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特表2023-533513胃腸障害を有する伴侶動物を支援するための組成物および関連する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-03
(54)【発明の名称】胃腸障害を有する伴侶動物を支援するための組成物および関連する方法
(51)【国際特許分類】
A61K 35/747 20150101AFI20230727BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230727BHJP
A61P 1/12 20060101ALI20230727BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20230727BHJP
【ＦＩ】
A61K35/747
A61P1/04
A61P1/12 171
C12N1/20 E ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023500290
(86)(22)【出願日】2021-06-29
(85)【翻訳文提出日】2023-03-06
(86)【国際出願番号】 CA2021050889
(87)【国際公開番号】W WO2022000080
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】63/045,283
(32)【優先日】2020-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523003962
【氏名又は名称】キャンバイオシン・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣａｎＢｉｏｃｉｎ Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】オウ，チーシン
(72)【発明者】
【氏名】バーレット，ジョン エフ
(72)【発明者】
【氏名】コレバ，ペトヤ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA30X
4B065CA43
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC56
4C087MA02
4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA66
(57)【要約】
組成物は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および／または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に罹患した伴侶動物に支援を提供するために提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、オオカミプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株およびイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含む。また、組成物を調製するための、および対象においてＩＢＳおよび／またはＩＢＤを処置するための関連する方法も提供される。
【選択図】図５
【選択図】図５
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下：オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株、ここで該オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株はラクトバチルス科の種である；
オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株、ここで該オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株はエンテロコッカス科の種である；および
イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株、ここで該イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株はラクトバチルス科の少なくとも１つの種を含む
を含む、組成物。
【請求項2】
少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
少なくとも１つのプレバイオティクスが、マルトデキストリン、フミン酸、およびフルボ酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株がレビラクトバチルス種であり、オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株がエンテロコッカス種である、請求項１－３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株がレビラクトバチルス・ブレビスであり、オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株がエンテロコッカス・フェシウムである、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株がレビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株であり；およびオオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株がエンテロコッカス・フェシウム株ＷＦ－３ ＩＤＡＣ受託番号１８１２１８－０３またはその変異株である、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株が、ラクチカゼイバチルス種およびリモシラクトバチルス種を含む、請求項１－６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの株が、ラクチカゼイバチルス・カゼイおよびリモシラクトバチルス・ファーメンタムを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株が、以下：ラクチカゼイバチルス・カゼイ株Ｋ９－１ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０１またはその変異株；およびリモシラクトバチルス・ファーメンタム株Ｋ９－２ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２またはその変異株
を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
組成物が、以下：レビラクトバチルス・ブレビス株ＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２；
エンテロコッカス・フェシウム株ＷＦ－３ ＩＤＡＣ受託番号１８１２１８－０３；
ラクチカゼイバチルス・カゼイ株Ｋ９－１ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０１；
リモシラクトバチルス・ファーメンタム株Ｋ９－２ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２；
マルトデキストリン、フミン酸、およびフルボ酸の少なくとも１つ
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
対象において炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および／または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を処置するための、請求項１－１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項12】
対象が飼い犬である、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
請求項１－１０のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象においてＩＢＤおよび／またはＩＢＳを処置するための方法。
【請求項14】
対象が飼い犬である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
組成物が経口投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
請求項１－１０のいずれか一項に記載の組成物と、ＩＢＤおよび／またはＩＢＳを処置するための組成物を投与するための説明書とを含む、キット。
【請求項17】
ＩＢＤおよび／またはＩＢＳを処置するための組成物を作製する方法であって、以下：オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株を提供すること、ここでオオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株はラクトバチルス科の種である、提供すること；
オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株を提供すること、ここでオオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株はエンテロコッカス科の種である、提供すること；
イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株を提供すること、ここでイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株はラクトバチルス科の少なくとも１つの種を含む、提供すること；および
オオカミプロバイオティクス細菌の第１および第２の単離された株と、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの株とを組み合わせること
を含む、方法。
【請求項18】
少なくとも１つのプレバイオティクスを提供すること、および該少なくとも１つのプレバイオティクスをオオカミプロバイオティクス細菌の第１および第２の単離された株ならびにイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株と組み合わせることをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２。
【請求項20】
レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株および少なくとも１つの追加の成分を含む組成物。
【請求項21】
対象において腸内細菌叢症を処置または予防するための薬剤の調製におけるレビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株の使用。
【請求項22】
レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株を対象に投与することを含む、対象において腸内細菌叢症を処置または予防する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願：
本開示は、２０２０年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４５，２８３号に対する優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、２０２０年６月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／０４５，２８３号に対する優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
技術分野：
本開示は、胃腸障害を処置するための組成物に関する。より具体的には、本開示は、伴侶動物における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に罹患した伴侶動物を支援するための組成物および関連する方法に関する。
本開示は、胃腸障害を処置するための組成物に関する。より具体的には、本開示は、伴侶動物における炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および過敏性腸症候群（ＩＢＳ）に罹患した伴侶動物を支援するための組成物および関連する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を有する動物は、下痢、腹痛、胃腸通過時間の加速、および食餌嗜好の変化を含むがこれらに限定されない症状を一般に呈する。一般的な関与する特徴は、遺伝的素因、腸バリア機能の障害、および変化した腸内微生物叢を含む。可能性のある治療法は、抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクス、および糞便移植の適用を含む(Major & Spiller, 2014)。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を有する動物は、下痢、腹痛、胃腸通過時間の加速、および食餌嗜好の変化を含むがこれらに限定されない症状を一般に呈する。一般的な関与する特徴は、遺伝的素因、腸バリア機能の障害、および変化した腸内微生物叢を含む。可能性のある治療法は、抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクス、および糞便移植の適用を含む(Major & Spiller, 2014)。
【0004】
ヒトのＩＢＤおよびＩＢＳを処置するために様々な治療法が開発されてきたが、かかる治療法は一般に動物では有効ではない。飼い犬などの伴侶動物のＩＢＳおよびＩＢＤの処置に最適化された市販の治療薬はほとんどない。
【発明の概要】
【0005】
概要：
一態様において、以下を含む組成物が提供される：オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株、ここで該オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された菌株がラクトバチルス科の種である；オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株、ここで該オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株は、エンテロコッカス科の種である、およびイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも1つの単離された株、ここで該イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株は、ラクトバチルス科の少なくとも１つの種を含む。
