特表 2023-533217 アポトーシス耐性細胞株

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-02

(54)【発明の名称】アポトーシス耐性細胞株

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20230726BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230726BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20230726BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230726BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230726BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20230726BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230726BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/12

C12N15/33

C12N1/15

C12N1/19

C12N15/86 Z

C12N15/09 100

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022580157

(86)(22)【出願日】2021-06-23

(85)【翻訳文提出日】2023-01-31

(86)【国際出願番号】 US2021038574

(87)【国際公開番号】W WO2021262783

(87)【国際公開日】2021-12-30

(31)【優先権主張番号】63/043,545

(32)【優先日】2020-06-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/210,640

(32)【優先日】2021-06-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

２．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ミサギ， シャーラム

(72)【発明者】

【氏名】タン， タンミン

(72)【発明者】

【氏名】シェン， エイミー

(72)【発明者】

【氏名】レアード， マイケル

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA46

(57)【要約】

本発明の開示は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を有する真核細胞株に関する。そのような細胞株を生成する方法も提供される。本開示はまた、そのような細胞株を含む組成物及び細胞培養物と、組換えポリペプチド又はウイルスベクターなどの生成物を生成する方法と、細胞、組成物及び細胞培養物の使用とに関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された真核細胞株であって、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む、細胞株。

【請求項2】

Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む、請求項１に記載の細胞株。

【請求項3】

動物細胞株又は真菌細胞株である、請求項１又は２に記載の細胞株。

【請求項4】

動物細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項３に記載の細胞株。

【請求項5】

哺乳動物細胞株が、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株、若しくはＣＨＯ細胞株、又はそれらの誘導体である、請求項４に記載の細胞株。

【請求項6】

ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体である、請求項５に記載の細胞株。

【請求項7】

Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項8】

ウイルスゲノムと、ウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項9】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項10】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞株の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項９に記載の細胞株。

【請求項11】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞株の細胞ゲノムに無作為に組み込まれている、請求項９に記載の細胞株。

【請求項12】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項13】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞株の染色体に組み込まれている、請求項９から１１のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項14】

目的の生成物が組換えポリペプチドを含む、請求項９から１１のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項15】

目的の生成物が、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンを含む、請求項９から１４のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項16】

抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項１５に記載の細胞株。

【請求項17】

抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項１５又は１６に記載の細胞株。

【請求項18】

抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項19】

抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項20】

ポリヌクレオチドと、野生型Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーとを含む、対応する単離された真核細胞よりも高い比生産性を有する、請求項７から１９のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項21】

Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離された真核細胞株よりもアポトーシスに対して耐性である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項22】

フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流などの細胞培養プロセスで用いられる、請求項１から２１のいずれか一項に記載の細胞株。

【請求項23】

強化灌流プロセスで用いられる、請求項２２に記載の細胞株。

【請求項24】

請求項１から２３のいずれか一項に記載の真核細胞株を含む組成物。

【請求項25】

細胞培地をさらに含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

細胞培地及び複数の真核細胞を含む細胞培養物であって、複数の各細胞が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む、細胞培養物。

【請求項27】

各細胞が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む、請求項２６に記載の細胞培養物。

【請求項28】

複数の各細胞が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む、請求項２６又は２７に記載の細胞培養物。

【請求項29】

細胞が動物細胞又は真菌細胞である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項30】

動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の細胞培養物。

【請求項31】

哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、若しくはＣＨＯ細胞、又はそれらの誘導体である、請求項３０に記載の細胞培養物。

【請求項32】

ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、又はそれらの誘導体である、請求項３１に記載の細胞培養物。

【請求項33】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項34】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項３３に記載の細胞培養物。

【請求項35】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれている、請求項３３に記載の細胞培養物。

【請求項36】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項37】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞の染色体に組み込まれている、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項38】

目的の生成物が組換えポリペプチドを含む、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項39】

目的の生成物が、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンである、請求項３３から３８のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項40】

抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項３９に記載の細胞培養物。

【請求項41】

抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項３９又は４０に記載の細胞培養物。

【請求項42】

抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項43】

抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項44】

細胞のそれぞれが、組換えポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２６から４３のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項45】

細胞が、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流などの細胞培養プロセスで用いられる、請求項２６から４４のいずれか一項に記載の細胞培養物。

【請求項46】

強化灌流プロセスで用いられる、請求項４５に記載の細胞培養物。

【請求項47】

真核細胞におけるアポトーシス活性を低下させる方法であって、細胞に遺伝子組換えシステムを施すことを含み、遺伝子組換えシステムが：
ａ．Ｂａｘポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトし；
ｂ．Ｂａｋポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする、
方法。

【請求項48】

フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流細胞培養プロセスで真核細胞を用いることをさらに含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

真核細胞が強化細胞培養プロセスで用いられる、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

遺伝子組換えシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

遺伝子組換えシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムであるか又はそれを含む、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、
ａ．Ｃａｓ９分子と、
ｂ．Ｂａｘ遺伝子内の標的配列に対して相補的な標的配列を含む少なくとも１つの第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、
ｃ．Ｂａｋ遺伝子内の標的配列に対して相補的な標的配列を含む少なくとも１つの第２のｇＲＮＡと
を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

標的配列のうちの少なくとも１つが、Ｂａｘ遺伝子の一部であり、且つ／又は標的配列のうちの少なくとも１つが、Ｂａｋ遺伝子の一部である、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

Ｂａｘポリペプチドの発現及び／又はＢａｋポリペプチドの発現がノックアウトされ、細胞のアポトーシス活性が、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する、請求項４７から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

Ｂａｘポリペプチドの発現及び／又はＢａｋポリペプチドの発現がノックダウンされ、細胞のアポトーシス活性が、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する、請求項４７から５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

細胞のアポトーシス活性が、産生期の第１４日に決定された前記基準細胞の集合の生存率と比較した前記細胞の集合の生存率から決定される、請求項５４又は５５に記載の方法。

【請求項57】

基準細胞が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、請求項５４から５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

遺伝子組換えシステムが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムであるか又はそれを含む、請求項４７から５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

細胞株発生システムが、標的化組込み、ランダム組込み、又はトランスポサーゼシステムを含む、請求項４７から５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

細胞が動物細胞又は真菌細胞である、請求項４７から５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

動物細胞が哺乳動物細胞である、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞、若しくはＣＨＯ細胞株、又はそれらの誘導体である、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、又はそれらの誘導体である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

細胞が、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項４７から６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれている、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項68】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞の染色体に組み込まれている、請求項６４から６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

目的の生成物が組換えポリペプチドを含む、請求項６４から６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項70】

目的の生成物が、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンである、請求項６４から６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項７０又は７１に記載の方法。

【請求項73】

抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

細胞のそれぞれが、組換えポリヌクレオチドをさらに含む、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

組換えポリペプチドを生成する方法であって、
ポリペプチドの生成に適した条件下で、真核細胞株を培養することであって、真核細胞株が、
（ａ）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、
（ｂ）組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
を含む、真核細胞株を培養することを含む、方法。

【請求項77】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞株の細胞の細胞ゲノムに組み込まれている、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、細胞株の細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれている、請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、請求項７６から７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、細胞株の細胞の染色体に組み込まれている、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

組換えポリペプチドが、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンである、請求項７６から８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

抗体が多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

抗体が、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項84】

抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、請求項８１から８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

抗体がモノクローナル抗体を含む、請求項８１から８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

組換えポリペプチドを単離することをさらに含む、請求項７６から８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

ウイルスベクターを生成する方法であって、
ウイルスベクターの生成に適した条件下で、（ａ）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、（ｂ）ウイルスゲノムと、（ｃ）ウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを含む真核細胞株を培養することを含む、方法。

【請求項88】

ウイルスベクターを単離することをさらに含む、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

細胞株が動物細胞株又は真菌細胞株である、請求項８７又は８８に記載の方法。

【請求項90】

動物細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

哺乳動物細胞株が、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株、若しくはＣＨＯ細胞株、又はそれらの誘導体である、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体である、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

細胞株が細胞培地中で培養される、請求項８７から９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

細胞株が、フェドバッチ培養条件又は灌流培養条件下で培養される、請求項８７から９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

細胞株が、フェドバッチ培養条件下で培養され、任意選択的には、フェドバッチ培養条件が強化フェドバッチ培養条件である、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

細胞株が灌流培養条件下で培養され、任意選択的には、灌流培養条件が半連続灌流又は連続灌流である、請求項８７から９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

細胞株が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む、請求項８７から９６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５４５号及び２０２１年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２１０，６４０号の優先権を主張し、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

１．技術分野
本開示は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を有する真核細胞株に関する。そのような細胞株を生成する方法も提供される。本開示はまた、前記細胞を含む組成物及び細胞培養物と、組換えポリペプチド又はウイルスベクターなどの生成物を生成する方法と、目的の生成物を生成する方法における前記細胞、組成物及び細胞培養物の使用とに関する。

【0003】

２．背景技術
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び他の組換えタンパク質は、免疫学、腫瘍学、神経科学などを含む多くの疾患適応症のための成功した治療薬として確立されている（例えば、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（２０１７）ｍＡｂｓ． ９：１６７－１８１；Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｕｒｒ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １３：８５－９９を参照されたい）。バイオテクノロジー業界において３００を超えるｍＡｂが開発中であり、ｍＡｂ市場は２０２０年までに７０のｍＡｂ製品に拡大すると予測されている（Ｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ｍＡｂｓ． ７：９－１４）。業界が拡大し、標的がより複雑になるにつれて、多数のｍＡｂ変異体をスクリーニングし、所望の特徴を有する臨床候補を同定するために、より大きな抗体発見キャンペーンが必要とされる。

【0004】

哺乳動物細胞などの真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、その、適切なタンパク質の折りたたみ、集合、及び翻訳後修飾に対する能力故に、臨床用途のための治療用タンパク質の製造において、幅広く使用されている。しかし、目的の分子の大量の細胞培養及び生産は困難である。したがって、治療用タンパク質などの所望の生成物の生成をさらに最適化するための改良された細胞及び方法を提供することが望ましい。

【発明の概要】

【0005】

組換えポリヌクレオチド又は組換えポリペプチドなどの目的の生成物を生成するために、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）などの真核細胞株を培養するための最適な方法が依然として必要とされている。我々は、目的の生成物を生成するために細胞株を使用するとき、細胞が高い生存率を示すことが有利である（例えば、より良い生成物力価を提供する）ことを確認した。そのため、野生型の対応物よりも高い生産性とバイオリアクターでのより強力な性能を提供するために、アポトーシスに対する耐性を有する哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）を含む細胞株が必要とされている。

【0006】

これら及び他の必要性を満たすために、本明細書では、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を有する、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）などの真核細胞株が提供される。したがって、本開示は、本開示の細胞を使用して、目的の産物、例えば組換えポリヌクレオチド及び／又は組換えポリペプチドを生成するための、方法、細胞、及び細胞を含む組成物に関する。特に、本明細書に記載の方法、細胞、及び組成物は、目的の生成物を発現する改良された哺乳動物細胞を含み、細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を有する。細胞及び細胞株におけるＢａｘ遺伝子とＢａｋ遺伝子のダウンレギュレーション又は欠失は、所望のアポトーシス活性に関連する望ましくない影響、例えば真核細胞の生存率及び生産性の低下を減少させる。

【0007】

一態様では、本開示は、単離された真核細胞株を提供し、この細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む。

【0008】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む。

【0009】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む。

【0010】

特定の実施態様では、細胞株は、動物細胞株又は真菌細胞株である。細胞株は、動物細胞株、例えば哺乳動物細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞株には、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株（ＢＨＫ－２１細胞株を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞株は、ＣＨＯ細胞株、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体であり得る。細胞株は、真菌細胞株、例えば酵母細胞株であり得る。

【0011】

特定の実施態様では、細胞株は、ウイルスゲノムと、ウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとをさらに含む。

【0012】

特定の実施態様では、細胞株は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0013】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、標的位置で細胞株の細胞ゲノムに組み込まれ得る。目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞株の細胞ゲノムに無作為に組み込まれ得る。目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、染色体外ポリヌクレオチドであり得る。目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞株の染色体に組み込まれ得る。

【0014】

目的の生成物は、組換えポリペプチドであり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物（組換えポリペプチドなど）は、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンであり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物は、抗体であり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物は、抗原であり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物は、酵素であり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物は、ワクチンであり得るか又はそれを含み得る。

【0015】

抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなり得る。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含み得る。抗体は、モノクローナル抗体を含み得る。

【0016】

特定の実施態様では、細胞株は、ポリヌクレオチドと、野生型Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーとを含む、対応する単離された真核細胞よりも高い比生産性を有する。

【0017】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離された真核細胞株よりもアポトーシスに対して耐性である。

【0018】

特定の実施態様では、細胞株は、フェドバッチ、灌流、プロセス強化灌流、半連続灌流、又は連続灌流などの細胞培養プロセスで使用される。例えば、限定されないが、細胞株は、強化灌流プロセスで使用され得る。

【0019】

別の態様では、本開示は、本発明の真核細胞株、例えば第１の態様の細胞株を含む組成物を提供する。組成物は、細胞培地も含み得る。

【0020】

特定の実施態様では、組成物は、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流などの細胞培養プロセスで使用される。例えば、限定されないが、細胞培養プロセスは、強化灌流プロセスであり得る。

【0021】

別の態様では、本開示は、細胞培地と、複数の真核細胞であって、複数の各細胞がＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む複数の真核生物細胞とを含む細胞培養物を提供する。

【0022】

特定の実施態様では、細胞培養物は、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流などの細胞培養プロセスで使用される。細胞培養プロセスは、強化灌流プロセスであり得る。

【0023】

特定の実施態様では、各細胞は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む。

【0024】

特定の実施態様では、複数の細胞は各々、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む。

【0025】

特定の実施態様では、細胞は動物細胞又は真菌細胞である。細胞は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞であり得る。例示的な哺乳動物細胞には、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ－２１細胞を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、又はそれらの誘導体であり得る。細胞は、真菌細胞、例えば酵母細胞であり得る。

【0026】

特定の実施態様では、細胞は、ウイルスゲノムと、ウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとをさらに含む。

【0027】

特定の実施態様では、細胞培養物（例えば、複数の細胞）は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0028】

特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、標的位置で細胞の細胞ゲノムに組み込まれ得る。特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれ得る。特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、染色体外ポリヌクレオチドであり得る。特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞の染色体に組み込まれ得る。

【0029】

特定の実施態様では、目的の生成物は、組換えポリペプチドであり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物（組換えポリペプチドなど）は、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンであり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物は、抗体であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物は、抗原であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物は、酵素であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物は、ワクチンであり得るか又はそれを含み得る。

【0030】

特定の実施態様では、抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。特定の実施態様では、抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。特定の実施態様では、抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなり得る。特定の実施態様では、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含み得る。抗体は、モノクローナル抗体を含み得る。

【0031】

特定の実施態様では、細胞のそれぞれは、組換えポリヌクレオチドをさらに含む。

【0032】

別の態様では、本開示は、真核細胞におけるアポトーシス活性を低下させる方法であって、細胞に遺伝子組換えシステムを施すことを含む、方法を提供する。特定の実施態様では、遺伝子組換えシステムは：（ａ）Ｂａｘポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトし；（ｂ）Ｂａｋポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする。

【0033】

特定の実施態様では、方法は、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流細胞培養プロセスで真核細胞を使用することをさらに含む。真核細胞は、強化細胞培養プロセスで使用され得る。

【0034】

特定の実施態様では、遺伝子組換えシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。遺伝子組換えシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムであり得る。遺伝子組換えシステムは、ＺＦＮシステムであり得る。遺伝子組換えシステムは、ＴＡＬＥＮシステムであり得る。

【0035】

特定の実施態様では、遺伝子組換えシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムであるか又はそれを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、（ａ）Ｃａｓ９分子と、（ｂ）Ｂａｘ遺伝子の標的配列に相補的な標的配列を含む少なくとも１つの第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）Ｂａｋ遺伝子の標的配列に相補的な標的配列を含む少なくとも１つの第２のｇＲＮＡとを含み得る。標的配列の少なくとも１つは、Ｂａｘ遺伝子の一部であり得る。標的配列の少なくとも１つは、Ｂａｋ遺伝子の一部であり得る。標的配列の少なくとも１つは、Ｂａｘ遺伝子の一部であり得、標的配列の少なくとももう１つは、Ｂａｋ遺伝子の一部であり得る。

【0036】

特定の実施態様では、Ｂａｘポリペプチドの発現又はＢａｋポリペプチドの発現はノックアウトされ、細胞のアポトーシス活性は、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する。ある実施態様では、Ｂａｘポリペプチドの発現及びＢａｋポリペプチドの発現はノックアウトされ、細胞のアポトーシス活性は、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する。

【0037】

特定の実施態様では、Ｂａｘポリペプチドの発現又はＢａｋポリペプチドの発現はノックダウンされ、細胞のアポトーシス活性は、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する。ある実施態様では、Ｂａｘポリペプチドの発現又はＢａｋポリペプチドの発現はノックダウンされ、細胞のアポトーシス活性は、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する。

【0038】

特定の実施態様では、アポトーシス活性は、基準細胞のアポトーシス活性よりも低い（例えば、アポトーシス活性は、基準細胞のアポトーシス活性よりも約８０％低いか、約５０％低いか、又は約３０％低い）。例えば、アポトーシス活性は、基準細胞のアポトーシス活性よりも約１％から約９９％低い。細胞のアポトーシス活性は、産生期中に決定された前記基準細胞の集合の生存率と比較した前記細胞の集合の生存率から決定され得る。基準細胞は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞であり得る。例えば、基準細胞は、基準細胞はＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の野生型対立遺伝子を含むという点においてのみ、アポトーシス減弱細胞とは実質的に異なる細胞であり得る。ある実施態様では、アポトーシスの少なさは、生存率が高い細胞と相関している。

【0039】

特定の実施態様では、細胞は、動物細胞又は真菌細胞である。細胞は、動物細胞、例えば哺乳動物であり得る。例示的な哺乳動物細胞には、ハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ－２１細胞を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、又はそれらの誘導体であり得る。細胞は、真菌細胞、例えば酵母細胞であり得る。

【0040】

特定の実施態様では、細胞は、ウイルスゲノムと、ウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとをさらに含む。

【0041】

特定の実施態様では、細胞は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0042】

特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、標的位置で細胞の細胞ゲノムに組み込まれ得る。特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれ得る。特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、染色体外ポリヌクレオチドであり得る。特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞の染色体に組み込まれ得る。

【0043】

特定の実施態様では、目的の生成物は、組換えポリペプチドであり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物（組換えポリペプチドなど）は、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンであり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物は、抗体であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物は、抗原であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物は、酵素であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、目的の生成物は、ワクチンであり得るか又はそれを含み得る。

【0044】

特定の実施態様では、抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。特定の実施態様では、抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。特定の実施態様では、抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなり得る。特定の実施態様では、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含み得る。特定の実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体を含み得る。

【0045】

特定の実施態様では、細胞のそれぞれは、組換えポリヌクレオチドをさらに含む。

【0046】

別の態様では、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法を提供する。特定の実施態様では、方法は、ポリペプチドの生成に適した条件下で真核細胞株を培養することを含む。特定の実施態様では、細胞株は、（ａ）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、（ｂ）組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む。

【0047】

特定の実施態様では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標的位置で細胞株の細胞の細胞ゲノムに組み込まれる。特定の実施態様では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞株の細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれる。

【0048】

特定の実施態様では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、染色体外ポリヌクレオチドである。特定の実施態様では、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞株の細胞の染色体に組み込まれる。

【0049】

特定の実施態様では、組換えポリペプチドは、抗体、抗原、酵素、又はワクチンであり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、組換えポリペプチドは、抗体であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、組換えポリペプチドは、抗体融合タンパク質であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、組換えポリペプチドは、抗原であり得るか又はそれを含み得る。特定の実施態様では、組換えポリペプチドは、酵素であり得るか又はそれを含み得る。組換えポリペプチドは、ワクチンであり得るか又はそれを含み得る。

【0050】

特定の実施態様では、抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。特定の実施態様では、抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。特定の実施態様では、抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなり得る。特定の実施態様では、抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含み得る。特定の実施態様では、抗体は、モノクローナル抗体を含み得る。

【0051】

特定の実施態様では、方法は、組換えポリペプチドを単離することをさらに含む。単離することは、典型的には、細胞株から組換えポリペプチドを単離することを含む。

【0052】

特定の実施態様では、細胞株は、動物細胞株又は真菌細胞株である。細胞株は、動物細胞株、例えば哺乳動物細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞株には、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株（ＢＨＫ－２１細胞株を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞株は、ＣＨＯ細胞株、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体であり得る。細胞株は、真菌細胞株、例えば酵母細胞株であり得る。

【0053】

特定の実施態様では、細胞株は、細胞培地で培養される。細胞株は、フェドバッチ培養条件又は灌流培養条件下で培養され得る。細胞株は、フェドバッチ培養条件下で培養され得る。フェドバッチ培養条件は、強化フェドバッチ培養条件であり得る。細胞株は、灌流培養条件下で培養され得る。灌流培養条件は、半連続灌流であり得る。灌流培養条件は、連続灌流であり得る。

【0054】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む。

【0055】

別の態様では、本開示は、ウイルスベクターを生成する方法を提供する。特定の実施態様では、方法は、ウイルスベクターの生成に適した条件下で真核細胞株を培養することを含む。特定の実施態様では、細胞株は、（ａ）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、（ｂ）ウイルスゲノムと、（ｃ）ウイルスベクターの生成に適した条件下でウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを含む。

【0056】

特定の実施態様では、方法は、ウイルスベクターを単離することをさらに含む。単離することは、典型的には、細胞株からウイルスベクターを単離することを含む。

【0057】

特定の実施態様では、細胞株は、動物細胞株又は真菌細胞株である。細胞株は、動物細胞株、例えば哺乳動物細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞株には、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株（ＢＨＫ－２１細胞株を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞株は、ＣＨＯ細胞株、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体であり得る。細胞株は、真菌細胞株、例えば酵母細胞株であり得る。

【0058】

特定の実施態様では、細胞株は、細胞培地で培養される。細胞株は、フェドバッチ培養条件又は灌流培養条件下で培養され得る。細胞株は、フェドバッチ培養条件下で培養され得る。フェドバッチ培養条件は、強化フェドバッチ培養条件であり得る。細胞株は、灌流培養条件下で培養され得る。灌流培養条件は、半連続灌流であり得る。灌流培養条件は、連続灌流であり得る。

【0059】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む。

【0060】

別の態様では、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、第４の態様に従ってアポトーシス活性を低下させ、その後、第５の態様の方法に従って組換えポリペプチドを生成する方法を含む、方法を提供する。

【0061】

別の態様では、本開示は、ウイルスベクターを生成する方法であって、第４の態様に従ってアポトーシス活性を低下させ、その後、第６の態様の方法に従ってウイルスベクターを生成する方法を含む、方法を提供する。

【0062】

別の態様では、本開示は、目的の生成物の生成のための第１の態様の単離された真核細胞株の使用であって、細胞株が目的の生成物をコードするポリヌクレオチドを含む、使用を提供する。使用は、目的の生成物を単離することをさらに含み得る。

【0063】

別の態様では、本開示は、目的の生成物の生成のための第２の態様の組成物の使用であって、前記組成物の細胞株が目的の生成物をコードするポリヌクレオチドを含む、使用を提供する。使用は、目的の生成物を単離することをさらに含み得る。

【0064】

別の態様では、本開示は、目的の生成物の生成のための第３の態様の細胞培養物の使用であって、前記細胞培養物の複数の真核細胞が目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、使用を提供する。使用は、目的の生成物を単離することをさらに含み得る。

【0065】

別の態様では、本開示は、細胞培養プロセスにおける第１の態様の細胞株、第２の態様の組成物、又は第３の態様の細胞培養物の使用を提供する。細胞培養プロセスは、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流細胞培養プロセスであり得るか又はそれを含み得る。細胞培養プロセスは、強化灌流プロセスを含み得る。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1】野生型（ＷＴ）及び２つの異なるＢａｘ／Ｂａｋダブルノックアウト（ＤＫＯ）宿主からそれぞれ生成された最高の抗体力価を有する４から５のクローンの第１４日のＩＶＣＣ結果を提供する。これらは、強化された（高播種密度）抗体産生プロセスの１４日間にわたる生存細胞濃度の積分について分析された（ＩＶＣＣ、１ｅ８細胞－ｄ／Ｌ）。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、ＷＴクローンと同等か又はそれよりも高いＩＶＣＣを有した。

