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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-02
(54)【発明の名称】システム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20230726BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230726BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023525120
(86)(22)【出願日】2021-07-09
(85)【翻訳文提出日】2023-03-07
(86)【国際出願番号】 EP2021069138
(87)【国際公開番号】W WO2022008712
(87)【国際公開日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】2010620.9
(32)【優先日】2020-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523009595
【氏名又は名称】ジーティーインヴェント リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】ハリントン チャールズ ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ポラック サスキア ジュリー
(72)【発明者】
【氏名】マーシャル カレン エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】サーペル ルイーズ シャーロット
(72)【発明者】
【氏名】ウィシック クロード ミシェル
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QX01
(57)【要約】
本発明は、タウタンパク質またはその断片の凝集体に対する治療効果のある薬剤をスクリーニングするために使用できる、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞におけるタウタンパク質凝集の研究システムを提供するものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片の神経細胞に対する細胞毒性の阻害に有効な薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法。（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養する工程；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実施した後の神経細胞に対するタウタンパク質断片の細胞毒性を決定する工程。
【請求項2】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片の内在化阻害に有効な薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法。（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質の断片とともに神経細胞を培養すること；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養すること；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実行した後の神経細胞におけるタウタンパク質断片の内在化を決定すること。
【請求項3】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用を破壊するために有効な薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法。（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質の断片とともに神経細胞を培養すること；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実行した後に、タウタンパク質断片と神経細胞内の内因性タウタンパク質との相互作用の程度を決定する工程。
【請求項4】
本発明による使用のための上記で定義されたタウタンパク質の断片が、７０から９７アミノ酸長であってよく、任意選択的に７１から９７アミノ酸長であってよい、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
タウタンパク質の断片が、７１、７３、９４、９５、９７アミノ酸長の断片の群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片が、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に記載のアミノ酸配列、もしくはそれらに少なくとも８５％同一性を有する配列を有するタウタンパク質断片からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片の細胞毒性の阻害に有効な薬剤のスクリーニングシステムであって、（ｉ）神経細胞株、（ｉｉ）ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片、またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列、および（ｉｉｉ）薬剤のライブラリを含み、神経細胞株はヘパリンを含まない、システム。
【請求項8】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列の内在化の阻害に有効な薬剤のスクリーニングシステムであって、（ｉ）神経細胞株、（ｉｉ） ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片、またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列、および（ｉｉｉ） 薬剤のライブラリを含み、神経細胞株がヘパリンを含まない、システム。
【請求項9】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用を破壊するために有効な薬剤のスクリーニングシステムであって、（ｉ）神経細胞株、（ｉｉ）ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片、またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列、および（ｉｉｉ）薬剤のライブラリを含み、神経細胞株がヘパリンを含まない、システム。
【請求項10】
本発明による使用のための上記で定義されたタウタンパク質の断片が、７０～９７アミノ酸長であってもよく、任意選択的に７１～９７アミノ酸長であってよい、請求項７～９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項11】
タウタンパク質の断片が、７１、７３、９４、９５、９７アミノ酸長の断片の群から選択される、請求項１０に記載のシステム。
【請求項12】
ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片が、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に記載のアミノ酸配列、もしくはそれらに少なくとも８５％同一性を有する配列を有するタウタンパク質断片からなる群から選択される、請求項７～９のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タウタンパク質またはその断片の凝集体に対する治療効果のある薬剤をスクリーニングするために使用できる、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞におけるタウタンパク質凝集の研究システムを提供する。
【背景技術】
【0002】
アルツハイマー病では、タウタンパク質が対をなすらせん状のフィラメント（ＰＨＦ）や直線状のフィラメントに集合し、凝集体を形成することが大きな特徴である。タウの凝集は、神経変性、細胞毒性、疾患の進行に伴う増殖に関与しているとされている。タウタンパク質が誤って折り畳まれ、自己組織化し、タングル（もつれ）に蓄積することは、アルツハイマー病（ＡＤ）に代表されるタウオパチーに共通する病態の大きな特徴である。病態下では、タウタンパク質が対のらせん状フィラメント（ＰＨＦ）に異常凝集して神経原線維変化（ＮＦＴ）を生じ、タウタンパク質の機能低下と神経細胞の機能不全を伴う。
【0003】
タウは、細胞への取り込みや鋳型化された播種など、プリオン様挙動を示す。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究では、細胞外のタウ凝集体が神経細胞に内在化され、細胞内の内因性タウの自己集合を誘発し、それが放出されて隣接する神経細胞やシナプスに接続した神経細胞に移行することが示されている。培養細胞株では、ヘパリンを用いて誘導した組換えタウやＡＤ脳由来タウ凝集体の内在化凝集体がエンドソーム区画で観察でき、内因性タウや凝集しやすいタウを勧誘して凝集させることが可能である。これらの研究で一貫して見られるのは、タウがエンドソームやリソソームと共局在していることである。
【0004】
タウの凝集体は、神経細胞やグリア細胞の間で伝達されるという強い裏付けがある一方で、その原因となる種については議論がなされてきた。タウの播種能力はタウ凝集体のサイズとコンフォメーションに依存し、ｒＴｇ４５１０マウスから精製したモノマーや長いフィブリルではなく、タウオリゴマーが伝播誘発の鍵種として作用することが研究で示唆された。ある研究では、Ｐ３０１Ｓタウ遺伝子導入マウスでは大きなタウ凝集体（＞１０ｍｅｒｓ）がシードコンピテント種であると報告され、別の研究では、タウ三量体がヒトタウ発現ＨＥＫ－２９３細胞の立体配置鋳型播種と細胞内タウ凝集に必要な最小単位であると判明した。
【0005】
多くの研究が、ヒトや変異型タウを過剰発現させた動物モデルや細胞モデルを用いて行われている。Ｉｎ ｖｉｔｒｏの研究では、ヘパリンによる線維化を必要とする全長あるいは切断されたタウタンパク質が利用されてきた。どちらのアプローチも、完全長タウの低い凝集傾向と細胞毒性の欠如を克服することを目的としている。しかし、ヘパリンで誘導されたタウフィラメントは自己組織化せず、ＡＤフィラメントの主要な構造的特徴を再現しないため、生理的な関連性に疑問が持たれつつある。残基２９７～３９１にまたがるタウの切断されたリピートドメイン断片（ｄＧＡＥと呼ばれる（参照 Ｄｅｓｐｒｅｓ ｅｔ ａｌ ＡＣＳ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． １４， ｎｏ． ６， ｐｐ． １３６３-１３７９，（２０１９）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｅｌｉｆｅ， ｖｏｌ． ８， ｐ． ｅ４３５８４，（２０１９）； Ｗｉｓｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ｖｏｌ． ８５， ｎｏ． １２， ｐｐ． ４５０６-４５１０，（１９８８）） は、ＡＤ脳組織のタンパク質分解安定化ＰＨＦコア調製物から生化学的に初めて同定され、低温電子顕微鏡でクロスベータ／ベータヘリックス構造を形成するＣ型サブユニットとして特徴付けられたコア配列（３０６－３７８）と重なっていることがわかった。ＡＤにおけるタウ凝集のプロセスを開始するものは理解されていないが、切断されたｄＧＡＥは、無細胞および細胞モデルにおいてタウの鋳型指向性凝集に役立つ（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２９０， ｎｏ． １７， ｐｐ． １０８６２-１０８７５， ２０１５）， Ｗｉｓｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ｖｏｌ． ９３， ｎｏ． ２０， ｐｐ． １１２１３－１１２１８（１９９６））， ａｎｄ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ（Ｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．， ｖｏｌ． ７２， ｎｏ． １１， ｐｐ． ２１９９-２２２２，（２０１５））。タウのｄＧＡＥ領域（２９７－３９１）は、ヘパリンなどの添加物のない生理的条件下で自発的に集合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＨＦ様フィラメントを形成する。
【0006】
組織培養細胞モデルにおいて外因的に適用されたタウの特性を調べるこれまでの研究は、ヒト野生型または変異型タウを過剰発現する非神経細胞または神経細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの使用によって妨げられ、しばしば凝集を開始するために非生理的断片またはタウの調製品を使用していた（Ｆａｌｃｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２９０， ｎｏ． ２， ｐｐ． １０４９-１０６５，（２０１５）； Ｊ． Ｌ．Ｇｕｏ ａｎｄ Ｖ． Ｍ．Ｙ． Ｌｅｅ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２８６， ｎｏ． １７， ｐｐ １５３１７－１５３３１（２０１１）； ａｎｄ Ｋｆｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２８７， ｎｏ． ２３， ｐｐ． １９４４０-１９４５１，（２０１２））。
【0007】
また、完全長タウ、変異タウ、リン酸化状態の異なるタウ凝集体は、細胞生存率にほとんど影響を与えないことが報告されている（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２８９， ｎｏ． ２９， ｐｐ． ２０３１８-２０３３２，（２０１４）； Ｔｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２８９， ｎｏ． ４９， ｐｐ． ３４３８９-３４４０７，（２０１４） ａｎｄ Ｋａｎｉｙａｐｐａｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｅｍｅｎｔ．， ｖｏｌ． １３， ｎｏ． １１， ｐｐ． １２７０-１２９１，（２０１７））。例えば、バリアント反復タウ断片（Ｌｙｓ－２８０欠失したｔａｕ２４４－３７２に相当；ＴａｕＲＤΔＫ）から形成されるオリゴマーは、細胞生存率に影響を与えずに樹状突起スパインに選択的に毒性を示すことが観察された（Ｋａｎｉｙａｐｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ Ｄｅｍｅｎｔ．， ｖｏｌ．１３， ｎｏ．１１， ｐｐ．１２７０－１２９１，（２０１７））。
【0008】
他の研究では、毒性は使用されるタウの正確な断片に依存することも示されている（Ｆｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ｖｏｌ． ２８７， ｎｏ． ５２， ｐｐ． ４３２２３-４３２３３，（２０１２）； Ｌａｓａｇｎａ－Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ４９， ｎｏ． ４７， ｐｐ． １００３９-１００４１，（２０１０）； ａｎｄ Ｌａｓａｇｎａ－Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．， ｖｏｌ． ６， ｎｏ． １， ｐ． ３９，（２０１１））。タウ毒性試験におけるばらつきは、使用するタウ断片やその調製方法の違いも関係していると思われる。
【0009】
タウ凝集阻害剤の同定については、ＷＯ １９９６／０３０７６６およびＷＯ ２００２／０５５７２０に記載されている。タウのペアーヘリカルフィラメントの阻害剤のスクリーニングについては、ＷＯ ２００１／０１８５４６に記載されている。タウ凝集阻害剤の同定に用いるハイスループットスクリーニングについては、Ｂｕｌｉｃ ｅｔ ａｌ（Ｊ． Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．５６， ｐｐ ４１３５－４１５５（２０１３））にレビューされている。Ｌｉｕら（Ｐｈａｒｍ．パットＡｎａｌ． Ｖｏｌ．３ ｐｐ ４２９－４４７（２０１４））でも、タウ凝集阻害剤とは異なる複数の異なるメカニズムを用いた様々なタウ標的化アプローチについて報告されている。同定された化合物の臨床開発については、Ｐａｎｚａ ｅｔ ａｌ（ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔ．， Ｖｏｌ． ２１６， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ３２４５９３５，（２０１６））に記載されている。これらの報告にもかかわらず、記載されたメチレンブルー（ＭＢ）またはＬＭＴ（（ロイコ－メチルチオニニウムビスヒドロメタンスルホネート、ＬＭＴＭ；ＬＭＴ－ＸまたはＴＲｘ０２３７としても知られている）以外の阻害剤は、いずれも完全な第３相臨床試験まで進んでいない（Ｐａｎｚａ ｅｔ ａｌ（ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔ．， Ｖｏｌ． ２１６， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ３２４５９３５，（２０１６））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本明細書に記載のシステムにより、タウ凝集病態の進展の分子機構をより生理的にｉｎ ｖｉｔｒｏで研究することが可能となり、新規治療法の開発につながることが期待される。この新しいモデルシステムは、ヒト神経細胞において、変異タウの過剰発現や外因性の播種因子がない場合のタウのＰＨＦ形成領域の内在化、細胞毒性、内因性タウへの影響を調べることを可能にするものである。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の第１の態様によれば、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片の神経細胞に対する細胞毒性の阻害に有効な薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を含むものが提供される：
（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養する工程；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実施した後の神経細胞に対するタウタンパク質断片の細胞毒性を決定する工程。
（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養する工程；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実施した後の神経細胞に対するタウタンパク質断片の細胞毒性を決定する工程。
【0012】
本発明の方法は、好適には、神経細胞集団に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。したがって、本発明の方法は、タウタンパク質またはその断片の凝集体に対して所望の活性を有する薬剤をスクリーニングするためのｅｘ ｖｉｖｏ方法である。
【0013】
神経細胞は、薬剤の存在下で培養された後、さらにタウタンパク質断片の存在下で培養されてもよい。あるいは、神経細胞をタウタンパク質断片の存在下で培養し、さらに薬剤の存在下で培養することも可能である。
【0014】
上記で定義されたタウタンパク質断片は、好適には凝集して、オリゴマーおよび／またはフィラメントを自己集合した構造を形成する。タウタンパク質の断片は、主にランダムなコイル構造であり、かつ／または可溶性の単量体および二量体から構成されている場合がある。本明細書に記載されるタウタンパク質またはその断片の凝集体は、任意の好適な形態のタウタンパク質であってもよい。好適には、タウタンパク質は、タウタンパク質の組換え体である。このようなタウタンパク質の断片は、タウ凝集体とも呼ばれることがある。タウタンパク質の断片は、調製品からコンタミネーション（より短いペプチド断片）が除去された精製調製品に存在する場合がある。
【0015】
本明細書に記載されたタウタンパク質の断片は、リン酸化されることなく自己凝集することが可能である。本明細書に記載されるタウタンパク質断片は、内因性タウタンパク質と共凝集する。共凝集後、本明細書に記載のタウタンパク質断片と内因性タウタンパク質は、神経細胞内のエンドソームおよび／またはリソソーム区画内に共に蓄積される。
【0016】
ｄＧＡＥ９５のアミノ酸配列（配列番号４）またはそれと少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質の断片は、好適には、配列番号４のアミノ酸から少なくとも７０アミノ酸の連続した配列を含む。
【0017】
本発明による使用のための上記で定義されたタウタンパク質の断片は、７０～９７アミノ酸長であってもよく、任意選択的に７１～９７アミノ酸長であってもよい。上記で定義されたタウタンパク質の断片は、好適には、７１、７３、９４、９５、９７アミノ酸長の断片の群から選択され得る。
【0018】
したがって、ｄＧＡＥ９５のアミノ酸配列（配列番号４）またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片は、配列番号４、配列番号３、配列番号５、配列番号６、または配列番号７に記載のアミノ酸配列、もしくはそれらに少なくとも８５％同一性を有する配列を有するタウタンパク質断片からなる群から選択され得る。
【0019】
ｄＧＡＥ９５は、配列番号４に記載された、Ｎ末端がＩｌｅ－２９７残基、Ｃ末端がＧｌｕ－３９１残基のタウ（２Ｎ４Ｒ）の９５残基断片、または他の生物種の相同位置を指す（言及した残基はヒトまたはマウスタウ配列を指し、この２つは、この領域で同一である）。
【0020】
したがって、本発明に従って使用されるタウタンパク質の断片は、断片ｄＧＡＥ９７（ｄＧＡＥ９７は、配列番号３に記載されているように、Ｎ末端が残基Ａｓｐ－２９５、Ｃ末端が残基Ｇｌｕ－３９１であるタウ（２Ｎ４Ｒ）の９７残基断片、または他の種における相同位置の断片をさす）、ｄＧＡ（「ｄＧＡ」は、配列番号５に記載されているように、Ｎ末端が残基Ｉｌｅ－２９７、Ｃ末端が残基Ａｌａ－３９０であるタウ（２Ｎ４Ｒ）の９４残基断片、または他の種における相同位置の断片をさす）、ｄＧＡＥ７３（ｄＧＡＥ７３は、配列番号６に記載されているように、Ｎ末端が残基Ｖａｌ－３０６、Ｃ末端が残基Ｐｈｅ－３７８であるタウ（２Ｎ４Ｒ）の断片、または他の種における相同位置の断片をさす）、および 配列番号７に記載されている、Ｎ末端が残基Ｉｌｅ－３０８、Ｃ末端が残基Ｐｈｅ－３７８のタウ（２Ｎ４Ｒ）の残基３０８から３７８のアミノ酸配列、または他の種における相同な位置のアミノ酸配列を含む。
【0021】
本開示におけるタウタンパク質の配列および構造の全ての残基番号は、ヒトタウタンパク質の４回繰り返しアイソフォーム２Ｎ４Ｒの配列である配列番号１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ１０６３６－８）、または他の種若しくはそのバリアントにおける相同な位置の残基を意味する。ヒトタウアイソフォーム２Ｎ４Ｒ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ１０６３６－８）は、全長タウ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ１０６３６またはＰ１０６３６－１のアミノ酸１－１２４、３７６－３９４および４６１－７５８に相当し、配列番号２として提供される。配列番号２は、中枢神経系（ＣＮＳ）ではなく、末梢神経系（ＰＮＳ）で見られる、より長い形態のタウに関するものである。本明細書で使用する場合、「全長」タウへの言及は、配列番号１（ＣＮＳに関連する配列）を指し、配列番号２（ＣＮＳに関連しない）を意味しない。
