特表 2023-533812 ５－メチルフォレート産生微生物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-04

(54)【発明の名称】５－メチルフォレート産生微生物

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20230728BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230728BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230728BHJP

   C12P 13/14 20060101ALI20230728BHJP

   C12N 9/78 20060101ALI20230728BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20230728BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12P13/14

C12N9/78

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023502682

(86)(22)【出願日】2021-06-30

(85)【翻訳文提出日】2023-03-13

(86)【国際出願番号】 IB2021055845

(87)【国際公開番号】W WO2022013663

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】20186028.5

(32)【優先日】2020-07-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20189690.9

(32)【優先日】2020-08-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522073700

【氏名又は名称】チーフォン ファーマシューティカル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｆｅｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】＃１， Ｃｈｉｙａｏ Ｒｏａｄ， Ｃｈｉｆｅｎｇ Ｈｏｎｇｓｈａｎ Ｎｅｗ ａｎｄ Ｈｉｇｈ－Ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｈｏｎｇｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｃｈｉｆｅｎｇ， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ０２４０００， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100114890

【弁理士】

【氏名又は名称】アインゼル・フェリックス＝ラインハルト

(74)【代理人】

【識別番号】100098501

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 拓

(74)【代理人】

【識別番号】100116403

【弁理士】

【氏名又は名称】前川 純一

(74)【代理人】

【識別番号】100134315

【弁理士】

【氏名又は名称】永島 秀郎

(74)【代理人】

【識別番号】100162880

【弁理士】

【氏名又は名称】上島 類

(72)【発明者】

【氏名】ミンガン シー

(72)【発明者】

【氏名】シン シオン

(72)【発明者】

【氏名】ジア スン

(72)【発明者】

【氏名】ジン ヅゥオ

(72)【発明者】

【氏名】ユンチョン シァ

(72)【発明者】

【氏名】ヅァイリン ヂュウ

(72)【発明者】

【氏名】ヂーガン ツァイ

(72)【発明者】

【氏名】グオイン ヂャン

(72)【発明者】

【氏名】マルコ ブラジッチ

(72)【発明者】

【氏名】ティナ コゲイ

(72)【発明者】

【氏名】グレゴル コセッチ

(72)【発明者】

【氏名】ミリヤン シュヴァゲリ

(72)【発明者】

【氏名】ヤカ ホルヴァト

(72)【発明者】

【氏名】シュテファン フイス

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AE01

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA16

4B065AA01X

4B065AA19X

4B065AA26X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA79X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA17

4B065CA18

4B065CA27

(57)【要約】

本発明は、ａ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドの発現および／または活性が、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変され、ｂ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現するように（さらに）改変され、ｃ）５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの酵素）の発現レベルが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変され、かつ／またはｄ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現および／または活性が、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように（さらに）改変されている５－メチルフォレート産生微生物を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素の発現レベルが、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように改変され、かつ／または５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／もしくは活性が、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている、遺伝子組換え微生物。

【請求項2】

５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素の発現レベルが、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように改変されている、請求項１記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項3】

前記５－メチルフォレートの生合成に関与する酵素が、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチド、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチド、および５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項１または２記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項4】

５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように改変されている、請求項１から３までのいずれか１項記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項5】

前記５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素である、それぞれのポリペプチドが、前記遺伝子組換え微生物に対して異種である、請求項１から４までのいずれか１項記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項6】

５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性が、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている、請求項１から５までのいずれか１項記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項7】

ａ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性が、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して減少し、かつｂ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現するように改変されている、請求項１から６までのいずれか１項記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項8】

細菌である、請求項１から７までのいずれか１項記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項9】

バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｔｉｓ）種の細菌である、請求項１から８までのいずれか１項記載の遺伝子組換え微生物。

【請求項10】

フォレート、その前駆体または中間体を調製する方法であって、ｉ）請求項１から９までのいずれか１項記載の遺伝子組換え微生物を好適な培養条件下にて培養培地中で培養し、前記フォレート、その前駆体または中間体を含有する発酵産物を得ることと、ｉｉ）任意に前記フォレート、その前駆体または中間体を分離および／または精製することとを含む、方法。

【請求項11】

前記フォレートが、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式Ｉ：

【化1】

の化合物である、請求項１０記載の方法。

【請求項12】

前記フォレートが、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式ＩＩ：

【化2】

の化合物である、請求項１０または１１記載の方法。

【請求項13】

前記フォレートが式ＩＩａ：

【化3】

の化合物である、請求項１０から１２までのいずれか１項記載の方法。

【請求項14】

遺伝子組換え微生物を作製する方法であって、下記工程（ａ）および（ｂ）：
（ａ）５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素の発現レベルを、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して増加させる工程、ならびに
（ｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性を、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程
のいずれか１つを含む、方法。

【請求項15】

下記工程（ｃ）および（ｄ）：
（ｃ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性を、その改変を有しないことを除いて同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程、ならびに
（ｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現させる工程
をさらに含む、請求項１４記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、バイオテクノロジー工学の分野、特に５－メチルフォレート、例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート（５－メチル－ＴＨＦ）を産生する微生物、ならびにその調製および使用に関する。より具体的には、本発明は、ａ）５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの酵素）の発現レベルが、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように改変され、ｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／もしくは活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように（さらに）改変され、ｃ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／もしくは活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように（さらに）改変され、かつ／またはｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現するように（さらに）改変されている、５－メチルフォレート産生微生物、例えば５－メチルフォレート産生細菌を提供する。

【0002】

発明の背景
フォレートは、葉酸およびその多数の誘導体の総称であり、これらは酸化状態、プテリジン環の１炭素置換、およびγ－結合型グルタメート残基の数が異なる（図１に示す）。フォレートのプテリジン部分は、完全に酸化（葉酸）、または還元型７，８－ジヒドロフォレート（ＤＨＦ）、または５，６，７，８－テトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）の３つの酸化状態で存在し得る。ＴＨＦは、Ｎ５もしくはＮ１０位に付着するか、またはこれらの位置の架橋により付着するＣ１基を受容、転移および供与する補酵素活性型のビタミンである。Ｃ１基の酸化状態も異なり、フォレートは、ホルメート（５－ホルミル－ＴＨＦ（５－ＦＴＨＦまたはフォリン酸）、１０－ホルミル－ＴＨＦ、５，１０－メテニル－ＴＨＦおよび５－ホルムイミノ－ＴＨＦ）、メタノール（５－メチル－ＴＨＦ；５－ＭＴＨＦ）またはホルムアルデヒド（５，１０－メチレン－ＴＨＦ）の誘導体として存在する。加えて、天然に存在する殆どのフォレートは、γ－結合型ポリグルタメートコンジュゲートとして存在する。

【0003】

葉酸（プテロイル－Ｌ－グルタミン酸）は、自然界には存在しない合成化合物である。葉酸は、補酵素としては活性でなく、代謝的に活性なＴＨＦ型に変換されるには、細胞内で幾つかの代謝段階を経る必要がある。しかしながら、葉酸は商業的に最も重要なフォレート化合物であり、化学合成により工業的に生産される。哺乳動物は、フォレートを合成することができず、正常レベルのフォレートを維持するため食事補給に依存する。低フォレート状態は、低い食事摂取量、摂取したフォレートの吸収不良、および遺伝的欠陥または薬物相互作用によるフォレート代謝の変化に起因する可能性がある。殆どの国で、葉酸サプリメントまたは強化食品によるフォレートの推奨摂取量が定められている。食事補給に使用されるフォレートとしては、葉酸、フォリン酸（５－ＦＴＨＦ、ロイコボリン）または５－ＭＴＨＦが挙げられる（Scaglione and Panzavolta 2014）。５－ＭＴＨＦの２つの塩形態が現在、サプリメントとして生産されている。Merck Milliporeは、５－ＭＴＨＦのカルシウム塩であるＭｅｔａｆｏｌｉｎ（登録商標）を生産しており、これは天然に存在する主要な形態のフォレートの安定した結晶形である。Gnosis S.p.A.は、商標名Ｑｕａｔｒｅｆｏｌｉｃ（登録商標）の（６Ｓ）－５－ＭＴＨＦのグルコサミン塩を開発し、特許を取得している。

【0004】

現在、葉酸は主に化学合成によって工業的に生産されているが、他のビタミンとは異なり、現在の細菌株によって産生される葉酸の低い収率から、工業規模での葉酸の微生物生産は開発されていない（Rossi et al., 2016）。化学的に生産された葉酸は、天然に存在する分子ではないが、ヒトはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）酵素の作用により、これを生物学的に活性な形態のフォレートへと代謝することができる。幾つかの理由から、フォレートの商業生産のために化学合成法を微生物発酵に置き換えることが支持される：第一に、還元型の葉酸を微生物によって生産することができ、ヒトはこれをより効率的に用いることができる。最も重要なことには、単一段階の発酵プロセスは、原則として多段階の化学プロセスよりもはるかに効率的であり、環境に優しい可能性がある。

【0005】

これまでの研究は、微生物におけるフォレート／葉酸産生を解明するために行われている。フォレートの産生のための微生物用途の殆どは、発酵乳製品の栄養強化およびフォレート産生プロバイオティクスに限定される。フォレートの合成を改善するための培養条件の最適化も行われ、約１５０μｇ／ｇの葉酸収率が達成されている（Hjortmo et al., 2008；Sybesma et al., 2003b）。幾つかの研究では、乳酸菌（Sybesma et al., 2003a）、酵母（Walkey et al., 2015）または糸状真菌（Serrano-Amatriain et al. 2016）のいずれかの遺伝子組換え株が記載されており、これらは最大６．６ｍｇ／Ｌの力価で葉酸を産生することができる。フォレートの微生物生産のための別の首尾よく用いられているアプローチは、パラアミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）の存在下での酵母または細菌株の培養である。これらの培養物の上清では、最大２２ｍｇ／Ｌの総フォレート含量が測定された。

【0006】

（６Ｓ）－５－メチルテトラヒドロフォレート（Ｌ－５－メチルテトラヒドロフォレートまたはＬ－５－メチル－ＴＨＦ）は、葉酸（ビタミンＢ９）の活性型である。葉酸（プテロイル－Ｌ－グルタミン酸）は、化学合成によって工業的に生産される合成化合物であり、新鮮な天然食品には含まれていない。葉酸は補酵素としては活性でなく、代謝的に活性なフォレート形態に変換されるには、細胞内で幾つかの代謝段階を経る必要がある。一方、５－メチルテトラヒドロフォレートは食事性フォレートの主要な形態であり、ヒト体内のフォレートの主要な活性型でもあり、ヒト血漿中のフォレートのおよそ９８％を占める。Ｌ－５－メチル－ＴＨＦの摂取は、ビタミンＢ１２欠乏症の血液症状を隠す可能性が低く、ジヒドロ葉酸レダクターゼを標的とする薬物との干渉が少なく、およびＬ－５－メチル－ＴＨＦが未代謝のビタミンとしてヒト血漿中に蓄積しない等、葉酸の摂取と比べて幾つかの利点を有し得る。

【0007】

葉酸の化学合成のための工業技術は、大きな環境負荷に阻まれている。これまでのところ、葉酸または天然型のフォレートのいずれか、例えば５－メチルフォレートを生産する微生物発酵プロセスは、フォレートの非常に低い産生力価／収率のために競争力がない。

【0008】

したがって、５－メチルフォレート、例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート、またはその前駆体もしくは中間体の産生能を高めるための新たな遺伝子組換え微生物を開発する緊急の必要性がある。

【0009】

発明の概要
本発明の目的は、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）またはその前駆体もしくは中間体の産生能を高めるための遺伝子組換え微生物を提供することである。この目的は、本発明者らによって解決される。

【0010】

本発明は、以下の項目によってまとめることができる。

【0011】

１． 遺伝子組換え微生物、例えば細菌。

【0012】

２． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている、項目１記載の遺伝子組換え微生物。

【0013】

３． 前記ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている、項目２記載の遺伝子組換え微生物。

【0014】

４． 内在性遺伝子の発現レベルが、それ以外は同一の微生物と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少する、項目３記載の遺伝子組換え微生物。

【0015】

５． 前記ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子が不活性化されている、項目３または４記載の遺伝子組換え微生物。

【0016】

６． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目５記載の遺伝子組換え微生物。

【0017】

７． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを微生物に導入または発現させることによって不活性化されている、項目４または５記載の遺伝子組換え微生物。

【0018】

８． 前記レアカットエンドヌクレアーゼが転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、項目７記載の遺伝子組換え微生物。

【0019】

９． ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質である、項目８記載の遺伝子組換え微生物。

【0020】

１０． 前記ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む（例えば発現する）、項目１３記載の遺伝子組換え微生物。

【0021】

１１． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記内在性ポリペプチドの発現が、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）、項目２記載の遺伝子組換え微生物。

【0022】

１２． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記内在性ポリペプチドの発現が、前記ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）阻害性核酸分子を微生物に導入または発現させることによって減少する（例えば阻害される）、項目２記載の遺伝子組換え微生物。

【0023】

１３． 阻害性核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である、項目１２記載の遺伝子組換え微生物。

【0024】

１４． 干渉ＲＮＡ分子がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目１３記載の遺伝子組換え微生物。

【0025】

１５． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの活性が、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている、項目２または３記載の遺伝子組換え微生物。

【0026】

１６． 前記ポリペプチドの活性が、活性の低下または喪失をもたらす少なくとも１つの活性部位突然変異によって減少する、項目１５記載の遺伝子組換え微生物。

【0027】

１７． 少なくとも１つの活性部位突然変異が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列の５１～５４、７５、１１４～１１７、１４５、１５２～１５４、１７２、２６３、３０２および３１５位のいずれか１つに相当する位置にある、項目１６記載の遺伝子組換え微生物。

【0028】

１８． 少なくとも１つの活性部位突然変異が非保存的アミノ酸置換である、項目１６または１７記載の遺伝子組換え微生物。

【0029】

１９． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が遺伝子ｆｏｌＣである、項目２から１８までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0030】

２０． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が内在性遺伝子ｆｏｌＣである、項目２から１８までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0031】

２１． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、配列番号５に示される核酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、項目２から２０までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0032】

２２． 内在性遺伝子によってコードされるジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸を含む、項目２から２１までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0033】

２３． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現するように（さらに）改変されている、項目１から２２までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0034】

２４． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドが、好ましくはラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）およびアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）から選択される、細菌または真菌に由来する、項目２３記載の遺伝子組換え微生物。

【0035】

２４． ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドが、配列番号２２または２３と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目２３または２４記載の遺伝子組換え微生物。

【0036】

２５． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）またはその前駆体もしくは中間体の産生能が、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して大幅に改善されるように（さらに）改変されている、項目１から２４までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0037】

２６． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）またはその前駆体もしくは中間体の産生能が、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも５０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％または少なくとも５００００％増加する、項目２５記載の遺伝子組換え微生物。

【0038】

２７． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から２６までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0039】

２８． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも２つの遺伝子（例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から２７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0040】

２９． ５－メチルフォレートの生合成に関与する酵素をコードする少なくとも３つの遺伝子（例えば少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から２８までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0041】

３０． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも４つの遺伝子（例えば少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から２９までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0042】

３１． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも５つの遺伝子（例えば少なくとも６つの遺伝子、少なくとも７つの遺伝子または少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３０までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0043】

３２． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも６つの遺伝子（例えば少なくとも７つの遺伝子または少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３１までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0044】

３３． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも７つの遺伝子（例えば少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３２までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0045】

３４． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子がｆｏｌＥ／ｍｔｒＡ、ｆｏｌＢ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＰ／ｓｕｌ、ｆｏｌＡ／ｄｆｒＡ、ｇｌｙＡ、ｐｕｒＵ、ｙｉｔＪおよびｍｅｔＦからなる群から選択される、項目２７から３３までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0046】

３５． ５－メチルフォレート、例えば５－メチル－テトラヒドロフォレートの生合成に関与する酵素が、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチド、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチド、および５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目２７から３４までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0047】

３６． ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３４までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0048】

３７． ７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３６までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0049】

３８． ２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0050】

３９． ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３８までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0051】

４０． ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から３９までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0052】

４１． セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から４０までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0053】

４２． ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から４１までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0054】

４３． ５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から４２までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0055】

４４． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が、遺伝子組換え微生物に対して異種である、項目２７から４３までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0056】

４５． ５－メチルフォレートの生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が、好ましくはバチルス、エシェリキア、ラクトコッカス、シューワネラ、ビブリオおよびアシュビア属から選択される、細菌または真菌に由来する、項目２７から４４までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0057】

４６． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｔｉｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュワネラ・ビオラセア（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｖｉｏｌａｃｅａ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）またはアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）から選択される細菌または真菌に由来する、項目２７から４５までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0058】

４７． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して少なくとも５０％、少なくとも１００、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも５０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％または少なくとも５００００％増加する、項目２７から４６までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0059】

４８． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも１つの酵素（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの酵素）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から４７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0060】

４９． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも２つ（例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つ）の酵素の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から４７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0061】

５０． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも３つ（例えば少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つ）の酵素の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から４７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0062】

５１． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも４つ（例えば少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つ）の酵素の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から４７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0063】

５２． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも５つ（例えば少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つ）の酵素の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から４７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0064】

５３． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも６つ（例えば少なくとも７つまたは少なくとも８つ）の酵素の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するようにさらに改変されている、項目１から４７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0065】

５４． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも７つ（例えば少なくとも８つ）の酵素の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から４７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0066】

５５． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する前記少なくとも１つの酵素が、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチド、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチド、および５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドからなる群から選択される、項目４８から５４までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0067】

５６． ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から５５までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0068】

５７． ７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から５６までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0069】

５８． ２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から５７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0070】

５９． ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から５８までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0071】

６０． ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から５９までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0072】

６１． セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から６０までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0073】

６２． ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から６１までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0074】

６３． ５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている、項目１から６２までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0075】

６４． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも１つの酵素である、それぞれの列挙されたポリペプチドが、遺伝子組換え微生物に対して異種である、項目４８から６３までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0076】

６５． ５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素である、それぞれの列挙されたポリペプチドが、好ましくはバチルス、エシェリキア、ラクトコッカス、シューワネラ、ビブリオおよびアシュビア属から選択される、細菌または真菌に由来する、項目４８から６４までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0077】

６６． ５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも１つの酵素である、それぞれの列挙されたポリペプチドが、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｔｉｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュワネラ・ビオラセア（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｖｉｏｌａｃｅａ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）またはアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）から選択される細菌または真菌に由来する、項目４８から６５までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0078】

６７． ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、３６、５５および５６のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0079】

６８． ７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号８と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、３７、５５および５７のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0080】

６９． ２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチル－ジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号９と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、３８、５５および５８のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0081】

７０． ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１０と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、３９、５５または５９のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0082】

７１． ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号１２と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、４０、５５および６０のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0083】

