特表2023-533613ＩＬ－１０を発現する複数ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-03
(54)【発明の名称】ＩＬ－１０を発現する複数ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20230727BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230727BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20230727BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20230727BHJP
A61K 35/14 20150101ALI20230727BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230727BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230727BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20230727BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230727BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20230727BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230727BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20230727BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20230727BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20230727BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230727BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20230727BHJP
A61P 21/04 20060101ALI20230727BHJP
A61P 5/14 20060101ALI20230727BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20230727BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230727BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20230727BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20230727BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20230727BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20230727BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230727BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20230727BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20230727BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20230727BHJP
C12N 15/19 20060101ALN20230727BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20230727BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/17
A61P37/06
A61K35/28
A61K35/14
A61P35/00
A61P7/00
A61P35/02
A61P29/00
A61P31/14
A61P43/00 105
A61P11/06
A61P37/08
A61P43/00 111
A61P17/00
A61P7/06
A61P9/00
A61P21/04
A61P5/14
A61P1/04
A61P25/00
A61P17/06
A61P19/02
A61P29/00 101
A61P27/02
A61P3/10
A61K35/76
C12N5/0783
C07K14/54
C12N15/867 Z
C12N15/19
C12N7/01
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023524485
(86)(22)【出願日】2021-06-28
(85)【翻訳文提出日】2023-02-28
(86)【国際出願番号】 US2021039464
(87)【国際公開番号】W WO2022006020
(87)【国際公開日】2022-01-06
(31)【優先権主張番号】PCT/US2020/040372
(32)【優先日】2020-06-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523000846
【氏名又は名称】ティーアール１エックス，インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100126354
【弁理士】
【氏名又は名称】藤田 尚
(72)【発明者】
【氏名】ロンカロロ，マリア，グラツィア
(72)【発明者】
【氏名】デ フリーズ，ジャン，エグバート
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB34
4C087BB37
4C087BB44
4C087BB65
4C087BC83
4C087MA02
4C087NA14
4C087ZA01
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4C087ZA68
4C087ZA89
4C087ZA94
4C087ZA96
4C087ZB08
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4C087ZB15
4C087ZB26
4C087ZB27
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4C087ZC06
4C087ZC35
4C087ZC75
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA02
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を遺伝子改変することによって生成された複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を提供する。さらに、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法、並びに免疫寛容化、ＧｖＨＤ、細胞及び臓器の移植、癌、並びに他の免疫障害の治療のために複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用する方法が提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られた、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団（複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）。
【請求項2】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、３、４、５、６、７、８、９、又は１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られた、請求項１に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項3】
前記集団中の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、全体で、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれ以上の異なるＨＬＡハプロタイプを有する、請求項１又は請求項２に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項4】
前記集団中のすべての前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、又は９／１０の一致を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項5】
前記集団中のすべての前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８の一致を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項6】
前記集団中のすべての前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座において、互いに２／２の一致を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項7】
前記集団中のすべての前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座において、互いに２／２の一致を有する、請求項１から６のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項8】
前記集団中のすべての前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において、互いに２／２の一致を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項9】
前記集団中のすべての前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも３／４又は４／４の一致を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項10】
前記集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ａ＊０２対立遺伝子を有する、請求項１から９のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項11】
いずれのＣＤ４＋Ｔ細胞も不死化されていない、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項12】
前記外因性ポリヌクレオチドが、発現制御エレメントに作動可能に連結されたＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項13】
前記ＩＬ－１０がヒトＩＬ－１０である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項14】
前記ＩＬ－１０がウイルスＩＬ－１０である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項15】
前記ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントが、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項16】
前記ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントが配列番号２の配列を有する、請求項１５に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項17】
前記発現制御エレメントが、前記コードされたＩＬ－１０の構成的発現を駆動する、請求項１２から１６のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項18】
前記外因性ポリヌクレオチドが選択マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項19】
前記選択マーカーがΔＮＧＦＲである、請求項１８に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項20】
前記ΔＮＧＦＲが配列番号３の配列を有する、請求項１９に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項21】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号４の配列を含む、請求項１９に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項22】
前記選択マーカーが切断型ＥＧＦＲポリペプチドである、請求項１８に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項23】
前記外因性ポリヌクレオチドが配列番号５の配列を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項24】
前記外因性ポリヌクレオチドがＴ細胞核ゲノムに組み込まれている、請求項１から２３のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項25】
前記外因性ポリヌクレオチドがＴ細胞核ゲノムに組み込まれていない、請求項１から２３のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項26】
前記外因性ポリヌクレオチドがレンチウイルスベクター配列をさらに含む、請求項２４又は２５に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項27】
前記外因性ポリヌクレオチドがＴ細胞核ゲノムに組み込まれていない、請求項１から２６のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項28】
前記集団内の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％がＩＬ－１０を発現する、請求項１から２７のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項29】
前記集団内の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％がＩＬ－１０を発現する、請求項２８に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項30】
前記集団内の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％がＩＬ－１０を発現する、請求項２９に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項31】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／培養培地１ｍｌ当たり、少なくとも１００ｐｇのＩＬ－１０を構成的に発現する、請求項１から３０のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項32】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍｌ当たり少なくとも１００ｐｇ、２００ｐｇ、５００ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、又は５０ｎｇのＩＬ－１０を構成的に発現する、請求項３１に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項33】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による活性化後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍｌ当たり少なくとも１ｎｇのＩＬ－１０を発現する、請求項１から３２のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項34】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による活性化後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍｌ当たり少なくとも２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、又は５００ｎｇのＩＬ－１０を発現する、請求項３３に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項35】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも少なくとも５倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する、請求項１から３４のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項36】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞が、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも少なくとも１０倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する、請求項３５に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項37】
前記集団内の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％が前記外因性ポリヌクレオチドから前記選択マーカーを発現する、請求項１から３６のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項38】
前記集団内の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％が前記外因性ポリヌクレオチドから前記選択マーカーを発現する、請求項３７に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項39】
前記集団内の前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％が前記外因性ポリヌクレオチドから前記選択マーカーを発現する、請求項３８に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項40】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ４９ｂを発現する、請求項１から３９のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項41】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＬＡＧ－３を発現する、請求項１から４０のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項42】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴＧＦ－βを発現する、請求項１から４１のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項43】
遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＦＮγを発現する、請求項１から４２のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項44】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＧｚＢを発現する、請求項１から４３のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項45】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がパーフォリンを発現する、請求項１から４４のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項46】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ１８を発現する、請求項１から４５のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項47】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２を発現する、請求項１から４６のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項48】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ２２６を発現する、請求項１から４７のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項49】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＬ－２２を発現する、請求項１から４８のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項50】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が、宿主由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でアネルギー化されていない、請求項１から４９のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項51】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が組換えＩＬ－１０タンパク質の存在下でアネルギー化されておらず、前記組換えＩＬ－１０タンパク質が前記ＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されない、請求項１から５０のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項52】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が宿主由来のＤＣ１０細胞の存在下でアネルギー化されていない、請求項１から５１のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項53】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が凍結懸濁液中にある、請求項１から５２のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項54】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞が液体懸濁液中にある、請求項１から５２のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項55】
前記液体懸濁液が事前に凍結されている、請求項５４に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
【請求項56】
（ｉ）請求項１から５５のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、（ｉｉ）薬学的に許容される担体に懸濁された
集団を含む医薬組成物。
【請求項57】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールする工程と、
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって前記プールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変する工程と、を含み、
それによって前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得る、方法。
【請求項58】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程と、
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に改変する工程と、次いで、
（ｉｉｉ）前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それにより、前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得る工程と、を含む方法。
【請求項59】
工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に、又は工程（ｉｉ）の後に、又は工程（ｉｉ）の後かつ工程（ｉｉｉ）の前に、又は工程（ｉｉｉ）の後に、前記初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下でインキュベートする工程をさらに含む、請求項５７又は請求項５８に記載の方法。
【請求項60】
前記初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をＩＬ－２の存在下でさらにインキュベートする、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記外因性ポリヌクレオチドが、ウイルスベクターを使用して前記初代ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号１の配列を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む、請求項５７から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントが配列番号２の配列を有する、請求項５３から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記外因性ポリヌクレオチドが選択マーカーをコードするセグメントをさらに含む、請求項５７から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記コードされた選択マーカーがΔＮＧＦＲである、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記コードされた選択マーカーが配列番号３の配列を有する、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
工程（ｉｉ）の後に、前記選択マーカーを発現する前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それにより遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団を生成する工程をさらに含む、請求項６５から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記濃縮された集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％又は少なくとも９５％がＩＬ－１０を発現する、請求項６７に記載の方法。
【請求項70】
前記濃縮された集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％がＩＬ－１０を発現する、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
前記濃縮された集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％又は少なくとも９５％が前記選択マーカーを発現する、請求項６８から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記濃縮された集団中の前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％が前記選択マーカーを発現する、請求項７０に記載の方法。
【請求項73】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団をインキュベートする工程をさらに含む、請求項６８から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項74】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団をインキュベートする工程は、ＩＬ－２の存在下、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下で行われる、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
前記遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を凍結する後続する工程をさらに含む、請求項５７から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項76】
工程（ｉ）において、前記初代ＣＤ４＋Ｔ細胞が、３、４、５、６、７、８、９又は１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られる、請求項５７から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
前記少なくとも３人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０又は９／１０の一致を有する、請求項７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
前記少なくとも３人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、４／８、５／８、６／８、７／８又は８／８の一致を有する、請求項５７から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
前記少なくとも３人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する、請求項５７から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
前記少なくとも３人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する、請求項５７から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項81】
前記少なくとも３人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する、請求項５７から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項82】
前記少なくとも３人のＴ細胞ドナーが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも３／４又は４／４の一致を有する、請求項５７から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項83】
前記少なくとも３人のＴ細胞ドナーの各々がＡ＊０２対立遺伝子を有する、請求項５７から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項84】
工程（ｉ）において、前記初代ＣＤ４＋Ｔ細胞が１つ又はそれ以上の凍結ストックから得られる、請求項５７から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項85】
工程（ｉ）において、前記初代ＣＤ４＋Ｔ細胞が、前記少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーの非凍結末梢血単核細胞から得られる、請求項５７から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項86】
前記末梢血単核細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する工程をさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項87】
患者を治療する方法であって、請求項１から５５のいずれか一項に記載の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は請求項５６に記載の医薬組成物を、免疫寛容化を必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項88】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の凍結懸濁液を解凍する先行する工程をさらに含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項89】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物が、前記患者における病原性Ｔ細胞応答の重症度を予防又は軽減する、請求項８７又は８８に記載の方法。