【図2A-2C】強化生成プロセス中のＷＴクローン及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンのＶＣＣを提供する。ＷＴ宿主（Ａ）又は２つの異なるＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主（Ｂ及びＣ）からの示されたクローンの生細胞数（ＶＣＣ、１ｅ６細胞／ｍＬ）を測定及びプロットした。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとＷＴクローンは、最初の２日間で同様の成長速度を有した。ＶＣＣは第３日の後に減少したが、これは、供給物を追加し、さまざまなアッセイのために培養細胞を除去することにより、毎日細胞培養物を希釈したためである。

【図3A-3C】強化生成プロセス中のＷＴクローン及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの生存率を提供する。ＷＴ宿主（Ａ）又は２つの異なるＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主（Ｂ＆Ｃ）から生成された示されたクローンの生存率（％）を測定及びプロットした。ＷＴクローンは第１０日の後に生存率が減少し（Ａ）、その一方、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、プロセスの終わりまで高い生存率を維持した。これは、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の欠失が、強化プロセスの後期段階の細胞死を有意に防ぐことを示唆している。

【図4】示されたクローンの第１４日の生存率（％）を提供する。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ遺伝子は、第１４日にＷＴクローンよりもはるかに高い生存率を示した。これは、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の欠失が、強化プロセスの後期段階の細胞死を有意に減少させることを裏付けている。

【図5】第１４日の細胞ペレットの切断カスパーゼのウエスタンブロット分析を提供する。アポトーシスマーカータンパク質である切断カスパーゼ－３のレベルについてのウエスタンブロットにより、示されたクローンの第１４日の細胞ペレットを分析した。すべてのＷＴクローンは、高レベルの切断カスパーゼ－３を発現した。これは、ＷＴ細胞が強化プロセスの後期段階でアポトーシスを遂げていること、及びアポトーシス細胞死が培養生存率の減少の主な要因であることを示している。すべてのＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ遺伝子は、低レベルの切断カスパーゼ－３の切断を有した。これは、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の欠失が、アポトーシス細胞死を十分にブロックすることを示唆している。

【図6】第３、７、１０、及び１４日に得た力価を示す。示されたクローンについての１４日間の強化プロセスにおける第３、７、１０、及び１４日の抗体力価（ｇ／Ｌ）を測定及びプロットした。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの第７日の力価は、平均してＷＴクローンと同等であったが、第１４日の力価は有意に高かったことに留意されたい。より重要なことには、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの大部分について、第１４日の力価は第１０日の力価よりも高かった。これは、細胞が生成培養の最後の４日間で依然として抗体を産生していたことを示している。しかし、ＷＴクローンでは、力価は第１０日から第１４日までで増加しなかった。これは、これらのクローンが強化生成プロセスの最後に生産性を失ったことを示唆している。ＷＴクローンの生産性の損失は、これらの培養におけるアポトーシス細胞死による可能性が高かった。

【図7】平均的な比生産性を示す。第１４日の力価（ｇ／Ｌ）を第１４日のＩＶＣＣ（１ｅ８ 細胞－ｄ／Ｌ）で割ることによって、細胞の比生産性（Ｑｐ、ｐｇ／細胞－ｄ）を計算した。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンのＱｐは、平均して、ＷＴクローンのＱｐよりも高かった。

【図8】１４日のプロセス全体における上位クローンの修正した平均比生産性を示す。細胞の比生産性（Ｑｐ、ｐｇ／細胞－ｄ）を希釈倍率によって修正した。ＷＴ宿主の上位クローン及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主の上位２－３クローンについての結果を図８に提供する。

【図9】強化生成プロセス中の異なる段階での上位クローンの修正した比生産性を提供する。示された上位クローンの修正した比生産性（Ｑｐ、ｐｇ／細胞－ｄ）を強化プロセス中の異なる段階で提供した。すべてのクローンについて、第０日から第３日は細胞増殖段階であった。このとき、Ｑｐは安定段階（第３日の後）中よりも低かった。ＷＴクローンのみが、第１０日から第１４日の間のＱｐの低下を示した。Ｑｐは生細胞についてのみ計算されたため、この結果は、ＷＴ細胞の生存率が低下しただけではなく、プロセスの最後の４日間での生産性も低下したことを示唆している。この生産性の低下は、アポトーシスの開始時のＢａｘタンパク質及びＢａｋタンパク質の活性化によって引き起こされるミトコンドリア膜の損傷による可能性が高い。その一方で、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、生存率が向上しただけではなく、生産性も向上した。したがって、これら２つの遺伝子の欠失は、アポトーシスを防ぐだけでなく、ミトコンドリアの完全性及び健康を維持するのにも役立ったと考えられる。

【図10】上位クローンのグルコース消費割合を示す。強化生成プロセス中に消費したグルコースの総量（ｍｇ）を、異なる時点での総細胞数（１ｅ６細胞－ｄ）の積分に対してプロットした。傾斜は、示されたクローンのグルコース消費割合（ｍｇ／１ｅ６ 細胞－ｄ）を表す。グルコース消費割合は、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとＷＴクローンとの間で同等であった。

【図11】強化生成プロセス中の上位クローンの培養物のラクテート濃度を示す。示されたクローンの収集細胞培養物（ＨＣＣＦ）中のラクテート濃度を、毎日測定し、プロットした。結果は、強化生成プロセス中でのＷＴクローン及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンのラクテート代謝は同等であったことを示唆する。

【図12】第１４日のＨＭＷＳ（％）を提供する。示されたクローンの第１４日のＨＣＣＦ中の凝集抗体のレベル（％）を示す。％ＨＭＷＳレベルは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で、平均して同等であった。

【図13】第１４日の％メインピークを示す。これは、示されたクローンの第１４日のＨＣＣＦにおけるインタクトな抗体及び単量体抗体のレベル（％）を説明する。％メインピークレベルは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で、平均して同等であった。

【図14】％ ＬＭＷＳとしての抗体断片の量を説明する。示されたクローンの第１４日のＨＣＣＦにおける抗体断片のレベルを示す。％ＬＭＷＳレベルは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で、平均して同等であった。

【図15】クローンの第１４日のＨＣＣＦにおける抗体酸性電荷バリアントの量（％）を示す。％酸性ピークレベルは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で、平均して同等であった。

【図16】メインピークの結果を示す。これは、クローンの第１４日のＨＣＣＦにおける抗体中性電荷バリアントのレベル（％）を示す。％メインピークレベルは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で、平均して同等であった。

【図17】クローンの第１４日のＨＣＣＦにおける抗体塩基性電荷バリアントの量（％）を示す。％塩基性ピークレベルは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で、平均して同等であった。

【図18A-18C】Ｂａｘ／Ｂａｋ遺伝子をノックアウトすることにより、強化生成プロセスにおいて標準的なｍＡｂ発現ＣＨＯプールの細胞生存率及び力価が改善されることを示す。示された宿主細胞株から生成されたｍＡｂ－Ａを発現する細胞のプールの生存率、生細胞数（ＶＣＣ）、力価、及び第１４日の平均比生産性（Ｑｐ）を、振とうフラスコ中での低播種密度プラットフォーム－１プロセスで（１８Ａ）、ＡＭＢＲ１５バイオリアクター中での低播種密度プラットフォーム－１プロセスで（１８Ｂ）、ＡＭＢＲ１５バイオリアクター中での高播種密度プラットフォーム－１プロセスで（１８Ｃ）、測定した。

【図19A-19B】Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主から生成された単一細胞クローンが、強化生成プロセスにおいて標準ｍＡｂの生存率の延長及びより高い力価を達成したことを示している。示された宿主細胞株から生成されたｍＡｂ－Ａを発現する上位クローンの生存率、ＶＣＣ、力価、及び第１４日の平均比生産性を、振とうフラスコ中での低播種密度プロセスで（１９Ａ）、及びＡＭＢＲ１５バイオリアクター中での強化プロセスで（１９Ｂ）測定した。エラーバーは、示された宿主から生成された４－５の上位クローンの標準偏差を示す。

【図20】Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主から生成された単一細胞クローンが、スケールアップ強化生成プロセスにおいて標準ｍＡｂの生存率の延長及びより高い力価を達成したことを示している。示された宿主細胞株から生成されたｍＡｂ－Ａを発現する上位クローンの生存率、ＶＣＣ、力価、及び第１４日の平均比生産性を、ＡＭＢＲ２５０バイオリアクターを使用して強化プロセスで測定した。エラーバーは、同じＷＴ上位クローンの４つの複製物の標準偏差を示す。

【図21A-21C】Ｂａｘ／Ｂａｋ遺伝子をノックアウトすることによってＣＨＯ強化生成プロセスにおける複合分子の発現が改善されることを示す。ＷＴ宿主細胞株及び２つのＤＫＯ宿主細胞株から生成された、複合分子Ｂ（２１Ａ）、二重特異性抗体分子Ｃ（２１Ｂ）、及び複合分子Ｄ（２１Ｃ）の生存率、ＶＣＣ、力価、及び第１４日の平均比生産性を、ＡＭＢＲ１５バイオリアクター中での強化生成プロセスで測定した。エラーバーは、示された分子の同じ宿主に由来した２つの複製プールの標準偏差を示す。

【図22A-22D】Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞株の生成と、３つの生成プロセスにおいてＷＴプール及びＤＫＯプールで生成されたｍＡｂ－Ａの生成物の質の特性とを示す。ＷＴ細胞株由来のＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の連続したノックアウトを、以下のように実施した。工程１、ＲＮＡ標的Ｂａｘ遺伝子をＷＴ細胞にトランスフェクトし、続いて単一細胞をクローニングしてＢａｘ ＫＯクローン＃４０を生成する。工程２、ＲＮＡ標的Ｂａｋ遺伝子をＢａｘ ＫＯクローン＃４０細胞にトランスフェクトし、続いて単一細胞をクローニングして、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローン１、２、３、７、８、２１を生成する。（２２Ｂ－２２Ｄ）。高分子量種（ＨＭＷＳ）／凝集体レベル、異なるグリカン種レベル、及び電荷バリアントレベルを、低播種密度（ＳＤ）の振とうフラスコ中での生成プラットフォーム－１で（２２Ｂ）、低ＳＤのＡＭＢＲ１５中での生成プラットフォーム－１で（２２Ｃ）、及び高ＳＤのＡＭＢＲ１５中での生成プラットフォーム－１（２２Ｄ）で、ｍＡｂ－Ａ発現プールについて測定した。

【図23A-23C】振とうフラスコ及びＡＭＢＲ１５バイオリアクター中でＷＴ宿主及びＤＫＯ宿主から生成されたｍＡｂ－Ａ発現上位クローンの生成物の質の特性を示す。異なるグリカン種レベル、電荷バリアントレベル、及び高分子量種（ＨＭＷＳ）／凝集体レベルを、低ＳＤの振とうフラスコ中での生成プラットフォーム－１で（２３Ａ）、及びＡＭＢＲ１５中での強化生成プラットフォーム－１で（２３Ｂ）、ｍＡｂ－Ａ発現クローンについて測定した。Ｃは、ＡＭＢＲ１５中での強化生成プラットフォーム－１での第１４日の細胞における切断カスパーゼ３のレベルのウエスタンブロットである。

【図24A-24C】ＡＭＢＲ１５バイオリアクター中での強化プロセスにおいてＣＨＯプールで発現した複合分子及び二重特異性抗体の生成物の質の特性を示す。電荷バリアントレベル、高分子量種（ＨＭＷＳ）／凝集体レベル、及び異なるグリカン種レベルを、複合分子Ｂ（２４Ａ）、二重特異性分子Ｃ（２４Ｂ）、及び複合分子Ｃ（２４Ｃ）を発現するＣＨＯプールについて測定した。二重特異性分子Ｃは非グリコシル化分子であるため、この分子についてのグリコシル化のデータは該当なしであることに留意されたい。

【図25A-25D】複合分子Ｅを発現するトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のプールにおけるＢａｘ／Ｂａｋ遺伝子のノックアウトが高播種密度生成プロセスで細胞生存率を改善したことを示す。（２５Ａ）複合分子Ｅ発現構築物をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のプールでのＢａｘ／Ｂａｋ遺伝子ノックアウトを評価するための戦略の概要。模擬トランスフェクション又はＢａｘ／Ｂａｋ ｇＲＮＡトランスフェクション後のＣＨＯ細胞の複合分子Ｅ発現プールの力価（２５Ｂ）、細胞生存率（２５Ｃ）、及びＶＣＣ（２５Ｄ）。

【発明を実施するための形態】

【0067】

本明細書及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語並びにそれらの変形例は、「含むが限定されない」ことを意味し、それらは、他の部分、添加物、成分、整数、又は工程を排除することを意図しない（及び排除しない）。本明細書及び特許請求の範囲を通じて、文脈が別途必要としない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、明細書は、文脈が別途必要としない限り、単一性だけでなく複数性も考慮していると理解されるべきである。

【0068】

本発明の特定の態様、実施態様又は実施例に関連して記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分又は基は、両立しない場合を除き、本明細書に記載される任意の他の態様、実施態様又は実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書及び図面を含む）に開示された特徴の全て、及び／又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの工程の全ては、そのような特徴及び／又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除き、任意の組合せで組み合わされ得る。本発明は、いずれの開示される実施態様の細部にも限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む）に開示された特徴の任意の新規な１つ若しくは任意の新規な組合せ、又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスの工程の任意の新規な１つ若しくは任意の新規な組合せに及ぶ。

【0069】

読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時に又は本明細書より前に提出され、本明細書とともに公衆の閲覧に開放されているすべての論文及び文書に向けられており、そのようなすべての論文及び文書の内容は参照により本明細書に援用される。

【0070】

特許出願、特許公報、非特許文献、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書において引用されるすべての参考文献は、個々の参考文献がそれぞれ参照により援用されるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

【0071】

疑義を避けるために、「背景技術」という見出しの下、本明細書で前に開示された情報は、本発明に関連し、本発明の開示の一部として読まれるべきであるとここに述べる。

【0072】

限定するためではなく、明確化のために、本明細書にて開示する主題の詳細の説明を、以下の小節に分ける：
５．１ 定義；
５．２ ＢＡＸ及びＢＡＫの発現を調節するための方法
５．３ 細胞株；
５．４ 細胞培養物；
５．５ 生成方法；及び
５．６ 生成物。

【0073】

５．１ 定義
以下の用語及び方法の説明は、本開示をよりよく説明し、本開示の実施において当業者を導くために提供される。

【0074】

本明細書で使用される場合、「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、これは、その値が測定又は決定される方法、即ち、測定システムの限界にある程度依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での１回の実施当たり３つ又は３つよりも多くの標準偏差以内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の、最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、そしてより好ましくはさらに最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁違い以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。

【0075】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、互換的に使用することができ、概して、ペプチジル結合によって結合された約１０個を超える共有結合アミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。タンパク質という用語は、精製された天然産物、又は組換え技術若しくは合成技術を使用して部分的若しくは全体的に生成され得る産物を包含する。ペプチド及びタンパク質という用語は、二量体若しくは他の多量体、融合タンパク質、タンパク質バリアント、又はそれらの誘導体などのタンパク質の凝集体を指し得る。この用語は、タンパク質の修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ペグ化、ユビキチン化などによって修飾されたタンパク質も含まれる。タンパク質は、核酸コドンによってコードされていないアミノ酸を含み得る。タンパク質は、より高いレベルの三次及び／又は四次構造を生成するのに十分な長さのアミノ酸配列を有し得る。本明細書における典型的なタンパク質は、少なくとも約１５～２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有し得る。本明細書の定義に包含されるタンパク質の例としては、全ての哺乳動物タンパク質、特に、治療用及び診断用抗体などの治療用及び診断用タンパク質、並びに、１つ又は複数の鎖間及び／又は鎖内ジスルフィド結合を含む多鎖ポリペプチドを含む、１つ又は複数のジスルフィド結合を含有する一般的なタンパク質が挙げられる。

【0076】

「タンパク質修飾」又は「タンパク質変異」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入及び／若しくは欠失、又はタンパク質に化学的に結合された部分に対する改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した改変された炭水化物又はＰＥＧ構造でありうる。本発明のタンパク質は、少なくとも１つのこのようなタンパク質修飾を含み得る。

【0077】

「修飾されたタンパク質」又は「変異したタンパク質」という用語は、アミノ酸の少なくとも１つの置換、挿入、及び／又は欠失を有するタンパク質を包含する。修飾されたタンパク質又は変異したタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０又はそれを超えるアミノ酸修飾（置換、挿入、欠失、及びそれらの組み合わせ）を有し得る。

【0078】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体（例えば、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列からなる抗体（このようなペアリングの多量体を含む））、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。

【0079】

本明細書で使用する場合、抗体の「抗体断片」、「抗原結合部」（若しくは単に「抗体部」）、又は、抗体の「抗原結合断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；並びに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。

【0080】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を意味する。

【0081】

「ヒト抗体」という用語は、ヒト若しくはヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0082】

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒトＣＤＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を意味する。実施例では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、そのドメイン中ではＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応することになる。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0083】

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体、すなわち、概して少量で存在している起こり得るバリアント抗体（例えば天然に存在する突然変異を含んでいるか、又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じるもの）を除いて、同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する集合を含む個々の抗体を意味する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本開示の主題に従ったモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない様々な技法によって作製することができ、そのような方法及び他の例示のモノクローナル抗体の作製方法は、本明細書に記載されている。

【0084】

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを意味する。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、概して、類似の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ６ｔｈ ｅｄ．， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと）。抗原結合特異性を与えるには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリをそれぞれスクリーニングして、単離されてもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＩｍｍｕｎｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照のこと。

【0085】

本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変可能であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）のそれぞれを意味する。一般に、抗体は６つのＣＤＲを含み、３つがＶＨ中にあり（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、３つがＶＬ中にある（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）。本明細書における例示的なＣＤＲには、以下が含まれる：
アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）、及び９６－１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７（１９８７））；
アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）、及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１））；並びに
アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）、及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原コンタクト（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：：７３２－７４５（１９９６））。

【0086】

ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ（１９９１）に従って決定され得る。ＣＤＲの名称はまた、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７（１９８７）， ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：：７３２－７４５（１９９６）、又は任意の他の科学的に認められた命名システムに従って決定され得る。

【0087】

抗体に関連する「クラス」という用語は、その重鎖によって保有される定常ドメイン又は定常領域の種類を意味する。抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり得る。抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプであり得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれａ、ｄ、ｅ、ｇ、及びｍと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの種類のうちの１つに割り当てることができる。

【0088】

「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、当該塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書において、核酸分子という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡを含む）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、直鎖状又は環状であってもよい。これに加え、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含むことができる。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖若しくはリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基又は化学的に修飾された残基が挙げられる。核酸分子はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ、例えば宿主又は患者において本開示の抗体を直接発現させるためのベクターとして好適なＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を産生するために対象にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を高めるように化学修飾され得る（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １２ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又は欧州特許第２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照されたい）。「ベクター」という用語は、文脈が別途必要としない限り、結合された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。

【0089】

「単離された」という用語は、成分、すなわち他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質が天然に存在する生物体の細胞の他の生体成分から実質的に分離又は精製されている生体成分（例えば核酸分子又はタンパク質）を意味する。「単離された」核酸及びタンパク質は、標準的な精製方法により精製された核酸及びタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞において組換え発現により調製された核酸及びタンパク質、並びに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、及びペプチドも包含する。

【0090】

精製：この用語は、絶対的な純度を必要せず、むしろ、相対的な用語として意図されている。よって、例えば、精製された生成物は、生成物がそれに付随し得る細胞成分（核酸、脂質、炭水化物、及び［その他の］ポリペプチド）から実質的に分離されるように、細胞内のその環境にある生成物（例えば、ポリペプチド又はタンパク質）よりも濃縮されている生成物である。

【0091】

一例では、本開示の目的の生成物（例えば、抗体などのポリペプチド）は、サンプルの少なくとも５０重量％が生成物で構成されるとき、例えば、サンプルの少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、又は９９％、又はそれより多くがポリペプチドで構成されるとき、精製される。ポリペプチドを精製するために使用することができる方法の例には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８９， Ｃｈ． １７）に開示される方法が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質の精製は、例えば、高圧液体クロマトグラフィー又はその他の従来の方法によって決定することができる。

【0092】

「力価」という用語は、細胞培養によって生成された目的の生成物（例えば、抗体などの組換えポリペプチド）の総量を所定量の培地体積で割ったものを意味する。力価は典型的には、１ミリリットル又は１リットルの培地当たりの、抗体のミリグラムの単位（ｍｇ／ｍＬ又はｍｇ／Ｌ）にて表される。特定の実施態様において、力価は、１リットルの培地当たりの抗体のグラム（ｇ／Ｌ）で表される。力価は、異なる培養条件下でタンパク質産生物を得ることと比較しての、力価の増加割合といった、相対的な測定値の観点から表現又は評価することができる。

【0093】

「配列同一性」という用語：２つ以上の核酸配列又は２つ以上のアミノ酸配列間の同一性は、配列間の同一性又は類似性に関して表される。配列同一性は、パーセンテージ同一性に関して測定することができ、このパーセンテージが高いほど、配列はより一致している。パーセンテージ同一性は、配列の全長にわたって計算される。核酸配列又はアミノ酸配列のホモログ又はオルソログは、標準的な方法を使用して整列させた場合、比較的高度な配列同一性を保有する。この相同性は、オルソロガスタンパク質又はｃＤＮＡがより密接に関連する種（例えば、ヒト及びマウス配列）に由来するとき、より遠い関連種（例えば、ヒト及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓ配列）と比較してより重要である。

【0094】

本明細書で使用される「細胞」という用語は、真核細胞への言及を含む。文脈が別途必要としない限り、細胞への言及は、複数（の細胞）への言及を含み得る。真核細胞は、動物細胞（例えば哺乳動物細胞）又は真菌細胞（例えば酵母細胞）であり得る。真核細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ハイブリドーマ、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ－２１細胞を含む）、及びそれらの誘導体であり得る。ＣＨＯ細胞は、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、又はそれらの誘導体であり得る。

【0095】

本明細書で使用される「細胞株」という用語は、繰り返し増殖し得る真核細胞の培養物への言及を含む。細胞株の真核細胞は、本明細書で定義されるような任意の細胞から選択され得る。

【0096】

「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、中に外因性の核酸が導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）を指す。宿主細胞には「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらの細胞には、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫が、継代数に関係なく含まれる。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一である必要はないが、変異を含むことができる。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか又は選択されるのと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は、本発明に含まれる。

【0097】

本明細書で使用される「哺乳動物宿主細胞」又は「哺乳動物細胞」という用語は、適切な栄養素及び成長因子を含有する培地内の、単一層培養物又は懸濁培養物のいずれかに置いたときに、増殖及び生残可能な哺乳動物に由来する細胞及び細胞株を指す。特定の細胞株に必要な成長因子は、例えばＭａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．１９８４）、及びＢａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，（１９８０）Ｃｅｌｌ，２２：６４９に記載されているように、過度な実験をすることなく、実験により速やかに決定される。典型的には、細胞は、目的の、多量の特定のタンパク質、例えば糖タンパク質を、培地中に発現させて分泌させることができる。好適な哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６ １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に出版された欧州特許第３０７，２４７号）；ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ－６１）；ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞、又は、懸濁培養物中での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９ １９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３－２５１ １９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファロー系ラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４－６８ １９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれ得る。哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６ １９８０）；ｄｐ１２．ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に公開された欧州特許第３０７，２４７号）を含む。

【0098】

「ハイブリドーマ」という用語は、免疫原の不死化細胞株と、抗体産生細胞との融合により産生される、ハイブリッド細胞株を意味する。この用語は、ヒト細胞とマウス骨髄腫細胞株とを融合した後、トリオーマ細胞株として一般に知られる形質細胞と融合した結果である、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合物の後代を包含する。さらに、この用語は、抗体を産生する、あらゆる不死化ハイブリッド細胞株、例えばクアドローマなどを含むことを意味する。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ５３７：３０５３（１９８３）を参照のこと。

【0099】

本明細書で使用される「細胞培地」という用語は、細胞を培養するための栄養液を指す。「細胞培養供給物」及び「細胞培養添加物」は、培地性能を改善するために細胞培地に添加され得る栄養補充物を表す。例えば、細胞培養供給物及び／又は細胞培養添加物は、細胞のバッチ培養中に細胞培地に添加され得る。細胞培地は、化学的に定義されていてもよく、又は定義されていない成分を含んでいてもよい。例えば哺乳動物細胞用の、細胞培地は、典型的には、以下のカテゴリーの１つ又は複数に由来する少なくとも１つの成分を含む：
１）通常、グルコースなどの炭水化物の形態のエネルギー供給源；
２）全ての必須アミノ酸、及び通常、２０個のアミノ酸＋システインの、塩基性のセット；
３）低濃度で必要とされるビタミン及び／又は他の有機化合物；
４）遊離脂肪酸；並びに
５）微量元素（微量元素は、非常に低濃度、通常マイクロモル範囲で典型的には必要とされる、無機化合物又は天然に存在する元素として定義される）。