７２． セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号７９と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、４１、５５および６１のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0084】

７３． ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号８１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、４２、５５および６２のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0085】

７４． ５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号８３と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、４３、５５および６３のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0086】

７５． ５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号８４と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目３５、４３、５５および６４のいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0087】

７６． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性が、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように（さらに）改変されている、項目１から７５までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0088】

７７． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている、項目７６記載の遺伝子組換え微生物。

【0089】

７８． 内在性遺伝子の発現レベルが、それ以外は同一の微生物と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少する、項目７７記載の遺伝子組換え微生物。

【0090】

７９． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の調節領域に、発現レベルの減少をもたらす少なくとも１つの突然変異を含む、項目７６または７７記載の遺伝子組換え微生物。

【0091】

８０． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が不活性化されている、項目７６または７７記載の遺伝子組換え微生物。

【0092】

８１． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている、項目７６または７７記載の遺伝子組換え微生物。

【0093】

８２． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを微生物に導入または発現させることによって不活性化されている、項目７６記載の遺伝子組換え微生物。

【0094】

８３． 前記レアカットエンドヌクレアーゼが転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである、項目８２記載の遺伝子組換え微生物。

【0095】

８４． ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質である、項目８３記載の遺伝子組換え微生物。

【0096】

８５． 前記ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む（例えば発現する）、項目８４記載の遺伝子組換え微生物。

【0097】

８６． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記内在性ポリペプチドの発現が、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）、項目７６記載の遺伝子組換え微生物。

【0098】

８７． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記内在性ポリペプチドの発現が、前記ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）阻害性核酸分子を微生物に導入または発現させることによって減少する（例えば阻害される）、項目７６記載の遺伝子組換え微生物。

【0099】

８８． 阻害性核酸分子がアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である、項目８７記載の遺伝子組換え微生物。

【0100】

８９． 干渉ＲＮＡ分子がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、項目８８記載の遺伝子組換え微生物。

【0101】

９０． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの活性が、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている、項目７６または７７記載の遺伝子組換え微生物。

【0102】

９１． 前記ポリペプチドの活性が、活性の低下または喪失をもたらす少なくとも１つの活性部位突然変異によって減少する、項目９０記載の遺伝子組換え微生物。

【0103】

９２． 少なくとも１つの活性部位突然変異が、配列番号１００に示されるアミノ酸配列の１８、２１、１１２、１１７、１１９、４３５～４３７、４８８、４９４、５１９～５２１、５６５、６０１、６０３、６０５、６４５、６４７、６６９、７３０および７３１位のいずれか１つに相当する位置にある、項目９１記載の遺伝子組換え微生物。

【0104】

９２． 少なくとも１つの活性部位突然変異が非保存的アミノ酸置換である、項目１６または１７記載の遺伝子組換え微生物。

【0105】

９３． 前記５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子が遺伝子ｍｅｔＥである、項目７６から９２までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0106】

９４． ５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、配列番号１０１に示される核酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、項目７６から９３までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0107】

９５． 内在性遺伝子によってコードされる５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、少なくとも７０％、例えば少なくとも８０、少なくとも８５％、少なくとも９０％、配列番号１００に示されるアミノ酸配列と少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目７６から９４までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0108】

９６． 細菌である、項目１から９５までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0109】

９７． バチルス科の細菌である、項目１から９６までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0110】

９８． バチルス属の細菌である、項目１から９７までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0111】

９９． バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｔｉｓ）種の細菌である、項目１から９８までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物。

【0112】

１００． フォレート、その前駆体または中間体を調製する方法であって、ｉ）項目１から９９までのいずれか１つ記載の遺伝子組換え微生物を好適な培養条件下にて培養培地中で培養し、前記フォレート、その前駆体または中間体を含有する発酵産物を得ることと、ｉｉ）任意に前記フォレート、その前駆体または中間体を分離および／または精製することとを含む、方法。

【0113】

１０１． 工程ｉ）を３２～４２℃の範囲、好ましくは３４～３９℃の範囲、より好ましくは３６～３９℃の範囲の培養温度、例えば約３７℃で行う、項目１００記載の方法。

【0114】

１０２． 工程ｉ）を１０～７０時間の範囲、好ましくは２４～６０時間の範囲、より好ましくは３６～５０時間の範囲の期間にわたって行う、項目１００または１０１記載の方法。

【0115】

１０３． 工程ｉ）を６～８の範囲、好ましくは６．５～７．５の範囲、より好ましくは６．８～７．２の範囲のｐＨで行う、項目１００から１０２までのいずれか１つ記載の方法。

【0116】

１０４． フォレートが、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式Ｉ：

【化1】

の化合物である、項目１００から１０２までのいずれか１つ記載の方法。

【0117】

１０５． フォレートが、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式ＩＩ：

【化2】

の化合物である、項目１００から１０４までのいずれか１つ記載の方法。

【0118】

１０６． フォレートが、式ＩＩａ：

【化3】

の化合物である、項目１００から１０５までのいずれか１つ記載の方法。

【0119】

１０７． フォレートが、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式ＩＩＩ：

【化4】

の化合物である、項目１００から１０４までのいずれか１つ記載の方法。

【0120】

１０８． 培養工程（ｉ）の間にパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を添加する工程をさらに含む、項目１００から１０７までのいずれか１つ記載の方法。

【0121】

１０９． パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）がパラアミノ安息香酸カリウム、パラアミノ安息香酸ナトリウム、パラアミノ安息香酸メチル、パラアミノ安息香酸エチル、パラアミノ安息香酸ブチルまたはそれらの組合せからなる群から選択される、項目１０８記載の方法。

【0122】

１１０． 工程（ｉ）または（ｉｉ）において得られた生成物を酸性またはアルカリ性条件に供し、誘導体化合物をさらに得ることをさらに含む、項目１００から１０９までのいずれか１つ記載の方法。

【0123】

１１１． 下記工程（ａ）～（ｄ）：
（ａ）５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つ）の酵素の発現レベルを、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加させる工程、
（ｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／もしくは活性を、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程、
（ｃ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／もしくは活性を、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程、ならびに／または
（ｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現させる工程、
のいずれか１つを含む、遺伝子組換え微生物を作製する方法。

【0124】

１１２． 下記工程（ａ）および（ｂ）：
（ａ）５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素の発現レベルを、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加させる工程、ならびに
（ｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性を、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程
のいずれか１つを含む、項目１１１記載の方法。

【0125】

１１３． 下記工程（ｃ）および（ｄ）：
（ｃ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性を、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程、ならびに
（ｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現させる工程
をさらに含む、請求項１１２記載の方法。

【0126】

１１４． ａａ）５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも１つの外因性核酸分子を前記微生物に導入する工程、ｂｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子を、例えば遺伝子配列の一部もしくは全体を欠失させることによって不活性化するか、もしくは前記内在性遺伝子の調節領域に、発現レベルの減少をもたらす少なくとも１つの突然変異を導入する工程、ｃｃ）前記微生物において、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子を、例えば遺伝子配列の一部もしくは全体を欠失させることによって不活性化する工程、ならびに／またはｄｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む外因性核酸分子を前記微生物に導入する工程を含む、項目１１１から１１３までのいずれか１つ記載の方法。

【0127】

本発明の範囲内で、前記および以下の本発明の各技術的特徴を互いに組み合わせて、好ましい技術的解決策を構成することができるが、ここではスペースの制約上、明示的に記載されないことを理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0128】

【図1】フォレートのコア構造を示す図である。天然のフォレートでは、プテリン環はテトラヒドロ型（図示）または７，８－ジヒドロ型で存在する。化学的に生産された葉酸では、この環は完全に酸化される。フォレートは通常、最初のグルタメートに付着した最大約８残基のγ－結合型ポリグルタミルテールを有する。１炭素単位（ホルミル、メチル等）がＮ５および／またはＮ１０位に連結し、５－ホルミルフォレート、１０－ホルミルフォレートまたは５－メチルフォレートが合成され得る。

【図2】Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）遺伝子からなる葉酸オペロンの一例の概略図である。

【図3】Ａ．ゴシッピイ（Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）遺伝子からなる葉酸オペロンの一例の概略図である。

【図4】Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子からなる葉酸オペロンの一例の概略図である。

【図5】テトラサイクリン耐性遺伝子（ＴｅｔＲ）、Ｐｖｅｇプロモーター下の異種ｆｏｌＣ２－ＬＲまたはｆｏｌＣ２－ＡＧ遺伝子、およびネイティブｆｏｌＣ標的遺伝子破壊のための隣接相同性末端を有するＦｏｌＣ破壊カセットの概略図である。ＤＮＡ破壊カセットのＰＣＲ増幅に使用されるプライマーの位置を線で示す。

【図6】発酵ブロスサンプルのクロマトグラムである。黒色：ＵＶシグナル、赤色：ＭＳスキャンシグナル。

【図7】酸素の存在下での１０－ホルミルジヒドロ葉酸の１０－ホルミル葉酸への酸化の概略図、過酸化水素の存在下での１０－ホルミルジヒドロ葉酸の１０－ホルミル葉酸への酸化の概略図、および過ヨウ素酸ナトリウムの存在下での１０－ホルミルジヒドロ葉酸の１０－ホルミル葉酸への酸化の概略図である。

【図8】酸性媒体中での１０－ホルミル葉酸の葉酸への脱ホルミル化の概略図である。

【図9】アルカリ性媒体中での１０－ホルミル葉酸の葉酸への脱ホルミル化の概略図である。

【図10】フォレート産生バイオプロセスのプロファイルを示す図である。フォレート（ｍｇ／Ｌ）：黒星；グルコース濃度（ｇ／Ｌ）：白四角；アセトイン濃度（ｇ／Ｌ）：黒四角；ＰＡＢＡ濃度（ｍｇ／Ｌ）：白丸；ＰＡＢＡフィード（ｍｇ／Ｌ）：縦棒；光学密度：黒丸。

【図11】シェーカー５ｍｌ規模実験でのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ｗ．ｔ．１６８、株ＶＢＢ３８、株ＦＬ２１およびＦＬ２３の全フォレート産生力価を示す図である。

【図12】シェーカー５ｍｌ規模実験でのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ｗ．ｔ．１６８、株ＶＢＢ３８、株ＦＬ２１、ＦＬ８２５およびＦＬ２７７１の５－メチルフォレート産生力価を示す図である。

【図13】親株ＦＬ２７７１への人工メチル－フォレートオペロンＭＴＨＦ－ＯＰ－Ｂでの形質転換による５－メチル－テトラヒドロフォレート産生株開発の概略図である。

【図14】人工ＭＴＨＦ－ＯＰフォレートオペロンの概略図である。構築したオペロンは、スペクチノマイシン選択可能マーカーおよびｙｗｈＬ遺伝子座でのゲノム組込みのための相同性を有する。ＭＴＨＦ－ＯＰ－Ａオペロンでは、遺伝子（ｇｌｙＡ、ｐｕｒＵおよびｙｉｔＪ）をネイティブ生物Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択し、最適遺伝子発現のために付加的にコドン最適化した。さらに、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するホモログ遺伝子（ｍｅｔＦ）をオペロンＭＴＨＦ－ＯＰ－ＢにおいてｙｉｔＪの代わりの遺伝子の構築に使用した。

【図15】親株ＦＬ８２５および子孫株ＦＬ２７７１におけるｍｅｔＥ遺伝子の転写レベルを示す図である。

【図16】Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子からなる葉酸オペロンであるＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ１の概略図を示す図である。

【0129】

詳細な説明
本明細書で特に定義されない限り、使用される全ての技術用語および科学用語は、生化学、遺伝学および分子生物学の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0130】

本明細書に記載のものと同様または同等の全ての方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができ、好適な方法および材料が本明細書に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照により援用される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は、特に指定のない限り、例示に過ぎず、限定を意図していない。

【0131】

本発明の実施には、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内の細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の従来の手法が用いられる。かかる手法は、文献中で十分に説明される。例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA)；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)；Mullis et al.の米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984)；Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)；B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)；Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ、特にVols.154 and 155 (Wu et al. eds.)およびVol. 185, “Gene Expression Technology” (D. Goeddel, ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)；ならびにImmunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986)を参照されたい。

【0132】

本発明の遺伝子組換え微生物
一態様では、本発明は、このように遺伝子組換え微生物、例えば遺伝子組換え細菌を提供する。好適には、遺伝子組換え微生物は、５－メチルフォレート（以下に示す式（Ｉ）による）、より具体的には５－メチルテトラヒドロフォレート（５－メチル－ＴＨＦ）（以下に示す式（ＩＩ）による）（その任意の立体異性体、例えばエナンチオマーまたはジアステレオマー、例えば（６Ｓ）－５－メチルテトラヒドロフォレート（以下に示す式（ＩＩａ）による）を含む）を産生する能力を有する。

【0133】

バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等の一部の細菌では、ジヒドロプテロエートへのＬ－グルタメートの付加（ジヒドロ葉酸シンテターゼ（ＤＨＦＳ）活性、ＥＣ ６．３．２．１２）およびその後のγカルボキシル基を介したテトラヒドロフォレートへのＬ－グルタメートの付加（ホリルポリグルタミン酸シンテターゼ（ＦＰＧＳ）活性、ＥＣ ６．３．２．１７）は、同じ酵素ＦｏｌＣによって触媒される。対照的に、真核生物および他の一部の細菌では、ＤＨＦＳおよびＦＰＧＳの酵素活性は、異なる遺伝子にコードされる。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は、他の多くの細菌と同様、フォレートにガンマ－結合型ポリ－グルタメートテールを付加して、溶解性を高め、環境中へのこの必須補因子の喪失を防ぐ。このように、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＦｏｌＣは、ｄｅ ｎｏｖｏフォレート生合成経路におけるジヒドロ葉酸シンターゼとしてのその役割に加え、ガンマ－カルボキシル基を介したフォレートのポリグルタミル化を触媒するホリルポリグルタミン酸シンテターゼ（ＦＰＧＳ）活性を有する。フォレートポリアニオンは、細胞外に排出されず、細胞内貯留が高められ得る（Sybesma et al., 2003c）。加えて、ＦＰＧＳ酵素の生成物であるホリル－ポリグルタメートは、フォレート生合成酵素の強力な阻害剤である（McGuire and Bertino, 1981）。したがって、フォレートの産生を増加させるために、本発明者らは、ネイティブ（内因性）ｆｏｌＣ遺伝子をノックアウトすることによってフォレートのポリグルタミル化を止め、必須のジヒドロ葉酸シンテターゼ（ＤＨＦＳ）活性のみをコードする異種ｆｏｌＣ遺伝子に置き換え、必須のグルタメート部分が１つのみ付加されたものを得た。ジヒドロ葉酸シンテターゼ（ＤＨＦＳ）のみを有し、ホリルポリグルタメート（ＦＧＰＳ）シンテターゼ活性を有しないＦｏｌＣのホモログは、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）のような多くの細菌種、およびアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のような多くの真核生物に見ることができる。

【0134】

広範かつ集中的な研究の後に、本発明者らは、驚くべきことに、微生物においてジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子、例えば遺伝子ｆｏｌＣの発現レベルを低下させ、代わりにジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有するポリペプチドをコードする外因性遺伝子を導入すると、生合成されるフォレートにグルタメートが１つのみ付加され、フォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）、その塩、前駆体または中間体の産生能が、それにより顕著に増加することを見出した。

【0135】

このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／または活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されていてもよい。

【0136】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルが、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されていてもよい。内在性遺伝子の発現レベルは例えば、それ以外は同一の微生物と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少し得る。

【0137】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。

【0138】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを微生物に導入または発現させることによって不活性化されている。内在性遺伝子を不活性化するために本発明に従って使用されるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。

【0139】

ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子を不活性化する方法の１つは、ＣＲＩＳＰＲｉシステムを使用することである。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、遺伝子発現の標的抑制またはゲノム上の標的位置のブロックのためのツールとして開発された。ＣＲＩＳＰＲｉシステムは、触媒的に不活性な「死んだ」Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）と、ＤＮＡに対するｄＣａｓ９の結合部位を画定するガイドＲＮＡとからなる。

【0140】

このように、幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質と、前記ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを微生物に導入または発現させることによって不活性化される。

【0141】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｔｉｓ）においてジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子を阻害すべき場合、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、配列番号５またはその相補体の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含み得る。

【0142】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現は、阻害によって減少する。

【0143】

ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記内在性ポリペプチドの発現の阻害は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の阻害性核酸分子の使用を伴う遺伝子サイレンシング技術によって発現を阻害することができる。

【0144】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記内在性ポリペプチドの発現は、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）。

【0145】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記内在性ポリペプチドの発現は、阻害性核酸分子を微生物に導入または発現させることによって阻害される。例えば、阻害性核酸分子は、微生物において前記阻害性核酸分子の産生を引き起こすように機能するプロモーター、例えば誘導性プロモーターに操作可能に連結した、前記阻害性核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子によって導入することができる。好適には、阻害性核酸分子は、内在性ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）ものである。標的に応じて、コードゲノムＤＮＡの転写および／またはコードｍＲＮＡの翻訳を阻害する。

【0146】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。好ましくは、かかる核酸分子は、対象のポリペプチドまたは酵素をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ（例えば、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡ）の相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。

【0147】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現を阻害すべき場合、かかる阻害性核酸分子は、配列番号５の相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含み得る。

【0148】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。

【0149】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、ハンマーヘッド型リボザイム等のリボザイムである。リボザイム分子は、ポリペプチドの翻訳を防ぐためにｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するように設計されている。

【0150】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。ＲＮＡ干渉は、ＲＮＡ分子が発現を阻害する生物学的プロセスであり、通例、特定のｍＲＮＡの破壊を引き起こす。ＲＮＡｉ分子の例示的なタイプとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられる。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｈＲＮＡである。

【0151】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現を阻害すべき場合、ＲＮＡｉ分子は、配列番号５に相補的な干渉ＲＮＡであり得る。ＲＮＡｉ分子は、配列番号５の相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むリボ核酸分子であってもよい。ＲＮＡｉ分子は、配列番号５の２０～２５、例えば２１～２３個の連続ヌクレオチドと同一の第１の鎖と、前記第１の鎖に相補的な第２の鎖とを含む二本鎖リボ核酸分子であってもよい。

【0152】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの活性が、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている。

【0153】

ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの活性の減少は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、活性の低下または喪失をもたらす１つ以上の突然変異をポリペプチドの活性部位に導入することによって活性を減少させることができる。このように、幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの活性が、活性の低下または喪失をもたらす少なくとも１つの活性部位突然変異によって減少する。少なくとも１つの活性部位突然変異は、例えば少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換であり得る。

【0154】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においてジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの活性を減少させるべき場合、活性部位の一部を形成する、配列番号１１に示されるアミノ酸配列の５１～５４、７５、１１４～１１７、１４５、１５２～１５４、１７２、２６３、３０２および３１５位のいずれか１つに少なくとも１つの活性部位突然変異を生じさせることができる。オーソロガスポリペプチドの場合、少なくとも１つの活性部位突然変異は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列の５１～５４、７５、１１４～１１７、１４５、１５２～１５４、１７２、２６３、３０２および３１５位のいずれか１つに相当する位置にあり得る。幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、遺伝子ｆｏｌＣである。