一態様において、以下を含む組成物が提供される：オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株、ここで該オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された菌株がラクトバチルス科の種である；オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株、ここで該オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株は、エンテロコッカス科の種である、およびイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも1つの単離された株、ここで該イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株は、ラクトバチルス科の少なくとも１つの種を含む。
【0006】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含む。
【0007】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプレバイオティクスは、マルトデキストリン、フミン酸、およびフルボ酸のうちの少なくとも１つを含む。
【0008】
いくつかの実施形態において、オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株はレビラクトバチルス種であり、オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株はエンテロコッカス種である。
【0009】
いくつかの実施形態において、オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株はレビラクトバチルス・ブレビス（Ｌｅｖｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）であり、オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）である。
【0010】
いくつかの実施形態において、オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株は、レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株である。オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株は、エンテロコッカス・フェシウム株ＷＦ－３ ＩＤＡＣ受託番号１８１２１８－０３またはその変異株である。
【0011】
いくつかの実施形態において、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株は、ラクチカゼイバチルス（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）種およびリモシラクトバチルス（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの株は、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）およびリモシラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）を含む。
【0013】
いくつかの実施形態において、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株は、以下を含む：リモシラクトバチルス・ファーメンタム株Ｋ９－２ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２またはその変異株。
【0014】
いくつかの実施形態において、組成物は以下を含む：エンテロコッカス・フェシウム株ＷＦ－３ ＩＤＡＣ受託番号１８１２１８－０３；ラクチカゼイバチルス・カゼイ株Ｋ９－１ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０１；リモシラクトバチルス・ファーメンタム株Ｋ９－２ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２；マルトデキストリン、フミン酸、およびフルボ酸の少なくとも１つ。
【0015】
別の態様において、対象の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および／または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を処置するための、請求項１－１０のいずれか一項に記載の組成物の使用が提供される。
【0016】
別の態様において、請求項１－１０のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、対象においてＩＢＤおよび／またはＩＢＳを処置する方法が提供される。
【0017】
いくつかの実施形態において、対象は飼い犬である。
【0018】
いくつかの実施形態において、組成物は経口投与される。
【0019】
別の態様において、容器中の請求項１－１０のいずれか一項に記載の組成物と、ＩＢＤおよび／またはＩＢＳを処置するための組成物の投与に関する説明書とを含むキットが提供される。
【0020】
別の態様において、ＩＢＤおよび／またはＩＢＳを処置するための組成物を作製する方法であって、オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株を提供すること、ここでオオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株はラクトバチルス科である、提供すること；オオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株を提供すること、ここでオオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株はエンテロコッカス科の種である、提供すること；イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株を提供すること、ここでイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株は、ラクトバチルス科の少なくとも１つの種を含む、提供すること；およびオオカミプロバイオティクス細菌の第１および第２の単離された株と、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの株を組み合わせることを含む方法が提供される。
【0021】
いくつかの実施形態において、方法は、少なくとも１つのプレバイオティクスを提供すること、および少なくとも１つのプレバイオティクスをオオカミプロバイオティクス細菌の第１および第２の単離された株ならびにイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株と組み合わせることをさらに含む。
【0022】
別の局面において、レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２が提供される。
【0023】
別の態様において、レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株および少なくとも１つの追加の成分を含む組成物が提供される。
【0024】
別の態様において、対象において腸内細菌叢症を処置または予防するための薬剤の調製におけるレビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株の使用が提供される。
【0025】
別の態様において、レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株を対象に投与することを含む、対象の腸内細菌叢症を処置または予防する方法が提供される。
【0026】
本開示の他の態様および特徴は、本開示の特定の実施形態の以下の説明を検討すると、当業者には明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0027】
ここで、添付の図面を参照して、本開示のいくつかの態様をより詳細に説明する。図面において：
【0028】
【図1-1】図１Ａは、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＷＦ－１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。図１Ｂは、リジラクトバチルス・アニマリス（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）ＷＦ－２の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。図１Ｃは、エンテロコッカス・フェシウムＷＦ－３の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。図１Ｄは、ラクチプランティバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＦ－４の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。図１Ｅは、Ｌ．ブレビスＷＦ－５の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。図１Ｆは、ラチラクトバチルス・クルバタス（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＷＦ－６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、Ｌ．ロイテリＷＦ－７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図1-2】図１Ａは、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＷＦ－１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。図１Ｂは、リジラクトバチルス・アニマリス（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）ＷＦ－２の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。図１Ｃは、エンテロコッカス・フェシウムＷＦ－３の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。図１Ｄは、ラクチプランティバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＦ－４の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。図１Ｅは、Ｌ．ブレビスＷＦ－５の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。図１Ｆは、ラチラクトバチルス・クルバタス（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＷＦ－６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、Ｌ．ロイテリＷＦ－７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図1-3】図１Ａは、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＷＦ－１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。図１Ｂは、リジラクトバチルス・アニマリス（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）ＷＦ－２の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。図１Ｃは、エンテロコッカス・フェシウムＷＦ－３の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。図１Ｄは、ラクチプランティバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＦ－４の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。図１Ｅは、Ｌ．ブレビスＷＦ－５の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。図１Ｆは、ラチラクトバチルス・クルバタス（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＷＦ－６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、Ｌ．ロイテリＷＦ－７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【図1-4】図１Ａは、リモシラクトバチルス・ロイテリ（Ｌｉｍｏｓｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）ＷＦ－１の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。図１Ｂは、リジラクトバチルス・アニマリス（Ｌｉｇｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｉｍａｌｉｓ）ＷＦ－２の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号２）を示す。図１Ｃは、エンテロコッカス・フェシウムＷＦ－３の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。図１Ｄは、ラクチプランティバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｉｐｌａｎｔｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＷＦ－４の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。図１Ｅは、Ｌ．ブレビスＷＦ－５の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号５）を示す。図１Ｆは、ラチラクトバチルス・クルバタス（Ｌａｔｉｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）ＷＦ－６の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号６）を示す。図１Ｇは、Ｌ．ロイテリＷＦ－７の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（配列番号７）を示す。