【0100】

細胞培地及び類似の栄養液は任意に、以下のカテゴリーのいずれかに由来する１つ又は複数の成分が補充され得る：
１）例えばインスリン、トランスフェリン、及び上皮増殖因子などの、ホルモン及び他の増殖因子；
２）例えばカルシウム、マグネシウム、及びホスフェートなどの、塩類及び緩衝液；
３）例えばアデノシン、チミジン、及びヒポキサンチンなどの、ヌクレオシド及び塩基；並びに
４）タンパク質及び組織加水分解物。

【0101】

本明細書で使用される「化学的に定義された」培地は、すべての原料が既知である培地である。化学的に定義された培地は、それぞれ未知の成分を含む、血清、胚抽出物、及び加水分解物とは区別される。本開示の細胞培地は、化学的に定義された培地であり得る。本開示の細胞培養供給物は、化学的に定義されていてもよい。本開示の細胞培養添加物は、化学的に定義されていてもよい。

【0102】

本明細書で使用される「定義されていない培地」又は「定義されていない成分を含む培地」は、未知の１つ又は複数の原料を含む培地への言及を含む。定義されていない成分は、例えば、血清、ペプトン、加水分解物（酵母、植物、又は血清加水分解物など）、及び胚抽出物によって提供され得る。

【0103】

「培養すること」という用語は、細胞を、細胞の生存及び／又は成長及び／又は増殖に好適な条件下で、細胞培地と接触させることを指す。

【0104】

「バッチ培養物」という用語は、培養プロセスの開始時に、細胞培養のための全ての成分（細胞及び全ての培養栄養素を含む）が培養バイオリアクターに供給されている培養物を指す。

【0105】

本明細書で使用される場合、「フェドバッチ細胞培養物」という用語は、細胞及び培地が培養バイオリアクターに最初に供給され、追加の培養栄養素が、培養終了前の定期的な細胞及び／又は生成物の採取の有無にかかわらず、培養プロセス中に培養物に継続して、又は個別に増加して、供給されるバッチ培養物を指す。

【0106】

連続培養物と呼ばれることがある「還流培養物」という用語は、細胞が、例えば濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングなどにより培養物中に保持され、培地が連続して、段階的に、又は断続的に（又はこれらの任意の組み合わせで）導入され、培養バイオリアクターから取り除かれる培養物である。

【0107】

細胞培養物の「増殖期」という用語は、細胞が概して急速に分裂する、指数的に細胞が増殖する期間（対数期）を指す。増殖期にて、細胞が維持される時間の長さは、例えば細胞の種類、細胞の増殖速度、及び／又は培地の状態に基づいて変化することができる。この期の間に、細胞は一定期間（例えば１～４日間）、細胞増殖が最大化されるような条件下において培養される。宿主細胞の増殖サイクルの決定は、過度な実験をすることなく想到される、特定の宿主細胞に対して決定される。「細胞増殖が最大化されるような期間及び条件下」などは、特定の細胞株に対して、細胞増殖及び分裂が最適であると測定される培養条件を意味する。例えば哺乳動物細胞の、特定の細胞培養物について、増殖期の間に、細胞は、特定の細胞株に対しての最適な増殖が達成されるように、概して約３０～４０℃の加湿・制御大気下で、必要な添加物を含有する栄養素培地で培養される。細胞は、約１日と４日の間、通常は２日と３日の間の期間、増殖期で維持され得る。

【0108】

細胞培養の「移行期」という用語は、産生期の培養条件が関与する期間を意味する。移行期の間、細胞培養物の温度、培地浸透圧等の環境要因は、増殖条件から産生条件へと移動する。

【0109】

細胞培養の「産生期」という用語は、細胞増殖が停滞する／停滞を続ける期間を指す。対数的な細胞増殖は典型的には、この期の前、又は間に低下し、タンパク質産生に引き継がれる。産生期の間、対数的な細胞増殖は終わり、生成物（例えばポリペプチド）の生成が主となる。この期間の間、培地は、概して、タンパク質の連続した生成を支持し、所望の生成物（糖タンパク質であり得る）を達成するために補充される。フェドバッチ培養及び／又は還流細胞培養プロセスは、この期の間に細胞培地を補充するか又は新鮮な培地を提供して、所望の細胞密度、生存率、及び／又は組換えタンパク質生成物の力価を達成及び／又は維持する。産生期は大規模に実施することができる。

【0110】

用語「発現」又は「発現する」は、本明細書において、宿主細胞内で生じる転写及び翻訳を意味するように用いられる。宿主細胞内での産生遺伝子の発現度合いは、細胞内に存在する、対応するｍＲＮＡの量、又は、細胞により産生される産生遺伝子によりコードされるタンパク質の量のいずれかに基づいて測定することができる。例えば、産生遺伝子から転写されるｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーションにより定量化され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｐｐ． ７．３－７．５７（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）。産生遺伝子によりコードされるタンパク質は、タンパク質の生物活性をアッセイすること、又はそのような活性とは無関係な、タンパク質と反応可能な抗体を使用するウエスタンブロット若しくはラジオイムノアッセイなどのアッセイを用いることのいずれかにより定量化することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｐｐ． １８．１－１８．８８（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）。

【0111】

「細胞密度」という用語は、所与の体積の培地中での、細胞の数を指す。特定の実施態様では、より高いタンパク質の生産性をもたらすという点で、高い細胞密度が望ましい。細胞密度は、培地からサンプルを抽出し、顕微鏡の下で細胞を分析すること、市販されている細胞計数装置を使用すること、又は、バイオリアクターそのもの（若しくは培地及び懸濁細胞が通過して、バイオリアクターに戻るループ）に導入した、市販されている好適なプローブを使用することを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の技術によりモニタリングすることができる。

【0112】

５．２ ＢＡＸ及びＢＡＫの発現を調節するための方法
本明細書では、遺伝子組換えシステムを用いて（ａ）Ｂａｘポリペプチドアイソフォームの発現；及び（ｂ）Ｂａｋポリペプチドアイソフォームの発現を調節（すなわちノックダウン又はノックアウト）することにより、真核細胞におけるアポトーシス活性を低下させる方法が提供される。これはまた、真核宿主細胞中への機能喪失変異又は機能減弱変異の安定した組み込みを可能にする任意の真核宿主細胞に変異を導入することにより、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は安定した機能減弱変異を提供する。安定した組み込みを可能にする真核宿主細胞は、標的組込み（ＴＩ）（例えば、国際公開第２０１９／１２６６３４号に記載されるようなもの）、ランダム組込み（ＲＩ）、又はトランスポサーゼ媒介組込みを含む様々な方法によって生成され得る。当該技術分野で知られる様々な遺伝子組換えシステムは、前記機能喪失又は機能減弱組換えに使用することができる。このような組換えシステムの非制限的な例には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムが含まれる。従来の、改善された、又は修正されたＣａｓシステム、及び、Ｃｐｆ－１などの、その他の細菌ベースのゲノム切除ツールを含む、当該技術分野において公知の任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、本明細書で開示される方法と共に使用することができる。

【0113】

特定の実施態様では、本開示の細胞は、ＢＡＸの発現の低下又は排除を示す。特定の実施態様では、本明細書で使用されるＢＡＸは、真核生物ＢＡＸ細胞タンパク質、例えば、ＣＨＯ ＢＡＸ細胞タンパク質（Ｅｎｔｒｅｚ遺伝子ＩＤ：１００６８９０３２；ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＥＦ１０４６４３．１）、及びその機能的バリアントを指す。特定の実施態様では、本明細書で使用される場合、ＢＡＸの機能的バリアントは、目的の組換え生成物の生成に使用される修飾細胞の野生型ＢＡＸ配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を有するＢＡＸ配列バリアントを包含する。

【0114】

特定の実施態様では、本開示の細胞は、ＢＡＫの発現の低下又は排除を示す。特定の実施態様では、本明細書で使用されるＢＡＫは、真核生物ＢＡＫ細胞タンパク質、例えば、ＣＨＯ ＢＡＫ細胞タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ：ＥＦ１０４６４４．１）、及びその機能的バリアントを指す。特定の実施態様では、本明細書で使用される場合、ＢＡＫの機能的バリアントは、目的の組換え生成物の生成に使用される修飾細胞の野生型ＢＡＫ配列と５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一性を有するＢＡＫ配列バリアントを包含する。

【0115】

Ｂａｘ遺伝子及び／又はＢａｋ遺伝子のそれぞれの全遺伝子又は一部は、Ｂａｘポリペプチド及び／又はＢａｋポリペプチドの発現を調節、例えばノックダウン又はノックアウトするために欠失され得る。Ｂａｘ遺伝子の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％が欠失され得る。Ｂａｋ遺伝子の少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％が欠失され得る。Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、又は少なくとも約９０％が欠失され得る。

【0116】

Ｂａｘ遺伝子の約２％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下、又は約９０％以下が欠失され得る。Ｂａｋ遺伝子の約２％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下、又は約９０％以下が欠失され得る。Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの約２％以下、約５％以下、約１０％以下、約１５％以下、約２０％以下、約２５％以下、約３０％以下、約３５％以下、約４０％以下、約４５％以下、約５０％以下、約５５％以下、約６０％以下、約６５％以下、約７０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下、又は約９０％以下が欠失され得る。

【0117】

特定の実施態様では、Ｂａｘ遺伝子の約２％と約９０％の間、約１０％と約９０％の間、約２０％と約９０％の間、約２５％と約９０％の間、約３０％と約９０％の間、約４０％と約９０％の間、約５０％と約９０％の間、約６０％と約９０％の間、約７０％と約９０％の間、約８０％と約９０％の間、約８５％と約９０％の間、約２％と約８０％の間、約１０％と約８０％の間、約２０％と約８０％の間、約３０％と約８０％の間、約４０％と約８０％の間、約５０％と約８０％の間、約６０％と約８０％の間、約７０％と約８０％の間、約７５％と約８０％の間、約２％と約７０％の間、約１０％と約７０％の間、約２０％と約７０％の間、約３０％と約７０％の間、約４０％と約７０％の間、約５０％と約７０％の間、約６０％と約７０％の間、約６５％と約７０％の間、約２％と約６０％の間、約１０％と約６０％の間、約２０％と約６０％の間、約３０％と約６０％の間、約４０％と約６０％の間、約５０％と約６０％の間、約５５％と約６０％の間、約２％と約５０％の間、約１０％と約５０％の間、約２０％と約５０％の間、約３０％と約５０％の間、約４０％と約５０％の間、約４５％と約５０％の間、約２％と約４０％の間、約１０％と約４０％の間、約２０％と約４０％の間、約３０％と約４０％の間、約３５％と約４０％の間、約２％と約３０％の間、約１０％と約３０％の間、約２０％と約３０％の間、約２５％と約３０％の間、約２％と約２０％の間、約５％と約２０％の間、約１０％と約２０％の間、約１５％と約２０％の間、約２％と約１０％の間、約５％と約１０％の間、又は約２％と約５％の間が欠失され得る。特定の実施態様では、Ｂａｋ遺伝子の約２％と約９０％の間、約１０％と約９０％の間、約２０％と約９０％の間、約２５％と約９０％の間、約３０％と約９０％の間、約４０％と約９０％の間、約５０％と約９０％の間、約６０％と約９０％の間、約７０％と約９０％の間、約８０％と約９０％の間、約８５％と約９０％の間、約２％と約８０％の間、約１０％と約８０％の間、約２０％と約８０％の間、約３０％と約８０％の間、約４０％と約８０％の間、約５０％と約８０％の間、約６０％と約８０％の間、約７０％と約８０％の間、約７５％と約８０％の間、約２％と約７０％の間、約１０％と約７０％の間、約２０％と約７０％の間、約３０％と約７０％の間、約４０％と約７０％の間、約５０％と約７０％の間、約６０％と約７０％の間、約６５％と約７０％の間、約２％と約６０％の間、約１０％と約６０％の間、約２０％と約６０％の間、約３０％と約６０％の間、約４０％と約６０％の間、約５０％と約６０％の間、約５５％と約６０％の間、約２％と約５０％の間、約１０％と約５０％の間、約２０％と約５０％の間、約３０％と約５０％の間、約４０％と約５０％の間、約４５％と約５０％の間、約２％と約４０％の間、約１０％と約４０％の間、約２０％と約４０％の間、約３０％と約４０％の間、約３５％と約４０％の間、約２％と約３０％の間、約１０％と約３０％の間、約２０％と約３０％の間、約２５％と約３０％の間、約２％と約２０％の間、約５％と約２０％の間、約１０％と約２０％の間、約１５％と約２０％の間、約２％と約１０％の間、約５％と約１０％の間、又は約２％と約５％の間が欠失され得る。特定の実施態様では、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの約２％と約９０％の間、約１０％と約９０％の間、約２０％と約９０％の間、約２５％と約９０％の間、約３０％と約９０％の間、約４０％と約９０％の間、約５０％と約９０％の間、約６０％と約９０％の間、約７０％と約９０％の間、約８０％と約９０％の間、約８５％と約９０％の間、約２％と約８０％の間、約１０％と約８０％の間、約２０％と約８０％の間、約３０％と約８０％の間、約４０％と約８０％の間、約５０％と約８０％の間、約６０％と約８０％の間、約７０％と約８０％の間、約７５％と約８０％の間、約２％と約７０％の間、約１０％と約７０％の間、約２０％と約７０％の間、約３０％と約７０％の間、約４０％と約７０％の間、約５０％と約７０％の間、約６０％と約７０％の間、約６５％と約７０％の間、約２％と約６０％の間、約１０％と約６０％の間、約２０％と約６０％の間、約３０％と約６０％の間、約４０％と約６０％の間、約５０％と約６０％の間、約５５％と約６０％の間、約２％と約５０％の間、約１０％と約５０％の間、約２０％と約５０％の間、約３０％と約５０％の間、約４０％と約５０％の間、約４５％と約５０％の間、約２％と約４０％の間、約１０％と約４０％の間、約２０％と約４０％の間、約３０％と約４０％の間、約３５％と約４０％の間、約２％と約３０％の間、約１０％と約３０％の間、約２０％と約３０％の間、約２５％と約３０％の間、約２％と約２０％の間、約５％と約２０％の間、約１０％と約２０％の間、約１５％と約２０％の間、約２％と約１０％の間、約５％と約１０％の間、又は約２％と約５％の間が欠失され得る。

【0118】

Ｂａｘポリペプチド及び／又はＢａｋポリペプチドの発現を調節するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが用いられ得る。クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、原核細胞にて発見されたゲノム編集ツールである。ゲノム編集に利用する場合、システムは、Ｃａｓ９（ｃｒＲＮＡをガイドとして利用してＤＮＡを修飾することができるタンパク質）、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９により使用され、Ｃａｓ９と活性の複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（一般にヘアピンループ形態である）に結合する領域と共に、宿主ＤＮＡの正しい部分にｃｒＲＮＡをガイドするためのＲＮＡを含有する）、及び、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡに結合し、Ｃａｓ９との活性の複合体を形成する）を含む。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドヌクレアーゼの、細胞中のゲノム配列又はエピソーム配列などの標的配列への特異的会合（又は「標的化」）を促進する任意の核酸を指す。ｇＲＮＡは、単分子（単一のＲＮＡ分子を含み、代わりにキメラと呼ばれる）又はモジュラー（通常は、例えば二重化によって、相互に関連付けられているｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡなどの複数の、典型的には２つの別個のＲＮＡ分子を含む）であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法では、哺乳動物細胞をトランスフェクションするためのベクターを使用することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、Ｃａｓ９を使用して、細胞内の標的ＤＮＡを識別して、直接結合するための配列であるため、各用途に対して設計することができる。複数のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを合わせてパッケージ化して、一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。細胞内にトランスフェクションするために、ｓｇＲＮＡをＣａｓ９遺伝子と共に結合させ、ベクター内に組み入れることができる。

【0119】

１つ又は複数のＢａｘポリペプチド及び／又はＢａｋポリペプチドの発現の調節における使用のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９分子と、Ｂａｘ遺伝子及び／又はＢａｋ遺伝子の標的配列に相補的である標的ドメインを含む１つ又は複数のｇＲＮＡとを含み得る。標的遺伝子は、Ｂａｘ遺伝子及び／又はＢａｋ遺伝子の領域であり得る。したがって、標的配列は、Ｂａｘ遺伝子内の任意のエキソン又はイントロン領域であり得、例えば、その標的化は、Ｂａｘポリペプチドの発現を排除又は低下させる。したがって、標的配列は、Ｂａｋ遺伝子内の任意のエキソン又はイントロン領域であり得、例えば、その標的化は、Ｂａｋポリペプチドの発現を排除又は低下させる。

【0120】

ｇＲＮＡは、単一ベクターの細胞に投与され得、Ｃａｓ９分子は、第２のベクターの細胞に投与され得る。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９分子は、単一ベクターの細胞に投与され得る。あるいは、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９分子のそれぞれは、別個のベクターによって投与され得る。実施例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、１つ又は複数のｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓ９タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として細胞に送達され得、例えば、エレクトロポレーションによって送達され得る（ＲＮＰを細胞に送達するさらなる方法については、例えば、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ １２１－１２２：９－１５（２０１７）を参照のこと）。細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを投与すると、典型的には、ＢａｘポリペプチドとＢａｋポリペプチドの両方の発現のノックアウト又はノックダウンがもたらされる。

【0121】

Ｂａｘポリペプチド及び／又はＢａｋポリペプチドの発現を調節するために使用される遺伝子組換えシステムは、ＺＦＮシステムであり得る。ＺＦＮは制限酵素として作用することができ、これは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより作製される。ジンクフィンガードメインを操作して、特異的なＤＮＡ配列を標的化することができ、これにより、ジンクフィンガーヌクレアーゼが、ゲノム内で所望の配列を標的化することが可能になる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは典型的には、複数の、個別のジンクフィンガー反復を含有し、それぞれが複数の塩基対を認識することができる。新しいジンクフィンガードメインを生成するための、最も一般的な方法は、既知の特異性を有する小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的な、ＺＦＮの切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の、非特異的切断ドメインである。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列内で二本鎖の切断（ＤＳＢ）を行うことにより、タンパク質の発現を調節し、これは、相同テンプレートの不存在下にて、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復される。このような修復は、塩基対の欠失又は挿入をもたらし、フレームシフトを生成し、有害なタンパク質の産生を防ぐことができる（Ｄｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；３３（１８）：５９７８－９０（２００５））。ＺＦＮの複数の対を使用して、ゲノム配列の大きなセグメント全体を完全に削除することもできる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．；２０（１）：８１－９（２０１０））。標的遺伝子は、Ｂａｘ遺伝子の一部であり得る。標的遺伝子は、Ｂａｋ遺伝子の一部であり得る。

【0122】

Ｂａｘポリペプチド及び／又はＢａｋポリペプチドの発現を調節するために使用される遺伝子組換えシステムは、ＴＡＬＥＮシステムであり得る。ＴＡＬＥＮは、操作してＤＮＡの特異的な配列を切断することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮシステムは、ＺＦＮに類似した原理で作動する。ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクターＤＮＡ結合ドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと組み合わせることにより生成される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特定のヌクレオチドを強く認識する２つの可変位置を有する３３～３４のアミノ酸の繰り返しモチーフで構成されている。これらのＴＡＬＥのアレイを組み立てることにより、ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインを操作して所望のＤＮＡ配列に結合し、それによってヌクレアーゼがゲノムの特定の位置で切断するように誘導することができる（Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；２９（２）：１３５－６（２０１１）。標的遺伝子は、Ｂａｘ遺伝子の一部であり得る。標的遺伝子は、Ｂａｋ遺伝子の一部であり得る。

【0123】

本明細書で開示される遺伝子組換えシステムは、ウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクター等のレトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを使用して哺乳動物細胞に送達され得る。キャプシドタンパク質が、ヒト細胞を感染させるのに機能的である場合、レトロウイルスベクターと、適切なパッケージング株の組み合わせが好適である。ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：４３１－４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：２８９５－２９０２）；及びＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ， ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：６４６０－６４６４）を含むがこれらに限定されない様々な両種性ウイルス産生株が知られている。非両種性粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４、又はＧＡＬＶエンベロープ及び当該技術分野で知られている他の任意のものでシュードタイプされた粒子も好適である。形質導入の可能な方法には、例えばＢｒｅｇｎｉ， ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０：１４１８－１４２２の方法による、細胞と産生細胞の直接共培養、又は適切な成長因子及びポリカチオンの有無にかかわらず、例えばＸｕ， ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔ． ２２：２２３－２３０；及びＨｕｇｈｅｓ， ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８９：１８１７の方法によるウイルス上清単独又は濃縮ベクターのストックとの培養も含まれる。

【0124】

他の形質導入ウイルスベクターを使用して、本明細書にて開示した哺乳動物細胞を修飾することができる。特定の実施態様では、選択されたベクターは、高い感染効率と安定した組み込み及び発現とを示す（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：４２３－４３０， １９９７；Ｋｉｄｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｙｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １５：８３３－８４４， １９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６６４１－６６４９， １９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３－２６７， １９９６；及びＭｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９４：１０３１９， １９９７を参照のこと）。使用することができる他のウイルスベクターには、例えば、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、又はヘルペスウイルス、例えばエプスタインバーウイルス（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５－１４， １９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５－１２８１， １９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４， １９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：５５－６１， １９９０；Ｓｈａｒｐ， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３３７：１２７７－１２７８， １９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３６：３１１－３２２， １９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：４０１－４０９， １９８４；Ｍｏｅｎ， Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １７：４０７－４１６， １９９１；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９８０－９９０， １９８９；ＬｅＧａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：９８８－９９０， １９９３；ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｃｈｅｓｔ １０７：７７Ｓ－８３Ｓ， １９９５のベクターも参照のこと）が含まれる。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床現場で使用されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ ３２３：３７０， １９９０、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，３９９，３４６号。）

【0125】

５．３ 細胞株
本開示は、単離された真核細胞株であって、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む、細胞株に関する。ある態様では、単離された細胞株は、真核細胞株である。

【0126】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む。

【0127】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む。

【0128】

特定の実施態様では、細胞株は、動物細胞株又は真菌細胞株である。細胞株は、動物細胞株、例えば哺乳動物細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞株には、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株（ＢＨＫ－２１細胞株を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞株は、ＣＨＯ細胞株、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体であり得る。細胞株は、真菌細胞株、例えば酵母細胞株であり得る。

【0129】

特定の実施態様では、細胞株は、ウイルスゲノムと、ウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとをさらに含む。

【0130】

特定の実施態様では、細胞株は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。

【0131】

目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、標的位置で細胞株の細胞ゲノムに組み込まれ得る。目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞株の細胞ゲノムに無作為に組み込まれ得る。目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、染色体外ポリヌクレオチドであり得る。目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、細胞株の染色体に組み込まれ得る。

【0132】

特定の実施態様では、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドは、標的位置で細胞株の細胞ゲノムに組み込まれ得る。このような標的化組込みは、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの１つ又は複数の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施態様では、標的化組込みは、１つ又は複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。標的化組込みは、相同組換えによって媒介され得る。標的化組込みは、外因性の部位特異的ヌクレアーゼとそれに続く相同性指向修復（ＨＤＲ）及び／又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介され得る。本開示による標的化組込みは、国際公開第２０１９／１２６６３４号でさらに説明される通りであり得る（例えば、国際公開第２０１９／１２６６３４号、セクション５．１、５．２、５．３、及び５．４、４２－５５頁を参照のこと。標的化組込みを使用して細胞を調製する方法は、セクション６．１及び６．２、５５－６７頁でさらに説明されている）。

【0133】

標的化組込みを用いる特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞（「ＴＩ宿主細胞」）のゲノムの特定の遺伝子座内の部位で組み込まれる。特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれている遺伝子座は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。

【0134】

特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列のすぐ５’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５、及びそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列のすぐ５’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。

【0135】

特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列のすぐ３’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７、及びそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択される。特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列のすぐ３’のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。

【0136】

特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５、及びそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によって５’に隣接している。特定の実施態様では、組み込まれた外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７、及びそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によって３’に隣接している。特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の５’に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、及び少なくとも約９９．９％相同である。特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列の３’に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、又はＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、及び少なくとも約９９．９％相同である。