【請求項90】
単核細胞を前記患者に投与する工程をさらに含む、請求項８７から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項91】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物と、前記単核細胞とが同時に投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記単核細胞が、前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物の投与の前又は後のいずれかに投与される、請求項９０に記載の方法。
【請求項93】
前記プールされたドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物の投与の前又は後のいずれかに、前記患者にＨＳＣドナーの造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与する工程をさらに含む、請求項８７から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項94】
前記ＨＳＣドナーが、前記患者に対して部分的にＨＬＡ不一致である、請求項９３に記載の方法。
【請求項95】
前記ＨＳＣドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記ＨＳＣドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８、５／８、６／８、７／８又は８／８未満の一致を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項97】
前記ＨＳＣドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項98】
前記ＨＳＣドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において３／４未満又は４／４未満の一致を有する、請求項９４に記載の方法。
【請求項99】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記患者に対してＨＬＡ不一致又は部分的にＨＬＡ不一致である、請求項８７から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項100】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項101】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８、５／８、６／８、７／８又は８／８未満の一致を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項102】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項103】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記患者に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、２／４、３／４又は４／４未満の一致を有する、請求項９９に記載の方法。
【請求項104】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ不一致又は部分的ＨＬＡ不一致である、請求項８７から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項105】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項106】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８、５／８、６／８、７／８又は８／８未満の一致を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項107】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項108】
１又はそれ以上の前記Ｔ細胞ドナーが、前記ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、３／４又は４／４未満の一致を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項109】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物が、前記移植された造血幹細胞によるＧｖＨＤの重症度を予防又は軽減する、請求項７９から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項110】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物が、前記移植された造血細胞由来のリンパ球系細胞の病原性応答の重症度を防止又は軽減する、請求項９３から１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項111】
前記患者が新生物細胞を有する、請求項８７から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項112】
前記新生物細胞が、ＣＤ１３、ＨＬＡ－クラスＩ及びＣＤ５４を発現する、請求項１１１に記載の方法。
【請求項113】
前記新生物細胞が、ＣＤ１１２、ＣＤ５８又はＣＤ１５５を発現する、請求項１１１から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項114】
前記患者が癌を有し、任意選択で前記癌が固形又は血液新生物である、請求項１１１から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項115】
前記患者が、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、男性の乳癌、原発不明の癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌及び低咽頭癌、白血病、急性リンパ球性（ＡＬＬ）、急性骨髄（骨髄性肉腫及び皮膚白血病を含むＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄（ＣＭＬ）白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児の白血病、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、小児の非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫－成人軟部組織癌、皮膚癌、皮膚癌－基底細胞及び扁平細胞、皮膚癌－黒色腫、皮膚癌－メルケル細胞、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される癌を有する、請求項８７から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項116】
前記患者が骨髄性癌を有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項117】
前記患者がＡＭＬ又はＣＭＬを有する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項118】
前記患者が炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する、請求項８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項119】
前記炎症性又は自己免疫性疾患が、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性狼瘡、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、水疱性疾患、強皮症、及びセリアック病からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項120】
前記炎症性又は自己免疫性疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、１型糖尿病、狼瘡、乾癬、乾癬性関節炎、又は関節リウマチである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項121】
前記患者が、ＮＬＰＲ３インフラマソームの超活性を伴う疾患又は障害を有する、請求項８７から１１３又は１１８から１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項122】
前記患者が、２型糖尿病、神経変性疾患、心血管疾患又は炎症性腸疾患を有する、請求項８７から１１３又は１１８から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項123】
前記患者が、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１β産生の増加を伴う疾患又は障害を有する、請求項８７から１１３又は１１８から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項124】
前記患者が、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１８産生の増加を伴う疾患又は障害を有する、請求項８７から１１３又は１１８から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項125】
前記患者が、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞による成熟カスパーゼ１産生の増加を伴う疾患又は障害を有する、請求項８７から１１３又は１１８から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項126】
前記患者がアレルギー性又はアトピー性疾患を有する、請求項８７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項127】
前記アレルギー性又はアトピー性疾患が、喘息、アトピー性皮膚炎及び鼻炎からなる群から選択される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項128】
前記患者が食物アレルギーを有する、請求項８７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項129】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団又は前記医薬組成物の投与の前又は後のいずれかに、前記患者への臓器移植の工程をさらに含む、請求項８７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項130】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物が、前記臓器移植の宿主拒絶の重症度を予防又は軽減する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項131】
前記ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団又は前記医薬組成物の投与の前又は後のいずれかに、ｉＰＳ細胞由来の細胞又は組織を前記患者に移植する工程をさらに含む、請求項８７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項132】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物が、前記細胞移植の宿主拒絶の重症度を防止又は軽減する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項133】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物の投与前又は投与後に、組換えＡＡＶを前記患者に投与する工程をさらに含む、請求項８７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項134】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は前記医薬組成物が、前記組換えＡＡＶに対する免疫応答を低下させる、請求項１３３に記載の方法。
【請求項135】
前記患者が、ウイルス感染又は細菌感染に対して過剰な免疫応答を有する、請求項８７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項136】
前記患者がコロナウイルス感染症を有する、請求項１３５に記載の方法。
【請求項137】
前記患者から得られた生物学的試料において選択マーカーを検出し、それにより、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の有無を検出する工程をさらに含む、請求項８７から１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項138】
前記生物学的試料が、前記患者由来の生検材料又は血液である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項139】
悪性腫瘍を有する患者を治療する方法であって、同種ＨＳＣＴ移植片を前記患者に投与する工程と、
治療有効量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与する工程とを含む方法。
【請求項140】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の前記ＣＤ４ＩＬ－１０細胞のドナーのいずれも前記ＨＳＣＴ移植片のドナーではない、請求項１３９に記載の方法。
【請求項141】
血液癌を治療する方法であって、抗癌効果を誘導するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を血液癌患者に投与する工程を含み、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、及び構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、方法。
【請求項142】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与の前又は後に、同種ＨＳＣＴ移植片を前記患者に投与する工程をさらに含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項143】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の量が、同種ＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのにさらに十分な量である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項144】
前記血液癌が骨髄性白血病である、請求項１４１から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項145】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ１３を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる、請求項１４１から１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項146】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＨＬＡ－クラスＩを発現する癌細胞を標的化し、死滅させる、請求項１４１から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項147】
前記骨髄性白血病が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項１４１から１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項148】
前記同種ＨＳＣＴ移植片が、前記レシピエントに対して血縁又は非血縁のドナーから得られる、請求項１４１から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項149】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記レシピエントにとって非自己である、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項150】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記レシピエントに対して同種である、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項151】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されていない、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項152】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＴｒ１様細胞である、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項153】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がポリクローナルである、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項154】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がポリクローナルであり、前記レシピエントにとって非自己である、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項155】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３人のドナーから単離された後に遺伝子改変される、請求項１４１から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項156】
前記少なくとも３人のドナーのいずれも、前記同種ＨＳＣＴドナーと同じドナーではない、請求項１５５に記載の方法。
【請求項157】
前記同種ＨＳＣＴ移植片が、前記レシピエントに対して一致又は不一致のドナーから得られる、請求項１４１から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項158】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ５４を発現する細胞を標的化し、死滅させる、請求項１４１から１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項159】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＨＬＡ－クラスＩ及びＣＤ５４を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる、請求項１４１から１５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項160】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ１１２を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる、請求項１４１から１５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項161】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＣＤ５８を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる、請求項１４１から１６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項162】
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記宿主中の癌細胞を標的化し、死滅させる、請求項１４１～１６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項163】
同種造血幹細胞移植（同種ＨＳＣＴ）によって血液癌を治療する方法であって、対象（宿主）へ同種ＨＳＣＴ移植片を投与する工程と、
前記同種ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を前記同種ＨＳＣＴのレシピエント（宿主）に投与する工程と、を含み、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３名の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介性遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記レシピエントにとって非自己であり、前記同種ＨＳＣＴドナーにとって非自己であり、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されておらず、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がポリクローナル及びＴｒ１様である、方法。
【請求項164】
同種造血幹細胞移植（同種ＨＳＣＴ）によって血液癌を治療する方法であって、対象（宿主）へ同種ＨＳＣＴ移植片を投与する工程と、
前記同種ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を前記同種ＨＳＣＴのレシピエント（宿主）に投与する工程と、を含み、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３名の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介性遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記宿主中の癌細胞を標的化し、死滅させ、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されておらず、
前記複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、前記レシピエントにとって非自己であり、ポリクローナルであり、Ｔｒ１様である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月３０日に出願されたＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４０３７２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２０年６月３０日に出願されたＰＣＴ出願であるＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４０３７２号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
２．配列表
本出願は、５つの配列を有する配列表を含む。
本出願は、５つの配列を有する配列表を含む。
【背景技術】
【0003】
３．背景
制御性Ｔ細胞は、自己抗原及び非病原性抗原に対する免疫寛容を維持し、免疫恒常性を維持するＴ細胞の小さいが重要なサブセットに属する。制御性Ｔ細胞の２つの主要な集団－ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３＋細胞）及び１型制御性Ｔ（Ｔｒ１）細胞が存在する。Ｆｏｘｐ３＋及びＴｒ１細胞の両方が、臓器及び膵島移植、ＧｖＨＤ、並びに種々の自己免疫疾患及び炎症性疾患の種々の前臨床モデルにおいて病原性Ｔ細胞応答を下方制御する。
制御性Ｔ細胞は、自己抗原及び非病原性抗原に対する免疫寛容を維持し、免疫恒常性を維持するＴ細胞の小さいが重要なサブセットに属する。制御性Ｔ細胞の２つの主要な集団－ＣＤ４＋、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞（Ｆｏｘｐ３＋細胞）及び１型制御性Ｔ（Ｔｒ１）細胞が存在する。Ｆｏｘｐ３＋及びＴｒ１細胞の両方が、臓器及び膵島移植、ＧｖＨＤ、並びに種々の自己免疫疾患及び炎症性疾患の種々の前臨床モデルにおいて病原性Ｔ細胞応答を下方制御する。
【0004】
Ｔｒ１細胞は、臨床研究において有効であることが分かっている。クローン化された抗原特異的な自己Ｔｒ１細胞を進行中の中等度から重度のクローン病を有する患者に投与すると、客観的な一時的寛解がもたらされた（Desreumaux et al.,Gastroenterology.2012;143(5):1207-1217.e2.）。
さらに、同種ＨＳＣＴ後の白血病患者へのＴｒ１細胞が濃縮されたドナー由来の自己特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の養子移入は、重度のＧｖＨＤを伴うことなく、免疫系の迅速な再構成、並びに微生物感染及びウイルス感染に対する防御をもたらした。奏効した患者では、治癒をもたらす長期寛解及び耐性（７年超）が達成された（Bacchetta et al.,Front Immunol.2014;5:16）。
さらに、同種ＨＳＣＴ後の白血病患者へのＴｒ１細胞が濃縮されたドナー由来の自己特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の養子移入は、重度のＧｖＨＤを伴うことなく、免疫系の迅速な再構成、並びに微生物感染及びウイルス感染に対する防御をもたらした。奏効した患者では、治癒をもたらす長期寛解及び耐性（７年超）が達成された（Bacchetta et al.,Front Immunol.2014;5:16）。
【0005】
これらの有望な結果にもかかわらず、満たされていない医療ニーズが高い患者の大規模治療のためのドナー由来又は自己Ｔｒ１細胞の産生は、常に実現可能であるとは限らず、非常に面倒であり、大量の純粋なＴｒ１細胞の生成も可能にしない。
【0006】
最近、Ｌｏｃａｆａｒｏらは、ヒトＩＬ－１０遺伝子を含有する双方向レンチウイルスベクターを用いて、単一のドナーからの精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を形質導入することによって、これらの問題のいくつかを回避した。得られた単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０集団は、天然に存在するＴｒ１細胞の主要な機能を共有していた。Ｔｒ１細胞と同様に、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は高レベルのＩＬ－１０を産生し、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖を下方制御する。さらに、それらは、正常な骨髄性細胞（抗原提示細胞、ＡＰＣなど）及び骨髄性白血病細胞の両方に対して細胞傷害性である。これらの単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、移植片対白血病（ＧｖＬ）活性を保持しながら、ヒト化異種ＧｖＨＤモデルにおいてＧｖＨＤを減少させるのに有効であることが示された。Locafaro et al.Mol Ther.2017;25(10):2254-2269及び国際公開第２０１６／１４６，５４２号を参照されたい。
【0007】
治療的使用のための高度に精製された単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生することは可能であるが、様々な個々のバッチ間の定性的及び定量的差異のために依然として重大な制限があり、これはバフィーコートの質の変動に加えて様々なドナー間の固有の差異に関連する可能性が最も高い。
【発明の概要】
【0008】
４．概要
本開示は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を使用する新しいＴｒ１ベースの治療を提供する。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、次いでＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を指す。Ｔ細胞ドナーは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞で治療される宿主でも、ＨＳＣ又は臓器移植ドナーでもない第三者のドナーである。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種抗原特異的ではなく、換言すれば、投与前に宿主由来の細胞でプライミング又は刺激されていない。
本開示は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を使用する新しいＴｒ１ベースの治療を提供する。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、次いでＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を指す。Ｔ細胞ドナーは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞で治療される宿主でも、ＨＳＣ又は臓器移植ドナーでもない第三者のドナーである。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種抗原特異的ではなく、換言すれば、投与前に宿主由来の細胞でプライミング又は刺激されていない。
【0009】
本出願人は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のそれに匹敵するサイトカイン産生プロフィール、免疫抑制能及び細胞傷害能を有することを実証した。さらに、インビボでは、それらは単独ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞よりもＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される異種ＧｖＨＤを予防するのにより有効であるが、それらは単独ではＧｖＨＤを誘導しない。全体として、これらの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の機能的特性は、インビトロ及びインビボの両方で、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の機能的特性と同等か又はそれより良好であった。
【0010】
これらの結果に基づいて、本出願人は、複数ドナー同種ＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＧｖＨＤ、細胞及び臓器移植、自己免疫疾患及び炎症性疾患における治療目的のために使用され得ることを主張する。
【0011】
さらに、第三者のＴ細胞を使用し、自己特異性の必要性を排除することによって、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、Ｔｒ１ベースの細胞療法を様々な遺伝的背景を有する患者のより大きな集団に利用可能にする。
【0012】
したがって、本開示は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、当該ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナー（複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）から得られた細胞である、集団を提供する。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３、４、５、６、７、８、９、又は１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られたものである。いくつかの実施形態では、集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞は、全体で、６、７、８、９、１０、１１、１２、又はそれ以上の異なるＨＬＡハプロタイプを有する。
【0014】
いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、又は９／１０の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において互いに少なくとも３／４又は４／４の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ａ＊０２対立遺伝子を有する。
