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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-02
(54)【発明の名称】コロナウイルス交差反応性抗体を同定する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20230726BHJP
C07K 16/10 20060101ALI20230726BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20230726BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230726BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230726BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20230726BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
C07K16/10
C12Q1/02
A61P31/14
A61K39/395 S
G01N33/569 L
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023501599
(86)(22)【出願日】2021-07-09
(85)【翻訳文提出日】2023-03-03
(86)【国際出願番号】 NL2021050435
(87)【国際公開番号】W WO2022010353
(87)【国際公開日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】2026043
(32)【優先日】2020-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523009159
【氏名又は名称】ライデン ラボラトリーズ ビー．ブイ．
(74)【代理人】
【識別番号】100118599
【弁理士】
【氏名又は名称】村上 博司
(74)【代理人】
【識別番号】100160738
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 由加里
(72)【発明者】
【氏名】ゴーズミット，ヤープ
(72)【発明者】
【氏名】ファン ギル，マリト ヨハンナ
(72)【発明者】
【氏名】サンデルス，ロギール ウィレム
【テーマコード（参考）】
4B063
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QR48
4B063QS10
4B063QS33
4B063QS35
4B063QX01
4C085AA14
4C085BA71
4C085BB33
4C085BB36
4C085BB37
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG10
4H045AA10
4H045AA11
4H045DA75
4H045EA20
4H045EA31
(57)【要約】
本開示は、コロナウイルス交差反応性抗体を同定する方法を提供する。そのような抗体は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する。本明細書に記載されている方法により同定される抗体は、特に高病原性コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による、コロナウイルス感染症の他に、典型的に非ヒトコロナウイルスの種間伝染を処置又は予防する為に特に有用である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
コロナウイルス交差反応性抗体を同定する方法であって、ａ）１以上のヒト対象からの血漿試料、好ましくは少なくとも４５歳以上の１以上のヒト対象からの血漿試料、を用意すること、ここで、上記試料が独立して時点（Ｘ）で収集される；
ｂ）少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）に結合する免疫グロブリンを有する血漿試料を有する対象を同定すること、ここで、該ＨＣｏＶが、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される；
ｃ）上記同定された対象からのＰＢＭＣ試料を用意すること、ここで、該ＰＢＭＣ試料が、時点（Ｘ）又はそれ以後に収集され、並びにメモリーＢ細胞、形質細胞、及び形質芽球から選択されるＢ細胞を含む；
ｄ）ｃ）の該Ｂ細胞によりコードされる抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳ（スパイク）タンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすること；
ｅ）ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合するところの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；
ｆ）ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害するところの、ｅ）からの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる為の、ｆ）からの該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；並びに、
ｈ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること
を含む、前記方法。
【請求項2】
複数の対象からの更なる血漿試料を用意することを更に含み、ここで、上記試料は時点（Ｙ）で収集され、時点（Ｙ）は時点（Ｘ）よりも少なくとも３ヶ月前又は後である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
対象からの血漿試料が選択され、該血漿試料は、より前又はより後の時点で収集された対象からの血漿試料と比較して少なくとも２つのＨＣｏＶに結合する免疫グロブリンにおける増加を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
該血漿試料は、独立して、少なくとも２つのＨＣｏＶに結合する、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／又はＩｇＡ免疫グロブリンを有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
該免疫グロブリンは、ＨＣｏＶスパイクタンパク質のＳ２ドメインに結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
工程ｄ）が、抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳタンパク質の融合ペプチド、該Ｓタンパク質のＨＲ１ヘプタッドリピート、又は該Ｓタンパク質のＨＲ２ヘプタッドリピートの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすることを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
工程ｅ）が、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
工程ｅ）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択することを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
工程ｇ）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定することを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
工程ｈ）が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択することを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳ２ドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合するところの抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；該選択された抗原結合性断片を含むＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体を調製すること、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体の能力を決定すること；並びに、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させるＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体を選択すること
を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１稿に記載の方法によって同定される抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項13】
前記抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡ抗体である、請求項１２に記載の抗体。
【請求項14】
コロナウイルスによる感染症を処置又は予防する方法であって、それを必要とする対象に局所的に、好ましくは鼻腔内に、請求項１２又は１３に記載の抗体を投与することを含む、前記方法。
【請求項15】
前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、コロナウイルス交差反応性抗体を同定する方法を提供する。そのような抗体は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する。本明細書に記載されている方法により同定される抗体は、特に高病原性コロナウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による、コロナウイルス感染症の他に、典型的に非ヒトコロナウイルスの種間伝染を処置又は予防する為に特に有用である。
【背景技術】
【0002】
コロナウイルスは、哺乳動物及び鳥に感染できるエンベロープ型ＲＮＡウイルスである。アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルスは哺乳動物に感染し（例えば、ウシコロナウイルス（ＢＣｏＶ：bovine coronavirus）；イヌコロナウイルス（ＣＣｏＶ：canine coronavirus）、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ：feline coronavirus）、及びヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ：human coronavirus）、ガンマコロナウイルス及びデルタコロナウイルスは一般に鳥に感染する。殆どのコロナウイルスは１つの宿主種にのみ感染する。しかしながら、種間伝染が起こることもあり、ヒトにおける疾患出現の有意な原因である（すなわち、人獣共通感染症）。
【0003】
コロナウイルスは、スパイクタンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質及びヌクレオカプシドタンパク質を包含する幾つものウイルスタンパク質をコードする。該スパイクタンパク質（Ｓタンパク質）は、大きいＩ型膜貫通のクラスＩ融合タンパク質である。該Ｓタンパク質のエクトドメインはＳ１ドメイン及びＳ２ドメインを含有する。該Ｎ末端Ｓ１ドメインは受容体結合ドメイン（ＲＢＤ：receptor binding domains）を含み、受容体結合を担う。該Ｓ１ドメイン、特に該Ｓ１ ＲＢＤは、特有のコロナウイルスに対して開発された幾つもの抗体及びワクチンの標的部位とされている。該Ｃ末端Ｓ２エクトドメインは融合を担い、ＵＨドメイン（上流ヘリックス）、融合ペプチド、２つのヘプタッドリピート（hepted repeat）（ＨＲ１及びＨＲ２）、中心ヘリックス、並びにベータヘアピンを含む。これらの領域及びそのような領域の例示的な配列は当技術分野において既知であり、コロナウイルスの配列アライメントは以前に報告されている（例えば、Walls et al．Nature 2016 531:114-117、特にExtended Data Figure 9を参照）。
【0004】
コロナウイルスの７つの株は、ヒトに感染することが知られている。ヒトコロナウイルスの４つによる感染症、すなわち、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、及びＨＫＵ１感染症、は、典型的に軽症～重症の上及び下気道疾患をもたらす。これらのウイルスは感冒の約１５％を占める。ヒトコロナウイルスの３つ、すなわち、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ：Middle East respiratory syndrome-related coronavirus）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ：Severe acute respiratory syndrome coronavirus）、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2）、による感染症は、重度の症状の他に死に繋がる可能性がある。ヒトはヒトコブラクダからＭＥＲＳ－ＣｏＶを；コウモリからＳＡＲＳ－ＣｏＶを獲得した可能性が高く；コウモリはまたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリザーバー宿主であった可能性がある。
【0005】
ウイルス受容体エンゲージメント及びウイルス融合は、宿主細胞へのウイルス進入の為に必須である。コロナウイルスのスパイクタンパク質は、異なる標的に結合して感染力を媒介する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＮＬ６３はＡＣＥ２に結合し、ＯＣ４３及びＨＫＵ１は９－Ｏ－アセチル化されたシアル酸に結合し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶはＤＰＰ４及びシアル酸に結合し、２２９ＥはＡＰＮに結合する。これらのウイルスの間の更なる区別的な要因は、ヒトフューリン切断部位の、ウイルススパイクタンパク質Ｓにおける存在又は非存在である。ヒトフューリン切断部位は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質中に存在するが、ＮＬ４３、２２９Ｅ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質には存在しない。
【0006】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２はＣＯＶＩＤ－１９ウイルス（すなわち、コロナウイルス疾患２０１９を引き起こす新規のコロナウイルス）とも称される。Ｃｏｖｉｄ－１９パンデミックは莫大な健康上の危機をもたらしており、この感染症を予防、寛解又は治癒する為に新規の解決策が緊急に必要とされている。本開示の１つの目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、並びに他の病原性コロナウイルスに対する免疫を増加させる為の方法及び組成物を提供することである。
【0007】
入院をもたらす重症ＣＯＶＩＤ－１９の主要なリスク群は７０～８０歳においてピークとなっており、ＣＯＶＩＤ－１９死亡率はオランダのような国において８０～９０歳においてピークとなっている。この群では、その大部分が非伝染性である併存症の数が増えている。ＣＯＶＩＤ－１９はそのため、肺炎球菌性肺炎、重症インフルエンザ、帯状疱疹及び百日咳のように、加齢での新興疾患である（Santesmasses D et al．COVID-19 is an emergent disease of the aging，MedRxiv 2020）。当該群は、免疫の減衰及びこの年齢群を対象としたワクチンに対する不良な応答性という問題がある。これは依然として、高齢者におけるワクチン有効性についての主要な障害である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
理論により縛られることを望まないが、本開示は、「一般的な（ｃｏｍｍｏｎ）」ＨＣｏＶ（例えば、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＮＬ６３、及びＨＫＵ１）による感染、特に同時的な又は逐次的な感染、は、異種ウイルス株、例えば病原性ＨＣｏＶ、に対する交差反応性Ｂ細胞を誘導することを提唱する。本明細書に開示されている方法は、イン・ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）汎コロナ交差保護を提供する抗体を同定する為にイン・ビボモデルと共にこれらの交差反応性Ｂ細胞を活用する。そのような方法は、例えば、イン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）中和活性研究に基づいて、又は回復期ＣＯＶＩＤ－１９患者から、抗体候補を選択する従来の研究とは異なる。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本明細書に記載されている方法から同定される抗体は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を包含する、重症の及び潜在的に生命を脅かす感染症を発症するリスクがある対象を保護する為に特に有用である。そのような抗体はまた、コロナウイルスの種間伝染からの保護のファーストラインとして有用でありうる。
【0010】
本開示は以下の好ましい実施態様を提供する。しかしながら、本発明はこれらの実施態様に限定されない。
【0011】
１つの観点において、コロナウイルス交差反応性抗体を同定する方法であって、
ａ）１以上のヒト対象からの血漿試料、好ましくは少なくとも４５歳以上の１以上のヒト対象からの血漿試料、を用意すること、ここで、上記試料が独立して時点（Ｘ）で収集される；
ｂ）任意的に及び好ましくは、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）に結合する免疫グロブリンを有する血漿試料を有する対象を同定すること、ここで、該ＨＣｏＶが、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される；
ｃ）上記同定された対象からのＰＢＭＣ試料を用意すること、ここで、該ＰＢＭＣ試料が、時点（Ｘ）又はそれ以後に収集され、並びにメモリーＢ細胞、形質細胞、及び形質芽球から選択されるＢ細胞を含む；
ｄ）ｃ）の該Ｂ細胞によりコードされる抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳ（スパイク）タンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすること；好ましくは、抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳタンパク質の融合ペプチド、該Ｓタンパク質のＨＲ１ヘプタッドリピート、又は該Ｓタンパク質のＨＲ２ヘプタッドリピートの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすること；
ｅ）ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；好ましくは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ｆ）ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害するところの、ｅ）からの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる為の、ｆ）からの該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；並びに、
ｈ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること
を含む、上記方法が提供される。
ａ）１以上のヒト対象からの血漿試料、好ましくは少なくとも４５歳以上の１以上のヒト対象からの血漿試料、を用意すること、ここで、上記試料が独立して時点（Ｘ）で収集される；
ｂ）任意的に及び好ましくは、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）に結合する免疫グロブリンを有する血漿試料を有する対象を同定すること、ここで、該ＨＣｏＶが、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される；
ｃ）上記同定された対象からのＰＢＭＣ試料を用意すること、ここで、該ＰＢＭＣ試料が、時点（Ｘ）又はそれ以後に収集され、並びにメモリーＢ細胞、形質細胞、及び形質芽球から選択されるＢ細胞を含む；
ｄ）ｃ）の該Ｂ細胞によりコードされる抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳ（スパイク）タンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすること；好ましくは、抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳタンパク質の融合ペプチド、該Ｓタンパク質のＨＲ１ヘプタッドリピート、又は該Ｓタンパク質のＨＲ２ヘプタッドリピートの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすること；
ｅ）ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；好ましくは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ｆ）ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害するところの、ｅ）からの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ｇ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる為の、ｆ）からの該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；並びに、
ｈ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること
を含む、上記方法が提供される。
【0012】
１つの観点において、コロナウイルス交差反応性抗体を同定する方法であって、
１以上のヒト対象からのＰＢＭＣ試料を用意すること、ここで、該ＰＢＭＣ試料が、メモリーＢ細胞、形質細胞、又は形質芽球から選択されるＢ細胞を含む；
少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳ（スパイク）タンパク質の少なくとも部分に結合するＢ細胞を同定すること；好ましくは、抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳタンパク質の融合ペプチド、該Ｓタンパク質のＨＲ１ヘプタッドリピート、又は該Ｓタンパク質のＨＲ２ヘプタッドリピートの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすること；