【0137】

特定の実施態様では、組み込まれた外因性ヌクレオチド配列は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１、並びにそれらに少なくとも５０％相同な配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に作用可能に結合している。特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列に作用可能に結合しているヌクレオチド配列は、Ｃｏｎｔｉｇｓ ＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列に少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．９％相同である。

【0138】

特定の実施態様において、目的の生成物をコードする核酸を、トランスポサーゼ型組込みを使用して宿主細胞ゲノムに組み込むことができる。トランスポサーゼ型組込み技術は、例えば、Ｔｒｕｂｉｔｓｙｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ４５（１０）：ｅ８９（２０１７）， Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １１０（２５）：Ｅ２２７９－Ｅ２２８７（２０１３）及び国際公開第２００４／００９７９２号に開示されており、これらは参照によりその全文が本明細書に援用される。

【0139】

目的の生成物は、組換えポリペプチドであり得るか又はそれを含み得る。目的の生成物（組換えポリペプチドなど）は、抗体、抗原、酵素、又はワクチンであり得るか又はそれを含み得る。抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなり得る。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含み得る。目的の生成物は、複合分子、例えば、一部が抗体で一部がタンパク質であり得るか、又は非抗体複合タンパク質、及びそのような誘導体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体を含み得る。

【0140】

特定の実施態様では、細胞株は、ポリヌクレオチドと、野生型Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーとを含む、対応する真核細胞よりも高い比生産性を有する。例えば、細胞株は、ポリヌクレオチドと、野生型Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーとを含む、対応する真核細胞株の比生産性よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％高い比生産性（Ｑｐ）を有し得る。例えば、細胞株は、ポリヌクレオチドと、野生型Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む、対応する真核細胞株の力価よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、又は少なくとも約６０％高い力価を有し得る。

【0141】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離された真核細胞株よりもアポトーシスに対して耐性である。

【0142】

５．４ 細胞培養物
細胞培養物は、細胞培地と、少なくとも１つ（典型的には複数）の細胞とを含む。例えば、細胞培地は、細胞培地と複数の真核細胞とを含んでもよく、ここで、複数の各細胞は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む。

【0143】

細胞培地は、多くの成分を含有する。細胞培地は、制御された、人工の、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で細胞を維持及び成長させるのに必要な栄養物を提供する。細胞培地の特性及び組成は、特定の細胞要件によってさまざまである。重要なパラメータには、浸透圧、ｐＨ、及び栄養製剤が含まれる。

【0144】

アミノ酸、グルコース、塩、ビタミン、及びその他の栄養物の混合物を含み、粉末又は液体のいずれかの形態で供給業者から入手可能である。これらの成分の要件は、細胞株によってさまざまである。ｐＨの調節は最適な培養条件にとって重要であり、一般に、適切な緩衝系を使用して達成される。化学的に定義された培地（ＣＤＭ）は、無菌状態で調製及び使用されるときに再現性のあるコンタミネーションフリーの培地を提供するため、治療及び関連用途に好ましいが、いくつかの細胞型には、血清、タンパク質、又はその他の生物学的抽出物（酵母抽出物又は植物若しくは動物物質の酵素消化物など）を含む培地を使用することが必要な場合がある。

【0145】

細胞培養には、ビタミン、アミノ酸、有機塩、無機塩、及び緩衝剤から本質的になる極めて単純な定義培地も使用されてきた。しかし、このような培地（「基礎培地」と呼ばれることが多い）では、ほとんどの動物細胞が必要とする栄養含有量が、通常著しく不足している。したがって、これらの培地は、完全な培地を形成するために、例えば、供給物又はその他の添加物を補充する必要がある場合が多い。さらに、バッチ培養系では、培養細胞の生存率を、及び／又はポリペプチド（例えば、抗体、又は抗体の生物学的に機能する断片）、タンパク質、ペプチド、ホルモン、ウイルス若しくはウイルス様粒子、核酸、又はその断片などの生物学的生成物の生成を維持するために、濃縮した供給物又は添加物で培地を定期的に補充することが多い。

【0146】

基礎培地に存在し得る原料には、アミノ酸（窒素源）、ビタミン、無機塩、糖類（炭素源）、緩衝塩、及び脂質が含まれる。ある哺乳動物細胞培養系と共に使用するための基礎培地は、エタノールアミン、Ｄ－グルコース、Ｎ－［２－ヒドロキシエチル］－ピペラジン－Ｎ’－［２－エタンスルホン酸］（ＨＥＰＥＳ）、リノール酸、リポ酸、フェノールレッド、ＰＬＵＲＯＮｌＣ Ｆ６８、プトレシン、ピルビン酸ナトリウムを含み得る。

【0147】

培地に含まれ得るアミノ酸原料には、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ グルタミン、グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン（ｒｎｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、Ｌ フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリン、及びそれらの誘導体が含まれる。これらのアミノ酸は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から、商業的に入手することができる。

【0148】

培地に含まれ得るビタミン原料には、ビオチン、塩化コリン、Ｄ－Ｃａ２＋－パントテネート、葉酸、ｉ－イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、及びビタミンＢ１２が含まれる。これらのビタミンは、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から、商業的に入手することができる。

【0149】

培地に使用され得る無機塩原料には、１つ又は複数のカルシウム塩（例えば、ＣａＣｌ２）、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＫＣｌ、１つ又は複数のマグネシウム塩（例えばＭｇＣｌ２及び／又はＭｇＳＯ４）、１つ又は複数のマンガン塩（例えばＭｎＣｌ２）、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｎ２ＨＰＯ４、並びに微量元素セレニウム、バナジウム、亜鉛、及び銅のイオンが含まれる。これらの微量元素は、様々な形態で、好ましくは、Ｎａ２ＳｅＯ３、ＮＨ４ＶＯ３、ＺｎＳＯ４、及びＣｕＳＯ４などの塩の形態で提供され得る。これらの無機塩は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から、商業的に入手することができる。

【0150】

哺乳動物細胞の培養に有用な例示的な培地には、ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等の市販の培地が含まれ、これらは、宿主細胞の培養に適している。さらに、Ｈａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９７９）， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚ． ５８：４４；Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ（１９８０）， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５；米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；又は同第４，５６０，６５５号；国際公開第９０／０３４３０号；同第８７／００１９５号；米国再発行特許第３０，９８５号；又は米国特許第５，１２２，４６９号（これらの開示のすべては参照により本明細書に援用される）に記載されるいずれの培地も、宿主細胞の培地として使用され得る。これらの培地のうちのいずれかには、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩等）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオシド（アデノシン及びチミジン等）、抗生物質（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ^ＴＭ薬物等）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、並びにグルコース又は等価エネルギー源が補充され得る。任意の他の必要な補充物もまた、当業者に公知の適切な濃度で含まれ得る。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現のために選択された宿主細胞で既に使用したものであり、当業者に明らかであろう。例示的な培養条件は、Ｍ． Ｔａｋａｇｉ ａｎｄ Ｋ． Ｕｅｄａ， 「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏ ｌｕｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｎ ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９９４）， ４１， ５６５－５７０；Ｈ．Ｊ． Ｍｏｒｔｏｎ， 「Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ」， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（１９７０）， ６（２）， ８９－１０８；Ｊ． Ｖａｎ ｄｅｒ Ｖａｌｋ， ｅｔ ａｌ．，（２０１０）， 「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ－ｒｅｐｌａｃｉｎｇ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄｓ」， Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ２４（４）， １０５３－１０６３；Ｒ．Ｊ． Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， 「Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ：Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｋｅｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ」， ＢＩｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．（２０１９）， １１６（１２）， ３４４６－３４５６；Ｓ． Ｊａｎｏｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａ ｆｅｄ‐ｂａｔｃｈ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎｔｏ ｓｅｍｉ‐ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅ：Ｔｈｅ ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｍａｌｌ‐ｓｃａｌｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｓｈａｋｅ ｆｌａｓｋｓ ａｓ ｓｃａｌｅ‐ｄｏｗｎ ｍｏｄｅｌ」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．，（２０１９）， ３５（２）， ｅ２７５７；及びＭ． Ｋｕｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， 「Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｆｅｄ‐ｂａｔｃｈ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｆｅｅｄｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ＣＨＯ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ」， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ， １５ Ａｐｒｉｌ ２０１９， ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ ｂｔｐｒ．２８２１に提供されており、これらのすべては参照によりその全体が本明細書に援用される。

【0151】

ＣＨＯ細胞の産生に有用な例示的な培地は、任意にグリシン、ヒポキサンチン、及びチミジンを含有する、アミノ酸、塩類、糖、及びビタミン；組換えヒトインスリン、Ｐｒｉｍａｔｏｎｅ ＨＳ若しくはＰｒｉｍａｔｏｎｅ ＲＬ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）などの加水分解ペプトン、又は等価物；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８又は等価なプルロニックポリオールなどの、細胞保護剤；ゲンタマイシン；及び微量元素などの、いくつかの構成成分の濃度が変更された、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ Ｆ－１２系配合物などの、基礎培地構成成分（ＤＭＥＭ及びＨＡＭ Ｆ１２培地の組成物に関しては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８８、３４６－３４９頁を参照のこと）（米国特許第５，１２２，４６９号に記載の培地の配合物が、特に適切である）を含有し得る。

【0152】

細胞培養物は、組換えタンパク質を発現する、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む真核細胞を含み得る。組換えタンパク質は、様々な細胞培養条件下にて、目的の生成物を発現する細胞を成長させることにより産生することができる。例えば、タンパク質の大規模又は小規模産生のための、細胞培養手順は、本開示の文脈にて、潜在的に有用である。流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、振とうフラスコ培養、又は撹拌槽バイオリアクターシステムが挙げられるがこれらに限定されない手順を使用することができ（後者の２つのシステムでは、マイクロ担体と共に、又は無しで）、代替的にバッチ式、フェドバッチ培養式、又は連続モードで操作することができる。

【0153】

本開示の細胞培養は、撹拌槽バイオリアクターシステムで実施されてもよく、フェドバッチ培養手順が用いられる。フェドバッチ培養では、真核生物宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び培地が培養容器に最初に供給され、追加の培養栄養素が、培養終了前の定期的な細胞及び／又は生成物の採取の有無にかかわらず、培養中に培養物に継続して、又は個別に増加して供給される。フェドバッチ培養には、例えば、定期的に全ての培養物（細胞と培地を含む）が取り除かれ、新鮮な培地で交換される、半連続式フェドバッチ培養が含まれ得る。フェドバッチ培養は、細胞培養のための全ての構成成分（細胞、及び全ての培養栄養素を含む）が、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される、単純なバッチ培養とは区別される。フェドバッチ培養はさらに、上清がプロセス中に培養容器から取り除かれない限りにおいて、還流培養とは区別することができる（還流培養では、細胞は例えば、濾過、封入、マイクロ担体へのアンカリングにより、培養物中に保持される。そして培地が連続して、又は断続的に導入され、培養容器から取り除かれる）。

【0154】

想到される特定の宿主細胞及び特定の産生プランに好適であり得る、任意のスキーム又はルーティンに従い、培養物の細胞を増殖させることができる。したがって、本開示は、単一工程又は複数工程の培養手順を想到する。単一工程培養において、宿主細胞を培養環境に播種し、本開示のプロセスを、細胞培養の１回の産生期の間に用いる。あるいは、複数の段階培養を想到する。複数段階培養において、細胞は多数の工程又は段階で培養することができる。例えば、細胞を、第１工程又は増殖期培養中に成長させることができる。この段階において、場合により貯蔵庫から取り除かれた細胞が、成長及び高生存能を促進するのに好適な培地に播種される。新鮮な培地を宿主細胞培養物に添加することにより、細胞を好適な期間、増殖期で維持することができる。

【0155】

典型的にはフェドバッチ培養又は連続細胞培養条件を考案して、細胞培養物の増殖期における真核細胞（例えば哺乳動物細胞）の増殖を増強する。増殖期において、細胞は、増殖のために最大化された条件下、及び期間、増殖する。培養条件、例えば温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などは、特定の宿主で用いられるものであり、当業者には明らかであろう。概して、ｐＨは、酸（例えばＣＯ２）又は塩基（例えばＮａ２ＣＯ３又はＮａＯＨ）のいずれかを使用して、約６．５と７．５の間のレベルに調整される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞の培養に適切な温度範囲は、約３０℃と３８℃の間であり、適切なｄＯ２は空気飽和度の５～９０％である。

【0156】

特定の段階において、細胞を使用して、細胞培養の産生期又は産生工程を播種することができる。あるいは、上述のとおり、産生期又は工程を、播種又は増殖期又は工程と連続させることができる。

【0157】

本開示に記載される培養方法は、例えば、細胞培養の産生期に、細胞培養物から生成物を採取することをさらに含み得る。特定の実施態様では、本開示の細胞培養方法により生成された生成物は、第３のバイオリアクター、例えば生成バイオリアクターから採取され得る。例えば、限定されるものではないが、開示した方法は、細胞培養の産生期の完了時に、生成物を回収することを含むことができる。あるいは、又はさらに、生成物は、産生期の完了前に回収することができる。特定の実施態様において、生成物は、特定の細胞密度が達成されると、細胞培養物から回収することができる。例えば、限定されるものではないが、細胞密度は、回収前に、約２．０×１０^７細胞／ｍＬ～約５．０×１０^７細胞／ｍＬであり得る。

【0158】

細胞培養物から生成物を採取することは、遠心分離、濾過、音波分離、凝集及び細胞除去技術のうちの１つ又は複数を含み得る。

【0159】

目的の生成物を宿主細胞から分泌させることができ、又は、目的の生成物は、膜結合、サイトゾル、若しくは核タンパク質であり得る。ポリペプチドの可溶形態を、条件づけられた細胞培地から精製することができ、発現する細胞から全ての膜画分を調製し、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などの非イオン性界面活性剤を用いて膜を抽出することにより、ポリペプチドの膜結合形態を精製し得る。宿主細胞を（例えば、機械的な力、音波処理、及び／又は界面活性剤により）溶解させ、遠心分離により細胞膜画分を取り除き、上清を保持することにより、サイトゾル又は核タンパク質を調製し得る。

【0160】

ある実施態様では、本発明は、本明細書に開示されるような真核細胞株であって、細胞株の細胞がＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む、真核細胞株と、本明細書に開示されるような細胞培地とを含む組成物を提供する。

【0161】

別の実施態様は、細胞培地と、複数の真核細胞であって、複数の各細胞がＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む、複数の真核生物細胞とを含む細胞培養物を提供する。細胞は、本明細書に開示されるような特徴をさらに有し得る。細胞培地は、本明細書に開示されるようにさらに定義され得る。

【0162】

５．５ 生成方法
特定の実施態様では、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法を提供する。特定の実施態様では、方法は、ポリペプチドの生成に適した条件下で真核細胞株を培養することを含む。特定の実施態様では、細胞株は、（ａ）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、（ｂ）組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む。

【0163】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、標的位置で細胞株の細胞の細胞ゲノムに組み込まれ得る。このような標的化組込みは、外因性ヌクレオチド配列が宿主細胞ゲノムの１つ又は複数の所定の部位に組み込まれることを可能にする。特定の実施態様では、標的化組込みは、１つ又は複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。標的化組込みは、相同組換えによって媒介され得る。標的化組込みは、外因性の部位特異的ヌクレアーゼとそれに続く相同性指向修復（ＨＤＲ）及び／又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって媒介され得る。本開示による標的化組込みは、国際公開第２０１９／１２６６３４号でさらに説明される通りであり得る（例えば、国際公開第２０１９／１２６６３４号、セクション５．１、５．２、５．３、及び５．４、４２－５５頁を参照のこと。標的化組込みを使用して細胞を調製する方法は、セクション６．１及び６．２、５５－６７頁でさらに説明されている）。

【0164】

ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞株の細胞の細胞ゲノムに無作為に組み込まれ得る。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、染色体外ポリヌクレオチドであり得る。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞株の細胞の染色体に組み込まれ得る。

【0165】

組換えポリペプチドは、抗体、抗原、酵素、又はワクチンであり得るか又はそれを含み得る。組換えポリペプチドは、抗体であり得るか又はそれを含み得る。組換えポリペプチドは、抗原であり得るか又はそれを含み得る。組換えポリペプチドは、酵素であり得るか又はそれを含み得る。組換えポリペプチドは、ワクチンであり得るか又はそれを含み得る。抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。抗体は、多重特異性抗体又はその抗原結合断片であり得る。抗体は、単一の重鎖配列及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなり得る。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含み得る。抗体は、モノクローナル抗体を含み得る。

【0166】

方法は、組換えポリペプチドを単離することをさらに含み得る。このような単離は、典型的には、細胞株から組換えポリペプチドを単離することを含む。組換えポリペプチドを単離することは、遠心分離、濾過、音波分離、凝集、及び細胞除去技術のうちの１つ又は複数を含むことができる。単離された組換えポリペプチドは、精製され得る。

【0167】

細胞株は、動物細胞株又は真菌細胞株であり得る。細胞株は、動物細胞株、例えば哺乳動物細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞株には、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株（ＢＨＫ－２１細胞株を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞株は、ＣＨＯ細胞株、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体であり得る。細胞株は、真菌細胞株、例えば酵母細胞株であり得る。

【0168】

細胞株は、細胞培地で培養され得る。細胞培地及び／又は細胞培養条件は、上の「細胞培養物」の見出しでさらに記載され得る。細胞株は、フェドバッチ培養条件又は灌流培養条件下で培養され得る。細胞株は、フェドバッチ培養条件下で培養され得る。フェドバッチ培養条件は、強化フェドバッチ培養条件であり得る。細胞株は、灌流培養条件下で培養され得る。灌流培養条件は、半連続灌流であり得る。灌流培養条件は、連続灌流であり得る。

【0169】

細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含み得る。

【0170】

特定の実施態様では、本開示は、ウイルスベクターを生成する方法を提供する。特定の実施態様では、方法は、ウイルスベクターの生成に適した条件下で真核細胞株を培養することを含む。特定の実施態様では、細胞株は、（ａ）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、（ｂ）ウイルスゲノムと、（ｃ）ウイルスベクターの生成に適した条件下でウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを含む。

【0171】

特定の実施態様では、方法は、ウイルスベクターを単離することをさらに含み得る。特定の実施態様では、単離することは、典型的には、細胞株からウイルスベクターを単離することを含む。ウイルスベクターを単離することは、遠心分離、濾過、音波分離、凝集、及び細胞除去技術のうちの１つ又は複数を含むことができる。単離されたウイルスベクターは、精製され得る。

【0172】

細胞株は、動物細胞株又は真菌細胞株であり得る。細胞株は、動物細胞株、例えば哺乳動物細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞株には、ハイブリドーマ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株（ＢＨＫ－２１細胞株を含む）、又はそれらの誘導体が含まれる。細胞株は、ＣＨＯ細胞株、例えば、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体であり得る。細胞株は、真菌細胞株、例えば酵母細胞株であり得る。

【0173】

細胞株は、細胞培地で培養され得る。細胞培地及び／又は細胞培養条件は、上の「細胞培養物」の見出しでさらに記載され得る。細胞株は、フェドバッチ培養条件又は灌流培養条件下で培養され得る。細胞株は、フェドバッチ培養条件下で培養され得る。フェドバッチ培養条件は、強化フェドバッチ培養条件であり得る。細胞株は、灌流培養条件下で培養され得る。灌流培養条件は、半連続灌流であり得る。灌流培養条件は、連続灌流であり得る。

【0174】

特定の実施態様では、細胞株は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含み得る。

【0175】

特定の実施態様では、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、本明細書に記載されるように（「Ｂａｘ及びＢａｋの発現を調節するための方法」の見出しの下）アポトーシス活性を低下させ、続いて本開示の方法によって（例えば上で開示されるように）組換えポリペプチドを生成することを含む、方法を提供する。

【0176】

５．６ 生成物
本開示の細胞、及び／又は細胞株、及び／又は方法を使用して、本明細書に開示される細胞によって発現し得る任意の目的の生成物を生成することができる。本開示の細胞、及び／又は細胞株、及び／又は本開示の方法は、ポリペプチド、例えば哺乳動物ポリペプチドの生成に使用され得る。このようなポリペプチドの非限定的な例には、ホルモン、受容体、抗体融合タンパク質（例えば、抗体－サイトカイン融合タンパク質）を含む融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質、及び抗体が含まれる。本開示の細胞、及び／又は細胞株、及び／又は方法は、典型的には、分子、例えば、生成される抗体に対して、特異的ではない。

【0177】

本開示の方法は、治療用及び診断用抗体、又はその抗原結合断片を含む抗体の生成に使用され得る。本開示の細胞、細胞株、及び／又は方法により生成される抗体は、単一特異性抗体（例えば、一本鎖重鎖配列及び一本鎖軽鎖配列からなる、このような対の多量体を含む抗体）、多重特異性抗体、及びその抗原結合断片であり得るが、これらに限定されない。例えば、限定されるものではないが、多重特異性抗体は、二重特異性抗体、二重エピトープ抗体、Ｔ細胞依存性二重特異性抗体（ＴＤＢ）、二重作用ＦＡｂ（ＤＡＦ）、又はこれらの抗原結合断片であることができる。

【0178】

多重特異性抗体
抗体は、多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体であり得る。「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部分、即ち異なる抗原の異なるエピトープ（即ち、二重特異的）、又は、同じ抗原の異なるエピトープ（即ち、二重エピトープ）に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。多重特異性抗体は、３以上の結合特異性を有し得る。多重特異性抗体は、本明細書に記載した完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。

【0179】

多重特異性抗体を作製するための技法には、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）を参照）及び「ノブ－イン－ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及びＡｔｗｅｌｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が含まれる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照）；２つ以上の抗体又は断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１（１９８５）を参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の産生（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８（５）：１５４７１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；軽鎖のミスペアリング問題を回避するための、一般的な軽鎖技術の使用（例えば国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３６８（１９９４）を参照）；及び例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。

【0180】

例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作された抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の別の非限定例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、同第２０１０／１１２１９３号、同第２０１０／１３６１７２号、同第２０１０／１４５７９２号、及び同第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。二重特異性抗体又はその抗原結合断片は、「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照のこと）。

【0181】

多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを有する非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）、又は完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０も参照）を交換することによっても、提供され得る。多重特異性抗体は、クロスＦａｂ断片を含み得る。「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」という用語は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）で構成されるポリペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン界面に導入して正しいＦａｂペアリングを指向することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５を参照のこと。

【0182】

多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当該技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。

【0183】

本明細書に同様に含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性型不変構成成分、例えば、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるためのＣＤ３とに同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。

【0184】

この目的に有用であり得る二重特異性抗体フォーマットのさらなる非限定的な例には、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーにより融合された、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号、及び同第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照のこと）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデム二重特異性抗体（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、さらなる安定化のための、Ｃ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、及び、全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子である、いわゆるトリオマブ（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３６，４５８－４６７（２０１０）で確認される）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる、具体的なＴ細胞二重特異性抗体形式は、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。

【0185】

抗体断片
本明細書に提供される細胞、及び／又は細胞株、及び／又は方法は、抗体断片であり得る。例えば、限定されるものではないが、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）２断片、特にＦａｂ断片であり得る。インタクトな抗体をパパイン消化すると、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ順にＶＨ及びＶＬ）に加えて、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）もそれぞれが含む、２つの同一の抗原結合断片（いわゆる「Ｆａｂ」断片）が得られる。よって「Ｆａｂ断片」とは、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片を有する抗体断片のことである。「Ｆａｂ’断片」は、抗体ヒンジ領域から１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にて、残基を添加することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させたＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。

【0186】

抗体は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディであり得る。「ダイアボディ」は、二価又は二重特異性であってよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディについても、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４（２００３）に記載されている。

【0187】

抗体断片は、一本鎖Ｆａｂ断片であり得る。「一本鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、上記抗体ドメイン及び上記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２個と５０個の間のアミノ酸のポリペプチドであり得る。当該一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ断片は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングによると、可変重鎖の位置４４及び可変軽鎖の位置１００）を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化し得る。

【0188】

抗体断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であり得る。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、典型的には、柔軟性のためにグリシンが、かつ、溶解性のためにセリン又はスレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、又はこの逆のいずれかで、接続させることができる。このタンパク質は、定常領域が取り除かれ、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持することができる。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， １１３巻， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）， ｐ． ２６９－３１５（１９９４）を参照のこと。また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照のこと。

【0189】

抗体断片は、単一ドメイン抗体であり得る。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体であり得る（Ｄｏｍａｎｔｉｓ， Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照）。