【0022】
配列番号１（アイソフォームＴａｕ－Ｆ、別名Ｔａｕ－４、２Ｎ４Ｒ、４４１アミノ酸）：
配列番号２（全長ヒト タウ、アイソフォーム ＰＮＳ－タウ、７５８ アミノ酸）；
【0023】
ｄＧＡＥ９７は、配列番号３に記載されたＮ末端がＡｓｐ－２９５残基、Ｃ末端がＧｌｕ－３９１残基のタウ（２Ｎ４Ｒ）の９７残基断片、または他の生物種の相同位置の断片を指す（言及した残基はヒトまたはマウスタウ配列を指し、この２つは、この領域で同一である）。当業者には明らかなように、ｄＧＡＥ９７はまた、Ａｓｐ－６１２にＮ末端、Ｇｌｕ－７０８にＣ末端を有するアイソフォーム ＰＮＳ－Ｔａｕ（Ｐ１０６３６－１）の断片に対応する。
配列番号３（ｄＧＡＥ９７、ヒト／マウス、９７アミノ酸）：
配列番号３（ｄＧＡＥ９７、ヒト／マウス、９７アミノ酸）：
【0024】
ｄＧＡＥ９５は、配列番号４に記載された、Ｎ末端がＩｌｅ－２９７残基、Ｃ末端がＧｌｕ－３９１残基のタウ（２Ｎ４Ｒ）の９５残基断片、または他の生物種の相同位置を指す（言及した残基はヒトまたはマウスタウ配列を指し、この２つは、この領域で同一である）。当業者には明らかなように、ｄＧＡＥ９５はまた、Ｉｌｅ－６１４にＮ末端、Ｇｌｕ－７０８にＣ末端を有するアイソフォームＰＮＳ－Ｔａｕ（Ｐ１０６３６－１）の断片に対応する。この配列を単に「ｄＧＡＥ」と呼ぶこともある。タウの２９７から３９１残基（２Ｎ４Ｒ）は、タンパク質分解的に安定なペアヘリカルフィラメント（ＰＨＦ）のコアから分離された優勢な断片としても知られている。
配列番号４（ｄＧＡＥ９５または「ｄＧＡＥ」、ヒト／マウス、９５アミノ酸）：
配列番号４（ｄＧＡＥ９５または「ｄＧＡＥ」、ヒト／マウス、９５アミノ酸）：
【0025】
タウのｄＧＡＥ領域（２９７－３９１）は、ヘパリンなどの添加物のない生理的条件下で自発的に集合し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＰＨＦ様フィラメントを形成する。
【0026】
「ｄＧＡ」とは、配列番号５に記載された、Ｎ末端がＩｌｅ－２９７残基、Ｃ末端がＡｌａ－３９０残基のタウ（２Ｎ４Ｒ）の９４残基断片、または他の種における相同位置の断片を指す（言及した残基はヒトまたはマウスタウ配列を指し、この２つは、この領域で同一である）。
配列番号５（ｄＧＡ、ヒト／マウス、９４アミノ酸）：
配列番号５（ｄＧＡ、ヒト／マウス、９４アミノ酸）：
【0027】
ｄＧＡＥ７３は、配列番号６に記載されているように、Ｎ末端が残基Ｖａｌ－３０６、Ｃ末端が残基Ｐｈｅ－３７８であるタウ（２Ｎ４Ｒ）の断片、または他の種における相同位置の断片をさす （言及した残基はヒトまたはマウスタウ配列を指し、この２つは、この領域で同一である）。この断片は、ＡＤ脳組織から単離されたＰＨＦのコアであることが低温電子顕微鏡で確認された配列の３０６－３７８残基に相当する（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ， ２０１７； Ｎａｔｕｒｅ）。コアはこれらの残基を越えて広がることができるが、クライオ電子顕微鏡の分解能によって制限される。当業者には明らかなように、ｄＧＡＥ７３はまた、Ｖａｌ－６２３にＮ末端、Ｐｈｅ－６９５にＣ末端を有するアイソフォームＰＮＳ－Ｔａｕ（Ｐ１０６３６－１）の断片に対応するものである。
配列番号６（ｄＧＡＥ７３、ヒト／マウス、７３アミノ酸）：
配列番号６（ｄＧＡＥ７３、ヒト／マウス、７３アミノ酸）：
【0028】
ＰＨＦコアのさらなる断片は、配列番号７に記載されているように、残基Ｉｌｅ－３０８でＮ末端、残基Ｐｈｅ－３７８でＣ末端を持つタウ（２Ｎ４Ｒ）の残基３０８から３７８、または他の種で相同な位置にあるものである（言及した残基はヒトまたはマウスタウ配列を指し、この２つは、この領域で同一である）。
配列番号７（２Ｎ４Ｒの３０８～３７８残基、ヒト／マウス、７１アミノ酸）：
配列番号７（２Ｎ４Ｒの３０８～３７８残基、ヒト／マウス、７１アミノ酸）：
【0029】
タウタンパク質の好ましい一形態は、アミノ酸残基２９７～３９１に対応するタウタンパク質のｄＧＡＥ断片（２Ｎ４Ｒタウからの番号付けを使用）、好適には配列番号４による、その組換え形態である。精製後、ｄＧＡＥは主にランダムなコイル構造で存在し、主に可溶性のモノマーとダイマーの形態で構成される。
【0030】
本発明の方法に従って使用することができるタウの断片は、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含む断片である。任意選択的に、配列はそれに対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有することができる。
【0031】
したがって、そのような配列は、本明細書に記載の１つ以上の配列（配列番号を参照）に対して一定の割合の配列同一性を有するものとして定義される。配列の同一性は、簡便な方法で評価することができる。しかし、配列間の同一性の程度を判断するためには、配列のペアワイズアライメントやマルチプルアライメントを行うコンピュータプログラムが有用である。例えば、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ や ＥＭＢＯＳＳ ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（Ｒｉｃｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．， １６，（６） ｐｐ２７６－２７７， ２０００） をペアワイズ配列アライメントに使用することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｓｙｓｔ． Ｂｉｏｌ． ７：５３９， ２０１１） または ＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ， Ｒ．Ｃ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２（５）：１７９２－１７９７， ２００４） が多重配列アライメントに使用されるが、他の任意の適切なプログラムが使用され得る。ペアワイズアライメントであれマルチプルアライメントであれ、ローカルではなくグローバルに（つまり参照配列の全体にわたって）実行する必要がある。
【0032】
配列のアライメントとパーセント（％）同一性の計算は、例えば標準的な Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ のパラメータであるｍａｔｒｉｘ Ｇｏｎｎｅｔ， ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ ６， ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ １を使用して決定することができる。または、標準的なＥＭＢＯＳＳニードルのパラメータを使用することもできる：ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２， ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ １０， ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ ０．５。また、他の適切なパラメータを使用してもよい。
【0033】
本願では、異なる手法で得られた配列同一性値に争いがある場合、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅを用い、デフォルトパラメータでグローバルペアワイズアライメントを行った値を有効とするものとする。
【0034】
本発明の方法における使用のために、タウタンパク質の凝集体またはタウタンパク質（タウタンパク質の凝集体）の断片は、好適には、神経細胞への投与の前に、生理的緩衝液、例えばリン酸緩衝液（生理的ｐＨ、好適にはｐＨ７．４、例えばリン酸緩衝液）中に希釈され、好適には撹拌しながら生理温度でインキュベーション（好適には３７℃）することができる。リン酸塩緩衝液の好適な形態は、リン酸水素二ナトリウムと塩化ナトリウムの水溶液、または塩化カリウムとリン酸二水素カリウムの水溶液を含み得る。攪拌は、５００ｒｐｍ～１０００ｒｐｍ、例えば、７００ｒｐｍであってもよい。攪拌は、２４時間～９６時間、例えば、２４、時間、３６、時間、４８時間、６０時間、７２時間、または９６時間であってもよい。
【0035】
一例では、したがって、本発明の方法において使用するためのタウタンパク質またはその断片の凝集体の好適な調製物は、１００μＭのタンパク質を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、神経細胞への投与前に３７℃において好適には撹拌しながら、例えば７００ｒｐｍの速度で最大７２時間撹拌してインキュベートされ得る。
【0036】
神経細胞は、好適には、内因性形態のタウタンパク質を発現していてもよい。例えば、細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙは内因性のヒトタウタンパク質を発現する。したがって、神経細胞はタウタンパク質を発現するようにトランスフェクションされていない。
【0037】
神経細胞は、神経細胞株、例えば神経芽腫細胞株、例えば細胞株ＳＨ－ＳＹ５Ｙのものであってもよい。細胞は未分化であってもよく、その後、適切な増殖因子、例えばレチノイン酸の存在下で培養して分化させることができる。したがって、本発明の方法は、未分化の神経細胞、例えば未分化のＳＨ－ＳＹ５Ｙを使用してもよい。好適には、神経細胞は、分化した神経細胞、例えば、分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ（ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ）である。細胞が未分化細胞タイプである場合、本発明の方法は、したがって、未分化細胞を増殖因子の存在下で培養して分化させる最初の前段階を含んでもよい。成長因子は、レチノイン酸であってもよい。
【0038】
好適には、神経細胞株の細胞は、培養液、例えば低血清または無血清培養液、例えばＤＭＥＭ成長培地；またはリン酸緩衝生理食塩水で提供されてもよく、任意に分化因子および／または成長因子を補充される。本発明による神経細胞は、このような培地で培養することができる。
【0039】
未分化ＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞は、任意の一般的に適した成長培地、例えば、１０％ Ｆｏｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）および１％ Ｌ－Ｇｕｔａｍｉｎｅを補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２） で培養されうる。分化のために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、例えば２５，０００～３０，０００ｃｍ２、任意選択的に２４ウェルプレートの１ウェルあたり５０，０００細胞または６ウェルプレートの１ウェルあたり３００，０００細胞の密度でプレーティングすることが可能である。分化の初日に、培地を１０μＭのオールトランスレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む低血清培養液（１％ Ｆｏｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ） および１％ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２）に好適に置き換え、細胞を４８時間インキュベートしても良い。３日目には、このプロセスを新しいＲＡで繰り返し、細胞をさらに４８時間インキュベートすることができる。５日目には、無血清培地で１回洗浄し、微量の血清を除去することができる。５０ｎｇ／ｍｌ ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） を含む無血清培養液（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２， １％ Ｐ／Ｓ， １％ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）を加え、４８時間培養してもよい。分化した細胞（ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ）は、７日目には実験に使用できるように好適に準備される。
【0040】
神経細胞と薬剤とのインキュベーションは、最大１２時間～７２時間、例えば、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、または７２時間であってもよい。
【0041】
タウタンパク質の凝集体またはその断片は、０．０１μＭ～１００μＭの濃度、例えば１μＭ、５μＭまたは１０μＭで、細胞（２４ウェルプレートまたは６ウェルプレートにそれぞれ５０，０００～３００，０００／ウェルでプレーティング）または２５，０００～３０，０００／ｃｍ２に投与することができる。
【0042】
好適には、薬剤を用いた神経細胞の培養は、例えば１～２４時間、１～３６時間または１～４８時間など、薬剤が神経細胞によって内在化されるようにするために十分な時間実施される。
【0043】
タウタンパク質の凝集体またはその断片の神経細胞ステップへの投与は、タウタンパク質の凝集体またはその断片が神経細胞によって内在化されるような条件下、例えば２４～４８時間程度で実施される。
【0044】
本発明に従って使用される神経細胞に関する細胞毒性は、相対的な酸化ストレス、タウの内因性リクルートメント、神経細胞におけるリソソーム／ミトコンドリア損傷等の測定を含む、培養における細胞の生存率として定義することができる。
【0045】
毒性の低減は、細胞生存率、細胞形態、または神経細胞におけるタウタンパク質の細胞骨格分布によって判断することができる。
【0046】
本明細書に記載されているように、スクリーニングされる薬剤は、神経細胞へのタウタンパク質断片の投与に対して異なる時点、すなわち、タウタンパク質断片の投与前、またはタウタンパク質断片の投与後に神経細胞に添加することができる。
【0047】
したがって、本発明の方法は、試験される薬剤が、上記で定義されたタウタンパク質断片の細胞毒性を阻止または低減することができるかどうかを評価するために使用することができる。タウタンパク質断片の細胞毒性の低減は、薬剤の非存在下で上記で定義したタウタンパク質断片を用いて培養した神経細胞培養物の細胞死の割合と比較して、薬剤の存在下で上記で定義したタウタンパク質断片を用いて培養した神経細胞培養物の細胞死の割合の低減で示すことができる。
【0048】
好適には、工程（ｃ）における細胞毒性の阻害の判定は、神経細胞について、試験される薬剤の非存在下でタウタンパク質またはその断片の凝集体とインキュベートした場合の対照値との比較を含むことができる。細胞毒性の判定は、対照処理細胞（薬剤の非存在下で上記に定義したタウタンパク質断片とインキュベートした神経細胞）に対するパーセンテージとして表すことができる。上記で定義したタウタンパク質断片の毒性に関する参照レベルは、任意のアッセイで使用される上記で定義したタウタンパク質断片の濃度に対する絶対毒性レベルを提供するバッファ処理細胞を参照して確立することも可能である。
【0049】
アッセイの結果が、薬剤が細胞毒性を防止または低減できることを示したかどうかを確定するための適切な方法は、統計的検定、すなわち差の有意性を調べる統計的検定（例えば、対応のないｔ検定）であろう。したがって、この減少は、細胞毒性において統計的に有意な減少である可能性がある。例えば、タウタンパク質の細胞毒性断片は、対照培養液、例えば低血清または無血清培養液、例えばＤＭＥＭ成長培地；またはリン酸緩衝生理食塩水中の神経細胞培養物の細胞死２０％の対照値と比較して、神経細胞培養物の細胞死を４０％～６０％もたらすことができる。
【0050】
本発明の方法による細胞毒性のアッセイは、好適には、薬剤なしで、または処理用ビヒクルで処理した細胞について得られた結果に対して正規化することができる。約２μＭ以下の適当な濃度の薬剤で５０％の阻害を示す化合物は、細胞毒性の活性阻害剤とみなすことができる。したがって、相対的な活性はまた、本明細書に記載される本発明の方法に従って、異なる薬剤について比較することができる。
【0051】
あらゆる物質の細胞毒性は、細胞生存率アッセイによって評価することができる。細胞生存率アッセイは、例えば、（ｉ）蛍光アッセイ；（ｉｉ）比色アッセイ；（ｉｉｉ）ルミノメトリックアッセイ；または（ｉｖ）色素排除アッセイなどの一般的に適した任意の方法を使用して実施することができる。
【0052】
細胞毒性に関する蛍光測定法には、以下のものがある。ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）， ｒｅｓａｚｕｒｉｎ， ａｌａｍａｒＢｌｕｅ ａｓｓａｙまたはＣＦＤＡ－ＡＭ ａｓｓａｙ． 細胞毒性の比色測定法としては、以下のものがある。ＭＴＴアッセイ、ＭＴＳアッセイ、ＸＴＴアッセイ、ＷＳＴ－１アッセイ、ＷＳＴ－８アッセイ、ＬＤＨアッセイ、ＳＲＢアッセイ、ＮＲＵアッセイ、またはクリスタルバイオレットアッセイ。細胞毒性のルミノメトリックアッセイには、以下のものがある。ＡＴＰアッセイまたはリアルタイム・バイアビリティ・アッセイ。細胞毒性に関する色素排除アッセイには、以下のものがある。ＴＵＮＥＬ、Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ、ｅｏｓｉｎ、Ｃｏｎｇｏ ｒｅｄ、ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎｅ Ｂアッセイ。
【0053】
細胞生存率や細胞毒性の蛍光測定は、蛍光顕微鏡、蛍光光度計、蛍光マイクロプレートリーダー、フローサイトメーターなどを用いて簡単に行うことができ、従来の色素排除法や比色法よりも多くの利点がある。蛍光測定法は、接着細胞株や浮遊細胞株にも適用でき、使用も容易である。したがって、本発明の方法に従って、タウタンパク質またはその断片の凝集体の神経細胞に対する細胞毒性に対する対象薬剤の効果を評価する際には、蛍光測定法が好ましいと考えられる。
【0054】
このような蛍光法によるアプローチの１つとして、好適には、示差蛍光法によるアプローチを用いることができる。タウタンパク質またはその断片の凝集体を神経細胞集団、例えばｄＧＡＥに添加した後、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞の生存率を測定することができる。キットには、すべての細胞を標識できるＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）試薬（青）と死細胞のみを標識できるＮｕｃＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬（緑）が含まれる。タウタンパク質またはその断片、例えばｄＧＡＥのタグ付き凝集体については、ＮｕｃＲｅｄ（登録商標）試薬を用いて死細胞（赤）を標識することができる。
【0055】
神経細胞は、好適には、３７℃で１５分間、試薬とともにインキュベートすることができる。ＤＡＰＩ蛍光は、Ｇ ３６５励起フィルターとＬＰ ４２０発光フィルターを使用し、ＦＴ ３９５ダイクロイックを用いて撮影することができる。ＦＩＴＣフィルターセット（ＢＰ ４５０－４９０励起フィルター、ＢＰ ５１５－５６５ 発光フィルター、ＦＴ ５１０ダイクロイック）を用いて緑色蛍光を捕らえることもできる。
【0056】
バッファ処理による細胞死の割合は、画像をグレースケールに変換した後、手動で閾値を調整し、２値画像に変換してＤＡＰＩ染色された生きた細胞を強調することで定量化することができる。細胞数は自動カウントされてもよい。死細胞も同様にカウントし、細胞死をバッファ処理した細胞に対するパーセンテージで表すことができる。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、蛍光強度のバルク測定に使用することもできる。タウタンパク質の内在化された非標識断片の定量は、免疫蛍光法を用いて決定することができる。また、タウタンパク質の非標識断片は、チオフラビンＳ（ＴｈＳ）染色などを用いて測定することができる。
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、蛍光強度のバルク測定に使用することもできる。タウタンパク質の内在化された非標識断片の定量は、免疫蛍光法を用いて決定することができる。また、タウタンパク質の非標識断片は、チオフラビンＳ（ＴｈＳ）染色などを用いて測定することができる。
【0057】
比色分析法は、細胞の代謝活性を評価するために生化学的マーカーを測定する。比色分析に用いられる試薬は、細胞の生存率に応じて発色するため、分光光度計で細胞の生存率を比色測定することができる。発色測定は、付着性または浮遊性の細胞株に適用可能である。
【0058】
ルミノメトリックアッセイは、哺乳類細胞における細胞増殖および細胞毒性を迅速かつ簡便に測定することができる。これらのアッセイは、便利な９６ウェルおよび３８４ウェルのマイクロタイタープレートフォーマットで行うことができ、ルミノメトリックマイクロプレートリーダーで検出することができる。
【0059】
細胞毒性を評価する方法として、最も簡便で広く用いられているのが色素排除法である。色素排除法では、生細胞は色素を排除するが、死細胞は色素を排除しない。このような色素としては、エオシン、コンゴレッド、エリスロシンＢ、トリパンブルーなど様々なものを使用することができる。
【0060】
本発明のシステムは、タウタンパク質またはその断片の凝集体が神経細胞に対して及ぼす影響を変化させる目的の薬剤の有効性を評価するために用いることができる。薬剤は、化合物または生体分子を含む任意の薬学的に活性な分子または物質であってよく、好適には、抗体（例えば、二重特異性抗体を含むポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、またはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ断片、ダイアボディ、若しくはそれらのバリアントまたは誘導体等の抗体断片）等の特異結合分子を挙げることができる。薬剤は、直接投与してもよいし、適切なアジュバント、希釈剤または溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水のような適切な生理的緩衝溶液）中に配合してもよいし、当技術分野で周知の標準技術を使用して医薬製剤として製剤化してもよい。
【0061】
本発明の方法は、活性が既知の陽性対照としての薬剤の活性を確立する工程を含んでいてもよい。陽性対照として使用するためのタウタンパク質の断片に対する阻害活性が確立された既知の試験化合物の例としては、メチレンブルー（ＭＢ；塩化メチルチオニニウムとしても知られている）またはＬＭＴ（ロイコ－メチルチオニニウムビス－ヒドロメタンスルホン酸、ＬＭＴＭ；ＬＭＴ－ＸまたはＴＲｘ０２３７としても知られている）などが考えられるが、これらに限定されない。本発明の方法に従ってアッセイされた薬剤の活性は、陽性対照と比較することができる。
【0062】
本発明の方法は、陰性対照（活性が知られていない）を用いて、薬剤の活性がないことのベースラインを確立する工程を含んでもよい。適切な陰性対照の例としては、神経細胞用の培養液、リン酸緩衝生理食塩水などを挙げることができる。本発明の方法に従ってアッセイされた薬剤の活性は、陰性対照と比較することができる。
【0063】
任意選択的に、本発明の方法は、タウオパチーを有する対象を前記薬剤で治療する工程をさらに含み、任意選択的に、タウオパチーの治療に適した別の治療的活性物質をさらに含むことができる。
【0064】