【0155】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、配列番号５に示される核酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、配列番号５に示される核酸配列と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、配列番号５に示される核酸配列と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0156】

幾つかの実施形態によると、内在性遺伝子によってコードされるジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。幾つかの実施形態によると、内在性遺伝子によってコードされるジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。幾つかの実施形態によると、内在性遺伝子によってコードされるジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。

【0157】

本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現するように（さらに）改変されていてもよい。ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドは例えば、好ましくはラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）およびアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）から選択される、細菌または真菌に由来し得る。

【0158】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドは、配列番号２２または２３と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドは、配列番号２２または２３と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドは、配列番号２２または２３と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0159】

フォレート分子は、パラアミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）と、グルタミン酸の少なくとも１つの分子とに結合したグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）に由来する１つのプテリン部分を含有する。このように、フォレートのｄｅ ｎｏｖｏ生合成には、３つの前駆体：ＧＴＰ、ｐＡＢＡおよびグルタミン酸が必要とされる。

【0160】

フォレート生合成は、４つの連続工程でＧＴＰから６－ヒドロキシメチル－７，８－ジヒドロプテリンピロホスフェート（ＤＨＰＰＰ）への変換を経て進行する。最初の工程は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼＩ（ＥＣ ３．５．４．１６）（遺伝子ｆｏｌＥ／ｍｔｒＡ）によって触媒され、ＧＴＰの広範な変化を伴い、プテリン環構造が形成される。脱リン酸化に続いて、プテリン分子は、アルドラーゼ（ＥＣ ４．１．２．２５）（遺伝子ｆｏｌＢ）およびピロホスホキナーゼ反応（ＥＣ ２．７．６．３）（遺伝子ｆｏｌＫ）を受け、活性化されたピロリン酸化ＤＨＰＰＰが生成する。ジヒドロプテロイン酸シンターゼ（ＥＣ ２．５．１．１５）（遺伝子ｆｏｌＰ／ｓｕｌ）によって触媒されるパラアミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）とＤＨＰＰＰとの最初の縮合後に、ジヒドロプテロエートが生成する。第２の縮合は、ジヒドロ葉酸シンターゼ（ＤＨＦＳ）（ＥＣ ６．３．２．１２）（遺伝子ｆｏｌＣ）によるグルタメートとジヒドロプテロエートとの反応であり、ジヒドロフォレートが形成される。次いで、ＤＨＦは、ＤＨＦレダクターゼ－ＤＨＦＲ（ＥＣ １．５．１．３）（遺伝子ｆｏｌＡ／ｄｆｒＡ）によって生物学的に活性な補因子であるテトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）へと還元される。

【0161】

タンパク質ＧｌｙＡ、ＰｕｒＵ、ＹｉｔＪおよびＭｅｔＦがテトラヒドロフォレート相互変換経路にさらに関与する。テトラヒドロフォレート（ＴＨＦ）は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（遺伝子ｇｌｙＡ）（ＥＣ：２．１．２．１）によりセリンをグリシンに変換し、続いてメチル基をテトラヒドロフォレートに転移させることで、５，１０－メチレン－テトラヒドロフォレート（５，１０－ｍＴＨＦ）を形成することによって活性化され得る。５，１０－ｍＴＨＦは、細胞内のＣ１単位の主な供給源である。さらに、テトラヒドロフォレート相互変換では、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｙｉｔＪ遺伝子およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｍｅｔＦ遺伝子が、５－メチルテトラヒドロフォレートの最終的な形成をもたらす酵素である５，１０－メチレン－テトラヒドロフォレートレダクターゼ（ＥＣ １．５．１．２０）をコードする。

【0162】

さらに、酵素ＰｕｒＵは、１０－ホルミルテトラヒドロフォレートをＴＨＦへと変換し戻し、５－メチルテトラヒドロフォレート生合成にさらに利用可能とする上でホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ（ＥＣ ３．５．１．１０）として関与するため、これもテトラヒドロフォレート相互変換経路に重要である。

【0163】

【表1-1】

【表1-2】

【0164】

本発明者らは、微生物における５－メチル－ＴＨＦの生合成に関与する１つ以上の遺伝子（例えばｆｏｌＥ／ｍｔｒＡ、ｆｏｌＢ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＰ／ｓｕｌ、ｆｏｌＡ／ｄｆｒＡ、ｇｌｙＡ、ｐｕｒＵ、ｙｉｔＪおよびｍｅｔＦ）の導入または上方調節によっても５－メチル－ＴＨＦ、その塩、前駆体または中間体の産生能が顕著に増加し得ることを見出した。

【0165】

このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）またはその前駆体もしくは中間体の産生能が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して大幅に改善されるように（さらに）改変されていてもよい。５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）またはその前駆体もしくは中間体の産生能は例えば、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも５０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％または少なくとも５００００％増加し得る。

【0166】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも１つの酵素（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。

【0167】

５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つの遺伝子）の発現レベルは例えば、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも５０００％、少なくとも１００００％、少なくとも２００００％または少なくとも５００００％増加し得る。

【0168】

幾つかの実施形態によると、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチド、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチド、および５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドからなる群から選択される。

【0169】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0170】

幾つかの実施形態によると、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0171】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0172】

幾つかの実施形態によると、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0173】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0174】

幾つかの実施形態によると、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチル－ジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号９と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチル－ジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号９と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチル－ジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0175】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0176】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0177】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0178】

幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0179】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0180】

幾つかの実施形態によると、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７９と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７９と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号７９と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0181】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0182】

幾つかの実施形態によると、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８１と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８１と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８１と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0183】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加するように（さらに）改変されている。このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドの発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加していることがある。

【0184】

幾つかの実施形態によると、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８３と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８３と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８３と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0185】

幾つかの実施形態によると、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８４と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８４と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号８４と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0186】

幾つかの実施形態によると、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子はｆｏｌＥ／ｍｔｒＡ、ｆｏｌＢ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＰ／ｓｕｌ、ｆｏｌＡ／ｄｆｒＡ、ｇｌｙＡ、ｐｕｒＵ、ｙｉｔＪおよびｍｅｔＦからなる群から選択される。

【0187】

幾つかの実施形態によると、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、遺伝子組換え微生物に対して異種である。

【0188】

幾つかの実施形態によると、５－メチルフォレートの生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、好ましくはバチルス、エシェリキア、ラクトコッカス、シューワネラ、ビブリオおよびアシュビア属から選択される、細菌または真菌に由来する。

【0189】

幾つかの実施形態によると、５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｔｉｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュワネラ・ビオラセア（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｖｉｏｌａｃｅａ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）またはアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）から選択される細菌または真菌に由来する。

【0190】

本発明者らは、微生物における５－メチルテトラヒドロフォレートを代謝／消費する主要な酵素である５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子（例えば遺伝子ｍｅｔＥ）の下方調節または欠失によって、５－メチルテトラヒドロフォレート、その塩、前駆体または中間体の蓄積および産生能が顕著にさらに増加し得ることをさらに見出した。

【0191】

このように、本発明の遺伝子組換え微生物は、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルが、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように（さらに）改変されていてもよい。内在性遺伝子の発現レベルは例えば、それ以外は同一の微生物と比較して少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも１００％減少し得る。

【0192】

幾つかの実施形態によると、遺伝子組換え微生物は、発現レベルの減少をもたらす少なくとも１つの突然変異を５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子の調節領域に含む。例えば、調節領域における少なくとも１つの突然変異は、コードされるポリペプチドの発現レベルの減少をもたらす、プリブノーボックス（ＴＡＴＡＡＴ）配列に近接した（例えば、１または２ヌクレオチド上流または下流の）位置での少なくとも１つのヌクレオチド置換であり得る。特定の場合に応じて、例えば微生物がバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である場合、ヌクレオチド置換は、内在性遺伝子の開始コドンから１２ヌクレオチド上流にある位置であってもよい。少なくとも１つのヌクレオチド置換は、例えば或る種のプリンの別の種類のプリンでの（例えばグアニンからアデニンへの）置換であってもよい。

【0193】

幾つかの実施形態によると、遺伝子組換え微生物は、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子に動作可能に連結した内因性プロモーターを、内因性プロモーターと比較してＲＮＡポリメラーゼに対する親和性が弱い外因性プロモーターに置き換えることによって改変されている。当業者には理解されるように、ＲＮＡポリメラーゼに対する親和性が弱いほど、転写のレベルが減少し、ひいては微生物が産生する対応するポリペプチドのレベルが減少することになる。

【0194】

幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、例えば遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化されている。

【0195】

幾つかの実施形態によると、前記５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子をＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを微生物に導入または発現させることによって不活性化されている。内在性遺伝子を不活性化するために本発明に従って使用されるレアカットエンドヌクレアーゼは、例えば転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼであり得る。

【0196】

５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子を不活性化する方法の１つは、上述のようにＣＲＩＳＰＲｉシステムを使用することである。このように、幾つかの実施形態によると、前記５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、例えば触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質と、前記ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを微生物に導入または発現させることによって不活性化される。

【0197】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｔｉｓ）において前記５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子を阻害すべき場合、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、配列番号１０１またはその相補体の少なくとも２０個の連続ヌクレオチドを含み得る。

【0198】

幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現は、阻害によって減少する。

【0199】

５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記内在性ポリペプチドの発現の阻害は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の阻害性核酸分子の使用を伴う遺伝子サイレンシング技術によって発現を阻害することができる。

【0200】

幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記内在性ポリペプチドの発現は、前記ポリペプチドをコードする内在性遺伝子の転写抑制および／または翻訳抑制によって減少する（例えば阻害される）。

【0201】

幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する前記内在性ポリペプチドの発現は、阻害性核酸分子を微生物に導入または発現させることによって阻害される。例えば、阻害性核酸分子は、微生物において前記阻害性核酸分子の産生を引き起こすように機能するプロモーター、例えば誘導性プロモーターに操作可能に連結した、前記阻害性核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子によって導入することができる。好適には、阻害性核酸分子は、内在性ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）ものである。

【0202】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムまたは干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。好ましくは、かかる核酸分子は、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡの相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含む。

【0203】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現を阻害すべき場合、かかる阻害性核酸分子は、配列番号１０１の相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含み得る。

【0204】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズする（例えば結合する）核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）である。

【0205】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は、ハンマーヘッド型リボザイム等のリボザイムである。リボザイム分子は、ポリペプチドの翻訳を防ぐためにｍＲＮＡ転写産物を触媒的に切断するように設計されている。

【0206】

幾つかの実施形態によると、阻害性核酸分子は干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）分子である。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｍｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｉＲＮＡである。幾つかの実施形態によると、ＲＮＡｉ分子はｓｈＲＮＡである。

【0207】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現を阻害すべき場合、ＲＮＡｉ分子は、配列番号１０１に相補的な干渉ＲＮＡであり得る。ＲＮＡｉ分子は、配列番号１０１の相補体の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドを含むリボ核酸分子であってもよい。ＲＮＡｉ分子は、配列番号１０１の２０～２５、例えば２１～２３個の連続ヌクレオチドと同一の第１の鎖と、前記第１の鎖に相補的な第２の鎖とを含む二本鎖リボ核酸分子であってもよい。

【0208】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物は、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの活性が、前記改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少するように改変されている。

【0209】

５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの活性の減少は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、活性の低下または喪失をもたらす１つ以上の突然変異をポリペプチドの活性部位に導入することによって活性を減少させることができる。このように、幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの活性が、活性の低下または喪失をもたらす少なくとも１つの活性部位突然変異によって減少する。少なくとも１つの活性部位突然変異は、例えば少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換であり得る。

【0210】

例としては、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの活性を減少させるべき場合、活性部位の一部を形成する、配列番号１００に示されるアミノ酸配列の１８、２１、１１２、１１７、１１９、４３５～４３７、４８８、４９４、５１９～５２１、５６５、６０１、６０３、６０５、６４５、６４７、６６９、７３０および７３１位のいずれか１つに少なくとも１つの活性部位突然変異を生じさせることができる。オーソロガスポリペプチドの場合、少なくとも１つの活性部位突然変異は、配列番号１００に示されるアミノ酸配列の１８、２１、１１２、１１７、１１９、４３５～４３７、４８８、４９４、５１９～５２１、５６５、６０１、６０３、６０５、６４５、６４７、６６９、７３０および７３１位のいずれか１つに相当する位置にあり得る。幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、遺伝子ｍｅｔＥである。

【0211】

幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、配列番号１０１に示される核酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、配列番号１０１に示される核酸配列と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。幾つかの実施形態によると、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子は、配列番号１０１に示される核酸配列と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0212】

幾つかの実施形態によると、内在性遺伝子によってコードされる５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１００に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも８０、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。幾つかの実施形態によると、内在性遺伝子によってコードされる５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１００に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。

【0213】

幾つかの実施形態によると、内在性遺伝子によってコードされる５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号１００に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸を含む。

【0214】

概して、本明細書で言及される微生物は、単細胞または多細胞の微生物、例えば細菌または酵母を含む任意の好適な微生物であり得る。

【0215】

細菌性微生物は、グラム陽性またはグラム陰性細菌であり得る。グラム陰性細菌の非限定的な例としては、エシェリキア、エルウィニア、クレブシエラおよびサイトロバクター属からの種が挙げられる。グラム陽性細菌の非限定的な例としては、バチルス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ゲオバチルス、ペディオコッカス、モーレラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、ストレプトマイセス、ストレプトコッカスおよびセルロモナス属からの種が挙げられる。

【0216】

幾つかの実施形態によると、微生物は細菌であり、バチルス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、クロストリジウム、コリネバクテリウム、ゲオバチルス、ストレプトコッカス、ペディオコッカス、モーレラ、シュードモナス、ストレプトマイセス、エシェリキア、シゲラ、アシネトバクター、サイトロバクター、サルモネラ、クレブシエラ、エンテロバクター、エルウィニア、クライベラ、セラチア、セデセア、モーガネラ、ハフニア、エドワージエラ、プロビデンシア、プロテウスまたはエルシニア属の細菌であり得る。

【0217】

幾つかの実施形態によると、微生物はエシェリキア属の細菌である。エシェリキア属の細菌の非限定的な例は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。幾つかの実施形態によると、微生物はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。

【0218】

幾つかの実施形態によると、微生物はバチルス属の細菌である。バチルス属の細菌の非限定的な例は、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｔｌｉｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）およびバチルス・モジャベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｊａｖｅｎｓｉｓ）である。幾つかの実施形態によると、微生物はバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｔｌｉｓ）である。

【0219】

酵母細胞は、例えばサッカロミセス、ピキア、シゾサッカロミセス、ジゴサッカロミセス、ハンセヌラ、パキソレン、クルイベロミセス、デバリオミセス、ヤロウイア、カンジダ、クリプトコッカス、コマガタエラ、リポミセス、ロドスポリジウム、ロドトルラまたはトリコスポロンに由来し得る。

【0220】

幾つかの実施形態によると、微生物はサッカロミセス属の酵母である。サッカロミセス属の酵母の非限定的な例は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。或る特定の実施形態によると、微生物はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。

【0221】

上述のように、本発明の遺伝子組換え微生物は、本明細書に詳述するように１つ以上のポリペプチドを発現するように改変されてもよく、すなわち、前記ポリペプチド（単数または複数）をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む１つ以上の外因性核酸分子、例えばＤＮＡ分子が微生物に導入されている。ＤＮＡ分子等の外因性核酸分子を様々な宿主細胞に導入する手法は、当業者に既知であり、形質転換（例えば、熱ショックまたは自然形質転換）、トランスフェクション、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよび微粒子ボンバードメントが挙げられる。

【0222】

したがって、本発明の遺伝子組換え微生物は、本明細書に詳述するようにポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸分子を含み得る。微生物におけるポリペプチドの発現を促進するために、外因性核酸分子は、宿主細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能し、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結したプロモーター等の好適な調節要素を含んでいてもよい。本発明に従って有用なプロモーターは、所与の宿主細胞においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能する任意の既知のプロモーターである。多くのかかるプロモーターが当業者に既知である。かかるプロモーターとしては、通常は他の遺伝子と関連するプロモーター、および／または任意の細菌、酵母、真菌、藻類もしくは植物の細胞から単離されたプロモーターが挙げられる。タンパク質発現のためのプロモーターの使用は、一般に分子生物学の当業者に既知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989を参照されたい。外因性核酸分子は、プロモーターに加えて５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）および３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）から選択される少なくとも１つの調節要素をさらに含んでいてもよい。原核生物および真核生物に由来する多くのかかる５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲが当業者に既知である。

【0223】

外因性核酸分子は、ベクターまたはベクターの一部、例えば発現ベクターであり得る。通常、かかるベクターは、微生物において染色体外に留まり、すなわち微生物の核または核様体領域の外に見られる。外因性核酸分子が宿主細胞のゲノムに安定に組み込まれることも本発明により企図される。例えば相同組換えにより微生物のゲノムに安定に組み込むための手段が当業者に既知である。

【0224】

遺伝子組換え微生物に関して本明細書で与えられる詳細が本発明の他の態様、特に以下により詳細に記載される本発明による方法に当てはまることが理解される。

【0225】

本発明の方法
第２の態様では、本発明は、フォレート、その前駆体または中間体を調製する方法を提供する。特に、フォレート、その前駆体または中間体を調製する方法は、
ｉ）本発明による遺伝子組換え微生物を好適な培養条件下にて培養培地中で培養し、前記フォレート、その前駆体または中間体を含有する発酵産物を得ることと、ｉｉ）任意に前記フォレート、その前駆体または中間体を分離および／または精製することとを含む。

【0226】

用いられる培地は、問題の宿主細胞の培養に適した任意の従来の培地とすることができ、従来技術の原理に従って構成され得る。培地は通常、それぞれの宿主細胞の成長および生存に必要とされる全ての栄養素、例えば炭素源および窒素源、ならびに他の無機塩を含有する。好適な培地、例えば最少培地または複合培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、または公表されているレセプト、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）の菌株カタログに従って調製することができる。当業者に既知の非限定的な標準培地としては、ルリアベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、ＭＳブロス、酵母ペプトンデキストロース、ＢＭＭＹ、ＧＭＭＹまたは酵母麦芽エキス（ＹＭ）ブロスが挙げられ、全て市販されている。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等の細菌細胞の培養に適した培地の非限定的な例としては、最少培地および富栄養培地、例えばルリアブロス（ＬＢ）、Ｍ９培地、Ｍ１７培地、ＳＡ培地、ＭＯＰＳ培地、テリフィックブロス、ＹＴ等が挙げられる。酵母細胞等の真核細胞の培養に適した培地は、ＲＰＭＩ １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭであり、いずれも培養される特定の宿主細胞の必要に応じて血清および／または成長因子を添加してもよい。また、真核細胞の培養のための培地は、酵母最少培地等の任意の種類の最少培地とすることができる。

