特表 2023-533192 腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-02

(54)【発明の名称】腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させる方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/07 20060101AFI20230726BHJP

   A61K 31/015 20060101ALI20230726BHJP

   A61K 31/59 20060101ALI20230726BHJP

   A61K 31/525 20060101ALI20230726BHJP

   A61K 31/375 20060101ALI20230726BHJP

   A61K 31/197 20060101ALI20230726BHJP

   A61K 31/122 20060101ALI20230726BHJP

   A61K 31/202 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 3/14 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 25/22 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230726BHJP

   A61P 1/12 20060101ALI20230726BHJP

【ＦＩ】

A61K31/07

A61K31/015

A61K31/59

A61K31/525

A61K31/375

A61K31/197

A61K31/122

A61K31/202

A61P25/18

A61P3/14

A61P37/08

A61P25/22

A61P3/04

A61P29/00

A61P11/06

A61P1/04

A61P1/00

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P3/10

A61P25/24

A61P25/14

A61P1/16

A61P25/00

A61P25/28

A61P43/00 121

A61P1/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022578836

(86)(22)【出願日】2021-07-08

(85)【翻訳文提出日】2023-02-07

(86)【国際出願番号】 EP2021068935

(87)【国際公開番号】W WO2022008633

(87)【国際公開日】2022-01-13

(31)【優先権主張番号】20184914.8

(32)【優先日】2020-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】503220392

【氏名又は名称】ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．

【氏名又は名称原語表記】ＤＳＭ ＩＰ ＡＳＳＥＴＳ Ｂ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】Ｈｅｔ Ｏｖｅｒｌｏｏｎ １， ＮＬ－６４１１ ＴＥ Ｈｅｅｒｌｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(72)【発明者】

【氏名】ファム， タン‐ヴァン

(72)【発明者】

【氏名】レーマン， アティークル

(72)【発明者】

【氏名】サイフェルト， ニコール

(72)【発明者】

【氏名】シュタイネール， ロベルト

(72)【発明者】

【氏名】シベスマ， ウィルバート

【テーマコード（参考）】

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA04

4C086BA18

4C086CB09

4C086DA15

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA05

4C086ZA12

4C086ZA16

4C086ZA18

4C086ZA66

4C086ZA70

4C086ZA73

4C086ZA75

4C086ZA96

4C086ZB11

4C086ZB13

4C086ZB15

4C086ZC23

4C086ZC26

4C086ZC28

4C086ZC29

4C086ZC35

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206CA10

4C206CB28

4C206DB09

4C206GA05

4C206GA36

4C206MA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206MA80

4C206NA05

4C206NA14

4C206ZC75

(57)【要約】

様々な疾患を有する人々では、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数が低下している。本発明者らは、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ又はＥＰＡなどのビタミン／ビタミンの組合せの投与が、腸内細菌叢に栄養を直接提供するように大腸に直接投与されるとき、ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の増加をもたらし得ることを見出した。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させる方法であって、菌数を増加させるのに有効な量の、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はＰＵＦＡを動物、好ましくはヒトの大腸に直接投与することを含む方法。

【請求項2】

腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の減少した菌数と関連する疾患又は有害な状態を治療及び又は予防する方法であって、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はＰＵＦＡを、それを必要とする動物、好ましくはヒトの大腸に直接投与することを含む方法。

【請求項3】

前記それを必要とする動物は、過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病からなる群から選択される疾患又は有害な状態を経験している、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はＰＵＦＡの使用において、前記ビタミン又はＰＵＦＡは、動物、好ましくはヒトの大腸に、過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病の群から選択される疾患又は有害な状態を治療又は予防するために直接送達されることを特徴とする使用。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、ビタミン又はビタミンの組合せを動物、好ましくはヒトの腸内細菌叢に直接送達することにより、ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の腸内細菌叢の菌数を増加させる方法に関する。これは、例えば、選択されたビタミン又はＰＵＦＡ、好ましくはβ－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せの遅延放出製剤を使用することによって達成され得る。

【0002】

［発明の背景］
ディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）は、腸内細菌叢に見られる細菌の属名であり、腸内細菌叢に見られるＤ．ニューモシンテス（Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｓｉｎｔｅｓ）、Ｄ．インビサス（Ｄ．ｉｎｖｉｓｕｓ）、Ｄ．ミクラエロフィルス（Ｄ．ｍｉｃｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｄ．ホミニス（Ｄ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｄ．マシリエンシス（Ｄ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｄ．サクシナティフィラス（Ｄ．ｓｕｃｃｉｎａｔｉｐｈｉｌｕｓ）及びＤ．プロピオニシファシエンス（Ｄ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｆａｃｉｅｎｓ）を含む。Ｄ．ニューモシンテス（Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｓｉｎｔｅｓ）は、以前にはバクテリオデス・ニューモシンテス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ ｐｎｅｕｍｏｓｉｎｔｅｓ）として知られていた。