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス、好ましくはＨＣｏＶ－ＮＬ６３、のＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、のＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合するところの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；好ましくは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害するところの、上記からの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；並びに
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること
を含む、上記方法が提供される。
１以上のヒト対象からのＰＢＭＣ試料を用意すること、ここで、該ＰＢＭＣ試料が、メモリーＢ細胞、形質細胞、又は形質芽球から選択されるＢ細胞を含む；
少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳ（スパイク）タンパク質の少なくとも部分に結合するＢ細胞を同定すること；好ましくは、抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも４つの、異なるコロナウイルスからのＳタンパク質の融合ペプチド、該Ｓタンパク質のＨＲ１ヘプタッドリピート、又は該Ｓタンパク質のＨＲ２ヘプタッドリピートの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすること；
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス、好ましくはＨＣｏＶ－ＮＬ６３、のＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルス、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、のＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合するところの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；好ましくは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのウイルス融合、感染、及び／又は複製を阻害するところの、上記からの抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定すること；並びに
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること；好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からのＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる抗体又はその抗原結合性断片を選択すること
を含む、上記方法が提供される。
【0013】
好ましくは、該方法は、複数の対象からの更なる血漿試料を用意することを含み、ここで、上記試料は時点（Ｙ）で収集され、時点（Ｙ）は時点（Ｘ）よりも少なくとも３ヶ月前又は後である。
【0014】
好ましくは、対象からの血漿試料が選択され、該血漿試料は、より前又はより後の時点で収集された対象からの血漿試料と比較して少なくとも２つのＨＣｏＶに結合する免疫グロブリンにおける増加を有する。
【0015】
好ましくは、該血漿試料は、独立して、少なくとも２つのＨＣｏＶに結合する、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及び／又はＩｇＡ免疫グロブリンを有する。好ましくは、該免疫グロブリンは、ＨＣｏＶスパイクタンパク質のＳ２ドメインに結合する。
【0016】
好ましくは、該方法は、
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳ２ドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合するところの抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；
該選択された抗原結合性断片を含むＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体を調製すること、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体の能力を決定すること；並びに
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させるＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体を選択すること
を含む。
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳ２ドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２ドメインの少なくとも部分に結合するところの抗原結合性断片を選択すること；好ましくはここで、上記選択される抗体又はその抗原結合性断片はまた、動物コロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する；
該選択された抗原結合性断片を含むＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体を調製すること、
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体の能力を決定すること；並びに
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させるＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧ抗体を選択すること
を含む。
【0017】
１つの観点において、本明細書に開示されている方法により同定されるか又は得られ得る抗体又はその抗原結合性断片が提供される。好ましくは、該抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡ抗体である。
【0018】
１つの態様において、コロナウイルスによる感染症、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症、を処置又は予防する方法であって、それを必要とする対象に局所的に、好ましくは鼻腔内に、本明細書に開示されている抗体又はその抗原結合性断片を投与することを含む、該方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックへの応答として、感染症を予防する為にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ワクチンを開発する為の様々な努力が為されてきた。典型的なワクチン開発は、疾患を引き起こすウイルスを使用すること、及び「弱毒生ワクチン」としての使用の為に該ウイルスを弱毒化すること又は該ウイルスを不活性化することに依拠する。サブユニットワクチンがまた、該ウイルスの断片、例えば表面タンパク質、に基づいて開発されうる。ワクチン開発、特には新たなウイルスに関するワクチン開発、は、長い及び困難な過程である。ワクチンはまた、リスク群、例えば高齢者、においてより低い有効性でありうる。
【0021】
ＣＯＶＩＤ－１９患者からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に向けられている抗体を同定する為の努力がまたなされている。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９患者からの中和抗体の同定を記載するKreer C et al．(Longitudinal isolation of potent near-germline SARS-CoV-2 neutralizing antibodies from COVID-19 patients．MedRxiv 2020)を参照。
【0022】
対照的に、本明細書に記載されているアプローチにより提供される解決策は、ＣＯＶＩＤ－１９患者からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に依拠しない。理論により縛られることを望まないが、ＣＯＶＩＤ－１９患者から単離されるそのような抗体は、特定の患者に感染したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株を特異的に標的化しうるが、そのような抗体は、進化しているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株、他の病原性コロナウイルス、又は種間伝染を起こしやすい動物コロナウイルスの標的化においてより低い有効性であることが本明細書において提唱される。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の大流行により実証されるように、コロナウイルスの種間伝染は疾患出現に繋がる。特定のＨＣｏＶ株に高度に特異的な抗体は、そのような新たに出現するＨＣｏＶに対する、あったとしても、有意な保護を提供する可能性が低い。
【0023】
一部の態様において、本開示は、コロナウイルス交差反応性抗体を同定する方法を提供する。１つのステップにおいて、該方法は、１以上（例えば、複数）のヒト対象からの血漿試料を用意することを含む。該試料は時点（Ｘ）で収集される。収集の時点は各々の対象について独立している。
【0024】
該ヒト対象は、好ましくは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいずれにも過去に感染していない。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による感染症の数が相対的に少ないことに起因して、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１に影響されなかった地域における２０１９年の終わりよりも前に収集された全ての試料は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のいずれにも過去に感染していない対象からのものである可能性が高い。
【0025】
幾つかの実施態様において、該対象は、少なくとも４０歳、より好ましくは少なくとも４５歳又はより高齢である。高齢の個体は、複数のＨＣｏＶに感染した可能性がより高い。幾つかの実施態様において、該対象は、７５歳又はそれ未満、より好ましくは６５歳又はそれ未満、である。好ましくは、該対象は４５～６５歳である。
【0026】
以下により詳細に記載されているように、該血漿試料は、例えば、対象が１以上のＨＣｏＶに感染しているか又は感染したかどうかを決定する為に、有用である。幾つかの実施態様において、該方法は、ＨＣｏＶ（好ましくは少なくとも２つの一般的なＨＣｏＶ）に感染しているか又は感染した対象から収集された血漿試料を選択することを更に含む。よって、該方法は、好ましくは、ヒトコロナウイルス（ＨＣｏＶ）、好ましくは少なくとも２つのヒトコロナウイルス、に結合する免疫グロブリンを有する血漿試料を選択することを含み、ここで、該ＨＣｏＶは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される。言い換えれば、ＨＣｏＶに対して免疫反応性を有する血漿試料が選択されうる。好ましくは、該血漿試料は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択されるＨＣｏＶのうちの少なくとも３つ及び少なくとも４つに対して免疫反応性を有する。好ましくは、該血漿試料は、ＨＣｏＶ ＮＬ６３に対して免疫反応性を有する。好ましくは、該血漿試料は、ＨＣｏＶ ＮＬ６３及びＨＫＵ１に対して免疫反応性を有する。
【0027】
免疫反応性及び免疫グロブリン結合性は、ＨＣｏＶを抗原として認識する、該血漿試料中の免疫グロブリンの能力を云う。上記免疫グロブリンが測定可能な免疫効果を生成することは本開示の文脈において必要ではない。２つのウイルス、例えば、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、に対する増加した免疫グロブリン結合性は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の両方に結合する免疫グロブリンにおける増加を云いうるが、そのような増加は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３に結合する特定の免疫グロブリン及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に結合する特定の免疫グロブリンにおける増加に起因することが予想される。
【0028】
「一般的」なＨＣｏＶの配列は当技術分野において既知であり、上記ウイルスによりコードされるウイルスタンパク質の配列についても同様である。コロナウイルス（coronoavirus）の供給源は、例えば、ヒト患者の鼻又は咽頭スワブから得られた、臨床分離株でありうる。該ウイルスは、細胞株、例えば哺乳動物細胞株、例えばｖｅｒｏ細胞、ＭａｄｉｎＤａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ：MadinDarby canine kidney）細胞、及びＰＥＲＣ６細胞、において繁殖させうる。例示的なＨＣｏＶ－ＮＬ６３配列は国際公開第２００５０１７１３３号パンフレットにおいて記載されている。幾つかの臨床分離株のゲノム配列がまた公開されており；例えば、ヒトコロナウイルスＮＬ６３分離株Ａｍｓｔｅｒｄａｍ４９６のゲノム配列は、アクセッション番号ＤＱ４４５９１２（ＶＲＬ ２１－ＮＯＶ－２００６）を有してPyrc et al．(J．Mol．Biol．364 (5)，964-973 (2006)において記載されており；ヒトコロナウイルスＮＬ６３分離株Ａｍｓｔｅｒｄａｍ０５７のゲノム配列は、アクセッション番号ＤＱ４４５９１１（ＶＲＬ ２１－ＮＯＶ－２００６）を有してPyrc et al．(J．Mol．Biol．364 (5)，964-973 (2006)において記載されており；ヒトコロナウイルスＮＬ６３分離株ＣｈｉｎａＧＤ０１のゲノム配列は、アクセッション番号ＭＫ３３４０４６（２８－ＦＥＢ－２０２０）を有してZhang et al．(Microbiol Resour Announc 9 (8)，e01597-19 (2020))において記載されており；ヒトコロナウイルスＮＬ６３分離株ＣｈｉｎａＧＤ０５のゲノム配列は、アクセッション番号ＭＫ３３４０４５（ＶＲＬ ２８－ＦＥＢ－２０２０）を有してZhang et al．(Microbiol Resour Announc 9 (8)，e01597-19 (2020))において記載されており；ヒトコロナウイルスＮＬ６３分離株ＮＬ６３／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／８９１－４／１９８９のゲノム配列はアクセッション番号ＫＦ５３０１１４（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有し；ヒトコロナウイルスＮＬ６３分離株ＮＬ６３／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／８３８－９／１９８３のゲノム配列はアクセッション番号ＫＦ５３０１１０（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有する。上記に列記される６つの分離株のＢＬＡＳＴ分析は、それらは、９８％より高い配列同一性を共有することを指し示す。
【0029】
ＨＣｏＶ－２２９Ｅの幾つかの臨床分離株のゲノム配列が公開されており；例えば、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ分離株０３４９のゲノム配列は、アクセッション番号ＪＸ５０３０６０（ＶＲＬ ０４－ＡＰＲ－２０１３）を有してFarsani et al．(Virus Genes 45 (3)，433-439 (2012))において記載されており；ヒトコロナウイルス２２９Ｅ分離株Ｊ０３０４のゲノム配列は、アクセッション番号ＪＸ５０３０６１（ＶＲＬ ０４－ＡＰＲ－２０１３）を有してFarsani et al．(Virus Genes 45 (3)，433-439 (2012))において記載されており；ヒトコロナウイルス２２９Ｅ／Ｓｅａｔｔｌｅ／ＵＳＡ／ＳＣ９７２４／２０１８のゲノム配列はアクセッション番号ＭＮ３６９０４６（ＶＲＬ ２１－ＦＥＢ－２０２０）を有し；ヒトコロナウイルス２２９Ｅ／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／９３３－４０／１９９３のゲノム配列はアクセッション番号ＫＦ５１４４３３（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有し；ヒトコロナウイルス２２９Ｅ／ＢＮ１／ＧＥＲ／２０１５のゲノム配列はアクセッション番号ＫＵ２９１４４８ ＶＲＬ（０４－ＳＥＰ－２０１６）を有し；ヒトコロナウイルス２２９Ｅ／Ｓｅａｔｔｌｅ／ＵＳＡ／ＳＣ１２１２／２０１６のゲノム配列はアクセッション番号ＫＹ３６９９１１（ＶＲＬ ２１－ＦＥＢ－２０２０）を有する。上記に列記される該６つの分離株のＢＬＡＳＴ分析は、それらは、９９％より高い配列同一性を共有することを指し示す。追加的に、該ウイルスはまた、ヒトコロナウイルス２２９ＥとしてＡＴＣＣから公的に入手可能である（ＡＴＣＣ ＶＲ－７４０；Hamre D，Procknow JJ．A new virus isolated from the human respiratory tract．Proc．Soc．Exp．Biol．Med．121：190-193，1966）。
【0030】
ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の幾つかの臨床分離株のゲノム配列が公開されており；例えば、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１分離株Ｃａｅｎ１のゲノム配列はアクセッション番号ＨＭ０３４８３７（ＶＲＬ ０８－ＯＣＴ－２０１０）を有し；ヒトコロナウイルスＨＫＵ１分離株遺伝子型Ａのゲノム配列はアクセッション番号ＡＹ５９７０１１（ＶＲＬ ２７－ＪＡＮ－２００６）を有し；ヒトコロナウイルスＨＫＵ１／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／ＨＫＵ１－１５／２００９のゲノム配列は、アクセッション番号ＫＦ６８６３４４（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有してDominguez et al．(J．Gen．Virol．95 (PT 4)，836-848 (2014))において記載されており；ヒトコロナウイルスＨＫＵ１／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／ＨＫＵ１－５／２００９のゲノム配列はアクセッション番号ＫＦ６８６３４０（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有し；ヒトコロナウイルスＨＫＵ１／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／ＨＫＵ１－１１／２００９のゲノム配列はアクセッション番号ＫＦ４３０２０１（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有する。上記に列記される該６つの分離株のＢＬＡＳＴ分析は、それらは、９９％より高い配列同一性を共有することを指し示す。
【0031】
ＨＣｏＶ－ＯＣ４３の幾つかの臨床分離株のゲノム配列が公開されており；例えば、ヒトコロナウイルスＯＣ４３分離株ＭＤＳ１６のゲノム配列はアクセッション番号ＭＫ３０３６２５（ＶＲＬ ３０－ＭＡＲ－２０１９）を有し；ヒトコロナウイルスＯＣ４３分離株ＭＤＳ１２のゲノム配列はアクセッション番号ＭＫ３０３６２３（ＶＲＬ ３０－ＭＡＲ－２０１９）を有し；ヒトコロナウイルスＯＣ４３／Ｓｅａｔｔｌｅ／ＵＳＡ／ＳＣ９４２８／２０１８のゲノム配列はアクセッション番号ＭＮ３１０４７６（ＶＲＬ ２１－ＦＥＢ－２０２０）を有し；ヒトコロナウイルスＯＣ４３／Ｓｅａｔｔｌｅ／ＵＳＡ／ＳＣ９４３０／２０１８のゲノム配列はアクセッション番号ＭＮ３０６０５３（ＶＲＬ ２１－ＦＥＢ－２０２０）を有し；ヒトコロナウイルスＯＣ４３／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／９２１１－４３／１９９２のゲノム配列はアクセッション番号ＫＦ５３００９７（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有し；ヒトコロナウイルスＯＣ４３／ｈｕｍａｎ／ＵＳＡ／８７３－６／１９８７のゲノム配列はアクセッション番号ＫＦ５３００８７（ＶＲＬ ２６－ＳＥＰ－２０１４）を有する。上記に列記される該６つの分離株のＢＬＡＳＴ分析は、それらは、９８％より高い配列同一性を共有することを指し示す。
【0032】
ＨＣｏＶに対する免疫反応性をアッセイする方法は当技術分野において知られている。例えば、Chan KH et al．Serological Responses in Patients With Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Infection and Cross-Reactivity With Human Coronaviruses 229E，OC43，and NL63．Clin Diagn Lab Immunol．2005 Nov;12(11):1317-21；Kramer AR et al．The Human Antibody Repertoire Specific for Rabies Virus Glycoprotein as Selected From Immune Libraries．Eur J Immunol．2005 Jul;35(7):2131-45;及びPohl-Koppe 1995 Journal of Virological Methods 55:175-183を参照。例えば、そのような方法は、例えば、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、又は任意の他の既知のイムノアッセイ、を使用して、血漿試料中に存在する免疫グロブリンを検出する為にウイルスタンパク質、又はその断片を使用することを含む。好ましくは、該方法は、ＨＣｏＶに結合する免疫グロブリンの存在を（定性的に又は定量的に）決定することを含む。好ましくは、該方法は、１以上のＨＣｏＶに対する該血漿試料の免疫反応性を決定することを含む。
【0033】
当業者に明らかなように、ＨＣｏＶに対する免疫反応性又は抗体結合性は、上記ウイルスによりコードされるタンパク質に対する免疫反応性又は抗体結合性を包含する。好ましくは、該方法は、ＨＣｏＶ Ｓタンパク質のＳ２ドメインに結合する免疫グロブリンにおける増加を有する血漿試料を選択する。
【0034】
理論により縛られることを望まないが、ＨＣｏＶに対する免疫反応性は、該ＨＣｏＶによる感染症又は過去の感染症の指標であると考えられる。好ましくは、該方法は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＧを検出する。より好ましくは、ＩｇＭ及びＩｇＡが検出され、これらの免疫グロブリンは早期感染症の指標となる。ＨＣｏＶに結合する免疫グロブリンのレベルが感染症を指し示すかどうか又はそれがバックグラウンドレベル内にあるかどうかを当業者は容易に決定することができる。例えば、抗体が、少なくとも８倍に希釈された血漿中で検出されることができる場合に、免疫反応性が指し示される。
