特表2023-533323血液及び体液からの微生物の単離及び迅速検出のための方法及び組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-02
(54)【発明の名称】血液及び体液からの微生物の単離及び迅速検出のための方法及び組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 1/06 20060101AFI20230726BHJP
C12Q 1/04 20060101ALI20230726BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20230726BHJP
【ＦＩ】
C12N1/06
C12Q1/04
G01N33/48 M
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023501209
(86)(22)【出願日】2021-07-08
(85)【翻訳文提出日】2023-02-28
(86)【国際出願番号】 US2021040951
(87)【国際公開番号】W WO2022011182
(87)【国際公開日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】63/050,509
(32)【優先日】2020-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523005405
【氏名又は名称】アキュタス ダイアグノスティクス，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100115794
【弁理士】
【氏名又は名称】今下 勝博
(74)【代理人】
【識別番号】100119677
【弁理士】
【氏名又は名称】岡田 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100160495
【弁理士】
【氏名又は名称】畑 雅明
(74)【代理人】
【識別番号】100173716
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 真理
(72)【発明者】
【氏名】シャンムガム、メイユヴァハナン
(72)【発明者】
【氏名】アクタル、マムタズ
(72)【発明者】
【氏名】ゴールドバーグ、デイビット
(72)【発明者】
【氏名】ボン オム、マージョリー
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
2G045AA28
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB21
4B063QA01
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4B065CA46
(57)【要約】
本開示は、血液試料を試験して、血流感染症（ＢＳＩ）の存在を判定し且つ種類を特定するための方法及び組成物を提供する。一実施形態では、組成物は、ベタイン塩酸塩、スペルミジン、サポニン、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００を含む溶解試薬又は組成物である。方法は、溶解試薬を血液試料と組み合わせることと、ＢＳＩを引き起こす微生物を単離するための少なくとも１つの遠心分離工程と、を含む。微生物は、様々な方法工程が行われた後でも血液試料に対して診断試験が行われ得るように生存したままである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポリアミンと、脂肪動員薬と、
サポニンと、
界面活性剤と、
を含む、血液細胞溶解用試薬組成物。
【請求項2】
前記ポリアミンは、スペルミジン、プトレシン、スペルミン、アグマチン、カダベリン、及びそれらの任意の組合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項3】
前記ポリアミンは、スペルミジンである、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項4】
前記脂肪動員薬は、ベタイン塩酸塩、オキシベタイン、トリメチルグリシン、イノシトール、メチオニン、それらの任意の組合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項5】
前記脂肪動員薬は、ベタイン塩酸塩である、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項6】
前記界面活性剤は、親水性ポリエチレンオキシド鎖を有する非イオン性界面活性剤である、請求項１に記載の試薬組成物。
【請求項7】
前記組成物は、０．２５～１ｍｍｏｌ／Ｌのポリアミンと、
０．５～１ｍｍｏｌ／Ｌの脂肪動員薬と、
０．２２７２～０．３６３６体積％の界面活性剤と、
０．０９０９～０．２２７２体積％のサポニンと、