【0190】

特定の態様では、本明細書において提供される細胞及び方法により生成される抗体融合タンパク質は、抗体－サイトカイ融合タンパク質である。このような抗体－サイトカイン融合タンパク質は完全長抗体を含み得る一方、抗体－サイトカイン融合タンパク質の抗体は、特定の実施態様では、抗体断片、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、又は小さな免疫タンパク質（ＳＩＰ）である。特定の実施態様では、サイトカインは、抗体のＮ末端又はＣ末端に融合され得る。特定の実施態様では、抗体－サイトカイン融合タンパク質のサイトカインは、複数のサブユニットからなる。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、同じ（ホモマー）である。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、異なる（ヘテロマーである）。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、同じ抗体に融合する。特定の実施態様では、サイトカインのサブユニットは、異なる抗体に融合する。抗体－サイトカイン融合タンパク質の総説については、例えば、Ｍｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５２：４２－５３（２０１９）を参照のこと。

【0191】

抗体断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解を含むがこれに限定されない、様々な技術により作製され得る。

【0192】

キメラ抗体及びヒト化抗体
本明細書で提供される細胞、及び／又は細胞株、及び／又は方法は、キメラ抗体であり得る。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４８１６５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１：６８５１－６８５５（１９８４）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えば、サル由来の可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが親抗体のそれから変更されている「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。

【0193】

キメラ抗体は、ヒト化抗体であり得る。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低下させるようにヒト化される一方、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持する。概して、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部分）が非ヒト抗体に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はの一部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含み得る。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体におけるいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を復元又は改善するように、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。

【0194】

ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えばＡｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ， Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９－１６３３（２００８）で総説されており、さらに、例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）、米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）のグラフティングを記載）、Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」を記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載）、並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導選択」アプローチを記載）に記載されている。

【0195】

ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域には、以下が含まれるが、これらに限定されない： 「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：２６２３（１９９３）を参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）；及びＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）。

【0196】

ヒト抗体
本明細書で提供される細胞、及び／又は細胞株、及び／又は方法は、ヒト抗体であり得る。ヒト抗体は、当該技術分野で知られる様々な技法を使用して産生され得る。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。

【0197】

ヒト抗体は、抗原曝露に応答して、インタクトなヒト抗体、又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座に取って代わるか、又は染色体外に存在するか、若しくは動物の染色体にランダムに組み込まれるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部分を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、概して不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照のこと。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術を記載している、米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号；ＨｕＭａｂ（登録商標）技術を記載している米国特許第５７７０４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許第７０４１８７０号、及びＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載している米国特許公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物によって生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによってさらに修飾することができる。

【0198】

ヒト抗体はまた、ハイブリドーマベースの方法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐｐ． ５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７：８６（１９９１）を参照のこと。） ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体はまた、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３：３５５７－３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法は、例えば、米国特許第７１８９８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生を記載）及びＮｉ， Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ， ２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されるものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ， Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ２７（３）：１８５－９１（２００５）に記載されている。

【0199】

標的分子
本明細書で開示される細胞及び方法により生成された抗体により標的化され得る分子の非限定的な例には、可溶性血清タンパク質及びそれらの受容体、並びに他の膜結合タンパク質（例えばアドヘシン）が含まれる。特定の実施例では、本明細書で開示される細胞及び方法により産生される抗体は、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１ ０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（ＥＰＳＥＬＯＮ）、ＦＥＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ １Ａ、ＩＬ １Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１ ０、ＩＬ １１、ＩＬ １２Ａ、ＩＬ １２Ｂ、ＩＬ １３、ＩＬ １４、ＩＬ １５、ＩＬ １６、ＩＬ １７、ＩＬ １７Ｂ、ＩＬ １８、ＩＬ １９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ １１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２， ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ， ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２， ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯからなる群から選択される、１つ、２つ又はそれ以上のサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカイン受容体に結合することができる。

【0200】

本明細書で開示される細胞及び方法により生成される抗体は、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質に結合することができる場合がある。

【0201】

特定の実施例では、本明細書で開示される方法により生成された抗体（例えば、二重特異性抗体などの多重特異性抗体）は、以下から選択される１つ又は複数の標的分子に結合することができる：０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（すなわち、卵巣がん抗原）、ＡＢＣＦ１；ＡＣＶＲ１；ＡＣＶＲ１Ｂ；ＡＣＶＲ２；ＡＣＶＲ２Ｂ；ＡＣＶＲＬ１；ＡＤＯＲＡ２Ａ；アグリカン；ＡＧＲ２；ＡＩＣＤＡ；ＡＩＦ１；ＡＩＧ１；ＡＫＡＰ１；ＡＫＡＰ２；ＡＭＨ；ＡＭＨＲ２；アミロイドベータ；ＡＮＧＰＴＬ；ＡＮＧＰＴ２；ＡＮＧＰＴＬ３；ＡＮＧＰＴＬ４；ＡＮＰＥＰ；ＡＰＣ；ＡＰＯＣ１；ＡＲ；ＡＳＬＧ６５９；ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータ－ヒドロキシラーゼドメイン含有１；ＬＯＣ２５３９８２）；ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）；Ｂ７．１；Ｂ７．２；ＢＡＤ；ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３；ＢＡＧ１；ＢＡＩ１；ＢＣＬ２；ＢＣＬ６；ＢＤＮＦ；ＢＬＮＫ；ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）；ＢＭＰ１；ＢＭＰ２；ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）；ＢＭＰ４；ＢＭＰ６；ＢＭＰ８；ＢＭＰＲ１Ａ；ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体－ＩＢ型）；ＢＭＰＲ２；ＢＰＡＧ１（プレクチン）；ＢＲＣＡ１；ブレビカン；Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）；Ｃ３；Ｃ４Ａ；Ｃ５；Ｃ５Ｒ１；ＣＡＮＴ１；ＣＡＳＰ１；ＣＡＳＰ４；ＣＡＶ１；ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）；ＣＣＬ１（１－３０９）；ＣＣＬ１１（エオタキシン）；ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）；ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）；ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）；ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）；ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）；ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）；ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）；ＭＣＡＦ；ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）；ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）；ＳＬＣ；エクソダス－２；ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）；ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）；ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）；ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）；ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）；ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）；ＣＣＬ２８；ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉα）；ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉβ）；ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）；ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）；ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）；ＣＣＮＡ１；ＣＣＮＡ２；ＣＣＮＤ１；ＣＣＮＥ１；ＣＣＮＥ２；ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）；ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲβ／ＲＡ）；ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）；ＣＣＲ４；ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）；ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）；ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）；ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）；ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）；ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）；ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）；ＣＤ１６４；ＣＤ１９；ＣＤ１Ｃ；ＣＤ２０；ＣＤ２００；ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）；ＣＤ２４；ＣＤ２８；ＣＤ３；ＣＤ３７；ＣＤ３８；ＣＤ３Ｅ；ＣＤ３Ｇ；ＣＤ３Ｚ；ＣＤ４；ＣＤ４０；ＣＤ４０Ｌ；ＣＤ４４；ＣＤ４５ＲＢ；ＣＤ５２；ＣＤ６９；ＣＤ７２；ＣＤ７４；ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）；ＣＤ７９Ｂ；ＣＤＳ；ＣＤ８０；ＣＤ８１；ＣＤ８３；ＣＤ８６；ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）；ＣＤＨ１０；ＣＤＨ１２；ＣＤＨ１３；ＣＤＨ１８；ＣＤＨ１９；ＣＤＨ２０；ＣＤＨ５；ＣＤＨ７；ＣＤＨ８；ＣＤＨ９；ＣＤＫ２；ＣＤＫ３；ＣＤＫ４；ＣＤＫ５；ＣＤＫ６；ＣＤＫ７；ＣＤＫ９；ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）；ＣＤＫＮ１Ｃ；ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）；ＣＤＫＮ２Ｂ；ＣＤＫＮ２Ｃ；ＣＤＫＮ３；ＣＥＢＰＢ；ＣＥＲ１；ＣＨＧＡ；ＣＨＧＢ；キチナーゼ；ＣＨＳＴ１０；ＣＫＬＦＳＦ２；ＣＫＬＦＳＦ３；ＣＫＬＦＳＦ４；ＣＫＬＦＳＦ５；ＣＫＬＦＳＦ６；ＣＫＬＦＳＦ７；ＣＫＬＦＳＦ８；ＣＬＤＮ３；ＣＬＤＮ７（クローディン－７）；ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）；ＣＬＮ３；ＣＬＵ（クラスタリン）；ＣＭＫＬＲ１；ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）；ＣＮＲ１；ＣＯＬ １８Ａ１；ＣＯＬ１Ａ１；ＣＯＬ４Ａ３；ＣＯＬ６Ａ１；補体因子Ｄ；ＣＲ２；ＣＲＰ；ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形癌由来増殖因子）；ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）；ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）；ＣＴＬＡ４；ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）；ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）；ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）；ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）；ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）；ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）；ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）；ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）；ＣＸＣＬ１３；ＣＸＣＬ１４；ＣＸＣＬ１６；ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）；ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）；ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）；ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）；ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）；ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）；ＣＸＣＲ４；ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質共役受容体）；ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）；ＣＹＢ５；ＣＹＣ１；ＣＹＳＬＴＲ１；ＤＡＢ２ＩＰ；ＤＥＳ；ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８；ＤＮＣＬＩ；ＤＰＰ４；Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）；Ｅ２Ｆ１；ＥＣＧＦ１；ＥＤＧ１；ＥＦＮＡ１；ＥＦＮＡ３；ＥＦＮＢ２；ＥＧＦ；ＥＧＦＲ；ＥＬＡＣ２；ＥＮＧ；ＥＮＯ１；ＥＮＯ２；ＥＮＯ３；ＥＰＨＢ４；ＥｐｈＢ２Ｒ；ＥＰＯ；ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）；ＥＲＥＧ；ＥＲＫ８；ＥＳＲ１；ＥＳＲ２；ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）；Ｆ３（ＴＦ）；ＦＡＤＤ；ＦａｓＬ；ＦＡＳＮ；ＦＣＥＲ１Ａ；ＦＣＥＲ２；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）；ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）；ＦＧＦ；ＦＧＦ１（αＦＧＦ）；ＦＧＦ１０；ＦＧＦ１１；ＦＧＦ１２；ＦＧＦ１２Ｂ；ＦＧＦ１３；ＦＧＦ１４；ＦＧＦ１６；ＦＧＦ１７；ＦＧＦ１８；ＦＧＦ１９；ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）；ＦＧＦ２０；ＦＧＦ２１；ＦＧＦ２２；ＦＧＦ２３；ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）；ＦＧＦ４（ＨＳＴ）；ＦＧＦ５；ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）；ＦＧＦ７（ＫＧＦ）；ＦＧＦ８；ＦＧＦ９；ＦＧＦＲ；ＦＧＦＲ３；ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）；ＦＥＬｌ（ＥＰＳＩＬＯＮ）；ＦＩＬｌ（ＺＥＴＡ）；ＦＬＪ１２５８４；ＦＬＪ２５５３０；ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）；ＦＬＴ１；ＦＯＳ；ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）；ＦＹ（ＤＡＲＣ）；ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）；ＧＡＧＥＢ１；ＧＡＧＥＣ１；ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ；ＧＡＴＡ３；ＧＤＦ５；ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１；ＧＦＲＡ１；ＧＤＮＦＲ；ＧＤＮＦＲＡ；ＲＥＴＬ１；ＴＲＮＲ１；ＲＥＴ１Ｌ；ＧＤＮＦＲ－アルファ１；ＧＦＲ－ＡＬＰＨＡ－１）；ＧＥＤＡ；ＧＦＩ１；ＧＧＴ１；ＧＭ－ＣＳＦ；ＧＮＡＳＩ；ＧＮＲＨＩ；ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）；ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役受容体１９；Ｍｍ．４７８７）；ＧＰＲ３１；ＧＰＲ４４；ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体；ＫＩＳＳ１Ｒ；ＧＰＲ５４；ＨＯＴ７Ｔ１７５；ＡＸＯＲ１２）；ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）；ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役受容体１７２Ａ；ＧＰＣＲ４１；ＦＬＪ１１８５６；Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）；ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）；ＧＲＰ；ＧＳＮ（ゲルソリン）；ＧＳＴＰ１；ＨＡＶＣＲ２；ＨＤＡＣ４；ＨＤＡＣ５；ＨＤＡＣ７Ａ；ＨＤＡＣ９；ＨＧＦ；ＨＩＦ１Ａ；ＨＯＰ１；ヒスタミン及びヒスタミン受容体；ＨＬＡ－Ａ；ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子のベータサブユニット（Ｉａ抗原）；ＨＬＡ－ＤＲＡ；ＨＭ７４；ＨＭＯＸＩ；ＨＵＭＣＹＴ２Ａ；ＩＣＥＢＥＲＧ；ＩＣＯＳＬ；１Ｄ２；ＩＦＮ－ａ；ＩＦＮＡ１；ＩＦＮＡ２；ＩＦＮＡ４；ＩＦＮＡ５；ＩＦＮＡ６；ＩＦＮＡ７；ＩＦＮＢ１；ＩＦＮガンマ；ＤＦＮＷ１；ＩＧＢＰ１；ＩＧＦ１；ＩＧＦ１Ｒ；ＩＧＦ２；ＩＧＦＢＰ２；ＩＧＦＢＰ３；ＩＧＦＢＰ６；ＩＬ－ｌ；ＩＬ１０；ＩＬ１０ＲＡ；ＩＬ１０ＲＢ；ＩＬ１１；ＩＬ１１ＲＡ；ＩＬ－１２；ＩＬ１２Ａ；ＩＬ１２Ｂ；ＩＬ１２ＲＢ１；ＩＬ１２ＲＢ２；ＩＬ１３；ＩＬ１３ＲＡ１；ＩＬ１３ＲＡ２；ＩＬ１４；ＩＬ１５；ＩＬ１５ＲＡ；ＩＬ１６；ＩＬ１７；ＩＬ１７Ｂ；ＩＬ１７Ｃ；ＩＬ１７Ｒ；ＩＬ１８；ＩＬ１８ＢＰ；ＩＬ１８Ｒ１；ＩＬ１８ＲＡＰ；ＩＬ１９；ＩＬ１Ａ；ＩＬ１Ｂ；ＩＬＩＦ１０；ＩＬ１Ｆ５；ＩＬ１Ｆ６；ＩＬ１Ｆ７；ＩＬ１Ｆ８；ＩＬ１Ｆ９；ＩＬ１ＨＹ１；ＩＬ１Ｒ１；ＩＬ１Ｒ２；ＩＬ１ＲＡＰ；ＩＬ１ＲＡＰＬ１；ＩＬ１ＲＡＰＬ２；ＩＬ１ＲＬ１；ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ；ＩＬ２；ＩＬ２０；ＩＬ２０Ｒα；ＩＬ２１ Ｒ；ＩＬ２２；ＩＬ－２２ｃ；ＩＬ２２Ｒ；ＩＬ２２ＲＡ２；ＩＬ２３；ＩＬ２４；ＩＬ２５；ＩＬ２６；ＩＬ２７；ＩＬ２８Ａ；ＩＬ２８Ｂ；ＩＬ２９；ＩＬ２ＲＡ；ＩＬ２ＲＢ；ＩＬ２ＲＧ；ＩＬ３；ＩＬ３０；ＩＬ３ＲＡ；ＩＬ４；ＩＬ４Ｒ；ＩＬ５；ＩＬ５ＲＡ；ＩＬ６；ＩＬ６Ｒ；ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）；インフルエンザＡ；インフルエンザＢ；ＥＬ７；ＥＬ７Ｒ；ＥＬ８；ＩＬ８ＲＡ；ＤＬ８ＲＢ；ＩＬ８ＲＢ；ＤＬ９；ＤＬ９Ｒ；ＤＬＫ；ＩＮＨＡ；ＩＮＨＢＡ；ＩＮＳＬ３；ＩＮＳＬ４；ＩＲＡＫ１；ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）；ＥＲＡＫ２；ＩＴＧＡ１；ＩＴＧＡ２；ＩＴＧＡ３；ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）；ＩＴＧＡＶ；ＩＴＧＢ３；ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）；α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体；ＪＡＧ１；ＪＡＫ１；ＪＡＫ３；ＪＵＮ；Ｋ６ＨＦ；ＫＡＩ１；ＫＤＲ；ＫＩＴＬＧ；ＫＬＦ５（ＧＣ Ｂｏｘ ＢＰ）；ＫＬＦ６；ＫＬＫＩＯ；ＫＬＫ１２；ＫＬＫ１３；ＫＬＫ１４；ＫＬＫ１５；ＫＬＫ３；ＫＬＫ４；ＫＬＫ５；ＫＬＫ６；ＫＬＫ９；ＫＲＴ１；ＫＲＴ１９（ケラチン１９）；ＫＲＴ２Ａ；ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）；ＬＡＭＡＳ；ＬＥＰ（レプチン）；ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５；ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）；Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５；Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ；ＬＰＳ；ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）；ＬＴＢ；ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）；ＬＴＢ４Ｒ２；ＬＴＢＲ；ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）；Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｅ；Ｌｙ６７，ＲＩＧ－Ｅ，ＳＣＡ－２，ＴＳＡ－１）；Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｇ６Ｄ；Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）；ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、遺伝子座Ｋ；ＬＹ６Ｋ；ＨＳＪ００１３４８；ＦＬＪ３５２２６）；ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ；ＭＡＧ又はＯＭｇｐ；ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）；ＭＤＫ；ＭＤＰ；ＭＩＢ１；ｍｉｄｋｉｎｅ；ＭＥＦ；ＭＩＰ－２；ＭＫＩ６７；（Ｋｉ－６７）；ＭＭＰ２；ＭＭＰ９；ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）；ＭＳ４Ａ１；ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）；ＭＳＭＢ；ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）；ＭＴＳＳ１；ＭＵＣ１（ムチン）；ＭＹＣ；ＭＹ０８８；Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質担体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性ホスフェート輸送体３ｂ）；ＮＣＡ；ＮＣＫ２；ニューロカン；ＮＦＫＢ１；ＮＦＫＢ２；ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）；ＮＧＦＲ；ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ；ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）；ＮｇＲ－ｐ７５；ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ；ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）；ＮＯＸ５；ＮＰＰＢ；ＮＲ０Ｂ１；ＮＲ０Ｂ２；ＮＲ１Ｄ１；ＮＲ１Ｄ２；ＮＲ１Ｈ２；ＮＲ１Ｈ３；ＮＲ１Ｈ４；ＮＲ１１２；ＮＲ１１３；ＮＲ２Ｃ１；ＮＲ２Ｃ２；ＮＲ２Ｅ１；ＮＲ２Ｅ３；ＮＲ２Ｆ１；ＮＲ２Ｆ２；ＮＲ２Ｆ６；ＮＲ３Ｃ１；
ＮＲ３Ｃ２；ＮＲ４Ａ１；ＮＲ４Ａ２；ＮＲ４Ａ３；ＮＲ５Ａ１；ＮＲ５Ａ２；ＮＲ６Ａ１；ＮＲＰ１；ＮＲＰ２；ＮＴ５Ｅ；ＮＴＮ４；ＯＤＺＩ；ＯＰＲＤ１；ＯＸ４０；Ｐ２ＲＸ７；Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド依存性イオンチャネル５）；ＰＡＰ；ＰＡＲＴ１；ＰＡＴＥ；ＰＡＷＲ；ＰＣＡ３；ＰＣＮＡ；ＰＤ－Ｌ１；ＰＤ－Ｌ２；ＰＤ－１；ＰＯＧＦＡ；ＰＯＧＦＢ；ＰＥＣＡＭ１；ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）；ＰＧＦ；ＰＧＲ；ホスファカン；ＰＩＡＳ２；ＰＩＫ３ＣＧ；ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）；ＰＬＧ；ＰＬＸＤＣ１；ＰＭＥＬ１７（銀同族体；ＳＩＬＶ；Ｄ１２Ｓ５３Ｅ；ＰＭＥＬ１７；ＳＩ；ＳＩＬ）；ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）；ＰＰＩＤ；ＰＲＩ；ＰＲＫＣＱ；ＰＲＫＤＩ；ＰＲＬ；ＰＲＯＣ；ＰＲＯＫ２；ＰＳＡＰ；ＰＳＣＡ ｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）；ＰＴＡＦＲ；ＰＴＥＮ；ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）；ＰＴＮ；ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）；ＲＡＲＢ；ＲＥＴ（ｒｅｔ癌源遺伝子；ＭＥＮ２Ａ；ＨＳＣＲ１；ＭＥＮ２Ｂ；ＭＴＣ１；ＰＴＣ；ＣＤＨＦ１２；Ｈｓ．１６８１１４；ＲＥＴ５１；ＲＥＴ－ＥＬＥ１）；ＲＧＳＩ；ＲＧＳ１３；ＲＧＳ３；ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）；ＲＯＢＯ２；Ｓ１００Ａ２；ＳＣＧＢ１Ｄ２（ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｎ Ｂ）；ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）；ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）；ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）；ＳＤＦ２；Ｓｅｍａ ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７のトロンボスポンジンリピート（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）；ＳＥＲＰＩＮＡ１；ＳＥＲＰＩＮＡ３；ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）；ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）；ＳＥＲＰＤＭＦ１；ＳＨＢＧ；ＳＬＡ２；ＳＬＣ２Ａ２；ＳＬＣ３３Ａ１；ＳＬＣ４３Ａ１；ＳＬＩＴ２；ＳＰＰＩ；ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）；ＳＴ６ＧＡＬ１；ＳＴＡＢＩ；ＳＴＡＴ６；ＳＴＥＡＰ（６の前立腺の膜貫通上皮抗原）；ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺がん関連遺伝子 １、前立腺がん関連タンパク質１、６の前立腺の膜貫通上皮抗原２、６の膜貫通前立腺タンパク質）；ＴＢ４Ｒ２；ＴＢＸ２１；ＴＣＰＩＯ；ＴＯＧＦＩ；ＴＥＫ；ＴＥＮＢ２（推定膜貫通プロテオグリカン）；ＴＧＦＡ；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢ１ＩＩ；ＴＧＦＢ２；ＴＧＦＢ３；ＴＧＦＢＩ；ＴＧＦＢＲＩ；ＴＧＦＢＲ２；ＴＧＦＢＲ３；ＴＨＩＬ；ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１ ）；ＴＨＢＳ２；ＴＨＢＳ４；ＴＨＰＯ；ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１ ）；ＴＭＰ３；組織因子；ＴＬＲ１；ＴＬＲ２；ＴＬＲ３；ＴＬＲ４；ＴＬＲ５；ＴＬＲ６；ＴＬＲ７；ＴＬＲ８；ＴＬＲ９；ＴＬＲ１０；ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１；トモレグリン－１）；ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａ同族体２）；ＴＮＦ；ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４ ）；ＴＮＦＡＩＰ３；ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ；ＴＮＦＲＳＦ１Ａ；ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ；ＴＮＦＲＳＦ２１；ＴＮＦＲＳＦ５；ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）；ＴＮＦＲＳＦ７；ＴＮＦＲＳＦ８；ＴＮＦＲＳＦ９；ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）；ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）；ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）；ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）；ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）；ＴＮＦＳＦ１８；ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）；ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）；ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）；ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）；ＴＮＦＳＦ９（４－１ ＢＢリガンド）；ＴＯＬＬＩＰ；Ｔｏｌｌ様受容体；ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）；ＴＰ５３；ＴＰＭ１；ＴＰＭ２；ＴＲＡＤＤ；ＴＭＥＭ１１８（リングフィンガータンパク質、膜貫通２；ＲＮＦＴ２；ＦＬＪ１４６２７）；ＴＲＡＦ１；ＴＲＡＦ２；ＴＲＡＦ３；ＴＲＡＦ４；ＴＲＡＦ５；ＴＲＡＦ６；ＴＲＥＭ１；ＴＲＥＭ２；ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）；ＴＲＰＣ６；ＴＳＬＰ；ＴＷＥＡＫ；チロシナーゼ（ＴＹＲ；ＯＣＡＩＡ；ＯＣＡ１Ａ；チロシナーゼ；ＳＨＥＰ３）；ＶＥＧＦ；ＶＥＧＦＢ；ＶＥＧＦＣ；バーシカン；ＶＨＬ Ｃ５；ＶＬＡ－４；ＸＣＬ１（リンホタクチン）；ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）；ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ ＣＣＸＣＲＩ）；ＹＹ１；及びＺＦＰＭ２と結合し得るか又は相互作用し得る。

【0202】

特定の実施例では、本明細書で開示される細胞及び方法により生成される抗体は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）又はＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）、又はＨｓ．７３７９２）；ＣＤ３３；ＣＤ３４；ＣＤ６４；ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）；ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連β）、Ｂ２９）；ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４受容体などの、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー；ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、α４／β７インテグリン、及び、αｖ／β３インテグリン（これらのα又はβサブユニットのいずれかを含む）などの細胞接着分子（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃ；組織因子（ＴＦ）；αインターフェロン（αＩＦＮ）などの成長因子；ＩＬ－１β、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３Ｒα１、ＩＬ１３Ｒα２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥなどの、インターロイキンであるＴＮＦα；血液群抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ－４；ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどのＣＤタンパク質に結合することができる。