したがって、本発明は、被験者の神経細胞におけるタウタンパク質の異常蓄積によって特徴付けられるタウオパチーまたは疾患の治療における薬剤の有効性を評価するために使用できる、タウタンパク質またはその断片の凝集体の挙動に対する薬剤の効果を研究するためのシステムを提供するものである。
【0065】
タウタンパク質の凝集は、「タウオパチー」と呼ばれる疾患の特徴である。神経細胞および／またはグリアにおける顕著なタウ病理を特徴とする様々なタウオパチー障害が認識されており、この用語は数年前から当技術分野で使用されている。これらの病的封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｓ）とＡＤなどの疾患に特徴的なタウ封入体との類似性は、構造的特徴を共有しており、観察される臨床表現型の違いの原因は、病的封入体の局在分布にあることを示す。特に、ＡＤ、ピック病（前頭側頭型認知症のサブタイプ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、皮質基底変性症（ＣＢＤ）における凝集タウの低温電子顕微鏡構造がこれまでに得られており、すべて共通の構造的特徴を示していることから、例えば、ＡＤで見られるようなＰＨＦのタウ凝集を調節する能力のある化合物は、他のタウオパチーにおけるタウの凝集も調節できる可能性があることが示されている。後述する特定の疾患に加えて、当業者は、認知または行動症状の組み合わせによって、さらに、ＷＯ ０２／０７５３１８に記載されているものなど、ＰＥＴまたはＭＲＩを用いて可視化される凝集タウに対する適切なリガンドの使用によって、タウオパチーを特定することが可能である。
【0066】
アルツハイマー病（ＡＤ）と同様に、ピック病や進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）などの神経変性疾患の病因は、新皮質の歯状回や星状錐体細胞における病的な切断型タウ凝集体の蓄積と相関していると考えられている。関連するタウオパチー（またはタウ関連認知症）には以下を含む：前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、１７ 番染色体に連鎖するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、ｄｉｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ－ｄｅｍｅｎｔｉａ－ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ－ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＤＰＡＣ）、掌蹠膿胞腎変性症（ＰＰＮＤ）、グアム－ＡＬＳ症候群、ｐａｌｌｉｄｏ－ｎｉｇｒｏ－ｌｕｙｓｉａｎ変性（ＰＮＬＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡｇＤ）、拳闘家痴呆（ＤＰ）（トポグラフィーは異なるものの、ＮＦＴはＡＤで観察されるものと類似）（Ｂｏｕｒａｓ ｅｔ ａｌ， １９９２）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、ＤＰおよびスポーツに関連した脳震盪を繰り返すタウオパチー（ＭｃＫｅｅ， ｅｔ ａｌ．２００９．）その他はＷｉｓｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．２０００に詳細な議論がある（特に表５．１）。
【0067】
ＮＦＴの異常なタウは、ダウン症（ＤＳ）（Ｆｌａｍｅｎｔら、１９９０）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９４）でも見られる。タウ陽性のＮＦＴは、後脳症性パーキンソニズム（ＰＥＰ）にも見られる（Ｃｈａｒｐｉｏｔら、１９９２）。亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）では、グリアタウタングルが観察される（池田ら、１９９５）。他のタウオパチーには、ニーマン・ピック病Ｃ型（ＮＰＣ）（Ｌｏｖｅら、１９９５）、サンフィリッポ症候群Ｂ型（またはムコ多糖症ＩＩＩ Ｂ、ＭＰＳ ＩＩＩ Ｂ）（Ｏｈｍら、２００９）、筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、ＤＭ１（Ｓｅｒｇｅａｎｔら、２００１およびそこに引用されている文献）およびＤＭ２（Ｍａｕｒａｇｅら、２００５）などがある。さらに、タウの病理は、軽度認知障害（ＭＣＩ）を含む認知障害および低下により一般的に寄与する可能性もあるという文献上のコンセンサスが高まっている（Ｂｒａａｋ， ｅｔ ａｌ．， ２００３， Ｗｉｓｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ， ２０１８などを参照）。
【0068】
異常なタウ凝集を主な特徴とするこれらの疾患はすべて、本明細書では「タウオパチー」または「タウタンパク質凝集の疾患」と呼ぶ。タウオパチーに関する本発明の態様において、タウオパチーは、本明細書で定義される任意のタウオパチーから選択され得る。
【0069】
タウオパチーは、以下からなる群から選択され得る：アルツハイマー型認知症、原発性加齢性タウオパチー（ＰＡＲＴ）、神経原線維変化優勢型老人性認知症、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、前頭側頭型認知症および１７番染色体に連鎖するパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、ピック病、ｄｉｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ－ｄｅｍｅｎｔｉａ－ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ－ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＤＰＡＣ）、掌蹠膿胞腎変性症（ＰＰＮＤ）、グアム－ＡＬＳ症候群、ｐａｌｌｉｄｏ－ｎｉｇｒｏ－ｌｕｙｓｉａｎ変性（ＰＮＬＤ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡｇＤ）、ダウン症（ＤＳ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、後脳症性パーキンソニズム（ＰＥＰ）、拳闘家痴呆（ＤＰ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、虚血、リティコ・ボディグ病（グアムのパーキンソン認知症複合体）、神経膠腫、神経膠細胞腫、髄膜血管腫症、後脳症性パーキンソニズム（ＰＥＰ）、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）、鉛脳症、結節性硬化症、パントテン酸キナーゼに関連した神経変性、リポフスチン症、および軽度認知障害（ＭＣＩ）。
【0070】
タウオパチーがアルツハイマー病であり得る。
【0071】
また、本発明は、予防としての治療も包含している。治療は予防的治療であり得る。治療は、能動的な免疫によるものと受動的な免疫によるものとがある。
【0072】
アクティブなタウの免疫化は、単一または複数のリン酸化エピトープ、アミノ末端、全長の正常タウおよび変異タウ、または凝集タウを標的として、タウ病理を軽減することが示されている。病的なタウの減少が得られ、副作用もほとんど報告されておらず、免疫反応が長期間持続することから、積極的な免疫療法が期待されている。しかし、ネイティブなタンパク質に対する抗体を惹起することは、常に有害な免疫反応や正常なタンパク質の有害な標的化のリスクを伴う。
【0073】
受動的な予防接種は、能動的な戦略から生じる安全性の懸念に対する解決策となる可能性がある。患者自身が抗体を作ることはなく、免疫の効果は一過性であると考えられるため、免疫学的な副作用のリスクは軽減される。また、受動免疫では、標的とするエピトープに対する特異性がより高い。また、抗体は、タウの病態の広がりを阻害することで、病気の進行を修正する可能性もある。
【0074】
したがって、本発明の方法により同定された、対象の神経細胞におけるタウタンパク質の異常蓄積を特徴とするタウオパチーまたは疾患に対して治療効果を有する薬剤は、早期のタウオパチーおよび／または軽度の症状を特徴とするタウオパチーの治療に使用することができる。本剤は、軽度認知障害（ＭＣＩ）の治療に使用するものであってもよい。
【0075】
本剤は、タウオパチーを発症するリスクのある対象におけるタウオパチーの治療に使用するためのものであってもよい。タウオパチーを発症するリスクのある対象者は、病歴、身体検査、神経学的検査、脳画像、精神状態検査（Ｍｉｎｉ－Ｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｅ Ｅｘａｍ（ＭＭＳＥ）やＭｉｎｉ－Ｃｏｇ検査など）、コンピュータ認知検査（Ｃａｎｔａｂ Ｍｏｂｉｌｅ、Ｃｏｇｎｉｇｒａｍ、Ｃｏｇｎｉｖｕｅ、Ｃｏｇｎｉｓｉｏｎ、Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｍｅｔｒｉｃｓ（ＡＮＡＭ）などのデバイス）、気分評価および遺伝子検査など、１つ以上の適切な手段によって同定され得る。
【0076】
当業者は、タウオパチーの診断は、死後まで必ずしも確定的でない場合があることを認識している。したがって、本剤は、タウオパチーを発症するリスクのある対象におけるタウオパチーの治療に使用するためのものであってもよい。対象は、タウオパチーが疑われる場合がある。対象は、タウオパチーの１つ以上の症状を有していてもよい。本剤は、タウオパチーまたはその疑いのあるタウオパチーの進行を遅らせるために使用することができる。
【0077】
本明細書で使用される場合、用語「治療上有効量」は、所望の治療レジメンに従って投与された場合に、妥当な利益／リスク比に見合った、ある所望の治療効果をもたらすために有効な、本発明の組み合わせ方法論の実施に使用される薬剤の量に関連するものである。
【0078】
以上説明したように、本発明は予防的手段としての治療も包含している。例えば、本発明は、対照のタウオパチーの予防的治療方法を提供し、この方法は、本発明の方法によって同定された薬剤を前記対象に投与することを含む。
【0079】
本明細書で使用する「予防的有効量」という用語は、本発明の方法によって同定された薬剤のうち、所望の治療レジメンに従って投与した場合に、妥当な利益／リスク比に見合った、何らかの所望の予防効果をもたらすために有効な量に関するものである。本明細書の文脈における「予防」は、完全な成功すなわち完全な保護または完全な予防を包含すると理解されるべきではない。この文脈での予防とは、むしろ、症状のある状態を発見する前に、その特定の状態を遅延、軽減または回避するのを助けることによって健康を維持することを目的として投与される手段を指す。
【0080】
本発明の第２およびそれ以降の態様の好ましい特徴は、第１の態様に関して準用される。
【0081】
本発明の第２の態様によれば、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片の内在化阻害に有効な薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法が提供される。
（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質の断片とともに神経細胞を培養すること；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養すること；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実行した後の神経細胞におけるタウタンパク質断片の内在化を決定すること。
（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質の断片とともに神経細胞を培養すること；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養すること；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実行した後の神経細胞におけるタウタンパク質断片の内在化を決定すること。
【0082】
本明細書に記載されているように、上記で定義されたタウタンパク質断片の内在化は、不溶性タウ種（すなわち凝集体）の生成、内因性全長タウタンパク質の異常リン酸化および切断をもたらす。
【0083】
本明細書に記載されるタウタンパク質断片の内在化の阻害は、免疫蛍光法および／または透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いてアッセイすることができる。このような技術は、活性剤の存在下で神経細胞によって内在化されたタウタンパク質の断片の相対的な量を示すことができる。既知の阻害活性を有する薬剤の既知の活性レベルと薬剤非存在下でのベースライン活性を確立するために、適切な陽性対照および陰性対照も本明細書に記載したようにそれぞれ調製することができる。
【0084】
免疫蛍光法を用いる方法では、本明細書に記載のタウタンパク質の断片は、検出可能な蛍光標識で標識されていてもよい。本方法は、本明細書に記載のタウタンパク質断片を特異的に認識し結合する、適切なフルオロフォアに連結した単一の（一次）抗体を使用することができる。あるいは、本方法は、２つの抗体を使用することができ、この場合は非標識の第１の（一次）抗体は本明細書に記載されたタウタンパク質断片を特異的に認識して結合し、フルオロフォアで標識された二次抗体は一次抗体を認識して結合する。
【0085】
イムノゴールド透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）は、本明細書で定義するタウタンパク質断片を特異的に認識し結合する抗体に付着させたコロイド金粒子を使用する。コロイド金粒子は、本明細書で定義されるタウタンパク質断片を特異的に認識して結合する一次抗体に付着させてもよい。または、本明細書に記載されるように、タウタンパク質断片を特異的に認識し結合する一次抗体を特異的に認識し結合する二次抗体に、コロイド金粒子を結合させてもよい。
【0086】
本明細書に記載されるタウタンパク質断片の内在化は、検出可能に標識されたタウタンパク質断片、例えば蛍光標識されたタウタンパク質断片を用いてアッセイすることもできる。
【0087】
したがって、神経細胞におけるタウタンパク質断片の内在化の阻害を決定する工程は、神経細胞に内在化したタウタンパク質断片の相対量を可視化するために、写真またはＴＥＭを使用してもよい。
【0088】
本明細書に記載されるように処理された細胞の免疫蛍光法および免疫金透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）は、上記に定義されるタウタンパク質の断片、例えばｄＧＡＥが、細胞のエンドソーム／リソソーム区画内に蓄積することを明らかにする。
【0089】
インキュベーション後、神経細胞を画像化し、例えば「ＩｍａｇｅＪ」のような適切な解析プログラムを用いて解析を行い、細胞体内の蛍光強度を定量して内在化の読み出しを行い、統計解析を実施して陽性および陰性対照と薬剤処理サンプルの蛍光強度を比較することができる。細胞数をカウントすることで、視野内の細胞数の違いを考慮し、平均蛍光強度／細胞として内在化のレベルを表すことができる。
【0090】
アッセイの結果が、薬剤がタウタンパク質断片の内在化を阻害できることを示したかどうかを確定するための好適な方法は、統計的検定、すなわち差の有意性を調べる統計的検定（例えば、対応のないｔ検定）により実施することができる。したがって、この減少は、統計的に有意な内在化の減少である可能性がある。例えば、内在化の阻害剤として機能することができるタウタンパク質断片は、対照培養液、例えばＤＭＥＭ成長培地中の神経細胞培養の２０％の阻害という対照値と比較して、神経細胞培養におけるタウタンパク質断片の内在化の４０％～６０％の阻害をもたらすことができる。
【0091】
本発明の方法によるタウタンパク質断片の内在化阻害のアッセイは、好適には、薬剤無しまたは処理用ビヒクルで処理した細胞について得られた結果に対して正規化することができる。約２μＭ以下の適切な濃度の薬剤で５０％の阻害を示す化合物は、内在化の活性阻害剤と見なすことができる。したがって、相対的な活性はまた、本明細書に記載される本発明の方法に従って、異なる薬剤について比較することができる。
【0092】
本発明の方法は、活性が既知の陽性対照としての薬剤の活性を確立する工程を含んでいてもよい。陽性対照として使用するためのタウタンパク質の断片に対する阻害活性が確立された既知の試験化合物の例としては、メチレンブルー（ＭＢは塩化メチルチオニニウムとしても知られている）またはＬＭＴ（ロイコ－メチルチオニニウムビス－ヒドロメタンスルホン酸、ＬＭＴＭ；ＬＭＴ－ＸまたはＴＲｘ０２３７としても知られている）などが考えられるが、これらに限定されない。本発明の方法に従ってアッセイされた薬剤の活性は、陽性対照と比較することができる。
【0093】
本発明の方法は、陰性対照（活性が知られていない）を用いて、薬剤の活性がないことのベースラインを確立する工程を含んでもよい。適切な陰性対照の例としては、神経細胞用の培養液、リン酸緩衝生理食塩水などを挙げることができる。本発明の方法に従ってアッセイされた薬剤の活性は、陰性対照と比較することができる。
【0094】
任意選択的に、本発明の方法は、タウオパチーを有する対象を前記薬剤で治療する工程をさらに含み、任意選択的に、タウオパチーの治療に適した別の治療的活性物質をさらに含むことができる。
【0095】
本発明の第３の態様によれば、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用を破壊するために有効な薬剤のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法が提供される：
（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質の断片とともに神経細胞を培養すること；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実行した後に、タウタンパク質断片と神経細胞内の内因性タウタンパク質との相互作用の程度を決定する工程。
（ａ）薬剤の存在下で神経細胞を培養し、その後、ヘパリンの非存在下でタウタンパク質の断片とともに神経細胞を培養すること；または
（ｂ）ヘパリンの非存在下でタウタンパク質断片とともに神経細胞を培養し、その後、薬剤の存在下で神経細胞を培養する工程；および
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）を実行した後に、タウタンパク質断片と神経細胞内の内因性タウタンパク質との相互作用の程度を決定する工程。
【0096】
タウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との間の相互作用の破壊は、本明細書に記載されるように、免疫蛍光法および／または免疫金透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて好適にアッセイされ得る。
【0097】
本明細書に記載されているように、上記で定義されたタウタンパク質断片の内在化は、不溶性タウ種の生成、内因性全長タウタンパク質の異常リン酸化および切断をもたらす。
【0098】
処理された細胞の免疫蛍光法および免疫金ＴＥＭにより、タウタンパク質またはその断片、例えばｄＧＡＥの凝集体が、細胞のエンドソーム／リソソーム区画内に蓄積していることが明らかにされた。タウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用の破壊は、タウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用の阻害と記載することができる。
【0099】
したがって、神経細胞におけるタウタンパク質断片と内在性タウタンパク質との間の相互作用の破壊を決定する工程は、神経細胞におけるタウタンパク質断片と内在性タウタンパク質との相対的相互作用を視覚化するために、写真またはＴＥＭを使用することができる。
【0100】
本明細書に記載されるように、免疫蛍光法および／または免疫金ＴＥＭは、活性剤の存在下で、タウタンパク質断片と、神経細胞によって内在化された内因性タウタンパク質との間の相互作用の相対的破壊を示すために使用することができる。既知の阻害活性を有する薬剤の既知の活性レベルと薬剤非存在下でのベースライン活性を確立するために、適切な陽性対照および陰性対照も本明細書に記載したようにそれぞれ調製することができる。
【0101】
アッセイの結果が、薬剤がタウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用を破壊できることを示したかどうかを確定する好適な方法は、統計的検定、すなわち差異の有意性を調べる統計的検定（例えば、対応のないｔ検定）により実施され得る。したがって、この減少は、タウの断片と内因性タウタンパク質との相互作用の破壊を統計的に有意に減少させるものであると考えられる。例えば、相互作用の破壊として機能することができるタウタンパク質断片は、対照培養液、例えばＤＭＥＭ成長培地中の神経細胞培養の２０％阻害という対照値と比較して、神経細胞培養におけるタウタンパク質断片の内因性タウタンパク質との相互作用を４０～６０％阻害する結果となる場合がある。
【0102】
本発明の方法によるタウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用の破壊のアッセイは、好適には、薬剤無しまたは処理ビヒクルで処理した細胞について得られた結果に対して正規化することができる。約２μＭ以下の適切な濃度で薬剤と５０％の活性を示す化合物は、相互作用の活性阻害剤であると考えることができる。したがって、相対的な活性はまた、本明細書に記載される本発明の方法に従って、異なる薬剤について比較することができる。
【0103】
本発明の方法は、活性が既知の陽性対照としての薬剤の活性を確立する工程を含んでいてもよい。陽性対照として使用するためのタウタンパク質の断片に対する阻害活性が確立された既知の試験化合物の例としては、メチレンブルー（ＭＢは塩化メチルチオニニウムとしても知られている）またはＬＭＴ（ロイコ－メチルチオニニウムビス－ヒドロメタンスルホン酸、ＬＭＴＭ；ＬＭＴ－ＸまたはＴＲｘ０２３７としても知られている）などが考えられるが、これらに限定されない。本発明の方法に従ってアッセイされた薬剤の活性は、陽性対照と比較することができる。
【0104】
本発明の方法は、陰性対照（活性が知られていない）を用いて、薬剤の活性がないことのベースラインを確立する工程を含んでもよい。適切な陰性対照の例としては、神経細胞用の培養液、リン酸緩衝生理食塩水などを挙げることができる。本発明の方法に従ってアッセイされた薬剤の活性は、陰性対照と比較することができる。
【0105】
任意選択的に、本発明の方法は、タウオパチーを有する対象を前記薬剤で治療する工程をさらに含み、任意選択的に、タウオパチーの治療に適した別の治療的活性物質をさらに含むことができる。
【0106】
本発明の第４の態様によれば、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片の細胞毒性の阻害に有効な薬剤をスクリーニングするためのシステムであって、（ｉ）神経細胞系、（ｉｉ） ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片、またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列、および（ｉｉｉ） 薬剤のライブラリを含み、神経細胞株がヘパリンを含まない、システムが提供される。
【0107】
薬剤のライブラリは、神経細胞に対する本明細書に記載のタウタンパク質またはその断片の凝集体の影響を変化させることができる、本明細書に記載の任意の関心ある薬剤を含んでいてもよい。薬剤は、化合物または生体分子を含む任意の薬学的に活性な分子または物質であってよく、好適には、抗体のような特異的結合分子である。ライブラリは、化学化合物のライブラリであってもよいし、特定の結合分子のライブラリであってもよい。