【0227】

それぞれの微生物の培養に適した条件は、当業者に既知である。通例、遺伝子組換え微生物は３２～約４２℃の範囲、好ましくは３４～３９℃の範囲、より好ましくは３６～３９℃の範囲の温度、例えば約３７℃で培養される。培地のｐＨは６～８の範囲、好ましくは６．５～７．５の範囲、より好ましくは６．８～７．２の範囲とすることができる。工程ｉ）における培養は、１０～７０時間の範囲、好ましくは２４～６０時間の範囲、より好ましくは３６～５０時間の範囲の期間にわたって行うことができる。

【0228】

方法は、ｉｉ）前記フォレート、その前駆体または中間体を分離および／または精製することをさらに含み得る。フォレート、その前駆体または中間体は、培地から化学化合物を単離および精製するための任意の従来の方法によって分離および／または精製することができる。既知の精製手順としては、遠心分離または濾過、沈殿、およびクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等が挙げられる。

【0229】

本発明の方法によって調製されるフォレートは、好ましくは、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式Ｉ：

【化5】

の化合物である。

【0230】

前記一般式（Ｉ）において、ａが単結合である場合にａ’が存在せず、またはａ’が単結合である場合にａが存在しないことが意図される。

【0231】

或る特定の実施形態によると、本発明の方法によって調製されるフォレートは、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式ＩＩ：

【化6】

の化合物（５－メチルテトラヒドロフォレート）である。

【0232】

特定の実施形態によると、本発明の方法によって調製されるフォレートは、式ＩＩａ：

【化7】

の化合物（Ｌ－５－メチルテトラヒドロフォレート；（６Ｓ）－５－メチルテトラヒドロフォレート）である。

【0233】

或る特定の実施形態によると、本発明の方法によって調製されるフォレートは、任意に立体異性体、好ましくはエナンチオマーまたはジアステレオマーの１つの形態、ラセミ体の形態、または任意の混合比での立体異性体、好ましくはエナンチオマーおよび／もしくはジアステレオマーの少なくとも２つの混合物の形態の式ＩＩＩ：

【化8】

の化合物（５－メチルジヒドロフォレート）である。

【0234】

本発明者らはまた、驚くべきことに、前記のように得られた株の培養中にパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を添加することで、フォレート、その塩、前駆体または中間体の産生能が顕著にさらに増加し得ることを見出した。このように、幾つかの実施形態によると、方法は、培養工程（ｉ）の間にパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を添加する工程をさらに含む。

【0235】

パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）は、例えばパラアミノ安息香酸カリウム、パラアミノ安息香酸ナトリウム、パラアミノ安息香酸メチル、パラアミノ安息香酸エチル、パラアミノ安息香酸ブチルまたはそれらの組合せからなる群から選択されるＰＡＢＡであり得る。

【0236】

幾つかの実施形態によると、方法は、工程（ｉ）または（ｉｉ）において得られた生成物を酸性またはアルカリ性条件に供し、誘導体化合物をさらに得ることをさらに含む。

【0237】

更なる態様では、本発明は、本発明の遺伝子組換え微生物を作製する方法を提供する。特に、本発明の遺伝子組換え微生物を作製する方法は、下記工程（ａ）～（ｄ）：
（ａ）５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する少なくとも１つ（例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つまたは少なくとも８つ）の酵素の発現レベルを、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加させる工程、
（ｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有する内在性ポリペプチドの発現および／もしくは活性を、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程、
（ｃ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有する内在性ポリペプチドの発現および／もしくは活性を、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程、ならびに／または
（ｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現させる工程
のいずれか１つ（例えば全て）を含む。

【0238】

幾つかの実施形態によると、方法は下記工程（ａ）および（ｂ）：
（ａ）５－メチルフォレートの生合成に関与する少なくとも１つの酵素の発現レベルを、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して増加させる工程、および
（ｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルを、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程
のいずれか１つを含み、任意に下記工程（ｃ）および（ｄ）：
（ｃ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子の発現レベルを、それ以外は同一の微生物（参照微生物）と比較して減少させる工程、ならびに
（ｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドを発現させる工程
をさらに含む。

【0239】

幾つかの実施形態によると、本発明の遺伝子組換え微生物を作製する方法は、ａａ）５－メチルフォレート（例えば５－メチル－テトラヒドロフォレート）の生合成に関与する酵素をコードする核酸配列を含む少なくとも１つの外因性核酸分子を前記微生物に導入する工程、ｂｂ）５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子を、例えば遺伝子配列の一部もしくは全体を欠失させることによって不活性化するか、もしくは前記内在性遺伝子の調節領域に、発現レベルの減少をもたらす少なくとも１つの突然変異を導入する工程、ｃｃ）前記微生物において、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドをコードする内在性遺伝子を、例えば遺伝子配列の一部もしくは全体を欠失させることによって不活性化する工程、ならびに／またはｄｄ）ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有する異種ポリペプチドをコードする核酸配列を含む外因性核酸分子を前記微生物に導入する工程を含む。

【0240】

或る特定の定義
本明細書で使用される５－メチルフォレートは、５－メチルテトラヒドロフォレートおよび５－メチルジヒドロフォレートのいずれか１つを意味し、その任意の立体異性体形態およびプロトン化（酸）または脱プロトン化（塩）形態を含む。

【0241】

「５－メチルフォレートを産生する能力」という表現は、細菌等の微生物が、微生物を培地中で培養した場合に５－メチルフォレートを産生、排出もしくは分泌し、かつ／または培養培地もしくは微生物中に５－メチルフォレートを蓄積させることができることを意味する。微生物は、５－メチルフォレートを生じる生合成経路に関与する全ての酵素を発現する場合に、５－メチルフォレートを産生する能力を有するとみなすことができる。

【0242】

「５－メチル－テトラヒドロフォレート（５－メチル－ＴＨＦ）を産生する能力」という表現は、細菌等の微生物が、微生物を培地中で培養した場合に５－メチル－ＴＨＦを産生、排出もしくは分泌し、かつ／または培養培地もしくは微生物中に５－メチル－ＴＨＦを蓄積させることができることを意味する。微生物は、５－メチル－ＴＨＦを生じる生合成経路に関与する全ての酵素を発現する場合に、５－メチル－ＴＨＦを産生する能力を有するとみなすことができる。

【0243】

本明細書で使用される場合、「ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチド」は、反応：ＡＴＰ＋７，８－ジヒドロプテロエート＋Ｌ－グルタメート＜＝＞ＡＤＰ＋ホスフェート＋７，８－ジヒドロプテロイルグルタメート（ＥＣ ６．３．２．１２）および反応：ＡＴＰ＋テトラヒドロプテロイル－（ガンマ－Ｇｌｕ）（ｎ）＋Ｌ－グルタメート＜＝＞ＡＤＰ＋ホスフェート＋テトラヒドロプテロイル－（ガンマ－Ｇｌｕ）（ｎ＋１）（ＥＣ ６．３．２．１７）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｆｏｌＣによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｆｏｌＣに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ２８０８０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３９０６８６．１も参照されたい。

【0244】

本明細書で使用される場合、「ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有するポリペプチド」は、反応：ＡＴＰ＋７，８－ジヒドロプテロエート＋Ｌ－グルタメート＜＝＞ＡＤＰ＋ホスフェート＋７，８－ジヒドロプテロイルグルタメート（ＥＣ ６．３．２．１２）のみを触媒するポリペプチドを意味する。例えば、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性のみを有するポリペプチドは、例えばアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）に見られる遺伝子ｆｏｌＣ２によってコードされる。例えばアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）のｆｏｌＣ２に関する更なる情報は、それぞれＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＡＧＯＳ＿ＡＥＬ３１０ＣおよびＬｒｅｕ＿１２７７で利用可能である。アミノ酸配列については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿９８４５５０．１（アシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ））およびＷＰ＿００３６６８５２６．１（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ））も参照されたい。

【0245】

本明細書で使用される場合、「ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：ＧＴＰ＋Ｈ（２）Ｏ＜＝＞ホルメート＋２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－（エリスロ－１，２，３－トリヒドロキシプロピル）－ジヒドロプテリジントリホスフェート（ＥＣ ３．５．４．１６）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、ＧＴＰシクロヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｆｏｌＥによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｆｏｌＥに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ２２７８０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３９０１５９．１も参照されたい。

【0246】

本明細書で使用される場合、「７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：７，８－ジヒドロネオプテリン＜＝＞６－ヒドロキシメチル－７，８－ジヒドロプテリン＋グリコールアルデヒド（ＥＣ ４．１．２．２５）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、７，８－ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｆｏｌＢによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｆｏｌＢに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ００７８０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３８７９５９．１も参照されたい。

【0247】

本明細書で使用される場合、「２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：ＡＴＰ＋６－ヒドロキシメチル－７，８－ジヒドロプテリン＜＝＞ＡＭＰ＋６－ヒドロキシメチル－７，８－ジヒドロプテリンジホスフェート（ＥＣ ２．７．６．３）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、２－アミノ－４－ヒドロキシ－６－ヒドロキシメチルジヒドロプテリジンピロホスホキナーゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｆｏｌＫによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｆｏｌＫに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ００７９０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３８７９６０．１も参照されたい。

【0248】

本明細書で使用される場合、「ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：６－ヒドロキシメチル－７，８－ジヒドロプテリンジホスフェート＋４－アミノベンゾエート＜＝＞ジホスフェート＋ジヒドロプテロエート（ＥＣ ２．５．１．１５）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｆｏｌＰによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｆｏｌＰに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ００７７０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３８７９５８．１も参照されたい。

【0249】

本明細書で使用される場合、「ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：５，６，７，８－テトラヒドロフォレート＋ＮＡＤＰ（＋）＜＝＞７，８－ジヒドロフォレート＋ＮＡＤＰＨ（ＥＣ １．５．１．３）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｆｏｌＡによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｆｏｌＡに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ２１８１０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３９００６４．１も参照されたい。

【0250】

本明細書で使用される場合、「セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：５，１０－メチレンテトラヒドロフォレート＋グリシン＋Ｈ（２）Ｏ＜＝＞テトラヒドロフォレート＋Ｌ－セリン（ＥＣ ２．１．２．１）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｇｌｙＡによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｇｌｙＡに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ３６９００で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３９１５７１．１も参照されたい。

【0251】

本明細書で使用される場合、「ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：１０－ホルミルテトラヒドロフォレート＋Ｈ（２）Ｏ＜＝＞ホルメート＋テトラヒドロフォレート（ＥＣ ５．５．１．１０）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｐｕｒＵによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｕｒＵに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ１３１１０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３８９１９４．２も参照されたい。

【0252】

本明細書で使用される場合、「５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：５－メチルテトラヒドロフォレート＋ＮＡＤ（Ｐ）（＋）＜＝＞５，１０－メチレンテトラヒドロフォレート＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ＥＣ １．５．１．２０）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｙｉｔＪによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｙｉｔＪに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ１１０１０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３８８９８２．１も参照されたい。例えば、５，１０－メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に見られる遺伝子ｍｅｔＦによってコードされる。例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｍｅｔＦに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ｂ３９４１で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿４１８３７６．１も参照されたい。

【0253】

本明細書で使用される場合、「５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド」は、反応：５－メチルテトラヒドロプテロイルｔｒｉ－Ｌ－グルタメート＋Ｌ－ホモシステイン＜＝＞テトラヒドロプテロイルｔｒｉ－Ｌ－グルタメート＋Ｌ－メチオニン（ＥＣ ２．１．１．１４）を触媒するポリペプチドを意味する。例えば、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に見られる遺伝子ｍｅｔＥによってコードされる。例えばバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｍｅｔＥに関する更なる情報は、ＫＥＧＧ（https://www.kegg.jp/kegg/genes.html）にてアクセッション番号ＢＳＵ１３１８０で利用可能である。アミノ酸配列（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））については、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿３８９２０１．２も参照されたい。

【0254】

本明細書で遺伝子または核酸分子の文脈において使用される「異種」または「外因性」は、それが存在する微生物のゲノムの一部として天然に存在しない、または天然に存在する場合とは異なるゲノム内の位置（単数または複数）に見られる遺伝子または核酸分子（すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ分子）を指す。このように、「異種」または「外因性」の遺伝子または核酸分子は、微生物に対して内因性ではなく、微生物に外因的に導入されたものである。「異種」遺伝子または核酸分子のＤＮＡ分子は、宿主ＤＮＡとして異なる生物、異なる種、異なる属または異なる界に由来し得る。

【0255】

本明細書でポリペプチド（例えば酵素）の文脈において使用される「異種」は、ポリペプチドが通常は宿主微生物に見られず、または宿主微生物によって作製（すなわち発現）されず、異なる生物、異なる種、異なる属または異なる界に由来することを意味する。

【0256】

本明細書で使用される場合、「オーソログ」という用語は、共通の祖先遺伝子に由来するが、異なる種に存在する遺伝子、それによりコードされる核酸分子、すなわちｍＲＮＡ、またはそれによりコードされるタンパク質を指す。

【0257】

遺伝子の「発現レベルの減少」とは、遺伝子組換え微生物が産生する転写産物の量、それぞれ前記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物と比較して減少することを意味する。より詳細には、遺伝子の「発現レベルの減少」とは、遺伝子組換え微生物が産生する転写産物の量、それぞれ前記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも１００％減少する。遺伝子発現のレベルは、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって決定することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子によってコードされるポリペプチドの量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティング等を含む既知の方法によって測定することができる。

【0258】

遺伝子の発現は、遺伝子によってコードされるポリペプチドの細胞内活性が、前記突然変異を有しないが、それ以外は同一の微生物と比較して減少するように、微生物のゲノム内の遺伝子に突然変異を導入することによって減少させることができる。遺伝子の発現の減少をもたらす突然変異としては、遺伝子によってコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸置換を引き起こす１ヌクレオチド以上の置換（ミスセンス突然変異）、終止コドンの導入（ナンセンス突然変異）、フレームシフトを引き起こすヌクレオチドの欠失もしくは挿入、薬剤耐性遺伝子の挿入、または遺伝子の一部もしくは遺伝子全体の欠失が挙げられる（Qiu and Goodman, 1997；Kwon et al., 2000）。プロモーター、シャイン－ダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列の改変等によっても発現を減少させることができる。遺伝子の発現は、「λ－レッド媒介遺伝子置換」等の遺伝子置換によって減少させることもできる（Datsenko and Wanner, 2000）。λ－レッド媒介遺伝子置換は、本明細書に記載される１つ以上の遺伝子を不活性化する特に好適な方法である。

【0259】

「不活性化する」、「不活性化」および「不活性化した」は、遺伝子の文脈において使用される場合、問題の遺伝子がもはや機能性タンパク質を発現しないことを意味する。遺伝子配列の一部もしくは全体の欠失、遺伝子のリーディングフレームの移動、ミスセンス／ナンセンス突然変異の導入、または遺伝子発現を制御する配列、例えばプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター、リボソーム結合部位等を含む遺伝子の隣接領域の改変のために改変ＤＮＡ領域が遺伝子を天然に発現することができない可能性がある。好ましくは、対象の遺伝子は、遺伝子置換等による遺伝子配列の一部または全体の欠失によって不活性化される。不活性化は、対象の遺伝子をＤＮＡ切断、好ましくは二本鎖切断により選択的に不活性化することが可能なレアカットエンドヌクレアーゼを導入または発現させることによっても達成され得る。本発明の文脈における「レアカットエンドヌクレアーゼ」としては、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼが挙げられる。

【0260】

微生物、例えば細菌のゲノム内の遺伝子の有無は、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって検出することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥに続くイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング分析）等を含む既知の方法によって測定することができる。

【0261】

遺伝子の「発現レベルの増加」とは、遺伝子組換え微生物が産生する転写産物の量、それぞれ前記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物と比較して増加することを意味する。より詳細には、遺伝子の「発現レベルの増加」とは、遺伝子組換え微生物が産生する転写産物の量、それぞれ前記遺伝子によってコードされるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。遺伝子発現のレベルは、ＰＣＲ、サザンブロッティング等を含む既知の方法によって決定することができる。加えて、遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量ＲＴ－ＰＣＲ等を含む様々な既知の方法を用いて、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することで推定することができる。遺伝子によってコードされるポリペプチドの量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティング等を含む既知の方法によって測定することができる。

【0262】

ポリペプチドの「発現レベルの増加」とは、遺伝子組換え微生物が産生する問題のポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物と比較して増加することを意味する。より詳細には、ポリペプチドの「発現レベルの増加」は、遺伝子組換え微生物が産生する問題のポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物と比較して少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％または少なくとも約１００００％増加することを意味する。所与の細胞において産生されるポリペプチドの量は、当該技術分野で既知の任意の好適な定量化法、例えばＥＬＩＳＡ、免疫組織化学またはウエスタンブロッティングによって決定することができる。

【0263】

ポリペプチド発現の増加は、当業者に既知の任意の好適な手段によって達成することができる。例えば、ポリペプチド発現の増加は、微生物においてポリペプチドをコードする遺伝子（単数または複数）のコピー数を増加させること、例えば微生物においてｍＲＮＡ分子の産生を引き起こすように機能するプロモーターに操作可能に連結した、ポリペプチドをコードする遺伝子（単数または複数）を含む外因性核酸、例えばベクターを微生物に導入することによって達成され得る。ポリペプチド発現の増加は、ポリペプチドをコードする遺伝子（単数または複数）の少なくとも第２のコピーを微生物のゲノムに組み込むことによって達成され得る。ポリペプチド発現の増加は、ポリペプチドをコードする遺伝子（単数または複数）に操作可能に連結したプロモーターの強度を増大させることによっても達成することができる。ポリペプチド発現の増加は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子上のリボソーム結合部位を改変することによっても達成することができる。リボソーム結合部位の配列を改変することで、翻訳開始速度を高め、それにより翻訳効率を向上させることができる。

【0264】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド（例えば、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドまたは５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド）の発現が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変微生物における前記ポリペプチドの発現が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（対照）における前記ポリペプチドの発現と比較して低下することを意味する。改変微生物におけるポリペプチドの発現は、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（対照）における前記ポリペプチドの発現と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数（例えば６％、７％、８％等）の任意のパーセンテージで低下し得る。より詳細には、ポリペプチドの発現が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、微生物におけるポリペプチドの量が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（対照）における前記ポリペプチドの量と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数（例えば６％、７％、８％等）の任意のパーセンテージで低下することを意味する。微生物におけるポリペプチドの発現または量は、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学、ウエスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー等の手法を含む当該技術分野で既知の任意の好適な手段によって決定することができる。