【0003】

研究は、腸内のディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の正常未満の量が、一見無関係に見える様々な病状及び／又は有害な状態と関連していることを示している。これらは、以下を含む：過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病。

【0004】

腸内細菌叢、特に上述の疾患／有害な状態又はこの疾患／有害な状態の１つと関連する症状を経験しているか又は経験する危険性がある個体において、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させる方法を提供することが望ましいであろう。

【0005】

［発明の詳細な説明］
多くの研究は、動物、好ましくはヒトが特定の疾患／有害な状態に罹患すると、その特定の疾患／有害な状態に罹患していない動物中に存在する菌数と比較して、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数が減少することを示している。しかし、これらのいずれの研究も、ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させ、それによりその疾患／有害な状態の症状の少なくとも１つを緩和する方法を示唆していない。本発明に従い、特定のビタミン又は多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）を動物、好ましくはヒトの大腸に直接送達することにより、腸内細菌叢に栄養を提供し、且つディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の定住菌数を増加させ得ることが見出された。したがって、本発明は、腸に直接送達される少なくとも１種のビタミン又はＰＵＦＡを投与することにより、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の正常未満の菌数を特徴とする疾患／有害な状態を予防し、その発症のリスクを低減するか若しくは発症を遅延させ、且つ／又は疾患／有害な状態を治療する方法に関する。

【0006】

本発明に従い、本発明者らは、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ドコヘキサエン酸「ＤＨＡ」、エイコサペンタエン酸「ＥＰＡ」並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択される特定のビタミン及びＰＵＦＡが、腸内細菌叢に提供されるとき、腸内のディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させるのに適していることを見出した。

【0007】

したがって、本発明の一態様は、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させる方法であって、菌数を増加させるのに有効な量の、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はＰＵＦＡを動物、好ましくはヒトの大腸に直接投与することを含む方法である。

【0008】

本発明の他の実施形態は、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の減少した菌数と関連する疾患又は有害な状態の治療及び又は予防であって、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はＰＵＦＡを、それを必要とする動物、好ましくはヒトの大腸に直接投与することを含む治療及び又は予防である。ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の減少した菌数によって特徴付けられる状態又は疾患は、過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病を含む。

【0009】

本発明の他の実施形態は、ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させるのに有効な量の、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はＰＵＦＡと、賦形剤とを含む経口送達用製剤であり、前記形態は、ビタミン又はＰＵＦＡが大腸の腸内細菌叢に送達されることを特徴とする。

【0010】

本発明の他の実施形態は、過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患；アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病からなる群から選択される疾患／有害な状態の少なくとも１つの症状を経験している患者の栄養上の必要性に対処する医療用食品であって、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択される栄養素を含む医療用食品において、この栄養素は、腸内細菌叢に直接送達されるように製剤化されることを特徴とする医療用食品である。

【0011】

［定義］
本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用される場合、以下の定義が適用される。

【0012】

「ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）」とは、ディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の少なくとも１つの種を意味し、Ｄ．ニューモシンテス（Ｄ．ｐｎｅｕｍｏｓｉｎｔｅｓ）、Ｄ．インビサス（Ｄ．ｉｎｖｉｓｕｓ）、Ｄ．ミクラエロフィルス（Ｄ．ｍｉｃｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｄ．ホミニス（Ｄ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、Ｄ．マシリエンシス（Ｄ．ｍａｓｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｄ．サクシナティフィラス（Ｄ．ｓｕｃｃｉｎａｔｉｐｈｉｌｕｓ）及びＤ．プロピオニシファシエンス（Ｄ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｆａｃｉｅｎｓ）を含み得る。

【0013】

「減少した菌数」は、個体内に存在するディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の量が、健康な人の集団に見られる量と比較して低下していることを意味する。

【0014】

本明細書において使用される「健康な」とは、ヒトを含む動物が、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の減少した菌数と関連することが知られている疾患／有害な状態を経験していないことを意味する。

【0015】

「ビタミンＢ２」及び「リボフラビン」という用語は、互換的に使用され、そのエステル、特にリボフラビン－５’－リン酸を含む。

【0016】

「ビタミンＫ」という用語は、ビタミンＫ１及びビタミンＫ２の一方又は両方を含む。

【0017】

「ＤＨＡ」は、その遊離酸形態に加えて、塩及びエチルエステルなどのエステルを含む。これは、純度が少なくとも９０％のものなどの様々な濃度のものも含む。これは、天然に存在する量又は濃縮された量のいずれかでＤＨＡを含み、ＥＰＡも含み得る魚油及び藻油も含む。これは、ＤＨＡトリグリセリドを更に含む。

【0018】

「ＥＰＡ」は、その遊離酸形態に加えて、その塩及びエステルを含む。これは、純度が少なくとも９０％のものなどの様々な濃度のものも含む。これは、ＥＰＡをある程度の量で含み得る魚油及び藻油も含み、ＤＨＡも含み得る。更に、これは、ＥＰＡトリグリセリドも含む。