【0108】
このような本発明のシステムは、神経細胞株の細胞集団；ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片を含むタウタンパク質断片；および薬剤のライブラリを含む部品のキットの形態で提供されてもよく；ここで、神経細胞株は、ヘパリンを含まないものである。このような本発明のシステムまたは部品のキットは、使用説明書も提供され得る。細胞は、本明細書に記載されるような適切な成長培地または培養培地中に提供され得る。また、細胞は適当な容器に収容して提供することもできる。
【0109】
本発明のシステムに関する第４およびそれ以降の態様の他の好ましい特徴は、上述の通りである。
【0110】
本発明の第５の態様によれば、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片の内在化阻害に有効な薬剤のスクリーニングシステムであって、（ｉ）神経細胞株、（ｉｉ）ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片、またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列、および（ｉｉｉ）薬剤のライブラリを含むスクリーニングシステムであって、神経細胞系はヘパリンを含まない、システムが提供される。
【0111】
薬剤のライブラリは、神経細胞に対する本明細書に記載のタウタンパク質またはその断片の凝集体の影響を変化させることができる、本明細書に記載の任意の関心ある薬剤を含んでいてもよい。薬剤は、化合物または生体分子を含む任意の薬学的に活性な分子または物質であってよく、好適には、抗体のような特異的結合分子である。ライブラリは、化学化合物のライブラリであってもよいし、特定の結合分子のライブラリであってもよい。
【0112】
このような本発明のシステムは、神経細胞株、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片、および薬剤のライブラリを含む部品のキットの形態で提供されてもよく、神経細胞株は、ヘパリンを含まないものである。
【0113】
本発明の第６の態様によれば、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片と内因性タウタンパク質との相互作用を阻害するために有効な薬剤をスクリーニングするためのシステムであって、（ｉ）神経細胞系、（ｉｉ）ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列中の少なくとも７０アミノ酸からなるタウタンパク質断片、またはそれと少なくとも８５％同一性を有する配列、および（ｉｉｉ） 薬剤のライブラリを含み、神経細胞株はヘパリンを含まない、システムが提供される。
【0114】
薬剤のライブラリは、神経細胞に対する本明細書に記載のタウタンパク質またはその断片の凝集体の影響を変化させることができる、本明細書に記載の任意の関心ある薬剤を含んでいてもよい。薬剤は、化合物または生体分子を含む任意の薬学的に活性な分子または物質であってよく、好適には、抗体のような特異的結合分子である。ライブラリは、化学化合物のライブラリであってもよいし、特定の結合分子のライブラリであってもよい。
【0115】
このような本発明のシステムは、神経細胞株、ｄＧＡＥ９５（配列番号４）のアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも８５％同一性を有する配列中の少なくとも７０アミノ酸を含むタウタンパク質断片、および薬剤のライブラリを含む部品のキットの形態で提供されてもよく、神経細胞株は、ヘパリンを含まないものである。
【0116】
本開示は、本明細書で定義されるタウタンパク質の可溶性および断片、すなわちタウタンパク質の凝集形態、例えばタウタンパク質断片ｄＧＡＥの細胞内取り込みをどのように探索することができるかを説明する。分化したＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞へのタウの内在化がもたらす下流の結果は、構造および生化学的分析とともに、蛍光および電子顕微鏡を使用して調べることができる。
【0117】
本発明の任意の態様の方法またはシステムの一実施形態では、未分化の神経細胞は、マルチウェルプレートに適当な濃度（例えば、１ウェル当たり３０，０００細胞）でプレーティングし、前述のように枯渇血清培地でレチノイン酸を用いて分化させるか、未分化のままにしておくことができる。次に、細胞は以下のいずれかの方法で処理することができる。
【0118】
（１）本明細書で定義されるタウタンパク質の断片（このような断片はタウ凝集体とも呼ばれ得る）を加える前に、細胞を目的の薬剤の存在下でプレインキュベーションする；または（２）細胞を目的の薬剤およびタウ凝集体を同時に投与して共にインキュベートする。
【0119】
各ステージで１２時間、２４時間、４８時間インキュベートすることができる。例えば、２４時間培養した場合、（１）の合計時間は４８時間、（２）の合計時間は２４時間となる。例えば、本明細書に記載されているように、タウタンパク質断片ｄＧＡＥ－４８８（例えば１μＭの濃度で使用）は、内在化タウタンパク質が見られるのに十分である２４時間、細胞とインキュベートされ得る。
【0120】
インキュベーション後、細胞を写真撮影し、適切な解析ソフトウェアプログラム（例えばＩｍａｇｅＪ）を用いて画像の解析を行い、細胞体内の蛍光強度を定量化することができる。蛍光強度を定量化することで、タウタンパク質の内在化の指標を得ることができる。
【0121】
視野内の細胞数の違いを考慮し、細胞数をカウントして平均蛍光強度／細胞で内在化のレベルを表すことができる。
【0122】
一実施形態では、タウタンパク質の断片、例えばｄＧＡＥ－４８８は、適切な濃度、例えば約１μＭで添加することができる。スクリーニングのための薬剤は、最初は単一の濃度、例えば１０μＭでテストすることができる。阻害活性を示す薬剤を、例えば約２μＭから約２０ｎＭの濃度範囲で試験し、例えば５０％の活性阻害が観察される濃度として化合物の活性を報告することができる。
【0123】
本発明の方法またはシステムに従って測定される活性は、本明細書に記載されるように、以下を含むことができる。（ｉ）タウの内在化（例えば、本明細書に記載の検出可能に標識されたタウタンパク質断片の細胞内蛍光によって測定される）；（ｉｉ）本明細書に記載の検出可能に標識されたタウタンパク質断片の細胞内凝集（例えば、細胞を採取し、溶解して、超遠心分離によってタウタンパク質の凝集標識断片を分離して凝集タウ（例えば抗タウ抗体による免疫染色によって測定することによって測定する）、および（ｉｉｉ）本明細書に記載のタウタンパク質断片の細胞毒性（例えば、細胞死を測定するために適切な細胞毒性アッセイ（例えば、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）アッセイ）を使用して測定する）（例えば、図２Ａを参照）。
【0124】
活性は、薬剤なしまたは処理用ビヒクルで処理した細胞で得られた結果に対して正規化することができる。好適には、２μＭ以下で試験した薬剤で５０％の阻害を示す化合物が活性とみなされる。また、本明細書に記載された方法およびシステムにより、異なる薬剤について相対的な活性を比較することができる。
【0125】
本明細書に記載された研究の結果、集合したｄＧＡＥは可溶性の非凝集型よりも急性細胞毒性を示すことが示された。一方、可溶型はより容易に細胞内に内在化され、細胞内に入ると内因性タウと結合し、内因性タウのリン酸化と凝集を促進し、細胞内のリソソーム／エンドソーム区画に蓄積させることができる。可溶性オリゴマーは急性毒性を持たずにタウの病態を伝播させることができるようだ。したがって、本明細書に記載の研究は、本明細書に記載のタウタンパク質断片の細胞毒性、本明細書に記載のタウタンパク質断片の内在化および／または内因性タウタンパク質と本明細書に記載のタウタンパク質断片との相互作用によって測定される、タウタンパク質断片の活性を阻害する薬剤の活性を決定する方法およびシステムを提供するものである。
【0126】
本結果は、凝集したｄＧＡＥは細胞毒性を示し、可溶性の非繊維状のｄＧＡＥは急性毒性を示さず、神経細胞様細胞に取り込まれることを示している。内在化すると、不溶性タウの生成、リン酸化の異常、内因性全長タウの切断が起こる。処理した細胞の免疫蛍光法およびイムノゴールドＴＥＭにより、ｄＧＡＥが細胞のエンドソーム／リソソーム区画内に蓄積していることが明らかになった。タウ断片の内在化は、細胞毒性、不溶性タウ種への凝集、タウの切断／リン酸化といった下流工程に影響を及ぼす。
【0127】
本明細書に記載された実験の２４時間枠において、分化した神経芽細胞腫細胞を凝集型ｄＧＡＥに曝露した後に細胞死の増加が観察されたが、可溶型ｄＧＡＥで処理した細胞の生存率にはほとんど差がなかった。
【0128】
今回使用した条件下では、凝集したｄＧＡＥは２４時間の培養期間後、分化した神経芽腫細胞に対してより急性毒性を示すようであった。高濃度でも毒性は低いが、可溶型のｄＧＡＥは暴露２時間以内に分化した神経芽細胞腫細胞に内在化された。攪拌後、ｄＧＡＥ－４８８はより効率的に内在化される。本研究では、凝集した調製物を用いていくつかの内部化が観察されたが、これらはフィラメント調製中に溶液中に残留した可溶性または部分可溶性の種である可能性がある。攪拌されたｄＧＡＥ－４８８には、タウの集合体のサイズが混在しており、一部は内在化され、一部は内在化されないようである。内在化される正確な種はまだ解明されていないが、可溶性ｄＧＡＥ調製物は直径１０－８０ｎｍの凝集体からなり、多様なオリゴマー形態を示唆している（図１Ａ）。
【0129】
さらに、０ｈ ｄＧＡＥが毒性を示すようになるまでの時間は、これらの実験の時間枠よりも長い可能性がある。本明細書に記載された内在化は、凝集にも細胞への取り込みにも外来因子を必要としない。
【0130】
本研究では、可溶性ｄＧＡＥの細胞質への取り込みにより、内因性タウが回収され、不溶性形態に変換されるかどうかを調べた。エンドサイトーシスされたタウと細胞質タウの相互作用は、ヒトタウの過剰発現を必要とする様々な細胞モデルや、タンパク質送達試薬を用いて外来タウを導入することにより、これまでにも研究されてきた。
【0131】
本論文のデータは、可溶型のｄＧＡＥとインキュベートすることで、内因性タウが正常なレベルの細胞において、ＡＤにおけるタウ病理と一致する内因性ホスホタウが局所的に増加することを示している。ｄＧＡＥ－４８８とリピートドメイン以外のエピトープを認識する抗体を用いて内因性タウタンパク質のリン酸化状態を調べると、Ｔ２３１とＳ２０２－Ｔ２０５で内因性タウのリン酸化が増加することが本明細書で示されている。これらの変化は、順次抽出した後の不溶性のリン酸化タウタンパク質のレベルの上昇を伴うが、溶解液全体ではそうではない。溶解液全体からのウェスタンブロットでは、ＡＴ８０またはＡＴ１８０を用いたリン酸化タウレベルに明確な違いは見られなかった。これは、全体のレベルは一定であるが、免疫蛍光法および連続抽出後に示されたように、不溶性／凝集したタウの領域内で局所リン酸化タウレベルが増加することを示唆していると思われる。可溶型のｄＧＡＥの取り込みに伴う凝集の誘導やリン酸化の増加のメカニズムは、現段階では不明である。この切断されたタウは、リン酸化を必要とせず、自発的に自己凝集することができる。本明細書では、ｄＧＡＥが内因性タウと共凝集し、これらがエンドソーム／リソソーム区画内に共に蓄積されることを示した。
【0132】
本開示は、細胞によって内在化されるｄＧＡＥの大部分がリソソーム区画に局在化することを示す。イムノゴールドＴＥＭにより、ｄＧＡＥ－４８８は小胞構造に局在し、そのサイズ範囲はリソソーム区画を示唆するものであることが示された。
【0133】
免疫蛍光法とＴＥＭの結果から、ｄＧＡＥと内因性タウの両方がエンド・ライソソーム区画内に蓄積していることが示唆された。これらの知見は、病的なタウが内在化した後の細胞の超微細構造に関する新しい視点を提供し、その分解にオートファジー経路が関与している可能性を示唆する。
【0134】
生理的および病理的なタウは、プロテアソームおよびオートファジー分解系によって除去されるが、病理的なタウはオートファジー－リソソーム系によって優先的に分解されることが示唆されている。病的なタウの蓄積は、これらの分解プロセスの正常な機能を阻害している可能性がある。ＡＤでは、リソソームによるオートファジー液胞の分解が損なわれていることが示唆されており、病的なタウの除去が不完全であれば、神経細胞の機能障害に関与する可能性がある。蓄積されたタウが細胞から排出される仕組みを理解することで、タウ凝集の抑制に加え、補完的な治療法の開発が期待される。
【0135】
可溶性ｄＧＡＥは自己組織化しやすく、神経細胞内に取り込まれやすいことから、細胞環境における自己組織化の影響、特に急性毒性への影響、内在性タウのリン酸化状態や不溶性への影響を超微細構造レベルで研究することが可能である。この方法は、タンパク質の過剰発現、翻訳後修飾、集合の誘導物質がない状態でのタウ凝集の研究を促進し、最終的にはＡＤおよび関連タウオパチーにおけるタウ播種と神経伝達を標的としたタウ凝集阻害剤の作用メカニズムを研究するための有用なツールを提供するものである。
【0136】
上記のように、本発明の第２およびそれ以降の態様の好ましい特徴は、第１の態様に関して準用される。
【0137】
次に、本発明は、参考のためにのみ含まれ、本発明の限定であると解釈されるべきではない以下の実施例を参照してさらに説明され、その中で、多くの図も参照される。
【図面の簡単な説明】
【0138】
【図1】図１は、ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８が自己集合して、構造的に類似したフィブリルを形成していることを示している。ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８は１００μＭで７２時間インキュベートした。集合体混合物のアリコートをフィブリル化前（０時間）と後（７２時間）に採取し、ネガティブステインＴＥＭ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動、ＣＤスペクトロスコピーを実施した。（Ａ） ０時間および７２時間攪拌時のｄＧＡＥ種の電子顕微鏡写真。スケールバー：５００ｎｍ。中段は左図の白枠の拡大図である（スケールバー：２００ｎｍ）。（Ｂ） ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルをクーマシー染色（左パネル）と蛍光（右パネル）で示す。黒い矢印は、ウェル内の単量体、二量体、四量体、不溶性フィブリルを指す。（Ｃ） ０時間および７２時間撹拌したｄＧＡＥおよびｄＧＡＥ－４８８の全組成混合物のＣＤスペクトル。
【図2】図２は、可溶性（モノマー／ダイマー）のｄＧＡＥではなく、凝集したｄＧＡＥにさらされた場合、細胞死が増加することを示している。１００μＭ ｄＧＡＥ を ７２ 時間攪拌し、フィブリルを生成させた。可溶性（０時間）または凝集性（７２時間）の種（１μＭ）を細胞に加え、２４時間インキュベートして放置した。（Ａ） ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ試薬を用いてバッファまたはｄＧＡＥに暴露した後の代表的な広視野画像で、全核を青で、死細胞の核を緑で示す。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ） すべての条件において、細胞死の割合を定量化した。データは４－６回の独立した実験による６視野の平均値±ＳＥＭを示す。一元配置の分散分析では、グループ間で有意な差が見られた（Ｆ ＝ １１．２６， Ｒ２ ＝ ０．１２， ｐ＜０．０００１）。Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較では、バッファのみで処理した細胞（２１．６±１．６％）とｄＧＡＥフィブリル（７２時間ｄＧＡＥ）で処理した細胞（３４．０±２．９％）（ｐ＜０．０００１）の間に有意差が見られたが、バッファで処理した細胞と可溶性ｄＧＡＥ処理した細胞（２４．１±１．２％）の間には差がなかった。
【図3】図３は、可溶性ｄＧＡＥ－４８８がｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に容易に取り込まれることを示している。（Ａ） １μＭの可溶性ｄＧＡＥ－４８８（非撹拌）または７２時間撹拌した（凝集）ｄＧＡＥをｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の培地に添加し、２４時間暴露後に固定し共焦点顕微鏡で可視化した。すべてのスケールバー：２０μｍ。（Ｂ） ６つの独立した実験から得たＮ ＝ ２７３細胞（０時間）と３つの独立した実験から得たＮ ＝ １２０細胞（７２時間）のｚスタックの中央から、細胞体内の４８８蛍光強度を定量化した。Ｗｅｌｃｈの補正を加えた対応のないｔ検定では、０時間（１１１４±６６．７５ ＡＵ）と７２時間（４７４．１±９５．９７ ＡＵ）の間で４８８蛍光強度に有意差が見られた（ｔ ＝ ５．４７５， ｄｆ ＝ ２３７．７， Ｒ２ ＝ ０．１１２， ｐ＜０．０００１）．データは平均値±ＳＥＭで示す。（Ｃ） ５μＭ可溶性ｄＧＡＥ－４８８（未撹拌）の内在化は、０時間から１４時間まで共焦点顕微鏡を用いてライブでモニターされた。４８８陽性の点刻は、ｄＧＡＥ－４８８の初回添加後２時間から細胞体および神経突起に内在化されていることが確認できる（白矢印）。スケールバー：５０μｍ。（Ｄ） ２４時間暴露後の内在化した可溶性ｄＧＡＥ－４８８の高倍率画像では、細胞体内の点状パターン（白矢印）とより大きな核周辺集積（赤矢印）が確認できる。スケールバー：１５μｍ。すべてのパネルで、細胞体の中央から１つのＺスライスを示している。
【図4】図４は、ｄＧＡＥ－４８８への曝露が、ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞における内因性ホスホタウの蓄積を引き起こすことを示す。ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の培地に１μＭの可溶性ｄＧＡＥ－４８８（未撹拌）を２４時間添加した。細胞はｐ－ｔａｕ抗体（Ａｉ）ＡＴ１８０、（Ｂｉ）ＡＴ８、（Ｃｉ）脱リン酸化Ｔａｕ－１を用いて内因性タウの免疫標識が行われた。細胞体の中央から１枚のＺスライスを示す。ＡｉとＢｉには、ｄＧＡＥ－４８８と内因性タウの共焦点化の可能性を示す直交する図が表示されている。スケールバー：２０μｍ。各パネルは、蛍光強度をバッファ処理した細胞に対する割合で定量化したもの。（Ａｉｉ）ＡＴ１８０蛍光の定量化（Ｎ ＝ ６９細胞（バッファ）、７６細胞（ｄＧＡＥ）、４つの独立した実験から）。Ｗｅｌｃｈの補正をかけた対応のないｔ検定では、ｄＧＡＥ－（１４３．５±７．８％）とバッファ処理細胞（１００±５．２％）の間でＡＴ１８０蛍光強度に有意差が見られた（ｔ ＝ ４．７０２， ｄｆ ＝ １２８．２， Ｒ２ ＝ ０．１４７１， ｐ＜０．０００１）．（Ｂｉｉ）ＡＴ８蛍光の定量化。Ｎ ＝ ３４８細胞（バッファ）、Ｎ ＝ ３３８細胞（ｄＧＡＥ）、３つの独立した実験から。Ｗｅｌｃｈの補正を加えた対応のないｔ検定により、ｄＧＡＥ－（２７０．７±２２．５％）とバッファ処理細胞（１００±３．５１％）の間でＡＴ８蛍光強度に有意差が見られた（ｔ ＝ ７．１０３， ｄｆ ＝ ３５３．４， Ｒ２ ＝ ０．１２４９， ｐ＜０．０００１）．（Ｃｉｉ） Ｔａｕ１蛍光の定量化。Ｎ ＝ ６８細胞（バッファ）、９６細胞（ｄＧＡＥ）、３つの独立した実験による。Ｗｅｌｃｈの補正を加えた対応のないｔ検定により、ｄＧＡＥ（５９．１７±３．６％）とバッファ処理細胞（１００±７．３％）の間でＴａｕ－１蛍光強度に有意差が見られた（ｔ ＝ ５．０１１， ｄｆ ＝ ９９．８４， Ｒ２ ＝ ０．２０１， ｐ＜０．０００１）．
【図5】図５は、ｄＧＡＥに２４時間暴露すると、ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞のＴｒｉｔｏｎ不溶性画分に内因性リン酸化タウが蓄積されることを示す。（Ａｉ） ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞ライセートの代表的なウエスタンブロット。ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の培地に１μＭの可溶性ｄＧＡＥ（未撹拌）を添加した。２４時間後、細胞をＲＩＰＡバッファーで溶解し、Ｓウエスタンブロット析した。ブロットは総タウ、ＡＴ１８０、ＡＴ８に対してプローブされた。ＧＡＰＤＨはローディング対照として使用された。（Ａｉｉ） ５０－７０ｋＤａのバンドの強度を各抗体について定量し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。ＡＴ１８０とＡＴ８の正規化値は、全タウの割合（バッファーの割合）として表現されている。データは３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして示す。対応のないｔ検定では、バッファ処理した対照細胞とｄＧＡＥ処理した細胞の間で、総タウ（ｐ ＝ ０．３１０１）、ＡＴ１８０（ｐ ＝ ０．４６６２）またはＡＴ８（ｐ ＝ ０．２１１９）の免疫反応に有意差はないことが示された。（Ｂｉ）また、細胞はＴｒｉバッファ １００溶解ウウエスタンブロットし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した。Ｓ ＝ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００可溶性ライセート；Ｉ ＝ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００不溶性ライセート。ＡＴ１８０－抗体は内因性リン酸化タウの検出に使用し、ＧＡＰＤＨはローディング対照として使用した。Ｂ） 不溶性および可溶性画分中のタウの割合をデンシトメトリーにより定量し、バッファ処理した対照に対するパーセンテージで表した。データは４つの独立した実験（１回の実験につき１生物学的反復）からの平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定では、バッファ（１００±０）処理細胞とｄＧＡＥ処理細胞の間の不溶性タウ（１３９．４±１４．５４）（ｔ ＝ ２．７０９， ｄｆ ＝ ６， Ｒ２ ＝ ０．５５０１， ｐ ＝ ０．０３５２）とバッファ（１００±０）処理細胞とｄＧＡＥ処理細胞の間の可溶性タウ（８２．９８±５．４８）（ｔ ＝ ３．１０６， ｄｆ ＝ ６， Ｒ２ ＝ ０．６１６５， ｐ ＝ ０．０２０１） に有意差が示された。
【図6】図６は、ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞において、内在化した可溶性ｄＧＡＥ－４８８が酸性小胞に局在していることを示す。Ａｉ） １μＭ 可溶性 ｄＧＡＥ－４８８（未撹拌） に ２４時間暴露した細胞の代表的な免疫蛍光画像。細胞は、リソソームやエンドソームを含む酸性小胞を染色するためにＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで標識され、ライブ画像化された。ｄＧＡＥ－４８８とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ標識は主に細胞体（白矢印）に局在する。細胞体の中央から１枚のＺスライスを示す。スケールバー：５０μｍ。（Ａｉｉ） バッファ処理した細胞に対するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ蛍光強度の割合で定量化した。データは３つの独立した実験からプールされた平均±ＳＥＭを示す。Ｎ ＝ １７０細胞（バッファ）、Ｎ ＝ １４６ 細胞（ｄＧＡＥ）。Ｗｅｌｃｈの補正を加えた対応のないｔ検定により、ｄＧＡＥ（２１１．９±９．８９％）とバッファ処理細胞（１００±５．２３％）の間でＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ蛍光強度に有意差が見られた（ｔ ＝ １０， ｄｆ ＝ ２２２．６， Ｒ２ ＝ ０．３１０１， ｐ＜０．０００１） 。Ｂｉ） 内在化されたｄＧＡＥ－４８８を含むＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで標識された単一細胞の高倍率写真。最後のパネルは、ｄＧＡＥ－４８８とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの共局在を示す直交図である。細胞体の中央から１枚のＺスライスを示す。スケールバー：１０μｍ。（Ｂｉｉ）（Ｂｉ）の最後のパネルに白線で示した領域（２０μｍ）に沿った４８８（緑）とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（赤）の蛍光強度の正規化した値。ｄＧＡＥ－４８８とＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒの共局在は、緑と赤のチャンネル間のピアソンの相関係数によって確認される。ピアソンのＲ値の平均は０．８３８２±０．０３６（ｐ＜０．０００１各細胞について）（Ｎ ＝ ７細胞）であった。