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【図13】図１３は、対照群（プラセボを与えられたイヌ；黒色バー）および試験群（プロバイオティクスを与えられたイヌ；白色バー）（パネルＡ＝総細菌；パネルＢ＝ラクトバチルス属；パネルＣ＝エンテロコッカス属；パネルＤ＝Ｌ．カゼイ；パネルＥ＝Ｌ．ファーメンタム；パネルＦ＝Ｌ．ブレビス；パネルＧ＝Ｅ．フェシウム）から－１日目（処置前）および１９日目（処置中）に収集された糞便試料中の特定の細菌群／種の相対的存在量を示す一連のグラフであり；縦棒は平均±ＳＥＭを表す；アスタリスク（＊）は、２つのデータセットが統計的に有意であることを示し（Ｐ＜０．１０）；共通の上付き文字のない２つのデータセットは、それらが統計的に有意に異なることを示す（Ｐ＜０．０５）。
【0041】
【0042】
【0043】
詳細な説明：
一般に、本開示は、オオカミ（カニス・ループス（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ））プロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株およびイヌ（Ｃ．ｌ．ファミリアリス（ｆａｍｉａｌｉｓ））プロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含む。また、組成物を調製するための関連する方法、ならびに対象においてＩＢＳおよび／またはＩＢＤを処置するための方法も提供される。
一般に、本開示は、オオカミ（カニス・ループス（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ））プロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株およびイヌ（Ｃ．ｌ．ファミリアリス（ｆａｍｉａｌｉｓ））プロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含む。また、組成物を調製するための関連する方法、ならびに対象においてＩＢＳおよび／またはＩＢＤを処置するための方法も提供される。
【0044】
組成物はシンバイオティック組成物であってもよい。本明細書で使用される場合、「シンバイオティック」は、少なくとも１つのプロバイオティクス成分および少なくとも１つのプレバイオティック成分を含む組成物を指す。本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」は、宿主生物に対して少なくとも１つの有益な効果を有する微生物細胞培養物または調製物を指す。宿主生物に対する有益な効果は、例えば、宿主の消化器系、免疫系、および脳－腸－マイクロバイオーム系のうちの少なくとも１つに対する有益な効果を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「プレバイオティクス」とは、少なくとも１つの有益な微生物の成長および／または活動を支援する物質を指す。
【0045】
本明細書で使用される場合、「単離された」または「単離物」は、細株に関して使用される場合、それらの自然環境から分離された細菌を指す。いくつかの実施形態において、単離された株または単離物は、細菌の特定の株の生物学的に純粋な培養物である。本明細書で使用される場合、「生物学的に純粋」とは、生物の他の株を実質的に含まない培養物を指す。
【0046】
組成物は、オオカミプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「オオカミプロバイオティクス細菌」は、オオカミから単離されたプロバイオティクス活性を有するバクテリアを指す。本明細書で使用される場合、「オオカミ」は、カニス・ループス・ファミリアリスを除いて、任意の既知の亜種を含むカニス・ループス種の動物を指す。オオカミは、ハイイロオオカミ（ｇｒａｙ ｗｏｌｆ）、ハイイロオオカミ（ｇｒｅｙ ｗｏｌｆ）、シンリンオオカミ、またはツンドラオオカミとしても知られていてもよい。いくつかの実施形態において、オオカミは放し飼いのオオカミである。いくつかの実施形態において、オオカミは、カナダのサスカチュワン州にあるプリンス・アルバート国立公園原産の放し飼いのオオカミである。
【0047】
オオカミプロバイオティクス細菌の各単離された株は、オオカミの胃腸管に固有の胃腸細菌の単離された株であってもよい。いくつかの実施形態において、単離された株はオオカミの糞から単離される。他の実施形態において、各単離された株は、任意の他の適切な手段によってオオカミから単離されてもよい。
【0048】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は乳酸菌の株である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は、リモシラクトバチルス、リジラクトバチルス、ラクチプランチバチルス、レビラクトバチルス、もしくはラチラクトバチルス属の種、または以前のラクトバチルス属の任意の他の種（「乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）」という）を含むがこれらに限定されないラクトバチルス科の種である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は、例えば、エンテロコッカス属の種を含むエンテロコッカス科の種である。他の実施形態において、単離された株は、オオカミの胃腸管に由来する胃腸細菌の任意の他の属である。
【0049】
いくつかの実施形態において、オオカミプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株は、リモシラクトバチルス・ロイテリ（以前のラクトバチルス・ロイテリ）、リジラクトバチルス・アニマリス（以前のラクトバチルス・アニマリス）、エンテロコッカス・フェシウム、ラクチプランティバチルス・プランタルム（以前のラクトバチルス・プランタルム）、レビラクトバチルス・ブレビス（以前のラクトバチルス・ブレビス）、およびラチラクトバチルス・クルバタス（以前のラクトバチルス・クルバタス）であった。当業者は、現在および以前の名前が同じ種を指し、実施形態が特定の用語に限定されないことを理解するであろう。
【0050】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は、以下の表１に列挙された株から選択され、国際ＰＣＴ（特許協力条約）特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に開示され、ＷＯ２０２０／０３７４１４として公開され、参照により本明細書に組み込まれる。表１の各細株について、２０１８年１２月１８日のブダペスト条約に基づき、各単離された株の生物学的に純粋なストックがカナダ国際寄託機関（ＩＤＡＣ）(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)に寄託された。
【表1】
【0051】
いくつかの実施形態において、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列を使用して、細菌の属および種を同定することができる。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列の配列決定は、ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に記載されている方法を使用して実行できる。表１に記載されている単離された株の部分１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を図１Ａから１Ｇに示す。
【0052】
いくつかの実施形態において、単離された株の１つは、カナダ、サスカチュワン州のプリンス・アルバート国立公園原産の放し飼いのオオカミの糞から単離されたレビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂである。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの生物学的に純粋な株は、２０２０年１１月５日のブダペスト条約に基づき、カナダ国際寄託機関（ＩＤＡＣ）(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)に寄託され、受託番号０５１１２０－０２が割り当てられた。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの部分１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を図２（配列番号１０）に示す。
【0053】
以下の実施例で実証されるように、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの細菌は、低ｐＨおよび胆汁塩の存在に対して耐性を示す。細菌はまた、少なくとも１つの胃および／または腸の消化酵素の存在に対して耐性を示す。これらの結果は、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂが、酸性のイヌの胃およびイヌの腸を通過しても生き残ることができることを示している。本明細書で使用される場合、「生き残る」とは、試験培養物の生細胞数（１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で測定される）が検出限界［１．７ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）または５０ＣＦＵ／ｍＬ］を超えていることを意味する。
【0054】
以下の実施例はまた、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの細菌が自己凝集能力および細胞表面疎水性を有することを示しており、細菌細胞が対象の宿主腸上皮細胞に結合して胃腸管のコロニー形成を促進することができる可能性があることを示している。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの細菌は、インビトロでイヌの上皮細胞に結合することもわかっている。
【0055】
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの細菌は、少なくとも１つの病原微生物または腐敗微生物の増殖を阻害する阻害物質を産生することも示されている。以下で説明するように、ＷＦ－１Ｂは、大腸菌、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、およびエンテロコッカス・フェカリスを含む病原微生物または腐敗微生物のいくつかの株を阻害することがわかっている。
【0056】
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンに対して感受性であるが、アンピシリン、カナマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールに対して耐性である。抗生物質感受性は、病原性細菌を含む他の細菌への抗生物質耐性遺伝子の伝達を防ぐために望ましい場合がある。細菌の増殖が観察されない最低の抗生物質濃度は、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）と呼ばれる。いくつかの実施形態において、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、欧州食品安全機関（the European Food Safety Authority）（ＥＦＳＡ）によって設定されたＭＩＣカットオフ値以下の少なくとも１つの抗生物質のＭＩＣ値を有する。全ゲノム配列解析により、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂのアンピシリン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールに対する耐性は、固有耐性またはゲノム変異による獲得耐性のいずれかに分類されることが示されている。水平抗生物質耐性（ＡＲ）遺伝子伝達のリスクは低い。したがって、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂを動物栄養の飼料添加物として使用することは安全であると考えられる。
【0057】
いくつかの実施形態において、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、１つまたは複数の他の望ましい特性を示し、かかる特性は、本明細書に記載のものだけに限定されない。
【0058】
いくつかの実施形態において、組成物は、上記の株のうちの１つの突然変異体を含む。本明細書で使用する場合、「突然変異体」または「突然変異株」は、参照細株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列と少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、少なくとも９９％の相同性、または少なくとも９９．５％の相同性を有するが、それ以外の場合、細菌ゲノムの１つまたは複数の他のＤＮＡ配列に１つまたは複数のＤＮＡ変異を有する細株を指す。ＤＮＡ変異は、遷移および転移を含む塩基置換、欠失、挿入、およびその他の任意の種類の自然または誘導されたＤＮＡ修飾を含んでもよい。
【0059】
いくつかの実施形態において、組成物は、オオカミプロバイオティクス細菌の単離された株の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、オオカミプロバイオティクス細菌の第１の単離された株およびオオカミプロバイオティクス細菌の第２の単離された株を含む。いくつかの実施形態において、第１の単離された株はラクトバチルス科の種であり、第２の単離された株はエンテロコッカス科の種である。
【0060】
第１の単離された株は、例えば、リモシラクトバチルス属、リジラクトバチルス属、ラクチプランチバチルス属、レビラクトバチルス属、またはラチラクトバチルス属（または以前のラクトバチルス属の任意の他の種）の単離された株を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第１の単離された株は、レビラクトバチルス・ブレビスなどのレビラクトバチルス種である。いくつかの好ましい実施形態において、第１の単離された株は、レビラクトバチルス・ブレビスＷＦ－１Ｂ ＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２またはその変異株である。