【0015】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれも不死化されない。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントに作動可能に連結される、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０はヒトＩＬ－１０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０はウイルスＩＬ－１０である。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１の配列を有するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２の配列を有する。いくつかの実施形態では、発現制御エレメントは、コードされたＩＬ－１０の構成的発現を駆動する。いくつかの実施形態では、発現制御エレメントは活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、発現制御エレメントは組織特異的又はＣＤ４＋Ｔ細胞特異的発現を駆動する。
【0016】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーはΔＮＧＦＲである。いくつかの実施形態では、ΔＮＧＦＲは、配列番号３の配列を有する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは配列番号５の配列を有する。
【0017】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、切断型ＥＧＦＲポリペプチドである。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、切断型ヒトＥＧＦＲポリペプチドである。
【0018】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドはＴ細胞核ゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドはＴ細胞核ゲノムに組み込まれない。
【0019】
いくつかの実施形態では、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％がＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％がＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％がＩＬ－１０を発現する。
【0020】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／培養培地１ｍｌ当たり、少なくとも１００ｐｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍｌ当たり、少なくとも２００ｐｇ、５００ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、又は５０ｎｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で活性化した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍｌ当たり、少なくとも１又は２ｎｇのＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体で活性化した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／ｍｌ当たり、少なくとも２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、又は５００ｎｇのＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも少なくとも５倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも少なくとも１０倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。
【0021】
いくつかの実施形態では、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％が外因性ポリヌクレオチドから選択マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％が外因性ポリヌクレオチドから選択マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、集団内のＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％が外因性ポリヌクレオチドから選択マーカーを発現する。
【0022】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ４９ｂを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＬＡＧ－３を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴＧＦ－βを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＦＮγを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＧｚＢを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はパーフォリンを発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ１８を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ２を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ２２６を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ－２２を発現する。
【0023】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、宿主由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でアネルギー化されていない。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、組換えＩＬ－１０タンパク質の存在下でアネルギー化されておらず、組換えＩＬ－１０タンパク質はＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されない。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、宿主由来のＤＣ１０細胞の存在下でアネルギー化されていない。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は凍結懸濁液中にある。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は液体懸濁液中にある。いくつかの実施形態では、液体懸濁液は予め凍結されている。
【0025】
本開示の別の態様では、
（ｉ）上記請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体に懸濁された
集団を含む医薬組成物が提供される。
（ｉ）上記請求項のいずれか一項に記載のＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、
（ｉｉ）薬学的に許容される担体に懸濁された
集団を含む医薬組成物が提供される。
【0026】
さらに別の態様では、本開示は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、
（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールする工程と、
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってプールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変する工程と、を含み、
それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る、方法。
（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールする工程と、
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってプールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変する工程と、を含み、
それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る、方法。
【0027】
一態様では、本開示は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法であって、
（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程と、
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に改変する工程と、次いで
（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程と、
を含む方法を提供する。
（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程と、
（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に改変する工程と、次いで
（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程と、
を含む方法を提供する。
【0028】
いくつかの実施形態では、本方法は、工程（ｉ）の後かつ工程（ｉｉ）の前に、又は工程（ｉｉ）の後に、又は工程（ｉｉ）の後かつ工程（ｉｉｉ）の前に、又は工程（ｉｉｉ）の後に、
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下でインキュベートする工程をさらに含む。
初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下でインキュベートする工程をさらに含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＩＬ－２の存在下で、さらに初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを使用して初代ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２の配列を有する。
【0030】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードするセグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、コードされた選択マーカーはΔＮＧＦＲである。いくつかの実施形態では、コードされた選択マーカーは、配列番号３の配列を有する。いくつかの実施形態では、コードされる選択マーカーは、切断型ＥＧＦＲポリペプチドである。いくつかの実施形態では、コードされる選択マーカーは、切断型ヒトＥＧＦＲポリペプチドである。
【0031】
いくつかの実施形態では、本方法は、工程（ｉｉ）の後に、
選択マーカーを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それにより遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団を生成する工程をさらに含む。
選択マーカーを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それにより遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団を生成する工程をさらに含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％又は少なくとも９５％がＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％がＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％又は少なくとも９５％が選択マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９８％が選択マーカーを発現する。
【0033】
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団をインキュベートする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団をインキュベートする工程は、ＩＬ－２の存在下、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又はＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下で行われる。
【0034】
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を凍結する後続する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）において、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３、４、５、６、７、８、９、又は１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られる。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、又は９／１０の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において互いに少なくとも３／４又は４／４一致する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーの各々は、Ａ＊０２対立遺伝子を有する。
【0035】
いくつかの実施形態では、工程（ｉ）において、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１つ又はそれ以上の凍結ストックから得られる。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）において、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーの非凍結末梢血単核細胞から得られる。
【0036】
いくつかの実施形態では、本方法は、末梢血単核細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、末梢血単核細胞はバフィーコート又はアフェレーシスから得られる。
【0037】
別の態様では、本開示は、患者を治療する方法であって、
本開示の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物を、免疫寛容を必要とする患者に投与する工程を含む方法を提供する。
本開示の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物を、免疫寛容を必要とする患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【0038】
いくつかの実施形態では、本方法は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の凍結懸濁液を解凍する先行する工程をさらに含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、患者における病原性Ｔ細胞応答の重症度を予防又は軽減する。
【0040】
いくつかの実施形態では、本方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）ドナー由来の単核細胞を患者に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物及びＨＳＣドナー由来の単核細胞を同時に投与する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣからの単核細胞は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物の投与の前又は後のいずれかに投与される。いくつかの実施形態では、単核細胞はＰＢＭＣ中にあるものである。いくつかの実施形態では、単核細胞は骨髄中にあるものである。いくつかの実施形態では、単核細胞は臍帯血中にあるものである。いくつかの実施形態では、単核細胞は、ＰＢＭＣ、骨髄又は臍帯血から単離されたものである。
【0041】
いくつかの実施形態では、本方法は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物の投与の前又は後のいずれかに、ＨＳＣドナーの造血幹細胞（ＨＳＣ）を患者に投与する工程をさらに含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０未満、６／１０未満、７／１０未満、８／１０未満、９／１０未満又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８未満、５／８未満、６／８未満、７／８未満又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、３／４未満又は４／４未満の一致を有する。
【0043】
いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ不一致又は部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８未満、５／８未満、６／８未満、７／８未満又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、２／４未満、３／４未満又は４／４未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーとＨＬＡ不一致又は部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において３／４又は４／４未満の一致を有する。
【0044】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、移植された造血幹細胞によるＧｖＨＤの重症度を予防又は軽減する。
【0045】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、移植された造血幹細胞由来のリンパ系細胞の病原性応答の重症度を予防又は軽減する。
【0046】
いくつかの実施形態では、患者は癌を有する。いくつかの実施形態では、患者は新生物細胞を有する。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、ＣＤ１３、ＨＬＡ－クラスＩ及びＣＤ５４を発現する。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、ＣＤ１１２、ＣＤ５８又はＣＤ１５５を発現する。
【0047】
いくつかの実施形態では、患者は癌を有する。いくつかの実施形態では、癌は、固形又は血液新生物である。いくつかの実施形態では、患者は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、男性の乳癌、原発不明の癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌及び低咽頭癌、白血病、急性リンパ球性（ＡＬＬ）、急性骨髄（骨髄性肉腫及び皮膚白血病を含むＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄（ＣＭＬ）白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児の白血病、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、小児の非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫－成人軟部組織癌、皮膚癌、皮膚癌－基底細胞及び扁平細胞、皮膚癌－黒色腫、皮膚癌－メルケル細胞、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される癌を有する。
【0048】
いくつかの実施形態では、癌は骨髄性癌である。いくつかの実施形態では、癌はＡＭＬ又はＣＭＬである。
【0049】
いくつかの実施形態では、患者は、炎症性疾患又は自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態では、炎症性又は自己免疫性疾患は、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性狼瘡、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、水疱性疾患、強皮症、及びセリアック病からなる群から選択される。
【0050】
いくつかの実施形態では、炎症性又は自己免疫性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、１型糖尿病、狼瘡、乾癬、乾癬性関節炎、又は関節リウマチである。
【0051】
いくつかの実施形態では、患者は、ＮＬＰＲ３インフラマソームの超活性を伴う疾患又は障害を有する。いくつかの実施形態では、患者は、２型糖尿病、神経変性疾患又は炎症性腸疾患を有する。
【0052】
いくつかの実施形態では、患者は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１β産生の増加を伴う疾患又は障害を有する。
【0053】
いくつかの実施形態では、患者は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１８産生の増加を伴う疾患又は障害を有する。
【0054】
いくつかの実施形態では、患者は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞による成熟カスパーゼ１産生の増加を伴う疾患又は障害を有する。
【0055】
いくつかの実施形態では、患者は、アレルギー性又はアトピー性疾患を有する。いくつかの実施形態では、アレルギー性又はアトピー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎及び鼻炎からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、患者は食物アレルギーを有する。
【0056】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団又は医薬組成物の投与の前又は後のいずれかに、患者へ細胞及び臓器を移植する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、細胞及び臓器移植の宿主拒絶の重症度を予防又は軽減する。
【0057】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団又は医薬組成物の投与の前又は後に、ｉＰＳ細胞由来の細胞又は組織を患者に移植する工程をさらに含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、移植の宿主拒絶の重症度を予防又は軽減する。
【0059】
いくつかの実施形態では、本方法は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物の投与前又は投与後に、組換えＡＡＶを患者に投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、組換えＡＡＶに対する免疫応答を低下させる。
【0060】
いくつかの実施形態では、患者は、ウイルス感染又は細菌感染に対する過剰な免疫応答を有する。いくつかの実施形態では、患者は、コロナウイルス感染症を有する。
【0061】
いくつかの実施形態では、本方法は、患者から得られた生物学的試料において選択マーカーを検出し、それにより、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の有無を検出する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、生物学的試料は患者由来の生検試料又は血液である。
【0062】
一態様では、本開示は、悪性腫瘍を有する患者を治療する方法であって、同種ＨＳＣＴ移植片を患者に投与する工程と、治療有効量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与する工程とを含む方法を提供する。
【0063】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のドナーのいずれも、ＨＳＣＴ移植片のドナーではない。
【0064】
別の態様では、本開示は、血液癌を治療する方法であって、抗癌効果を誘導するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を血液癌患者に投与する工程を含み、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られ、次いで構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、方法を提供する。
【0065】
いくつかの実施形態では、本方法は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与に先立って、又はその後に患者に同種ＨＳＣＴ移植片を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の量は、同種ＨＳＣＴの移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのにさらに十分な量である。
【0066】
いくつかの実施形態では、血液癌が骨髄性白血病である。
【0067】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ１３を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＨＬＡ－クラスＩを発現する癌細胞を標的化し、死滅させる。いくつかの実施形態では、骨髄性白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。
【0068】
いくつかの実施形態では、同種ＨＳＣＴ移植片は、レシピエントの血縁ドナー又は非血縁ドナーから得られる。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、レシピエントにとって非自己である。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、レシピエントに対して同種である。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されない。
【0069】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞はＴｒ１様細胞である。
【0070】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞はポリクローナルである。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ポリクローナルであり、レシピエントにとって非自己である。
【0071】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、少なくとも３人のドナーから単離された後に遺伝子改変される。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のドナーのいずれも、同種ＨＳＣＴドナーと同じドナーではない。いくつかの実施形態では、同種ＨＳＣＴ移植片は、レシピエントに対して一致するドナー又は不一致のドナーから得られる。
【0072】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ５４を発現する細胞を標的化し、死滅させる。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＨＬＡ－クラスＩ及びＣＤ５４を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ１１２を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＣＤ５８を発現する癌細胞を標的化し、死滅させる。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、宿主中の癌細胞を標的化し、死滅させる。
【0073】
本開示の一態様は、同種造血幹細胞移植（同種ＨＳＣＴ）によって血液癌を治療する方法であって、
対象（宿主）へ同種ＨＳＣＴ移植片を投与する工程と、
同種ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を同種ＨＳＣＴのレシピエント（宿主）に投与する工程と、を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３名の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介性遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、レシピエントにとって非自己であり、同種ＨＳＣＴドナーにとって非自己であり、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されておらず、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がポリクローナル及びＴｒ１様である、方法を提供する。
対象（宿主）へ同種ＨＳＣＴ移植片を投与する工程と、
同種ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を同種ＨＳＣＴのレシピエント（宿主）に投与する工程と、を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３名の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介性遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、レシピエントにとって非自己であり、同種ＨＳＣＴドナーにとって非自己であり、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されておらず、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がポリクローナル及びＴｒ１様である、方法を提供する。
【0074】
本開示の他の態様は、同種造血幹細胞移植（同種ＨＳＣＴ）によって血液癌を治療する方法であって、
対象（宿主）へ同種ＨＳＣＴ移植片を投与する工程と、
同種ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を同種ＨＳＣＴのレシピエント（宿主）に投与する工程と、を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３名の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介性遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主中の癌細胞を標的化し、死滅させ、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されておらず、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、レシピエントにとって非自己であり、ポリクローナルであり、Ｔｒ１様である、方法を提供する。
対象（宿主）へ同種ＨＳＣＴ移植片を投与する工程と、
同種ＨＳＣＴ移植片の移植片対白血病（ＧｖＬ）又は移植片対腫瘍（ＧｖＴ）の効力を抑制することなく移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を抑制するのに十分な量の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を同種ＨＳＣＴのレシピエント（宿主）に投与する工程と、を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、少なくとも３名の異なるＴ細胞ドナーから得られ、構成的プロモーターの制御下でヒトＩＬ－１０のコード配列のベクター媒介性遺伝子導入によって遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主中の癌細胞を標的化し、死滅させ、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、宿主へ投与する前に宿主の同種抗原に対してアネルギー化されておらず、
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、レシピエントにとって非自己であり、ポリクローナルであり、Ｔｒ１様である、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0075】
５．図面の簡単な説明
【図2】図２は、ヒトＩＬ－１０及びΔＮＧＦＲコード配列を複数のドナーからＣＤ４＋Ｔ細胞に送達して複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生するための双方向レンチウイルスベクター（ｈＰＧＫ．ＩＬ１０．ＷＰＲＥ．ｍｈＣＭＶ．ΔＮＧＦＲ．ＳＶ４０ＰＡ）の完全かつ環状の構造を示す。