【0265】

本明細書で使用される場合、ポリペプチド（例えば、ジヒドロ葉酸シンターゼ活性およびホリルポリグルタミン酸シンテターゼ活性の両方を有するポリペプチドまたは５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸－ホモシステインＳ－メチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド）の活性が「減少した」、「減少する」またはその「減少」とは、改変微生物における前記ポリペプチドの触媒活性が、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（対照）における前記ポリペプチドの触媒活性と比較して低下することを意味する。改変微生物におけるポリペプチドの活性は、改変を有しないが、それ以外は同一の微生物（対照）における前記ポリペプチドの発現と比較して少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％もしくは１００％、または１０％～１００％の整数（例えば６％、７％、８％等）の任意のパーセンテージで低下し得る。微生物におけるポリペプチドの活性は、任意の好適なタンパク質および酵素活性アッセイによって決定することができる。

【0266】

本明細書で使用される場合、遺伝子の「調節領域」は、コード配列の発現に影響を与える核酸配列を指す。調節領域は、当該技術分野で既知であり、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、マトリックス付着領域、および／またはコード配列の発現を調節する他の要素が挙げられるが、これらに限定されない。

【0267】

本明細書で使用される場合、「発現」は転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含むが、これらに限定されない、ポリペプチド（例えば、コードされる酵素）の産生に関与する任意の工程を含む。

【0268】

「置換」または「置換された」は、或るアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置き換えることによるポリペプチドの改変を指し、例えばポリペプチド配列中のセリン残基をグリシンまたはアラニン残基で置き換えることは、アミノ酸置換である。ポリヌクレオチドに関して使用される場合、「置換」または「置換された」は、或るヌクレオチドを別のヌクレオチドで置き換えることによるポリヌクレオチドの改変を指す。例えば、ポリヌクレオチド配列中のシトシンをチミンで置き換えることは、ヌクレオチド置換である。

【0269】

「非保存的置換」は、ポリペプチドに関して使用される場合、ポリペプチド中のアミノ酸を側鎖の特性が顕著に異なるアミノ酸で置換することを指す。非保存的置換では、定義された基の中ではなく、その間のアミノ酸を使用することができ、（ａ）置換（例えば、グリシンの代わりにセリン）の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さに影響を与える。例として、限定されるものではないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小型のアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。

【0270】

「配列同一性のパーセンテージ」、「％配列同一性」および「パーセント同一性」は、本明細書においてアミノ酸配列と参照アミノ酸配列との間の比較を指すために使用される。本明細書で使用される「％配列同一性」は、２つのアミノ酸配列から以下のように算出される：Genetic Computing GroupのＧＡＰ（グローバルアラインメントプログラム）バージョン９を用い、デフォルトのＢＬＯＳＵＭ６２行列を－１２のギャップオープンペナルティ（ギャップの最初のヌルに対する）および－４のギャップ伸長ペナルティ（ギャップ内の追加の各ヌルに対する）で用いて配列をアラインメントする。アラインメント後に、参照アミノ酸配列中のアミノ酸の数に対するパーセンテージとしてマッチの数を表すことによって、パーセンテージ同一性を算出する。

【0271】

数値の限界または範囲が本明細書において定められる場合、端点が含まれる。また、数値の限界または範囲内の全ての値および部分範囲は、明示的に書き出されるかのように具体的に含まれる。

【0272】

本発明を一般的に説明したが、例示のみを目的として本明細書に提示され、特に指定のない限り、限定を意図するものではない或る特定の具体例を参照することによって更なる理解を得ることができる。

【0273】

実施例
実施例１：バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムにおけるフォレート生合成遺伝子の同定
フォレート生合成経路に関与する遺伝子および酵素は、文献中で知られており、ＫＥＧＧデータベース（www.genome.jp/kegg/pathway.html）に詳細に記載されている。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の重要なフォレート生合成遺伝子のヌクレオチド配列およびタンパク質配列を、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムおよびタンパク質データベースを調査することによって得た。フォレート生合成遺伝子および酵素の配列を「クエリー」として導入し、対応するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）配列を「ヒット」として同定した。フォレート生合成遺伝子の配列を下記表２に示す。

【0274】

【表2-1】

【表2-2】

【0275】

実施例２：バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に最適化された葉酸生合成のための合成遺伝子の合成
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるタンパク質発現を改善するために、アミノ酸配列（配列番号７、８、９、１０、１２、７９、８１および８３）を遺伝子コドン最適化（IDT Integrated DNA TechnologiesのＣｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌ）に使用した。合成されるＤＮＡフラグメント（それぞれ配列番号１３、１４、１５、１６、１７、９１、９２および９３）は、ＲＢＳ配列、遺伝子過剰発現のための調節プロモーター配列（例えば配列番号３８のｐ１５）、また葉酸オペロン発現カセットの更なるアセンブリに必要とされる短いアダプター配列を両末端に付加して設計した。

【0276】

実施例３：葉酸オペロンのアセンブリ
・バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子からアセンブリした葉酸オペロン
ＤＮＡフラグメント（配列番号１３、１４、１５、１６および１７）として合成したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子の重要なフォレート生合成遺伝子を葉酸オペロン（ＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ２）のアセンブリに使用した。葉酸オペロンをＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムに組み込むために、ｌａｃＡ相同性およびエリスロマイシン選択可能マーカーを有する２つの付加的なＤＮＡフラグメント（配列番号１８および１９）を設計し、安定したゲノム組込みのために合成した。

【0277】

葉酸オペロンアセンブリの最初の工程では、別個のＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅は、プライマーの特定のセット（配列番号１３のフラグメントについては配列番号２６および配列番号２７のプライマー対；配列番号１７のフラグメントについては配列番号３２および配列番号２８のプライマー対；配列番号１５のフラグメントについては配列番号３３および配列番号２９のプライマー対；配列番号１６のフラグメントについては配列番号３４および配列番号３０のプライマー対；配列番号１４のフラグメントについては配列番号３５および配列番号３１のプライマー対）を用いて行った。

【0278】

フラグメントは、EppendorfのサイクラーおよびＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）を用い、２００μＭ ｄＮＴＰ、５％ＤＭＳＯ、０．５μＭの各プライマーおよびおよそ２０ｎｇの鋳型を添加した製造業者により提供されるバッファーを５０μｌの最終容量で用いて、３２サイクル増幅した。

【0279】

使用したプログラム：９８℃で２分
（９８℃で３０秒、６５℃で１５秒、７２℃で３０秒）を３２サイクル
７２℃で５分
１０℃ホールド

【0280】

各フラグメントのＰＣＲを０．８％アガロースゲルで行い、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲクリーニングキット（Promega）で提供されるプロトコルによってゲルからクリーニングした。制限およびライゲーションの繰り返し工程により、フラグメントを人工フォレートオペロンにアセンブリした。ライゲーションの成功に適合した制限末端を確実にするために、ＮｄｅＩおよびＡｓｅＩ制限部位の組合せを使用した。ライゲーションの各工程の後に、組み合わせたフラグメントを次のＰＣＲ増幅に新たな鋳型として使用した。５μｌのＦＤ ｇｒｅｅｎバッファー、３μｌの選択酵素およびおよそ１５００ｎｇのＰＣＲフラグメントを添加して５０μｌ容量で制限を行った。フラグメントを制限後にＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍでクリーニングし、最初の２つをライゲーションに使用した。２．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）を製造業者により提供されるバッファーとともに、５％ＰＥＧ ４０００を添加し、両方のフラグメントを１：１のモル比で最終容量１５μｌとして使用した。次の工程では、１μｌの不活性化ライゲーションを鋳型として、配列番号２６および配列番号２８のプライマー、ならびに同じプログラム（伸長時間をより長くする）、ならびに上で使用したミックスを用いる新たな５０μＬのＰＣＲに使用した。ＰＣＲを０．８％アガロースゲルで行い、フラグメントをゲルから切り出し、クリーニングした。クリーニングした新たなフラグメント（配列番号１３および配列番号１７のアセンブリ）をＡｓｅＩ制限酵素で切断し、更なるクリーニング後に、既にＮｄｅＩで切断し、その後クリーニングした第３のフラグメント（配列番号１５）とのライゲーションに使用した。ライゲーションを鋳型とした新たなＰＣＲに続いて、同じプロトコルによってフラグメント４および５を追加し、最大５つのフォレート生合成遺伝子のフラグメントを作製した。

【0281】

株ＦＬ７２２を生成するために、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子からアセンブリした構築葉酸オペロン（図４に示す）を形質転換に使用し（実施例５を参照されたい）、培養後に全フォレートの測定を行った（実施例１２を参照されたい）を参照されたい。

【0282】

・ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）遺伝子に由来する葉酸オペロン
ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）オペロンＦＯＬ－ＯＰ－ＬＬ（配列番号４９）からの異種遺伝子（ｆｏｌＡ、ｃｌｐＸ、ｙｓｘＬ、ｆｏｌＢ、ｆｏｌＥ、ｆｏｌＰ、ｙｌｇＧおよびｆｏｌＣ）をＰＣＲによって増幅し、単離されたゲノムＤＮＡを鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅用のプライマーを２つの別個のＰＣＲ反応のために設計し、第１のＰＣＲ反応では、プライマー（配列番号４５および配列番号４６）をゲノムＤＮＡからの遺伝子の特異的増幅に使用し、第２のＰＣＲ反応では、プライマー（配列番号４７および配列番号４８）を用いて、さらに制限部位（ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ）をオペロンの両末端に導入した。ＰＣＲ産物を低コピーベクターｐＦＯＬ１にサブクローニングし、強力な構成的プロモーターＰ_１５（配列番号３８）をＦＯＬ－ＯＰ－ＬＬオペロンの初めに付加した。ＦＯＬ－ＯＰ－ＬＬオペロンの組込みカセットの構築のために、クロラムフェニコール耐性カセットおよびａｍｙＥ遺伝子座の下流相同性を導入した。最終工程では、ＳｂｆＩ制限酵素を用いて組込みカセットをクローニングベクターから実現し、セルフライゲーションに使用して多コピーゲノム組込みを達成した。株ＦＬ８４を生成するために、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）遺伝子からアセンブリした構築葉酸オペロン（図２に示す）を形質転換に使用し、培養後に全フォレートの測定を行った（実施例１２を参照されたい）。

【0283】

・バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子からアセンブリした葉酸オペロンＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ１
ＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ１（人工フォレートオペロン）のアセンブリは、合成技術の２つの別個のＤＮＡフラグメント（ＢＳ－ＦＯＬＯＰ１－ＣＯＭＢおよびＢＳ－ＦＯＬＯＰ２－ＣＯＭＢ、配列番号７７および７８）から行った。合成ＤＮＡフラグメントＢＳ－ＦＯＬＯＰ２－ＣＯＭＢは、カナマイシン耐性カセットおよびａｍｙＥ遺伝子座の下流相同性を有する低コピー数プラスミドにクローニングした。ＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ１組込みカセットの構築の最終工程では、ギブソンアセンブリプロトコルを用い、ＢＳ－ＦＯＬＯＰ１－ＣＯＭＢ（パートＡ）の増幅のために特別に設計したプライマー対（配列番号８７および８８）およびＢＳ－ＦＯＬＯＰ２－ＣＯＭＢ＋ＫｎＲ＋ａｍｙＥ－ＨＯＭ（パートＢ）の増幅のためのプライマー対（配列番号８９および９０）を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでアセンブリを行った。フォレート生合成のためのオペロンＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ１は、強力な構成的プロモーターＰｖｅｇおよび選択マーカーとしてのカナマイシン耐性カセットの発現下にある（図１６）。アセンブリした組込みカセットＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ１をＰＣＲ増幅し、さらにセルフライゲーションに用いて、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムのａｍｙＥ遺伝子座への多コピーゲノム組込みを可能にした。

【0284】

・アシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（エレモテシウム・ゴシッピイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ｇｏｓｓｙｐｉｉ））遺伝子からの葉酸オペロン
既知のＢ２ビタミン産生糸状真菌であるアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（エレモテシウム・ゴシッピイ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｍ ｇｏｓｓｙｐｉｉ））からの発現カセット（ＦＯＬ－ＯＰ－ＡＧ）を、２つの合成フォレート生合成遺伝子ｆｏｌ１－ＡＧ（配列番号５０）およびｆｏｌ２－ＡＧ（配列番号５１）を用いて構築した。遺伝子をＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の最適発現のためにコドン最適化し、付加的な調節プロモーター配列（プロモーターＰ_１５）を導入した２つの別個のＤＮＡフラグメントＦＯＬ１－ＡＧ（配列番号５２）およびＦＯＬ２－ＡＧ（配列番号５３）として合成した。ＦＯＬ１－ＡＧフラグメントを、初めにＳｐｅＩ／ＢａｍＨＩ制限部位を用いて低コピーベクターｐＦＯＬ１にクロラムフェニコール耐性カセットおよび強力な構成的プロモーターＰ_１５の下流でサブクローニングした。第２の工程では、ＦＯＬ２－ＡＧフラグメントを、ＥｃｏＲＶ制限部位を用いて低コピーベクターｐＦＯＬ２にａｍｙＥ遺伝子座の相同性の上流でサブクローニングした。次の工程では、Ｐ_１５－ｆｏｌ２－ＡＧおよびａｍｙＥ相同性を含むＤＮＡフラグメントを、プライマー（配列番号５４および配列番号５５）を用いてＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ制限部位を用いてプラスミドｐＦＯＬ１にクロラムフェニコール耐性カセットおよびＰ_１５－ｆｏｌ１－ＡＧの下流でクローニングした。最終工程では、アセンブリした組込みカセットＦＯＬ－ＯＰ－ＡＧを、プライマー（配列番号５６および配列番号５７）を用いてＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を細胞の形質転換に使用した。株ＦＬ２６０を生成するために、アシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）遺伝子からアセンブリした構築葉酸オペロン（図３に示す）を形質転換に使用し、培養後に全フォレートの測定を行った（実施例１２を参照されたい）。

【0285】

実施例４：ｆｏｌＣ置換のための遺伝子構築物のアセンブリ
フォレートに複数のグルタメート残基を付着させることが可能なネイティブホリルポリグルタミン酸シンターゼ（ｆｏｌＣ）を、フォレート生合成において最初のグルタメート残基のみを付着させることが可能な変異体に置き換えるために、対応する遺伝子構築物の生成を試みた。配列番号４３および配列番号４４の対応するプライマー対を用いてｇＤＮＡ Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＢＢ３８からＰＣＲによって増幅したｆｏｌＣ相同性末端を用いることで、ｆｏｌＣ破壊カセットをアセンブリした。ＰＣＲミックスは、Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Thermo Fisher）および製造業者により提供されるバッファーを用い、５％ＤＭＳＯ、２００μＭ ｄＮＴＰおよび０．５μＭの各プライマーを添加して５０μＬの最終容量とし、３２サイクル行った（アニーリング温度６５℃、伸長時間２分）。増幅したＰＣＲフラグメントを０．８％アガロースゲルから切り出し、Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｓｙｓｔｅｍキットでクリーニングし、１ｍＭ ＡＴＰを添加した、製造業者により提供されるバッファーＡ中にてＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Thermo Fisher）でリン酸化した。

【0286】

予めＦｓｐＡＩおよびＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（Thermo Fisher）で平滑末端化し、ＦａｓｔＡＰ感熱性アルカリホスファターゼ（Thermo Fisher）で脱リン酸化した低コピープラスミドｐＥＴ－２９ｃ（Novagen）に、調製したフラグメントをライゲートした。

【0287】

テトラサイクリン耐性カセット（配列番号２１）を用いてｆｏｌＣ遺伝子配列を破壊した。テトラサイクリン耐性カセットは、プラスミドをＢｓｐ１１９Ｉ制限酵素で切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（Thermo Fisher）で平滑末端化し、ＦａｓｔＡＰを用いて脱リン酸化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Thermo Fisher）を用いてライゲートしてｆｏｌＣ配列に挿入した。

【0288】

さらに、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）（ｆｏｌＣ２－ＬＲ）（配列番号２２）およびアシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（ｆｏｌＣ２－ＡＧ）（配列番号２３）に由来する異種ｆｏｌＣ２タンパク質配列を、ｆｏｌＣ２－ＬＲ（ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ））（配列番号２４）およびｆｏｌＣ２－ＡＧ（アシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉ））（配列番号２５）の異種遺伝子発現のためのコドン最適化ＤＮＡ配列の設計に使用した。ＤＮＡフラグメントを合成し（IDT Integrated DNA Technologies）、２つの組込みカセットの構築に使用した（図５に示す）。初めに、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（Thermo Fisher）を用いて平滑末端化した、Ｐｖｅｇプロモーター（配列番号３７）を含むフラグメントを生成し、予めＸｂａＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｌａｒｇｅ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（Thermo Fisher）で平滑末端化した、ｆｏｌＣ相同性を有するプラスミドにライゲートした。

【0289】

次に、新たに構築したプラスミドをＢｃｕＩおよびＦｓｐＡＩ制限酵素で切断し、ＦａｓｔＡＰを用いて脱リン酸化した。その後、プラスミドを、予めＢｃｕＩおよびＦｓｐＡＩ制限酵素で切断した、ｆｏｌＣ２－ＬＲ中の秩序化された最適化配列ｆｏｌＣ２－ＡＧとライゲートした。このプラスミドに、予めＥｃｏＲＩ制限酵素で切断し、平滑末端化したテトラサイクリン耐性を、プラスミドをＦｓｐＡＩで制限し、脱リン酸化した後にライゲートした。構築したプラスミドを配列番号４３および配列番号４４のＰＣＲプライマーの鋳型として使用し、形質転換用のｆｏｌＣ破壊／置換カセットを生成した。

【0290】

実施例５：形質転換用の葉酸オペロン構築物のアセンブリ
葉酸オペロンのアセンブリ後に（実施例３を参照されたい）、フォレート生合成遺伝子を有するＤＮＡフラグメントをさらにＸｂａＩ制限酵素で切断し、配列番号４０および配列番号４１のプライマーを用いてエリスロマイシン耐性カセット用の合成ＤＮＡフラグメント（配列番号１９）とライゲートし（６２℃、４０秒）、ＸｂａＩで切断し、ライゲーションに適合したＤＮＡ末端を確実にした。ライゲーション後に、プライマー（配列番号３６および配列番号３９）を用いてフラグメント全体をＰＣＲ増幅した。

【0291】

アセンブリの最終工程では、ｌａｃＡ相同性および調節プロモーター領域を有するフラグメント（配列番号１８）を付加した。フラグメントをＳｐｅＩ制限酵素で切断し、ライゲーションに使用した。ライゲーション混合物を、プライマー（配列番号４２および配列番号３９）を用いてＰＣＲ鋳型として使用し、これによりＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株へのゲノム形質転換用の発現カセット（配列番号２０）としての人工フォレートオペロン（図４に示す）のアセンブリを完成させた。