【0061】
第２の単離された株は、例えば、エンテロコッカス属の単離された株を含んでもよい。いくつかの実施形態において、第２の単離された株はエンテロコッカス・フェシウムである。いくつかの好ましい実施形態において、第２の単離された株は、エンテロコッカス・フェシウム株ＷＦ－３ ＩＤＡＣ受託番号１８１２１８－０３またはその変異株である。
【0062】
いくつかの実施形態において、組成物は、第３、第４、第５の単離された株などのオオカミプロバイオティクス細菌の追加の単離された株をさらに含んでもよい。他の実施形態において、組成物は、オオカミプロバイオティクス細菌の単離された株の他の適切な組み合わせを含んでもよい。
【0063】
組成物は、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株をさらに含んでもよい。本明細書で使用される場合、「イヌ（ｃａｎｉｎｅ）プロバイオティクス細菌」または「イヌ（ｄｏｇ）プロバイオティクス細菌」は、イヌから単離されたプロバイオティクス活性を有する細菌を指す。本明細書で使用される場合、「イヌ」または「飼い犬」は、カニス・ループス・ファミリアリス亜種の動物を指す。一部の分類学当局は、飼い犬を別の種のカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）として認識している。
【0064】
イヌプロバイオティクス細菌の各単離された株は、イヌの胃腸管に固有の胃腸細菌の単離された株であってもよい。いくつかの実施形態において、単離された株はイヌの糞から単離される。他の実施形態において、各単離された株は、任意の他の適切な手段によってイヌから単離されてもよい。
【0065】
いくつかの実施形態において、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株は、乳酸菌の株である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は、リモシラクトバチルスまたはラクチカゼイバチルス属の種（または以前のラクトバチルス属の任意の他の種）を含むがこれらに限定されないラクトバチルス科の種である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は、ラクチカゼイバチルス・カゼイ（以前のラクトバチルス・カゼイ）またはリモシラクトバチルス・ファーメンタム（以前のラクトバチルス・ファーメンタム）から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は、表２に列挙され、参照により本明細書に組み込まれるカナダ特許第２，８９０，９６５号に開示される株から選択される。表２の各細株について、２０１５年４月２１日のブダペスト条約に基づいて、各単離された株の生物学的に純粋なストックがカナダ国際寄託機関（ＩＤＡＣ）(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)に寄託された。表２の株の部分１６Ｓ ｒＤＮＡ配列を図３Ａおよび３Ｂに示す。
【表2】
【0066】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの単離された株は、表２に列挙された株のうちの１つの突然変異体である。
【0067】
組成物は、イヌプロバイオティクス細菌の単離された株の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、イヌプロバイオティクス細菌の第１の単離された株およびイヌプロバイオティクス細菌の第２の単離された株を含む。第１および第２の株は両方ともラクトバチルス科の種であってもよい。いくつかの実施形態において、第１の単離された株はラクチカゼイバチルス・カゼイなどのラクチカゼイバチルス種であり、第２の単離された株はリモシラクトバチルス・ファーメンタムなどのリモシラクトバチルス種である。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、ラクチカゼイバチルス・カゼイＫ９－１ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０１およびリモシラクトバチルス・ファーメンタム株Ｋ９－２ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２を含む。
【0068】
いくつかの実施形態において、組成物は、第３、第４、第５の単離された株などのイヌプロバイオティクス細菌の追加の単離された株をさらに含んでもよい。
【0069】
以下の実施例で実証されるように、オオカミプロバイオティクス細菌およびイヌのプロバイオティクス細菌の単離された株は、飼い犬に経口投与された場合、一般的に良好に忍容される。単離された株はまた、イヌの胃腸管を通過しても生き残ることができる。いくつかの実施形態において、以下でより詳細に説明するように、各単離された株は対象に対して１つまたは複数の有益な生理学的効果を有する。
【0070】
いくつかの実施形態において、オオカミプロバイオティクス細菌およびイヌプロバイオティクス細菌の単離された株は、生存可能な形態であってもよい。いくつかの実施形態において、単離された株は、凍結乾燥（凍結乾燥）された形態であってもよい。他の実施形態において、単離された株は液体懸濁液の形態である。
【0071】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含むシンバイオティック組成物である。いくつかの実施形態において、プレバイオティクスは、多糖プレバイオティクスを含む。例えば、プレバイオティクスはマルトデキストリンを含んでもよい。他の実施形態において、プレバイオティクスは、フミン酸および／またはフルボ酸を含む少なくとも１つの腐植物質成分を含む。「フミン酸」および「フルボ酸」なる語は、それぞれフミン酸およびフルボ酸の異種混合物、ならびにそれらの任意の塩、エステル、または他の誘導体を含むと理解される。フミン酸は一般にアルカリ性ｐＨで水溶性であるが、酸性条件下では溶解しにくくなるが、フルボ酸は一般にすべてのｐＨ値で水溶性である。
【0072】
いくつかの実施形態において、組成物は、２つ以上のプレバイオティクスの組み合わせを含む。例えば、組成物は、マルトデキストリンとフミン酸および／またはフルボ酸との組み合わせを含んでもよい。他の実施形態において、組成物は、任意の他の適切なプレバイオティクスまたはプレバイオティクスの組み合わせを含んでもよい。組成物のプレバイオティック成分は、液体形態、粉末形態、またはいずれか１つの適切な形態であってもよい。
【0073】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのプレバイオティクスは、組成物中のオオカミプロバイオティクス細菌および／またはイヌプロバイオティクス細菌の増殖および／または活性を支援してもよい。一部の実施形態において、以下でより詳細に説明するように、少なくとも１つのプレバイオティクスが、対象に対して１つまたは複数の有益な生理学的効果を有してもよい。
【0074】
１つの特定の例として、組成物は、以下を含むシンバイオティック組成物であってもよい：エンテロコッカス・フェシウム株ＷＦ－３ ＩＤＡＣ受託番号１８１２１８－０３；ラクチカゼイバチルス・カゼイ株Ｋ９－１ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０１；リモシラクトバチルス・ファーメンタム株Ｋ９－２ ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２；およびマルトデキストリン、フミン酸、およびフルボ酸の少なくとも１つ。
【0075】
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、細胞数または光学密度によって、単離された株のそれぞれを等しい割合で含む。他の実施形態において、組成物は、単離された株を他の適切な比率で含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも約１×１０７ＣＦＵ／ｇの各単離された株を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約１×１０７ＣＦＵ／ｇから約１×１０１１ＣＦＵ／ｇの間を含む。
【0076】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬのプレバイオティクス、または約１ｍｇ／ｍＬから約２０ｍｇ／ｍＬの間、または約５ｍｇ／ｍＬから約１５ｍｇ／ｍＬのプレバイオティクスを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約１０ｍｇ／ｍＬのマルトデキストリンまたは約１０ｍｇ／ｍＬのフミン酸および／またはフルボ酸を含む。他の実施形態において、組成物は、任意の他の適切な濃度のマルトデキストリン、フミン酸および／またはフルボ酸を含む。
【0077】
いくつかの実施形態において、組成物は、相乗的に有効な量のオオカミプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株；相乗的に有効な量のイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株；および／または相乗的に有効な量の少なくとも１つのプレバイオティクスを含む。本明細書で使用される場合、「相乗的に有効な量」は、組成物中の少なくとも１つの他の成分との相乗効果を誘発するのに十分な１つの成分の量を指す。
【0078】
組成物は、即時放出、高速放出、遅延放出、持続放出、もしくは遅延放出組成物、または任意の他の適切なタイプの組成物であってもよい。
【0079】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの薬学的または栄養的に許容される賦形剤をさらに含んでもよい。適切な賦形剤の非限定的な例は、充填剤、結合剤、担体、希釈剤、安定剤、潤滑剤、流動促進剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、崩壊剤、保存剤、吸着剤、甘味料、および任意の他の薬学的または栄養的に許容される賦形剤を含む。
【0080】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの封入材料をさらに含んでもよい。適切な封入材料の非限定的な例は、アルギン酸塩、植物／微生物ゴム、キトサン、デンプン、ｋ－カラギーナン、酢酸フタル酸セルロースなどの多糖類；ゼラチンまたは乳タンパク質などのタンパク質；脂肪；およびその他の適切な封入材料を含む。単離された株は、噴霧乾燥、押出、ゲル化、液滴押出、エマルジョン、凍結乾燥、または任意の他の適切な封入化方法によって、封入材料に封入化されてもよい。単離された株の細菌細胞の封入化は、細胞を保護し、組成物の貯蔵寿命を延ばすことができる。
【0081】
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの追加の医薬または栄養成分をさらに含んでもよい。追加の成分の非限定的な例は、少なくとも１つのビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、アミノ酸、または任意の他の適切な医薬品または栄養成分を含む。
【0082】
いくつかの実施形態において、組成物は摂取可能な組成物である。本明細書で使用される場合、「摂取可能な」は、対象が経口摂取できる物質を指す。
【0083】
いくつかの実施形態において、摂取可能な組成物は栄養補助食品の形態である。栄養補助食品は、粉末、カプセル、ゲルカプセル、マイクロカプセル、ビーズ、錠剤、咀嚼錠、グミ、液体、または任意の他の適切な形態の栄養補助食品の形態であってもよい。
【0084】
いくつかの実施形態において、摂取可能な組成物は食品の形態である。いくつかの実施形態において、食品は伴侶動物、特に飼い犬に適した任意の形態である。いくつかの実施形態において、食品は固形食品である。いくつかの実施形態において、固形食品は、乾燥、湿った、半湿潤、冷凍、脱水、凍結乾燥、または任意の他の適切な形態であってもよい。適切な固形食品の例は、キブル、ビスケット、チュー、湿ったドッグフード、生肉を含む生のドッグフード、凍結乾燥ヨーグルトなどのドッグフードを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、固形食品は、例えば、凍結乾燥されたイヌのおやつを含むイヌのおやつの形態であってもよい。
【0085】
いくつかの実施形態において、固形食品は、その中に組成物とともに配合される。他の実施形態において、組成物は、製造後に固形食品に添加することができる。
【0086】
いくつかの実施形態において、摂取可能な組成物は、固形食品用の表面コーティングの形態であってもよい。いくつかの実施形態において、表面コーティングは、細菌が固形食品の表面に付着することを可能にする担体を含む。担体は、例えば、食用油または任意の他の適切な担体であってもよい。一例として、オイルベースの表面コーティングは、キブルしたドッグフードの製造後および冷却後に適用できる。
【0087】
他の実施形態において、摂取可能な組成物は、固形食品の表面にふりかけるのに適した粉末形態で提供されてもよい。他の実施形態において、摂取可能な組成物は、固形食品の表面に噴霧、注ぎ、または滴下するために液体形態で提供されてもよい。
【0088】
他の実施形態において、食品は液体食品である。液体食品の非限定的な例は、飲料、ブロス、油性懸濁液、グレービー、乳ベースの製品、液体または半固体のヨーグルトなどを含む。
【0089】
いくつかの実施形態において、液体食品は、その中に組成物とともに配合される。他の実施形態において、組成物は製造後に液状食品に添加することができる。いくつかの実施形態において、摂取可能な組成物は粉末形態で提供されてもよく、粉末は、水、牛乳、または任意の他の適切な液体に溶解されて、液体食品を形成してもよい。他の実施形態において、摂取可能な組成物は、液体の形態で提供されてもよく、水、牛乳、または任意の他の適切な液体と混合されて、液体食品を形成してもよい。あるいは、液体食品は、対象の口に直接噴射する、注ぐ、または落下させてもよい。
【0090】
他の実施形態において、摂取可能な組成物は、伴侶動物、特に飼い犬による摂取に適した任意の他の形態であってもよい。 他の実施形態において、組成物は、非摂取形態、例えば座薬、または任意の他の適切な形態であってもよい。
【0091】
本明細書では、上記の組成物を用いて対象の胃腸障害を処置する方法が提供される。また、本明細書では、対象の胃腸障害を処置するための組成物の使用も提供される。本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置」は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、健康状態またはその症状を完全にまたは部分的に予防するという点で予防的である可能性があり、および／または健康状態の少なくとも１つの症状および／または健康状態に起因する悪影響を完全にまたは部分的に改善するという点で治療的である可能性がある。より明確にするために、この文脈における「処置する」または「処置」なる語は、対象に何らかの有益な生理学的効果を提供することを含むことを意図しており、それらの意味は、特定の障害または健康状態を予防または治癒することに限定されないことが理解されるであろう。