【図4A】図４Ａは、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ（ヒトＩＬ－１０及び切断型ヒトＮＧＦ受容体をコードする双方向レンチウイルスベクター）で形質導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞（平均±ＳＤ、ｎ＝１０、灰色バー）及びベクターのコピー数（ＶＣＮ、平均±ＳＤ、ｎ＝１０、オレンジ色のバー）のパーセンテージを示す。
【図4B】図４Ｂは、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲで形質導入され、抗ＣＤ２７１マイクロビーズを使用して精製された２人の代表的なドナー（ドナーＢ及びドナーＣ）由来のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４及びΔＮＧＦＲの発現のＦＡＣＳ分析を示す。
【図5】図５は、２回目（ＴＦ２）及び３回目（ＴＦ３）の再刺激後の単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルを示す。ＴＦ２細胞及びＴＦ３ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を刺激せずに放置した（オレンジ色のバー）、又は固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ（灰色のバー）で４８時間刺激した。培養上清を回収し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。すべての試料を３連で試験した。平均±ＳＤ、試験したドナー（ｎ＝８）を示す。
【図6】図６Ａは、ＦＡＣＳによって分析された２回目の刺激（ＴＦ２）後のグランザイムＢ（ＧｚＢ）を発現するＣＤ４ＩＬ－１０細胞のパーセンテージを示す。ドナー（ｎ＝７）及び単一ドナーのボックス及びウィスカーを示す。図６Ｂは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５／ウェル）をＫ５６２及びＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５／ウェル）と１：１の比で３日間共培養した場合の死細胞％を示す。ボックス及びウィスカーはｎ＝４のドナーのデータを表し、点は単一のドナーのデータを表す。
【図7A】図７Ａ及び図７Ｂは、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制し得ることを示す。同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（１０５細胞／ウェル）で標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の非存在下又は存在下（１０５細胞／ウェル）、１：１のレスポンダー：サプレッサー比で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。４日間の培養後、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞でゲーティングしてから、フローサイトメトリーを用いてｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０希釈によって増殖応答細胞の割合を求めた。図７Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦの結果を示し、図７Ｂは、ドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬの結果を示す。増殖及び抑制の割合を示す。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって媒介される抑制を以下のように計算した：１００－（［ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下での応答細胞の増殖／応答細胞単独での増殖］×１００）。
【図7B】同上。
【図8A】図８Ａ及び図８Ｂは、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が同種ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制し得ることを示す。同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（１０５細胞／ウェル）で標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の非存在下又は存在下（１０５細胞／ウェル）、１：１のレスポンダー：サプレッサー比で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。４日間の培養後、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞でゲーティングしてから、フローサイトメトリーを用いてｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０希釈によって増殖応答細胞の割合を求めた。図８Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦの結果を示し、図８Ｂは、ドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬの結果を示す。増殖及び抑制の割合を示す。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって媒介される抑制を以下のように計算した：１００－（［ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下での応答細胞の増殖／応答細胞単独での増殖］×１００）。
【図8B】同上。
【図9】図９は、８名の個々のドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって産生される平均レベル（＋／－ＳＤ）と比較した、３回目の（ＴＦ３）再刺激後の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルを示す。３人のドナー由来のＴＦ３ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１：１：１の比でプールし、固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで４８時間刺激した。培養上清を回収し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。点は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果であり、灰色のバーは平均±ＳＤ、単一ドナー（ｎ＝８）を表す。
【図10】図１０Ａは、プールを生成するために使用した単一ドナー（ｎ＝３）のＣＤ４ＩＬ－１０細胞によるグランザイムＢ発現の平均％レベル（＋／－ＳＤ）と比較した、グランザイムＢを発現する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（ＧｚＢ）のパーセンテージを示す。３回目の刺激（ＴＦ３）後にＦＡＣＳによって細胞を分析した。図１０Ｂは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５個／ウェル）をＫ５６２細胞及びＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５個／ウェル）と１：１の比で３日間共培養した場合の死細胞％を示す。残存白血病細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋）を各標的細胞についてＦＡＣＳによって計数した。点は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０の結果であり、灰色のバーはプールを生成するために使用された単一ドナー（ｎ＝３）の平均±ＳＤを表す。
【図11A】図１１Ａ及び図１１Ｂは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が同種ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制し得ることを示す。同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（１０５細胞／ウェル）で標識し、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の非存在下又は存在下（１０５細胞／ウェル）、１：１のレスポンダー：サプレッサー比で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。４日間の培養後、増殖応答細胞の割合を、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞及びＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞でゲーティングしてから、フローサイトメトリーを用いてｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０希釈によって求めた。図１１Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦからプールされたＣＤ４＋細胞を含有する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。図１１Ｂは、ドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬからプールされたＣＤ４＋細胞を含有する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞によって媒介される抑制を以下のように計算した：１００－（［ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下での応答細胞の増殖／応答細胞単独での増殖］×１００）。
【図11B】同上。
【図13】図１３は、ＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）、複数ドナー（３名のドナー）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６細胞／マウス）又はＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）を複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３名のドナー）（５×１０６細胞／マウス）と組み合わせて注射した後の各日においてＧｖＨＤを示すＮＳＧマウスの％を示す。
【図14】図１４は、ＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）、複数ドナー（３名のドナー）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６細胞／マウス）、又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３名のドナー）（５×１０６細胞／マウス）と組み合わせたＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）を注射したＮＳＧマウスにおける脾臓及び骨髄へのＣＤ４ＩＬ－１０細胞の遊走を示す。ドナー（ｎ＝８）及び単一ドナーのボックス及びウィスカーを示す。
【図17】図１７Ａ及び図１７Ｂは、循環白血病細胞の減少及び長期の無白血病生存に基づいて試験した移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を示す。白血病を以前に報告されているように測定した（Locafaro G.et al Molecular Therapy 2017）。０日目に、ＮＳＧマウスに亜致死量の放射線を照射し、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）（５×１０６個）を静脈内注射した。図１７Ａは、３日目にＰＢＭＣ（５×１０６個）又は単一ドナー（ドナーＢＣ－Ｉ及びドナーＢＣ－Ｈ由来）のＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を注射した動物の無白血病生存率を示す。図１７Ｂは、３日目にＰＢＭＣ（５×１０６個）又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を注射した動物の無白血病生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【0076】
これらの図面は、例示のみを目的として本発明の様々な実施形態を示す。当業者は、以下の説明から、本明細書に記載される本発明の原理から逸脱することなく、本明細書に示される構造及び方法の代替実施形態が使用され得ることを容易に理解するであろう。
【0077】
６．詳細な説明
６．１．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に帰する意味を有する。
６．１．定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下に帰する意味を有する。
【0078】
「移植片対白血病効果」又は「ＧｖＬ」は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）又は骨髄移植（ＢＭＴ）の後に現れる効果を指す。同種移植片のＴリンパ球は、悪性の残留する宿主白血病細胞を排除する。
【0079】
「移植片対腫瘍効果」又は「ＧｖＴ」は、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）又は骨髄移植（ＢＭＴ）の後に現れる効果を指す。
同種移植片のＴリンパ球は、悪性の残存する宿主癌細胞、例えば、骨髄腫並びにリンパ性及び骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫及びおそらくは乳癌の細胞を排除する。ＧｖＴという用語は、ＧｖＬの総称である。
同種移植片のＴリンパ球は、悪性の残存する宿主癌細胞、例えば、骨髄腫並びにリンパ性及び骨髄性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫及びおそらくは乳癌の細胞を排除する。ＧｖＴという用語は、ＧｖＬの総称である。
【0080】
「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書では、医学分野で理解されている最も広い意味で使用される。特に、これらの用語は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味する。その効果は、疾患、状態、又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防的であり得、及び／あるいは、疾患若しくは状態及び／又は有害作用、例えば、その疾患若しくは状態に起因する症状の部分的又は完全な治癒の点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒトの疾患又は状態のあらゆる治療を包含し、（ａ）その疾患又は状態にかかりやすい可能性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患又は状態が発生するのを予防する工程、（ｂ）その疾患又は状態を阻害する工程（例えば、その発症を阻止する工程）、あるいは、（ｃ）その疾患又は状態を軽減する工程（例えば、その疾患又は状態を退縮させ、１つ又はそれ以上の症状の改善をもたらす工程）を含む。
いずれの状態の改善も、当分野で公知の標準的な方法及び技術に従って容易に評価することができる。疾患の方法によって治療される対象の集団には、望ましくない状態又は疾患に罹患している対象、並びにその状態又は疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。
いずれの状態の改善も、当分野で公知の標準的な方法及び技術に従って容易に評価することができる。疾患の方法によって治療される対象の集団には、望ましくない状態又は疾患に罹患している対象、並びにその状態又は疾患の発症のリスクがある対象が含まれる。
【0081】
本明細書で使用される「ＨＬＡ一致」は、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）及びクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１）遺伝子座において一致するＨＬＡ対立遺伝子を有し、個体が互いに免疫学的に適合することを可能にするその個体のペアを指す。ＨＬＡ適合性は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Tiervy,Haematologica 2016 Volume 101(6):680-687に記載されているような、当分野で利用可能な方法のいずれかを使用して決定することができる。
【0082】
所与の遺伝子座について、個体のペアは、一方の個体の２つの対立遺伝子の各々が他方の個体の２つの対立遺伝子と一致する場合、２／２の一致を有する。個体のペアは、一方の個体の２つの対立遺伝子の一方のみが他方の個体の２つの対立遺伝子の一方と一致する場合、１／２の一致を有する。個体のペアは、一方の個体の１０個の対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座の各々について２つ）のすべてが他方の個体の１０個の対立遺伝子のすべてと一致する場合、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において１０／１０の一致を有する。
【0083】
好ましい実施形態では、対立遺伝子レベルタイピングがＨＬＡ適合性の決定のために使用される。対立遺伝子レベルタイピングは、例えば、Ａ＊０２：０１：０１：０１のように第１、第２、第３及び第４の区域のすべての数字を使用することによって定義されるＨＬＡ遺伝子の固有のヌクレオチド配列に対応する。
機能的には、コード配列におけるサイレント置換及び非コード配列における置換によってそれぞれ異なる対立遺伝子を特徴付ける第３及び第４の区域は、置換がＨＬＡ対立遺伝子の発現を妨げる場合（例えば、ヌル対立遺伝子Ｂ＊１５：０１：０１：０２Ｎ）を除いて、無関係である。ヌル対立遺伝子を欠くことは、同種反応性Ｔ細胞によって認識される可能性が非常に高く、有害な臨床的影響を有するミスマッチをもたらすことが多い。非コード配列における置換は、発現レベルに影響を及ぼし得る（例えば、Ａ２４ｌｏｗ対立遺伝子Ａ＊２４：０２：０１：０２Ｌ）。そのような変動性はまた、抗ＨＬＡ非自己認識に影響を及ぼし得る。
機能的には、コード配列におけるサイレント置換及び非コード配列における置換によってそれぞれ異なる対立遺伝子を特徴付ける第３及び第４の区域は、置換がＨＬＡ対立遺伝子の発現を妨げる場合（例えば、ヌル対立遺伝子Ｂ＊１５：０１：０１：０２Ｎ）を除いて、無関係である。ヌル対立遺伝子を欠くことは、同種反応性Ｔ細胞によって認識される可能性が非常に高く、有害な臨床的影響を有するミスマッチをもたらすことが多い。非コード配列における置換は、発現レベルに影響を及ぼし得る（例えば、Ａ２４ｌｏｗ対立遺伝子Ａ＊２４：０２：０１：０２Ｌ）。そのような変動性はまた、抗ＨＬＡ非自己認識に影響を及ぼし得る。
【0084】
本明細書で使用される「ＨＬＡ不一致」という用語は、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）及びクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１）遺伝子座に不一致のＨＬＡ対立遺伝子を有し、個体を互いに免疫学的に不適合にする個体のペアを指す。
【0085】
本明細書で使用される「部分的ＨＬＡ不一致」という用語は、ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）及びクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１）遺伝子座に不一致のＨＬＡ対立遺伝子を有し、許容される程度に個体を互いに免疫学的に不適合にする個体のペアを指す。いくつかの研究では、許容された不一致が特定されている。いくつかのＨＬＡクラスＩの非適合性は、より許容性が高いと考えられる。
【0086】
「ＨＬＡハプロタイプ」は、染色体ごとの一連のＨＬＡ遺伝子座対立遺伝子を指し、１つは母親から渡され、１つは父親から渡される。ＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ）及びクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１）遺伝子座の遺伝子型を使用して、ＨＬＡハプロタイプを決定することができる。
【0087】
「治療有効量」という用語は、疾患を治療し、ひいては疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療と考えられ得るので、治療有効量は「予防有効量」であり得る。
【0088】
「改善する」という用語は、予防、重症度若しくは進行の軽減、寛解又は治癒を含む、疾患状態、例えば、神経変性疾患状態の治療における任意の治療上有益な結果を指す。
【0089】
６．２．他の解釈規則
本明細書に記載された範囲は、記載された終点を含む範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。
本明細書に記載された範囲は、記載された終点を含む範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、１から５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含むと理解される。
【0090】
６．３．実験観察のまとめ
本開示は、ヒトＩＬ－１０遺伝子及び切断型非シグナル伝達形態のヒトＮＧＦＲを含有する双方向レンチウイルスベクターで形質導入された高度に精製された同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生及び使用のための方法を提供する。首尾よく形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＮＧＦＲ特異的モノクローナル抗体を利用して精製して、９５％超の純粋なＩＬ－１０を産生しＮＧＦＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞と命名）を得た。３人の異なる同種ＨＬＡ不一致ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１：１：１の比でプールした。
本開示は、ヒトＩＬ－１０遺伝子及び切断型非シグナル伝達形態のヒトＮＧＦＲを含有する双方向レンチウイルスベクターで形質導入された高度に精製された同種ＣＤ４＋Ｔ細胞の産生及び使用のための方法を提供する。首尾よく形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＮＧＦＲ特異的モノクローナル抗体を利用して精製して、９５％超の純粋なＩＬ－１０を産生しＮＧＦＲを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞と命名）を得た。３人の異なる同種ＨＬＡ不一致ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１：１：１の比でプールした。
【0091】
本明細書で複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞とも呼ばれるこれらのプール集団は、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞及び天然由来の１型制御性Ｔ（Ｔｒ１）細胞のサイトカイン産生プロファイルに匹敵するサイトカイン産生プロファイルを有していた。それらは、高レベルのＩＬ－１０、ＩＬ－２２、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－５及び低レベルのＩＬ－４を産生する。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞はポリクローナルであり（複数の抗原特異性を有する）、インビトロで同種ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖を抑制した。さらに、それらはインビトロで骨髄性白血病細胞を特異的に死滅させた。移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のヒト化マウスモデルにおける複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入は、これらの細胞が脾臓に効率的にホーミングすることを示した。ＧｖＨＤのヒト化マウスモデルにおける複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の養子移入は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によって誘導される重度の異種ＧｖＨＤを阻害した。重要なことに、高濃度であっても、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は単独ではＧｖＨＤを誘導しなかった。これらの結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＧｖＨＤの治療及び／又は予防のために使用することができ、白血病及び他の悪性腫瘍を治療するための同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の補助として使用してＨＳＣＴのＧｖＬ又はＧｖＴの治療効果を維持しながらＧｖＨＤを軽減することができ、細胞及び臓器の拒絶並びに自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するために使用できることを示している。
【0092】
６．４．複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞
第１の態様では、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞の集団（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞）が提供される。この集団は、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナー（複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
第１の態様では、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されたＣＤ４＋Ｔ細胞の集団（ＣＤ４ＩＬ－１０細胞）が提供される。この集団は、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナー（複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞）から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【0093】
６．４．１．ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴ細胞ドナー
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０集団に使用されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、当分野で利用可能な方法を使用して、末梢血、臍帯血、又はドナー由来の他の血液試料から単離することができる。典型的な実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は末梢血から単離される。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、第三者の血液バンクから得られた末梢血から単離される。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０集団に使用されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、当分野で利用可能な方法を使用して、末梢血、臍帯血、又はドナー由来の他の血液試料から単離することができる。典型的な実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は末梢血から単離される。特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、第三者の血液バンクから得られた末梢血から単離される。
【0094】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、血液の事前に凍結されたストック又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の事前に凍結されたストックから単離される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、末梢血から、又は事前に凍結されていないＰＢＭＣから単離される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、複数のドナーから得られた血液又はＰＢＭＣから別々に単離され、次いでプールされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、複数のドナーから最初にプールされた血液又はＰＢＭＣから単離される。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３、４、５、６、７、８、９、又は１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られるものである。
【0096】
いくつかの実施形態では、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーは、遺伝子型に関係なく選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーは、遺伝子型に基づいて選択される。
【0097】
特定の実施形態では、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーは、それらのＨＬＡハプロタイプに基づいて選択される。
【0098】
いくつかの実施形態では、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーの一部又は全員が、一致するＨＬＡハプロタイプを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーの一部又は全員が、不一致のＨＬＡハプロタイプを有する。
【0099】
いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、又は９／１０の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ ＤＱＢ１遺伝子座において互いに少なくとも３／４又は４／４の一致を有する。いくつかの実施形態では、集団中のすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ａ＊０２対立遺伝子を有する。
【0100】
好ましい実施形態では、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーのいずれも、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞で処理される宿主ではない。好ましい実施形態では、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーのいずれも、本明細書に記載の治療方法においてＣＤ４ＩＬ－１０細胞と共に使用される幹細胞（例えば、ＨＳＣ）、組織又は臓器のドナーではない。
【0101】
いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、治療される患者（宿主）に対して、ＨＬＡ不一致又は部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８未満、５／８未満、６／８未満、７／８未満又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、２／４未満、３／４未満又は４／４未満の一致を有する。
【0102】
いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーとＨＬＡ不一致又は部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において３／４又は４／４未満の一致を有する。
【0103】
好ましい実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれも不死化されない。
【0104】
６．４．２．ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチド
本開示の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞である。外因性ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントに作動可能に連結されるＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。