【0019】

本明細書において使用される「ビタミンＤ」という用語は、ビタミンＤ３を意味する。ビタミンＤ３に替えて又はビタミンＤ３に加えて、２５－ヒドロキシビタミンＤ３を好ましくは非ヒト種に使用することができる。２５－ヒドロキシビタミンＤ３のビタミンＤ３に対する相対的な強度は、約４０：１であり、したがって、２５－ヒドロキシビタミンＤ３を投薬する場合、これに従って調整する必要がある。

【0020】

「ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させる必要がある」動物、好ましくはヒトは、過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病からなる群から選択される少なくとも１つの疾患／有害な状態の危険性があるか又はそれを現在経験している。

【0021】

「予防」は、疾患／有害な状態に到達したことがない状況に限定されない。代わりに、本明細書及び特許請求の範囲の全体を通して使用される場合、それは、疾患／有害な状態又はその症状の重症度を軽減すること；疾患／有害な状態又はその症状の発症を遅延させること；疾患／有害な状態又はその症状に早期に介入すること；及び疾患／有害な状態又は症状が発症する危険性を低減することを含み得る。

【0022】

「直接送達」とは、ビタミン又はＰＵＦＡを、ビタミン又はＰＵＦＡが胃及び／又は小腸で吸収されずに、むしろ、ビタミン及び／又は組合せが、微生物叢がそれを利用できる遠位腸管、好ましくは大腸に存在するように投与することを意味する。これらのビタミン又はＰＵＦＡは、ヒトの通常の１日の栄養要求量（一般に食事及び従来のビタミン又はＰＵＦＡ補給を通して得られるもの）の一部ではなく、それを上回る量で投与される。ヒトに使用する場合の好ましい方法は、腸管に到達するまで送達を遅延させる形態を介した方法である。非ヒト動物について、好ましい送達は、送達されたビタミン又はＰＵＦＡの一部のみが胃で吸収され、有効用量である残部が腸管で利用できるような十分に多い用量を投与する方法を含み、好ましくはないが、この送達方法は、ヒトにも使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1A】インビトロ実験１における、ビタミン投与後のディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比である。対照と比較した２４時間後の発酵上清中のディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の存在比のｌｏｇ１０倍率変化を示す。

【図1B】インビトロ実験２における、ビタミン投与後のディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比である。対照と比較した２４時間後の発酵上清中のディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の存在比のｌｏｇ１０倍率変化を示す。

【図1C】ヒト試験における、ビタミン投与後のディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比である。ヒト試験において結腸を標的とするビタミンを投与した後の糞便中のディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比を示す。

【0024】

［疾患／有害な状態］
本発明の他の実施形態は、動物、好ましくはヒトの腸内細菌叢に直接送達するために製剤化されたＰＵＦＡ又はビタミンの使用において、送達時、ＰＵＦＡ又はビタミンは、腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させることを特徴とする使用である。好ましくは、ビタミン及び／又はビタミンの組合せは、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択される。

【0025】

幾つかの実施形態において、ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させる必要があるヒトを含む動物は、過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病からなる群から選択される疾患又は状態の危険性があるか又はそれを経験しており、ディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数は、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はＰＵＦＡを投与することによって増加される。

【0026】

本発明の他の実施形態は、腸内細菌叢に直接送達するために製剤化されたＰＵＦＡ及び／又はビタミンの非治療的使用において、送達時、ＰＵＦＡ及び／又はビタミンは、動物、好ましくはヒトの腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させることを特徴とする非治療的使用である。好ましくは、ＰＵＦＡ又はビタミンは、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択される。

【0027】

本発明の他の実施形態は、直接送達するために製剤化される医薬の製造におけるビタミン又はＰＵＦＡの組合せの使用において、送達時、ビタミン又はＰＵＦＡの組合せは、動物、好ましくはヒトの腸内細菌叢におけるディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させることを特徴とする使用である。好ましくは、ＰＵＦＡ又はビタミンは、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択される。

【0028】

幾つかの実施形態において、ＰＵＦＡ又はビタミンは、過敏性腸症候群、自閉症スペクトラム障害、カルシウム吸収不全、食物アレルギー及び感作（乳、卵、落花生、大豆、クルミ及び小麦）、全般性不安障害、小児肥満、乳幼児の成長障害及び病的状態、免疫媒介性炎症性疾患、アトピー性疾患（小児の喘息及びアレルギーを含む喘息）、クローン病、関節リウマチ及び変形性関節症、早発型子癇前症、１型糖尿病、若年性特発性関節炎、抑うつ、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、Ｂ型慢性肝炎、大うつ病性障害、気道アレルギー、多発性硬化症、慢性炎症並びにアルツハイマー病からなる群から選択される疾患又は状態の危険性があるか又はそれを経験している動物又はヒトのディアリスター属菌（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ ｓｐｐ．）の菌数を増加させるために、β－カロテン、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ２、ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せ、ビタミンＫ、ＤＨＡ、ＥＰＡ並びにＥＰＡ及びＤＨＡの組合せからなる群から選択されるビタミン又はビタミンを投与することによって使用される。