【0035】
該方法の幾つかの実施態様において、更なる血漿試料が経時的に同じ対象から収集されうる。例えば、試料は、３、６、９、若しくは１２ヶ月又はそれらの任意の組み合わせ毎に収集されうる。幾つかの実施態様において、該方法は、時点（Ｙ）で収集された血漿試料を用意することを含み、ここで、時点（Ｙ）は時点（Ｘ）よりも少なくとも３ヶ月前又は後である。
【0036】
同じ対象から様々な時点で収集される試料は、特定の時点における対象のウイルス感染症が、ＨＣｏＶに特異的な免疫グロブリンのレベルを試料の間で比較することにより決定されることができるという利点を提供する。例えば、以前の時点で収集された試料と比較した血漿中のＨＣｏＶ－ＮＬ６３に特異的な免疫グロブリンのレベルの増加は、該対象が、上記試料が収集された時点においてＨＣｏＶ－ＮＬ６３に感染していた（又は最近感染した）ことを指し示す。
【0037】
免疫グロブリンレベルにおける差異が「有意」であるかどうかを当業者は容易に決定することができる。例えば、ＩｇＭレベルにおける１０％の増加は有意と考えられうるが、ＩｇＭレベル及びＩｇＡレベルの両方におけるより小さい増加（例えば、５％）は有意と考えられうる。
【0038】
少なくとも２つのＨＣｏＶに対して免疫反応性を有する時点（Ｘ）における血漿試料を有する対象は、時点（Ｘ）において又はその前に少なくとも２つのＨＣｏＶに感染していた可能性が高い。理論により縛られることを望まないが、本開示は、これらの対象の一部からのＢ細胞が、交差反応性汎コロナ抗体をコードしうることを提供する。よって、該方法は、上記対象からのＰＢＭＣ試料を用意することを更に開示する。該ＰＢＭＣ試料は、時点（Ｘ）又はそれ以後に収集される。「時点（Ｘ）において」はまた、時点Ｘの数日前を包含することを当業者は認識する。
【0039】
当業者により理解されるように、血漿試料は、血漿を含む試料を云い、ＰＢＭＣ試料は、ＰＢＭＣを含む試料を云う。該血漿試料及び該ＰＢＭＣ試料は、同じ試料、例えば血液試料（例えば、時点（Ｘ）で収集されたもの）、でありうるが、長期貯蔵の為にこれらの２つの成分は通常は分離される。１つの実施態様において、血液試料は、時点Ｘにおいて対象から得られうる。該血液試料は、必要な場合に長い時間的期間にわたり別々に貯蔵されることができる血漿試料及びＰＢＭＣ試料を調製する為に更に処理されうる。貯蔵の為に血漿及びＰＢＭＣを処理する方法は当技術分野において周知である。
【0040】
幾つかの実施態様において、該方法は、本明細書に記載されているように対象からの血漿試料を用意すること及び免疫反応性を決定することを含む。ＰＢＭＣ試料は次に、その血漿試料が少なくとも２つのＨＣｏＶに対して免疫反応性を示した対象から得られうる。幾つかの実施態様において、該方法は、複数のヒト対象からの試料を用意することを含み、ここで、各々の対象について該試料は、時点（Ｘ）で収集された血漿試料及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料を含む試料のペアを含む。幾つかの実施態様において、該方法は、時点（Ｙ）で収集された血漿試料及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料を含む対象からの試料の少なくとも第２のペアを用意することを含み、ここで、時点（Ｙ）は時点（Ｘ）よりも少なくとも３ヶ月前又は後である。
【0041】
該方法は、メモリーＢ細胞を含有するＰＢＭＣ試料を用意することを含む。本明細書において使用される場合、「メモリーＢ細胞」は、ＣＤ２７＋／ＩｇＡ＋；ＣＤ２７＋／ＩｇＧ＋；ＣＤ２７＋／ＩｇＭ＋及びＣＤ２７＋／ＩｇＭ＋／ＩｇＤ＋メモリーＢ細胞を云い、これは更にＣＤ１９＋、ＣＤ２２＋及び／又はＣＤ２４＋でありうる。
【0042】
幾つかの実施態様において、該メモリーＢ細胞は、他のＰＢＭＣから単離又は濃縮されうる。メモリーＢ細胞の特徴の他に、そのような細胞を単離又は濃縮する方法は当技術分野において知られている。例えば、メモリーＢ細胞は、抗ＣＤ２７マイクロビーズを使用して陽性細胞選別により濃縮されることができる。
【0043】
該方法は、該メモリーＢ細胞によりコードされる抗体を、異なるコロナウイルスからのＳ２エクトドメインの少なくとも部分への結合についてスクリーニングすることを更に含む。一部の場合において、全てのメモリーＢ細胞からの抗体がスクリーニングされうるが、本開示は、該Ｂ細胞の画分のみを使用することを包含する。幾つかの実施態様において、幾つかの異なるコロナウイルスからのＳタンパク質全体又はＳ２エクトドメインが、該抗体をスクリーニングする為に使用される。幾つかの実施態様において、ＵＨ、ＦＰ、ＨＲ１、中心ヘリックス、ベータ－ヘアピン、及びＨＲ２ドメインから選択されるドメインに対応するペプチドが、抗体結合性についてスクリーニングする為に使用される。幾つかの実施態様において、ペプチドは、ＦＰ、ＨＲ１又はＨＲ２ドメインから選択されるドメインに対応する。該ペプチドは、上記されているドメイン全体に対応する必要はないが、該ドメインの少なくとも部分を含有するペプチドも包含する。幾つかの実施態様において、該ペプチドは、１０～２００個のアミノ酸、好ましくは１２～５０個のアミノ酸、である。幾つかの実施態様において、該Ｓ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する抗体又はその抗原結合性断片をスクリーニングする該ステップは、結合アッセイを行って、該Ｓ２エクトドメインの少なくとも部分に結合する抗体を同定することを云う。
【0044】
幾つかの実施態様において、抗体は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスへの結合についてスクリーニングされ、及び好ましくは選択される。幾つかの実施態様において、抗体は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１への結合についてスクリーニングされ、及び好ましくは選択される。幾つかの実施態様において、抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２への結合についてスクリーニングされ、及び好ましくは選択される。幾つかの実施態様において、抗体は、非ヒトコロナウイルス、例えば、ブタ、ウシ、ウマ、ラクダ、ネコ、イヌ、齧歯動物、鳥、コウモリ、ウサギ、フェレット、又はミンクコロナウイルス、への結合についてスクリーニングされ、及び好ましくは選択される。好ましくは、該抗体は、５個又はより多く又は更には１０個又はより多くの異なるコロナウイルスへの結合についてスクリーニングされる。
【0045】
好ましい実施態様において、該抗体は、少なくとも１つの高病原性ＨＣｏＶ、少なくとも１つの一般的なＨＣｏＶ、及び少なくとも１つの動物ＣｏＶからのＳ２エクトドメインへの結合についてスクリーニングされる。幾つかの実施態様において、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルス；並びにブタ、ウシ、ウマ、ラクダ、ネコ、イヌ、齧歯動物、鳥、コウモリ、ウサギ、フェレット、又はミンクコロナウイルスから選択される少なくとも１つの動物コロナウイルスに結合する抗体が選択される。例えば、Fenner's Veterinary Virology，Chapter 24 - Coronaviridae 2017，pp．435-461及び配列の為にthe CoVDB (Coronavirus Database at covdb.popgenetics.net/v1/)を参照。
【0046】
本開示の例示的な実施態様において、抗体は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及び少なくとも１つの動物コロナウイルスのＳ２エクトドメインへの結合を決定する為にスクリーニングされる。好ましい抗体は、試験されるＳ２エクトドメインの全てへの結合を実証する。しかしながら、サブセットのみに結合する抗体がまた交差反応性抗体として有用であることを当業者は理解する。
【0047】
当業者に明らかなように、それぞれの抗原結合性断片がまた該スクリーニングステップにおいて使用されうる。抗体の抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片を包含する。好ましくは、抗原結合性断片は、重鎖のＣＤＲ １～３及び軽鎖のＣＤＲ １～３を含む。より好ましくは、抗原結合性断片は軽鎖及び重鎖可変領域を含む。
【0048】
例えば、幾つかの実施態様において、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ：single chain variable fragment）ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、該メモリーＢ細胞によりコードされる抗体配列（すなわち、可変鎖ドメイン）を使用して構築されうる。例えば、Kramer AR et al．The Human Antibody Repertoire Specific for Rabies Virus Glycoprotein as Selected From Immune Libraries．Eur J Immunol．2005 Jul;35(7):2131-45.）を参照。ファージディスプレイライブラリーは次に、（バイオ－）パニングを通じて抗原（Ｓタンパク質のＳ２ドメインに対応する）に結合するファージについてスクリーニングされる。
【0049】
幾つかの実施態様において、単一細胞スクリーニング（single cell screening）は、特定の標的に結合するＢ細胞を同定する為に行われうる。これは、例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成する前に、初期ステップとして使用されることができる。幾つかの実施態様において、Ｂ細胞は、コロナウイルスのパネルからのＳ２エクトドメインに結合する能力についてスクリーニングされる。陽性Ｂ細胞は次に、複数のコロナウイルスと交差反応する抗原結合性断片を同定する為にファージディスプレイライブラリーを生成する為の供給源として使用される。
【0050】
他の実施態様において、上記Ｂ細胞により産生された抗体はスクリーニングされうる。例えば、幾つかの実施態様において、Ｂ細胞は不死化され、分泌された抗体は、上記パネルに対してスクリーニングされる。Ｂ細胞は、例えば、Ｂ細胞をエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に感染させることにより、不死化されることができ、個々のクローンは増殖されることができる。ＥＢＶで不死化される細胞の不死化及びクローニングの効率は、メモリーＢ細胞上に発現されるパターン認識受容体のアゴニスト、例えば、ＴＬＲ－７、ＴＬＲ－９又はＴＬＲ－１０アゴニスト、も使用することにより改善されることができる（例えば、米国特許第９２９０７８６（Ｂ２）号明細書を参照）。
【0051】
抗原結合性を決定する為に免疫グロブリンをスクリーニングする方法は当技術分野において知られている。ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ、又は任意の他の既知のイムノアッセイが使用されうる。例えば、ペプチドは、固体表面、例えばペプチドマイクロアレイ（すなわち、ペプチドチップ）、に連結されうる。幾つかの実施態様において、Ｐｅｐｓｃａｎ分析が行われることができ、例えば、Ｓ２ドメインにわたるオーバーラップする１５－ｍｅｒ直鎖状ペプチドが免疫グロブリン結合性についてスクリーニングされる（例えば、Kramer et al．The Human Antibody Repertoire Specific for Rabies Virus Glycoprotein as Selected From Immune Libraries．Eur J Immunol．2005 Jul;35(7):2131-45を参照）。該Ｓ２ドメイン又はその部分はまた、細胞表面上に発現され、免疫グロブリン結合性についてスクリーニングする為に使用されうる。
【0052】
該Ｓ２ドメインに結合する抗体をコードするか又は発現するとして同定されたＢ細胞は、該抗体遺伝子をクローニングする為の核酸の供給源として使用されうる。
【0053】
該方法は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２エクトドメインの少なくとも部分に結合し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのＳタンパク質のＳ２ドメインに結合するところの抗体又はその抗原結合性断片を選択することを更に含む。好ましい実施態様において、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３のＨＲ１ドメイン、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３のＨＲ１ドメイン、ＨＣｏＶ－２２９ＥのＨＲ１ドメイン及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＨＲ１ドメインに結合し並びに／又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のＨＲ１ドメイン、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＨＲ１ドメイン及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨＲ１ドメインに結合するところの抗体又はその抗原結合性断片が選択される。
【0054】
該方法は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルスのウイルス融合、複製、及び／又は複製を阻害し並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスのウイルス融合を阻害する及び／又は細胞感染力を阻害するところの抗体又はその抗原結合性断片を選択することを更に含む。ウイルス融合アッセイ、感染アッセイ、及び複製アッセイは当業者に周知であり、そのような方法を行う例示的な方法は実施例において本明細書に記載されている。例えば、様々なＨＣｏＶのＳタンパク質により媒介される複数の細胞－細胞融合アッセイが開発されている（Xia S，Yan L，Xu W，et al．A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike．Sci Adv．2019;5(4)）。シュードタイプウイルス感染アッセイ、例えばLu et al．(Nat．Commun．5，3067 (2014)において記載されているもの、もまた使用されうる。ＨＣｏＶ複製を測定する為のアッセイもまた記載されている（実施例を参照）。当業者に明らかなように、完全な阻害は要求されず、当業者は、ウイルス融合、感染、又は複製を有意に阻害する抗体を同定することができる。好ましくは、抗体は少なくとも５０％の阻害をもたらす。
【0055】
幾つかの実施態様において、該方法は、ウイルス融合、感染、及び／又は複製に対する該抗体又は抗原結合性断片の効果を測定することを含む。本開示の例示的な実施態様において、抗体は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及び少なくとも１つの動物コロナウイルスを用いて融合、感染、又は複製に対する効果を決定する為にスクリーニングされる。好ましい抗体は、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及び少なくとも１つの動物コロナウイルスの融合、感染、及び／又は複製を阻害する。しかしながら、コロナウイルスのサブセットのみに対して融合、感染、及び／又は複製を阻害する抗体もまた交差反応性抗体として有用であることを当業者は理解する。
【0056】
該方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択されるＨＣｏＶ感染症のイン・ビボモデルにおいて感染症を予防する又は低減させる、該選択された抗体又はその抗原結合性断片の能力を決定することを更に含む。抗原結合性断片、例えばｓｃＦｖ、が該イン・ビボモデルにおいて使用されうる。好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡフォーマットの全長抗体が使用される。可変領域を全長フォーマット又は異なる全長フォーマットにクローニングする方法は当技術分野において知られている。例えば、Boel E et al．Functional Human Monoclonal Antibodies of All Isotypes Constructed From Phage Display Library-Derived Single-Chain Fv Antibody Fragments．J Immunol Methods．2000 May 26;239(1-2):153-66を参照。幾つかの実施態様において、特定の抗体からの該抗原結合性断片が幾つかのフォーマット、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、及びＩｇＡフォーマットにおいて、該抗体フォーマットが機能に対して効果を有するかどうかを決定する為に試験されうる。
【0057】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症のイン・ビボモデルは知られている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の好適なイン・ビボモデルは、例えば、Sia，S.F.，Yan，L.，Chin，A.W.H．et al．Pathogenesis and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters．Nature (2020)、に記載されている。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染症の好適なイン・ビボモデルは、例えば、Kim J et al．Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus Infection Into Established hDPP4-Transgenic Mice Accelerates Lung Damage Via Activation of the Pro-Inflammatory Response and Pulmonary Fibrosis．J Microbiol Biotechnol．2020 Mar 28;30(3):427-438、に記載されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染症の好適なイン・ビボモデルは、例えば、Roberts et al．Virus Research 2008 133:20-32、に記載されている。
【0058】
イン・ビボでの感染症の予防又は低減は、感染症に対する抵抗性の増加又は感染症と戦う能力の改善を包含する（例えば、感染症は、症状が現れる前に解消されうるか、又は経験される症状はより軽症である）。死亡率、体重損失、及び肺病理学は、イン・ビボで感染症を予防する又は低減させる能力の指標として使用されうる。
【0059】
１つの態様において、本開示は、コロナウイルス交差反応性抗体を提供する。該抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの、ＨＣｏＶに結合する。該抗体はまた、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つのＨＣｏＶに結合する。好ましくは、該抗体はまた、少なくとも１以上の動物コロナウイルス、例えばブタ、ウシ、ウマ、ラクダ、ネコ、イヌ、齧歯動物、鳥、コウモリ、ウサギ、フェレット、又はミンクコロナウイルス、に結合する。好ましくは、該抗体はＳタンパク質のＳ２ドメインに結合する。好ましくは、該抗体は、Ｓタンパク質の融合ペプチド、ＨＲ１、又はＨＲ２に結合する。幾つかの実施態様において、該抗体は、本明細書に開示されている方法に従って同定される。
【0060】
本明細書において同定される抗体は、コロナウイルスに対する個体における免疫を増加させる為に有用である。語「免疫を増加させる」は、特定の抗原（例えば、コロナウイルス）に対する個体の免疫応答を増加させることを云う。増加された免疫は、感染症に対する抵抗性の増加に繋がることができるか、又は感染症と戦う、個体の能力を改善しうる（例えば、感染症は、症状が現れる前に解消されうるか、又は経験される症状はより軽症である）。増加された免疫は完全な免疫を要求せず、部分的な免疫を包含する。当業者に明らかなように、本明細書に開示されている方法及び組成物は、コロナウイルス感染症を予防するか若しくは低減させるため及び／又はコロナウイルス感染症の重症度を低減させる為に使用されうる。上記方法及び組成物はまた、コロナウイルス感染症と関連付けられる症状の重症度を予防する又は低減させる為に使用されうる。特に、増加された免疫は、例えば抗体の投与による、受動免疫を云う。
【0061】
幾つかの実施態様において、増加された免疫は、滅菌免疫（sterilizing immunity）を提供することを云う。感染を可能にするが該感染を排除するのに有効である免疫とは対照的に、滅菌免疫は強力なウイルス感染を防止する。幾つかの実施態様において、本明細書に開示されている組成物は滅菌免疫を提供する。幾つかの実施態様において、本明細書に開示されている抗体を含む組成物は、少なくとも１日、好ましくは少なくとも１週間、にわたり滅菌免疫を提供する。幾つかの実施態様において、本明細書に開示されている抗体を含む組成物は、１～２週間にわたり滅菌免疫を提供する。
【0062】
本開示は、コロナウイルスに対する免疫を増加させる為の方法及び組成物を提供する。好ましくは、該個体はヒトであり、及び該コロナウイルスはヒトコロナウイルス、すなわち、ヒトに感染する能力を有するウイルス、である。好ましくは、該コロナウイルスは、高病原性ウイルス、又は感染した患者において重度の症状に繋がることができるウイルスである。幾つかの実施態様において、高病原性ウイルスは、本明細書において使用される場合、１％以上の致死率を有するウイルスを云う。例示的な高病原性コロナウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（約３４％の致死率）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１（約９．５％の致死率）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（約２％の致死率）を包含する（Petrosillo et al．Clinical Microbiology and Infection Volume 26，Issue 6，June 2020，Pages 729-734）。病原性はまた、症状の重症度に基づいて定義されることができる。例えば、幾つかの実施態様において、高病原性コロナウイルスは、本明細書において使用される場合、感染した個体の少なくとも１０％において急性呼吸窮迫症候群を引き起こすウイルスを云い、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶを包含する（Petrosillo et al．2020）。好ましい実施態様において、該コロナウイルスはアルファ－又はベータ－コロナウイルスである。
【0063】