【0203】

特定の実施例では、本明細書において提供される細胞、細胞株、及び方法を使用して、補体プロテインＣ５に特異的に結合する抗体（二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、ヒトＣ５に特異的に結合する抗Ｃ５アゴニスト抗体）を産生することができる。抗Ｃ５抗体は、（ａ）ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。例えば、抗Ｃ５抗体は、（ａ）ＳＳＹＹＭＡ（配列番号１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧ（配列番号２６）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹ（配列番号２７）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、並びに／又は、（ｄ）ＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡ（配列番号２８）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＧＡＳＥＴＥＳ（配列番号２９）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）ＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含み得る。重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３の配列は、米国特許公開第２０１６／０１７６９５４号にそれぞれ、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、及び配列番号１２５として開示されている（米国特許公開第２０１６／０１７６９５４号の表７及び８を参照のこと）。

【0204】

特定の実施例では、抗Ｃ５抗体は、ＶＨ配列及びＶＬ配列
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＴＶＨ ＳＳＹＹＭＡＷＶＲＱ ＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧ ＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹ ＫＡＥＷＡＫＧＲＶＴ ＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶ ＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶ ＤＴＡＴＹＹＣＡＳＤ ＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭ ＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴ ＶＳＳ（配列番号３１）及びＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳ ＳＳＬＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧ ＡＳＥＴＥＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮ ＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴ ＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３２）をそれぞれ含み、それらの配列の翻訳後修飾を含む。上記ＶＨ及びＶＬ配列は、米国特許公開第２０１６／０１７６９５４号にそれぞれ、配列番号１０６及び配列番号１１１として開示されている。（米国特許公開第２０１６／０１７６９５４号の表７及び８を参照のこと。）抗Ｃ５抗体は、３０５Ｌ０１５であり得る（米国特許公開第２０１６／０１７６９５４号を参照のこと）。

【0205】

特定の実施例では、本明細書で開示される方法により生成される抗体は、ＯＸ４０に結合することができる（例えば、ヒトＯＸ４０に特異的に結合する抗ＯＸ４０アゴニスト抗体）。抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び、（ｆ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含み得る。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＤＳＹＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＤＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹＮＱＫＦＲＥ（配列番号３）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｃ）ＡＰＲＷＹＦＳＶ（配列番号４）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、並びに／又は（ａ）ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＹＴＳＲＬＲＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｃ）ＱＱＧＨＴＬＰＰＴ（配列番号７）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含み得る。特定の実施態様では、抗ＯＸ４０抗体は、ＶＨ配列及びＶＬ配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＤＳＹＭＳＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＤ ＭＹＰＤＮＧＤＳＳＹ ＮＱＫＦＲＥＲＶＴＩ ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＶＬＡＰ ＲＷＹＦＳＶＷＧＱＧ ＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８）及びＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹ ＴＳＲＬＲＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＧＨＴＬＰＰＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号９）をそれぞれ含み、それらの配列の翻訳後修飾を含み得る。

【0206】

特定の実施例では、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫＧ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｅ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｆ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１、２、３、４、５、又は６個のＣＤＲを含む。例えば、抗ＯＸ４０抗体は、（ａ）ＮＹＬＩＥ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＶＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹＳＥＫＦＫ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｃ）ＤＲＬＤＹ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、並びに／又は（ａ）ＨＡＳＱＤＩＳＳＹＩＶ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１；（ｂ）ＨＧＴＮＬＥＤ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；及び（ｃ）ＶＨＹＡＱＦＰＹＴ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含み得る。抗ＯＸ４０抗体は、ＶＨ配列及びＶＬ配列ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＡＦＴ ＮＹＬＩＥＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶ ＩＮＰＧＳＧＤＴＹＹ ＳＥＫＦＫＧＲＶＴＩ ＴＲＤＴＳＴＳＴＡＹ ＬＥＬＳＳＬＲＳＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲ ＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶ ＴＶＳＳ（配列番号１６）及びＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＨＡＳＱＤＩＳ ＳＹＩＶＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＨ ＧＴＮＬＥＤＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＶＨ ＹＡＱＦＰＹＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号）をそれぞれ含み得、それらの配列の翻訳後修飾を含み得る。

【0207】

抗ＯＸ４０抗体に関するさらなる詳細が、国際公開第２０１５／１５３５１３号で開示されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0208】

特定の実施例では、本明細書で開示される細胞及び方法により生成される抗体は、インフルエンザウイルスＢヘマグルチニン、即ち「ｆｌｕＢ」に結合することができる（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでインフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａリネージ由来のヘマグルチニンに結合する、インフルエンザＢウイルスのＶｉｃｔｏｒｉａリネージ由来のヘマグルチニンに結合する、インフルエンザＢウイルスの祖先リネージ由来のヘマグルチニンに結合する、又は、インフルエンザＢウイルスのＹａｍａｇａｔａリネージ、Ｖｉｃｔｏｒｉａリネージ、及び祖先リネージ由来のヘマグルチニンに結合する抗体）。抗ＦｌｕＢ抗体に関する更なる詳細は国際公開第２０１５／１４８８０６号で開示されており、その全体が本明細書に参照により組み込まれている。

【0209】

特定の実施例では、本明細書で開示される細胞及び方法により生成される抗体は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１若しくはＬＲＰ－８又はトランスフェリン受容体、並びに、ベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１又はＢＡＣＥ２）、アルファ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、タウ－セクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイドベータペプチド、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ｐ７５ ＮＴＲ、ＣＤ４０、及びカスパーゼ－６からなる群から選択される少なくとも１つの標的に結合することができる。

【0210】

特定の実施例では、本明細書で開示される細胞及び方法により生成される抗体は、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体である。特定の実施例では、抗ＣＤ４０抗体はＲＧ７８７６である。

【0211】

特定の実施例では、本開示の細胞、細胞株、及び／方法を使用して、ポリペプチドを生成することができる。ポリペプチドは、標的化された免疫サイトカインであり得る。標的化された免疫サイトカインは、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカイン、例えばＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインＲＧ７８１３であり得る。標的化された免疫サイトカインは、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインであり得、例えばＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインはＲＧ７４６１である。

【0212】

実施例では、本明細書で提供される細胞、細胞株、及び／又は方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＣＥＡと、少なくとも１つの追加の標的分子とに結合することができる。本明細書で提供される方法に従って生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、腫瘍標的化サイトカインと、少なくとも１つの追加の標的分子とに結合することができる。本明細書で提供される方法に従って生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ２ｖ（即ち、インターロイキン２バリアント）に融合され、ＩＬ－１系免疫サイトカインと、少なくとも１つの追加の標的分子とに結合する。特定の実施例では、本明細書で提供される方法に従って生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、Ｔ細胞二重特異性抗体（即ち、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー又はＢｉＴＥ）である。

【0213】

特定の実施例では、本明細書で提供される方法に従って生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ－１アルファ及びＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１２及びＩＬ－１Ｓ；ＩＬ－１３及びＩＬ－９；ＩＬ－１３及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－５；ＩＬ－５及びＩＬ－４；ＩＬ－１３及びＩＬ－１ベータ；ＩＬ－１３及びＩＬ－２５；ＩＬ－１３及びＴＡＲＣ；ＩＬ－１３及びＭＤＣ；ＩＬ－１３及びＭＥＦ；ＩＬ－１３及びＴＧＦ－～；ＩＬ－１３及びＬＨＲアゴニスト；ＩＬ－１２及びＴＷＥＡＫ；ＩＬ－１３及びＣＬ２５；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ａ；ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ｂ；ＩＬ－１３及びＡＤＡＭＳ；ＩＬ－１３及びＰＥＤ２；ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ；ＣＥＡ及びＣＤ３；ＣＤ３及びＣＤ１９；ＣＤ１３８及びＣＤ２０；ＣＤ１３８及びＣＤ４０；ＣＤ１９及びＣＤ２０；ＣＤ２０及びＣＤ３；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０；ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０；ＣＤ４０及びＣＤ２０；ＣＤ－Ｓ及びＩＬ－６；ＣＤ２０及びＢＲ３；ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１ベータ；ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ－１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８、ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２、ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ－４、ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０、ＴＮＦａ及びＩＬ－１２ｐ４０、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン、ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５、ＶＥＧＦ及びＩＬ－８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ－１４及びＩＬ－１３、ＩＬ－１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－６Ｒ並びにＴＮＦＲ１及びＩＬ－１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭ Ａ；ＣＴＬＡ－４及びＢＴＮ０２；ＩＧＦ１及びＩＧＦ２；ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ；ＭＡＧ及びＲＧＭ Ａ；ＮｇＲ及びＲＧＭ Ａ；ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ Ａ；ＯＭＧｐ及びＲＧＭ Ａ；ＰＯＬ－ｌ及びＣＴＬＡ－４；並びにＲＧＭ Ａ及びＲＧＭ Ｂから選択される少なくとも２つの標的分子に結合する。

【0214】

特定の実施例では、本明細書で提供される方法に従って生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体はＲＧ７８０２である。特定の実施態様では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、以下に示す配列番号１８～２１に記載のアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＫＡＳＡＡＶＧ ＴＹＶＡＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳ ＡＳＹＲＫＲＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＨＱ ＹＹＴＹＰＬＦＴＦＧ ＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴ ＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰ ＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴ ＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦ ＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫ ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳ ＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬ ＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨ ＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱ ＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦ ＮＲＧＥＣ（配列番号１８）
ＱＡＶＶＴＱＥＰＳＬ ＴＶＳＰＧＧＴＶＴＬ ＴＣＧＳＳＴＧＡＶＴ ＴＳＮＹＡＮＷＶＱＥ ＫＰＧＱＡＦＲＧＬＩ ＧＧＴＮＫＲＡＰＧＴ ＰＡＲＦＳＧＳＬＬＧ ＧＫＡＡＬＴＬＳＧＡ ＱＰＥＤＥＡＥＹＹＣ ＡＬＷＹＳＮＬＷＶＦ ＧＧＧＴＫＬＴＶＬＳ ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣ（配列番号１９）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ ＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹ ＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦ ＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤ ＦＡＹＹＶＥＡＭＤＹ ＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧ ＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣＤＧＧＧＧＳ ＧＧＧＧＳＥＶＱＬＬ ＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧ ＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ ＧＦＴＦＳＴＹＡＭＮ ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬ ＥＷＶＳＲＩＲＳＫＹ ＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳ ＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤ ＤＳＫＮＴＬＹＬＱＭ ＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶ ＹＹＣＶＲＨＧＮＦＧ ＮＳＹＶＳＷＦＡＹＷ ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ ＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩ ＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳ ＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮ ＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱ ＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧ ＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤ ＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳ ＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥ ＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴ ＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ ＳＦＮＲＧＥＣＤＫＴ ＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥ ＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦ ＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩ ＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶ ＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶ ＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥ ＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥ ＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶ ＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷ ＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶ ＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥ ＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰ ＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰ ＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶ ＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹ ＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳ ＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴ ＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳ ＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤ ＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦ ＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨ ＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬ ＳＰＧＫ（配列番号２０）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＥＦＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧ ＷＩＮＴＫＴＧＥＡＴＹ ＶＥＥＦＫＧＲＶＴＦ ＴＴＤＴＳＴＳＴＡＹ ＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＷＤ ＦＡＹＹＶＥＡＭＤ ＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ ＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ ＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳ ＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶ ＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶ ＳＷＮＳＧＡＬＴＳ ＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳ ＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶ ＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱ ＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰ ＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥ ＰＫＳＣＤＫＴＨＴ ＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧ ＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫ ＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴ ＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶ ＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮ ＷＹＶＤＧＶＥＶＨ ＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹ ＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬ ＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧ ＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫ ＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩ ＳＫＡＫＧＱＰＲＥ ＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤ ＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳ ＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤ ＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱ ＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰ ＶＬＤＳＤＧＳＦＦ ＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲ ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳ ＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹ ＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ Ｋ（配列番号２１）
を含む。
抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関するさらなる詳細は、国際公開第２０１４／１２１７１２号で提供されており、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0215】

特定の実施例では、本明細書で開示される細胞及び方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。特定の実施例では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体はＣｒｏｓｓｍａｂである。特定の実施例では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体はＲＧ７７１６である。特定の実施例では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、以下に示す配列番号２２～２５に記載のアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＹＤＦＴ ＨＹＧＭＮＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷ ＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ ＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦ ＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰ ＹＹＹＧＴＳＨＷＹＦ ＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴ ＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳ ＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳ ＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣ ＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶ ＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴ ＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬ ＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳ ＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧ ＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨ ＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫ ＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨ ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡ ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰ ＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳ ＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶ ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶ ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥ ＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳ ＶＬＴＶＬＡＱＤＷＬ ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳ ＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫ ＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲ ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣ ＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳ ＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰ ＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮ ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ ＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫ ＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳ ＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ ＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳ ＰＧＫ（配列番号２２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥ ＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶ ＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴ ＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡ ＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷ ＩＮＰＮＳＧＧＴＮＹ ＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭ ＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹ ＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤ ＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰ ＮＰＹＹＹＤＳＳＧＹ ＹＹＰＧＡＦＤＩＷＧ ＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡ ＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦ ＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧ ＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮ ＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷ ＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮ ＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳ ＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴ ＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫ ＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨ ＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳ ＦＮＲＧＥＣＤＫＴＨ ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡ ＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰ ＰＫＰＫＤＴＬＭＡＳ ＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶ ＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶ ＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥ ＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳ ＶＬＴＶＬＡＱＤＷＬ ＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳ ＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫ ＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲ ＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳ ＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳ ＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰ ＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮ ＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴ ＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ ＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫ ＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳ ＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮ ＡＹＴＱＫＳＬＳＬＳ ＰＧＫ（配列番号２３）
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳ ＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦ ＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱ ＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ ＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ ＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡ ＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹ ＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶ ＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱ ＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤ ＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴ ＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫ ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧ ＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮ ＲＧＥＣ（配列番号２４）
ＳＹＶＬＴＱＰＰＳＶ ＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩ ＴＣＧＧＮＮＩＧＳＫ ＳＶＨＷＹＱＱＫＰＧ ＱＡＰＶＬＶＶＹＤＤ ＳＤＲＰＳＧＩＰＥＲ ＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡ ＴＬＴＩＳＲＶＥＡＧ ＤＥＡＤＹＹＣＱＶＷ ＤＳＳＳＤＨＷＶＦＧ ＧＧＴＫＬＴＶＬＳＳ ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ ＫＳＣ（配列番号２５）
を含む。

【0216】

特定の実施態様では、本明細書で開示される方法により生成される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体はＲＧ７２２１であり得る。抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３を有し得る。

【0217】

他の分子にコンジュゲートされていてもよい可溶性抗原又はその断片は、抗体を生成するための免疫原として使用され得る。受容体等の膜貫通分子に対しては、これらの断片（例えば、受容体の細胞外ドメイン）が、免疫原として使用され得る。あるいは、膜貫通分子を発現する細胞が免疫原として使用され得る。このような細胞は、自然源（例えば、がん細胞株）由来であってもよく、又は膜貫通分子を発現するように組換え技法によって形質転換された細胞であってもよい。抗体の調製に有用な他の抗原及びその形態は、当業者には明らかであろう。

【0218】

特定の実施例では、本明細書で開示される細胞、細胞株、及び／又は方法により生成されるポリペプチド（例えば抗体）は、染料又は細胞傷害性剤、例えば化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、微生物、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、又はこれらの断片）、又は放射性同位体（即ち放射性コンジュゲート）などの化学分子にさらにコンジュゲートすることが可能となり得る。本明細書に記載の方法を使用して生成される抗体又は二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートは、重鎖の１つのみ又は軽鎖の１つのみの定常領域にコンジュゲートした細胞傷害性剤を含有し得る。

【0219】

抗体バリアント
本明細書で提供される抗体のバリアントについて検討する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的性質を変化させることが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切な修飾を、抗体をコードするヌクレオチド配列に組み込むことにより、又はペプチド合成により調製することができる。このような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、及び／又は抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。

【0220】

置換、挿入、及び欠失バリアント
例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントが提供される。置換変異誘発の対象部位には、ＣＤＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換の例は、表１において、「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化の例は、表１において、「例示的な置換」の見出しの下に提供され、またアミノ酸側鎖クラスを参照して以下にさらに記載される通りである。目的の抗体中にアミノ酸置換を導入して、その生成物を、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。

【0221】

【0222】

アミノ酸は、共通の側鎖の特性に従ってグループ化することができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0223】

非保存的置換は、概して、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを伴う。

【0224】

ある種の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる試験ために選択される結果として生じるバリアントは、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低減）の修正（例えば、改善）を有し、かつ／又は実質的に保持された親抗体の特定の生物学的特性を有する。例示的な置換バリアントは、例えば、本明細書に記載されるものなどのファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使用して好都合に生成することができる、親和性成熟抗体である。簡潔には、１つ又は複数。ＣＤＲ残基が変異され、バリアント抗体がファージにディスプレイされ、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。

【0225】

例えば抗体親和性を向上させるために、ＣＤＲにおいて改変（例えば、置換）が行われ得る。そのような改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で突然変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）、及び／又は抗原と接触する残基内で行われ得、結果として得られるバリアントＶＨ又はＶＬが結合親和性について試験される。二次ライブラリを構築し、再選択することによる親和性成熟が、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， ｅｄ．， Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ，（２００１））に記載されている。親和性成熟のいくつかの態様では、多様な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド指向性変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択される可変遺伝子に多様性が導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する抗体バリアントを同定する。多様性を導入する別の方法は、いくつかのＣＤＲ残基（例えば、一度に４～６残基）がランダム化されるＣＤＲ指向手法を含む。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に特定され得る。特にＣＤＲ－Ｈ３及びＣＤＲ－Ｌ３が標的とされることが多い。

【0226】

置換、挿入、又は欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、１つ又は複数のＣＤＲ内で起こり得る。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）は、ＣＤＲで行われ得る。そのような改変は、例えば、ＣＤＲ内の抗原接触残基の外側で生じ得る。上述の特定のバリアントＶＨ及びＶＬ配列において、各ＣＤＲは、改変されていないか、又は１つ、２つ、又は３つ以下のアミノ酸置換を有するかのいずれかである。

【0227】

突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４：１０８１－１０８５により記載されるように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は標的残基群（例えば、帯電した残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕ）が同定され、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。あるいは、又はさらに、抗原－抗体複合体の結晶構造を使用して、抗体と抗原との間の接触点を特定することができる。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、又は除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。

【0228】

アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに１個又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとしては、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ（抗体指向性酵素プロドラッグ治療法のための）又はポリペプチドへの抗体のＮ末端若しくはＣ末端の融合が挙げられ、これは抗体の血清半減期を増大させる。

【0229】

グリコシル化バリアント
特定の実施例では、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化されている程度を増加又は減少させるように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作り出されるか、又は除去されるようにアミノ酸配列を改変させることにより好都合に達成され得る。

【0230】

抗体がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に概して結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えばＷｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」のＧｌｃＮａｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施例では、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作成するために、本開示の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えることができる。

【0231】

いくつかの実施例では、非フコシル化オリゴ糖、即ち、Ｆｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）が欠落した、オリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分枝オリゴ糖構造のステムに第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。実施例では、天然又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントが提供される。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（即ち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合した全てのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体のマイナーな配列変化のために、位置２９７の上流又は下流、すなわち位置２９４と３００の間の約±３個のアミノ酸にも位置し得る。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した、このような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照のこと。

【0232】

低減したフコシル化を有する抗体を生成することのできる細胞株の例には、タンパク質フコシル化を欠くＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．， ９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくは輸送タンパク質が低減若しくは消失した細胞（例えば、米国特許公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照）が含まれる。

【0233】

さらなる実施例では、抗体バリアントには、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている、二分されたオリゴ糖が提供される。そのような抗体バリアントは、上述のとおり、低下したフコシル化、及び／又は改善されたＡＤＣＣを有することができる。このような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７， １７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３， ８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；同第２００４／０６５５４０号、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。

【0234】

Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有することができる。このような抗体バリアントの例は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；同第１９９８／５８９６４号；及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。

【0235】

Ｆｃ領域バリアント
特定の実施例では、１つ又は複数のアミノ酸修飾が本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に導入され、それにより、Ｆｃ領域バリアントが生成され得る。Ｆｃ領域バリアントは、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。

【0236】

本開示は、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有することで、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期が重要でありながら、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ））が不必要又は有害である用途に対して望ましい候補となる、抗体バリアントを想到する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠いている（そのため、ＡＤＣＣ活性を欠いている可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞内でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：４５７－４９２（１９９１の第４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７０５９－７０６３（１９８６）を参照）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ， Ｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号（例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６６：１３５１－１３６１（１９８７）を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法が用いられ得る（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ^ＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩを参照）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができないためにＣＤＣ活性を欠くことを確認することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ， Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ， Ｍ．Ｓ． ａｎｄ Ｍ．Ｊ． Ｇｌｅｎｎｉｅ， Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照）。ＦｃＲｎ結合及びｉｎ ｖｉｖｏクリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で知られる方法を使用しても実施することができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ， Ｓ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ’ｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照）。

【0237】

エフェクター機能が低下した抗体としては、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ又は複数の置換を含むものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。

【0238】

ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体バリアントが記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ９（２）：６５９１－６６０４（２００１）を参照）。特定の実施例では、抗体バリアントは、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８位、３３３位、及び／又は３３４位（残基のＥＵ番号付け）における置換を含むＦｃ領域を含む。

【0239】

ある特定の実施例では、抗体バリアントは、ＦｃγＲ結合を減少させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２３４及び２３５（ＥＵナンバリングの残基）を有するＦｃ領域を含む。一態様では、置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。抗体バリアントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域にＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇをさらに含み得る。置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ－ＰＧ）であり得る。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照されたい。）置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ－ＤＡ）であり得る。

【0240】

いくつかの実施例では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４：４１７８－４１８４（２０００）に記載されるように、改変された（すなわち、改善されたか又は減少したかのいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす改変が、Ｆｃ領域において行われる。

【0241】

半減期が延長され、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合性が改善された、胎児への母性ＩｇＧの移行を担う抗体（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９（１９９４））が、米国特許公開第２００５／００１４９３４号（Ｈｉｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．ら）に記載されている。それらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つ又は複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃバリアントとしては、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ又は複数において置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものが挙げられる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（２００６）２３５１４－２３５２４を参照のこと）。

【0242】

マウスＦｃマウスＦｃＲｎ相互作用に決定的なＦｃ領域残基は、部位特異的突然変異誘発により識別されている（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ， Ｗ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９（２００２）５１７１－５１８０を参照）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、及びＨ４３５（ＥＵインデックスナンバリング）は、相互作用に関与している（Ｍｅｄｅｓａｎ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６（１９９６）２５３３；Ｆｉｒａｎ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３（２００１）９９３；Ｋｉｍ， Ｊ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４（１９９４）５４２）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎの相互作用に決定的であることが発見された（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２８１９）。ヒトＦｃ－ヒトＦｃＲｎ複合体の研究により、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、及びＹ４３６が相互作用に決定的であることが示された（Ｆｉｒａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３（２００１）９９３；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４）。Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（２００９）７６６７－７６７１）において、残基２４８～２５９、及び３０１～３１７、及び３７６～３８２、及び４２４～４３７の様々な突然変異が報告され、調査されている。

【0243】

ある特定の実施例では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃの領域位置２５３、及び／又は３１０、及び／又は４３５（ＥＵナンバリングの残基）における置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の実施例では、抗体バリアントは、位置２５３、３１０、及び４３５におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａであり得る。例えばＧｒｅｖｙｓ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９４（２０１５）５４９７－５５０８を参照のこと。

【0244】

ある特定の実施例では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置３１０、及び／又は４３３、及び／又は４３６（ＥＵナンバリングの残基）における置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の実施例では、抗体バリアントは、位置３１０、４３３、及び４３６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａであり得る。（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０号を参照のこと）。

【0245】

ある特定の実施例では、抗体バリアントは、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃの領域位置２５２、及び／又は２５４、及び／又は２５６（ＥＵナンバリングの残基）における置換を有するＦｃ領域を含む。ある特定の実施例では、抗体バリアントは、位置２５２、２５４、及び２５６におけるアミノ酸置換を有するＦｃ領域を含む。一態様において、置換は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来するＦｃ領域における、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅである。Ｄｕｎｃａｎ ＆ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：７３８－４０（１９８８）；米国特許第５６４８２６０号；同第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域バリアントの他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。

【0246】

本明細書に報告されるような抗体の重鎖のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよい。重鎖のＣ末端は、Ｃ末端アミノ酸残基のうち１つ又は２つが除去された、短くなったＣ末端であってもよい。好ましい一実施例では、重鎖のＣ末端は、ＰＧを終結させる短縮型Ｃ末端である。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン－リシンジペプチドを含む（Ｇ４４６及びＫ４４７、ＥＵインデックス・ナンバリングのアミノ酸位置）。本明細書に報告される全ての態様のうちの１つの態様では、本明細書に明記されるＣ末端のＣＨ３ドメインを含む重鎖を含む抗体は、Ｃ末端グリシン残基を含む（Ｇ４４６、ＥＵインデックス・ナンバリングのアミノ酸位置）。