【0092】
いくつかの実施形態において、対象は、飼い犬を含むがこれに限定されない伴侶動物である。いくつかの実施形態において、イヌは成犬である。他の実施形態において、イヌは、他の発育段階にある。
【0093】
いくつかの実施形態において、組成物は、対象において炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および／または過敏性腸症候群（ＩＢＳ）を処置するために使用されてもよい。本明細書で使用される場合、「ＩＢＤ」は、例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む胃腸管の炎症状態を指す。本明細書で使用される場合、「ＩＢＳ」は、対象が再発性または慢性の胃腸症状を経験する機能性腸障害を指す。一般的な症状には、下痢、腹痛、消化管通過時間の短縮、食事の好みの変化などがあるが、これらに限定されない．いくつかの実施形態において、組成物は、ＩＢＤおよび／またはＩＢＳの１つ以上の症状を処置するために使用されてもよい。他の実施形態において、組成物は、例えば、他の機能性腸障害を含む他の胃腸障害を処置するために使用されてもよい。
【0094】
理論に制限されることなく、オオカミプロバイオティクス細菌およびイヌプロバイオティクス細菌の単離された株の組み合わせは、プレバイオティック成分とともに、相乗的に作用して少なくとも１つの有益な生理学的効果を誘導し、対象においてＩＢＤおよび／またはＩＢＳに関連する不快感を改善する。
【0095】
ＩＢＤおよびＩＢＳなどの胃腸障害は、局所腸炎症および腸バリアの完全性の喪失に関連する。いくつかの実施形態において、組成物の有益な生理学的効果は、腸タイトジャンクションタンパク質機能に対する正の効果、および腸組織のバリア障害の回復または予防を含む。いくつかの実施形態において、有益な生理学的効果は、腸組織の生存能力の維持を助けることも含む。組成物はまた、例えばＴＮＦ－αを含む腸内の炎症促進性サイトカインの発現を減少させてもよい。
【0096】
さらに、ＩＢＤおよびＩＢＳはまた、腸内微生物叢の変化および腸内細菌による繊維の発酵によって産生される短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）のレベルの低下と関連している。ＳＣＦＡは、腸の恒常性を維持する上で重要な代謝産物である。いくつかの実施形態において、組成物の有益な生理学的効果は、腸内微生物叢の構成および／またはＳＣＦＡの産生に対する正の効果、例えば酢酸、プロピオン酸および／または酪酸のレベルの増加を含む。
【0097】
いくつかの実施形態において、組成物は、１つまたは複数の追加の有益な生理学的効果を提供し、実施形態は、本明細書に開示される利益のみに限定されない。
【0098】
いくつかの実施形態において、オオカミおよびイヌプロバイオティクス細菌の単離された株およびプレバイオティクス成分はすべて、同じ有益な生理学的効果の１つまたは複数に寄与してもよい。あるいは（またはさらに）、オオカミプロバイオティクス細菌、イヌプロバイオティクス細菌、および／またはプレバイオティクス成分は、１つまたは複数の異なる有益な生理学的効果に寄与してもよい。例えば、以下の実施例で実証されているように、オオカミおよびイヌプロバイオティクス細菌の４株のカクテルは、腸バリアの完全性および腸の炎症にプラスの効果を示した一方、マルトデキストリンなどのプレバイオティクスは、株自体よりも腸内微生物叢の組成およびＳＣＦＡ産生に大きな影響を示した。したがって、組成物のプロバイオティクスおよびプレバイオティック成分は、ＩＢＤおよび／またはＩＢＳの症状の改善において全体的な利益を達成するための補完的な効果を有してもよい。
【0099】
組成物は、対象に有効量で投与されてもよい。本明細書で使用される場合、「有効量」または「治療有効量」は、症状または健康状態を予防、軽減、または排除するのに有効であってもよい組成物の量を指す。
【0100】
いくつかの好ましい実施形態において、組成物は対象に経口投与可能である。他の実施形態において、組成物は、被験体に経腸および／または直腸投与可能であってもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、少なくとも月に１回、少なくとも週に１回、または少なくとも１日に１回を含む任意の適切な間隔で対象に投与されてもよい。
【0101】
いくつかの実施形態において、有効量を１日１回の用量で投与することができる。他の実施形態において、有効量は、１日を通して適切な間隔で２回以上の部分用量で、または１日を通して微量用量として投与されてもよい。単離された株およびプレバイオティクスを１回の投与で一緒に投与することが好ましいが、本明細書の実施形態は、組成物の１つまたは複数の成分を別々に投与することを意図している。
【0102】
本明細書に記載の組成物における使用に加えて、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に記載されている個々の菌株と同様に、対象の健康を改善または維持するためのプロバイオティクスとして単独で使用されてもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、対象において腸内細菌叢症を処置または予防するために、または健康状態もしくは障害について対象を処置するために使用されてもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂを使用して、対象の下痢を処置または予防することができる。他の実施形態において、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂを使用して、対象に任意の他の健康上の利益を提供することができる。いくつかの実施形態において、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、腸内細菌叢症、下痢、または任意の他の適切な健康状態の処置または予防のための医薬品の調製において使用されてもよい。
【0103】
いくつかの実施形態において、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、細株および１つ以上の追加の成分を含む組成物の一部として投与されてもよい。追加の成分は、多株組成物について上述した成分のいずれかを含むことができる。追加の成分の非限定的な例は、１つまたは複数の薬学的または栄養的に許容される賦形剤、封入材料、食用成分および／または食品を含む。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ組成物は、例えば、サプリメントおよび食品を含む、上記の組成物と同じ形態のいずれであってもよい。
【0104】
ＩＢＤまたはＩＢＳを有する対象に投与するための組成物を調製するための方法も、本明細書において提供される。この方法は、本明細書に開示される組成物の実施形態を調製するために使用されてもよい。
【0105】
図４は、いくつかの実施形態による、組成物を作成するための例示的な方法１００のフローチャートを示す。ブロック１０２では、オオカミプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株が提供される。ブロック１０４では、イヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株が提供される。この文脈における「提供する」なる語は、単離された株を作製すること（単離することまたは培養することを含む）、受け取ること、購入すること、または別の方法で得ることを指してもよい。
【0106】
オオカミプロバイオティクス細菌およびイヌプロバイオティクス細菌の単離された株は、本明細書に開示される株のいずれであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、オオカミプロバイオティクス細菌の単離された株は、Ｌ．ブレビスＷＦ－１ＢＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２およびＥ．イヌプロバイオティクス細菌の単離された株は、Ｌ．カゼイ株Ｋ９－１ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０１およびＬ．ファーメンタム株Ｋ９－２ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２である。
【0107】
ブロック１０６において、オオカミプロバイオティクス細菌の単離された株は、イヌプロバイオティクス細菌の単離された株と組み合わされる。この文脈における「組み合わせる」なる語は、単離された株を混合、ブレンド、または他の方法で一緒にすることを指す。
【0108】
いくつかの実施形態において、方法１００は、少なくとも１つのプレバイオティクスを提供することをさらに含む。例えば、プレバイオティクスは、マルトデキストリン、フミン酸および／またはフルボ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、方法１００は、プレバイオティクスをオオカミおよびイヌプロバイオティクス細菌の単離された株と組み合わせることをさらに含む。いくつかの実施形態において、単離された株およびプレバイオティクスを同時に組み合わせる。他の実施形態において、単離された株を最初に組み合わせて混合物を形成し、混合物をプレバイオティクスと組み合わせる。
【0109】
いくつかの実施形態において、方法１００は、１つまたは複数の追加の成分を提供すること、および追加の成分を単離された株およびプレバイオティクスと組み合わせることをさらに含む。追加の成分の非限定的な例は、１つまたは複数の薬学的または栄養的に許容される賦形剤、封入材料、食用成分および／または食品を含む。
【0110】
また、本明細書では、容器内の組成物と、ＩＢＤおよび／またはＩＢＳを有する対象に組成物を投与するための説明書とを含むキットが提供される。組成物は、オオカミプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株およびイヌプロバイオティクス細菌の少なくとも１つの単離された株を含んでもよい。オオカミプロバイオティクス細菌およびイヌプロバイオティクス細菌の単離された株は、本明細書に開示される株のいずれであってもよい。いくつかの好ましい実施形態において、オオカミプロバイオティクス細菌の単離された株は、Ｌ．ブレビスＷＦ－１ＢＩＤＡＣ受託番号０５１１２０－０２およびＥ．イヌプロバイオティクス細菌の単離された株は、Ｌ．カゼイ株Ｋ９－１ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０１およびＬ．ファーメンタム株Ｋ９－２ＩＤＡＣ受託番号２１０４１５－０２である。
【0111】
キット中の単離された株は、凍結乾燥形態、液体形態、または任意の他の適切な形態で提供することができる。単離された株は好ましくは単一の容器内で組み合わされるが、１つまたは複数の株が別々の容器内で提供され、キットが株を一緒に組み合わせるための説明書を含む実施形態も企図される。
【0112】
いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、マルトデキストリン、フミン酸、および／またはフルボ酸を含む、少なくとも１つのプレバイオティクスをさらに含む。いくつかの実施形態において、プレバイオティクスは、単離された株と同じ容器内で組み合わされる。他の実施形態において、少なくとも１つのプレバイオティクスを別個の容器で提供することができ、キットは、プレバイオティクスを組成物の残りと組み合わせる説明書を含むことができる。
【0113】
組成物の投与のための説明書は、飼い犬などの伴侶動物に組成物を投与するための説明書を含んでもよい。説明書は、組成物を投与するための推奨用量および頻度を含んでもよく、また、食物の有無にかかわらず、他の薬剤の有無にかかわらず組成物を摂取するための指示も含んでもよい。
【0114】
前述のものに限定されることなく、本組成物、使用、および方法は、以下の実施例によってさらに説明される。
【0115】
実施例１－Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの分離および同定
２０１７年３月２３日、カナダのサスカチュワン州にあるプリンス・アルバート国立公園から、放し飼いのオオカミの糞便試料が採取された。ＷＦ－１Ｂと標識された新規株を、ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に記載されている方法を使用して分離および同定した。
２０１７年３月２３日、カナダのサスカチュワン州にあるプリンス・アルバート国立公園から、放し飼いのオオカミの糞便試料が採取された。ＷＦ－１Ｂと標識された新規株を、ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に記載されている方法を使用して分離および同定した。
【0116】
グラム染色を、標準的な方法を用いて行い、グラム染色された細菌を、ＯＭＡＸ（登録商標）ＬＥＤ４０ｘ－２０００ｘデジタル双眼生物学的化合物顕微鏡上の１００ｘレンズを用いて視覚化し、写真を、顕微鏡に接続される３．０ＭＰ ＵＳＢカメラを用いて得た。単離された株ＷＦ－１Ｂの棒状細菌の形態を示すグラム染色の結果を、図５に示す。
【0117】
株の種を同定するために、ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に記載されているように、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）をコードする部分遺伝子をＰＣＲによって増幅し、サンガー配列決定によって配列決定した。１６Ｓ ｒＤＮＡ配列決定の結果を図２に示し、単離された株をレビラクトバチルス・ブレビスと同定した。
【0118】
株レベルで単離された株を同定するために、全ゲノム配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実施して、株に関するより詳細な情報を得た。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの全ゲノム配列決定のデータ解析結果を、以下の表３に示す。
【表3】
【0119】
単離された株Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの生物学的に純粋な培養物の試料は、２０２０年１１月５日にブダペスト条約、および割り当てられた受託番号０５１１２０－０２下で、カナダ国際寄託機関（ＩＤＡＣ）(1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2)に寄託された。