本開示の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを含むように遺伝子改変されているＣＤ４＋Ｔ細胞である。外因性ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントに作動可能に連結されるＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む。
【0105】
ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、ヒト、ボノボ又はアカゲザルのＩＬ－１０をコードし得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１の配列を有するヒトＩＬ－１０をコードする。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有するヒトＩＬ－１０の変異体をコードする。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【0106】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドはウイルス－ＩＬ－１０をコードする。様々な実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＨＣＭＶ、ＧＭＣＭＶ、ＲｈＣＭＶ、ＢａＣＭＶ、ＭＯＣＭＶ、ＳＭＣＭＶ、ＥＢＶ、Ｂｏｎｏｂｏ－ＨＶ、ＢａＬＣＶ、ＯｖＨＶ－２、ＥＨＶ－２、ＣｙＨＶ－３、ＡｎｇＨＶ－１、ＯＲＦＶ、ＢＰＳＶ、ＰＣＰＶ、ＬＳＤＶ、ＳＰＶ、ＧＰＶ、又はＣＮＰＶ由来のＩＬ－１０をコードする。いくつかの実施形態では、外因性ポリペプチドは、ＥＢＶ又はＯＲＦＶ由来のウイルスＩＬ－１０をコードする。
【0107】
外因性ポリヌクレオチドは、形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるコードされたＩＬ－１０の発現を指令する発現制御エレメントをさらに含む。
【0108】
いくつかの実施形態では、発現制御エレメントは、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の発現を指令することができるプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターはＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の構成的発現を駆動する。いくつかの実施形態では、プロモーターは、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ－１０の発現を駆動する。
【0109】
いくつかの実施形態では、治療上適切な場合に、誘導性プロモーターを使用してＩＬ－１０の発現を誘導する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０プロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、系統特異的プロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、遍在的に発現されるプロモーターが使用される。
【0110】
いくつかの実施形態では、天然のヒトプロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、ヒト伸長因子（ＥＦ）１αプロモーターが使用される。いくつかの実施形態では、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）が使用される。いくつかの実施形態では、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＩ－Ｃ）が使用される。
【0111】
いくつかの実施形態では、合成プロモーターが使用される。特定の実施形態では、最小ＣＭＶコアプロモーターが使用される。特定の実施形態では、誘導性の又は構成的な双方向プロモーターが使用される。特定の実施形態では、Amendola et al.,Nature Biotechnology,23(1):108-116(2005)に開示されている合成双方向プロモーターが使用される。このプロモーターは、遍在的又は組織特異的な態様で２つのｍＲＮＡの協調転写を媒介することができる。特定の実施形態では、双方向プロモーターは、ＩＬ－１０及び選択マーカーの発現を誘導する。
【0112】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、首尾よく形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞の選択を可能にする選択マーカーをコードするセグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーはΔＮＧＦＲである。特定の実施形態では、選択マーカーは、配列番号３の配列を有するポリペプチドである。特定の実施形態では、選択マーカーは、配列番号３と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有するポリペプチドである。特定の実施形態では、ΔＮＧＦＲ選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４の配列を有する。いくつかの実施形態では、ΔＮＧＦＲ選択マーカーをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。
【0113】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、切断型のＥＧＦＲポリペプチドである。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、その全体が本明細書に組み込まれる、Wang et al.“A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection,in vivo tracking,and ablation of engineered cells”,Blood,v.118,n.5(2011)に開示されているヒトＥＧＦＲポリペプチドの切断型、任意選択でｈｕＥＧＦＲｔである。
【0114】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、抗生物質耐性遺伝子をコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、アンピシリン耐性遺伝子をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、カナマイシン耐性遺伝子をコードする配列を含む。
【0115】
典型的な実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ベクターを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞に送達される。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミドベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
【0116】
特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクターを使用してＣＤ４＋Ｔ細胞に送達され、外因性ポリヌクレオチドはレンチウイルスベクター配列を含む。特定の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれる、Matrai et al.,Molecular Therapy 18(3):477-490(2010)（「Ｍａｔｒａｉ」）に開示されているレンチウイルスベクターが使用される。
【0117】
いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込むことができない。いくつかの実施形態では、組込み欠損レンチウイルスベクターが使用される。
例えば、いくつかの実施形態では、Ｍａｔｒａｉに開示されている組込み欠損又は他のレンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、インテグラーゼ欠損レンチウイルスが使用される。例えば、インテグラーゼ（Ｄ６４Ｖ）に不活性化変異を含有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスを、参照により本明細書に組み込まれるMatrai et al.,Hepatology 53:1696-1707(2011)に記載されるように使用することができる。
例えば、いくつかの実施形態では、Ｍａｔｒａｉに開示されている組込み欠損又は他のレンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態では、インテグラーゼ欠損レンチウイルスが使用される。例えば、インテグラーゼ（Ｄ６４Ｖ）に不活性化変異を含有するインテグラーゼ欠損レンチウイルスを、参照により本明細書に組み込まれるMatrai et al.,Hepatology 53:1696-1707(2011)に記載されるように使用することができる。
【0118】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞核ゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、核ゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞の細胞質に存在する。
【0119】
特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号５の配列を有する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号５と少なくとも９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【0120】
６．４．３．複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の遺伝子発現
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞はＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を構成的に発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、活性化されるとＩＬ－１０を発現する。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞はＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を構成的に発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、活性化されるとＩＬ－１０を発現する。
【0121】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／培養培地１ｍｌ当たり、少なくとも１００ｐｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／培養培地１ｍｌ当たり、少なくとも２００ｐｇ、５００ｐｇ、１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、又は５０ｎｇのＩＬ－１０を構成的に発現する。
【0122】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体の組み合わせ又は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズで活性化した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／培養培地１ｍｌ当たり、少なくとも１ｎｇ又は２ｎｇのＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体又はＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズで活性化した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞１０６個／培養培地１ｍｌ当たり、少なくとも５ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ又は５００ｎｇのＩＬ－１０を発現する。
【0123】
様々な実施形態では、ＩＬ－１０産生量は、タンパク質の検出及び測定のための様々な方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、分光学的手順、比色法、アミノ酸分析、放射性標識、エドマン分解、ＨＰＬＣ、ウェスタンブロッティングなどを使用して、活性化の１２時間後、２４時間後又は４８時間後に測定される。好ましい実施形態では、ＩＬ－１０産生量は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体による活性化の４８時間後にＥＬＩＳＡで測定する。
【0124】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも少なくとも５倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、非改変ＣＤ４＋Ｔ細胞よりも少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、又は５０倍高いレベルでＩＬ－１０を発現する。
【0125】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、選択マーカーをさらに発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、典型的にはＴｒ１細胞において発現されるタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｔｒ１細胞に特徴的なマーカータンパク質を発現する。
【0126】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞はＣＤ４９ｂを発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞はＬＡＧ－３を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βを発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞はＩＦＮγを発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＧｚＢを発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、骨髄性抗原提示細胞で活性化されるとＧｚＢを放出する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、パーフォリンを発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、骨髄性抗原提示細胞で活性化されるとパーフォリンを放出する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ１８を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ２を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ２２６を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－２２を発現する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０を発現する。
【0127】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、Ｔｒ１細胞の少なくとも１つの表現型機能を示す。様々な実施形態では、その機能は、ＩＬ－１０の分泌、ＴＧＦ－βの分泌、並びにグランザイムＢ（ＧｚＢ）及びパーフォリンの放出による骨髄性抗原提示細胞の特異的殺滅によるものである。
【0128】
６．４．４．プロセスごとの生成物
典型的な実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドでＣＤ４＋Ｔ細胞を修飾することによって得られる。
典型的な実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドでＣＤ４＋Ｔ細胞を修飾することによって得られる。
【0129】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター又はプラスミドベクターによってＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される。特定の態様では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ－１０のコード配列を含有するレンチウイルスで形質導入される。
【0130】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールする工程と、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってプールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変する工程と、によって生成される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程と、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に改変する工程と、次いで、（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールする工程と、によって生成される。
【0131】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化することができるタンパク質の存在下で培養されたものである。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下で培養されたものである。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ－２、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズ及びＩＬ－２の存在下で培養されている。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞を、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で培養した。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で培養した。
【0132】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は凍結ストック中にある。
【0133】
６．５．医薬組成物
別の態様では、医薬組成物が提供される。本薬剤は、本明細書に開示される複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。
別の態様では、医薬組成物が提供される。本薬剤は、本明細書に開示される複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。
【0134】
本医薬組成物は、人間医学又は獣医学に適した任意の投与経路による投与のために製剤化することができる。典型的な実施形態では、本組成物は、静脈内（ＩＶ）投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、本組成物は静脈内（ＩＶ）注入のために製剤化される。ＩＶ投与のために製剤化された実施形態では、本医薬組成物は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態である。
【0135】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体又は希釈剤は、生理食塩水、乳酸リンゲル液、又は他の生理学的に適合性の溶液である。様々な実施形態では、本医薬組成物溶液は、２～２０％、好ましくは５％のヒト血清アルブミンを含む。
【0136】
いくつかの実施形態では、全身投与、特に、静脈内投与による医薬組成物の投与に適合した本医薬組成物の単位剤形が提供される。
【0137】
いくつかの実施形態では、単位剤形は、１０４から１０１１個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０４から１０１０個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０４から１０９個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０５から１０１０個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０５から１０９個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、１０５から１０８個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞、又は１０５から１０７個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞を含む。
【0138】
典型的な実施形態では、単位剤形の本医薬組成物は液体形態である。
【0139】
６．６．複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の作製方法
別の態様では、本開示は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法を提供する。
別の態様では、本開示は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を作製する方法を提供する。
【0140】
いくつかの実施形態では、本方法は、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールする工程と、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってプールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変する工程と、を含む。他の実施形態では、本方法は、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程と、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に改変する工程と、次いで、（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それにより、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得る工程と、を含む。当分野で公知の様々な方法を使用して、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを初代ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入することができる。
【0141】
いくつかの実施形態では、本方法は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下で、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞又は遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及びＩＬ－２、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズ及びＩＬ－２の存在下で、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞又は遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、フィーダー細胞の混合物の存在下で、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞又は遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体のナノ調整物の存在下で、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞又は遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をインキュベートする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で行われる。
【0142】
いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は、ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入する前に行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから得られた初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールする工程の後であるが、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってプールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変する工程の前に行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は、（ｉ）少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーから初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程の後であるが、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に改変する工程の前に行われる。
【0143】
いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は工程（ｉｉ）の後に行われる。換言すれば、いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによってプールされたＣＤ４＋Ｔ細胞を改変する工程の後で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は、（ｉｉ）ＩＬ－１０をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することによって各ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞を別々に改変する工程の後であるが、（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それによって遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を得る工程の前に行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は、（ｉｉｉ）遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞をプールし、それによって複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得る工程の後に行われる。
【0144】
いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は２回以上行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーション工程は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の遺伝子改変の前と後の両方で行われる。
【0145】
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを使用して初代ＣＤ４＋Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号１と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有するＩＬ－１０をコードするセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２の配列を有する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１０をコードするポリヌクレオチドセグメントは、配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、首尾よく形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞の選択を可能にするマーカーをコードするセグメントをさらに含む。いくつかの実施形態では、コードされた選択マーカーはΔＮＧＦＲである。ある特定の実施形態では、コードされた選択マーカーは、配列番号３の配列を有する。特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされた選択マーカーは、切断型のヒトＥＧＦＲポリペプチドである。
【0146】
いくつかの実施形態では、本方法は、選択マーカーを発現する遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、それにより遺伝子改変ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の濃縮された集団を生成する工程をさらに含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％が選択マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％が選択マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９６、９７、９８、又は９９％が選択マーカーを発現する。
【0148】
いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９０％がＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９５％がＩＬ－１０を発現する。いくつかの実施形態では、濃縮された集団中の遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも９６、９７、９８、又は９９％がＩＬ－１０を発現する。
【0149】
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞の濃縮された集団をインキュベートする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、又は抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、さらにＩＬ－２の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、フィーダー細胞の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体のナノ調整物の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ製のＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（商標）の存在下で行われる。
【0150】
いくつかの実施形態では、本方法は、遺伝子改変ＣＤ４＋Ｔ細胞を凍結する工程をさらに含む。
【0151】
いくつかの実施形態では、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＬＡハプロタイプに基づいて選択されたドナーに由来する。いくつかの実施形態では、本方法は、それらの遺伝情報を分析することによってＴ細胞ドナーを選択する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、候補となるＴ細胞ドナーの遺伝情報又はＨＬＡハプロタイプを分析する工程を含む。
【0152】
いくつかの実施形態では、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞又はその改変物で治療される宿主と少なくとも部分的にＨＬＡ一致を有するドナーに由来する。いくつかの実施形態では、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、幹細胞（ＨＳＣ）、組織又は臓器のドナーと少なくとも部分的にＨＬＡ一致を有するドナーに由来する。いくつかの実施形態では、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、宿主と生物学的につながりのない第三者のドナーから得られる。いくつかの実施形態では、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、幹細胞、組織又は臓器のドナーと生物学的につながりのない第三者のドナーから得られる。