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
少なくとも１つの細菌によって引き起こされる血流感染症について患者の血液試料を試験する方法であって、前記患者から試料を採取する工程と、
請求項１に記載の組成物を前記試料と混合して、第１の混合物を形成する工程と、
前記第１の混合物を遠心分離して、前記第１の混合物を、上清及びペレットに分離する工程と、
前記上清を廃棄する工程と、
前記ペレットを増殖培地に入れて、第２の混合物を形成する工程と、
前記第２の混合物を遠心分離する工程と、
前記第２の混合物を試験して、前記少なくとも１つの細菌の存在を判定する工程と、
を含む、少なくとも１つの細菌によって引き起こされる血流感染症について患者の血液試料を試験する方法。
【請求項9】
前記混合工程の後、且つ前記第１の遠心分離工程の前に、前記第１の混合物をベタイン塩酸塩及び水を含む第２の組成物で希釈する工程を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記第２の混合物を遠心分離する工程の後、且つ前記試験工程の前に、前記第２の混合物を遠心分離する工程の間中に生成された第２のペレットを廃棄する工程を更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記第１の混合物は、０．２５～１ｍｍｏｌ／Ｌのポリアミンと、
０．５～１ｍｍｏｌ／Ｌの脂肪動員薬と、
０．２２７２～０．３６３６体積％の界面活性剤と、
０．０９０９～０．２２７２体積％のサポニンと、
を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
少なくとも１つの細菌によって引き起こされる血流感染症を有することが知られている患者の血液試料を試験する方法であって、前記患者から試料を採取する工程と、
請求項１に記載の組成物を前記試料と混合して、第１の混合物を形成する工程と、
前記第１の混合物を遠心分離して、前記第１の混合物を、上清及びペレットに分離する工程と、
前記上清を廃棄し、且つ前記ペレットを保持する工程と、
前記ペレットを試験して、前記少なくとも１つの細菌の種類を特定する工程と、
を含む、少なくとも１つの細菌によって引き起こされる血流感染症を有することが知られている患者の血液試料を試験する方法。
【請求項13】
前記混合工程の後且つ前記第１の遠心分離工程の前に、前記第１の混合物をベタイン塩酸塩及び水を含む第２の組成物で希釈する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、血流感染症の感染源又は原因を迅速に特定するための血液検査方法及び組成物に関する。特に、本開示は、接種され、ベタイン塩酸塩と、スペルミジンと、サポニンと、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００等の界面活性剤とを含む新規な組成物と組み合わされる、血流試料中の感染源を迅速に特定する方法を提供する。試料は、次いで、グラム染色又は他の診断のために処理されて、感染症の種類を特定する。
【背景技術】
【0002】
血流感染症（Ｂｌｏｏｄ Ｓｔｒｅａｍ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＢＳＩ）は、世界的に深刻な病状であり、感染に対する宿主応答の調節不全により、生命を脅かす多臓器不全を導く。米国では、ＢＳＩが院内死亡の主な原因であり、年間２４０億ドルを超える費用がかかる。
【0003】
健康な患者では、血液は無菌である。全身又は局所感染は、微生物を血流に侵入させる可能性があり、これは「菌血症」として知られている。菌血症の大部分は免疫系によって迅速に排除される。圧倒的な微生物感染は、免疫系に打ち勝ち、ＢＳＩを生じさせ得る。血流感染症に関与する微生物を特定するために、血液培養物が必要とされる。血液培養物は、微生物（細菌又は酵母細胞）の増殖を支援する液体ブロス培地を含有する特殊な血液培養瓶に接種された、ＢＳＩを有すると疑われる患者からの血液試料からなる。
【0004】
ＢＳＩでは、患者血液１ｍＬ当たりの微生物の数が非常に少ない。血液培養瓶中の微生物増殖の検出は、血液が患者から採取された後、数時間（最低２４～７２時間）かかる。処置の１時間毎の遅延は、死亡の相対リスクの６～８％の増加をもたらす。現在、多くの医療従事者は、患者のＢＳＩの程度及び種類を知らないにもかかわらず、「抗生物質の投与開始が１時間遅れるごとに、生命が犠牲になる」という慣行を採用し、且つ抗生物質を投与している。これは、不適切な抗生物質投与による抗生物質耐性のレベルを増加させ、これは世界的な危機となり得る。さらに、不適切な抗生物質又はＢＳＩの種類に不適なものもまた、臓器損傷、ミトコンドリア機能不全、宿主マイクロバイオームに対する影響、ならびに真菌及びクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染による過剰増殖を介する等、患者に害を及ぼし得る。