幾つかの実施態様において、本開示は、本明細書に開示されている抗体をコードする核酸分子を提供する。本開示の更なる観点は、本明細書に開示されている核酸分子を含むベクター及び発現ベクターを提供する。本開示において有用な発現ベクターは、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、及びバキュロウイルスを包含する。該発現ベクターは、調節エレメント、例えばプロモーター、の制御下の又はそれに作動可能に連結した、本明細書に開示されている核酸配列又はその断片を含みうる。プロモーターとも称されるＤＮＡのセグメントは、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写の調節の原因となる。該発現ベクターは、例えば、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は他の真核細胞において、遺伝子の発現の為に好適な１以上のプロモーターを含みうる。
【0064】
本明細書に記載されている抗体を含む組成物は、医薬的に許容される担体、希釈剤及び／又はアジュバントと共に製剤化されることができる。医薬的に許容される担体又は希釈剤の例は、脱イオン又は蒸留水；食塩水溶液；植物油、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール等を包含する。
【0065】
好ましくは、本明細書に開示されている抗体は、局所的に、又は非全身的に投与される。局所投与は、皮膚、目、及び粘膜への投与を包含する。好ましい実施態様において、該組成物は、粘膜、例えば気管支、食道、鼻、及び口腔粘膜、並びに舌に施与される。好ましくは、該組成物は鼻吸入により提供される。該組成物はまた、クリーム又はローションとして鼻に提供されうる。該組成物はまた、口により吸引されうるか、又は口の粘膜に、例えばマウスウォッシュとして、施与されうる。幾つかの実施態様において、該組成物は、非経口的に投与されない（例えば、静脈内（ＩＶ：intravenous）、筋肉内（ＩＭ：intramuscular）、皮下（ＳＣ：subcutaneous）又は皮内（ＩＤ：intradermal）投与によるものではない）。
【0066】
該組成物は、高病原性コロナウイルスとの潜在的な遭遇の前に予防的に又は「必要に応じて」投与されうる。例えば、該組成物は１日１回投与されうる。該組成物の投与は、個体が、曝露のリスクなしに家に留まる日にはスキップされうる。
【0067】
本明細書において使用される場合、「含む」及びその活用形は、その非限定的な意味において使用され、該語に先行する項目が含まれるが、特に言及されない項目は除外されないことを意味する。追加的に、動詞「からなる」は、本明細書において定義されている化合物又は補助化合物が、特に同定されるもの以外の、発明の独特の特徴を変更しない１以上の追加の成分を含みうることを意味する「から本質的になる」により置き換えられうる。
【0068】
冠詞「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、該冠詞の文法的な目的語の１つ又は１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を云う為に本明細書において使用される。例として、「要素」（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）は、１つの要素又は１つより多くの要素を意味する。
【0069】
語「おおよそ」又は「約」は、数値との関連において使用される場合（おおよそ１０、約１０）、好ましくは、該値が、１０の該所与の値に該値の１％を足すか又は引いたものでありうることを意味する。
【0070】
本明細書において使用される場合、語「処置」、「処置する」（ｔｒｅａｔ）、及び「処置している」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）は、本明細書に記載されている疾患若しくは障害、又はその１以上の症状を逆転させるか、軽減するか、その開始を遅延させるか、又はその進行を阻害することを云う。幾つかの実施態様において、処置は、１以上の症状が発現した後に投与されうる。他の実施態様において、処置は、症状の非存在下で投与されうる。例えば、処置は、症状の開始の前に感受性の個体に投与されうる。処置はまた、症状が解消した後に、例えばそれらの再発を予防するか又は遅延させる為に、継続されうる。本明細書において使用される場合、語「予防する」は、例えば、感染症の、絶対的な予防を要求しないが、感染症のリスク又は可能性を低減させうる。
【0071】
本明細書において参照される全ての特許及び参照文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0072】
［実施例］
本発明は、以下の実施例において更に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定せず、本発明を実行する１つの可能な仕方を明確化する為に役立つものに過ぎない。他の方法が使用されうることを当業者は認識する。
本発明は、以下の実施例において更に説明される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定せず、本発明を実行する１つの可能な仕方を明確化する為に役立つものに過ぎない。他の方法が使用されうることを当業者は認識する。
【0073】
実施例１
血漿及びＰＢＭＣ試料は、以下のように数人のヒト対象から得られる。
血漿及びＰＢＭＣ試料は、以下のように数人のヒト対象から得られる。
【0074】
各々のドナーから、１０ｍｌの血液が、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを補充されたＶａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ（１０ｍｌ）に収集される。収集後８時間以内に血漿及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、生産者の指示書に従ってＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心分離を使用することにより単離される。血漿が採取され、１ミリリットルＮａｌｇｅｎｅクライオチューブ（cryotubes）（Ｎａｌｇｅｎｅ）に移される。
【0075】
ＰＢＭＮＣを含有するバフィコートが採取され、冷（＋４℃）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で３～５回洗浄されて、該バフィコート中に存在する栓球が除去される。最後の洗浄ステップ後に、ＰＢＭＮＣを含有する細胞ペレットが、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４０％の熱不活性化されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ：fetal calf serum）、及び５×１０６細胞／ｍｌの濃度の５０％のＲＰＭＩ １６４０培養培地を含有する冷凍結培地で希釈される。凍結培地は、連続的な混合下において滴下で細胞懸濁物に加えられた。該細胞懸濁物は１ミリリットルＮａｌｇｅｎｅクライオチューブに移される。
【0076】
血漿又はＰＢＭＮＣ細胞懸濁物を含有するクライオチューブは、Ｍｒ．Ｆｒｏｓｔｙ凍結容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）に入れられ、－８０℃で一晩保たれた後に、長期貯蔵の為に液体窒素に移される。
【0077】
実施例２
血漿試料は、以下の方法の１以上を使用してＨＣｏＶに対する免疫反応性について試験される。
血漿試料は、以下の方法の１以上を使用してＨＣｏＶに対する免疫反応性について試験される。
【0078】
１．ＥＬＩＳＡ試験
ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳ、Ｎ及び／又はＮ（ＮＣｔ）タンパク質のｃ末端に対する抗体レベルがＥＬＩＳＡにより決定される。今までに、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の該Ｓ、Ｎ及びＮＣｔ配列は、以前（Dijkman R，Jebbink MF，El Idrissi NB，Pyrc K，Muller MA，Kuijpers TW，et al．Human coronavirus NL63 and 229 E seroconversion in children．J Clin Microbiol 2008;46(July (7)):2368－73；Dijkman R，Jebbink MF，Gaunt E，et al．The dominance of human coronavirus OC43 and NL63 infections in infants．J Clin Virol．2012;53(2):135-139）に記載されたように、クローニング、発現及び精製される。ＥＬＩＳＡは、以前（Edridge et al.，Coronavirus protective immunity is short-lasting，medRxiv 2020.05.11.20086439）に記載されたように行われる。簡潔に述べれば、９６ハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ）が、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈された３μｇ／ｍＬのタンパク質で４℃において一晩被覆される。非特異的結合部位が、５％のスキムミルク（Ｆｌｕｋａ）を補充されたリン酸緩衝食塩水－０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を用い、室温で１時間穏やかに振盪して、遮断される。血清試料が、１％のスキムミルクを含有するＰＢＳＴに１：２００で希釈され、室温で２時間穏やかに振盪して、該プレート中でインキュベーションされる。洗浄後に、１％スキムミルク－ＰＢＳＴに希釈（１：１５００）されたアルカリホスファターゼをコンジュゲートされた抗ヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃγ－テイル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）が加えられる。室温でインキュベーションを１時間穏やかに振盪した後に、該プレートは洗浄され、室温において暗所中で１時間穏やかに振盪して、Ｌｕｍｉ－Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を用いてシグナルが発生される。測定は、Ｇｌｏｍａｘ ９６ ｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われる。全ての血清は２連又は３連で試験され、照明時間における差異を矯正する為に正規化される。各々の正規化された観察について、標準偏差が技術的複製の間で算出される（２連／３連のＥＬＩＳＡが、同じ血清試料の新たに作製された希釈液において行われる）。
ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳ、Ｎ及び／又はＮ（ＮＣｔ）タンパク質のｃ末端に対する抗体レベルがＥＬＩＳＡにより決定される。今までに、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の該Ｓ、Ｎ及びＮＣｔ配列は、以前（Dijkman R，Jebbink MF，El Idrissi NB，Pyrc K，Muller MA，Kuijpers TW，et al．Human coronavirus NL63 and 229 E seroconversion in children．J Clin Microbiol 2008;46(July (7)):2368－73；Dijkman R，Jebbink MF，Gaunt E，et al．The dominance of human coronavirus OC43 and NL63 infections in infants．J Clin Virol．2012;53(2):135-139）に記載されたように、クローニング、発現及び精製される。ＥＬＩＳＡは、以前（Edridge et al.，Coronavirus protective immunity is short-lasting，medRxiv 2020.05.11.20086439）に記載されたように行われる。簡潔に述べれば、９６ハーフエリアマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－ｏｎｅ）が、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に希釈された３μｇ／ｍＬのタンパク質で４℃において一晩被覆される。非特異的結合部位が、５％のスキムミルク（Ｆｌｕｋａ）を補充されたリン酸緩衝食塩水－０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ＰＢＳＴ）を用い、室温で１時間穏やかに振盪して、遮断される。血清試料が、１％のスキムミルクを含有するＰＢＳＴに１：２００で希釈され、室温で２時間穏やかに振盪して、該プレート中でインキュベーションされる。洗浄後に、１％スキムミルク－ＰＢＳＴに希釈（１：１５００）されたアルカリホスファターゼをコンジュゲートされた抗ヒト免疫グロブリンＧ Ｆｃγ－テイル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）が加えられる。室温でインキュベーションを１時間穏やかに振盪した後に、該プレートは洗浄され、室温において暗所中で１時間穏やかに振盪して、Ｌｕｍｉ－Ｐｈｏｓ Ｐｌｕｓ（Ｌｕｍｉｇｅｎ）を用いてシグナルが発生される。測定は、Ｇｌｏｍａｘ ９６ ｐｌａｔｅ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行われる。全ての血清は２連又は３連で試験され、照明時間における差異を矯正する為に正規化される。各々の正規化された観察について、標準偏差が技術的複製の間で算出される（２連／３連のＥＬＩＳＡが、同じ血清試料の新たに作製された希釈液において行われる）。
【0079】
２．Ｐｅｐｓｃａｎ分析
ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳタンパク質配列からの、１４残基オーバーラップする１５－ｍｅｒペプチドが、Ｐｅｐｓｃａｎハイドロゲルの固体支持体上のＦｍｏｃ連結により合成される（Langedijk JPM，Zekveld MJ，Ruiter M，Corti D，Back JW．Helical peptide arrays for lead identification and interaction site mapping．Anal．Biochem．2011；417:149-155．[PubMed：21708118]）。ペプチドライブラリーが、１：１０００の希釈において、熱不活化されたヒト血清でプロービングされる。大規模な洗浄後に、ヤギ抗ヒトＨＲＰをコンジュゲートされた二次抗体が加えられ、続いて２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）を使用する顕色が行われる。電荷結合デバイスカメラが、４０５ｎｍにおける吸光度を定量化する為に使用される。あらゆる個々のＰｅｐｓｃａｎデータセットについて、データは、全体的な分析に由来する平均シグナル強度に対して正規化される。
ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１のＳタンパク質配列からの、１４残基オーバーラップする１５－ｍｅｒペプチドが、Ｐｅｐｓｃａｎハイドロゲルの固体支持体上のＦｍｏｃ連結により合成される（Langedijk JPM，Zekveld MJ，Ruiter M，Corti D，Back JW．Helical peptide arrays for lead identification and interaction site mapping．Anal．Biochem．2011；417:149-155．[PubMed：21708118]）。ペプチドライブラリーが、１：１０００の希釈において、熱不活化されたヒト血清でプロービングされる。大規模な洗浄後に、ヤギ抗ヒトＨＲＰをコンジュゲートされた二次抗体が加えられ、続いて２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）を使用する顕色が行われる。電荷結合デバイスカメラが、４０５ｎｍにおける吸光度を定量化する為に使用される。あらゆる個々のＰｅｐｓｃａｎデータセットについて、データは、全体的な分析に由来する平均シグナル強度に対して正規化される。
【0080】
３．ＨＣｏＶを使用するＡＢ力価の試験
ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に対する抗体力価が、一部の修飾と共に、以前に記載された免疫蛍光試験により決定された（Chan KH et al．Serological Responses in Patients With Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Infection and Cross-Reactivity With Human Coronaviruses 229E，OC43，and NL63．Clin Diagn Lab Immunol．2005 Nov;12(11):1317-21.）。
ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に対する抗体力価が、一部の修飾と共に、以前に記載された免疫蛍光試験により決定された（Chan KH et al．Serological Responses in Patients With Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Infection and Cross-Reactivity With Human Coronaviruses 229E，OC43，and NL63．Clin Diagn Lab Immunol．2005 Nov;12(11):1317-21.）。
【0081】
簡潔に述べれば、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１に感染されたＨＣＴ－８、ＨＣｏＶ－２２９に感染されたＭＲＣ－５細胞、並びにＨＣｏＶ－ＮＬ６３に感染されたＬＬＣＭＫ２細胞のスメアが研究の為に使用された。細胞の６０％～７０％がウイルス抗原発現の証拠を有するときに、該細胞は、冷却されたアセトン中２０℃で１０分間固定され、使用まで８０℃で貯蔵される。抗体検出が、上記の論文に記載されたように間接免疫蛍光を使用して行われる。最低２つのＨＣｏＶに対して免疫反応性を実証する血漿試料が選択される。
【0082】
血漿試料が、最低２つのＨＣｏＶからのＳタンパク質、Ｓ２ドメイン、又はＮタンパク質ドメインに対して免疫反応性を実証するドナーが選択される。
【0083】
実施例３
血漿試料が、実施例２において決定されるように、最低２つのＨＣｏＶからのＳ又はＮタンパク質に対して免疫反応性を実証するドナーからのＰＭＢＣ試料が、標準的なファージ－ディスプレイ、Ｂ細胞不死化又は単一Ｂ細胞選別アプローチ、例えば以下に記載されているもの、を使用する抗体の単離の為のメモリーＢ細胞の供給源として使用される。
血漿試料が、実施例２において決定されるように、最低２つのＨＣｏＶからのＳ又はＮタンパク質に対して免疫反応性を実証するドナーからのＰＭＢＣ試料が、標準的なファージ－ディスプレイ、Ｂ細胞不死化又は単一Ｂ細胞選別アプローチ、例えば以下に記載されているもの、を使用する抗体の単離の為のメモリーＢ細胞の供給源として使用される。
【0084】
メモリーＢ細胞の選択
Ｂ細胞はＰＢＭＣ試料から濃縮される。以前（Throsby M et al．Heterosubtypic Neutralizing Monoclonal Antibodies Cross-Protective Against H5N1 and H1N1 Recovered From Human IgM+ Memory B Cells．PLoS One．2008;3(12):e3942，Ellebedy AH et al．Defining antigen-specific plasmablast and memory B cell subsets in blood following viral infection and vaccination of humans．Nat Immunol．2016;17(10):1226-1234，Wrammert J et al．Rapid and Massive Virus-Specific Plasmablast Responses During Acute Dengue Virus Infection in Humans．J Virol．2012 Mar;86(6):2911-8，Pascual G et al．Immunological Memory to Hyperphosphorylated Tau in Asymptomatic Individuals．Acta Neuropathol 2017 May;133(5):767-783)に記載されたように、メモリーＢ細胞は、特異的な蛍光をコンジュゲートされた抗体を用いて標識され、フローサイトメーターを用いて選別される。選別された細胞は細胞画分又は単一細胞として収集される。
Ｂ細胞はＰＢＭＣ試料から濃縮される。以前（Throsby M et al．Heterosubtypic Neutralizing Monoclonal Antibodies Cross-Protective Against H5N1 and H1N1 Recovered From Human IgM+ Memory B Cells．PLoS One．2008;3(12):e3942，Ellebedy AH et al．Defining antigen-specific plasmablast and memory B cell subsets in blood following viral infection and vaccination of humans．Nat Immunol．2016;17(10):1226-1234，Wrammert J et al．Rapid and Massive Virus-Specific Plasmablast Responses During Acute Dengue Virus Infection in Humans．J Virol．2012 Mar;86(6):2911-8，Pascual G et al．Immunological Memory to Hyperphosphorylated Tau in Asymptomatic Individuals．Acta Neuropathol 2017 May;133(5):767-783)に記載されたように、メモリーＢ細胞は、特異的な蛍光をコンジュゲートされた抗体を用いて標識され、フローサイトメーターを用いて選別される。選別された細胞は細胞画分又は単一細胞として収集される。
【0085】
実施例３Ａ
一部の実験において、該Ｂ細胞は、以下のようにファージディスプレイ抗体ライブラリーの構築の為に使用される。単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーは、以前（Kramer AR et al．The Human Antibody Repertoire Specific for Rabies Virus Glycoprotein as Selected From Immune Libraries．Eur J Immunol．2005 Jul;35(7):2131-45.）に記載されたように構築される。簡潔に述べれば、ファージライブラリーは、メモリーＢ細胞から単離された抗体遺伝子を使用して構築される。該ライブラリーの品質は、コロニーＰＣＲを使用することにより無作為に選ばれたクローンを分析することにより検証される。