【0120】
実施例２－Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの特徴付け
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの生物学的活性を、以下に概説するように、ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に記載された方法を使用して特徴付けた。
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの生物学的活性を、以下に概説するように、ＰＣＴ／ＣＡ２０１９／０５１１４０に記載された方法を使用して特徴付けた。
【0121】
実施例２．１自己凝集機能
単離された株の自己凝集活性を評価するために、自己凝集アッセイを実施した。十分に成長した培養液３０ｍＬをボルテックスで完全に混合した。６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００、Ａ０）を測定し、記録した。残りの細胞懸濁液を静置し、周囲温度で５時間静置した。ＯＤ６００ｎｍ（Ａｔ）を測定するために、上部懸濁液（細胞懸濁液はボルテックスされていない）１００μＬを１時間間隔で採取した。自己凝集のパーセンテージを次のように表した。
[式中、Ａ０は０時間でのＯＤ６００を表し、Ａｔは１時間、２時間、３時間、４時間、または５時間でのＯＤ６００を表す。]
単離された株の自己凝集活性を評価するために、自己凝集アッセイを実施した。十分に成長した培養液３０ｍＬをボルテックスで完全に混合した。６００ｎｍでの初期光学密度（ＯＤ６００、Ａ０）を測定し、記録した。残りの細胞懸濁液を静置し、周囲温度で５時間静置した。ＯＤ６００ｎｍ（Ａｔ）を測定するために、上部懸濁液（細胞懸濁液はボルテックスされていない）１００μＬを１時間間隔で採取した。自己凝集のパーセンテージを次のように表した。
【数1】
【0122】
Ｌ．ブレビスＷＦ１Ｂの自己凝集率（パーセンテージ）を図６に示す。これらの結果は、単離された株が宿主の腸上皮細胞表面に付着する可能性があることを示している。
【0123】
実施例２．２細胞表面の疎水性
Ｌ．ブレビスＷＦ１Ｂの細菌細胞表面の疎水性を評価するために、炭化水素への微生物接着（ＭＡＴＨ）アッセイ（Ｏｔｅｒｏら、２００４）を実施して、接着に関して株の疎水性を測定した。８，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、続いて細胞を生理食塩水で３回洗浄することにより、十分に増殖した培養液１０ｍＬを回収した。細胞ペレットを生理食塩水で再懸濁し、各細胞懸濁液のＯＤ６００を０．５±０．１に調整した。各細胞懸濁液の実際の最終ＯＤ６００を測定し、記録した。細胞懸濁液の３．６ｍＬをガラス試験管に分注し、続いて溶媒（トルエンまたはキシレン）０．６ｍＬを同じガラス試験管に分注し、１分間激しくボルテックスした。試験管を１時間静置して、混和しない溶媒と水相を分離させた。水層をパスツールピペットで除去し、ＯＤ６００（ＯＤｔｅｓｔ）を測定して記録した。各株の疎水性のパーセンテージを、次の式として計算した。
Ｌ．ブレビスＷＦ１Ｂの細菌細胞表面の疎水性を評価するために、炭化水素への微生物接着（ＭＡＴＨ）アッセイ（Ｏｔｅｒｏら、２００４）を実施して、接着に関して株の疎水性を測定した。８，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、続いて細胞を生理食塩水で３回洗浄することにより、十分に増殖した培養液１０ｍＬを回収した。細胞ペレットを生理食塩水で再懸濁し、各細胞懸濁液のＯＤ６００を０．５±０．１に調整した。各細胞懸濁液の実際の最終ＯＤ６００を測定し、記録した。細胞懸濁液の３．６ｍＬをガラス試験管に分注し、続いて溶媒（トルエンまたはキシレン）０．６ｍＬを同じガラス試験管に分注し、１分間激しくボルテックスした。試験管を１時間静置して、混和しない溶媒と水相を分離させた。水層をパスツールピペットで除去し、ＯＤ６００（ＯＤｔｅｓｔ）を測定して記録した。各株の疎水性のパーセンテージを、次の式として計算した。
【数2】
【0124】
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの疎水性パーセンテージを図７に示す。これらの結果は、単離された株が宿主腸上皮細胞表面に付着する可能性を有することを示している。
【0125】
実施例２．３－低ｐＨおよび胆汁塩耐性アッセイ
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの酸性条件に対する耐性を評価するために、完全に増殖した培養物（１０μＬ）の１％を、種々のｐＨ値（ｐＨ＝２．０、２．５、３．０、および７．０）を使用して、シミュレートされた胃液（ＳＧＦ、ペプシンなし）の１ｍＬ溶液のセットに継代培養した。異なるｐＨ値を有するＳＧＦ溶液は、ＳＧＦのｐＨをＨＣｌおよびＮａＯＨで調整し、続いて濾過による滅菌を行うことによって調製した。各継代培養物を各ＳＧＦ溶液に接種したら、混合物をボルテックスで完全に混合し、各混合物の６０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注して、希釈および播種した。残りの培養物は、すぐに気密条件下で３７°Ｃで６時間インキュベートした。６０μＬの各培養液を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注し、それぞれ２時間、４時間、および６時間のインキュベーション後に、希釈および播種を行った。
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの酸性条件に対する耐性を評価するために、完全に増殖した培養物（１０μＬ）の１％を、種々のｐＨ値（ｐＨ＝２．０、２．５、３．０、および７．０）を使用して、シミュレートされた胃液（ＳＧＦ、ペプシンなし）の１ｍＬ溶液のセットに継代培養した。異なるｐＨ値を有するＳＧＦ溶液は、ＳＧＦのｐＨをＨＣｌおよびＮａＯＨで調整し、続いて濾過による滅菌を行うことによって調製した。各継代培養物を各ＳＧＦ溶液に接種したら、混合物をボルテックスで完全に混合し、各混合物の６０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注して、希釈および播種した。残りの培養物は、すぐに気密条件下で３７°Ｃで６時間インキュベートした。６０μＬの各培養液を新しい９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注し、それぞれ２時間、４時間、および６時間のインキュベーション後に、希釈および播種を行った。
【0126】
胆汁塩に対する単離された株の耐性を評価するために、１％の完全に成長した培養物（１０μＬ）を、さまざまな胆汁塩濃度（０％、３％、および５％）を含む１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２）のセットに継代培養した。異なる胆汁塩濃度のＰＢＳ溶液を、対応する量の胆汁塩を無菌ＰＢＳに溶解することによって調製した。培養物を各ＰＢＳ溶液に接種したら、混合物をボルテックスで完全に混合し、各混合物の６０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注して、希釈および播種した。残りの培養物を気密条件下、３７°Ｃで２４時間直ちにインキュベートした。６時間および２４時間のインキュベーション後、希釈および播種のために、それぞれの培養液６０μＬを新しい９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注した。
【0127】
各培養物の連続１０倍希釈液を調製し、適切な希釈液をＭＲＳ寒天プレートに播種し、３７°Ｃで２日間インキュベートした。生細胞数を記録し、少なくとも３回の独立した複製の平均［ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）］±標準誤差として表した。
【0128】
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの低ｐＨおよび胆汁塩耐性アッセイの結果を、それぞれ図８および９に示す。低ｐＨ研究は、ＷＦ－１ＢがｐＨ２の溶液中で２時間生き残り、ｐＨ２．５および３．０の溶液中で６時間生き残ることを示した。胆汁塩耐性アッセイは、ＷＦ－１Ｂが３％および５％の胆汁塩で２４時間生き残ることを示した。
【0129】
実施例２．４－胃および腸の消化酵素耐性アッセイ
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの胃消化酵素に対する耐性を評価するために、１％の完全に成長した培養物（１０μＬ）を、さまざまなｐＨ値（ｐＨ＝２．０、２．５、および３．０）のＳＧＦ溶液（３．２ｍｇ／ｍＬのペプシンを含む）１ｍＬのセットに継代培養した。培養物を気密条件下で３７°Ｃで６時間インキュベートした。各培養液６０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注し、それぞれ０時間、２時間、４時間、および６時間のインキュベーション後に、希釈および播種を行った。
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの胃消化酵素に対する耐性を評価するために、１％の完全に成長した培養物（１０μＬ）を、さまざまなｐＨ値（ｐＨ＝２．０、２．５、および３．０）のＳＧＦ溶液（３．２ｍｇ／ｍＬのペプシンを含む）１ｍＬのセットに継代培養した。培養物を気密条件下で３７°Ｃで６時間インキュベートした。各培養液６０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注し、それぞれ０時間、２時間、４時間、および６時間のインキュベーション後に、希釈および播種を行った。
【0130】
腸消化酵素に対する単離された株の耐性を評価するために、１％の完全に成長した培養（１０μＬ）を、ｐＨ＝６．８で１０ｍｇ／ｍＬのパンクレアチンを含む模擬腸液（ＳＩＦ）溶液の１ｍＬのセットに継代培養した。培養物を気密条件下、３７°Ｃで２４時間インキュベートした。各培養液６０μＬを９６ウェルマイクロタイタープレートの最初の列に分注し、それぞれ０時間、６時間、２４時間のインキュベーション後に、希釈および播種を行った。
【0131】
各培養物の連続１０倍希釈物を調製し、適切な希釈物をＭＲＳ寒天プレートに播種し、３７°Ｃで２日間インキュベートした。生細胞数を記録し、少なくとも３回の独立した複製の平均［ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）］±標準誤差として表した。
【0132】
ブレビスＷＦ－１Ｂの胃消化酵素および腸消化酵素耐性アッセイの結果を、それぞれ図１０および１１に示す。胃消化酵素耐性アッセイは、ＷＦ－１ＢがＳＧＦ（３．２ｍｇ／ｍＬのペプシンを含む）中でｐＨ２．０で４時間、ｐＨ２．５および３．０で６時間生存したことを示した。腸消化酵素耐性アッセイでは、ＷＦ－１ＢがＳＩＦ（１０ｍｇ／ｍＬのパンクレアチンを含む）で２４時間生存したことが示された。
【0133】
実施例２．５－阻害物質の生産
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂが一連の病原微生物および腐敗微生物に対する阻害物質を産生する能力を評価するために、単離された株を一連の指標株の存在下で増殖させた。完全に成長した培養液１μＬを強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）プレートにスポットし、３７°Ｃで一晩インキュベートした。１０の指標株を、０．６％酵母抽出物（ＴＳＢＹＥ）を含むトリプチケースソイブロスで３７°Ｃで一晩培養した。各指標株（０．１％、６μＬ）を６ｍＬのＲＣＡ軟寒天（０．７５％寒天を含む）に接種し、斑点のあるＲＣＡプレートの上に混合物を注いた。固化した寒天プレートを３７°Ｃで一晩インキュベートした。指標株の目に見える増殖を伴わない阻害ゾーンのサイズを測定し、記録した。
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂが一連の病原微生物および腐敗微生物に対する阻害物質を産生する能力を評価するために、単離された株を一連の指標株の存在下で増殖させた。完全に成長した培養液１μＬを強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）プレートにスポットし、３７°Ｃで一晩インキュベートした。１０の指標株を、０．６％酵母抽出物（ＴＳＢＹＥ）を含むトリプチケースソイブロスで３７°Ｃで一晩培養した。各指標株（０．１％、６μＬ）を６ｍＬのＲＣＡ軟寒天（０．７５％寒天を含む）に接種し、斑点のあるＲＣＡプレートの上に混合物を注いた。固化した寒天プレートを３７°Ｃで一晩インキュベートした。指標株の目に見える増殖を伴わない阻害ゾーンのサイズを測定し、記録した。
【0134】
結果を表４に示す。表４において、「はい」は、単離された株が対応する指標株に対して阻害物質を産生することを示す。「いいえ」は、当該株が対応する指標株に対して阻害物質を産生しないことを示す。「ＭＲＳＡ」は、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスを指す。「ＶＲＥ」は、バンコマイシン耐性エンテロコッカスを指す。
【表4】
【0135】
表４に示されるように、ＷＦ－１Ｂは、この研究で試験された１０の指標株すべてに対して阻害物質を産生した。
【0136】
実施例２．６－抗生物質感受性アッセイおよび配列分析
ブロスの微量希釈を使用して、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ単離物の８つの一般的に使用される臨床抗生物質に対する感受性を決定した。ブロス微量希釈は、国際標準化機構、牛乳および乳製品－ビフィズス菌および非腸球菌性乳酸菌（ＬＡＢ）に適用される抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定（International Organization for Standardization, Milk and milk products - Determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterrococcal lactic acid bacteria (LAB)）(ISO10932:2012)による方法に従って行った。抗生物質原液は、ＣＬＳＩ、抗菌薬感受性試験の性能基準、第２３版、ＣＬＳＩ基準Ｍ１００、ウェイン、ＰＡ：臨床および検査基準協会；２０１３年（Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 23rd edition, CLSI Standard M100, Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2013）による方法に従って調製した。