【0153】
いくつかの実施形態では、工程（ｉ）において、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、３、４、５、６、７、８、９、又は１０人の異なるＴ細胞ドナーから得られる。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、又は９／１０の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、互いに少なくとも、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において互いに２／２の一致を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において互いに少なくとも３／４又は４／４一致する。いくつかの実施形態では、少なくとも３人のＴ細胞ドナーの各々は、Ａ＊０２対立遺伝子を有する。
【0154】
いくつかの実施形態では、工程（ｉ）において、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、１つ又はそれ以上の凍結ストックから得られる。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）において、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は、少なくとも３人の異なるＴ細胞ドナーの非凍結末梢血単核細胞から得られる。いくつかの実施形態では、本方法は、末梢血単核細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉ）において、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞は液体懸濁液から得られる。いくつかの実施形態では、液体懸濁液は、以前に凍結されたストックから得られる。
【0155】
いくつかの実施形態では、ドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を患者の抗原提示細胞（単球、樹状細胞、又はＤＣ－１０細胞）と接触させて、同種特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を生成し、これは後に高レベルのＩＬ－１０（同種ＣＤ４ＩＬ－１０細胞）を産生するように改変される。
【0156】
いくつかの実施形態では、本方法は、宿主由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞をアネルギー化する工程を含まない。いくつかの実施形態では、本方法は、組換えＩＬ－１０タンパク質の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞をアネルギー化する工程を含まず、組換えＩＬ－１０タンパク質はＣＤ４＋Ｔ細胞から発現されない。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主由来のＤＣ１０細胞の存在下でＣＤ４＋Ｔ細胞をアネルギー化する工程を含まない。
【0157】
６．７．複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の使用方法
さらに別の態様では、本開示は、患者を治療する方法であって、免疫寛容化を必要とする患者に、本明細書で提供される複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、患者を治療する方法であって、免疫寛容化を必要とする患者に、本明細書で提供される複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【0158】
いくつかの実施形態では、本方法は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の凍結懸濁液を解凍する先行する工程をさらに含む。
【0159】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、患者における病原性Ｔ細胞応答の重症度を予防又は軽減する。
【0160】
いくつかの実施形態では、治療方法は、投与後の患者の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞をモニタリングする工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、患者から得られた生物学的試料において選択マーカーを検出し、それにより、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞の有無を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、患者の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在下における変化を追跡するために複数の時点で検出される。いくつかの実施形態では、生物学的試料は患者由来の生検試料又は血液試料である。
【0161】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、治療有効量で投与される。その量は、体重及び他の臨床的要因に基づいて決定することができる。いくつかの実施形態では、１０３細胞／ｋｇから１０９細胞／ｋｇが投与される。いくつかの実施形態では、１０３細胞／ｋｇから１０８細胞／ｋｇが投与される。いくつかの実施形態では、１０３細胞／ｋｇから１０７細胞／ｋｇが投与される。いくつかの実施形態では、１０３細胞／ｋｇから１０６細胞／ｋｇが投与される。いくつかの実施形態では、１０３細胞／ｋｇから１０５細胞／ｋｇが投与される。いくつかの実施形態では、１０３細胞／ｋｇから１０４細胞／ｋｇが投与される。
【0162】
様々な実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、治療有効スケジュールで投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞を１回投与する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、毎日、３日ごと、７日ごと、１４日ごと、２１日ごと、又は毎月投与される。
【0163】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞は、異なる投与経路に従って、例えば、全身、皮下又は腹腔内に投与することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、２～２０％、好ましくは５％のヒト血清アルブミンを含有し得る生理食塩水又は生理学的溶液内に投与される。
【0164】
６．７．１．ＧｖＨＤを軽減又は予防する方法
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含む医薬組成物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＨＳＣＴ）の前に、ＨＳＣＴと同時に、又はＨＳＣＴの後に患者を治療するために使用される。
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含む医薬組成物は、造血幹細胞（ＨＳＣ）移植（ＨＳＣＴ）の前に、ＨＳＣＴと同時に、又はＨＳＣＴの後に患者を治療するために使用される。
【0165】
様々な実施形態では、ＨＳＣＴは、一致した血縁ＨＳＣＴである。様々な実施形態では、ＨＳＣＴは、ハプロタイプ一致ＨＳＣＴ、ミスマッチ血縁ＨＳＣＴ又はミスマッチ非血縁ＨＳＣＴである。
【0166】
いくつかの実施形態では、患者は、同種ＨＳＣＴによる治療を必要とする血液悪性腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、血液悪性腫瘍は異常な骨髄細胞によって媒介される。
【0167】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ドナーは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞及びＨＳＣで治療される患者の遺伝情報、及び／又はＨＳＣドナーの遺伝情報に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ドナーは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞及びＨＳＣで治療される患者のＨＬＡハプロタイプ、並びに／又はＨＳＣドナーのＨＬＡハプロタイプに基づいて選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与する前に、Ｔ細胞ドナーの遺伝情報又はＨＬＡハプロタイプを分析する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、宿主の遺伝情報又はＨＬＡハプロタイプを分析する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＨＳＣドナーの遺伝情報又はＨＬＡハプロタイプを分析する工程をさらに含む。
【0168】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ドナー、宿主及びＨＳＣドナーは生物学的につながりがない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ドナー、宿主及びＨＳＣドナーは、異なるＨＬＡハプロタイプを有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ドナー、宿主及びＨＳＣドナーは、ＨＬＡハプロタイプにおいて少なくとも部分的に不一致を有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞ドナーは、それらが閾値を超えるＨＬＡ一致を有するＨＬＡハプロタイプを有する場合に選択される。
【0169】
いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０未満、６／１０未満、７／１０未満、８／１０未満、９／１０未満又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８未満、５／８未満、６／８未満、７／８未満又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、ＨＳＣドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、３／４未満又は４／４未満の一致を有する。
【0170】
いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ不一致又は部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８未満、５／８未満、６／８未満、７／８未満又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、患者に対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、２／４未満、３／４未満又は４／４未満の一致を有する。
【0171】
いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーとＨＬＡ不一致又は部分的にＨＬＡ不一致である。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において、５／１０、６／１０、７／１０、８／１０、９／１０又は１０／１０未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、及びＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子座において、４／８、５／８、６／８、７／８、又は８／８未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、又はＨＬＡ－Ｃ遺伝子座において２／２未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、１又はそれ以上のＴ細胞ドナーは、ＨＳＣドナーに対して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子座において３／４又は４／４未満の一致を有する。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、移植された造血幹細胞によるＧｖＨＤの重症度を予防又は軽減する。
【0172】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、移植された造血細胞による病理学的Ｔ細胞応答の重症度を予防又は軽減する。特定の実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＧｖＨＤを予防又は低減する。
【0173】
６．７．２．癌の治療方法
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、癌の治療のために使用される。好ましい実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、抗腫瘍効果（移植片対腫瘍、ＧｖＴ）を直接媒介し、特定の実施形態では抗白血病効果（移植片対白血病、ＧｖＬ）を直接媒介する。
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、癌の治療のために使用される。好ましい実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、抗腫瘍効果（移植片対腫瘍、ＧｖＴ）を直接媒介し、特定の実施形態では抗白血病効果（移植片対白血病、ＧｖＬ）を直接媒介する。
【0174】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、癌の治療のために同種単核細胞又はＰＢＭＣと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＰＢＭＣの投与の前、又はその後に投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞及び同種単核細胞又はＰＢＭＣは、同時に投与される。
【0175】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞及び同種単核細胞又はＰＢＭＣは、１：３、１：２、１：１、２：１又は３：１の比で投与される。
【0176】
いくつかの実施形態では、新生物細胞はＣＤ１３を発現する。いくつかの実施形態では、新生物細胞はＨＬＡ－クラスＩを発現する。いくつかの実施形態では、新生物細胞はＣＤ５４を発現する。いくつかの実施形態では、新生物細胞は、ＣＤ１３、ＨＬＡ－クラスＩ及びＣＤ５４を発現する。いくつかの実施形態では、新生物細胞はＣＤ１１２を発現する。いくつかの実施形態では、新生物細胞はＣＤ５８を発現する。いくつかの実施形態では、新生物細胞はＣＤ１５５を発現する。いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＣＤ１１２、ＣＤ５８又はＣＤ１５５を発現する。様々な実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍である。
【0177】
いくつかの実施形態では、患者は、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人の脳／ＣＮＳ腫瘍、小児の脳／ＣＮＳ腫瘍、乳癌、男性の乳癌、原発不明の癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸／直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性栄養膜疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌及び低咽頭癌、白血病、急性リンパ球性（ＡＬＬ）、急性骨髄（骨髄性肉腫及び皮膚白血病を含むＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄（ＣＭＬ）白血病、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、小児の白血病、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、皮膚のリンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、小児の非ホジキンリンパ腫、口腔及び口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫－成人軟部組織癌、皮膚癌、皮膚癌－基底細胞及び扁平細胞、皮膚癌－黒色腫、皮膚癌－メルケル細胞、小腸癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍からなる群から選択される癌を有する。
【0178】
いくつかの実施形態では、癌は骨髄性腫瘍である。特定の実施形態では、癌はＡＭＬ又はＣＭＬである。いくつかの実施形態では、癌は骨髄性腫瘍である。
【0179】
いくつかの実施形態では、本方法は、血液、骨髄及びリンパ節に影響を及ぼす血液癌を治療するために使用される。様々な実施形態では、血液癌は、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫）、リンパ球性白血病、骨髄腫である。様々な実施形態では、血液癌は、急性又は慢性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ、ＣＭＬ）、又は骨髄異形成症候群である。
【0180】
いくつかの実施形態では、癌は、治療的介入に対して難治性又は抵抗性である。
【0181】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、治療的介入と組み合わせて使用される。この組み合わせは、同時に行われてもよいし、異なる時間に行われてもよい。好ましくは、治療的介入は、化学療法、放射線療法、同種ＨＳＣＴ、免疫抑制、輸血、骨髄移植、成長因子、生物学的製剤からなる群から選択される。
【0182】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、腫瘍浸潤骨髄系細胞（例えば、単球、マクロファージ、好中球）の細胞死を誘導する。
【0183】
６．７．３．他の障害を治療する方法
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、自己免疫疾患を治療するために投与される。
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、自己免疫疾患を治療するために投与される。
【0184】
いくつかの実施形態では、自己免疫性疾患は、１型糖尿病、自己免疫性ブドウ膜炎、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、全身性狼瘡、炎症性腸疾患、アジソン病、グレーブス病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、水疱性疾患、強皮症、及びセリアック病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自己免疫性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、１型糖尿病、狼瘡、乾癬、乾癬性関節炎、又は関節リウマチである。いくつかの実施形態では、患者は、アレルギー性又はアトピー性疾患を有する。アレルギー性又はアトピー性疾患は、喘息、アトピー性皮膚炎及び鼻炎からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、患者は食物アレルギーを有する。
【0185】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＨＳＣＴ以外の細胞移植及び臓器移植に対する病原性Ｔ細胞応答の重症度を予防又は軽減するために投与される。いくつかの実施形態では、本方法は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０Ｔ細胞又は医薬組成物の投与の前又は後のいずれかにおいて、患者への臓器移植の工程を含む。特定の実施形態では、臓器は、腎臓、心臓、又は膵島細胞である。好ましい実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物は、臓器移植の宿主拒絶の重症度を予防又は軽減する。
【0186】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、遺伝子療法、例えば、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）の投与に伴う免疫応答を予防又は低減するために投与される。これらの実施形態では、方法は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又は医薬組成物の投与前又はその後に、組換えＡＡＶを患者に投与する工程をさらに含む。
【0187】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ｉＰＳ由来の組織又は細胞の移植に伴う免疫応答を防止又は低下させるために投与される。ｉＰＳ由来の組織及び細胞としては、心筋細胞、肝細胞、上皮細胞、軟骨、骨及び筋肉細胞、ニューロンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0188】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、炎症を治療するために投与される。炎症は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、２型糖尿病、神経変性疾患、又は炎症性腸疾患に関連し得るが、これらに限定されない。
【0189】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ＮＬＰＲ３インフラマソームの活性亢進を伴う疾患又は障害を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１β産生の増加を伴う疾患又は障害を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１８産生の増加を伴う疾患又は障害を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞による成熟カスパーゼ１産生の増加を伴う疾患又は障害を治療するために投与される。
【0190】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１β産生を減少させるために投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞によるＩＬ－１８産生を減少させるために投与される。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、活性化単球、マクロファージ又は樹状細胞による成熟カスパーゼ１産生を減少させるために投与される。
【0191】
いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、ウイルス感染に対する患者の過剰活性免疫応答を低下させるために投与される。いくつかの実施形態では、ウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、細菌感染に対する過剰に活性な免疫応答、例えば、毒性ショック及びサイトカインストームを低下させるために投与される。
【実施例】
【0192】
６．８．実施例
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
【0193】
６．８．１．実施例１：複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の作製ベクター産生
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１４６５４２号に記載されているように、ヒトＩＬ－１０及びＮＧＦＲの切断型形態（ΔＮＧＦＲ）（図１及び図２）の両方のコード配列を含有するレンチウイルスベクターによる形質導入によって、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生した。ベクターの配列は、配列番号５として示す。手短に言えば、レンチウイルスベクターは、ｐＨ１５Ｃ（ＡＴＣＣ６８１９２）の５４９ｂｐ断片由来のヒトＩＬ－１０のコード配列をプラスミド＃１０７４．１０７１．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｍｈＣＭＶ．ｄＮＧＦＲ．ＳＶ４０ＰＡにライゲーションすることによって生成した。双方向プロモーター（ヒトＰＧＫプロモーター＋反対方向のＣＭＶプロモーターの最小コア要素）の存在は、２つの導入遺伝子の同時発現を可能にする。プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン又はカナマイシン）のコード配列をさらに含む。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／１４６５４２号に記載されているように、ヒトＩＬ－１０及びＮＧＦＲの切断型形態（ΔＮＧＦＲ）（図１及び図２）の両方のコード配列を含有するレンチウイルスベクターによる形質導入によって、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を産生した。ベクターの配列は、配列番号５として示す。手短に言えば、レンチウイルスベクターは、ｐＨ１５Ｃ（ＡＴＣＣ６８１９２）の５４９ｂｐ断片由来のヒトＩＬ－１０のコード配列をプラスミド＃１０７４．１０７１．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｍｈＣＭＶ．ｄＮＧＦＲ．ＳＶ４０ＰＡにライゲーションすることによって生成した。双方向プロモーター（ヒトＰＧＫプロモーター＋反対方向のＣＭＶプロモーターの最小コア要素）の存在は、２つの導入遺伝子の同時発現を可能にする。プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン又はカナマイシン）のコード配列をさらに含む。
【0194】
レンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞へのＣａ３ＰＯ４一過性４プラスミド同時トランスフェクションによって作製し、超遠心分離によって濃縮し、１μＭの酪酸ナトリウムをベクター回収のために培養物に添加した。限界希釈によって２９３Ｔ細胞上の力価を推定し、ベクター粒子をＨＩＶ－１ Ｇａｇ ｐ２４抗原免疫捕捉（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によって測定した。ベクター感染価を力価と粒子の比として計算した。濃縮ベクターの場合、力価は５×１０８から６×１０９形質導入単位／ｍｌの範囲であり、感染価は５×１０４から５×１０５形質導入単位／ｎｇの範囲であった。
【0195】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の産生
図３は、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の産生プロセスの概略図である。健常ドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂ、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ及びｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）で４８時間活性化した後、２０の感染多重度（ＭＯＩ）で、ヒトＩＬ－１０及び切断型ヒトＮＧＦ受容体（ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ）をコードする双方向レンチウイルスベクターによる形質導入を行った。
図３は、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の産生プロセスの概略図である。健常ドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を精製した。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂ、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ及びｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）で４８時間活性化した後、２０の感染多重度（ＭＯＩ）で、ヒトＩＬ－１０及び切断型ヒトＮＧＦ受容体（ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ）をコードする双方向レンチウイルスベクターによる形質導入を行った。
【0196】
１１日後、形質導入された細胞を、ΔＮＧＦＲの発現についてＦＡＣＳによって分析し、ベクターコピー数（ＶＣＮ）をデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量した。
【0197】
１０人の異なるドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の平均形質導入効率は４５±１７％であり、ＶＣＮは２．７±０．６％であった。図４Ａは、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ（ヒトＩＬ－１０及び切断型ヒトＮＧＦ受容体をコードする双方向レンチウイルスベクター）で形質導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞（平均±ＳＤ、ｎ＝１０、左バー）及びベクターコピー数（ＶＣＮ、平均±ＳＤ、ｎ＝１０、右バー）のパーセンテージを示す。ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞の頻度及びベクターコピー数を、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞におけるデジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって定量した。
【0198】
ΔＮＧＦＲ＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２７１ｍＡｂコーティングマイクロビーズを使用して精製し、９５％超の純粋なＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団を得た。精製後、細胞をＣＤ４及びΔＮＧＦＲのマーカーで染色し、ＦＡＣＳによって分析した。データは、精製工程から得られた純度が９８％を超えることを示した。図４Ｂは、試験した１０人のドナーのうちの２人の代表的なドナー（ドナーＢ及びドナーＣ）から得られたＦＡＣＳデータを示す。精製ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１４日間隔で３回再刺激し、第２の再刺激（ＴＦ２）及び又は第３の再刺激（ＴＦ３）機能の後にそれらのインビトロ及びインビボ機能を試験した。
【0199】
静止ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、構成的にＩＬ－１０を産生した。活性化されると、産生されたＩＬ－１０のレベルが強く増強された。
【0200】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、天然由来のＴｒ１細胞のサイトカイン産生プロファイルに匹敵するサイトカイン産生プロファイルを有する。
２回目（ＴＦ２）及び３回目（ＴＦ３）の再刺激後に、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルを分析し、結果を図５に示す。
具体的には、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２００μｌ中２×１０５細胞）を以前に報告されているように再刺激した（Andolfi et al.Mol Ther.2012;20(9):1778-1790 and Locafaro et al.Mol Ther.2017;25(10):2254-2269）。１４日目に、２回目（ＴＦ２）及び３回目（ＴＦ３）の再刺激の後、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を刺激せずに放置し（オレンジ色のバー）、又は固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで４８時間刺激した（灰色のバー）。培養上清を回収し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。すべての試料を３連で試験した。
平均±ＳＤ、試験したドナー（ｎ＝８）を示す。図５に示す結果は、固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激されたＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＴｒ１細胞サイトカイン産生プロファイルを示すことを示す。
２回目（ＴＦ２）及び３回目（ＴＦ３）の再刺激後に、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルを分析し、結果を図５に示す。