【0292】

実施例６：可能なバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）フォレート産生工学のための宿主株の選択
フォレート産生工学のための出発株として種々のバチルス株を使用することができる（表３）。バチルス株は自然界から単離するか、またはカルチャーコレクションから得ることができる。中でも、フォレート産生のための出発株は、プリン生合成経路に関連する代謝産物を過剰産生するために、既に突然変異誘発および選択の古典的方法に供したバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の中から選択され得る。例えば、リボフラビン、イノシンおよびグアノシンを過剰産生する株を選択することができる。ランダム突然変異誘発ならびにプリンおよびリボフラビン経路からの毒性代謝阻害剤に供した株が好ましく、表３に挙げられる。

【0293】

【表3】

【0294】

ＶＫＰＭ Ｂ２１１６株は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株（およそ４Ｍｂｐのゲノムを有する最も一般的なＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株）と株Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｗ２３に由来するＤＮＡの６．４ｋｂｐのアイランドとのハイブリッド株である。かかる構造は、殆どのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）工業株に共通しており、１６８株（トリプトファン栄養要求株ｔｒｐＣ－）をＷ２３（原栄養性ＴｒｐＣ＋）ＤＮＡで形質転換することで得られた。これは、ゲノムが公開されているＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レガシー株の１つである、一般に使用されているＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳＭＹ株と同じ６．４ｋｂｐのＷ２３アイランドをゲノム中に有する（Ziegler et al., The origins of 168, W23 and other Bacillus subtilis legacy strains, Journal of Bacteriology, 2008, 21, 6983 - 6995）。ＶＫＰＭ Ｂ２１１６株は、古典的な突然変異誘発および選択によって得られたＳＭＹ株の直系の子孫である。この株の別名は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＮＩＩ Ｇｅｎｅｔｉｋａ ３０４である。株の構築の説明は、１９８０年に出願されたソ連国特許発明第９０８０９２号明細書に記載されている。この突然変異は、その後の突然変異誘発および代謝阻害剤の選択によって得られた。株ＶＫＰＭ Ｂ２１１６は、フラビンキナーゼをコードするｒｉｂＣ遺伝子の突然変異により、ビタミンＢ２の毒性類似体であるロゼオフラビンに耐性を示す。この株は、プリン塩基の毒性類似体である８－アザグアニンにも耐性を示す。

【0295】

実施例７：ｆｏｌＣの置換および葉酸産生に最適な宿主株の生成
異種ｆｏｌＣ２（ｆｏｌＣ２－ＡＧまたはｆｏｌＣ２－ＬＲ）遺伝子発現カセットの構築後に（実施例４および図５を参照されたい）、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＢＢ３８およびＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＢＢ３８Δｒｉｂの形質転換を行った。ネイティブｆｏｌＣ遺伝子の破壊のための相同性を有する発現カセットを、配列番号４３および配列番号４４のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。形質転換後に、テトラサイクリンに耐性を示すコロニーを選択し、異種ｆｏｌＣ２遺伝子（Ａ．ゴシッピイ（Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）またはＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ））によるネイティブｆｏｌＣ遺伝子の置換を、ｃＰＣＲおよび得られたＰＣＲ産物のシークエンシングによって遺伝学的に確認した。新たな株を用いて全フォレートの産生収率を試験し（図１１を参照されたい）、上清と細胞バイオマスとの間の全フォレートの分布を比較した。

【0296】

実施例８：バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換
ｉ）バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のナチュラルコンピテンス形質転換
１０ｍＬのＳｐＣ培地にＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の新鮮プレートから接種し、一晩培養する。１．３ｍＬの一晩培養物を１０ｍＬの新鮮ＳｐＣ培地に希釈する（９倍希釈）。ＯＤ４５０を測定し、約０．５と予想される。培養物を３７℃、２２０ＲＰＭで３時間１０分成長させる。ＯＤ４５０を再び測定し、１．２～１．６と予想される。培養物をＳｐＩＩ（飢餓培地）で１：１希釈する。３．５ｍｌの培養物を３．５ｍｌの飢餓培地と混合し、濃度５０ｕｇ／ｍｌのトリプトファンを添加する。培養物を３７℃、２２０ＲＰＭでさらに２時間成長させる。インキュベーション後に、培養物を１時間最大限にコンピテントとする。５００ｕＬのコンピテント細胞を２ｍＬエッペンドルフチューブ内でＤＮＡ（濃度に応じて５～２０ｕＬ）と混合し、振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。コンピテント細胞の回復のために３００ｕＬの新鮮ＬＢを添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートする。エッペンドルフチューブを３０００ＲＰＭで５分間遠心分離する。ペレットを再懸濁し、適切な抗生物質を含むＬＢプレートにプレーティングする。

【0297】

培地：
１０×Ｔ－ｂａｓｅ
１５０ｍＭ硫酸アンモニウム
８００ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４
４４０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４
３５ｍＭクエン酸ナトリウム

【0298】

ＳｐＣ（最少培養培地）
１００ｍＬ １×Ｔ－ｂａｓｅ
１ｍＬ ５０％グルコース
１．５ｍＬ １．２％ＭｇＳＯ_４
２ｍｌ １０％酵母エキス
２．５ｍｌ １％カザミノ酸

【0299】

ＳｐＩＩ（飢餓培地）
１００ｍｌ １×Ｔ－ｂａｓｅ
１ｍｌ ５０％グルコース
７ｍｌ １．２％ＭｇＳＯ_４
１ｍｌ １０％酵母エキス
１ｍｌ １％カザミノ酸
０．５ｍｌ １００ｍＭ ＣａＣｌ_２

【0300】

実施例９：ｑＰＣＲを用いたフォレートオペロンコピー数の決定
組み込まれたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の人工フォレートオペロン遺伝子のコピー数の決定にリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法を用いた。フォレート産生Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換体における人工フォレートオペロン中の遺伝子ｆｏｌＰ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＥ、ｄｆｒＡおよびＫｎＲ（カナマイシン耐性遺伝子）のコピー数をＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ検出による（ｑＰＣＲ）によって推定した。人工Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）フォレートオペロン上のカナマイシン耐性遺伝子（ＫｎＲ）のコピー数およびフォレート生合成遺伝子ｆｏｌＰ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＥ、ｄｆｒＡのコピー数をｑＰＣＲによって定量化した。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のゲノムＤＮＡをＳＷ Ｗｉｚａｒｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Promega）によって単離した。ｇＤＮＡの濃度および純度をＯＤ２６０およびＯＤ２８０にて分光光度法で評価した。全ての実験で使用したｇＤＮＡの量は、参照株のｇＤＮＡの量に等しかった。遺伝子ｆｏｌＰ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＥ、ｄｆｒＡおよびＫｎＲを含む人工フォレートオペロンの単一コピーを有するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、遺伝子コピー数の相対定量化に参照株として使用した。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノム中の単一コピー遺伝子であるハウスキーピング遺伝子ＤｘＳを内因性制御遺伝子として使用した。フォレート生合成遺伝子の遺伝子コピー数の定量化は、プライマーの特定のセット（ｆｏｌＰ遺伝子については配列番号５９および配列番号６０のプライマー対、ｆｏｌＫ遺伝子については配列番号６１および配列番号６２のプライマー対、ｆｏｌＥ遺伝子については配列番号６３および配列番号６４のプライマー対、ｄｆｒＡ遺伝子については配列番号６５および配列番号６６のプライマー対）を用いて行い、フォレートオペロンに付着したカナマイシン耐性マーカーの定量化には（配列番号６７および配列番号６８のプライマー対）、参照ＤｘＳ遺伝子については配列番号７１および配列番号７２のプライマー対を使用した。ｑＰＣＲ分析は、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで行い、２^{－ΔΔＣＴ}法を用いて定量化を行った。

【0301】

人工ＢＳ－ＦＯＬ－ＯＰ株における遺伝子の遺伝子コピー数は、１コピーの遺伝子を有する株と比べて定量化した。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）形質転換株における人工フォレートオペロン中の遺伝子の遺伝子コピー数の相対定量化には、コピー数が１のＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株のＫｎＲ遺伝子を参照株として使用した。遺伝子ｆｏｌＰ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＥ、ｄｆｒＡおよびＫｎＲ遺伝子のｑＰＣＲ相対定量化により、単一コピー遺伝子を有するＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株と比較してＲＱ値の６倍の増加が示された。フォレート過剰産生株ＦＬ１７９およびＦＬ７２２は、葉酸合成オペロンの多コピー組込みを有することが確認された。

【0302】

実施例１０：バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の培養
凍結クライオバイアルからの段階希釈を行い、適切な抗生物質を含むＭＢプレートにプレーティングし、３７℃でおよそ４８時間インキュベートする。更なる試験のために、ＭＢプレートからの少なくとも１０～２０個の単一コロニーを各株について使用する。初めに、１０～２０個の単一コロニーを試験のために新鮮ＭＢプレート（同じ濃度の抗生物質を含む）に再パッチする。

【0303】

栄養生長期については、ＭＣ培地を用い、ファルコンチューブ１本当たり１プラグ（またはバッフル付きエルレンマイヤーフラスコ１本当たり５プラグ、もしくはマイクロタイタープレートのパッチのごく一部）で接種する。適切な抗生物質を培地に添加する。マイクロタイタープレートでは、９６ディープウェルに５００ｕｌの培地を用い、ファルコンチューブでは、５ｍｌの培地（５０ｍｌファルコンチューブ内）を用い、エルレンマイヤーフラスコでは、２５ｍｌ（２５０ｍｌフラスコ内）を用いる。培養物を２２０ＲＰＭにて３７℃で１８～２０時間インキュベートする。

【0304】

産生培地（ＭＤ）への接種は、植生培地において１８～２０時間後である。１０％の接種材料を使用する（ＭＷでは５０ｕｌ、ファルコンチューブでは０．５ｍｌ、エルレンマイヤーフラスコでは２．５ｍｌ）。各株を２つのアリコートで試験する。マイクロタイタープレートでは、４８ディープウェルで５００ｕｌの培地を用い、ファルコンチューブでは５ｍｌの培地を用い、バッフル付きエルレンマイヤーフラスコでは２５ｍｌを用いる。エルレンマイヤーフラスコでストッパーの代わりにガーゼを使用するように、より良好な通気のためにファルコンチューブにワイヤーを使用する。培養物を２２０ＲＰＭにて３７℃で４８時間インキュベートする。２４時間後および４８時間後に、開発された手順に従い、微生物学的アッセイを用いて全フォレートの力価を測定した。

【0305】

最良の候補株を同様の方法で再試験し、数回の確認後にバイオリアクターでの試験のために調製する。バイオリアクター試験のために選択した株の凍結培養物１００ｕｌを、適切な抗生物質を含むＭＢプレート上に塗布し、３７℃でおよそ４８時間インキュベートする。完全なバイオマスを１プレート当たり２ｍｌの滅菌２０％グリセロールで回収する。回収したバイオマスを１００ｕｌアリコートに分配し、－８０℃で凍結する。これをワーキングセルバンクとしてバイオリアクター試験に使用する。

【0306】

培地組成：
１）ＭＢ（プレート）
トリプトン １０ｇ／ｌ
酵母エキス ５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ
マルトース ２０ｇ／ｌ
寒天２０ｇ／ｌ
ｐＨ７．２～７．４
３０分間、１２１℃のオートクレーブ処理

【0307】

オートクレーブ処理および冷却後に適切な抗生物質を添加する。

【0308】

２）ＭＣ（植生培地）
糖蜜 ２０ｇ／ｌ
ＣＳＬ ２０ｇ／ｌ
酵母エキス ５ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ／ｌ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ５ｇ／ｌ

【0309】

成分を混合し、ｐＨを７．２～７．４とする。次いで、ＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４溶液をＫＨ_２ＰＯ_４ １．５ｇ／ｌおよびＫ_２ＨＰＯ_４ ３．５ｇ／ｌの最終濃度で添加する。培地をファルコンチューブ（５ｍｌ／５０ｍｌファルコンチューブ）またはエルレンマイヤーフラスコ（２５ｍｌ／２５０ｍｌ－バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ）に分配し、１２１℃で３０分間オートクレーブ処理する。滅菌グルコースをオートクレーブ処理後に最終濃度７．５ｇ／ｌで添加する。抗生物質を接種前に添加する。

【0310】

３）ＭＤ（産生培地）
酵母 ２０ｇ／ｌ
コーンスティープリカー（ＣＳＬ） ５ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．５ｇ／ｌ
パラアミノ安息香酸（ｐＡＢＡ） ０．５ｇ／Ｌ

【0311】

成分を混合し、ｐＨを７．２～７．４とする。次いで、ＫＨ_２ＰＯ_４－Ｋ_２ＨＰＯ_４溶液をＫＨ_２ＰＯ_４ １．５ｇ／ｌおよびＫ_２ＨＰＯ_４ ３．５ｇ／ｌの最終濃度で添加する。培地を１２１℃で３０分間オートクレーブ処理する。滅菌尿素溶液（２０ｍｌのストック溶液、最終濃度は６ｇ／Ｌである）、滅菌グルコース溶液（２５０ｍｌのストック溶液、最終濃度は１００ｇ／Ｌグルコースである）、滅菌ｐＡＢＡ溶液（１００ｍｌのストック溶液、最終濃度は０．５ｇ／Ｌである）および１５０ｍｌの滅菌水をオートクレーブ処理後に添加し、１ＬのＭＤ＋ｐＡＢＡ５００培地を得る。適切な抗生物質を接種前に添加する。次いで、培地を滅菌エルレンマイヤーフラスコ（２５ｍｌ／２５０ｍｌ－バッフル付きエルレンマイヤーフラスコ）に分配する。

【0312】

実施例１１：発酵ブロス中の全フォレートの定量化のための微生物学的アッセイ
エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）ＮＲＲＬ Ｂ－１２９５を用いる微生物学的アッセイを、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株において産生される全フォレートの検出に用いた。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が産生する細胞内（バイオマスに保持される）および細胞外（培養培地に放出される）全フォレートの評価に微生物学的アッセイを用いた。微生物学的アッセイには、フォレートまたは葉酸について栄養要求性の指標生物エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）ＮＲＲＬ Ｂ－１２９５を使用する。フォレートを含有する富栄養成長培地（ラクトバチルスＡＯＡＣブロス）において、Ｅ．ヒラエ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）を３７℃で１８～２４時間前培養する。次いで、フォレートを含まない成長培地（葉酸アッセイ培地）で洗浄し、残留フォレートを除去する。洗浄したＥ．ヒラエ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）培養物を、葉酸を含まないアッセイ培地に接種する。微生物学的アッセイを９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて開始する。アッセイ対象の適切に希釈した培地サンプルおよび葉酸の標準溶液を、指標株を含有する成長培地に添加し、プレートを３７℃で２０時間インキュベートする。指標生物の成長反応は、培地サンプル／対照に含まれる葉酸／フォレートの量に比例する。葉酸の一連の標準溶液を成長培地および指標株に添加することで、標準曲線を各アッセイについて構築する。光学密度（ＯＤ）を波長６００ｎｍで測定することで成長を測定する。試験サンプルに対するＥ．ヒラエ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）の成長反応を既知の標準溶液の反応と定量的に比較する。様々な濃度の葉酸を含有する希釈系列を調製し、前記のようにアッセイする。既知濃度の葉酸で測定したＯＤ６００をプロットすることによって標準曲線を得る。標準曲線を用いて試験サンプル中の全フォレートの量を算出する。指標生物Ｅ．ヒラエ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）ＮＲＲＬ Ｂ－１２９５を用いて、全フォレートの濃度を測定サンプルにおいて０．０５～０．７ｎｇ／ｍＬの範囲で検出する。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株が産生する細胞外および細胞内の全フォレートは、適切に希釈した試験サンプルを葉酸アッセイ培地中の指標生物Ｅ．ヒラエ（Ｅ．ｈｉｒａｅ）に添加することで推定することができる。

【0313】

実施例１２：異なる出発株および初期ｆｏｌＣ置換株および葉酸オペロン増幅株の全フォレート収率
ｆｏｌＣ遺伝子をＡ．ゴシッピイ（Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ２１）またはＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ２３）のいずれかに由来する異種ｆｏｌＣ２遺伝子によって置き換えた形質転換体および葉酸オペロンを増幅させた形質転換体を、シェーカー規模（５ｍｌの産生培地ＭＤ）で全フォレート量について試験した。発酵後に、発酵ブロスのサンプル（２００μｌ）を慎重に回収して均一なサンプルを得て、氷冷抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）で１０倍希釈した。サンプルを１４０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離し、濾過滅菌した（細孔径０．２２ｕｍ）。微生物学的アッセイのためにサンプルを抽出バッファーで段階希釈し、微生物学的アッセイを開始するまで４℃に保った。表４に微生物学的アッセイによって測定された選択株の結果を示す。

【0314】

【表4】

【0315】

実施例１３：ＬＣ－ＭＳを用いたフォレート形態および関連化合物の濃度の決定、ならびに２つの主要産物としての１０－ホルミル－ジヒドロ葉酸および１０－ホルミル葉酸の同定
微生物学的アッセイに加えて、分析実行時間が適度に短い高感度の汎用的な分析法を開発することが目的であった。方法は揮発性移動相に適合するＬＣＭＳである必要があり、さらにはＵＶ検出が可能であり、可能な限り多くのフォレート関連分析物の良好なクロマトグラフィー分離をもたらす必要があった。

【0316】

機器および材料：
方法は、ｈＥＳＩ源を備えるＭＳ／ＭＳ可能質量分析計Ｔｈｅｒｍｏ ＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ａｃｃｅｓｓ ＭＡＸと組み合わせた、ＰＤＡ検出器を有するＴｈｅｒｍｏ Ａｃｃｅｌａ １２５０ ＨＰＬＣ機器で開発した。方法は、粒径２．２μｍのＴｈｅｒｍｏ Ａｃｃｌａｉｍ ＲＳＬＣ ＰＡ２、１５０×２．１ｍｍ ＨＰＬＣカラムで開始した。ＰＤＡ検出器を２８２ｎｍに設定し、バンド幅９ｎｍおよび８０Ｈｚ走査速度、さらには２００～８００ｎｍのＤＡＤスキャンとした。カラムオーブンを６０℃、トレイ冷却を１２℃に設定する。注入溶媒は水中１０％メタノールであり、洗浄およびフラッシュ量：２０００μｌとする。注入量を１０μｌに設定し、より高濃度の分析物が予想される場合には１μｌに設定することもできる。移動相Ａは水中６５０ｍＭ酢酸であり、移動相Ｂはメタノールである。移動相の流量は０．５ｍｌ／分であり、総実行時間は２０分である。方法には、表５の勾配プログラムおよび表６に記載のＭＳ分光計パラメーターを用いる。

【0317】

【表5】

【0318】

【表6】

【0319】

ＬＣＭＳ検出器をＤＡＤ検出器の後に連結し、分析物を４００～６００ｍ／ｚのスキャンモード、Ｍ．Ｗ．＋１でのＳＩＭモード、およびＭＳ／ＭＳモードで観察する（表６）。標準物質を０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液に秤量および溶解して調製し（表７および表８）、即座にＨＰＬＣ機器に投入する。