ブロスの微量希釈を使用して、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ単離物の８つの一般的に使用される臨床抗生物質に対する感受性を決定した。ブロス微量希釈は、国際標準化機構、牛乳および乳製品－ビフィズス菌および非腸球菌性乳酸菌（ＬＡＢ）に適用される抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定（International Organization for Standardization, Milk and milk products - Determination of the minimal inhibitory concentration (MIC) of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterrococcal lactic acid bacteria (LAB)）(ISO10932:2012)による方法に従って行った。抗生物質原液は、ＣＬＳＩ、抗菌薬感受性試験の性能基準、第２３版、ＣＬＳＩ基準Ｍ１００、ウェイン、ＰＡ：臨床および検査基準協会；２０１３年（Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 23rd edition, CLSI Standard M100, Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2013）による方法に従って調製した。
【0137】
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂの抗生物質感受性アッセイから測定された最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）および微生物学的カットオフ値を以下の表５に示す。
【表5】
【0138】
表５に示されるように、ＷＦ－１Ｂは、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンを含むいくつかの抗生物質に対して感受性があり、そのＭＩＣは欧州食品安全機関（ＥＦＳＡ）のカットオフ値を下回る。
【0139】
耐性の性質を調査するために、最初にＭＩＣ分布を種レベルでまとめた。第二に、全ゲノムショットガン配列（コンティグまたは足場）を、包括的な抗生物質耐性を含む最新のデータベースのリストと比較することにより、臨床的に重要な抗菌剤に対する耐性をコードする、または耐性に寄与する遺伝子の存在について、調査し、これは包括的な抗生物質耐性データベース（ＣＡＲＤ）、抗生物質耐性遺伝子アノテーションデータベース（ＡＲＧ－ＡＮＮＯＴ）、ＲｅＦｉｎｄｅｒ４．１、およびサブシステム技術を使用する迅速なアノテーション（Ｒａｐｉｄ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｓｕｂｓｙｓｔｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＲＡＳＴ）を含む。
【0140】
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、およびエリスロマイシンに対して感受性であったが、アンピシリン、カナマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールに対して耐性であった。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂに対するアンピシリン、カナマイシン、クリンダマイシン、およびクロラムフェニコールのＭＩＣは、Ｌ．ブレビスの種レベルでのＭＩＣ分布範囲に収まった。これは、これらの耐性が固有または自然耐性に属する可能性が高いことを示している。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂに対するテトラサイクリンのＭＩＣは、Ｌ．ブレビスの種レベルでのＭＩＣ分布範囲から外れた。これは、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂのテトラサイクリン耐性が獲得耐性に属することを示している。
【0141】
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂについては、ＲＧＩ（耐性遺伝子識別子）分析を行うことによるデータベースＣＡＲＤ、取得した抗菌剤耐性遺伝子を検索することによるＲｅｓＦｉｎｄｅｒ４．１、およびｂｌａｓｔを行うことによるＡＲＧ－ＡＮＮＯＴと比較することにより、ヒットは見出されなかった。
【0142】
さらに、病原性因子、抗生物質耐性、および転移因子は、病原性、疾患および防御サブシステム、ならびにプロファージ、転移因子、およびプラスミドサブシステムで同定された因子について、ＲＡＳＴ出力のサブシステム特徴カウントを検索することによって注釈付けされた。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂにおいて、病原性因子または病原性島は特定されなかった。Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂで同定された抗生物質耐性（ＡＲ）決定因子は、翻訳伸長因子Ｇ、リボソーム保護型テトラサイクリン耐性関連タンパク質（群２）、ＤＮＡジャイレースサブユニットＡおよびＢ、多剤排出ポンプオペロンの転写調節因子、ＴｅｔＲ（ＡｃｒＲ）ファミリー、マルチ抗菌押出タンパク質（Ｎａ（＋）／薬物アンチポーター）、およびＭＤＲ排出ポンプのＭＡＴＥファミリーを含む。
【0143】
したがって、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂは、リボソーム保護型テトラサイクリン耐性関連タンパク質（群２）、翻訳伸長因子Ｇ、および多剤耐性流出ポンプの存在により、上に挙げた抗生物質に対して耐性であり、これらはプラスミド上の存在の代わりにＬ．ブレビスＷＦ－１Ｂの染色体上に存在していた。さらに、上記の遺伝子に隣接する上流および下流の配列は、それらを類似の生物のものと比較することによって特徴付けられ、可動性の遺伝要素は特定されなかった。さらに、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂでは、転移因子および遺伝子導入剤は特定されなかった。したがって、耐性は、固有の耐性またはゲノム変異による獲得耐性のいずれかに分類される。ＡＲ遺伝子の水平伝播のリスクは低い。したがって、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂを動物栄養の飼料添加物として使用することは安全であると考えられる。
【0144】
実施例２．７－細胞結合アッセイ
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ単離物のインビトロでの接着能力を評価するために、２つのイヌ細胞株、ＭＤＣＫおよびＤＨ８２をこの研究で使用した。カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｉｓ）ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４（ＭＤＣＫ（ＮＢＬ－２））およびカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｉｓ）ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０３８９（ＤＨ８２）を、組織培養フラスコ内の完全培地を含む液体窒素タンクに保存された凍結ストックから蘇生させた。この研究で細胞株の培養に使用された基本培地は、高グルコースレベル、グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ）；Ｇｉｂｃｏ（登録商標））であった。完全培地は、ＤＭＥＭおよび１０％の熱不活化（５６°Ｃで３０分間）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で構成されていた。生育条件は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２であった。細胞分散に使用した溶液は、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンであった。接着アッセイの前に完全な分化を可能にするために、合流後２週間細胞系培養物を維持した。細胞計数について血球計を使用した。
Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ単離物のインビトロでの接着能力を評価するために、２つのイヌ細胞株、ＭＤＣＫおよびＤＨ８２をこの研究で使用した。カニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｉｓ）ＡＴＣＣ ＣＣＬ－３４（ＭＤＣＫ（ＮＢＬ－２））およびカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｉｓ）ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０３８９（ＤＨ８２）を、組織培養フラスコ内の完全培地を含む液体窒素タンクに保存された凍結ストックから蘇生させた。この研究で細胞株の培養に使用された基本培地は、高グルコースレベル、グルタミン、およびピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉａ）；Ｇｉｂｃｏ（登録商標））であった。完全培地は、ＤＭＥＭおよび１０％の熱不活化（５６°Ｃで３０分間）ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ（登録商標））で構成されていた。生育条件は、３７°Ｃ、５％ＣＯ２であった。細胞分散に使用した溶液は、０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンであった。接着アッセイの前に完全な分化を可能にするために、合流後２週間細胞系培養物を維持した。細胞計数について血球計を使用した。
【0145】
３，５００ｇで１０分間の遠心分離により完全に増殖した培養物５ｍＬを採取し、続いて細胞をＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）で３回洗浄することにより、細菌細胞懸濁液を調製した。細胞ペレットを基本培地ＤＭＥＭに再懸濁し、ＷＦ－１Ｂ単離物について約１．０のＯＤ６００ｎｍに調整し、対照株Ｓ．エンテリカＡＴＣＣ１３３１１について約０．１に調整した。これは、ＷＦ－１Ｂ単離物について約５×１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当し、対照株について約１×１０８ＣＦＵ／ｍＬに相当する。
【0146】
ＭＤＣＫおよびＤＨ８２細胞の細胞単層を１２ウェル組織培養プレートで調製した。細胞をウェルあたり４×１０４細胞の濃度で接種して合流させ、分化させた。培地は２日ごとに交換した。細胞が合流したら、完全培地を除去した後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。１ｍＬの基本培地ＤＭＥＭを各ウェルに加え、接着アッセイの前に３７°Ｃ、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。
【0147】
細菌細胞懸濁液の１ｍＬアリコートを合流単層細胞に添加し、３７°Ｃで５％ＣＯ２雰囲気とともに２時間インキュベートした。１ｍＬの基本培地ＤＭＥＭを１つのウェルに加えて、無菌対照として使用した。２時間後、単層細胞をＰＢＳで３回洗浄した。トリプシン－ＥＤＴＡ溶液２５０μＬを細胞層が分散するまで各ウェルに加えた後、完全培地１．７５ｍＬを加え、ピペッティングにより細胞を吸引した。
【0148】
各培養物の連続１０倍希釈物を調製し、適切な希釈物をＭＲＳ寒天プレートに播種し、３７°Ｃで２日間インキュベートした。生細胞数を記録し、少なくとも３回の独立した複製の平均［ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）］±標準誤差として表した。細胞結合率は、細胞株への細菌細胞懸濁液の元の接種されたＣＦＵを超えて細胞株に結合した生細胞数として計算された。
【0149】
細胞結合アッセイの結果を図１２に示す。細胞結合アッセイの結果は、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂが高い細胞表面結合能力を示すことを実証した。
【0150】
実施例３－オオカミおよびイヌの単離された株およびプレバイオティクスの生物学的効果
実施例３．１－イヌの給餌試験
１つはカナダで実施され、２つはアイルランド共和国で実施された３つの独立したイヌ給餌試験は、乳酸菌の４つの株、Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１ＢおよびＥ．フェシウムＷＦ－３は、健康なビーグル犬に１日１回２８日間経口投与した場合、良好に忍容された。
実施例３．１－イヌの給餌試験
１つはカナダで実施され、２つはアイルランド共和国で実施された３つの独立したイヌ給餌試験は、乳酸菌の４つの株、Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１ＢおよびＥ．フェシウムＷＦ－３は、健康なビーグル犬に１日１回２８日間経口投与した場合、良好に忍容された。
【0151】
さらに、ＰＭＡ－ｑＰＣＲ（プロピジウムモノアジド－定量的ポリメラーゼ連鎖反応）技術によるイヌ給餌試験から収集された糞便試料からの生細胞計数は、４つすべてのプロバイオティクス株（Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３）は、イヌの消化管をうまく通過して生き残る。
【0152】
健康なイヌにおけるＬ．カゼイ、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．ブレビス、およびＥ．フェシウムを含む特定の細菌種の存在量に対する組成物の効果をｑＰＣＲによって決定し、結果を図１３に示す。図１３では、縦棒は平均±ＳＥＭを表し、データ分析は、対照群（プラセボを与えられたイヌ）および試験群（Ｋ－９ Ｈｅｒｉｔａｇｅ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ Ｂｌｅｎｄ（登録商標）を与えられたイヌ）の間、または－１日目（処置前）およびＤ１９（処置１９日目）の試料は、細菌、ラクトバチルス属、Ｌ．カゼイ、Ｌ．ファーメンタム、およびＬ．ブレビスの総数について同じ試験群から収集された。試験群からＤ１９に収集された糞便試料に存在するエンテロコッカス属の数は、試験群から－１日目に収集されたもの（Ｐ＜０．０５）および対照群からＤ１９に収集されたもの（Ｐ＜０．１０）よりも有意に高かった。試験群からＤ１９に収集された糞便試料に存在するＥ．フェシウムの数は、対照群と試験群の両方から－１日目に収集されたもの（Ｐ＜０．０５）および対照群からＤ１９に収集されたもの（Ｐ＜０．０５）よりも有意に高かった）。