【図7】図７は、内在化された可溶性ｄＧＡＥ－４８８がｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞の小胞構造に局在することを示す。ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を１μＭ可溶性ｄＧＡＥ－４８８（未撹拌）に２４時間暴露し、イムノゴールド電子顕微鏡で処理した。抗４８８抗体を用いてｄＧＡＥを標識し、１０ｎｍの金粒子で検出した。Ａ） 細胞の超微細構造を保存した電子顕微鏡写真で、主な細胞区画を次のようにラベル付けしている。黒い矢頭は小胞構造を指す。黒枠の画像は、白枠の部分を拡大したものである。左のスケールバー：５μｍ。右のスケールバー：１μｍ。Ｂ）小胞直径の定量化。データは２つの独立した実験からプールされた平均±ＳＥＭとして示されている。Ｎ ＝ ３４の小胞（バッファ）、Ｎ ＝ ４５の小胞（ｄＧＡＥ－４８８）。対応のないｔ検定により、バッファ（３０３．７±２０．０３）とｄＧＡＥ処理細胞（４７８．４±２２．４８）の間で小胞径に有意差が認められた（ｔ ＝ ５．６０１， ｄｆ ＝ ７７， ｐ＜０．０００１， Ｒ２ ＝ ０．２８９５）。Ｃ）バッファ処理細胞およびｄＧＡＥ－４８８処理細胞からの小胞構造の高倍率電子顕微鏡写真。黒い矢頭は金粒子の例を示している。スケールバー：２００ｎｍ。
【図8】図８は、抗体の存在下および非存在下で集合化されたｄＧＡＥの透過型電子顕微鏡画像である。（Ａ）ｄＧＡＥ（１００μＭ）；（Ｂ）ｄＧＡＥ（２５μＭ）；（Ｃ）ｄＧＡＥ（１０μＭ）；（Ｄ）ｄＧＡＥ（１００μＭ）＋ｓ１Ｄ１２（２５μＭ；４：１）；（Ｅ）ｄＧＡＥ（２５μＭ）＋ｓ１Ｄ１２（２５μＭ；１：１）；（Ｆ）ｄＧＡＥ（１０μＭ）＋ｓ１Ｄ１２（２．５μＭ；４：１）；（Ｇ）ｄＧＡＥ（１０μＭ）＋抗オバルブミン（２．５μＭ；４：１）；（Ｈ）ｓ１Ｄ１２（２５μＭ）；（Ｉ）抗オバルブミン（２．５μＭ）。フィブリルは、ｓ１Ｄ１２の不在下での準備（Ａ－Ｃ）または非ｔａｕ ＩｇＧ抗体、抗オバルブミン（Ｇ）の存在下で準備したｄＧＡＥの対照においてのみ観察される。ｓ１Ｄ１２をｄＧＡＥタンパク質：抗体の比が１：１または４：１のいずれかで集合混合物に加えた場合（Ｄ、Ｅ、Ｆ）、フィブリル形成は観察されない。ｄＧＡＥ非存在下の抗体対照ではフィブリルも見られない（ＨおよびＩ）。スケールバー（全パネルのＩ上）、２００ｎｍ。
【実施例】
【0139】
材料および方法
リコンビナントｄＧＡＥの調製
精製リコンビナント切断タウ（ｄＧＡＥ、２Ｎ４Ｒタウからの番号付けによりアミノ酸残基２９７－３９１に対応）を研究全体を通じて使用した。リコンビナントタウタンパク質２９７－３９１は、Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙらの既述に従って精製した（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。精製後、ｄＧＡＥは主にランダムコイル構造で存在し、以前に特徴付けられ、Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙらに記載されたように主に可溶性モノマーおよびダイマーからなる（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。
リコンビナントｄＧＡＥの調製
精製リコンビナント切断タウ（ｄＧＡＥ、２Ｎ４Ｒタウからの番号付けによりアミノ酸残基２９７－３９１に対応）を研究全体を通じて使用した。リコンビナントタウタンパク質２９７－３９１は、Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙらの既述に従って精製した（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。精製後、ｄＧＡＥは主にランダムコイル構造で存在し、以前に特徴付けられ、Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙらに記載されたように主に可溶性モノマーおよびダイマーからなる（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。
【0140】
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８標識タウタンパク質
蛍光標識タウタンパク質（ｄＧＡＥ－４８８）を生成するために、２００μｌタンパク質（４２５．２μＭ）を１０μｌ １１３ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ＴＦＰエステルと２０μｌ １Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ ８．３）と混合し、ｄＧＡＥをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ライフテクノロジー）で共有結合で標識化した。この混合物を暗所で１５分間、室温でインキュベートした。Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯ カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） に １ ｍｌ の １０ｍＭ リン酸バッファ（ｐＨ ７．４） を加え、１，０００ｘ ｇ、４℃で ２ 分間遠心し、平衡化させた。溶出液は捨て、この操作を３回繰り返した。タンパク質／色素混合物をカラム上部に滴下し、続いて４０μｌのリン酸緩衝液を加え、１，０００×ｇ、２分間、４℃で遠心分離を行った。タンパク質溶液を氷上に置き、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定した。タンパク質濃度は、Ａ２８０と、Ａ４９４での色素の吸収を考慮したｄＧＡＥのモル消光係数（１，４００ｃｍ－１ Ｍ－１）を用いて算出した。ｄＧＡＥは１４個のリジン残基を持っており、これらはすべて４８８色素が結合できる潜在的な部位である。標識の程度は、Ａ４９４と色素のモル消光係数（７１，０００ｃｍ－１ Ｍ－１）で判断した。このタンパク質（ｄＧＡＥ－４８８）は、すぐにその後の実験に使用するか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで攪拌に供した。
蛍光標識タウタンパク質（ｄＧＡＥ－４８８）を生成するために、２００μｌタンパク質（４２５．２μＭ）を１０μｌ １１３ｎＭ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ＴＦＰエステルと２０μｌ １Ｍ重炭酸ナトリウム（ｐＨ ８．３）と混合し、ｄＧＡＥをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ライフテクノロジー）で共有結合で標識化した。この混合物を暗所で１５分間、室温でインキュベートした。Ｚｅｂａ ７Ｋ ＭＷＣＯ カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） に １ ｍｌ の １０ｍＭ リン酸バッファ（ｐＨ ７．４） を加え、１，０００ｘ ｇ、４℃で ２ 分間遠心し、平衡化させた。溶出液は捨て、この操作を３回繰り返した。タンパク質／色素混合物をカラム上部に滴下し、続いて４０μｌのリン酸緩衝液を加え、１，０００×ｇ、２分間、４℃で遠心分離を行った。タンパク質溶液を氷上に置き、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）を測定した。タンパク質濃度は、Ａ２８０と、Ａ４９４での色素の吸収を考慮したｄＧＡＥのモル消光係数（１，４００ｃｍ－１ Ｍ－１）を用いて算出した。ｄＧＡＥは１４個のリジン残基を持っており、これらはすべて４８８色素が結合できる潜在的な部位である。標識の程度は、Ａ４９４と色素のモル消光係数（７１，０００ｃｍ－１ Ｍ－１）で判断した。このタンパク質（ｄＧＡＥ－４８８）は、すぐにその後の実験に使用するか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで攪拌に供した。
【0141】
ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８のｉｎ ｖｉｔｒｏ集合化
ｄＧＡＥおよびｄＧＡＥ－４８８のｉｎ ｖｉｔｒｏ集合化は、以前に記載したように、Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙら（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．４２９， ｎｏ．２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））のように還元剤なしで行った。１００μＭのタンパク質を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で希釈し、エッペンドルフ社のサーモミキサーで７００ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃で７２時間インキュベートした。サンプルはネガティブステイン透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で可視化した。すべての実験は、リン酸緩衝液中のストック１００μＭ ｄＧＡＥを用いて行われた。
ｄＧＡＥおよびｄＧＡＥ－４８８のｉｎ ｖｉｔｒｏ集合化は、以前に記載したように、Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙら（Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ．４２９， ｎｏ．２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））のように還元剤なしで行った。１００μＭのタンパク質を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で希釈し、エッペンドルフ社のサーモミキサーで７００ｒｐｍの速度で撹拌しながら３７℃で７２時間インキュベートした。サンプルはネガティブステイン透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で可視化した。すべての実験は、リン酸緩衝液中のストック１００μＭ ｄＧＡＥを用いて行われた。
【0142】
ネガティブステインＴＥＭ
ｄＧＡＥアセンブリ混合物（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４で１００μＭ）のアリコート（４μｌ）を４００メッシュのカーボンコートグリッドに置き、１分間インキュベートした。フィルターペーパーで余分な溶液を除去した後、グリッドを４μｌのフィルター付きＭｉｌｌｉ－Ｑ水で１分間洗浄し、ブロッティングを行った。グリッドは４μｌのフィルター付き２％（ｗ／ｖ） 酢酸ウラニルで１分間ネガ染色し、ブロットして乾燥させ、少なくとも５分間風乾させた。グリッドは日本電子のＪＥＭ１４００－Ｐｌｕｓ透過型電子顕微鏡で１００ｋＶで観察し、４ｋ×４ｋ Ｏｎｅ Ｖｉｅｗ（Ｇａｔａｎ）カメラで電子顕微鏡写真を収集した。
ｄＧＡＥアセンブリ混合物（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４で１００μＭ）のアリコート（４μｌ）を４００メッシュのカーボンコートグリッドに置き、１分間インキュベートした。フィルターペーパーで余分な溶液を除去した後、グリッドを４μｌのフィルター付きＭｉｌｌｉ－Ｑ水で１分間洗浄し、ブロッティングを行った。グリッドは４μｌのフィルター付き２％（ｗ／ｖ） 酢酸ウラニルで１分間ネガ染色し、ブロットして乾燥させ、少なくとも５分間風乾させた。グリッドは日本電子のＪＥＭ１４００－Ｐｌｕｓ透過型電子顕微鏡で１００ｋＶで観察し、４ｋ×４ｋ Ｏｎｅ Ｖｉｅｗ（Ｇａｔａｎ）カメラで電子顕微鏡写真を収集した。
【0143】
円偏光二色性分光法
円偏光二色性分光法（ＣＤ）はＪａｓｃｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｊ７１５を使用して行い、２１℃の維持温度で３回に分けてスペクトルを収集した。タンパク質サンプルを０．０２ ｍｍ経路長の石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ） に入れ、１８０から３２０ｎｍまでスキャンした。ＣＤデータはモル楕円率（ｄｅｇ・ｃｍ２・ｄｍｏｌ－１）に変換された。
円偏光二色性分光法（ＣＤ）はＪａｓｃｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ Ｊ７１５を使用して行い、２１℃の維持温度で３回に分けてスペクトルを収集した。タンパク質サンプルを０．０２ ｍｍ経路長の石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ） に入れ、１８０から３２０ｎｍまでスキャンした。ＣＤデータはモル楕円率（ｄｅｇ・ｃｍ２・ｄｍｏｌ－１）に変換された。
【0144】
細胞培養とｄＧＡＥ処理
未分化のＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞は、１０％ Ｆｏｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ） および１％ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２） で増殖させた。分化のために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、２４ウェルプレートでは１ウェルあたり５万個、６ウェルプレートでは１ウェルあたり３０万個の密度でプレーティングされた。免疫蛍光法では、細胞をＭｅｎｚｅｌ－Ｇｌａｓｅｒカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にプレーティングした。ライブセルイメージングのために、細胞を１．５ ｍｍのカバースリップ（Ｍａｔｔｅｋ）上の３５ ｍｍディッシュにプレーティングした。分化初日に培地を１０μＭ ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） を含む低血清培養液（１％ ＦＣＳ， １％ Ｐ／Ｓ， １％ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ を含む ＤＭＥＭ／Ｆ－１２） に置き換え、細胞を４８時間インキュベートした。３日目には、このプロセスを新鮮なＲＡで繰り返し、細胞をさらに４８時間培養した。５日目に、無血清培地で１回洗浄し、微量の血清を除去した。５０ｎｇ／ｍｌ 脳由来神経栄養因子（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む無血清培養液（１％ Ｐ／Ｓと１％ ｌ－グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２）を細胞に加え、４８時間インキュベートした。分化した細胞（ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ）は、７日目に実験に使用できるようになった。ｄＧＡＥ処理では、細胞を１μＭのｄＧＡＥ（攪拌なしの可溶性または攪拌後）に暴露し、２４時間インキュベートした。すべての実験は、ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用いて行った。
未分化のＳＨ－ＳＹ５Ｙヒト神経芽腫細胞は、１０％ Ｆｏｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ） および１％ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（ＤＭＥＭ／Ｆ－１２） で増殖させた。分化のために、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞は、２４ウェルプレートでは１ウェルあたり５万個、６ウェルプレートでは１ウェルあたり３０万個の密度でプレーティングされた。免疫蛍光法では、細胞をＭｅｎｚｅｌ－Ｇｌａｓｅｒカバースリップ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にプレーティングした。ライブセルイメージングのために、細胞を１．５ ｍｍのカバースリップ（Ｍａｔｔｅｋ）上の３５ ｍｍディッシュにプレーティングした。分化初日に培地を１０μＭ ａｌｌ－ｔｒａｎｓ ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ） を含む低血清培養液（１％ ＦＣＳ， １％ Ｐ／Ｓ， １％ ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ を含む ＤＭＥＭ／Ｆ－１２） に置き換え、細胞を４８時間インキュベートした。３日目には、このプロセスを新鮮なＲＡで繰り返し、細胞をさらに４８時間培養した。５日目に、無血清培地で１回洗浄し、微量の血清を除去した。５０ｎｇ／ｍｌ 脳由来神経栄養因子（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む無血清培養液（１％ Ｐ／Ｓと１％ ｌ－グルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２）を細胞に加え、４８時間インキュベートした。分化した細胞（ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ）は、７日目に実験に使用できるようになった。ｄＧＡＥ処理では、細胞を１μＭのｄＧＡＥ（攪拌なしの可溶性または攪拌後）に暴露し、２４時間インキュベートした。すべての実験は、ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞を用いて行った。
【0145】
細胞生存率測定法
ｄＧＡＥ添加後、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞生存率を測定した。キットには、すべての細胞を標識するＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）試薬（青色）と死細胞のみを標識するＮｕｃＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬（緑色）が含まれる。タグ付きｄＧＡＥでは、ＮｕｃＲｅｄ（登録商標）試薬を用いて死細胞（赤色）を標識した。各試薬１滴を５００μｌの培地中の細胞にメーカーのプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って添加した。細胞を試薬とともに３７℃で１５分間インキュベートした後、培地をＬｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に交換した。細胞はＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡で撮像された。ＤＡＰＩ蛍光は、Ｇ ３６５励起フィルターとＬＰ ４２０発光フィルターを使用し、ＦＴ ３９５ダイクロイックを用いて撮影した。緑色蛍光はＦＩＴＣフィルターセット（ＢＰ ４５０－４９０励起フィルター、ＢＰ ５１５－５６５ 発光フィルター、ＦＴ ５１０ダイクロイック）を用いて捕捉した。すべてのレプリケートで同一の撮影設定を行い、ＦＩＪＩを使用して画像を解析した。１サンプルにつき６視野が撮影され、１条件につき平均４５００個の細胞が分析された。バッファ処理による細胞死の割合は、画像をグレースケールに変換した後、手動で閾値を調整し、ＤＡＰＩ染色された生きた細胞を強調する２値画像に変換することで定量化された。細胞の数は自動カウントされた。死んだ細胞も同様に数え、細胞死をバッファ処理した細胞に対するパーセンテージで表した。
ｄＧＡＥ添加後、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞生存率を測定した。キットには、すべての細胞を標識するＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）試薬（青色）と死細胞のみを標識するＮｕｃＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬（緑色）が含まれる。タグ付きｄＧＡＥでは、ＮｕｃＲｅｄ（登録商標）試薬を用いて死細胞（赤色）を標識した。各試薬１滴を５００μｌの培地中の細胞にメーカーのプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って添加した。細胞を試薬とともに３７℃で１５分間インキュベートした後、培地をＬｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に交換した。細胞はＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡で撮像された。ＤＡＰＩ蛍光は、Ｇ ３６５励起フィルターとＬＰ ４２０発光フィルターを使用し、ＦＴ ３９５ダイクロイックを用いて撮影した。緑色蛍光はＦＩＴＣフィルターセット（ＢＰ ４５０－４９０励起フィルター、ＢＰ ５１５－５６５ 発光フィルター、ＦＴ ５１０ダイクロイック）を用いて捕捉した。すべてのレプリケートで同一の撮影設定を行い、ＦＩＪＩを使用して画像を解析した。１サンプルにつき６視野が撮影され、１条件につき平均４５００個の細胞が分析された。バッファ処理による細胞死の割合は、画像をグレースケールに変換した後、手動で閾値を調整し、ＤＡＰＩ染色された生きた細胞を強調する２値画像に変換することで定量化された。細胞の数は自動カウントされた。死んだ細胞も同様に数え、細胞死をバッファ処理した細胞に対するパーセンテージで表した。
【0146】
細胞溶解と分画
０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ） でインキュベートしてカバースリップから細胞を剥離し，５ ｍｌ の培養液と混合した。５００ｘ ｇで５分間遠心分離して細胞を採取し、上清を廃棄した。細胞ペレットを氷冷したＰＢＳに再懸濁し、５００×ｇ、４℃で遠心分離した。細胞を、ＨａｌｔＴＭプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む１％ Ｔｒｉｔｏｎ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｖ／ｖ）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ａｎｄ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．６） で氷上１５分溶解させた。１６，０００ｘ ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を回収した（Ｔｒｉｔｏｎ可溶性画分）。ペレットは、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含むＳＤＳ溶解バッファ（１％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ａｎｄ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．６）に再懸濁させた。１６，０００ｘ ｇ、室温で３０分間遠心分離し、上清を回収した（Ｔｒｉｔｏｎ不溶性画分）。Ｔｒｉｔｏｎ可溶性画分中のタンパク質濃度は、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） を用いて、メーカーの説明書に従って測定した。