【0029】

上述のビタミン及びビタミンの組合せは、単独の活性剤として投与され得るか、又は従来使用されているプレバイオティクス、プロバイオティクス、腸内細菌叢を調節することができる他の成分及び従来の医薬品若しくは栄養剤と組み合わせて投与され得る。したがって、ＤＨＡを単独の活性剤として選択することができ；ＥＰＡを単独の活性剤として選択することができ；ビタミンＫを単独の活性剤として選択することができ；β－カロテンを単独の活性剤として選択することができ；ビタミンＡを単独の活性剤として選択することができ；ビタミンＤを単独の活性剤として選択することができ；ビタミンＢ５を単独の活性剤として選択することができ；ビタミンＢ２を単独の活性剤として選択することができ；ビタミンＢ２及びビタミンＣの組合せを単独の活性剤として選択することができ；又はＥＰＡ及びＤＨＡの組合せを単独の活性剤として選択することができる。

【0030】

［動物］
「動物」は、哺乳動物、家禽類、好ましくはヒトを含む。好ましい非ヒト動物は、伴侶動物であり、イヌ、ネコ及びウマを含む。農業上重要な動物の中でも、好ましい動物は、家禽類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ及びウマを含む。

【0031】

［投与量］
本明細書において使用する投与量は、一般的な栄養目的で摂取される活性成分に追加されるものを意図する。代わりに、これらは、腸内細菌の腸内細菌叢環境全体に属、種及び菌株レベルで作用する。この活性剤は、ヒトを含む動物によって直接代謝されることを意図したものではない。むしろ、これらは、結腸の細菌集団に利用されることが意図される。したがって、以下に報告する量は、動物によって通常の食餌に加えて摂取されることになるが、その放出が遅延されるため、動物に直接利用されない。

【0032】

好適な１日あたりの投与量は、以下の通りである：
リボフラビン：１日あたり最大２００ｍｇ；好ましくは１日あたり１～８５ｍｇ；より好ましくは１日あたり７０～８０ｍｇ。一実施形態では、１日あたり約７５ｍｇが使用される。好ましくは、リボフラビンは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０５ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも０．１ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１２５ｇ／Ｌとなるような量で投与される。結腸内での好ましい局所濃度は、約０．１ｇ／Ｌ～約０．５ｇ／Ｌ又は約０．１ｇ／Ｌ～約０．２ｇ／Ｌの範囲であり、好ましくは約０．１２５ｇ／Ｌである。好ましい１日あたりの投与量の１つは、最大２００ｍｇであり得る。

【0033】

β－カロテン：１日あたり最大１５０ｍｇ（追加範囲）。好ましくは、β－カロテンは、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．１ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも０．１５ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも０．２ｇ／Ｌとなるような量で投与される。結腸内での好ましい局所濃度は、約０．０５ｇ／Ｌ～約０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは約０．１５ｇ／Ｌ～約０．２５ｇ／Ｌの範囲である。１日あたりの好ましい投与量の１つは、最大１５０ｍｇである。

【0034】

ビタミンＢ５：１日あたり最大１５００ｍｇ（追加範囲）。好ましくは、ビタミンＢ５は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも１ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも１．５ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも２ｇ／Ｌとなるような量で投与される。結腸内での好ましい局所濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約４ｇ／Ｌ、より好ましくは約１．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌの範囲である。１日あたりの好ましい投与量の１つは、最大１５００ｍｇである。

【0035】

ビタミンＣ：１日あたり最大２０００ｍｇ；好ましくは１日あたり４００～６００ｍｇ；より好ましくは１日あたり４５０～５５０ｍｇ。好ましくは、アスコルビン酸は、結腸内でのその局所濃度が少なくとも０．０５ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも０．１ｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも０．８ｇ／Ｌとなるような量で投与される。結腸内での好ましい局所濃度は、約０．０５ｇ／Ｌ～約１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは約０．５ｇ／Ｌ～約１ｇ／Ｌ、最も好ましくは約０．８ｇ／Ｌ～約０．９ｇ／Ｌの範囲である。１日あたりの好ましい投与量の１つは、最大２０００ｍｇである。

【0036】

ビタミンＤ３：１日あたり最大２５０マイクログラム；好ましくは１日あたり５～８０マイクログラム；より好ましくは１日あたり１５～２５マイクログラム。

【0037】

ビタミンＫ：１日あたり最大１０，０００マイクログラム、好ましくは１日あたり８０～１４０マイクログラム、より好ましくは１日あたり１００～１２０マイクログラム。一実施形態において、１日あたり１１０マイクログラムが投与される。

【0038】

ＤＨＡ及びＥＰＡの組合せ：１日あたり最大５，０００ｍｇ。ＤＨＡ対ＥＰＡの比は、重要ではない。一実施形態において、ＥＰＡ対ＤＨＡの比は、天然の魚油又は藻油に見られる組合せの比と同じであり得る。他の非限定的な提供可能な比は、１０～１：１～１０のＤＨＡ対ＥＰＡの比を含む。