【0005】
必要とする患者に役立てるために、早期診断のためのより良いツール及びプロトコルが、迅速且つ適切な抗生物質治療のための前提条件である。したがって、血液培養瓶からの微生物の増殖を迅速に検出する方法を開発する必要がある。微生物（複数可）の増殖が検出されると、グラム陽性、陰性及び酵母を区別するためにグラム染色が行われる。この早期情報は、臨床医が、必要とする患者に最も適切な抗生物質治療を決定するのを助けることができる。
【0006】
さらに、血液培養瓶からの微生物増殖の迅速な検出では、溶解によって血球を除去しながら微生物の生存率を維持することが重要である。微生物の生存率は、薬剤感受性試験（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ：ＡＳＴ）等の下流工程での試験にとっても重要である。インタクトな微生物を有することは、ＰＣＲ又はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析及び次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）等の更なる微生物特定にとって重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示の方法は、患者からの採血直後の血液培養瓶、及び／又は微生物について陽性であることが既に知られている血液培養試料からの生存微生物の単離を可能にする。本開示の方法は、脂肪動員薬（ｌｉｐｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ、脂肪作用薬）（例えば、ベタイン塩酸塩）と、ポリアミン（例えば、スペルミジン）と、サポニンと、非イオン性界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００）等の血球を溶解することが知られている溶解緩衝液とを含む組成物又は溶解試薬で血液培養試料を処理することを含む。この方法には、血液試料から微生物を濃縮し、且つ単離するための少なくとも１つの遠心分離工程も存在する。
【0008】
重要なことに、本開示の方法は、血液培養試料のほんの一部から生存微生物を提供する。タイムラプスデジタル顕微鏡を使用して、試料に対して迅速な微生物増殖検出が行われ得る。微生物の生存率は、微生物の同定及びＡＳＴ試験等の下流工程での複数の試験が実施されることを可能にする。本開示のこれらの方法はまた、更なる分析のために純粋培養物を調製し、且つ増殖させる選択肢を提供する。
【0009】
一実施形態において、本開示は、ポリアミンと、脂肪動員薬と、サポニンと、界面活性剤とを含む、血液細胞溶解溶液用試薬組成物を提供する。組成物は、０．５～１ｍｍｏｌ／Ｌのポリアミンと、０．５～１ｍｍｏｌ／Ｌの脂肪動員薬と、０．０９０９～０．２２７２体積％の界面活性剤と、０．２７２７～０．３６３６体積％のサポニンとを含むことができる。
【0010】
本開示はまた、少なくとも１つの細菌によって引き起こされる血流感染症について患者の血液試料を試験する方法を提供する。本方法は、患者から試料を採取する工程と、前段落の組成物を試料と混合して第１の混合物を形成する工程と、第１の混合物を遠心分離して、第１の混合物を、上清及びペレットに分離する工程と、上清を廃棄する工程と、ペレットを増殖培地に入れて、第２の混合物を形成する工程と、第２の混合物を遠心分離する工程と、第２の混合物を試験して、少なくとも１つの細菌の存在を判定する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】本開示の第１の方法の概略図である。
【図2】本開示の第２の方法の概略図である。
【図3】本開示の第３の方法の概略図である。
【図4】血液試料に対する本開示の方法の使用後の選択された微生物の増殖を確認する、選択された時点でのデジタル顕微鏡写真を示す。顕微鏡写真は、タイムラプスデジタル顕微鏡を使用して撮影される。
【図5a】選択された微生物の増殖曲線を時間の関数として示し、データは、デジタル顕微鏡を使用して得られる。
【図5b】選択された微生物の増殖曲線を時間の関数として示し、データは、デジタル顕微鏡を使用して得られる。
【図5c】選択された微生物の増殖曲線を時間の関数として示し、データは、デジタル顕微鏡を使用して得られる。
【図5d】選択された微生物の増殖曲線を時間の関数として示し、データは、デジタル顕微鏡を使用して得られる。
【図5e】選択された微生物の増殖曲線を時間の関数として示し、データは、デジタル顕微鏡を使用して得られる。
【図5f】選択された微生物の増殖曲線を時間の関数として示し、データは、デジタル顕微鏡を使用して得られる。
【図5g】選択された微生物の増殖曲線を時間の関数として示し、データは、デジタル顕微鏡を使用して得られる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