【0247】

システイン操作抗体バリアント
ある特定の実施例では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ^ＴＭ抗体を生成することが望ましい場合がある。特定の実施例では、置換された残基は、抗体の利用しやすい部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基が抗体の接触可能部位に配置され、抗体を他の部位、例えば薬物部位、又はリンカー／薬物部位と結合させ、本明細書で更に記載する免疫抱合体を作製するのに用いることができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。

【0248】

抗体誘導体
特定の実施例では、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野で既知であり、容易に入手可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部位には、水溶性ポリマーが含まれるが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにこれらの混合物が含まれる（ただし、これらに限定されない）。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは任意の分子量であることができ、かつ分枝又は非分枝であることができる。抗体に結合したポリマーの数は異なってもよく、複数のポリマーが結合している場合、それらは同じ分子であっても、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定するものではないが、改良される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が定義された条件下で治療に使用されるかどうか等の考慮事項に基づいて決定することができる。

【0249】

イムノコンジュゲート
本開示はまた、１つ又は複数の治療剤、例えば細胞傷害性剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えばタンパク質毒素、微生物、菌類、植物若しくは動物由来の酵素活性毒素、又はこれらの断片）、又は放射性同位体にコンジュゲートした（化学結合した）、本明細書で開示される抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

【0250】

いくつかの実施例では、イムノコンジュゲートは、抗体が上述の治療剤のうちの１つ又は複数にコンジュゲートしている抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は典型的には、リンカーを使用して、治療剤の１つ又は複数に接続される。治療剤及び薬物及びリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概説が、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。

【0251】

他の実施例では、イムノコンジュゲートは、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンシンタンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むがこれらに限定されない、酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。

【0252】

他の実施例では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて、放射性コンジュゲートを形成する、本明細書に記載される抗体を含む。放射性コンジュゲートの生成には、様々な放射性同位体が利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性コンジュゲートは、検出のために使用されるとき、シンチグラフ研究のための放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、あるいは核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ＭＲＩとしても知られる）のためのスピン標識（ここでもヨウ素－１２３、ヨウ素－１３１、インジウム－１１１、フッ素－１９、炭素－１３、窒素－１５、酸素－１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄など）を含み得る。

【0253】

抗体と細胞傷害性剤とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えばジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えばビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えばビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えばトルエン ２，６－ジイソシアネート）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）を使用して作製することができる。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように調製することができる。炭素－１４－標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体にコンジュゲートするための例示的なキレート化剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内において細胞傷害性薬物の放出を容易にする「切断可能リンカー」であってもよい。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。

【0254】

本明細書のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むが、これらに限定されない架橋試薬で調製される、このようなコンジュゲートを明示的に企図するが、これらに限定されない。

【0255】

５．７ 例示的な非限定的実施態様
Ａ．特定の実施態様では、本開示は、単離された真核細胞株であって、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む、細胞株を対象とする。

【0256】

Ａ１． 特定の実施態様では、本開示は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む、Ａの細胞株を対象とする。

【0257】

Ａ２．特定の実施態様では、本開示は、動物細胞株又は真菌細胞株である、Ａ又はＡ１の細胞株を対象とする。

【0258】

Ａ３．特定の実施態様では、本開示は、動物細胞株が哺乳動物細胞株である、Ａ２の細胞株を対象とする。

【0259】

Ａ４．特定の実施態様では、本開示は、哺乳動物細胞株が、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株、若しくはＣＨＯ細胞株、又はそれらの誘導体である、Ａ３の細胞株を対象とする。

【0260】

Ａ５．特定の実施態様では、本開示は、ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体である、Ａ４の細胞株を対象とする。

【0261】

Ａ６．特定の実施態様では、本開示は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む、ＡからＡ５のいずれかの細胞株を対象とする。

【0262】

Ａ７．特定の実施態様では、本開示は、ウイルスゲノムと、ウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとをさらに含む、ＡからＡ６のいずれかの細胞株を対象とする。

【0263】

Ａ８．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、ＡからＡ７のいずれかの細胞株を対象とする。

【0264】

Ａ９．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞株の細胞ゲノムに組み込まれる、Ａ８の細胞株を対象とする。

【0265】

Ａ１０．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、無作為に細胞株の細胞ゲノムに組み込まれる、Ａ８の細胞株を対象とする。

【0266】

Ａ１１．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、Ａ８からＡ１０の細胞株を対象とする。

【0267】

Ａ１２．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞株の染色体に組み込まれる、Ａ８からＡ１０のいずれかの細胞株を対象とする。

【0268】

Ａ１３．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物が組換えポリペプチドを含む、Ａ８からＡ１０のいずれかの細胞株を対象とする。

【0269】

Ａ１４．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物が、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンを含む、Ａ８からＡ１３のいずれかの細胞株を対象とする。

【0270】

Ａ１５．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、Ａ１４の細胞株を対象とする。

【0271】

Ａ１６．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、単一の重鎖配列、及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、Ａ１４又はＡ１５の細胞株を対象とする。

【0272】

Ａ１７．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、Ａ１４からＡ１６のいずれかの細胞株を対象とする。

【0273】

Ａ１８．特定の実施態様では、本開示は、抗体がモノクローナル抗体を含む、Ａ１４からＡ１７のいずれかの細胞株を対象とする。

【0274】

Ａ１９．特定の実施態様では、本開示は、ポリヌクレオチドと、野生型Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む、対応する単離された真核細胞よりも高い比生産性を有する、Ａ６からＡ１８のいずれかの細胞株を対象とする。

【0275】

Ａ２０．特定の実施態様では、本開示は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれの機能的コピーを含む対応する単離された真核細胞株よりもアポトーシスに対して耐性である、ＡからＡ１９のいずれかの細胞株を対象とする。

【0276】

Ａ２１．特定の実施態様では、本開示は、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流などの細胞培養プロセスで用いられる、ＡからＡ２０のいずれかの細胞株を対象とする。

【0277】

Ａ２２．特定の実施態様では、本開示は、強化灌流プロセスで用いられる、Ａ２１の細胞株を対象とする。

【0278】

Ａ２３．特定の実施態様では、本開示は、ＡからＡ２２のいずれかの真核細胞株を含む組成物を対象とする。

【0279】

Ａ２４．特定の実施態様では、本開示は、細胞培地をさらに含む、Ａ２３の組成物を対象とする。

【0280】

Ｂ．特定の実施態様では、本開示は、細胞培地と、複数の真核細胞であって、複数の各細胞がＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異を含む複数の真核生物細胞とを含む細胞培養物を対象とする。

【0281】

Ｂ１．特定の実施態様では、本開示は、各細胞が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む、Ｂの細胞培養物を対象とする。

【0282】

Ｂ２．特定の実施態様では、本開示は、複数の各細胞が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに欠失を含む、Ｂ又はＢ１の細胞培養物を対象とする。

【0283】

Ｂ３．特定の実施態様では、本開示は、細胞が動物細胞又は真菌細胞であるＢからＢ２のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0284】

Ｂ４．特定の実施態様では、本開示は、動物細胞が哺乳動物細胞である、Ｂ３の細胞培養物を対象とする。

【0285】

Ｂ５．特定の実施態様では、本開示は、哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＢＨＫ細胞、若しくはＣＨＯ細胞、又はそれらの誘導体である、Ｂ４の細胞培養物を対象とする。

【0286】

Ｂ６．特定の実施態様では、本開示は、ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、又はそれらの誘導体である、Ｂ５の細胞培養物を対象とする。

【0287】

Ｂ７．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、ＢからＢ６の細胞培養物を対象とする。

【0288】

Ｂ８．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、Ｂ７の細胞培養物を対象とする。

【0289】

Ｂ９．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、無作為に細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、Ｂ７の細胞培養物を対象とする。

【0290】

Ｂ１０．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、Ｂ７からＢ９のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0291】

Ｂ１１．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞の染色体に組み込まれる、Ｂ７からＢ９のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0292】

Ｂ１２．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物が組換えポリペプチドを含む、Ｂ７からＢ１１のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0293】

Ｂ１３．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物が、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンを含む、Ｂ７からＢ１２のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0294】

Ｂ１４．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、Ｂ１３の細胞培養物を対象とする。

【0295】

Ｂ１５．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、単一の重鎖配列、及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、Ｂ１３又はＢ１４の細胞培養物を対象とする。

【0296】

Ｂ１６．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体を含む、Ｂ１３からＢ１５のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0297】

Ｂ１７．特定の実施態様では、本開示は、抗体がモノクローナル抗体を含む、Ｂ１３からＢ１６のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0298】

Ｂ１８．特定の実施態様では、本開示は、細胞のそれぞれが、組換えポリヌクレオチドをさらに含む、ＢからＢ１７のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0299】

Ｂ１９．特定の実施態様では、本開示は、細胞が、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流などの細胞培養プロセスで用いられる、ＢからＢ１８のいずれかの細胞培養物を対象とする。

【0300】

Ｂ２０．特定の実施態様では、本開示は、細胞が強化灌流プロセスで用いられる、Ｂ１９の細胞培養物を対象とする。

【0301】

Ｃ． 特定の実施態様では、本開示は、真核細胞におけるアポトーシス活性を低下させる方法であって、細胞に遺伝子組換えシステムを施すことを含み、遺伝子組換えシステムが、ａ）Ｂａｘポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトし；（ｂ）Ｂａｋポリペプチドアイソフォームの発現をノックダウン又はノックアウトする、方法を対象とする。

【0302】

Ｃ１．特定の実施態様では、本開示は、フェドバッチ、灌流、プロセス強化、半連続灌流、又は連続灌流細胞培養プロセスで真核細胞を使用することをさらに含む、Ｃの方法を対象とする。

【0303】

Ｃ２．特定の実施態様では、本開示は、真核細胞が強化細胞培養プロセスで用いられる、Ｃ１の方法を対象とする。

【0304】

Ｃ３．特定の実施態様では、本開示は、遺伝子組換えシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、ＣからＣ２のいずれかの方法を対象とする。

【0305】

Ｃ４．特定の実施態様では、本開示は、遺伝子組換えシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムであるか又はそれを含む、ＣからＣ３のいずれかの方法を対象とする。

【0306】

Ｃ５．特定の実施態様では、本開示は、（ａ）Ｃａｓ９分子と、（ｂ）Ｂａｘ遺伝子の標的配列に相補的な標的配列を含む少なくとも１つの第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、（ｃ）Ｂａｋ遺伝子の標的配列に相補的な標的配列を含む少なくとも１つの第２のｇＲＮＡとを含む、Ｃ４の方法を対象とする。

【0307】

Ｃ６．特定の実施態様では、本開示は、標的配列のうちの少なくとも１つが、Ｂａｘ遺伝子の一部であり、且つ／又は標的配列のうちの少なくとも１つが、Ｂａｋ遺伝子の一部である、Ｃ５の方法を対象とする。

【0308】

Ｃ７．特定の実施態様では、本開示は、Ｂａｘポリペプチドの発現及び／又はＢａｋポリペプチドの発現がノックアウトされ、細胞のアポトーシス活性が、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する、ＣからＣ６のいずれかの方法を対象とする。

【0309】

Ｃ８．特定の実施態様では、本開示は、Ｂａｘポリペプチドの発現及び／又はＢａｋポリペプチドの発現がノックダウンされ、細胞のアポトーシス活性が、基準細胞のアポトーシス活性と比較して低下する、ＣからＣ６の方法を対象とする。

【0310】

Ｃ９．特定の実施態様では、本開示は、細胞のアポトーシス活性が、産生期の第１４日に決定された前記基準細胞の集合の生存率と比較して、前記細胞の集合の生存率から決定される、Ｃ７又はＣ８の方法を対象とする。

【0311】

Ｃ１０．特定の実施態様では、本開示は、基準細胞が、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の野生型対立遺伝子を含む細胞である、Ｃ７からＣ９のいずれかの方法を対象とする。

【0312】

Ｃ１１．特定の実施態様では、本開示は、遺伝子組換えシステムが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムであるか又はそれを含む、ＣからＣ１０のいずれかの方法を対象とする。

【0313】

Ｃ１２．特定の実施態様では、本開示は、細胞株発生システムが、標的化組込み、ランダム組込み、又はトランスポサーゼシステムを含む、ＣからＣ１１のいずれかの方法を対象とする。

【0314】

Ｃ１３．特定の実施態様では、本開示は、細胞が動物細胞又は真菌細胞であるＣからＣ１２のいずれかの方法を対象とする。

【0315】

Ｃ１４．特定の実施態様では、本開示は、動物細胞が哺乳動物細胞である、Ｃ１３の方法を対象とする。

【0316】

Ｃ１５．特定の実施態様では、本開示は、哺乳動物細胞が、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＰＥＲ－Ｃ６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ－４細胞、Ｍｌ細胞、ＮＳ－１細胞、ＣＯＳ－７細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞、若しくはＣＨＯ細胞株、又はそれらの誘導体である、Ｃ１４の方法を対象とする。

【0317】

Ｃ１６．特定の実施態様では、本開示は、ＣＨＯ細胞が、ＣＨＯ Ｋ１細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４細胞、ＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞、又はそれらの誘導体である、Ｃ１５の方法を対象とする。

【0318】

Ｃ１７．特定の実施態様では、本開示は、細胞が、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、ＣからＣ１６の方法を対象とする。

【0319】

Ｃ１８．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、Ｃ１７の方法を対象とする。

【0320】

Ｃ１９．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞の細胞ゲノムにランダムに組み込まれる、Ｃ１７の方法を対象とする。

【0321】

Ｃ２０．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、Ｃ１７からＣ１９のいずれかの方法を対象とする。

【0322】

Ｃ２１．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物をコードするポリヌクレオチドが、細胞の染色体内に組み込まれる、Ｃ１７からＣ１９のいずれかの方法を対象とする。

【0323】

Ｃ２２．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物が、組換えポリペプチドを含む。Ｃ１７からＣ２１のいずれかの方法を対象とする。

【0324】

Ｃ２３．特定の実施態様では、本開示は、目的の生成物が、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンである、Ｃ１７からＣ２２のいずれかの方法を対象とする。

【0325】

Ｃ２４．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、Ｃ２３の方法を対象とする。

【0326】

Ｃ２５．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、単一の重鎖配列、及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、Ｃ２３又はＣ２４の方法を対象とする。

【0327】

Ｃ２６．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体を含む、Ｃ２３からＣ２５のいずれかの方法を対象とする。

【0328】

Ｃ２７．特定の実施態様では、本開示は、抗体がモノクローナル抗体を含む、Ｃ２３からＣ２６のいずれかの方法を対象とする。

【0329】

Ｃ２８．特定の実施態様では、本開示は、細胞のそれぞれが組換えポリヌクレオチドをさらに含む、Ｃ２３からＣ２７のいずれかの方法を対象とする。

【0330】

Ｄ．特定の実施態様では、本開示は、組換えポリペプチドを生成する方法であって、真核細胞株を培養することを含み、真核細胞株が、（ａ）Ｂａｘ遺伝子とＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、（ｂ）ポリペプチドの生成に適した条件下で、組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、方法を対象とする。

【0331】

Ｄ１．特定の実施態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、標的位置で細胞株の細胞の細胞ゲノムに組み込まれる、Ｄの方法を対象とする。

【0332】

Ｄ２．特定の実施態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、細胞株の細胞の細胞ゲノムにランダムに組み込まれる、Ｄの方法を対象とする。

【0333】

Ｄ３．特定の実施態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、染色体外ポリヌクレオチドである、ＤからＤ２のいずれかの方法を対象とする。

【0334】

Ｄ４．特定の実施態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、細胞株の細胞の染色体内に組み込まれる、Ｄ－Ｄ３の方法を対象とする。

【0335】

Ｄ５．特定の実施態様では、本開示は、組換えポリペプチドが、抗体、抗体融合タンパク質、抗原、酵素、又はワクチンである、ＤからＤ４のいずれかの方法を対象とする。

【0336】

Ｄ６．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、Ｄ５の方法を対象とする。

【0337】

Ｄ７．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、単一の重鎖配列、及び単一の軽鎖配列、又はそれらの抗原結合断片からなる、Ｄ５又はＤ６の方法を対象とする。

【0338】

Ｄ８．特定の実施態様では、本開示は、抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体を含む、Ｄ５からＤ７のいずれかの方法を対象とする。

【0339】

Ｄ９．特定の実施態様では、本開示は、抗体がモノクローナル抗体を含む、Ｄ５からＤ８のいずれかの方法を対象とする。

【0340】

Ｄ１０．特定の実施態様では、本開示は、組換えポリペプチドを単離することをさらに含む、ＤからＤ９のいずれかの方法を対象とする。

【0341】

Ｅ． 特定の実施態様では、本開示は、ウイルスベクターを生成する方法であって、真核細胞株を培養することを含み、真核細胞が、（ａ）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異又は機能減弱変異と、（ｂ）ウイルスゲノムと、（ｃ）ウイルスベクターの生成に適した条件下でウイルスカプシドをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドとを含む、方法を対象とする。

【0342】

Ｅ１．特定の実施態様では、本開示は、ウイルスベクターを単離することをさらに含む、Ｅの方法を対象とする。

【0343】

Ｅ２．特定の実施態様では、本開示は、細胞株が動物細胞株又は真菌細胞株である、ＥからＥ１のいずれかの方法を対象とする。

【0344】

Ｅ３．特定の実施態様では、本開示は、動物細胞株が哺乳動物細胞株である、Ｅ２の方法を対象とする。

【0345】

Ｅ４．特定の実施態様では、本開示は、哺乳細胞株が、ＣＯＳ細胞株、ＶＥＲＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、ＨＥＫ ２９３細胞株、ＰＥＲ－Ｃ６細胞株、Ｋ５６２細胞株、ＭＯＬＴ－４細胞株、Ｍｌ細胞株、ＮＳ－１細胞株、ＣＯＳ－７細胞株、ＭＤＢＫ細胞株、ＭＤＣＫ細胞株、ＭＲＣ－５細胞株、ＷＩ－３８細胞株、ＷＥＨＩ細胞株、ＳＰ２／０細胞株、ＢＨＫ細胞株、若しくはＣＨＯ細胞株、又はそれらの誘導体である、Ｅ３の方法を対象とする。

【0346】

Ｅ５．特定の実施態様では、本開示は、ＣＨＯ細胞株が、ＣＨＯ Ｋ１細胞株、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ細胞株、ＤＧ４４細胞株、ＤＵＫＸＢ－１１細胞株、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞株、若しくはＣＨＯ Ｋ１Ｍ細胞株、又はそれらの誘導体である、Ｅ４の方法を対象とする。

【0347】

Ｅ６．特定の実施態様では、本開示は、細胞株が細胞培地で培養される、ＥからＥ５のいずれかの方法を対象とする。

【0348】

Ｅ７．特定の実施態様では、本開示は、細胞株が、フェドバッチ培養条件又は灌流培養条件下で培養される、ＥからＥ６のいずれかの方法を対象とする。

【0349】

Ｅ８．特定の実施態様では、本開示は、細胞株が、フェドバッチ培養条件下で培養され、任意選択的には、フェドバッチ培養条件が強化フェドバッチ培養条件である、Ｅ７の方法を対象とする。

【0350】

Ｅ９．特定の実施態様では、本開示は、細胞株が灌流培養条件下で培養され、任意選択的には、灌流培養条件が半連続灌流又は連続灌流である、ＥからＥ８のいずれかの方法を対象とする。

【0351】

Ｅ１０．特定の実施態様では、本開示は、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のそれぞれに安定して組み込まれた機能喪失変異を含む、ＥからＥ９のいずれかの方法を対象とする。

【実施例】

【0352】

６．実施例
本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されることになる。しかし、これらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施態様は、例示のみを目的としており、それに照らして様々な修正又は変更が当業者に提案され、本出願の精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。

【0353】

実施例１：アポトーシス耐性株の生成及び試験
この実施例は、１４日間の強化プロセスでのアポトーシス耐性宿主から生成された細胞株の評価について記載する。この実験では、標準分子（抗体Ａ）をモデル分子として試験した。抗体Ａを発現する安定した細胞株の生成は、標準細胞株（ＣＬＤ）プロトコールに従った。野生型（ＷＴ）標的化組込み（ＴＩ）ＣＨＯ宿主又はＢａｘ遺伝子とＢａｋ遺伝子の両方がノックアウトされた（Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ）２つの遺伝子組換え宿主から生成された上位クローンを、１４日間の強化プロセスを使用してａｍｂｒ１５ミニバイオリアクター中ＣＨＯ生成培地で評価した。プロセスの初めの７日間では、ＷＴクローン及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、同様の力価、細胞成長、生存率、及びＱｐを示した。しかし、第７日と第１４日の間では、ＷＴクローンは生存率及びＱｐの低下を示し、その一方、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは生存率が高いままであった。上位Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、この１４日間延長強化プロセスにおいて上位ＷＴクローンと比較して５０％の力価の上昇を示した。これは、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子をノックアウトすることによるアポトーシスの遮断が、強化プロセスにおける生成を改善することを示す。さらに、これにより、強化プロセスでの産生期の延長が可能になり、より高い力価が達成されるはずである。これにより、製造プロセスのコストが削減されるだけでなく、所定の量の所望の生成物を得るために必要な製造作業の回数も削減される。

【0354】

方法
Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ 宿主生成
野生型ＴＩ宿主細胞に、Ｃａｓ９タンパク質、及びＢａｘ遺伝子とＢａｋ遺伝子とを標的とするｇＲＮＡを同時トランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、Ｃｙｔｅｎａの単一細胞プリンタを使用して、選択試薬を含有する４０μＬの独自のシードトレイン培地が事前に充填されたイメージング品質の３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃７３１１）で１細胞／ウェルで単一細胞プリントし、Ｃｅｌｉｇｏ Ｉｍａｇｅｒを使用した白色光及び蛍光モードですぐにイメージングした。３７℃、５％ ＣＯ２、加湿環境でプレートを２週間インキュベートした後、コンフルエンスに基づいて４８個のコロニー由来のクローンを選択した。クローンを宿主シードトレイン培地で増殖させ、ウエスタンブロット分析によりＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ効率を評価した。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯが確認されたクローンをスケールアップして、抗体Ａ発現クローンを生成した。

【0355】

抗体Ａ発現細胞の単一細胞クローニング
野生型ＴＩ宿主細胞株及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主細胞株を使用して、抗体Ａ発現標的化組込み単一細胞クローンを生成した。標準細胞株発生プロトコールに従って、トランスフェクション及び単一細胞クローニングを実施した。

【0356】

細胞を、選択試薬を含有する４０μＬの単一細胞クローニング（ＳＣＣ）培地が事前に充填された３８４ウェルプレートで１細胞／ウェルで単一細胞プリントし、各宿主から８８個のクローンを採取し、９６ウェルプレートに移した。ＨＴＲＦ力価スクリーニングアッセイを３回行った後、１つの宿主あたり５つのクローン由来の単一細胞クローンを、ａｍｂｒ１５でのフェドバッチ生成アッセイ評価のために選択した。

【0357】

クローン評価
ＣＨＯ生成培地（専用）を有するａｍｂｒ１５強化プロセスにおいてクローン評価を１４日間実施した。すべてのクローンを、Ｎ－１代継代について振とうフラスコでスケールアップした。培養４日後、細胞を遠心分離によって濃縮し、生成の第０日に高播種密度で接種した。

【0358】

生成評価の期間にわたって、培養温度を３５℃に維持した。第１日、第３日、第５日、第１２日、及び（浸透圧が低い場合は）第７日又は第９日に、（作業容量の）１５％及び（作業容量の）２．６％の適切な供給物を追加した。クローンを第１４日に収穫した。表２は、アッセイの種類及びそれぞれのサンプル収集日の概要を示している。

【0359】

【0360】

結果
生存率及び細胞成長
１４日間のプロセスにわたって、すべてのＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、ＷＴクローンと同等か又はそれより高い生細胞数（ＶＣＣ）を有した（図１及び２）。ＶＣＣは体積単位で決まるため、供給物の添加による希釈により、生成期間中のすべてのクローンでＶＣＣがいくらか低下した。これは、生存率（％）を計算するときに修正される。ＷＴクローンは、第１０日の後に生存率の減少を示したが、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの生存率はプロセスの終わりまで高いままであった（図３）。第１４日に、すべてのＷＴクローンは７０％未満の生存率を有したが、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは８０％を超える生存率を有した（図４）。切断カスパーゼ３のウエスタンブロット分析は、すべてのＷＴクローンが実験の終わりにアポトーシスを受けたが、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンはそうではなかった（図５）。