一部の実験において、該Ｂ細胞は、以下のようにファージディスプレイ抗体ライブラリーの構築の為に使用される。単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）ファージディスプレイライブラリーは、以前（Kramer AR et al．The Human Antibody Repertoire Specific for Rabies Virus Glycoprotein as Selected From Immune Libraries．Eur J Immunol．2005 Jul;35(7):2131-45.）に記載されたように構築される。簡潔に述べれば、ファージライブラリーは、メモリーＢ細胞から単離された抗体遺伝子を使用して構築される。該ライブラリーの品質は、コロニーＰＣＲを使用することにより無作為に選ばれたクローンを分析することにより検証される。
【0086】
Ｓ２ドメイン特異的ｓｃＦｖファージのファージディスプレイ選択は、本質的に以前（Kramer AR et al．The Human Antibody Repertoire Specific for Rabies Virus Glycoprotein as Selected From Immune Libraries．Eur J Immunol．2005 Jul;35(7):2131-45.）に記載されたように行われるが、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の他に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２ドメイン（特にＵＨ、ＦＰ、ＨＲ１、中心ヘリックス、ベータ－ヘアピン、及びＨＲ２領域）にわたるオーバーラップするペプチドのパネルを使用する。代替的には、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１の他に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの細胞表面に発現されたか又は精製されたスパイクタンパク質が使用されうる。
【0087】
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスからの１以上のペプチド（又は表面に発現されたか若しくは精製されたＳタンパク質）への結合を実証するクローンが選択される。
【0088】
実施例３Ｂ
一部の実験において、該Ｂ細胞は、モノクローナル抗体の製造の為のＢ細胞不死化の為に使用される。モノクローナル抗体産生性の不死化されたＢ細胞クローンは、以前（Lanzavecchia A et al．Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells．Curr Opin Biotechnol．2007;18(6):523-528.）に記載されたように生成される。
一部の実験において、該Ｂ細胞は、モノクローナル抗体の製造の為のＢ細胞不死化の為に使用される。モノクローナル抗体産生性の不死化されたＢ細胞クローンは、以前（Lanzavecchia A et al．Human monoclonal antibodies by immortalization of memory B cells．Curr Opin Biotechnol．2007;18(6):523-528.）に記載されたように生成される。
【0089】
メモリーＢ細胞を使用する場合、該細胞は最初に、形質細胞を生成するように誘導されなければならない。形質細胞は、以前（Maiga RI et al．Human CD38hiCD138+ Plasma Cells Can Be Generated in Vitro From CD40-activated Switched-Memory B Lymphocytes．J Immunol Res．2014;2014:635108）に記載されたようにメモリーＢ細胞からイン・ビトロで生成される。簡潔に述べれば、選別されたメモリーＢ細胞が拡大増殖され、その後にＣＤ１５４＋及びＣＤ７０＋接着細胞上で培養され、これはＣＤ３８ｈｉＣＤ１３８＋形質細胞を生成する。
【0090】
培養上清は、上記されている複数のコロナウイルスからのＳ２ドメインにわたるペプチド及び／又は表面に発現されたか若しくは精製されたＳタンパク質への結合について試験される。ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスからの１以上のペプチド又はＳタンパク質に結合する抗体を産生するＢ細胞が選択される。
【0091】
実施例３Ｃ
一部の実験において、イン・ビトロでＳ２ドメインに結合するメモリーＢ細胞が選択される。ウイルスペプチドに結合するメモリーＢ細胞は、本質的に以前（Pascual G et al．Acta Neuropathol．2017；133(5)：767-783．Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals）に記載されたように選択される。
一部の実験において、イン・ビトロでＳ２ドメインに結合するメモリーＢ細胞が選択される。ウイルスペプチドに結合するメモリーＢ細胞は、本質的に以前（Pascual G et al．Acta Neuropathol．2017；133(5)：767-783．Immunological memory to hyperphosphorylated tau in asymptomatic individuals）に記載されたように選択される。
【0092】
簡潔に述べれば、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質からのＨＲ１、ＨＲ２及び／又はＦＰドメインペプチド配列が調製され、ビオチン化され、蛍光色素にコンジュゲートされる。ＣＤ２２＋ ＰＢＭＮＣ細胞は、蛍光をコンジュゲートされた抗体ＩｇＧ－ＦＩＴＣ、ＣＤ１９－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５で標識され、該ビオチン化された蛍光ウイルスペプチドとインキュベーションされる。該蛍光ウイルスペプチドに結合するメモリーＢ細胞表現型を有する細胞は、フローサイトメーターを用いて単一細胞として選別される。
【0093】
選択されたものは、実施例４に記載されているように全長抗体を生成する為に使用される。そのような抗体は次に、幾つかのコロナウイルスからのＳ２エクトドメインへの結合について更に試験されうる。
【0094】
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスからのペプチドに結合する細胞が選択される。
【0095】
実施例４
選択されたファージ（実施例３Ａ）又はメモリーＢ細胞（実施例３Ｂ及びＣ）からＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ抗体が生成される。
選択されたファージ（実施例３Ａ）又はメモリーＢ細胞（実施例３Ｂ及びＣ）からＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ抗体が生成される。
【0096】
選択されたファージからのヒトＩｇＧ、ＩｇＭ又はＩｇＡモノクローナル抗体の製造は、以前（Boel E et al．Functional Human Monoclonal Antibodies of All Isotypes Constructed From Phage Display Library-Derived Single-Chain Fv Antibody Fragments．J Immunol Methods．2000 May 26;239(1-2):153-66.）に記載されたように行われる。
【0097】
簡潔に述べれば、ベクターは、ヒトＩｇＧ１～４、ＩｇＡ１～２、及び／又はＩｇＭモノクローナル抗体の製造の為に構築される。選択されたファージのｓｃＦｖ断片をコードするＶＨ ３ Ｈ鎖及びＶλ３ Ｌ鎖の遺伝子は、該異なるＩｇサブクラスのモノクローナル抗体を生成する為に該異なる発現ベクターにクローニングされる。安定的にトランスフェクションされた細胞株は、ｆｕｒ－ＢＨＫ２１細胞におけるＨ及びＬ鎖構築物の共トランスフェクションにより確立される。培養上清は採取され、全てのサブクラスは、プロテインＡカラムを使用することにより精製される。
【0098】
ＩｇＧ１～４、ＩｇＡ１～２、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体は、選択されたメモリーＢ細胞から以前（Apetri A et al．A Common Antigenic Motif Recognized by Naturally Occurring Human V H 5-51/V L 4-1 Anti-Tau Antibodies With Distinct Functionalities．Acta Neuropathol Commun．2018 May 31;6(1):43）に記載されたように本質的に生成される。
【0099】
簡潔に述べれば、重鎖及び軽鎖（ＨＣ／ＬＣ：heavy and light chain）抗体可変領域は、リーダー特異的及びフレームワーク特異的プライマーのプールを使用して単一細胞選別されたメモリーＢ細胞から２ステップＰＣＲアプローチを使用して回収される。重鎖及び軽鎖ＰＣＲ断片（３８０～４００ｋｂ）は、オーバーラップ伸長ＰＣＲを介して連結され、その後に二重ＣＭＶベースのヒトＩｇＧ１～４、ＩｇＡ１～２、ＩｇＭ又はＩｇＥ哺乳動物発現ベクターにクローニングされる。クローニングされた抗スパイクタンパク質ヒトモノクローナル抗体は、ヒト胚性腎臓２９３に由来するＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に一過的にトランスフェクションされ、トランスフェクションの７２時間後に、細胞培地は採取され、１２００ＲＰＭで７分間遠心分離される。免疫グロブリンは、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー法により該培養培地から精製される。
【0100】
該モノクローナル抗体は、幾つかのコロナウイルス、例えばＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、からのＳタンパク質、Ｓ２エクトドメイン又は特有のペプチドへの結合について試験されうる。
【0101】
実施例５
該モノクローナル抗体のイン・ビトロ機能性は、以下の方法の１以上を使用して評価されうる。
該モノクローナル抗体のイン・ビトロ機能性は、以下の方法の１以上を使用して評価されうる。
【0102】
１．細胞融合阻害
様々なＨＣｏＶのＳタンパク質により媒介される複数の細胞－細胞融合アッセイが開発されている（Xia S，Yan L，Xu W，et al．A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike．Sci Adv．2019;5(4)）。特に：（１）ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓに媒介される細胞融合；（２）２２９Ｅ Ｓに媒介される細胞融合；（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＬ－ＣｏＶ Ｓに媒介される細胞－細胞融合；並びに（４）ＯＣ４３又はＮＬ６３ Ｓに媒介される細胞－細胞融合。該異なるＳタンパク質により媒介される融合に対する該モノクローナル抗体の阻害効力を評価する為に、エフェクター細胞（２９３ Ｔ／Ｓ／ＧＦＰ）及び標的細胞（Ｈｕｈ－７細胞）が、融合の為に指し示される濃度において試験ｍＡｂの存在又は非存在下において共培養される。融合した及び融合していない細胞をカウントした後に、細胞－細胞融合のパーセンテージが算出される。今までに、各々のウェル中の５つの視野が、該融合した及び融合していない細胞をカウントする為に無作為に選択される。該融合した細胞は、該融合していない細胞の少なくとも２倍の大きさであり、該融合した細胞における蛍光強度は、１つのエフェクター細胞から標的細胞への強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ：enhanced green fluorescent protein）の拡散の結果として弱くなる。細胞－細胞融合のパーセンテージ［（該融合した細胞の数／該融合した及び融合していない細胞の数）×１００％］が次に算出される。細胞－細胞融合の阻害パーセントは、以下の式：［１－（Ｅ－Ｎ）／（Ｐ－Ｎ）］×１００％を使用して算出される。ここで、「Ｅ」は、実験群における細胞－細胞融合のパーセンテージを表す。「Ｐ」は、２９３ Ｔ／ＨＣｏＶ Ｓ／ＥＧＦＰ細胞がエフェクター細胞として使用され、そこにＰＢＳのみが加えられた陽性対照群における細胞－細胞融合のパーセンテージを表す。「Ｎ」は、２９３ Ｔ／ＥＧＦＰ細胞がエフェクター細胞として使用される陰性対照群における細胞－細胞融合のパーセンテージである。
様々なＨＣｏＶのＳタンパク質により媒介される複数の細胞－細胞融合アッセイが開発されている（Xia S，Yan L，Xu W，et al．A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike．Sci Adv．2019;5(4)）。特に：（１）ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓに媒介される細胞融合；（２）２２９Ｅ Ｓに媒介される細胞融合；（３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＬ－ＣｏＶ Ｓに媒介される細胞－細胞融合；並びに（４）ＯＣ４３又はＮＬ６３ Ｓに媒介される細胞－細胞融合。該異なるＳタンパク質により媒介される融合に対する該モノクローナル抗体の阻害効力を評価する為に、エフェクター細胞（２９３ Ｔ／Ｓ／ＧＦＰ）及び標的細胞（Ｈｕｈ－７細胞）が、融合の為に指し示される濃度において試験ｍＡｂの存在又は非存在下において共培養される。融合した及び融合していない細胞をカウントした後に、細胞－細胞融合のパーセンテージが算出される。今までに、各々のウェル中の５つの視野が、該融合した及び融合していない細胞をカウントする為に無作為に選択される。該融合した細胞は、該融合していない細胞の少なくとも２倍の大きさであり、該融合した細胞における蛍光強度は、１つのエフェクター細胞から標的細胞への強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ：enhanced green fluorescent protein）の拡散の結果として弱くなる。細胞－細胞融合のパーセンテージ［（該融合した細胞の数／該融合した及び融合していない細胞の数）×１００％］が次に算出される。細胞－細胞融合の阻害パーセントは、以下の式：［１－（Ｅ－Ｎ）／（Ｐ－Ｎ）］×１００％を使用して算出される。ここで、「Ｅ」は、実験群における細胞－細胞融合のパーセンテージを表す。「Ｐ」は、２９３ Ｔ／ＨＣｏＶ Ｓ／ＥＧＦＰ細胞がエフェクター細胞として使用され、そこにＰＢＳのみが加えられた陽性対照群における細胞－細胞融合のパーセンテージを表す。「Ｎ」は、２９３ Ｔ／ＥＧＦＰ細胞がエフェクター細胞として使用される陰性対照群における細胞－細胞融合のパーセンテージである。
【0103】
２．シュードタイプウイルス感染アッセイ
ＣｏＶ Ｓタンパク質又はＶＳＶ－Ｇタンパク質及びルシフェラーゼをレポーターとして発現する欠陥性ＨＩＶ－１ゲノムを有するシュードウイルスが、以前（L．Lu，Q．Liu，Y．Zhu，K.-H．Chan，L．Qin，Y．Li，Q．Wang，J．F.-W．Chan，L．Du，F．Yu，C．Ma，S．Ye，K.-Y．Yuen，R．Zhang，S．Jiang，Structure-based discovery of Middle East respiratory syndrome coronavirus fusion inhibitor．Nat．Commun．5，3067 (2014).）に記載されたように、２９３ Ｔ細胞において製造され、その力価が、ＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡを使用することにより定量化された。該シュードウイルスは次に、段階希釈された試験ｍＡｂの存在又は非存在下で標的Ｈｕｈ－７細胞（又はシュード型ＳＡＲＳ－ＣｏＶの為にＡＣＥ２／２９３ Ｔ細胞）（９６ウェルプレート中１０４個／ウェル）に感染させる為に使用される。感染の１２時間後に、培養培地は交換され、次に追加の４８時間にわたりインキュベーションされ、続いてＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞を溶解し、Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＵｌｔｒａ ３８４ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用する相対光単位の検出の為に９６－ｗｅｌｌ Ｃｏｓｔａｒ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）に該細胞溶解液を移す。
ＣｏＶ Ｓタンパク質又はＶＳＶ－Ｇタンパク質及びルシフェラーゼをレポーターとして発現する欠陥性ＨＩＶ－１ゲノムを有するシュードウイルスが、以前（L．Lu，Q．Liu，Y．Zhu，K.-H．Chan，L．Qin，Y．Li，Q．Wang，J．F.-W．Chan，L．Du，F．Yu，C．Ma，S．Ye，K.-Y．Yuen，R．Zhang，S．Jiang，Structure-based discovery of Middle East respiratory syndrome coronavirus fusion inhibitor．Nat．Commun．5，3067 (2014).）に記載されたように、２９３ Ｔ細胞において製造され、その力価が、ＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡを使用することにより定量化された。該シュードウイルスは次に、段階希釈された試験ｍＡｂの存在又は非存在下で標的Ｈｕｈ－７細胞（又はシュード型ＳＡＲＳ－ＣｏＶの為にＡＣＥ２／２９３ Ｔ細胞）（９６ウェルプレート中１０４個／ウェル）に感染させる為に使用される。感染の１２時間後に、培養培地は交換され、次に追加の４８時間にわたりインキュベーションされ、続いてＰＢＳで細胞を洗浄し、溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で細胞を溶解し、Ｆｉｒｅｆｌｙ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＵｌｔｒａ ３８４ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｔｅｃａｎ）を使用する相対光単位の検出の為に９６－ｗｅｌｌ Ｃｏｓｔａｒ ｆｌａｔ－ｂｏｔｔｏｍ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ ｐｌａｔｅｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）に該細胞溶解液を移す。
【0104】
３．生ＨＣｏＶの複製の阻害
ＨＣＴ－８細胞におけるＯＣ４３複製に対するｍＡｂの阻害活性は、他の箇所（E．Brison，H．Jacomy，M．Desforges，P．J．Talbot，Novel treatment with neuroprotective and antiviral properties against a neuroinvasive human respiratory virus．J．Virol．88，1548-1563 (2014)）に記載されたように評価される。簡潔に述べれば、１００ ＴＣＩＤ５０のＯＣ４３が抗体の段階希釈液と混合され、３７℃で３０分間インキュベーションされる。該混合物は次に、９６ウェルマイクロタイタープレート中で増殖されたＨＣＴ－８細胞の単層に３連で施与される。感染後５日目に、該培養培地中のウイルス力価が試験され、ＴＣＩＤ５０が、細胞傷害効果（ＣＰＥ）に基づいて算出された（J．Ciejka，K．Wolski，M．Nowakowska，K．Pyrc，K．Szczubialka，Biopolymeric nano/ microspheres for selective and reversible adsorption of coronaviruses．Mater．Sci．Eng．C Mater．Biol．Appl．76，735-742 (2017)）。Ａ５４９細胞における２２９Ｅ複製及びＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるＮＬ６３複製に対する該試験された抗体の阻害活性は、上記されるものと類似した仕方で評価される。
ＨＣＴ－８細胞におけるＯＣ４３複製に対するｍＡｂの阻害活性は、他の箇所（E．Brison，H．Jacomy，M．Desforges，P．J．Talbot，Novel treatment with neuroprotective and antiviral properties against a neuroinvasive human respiratory virus．J．Virol．88，1548-1563 (2014)）に記載されたように評価される。簡潔に述べれば、１００ ＴＣＩＤ５０のＯＣ４３が抗体の段階希釈液と混合され、３７℃で３０分間インキュベーションされる。該混合物は次に、９６ウェルマイクロタイタープレート中で増殖されたＨＣＴ－８細胞の単層に３連で施与される。感染後５日目に、該培養培地中のウイルス力価が試験され、ＴＣＩＤ５０が、細胞傷害効果（ＣＰＥ）に基づいて算出された（J．Ciejka，K．Wolski，M．Nowakowska，K．Pyrc，K．Szczubialka，Biopolymeric nano/ microspheres for selective and reversible adsorption of coronaviruses．Mater．Sci．Eng．C Mater．Biol．Appl．76，735-742 (2017)）。Ａ５４９細胞における２２９Ｅ複製及びＬＬＣ－ＭＫ２細胞におけるＮＬ６３複製に対する該試験された抗体の阻害活性は、上記されるものと類似した仕方で評価される。
【0105】
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製に対する抗体の阻害活性は、以前（X．Tao，F．Mei，A．Agrawal，C．J．Peters，T．G．Ksiazek，X．Cheng，C.-T．K．Tseng，Blocking of exchange proteins directly activated by cAMP leads to reduced replication of Middle East respiratory syndrome coronavirus．J．Virol．88，3902-3910 (2014)）に記載されたように、修飾された標準的なマイクロ中和試験アッセイを使用してＣａｌｕ－３細胞において試験される。簡潔に述べれば、６０μｌの段階的に２倍希釈されたｍＡｂは、９６ウェルプレートの２連のウェル中で２％のＦＢＳを補充されたＭＥＭ培地（Ｍ－２培地）中、６０μｌ（１２０ ＴＣＩＤ５０）のＭＥＲＳ－ＣｏＶと室温で約６０分間インキュベーションされる。１００マイクロリットルの該ｍＡｂ／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ混合物は次に、９６ウェルプレート中で増殖されたコンフルエントなＣａｌｕ－３細胞中に移される。ウイルスあり及びなしでＭ－２培地と培養されたＣａｌｕ－３細胞のウェルがこれらのアッセイにおいてそれぞれ陽性及び陰性対照として含められた。上清が７２時間時に採取され、感染性ウイルス力価が標準的なＶｅｒｏ Ｅ６ベースの感染力アッセイにより定量化され、該力価がｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表される。
【0106】
実施例６
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスに対して免疫応答性の実施例５からの抗体がイン・ビボ有効性研究の為に選択される。イン・ビボウイルス負荷研究は以下のように行われる。
ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ及びＨＣｏＶ－ＨＫＵ１から選択される少なくとも１つの一般的なヒトコロナウイルス並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から選択される少なくとも１つの高病原性ヒトコロナウイルスに対して免疫応答性の実施例５からの抗体がイン・ビボ有効性研究の為に選択される。イン・ビボウイルス負荷研究は以下のように行われる。
【0107】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ
モノクローナル抗体（０．１～２ｍｇ／ｋｇ）がゴールデンシリアンハムスターの鼻腔内に投与される。以前（Sia，S.F.，Yan，L.，Chin，A.W.H．et al．Pathogenesis and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters．Nature (2020)）に記載されたように、２時間後に、該ゴールデンシリアンハムスターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶで負荷される。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた動物の体重が、感染前から感染の１４日後まで測定される。イン・ビボで保護効果を提供する抗体は、処置されていない動物と比較して体重損失を予防する又は低減させる。
モノクローナル抗体（０．１～２ｍｇ／ｋｇ）がゴールデンシリアンハムスターの鼻腔内に投与される。以前（Sia，S.F.，Yan，L.，Chin，A.W.H．et al．Pathogenesis and transmission of SARS-CoV-2 in golden hamsters．Nature (2020)）に記載されたように、２時間後に、該ゴールデンシリアンハムスターは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶで負荷される。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させた動物の体重が、感染前から感染の１４日後まで測定される。イン・ビボで保護効果を提供する抗体は、処置されていない動物と比較して体重損失を予防する又は低減させる。
【0108】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶに感染させたゴールデンシリアンハムスターにおいてモノクローナル抗体の効果を決定する為に、肺病理が感染の８日後にスコア付けされる。イン・ビボで保護効果を提供する抗体は、処置されていない動物と比較して肺病理を予防する又は低減させる。
【0109】
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ
モノクローナル抗体（０．１～２ｍｇ／ｋｇ）がｈＤＰＰ４トランスジェニックマウスの鼻腔内に投与される。以前（Kim J et al．Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus Infection Into Established hDPP4-Transgenic Mice Accelerates Lung Damage Via Activation of the Pro-Inflammatory Response and Pulmonary Fibrosis．J Microbiol Biotechnol．2020 Mar 28;30(3):427-438.）に記載されたように、２時間後に該ｈＤＰＰ４トランスジェニックマウスはＭＥＲＳ－ＣｏＶで負荷される。該ＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させたマウスの体重が、感染前から感染の１４日後まで測定される。イン・ビボで保護効果を提供する抗体は、処置されていない動物と比較して体重損失を予防する又は低減させる。
モノクローナル抗体（０．１～２ｍｇ／ｋｇ）がｈＤＰＰ４トランスジェニックマウスの鼻腔内に投与される。以前（Kim J et al．Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus Infection Into Established hDPP4-Transgenic Mice Accelerates Lung Damage Via Activation of the Pro-Inflammatory Response and Pulmonary Fibrosis．J Microbiol Biotechnol．2020 Mar 28;30(3):427-438.）に記載されたように、２時間後に該ｈＤＰＰ４トランスジェニックマウスはＭＥＲＳ－ＣｏＶで負荷される。該ＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させたマウスの体重が、感染前から感染の１４日後まで測定される。イン・ビボで保護効果を提供する抗体は、処置されていない動物と比較して体重損失を予防する又は低減させる。
【0110】
実施例７
静脈血試料が、Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに住む成人ボランティア（４０～６２歳の範囲に及ぶ）から収集された。ＰＢＭＣが単離され、後の分析の為に凍結保存された。全ての参加者は、血液収集前１０日以内にコロナウイルスに感染した（可能性がある）人物と接触していないと回答し、またいずれの参加者もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の試験で以前に陽性とされていなかった。鼻スワブが収集され、他のヒトコロナウイルスの中でもＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を包含するマルチプレックス呼吸器ウイルスＰＣＲにおいて試験され、全てのボランティアは全てのウイルスについて陰性であると試験された。血清試料は、ｈＣｏＶ ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、及び２２９Ｅのスパイクタンパクに対するＩｇＧ抗体力価を評価する為に１：４，０００で希釈され、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘアッセイにおいて病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣＯＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対するＩｇＧ抗体力価を評価する為に１：２００で希釈された。先行する発見（Grobben et al．2021）に基づいて、ドナーは、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、及び２２９Ｅに対するＩｇＧについて≧１２５ＭＦＩの結果、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧについて≧２，５００ＭＦＩの結果を返す場合に、以前の１以上の感染症について陽性であると考えられた。これらのカットオフに基づいて各々のボランティアは、４つ全てのｈＣｏＶ ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、及び２２９Ｅに過去に感染したと考えられ（ドナーＩＤ番号：１００１～１０２０；表１）；全員はＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による過去の感染症について陰性であると試験され、２人を除いて全員は、過去のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症について陰性であると試験された（ドナーＩＤ番号：１００７及び１０１７は陽性であると試験され、表１に含まれていない）。
静脈血試料が、Ｌｅｉｄｅｎ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに住む成人ボランティア（４０～６２歳の範囲に及ぶ）から収集された。ＰＢＭＣが単離され、後の分析の為に凍結保存された。全ての参加者は、血液収集前１０日以内にコロナウイルスに感染した（可能性がある）人物と接触していないと回答し、またいずれの参加者もＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の試験で以前に陽性とされていなかった。鼻スワブが収集され、他のヒトコロナウイルスの中でもＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、２２９Ｅ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を包含するマルチプレックス呼吸器ウイルスＰＣＲにおいて試験され、全てのボランティアは全てのウイルスについて陰性であると試験された。血清試料は、ｈＣｏＶ ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、及び２２９Ｅのスパイクタンパクに対するＩｇＧ抗体力価を評価する為に１：４，０００で希釈され、マルチプレックスＬｕｍｉｎｅｘアッセイにおいて病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣＯＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に対するＩｇＧ抗体力価を評価する為に１：２００で希釈された。先行する発見（Grobben et al．2021）に基づいて、ドナーは、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、及び２２９Ｅに対するＩｇＧについて≧１２５ＭＦＩの結果、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するＩｇＧについて≧２，５００ＭＦＩの結果を返す場合に、以前の１以上の感染症について陽性であると考えられた。これらのカットオフに基づいて各々のボランティアは、４つ全てのｈＣｏＶ ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１、及び２２９Ｅに過去に感染したと考えられ（ドナーＩＤ番号：１００１～１０２０；表１）；全員はＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１による過去の感染症について陰性であると試験され、２人を除いて全員は、過去のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症について陰性であると試験された（ドナーＩＤ番号：１００７及び１０１７は陽性であると試験され、表１に含まれていない）。
【0111】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：Peripheral blood mononuclear cells）が、ヒトドナーから収集された静脈血試料から得られ、Ｂ細胞について濃縮された。Ｂ細胞を濃縮されたＰＢＭＣは、図１に示されているように、メモリーＢ細胞マーカー及び一般的なｈＣＯＶ ＮＬ６３スパイク（Ｓ）タンパク質への結合に基づいてＦＡＣＳにおいて単一細胞選別された。ｍＲＮＡが、ＮＬ６３ Ｓ特異的な単一選別されたＢ細胞から得られ、ｃＤＮＡに転写され、該Ｂ細胞により発現される抗体のＶ（Ｄ）Ｊ可変領域がＰＣＲにより増幅された。表１は、単一細胞選別されることができたＮＬ６３ Ｓ特異的なＢ細胞の数及び異なるドナーに由来することができた成功裏のＶＨ ＶＬペアの数を例として示す。該表はまた、該選別されたＮＬ６３－Ｓ特異的なメモリーＢ細胞及びそれに由来するＶＨ ＶＬペアのどれほど多くが選別前に該ＦＡＣＳアッセイにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに結合したかの他に、発現された抗体のアイソタイプを示す。選別Ｂ、Ｅ及びＦにおいて単一細胞選別されたＮＬ６３ ＳメモリーＢ細胞について、該組換え抗体の重鎖及び軽鎖の可変Ｖ（Ｄ）Ｊ領域が次に、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーを使用して該重鎖又は軽鎖についてのヒトＩｇＧ１の定常領域を含有する発現ベクターにクローニングされた。接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が小スケールトランスフェクションの為に使用され、上清がトランスフェクションの４８時間後に採取された。異なる方法が、該上清を分析する為に使用され、これは、一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及び病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（武漢）のスパイクタンパク質への抗体の結合を評価するＬｕｍｉｎｅｘ又はＥＬＩＳＡアッセイ、並びに一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及びＯＣ４３並びに病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２つのバリアント（ブラジル及び南アフリカバリアント）のスパイクタンパク質への抗体の結合を評価する為のＦＡＣＳ分析を含んだ（分析の為に利用可能な限られた体積に起因して、異なる選別に由来する上清は、異なる方法を試験して分析された）。結果は図２並びに表２及び表３に示され、少なくとも１つの一般的なｈＣｏＶのＳタンパク質及び病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に結合する抗体を産生した複数のクローンが同定され、一部のクローンは、安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２三量体への結合を追加的に示した。これらのクローンはその後に、懸濁ＨＥＫ２９３Ｆ細胞におけるトランスフェクション及びｍＡｂの大スケール発現の為に選択された。精製された抗体は、一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及び病原体ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質への結合についてＦＡＣＳ分析において、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２サブユニットの安定化された三量体への結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験された。結果が、図３Ａ及び図３Ｂ並びに下記の表４に示されている。
【0112】
【表1】
【0113】
ＨＥＫ２９３Ｔ培養物
ＨＥＫ２９３Ｔ培養物 上清 Ｂ／Ｅ選別
「選別Ｂ及びＥ」に由来するクローンが２９３Ｔ細胞においてトランスフェクションされ、上清が、１．一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及び病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（武漢）のスパイクタンパク質への結合についてＬｕｍｉｎｅｘアッセイにおいて、並びに２．一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及びＯＣ４３並びに病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２つのバリアント（ブラジル及び南アフリカバリアント）のスパイクタンパク質への結合についてＦＡＣＳ分析において試験された。少なくとも１つの一般的なｈＣｏＶ及び少なくとも１つの病原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのＳに結合する抗体を産生するクローンについてのデータが表２に示され、これらのクローンはその後に、２９３Ｆ細胞におけるトランスフェクションの為に選択された。
ＨＥＫ２９３Ｔ培養物 上清 Ｂ／Ｅ選別
「選別Ｂ及びＥ」に由来するクローンが２９３Ｔ細胞においてトランスフェクションされ、上清が、１．一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及び病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（武漢）のスパイクタンパク質への結合についてＬｕｍｉｎｅｘアッセイにおいて、並びに２．一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及びＯＣ４３並びに病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２つのバリアント（ブラジル及び南アフリカバリアント）のスパイクタンパク質への結合についてＦＡＣＳ分析において試験された。少なくとも１つの一般的なｈＣｏＶ及び少なくとも１つの病原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのＳに結合する抗体を産生するクローンについてのデータが表２に示され、これらのクローンはその後に、２９３Ｆ細胞におけるトランスフェクションの為に選択された。
【0114】
少なくとも１つの一般的なｈＣｏＶ（ＮＬ６３）並びに少なくとも１つの病原性ｈＣｏＶ（Ｂ１Ｃ１＆Ｂ１Ｅ３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢及びブラジルバリアント；並びにＥ１Ｂ２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２武漢及び南アフリカバリアント）のスパイクタンパク質に結合する抗体を産生する３つのクローン（Ｂ１Ｃ１、Ｂ１Ｅ３＆Ｅ１Ｂ２）。
【0115】
少なくとも２つの一般的なｈＣｏＶ（ＮＬ６３＆ＯＣ４３）及び少なくとも１つの病原性ｈＣｏＶ（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ブラジルバリアント）のスパイクタンパク質に結合する抗体を産生する２つのクローン（Ｂ１Ｂ２＆Ｂ１Ｅ８）。
【0116】
【表2】
【0117】
ＨＥＫ２９３Ｔ培養物 上清 Ｆ選別
「選別Ｆ」に由来するクローンが２９３Ｔ細胞においてトランスフェクションされ、上清が、一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及び病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（武漢）のスパイクタンパク質の他に、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（武漢）のＳ２サブユニットの安定化された三量体への結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験された。ＮＬ６３ Ｓ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに結合する抗体を産生し、その後に２９３Ｆ細胞におけるトランスフェクションの為に選択されたクローンについてのデータが示されている（図２及び下記の表３）。
「選別Ｆ」に由来するクローンが２９３Ｔ細胞においてトランスフェクションされ、上清が、一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３及び病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（武漢）のスパイクタンパク質の他に、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２（武漢）のＳ２サブユニットの安定化された三量体への結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験された。ＮＬ６３ Ｓ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓに結合する抗体を産生し、その後に２９３Ｆ細胞におけるトランスフェクションの為に選択されたクローンについてのデータが示されている（図２及び下記の表３）。
【0118】
４つのクローン（Ｆ６Ｂ２、Ｆ６Ｇ１、Ｆ６Ｆ６及びＦ６Ａ１０）は、一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３（試験された一般的なｈＣｏＶ Ｓのみ）及び病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（試験された病原性ｈＣｏＶ Ｓのみ）のＳタンパク質に結合する抗体を産生した。クローンＦ６Ｂ２及びＦ６Ｆ６はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２三量体への結合を追加的に示した。
【0119】
【表3】
【0120】
ＨＥＫ２９３Ｆ培養物
２９３Ｆ培養物 精製された抗体 Ｂ／Ｅ及びＦ選別
少なくとも１つの一般的なｈＣｏＶ及び病原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに結合する抗体を製造する為に選択されたクローンが２９３Ｆ細胞にトランスフェクションされ、抗体が培養物から精製され、１．一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３、並びにｈＣｏＶ ＯＣ４３及び２２９Ｅ（選別Ｂ／Ｅのみに由来するクローン）並びに病原体ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢）のスパイクタンパク質への結合についてＦＡＣＳ分析において、並びに２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２サブユニットの安定化された三量体への結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験された。
２９３Ｆ培養物 精製された抗体 Ｂ／Ｅ及びＦ選別
少なくとも１つの一般的なｈＣｏＶ及び病原性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳに結合する抗体を製造する為に選択されたクローンが２９３Ｆ細胞にトランスフェクションされ、抗体が培養物から精製され、１．一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３、並びにｈＣｏＶ ＯＣ４３及び２２９Ｅ（選別Ｂ／Ｅのみに由来するクローン）並びに病原体ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（武漢）のスパイクタンパク質への結合についてＦＡＣＳ分析において、並びに２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２サブユニットの安定化された三量体への結合についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験された。
【0121】
６つのクローン（Ｂ１Ｂ２、Ｂ１Ｃ１、Ｂ１Ｅ３、Ｂ１Ｅ８、Ｆ６Ｂ２＆Ｆ６Ｆ６）からの精製された抗体は、第２の一般的なｈＣｏＶ（２２９Ｅ）のスパイクタンパク質に結合するＢ／Ｅ選別からの２つのクローン並びに３つの試験された一般的なｈＣｏＶ（ＮＬ６３、２２９Ｅ、及びＯＣ４３）のスパイクタンパク質に結合するこの選別からの１つのクローン（Ｂ１Ｅ８）を含めて、一般的なｈＣｏＶ ＮＬ６３（Ｆ選別由来のクローンについて、試験された一般的なｈＣｏＶのみ）のスパイクタンパク質への結合を示し、６つ全てのクローンはまた、ＦＡＣＳにおいて病原性ｈＣｏＶ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（試験された武漢のみ）に結合した。クローンＥ１Ｂ２、Ｆ６Ａ１０、及びＦ６Ｇ１により産生された抗体は、該ＦＡＣＳ実験においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓへの良好な結合を示したが、親メモリーＢ細胞はＮＬ６３ Ｓへのそれらの結合に基づいて選別され、該２９３Ｔ培養物において産生された抗体はＮＬ６３ Ｓへの良好な結合を示したにもかかわらず、ＮＬ６３ Ｓへの低い／無結合を示した。表４及び図３Ａを参照。