図面、特に図１～図３を参照すると、本開示の方法の概略図が示されている。本開示の方法は、患者からの新たに接種された血液試料の迅速な処理を提供して、患者が血流感染症（ＢＳＩ）を有するか否か、且つ有する場合、感染症を引き起こしている細菌の種類を特定する。本開示の方法はまた、ＢＳＩを有することが知られているが、どの種類であるかが明らかでない患者からの試料の迅速な分析を提供することができる。本開示の方法は、脂肪動員薬と、ポリアミンと、サポニンと、溶解緩衝液とを含む新規な組成物で血液試料を処理することを含む。一実施形態では、新規な組成物は、ベタイン塩酸塩と、スペルミジンと、サポニンと、非イオン性界面活性剤、例えばＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ１００とを含む。得られた組成物は撹拌され、且つ／又は少なくとも１つの遠心分離工程にかけられて、組成物の成分を分離する。
【0013】
適切な脂肪動員薬は、ベタイン塩酸塩、オキシベタイン（ｏｘｉｂｅｔａｉｎｅ）、トリメチルグリシン、イノシトール、メチオニン、及びそれらの任意の組合わせを含む。一実施形態では、脂肪動員薬はベタイン塩酸塩である。
【0014】
適切なポリアミンは、スペルミジン、プトレシン、スペルミン、アグマチン、カダベリン、及びそれらの任意の組合わせを含む。一実施形態では、脂肪動員薬はスペルミジンである。
【0015】
適切な溶解緩衝液は、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤を含む。具体的な非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００及びＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０、又はそれらの組合わせを含む。Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ１００は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から入手可能であり、一般名ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノールを有し、式ｔ－ｏｃｔ－Ｃ６Ｈ４－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｘを有し、式中、ｘは９又は１０である。ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ－６３０は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から入手可能であり、一般名オクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノールを有し、分岐しており、式（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎＣ１４Ｈ２２Ｏを有する。
【0016】
重要なことに、本開示の方法は、現在利用可能なものよりもはるかに短い時間でＢＳＩの存在及び原因となる細菌の種類を同定することができる試験結果を提供する。前述のように、従来技術の方法は２４～７２時間かかる可能性があり、これは患者にとって壊滅的な影響、最も顕著には、１時間経過毎の死亡の可能性の有意な増加を引き起こす。対照的に、本方法は、以下でより詳細に説明するように、４時間以内に結果を提供することができる。さらに、他の先行技術の方法が細菌試料を破壊する可能性がある場合、本開示の方法は、更に分析され且つ試験され得る生存微生物試料を提供する。
【0017】
以下でより詳細に論じるように、本明細書に記載の詳細な方法は、微生物（複数可）の早期検出のために、新たに接種した血液培養試料、血液培養陽性試料及び他の体液からの生存微生物（複数可）（すなわち、ＢＳＩを引き起こす因子）の単離を提供する。検出は、タイムラプスデジタル顕微鏡を用いて、且つその後の単離された微生物（複数可）の下流工程での試験のために行われ得る。様々な方法は、新たに接種した血液培養試料及び血液培養陽性試料から単離された微生物（複数可）の下流工程での複数の分析を可能にする。
【0018】
本開示はまた、新たに回収された血液培養物から、又は微生物（複数可）の存在について陽性と試験された血液培養試料から生存微生物（複数可）を単離、検出、及び／又は評価する方法を提供する。これらの方法は、少なくとも１つの微生物を含有すると判定された生物学的試料を得ることと、生物学的試料の少なくとも一部をベタイン塩酸塩及びスペルミジン含有溶解試薬と組み合わせて、生物学的試料中の非標的細胞（例えば、血液試料中の血球）を溶解することと、インタクトな微生物（複数可）を単離することと、生物学的試料中の微生物（複数可）の増殖を早期に検出することと、場合によりプレートに播種した純粋培養物又は単一の接種物を調製することと、単離された生存微生物（複数可）又は場合により純粋な培養物／接種物に対して下流工程での分析を行うことと、を含む。