【0361】

力価及び比生産性
第３日、第７日、第１０日、及び第１４日の力価と、第１４日の比生産性を、それぞれ図６及び図７に示す。ＷＴクローン及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの第７日の力価は、同等であった。しかし、第１４日では、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主から生成された上位クローンは、ＷＴクローンよりも高い力価を示した。より重要なことには、ＷＴクローンの生産性は、第１０日の後に有意に減少したが、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、依然として抗体を生成した。この実験における供給戦略は最適化されず、複数のＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンには、第７日及び第１０日に必須アミノ酸がなくなったことに留意されたい。供給戦略のさらなる最適化を伴うと、これらのＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの力価は高くなると予想される。

【0362】

サンプリング又は体積減少のために細胞培養物を除去し、供給物を追加することにより、細胞培養物はプロセス中に毎日希釈されたため、図７に示す比生産性は過小評価されることになった。１４日間のプロセス中の異なる段階での比生産性を計算するために、希釈倍率を使用して力価及びＶＣＣの読み取り値を修正した。ＷＴ ＴＩ宿主から生成された上位クローンＷＴ－４を、２つのＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主から生成された上位クローンと共に、１４日間のプロセス全体（図８）における、及びプロセス中に異なる段階での（図９）比生産性について分析した。図９に示されるように、ＷＴ－４クローンの比生産性は、第１０日と第１４日の間に有意に減少したが、すべてのＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの比生産性は第１０日の後に高いままであった。

【0363】

代謝物
最初のグルコース供給戦略は、グルコースの読み取り値が培養中の最適レベルを下回るか、又は下回ると予想される場合に実施され、さらにグルコースが追加された。第２日に、すべてのクローンがグルコースを使い果たしたが、標準量のグルコースのみが供給された。第４日から最後まで、毎日の培養グルコース消費量を計算し、追加のグルコースを追加して、翌日のグルコース読み取り値が２ｇ／Ｌの所望のしきい値を下回らないようにした。図１０は、上位のクローンのグルコース消費の概要を示している。図１１は、上位のクローンのラクテートの概要を示している。

【0364】

生成物品質
第１４日のＰＱＡ分析からの生成物品質データは、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンから生成された生成物が、ＷＴクローンと同等の生成物品質を有したことを示唆している。

【0365】

サイズバリアント（％）：ＨＭＷＳ、メインピーク、ＬＭＷＳ。図１２、１３、及び１４は、ＷＴクローン及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの分子サイズデータを示している。凝集データは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で同等であった。

【0366】

電荷バリアント（％）：酸性、メインピーク、塩基性。図１５、１６、及び１７はそれぞれ、酸性、メイン、塩基性の割合を示している。電荷バリアントデータは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で同等であった。

【0367】

ＨＩＬＩＣグリカンアッセイ（％）。第１４日に採取した細胞培養物（ＨＣＣＦ）をグリカンアッセイのためにＡＯで検証した。表３は、分析した主要グリカン種の概要を示している。グリカン種レベルは、ＷＴクローンとＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとの間で全体的に同等であった。図１２－１７及び表３から得た結果は、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主から生成した抗体は、ＷＴ宿主から生成した抗体と同等の生成物品質を有することを示唆している。

【0368】

【0369】

結論
力価が高いプロセスはコストを削減するだけでなく、製造ネットワークをより柔軟にすることができる。ただし、生成培養期間の延長、細胞密度の増加、又はＨＤＡＣ阻害剤を使用したＱｐの改善などの戦略は、細胞内でアポトーシスを誘導し、それによってＶＣＣを減少させることによって妨げられる。アポトーシス耐性宿主細胞株を使用することによって、これらの戦略におけるこの望ましくない影響を低減することができる。この実施例では、延長強化プロセスでＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯアポトーシス耐性宿主を試験した。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主から生成された抗体Ａ産生クローンは、ＷＴ細胞株と比べて生存率の改善を示しただけでなく、１４日間の強化プロセスの後期段階において生産性の延長も示した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンの拡張された生産性は、次の理由による場合がある：１）Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のノックアウトは、生成の後期段階でミトコンドリアの完全性と健康を維持するのに役立ち、２）培養中のアポトーシスも防止／遅延する。このプロセスでは、上位Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンは、上位ＷＴクローンと比べて５０％多い抗体を生成した。供給戦略をさらに修正すると、力価をさらに増加させることが可能である。生成物品質は、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンとＷＴクローンとの間で同等であった。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンはまた、ＷＴクローンと同様の代謝を有した。

【0370】

実施例２：アポトーシス耐性株の生成及び試験
治療用分子の製造におけるＢａｘ／Ｂａｋ欠乏の利点をさらに定義するために、本実施例は、標準的なモノクローナル抗体分子とＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ遺伝的背景におけるいくつかの複雑な分子との両方の産生を、定期的に又は強化されたプロセス及び異なる規模で評価した。

【0371】

材料及び方法
細胞培養
１５０ｒｐｍ、３７℃、及び５％ ＣＯの１２５ｍＬの振とうフラスコ中独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２系培地中で、細胞を培養した。３～４日毎に４×１０^５細胞／ｍＬの播種密度で細胞を継代した。

【0372】

抗体発現細胞株発生
安定にｍＡｂを発現する細胞のプールを、Ｍｉｓａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２０１３， ２９， ７２７に記載されるように生成した。発現プラスミドを、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸエレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）によって、ＷＴ細胞又はＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、その後、選択し、ｍＡｂの発現をヒトＩｇＧ染色を介してＦＡＣＳによって確認した。

【0373】

フェドバッチ生成アッセイ
独自の化学的に定義された生成培地を含む、振とうフラスコ、ＡＭＢＲ１５、又はＡＭＢＲ２５０バイオリアクター（ＴＡＰ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、フェドバッチ生成培養を実施した。標準又は低播種密度プロセスについては、細胞を生成段階の第０日（Ｎ）に２×１０^６細胞／ｍｌで播種した。第３、７、及び１０日に、培養物に独自の供給培地を加えた。強化プロセスについては、細胞を、ＡＭＢＲ１５容器又はＡＭＢＲ２５０容器中、生成の第０日（Ｎ）に３×１０^７細胞／ｍｌで播種した。２～４日毎に培養物に独自の供給培地を加えた。ＡＭＢＲ１５システムでの生成を、３７℃、ＤＯ ３０％、ｐＨ ７．２、及び１４００ｒｐｍの撹拌速度の設定値で操作した。ＡＭＢＲ２５０システムの生成を、３５℃、ＤＯ ３０％、ｐＨ ７．２、及び４７７ｒｐｍの撹拌速度の設定値で操作した。

【0374】

Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のノックアウト
ＣＨＯ細胞でＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子をノックアウトするために、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．の遺伝子標的Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ｃｒＲＮＡ及び非特異的Ａｌｔ－Ｒ（登録商標）ｔｒａｃｒＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｄｕｐｌｅｘ Ｂｕｆｆｅｒで１００μＭに再構成し、１：１の比で混合した。その後、９５℃で５分間インキュベートし、室温まで冷却してアニーリングした。その後、ガイドＲＮＡ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、３μＬ（１５０ｐｍｏｌ）のアニールしたｇＲＮＡと１μＬのＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴ、１０ｍｇ／ｍＬ）を混合し、その後、室温で１０分間インキュベートして調製した。Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子を、Ｎｅｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＧｅｎｅｎｔｅｃｈ ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞株の１００万個の細胞に５μＬのｇＲＮＡ－Ｃａｓ９ ＲＮＰをトランスフェクトし、続いて個々のＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主細胞株を単離するための単一細胞クローニングによって順次標的にした。これらのＤＫＯ宿主細胞におけるＢａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子の完全なノックアウトを、ウエスタンブロットによって確認した。

【0375】

ｇＲＮＡオリゴヌクレオチドの配列：
Ｂａｘ ｇＲＮＡ：ＧＧＧＴＣＧＧＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＧＧ
Ｂａｋ ｇＲＮＡ－１：ＴＣＡＴＣＡＣＡＧＴＣＣＴＧＣＣＴＡＧＧ
Ｂａｋ ｇＲＮＡ－２：ＡＴＧＧＣＧＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣ。

【0376】

オフラインでのサンプル分析
生細胞数（ＶＣＣ）及び生存能について、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、また、ｐＯ_２、ｐＨ、ｐＣＯ_２、Ｎａ^＋、グルコース、及びラクテートについて、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、１日おきに上清サンプルを分析した。ＡＭＢＲバイオリアクターの全てのサンプルを、サンプリングして気体発生を最小限に抑えた後、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ４００で数分間分析した。同じＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ，ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ４００及び浸透圧計（Ｍｏｄｅｌ ２０２０，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を全てのサンプルに使用し、機器間での変動性を取り除いた。プレカラム誘導体化及び逆相高速液体クロマトグラフィーによって上清のアミノ酸濃度を測定した。すべてのアミノ酸を６－アミノキノリル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート（ＡＱＣ）で誘導体化して、蛍光性の高い誘導体を生成した。プロテインＡカラムを備える高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、抗体力価を測定した。ＰｈｙＴｉｐプロテインＡカラムにより精製した、細胞培養上清サンプルを使用して、抗体産生物の品質アッセイを実施した。蛍光検出を伴うキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって抗体グリカン分布を分析し、その一方、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分子サイズ分布を分析した。タンパク質の電荷の不均一性は、画像化されたキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）を使用して測定した。すべての電荷不均一性サンプルは、カルボキシペプチダーゼ Ｂで前処理した。すべてのタンパク質生成物品質アッセイは社内で開発され、詳細なプロトコールが公開されている（例えば、Ｈｏｐｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２００９， ２５， １４２７）。

【0377】

結果
Ｂａｘ／Ｂａｋダブルノックアウト宿主から生成されたプールは、標準ｍＡｂの改善された生存率及びより高い力価をもたらす。
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）トランスフェクションを用いてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ ＣＨＯ－Ｋ１宿主細胞株で Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子を連続的に標的とすることにより、ウエスタンブロットによってＢａｘ／Ｂａｋ欠損が確認された、いくつかの異なる単一細胞クローンＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主細胞株を生成することができた。これらのＤＫＯ宿主細胞株が、親のＷＴ宿主細胞株と比較してより優れた生存率及び組換えタンパク質発現を達成するかどうかを試験するために、各ＤＫＯ及びＷＴ宿主細胞株をトランスフェクトして、モノクローナル抗体（ｍＡｂ－Ａ）を発現する安定したプールを生成した。これらのプールを、振とうフラスコ（図１Ａ）内で、同様に、温度、ｐＨ、及び酸素レベルが継続的にモニタリングされ、厳密に制御された、ＡＭＢＲ１５バイオリアクター（図１Ｂ）内で、１４日間の低播種密度生成プラットフォーム（プラットフォーム１）における細胞培養性能及びｍＡｂ－Ａ生産性について最初に評価した。振とうフラスコでは、最初に細胞増殖が良好であったいくつかのプール（ＷＴ、ＤＫＯ２、ＤＫＯ８）は、プロセスの最後に生存率の低下を示したが、これは、おそらくプロセス制御（例えばｐＨ制御）の欠如又はガス発生が原因である。対照的に、ＡＭＢＲ１５バイオリアクターでは、すべてのプールがプロセス全体で良好な生存率を示し、ＷＴプールのみが、培養プロセスの最後に生存率のわずかな減少を示したウエスタンブロットロセスとＡＭＢＲ１５プロセスの両方で、平均して、ＤＫＯ宿主由来のプールは、ＷＴと比べてわずかに良好又は同等の力価及び比生産性を達成した（図１Ａ及び１Ｂ）。

【0378】

Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞が強化プロセスでより良好な生存率及び生産性を達成するかを決定するために、プールを、その後、ＡＭＢＲ１５バイオリアクター中、高播種密度プロセスで試験した（図１Ｃ）。高播種密度プロセスでは、ＷＴプールは、第３日から生存率の低減を示し、プロセスの最後に６７％のみの生細胞を有したのに対して、すべてのＤＫＯプールは、プロセス全体で９０％を超える生存率を維持した。すべてのＤＫＯプールは、強化プロセスにおいてＷＴプールよりも高い力価を達成したが、これは主に、より良好な生存率及びより高い生細胞数（ＶＣＣ）によるものであった。これらの結果は、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ遺伝子組換えが強化プロセスにおいて細胞死を防いだためにより高い力価をもたらしたことを示唆している。

【0379】

振とうフラスコ生成プロセスとＡＭＢＲ１５生成プロセスの両方において、ＷＴプールとＤＫＯプールの間で生成物の品質属性に劇的な違いは観察されなかった（補足図１Ｂ－Ｄ）。強化プロセスでは、ＤＫＯプールから生成された生成物において観察された高分子量種（ＨＭＷＳ）又はタンパク質凝集の割合は高かった（補足図１Ｄ）。これは、通常、高い力価に関連している。これらの細胞株はすべて、他の生成物の品質属性、例えば電荷バリアント又はグリコシル化レベルに関して同等であった（補足図１Ｂ－Ｄ）。

【0380】

Ｂａｘ／Ｂａｋダブルノックアウト宿主から生成された単一細胞クローンは、細胞培養生存率の改善によりプロセスの延長を可能にし、強化プロセスで標準ｍＡｂの力価は高くなった。
Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯプールで観察されたより良好な生存率及びｍＡｂ－Ａ力価を達成することの利点が、単一細胞クローニングの後も維持され得るかを決定するために、ＷＴプール及び２つのＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯプールを単一細胞クローニングし、プレート力価アッセイを２回行った後に各アームから上位４－５クローンを採取した。単一細胞クローン（ＳＣＣ）を、振とうフラスコ中、低細胞播種密度フェドバッチ生成プロセスで最初に分析した（図２Ａ）。プールの結果と同様に、細胞培養の生存率が向上し、ＷＴクローンと比較してＤＫＯクローンの力価がわずかに増加した。ＷＴクローンとＤＫＯクローンとの間で、すべての生成物の品質属性は同等であった（補足図２Ａ）。

【0381】

Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯクローンが強化プロセスにおいてより高い力価を達成するかどうかを試験した。ＷＴ及び２つのＤＫＯアームからの上位のクローンは、ＡＭＢＲ１５バイオリアクターで、目標の３０×１０^６細胞／ｍＬ開始細胞播種密度で、長時間（１４日間）の強化プラットフォーム－１フェドバッチ生成プロセスで試験した（図２Ｂ）。プロセスの後期で生存率が低下したＷＴクローンとは異なり、ＤＫＯクローンは１４日間のプロセスが終了するまで高い生存率を維持した（図２Ｂ）。アポトーシスマーカータンパク質である切断カスパーゼ３のレベルは、第１４日にＷＴクローンで上昇したが、ＤＫＯクローンでは上昇しなかった。これは、ＷＴ細胞が強化生成プロセスの後期段階でアポトーシスを受けたが、Ｂａｘ／Ｂａｋ遺伝子をノックアウトすることでそれが防止されたことを示している（補足図２Ｃ）。さらに、ＷＴクローンの力価は、第１０日あたりで頭打ちになり、第１４日に４．７±０．７ｇ／Ｌに達したが、ＤＫＯクローンの力価は増加し続け、第１４日には７．１±０．８ｇ／Ｌに達した。第１０日から第１４日までのＷＴクローンの力価の低下と、ＤＫＯクローンの力価の緩やかな上昇は、培養物からサンプルを除去し、供給物及びグルコースを培養物に戻すことによる生成培養物の希釈によるものであることに留意されたい。プロセスの最後の４日間におけるＷＴクローンのｍＡｂ－Ａ生産性の低下は、生存率とＶＣＣの損失だけでなく、比生産性（Ｑｐ）の低下にも起因していた。
平均して、ＷＴクローンは最初の１０日間（図２Ｂ、最下部のパネル、第０日～第１０日）よりもプロセス全体の１４日間（図２Ｂ、最下部のパネル、第０日～第１４日）で全体的なＱｐが低かった。これは、ＷＴクローンで最後の４日間にＱｐが減少したことを示している。プロセスの最終段階でＤＫＯ クローンに対してＷＴクローンのＱｐが低いのは、生細胞でのＢａｘ／Ｂａｋ活性化によるミトコンドリア膜の損傷が原因である可能性がある。これらの結果は、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞が、細胞培養物の生存率の延長を可能にし、よって、強化プロセスにおける生成プロセスの延長を可能にして、最良の場合は、ＷＴクローンと比較して４４％の力価の上昇をもたらしたことを示している。ＷＴ細胞と比べて、ＤＫＯ細胞では有意な生成物の品質の変化は観察されなかった（補足図２Ｂ）。

【0382】

生成スケールがＤＫＯ細胞の性能に影響を及ぼすかどうかを評価するために、同じ強化プロセスにおけるＡＭＢＲ２５０容器中の各宿主からの上位クローンを試験した。このより大きなスケールでは、ＡＭＢＲ１５プロセスと同様に、ＤＫＯクローンは、ＷＴクローン（５．５±０．４ｇ／Ｌ、同じクローンから４回複製）よりも良好な生存率、Ｑｐ、及び力価（８．２ｇ／Ｌ）を達成した（図３）。

【0383】

Ｂａｘ／Ｂａｋのダブルノックアウトはまた、強化プロセスでの生存率を改善することにより、複合抗体の産生も改善する。
標準的なｍＡｂ分子と比較して、二重特異性抗体又は複合抗体の産生は、それらの非標準的な形式のため、より困難であり、生成物の不安定性、望ましくない副産物種、より高い生成物断片又は凝集レベル、及び低発現レベルなどの追加の製造上の問題を引き起こす可能性がある。二重特異性抗体又は複合分子の非天然形式は、分子の誤った折り畳み及びジスルフィド結合の誤対合の可能性を高め、細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積及び細胞内部の酸化ストレスのレベルを高め、最終的にＶＣＤ、生存率、及び生産性の低下を引き起こす。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞株がこれらの問題を緩和するのに役立つかどうかを試験した。

【0384】

２つの複合分子（Ｂ及びＤ）と１つの二重特異性分子（Ｃ）の生成を、ＷＴ宿主又はＤＫＯ宿主のいずれかで比較した（図４）。複合分子Ｂ及び二重特異性分子Ｃについては、各宿主から２つの安定した発現プールが生成されたが、複合分子Ｄについては、各宿主から１つの安定した発現プールが生成された。これらのプールを、ＡＭＢＲ１５バイオリアクターでの長期間（１４日間）の強化生成プロセスで試験した。これら３つすべての分子について、ＤＫＯ宿主から生成されたプールはプロセス全体で高い生存率を維持したが、ＷＴプールは、生成の後期段階で生存率の減少を示した（図４）。生存率が向上すると、ＤＫＯプールのＶＣＣも高くなり、分子Ｂ及び分子Ｃの収率が、ＷＴ（それぞれ６．０±０．５ｇ／Ｌ及び６．２±０．８ｇ／Ｌ）と比較して、ＤＫＯ１宿主では約３０％高くなる（それぞれ７．９±０．５及び７．８±１．０ｇ／Ｌ）（図４Ｂ及び４Ｃ）。分子Ｄでは、ＤＫＯプールは、ＷＴプールと比べて５％高い力価を達成しただけであるが、これは主に、培養中のシステインなどの必須アミノ酸の枯渇によって引き起こされる可能性が高い、生成の後期段階でのＤＫＯプールの比生産性の低下に起因する（図４Ｃ）。すべての生成物の品質属性は、３つすべての分子のＷＴプールとＤＫＯプールの間で同等であった（補足図３）。全体として、二重特異性分子又は複合分子を発現するＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞株は、１４日間の強化生成プロセスで高い生存率を維持し、生成物の品質に影響を与えることなく、より高い生成物力価をもたらした。

【0385】

確立された治療用タンパク質を発現する細胞株からＢａｘ／Ｂａｋをノックアウトすると、プール段階でもいくつかの有益な特性が示された。補足図４に示すように、モック又はＢａｘ／Ｂａｋ ｇＲＮＡのいずれかを、抗体サイトカイン複合分子Ｅ）発現コンストラクトで予めトランスフェクトした細胞のプールにトランスフェクトした。コントロール及びＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯプールの細胞培養性能及び力価を、ＡＭＢＲ２５０バイオリアクターでの強化生成プロセスで比較した。以前の結果と同様に、Ｂａｘ／Ｂａｋ遺伝子の欠失により、生成の後期段階で培養生存率が向上したが、Ｂａｘ遺伝子及びＢａｋ遺伝子のノックアウト効率が５０％未満であったため（データは非表示）、ＤＫＯプールでのＶＣＣ及び力価の改善はほとんど観察されなかった。遺伝子ノックアウト効率を最適化及び改善することにより、確立された細胞株又は最近トランスフェクトされた細胞プールへのＢａｘ／Ｂａｋ ｇＲＮＡのトランスフェクションとそれに続くＳＣＣも、強化生成プロセスで高い生存率及び力価を達成することができる完全なＢａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ表現型を有する単一細胞クローンの単離を可能にすると考えられる。

【0386】

考察
この実施例では、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯアポトーシス耐性宿主細胞株が生成され、標準的なモノクローナル抗体といくつかの複合分子の両方が、プール及び単一細胞クローンとして、異なるスケールで、強化生成プロセスで発現した。Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ宿主から生成された治療用タンパク質発現プール又はクローンは、生存率と生産性の延長を示したが、ＷＴ宿主を用いると、強化生成プロセスの後期段階で生存率と生産性の両方が低下した。一方、生成物の品質属性は、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞株とＷＴ細胞株の間で同等であった。全体として、データは、アポトーシス耐性宿主細胞株の利用がプロセス強化戦略を大幅に改善し、生成物の品質を変えることなくより高い容積生産性をもたらし、よって生産プロセスの延長を可能にすることを示している。Ｂａｘ遺伝子とＢａｋ遺伝子の両方をノックアウトすることで、すべてのケースで１４日間の生成プロセスを通じて高い生存率を維持することができた。複合分子を発現するコンストラクトを以前にトランスフェクトした細胞株にＢａｘ／Ｂａｋ ｇＲＮＡをトランスフェクトすることによっても、異種プールを生成し（補足図４）、生存率の向上に役立った。高い培養生存率自体は、生成物の品質をより適切に制御できるため、製造プロセスにとって非常に有益である。生存率の改善に加えて、強化生成プロセスのほとんどで、培養力価が３０～８０％増加した。

【0387】

［００１］通常又は低い播種密度（図１Ａ及び２Ａ）では、強化プロセスと比べて、力価の向上はほとんど見られなかったが、これは主に、コントロール培養物における細胞死が少ないためである。アポトーシスは、細胞密度が高いとき、強化生成プロセス中により頻繁に発生する。これは、おそらく、低酸素症、せん断応力、栄養欠乏のリスクの上昇、並びに、阻害性代謝産物（例えば、イソ吉草酸及びギ酸）及び活性酸素種（ＲＯＳ）を含む細胞により生成された有毒な代謝副生成物の迅速な蓄積による可能性が高い。細胞内ＲＯＳの蓄積を減少させ、培養物に酸素及び栄養素を継続的に提供しながら細胞培養物から阻害代謝物を除去することにより、灌流技術を使用してこれらの細胞ストレスを軽減することができる。ただし、複雑なプロセス制御と大量の培地が必要なため、一般に灌流細胞培養はあまり理想的ではない。この研究におけるアポトーシス耐性Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞株の利用は、培養細胞密度を増加させ、強化フェドバッチ培養における力価を改善するための代替アプローチを提供する。フェドバッチ強化生成プロセス中の広範な培養生存率の低下を軽減する別の方法は、フェドバッチ培養時間を短縮し、生存率が低下し始める前に培養物を収穫することである。しかし、培養時間を短縮すると、経済的利益及び改善された製造ネットワークの柔軟性が減少する。これは、生成培養物を確立するために必要な材料と労力に莫大なコストがかかるためである。したがって、培養の生産性を維持しながら培養時間を延長することは、所望の利益費用比を達成し、製造の柔軟性を高めるために重要である。この実施例に示すように、Ｂａｘ／Ｂａｋ ＤＫＯ細胞株を使用することにより、生成培養時間をＷＴ細胞の７～１０日と比較して少なくとも１４日に延長することができ、標準抗体と複合分子の両方で３０～５０％の力価の増加が可能になる。これは、生成物単位あたりの生成コストを有意に削減することになる。要約すると、Ｂａｘ／Ｂａｋアポトーシス耐性ＣＨＯ細胞は、高い細胞密度及び長い培養時間により、高生存率／高収量の強化生成プロセスを可能にする。

【図1】

【図2A-2C】

【図3A-3C】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A-18C】

【図19A-19B】

【図20】

【図21A-21C】

【図22A-22D】

【図23A-23C】

【図24A-24C】

【図25A-25D】

【配列表】

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【国際調査報告】