【0122】
クローンＦ６Ｇ１からの２９３Ｆ培養物で精製された抗体は、ＥＬＩＳＡにおいてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ２サブユニットの安定化された三量体への結合を示し、クローンＢ１Ｃ１により産生される抗体は、より高い濃度で試験された場合にＳ２に結合することの何らかの証拠があった。図３Ｂ及び下記の表４を参照。
【0123】
【表4A】
【0124】
【表4B】
【0125】
材料及び方法
コロナウイルスＳタンパク質の設計
Ｔ４三量体化ドメイン及びヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の融合前Ｓタンパク質エクトドメイン、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤドメインは、以前（Brouwer et al．2020）に記載されたように設計及びクローニングされ、Ｔ４三量体化ドメイン及びＳｔｒｅｐＩＩタグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２エクトドメインが作製された。他のヒトコロナウイルスの融合前Ｓタンパク質エクトドメインは、この配列を鋳型として使用して設計され、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに注文された。切断部位は、異なるタンパク質配列のアライメントにより選択された。存在する場合、フューリン切断部位は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質参照配列中の６８２～６８５に対応するアミノ酸において「ＧＧＧＧ」で置き換えられ、プロリン置換が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照配列中の９８６及び９８７に対応するアミノ酸において挿入された。Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＭＮ９０８９４７．３（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＡＢＤ７２９８４．１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＡＨＩ４８５５０．１（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＡＡＴ８４３６２．１（ＯＣ４３－ＣｏＶ）、Ｑ０ＺＭＥ７（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）、ＮＰ＿０７３５５１．１（２２９Ｅ－ＣｏＶ）及びＡＫＴ０７９５２．１（ＮＬ６３－ＣｏＶ）は、タンパク質設計の為の鋳型として役立った。Ａｖｉタグが、フローサイトメトリーにおいて使用されるタンパク質の為に該三量体化ドメインと該ｈｉｓタグとの間に付加された。
コロナウイルスＳタンパク質の設計
Ｔ４三量体化ドメイン及びヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）タグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の融合前Ｓタンパク質エクトドメイン、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤドメインは、以前（Brouwer et al．2020）に記載されたように設計及びクローニングされ、Ｔ４三量体化ドメイン及びＳｔｒｅｐＩＩタグを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ２エクトドメインが作製された。他のヒトコロナウイルスの融合前Ｓタンパク質エクトドメインは、この配列を鋳型として使用して設計され、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔに注文された。切断部位は、異なるタンパク質配列のアライメントにより選択された。存在する場合、フューリン切断部位は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質参照配列中の６８２～６８５に対応するアミノ酸において「ＧＧＧＧ」で置き換えられ、プロリン置換が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２参照配列中の９８６及び９８７に対応するアミノ酸において挿入された。Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ ＭＮ９０８９４７．３（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＡＢＤ７２９８４．１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ＡＨＩ４８５５０．１（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＡＡＴ８４３６２．１（ＯＣ４３－ＣｏＶ）、Ｑ０ＺＭＥ７（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）、ＮＰ＿０７３５５１．１（２２９Ｅ－ＣｏＶ）及びＡＫＴ０７９５２．１（ＮＬ６３－ＣｏＶ）は、タンパク質設計の為の鋳型として役立った。Ａｖｉタグが、フローサイトメトリーにおいて使用されるタンパク質の為に該三量体化ドメインと該ｈｉｓタグとの間に付加された。
【0126】
コロナウイルスＳタンパク質の発現及び精製
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＮＬ６３－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、及び２２９Ｅ－ＣｏＶスパイクタンパク質は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に維持されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において製造された。トランスフェクションが、１リットル当たり５０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において１ｍｇ／Ｌのポリエチレンイミン塩酸塩（ＰＥＩ）ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び３：１の比で３１２．５μｇ／Ｌの該発現プラスミドを使用して行われた。上清が４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によりトランスフェクションの７日後に採取され、続いて０．２２μＭ Ｓｔｅｒｉｔｏｐフィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して該上清が濾過された。Ｈｉｓタグ付加されたタンパク質は、ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーを用いて清澄化された上清から精製された。１００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮装置を使用して溶出液が濃縮され、ＰＢＳに緩衝液交換された。凝集した及び単量体タンパク質画分を除去する為の更なる精製が、ＰＢＳを緩衝剤として使用するＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して行われた。三量体Ｓタンパク質は約１３ｍＬの体積で溶出された。三量体タンパク質を含有する画分がプールされ、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮装置を使用して濃縮された。もたらされたタンパク質濃度が、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計を使用して決定された。タンパク質は、必要とされるまで－８０℃で貯蔵された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＮＬ６３－ＣｏＶ、ＯＣ４３－ＣｏＶ、ＨＫＵ１－ＣｏＶ、及び２２９Ｅ－ＣｏＶスパイクタンパク質は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に維持されたＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において製造された。トランスフェクションが、１リットル当たり５０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）において１ｍｇ／Ｌのポリエチレンイミン塩酸塩（ＰＥＩ）ＭＡＸ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び３：１の比で３１２．５μｇ／Ｌの該発現プラスミドを使用して行われた。上清が４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によりトランスフェクションの７日後に採取され、続いて０．２２μＭ Ｓｔｅｒｉｔｏｐフィルターユニット（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して該上清が濾過された。Ｈｉｓタグ付加されたタンパク質は、ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）アガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアフィニティークロマトグラフィーを用いて清澄化された上清から精製された。１００ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮装置を使用して溶出液が濃縮され、ＰＢＳに緩衝液交換された。凝集した及び単量体タンパク質画分を除去する為の更なる精製が、ＰＢＳを緩衝剤として使用するＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用して行われた。三量体Ｓタンパク質は約１３ｍＬの体積で溶出された。三量体タンパク質を含有する画分がプールされ、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮装置を使用して濃縮された。もたらされたタンパク質濃度が、Ｎａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計を使用して決定された。タンパク質は、必要とされるまで－８０℃で貯蔵された。
【0127】
ａｖｉタグを有するタンパク質は、生産者のプロトコールに従って全てのタンパク質について同じ条件を使用してＢｉｒＡ ｋｉｔ（Ａｖｉｄｉｔｙ）を用いてビオチン化された。その後に、タンパク質は、ＳｕｐｅｒＤｅｘ２００ １０／３００ ＧＬ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｃｏｌｕｍｎを使用して、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により更に精製された。Ｓ三量体タンパク質に対応するピーク画分がプールされ、再び濃縮され、ＰＢＳ中－８０℃で貯蔵された。
【0128】
コロナウイルスＳタンパク質に結合する抗体を評価するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ
タンパク質は、２ステップカルボジイミド反応を使用してＬｕｍｉｎｅｘ Ｍａｇｐｌｅｘビーズに共有結合的に連結された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、７５μｇのタンパク質と１２５０万個のビーズとの比で連結された。他のタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対して等モルで連結された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１及びＳ２タンパク質はＡｂｃｌｏｎａｌから得られた。Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍａｇｐｌｅｘビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）が１００ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）で洗浄され、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加により活性化され、ローテーター上で、室温で３０分間インキュベーションされた。活性化されたビーズは、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．０）で３回洗浄された。タンパク質は５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．０）中に希釈され、該ビーズに加えられた。該ビーズ及びタンパク質はローテーター上で、室温で３時間インキュベーションされた。次に、該タンパク質をコンジュゲートされたビーズはＰＢＳで洗浄され、２％のＢＳＡ、３％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するｐＨ７．０のＰＢＳを用いてローテーター上で、室温で３０分間ブロッキングされた。タンパク質をコンジュゲートされたビーズは洗浄され、０．０５％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中４℃で貯蔵され、６ヶ月以内に使用された。各々のＳタンパク質を連結されたビーズ上の該Ｈｉｓタグの検出が、該ビーズ上のタンパク質の量を確認する為に使用された。
タンパク質は、２ステップカルボジイミド反応を使用してＬｕｍｉｎｅｘ Ｍａｇｐｌｅｘビーズに共有結合的に連結された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、７５μｇのタンパク質と１２５０万個のビーズとの比で連結された。他のタンパク質は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質に対して等モルで連結された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１及びＳ２タンパク質はＡｂｃｌｏｎａｌから得られた。Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｍａｇｐｌｅｘビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）が１００ｍＭ一塩基性リン酸ナトリウム（ｐＨ６．２）で洗浄され、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加により活性化され、ローテーター上で、室温で３０分間インキュベーションされた。活性化されたビーズは、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．０）で３回洗浄された。タンパク質は５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．０）中に希釈され、該ビーズに加えられた。該ビーズ及びタンパク質はローテーター上で、室温で３時間インキュベーションされた。次に、該タンパク質をコンジュゲートされたビーズはＰＢＳで洗浄され、２％のＢＳＡ、３％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するｐＨ７．０のＰＢＳを用いてローテーター上で、室温で３０分間ブロッキングされた。タンパク質をコンジュゲートされたビーズは洗浄され、０．０５％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中４℃で貯蔵され、６ヶ月以内に使用された。各々のＳタンパク質を連結されたビーズ上の該Ｈｉｓタグの検出が、該ビーズ上のタンパク質の量を確認する為に使用された。
【0129】
各々のタンパク質－ビーズコンジュゲート１μｌ当たり２０個のビーズを含有する５０μｌの作業用ビーズ混合物は、５０μｌの希釈された血清と一晩インキュベーションされた。プレートは密閉され、プレートシェーカー上４℃で一晩インキュベーションされた。翌日に、プレートは、携帯式磁気分離装置を使用して０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有するＴＢＳ（ＴＢＳＴ）を用いて洗浄された。タンパク質をコンジュゲートされたビーズは、５０μｌのヤギ－抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）中に再懸濁され、プレートシェーカー上で、室温で２時間インキュベーションされた。次に、ビーズは、ＴＢＳＴで洗浄され、７０μｌのＭａｇｐｉｘ ｄｒｉｖｅ ｆｌｕｉｄ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）中に再懸濁され、プレートシェーカー上で、室温で数分間静置された。読み出しが次にＭａｇｐｉｘ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）上で行われた。メジアン蛍光強度（ＭＦＩ）値がウェル当たり約５０個のビーズのメジアンとして評価され、緩衝剤及びビーズのみのウェルからのＭＦＩ値の減算により補正された。
【0130】
単一細胞メモリーＢ細胞選別
フローサイトメトリーにおいてコロナウイルスタンパク質に結合するＢ細胞を同定する為に、Brouwer et al．(Science 2020)に記載されているように、ビオチン化された組換えＣｏＶ（ＮＬ６３）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質はストレプトアビジンフルオロフォアとコンジュゲートされ、蛍光標識されたプローブがもたらされた。簡潔に述べれば、組換えＮＬ６３ Ｓタンパク質は、２：１のモル比でストレプトアビジン－コンジュゲートＡＦ６４７（０．５ｍｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＢＶ４２１（０．１ｍｇ／ｍＬ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートされた。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、ストレプトアビジンＢＢ５１５（０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて標識された。コンジュゲーションのインキュベーションは、４℃で最低１時間行われた。プローブのコンジュゲーションは、１０ｍＭ遊離ビオチン（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）との１５分のインキュベーションにより停止された。
フローサイトメトリーにおいてコロナウイルスタンパク質に結合するＢ細胞を同定する為に、Brouwer et al．(Science 2020)に記載されているように、ビオチン化された組換えＣｏＶ（ＮＬ６３）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ）タンパク質はストレプトアビジンフルオロフォアとコンジュゲートされ、蛍光標識されたプローブがもたらされた。簡潔に述べれば、組換えＮＬ６３ Ｓタンパク質は、２：１のモル比でストレプトアビジン－コンジュゲートＡＦ６４７（０．５ｍｇ／ｍＬ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＢＶ４２１（０．１ｍｇ／ｍＬ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）にコンジュゲートされた。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質は、ストレプトアビジンＢＢ５１５（０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて標識された。コンジュゲーションのインキュベーションは、４℃で最低１時間行われた。プローブのコンジュゲーションは、１０ｍＭ遊離ビオチン（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）との１５分のインキュベーションにより停止された。
【0131】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は最初に、生産者の指示書に従ってＨｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）を使用してＢ細胞について濃縮された。Ｂ細胞を濃縮されたＰＢＭＣは次に、該蛍光標識されたコロナウイルスと４℃で３０分間インキュベーションされた。スパイクタンパク質（ＮＬ６３Ｓ－ＡＦ６４７；ＮＬ６３Ｓ－ＢＶ４２１；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－ＢＢ５１５；生／死細胞マーカー（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ－ｅＦ７８０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；表面マーカーＣＤ２０－ＰＥ－ＣＦ５９４（２Ｈ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２７－ＰＥ（Ｌ１２８、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩｇＧ ＡＦ７００（Ｇ１８－１４５、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＩｇＭ－ＢＶ６０５（ＭＨＭ－８８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩｇＤ－ＰＥ－Ｃｙ７（ＩＡ６－２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；並びに、Ｔ細胞マーカーＣＤ３（ＵＣＨＴ１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＣＤ４（ＯＫＴ４、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、単球及びマクロファージマーカーＣＤ１４（Ｃ１Ｄ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、並びにＮＫ細胞マーカーＣＤ１６（ＣＢ１６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を包含する、全ての非Ｂ細胞を排除する為の同じフルオロフォアＡＰＣ－ｅＦ７８０を有する様々な表面マーカー。１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２％のウシ胎仔血清を補充されたＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝食塩水、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中での３回の洗浄後に、フローサイトメトリーが４－ｌａｓｅｒ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において行われた。生メモリーＢ細胞は、ＮＬ６３ Ｓ（ＡＦ６４７及びＢＶ４２１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓの結合、並びにアイソタイプ発現についてＦｌｏｗＪｏ（バージョン１０．６．２）を使用して分析された。ＮＬ６３ Ｓ（ＡＦ６４７及びＢＶ４２１）について二重陽性の生メモリーＢ細胞（例示的な図１を参照）は、空の９６ウェルプレートへの収率純度を使用して単一細胞選別され、－８０℃で少なくとも１時間直ちに凍結された後に、溶解され、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写する為の逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲが行われた。