【0039】

ＤＨＡ：１日あたり最大１０００ｍｇ；好ましくは１日あたり８０～１２０ｍｇ；より好ましくは９０～１１０ｍｇ。一実施形態において、約１００ｍｇが使用される。

【0040】

ＥＰＡ：１日あたり最大１８００ｍｇ、好ましくは１日あたり最大８０～１２０ｍｇ；より好ましくは１日あたり最大９０～１１０ｍｇ。一実施形態において、１日あたり約１００ｍｇが使用される。

【0041】

ビタミンＢ２及びＣの組合せに関して、ビタミンＢ２対Ｃの比は、重要ではない。一般に、ビタミンＣの量は、Ｂ２の量よりもはるかに高く、例えば、ビタミンＣは、５００ｍｇ～１０００ｍｇであり、ビタミンＢ２は、１ｍｇである。

【0042】

遅延放出製剤を使用して直接送達を行うために、投与量は、好ましくは、１日１回摂取されるが、必要に応じてより少ない用量で複数回（即ち半分の用量で１日あたり２回又は１／３の用量で１日あたり３回）摂取され得る。

【0043】

動物がヒトではない場合に一般的に行われるように腸に直接送達するのではなく、高用量で投与される場合、その投与量は、推奨用量の少なくとも約１０倍又は更に２０倍であり得、例えば１日の推奨用量が５ｍｇである場合、ビタミン及び／又はＰＵＦＡを結腸に存在させるために、５０ｍｇ又は１００ｍｇの量が好ましくは食品、剤形又は飼料中で投与される。ヒトの場合、より高い投与量に調整することが必要となり得る。

【0044】

この用量の摂取を例えば少なくとも１週間、好ましくは少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも１ヵ月間の期間にわたって継続することが好ましい。この用量は、必要に応じて、長期間にわたり毎日摂取され得る。

【0045】

［製剤］
好適な製剤は、ビタミン／ＰＵＦＡの数種の一部が正常に吸収されるが、残部が腸内の腸内細菌叢で有効量において利用できるような十分に高い投与量を含み得る。他の製剤としては、坐剤又は注射剤などの非経口経路を介したものが挙げられる。好ましい製剤は、経口用遅延放出製剤である。

【0046】

本明細書において使用される「遅延放出」とは、活性剤が投与直後よりも遅れて放出されることを指す。好ましくは、「遅延放出」は、経口投与後、活性剤が、大腸、好ましくは結腸に、即時放出製剤と比較して遅れて送達されることを意味する。

【0047】

「腸溶性層」は、芯物質を取り囲む層であり、芯物質は、活性剤を含み、層は、胃液に対する耐性を付与する。「腸溶性シェル」は、活性剤を取り囲むか又は封入しているシェル又はマトリックスであり、シェルは、胃液に対する耐性を付与する。代わりに、マトリックスに基づく送達系を使用することもできる。マトリックスに基づく系は、別個の被覆材料の層が存在せず、活性剤は、マトリックス中にある程度均質に分布している。更に、例えば、繊維マトリックス（酵素に応答する）に活性剤が埋め込まれており、最外層が腸溶性被覆である結腸放出系がある。

【0048】

ヒトのための好ましい実施形態において、本発明の製剤は、経口投与のための固体剤形である。この製剤は、小腸の前、好ましくは結腸の前で活性剤が放出されることを防止するための遅延放出性被覆又はシェルで任意選択的に被覆されたカプセル剤、ペレット、ビーズ、球体、小球体、錠剤、小型錠剤又は顆粒剤の形態であり得る。

【0049】

経口投与により活性剤を遅延放出させるため、特に回腸又は大腸内で標的化放出させるための被覆、シェル又はマトリックス材料は、当技術分野において知られている。これらは、特定のｐＨを超えると崩壊する被覆材料、消化管内で特定の滞留時間が経過した後に崩壊する被覆材料及び腸の特定の領域の微生物叢に特有の酵素に応答して崩壊する被覆材料に細分することができる。異なる種類に分類されている被覆又はシェル材料を組み合わせて使用することは、一般的である。大腸に標的化するための被覆又はシェル材料のこれらの３つの異なる種類については、例えば、Ｂａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．（Ｐｏｌｉｍ．Ｍｅｄ．２０１４，４４，２，１０９－１１８）に概説されている。本発明の一実施形態において、遅延放出性被覆は、ｐＨ依存的に崩壊する被覆材料、時間依存的に崩壊する被覆材料、腸内環境（例えば、回腸及び大腸の腸内環境）におけるトリガー酵素に応答して崩壊する被覆材料及びこれらの組合せから選択される少なくとも１つの成分を含む。

