remodeling tight junction structure. J Cell Sci, 2006. 119(Pt 10): p. 2095-106.
13. Turner, J.R., et al., Physiological regulation of epithelial tight junctions is associated with myosin light-chain phosphorylation. Am J Physiol, 1997. 273(4): p. C1378-85.
14. Cunningham, K.E. and J.R. Turner, Myosin light chain kinase: pulling the strings of epithelial tight junction function. Ann N Y Acad Sci, 2012. 1258: p. 34-42.
15. Terrak, M., et al., Structural basis of protein phosphatase 1 regulation. Nature, 2004. 429(6993): p. 780-4.
16. Eto, M., Regulation of Cellular Protein Phosphatase-1 (PP1) by Phosphorylation of the CPI-17 Family, C-kinase-activated PP1 Inhibitors. Journal of Biological Chemistry, 2009. 284(51): p. 35273-35277.
17. Pinheiro, A.S., et al., Structural signature of the MYPT1-PP1 interaction. J Am Chem Soc, 2011. 133(1): p. 73-80.
18. Tanaka, J., et al., Interaction of myosin phosphatase target subunit 1 with the catalytic subunit of type 1 protein phosphatase.Biochemistry, 1998. 37(47): p. 16697-16703.
19. Toth, A., et al., Study of the subunit interactions in myosin phosphatase by surface plasmon resonance. Eur J Biochem, 2000. 267(6): p. 1687-97.
20. Taverner, A., et al., Enhanced paracellular transport of insulin can be achieved via transient induction of myosin light chain phosphorylation. Journal of Controlled Release, 2015. 210: p. 189-197.
21. Almansour, K., et al., Mechanistic studies of a cell-permeant peptide designed to enhance myosin light chain phosphorylation in polarized intestinal epithelia. J Control Release, 2018. 279: p. 208-219.
22. Almansour, K., et al., An intestinal paracellular pathway biased toward positively-charged macromolecules. J Control Release, 2018. 288: p. 111-125.
23. Kristensen, M. and H.M. Nielsen, Cell-Penetrating Peptides as Carriers for Oral Delivery of Biopharmaceuticals. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2016. 118(2): p. 99-106.
標準的な分子生物学的手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、２００１、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、を参照されたい。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2022-07-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
上皮透過性を増大することができる薬剤であって、長さが１５個以下のアミノ酸のペプチドを含み、前記ペプチドが式Ｉ：ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋ（式Ｉ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列
を含む、薬剤。
【請求項2】
ペプチドが式ＩＩ：ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋ（式ＩＩ）
（式中、
ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、
ｘ５は、Ｄ－Ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択され、ならびに
ｘ３とｘ５の両方がＤ－Ｐｈｅであることはない）
のコア配列
を有する、請求項１に記載の薬剤。
【請求項3】
薬剤が上皮細胞の形質膜を通過することができる、請求項１または請求項２に記載の薬剤。
【請求項4】
ペプチドが、形質膜を横切る通過を媒介することができる１つまたは複数の追加の配列を含む、請求項３に記載の薬剤。
【請求項5】
ペプチドが、コア配列のＮ末端の残基ｒｒ、および／またはコア配列のＣ末端の残基ｋｒｋを含む、請求項４に記載の薬剤。
【請求項6】
ペプチドが、配列：ｒｒ－ｘ３－ｋ－ｘ５－ｋｔｋｋｒｋ
を含むか、またはそれからなり、
式中、
（ｉ）ｘ３は、Ｄ－Ｐｈｅであり、ｘ５は、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択されるか；あるいは
（ｉｉ）ｘ３は、Ｄ－Ａｌａであり、ｘ５は、Ｄ－ｖａｌ、Ｄ－Ａｌａ、Ｄ－ＬｅｕおよびＧｌｙから選択される、
請求項１から５のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項7】
式Ｉのコア配列がａｋｖｋ、ｆｋａｋまたはａｋａｋ、好ましくはａｋｖｋまたはｆｋａｋである、請求項１に記載の薬剤。
【請求項8】
式ＩＩのコア配列がａｋｖｋｔｋ、ｆｋａｋｔｋ、またはａｋａｋｔｋ、好ましくはａｋｖｋｔｋまたはｆｋａｋｔｋである、請求項２に記載の薬剤。
【請求項9】
ペプチドが、配列：ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ
もしくは
ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ
を含む、またはそれからなる、請求項１から８のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項10】
式：Ｒ１－Ｚ－Ｒ２
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、またはトリフルオロアセチルであり、
Ｒ２はＯＨまたはＮＨ２であり、
Ｚは、請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド配列を表す）
を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項11】
Ｈ－ｒｒａｋｖｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
または
Ｈ－ｒｒｆｋａｋｔｋｋｒｋ－ＮＨ２
である、請求項１０に記載の薬剤。
【請求項12】
治療における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項13】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項14】
上皮表面を横切って送達される物質をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
（ｉ）請求項１から１３のいずれか一項に記載の薬剤を含む第１の組成物；および（ｉｉ）上皮表面を横切って送達される物質を含む第２の組成物、
を含む、キット。
【請求項16】
上皮表面の透過性の増大における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬剤または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項17】
上皮表面を横切って物質を送達する方法における使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬剤または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項18】
物質が診断薬または治療薬である、請求項１４、１５または１７のいずれか一項に記載の医薬組成物、キット、または使用のための薬剤。【国際調査報告】