【0019】
図１には、本開示の方法の第１の実施形態が参照番号１０００で示されている。まず、ＢＳＩを有することが疑われる患者から培養物が採取される（工程１００１）。試料は、撹拌しながら高温（例えば３０℃～３５℃）で一定期間（例えば、２～３時間）インキュベートされる（工程１００２）。新たに接種した血液培養試料（例えば、５～１０ｍＬ）の一部が培養物から得られる（工程１００３）。一定量の溶解試薬（例えば、０．５～１ｍＬ）が血液培養物に添加される（工程１００４）。試薬については、以下でより詳細に説明される。
【0020】
新たに接種した血液培養試料と溶解試薬との混合物は、一定期間（例えば３０～６０秒）ボルテックスされ、十分に混合され、且つ室温で最大５分間インキュベートされて（工程１００５）、インキュベートした、溶解試料を生成する。インキュベートした溶解試料は、溶解試料に添加した場合のベタイン塩酸塩の最終濃度が約１ｍｍｏｌ／Ｌになるように、ベタイン塩酸塩水溶液で希釈され（例えば、１：１０～１：２０希釈）、且つ混合される（工程１００６）。希釈した試料は、最大１０分間遠心分離（例えば２０００×ｇ～３０００×ｇ）されて、上清及びペレットを生成する（工程１００７）。ペレットは、もしあれば微生物を含有するであろう。上清は廃棄される（工程１００７ａ）。
【0021】
単離された生存微生物（複数可）を含有するペレットは、増殖培地（例えば、０．１～０．３ｍＬ）に再懸濁される（工程１００８）。増殖培地については、以下でより詳細に説明される。単離／生存微生物（複数可）の再懸濁ペレットは、ボルテックスされ、且つよく混合される（工程１００８）。次いで、再懸濁した単離／生存微生物（複数可）は、一定期間（例えば、最大１０分）遠心分離される（例えば、約１５０×ｇ～１７５×ｇ）（工程１００９）。上清は、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）中の単一ウェルに移され（工程１０１０）、一方、ペレットは、廃棄される（工程１００９ａ）。ウェルプレートは、遠心分離され（例えば、約１００×ｇ～２００×ｇで最大５分間）（工程１０１１）、且つ次いで、タイムラプスデジタル顕微鏡観察及び分析に直ちにかけられる（工程１０１２）。微生物（複数可）の陽性増殖試料は、グラム染色にかけられる（工程１０１３）。これは、試料中に存在する特定の種類の微生物を同定するのに役立つ。図１の方法が要する合計時間は、４時間以下とすることができる。
【0022】
図２を参照すると、本開示の第２の方法が参照番号２０００で示されている。方法２０００は、方法１０００と同様であるが、以下で説明するいくつかの重要な違いがある。方法２０００では、まず、ＢＳＩを有すると疑われる患者から培養物が採取される（工程２００１）。試料は、撹拌しながら高温（例えば３０℃～３５℃）で一定期間（例えば、２～３時間）インキュベートされる（工程２００２）。新たに接種した血液培養試料（例えば、５～１０ｍＬ）の一部を培養物から得る（工程２００３）。一定量の溶解試薬（例えば、０．５～１ｍＬ）が血液培養物部分に添加される（工程２００４）。さらに、試薬は、以下でより詳細に説明される。
【0023】
新たに接種した血液培養試料と溶解試薬との混合物は、一定期間（例えば３０～６０秒）ボルテックスされ、十分に混合され、且つ室温で最大５分間インキュベートされて（工程２００５）、インキュベートした溶解試料を生成する。インキュベートした溶解試料は、溶解試料に添加した場合のベタイン塩酸塩の最終濃度が０．５～１ｍｍｏｌ／Ｌになるように、ベタイン塩酸塩水溶液で希釈される（例えば、１：１０～１：２０希釈）（工程２００６）。希釈した試料は、最大１０分間遠心分離されて（例えば、約２０００×ｇ～３０００×ｇ）、上清及びペレットを生成する（工程２００７）。ペレットは、もしあれば微生物を含有するであろう。上清は廃棄される（工程２００７ａ）。
【0024】
単離された生存微生物（複数可）を含有するペレットは、増殖培地（例えば、０．１～０．３ｍＬ）に再懸濁される（工程２００８）。増殖培地については、以下でより詳細に説明される。ここにおいて、方法２０００は、方法１０００と異なる。再懸濁したペレットが再度遠心分離される別の遠心分離工程（方法２０１０のように）ではなく、方法２０００では、工程２００８からのペレットは、ウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）内の単一ウェルに直接移される（工程２０１０）。次いで、ウェルプレートは、遠心分離され（例えば、約２００×ｇで最大５分間）（工程２０１１）、且つ次いで、タイムラプスデジタル顕微鏡観察及び分析に直ちにかけられる（工程２０１２）。微生物（複数可）の陽性増殖試料は、グラム染色にかけられる（工程２０１３）。これは、試料中に存在する特定の種類の微生物を同定するのに役立つ。図２の方法が要する合計時間は、３時間３０分以下とすることができる。方法２０００は、２つの遠心分離工程を有し、方法１０００は、３つの遠心分離工程を有していた。