【0050】

ｐＨ依存的に崩壊する被覆材料としては、ポリビニルアセテートフタレート、トリメリット酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースＨＰ－５０、ＨＰ－５５又はＨＰ－５５Ｓ、酢酸フタル酸セルロース、シェラック、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート（ＨＰＭＣＡＳ）、ポリ（メタクリル酸－アクリル酸エチル）１：１（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１００－５５、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ３０Ｄ－５５）、ポリ（メタクリル酸－メタクリル酸メチル）１：１（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ－１００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ１２．５）、ポリ（メタクリル酸－メタクリル酸メチル）１：２（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ－１００、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｓ１２，５及びＥｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＦＳ３０Ｄ）が挙げられる。

【0051】

時間依存的に崩壊する被覆材料としては、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＬ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）ＲＳ及びエチルセルロースが挙げられる。

【0052】

大腸環境内の酵素トリガーに応答して崩壊する被覆材料としては、コンドロイチン硫酸、ペクチン、グアーガム、キトサン、イヌリン、ラクツロース、ラフィノース、スタキオース、アルギン酸塩、デキストラン、キサンタンガム、ローカストビーンガム、アラビノガラクタン、シクロデキストリン、プルラン、カラギーナン、スクレログルカン、キチン、カーデュラン、レバン、アミロペクチン、デンプン、アミロース、難消化性デンプン及びアゾ結合を切断する細菌により分解されるアゾ化合物が挙げられる。

【0053】

一実施形態において、製剤は、活性剤を含む組成物が充填された腸溶性カプセルを含む。腸溶性カプセルは、胃の酸性環境に対する耐性を付与する。例えば、ソフトゲル製剤は、活性剤を溶液で送達することができ、且つ固形剤形の利点をなおも提供することができる。ソフトゲルカプセルは、水に溶解しにくい疎水性の活性剤に特に適している。ビタミンＫ及びオメガ－３脂肪酸は、ソフトゲルカプセル剤として製剤化するのに好ましい。

【0054】

他の実施形態において、製剤は、（ｉ）活性剤を含む芯物質、及び（ｉｉ）腸溶性被覆などの遅延放出性被覆を含む錠剤である。これは、ハードゲルカプセルであり得る。

【0055】

活性剤の放出は、小腸まで遅延させることができる。他の実施形態において、活性剤の放出は、遠位小腸まで遅延される。更なる他の実施形態において、活性剤の放出は、結腸まで遅延される。

【0056】

以下の非限定的な例により、本発明をよりよく説明する。

【0057】

［実施例］
［実施例１］
［インビトロ発酵試験１］
［ドナー及びサンプル調製］
この回分式腸発酵培養の開始時、以下を含む（ｇ／ｌ）改変栄養培地に全ての試験成分を原液から添加した：Ｋ２ＨＰＯ４（２．５）、ＫＨ２ＰＯ４（１０．９）、ＮａＨＣＯ３（２）、酵母エキス（２）、ペプトン（２）、ムチン（１）、システイン（０．５）、Ｔｗｅｅｎ ８０（２）、グルコース（２）、デンプン（２）、セロビオース（２）、ＮａＣｌ（０．１）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（０．０１）、ＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ（０．０１）、ヘミン（０．０５）、胆汁酸塩（０．５）。

【0058】

以下の化合物を、水中で調製したビタミンＢ２及びＢ９の原液並びにエタノール中で調製したビタミンＫ１、ＤＨＡ及びＥＰＡの原液から添加した。

【0059】

【表1】

【0060】

各化合物を３つの異なる濃度で試験した。微生物群の供給源として、ドナーから採取直後に調製した糞便懸濁液を反応器に加えた。各反応器は、７０ｍｌの容量を有した。空試験以外の全ての試験を１連で実施した。培養条件は、３７℃の嫌気性条件下で４８時間振盪（９０ｒｐｍ）するものとした。

【0061】

［測定］
微生物組成：本試験を通して回収した全ての発酵サンプルから、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｓｔｏｏｌ ｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用し、先に述べられているようにビーズ破砕ステップを追加したこと及び溶解温度を９５℃まで昇温したことを除いて、製造業者の指示に従って全ＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを単離した後、Ｑｕｂｉｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してＤＮＡを定量した。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を製造業者の指示に従って使用し、以下の改変を行って全メタゲノムライブラリーを調製した：第１に、タグメンテーション時間を７分間に延長し、第２に、インデックス付加及び生成物のＡｍｐｕｒｅ精製後、サンプルをＡｇｉｌｅｎｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐ（Ａｇｉｌｅｎｔ）上で電気泳動することによってそれぞれ個々にサイズ確認し、Ｑｕｂｉｔ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ＤＮＡ ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｔｅａｇａｓｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＳＯＰに従って定量した。次いで、サンプルを等モル量でプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００でＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ ｖ２高出力試薬キット（３００サイクル）を用いてシーケンシングを行った。全てのシーケンシングは、Ｔｅａｇａｓｃシーケンシング設備において、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプロトコルに従って実施した。納品されたＦＡＳＴＱ形式の生配列ファイルを以下の通り品質チェックした：ＳＡＭ及びＰｉｃａｒｄツールの組合せを使用して、低品質及び重複リードを削除すると共に、トリミングを行った。Ｍｅｔａｐｈｌａｎ２ソフトウェアを使用して、リードを分類群に当てはめた。