【0320】

【表7】

【0321】

【表8】

【0322】

方法は最大１０００ｍｇ／Ｌの分析物のＭＳ／ＭＳ検出で線形応答を有し、全ての標準物質について９０％を超える相関を有する。

【0323】

実施例１４：遺伝子組換えバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）による異なる比率の葉酸および誘導体の産生
ｆｏｌＣ遺伝子をＡ．ゴシッピイ（Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ２１）またはＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ２３）のいずれかに由来する異種ｆｏｌＣ２遺伝子によって置き換えた形質転換体および葉酸オペロンを増幅させた形質転換体を、シェーカー規模（５ｍｌの産生培地ＭＤ）で全フォレート量について試験した。

【0324】

適切な抗生物質を含むＭＢプレートに株をパッチし、３７℃で２日間インキュベートした。振盪フラスコ実験については、成長させた株をＦａｌｃｏｎ ５０ｍＬコニカル遠心チューブ内の５ｍｌのＭＣ（シード）培地に移し（１プラグ／５ｍｌ）、ロータリーシェーカーにて２２０ＲＰＭおよび３７℃で１６～１８時間培養した。シード培養物の１０％接種材料を用いて５ｍＬの産生培地（ＭＤ＋ｐＡＢＡ５００）に接種した。ロータリーシェーカーにて２２０ＲＰＭおよび３７℃で４８時間、暗所で株を培養した。発酵後に、発酵ブロスのサンプル（２００μｌ）を慎重に回収して均一なサンプルを得て、氷冷抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）で１０倍希釈した。サンプルを１４０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離し、濾過滅菌した（細孔径０．２２ｕｍ）。異なるフォレート種の定量化については、実施例１３に記載のようにＨＰＬＣ法を用いた。異なるＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の結果を表９に示し、発酵ブロスサンプルの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。

【0325】

【表9】

【0326】

Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する異種ｆｏｌＣ－ＡＧおよび過剰発現フォレート生合成遺伝子を有する株ＦＬ１７９は、野生型バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株と比較して４３２９７％の１０－ホルミル葉酸産生の増加を示した。

【0327】

実施例１５：１０－ホルミルジヒドロ葉酸の１０－ホルミル葉酸への酸化的変換
発酵の終了後、ブロスのＨＰＬＣ分析により、比較的多量（８５面積％）の１０－ホルミルジヒドロ葉酸（１０Ｆ－ＤＨＦ）が検出された。さらに、１０－ホルミルジヒドロ葉酸が１０－ホルミル葉酸へと酸化的に変換され得ることが観察された（図７を参照されたい）。したがって、１０－ホルミル葉酸への定量的変換をもたらすプロトコルの開発を始めた。その後の脱ホルミル化工程により、葉酸が最大限の収率で得られると期待される。文献検索から、特定のｐＨ値での水溶液中の空気によるテトラヒドロ葉酸の酸化を記載している報告が明らかになった（Reed 1980）。この報告に基づくと、ｐＨ値４、７および１０では、酸化の主要産物はｐ－アミノベンゾイルグルタミン酸（ＰＡＢＧ）および６－ホルミルプテリンである。加えて、７，８－ジヒドロフォレート中間体はｐＨ＝１０でのみ検出された。１０－ホルミルジヒドロ葉酸から１０－ホルミル葉酸へのシフト変換を促進するために、発酵ブロス上清での一連の酸化実験を行った。Ｏ_２、Ｈ_２Ｏ_２およびＮａＩＯ_４等の幾つかの酸化試薬を試験した（図７を参照されたい）。

【0328】

【表10】

【0329】

実験は５０ｍＬ丸底フラスコ内で１０ｍＬの発酵ブロス上清を用いて行った。１．０Ｍおよび０．１Ｍ ＮａＯＨ溶液によってｐＨ値を設定した。反応の進行および結果をＨＰＬＣによって測定した。ＨＰＬＣサンプルは、抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）中で調製した。全ての反応物を常温（２５℃）で４８時間、遮光して撹拌した。

【0330】

必要なｐＨ値は、１Ｍおよび０．１ＭのＨＣｌまたはＮａＯＨで調整した。より低ｐＨ値での反応はより遅く、フォレートの合計が比較的高く維持される（表１０、項目２～４）。逆に、より高ｐＨ値での反応（表１０、項目５～７）では、フォレートの合計が大幅に減少するにもかかわらず、１０－ホルミルジヒドロ葉酸の消費が改善される。過酸化水素または過ヨウ素酸ナトリウム等の代替的な酸化試薬が使用され得ることが予想される。

【0331】

代表的な実験手順：
発酵ブロスを４５００ｒｐｍで遠心分離し、上清をデカントした。１０ｍＬの発酵ブロス上清を撹拌子、ｐＨメーターおよび遮光用アルミ箔を備える５０ｍＬ丸底フラスコにピペットで移した。水酸化ナトリウムまたは塩酸（微調整のため１．０Ｍおよび０．１Ｍ）を滴加してｐＨ値を設定し、反応物を常温（２５℃）下で２４時間激しく撹拌した。反応混合物をバルーンからの空気でパージした。４８時間の撹拌後に、１ｍＬの各発酵ブロスを９ｍＬの抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）により二連で希釈した。懸濁液をボルテックスで撹拌し、４５００ｒｐｍで遠心分離し、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＨＰＬＣで分析した。

【0332】

【表11】

【0333】

実験は５０ｍＬ丸底フラスコ内で１０ｍＬの発酵ブロス上清を用いて行った。過酸化水素を３０％水溶液として滴加した。反応の進行および結果をＨＰＬＣによって測定した。ＨＰＬＣサンプルは、抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）中で調製した。全ての反応物を常温（２５℃）で４８時間、遮光して撹拌した。

【0334】

１０－ホルミルジヒドロ葉酸の１０－ホルミル葉酸への酸化的変換のための代替的な酸化剤である過酸化水素を５０～５００ｍｇ／Ｌの濃度範囲で添加すると、より高度な結果が得られた（表１１）。反応の最初の２４時間で、１０－ホルミルジヒドロ葉酸の濃度が初期値の５０％まで低下した。反応を４８時間まで延長すると、良好な変換が得られ、全フォレートの合計が比較的高く維持された。

【0335】

代表的な実験手順：
発酵ブロスを４５００ｒｐｍで遠心分離し、上清をデカントした。１０ｍＬの発酵ブロス上清を撹拌子、ｐＨメーターおよび遮光用アルミ箔を備える５０ｍＬ丸底フラスコにピペットで移した。過酸化水素を３０％水溶液として滴加し、反応混合物を常温（２５℃）下で２４～４８時間激しく撹拌した。４８時間の撹拌後に、１ｍＬの各発酵ブロスを９ｍＬの抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）により二連で希釈した。懸濁液をボルテックスで撹拌し、４５００ｒｐｍで遠心分離し、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＨＰＬＣで分析した。

【0336】

【表12】

【0337】

実験は５０ｍＬ丸底フラスコ内で１０ｍＬの発酵ブロス上清を用いて行った。過ヨウ素酸ナトリウムを一度に添加した。反応の進行および結果をＨＰＬＣによって測定した。ＨＰＬＣサンプルは、抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）中で調製した。全ての反応物を常温（２５℃）で４８時間、遮光して撹拌した。

【0338】

過ヨウ素酸ナトリウムは、予測できない基質の最適な試薬として使用されることが多い。この試薬を用いた本発明者らの初期実験では、酸化的変換の有効濃度が１～１０ｇ／Ｌであることが明らかとなった。過ヨウ素酸ナトリウムは、５ｇ／Ｌおよび１０ｇ／Ｌの２つの異なる濃度で添加した。反応の最初の２４時間で、１０－ホルミルジヒドロ葉酸の濃度が初期値から大幅に低下した（表１２）。反応を４８時間まで延長すると、優れた変換が得られ、全フォレートの合計が比較的高く維持された。

【0339】

代表的な実験手順：
発酵ブロスを４５００ｒｐｍで遠心分離し、上清をデカントした。１０ｍＬの発酵ブロス上清を撹拌子、ｐＨメーターおよび遮光用アルミ箔を備える５０ｍＬ丸底フラスコにピペットで移した。過ヨウ素酸ナトリウムを一度に添加し、反応混合物を常温（２５℃）下で２４時間激しく撹拌した。４８時間の撹拌後に、１ｍＬの各発酵ブロスを９ｍＬの抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）により二連で希釈した。懸濁液をボルテックスで撹拌し、４５００ｒｐｍで遠心分離し、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＨＰＬＣで分析した。

【0340】

実施例１６：５Ｌバイオリアクター容量でのフォレートの産生
フォレートの産生は、適切な条件をフォレートの培養および産生に用いるバイオリアクターにおいて大幅に改善され得る。このプロセスには、前培養物の調製および主なフェドバッチバイオプロセスが含まれる。

【0341】

ｉ）前培養物の調製
フラスコ内の前培養培地（ＦＯＬ－ＭＣ、表１３）に株ＦＬ１７９のワーキングセルバンクを播種し、３７℃および２２０ＲＰＭ（２インチスロー）のロータリーシェーカーで１１～１４時間培養した。

【0342】

ｉｉ）フェドバッチバイオプロセス
フォレートの産生を５Ｌバイオリアクター内でＦＯＬ－ＭＥ培地（表１４）を用いて行う。バイオリアクターの開始パラメーターは撹拌＝６００ＲＰＭ、通気＝１ｖｖｍであり、水酸化アンモニウム溶液を用いてｐＨを７に制御する。バイオリアクターに１０％の前培養物を接種する。３０％を超える空気飽和度を維持するためにＤＯを撹拌および気流によって制御する。発酵ブロス中のグルコースが枯渇した時点で、グルコースおよびＣＳＬ混合物（表１５）の供給を開始する。フィード添加速度は慎重に制御する必要があり、供給速度は、アセトイン（１０ｇ／Ｌ以下）の蓄積をもたらさないレベルに制御する。アセトインが発酵ブロス中に検出されない場合、供給速度は過度に低い。発酵ブロス中のパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）濃度を一定間隔で測定し、濃縮ＰＡＢＡストック溶液（５０ｇ／Ｌ）のバッチ供給により５００ｍｇ／Ｌ超に維持する必要がある。バイオプロセスは、通常は５０時間で完了する。フォレート産生バイオプロセスのプロファイルを図１０に示す。

【0343】

【表13】

【0344】

【表14】

【0345】

【表15】

【0346】

実施例１７：ｑＰＣＲを用いたフォレート生合成遺伝子の発現レベルの決定
培養物成長条件：Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）培養物をＬＢ培地中で指数増殖期まで成長させた。培養物を２容量のＲＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｒｅａｇｅｎｔ（QIAGEN）と混合し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、－８０℃で凍結するか、または即座に処理した。１ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有する２００μＬのＴＥバッファーに細胞ペレットを１５分間再懸濁し、細胞壁を除去した。QIAGENのＲｎｅａｓｙ ｍｉｎｉキットを用い、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡは、分光光度法で濃度および品質を確認した。単離したＲＮＡをＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎキット）で処理し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Thermo Scientific）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。得られたｃＤＮＡを希釈し、ｃＤＮＡの最終収率は約２．５ｎｇ／μＬである。

【0347】

得られたｃＤＮＡをｑＰＣＲ分析（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Applied Biosystems）によってＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Thermo Scientific）検出で分析した。組み込まれたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の人工フォレートオペロン遺伝子ｆｏｌＰ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＥ、ｄｆｒＡにおけるフォレートオペロン遺伝子の発現を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法によって定量化した。

【0348】

定量ｑＰＣＲ発現データの正規化のために参照として使用される内部標準遺伝子である、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を使用した。フォレート生合成遺伝子の発現は、プライマーの特定のセット（ｆｏｌＰ遺伝子については配列番号５９および配列番号６０のプライマー対、ｆｏｌＫ遺伝子については配列番号６１および配列番号６２のプライマー対、ｆｏｌＥ遺伝子については配列番号６３および配列番号６４のプライマー対、ｄｆｒＡ遺伝子については配列番号６５および配列番号６６のプライマー対）を用いて決定し、内部標準として選択された１６Ｓ遺伝子については配列番号６９および配列番号７０のプライマー対を使用した。ｑＰＣＲ分析をＳｔｅｐＯｎｅ（商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで行い、２^{－ΔΔＣＴ}法を用いて定量化を行った。

【0349】

多コピーの合成フォレートオペロンを２つの別個のゲノム位置（ａｍｙＥおよびｌａｃＡ）に有する最良のフォレート産生株ＦＬ７２２が、フォレート生合成遺伝子の最も強い発現レベルを有することが確認された。

【0350】

実施例１８：１０－ホルミル葉酸の葉酸への化学変換
酸媒介脱ホルミル化
１０－ホルミル葉酸の脱ホルミル化を０．０１ｍｍｏｌ規模（５ｍｇ）で行った。１０－ホルミル葉酸を、撹拌子を備える２ｍＬエッペンドルフチューブに秤量し、蒸留水（１ｍＬ）に懸濁した。懸濁液を酸（５０当量、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、常温で１６時間撹拌した。続いて、懸濁液（２００μＬ）をＤＭＳＯ（８００μＬ）で希釈し、ボルテックススターラーでホモジナイズし、ＨＰＬＣで分析した。脱ホルミル化の結果を表１６に示す。

【0351】

【表16】

【0352】

全ての実験を２ｍＬエッペンドルフチューブで１０－ホルミル葉酸（５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を用いて行った。^ａ変換率はＨＰＬＣによって測定した。^ｂｎ．ｄ． － 不検出。本実験では、分析物がＤｏｗｅｘ ５０ＷＸ２樹脂に吸着している可能性が高いため、１０－ホルミル葉酸も検出されなかった。^ｃＴＦＡ － トリフルオロ酢酸。^ｄＴＣＡ － トリクロロ酢酸。^ｅＰＴＳＡ － ｐ－トルエンスルホン酸。

【0353】

無機強酸による１０－ホルミル葉酸の脱ホルミル化は、ほぼ定量的に葉酸へと進行した（表１６、項目１および８）。一方、より強い有機酸による脱ホルミル化は、ほぼ等しい効率で葉酸をもたらした（表１６、項目３、４および６）。予想されるように、ギ酸および酢酸による脱ホルミル化は、変換をもたらさなかった（表１６、項目５および７）。Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ２樹脂を用いた脱ホルミル化のＨＰＬＣ分析では、分析物がおそらくは樹脂に吸着したままであり、溶出の必要があるため、出発物質も産物も検出されなかった。

【0354】

発酵ブロス中の１０－ホルミル葉酸の酸媒介Ｎ－脱ホルミル化
先の実験では、強酸を用いた１０－ホルミル葉酸標準物質の脱ホルミル化により、図８に示す葉酸へのきれいな変換が得られることを説明した。ここでは、同じ原理をより複雑な系である発酵ブロスに適用した。生体サンプルに対する実験を続けるために、非常に効果的であり、研究した他の酸よりも安価であることから、塩酸（ＨＣｌ）を脱ホルミル化試薬として選択した。実施例１６からの発酵ブロスのＨＰＬＣ分析では、生合成時に形成された幾つかのフォレートの中でも相当量の１０－ホルミル葉酸が示された（１０－ホルミル葉酸４６面積％；５－イミドメチルテトラヒドロ葉酸４７面積％および５－メチルテトラヒドロ葉酸７面積％）。発酵ブロスのサンプルを１Ｍ ＨＣｌで異なるｐＨレベル（ｐＨ＝４、３、２、１および０）まで処理し、遮光して常温（２５℃）で２４時間撹拌した。本発明者らのＨＰＬＣアッセイによると、低いｐＨレベル（ｐＨ＝１および０）でのみ、脱ホルミル化により適度の量の葉酸が得られた。これらの結果に基づき、酸媒介脱ホルミル化戦略が葉酸の下流の処理に適用可能な可能性があることが確信される。発酵ブロス等の複雑な系におけるホルミルフォレート種のコスト効率の良い脱ホルミル化プロトコルを開発するためには、酸の量および反応温度の更なる最適化が不可欠である。

【0355】

よく撹拌した実施例１６の発酵ブロスを、撹拌子およびｐＨ電極を備える６本の１００ｍＬ丸底フラスコにピペットで移した。塩酸を撹拌しながら滴加し、表１７に記載の幾つかのｐＨ値（ｐＨ＝４、３、２、１、０）を達成した。

【0356】

【表17】

【0357】

発酵混合物を、フラスコをアルミ箔で包んで紫外線から保護して常温（２５℃）で２４時間撹拌した。酸が存在しないが、全く同じ条件下で対照サンプルを調製した（実験１）。２４時間の撹拌後に、１ｍＬの各発酵ブロスを９ｍＬの抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）により二連で希釈した。懸濁液をボルテックスで撹拌し、４５００ｒｐｍで遠心分離し、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ結果を表１８にまとめる。本発明者らのＨＰＬＣアッセイによると、低いｐＨレベル（ｐＨ＝１および０）でのみ、脱ホルミル化により適度の量の葉酸が得られた。結論として、発酵の主要産物である１０－ホルミル葉酸の酸媒介脱ホルミル化が開発された。

【0358】

【表18】

【0359】

塩基媒介脱ホルミル化
化学文献を通覧することで、葉酸がより高ｐＨ値でより高い安定性を示すことを記載している幾つかの報告が確認された。かかるｐＨ値では、葉酸はより高い溶解性を示し、合成操作、精製および下流の処理が簡単になる。したがって、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いた一連のＮ－脱ホルミル化実験において、発酵ブロスからの標的産物の単離を簡単にする、１０－ホルミル葉酸から葉酸へのきれいで効率的な変換を目指す（図９を参照されたい）。１０－ホルミル葉酸の分析標準に対し、０．０１ｍｍｏｌ規模（５ｍｇ）を用いて初期脱ホルミル化実験を行った。

【0360】

代表的な実験手順：
１０－ホルミル葉酸を、撹拌子およびゴム隔膜を備える１０ｍＬ丸底フラスコに秤量した。懸濁液を０．１Ｍ水酸化ナトリウム（５０当量、０．５ｍｍｏｌ、５ｍＬ）で処理し、遮光して常温で２４～４８時間撹拌した。続いて、溶液（１００μＬ）を葉酸抽出バッファー（９００μＬ）で希釈し、ボルテックススターラーでホモジナイズし、ＨＰＬＣで分析した。時間に依存した３つのアリコートをサンプリングし、ＨＰＬＣで分析した。脱ホルミル化の結果を表１９に示す。０．１Ｍ ＮａＯＨによる１０－ホルミル葉酸の脱ホルミル化は、２４時間後の最初のサンプリングにおいて、ほぼ定量的に葉酸へと進行した（表１９、項目１）。４８時間撹拌した後、ＨＰＬＣ分析によると反応が完了まで進行した。同じ条件下で長時間撹拌することで、新たに形成された葉酸が１４４時間（６日間）後でも分解を受けないことが明らかとなった。