【0025】
図３に示され、符号３０００で参照される第３の方法は、患者がＢＳＩを有すると推定されているか、又は知られているという点で方法１０００及び２０００とは異なる（工程３００１）。したがって、方法３０００では、血液培養陽性（ＰＢＣ）試料の一部（例えば、５～１０ｍＬ）が得られる（工程３００２）。試薬は、ＰＢＣ試料に添加される（工程３００３）。ＰＢＣ試料と溶解試薬との混合物は、一定期間（例えば、３０～６０秒）ボルテックスされ、十分に混合され、且つ室温で一定期間（例えば最大５分）インキュベートされる（工程３００４）。インキュベートした溶解試料は、ベタイン塩酸塩水溶液で希釈されて（例えば、１：１０～１：２０希釈）、溶解試料に添加した場合のベタイン塩酸塩の最終濃度は、０．５～１ｍｍｏｌ／Ｌになる（工程３００５）。
【0026】
希釈した試料は、遠心分離されて（例えば、約２０００×ｇ～３０００×ｇで最大１０分間）、上清及びペレットを生成する（工程３００６）。上清は、廃棄され（工程３００７）、単離／生存微生物（複数可）を含有するペレットは保持される（工程３００８）。次いで、ペレットは、任意の数の診断試験にかけられて、試料中に存在する微生物の種類を特定することができる（工程３００９）。例えば、これらの試験は、マトリックス支援レーザ吸着イオン化飛行時間型質量分析（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）、薬剤感受性試験（ＡＳＴ）、グラム染色、及び純粋培養技術を含み得る。図３の方法にかかる合計時間は、３０分以下とすることができる。方法３０００では、単一の遠心分離工程が存在する。
【0027】
以下の表１は、溶解試薬組成物の一実施形態の成分及び量を示し、これは、溶解試薬組成物が血液試料に添加された後の各成分のモル量又は体積量である。本開示は、予想外にも、ベタイン塩酸塩及びスペルミジンが、上記の方法に記載されるように、患者の身体から抽出され、且つインキュベートされ、ボルテックスされ、且つ遠心分離された後に、微生物の生存を維持する優れた能力を提供することを見出した。これは、存在する微生物の種類を特定するために試料に対して行うことができる無数の診断試験を可能にするという点で重要である。表１の組成物はまた、上記の代替物、例えば、ベタイン塩酸塩を代替するオキシベタイン、又はスペルミジンを代替するプトレシンを含み得る。
【0028】
【表1】
【0029】
以下の表２は、方法１０及び１００で使用される増殖培地の組成物を示す。
【0030】
【表2】
【0031】
表３及び表４並びに図４～図５ｇは、本開示の方法が特定の血液試料で試験される場合に達成された結果に関する。まず、血液試料は、表３に列挙した量の特定の種類の細菌でスパイクされた。表４は、本明細書に記載の方法の様々な段階に必要な時間を示す。図４～図５ｇは、このデータをグラフ形式で示している。一部の細菌、例えばＥ．クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）は、他の細菌よりも増殖に時間がかかり得る。しかし、表４に見られるように、すべての場合において、ＢＳＩの存在を判定し且つ種類を特定するための総時間は８．５時間未満であった。示された細菌のほとんどで、必要な時間は６．５時間以下又は５．５時間以下であった。血液試料中の細菌数が多い場合、ＢＳＩの存在を決定する総時間は更に短く、すなわち４時間以下であり得る（前述のように）。細菌数が少ない場合、例えば表３に記載のように細菌数が少ない場合、表４の時間で示されるように、増殖を検出するのにより多くの時間がかかる。いずれの場合でも、本開示は、前述したように２４時間から７２時間もかかる可能性がある現行の方法に対する大幅な改善を提供する。したがって、本開示の方法及び組成物は、ＢＳＩの療養者及びそれらを治療する医療専門家に大きな利益を提供する。
【0032】
【表3】
【0033】
【表4】
【0034】
１つ以上の例示的な実施形態を参照して本開示が説明されてきたが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ得、等価物によって、その要素が置き換えられ得ることは当業者によって理解されるであろう。時間、量又は濃度等の上記の任意の範囲について、本明細書は、その範囲及びそれらの間の任意の部分範囲を企図する。例えば、本明細書が３０～６０秒の範囲を記載する場合、本開示は、３５～５５秒、４０～５０秒、３０～５５秒等も企図する。加えて、本開示の範囲から逸脱することなく、特定の状況又は材料を本開示の技術に適合させるために多くの変更がなされ得る。したがって、本開示は、企図される最良の形態として開示された特定の実施形態（複数可）に限定されず、それは、添付の特許請求の範囲内に入るすべての実施形態を含むことが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図5g】
【国際調査報告】