【0062】

［実施例２］
［インビトロ発酵試験２］
［ドナー及びサンプル調製］
この回分式腸発酵培養の開始時、以下を含む（ｇ／ｌ）改変栄養培地に全ての試験成分を原液から添加した：Ｋ２ＨＰＯ４（２．５）、ＫＨ２ＰＯ４（１０．９）、ＮａＨＣＯ３（２）、酵母エキス（２）、ペプトン（２）、ムチン（１）、システイン（０．５）、Ｔｗｅｅｎ ８０（２）、グルコース（２）、デンプン（２）、セロビオース（２）、ＮａＣｌ（０．１）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（０．０１）、ＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ（０．０１）、ヘミン（０．０５）、胆汁酸塩（０．５）。

【0063】

以下の化合物を、水中で調製した原液から添加した：
β－カロテン、
ビタミンＢ３、
ビタミンＢ５、
ビタミンＢ７、
フルクトオリゴ糖（陽性対照）。

【0064】

各化合物を３つの異なる濃度で試験し、概要を以下の表２に示す。微生物群の供給源として、ドナーから採取直後に調製した糞便懸濁液を反応器に加えた。各反応器は、７０ｍｌの容量を有した。空試験以外の全ての試験を１連で実施した。培養条件は、３７℃の嫌気性条件下で４８時間振盪（９０ｒｐｍ）するものとした。

【0065】

【表2】

【0066】

［測定］
微生物組成：培養開始時及び２４時間培養後にＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを実施した。この技法は、遺伝子全体に可変領域及び保存領域が分散している構造を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を標的とするものである。これは、タンパク質発現において重要な役割を果たすため、保存領域は、非常に遅い進化速度によって特徴付けられる。

【0067】

適用される方法論は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の２つの超可変領域（Ｖ３－Ｖ４）に及ぶプライマーを伴う。ペアエンドシーケンス手法を用いて２×２５０ｂｐをシーケンシングすることにより、４２４ｂｐのアンプリコンを生成する。このような断片は、より短い断片よりも多くの分類学的情報を含む。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングで解析したサンプルを、全細菌細胞数を決定するためにフローサイトメトリーでも分析し、それによりＩｌｌｕｍｉｎａで得られた相対値を絶対量に換算した。サンプルは、ＢＤＦａｃｓ ｖｅｒｓｅで分析した。サンプルは、高流速で流した。ＳＹＴＯチャネルで閾値を２００に設定して、細菌細胞を培地の残滓及びシグナルノイズから分離した。全ての集団を測定するために、親細胞及び娘細胞に適切なゲートを設定した。

【0068】

［実施例３］
［臨床試験］
［ヒト対象］
６つのビタミン群にそれぞれ１２人の参加者を割り付け、２４人の参加者をプラセボ群に割り付けた。９６人の参加者全員が介入を完了した。以下を満たす参加者を本試験の登録適格者とする：同意説明文書を提出できること；年齢が２０歳以上５０歳以下であること；ＢＭＩが１８．５～３０Ｋｇ／ｍ２であること；過去３ヵ月間にわたり体重が安定していること（変化率＜５％）；試験責任医師により健康状態が概ね良好と判断されていること；ベースライン来院前の４週間以内に栄養補助食品、プレバイオティクス、プロバイオティクス、栄養又は繊維豊富な補助食品を摂取しておらず、試験終了時までこれらの補助食品を控える意思があること；試験期間にわたりレバーの摂取を控える意思があること；試験期間にわたり各自の現時点の水準の身体活動を維持する意思があること；及び試験期間にわたり毎日ＩＰを摂取する意思があること。以下に該当する参加者は、除外された：通常の繊維摂取量が＞３０ｇ／日である；妊娠中であるか若しくは妊娠を計画している；禁止されている投薬治療を受けた；過去３ヵ月間にわたり食事内容が大きく変化したか、若しくは生活スタイルを大きく変えることを計画している；過去６０日以内に試験に参加した；又は責任医師が試験の目的に影響を及ぼすであろうと見なした病気が継続しているか若しくは既往症がある。

【0069】

本試験手順は、Ｃｏｒｋ Ｔｅａｃｈｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌｓの臨床研究倫理委員会により承認され（プロトコル番号：ＡＦＣＲＯ－０８７）、ヘルシンキ宣言に準拠して実施した。各対象は、試験に組み込まれる前に同意説明文書を提出した。この試験は、ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖにＩＤ：ＮＣＴ０３６６８９６４で登録された。