具体的には、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２００μｌ中２×１０５細胞）を以前に報告されているように再刺激した（Andolfi et al.Mol Ther.2012;20(9):1778-1790 and Locafaro et al.Mol Ther.2017;25(10):2254-2269）。１４日目に、２回目（ＴＦ２）及び３回目（ＴＦ３）の再刺激の後、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を刺激せずに放置し（オレンジ色のバー）、又は固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで４８時間刺激した（灰色のバー）。培養上清を回収し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。すべての試料を３連で試験した。
平均±ＳＤ、試験したドナー（ｎ＝８）を示す。図５に示す結果は、固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激されたＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＴｒ１細胞サイトカイン産生プロファイルを示すことを示す。
【0201】
異なるドナー間でかなりの変動が観察されたが、２回目（ＴＦ２）又は３回目（ＴＦ３）の再刺激後の全体的なサイトカイン産生プロファイルは同等であり、Ｔｒ１細胞のそれを反映していた（Roncarolo et al.,Immunity,2018）。Ｔｒ１細胞と同様に、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２を産生したが、ＩＬ－４は低レベルであり、ＩＬ－２は検出不能なレベルであった。
【0202】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は高レベルのグランザイムＢを発現し、骨髄性白血病細胞を選択的に死滅させる
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、２回目の再刺激（ＴＦ２）の後にグランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現についてさらに分析した。図６Ａのデータは、ほとんどのＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＧｚＢを発現したことを示す。７名の異なるドナーに由来する全ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の９５％超が高レベルのグランザイムＢを発現した。
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、２回目の再刺激（ＴＦ２）の後にグランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現についてさらに分析した。図６Ａのデータは、ほとんどのＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＧｚＢを発現したことを示す。７名の異なるドナーに由来する全ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の９５％超が高レベルのグランザイムＢを発現した。
【0203】
２回目（ＴＦ２）の再刺激から得られたＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）及び赤血球白血病細胞株（Ｋ５６２）に対するそれらの細胞傷害効果についてさらに分析した。ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５個／ウェル）をＫ５６２細胞及びＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５個／ウェル）と１：１の比で３日間共培養した。残存白血病細胞株（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３３＋）を各標的細胞についてＦＡＣＳによって計数した。
【0204】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、図６Ｂに示すように骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）を選択的に死滅させた。死滅したＡＬＬ－ＣＭ細胞の％は６２％～１００％の間で変動したが、赤血球白血病細胞株Ｋ５６２（非特異的細胞傷害活性に対して非常に感受性である）の死滅は０～２７％の間で変動した（４人の異なるドナーで試験）。まとめると、これらのデータは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞がグランザイムＢを発現し、骨髄性白血病細胞を効率的に死滅させることを裏付けている。予想されたように、個々のドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞の殺滅能力における多少のばらつきが観察された。
【0205】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖応答を抑制する
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に対するそれらの効果についても分析した。具体的には、同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（１０５細胞／ウェル）で標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の非存在下又は存在下（１０５細胞／ウェル）、１：１のレスポンダー：サプレッサー比で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。４日間の培養後、増殖応答細胞の割合を、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞又はＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞でゲーティングしてから、フローサイトメトリーを用いてｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０希釈によって求めた。図７Ａ及び図７Ｂは、６人の異なるプールされていないドナー（図７ＡのドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦ並びに図７ＢのドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬ）由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＣＤ４＋Ｔ細胞に対する効果を増殖及び抑制の割合で示す。図８Ａ及び図８Ｂは、６人の異なるプールされていないドナー（図８ＡのドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦ並びに図８ＢのドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬ）由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する効果を示す。
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に対するそれらの効果についても分析した。具体的には、同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（１０５細胞／ウェル）で標識し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の非存在下又は存在下（１０５細胞／ウェル）、１：１のレスポンダー：サプレッサー比で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。４日間の培養後、増殖応答細胞の割合を、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞又はＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞でゲーティングしてから、フローサイトメトリーを用いてｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０希釈によって求めた。図７Ａ及び図７Ｂは、６人の異なるプールされていないドナー（図７ＡのドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦ並びに図７ＢのドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬ）由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＣＤ４＋Ｔ細胞に対する効果を増殖及び抑制の割合で示す。図８Ａ及び図８Ｂは、６人の異なるプールされていないドナー（図８ＡのドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦ並びに図８ＢのドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬ）由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞に対する効果を示す。
【0206】
これらの結果は、プールされておらず、別個に試験された６人の異なるドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖応答を下方制御したことを示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抑制効果は５１％～９６％の間で変動したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抑制効果は６２％～７３％の間で変動した。
【0207】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の作製及び特性評価
複数のドナー由来のＣＤ４＋細胞を使用して、上記及び図３のようにＣＤ４ＩＬ－１０細胞を生成した。各ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、２回目（ＴＦ２）及び３回目（ＴＦ３）の再刺激によって刺激した。３回目の刺激の後、３名のドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１：１：１の比でプールし、固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで４８時間刺激した。
複数のドナー由来のＣＤ４＋細胞を使用して、上記及び図３のようにＣＤ４ＩＬ－１０細胞を生成した。各ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、２回目（ＴＦ２）及び３回目（ＴＦ３）の再刺激によって刺激した。３回目の刺激の後、３名のドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１：１：１の比でプールし、固定化抗ＣＤ３及び可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで４８時間刺激した。
【0208】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、個々のドナー及びＴｒ１細胞のＣＤ４Ｉｌ－１０細胞のサイトカイン産生プロファイルに匹敵するサイトカイン産生プロファイルを有する。
培養上清を回収し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。図９に提供される結果は、３名の異なる同種ドナー由来のプールされた（１：１：１でプールされた）複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生（赤色ドット）が、個々のドナー（ｎ＝８）由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生（灰色バー）と同等であったことを示す。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２並びに低レベルのＩＬ－４及び検出不能レベルのＩＬ－２を産生した（図示せず）。これらのデータは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞をプールすることが実行可能であり、これらの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、単一ドナー由来ＣＤ４ＩＬ－１０細胞及びＴｒ１細胞のサイトカイン産生シグネチャーを維持することを示す。重要なことに、プールされた同種細胞集団は９５％超の生存細胞を含有しており、それらが互いに死滅させなかったことを示した。
培養上清を回収し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。図９に提供される結果は、３名の異なる同種ドナー由来のプールされた（１：１：１でプールされた）複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生（赤色ドット）が、個々のドナー（ｎ＝８）由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞のサイトカイン産生（灰色バー）と同等であったことを示す。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、高レベルのＩＬ－１０、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２並びに低レベルのＩＬ－４及び検出不能レベルのＩＬ－２を産生した（図示せず）。これらのデータは、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞をプールすることが実行可能であり、これらの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、単一ドナー由来ＣＤ４ＩＬ－１０細胞及びＴｒ１細胞のサイトカイン産生シグネチャーを維持することを示す。重要なことに、プールされた同種細胞集団は９５％超の生存細胞を含有しており、それらが互いに死滅させなかったことを示した。
【0209】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は高レベルのグランザイムＢを発現し、骨髄性白血病細胞株を死滅させる。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、グランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現について３回目の再刺激（ＴＦ３）の後にさらに分析した。図１０Ａのデータは、ほとんどの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＧｚＢを発現することを示す。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の９５％超がグランザイムＢを発現し、単一ドナー由来ＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＧｚＢ発現に匹敵した。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、グランザイムＢ（ＧｚＢ）の発現について３回目の再刺激（ＴＦ３）の後にさらに分析した。図１０Ａのデータは、ほとんどの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がＧｚＢを発現することを示す。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の９５％超がグランザイムＢを発現し、単一ドナー由来ＣＤ４ＩＬ－１０細胞のＧｚＢ発現に匹敵した。
【0210】
３回目（ＴＦ３）の再刺激から得られたＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ細胞株）又はＫ５６２に対するそれらの細胞傷害効果についてさらに分析した。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（１０５個／ウェル）をＫ５６２細胞及びＡＬＬ－ＣＭ細胞（１０５個／ウェル）と１：１の比で３日間共培養した。残存白血病細胞株（ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３３＋）を各標的細胞についてＦＡＣＳによって計数した。図１０Ｂに示す結果は、非特異的細胞傷害性に対して非常に感受性であるＫ５６２細胞に対するある程度の細胞傷害性を示す。それにもかかわらず、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）に対するあるレベルの選択性が得られ、これは、単一ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞の選択性に匹敵する。
【0211】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の増殖応答を抑制する。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に対するそれらの効果についても分析した。具体的には、同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（１０５細胞／ウェル）で標識し、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の非存在下又は存在下（１０５細胞／ウェル）、１：１のレスポンダー：サプレッサー比で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。４日間の培養後、増殖応答細胞の割合を、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞及びＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞でゲーティングしてから、フローサイトメトリーを用いてｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０希釈によって求めた。図１１Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦ由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。図１１Ｂは、試験前に凍結され、保存され、解凍されたドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬ由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を、同種ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞に対するそれらの効果についても分析した。具体的には、同種ＰＢＭＣ細胞をｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（１０５細胞／ウェル）で標識し、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の非存在下又は存在下（１０５細胞／ウェル）、１：１のレスポンダー：サプレッサー比で同種成熟樹状（ＤＣ）細胞（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂで刺激した。４日間の培養後、増殖応答細胞の割合を、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞及びＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞でゲーティングしてから、フローサイトメトリーを用いてｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０希釈によって求めた。図１１Ａは、ドナーＣ、ドナーＥ及びドナーＦ由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。図１１Ｂは、試験前に凍結され、保存され、解凍されたドナーＨ、ドナーＩ及びドナーＬ由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を含有する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の結果を示す。
【0212】
図１１Ａは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人の異なるドナー由来）が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答をそれぞれ９６％及び７４％抑制することを示す。試験前に細胞を凍結し、保存し、解凍した後に試験した第２の異なるバッチの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を用いて、同等の結果を得た（図１１Ｂ）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の抑制は、それぞれ６８％及び７５％であった。これらのデータは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を凍結し、機能を失うことなく保存することができることを示している。
【0213】
まとめると、複数ドナーＣＤ４ＩＬ１０細胞を用いて得られたデータは、これらの細胞調製物を問題なくプールすることができることを示している。それらは９５％超の生存細胞を含有し、単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の関連する機能（サイトカイン産生、細胞傷害能、及び同種Ｔ細胞応答の抑制）をすべて維持する。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞のより大きなプールの使用は、異なる個々のドナーに由来するＣＤ４ＩＬ－１０細胞ロット間で観察される当然のばらつきを減少させるはずであり、ヒト治療のための大量の画一的なＣＤ４ＩＬ－１０細胞を提供するはずである。
【0214】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞産物は、より均質な産物という点で有意な利点を有しており、これにより十分に定義された、ロット間のばらつきが少ない、効力及び放出の基準を決定することが可能になるであろう。さらに、それは連続的な大規模セル製造プロセスの開発を可能にする。
【0215】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の他の産生方法
レンチウイルス形質導入の前に、最低３～５人の異なるドナー由来のバフィーコートをプールする。ＣＤ４＋細胞は、抗ＣＤ４抗体を使用した正の選択によってバフィーコートから単離される。プールされたＣＤ４＋細胞の純度をＦＡＣＳによって確認する。あるいは、凍結ヒトＣＤ４＋細胞は、最低３～５人の正常な健常ドナーから得られる。凍結したヒトＣＤ４＋細胞を使用前に解凍する。バフィーコート又は凍結ストック由来のＣＤ４＋細胞を、ＩＬ－２の存在下でＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の組み合わせ又はＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズによって２４～４８時間活性化する。場合によって、バフィーコート又は凍結ストック由来のＣＤ４＋細胞を可溶性抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ及びｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）で４８時間活性化し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の産生のために上記のヒトＩＬ－１０をコードする双方向レンチウイルスベクターで形質導入する。
レンチウイルス形質導入の前に、最低３～５人の異なるドナー由来のバフィーコートをプールする。ＣＤ４＋細胞は、抗ＣＤ４抗体を使用した正の選択によってバフィーコートから単離される。プールされたＣＤ４＋細胞の純度をＦＡＣＳによって確認する。あるいは、凍結ヒトＣＤ４＋細胞は、最低３～５人の正常な健常ドナーから得られる。凍結したヒトＣＤ４＋細胞を使用前に解凍する。バフィーコート又は凍結ストック由来のＣＤ４＋細胞を、ＩＬ－２の存在下でＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の組み合わせ又はＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズによって２４～４８時間活性化する。場合によって、バフィーコート又は凍結ストック由来のＣＤ４＋細胞を可溶性抗ＣＤ３、可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂ及びｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）で４８時間活性化し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞の産生のために上記のヒトＩＬ－１０をコードする双方向レンチウイルスベクターで形質導入する。
【0216】
場合によっては、Ｔ細胞ドナー（又はそのドナーから単離されたＣＤ４＋細胞）のＨＬＡハプロタイプを最初に決定し、所望のＨＬＡハプロタイプを有するＣＤ４＋細胞を選択的にプールして使用する。
【0217】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、上記の活性化ＣＤ４＋細胞を、上記のヒトＩＬ－１０及びΔＮＧＦＲコード配列を含有するレンチウイルスベクターで形質導入することによって作製される。
【0218】
形質導入の５～９日後である７～１１日目に、細胞を回収し、形質導入に成功したＴ細胞を抗ＮＧＦＲ抗体を利用して精製した。このプロセスは、通常、９５％の純粋な複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞集団をもたらす。
【0219】
精製された複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を計数し、ＩＬ－２の存在下、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の混合物、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズによって、任意選択でフィーダー細胞の存在下で、さらに８～１０日間再刺激する。場合によっては、精製複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞をフィーダー細胞の存在下で再刺激する。
【0220】
１４～１８日間の全培養期間の後、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を回収し、計数し、自発的にＩＬ－１０を産生するそれらの能力、又はＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体若しくはＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズによる活性化後にＩＬ－１０を産生するそれらの能力について試験する。さらに、ＧｒｚＢ及びパーフォリンのレベルを測定する。併せて、ヒトＴ細胞（ＰＢＭＣ）並びに精製ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を抑制するそれらの能力も試験する。
【0221】
加えて、ＩＬ－２２の産生は、構成的に、かつ、他のサイトカイン、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ－１０、ＩＬ－４及びＩＬ－５の産生について先に記載したように、ＣＤ３抗体及びＣＤ２８抗体の組み合わせを使用して、２００マイクロリットルの体積の２００，０００個のＣＤ４ＩＬ－１０細胞を活性化した後に測定される。ＩＬ－２２の産生レベルは、国際公開第２０１６／１４６５４２号に他のサイトカインについて記載されているように、ＩＬ－２２特異的ＥＬＩＳＡで測定される。保存する前に、プールされたＣＤ４ＩＬ－１０細胞を凍結する。
【0222】
６．８．２．実施例２：複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を用いたＧｖＨＤの治療又は予防
インビボでの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を、図１２に示すように、ヒトＰＢＭＣによって誘導されるＧｖＨＤに対するそれらの効果について、ヒト化ｘｅｎｏ ＧｖＨＤ疾患モデルであるＮＳＧマウスモデルで試験した。ＮＳＧマウスに亜致死量の放射線を照射し、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）、複数ドナー（３名のドナー）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６細胞／マウス）、又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３名のドナー）（５×１０６細胞／マウス）と組み合わせたヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）を静脈内注射した。ＧｖＨＤを、以前に報告されているように（Bondanza et al.Blood 2006）、体重減少（２０％超の体重減少）、皮膚病変、毛並み、活動性及び姿勢に基づいて評価した。
インビボでの複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を、図１２に示すように、ヒトＰＢＭＣによって誘導されるＧｖＨＤに対するそれらの効果について、ヒト化ｘｅｎｏ ＧｖＨＤ疾患モデルであるＮＳＧマウスモデルで試験した。ＮＳＧマウスに亜致死量の放射線を照射し、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）、複数ドナー（３名のドナー）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６細胞／マウス）、又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３名のドナー）（５×１０６細胞／マウス）と組み合わせたヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）を静脈内注射した。ＧｖＨＤを、以前に報告されているように（Bondanza et al.Blood 2006）、体重減少（２０％超の体重減少）、皮膚病変、毛並み、活動性及び姿勢に基づいて評価した。
【0223】
図１３は、注射後の各日におけるＧｖＨＤを示すＮＳＧマウスの％を示す。照射されたＮＳＧマウスへの５×１０６個のヒトＰＢＭＣの投与は、予想外にも、異常に興奮性のＧｖＨＤをもたらした。すべてのマウスは１０日目に死亡し、これは非常に致死的なＧｖＨＤを反映している。５×１０６個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の同時投与は、この劇症型ＧｖＨＤを遅延させたが、マウスは、屠殺のための予め指定されたヒトの２０％体重減少基準に達したので、１４日目に屠殺した（図１３）。とは言え、これらの結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０が非常に重度のＧｖＨＤを遅延させ得ることを示している。重要なことに、ＰＢＭＣと同じ用量で単独で投与された複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６細胞）は、ＧｖＨＤのいかなる徴候も誘導しなかった。
【0224】
また、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）、複数ドナー（３名のドナー）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６細胞／マウス）又はヒトＰＢＭＣ（５×１０６細胞／マウス）を複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３名のドナー）（５×１０６細胞／マウス）と組み合わせて注射したＮＳＧマウスの脾臓（図１４、左パネル）及び骨髄（図１４、右パネル）におけるヒトＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在を注射の１４日後に調べた。図１４に示す結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が脾臓及び骨髄に遊走したことを示す。細胞の注入の１４日後に、これらの細胞が低い割合で存在することが見出された。これらの結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がヒトＰＢＭＣによって誘導された劇症ＧｖＨＤを遅延させ、それら自体はいかなる異種ＧｖＨＤも誘導しないことを示している。
【0225】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞は、精製ＣＤ４＋細胞によって重度の異種ＧｖＨＤを阻害する。