０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ） でインキュベートしてカバースリップから細胞を剥離し，５ ｍｌ の培養液と混合した。５００ｘ ｇで５分間遠心分離して細胞を採取し、上清を廃棄した。細胞ペレットを氷冷したＰＢＳに再懸濁し、５００×ｇ、４℃で遠心分離した。細胞を、ＨａｌｔＴＭプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびホスファターゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む１％ Ｔｒｉｔｏｎ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ｖ／ｖ）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ａｎｄ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．６） で氷上１５分溶解させた。１６，０００ｘ ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を回収した（Ｔｒｉｔｏｎ可溶性画分）。ペレットは、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を含むＳＤＳ溶解バッファ（１％ ＳＤＳ（ｗ／ｖ）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ａｎｄ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．６）に再懸濁させた。１６，０００ｘ ｇ、室温で３０分間遠心分離し、上清を回収した（Ｔｒｉｔｏｎ不溶性画分）。Ｔｒｉｔｏｎ可溶性画分中のタンパク質濃度は、ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） を用いて、メーカーの説明書に従って測定した。
【0147】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥとウエスタンブロッティング
細胞溶解液については、Ｔｒｉｔｏｎ－可溶性タンパク質（２０μｇ）と等量のＴｒｉｔｏｎ－不溶性タンパク質をそれぞれ５％（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノールを含むＬaｍｍｌｉサンプルバッファ（４ｘ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混ぜ、９５℃で５分加熱した。リコンビナントタンパク質の場合、３μｇを還元剤、煮沸せずにサンプルバッファと混合した。すべてのサンプルを１０００ｘ ｇで５分間遠心分離し、サンプルを４－２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ｐｒｅｃａｓｔ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） にロードし、Ｔｒｉｓ－ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １９２ ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ， ｐＨ ８．３） 中１２０Ｖで１時間、またはサンプルバッファがゲルの端に達するまで動作させた。クーマシー染色は、ゲルを二重蒸留水で ５ 分間 ３回洗浄し、ＩｍｐｅｒｉａｌＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） で １ 時間染色した後、二重蒸留水で一晩脱染した。染色したゲルをＨＰ Ｐｈｏｔｏｓｍａｒｔ Ｃ５２８０スキャナーでスキャンした。ウエスタンブロッティングでは、ゲル上で分離したタンパク質をニトロセルロース膜（０．４５μｍ）に２００ｍＡで９０分かけて転写した。膜は、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ） サンプルバッファ水（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ７．４， １５０ｍＭ ＮａＣｌ） 中の ５％（ｗ／ｖ） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） で室温で１時間ロックしてブロックされた。膜は、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ ＢＳＡで希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体および希釈液を使用した；Ａｎｔｉ－Ｔａｕ（ポリクローナル、ｔｏｔａｌ ｔａｕ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１：２５００），ＡＴ１８０（ａｎｔｉ－ｐＴ２３１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１：１０００），ＡＴ８（ａｎｔｉ－ｐＳ２０２－Ｔ２０５）（１：１０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００）（Ａｂｃａｍ）．。翌日、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－抗マウス抗体（１：５０００）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＨＲＰ－抗ラビット抗体（１：５０００）（Ａｂｃａｍ）で５％ ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳ－Ｔ で室温、１時間インキュベートした。メンブレンは、抗体インキュベーションの間にＴＢＳ－ Ｔで３回×１０分間洗浄した。ＥＣＬ 基質（ＣｌａｒｉｔｙＴＭ， Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて免疫反応性タンパク質バンドを検出し、Ｘ 線フィルムを ＨＰ Ｐｈｏｔｏｓｍａｒｔ Ｃ５２８０スキャナーでスキャンした。ＦＩＪＩを使用して、任意のデンシトメトリー単位でバンドを定量した。全長タウ（５０－７０ｋＤａ）に相当するバンドの密度を測定し、ＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。これらの値を用いて、リン酸化された全タウの割合を算出し、バッファ処理した対照群に対する割合で表した。Ｔｒｉｔｏｎ不溶性および可溶性タンパク質の定量は、不溶性画分および可溶性画分中のタウの割合を、それぞれ不溶性／（可溶性＋不溶性）または可溶性／（可溶性＋不溶性）の式で算出し、それぞれの可溶性または不溶性の対照値に対する割合として示した。
細胞溶解液については、Ｔｒｉｔｏｎ－可溶性タンパク質（２０μｇ）と等量のＴｒｉｔｏｎ－不溶性タンパク質をそれぞれ５％（ｖ／ｖ）β－メルカプトエタノールを含むＬaｍｍｌｉサンプルバッファ（４ｘ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と混ぜ、９５℃で５分加熱した。リコンビナントタンパク質の場合、３μｇを還元剤、煮沸せずにサンプルバッファと混合した。すべてのサンプルを１０００ｘ ｇで５分間遠心分離し、サンプルを４－２０％ Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ｐｒｅｃａｓｔ ｇｅｌｓ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） にロードし、Ｔｒｉｓ－ｇｌｙｃｉｎｅ ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（２５ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １９２ ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ， ｐＨ ８．３） 中１２０Ｖで１時間、またはサンプルバッファがゲルの端に達するまで動作させた。クーマシー染色は、ゲルを二重蒸留水で ５ 分間 ３回洗浄し、ＩｍｐｅｒｉａｌＴＭ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） で １ 時間染色した後、二重蒸留水で一晩脱染した。染色したゲルをＨＰ Ｐｈｏｔｏｓｍａｒｔ Ｃ５２８０スキャナーでスキャンした。ウエスタンブロッティングでは、ゲル上で分離したタンパク質をニトロセルロース膜（０．４５μｍ）に２００ｍＡで９０分かけて転写した。膜は、０．１％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ） サンプルバッファ水（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ７．４， １５０ｍＭ ＮａＣｌ） 中の ５％（ｗ／ｖ） ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） で室温で１時間ロックしてブロックされた。膜は、ＴＢＳ－Ｔ中の５％ ＢＳＡで希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体および希釈液を使用した；Ａｎｔｉ－Ｔａｕ（ポリクローナル、ｔｏｔａｌ ｔａｕ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１：２５００），ＡＴ１８０（ａｎｔｉ－ｐＴ２３１）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１：１０００），ＡＴ８（ａｎｔｉ－ｐＳ２０２－Ｔ２０５）（１：１０００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ），抗ＧＡＰＤＨ（１：５０００）（Ａｂｃａｍ）．。翌日、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－抗マウス抗体（１：５０００）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＨＲＰ－抗ラビット抗体（１：５０００）（Ａｂｃａｍ）で５％ ＢＳＡ ｉｎ ＴＢＳ－Ｔ で室温、１時間インキュベートした。メンブレンは、抗体インキュベーションの間にＴＢＳ－ Ｔで３回×１０分間洗浄した。ＥＣＬ 基質（ＣｌａｒｉｔｙＴＭ， Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて免疫反応性タンパク質バンドを検出し、Ｘ 線フィルムを ＨＰ Ｐｈｏｔｏｓｍａｒｔ Ｃ５２８０スキャナーでスキャンした。ＦＩＪＩを使用して、任意のデンシトメトリー単位でバンドを定量した。全長タウ（５０－７０ｋＤａ）に相当するバンドの密度を測定し、ＧＡＰＤＨの量に対して正規化した。これらの値を用いて、リン酸化された全タウの割合を算出し、バッファ処理した対照群に対する割合で表した。Ｔｒｉｔｏｎ不溶性および可溶性タンパク質の定量は、不溶性画分および可溶性画分中のタウの割合を、それぞれ不溶性／（可溶性＋不溶性）または可溶性／（可溶性＋不溶性）の式で算出し、それぞれの可溶性または不溶性の対照値に対する割合として示した。
【0148】
免疫蛍光
ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞から細胞培養液を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞はＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ） パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ） で１５分間固定し、その後ＰＢＳで３回洗浄した。透過化のために、細胞をＰＢＳ中の０．２５％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間インキュベートした。細胞は２％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳで１時間ブロッキングし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。一次抗体はＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ） ＢＳＡで希釈し、細胞とともに１時間インキュベートした。使用した一次抗体と希釈率は、ＡＴ１８０（抗ｐＴ２３１）（１：２５０）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＴ８（抗ｐＳ２０２－Ｔ２０５）（１：５００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｔａｕ１（Ｓ１９５、１９８、１９９、２０２の脱リン酸化タウ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ） ＢＳＡで希釈したヤギ抗マウス－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４（１：１０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） と共に，暗所で１時間インキュベートされた。細胞は、抗体インキュベーションの間にＰＢＳで３回洗浄した。４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を含むプロロング・ゴールド・マウント・メディウムを用いて細胞をスライドガラスにマウントした。マウントしたスライドは、撮影前に２４～４８時間室温で暗所に保管し、長期保管の場合は４℃で保管した。細胞はＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡で撮像された。
ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞から細胞培養液を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞はＰＢＳ中の４％（ｗ／ｖ） パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ） で１５分間固定し、その後ＰＢＳで３回洗浄した。透過化のために、細胞をＰＢＳ中の０．２５％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１０分間インキュベートした。細胞は２％（ｗ／ｖ） ＢＳＡ ｉｎ ＰＢＳで１時間ブロッキングし、その後ＰＢＳで３回洗浄した。一次抗体はＰＢＳ中の２％（ｗ／ｖ） ＢＳＡで希釈し、細胞とともに１時間インキュベートした。使用した一次抗体と希釈率は、ＡＴ１８０（抗ｐＴ２３１）（１：２５０）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＴ８（抗ｐＳ２０２－Ｔ２０５）（１：５００）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｔａｕ１（Ｓ１９５、１９８、１９９、２０２の脱リン酸化タウ）（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）であった。ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ） ＢＳＡで希釈したヤギ抗マウス－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４（１：１０００）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） と共に，暗所で１時間インキュベートされた。細胞は、抗体インキュベーションの間にＰＢＳで３回洗浄した。４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を含むプロロング・ゴールド・マウント・メディウムを用いて細胞をスライドガラスにマウントした。マウントしたスライドは、撮影前に２４～４８時間室温で暗所に保管し、長期保管の場合は４℃で保管した。細胞はＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡で撮像された。
【0149】
酸性オルガネラの標識
細胞は３５ｍｍディッシュに１．５ｍｍカバースリップ（Ｍａｔｔｅｋ）上にプレーティングした。分化後、ｄＧＡＥ－４８８（５μＭ）を２４時間細胞に添加した。ライソゾームとエンドソームの標識には、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） を最終濃度５０ｎＭで培養液に希釈し、９０分間インキュベートしてからＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡でイメージングを行った。
細胞は３５ｍｍディッシュに１．５ｍｍカバースリップ（Ｍａｔｔｅｋ）上にプレーティングした。分化後、ｄＧＡＥ－４８８（５μＭ）を２４時間細胞に添加した。ライソゾームとエンドソームの標識には、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標） ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） を最終濃度５０ｎＭで培養液に希釈し、９０分間インキュベートしてからＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡でイメージングを行った。
【0150】
共焦点顕微鏡
すべての共焦点顕微鏡撮影は、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して行った。装置の設定はＰＭＴ ３とＰＭＴ Ｔｒａｎｓチャンネル／レーザーで、画像はＨＣ ＰＬＡＰｏＣｓ２ ６３ｘ／１．４０油浸対物レンズで取得された。スペクトルブリードスルーを防ぐため、試料は順次スキャンされました。すべての画像は、０．５μｍのステップサイズを使用して、すべてのチャンネルのＺスタックとして収集された。各サンプルについて５～１０枚のＺスタックを撮影し、各実験を３回以上繰り返した。ｄＧＡＥ－４８８のライブ取り込みをモニターするため、加湿したＣＯ２を用いて３７℃の環境を維持し、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ機能により、実験期間中、焦点面を一定に保った。
すべての共焦点顕微鏡撮影は、Ｌｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して行った。装置の設定はＰＭＴ ３とＰＭＴ Ｔｒａｎｓチャンネル／レーザーで、画像はＨＣ ＰＬＡＰｏＣｓ２ ６３ｘ／１．４０油浸対物レンズで取得された。スペクトルブリードスルーを防ぐため、試料は順次スキャンされました。すべての画像は、０．５μｍのステップサイズを使用して、すべてのチャンネルのＺスタックとして収集された。各サンプルについて５～１０枚のＺスタックを撮影し、各実験を３回以上繰り返した。ｄＧＡＥ－４８８のライブ取り込みをモニターするため、加湿したＣＯ２を用いて３７℃の環境を維持し、Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ機能により、実験期間中、焦点面を一定に保った。
【0151】
ＴＥＭ用細胞の加工
ＤＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８含有バッファ、または１０μＭの新鮮なｄＧＡＥ－４８８で２４時間処理した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、チューブに掻き入れ、５００ｘ ｇで５分間遠心分離した。培地を除去し、あらかじめ温めておいた１：１の混合培養液４％（ｖ／ｖ） ＰＦＡに細胞を３７℃、１５分間懸濁させた。５００ｘ ｇで５分間遠心し、細胞を新鮮な４％（ｖ／ｖ） ＰＦＡと０．１％（ｖ／ｖ） グルタルアルデヒド（ＧＡ） を含む ０．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４） に室温で３時間かけて再懸濁した。固定した細胞を１，０００ｘ ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットをＰＢＳ中の５０ｍＭグリシンに懸濁し、室温で１０分間静置した。１，０００ｘ ｇ で ５ 分間遠心分離し、ペレットを ０．１ Ｍカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ ７．４） で ３回洗浄した。約２００μｌの４％（ｗ／ｖ） 低融点アガロースを加え、直ちに１，０００ｘ ｇ、３０℃で１０分間遠心分離した。チューブは直ちに４℃または氷上に移し、２０分間アガロースを固化させた。アガロース包埋細胞ペレットを新しいチューブに移し、０．１ Ｍ カコジル酸塩緩衝液（ｐＨ ７．４） で２－３回洗浄した。ペレットは還元オスミウム溶液（１％（ｖ／ｖ） ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ， １．５％（ｗ／ｖ） ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ ｉｎ ０．１ Ｍ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ， ｐＨ ７．４）で４℃、１時間後、０．１ Ｍ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）と３回洗浄、２回蒸留Ｈ２Ｏでそれぞれ５分、固定された。ペレットを３０，５０，７５，９０，９５％エタノールで１５分ずつ４℃で脱水し、その後１００％エタノールで２０分ずつ４℃で３回インキュベートした。その後、１００％エタノールとユニクリル樹脂の２：１混合液（３０分間、続いて１００％エタノールとユニクリル樹脂（ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）の１：２混合液）に３０分間浸潤させた。最後に、ペレットをＢＥＥＭカプセル（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に移し、完全なＵｎｉｃｒｙｌ樹脂に４℃で一晩浸潤させた。ＢＥＥＭカプセルの下面から１２Ｖ，１００Ｗのフィリップス社製プロジェクションランプ６８３４型を３５ｃｍの距離で照射し，４８時間光重合で樹脂を硬化させた。Ｌｅｉｃａ Ｍ８０顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を取り付けた Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ７ 超ミクロトームでダイヤモンドナイフを用いて超薄切片（７０ｎｍ）を採取し、３００Ｍｅｓｈ Ｈｅｘａｇｏｎ Ｎｉｃｋｅｌ ３．０５ｍｍ Ｇｒｉｄｓ（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ）上に置いてからイムノゴールド標識の作製を進めた。
ＤＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８含有バッファ、または１０μＭの新鮮なｄＧＡＥ－４８８で２４時間処理した。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、チューブに掻き入れ、５００ｘ ｇで５分間遠心分離した。培地を除去し、あらかじめ温めておいた１：１の混合培養液４％（ｖ／ｖ） ＰＦＡに細胞を３７℃、１５分間懸濁させた。５００ｘ ｇで５分間遠心し、細胞を新鮮な４％（ｖ／ｖ） ＰＦＡと０．１％（ｖ／ｖ） グルタルアルデヒド（ＧＡ） を含む ０．１ Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ ７．４） に室温で３時間かけて再懸濁した。固定した細胞を１，０００ｘ ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットをＰＢＳ中の５０ｍＭグリシンに懸濁し、室温で１０分間静置した。１，０００ｘ ｇ で ５ 分間遠心分離し、ペレットを ０．１ Ｍカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ ７．４） で ３回洗浄した。約２００μｌの４％（ｗ／ｖ） 低融点アガロースを加え、直ちに１，０００ｘ ｇ、３０℃で１０分間遠心分離した。チューブは直ちに４℃または氷上に移し、２０分間アガロースを固化させた。アガロース包埋細胞ペレットを新しいチューブに移し、０．１ Ｍ カコジル酸塩緩衝液（ｐＨ ７．４） で２－３回洗浄した。ペレットは還元オスミウム溶液（１％（ｖ／ｖ） ｏｓｍｉｕｍ ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ， １．５％（ｗ／ｖ） ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ ｉｎ ０．１ Ｍ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ， ｐＨ ７．４）で４℃、１時間後、０．１ Ｍ ｃａｃｏｄｙｌａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．４）と３回洗浄、２回蒸留Ｈ２Ｏでそれぞれ５分、固定された。ペレットを３０，５０，７５，９０，９５％エタノールで１５分ずつ４℃で脱水し、その後１００％エタノールで２０分ずつ４℃で３回インキュベートした。その後、１００％エタノールとユニクリル樹脂の２：１混合液（３０分間、続いて１００％エタノールとユニクリル樹脂（ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）の１：２混合液）に３０分間浸潤させた。最後に、ペレットをＢＥＥＭカプセル（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に移し、完全なＵｎｉｃｒｙｌ樹脂に４℃で一晩浸潤させた。ＢＥＥＭカプセルの下面から１２Ｖ，１００Ｗのフィリップス社製プロジェクションランプ６８３４型を３５ｃｍの距離で照射し，４８時間光重合で樹脂を硬化させた。Ｌｅｉｃａ Ｍ８０顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を取り付けた Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ７ 超ミクロトームでダイヤモンドナイフを用いて超薄切片（７０ｎｍ）を採取し、３００Ｍｅｓｈ Ｈｅｘａｇｏｎ Ｎｉｃｋｅｌ ３．０５ｍｍ Ｇｒｉｄｓ（Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｌｔｄ）上に置いてからイムノゴールド標識の作製を進めた。
【0152】
イムノゴールド標識ＴＥＭ
抗体とゴールドプローブの希釈には、１％ ＢＳＡ、５００μｌ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ－２０、１０ｍＭ Ｎａ－ ＥＤＴＡ、０．２ｇ／Ｌ ＮａＮ３を含む修正 ＰＢＳ（ｐＨ ８．２） が以下の手順で使用された。超薄切片は、まず正常ヤギ血清（ＰＢＳ＋で１：１０希釈；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて室温で３０分間ブロッキングした後、抗Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８一次抗体（１：５０）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。切片をＰＢＳ＋で２分ずつ３回洗浄した後、１０ｎｍ金粒子コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ二次プローブをＰＢＳ＋で１：１０希釈して、室温で１時間インキュベートした。切片をＰＢＳ＋で１０分ずつ３回、蒸留水で５分ずつ４回洗浄した。その後，イムノゴールドで標識した薄切片を２％（ｗ／ｖ） 酢酸ウラニルで１時間後染色し，ＴＥＭでイメージングした。
抗体とゴールドプローブの希釈には、１％ ＢＳＡ、５００μｌ／Ｌ Ｔｗｅｅｎ－２０、１０ｍＭ Ｎａ－ ＥＤＴＡ、０．２ｇ／Ｌ ＮａＮ３を含む修正 ＰＢＳ（ｐＨ ８．２） が以下の手順で使用された。超薄切片は、まず正常ヤギ血清（ＰＢＳ＋で１：１０希釈；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて室温で３０分間ブロッキングした後、抗Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８一次抗体（１：５０）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。切片をＰＢＳ＋で２分ずつ３回洗浄した後、１０ｎｍ金粒子コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ二次プローブをＰＢＳ＋で１：１０希釈して、室温で１時間インキュベートした。切片をＰＢＳ＋で１０分ずつ３回、蒸留水で５分ずつ４回洗浄した。その後，イムノゴールドで標識した薄切片を２％（ｗ／ｖ） 酢酸ウラニルで１時間後染色し，ＴＥＭでイメージングした。
【0153】
画像解析
画像処理パッケージＦＩＪＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｆｉｊｉ．ｓｃ）（Ｊ． Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， ｖｏｌ．９， ｎｏ．７， ｐｐ．６７６－６８２，（２０１２））をすべての画像解析に使用した。蛍光強度の定量化のために、画像は最大強度にＺ投影された。各条件から５～１０視野を採取し、１条件あたり平均５０個の細胞を解析の対象とした。まず、個々の細胞の周囲に、核が融合している細胞を除いた関心領域（細胞体）を描いた。面積積分した強度と平均グレイバリューを測定し、蛍光のない（バックグラウンド）細胞の周囲から３つのセレクションを測定した。そして、補正した全細胞蛍光量（ＣＴＣＦ）を式で算出した。
内在化したｄＧＡＥ－４８８を定量化するために、ＤＡＰＩ蛍光が最大となる細胞中央の焦点面を選択し、解析に供した。
画像処理パッケージＦＩＪＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｆｉｊｉ．ｓｃ）（Ｊ． Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， ｖｏｌ．９， ｎｏ．７， ｐｐ．６７６－６８２，（２０１２））をすべての画像解析に使用した。蛍光強度の定量化のために、画像は最大強度にＺ投影された。各条件から５～１０視野を採取し、１条件あたり平均５０個の細胞を解析の対象とした。まず、個々の細胞の周囲に、核が融合している細胞を除いた関心領域（細胞体）を描いた。面積積分した強度と平均グレイバリューを測定し、蛍光のない（バックグラウンド）細胞の周囲から３つのセレクションを測定した。そして、補正した全細胞蛍光量（ＣＴＣＦ）を式で算出した。
内在化したｄＧＡＥ－４８８を定量化するために、ＤＡＰＩ蛍光が最大となる細胞中央の焦点面を選択し、解析に供した。
【0154】
データ分析
データおよび統計解析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して実施した。すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表される。２ 群を比較する場合、統計的有意性を判断するために、Ｗｅｌｃｈ の補正を加えた Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ 対応のないｔ検定を使用した。２つ以上のグループを比較する場合、実験グループと対照グループの間の差異を決定するために、Ｄｕｎｎｅｔのポストホックテストを伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）が使用された。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であるとみなされた。
データおよび統計解析は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を使用して実施した。すべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）で表される。２ 群を比較する場合、統計的有意性を判断するために、Ｗｅｌｃｈ の補正を加えた Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ 対応のないｔ検定を使用した。２つ以上のグループを比較する場合、実験グループと対照グループの間の差異を決定するために、Ｄｕｎｎｅｔのポストホックテストを伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）が使用された。ｐ＜０．０５の場合、差は統計的に有意であるとみなされた。
【0155】
実施例１：ｄＧＡＥおよびｄＧＡＥ－４８８によるフィブリル形成の検討
可溶性ｄＧＡＥをＡｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８タグ（ｄＧＡＥ－４８８）で蛍光標識し、ｄＧＡＥ集合体の内在化をモニターし、外因性ｄＧＡＥと内在性発現タウを区別することができるようにした。平均して、すべての標識化反応後にタンパク質１モルあたり０．１モルの４８８色素が存在した。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－ｔａｇはＮ末端とリジン残基上のアミノ基を標識する。そこで、標識が凝集やフィラメント形成に影響するかどうかを調べるために、ＴＥＭ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＤスペクトルを用いて、標識と非標識ｄＧＡＥを調査した。以前に確立された凝集のための非還元条件を用いて（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙら、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））、ｄＧＡＥおよびｄＧＡＥ－４８８は、形態的に類似した短いねじれフィブリルを生成した（図１Ａ）。ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８のＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、１０／２０ｋＤａと１２／２４ｋＤａのフォーム（モノマー／ダイマー）の両方が存在し、０時間後の非撹拌ｄＧＡＥ調製物では後者が優勢であった。我々は以前、ｄＧＡＥは０時間ではランダムコイルであり、主にＳＤＳ可溶性モノマーとダイマーから構成されているが、溶液には低分子量種が混在している可能性が高いことを示した。時間の経過とともに、ｄＧＡＥは自己集合してβシートに富んだフィラメントを形成する（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙ ｅｔ ａｌ，ｌ Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。ｄＧＡＥ－４８８調製品は、０時間後に二量体バンドの強度がわずかに増加した。０時間と７２時間のタンパク質の電子顕微鏡写真では、ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８の両方の調製品で同様のサイズの種が見られ（図Ｓ１）、０時間では直径１０－８０ｎｍの丸い種（図Ｓ１Ａｉｉ）、７２時間では長さ２０－３５０ｎｍのフィブリル（図Ｓ１Ｂｉｉ）であることがわかった。７２時間の撹拌によって誘導されたフィブリル化の後、ｄＧＡＥ－４８８と比較してｄＧＡＥについては１２ｋＤａの単量体型が少なく、両製剤はより多くゲルウェルに保持された（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。ＣＤスペクトルは両分析物とも類似しており、０時間では１９８ ｎｍ（主にランダムコイル構造）に同様の強度の極小値を示し、７２時間では予想通りランダムコイルの信号が減少し、２１８ ｎｍ付近に極小値を持つ不溶性のβシート構造の増加を伴っていた。我々は以前、遠心分離して上清と分離した後のペレットに２１８ｎｍのβシートシグナルを確認した（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。その結果、ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８は構造的、形態的に類似したフィブリルを形成することが示された。
可溶性ｄＧＡＥをＡｌｅｘａ－ｆｌｕｏｒ ４８８タグ（ｄＧＡＥ－４８８）で蛍光標識し、ｄＧＡＥ集合体の内在化をモニターし、外因性ｄＧＡＥと内在性発現タウを区別することができるようにした。平均して、すべての標識化反応後にタンパク質１モルあたり０．１モルの４８８色素が存在した。Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－ｔａｇはＮ末端とリジン残基上のアミノ基を標識する。そこで、標識が凝集やフィラメント形成に影響するかどうかを調べるために、ＴＥＭ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣＤスペクトルを用いて、標識と非標識ｄＧＡＥを調査した。以前に確立された凝集のための非還元条件を用いて（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙら、Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））、ｄＧＡＥおよびｄＧＡＥ－４８８は、形態的に類似した短いねじれフィブリルを生成した（図１Ａ）。ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８のＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、１０／２０ｋＤａと１２／２４ｋＤａのフォーム（モノマー／ダイマー）の両方が存在し、０時間後の非撹拌ｄＧＡＥ調製物では後者が優勢であった。我々は以前、ｄＧＡＥは０時間ではランダムコイルであり、主にＳＤＳ可溶性モノマーとダイマーから構成されているが、溶液には低分子量種が混在している可能性が高いことを示した。時間の経過とともに、ｄＧＡＥは自己集合してβシートに富んだフィラメントを形成する（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙ ｅｔ ａｌ，ｌ Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。ｄＧＡＥ－４８８調製品は、０時間後に二量体バンドの強度がわずかに増加した。０時間と７２時間のタンパク質の電子顕微鏡写真では、ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８の両方の調製品で同様のサイズの種が見られ（図Ｓ１）、０時間では直径１０－８０ｎｍの丸い種（図Ｓ１Ａｉｉ）、７２時間では長さ２０－３５０ｎｍのフィブリル（図Ｓ１Ｂｉｉ）であることがわかった。７２時間の撹拌によって誘導されたフィブリル化の後、ｄＧＡＥ－４８８と比較してｄＧＡＥについては１２ｋＤａの単量体型が少なく、両製剤はより多くゲルウェルに保持された（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。ＣＤスペクトルは両分析物とも類似しており、０時間では１９８ ｎｍ（主にランダムコイル構造）に同様の強度の極小値を示し、７２時間では予想通りランダムコイルの信号が減少し、２１８ ｎｍ付近に極小値を持つ不溶性のβシート構造の増加を伴っていた。我々は以前、遠心分離して上清と分離した後のペレットに２１８ｎｍのβシートシグナルを確認した（Ａｌ－Ｈｉｌａｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ｖｏｌ． ４２９， ｎｏ． ２３， ｐｐ ３６５０－３６６５（２０１７））。その結果、ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８は構造的、形態的に類似したフィブリルを形成することが示された。
【0156】
実施例２：ｄＧＡＥによる細胞死誘導の研究
凝集型ｄＧＡＥ（１００μＭ ７２時間撹拌）および可溶型ｄＧＡＥ（１００μＭ ０時間、撹拌なし）を１μＭの濃度で直接ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に塗布し２４時間インキュベートした。細胞生存率は、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）アッセイを用いて２４時間後に測定し、細胞死を測定した（図２Ａ）。バッファ処理と比較して、可溶性ｄＧＡＥによる死細胞の割合が若干増加したが、これは統計的な有意差には至らなかった（図２Ｂ）。凝集したｄＧＡＥとインキュベートした場合、バッファーのみの対照（２１．６±１．６％）と比較して、細胞死が有意に増加した（３４±２．９％， ｐ＜０．０００１）。可溶性ｄＧＡＥの濃度を２０μＭまで上げても、２４時間培養した後の細胞死はそれ以上増加しなかった（図Ｓ２）。ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８は、１μＭの可溶性または凝集性タンパク質とインキュベートした後の細胞死に対して同等の効果を示したが、ｄＧＡＥ－４８８の可溶型はわずかに毒性が高かったが、７２時間のフィブリル化後には差がなかった。その結果、細胞外に塗布された凝集型ｄＧＡＥは可溶型ｄＧＡＥと異なり、急性細胞死を誘導することがわかった。
凝集型ｄＧＡＥ（１００μＭ ７２時間撹拌）および可溶型ｄＧＡＥ（１００μＭ ０時間、撹拌なし）を１μＭの濃度で直接ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞に塗布し２４時間インキュベートした。細胞生存率は、ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）アッセイを用いて２４時間後に測定し、細胞死を測定した（図２Ａ）。バッファ処理と比較して、可溶性ｄＧＡＥによる死細胞の割合が若干増加したが、これは統計的な有意差には至らなかった（図２Ｂ）。凝集したｄＧＡＥとインキュベートした場合、バッファーのみの対照（２１．６±１．６％）と比較して、細胞死が有意に増加した（３４±２．９％， ｐ＜０．０００１）。可溶性ｄＧＡＥの濃度を２０μＭまで上げても、２４時間培養した後の細胞死はそれ以上増加しなかった（図Ｓ２）。ｄＧＡＥとｄＧＡＥ－４８８は、１μＭの可溶性または凝集性タンパク質とインキュベートした後の細胞死に対して同等の効果を示したが、ｄＧＡＥ－４８８の可溶型はわずかに毒性が高かったが、７２時間のフィブリル化後には差がなかった。その結果、細胞外に塗布された凝集型ｄＧＡＥは可溶型ｄＧＡＥと異なり、急性細胞死を誘導することがわかった。
【0157】
実施例３：ｄＧＡＥ－４８８の内在化
凝集状態が細胞内への内在化効率に影響を与えるかどうかを調べるために、可溶性および凝集したｄＧＡＥのｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞への取り込みを調査した。細胞への取り込みを可視化し、全細胞の蛍光を補正して測定できるように、標識されたｄＧＡＥ－４８８を使用した。可溶型または凝集型（７２ｈ）のｄＧＡＥ－４８８は、１μＭで２４時間ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞とインキュベートした。共焦点顕微鏡による解析の結果、可溶性ｄＧＡＥ－４８８の曝露後、細胞内に蛍光が点状染色として観察された（図３Ａ）。凝集したｄＧＡＥ－４８８は可溶型に比べて細胞内への内在化効率が著しく低く（細胞あたり４７４±９６ ＡＵ ｖｓ １，１１４±６７ ＡＵ、ｐ＜０．０００１；図３Ｂ）、細胞外にｄＧＡＥ－４８８蛍光の大きな集積が観察されることがわかった。可溶性ｄＧＡＥ－４８８の内在化をモニターするためにライブセルイメージングを使用した。ｄＧＡＥ－４８８の一部は細胞外に残り、時間の経過とともに輝度とサイズが増加する。これは、培地中で何らかの組み立てが継続されていることと一致する。ｄＧＡＥ－４８８は、２時間培養後、神経細胞内に取り込まれたことが検出され、時間の経過とともに取り込みが増加することが確認された（図３Ｃ）。２４時間後までには、はっきりとした点状の染色パターンと、より大きな核周囲の蓄積の両方が観察された（図３Ｃおよび３Ｄ）。ライブセルイメージングの時間間隔では、細胞内輸送を詳細に調べることはできなかったが、内在化したｄＧＡＥ－４８８がプロセスに沿って輸送される様子が観察された。その結果、標識されたｄＧＡＥ－４８８はｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞によって内在化されることがわかった。
凝集状態が細胞内への内在化効率に影響を与えるかどうかを調べるために、可溶性および凝集したｄＧＡＥのｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞への取り込みを調査した。細胞への取り込みを可視化し、全細胞の蛍光を補正して測定できるように、標識されたｄＧＡＥ－４８８を使用した。可溶型または凝集型（７２ｈ）のｄＧＡＥ－４８８は、１μＭで２４時間ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞とインキュベートした。共焦点顕微鏡による解析の結果、可溶性ｄＧＡＥ－４８８の曝露後、細胞内に蛍光が点状染色として観察された（図３Ａ）。凝集したｄＧＡＥ－４８８は可溶型に比べて細胞内への内在化効率が著しく低く（細胞あたり４７４±９６ ＡＵ ｖｓ １，１１４±６７ ＡＵ、ｐ＜０．０００１；図３Ｂ）、細胞外にｄＧＡＥ－４８８蛍光の大きな集積が観察されることがわかった。可溶性ｄＧＡＥ－４８８の内在化をモニターするためにライブセルイメージングを使用した。ｄＧＡＥ－４８８の一部は細胞外に残り、時間の経過とともに輝度とサイズが増加する。これは、培地中で何らかの組み立てが継続されていることと一致する。ｄＧＡＥ－４８８は、２時間培養後、神経細胞内に取り込まれたことが検出され、時間の経過とともに取り込みが増加することが確認された（図３Ｃ）。２４時間後までには、はっきりとした点状の染色パターンと、より大きな核周囲の蓄積の両方が観察された（図３Ｃおよび３Ｄ）。ライブセルイメージングの時間間隔では、細胞内輸送を詳細に調べることはできなかったが、内在化したｄＧＡＥ－４８８がプロセスに沿って輸送される様子が観察された。その結果、標識されたｄＧＡＥ－４８８はｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞によって内在化されることがわかった。
【0158】
実施例４：ｄＧＡＥ内在化後のリン酸化変化