【0070】

［試験設計］
本試験は、無作為化二重盲検プラセボ対照並行試験であり、対象は、ビタミン補助剤又はプラセボのいずれかを４週間にわたり投与された。来院は、３回であった：１）スクリーニング；２）ベースライン（スクリーニングの１週間後）、及び３）追跡調査（ベースラインの４週間後）。スクリーニング来院（来院１）では、同意説明を行い、病歴聴取及び身体検査を含む適格性を評価した。適格な参加者は、１週間の導入期間に入り、極端なダイエットを控えるように指導された。参加者は、毎日ｅＤｉａｒｙに記録し、無作為化来院の４８時間前に糞便サンプルを採取した。無作為化来院前に、参加者の通常の繊維摂取量が＜３０ｇ繊維／日であることを確認するために、食物摂取頻度調査票を分析した。この基準を満たさなかった参加者又は他の適格性基準を満たさなかった参加者を除外した。

【0071】

ベースライン来院（来院２）では、参加者に、来院前の４８時間以内に採取した糞便サンプルを返却させ、適格性を評価した。適格な参加者を組み入れて無作為化番号を割り付け、７つの群の１つから４週間分の治験薬（ＩＰ）を渡した。割り付けに関して、参加者及び研究スタッフの両方が盲検化された。参加者は、ＧＳＲＳ及びＳＦ－３６の質問票に記入した。血液サンプルを採取し、施設内で－８０℃において保管した。参加者は、極端なダイエットを控え、各自毎日ｅＤｉａｒｙに記入し、以後４週間にわたり毎日１カプセルずつ摂取するように指導された。

【0072】

最終来院（来院３）では、参加者に、来院前４８時間以内に採取した糞便サンプルを返却させた。参加者は、ＧＳＲＳ及びＳＦ－３６の質問票に記入した。血液サンプルを採取し、施設内で－８０℃において保管した。参加者にＩＰを返却させ、遵守を評価した。

【0073】

［治験薬］
治験薬は、以下の通りであった：
１）ビタミンＡ（レチノール当量（ＲＥ）２５０μｇ／日）、
２）ビタミンＣ（アスコルビン酸５００ｍｇ／日）、
３）ビタミンＢ２（７５ｍｇ／日）＋ビタミンＣ（５００ｍｇ／日）、
４）ビタミンＤ３（コレカルシフェロール６０μｇ／日）、又は
５）微結晶セルロース２００ｍｇ／日（プラセボ）。

【0074】

ビタミン類は、全てＤＳＭ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｌｔｄ（Ｋａｉｓｅｒａｕｇｓｔ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供されたものであり；プラセボは、Ｆａｇｒｏｎ（Ｗａｒｅｇｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手した。治験薬は、結腸を標的とする送達に有効であることが確認されている（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）ｐＨ依存性ポリマーであるＥｕｄｒａｇｉｔ Ｓ１００（Ｅｖｏｎｉｋ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ＆Ｃａｒｅ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して被覆したハードゼラチンカプセルとして、結腸放出形態で製剤化した（Ｌｏｎｚａ、Ｂｏｒｎｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。選択された用量は、過去の研究におけるビタミンの高用量の経口送達に基づき（ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００６；Ｌａｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｃａｎｔａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｔｅｉｎｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、各ビタミンの推定腸管吸収量（Ｇｒａｆ，１９８０；Ｂａｓｕ及びＤｏｎａｌｄｓｏｎ，２００３；Ｇｒｏｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｒｅｂｏｕｌ，２０１３）を差し引いた。上限値が規定されていないビタミンＢ２を除いて、全ての用量を、ＥＦＳＡにより発表されている上限値未満とした（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｆｓａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／ａｓｓｅｔｓ／ＵＬ＿Ｓｕｍｍａｒｙ＿ｔａｂｌｅｓ．ｐｄｆ）。

【0075】

［測定］
糞便の微生物組成：ＤＮＡ抽出及びシーケンシングは、インビトロ発酵試験１の発酵サンプルに用いたものと同じ方法を用いた。

【0076】

［結果］
・インビトロ実験１（図１Ａ）：
ディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比のビタミンＢ９による明らかな増加は、見られなかった。対照的に、ビタミンＢ２、並びに特にビタミンＫ１並びに多価不飽和脂肪酸であるＥＰＡ及びＤＨＡを投与すると、試験した全ての濃度で２４時間後のディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比が対照と比較して大幅に増加した。

【0077】

・インビトロ実験２（図１Ｂ）：
ディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比のビタミンＢ３及びＢ７による明らかな増加は、見られなかった。対照的に、試験した全ての濃度のβ－カロテン並びに０．２倍及び５倍のビタミンＢ５の投与により、ドナーＣのディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比が増加した。これらの増加は、プレバイオティクスであるＦＯＳで見られた増加と同等であった。

【0078】

・ヒト試験（図１Ｃ）：
ビタミンＡ、ビタミンＤ３並びにビタミンＢ２及びＣの組合せを４週間にわたり投与することにより、ディアリスター属（Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ）の相対存在比がプラセボと比較して増加した。これは、ビタミンＣで観測されたものとは対照的であった。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【国際調査報告】