【0132】
メモリーＢ細胞からの抗体ｃＤＮＡの抽出
凍結された単一細胞選別されたメモリーＢ細胞は、２０μｌの総体積の２０Ｕリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１．２５μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる溶解緩衝液（室温）中で再構成された。該溶解されたＮＬ６３ Ｓタンパク質特異的な単一Ｂ細胞のｍＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲによりｃＤＮＡに変換された。簡潔に述べれば、６μｌの総体積の５０ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌの６ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び２００ｎｇのランダム六量体プライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、単一の溶解された細胞を含有する各々のウェルに加えられた。以下のＲＴプログラムが使用された：４２℃で１０分、２５℃で１０分、５０℃で６０分、９５℃で５分、及び４℃で無限時間。ｃＤＮＡは、更なる分析まで－２０℃で貯蔵された。
凍結された単一細胞選別されたメモリーＢ細胞は、２０μｌの総体積の２０Ｕリボヌクレアーゼ（ＲＮＡｓｅ）阻害剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び１．２５μｌの０．１Ｍジチオトレイトール（ＤＴＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなる溶解緩衝液（室温）中で再構成された。該溶解されたＮＬ６３ Ｓタンパク質特異的な単一Ｂ細胞のｍＲＮＡはＲＴ－ＰＣＲによりｃＤＮＡに変換された。簡潔に述べれば、６μｌの総体積の５０ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μｌの６ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び２００ｎｇのランダム六量体プライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が、単一の溶解された細胞を含有する各々のウェルに加えられた。以下のＲＴプログラムが使用された：４２℃で１０分、２５℃で１０分、５０℃で６０分、９５℃で５分、及び４℃で無限時間。ｃＤＮＡは、更なる分析まで－２０℃で貯蔵された。
【0133】
該ＮＬ６３ Ｓ特異的な単一細胞選別されたＢ細胞により発現された抗体のＶ（Ｄ）Ｊ可変領域は、Tiller et al J Immunol Methods 2008により以前に記載されたように増幅された。簡潔に述べれば、カッパ鎖及びラムダ鎖の両方について、ＰＣＲ １は、２０μｌの総体積で０．５ＵのＭｙＴａｑポリメラーゼ（ＢｉｏＬｉｎｅ）、０．１μＭフォワード及びリバースの両方のマルチプレックスプライマー、ＭｙＴａｑ ＰＣＲ反応緩衝液（ＢｉｏＬｉｎｅ）、並びに２μｌのｃＤＮＡを用いて９５℃で１分間、５０サイクルの９５℃で１５秒、５８℃で１５秒、７２℃で４５秒、続いて７２℃で１０分行われた。該ネステッドＰＣＲは、１４．５μｌの総体積で０．３７５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０３４μＭフォワード及びリバースの両方のマルチプレックスプライマー、ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、並びに２μｌのＰＣＲ １生成物を用いて９５℃で５分間、５０サイクルの９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分、続いて７２℃で１０分行われた。重鎖の為に一次及び２つのネステッドＰＣＲ反応が行われた。簡潔に述べれば、該一次ＰＣＲは、１４．５μｌの総体積で０．３７５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．０６９μＭフォワード及びリバースの両方のマルチプレックスプライマー、ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、並びに２μｌのｃＤＮＡを用いて９５℃で５分間、５０サイクルの９４℃で３０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分、続いて７２℃で１０分行われた。該第１のネステッドＰＣＲは、２０μｌの総体積で０．５ＵのＭｙＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、０．０５μＭフォワード及びリバースの両方のマルチプレックスプライマー（３９）、ＭｙＴａｑ ＰＣＲ反応緩衝液（ＢｉｏＬｉｎｅ）、並びに２μｌのＰＣＲ １生成物を用いて９５℃で１分間、３０サイクルの９５℃で１５秒、５８℃で１５秒、７２℃で４５秒、続いて７２℃で１０分行われた。最終のＰＣＲは、１４．５μＬの総体積で０．３７５ＵのＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、ベクターオーバーハングを有する０．０３４μＭフォワード及びリバースの両方のマルチプレックスプライマー、ＨｏｔｓｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓ ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）、並びに２μｌのＰＣＲ ２生成物を用いて９５℃で５分間、５０サイクルの９４℃で３０ｓ、６０℃で３０ｓ、７２℃で１分、続いて７２℃で１０分行われた。
【0134】
抗体クローニング及び小スケール発現
全ての組換え抗体は、Sok et al．(PNAS 2014)及びvan Gils et al．(Nat Microbiol 2016)により以前に記載されたように哺乳動物細胞発現系において発現された。簡潔に述べれば、該抗体の重鎖及び軽鎖の可変Ｖ（Ｄ）Ｊ領域が、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー（Gibson et al．Nat Methods 2009）を使用して該重鎖又は軽鎖の為のヒトＩｇＧ１の定常領域を含有する対応する発現ベクターにクローニングされた。該Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーは、２ｘ Ｇｉｂｓｏｎミックス（０．２ＵのＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｂｉｏ）、１２．５ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｇｉｂｓｏｎ反応緩衝液（０．５ｇのＰＥＧ－８０００（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＭｇＣｌ２、１Ｍ ＤＴＴ、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＮＡＤ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＭＱ））からなる自社製Ｇｉｂｓｏｎミックスを用いて実行され、５０℃で６０分間行われた。該プラスミドの配列完全性はサンガーシークエンシングにより検証された。小スケールトランスフェクションの為に、接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持され、van Gils et al．(Nat Microbiol 2016)により以前に記載されたようにトランスフェクションされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、トランスフェクションの２４ｈ前に２４ウェル又は４８ウェルプレートに、上記されている完全培地中にそれぞれ２．７５ｘ１０＾５又は１．５ｘ１０＾５細胞／ウェルの密度で播種された。トランスフェクションミックスは、それぞれ２００又は１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：２．５の比を使用して１：１（ｗ：ｗ）のＨＣ／ＬＣ比からなるものであった。室温で１５分のインキュベーション後に、該トランスフェクションミックスが該細胞に加えられた。上清がトランスフェクションの４８時間後に採取され、清澄化され、更なる分析まで４℃で貯蔵された。
全ての組換え抗体は、Sok et al．(PNAS 2014)及びvan Gils et al．(Nat Microbiol 2016)により以前に記載されたように哺乳動物細胞発現系において発現された。簡潔に述べれば、該抗体の重鎖及び軽鎖の可変Ｖ（Ｄ）Ｊ領域が、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリー（Gibson et al．Nat Methods 2009）を使用して該重鎖又は軽鎖の為のヒトＩｇＧ１の定常領域を含有する対応する発現ベクターにクローニングされた。該Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーは、２ｘ Ｇｉｂｓｏｎミックス（０．２ＵのＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｅｐｉｂｉｏ）、１２．５ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｇｉｂｓｏｎ反応緩衝液（０．５ｇのＰＥＧ－８０００（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．５、１Ｍ ＭｇＣｌ２、１Ｍ ＤＴＴ、１００ｍＭ ｄＮＴＰ、５０ｍＭ ＮＡＤ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＭＱ））からなる自社製Ｇｉｂｓｏｎミックスを用いて実行され、５０℃で６０分間行われた。該プラスミドの配列完全性はサンガーシークエンシングにより検証された。小スケールトランスフェクションの為に、接着ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１１２６８）は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持され、van Gils et al．(Nat Microbiol 2016)により以前に記載されたようにトランスフェクションされた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、トランスフェクションの２４ｈ前に２４ウェル又は４８ウェルプレートに、上記されている完全培地中にそれぞれ２．７５ｘ１０＾５又は１．５ｘ１０＾５細胞／ウェルの密度で播種された。トランスフェクションミックスは、それぞれ２００又は１００μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ中のｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１：２．５の比を使用して１：１（ｗ：ｗ）のＨＣ／ＬＣ比からなるものであった。室温で１５分のインキュベーション後に、該トランスフェクションミックスが該細胞に加えられた。上清がトランスフェクションの４８時間後に採取され、清澄化され、更なる分析まで４℃で貯蔵された。
【0135】
大スケール抗体発現及び精製
選択されたｍＡｂのより大スケール発現の為に、懸濁ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ７９００７）は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養され、１ｍｇ／ＬのＰＥＩｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：３の比で８０～１２０万個の細胞／ｍＬの密度において１：１の比の対応する重鎖及び軽鎖を発現する該２つのＩｇＧプラスミドを共トランスフェクションされた。該組換えＩｇＧ抗体は、以前（Sok et al．PNAS 2014）に記載されたように５日の培養後に細胞上清から単離された。簡潔には、細胞懸濁物は４０００ｒｐｍで２５分遠心分離され、上清は、０．２２μｍの孔径のＳｔｅｒｉＴｏｐフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過された。該濾過された上清は、１０ｍＬのプロテインＡ／Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に流され、続いて２カラム体積のＰＢＳ洗浄が行われた。該抗体は、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて１：９の比の該中和緩衝液１Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．７）に溶出された。該精製された抗体は、１００ｋＤａ ＶｉｖａＳｐｉｎ２０ ｃｏｌｕｍｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用してＰＢＳに緩衝液交換された。ＩｇＧ濃度がＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００で決定され、該抗体は更なる分析まで４℃で貯蔵された。
選択されたｍＡｂのより大スケール発現の為に、懸濁ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｒ７９００７）は、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養され、１ｍｇ／ＬのＰＥＩｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）と１：３の比で８０～１２０万個の細胞／ｍＬの密度において１：１の比の対応する重鎖及び軽鎖を発現する該２つのＩｇＧプラスミドを共トランスフェクションされた。該組換えＩｇＧ抗体は、以前（Sok et al．PNAS 2014）に記載されたように５日の培養後に細胞上清から単離された。簡潔には、細胞懸濁物は４０００ｒｐｍで２５分遠心分離され、上清は、０．２２μｍの孔径のＳｔｅｒｉＴｏｐフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濾過された。該濾過された上清は、１０ｍＬのプロテインＡ／Ｇカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に流され、続いて２カラム体積のＰＢＳ洗浄が行われた。該抗体は、０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）を用いて１：９の比の該中和緩衝液１Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ８．７）に溶出された。該精製された抗体は、１００ｋＤａ ＶｉｖａＳｐｉｎ２０ ｃｏｌｕｍｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用してＰＢＳに緩衝液交換された。ＩｇＧ濃度がＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００で決定され、該抗体は更なる分析まで４℃で貯蔵された。
【0136】
Ｎｉ２＋－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）捕捉ＥＬＩＳＡ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨｉｓタグ付加されたスパイクタンパク質及びＳｔｒｅｐＩＩタグ付加されたＳ２タンパク質は、９６ウェルＮｉ－ＮＴＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上のカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中にＲＴで２ｈロードされた。該プレートがＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）で洗浄された後に、１０μｇ／ｍＬの濃度から開始する、カゼイン中のｍＡｂの３倍段階希釈液、又はＨＥＫ ２９３Ｔの抗体をトランスフェクションされた上清が加えられた。ＴＢＳでの３回の洗浄後に、カゼイン中のＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：３０００希釈液がＲＴで１時間加えられた。最後に、該プレートをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で５回洗浄した後に、顕色溶液（１％ ３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１％の過酸化水素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム及び１００ｍＭクエン酸）が加えられた。比色エンドポイントの顕色は４分間進行した後に、０．８Ｍ硫酸を加えることにより終了され、光学密度（ＯＤ値）が４５０ｎｍで決定された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＨｉｓタグ付加されたスパイクタンパク質及びＳｔｒｅｐＩＩタグ付加されたＳ２タンパク質は、９６ウェルＮｉ－ＮＴＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ）上のカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中にＲＴで２ｈロードされた。該プレートがＴｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）で洗浄された後に、１０μｇ／ｍＬの濃度から開始する、カゼイン中のｍＡｂの３倍段階希釈液、又はＨＥＫ ２９３Ｔの抗体をトランスフェクションされた上清が加えられた。ＴＢＳでの３回の洗浄後に、カゼイン中のＨＲＰ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）の１：３０００希釈液がＲＴで１時間加えられた。最後に、該プレートをＴＢＳ／０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０で５回洗浄した後に、顕色溶液（１％ ３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１％の過酸化水素、１００ｍＭ酢酸ナトリウム及び１００ｍＭクエン酸）が加えられた。比色エンドポイントの顕色は４分間進行した後に、０．８Ｍ硫酸を加えることにより終了され、光学密度（ＯＤ値）が４５０ｎｍで決定された。
【0137】
全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＣｏＶスパイクの発現及びＦＡＣＳにおける結合
表面発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＣｏＶスパイクは、ペトリ皿中の１２～１５ｍＬのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（前日に３．０ｘ１０＾６で播種された）への４００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ中の８μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長プラスミドＤＮＡ及び２５μｌのＰＥＩｍａｘのトランスフェクションにより得られた。４８時間後に、細胞は採取され、凍結された。解凍後に、関心対象のスパイクタンパク質を発現する２９３Ｔ細胞が９６ウェルプレート中でウェル当たりＰＢＳ／０．５％ＦＣＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に２０，０００～３０，０００細胞でプレーティングされ、２９３Ｔ細胞からの未精製の上清と、又は２９３Ｆ細胞における精製及び製造後のｍＡｂの希釈液と１：１で、４℃で１時間インキュベーションされた。細胞はその後にＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄され、１：１０００で希釈された、ＰＥをコンジュゲートされたヤギＦ（ａｂ）’２抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４２－０９）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中、４℃及び暗所で３０分間染色された。細胞はＦＡＣＳ緩衝液で更に１回洗浄され、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏ ＩＩ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ）で分析された。試料はＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析され、結合を示す細胞のパーセンテージがプロットされた。
表面発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＣｏＶスパイクは、ペトリ皿中の１２～１５ｍＬのＨＥＫ２９３Ｔ細胞（前日に３．０ｘ１０＾６で播種された）への４００μｌのＯｐｔｉｍｅｍ中の８μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２全長プラスミドＤＮＡ及び２５μｌのＰＥＩｍａｘのトランスフェクションにより得られた。４８時間後に、細胞は採取され、凍結された。解凍後に、関心対象のスパイクタンパク質を発現する２９３Ｔ細胞が９６ウェルプレート中でウェル当たりＰＢＳ／０．５％ＦＣＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中に２０，０００～３０，０００細胞でプレーティングされ、２９３Ｔ細胞からの未精製の上清と、又は２９３Ｆ細胞における精製及び製造後のｍＡｂの希釈液と１：１で、４℃で１時間インキュベーションされた。細胞はその後にＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄され、１：１０００で希釈された、ＰＥをコンジュゲートされたヤギＦ（ａｂ）’２抗ヒトＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４２－０９）を含有する５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液中、４℃及び暗所で３０分間染色された。細胞はＦＡＣＳ緩衝液で更に１回洗浄され、ＦＡＣＳ ｃａｎｔｏ ＩＩ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＢＤ）で分析された。試料はＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析され、結合を示す細胞のパーセンテージがプロットされた。
【0138】
方法は、以下の参考文献において更に記載されている。
【0139】
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【国際調査報告】