図１５に示すように、２．５×１０６個の精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の投与によってＧｖＨＤ疾患が誘導されたヒト化異種ＧｖＨＤモデルにおいて、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を試験した。０日目にＮＳＧマウスに亜致死量の放射線を照射し、３日目にヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６細胞／マウス）を単独で、又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人の異なるドナー）（２．５×１０６細胞／マウス）と組み合わせて、又はプールからの単一ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６細胞／マウス）と組み合わせて静脈内注射した。ＧｖＨＤを、以前に報告されているように（Bondanza et al.Blood 2006）、体重減少（２０％超の体重減少）、皮膚病変、毛並み、活動性及び姿勢に基づいて評価した。
図１５に示すように、２．５×１０６個の精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の投与によってＧｖＨＤ疾患が誘導されたヒト化異種ＧｖＨＤモデルにおいて、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を試験した。０日目にＮＳＧマウスに亜致死量の放射線を照射し、３日目にヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６細胞／マウス）を単独で、又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（３人の異なるドナー）（２．５×１０６細胞／マウス）と組み合わせて、又はプールからの単一ドナー由来のＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６細胞／マウス）と組み合わせて静脈内注射した。ＧｖＨＤを、以前に報告されているように（Bondanza et al.Blood 2006）、体重減少（２０％超の体重減少）、皮膚病変、毛並み、活動性及び姿勢に基づいて評価した。
【0226】
図１６は、注射後の各日におけるＧｖＨＤを示すＮＳＧマウスの％を示す。これらの結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞がヒト同種ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介されるＧｖＨＤを阻害することができることを示している。この特定の実験では、ＣＤ４＋Ｔ細胞を投与された対照群のすべてのマウスが２０日目に死亡したことから、異種ＧｖＨＤは非常に重症であった。対照的に、２．５×１０６個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０の同時投与は、ＧｖＨＤを７５％阻害した。単一ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞も保護的ではあったが、効果はそれほど強力ではなかった。
【0227】
他の実験
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療効果を、４つの異なるマウス群、すなわち、（ｉ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞とは非血縁のドナー由来のヒトＰＢＭＣを投与されたマウス（ＧｖＨＤ陽性対照）、（ｉｉ）複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与されたマウス（陰性対照）、
（ｉｉｉ）ＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組み合わせを１：１の比で投与されたマウス、及び
（ｉｖ）ＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組み合わせを２：１の比又は異なる比で受けたマウス、において試験する。ＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組み合わせを投与された動物の中で、一部の動物はＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞とを同時に投与され、一部の動物はＰＢＭＣを投与された数日後（例えば、５日後）に複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与され、一部の動物はＰＢＭＣを投与される数日前（例えば、５日前）に複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与される。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療効果を、４つの異なるマウス群、すなわち、（ｉ）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞とは非血縁のドナー由来のヒトＰＢＭＣを投与されたマウス（ＧｖＨＤ陽性対照）、（ｉｉ）複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与されたマウス（陰性対照）、
（ｉｉｉ）ＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組み合わせを１：１の比で投与されたマウス、及び
（ｉｖ）ＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組み合わせを２：１の比又は異なる比で受けたマウス、において試験する。ＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の組み合わせを投与された動物の中で、一部の動物はＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞とを同時に投与され、一部の動物はＰＢＭＣを投与された数日後（例えば、５日後）に複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与され、一部の動物はＰＢＭＣを投与される数日前（例えば、５日前）に複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与される。
【0228】
ＰＢＭＣ及び／又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の投与後、１、２、３、４週目、及び必要に応じて５週目に体重を測定することによって、マウスをＧｖＨＤの発症についてモニタリングする。体重減少に加えて、マウスを皮膚病変、毛の状態及び活性について検査する。治療群のマウスをさらなる期間にわたってモニタリングして、長期生存に対する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の影響を調べる。
【0229】
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の量及び局在化もまた、投与後に末梢血及び組織においてモニタリングする。具体的には、末梢血及び炎症部位、すなわち、リンパ節、脾臓、腸及び骨髄における複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の存在をモニタリングする。治療群のマウスをさらに３週間モニタリングして、長期生存を確認する。
【0230】
これらの結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が異種ＧｖＨＤの低減及び予防に有効であることを示している。
【0231】
６．８．３．実施例３：ＧｖＨＤの阻害及び癌の治療
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を、ヒトＰＢＭＣ及びＡＭＬ腫瘍細胞を移植したＮＳＧマウスモデルにおいて、ヒトＰＢＭＣによって誘導される異種ＧｖＨＤに対するそれらの効果及び抗腫瘍効果について試験する。ＡＭＬ細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）は、国際公開第２０１６／１４６５４２号に以前に記載されているようにｉ．ｖ．投与される。ＰＢＭＣ又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又はそれらの組み合わせを３日後に投与する。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を、ヒトＰＢＭＣ及びＡＭＬ腫瘍細胞を移植したＮＳＧマウスモデルにおいて、ヒトＰＢＭＣによって誘導される異種ＧｖＨＤに対するそれらの効果及び抗腫瘍効果について試験する。ＡＭＬ細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）は、国際公開第２０１６／１４６５４２号に以前に記載されているようにｉ．ｖ．投与される。ＰＢＭＣ又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞又はそれらの組み合わせを３日後に投与する。
【0232】
実施例１に記載されるように、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を得る。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の治療効果を、それぞれが０日目に照射を受け、５×１０６個のＡＬＬ－ＣＭ細胞を有する４つの異なる群のマウス（ＡＭＬマウス）、すなわち、（ｉ）さらなる治療を行わないＡＭＬマウス、（ｉｉ）複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞とは非血縁のドナー由来の５×１０６個のヒトＰＢＭＣを投与されたＡＭＬマウス－ＰＢＭＣは重篤な異種ＧｖＨＤを引き起こす、（ｉｉｉ）２．５×１０６個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を投与されたＡＭＬマウス、及び（ｉｖ）ＰＢＭＣと複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞との組み合わせを１：１若しくは２：１の比で、又は異なる比で投与されたＡＭＬマウス、において試験する。マウスの１つのさらなる群は、ＡＬＬ－ＣＭＬ細胞を投与されないが、照射後３日目に５×１０６個のヒトＰＢＭＣを投与される。
【0233】
ヒトＰＢＭＣによって誘導された異種ＧｖＨＤに対する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果を、体重減少、皮膚病変、毛の状態、活性、死亡率及び長期生存に基づいて試験する。複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の抗腫瘍又は移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を、血液循環中の腫瘍細胞の減少及び長期の無腫瘍生存に基づいて試験する。
【0234】
一部のマウスは、長期生存及び完全な腫瘍寛解をモニタリングするために７週間までモニタリングされる。
【0235】
結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、異種ＧｖＨＤの阻害及び癌の治療の両方において有効であることを示している。
【0236】
６．８．４．実施例４：複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を用いた癌の治療
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を、ＮＳＧマウスにおけるＴ細胞療法のＡＬＬ－ＣＭ白血病モデルにおいて試験する。
複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の集団を、ＮＳＧマウスにおけるＴ細胞療法のＡＬＬ－ＣＭ白血病モデルにおいて試験する。
【0237】
０日目に、ＮＳＧマウスに亜致死量の放射線を照射し、骨髄性白血病細胞（ＡＬＬ－ＣＭ）（５×１０６個）を静脈内注射した。動物の第１の群では、ＰＢＭＣ（５×１０６個）又は単一のドナー（ドナーＢＣ－Ｉ及びドナーＢＣ－Ｈ由来）のＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を３日目に注射した。動物の第２の群では、ＰＢＭＣ（５×１０６個）又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）を３日目に注射した。移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を、動物において、血中白血病細胞の減少及び長期の無白血病生存に基づいて試験した。白血病を以前に報告されているように測定した（Locafaro G.et al Molecular Therapy 2017）。
【0238】
図１７Ａ及び図１７Ｂに示されるように、ＡＬＬ－ＣＭ骨髄白血病細胞を注射されたマウスのすべてが、１７日目に広範な白血病進行を有していた。５×１０６個のＰＢＭＣの投与は、白血病進行の強力な阻害をもたらした。興味深いことに、白血病進行の同程度の阻害レベルが、より少ない数（２．５×１０６個）の単一ドナーＣＤ４ＩＬ１０（図１７Ａ）又は複数ドナーＣＤ４ＩＬ１０（図１７Ｂ）によって得られた。これらのデータは、単一ドナー及び複数ドナーＣＤ４ＩＬ１０が強い直接的な抗白血病効果を有することを示している。
【0239】
単一ドナーＣＤ４ＩＬ１０及び複数ドナーＣＤ４ＩＬ１０の移植片対白血病（ＧｖＬ）効果を、ＡＬＬ－ＣＭ骨髄性白血病細胞を注射したマウスにおいてＰＢＭＣと組み合わせてさらに試験した。５×１０６個のＰＢＭＣの投与は白血病進行の強力な阻害をもたらし、単一ドナーＣＤ４ＩＬ１０（２．５×１０６個）と組み合わせた５×１０６個のＰＢＭＣの投与は相乗効果を有した（図１８Ａ）。興味深いことに、２．５×１０６個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ１０と組み合わせた５×１０６個のＰＢＭＣの投与は、同等の相乗的ＧｖＬ効果を有した（図１８Ｂ）。これらのデータは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ１０がＰＢＭＣと相乗的に作用して強力なＧｖＬ効果を媒介することを示している。
【0240】
６．８．５．実施例５：複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を用いた慢性炎症性疾患及び自己免疫疾患の治療
【0241】
ＮＬＰＲ３インフラマソームの活性化は、多くの慢性炎症性及び自己免疫疾患に関与している。ＮＬＰＲ３インフラマソームは、単球／マクロファージによる炎症促進性サイトカインＩＬ－１β及びＩＬ－１８のカスパーゼ１媒介産生をもたらす「危険シグナル」によって活性化され得る。ヒト単球によるＮＬＰＲ３インフラマソーム及びＩＬ－１β／ＩＬ－１８産生に対する複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の効果を調べるために、一連のインビトロ実験を行う。
【0242】
最初に、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ／Ｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた標準密度遠心分離によって末梢血から単離する。単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を製造者の説明書に従って使用して、負の選択によってヒトＰＢＭＣから単球を単離する。正の選択又は接着は細胞の望ましくない活性化をもたらし得るので、負の選択が好ましい。３％の毒素を含まないヒトＡＢ血清を含有する培養培地中の９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、１つのウェルにつき、２００μ当たり、２×１０５個又は１×１０５個の複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が存在するところに、単離された単球を、５×１０４細胞／２００μｌで播種する。
【0243】
表１は、各セットが６ウェルの細胞を含む１７セットの単球に適用された治療条件をまとめたものである。ＬＰＳ単独で、ＡＴＰによって提供される第２のシグナルなしにヒト単球を活性化できることが知られている。
【表1】
【0244】
表１に概説した処理の後、各群につき６つのウェルから上清を回収し、ＩＬ－１β／ＩＬ－１８産生を、成熟ＩＬ－１β又はＩＬ－１８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）に特異的なＥＬＩＳＡによって測定する。グループＮｏ．３、１０、１３、１４及び１７について６ウェルから回収した細胞をウエスタンブロットによって分析して、活性化カスパーゼ１のレベルを調べる。
【0245】
実験から得られたデータは、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が活性化単球によるＩＬ－１β及びＩＬ－１８産生を下方制御することを示す。本発明者らはさらに、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が活性化単球における成熟カスパーゼ－１産生を下方制御することを示す。さらに、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０及び複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０によって産生されるＩＬ－１０は、インフラマソームを下方制御する。
【0246】
単球の代わりにヒトマクロファージ又は樹状細胞を用いて同様の実験を行う。実験の結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、活性化マクロファージ及び樹状細胞由来のＩＬ－１β、ＩＬ－１８及び成熟カスパーゼ－１産生をさらに下方制御することを示している。
【0247】
これらの結果は、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞が、ＮＬＰＲ３インフラマソームの過剰活性化を伴う疾患又は障害を治療するために使用され得ることを示唆している。具体的には、複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞を使用して、慢性炎症性疾患及び自己免疫疾患を治療することができる。ＮＬＰＲ３インフラマソームは、外因性又は内因性の「危険シグナル」、例えば、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、シリカ、アスベスト、損傷ミトコンドリア、壊死細胞及びストレス細胞からの危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）様産物、及び尿毒症酸結晶によって活性化され得る。
【0248】
６．８．６．実験方法及び材料
細胞調製物及び細胞株末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ勾配での遠心分離によって調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製し、９５％超の純度が得られた。成熟樹状細胞（ＤＣ）を、ＣＤ１４＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を製造者の説明書に従って使用して正の選択を行った末梢血ＣＤ１４＋単球から生成し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｏｎｚａ、イタリア）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、イタリア）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、イタリア）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ、イタリア）中、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）及び１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、シアトル、ワシントン州）の存在下、３７℃で５日間培養し、１ｍｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ、カリフォルニア州、米国）でさらに２日間成熟させた。
細胞調製物及び細胞株末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ勾配での遠心分離によって調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＤ４ Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製し、９５％超の純度が得られた。成熟樹状細胞（ＤＣ）を、ＣＤ１４＋ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）を製造者の説明書に従って使用して正の選択を行った末梢血ＣＤ１４＋単球から生成し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｏｎｚａ、イタリア）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ、イタリア）、２ｍＭのＬ－グルタミン（Ｌｏｎｚａ、イタリア）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｏｎｚａ、イタリア）中、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒト（ｒｈ）ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）及び１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ、シアトル、ワシントン州）の存在下、３７℃で５日間培養し、１ｍｇ／ｍＬのリポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ、カリフォルニア州、米国）でさらに２日間成熟させた。
【0249】
プラスミド構築ヒトＩＬ－１０のコード配列をｐＨ１５Ｃ（ＡＴＣＣｎ°６８１９２）から切り出し、５４９ｂｐ断片をｐＢｌｕＫＳＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニングサイトにクローニングして、ｐＢｌｕＫＳＭ－ｈＩＬ－１０を得た。ｐＢｌｕＫＳＭ－ｈＩＬ－１０からｈＩＬ－１０を切除し、１０７４．１０７１．ｈＰＧＫ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｍｈＣＭＶ．ｄＮＧＦＲ．ＳＶ４０ＰＡ（ここではＬＶ－ΔＮＧＦＲと呼ぶ）にライゲーションして５５５ｂｐの断片を得て、ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲを得た。双方向プロモーター（ヒトＰＧＫプロモーター＋反対方向のＣＭＶプロモーターの最小コア要素）の存在は、２つの導入遺伝子の同時発現を可能にする（Locafaro et al.Mol Ther.2017;25(10):2254-2269）。ＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲの配列をパイロシーケンシング（Ｐｒｉｍｍ）によって検証した。
【0250】
ベクター作製及び滴定ＶＳＶ－Ｇ－シュードタイプ化第３世代双方向レンチウイルスベクターを、２９３Ｔ細胞へのＣａ３ＰＯ４一過性４プラスミド共トランスフェクションによって作製し、報告されているように超遠心分離によって濃縮した（Locafaro et al.Mol Ther.2017;25(10):2254-2269）。限界希釈によって力価を推定し、ＨＩＶ－１ Ｇａｇ ｐ２４抗原免疫捕捉（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によってベクター粒子を測定し、ベクター感染価を力価と粒子の比として計算した。力価は、５×１０８から６×１０９形質導入単位／ｍＬの範囲であり、感染価は、５×１０４から１０５形質導入単位／ｐ２４のｎｇの範囲であった。
【0251】
ＣＤ４ＩＬ－１０細胞株の作製ポリクローナルＣＤ４形質導入細胞を以前に報告されているように得た（Andolfi et al.Mol Ther.2012;20(9):1778-1790）。端的に言えば、ＣＤ４精製Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ、３０ｎｇ／ｍＬ、ＯＫＴ３、Ｊａｎｓｓｅｎ－Ｃｉｌａｇ、Ｒａｒｉｔａｎ、ニュージャージー州、米国）、抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１μｇ／ｍＬ、ＢＤ）及びｒｈＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、ノバルティス、イタリア）で４８時間活性化した。Ｔ細胞に、２０の感染多重度（ＭＯＩ）を有するＬＶ－ＩＬ－１０／ΔＮＧＦＲ（ＣＤ４ＩＬ－１０）を形質導入した。１１日目に、ＣＤ２７１＋マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用してＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ＋細胞をビーズ選別し、５％ヒト血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ－Ｌｏｎｚａ、ワシントン州）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）及び５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ－２（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、ノバルティス、イタリア）を含むＸ－ＶＩＶＯ１５培地で増殖させた。７日目及び１０日目に、培地を、５０Ｕ／ｍＬのｒｈＩＬ－２を補充した新鮮な培地と交換した。１４日目に、細胞を回収し、洗浄し、以前に報告されているように同種フィーダー混合物で再刺激した（Andolfi et al.Mol Ther.2012;20(9):1778-1790）。１４日後、細胞を回収し、凍結した。解凍したＣＤ４ＩＬ－１０細胞を再刺激し、２回目及び３回目の再刺激及び増殖の後、インビトロで機能的特性解析を行って、インビボ実験に使用した。
【0252】
ベクターコピー数分析非組込み型ベクター形態を取り除くために、形質導入後１１日間細胞を培養した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ、５１１０６）を用いて製造者の説明書に従ってゲノムＤＮＡを単離した。ベクターの組み込みを、ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、製造業者の説明書に従って定量化した。
【0253】
サイトカインの測定サイトカイン産生を測定するために、２回目及び３回目の再刺激の後、単一ドナー及び複数ドナーのＣＤ４ＩＬ－１０細胞を刺激せずに放置するか、又は最終体積２００μｌの培地（９６ウェル丸底プレート、２×１０５／ウェル）中の固定化抗ＣＤ３（１０μｇ／ｍＬ）及び可溶性抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）ｍＡｂで刺激した。４８時間の培養後に上清を回収し、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２２のレベルを製造者の説明書（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従ってＥＬＩＳＡによって測定した。
【0254】
フローサイトメトリー分析ＣＤ４による表面染色後のグランザイムＢ（クローンＭＨＧＢ０４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）の発現のために、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を固定し、透過処理し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを製造者の説明書（カタログ番号５５４７１４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国）に従って使用して染色した。染色した細胞を、１％ＦＢＳを補充したＰＢＳで２回洗浄し、ＦｌｏｗＪｏ１０ソフトウェアを利用して分析したＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａで分析した。
【0255】
殺滅アッセイ２回目及び３回目の再刺激の後、単一ドナー及び複数ドナーのＣＤ４ＩＬ－１０細胞の細胞傷害性を共培養実験において分析した。端的に言えば、非骨髄性白血病株及び骨髄性白血病細胞株である、それぞれＫ５６２及びＡＬＬ－ＣＭを標的細胞として使用し、ＣＤ４ＩＬ－１０細胞を１：１の比（１０５個の標的細胞及び１０５個のＣＤ４ＩＬ－１０細胞）で３日間プレーティングした。共培養の終了時に、細胞を回収し、Ｋ５６２及びＡＬＬ－ＣＭ細胞を分析し、ＦＡＣＳによって計数した。
【0256】
抑制アッセイ単一ドナー及び複数ドナーＣＤ４ＩＬ－１０細胞の抑制能を測定するために、製造者の説明書に従って、同種ＰＢＭＣをＣｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、米国）で標識した後に、同種成熟ＤＣ（５×１０４細胞／ウェル）及び可溶性抗ＣＤ３（５０ｎｇ／ｍＬ）ｍＡｂによって刺激した。ＰＢＭＣ及びサプレッサー細胞を１：１の比（１０５個のＰＢＭＣ及び１０５個のＣＤ４ＩＬ－１０細胞）で添加した。培養３日後、ＣＤ４＋ΔＮＧＦＲ－又はＣＤ８＋ΔＮＧＦＲ－Ｔ細胞のｅＦｌｕｏｒ６７０希釈物をＦＡＣＳによって分析することによって、応答細胞の増殖を調べた。
【0257】
移植片対宿主病モデル：すべての実験において、６／８週齢の雌ＮＳＧマウスを使用した。０日目に、マウスは、マウスの体重に応じて線形加速器から１７５～２００ｃＧｙの単回用量の全身照射を受け、ＰＢＭＣ細胞（５×１０６個）、又はＣＤ４ＩＬ－１０細胞（単一ドナー又は複数ドナー（３名のドナーのプール）５×１０６個又は２．５×１０６個）、又はＣＤ４ＩＬ－１０細胞（５×１０６個又は２．５×１０６個）と組み合わせたＰＢＭＣ（５×１０６個）を静脈内投与した。生存率、体重減少、活動性、毛、皮膚及び姿勢を、以前に報告されているように週に少なくとも３回モニタリングした（Bondanza et al.Blood.2006;107(5):1828-1836）。マウスの体重減少が２０％となったとき、倫理上の理由からマウスを安楽死させた。
【0258】
あるいは、０日目に、マウスは上記のように全身照射を受けた。３日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６個）、単一及び複数ドナー（３人のドナーのプール）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）、又はＣＤ４＋Ｔ細胞（２．５×１０６個）を単一及び複数ドナー（３人のドナーのプール）ＣＤ４ＩＬ－１０細胞（２．５×１０６個）と組み合わせてマウスに注射した。ＧｖＨＤ誘導を上記のようにモニタリングした。
【0259】
７．参照による組み込み
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願及び他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願で引用されたすべての刊行物、特許、特許出願及び他の文献は、各個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文献がすべての目的のために参照により組み込まれることが個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0260】
８．均等物
様々な具体的な実施形態を図示して説明してきたが、上記の明細書は限定的なものではない。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されよう。本明細書を検討すれば、当業者には多くの変形形態が明らかになるであろう。
９．配列
配列番号１（ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列）
配列番号２（ヒトＩＬ－１０の例示的なｎｔ配列）
配列番号３（ΔＮＧＦＲのアミノ酸配列）
配列番号４（ΔＮＧＦＲの例示的なｎｔ配列）
配列番号５（ｂｄ．ΔＮＧＦＲ．ＰＧＫ．ＩＬ－１０のヌクレオチド配列）
様々な具体的な実施形態を図示して説明してきたが、上記の明細書は限定的なものではない。本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解されよう。本明細書を検討すれば、当業者には多くの変形形態が明らかになるであろう。
９．配列
配列番号１（ヒトＩＬ－１０のアミノ酸配列）
配列番号２（ヒトＩＬ－１０の例示的なｎｔ配列）
配列番号３（ΔＮＧＦＲのアミノ酸配列）
配列番号４（ΔＮＧＦＲの例示的なｎｔ配列）
配列番号５（ｂｄ．ΔＮＧＦＲ．ＰＧＫ．ＩＬ－１０のヌクレオチド配列）
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【国際調査報告】