本結果は、凝集したｄＧＡＥとインキュベートすると、２４時間だけ培養した後に著しい細胞死を引き起こすが、可溶性ｄＧＡＥは２４時間培養しても、内在化されるが、著しい毒性はないようである。そこで、内在化した可溶性ｄＧＡＥ－４８８が内在性タウの凝集状態やリン酸化状態を変化させることができるかどうかをさらに検討した。１μＭの可溶性ｄＧＡＥ－４８８に曝露した後、細胞を固定し、ｄＧＡＥ配列の外側のタウエピトープを認識する抗体を用いて免疫標識し、内因性タウのみを特異的に検出した（図４Ａ－Ｃ）。細胞は、内在化したｄＧＡＥ－４８８と内因性タウの共局在を調べ、細胞体内の標識タウの蛍光強度を各抗体について個々の細胞で定量化した。ＡＴ１８０（Ｔ２３１でリン酸化されたタウ；ｐＴ２３１）およびＡＴ８（２０２－２０５でリン酸化されたタウ；ｐＳ２０２－ｐＴ２０５）の標識は、バッファ処理細胞ではほとんど見られなかったが、可溶性ｄＧＡＥ－４８８とのインキュベーション後に著しく増加し、いくつかの細胞はリン酸化した内因性タウと可溶性ｄＧＡＥ－４８８の共局在化を示した（図４Ａ， Ｂ）。Ｔａｕ－１抗体を用いて検出したアミノ酸１９２－２０４間で脱リン酸化されたタウが、ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞では核内に存在することを以前に示しました（Ｍａｉｎａ ｅｔ ａｌ， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｃｏｍｍ， Ｖｏｌ．６ Ｎｏ．７０， ｐｐ １－１３（２０１８））。ここでは、予想通り核にタウ１ラベルを確認したが、ｄＧＡＥ－４８８との共局在は確認されなかった。タウ１蛍光を定量したところ、ｄＧＡＥ－４８８で処理した細胞では蛍光強度が著しく減少しており（図４Ｃ）、これはタウがリン酸化されることを示していると思われる。その結果、内在化したｄＧＡＥ－４８８は内因性タウのリン酸化を増加させることがわかった。
本結果は、凝集したｄＧＡＥとインキュベートすると、２４時間だけ培養した後に著しい細胞死を引き起こすが、可溶性ｄＧＡＥは２４時間培養しても、内在化されるが、著しい毒性はないようである。そこで、内在化した可溶性ｄＧＡＥ－４８８が内在性タウの凝集状態やリン酸化状態を変化させることができるかどうかをさらに検討した。１μＭの可溶性ｄＧＡＥ－４８８に曝露した後、細胞を固定し、ｄＧＡＥ配列の外側のタウエピトープを認識する抗体を用いて免疫標識し、内因性タウのみを特異的に検出した（図４Ａ－Ｃ）。細胞は、内在化したｄＧＡＥ－４８８と内因性タウの共局在を調べ、細胞体内の標識タウの蛍光強度を各抗体について個々の細胞で定量化した。ＡＴ１８０（Ｔ２３１でリン酸化されたタウ；ｐＴ２３１）およびＡＴ８（２０２－２０５でリン酸化されたタウ；ｐＳ２０２－ｐＴ２０５）の標識は、バッファ処理細胞ではほとんど見られなかったが、可溶性ｄＧＡＥ－４８８とのインキュベーション後に著しく増加し、いくつかの細胞はリン酸化した内因性タウと可溶性ｄＧＡＥ－４８８の共局在化を示した（図４Ａ， Ｂ）。Ｔａｕ－１抗体を用いて検出したアミノ酸１９２－２０４間で脱リン酸化されたタウが、ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞では核内に存在することを以前に示しました（Ｍａｉｎａ ｅｔ ａｌ， Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｃｏｍｍ， Ｖｏｌ．６ Ｎｏ．７０， ｐｐ １－１３（２０１８））。ここでは、予想通り核にタウ１ラベルを確認したが、ｄＧＡＥ－４８８との共局在は確認されなかった。タウ１蛍光を定量したところ、ｄＧＡＥ－４８８で処理した細胞では蛍光強度が著しく減少しており（図４Ｃ）、これはタウがリン酸化されることを示していると思われる。その結果、内在化したｄＧＡＥ－４８８は内因性タウのリン酸化を増加させることがわかった。
【0159】
実施例５：可溶性ｄＧＡＥ－４８８への細胞曝露の影響
全細胞溶解液のウェスタンブロットを行い、内因性タウホスホエピトープに対する外因性投与したｄＧＡＥの影響を検討した。可溶性ｄＧＡＥとインキュベートした細胞とバッファ処理した対照細胞を比較すると、総タウのレベルに変化はなく、ＡＴ８またはＡＴ１８０の免疫反応に統計的有意差に達しない程度の増加がみられた。ウェスタンブロットでは細胞内のリン酸化タウの総量を測定し、免疫蛍光イメージングでは、増加したリン酸化タウの細胞内局在を明らかにすることができる。内在性タウの可溶性に対する内在化した可溶性ｄＧＡＥ－４８８の影響を調べるため、細胞溶解液からタウタンパク質を順次抽出し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で可溶化した後に遠心分離（１６０００ｇ、３０分）した。可溶性ｄＧＡＥと２４時間インキュベートした後、ＡＴ１８０で免疫標識したタウタンパク質は、バッファ処理した対照と比較して、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００－可溶性画分からＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００－不溶性画分へと明らかに再分配された。ｄＧＡＥのインキュベーションは、ＡＴ１８０で免疫反応した可溶性タウの減少（８３．０±５．５％， ｐ ＝ ０．０２０１）と不溶性の増加（１３９．４±１４．５％， ｐ ＝ ０．０３５２）（図５Ａ、Ｂ）を引き起こした。予期せぬことに、バッファ処理した対照の不溶性画分に少量のタウが観察されたが、対照と処理した細胞の差は有意であった。さらに、タウ分子のＮ－末端半分にエピトープを持つ２０－２５ｋＤａのゲル移動度を持つ新しい切断型タウ種が不溶性画分に出現していた。これは、ｄＧＡＥとインキュベートした細胞では、バッファのみでインキュベートした場合よりも強かった。その結果、可溶性のｄＧＡＥ－４８８に細胞をさらすと、ｔｒｉｔｏｎ不溶性の内因性タウが増加することがわかった。
全細胞溶解液のウェスタンブロットを行い、内因性タウホスホエピトープに対する外因性投与したｄＧＡＥの影響を検討した。可溶性ｄＧＡＥとインキュベートした細胞とバッファ処理した対照細胞を比較すると、総タウのレベルに変化はなく、ＡＴ８またはＡＴ１８０の免疫反応に統計的有意差に達しない程度の増加がみられた。ウェスタンブロットでは細胞内のリン酸化タウの総量を測定し、免疫蛍光イメージングでは、増加したリン酸化タウの細胞内局在を明らかにすることができる。内在性タウの可溶性に対する内在化した可溶性ｄＧＡＥ－４８８の影響を調べるため、細胞溶解液からタウタンパク質を順次抽出し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で可溶化した後に遠心分離（１６０００ｇ、３０分）した。可溶性ｄＧＡＥと２４時間インキュベートした後、ＡＴ１８０で免疫標識したタウタンパク質は、バッファ処理した対照と比較して、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００－可溶性画分からＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００－不溶性画分へと明らかに再分配された。ｄＧＡＥのインキュベーションは、ＡＴ１８０で免疫反応した可溶性タウの減少（８３．０±５．５％， ｐ ＝ ０．０２０１）と不溶性の増加（１３９．４±１４．５％， ｐ ＝ ０．０３５２）（図５Ａ、Ｂ）を引き起こした。予期せぬことに、バッファ処理した対照の不溶性画分に少量のタウが観察されたが、対照と処理した細胞の差は有意であった。さらに、タウ分子のＮ－末端半分にエピトープを持つ２０－２５ｋＤａのゲル移動度を持つ新しい切断型タウ種が不溶性画分に出現していた。これは、ｄＧＡＥとインキュベートした細胞では、バッファのみでインキュベートした場合よりも強かった。その結果、可溶性のｄＧＡＥ－４８８に細胞をさらすと、ｔｒｉｔｏｎ不溶性の内因性タウが増加することがわかった。
【0160】
実施例６：内在化したｄＧＡＥ－４８８の局在性
可溶性ｄＧＡＥ－４８８に２４時間暴露した神経細胞では、核に近い細胞質内に蛍光性の点状粒子が観察された。この染色パターンは、細胞質小胞に局在していることと一致した。そこで、内在化したｄＧＡＥ－４８８がエンドソーム・ライソソーム区画に局在しているかどうかを検討した。可溶性ｄＧＡＥ－４８８を細胞と２４時間インキュベートし、酸性小器官（リソソームと後期エンドソーム）を標識する色素ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）で３０分間染色し、固定後共焦点顕微鏡で視覚化した。可溶性ｄＧＡＥ－４８８に暴露した細胞では、バッファ処理した対照細胞と比較して、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）の蛍光強度に有意な増加が見られた（２１１．９±９．９％，ｐ＜０．０００１； 図６Ａｉ， Ａｉｉ）。内在化したｄＧＡＥ－４８８は、ピアソンの相関係数を用いてＺ－スタックで定量した結果、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）と強い共局在性を示した（０．８３８２±０．０３６，ｐ＜０．０００１；図６Ｂｉ， Ｂｉｉ）。その結果、内在化したｄＧＡＥ－４８８は核周囲の酸性小胞に局在していることがわかった。
可溶性ｄＧＡＥ－４８８に２４時間暴露した神経細胞では、核に近い細胞質内に蛍光性の点状粒子が観察された。この染色パターンは、細胞質小胞に局在していることと一致した。そこで、内在化したｄＧＡＥ－４８８がエンドソーム・ライソソーム区画に局在しているかどうかを検討した。可溶性ｄＧＡＥ－４８８を細胞と２４時間インキュベートし、酸性小器官（リソソームと後期エンドソーム）を標識する色素ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）で３０分間染色し、固定後共焦点顕微鏡で視覚化した。可溶性ｄＧＡＥ－４８８に暴露した細胞では、バッファ処理した対照細胞と比較して、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）の蛍光強度に有意な増加が見られた（２１１．９±９．９％，ｐ＜０．０００１； 図６Ａｉ， Ａｉｉ）。内在化したｄＧＡＥ－４８８は、ピアソンの相関係数を用いてＺ－スタックで定量した結果、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）と強い共局在性を示した（０．８３８２±０．０３６，ｐ＜０．０００１；図６Ｂｉ， Ｂｉｉ）。その結果、内在化したｄＧＡＥ－４８８は核周囲の酸性小胞に局在していることがわかった。
【0161】
実施例７：細胞内に蓄積されたタウとｄＧＡＥ－４８８の微細構造
ＴＥＭを用いて、細胞内に蓄積したタウとｄＧＡＥ－４８８の超微細構造を調べた。ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙを１０μＭの可溶性ｄＧＡＥ－４８８に２４時間暴露し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８に対する抗体を用いてｄＧＡＥ－４８８を特異的に標識し、イムノゴールドＴＥＭ用に処理した。切り出した細胞内には小胞構造とミトコンドリアが観察され、ＴＥＭプロトコルが細胞構造を保持していることが確認された（図７Ａ）。細胞質には抗４８８抗体で標識された明確な繊維状の構造物はなかったが、高倍率で観察すると、膜に結合した小胞構造内に抗４８８抗体で高密度に標識された粒子が存在し、これらのオルガネラに４８８標識タンパク質が蓄積していることが示唆された（図７Ｃ）。同様の小胞構造は、ビヒクル処理した細胞にも存在したが、金の標識はなかった。膜結合区画の直径を比較する分析により、ｄＧＡＥ－４８８細胞で処理した神経細胞は、バッファ処理した対照細胞よりも大きな直径の小胞を含み（４４８．４±２２．５ ｎｍ 対 ３０３．７±２０．０ｎｍ、ｐ＜０．０００１） 、最大の小胞は７００－８００ｎｍ、最小は２００－３００ｎｍだった（図７Ｂ）。その結果、内在化したｄＧＡＥ－４８８は小胞区画にパッケージされていることがわかった。
ＴＥＭを用いて、細胞内に蓄積したタウとｄＧＡＥ－４８８の超微細構造を調べた。ｄＳＨ－ＳＹ５Ｙを１０μＭの可溶性ｄＧＡＥ－４８８に２４時間暴露し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８に対する抗体を用いてｄＧＡＥ－４８８を特異的に標識し、イムノゴールドＴＥＭ用に処理した。切り出した細胞内には小胞構造とミトコンドリアが観察され、ＴＥＭプロトコルが細胞構造を保持していることが確認された（図７Ａ）。細胞質には抗４８８抗体で標識された明確な繊維状の構造物はなかったが、高倍率で観察すると、膜に結合した小胞構造内に抗４８８抗体で高密度に標識された粒子が存在し、これらのオルガネラに４８８標識タンパク質が蓄積していることが示唆された（図７Ｃ）。同様の小胞構造は、ビヒクル処理した細胞にも存在したが、金の標識はなかった。膜結合区画の直径を比較する分析により、ｄＧＡＥ－４８８細胞で処理した神経細胞は、バッファ処理した対照細胞よりも大きな直径の小胞を含み（４４８．４±２２．５ ｎｍ 対 ３０３．７±２０．０ｎｍ、ｐ＜０．０００１） 、最大の小胞は７００－８００ｎｍ、最小は２００－３００ｎｍだった（図７Ｂ）。その結果、内在化したｄＧＡＥ－４８８は小胞区画にパッケージされていることがわかった。
【0162】
実施例８：神経細胞におけるタウタンパク質の凝集体の作用に対する薬剤の試験
ＳＨＳＹ５Ｙ細胞は２４ウェルプレートに植え付けられ（３０，０００細胞／ウェル）、前述のように枯渇血清培地中でレチノイン酸を用いて分化させるか、未分化のままにする。細胞は、（１）タウ凝集体を添加する前に目的の薬剤の存在下でプレインキュベーションする方法、（２）目的の薬剤とタウ凝集体を同時に投与してコインキュベーションする方法のいずれかにて処理される。培養時間は各ステージ２４時間で、（１）は４８時間、（２）は２４時間である。ｄＧＡＥ－４８８（１μＭ）を細胞とともに２４時間インキュベートすることは、内在化されたタンパク質を確認するのに十分である。インキュベーション後、細胞を撮影し、ＩｍａｇｅＪを使用して画像解析を行い、細胞体内の蛍光強度を定量化し、ｄＧＡＥ－４８８の内在化の指標とした。視野内の細胞数の違いを考慮し、細胞数をカウントして平均蛍光強度／細胞で内在化のレベルを表す。ｄＧＡＥ－４８８の断片は１μＭで添加される。スクリーニングに用いる薬剤は、まず１０μＭの単一濃度で試験し、阻害活性を示すものは２μＭから２０ｎＭの濃度範囲で試験し、活性の５０％阻害が観察される濃度を化合物の活性として報告することができる。測定される活性は以下の通りである。（ｉ） 細胞内蛍光により測定されるタウの内在化、（ｉｉ） 細胞の採取、溶解、超遠心分離による凝集タウの分離、抗タウ抗体を用いたイムノブロットによる凝集タウの測定による細胞内凝集、および（ｉｉｉ） ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標） ａｓｓａｙによる細胞毒性による細胞死（図２Ａ）。活性はすべて、薬剤なしまたは処理用ビヒクルで処理した細胞で得られた結果に対して正規化される。２μＭ以下の薬剤で５０％阻害を示す化合物を活性とし、異なる薬剤での相対的な活性を比較した。
ＳＨＳＹ５Ｙ細胞は２４ウェルプレートに植え付けられ（３０，０００細胞／ウェル）、前述のように枯渇血清培地中でレチノイン酸を用いて分化させるか、未分化のままにする。細胞は、（１）タウ凝集体を添加する前に目的の薬剤の存在下でプレインキュベーションする方法、（２）目的の薬剤とタウ凝集体を同時に投与してコインキュベーションする方法のいずれかにて処理される。培養時間は各ステージ２４時間で、（１）は４８時間、（２）は２４時間である。ｄＧＡＥ－４８８（１μＭ）を細胞とともに２４時間インキュベートすることは、内在化されたタンパク質を確認するのに十分である。インキュベーション後、細胞を撮影し、ＩｍａｇｅＪを使用して画像解析を行い、細胞体内の蛍光強度を定量化し、ｄＧＡＥ－４８８の内在化の指標とした。視野内の細胞数の違いを考慮し、細胞数をカウントして平均蛍光強度／細胞で内在化のレベルを表す。ｄＧＡＥ－４８８の断片は１μＭで添加される。スクリーニングに用いる薬剤は、まず１０μＭの単一濃度で試験し、阻害活性を示すものは２μＭから２０ｎＭの濃度範囲で試験し、活性の５０％阻害が観察される濃度を化合物の活性として報告することができる。測定される活性は以下の通りである。（ｉ） 細胞内蛍光により測定されるタウの内在化、（ｉｉ） 細胞の採取、溶解、超遠心分離による凝集タウの分離、抗タウ抗体を用いたイムノブロットによる凝集タウの測定による細胞内凝集、および（ｉｉｉ） ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標） ａｓｓａｙによる細胞毒性による細胞死（図２Ａ）。活性はすべて、薬剤なしまたは処理用ビヒクルで処理した細胞で得られた結果に対して正規化される。２μＭ以下の薬剤で５０％阻害を示す化合物を活性とし、異なる薬剤での相対的な活性を比較した。
【0163】
実施例９：ｉｎ ｖｉｔｒｏでのタウ凝集抑制アッセイ
ｄＧＡＥタンパク質を１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（ＰＢ）に希釈し、モノクローナル抗体ｓ１Ｄ１２を４：１タンパク質：Ａｂ（１００μＭ ｄＧＡＥ ＋ ２５μＭ ｓ１Ｄ１２および１０μＭ ｄＧＡＥ ＋ ２．５μＭ ｓ１Ｄ１２）または１：１（２５μＭ ｄＧＡＥ ＋ ２５μＭ ｓ１Ｄ１２）で使用した。
ｄＧＡＥタンパク質を１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４（ＰＢ）に希釈し、モノクローナル抗体ｓ１Ｄ１２を４：１タンパク質：Ａｂ（１００μＭ ｄＧＡＥ ＋ ２５μＭ ｓ１Ｄ１２および１０μＭ ｄＧＡＥ ＋ ２．５μＭ ｓ１Ｄ１２）または１：１（２５μＭ ｄＧＡＥ ＋ ２５μＭ ｓ１Ｄ１２）で使用した。
【0164】
「ｓ１Ｄ１２」は、２０２０年７月１０日に出願された英国出願番号ＧＢ２０１０６５２．２および２０２１年７月９日にＷｉｓＴａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄの名前で出願された国際（ＰＣＴ）出願に開示されたモノクローナル抗体を指す。両出願の全体が参照により本明細書に援用される。本明細書において「Ｓ１Ｄ１２」と称する特異的結合分子のＣＤＲが結合するエピトープは、配列番号１の残基３３７から３４９を含むアミノ酸配列内であってもよく、好ましくは配列番号１の残基３４１から３５３を含むアミノ酸配列内であってもよい。エピトープは、配列番号８（ＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲ）のアミノ酸配列を含み得る。Ｓ１Ｄ１２は、ＣＤＲであるＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２およびＶＬＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲの各々は、以下のアミノ酸配列を含む：
ＶＨＣＤＲ１は、配列番号９（ＮＮＡＶＧ）に記載された配列を含む；
ＶＨＣＤＲ２は、配列番号１０（ＧＣＳＳＤＧＴＣＹＹＮＳＡＬＫＳ）に記載の塩基配列を含む；
ＶＨＣＤＲ３は、配列番号１１（ＧＨＹＳＩＹＧＹＤＹＬＧＴＩＤＹ）に記載の塩基配列を含む；
ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１２（ＳＧＳＳＳＮＶＧＧＧＮＳＶＧ）に記載された配列を含む；
ＶＬＣＤＲ２は、配列番号１３（ＤＴＮＳＲＰＳ）に記載の配列を含み、および
ＶＬＣＤＲ３は、配列番号１４（ＶＴＧＤＳＴＴＨＤＤＬ）に記載された配列を含む。
ＶＨＣＤＲ１は、配列番号９（ＮＮＡＶＧ）に記載された配列を含む；
ＶＨＣＤＲ２は、配列番号１０（ＧＣＳＳＤＧＴＣＹＹＮＳＡＬＫＳ）に記載の塩基配列を含む；
ＶＨＣＤＲ３は、配列番号１１（ＧＨＹＳＩＹＧＹＤＹＬＧＴＩＤＹ）に記載の塩基配列を含む；
ＶＬＣＤＲ１は、配列番号１２（ＳＧＳＳＳＮＶＧＧＧＮＳＶＧ）に記載された配列を含む；
ＶＬＣＤＲ２は、配列番号１３（ＤＴＮＳＲＰＳ）に記載の配列を含み、および
ＶＬＣＤＲ３は、配列番号１４（ＶＴＧＤＳＴＴＨＤＤＬ）に記載された配列を含む。
【0165】
ｓ１Ｄ１２は、以下を含み得る：
（ａ） 配列番号１５に記載の配列を含むＶＨドメイン、
および／または
（ｂ） 配列番号１６に記載の配列を含むＶＬドメイン
またはそのいずれかのヒト化バリアント。
（ａ） 配列番号１５に記載の配列を含むＶＨドメイン、
（ｂ） 配列番号１６に記載の配列を含むＶＬドメイン
【0166】
ｓ１Ｄ１２は、以下を含み得る：
（ａ） 配列番号１７に記載の配列を含む重鎖、
および／または
（ｂ） 配列番号１８に記載の配列を含む軽鎖
またはそのいずれかのヒト化バリアント。
（ａ） 配列番号１７に記載の配列を含む重鎖、
（ｂ） 配列番号１８に記載の配列を含む軽鎖
【0167】
陽性対照として、ｄＧＡＥを１０ｍＭ ＰＢ中最終濃度１０、２５または１００μＭで調製した。引例対照は、ｄＧＡＥと非タウＩｇＧ抗体を４：１の比率で混合したもの（１０μＭ ｄＧＡＥ ＋ ２．５μＭ 抗オバルブミン）、または抗体単独（２５または２．５μＭ ｓ１Ｄ１２ ａｎｄ ２．５μＭ ａｎｔｉ－ｏｖａｌｂｕｍｉｎ） であった。サンプルは７００ｒｐｍ、３７℃で３日間撹拌した。
【0168】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、円偏光二色性（ＣＤ）、チオフラビンＳ（ＴｈＳ）アッセイはＡｌ－Ｈｉｌａｌｙ ｅｔ ａｌ．（２０１８） Ｊ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４３０， ４１１９－４１３１に記載のように実施した。ＴＥＭ グリッドの作製は，カーボンコートしたグリッドに試料を ４μＬ 添加し，ｍｉｌｌｉ－Ｑ ｆｉｌｔｅｒｅｄ ｗａｔｅｒ で洗浄後，２％ ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ で ２ 回染色することで行なった．グリッドは風乾させた後、日本電子の電子顕微鏡（８０ｋＶ）で撮影した。
【0169】
ＣＤは、６０μＬの試料を０．１ｍｍ石英キュベットに入れ、ＪＡＳＣＯの分光光度計にセットした。２０ｍＭ ＭＯＰＳ バッファ中の １００μＬ ＴｈＳ を各サンプル ５０μＬ に加え、最終濃度が ２０μＭ になるようによく混合し、室温で １０分間インキュベートした後、励起波長 ４４０ｎｍ の Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ 分光光度計で蛍光強度を計測した。ＣＤとＴｈＳの測定値から１０ｍＭ ＰＢによるベースラインの測定値を差し引いた。
【0170】
これら３つの実験から得られた知見は、ｓ１Ｄ１２がｉｎ ｖｉｔｒｏでｄＧＡＥのフィブリルへの集合を阻害することを示している。
【0171】
まず、１０μＭという低濃度のサンプルでは、ｄＧＡＥのフィブリルがＴＥＭで容易に観察された。同じ濃度のｓ１Ｄ１２存在下では、フィブリルは存在せず、集合体の阻害が示唆された。ｄＧＡＥ：Ａｂの同じモル比の非ｔａｕ抗体を用いた場合にもフィブリルが存在し、阻害効果が特異的であることが示された。
【0172】
円偏光二色性は、溶液中のタンパク質の二次構造特性を報告する。１０μＭと２５μＭのｄＧＡＥはＣＤで観察するには低すぎる濃度であるが、抗体構造から予想される特徴的なβシートのシグナルが支配的であることがわかった。１００μＭのｄＧＡＥでは、ｄＧＡＥ信号から抗体ＣＤ信号を差し引くと、ランダムなコイルの確認が明らかになる。このことから、ｓ１Ｄ１２とｄＧＡＥの比率が４：１の場合、ｄＧＡＥはβシートに富んだフィブリルに集合することができないことがさらに示された。
【0173】
最後に、チオフラビンＳを用いて、フィブリルの存在を報告した。ＴｈＳは、ｄＧＡＥ線維の基本構造であるアミロイドに結合する色素で、波長４４０ｎｍの光で励起すると４８３ｎｍ付近の特徴的な波長で蛍光を発する。２５μＭと１００μＭのｄＧＡＥフィブリルでは、正の信号が明確に観察された。しかし、ｓ１Ｄ１２と４：１または１：１の比率でインキュベートすると、このシグナルは消失し、ｄＧＡＥとｓ１Ｄ１２をインキュベートするとフィブリルが存在しないというこれまでの観察結果を裏付ける結果となった。
【0174】
これらの結果は、（ｉ）ｓ１Ｄ１２がｄＧＡＥのフィブリルへの集合を特異的に阻害すること、（ｉｉ）これらのアッセイは、アルツハイマー病に特徴的なタウ病理に強く類似した一対のらせんフィラメントの線維形成を阻害する他の抗体の阻害活性を測定するために利用できることを示す証拠である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】