【0361】

【表19】

【0362】

１０ｍＬ丸底フラスコ内で１０－ホルミル葉酸（５ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を用いて実験を行った。ＮａＯＨ ０．１Ｍを５０．０当量、５ｍＬで過剰に添加した。実験の開始時の１０－ＦＦＡの質量濃度は、およそ１０００ｍｇ／Ｌである。反応の進行をＨＰＬＣによって測定した。ＨＰＬＣサンプルは、抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）中で調製した。

【0363】

発酵ブロス中の１０－ホルミル葉酸の塩基媒介Ｎ－脱ホルミル化
先の実験では、０．１Ｍ ＮａＯＨを用いた１０－ホルミル葉酸標準物質の脱ホルミル化により、図９に示す葉酸へのきれいな変換が得られることを説明した。ここでは、同じ原理をより複雑な系である発酵ブロスに適用した。脱ホルミル化前の実施例１６からの発酵ブロスのＨＰＬＣ分析では、相当量の１０－ホルミルジヒドロ葉酸（１０Ｆ－ＤＨＦ；６０面積％）；および１０－ホルミル葉酸（１０Ｆ－ＦＡ；４０面積％）が示された。実施例１６からの発酵ブロスのサンプル（１０ｍＬ）を異なるｖ／ｖ比の０．１Ｍ ＮａＯＨ（１：１、１：２、１：３および１：４）で処理し、遮光して常温（２５℃）で２４時間撹拌した。本発明者らのＨＰＬＣアッセイによると、ｖ／ｖ １：１および１：２の発酵ブロス／ＮａＯＨを用いた実験では、表２０（項目２および３）に示されるように、脱ホルミル化ではなく、１０－ホルミルジヒドロ葉酸の１０－ホルミル葉酸への酸化的変換がもたらされた。続いて、ＮａＯＨの量を発酵ブロスに対して増加させると（１：３および１：４）、表２０（項目４および５）に示されるように、相当量の葉酸がＨＰＬＣによって検出された。興味深いことに、相当量の１０Ｆ－ＤＨＦがＨＰＬＣによって検出されることから、より多量のＮａＯＨが１０Ｆ－ＤＨＦの１０Ｆ－ＦＡへの酸化的変換を幾らか妨げていた。

【0364】

代表的な実験手順：
よく撹拌した実施例１６の発酵ブロス（１０ｍＬ）を、撹拌子および遮光用アルミ箔を備える５０～１００ｍＬ丸底フラスコにピペットで移した。水酸化ナトリウム（０．１Ｍ）を滴加し、反応物を常温（２５℃）下で２４時間激しく撹拌した。２４時間の撹拌後に、１ｍＬの各発酵ブロスを９ｍＬの抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）により二連で希釈した。懸濁液をボルテックスで撹拌し、４５００ｒｐｍで遠心分離し、０．２２μｍフィルターで濾過し、ＨＰＬＣで分析した。

【0365】

【表20】

【0366】

５０～１００ｍＬ丸底フラスコ内で実施例１６からの発酵ブロス（ＦＢ３１４８、１０ｍＬ）を用いて実験を行った。ＦＢ３１４８に対する容量／容量比（１：１、１：２、１：３および１：４）に基づいてＮａＯＨ ０．１Ｍを添加した。反応の進行および結果をＨＰＬＣによって測定した。ＨＰＬＣサンプルは、抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）中で調製した。全ての反応物を常温（２５℃）で２４時間、遮光して撹拌した。

【0367】

実施例１９：１０－ホルミル葉酸の単離
収集後に、５０ｇの葉酸を含有する発酵ブロスを、５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ＝１２に調整した。溶液を１００００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離した。上清に５０ｇの水酸化カルシウムを添加し、懸濁液を室温で２時間撹拌した。得られた懸濁液を沈殿させ、デカントし、１００の珪藻土（セライト）を用いて上清液を濾過した。濾過ケーキを５００ｍＬの水で洗浄し、濾過した。濾液を合わせ、１０リットルの最終容量まで希釈した。清澄化した葉酸の希アルカリ溶液を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ７．０に調整し、７０℃に加熱した後、室温まで冷却した。次に、溶液を濾過して、中性ｐＨで沈殿する不純物を除去した。清澄化した濾液を、１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ＝３に調整し、氷上で４時間冷却した。懸濁液を濾別し、ｐＨ＝１２（１Ｍ ＮａＯＨで調整）の熱アルカリ溶液８Ｌに再溶解した。この溶液に５０グラムの活性炭（１当量／葉酸の重量）を添加し、溶液を５０℃に加熱し、３０分間撹拌した。懸濁液を濾過し、濾過ケーキを３Ｌのアルカリ化水溶液（ｐＨ＝１２にＮａＯＨで調整）で洗浄した。濾液を合わせ、撹拌を続けながら１Ｎ ＨＣｌを添加してｐＨを３．０に調整した。得られたスラリーを氷上で２４時間または一晩冷却した。懸濁液を濾別し、ｐＨ＝３（ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整）を有する酸性化水溶液１Ｌに再懸濁した。懸濁液を再び濾過した後、得られた濾過ケーキを凍結および乾燥させて、１０％の水分を含有し、無水ベースで９０．１％の葉酸とアッセイされた４３グラムの葉酸を得た。

【0368】

実施例２０：葉酸の単離
収集後に、３０ｇの葉酸を含有する発酵ブロスを、１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ＝１０に調整した。溶液を１００００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離した。得られた上清を１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．０に調整し、７０℃に加熱した後、室温まで冷却した。次に、１００ｇのセライトを用いて溶液を濾過した。濾過ケーキをｐＨ＝１０（１Ｍ ＮａＯＨで調整）のアルカリ溶液５Ｌに再懸濁した。この溶液に５０グラムの活性炭（１当量／葉酸の重量）を添加し、溶液を５０℃に加熱し、３０分間撹拌した。懸濁液を濾過し、濾過ケーキを２Ｌのアルカリ化水溶液（ｐＨ＝１２にＮａＯＨで調整）で洗浄した。濾液を合わせ、撹拌を続けながら１Ｎ ＨＣｌを添加してｐＨを３．０に調整した。得られた沈殿物を氷上で１６～２４時間冷却した後、濾別し、ｐＨ＝３（ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで調整）を有する酸性化水溶液１Ｌに再懸濁した。懸濁液を再び濾過し、得られた沈殿ケーキを乾燥させて、９２％とアッセイされた２１グラムの１０－ホルミル葉酸を得た。

【0369】

実施例２１．５－メチルフォレートオペロン（ＭＴＨＦ－ＯＰ）のアセンブリ
フォレート生合成遺伝子（ｇｌｙＡ、ｐｕｒＵ、ｙｉｔＪおよびｍｅｔＦ）の合成は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の最適発現のためにコドン最適化された遺伝子ヌクレオチド配列を有する別個の合成ＤＮＡフラグメント（配列番号９１、９２、９３および９４）として行った。制限およびライゲーションの繰り返し工程により、フラグメントを人工オペロンにアセンブリした（実施例３）。ライゲーションの成功に適合した制限末端を確実にするために、ＮｄｅＩおよびＡｓｅＩ制限部位の組合せを使用した。ライゲーションの各工程の後に、組み合わせたフラグメントを次のＰＣＲ増幅に新たな鋳型として使用した。ｙｗｈＬ遺伝子座（配列番号９５）およびスペクチノマイシン選択可能マーカー（配列番号９６）に対する相同性を有する異なる生合成遺伝子を組み合わせるために、オペロンを段階的にアセンブリした。組込み遺伝子座ｙｗｈＬ（特徴付けられていないタンパク質）を新たな染色体組込み部位として選択した。フォレート生合成遺伝子メチル－フォレートオペロン（ＭＴＨＦ－ＯＰ）は、５－メチルテトラヒドロフォレート生合成の最終工程に関与する遺伝子の組合せとして設計されたものであり、強力な構成的Ｐ１５プロモーターの制御下にある（図１４）。ＭＴＨＦ－ＯＰ－Ａオペロン（配列番号９７）において、遺伝子（ｇｌｙＡ、ｐｕｒＵおよびｙｉｔＪ）はネイティブ宿主生物Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から選択され、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）最適遺伝子発現のために付加的にコドン最適化された。さらに、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に由来するホモログ遺伝子（ｍｅｔＦ）をオペロンＭＴＨＦ－ＯＰ－Ｂ（配列番号９８）におけるｙｉｔＪ遺伝子の代替の構築のために使用した。

【0370】

実施例２２：Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の突然変異誘発
メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）突然変異誘発をＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ８２５に対して行った。適切な抗生物質を含む液体ＬＢ培地中で培養物を指数増殖期まで成長させた。次いで、培養物を３０００ＲＰＭで３～５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを滅菌０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、上清を遠心分離によって除去した。ペレットを０．９％ＮａＣｌに再懸濁した。１００μＬの細胞懸濁液を９００μＬの３％メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）に希釈した。細胞を常に撹拌／混合しながら対応する時間にわたってＥＭＳに曝露した。インキュベーション後に、細胞懸濁液１容量当たり１容量の１０～１５％のチオ硫酸Ｎａを添加して、突然変異誘発反応を停止させた。液体を遠心分離によって除去した。細胞ペレットを滅菌０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、上清を遠心分離によって除去した。突然変異誘発した細胞の段階希釈物を、適切な抗生物質を含むＭＢプレートにプレーティングし、３７℃でおよそ４８時間インキュベートした。単一コロニーを５－メチルテトラヒドロフォレート産生についてさらに試験した（実施例２５）。

【0371】

実施例２３：ｑＰＣＲを用いたｍｅｔＥ遺伝子の発現レベルの決定
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ２７７１を液体ＬＢ培地中で指数増殖期まで成長させた。培養物を２容量のＲＮＡ ｐｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｒｅａｇｅｎｔ（QIAGEN）と混合し、４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、－８０℃で凍結するか、または即座に処理した。１ｍｇ／ｍＬリゾチームを含有する２００μＬのＴＥバッファーに細胞ペレットを１５分間再懸濁し、細胞壁を除去した。ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（QIAGEN）を用い、製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡを単離した。得られたＲＮＡは、分光光度法で濃度および品質を確認した。単離したＲＮＡをＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎキット）で処理し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Thermo Scientific）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。得られたｃＤＮＡを希釈し、ｃＤＮＡの最終収率はおよそ２．５ｎｇ／μＬであった。

【0372】

得られたｃＤＮＡをリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）法（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、Applied Biosystems）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Thermo Scientific）検出で分析した。５－Ｍｅ－ＴＨＦ産生株におけるｍｅｔＥ遺伝子の発現をｑＰＣＲによって定量化した。

【0373】

内部標準遺伝子である、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を定量ｑＰＣＲ発現データの正規化のための参照として使用した。Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＢＢ３８を対照株として使用した。ｍｅｔＥ遺伝子の発現は、特定のプライマー対であるＱ＿ｍｅｔＥ＿Ｆ（配列番号７３）およびＱ＿ｍｅｔＥ＿Ｒ（配列番号７４）を用いて決定し、内部標準遺伝子として選択した１６Ｓ遺伝子については、配列番号６９および配列番号７０のプライマー対を使用した。ｑＰＣＲ分析は、ＳｔｅｐＯｎｅ（商標） Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで行い、２－ΔΔＣＴ法を用いて定量化を行った。

【0374】

株ＦＬ２７７１は、出発親株ＦＬ８２５と比較して７０％超下方調節されたｍｅｔＥ遺伝子の発現を有していた（図１５）。

【0375】

実施例２４：５－メチルテトラヒドロフォレート産生株の生成
５－メチルテトラヒドロフォレート産生株を出発株ＶＢＢ３８から開発した（図１３を参照されたい）。組換え株の全フォレート産生能を改善するために２つの重要な遺伝子改変を行った。初めに、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のネイティブｆｏｌＣ遺伝子を破壊し、フォレート上のγ－グルタメートテールの合成を止め、ジヒドロ葉酸シンテターゼ（ＤＨＦＳ）活性のみをコードするｆｏｌＣホモログに置き換え、γ－グルタメートテールを有しない必須のグルタメート部分を１つのみ付加した。したがって、フォレート生合成経路を介した高い代謝フローを確実にするために、細胞から発酵培地へのフォレートの排出の増強が可能表現型を有する株ＦＬ２１を開発した。以下の株開発の工程では、「ｄｅ ｎｏｖｏ」生合成経路（ＧＴＰ前駆体からＴＨＦへ）を上方調節するために、フォレート生合成遺伝子（例えばｆｏｌＥ／ｍｔｒＡ、ｆｏｌＢ、ｆｏｌＫ、ｆｏｌＰ／ｓｕｌ、ｆｏｌＡ／ｄｆｒＡ）の過剰発現を導入した。選択フォレート生合成遺伝子を有する人工フォレートオペロン（ＢＳ－ＦＯＬ－ＯＰ１およびＢＳ－ＦＯＬ－ＯＰ２ － 実施例３を参照されたい）を構築し、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に複数のゲノム位置（ａｍｙＥおよびｌａｃＡ遺伝子座）で組み込み、高レベルの遺伝子発現をもたらした。新たに組み換えた株ＦＬ１８４（ＢＳ－ＦＯＬ－ＯＰ１）および株ＦＬ８２５（ＢＳ－ＦＯＬ－ＯＰ１＋ＢＳ－ＦＯＬ－ＯＰ２）におけるフォレート生合成遺伝子の上方調節により、全フォレートの産生能が出発株と比較して大幅に改善された。

【0376】

５－メチルテトラヒドロフォレートの過剰産生のためのＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の更なる組換え株を、ネイティブｍｅｔＥ遺伝子の下方調節／欠失およびフォレート形態の相互変換（ＴＨＦから５－メチルテトラヒドロフォレートへ）に関与する遺伝子（例えばｇｌｙＡ、ｐｕｒＵ、ｙｉｔＪおよびｍｅｔＦ）の過剰発現によって生成した。ネイティブｍｅｔＥ遺伝子の下方調節は、親株ＦＬ８２５のランダム突然変異誘発および５－メチルテトラヒドロフォレート産生の改善に基づく突然変異株の選択によって達成された。野生型株（０．３５ｍｇ／Ｌ）と比較して顕著に高い力価の５－メチルテトラヒドロフォレート（２２０ｍｇ／Ｌ超）を達成する新たな株ＦＬ２７７１を生成した。株ＦＬ２７７１を全ゲノムシークエンシングのためにさらに選択した。ＦＬ２７７１ゲノムのバイオインフォマティクス分析および祖先出発株Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＫＰＭ Ｂ２１１６の全ゲノム配列データとの比較から、株開発時にランダム突然変異誘発導入された、幾つかの観察されるＳＮＰ変化／突然変異とフォレート代謝サイクルとを合理的に関連付けることができた。１つの突然変異がｍｅｔＥ遺伝子の直接上流に位置し（配列番号７５および配列番号７６）、この突然変異は、５－メチルテトラヒドロフォレートの消費に関与するメチオニンシンターゼをコードする遺伝子の調節領域に位置する。

【0377】

５－メチルテトラヒドロフォレート産生株の開発の最終工程では、フォレート形態の相互変換に極めて重要な遺伝子（ｇｌｙＡ、ｐｕｒＵ、ｙｉｔＪおよびｍｅｔＦ）の過剰発現を行った。選択遺伝子の過剰発現は、１０Ｆ－フォレートと５－メチルテトラヒドロフォレートとの比率を改善するために、５－メチルテトラヒドロフォレート生合成の最終工程に関与する遺伝子（ｇｌｙＡおよびｙｉｔＪ／ｍｅｔＦ）および１０Ｆ－ＴＨＦのＴＨＦへの変換に関与する遺伝子ｐｕｒＵ（ホルミルテトラヒドロ葉酸デホルミラーゼ）から構築される新たなメチルフォレート生合成オペロン（ＭＴＨＦ－ＯＰ）として設計された。新たな遺伝子組換え株ＦＬ５４１６は、３００ｍｇ／Ｌを超える最高の５－メチルテトラヒドロフォレート収率をもたらすことが実証され、５－メチルテトラヒドロフォレート形態は、測定された全フォレートの７５％を占めていた。

【0378】

実施例２５：Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の遺伝子組換え株における異なる形態のフォレートの比率の決定
適切な抗生物質を含むＭＢプレートに株をパッチし、３７℃で２日間インキュベートした。振盪フラスコ実験については、成長させた株をＦａｌｃｏｎ ５０ｍＬコニカル遠心チューブ内の５ｍｌのＭＣ（シード）培地に移し（１プラグ／５ｍｌ）、ロータリーシェーカーにて２２０ＲＰＭおよび３７℃で１６～１８時間培養した。シード培養物の１０％接種材料を用いて５ｍＬの産生培地（ＭＤ＋ｐＡＢＡ５００）に接種した。ロータリーシェーカーにて２２０ＲＰＭおよび３７℃で２４時間、暗所で株を培養した。発酵後に、発酵ブロスのサンプル（２００μｌ）を慎重に回収して均一なサンプルを得て、氷冷抽出バッファー（１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸を含む０．１Ｍリン酸バッファー）で１０倍希釈した。サンプルを１４０００ｒｐｍおよび４℃で１０分間遠心分離し、濾過滅菌した（細孔径０．２２ｕｍ）。異なるフォレート種の定量化については、実施例１３に記載のようにＨＰＬＣ法を用いた。異なるＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株の結果を表２１に示し、発酵ブロスサンプルの代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図６に示す。

【0379】

【表21】

【0380】

異種ｆｏｌＣ－ＡＧおよび過剰発現フォレート生合成遺伝子（フォレートオペロンＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ１、ＦＯＬ－ＯＰ－ＢＳ２およびＭＴＨＦ－ＯＰ－Ｂ）を有する株ＦＬ５４１６は、野生型バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株と比較して１９１４６２％の５－メチルフォレート産生の増加を示した。

【0381】

比較例１
Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）野生型株「１６８」、本発明者らの出発非ＧＭＯ株ＶＢＢ３８（株ＶＫＰＭ Ｂ２１１６＝Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＶＮＩＩ Ｇｅｎｅｔｉｋａ ３０４）、およびネイティブｆｏｌＣ遺伝子が、Ａ．ゴシッピイ（Ａ．ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ２１）またはＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）（Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株ＦＬ２３）のいずれかに由来する異種ｆｏｌＣ２（ＦＯＬ３）遺伝子に１工程で置き換えられた、その形質転換体について全フォレート産生を決定した。株をシェーカー規模（５ｍｌの産生培地ＭＤ）で試験し、フォレート検出のための標準微生物学的アッセイを用いて全フォレートを決定した。

【0382】

結果から、異種ｆｏｌＣ２遺伝子を同時に発現しないＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ネイティブｆｏｌＣ遺伝子単独を欠失させたノックアウト突然変異体が標準培養条件（Ｔ＝３７℃、栄養素に富んだＬＢ培地中で好気的）で成長することができないことが示された。

【0383】

本明細書に引用した参照文献のリスト
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

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【国際調査報告】