【0153】
健康なイヌにおける、酢酸、プロピオン酸、ｎ－酪酸、イソ酪酸、吉草酸、およびイソ吉草酸を含む短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生に対する組成物の効果は、も決定。結果を図１４および１５に示す。データ分析は、対照群および試験群からの－１日目に収集された糞便試料に存在する酢酸、プロピオン酸、ｎ－酪酸、イソ酪酸、吉草酸、およびイソ吉草酸を含むＳＣＦＡの総量が、糞便１ｇ当たり約２００μｍｏｌであることを示した。１９日目に対照群および試験群から採取した糞便試料に存在するＳＣＦＡの総量は、それぞれ約１，２００μｍｏｌ／ｇの糞便および約１，０００μｍｏｌ／ｇの糞便に有意に増加した。全体として、対照群と試験群との間で、－１日目または１９日目に収集された糞便試料中に存在するＳＣＦＡの総量または個々のＳＣＦＡの両方に関して、有意差は観察されなかった。しかしながら、対照群または試験群のいずれかから収集された糞便試料に存在する全ＳＣＦＡまたは個々のＳＣＦＡ（吉草酸を除く）の量は、－１日目から１９日目にかけて劇的に増加した。
【0154】
実施例３．２－インビトロ胃腸モデル
イヌの胃および小腸を通過中のＬ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３の生存を、ＴＩＭ－１と呼ばれるイヌの状態をシミュレートする動的インビトロ胃腸モデルにおいてシミュレートした。ＴＩＭ－１システムは、オランダのＴＮＯ（オランダ応用科学研究機構（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））によって開発されたもので、消化管内の生理学的プロセスおよび状態をシミュレートするコンピューター制御モデルである。ＴＩＭ－１システムは、消化管通過を調節するバルブによって相互接続された複数のコンパートメントで構成されている。
イヌの胃および小腸を通過中のＬ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３の生存を、ＴＩＭ－１と呼ばれるイヌの状態をシミュレートする動的インビトロ胃腸モデルにおいてシミュレートした。ＴＩＭ－１システムは、オランダのＴＮＯ（オランダ応用科学研究機構（Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））によって開発されたもので、消化管内の生理学的プロセスおよび状態をシミュレートするコンピューター制御モデルである。ＴＩＭ－１システムは、消化管通過を調節するバルブによって相互接続された複数のコンパートメントで構成されている。
【0155】
乾燥イヌ食餌（キブル）と混合した凍結乾燥粉末フォーマットの４つの株をＴＩＭ－１システムに供給し、ＰＭＡ－ｑＰＣＲ技術によって回腸流出液中の生細胞当量を決定した。
【0156】
実施例３．３－インビトロ腸組織モデル
Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３の腸上皮バリア機能およびイヌ腸組織の抗炎症反応に対する効果を、プラットフォーム中に固定された健康なイヌの結腸組織の一部を使用してインビトロ腸モデル（ＩｎＴＥＳＴｉｎｅ（登録商標）ｐｌａｔｆｏｒｍ， ＴＮＯ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において研究した。サルモネラ・エンテリカ株を炎症誘発剤として使用し、サイトカラシンＤを腸のバリア機能妨害剤として使用した。
Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３の腸上皮バリア機能およびイヌ腸組織の抗炎症反応に対する効果を、プラットフォーム中に固定された健康なイヌの結腸組織の一部を使用してインビトロ腸モデル（ＩｎＴＥＳＴｉｎｅ（登録商標）ｐｌａｔｆｏｒｍ， ＴＮＯ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）において研究した。サルモネラ・エンテリカ株を炎症誘発剤として使用し、サイトカラシンＤを腸のバリア機能妨害剤として使用した。
【0157】
Ｓ．エンテリカの接種は結腸組織のバリア機能を有意に破壊し、タイトジャンクション機能に特異的な影響を与えた。４つのプロバイオティクス株、Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３のカクテルがＳ．エンテリカの接種の３０分前に接種された場合に、マンニトールの傍細胞輸送の増加（傍細胞輸送指標）は１０－１５％減少し、このことは、これらのプロバイオティクス菌株が腸のタイトジャンクションタンパク質の機能にプラスの効果をもたらし、腸組織のバリア障害を回復または防止することを示している。
【0158】
頂端および側底コンパートメントへの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ、細胞毒性指標）の累積漏出は、すべてのインキュベーションで低く、６時間のインキュベーション中の適切な腸組織生存率を示した。４つのプロバイオティクス株、Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３のカクテルを添加したすべてのインキュベーションで、ＬＤＨ放出の減少が示された。プロバイオティクス株は、腸組織の生存率を維持する上でプラスの効果がある。このプラスの効果は、主に先端コンパートメントへのＬＤＨ分泌の３倍から４倍の減少によって引き起こされた。
【0159】
結腸組織におけるＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２α、ＩＬ－１２β、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αおよびＧＡＰＤＨの遺伝子発現を、ｑＰＣＲによって決定した。サルモネラ・エンテリカとのインキュベーションにおけるＩＬ－６、ＩＬ－１２β、ＩＦＮ－γ、およびＴＮＦ－αの発現増加の傾向が観察された。興味深いことに、Ｌ．カゼイＫ９－１、Ｌ．ファーメンタムＫ９－２、Ｌ．ブレビスＷＦ－１Ｂ、およびＥ．フェシウムＷＦ－３の４つのプロバイオティクス株のカクテルをＳ．エンテリカの接種の３０分前に接種した場合に、これらのサイトカイン遺伝子の発現増加がわずかに減少した。特に、ＴＮＦ－αの発現が、有意に減少した。これらの結果は、４つのプロバイオティクス株の混合物が、サルモネラ菌によって誘発される腸内の炎症反応の減少にプラスの効果があることを示唆している。
【0160】
実施例３．４－インビトロ腸内微生物叢モデル
イヌ結腸における短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生および微生物叢組成の変化に対するプロバイオティクス株およびプレバイオティックの効果を、インビトロ腸モデル（ｉ－ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）ｐｌａｔｆｏｒｍ， ＴＮＯ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。６匹の健康なイヌから提供された糞便材料は、ｉ－ｓｃｒｅｅｎの基本的な接種材料の調製に使用された。フミン酸とフルボ酸またはマルトデキストリンの混合物を添加して、または添加せずに、単一のプロバイオティクス株または複数のプロバイオティクス株のカクテルを、ｉ－ｓｃｒｅｅｎインキュベーションシステムの９６ウェルのうちの１つのウェルに接種した。ＳＣＦＡの産生をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって定量化し、糞便微生物叢の組成を、２４時間のインキュベーション後にＶ４超可変領域の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子アンプリコン配列決定によって決定した。
イヌ結腸における短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の産生および微生物叢組成の変化に対するプロバイオティクス株およびプレバイオティックの効果を、インビトロ腸モデル（ｉ－ｓｃｒｅｅｎ（登録商標）ｐｌａｔｆｏｒｍ， ＴＮＯ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。６匹の健康なイヌから提供された糞便材料は、ｉ－ｓｃｒｅｅｎの基本的な接種材料の調製に使用された。フミン酸とフルボ酸またはマルトデキストリンの混合物を添加して、または添加せずに、単一のプロバイオティクス株または複数のプロバイオティクス株のカクテルを、ｉ－ｓｃｒｅｅｎインキュベーションシステムの９６ウェルのうちの１つのウェルに接種した。ＳＣＦＡの産生をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって定量化し、糞便微生物叢の組成を、２４時間のインキュベーション後にＶ４超可変領域の１６Ｓ ｒＤＮＡ遺伝子アンプリコン配列決定によって決定した。
【0161】
データ分析は、マルトデキストリンと、より少ない程度ではあるがフミン酸およびフルボ酸の存在が、アセテートを犠牲にしてプロピオン酸の生成を支援することを示した。マルトデキストリンも酪酸を大量に生成した。Ｅ．フェシウムＷＦ－３を除くプロバイオティクス株は、ＳＣＦＡ産生の変化が少なく、レベルは対照条件に匹敵する（微生物叢のみ）。しかしながら、１０７ＣＦＵ／ｍＬの初期カウントでＥ．フェシウムＷＦ－３単独またはＬ．ブレビスＷＦ－１Ｂまたはラチラクトバチルス・クルバタスＷＦ－６と組み合わせて存在すると、他の暴露条件と比較してより高い酢酸産生が支援された。
【0162】
３８°Ｃで２４時間のインキュベーション後、微生物叢における乳酸桿菌および腸球菌（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）の相対存在量が変化した。具体的には、乳酸桿株は、ｉ－ｓｃｒｅｅｎでイヌの腸内微生物叢に高い相対量でコロニーを形成していないように見えたが、２４時間のインキュベーション後、微生物叢にわずかな割合で残っていた。一方、エンテロコッカス・フェシウムは、乳酸菌と比較してより高いレベルでｉ－ｓｃｒｅｅｎのイヌの腸内細菌叢に存在したままであった。プレバイオティクスのマルトデキストリンは微生物叢の組成に強く影響を与えたが、フミン酸およびフルボ酸の混合物はそれほど影響を与えなかった。マルトデキストリンは、特に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、メガモナス（Ｍｅｇａｎｏｍｏｎａｓ）属、パスコラークトバクテリウム（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｔｅｒｉｕｍ）属、スクシニビブリオ（Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ）属、および狭義クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｅｎｓｕｓｔｒｉｃｔｏ）属の増加を支援した。これは、クロストリジウムＸＩ、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス、パラサテレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、分類されていないラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）科、およびドレア（Ｄｏｒｅａ）を犠牲にして行われた。
【0163】
実施例４－フミン酸および／またはフルボ酸を用いた以前の動物給餌試験の概要
他の研究者によって実施されたフミン酸および／またはフルボ酸を用いた動物給餌試験は、フミン酸およびフルボ酸が以下を含む多くの異なる有益な効果を提供することを実証し、以下を含む：望ましくない腸内微生物の増殖を抑制するが、望ましい腸内微生物の増殖を刺激すること；カビの成長および毒素の生成を減らすこと；免疫力を増強すること；腸の健康を改善すること；栄養素の消化率および利用率を改善すること；成長促進剤として働くこと；生産的な性能を向上させること；血中脂質およびコレステロールを減らすこと；および抗酸化力を高めること (Islam et al., 2005; Kuhnert et al., 2015; van Rensburg, 2015; Kaevska et al., 2016; Arif et al., 2019; Visscher et al., 2019; Mudronova et al., 2020)。
他の研究者によって実施されたフミン酸および／またはフルボ酸を用いた動物給餌試験は、フミン酸およびフルボ酸が以下を含む多くの異なる有益な効果を提供することを実証し、以下を含む：望ましくない腸内微生物の増殖を抑制するが、望ましい腸内微生物の増殖を刺激すること；カビの成長および毒素の生成を減らすこと；免疫力を増強すること；腸の健康を改善すること；栄養素の消化率および利用率を改善すること；成長促進剤として働くこと；生産的な性能を向上させること；血中脂質およびコレステロールを減らすこと；および抗酸化力を高めること (Islam et al., 2005; Kuhnert et al., 2015; van Rensburg, 2015; Kaevska et al., 2016; Arif et al., 2019; Visscher et al., 2019; Mudronova et al., 2020)。
【0164】
特定の実施形態を示して説明してきたが、当業者であれば、本開示の範囲から逸脱することなく様々な変更および修正を行うことができることを理解するであろう。前述の明細書で使用されている用語および表現は、本明細書では説明の用語として使用されており、限定するものではなく、かかる用語および表現を使用して、示され、説明されている機能またはその一部の均等物を除外する意図はない。さらに、本開示を解釈する際、すべての用語は、文脈と一致する可能な限り広い方法で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」なる語は、非排他的な方法で要素、構成要素、または工程を指すものとして解釈する必要があり、このことは参照された要素、構成要素、または工程が、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、または工程と存在する、または利用される、または組み合わされてもよいことを示す。
【0165】
参考文献
以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
以下の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】