特表 2023-533871 免疫療法のためのＡＰＣ標的化単位

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-04

(54)【発明の名称】免疫療法のためのＡＰＣ標的化単位

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230728BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230728BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20230728BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20230728BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230728BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20230728BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20230728BHJP

   C07K 14/005 20060101ALI20230728BHJP

   C07K 14/165 20060101ALI20230728BHJP

   C12N 15/50 20060101ALI20230728BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20230728BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20230728BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20230728BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230728BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230728BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20230728BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230728BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20230728BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230728BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20230728BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20230728BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20230728BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20230728BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20230728BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/12

C12N15/31

C12N15/33

C07K19/00

C07K14/47

C07K14/195

C07K14/005

C07K14/165

C12N15/50

C12N15/85 Z

A61K39/00 H

A61P31/04

A61P31/12

A61P35/00

A61P31/14

A61K48/00

A61P37/04

A61P43/00 105

A61K9/08

A61K47/02

A61K47/20

A61K47/26

A61K47/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023503113

(86)(22)【出願日】2021-07-14

(85)【翻訳文提出日】2023-03-14

(86)【国際出願番号】 EP2021069582

(87)【国際公開番号】W WO2022013277

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】20185743.0

(32)【優先日】2020-07-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】20207526.3

(32)【優先日】2020-11-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】21171319.3

(32)【優先日】2021-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521293464

【氏名又は名称】エヴァクシオン・バイオテック・アクティエセルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】レヌ，ビアギッテ

(72)【発明者】

【氏名】カルボ，マリナ バルリオ

(72)【発明者】

【氏名】セレンセン，アナス ブンゴー

(72)【発明者】

【氏名】チューエセン，クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】クリンゲルム，イェンス

(72)【発明者】

【氏名】フリース，スティーネ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA12

4C076BB01

4C076BB02

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB14

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076BB22

4C076BB24

4C076BB25

4C076BB27

4C076BB29

4C076BB30

4C076BB31

4C076CC27

4C076CC32

4C076CC35

4C076DD23Z

4C076DD26Z

4C076DD57Z

4C076DD67Z

4C076EE23

4C084AA13

4C084MA17

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB211

4C084ZB261

4C084ZB331

4C084ZB351

4C085AA03

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG05

4C085GG06

4C085GG08

4C085GG10

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA86

4H045EA28

4H045EA29

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、免疫療法およびワクチン、例えばがん免疫療法、または細菌もしくはウイルス感染症などの微生物による感染症のためのワクチンに関する。特に、本発明は、特異的な融合ポリペプチドまたはそのような融合ポリペプチドをコードする核酸を投与する事による、がんまたは微生物による感染症を予防または処置するための方法および物に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）少なくとも１つの抗原単位；
ｉｉ）樹状細胞を標的とする、少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位；
ｉｉｉ）任意選択で多量体化単位、例えば二量体化単位であって、２つ以上の抗原単位および２つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位を含むように該融合ポリペプチドの多量体化をもたらす多量体化単位；
を含む、融合ポリペプチド。

【請求項2】

抗原単位が、患者からの腫瘍細胞のネオエピトープである少なくとも１つのエピトープのアミノ酸配列からなる、またはそれを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項3】

抗原単位が患者からの腫瘍細胞のネオエピトープを含まない、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

抗原単位が細菌またはウイルス抗原である、例えば少なくとも１つの細菌またはウイルスエピトープのアミノ酸配列を含む抗原単位である、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

ＡＰＣ標的化単位が成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を標的とする、請求項１～４の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項6】

ＡＰＣ標的化単位が、例えばヒト型の、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１から選択される、請求項１～５の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項7】

ＡＰＣ標的化単位が受容体ＣＣＲ７を標的とする、請求項１～６の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

ＡＰＣ標的化単位が、例えばヒト型の、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、またはＸＣＬ１から選択される、請求項１～４の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項9】

ＡＰＣ標的化単位が未成熟樹状細胞（ｉｍＤＣ）を標的とする、請求項８に記載の融合ポリペプチド。

【請求項10】

ＡＰＣ標的化単位が、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、およびＸＣＲ１から選択される受容体を標的とする、請求項８または９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項11】

ＡＰＣ標的化単位が、抗原提示細胞上の標的表面分子、例えばＣＬＥＣ９ＡまたはＤＥＣ２０５に対する特異性を持つ抗体結合領域、例えば抗－ＣＬＥＣ９Ａ、抗－ＤＥＣ２０５、またはその変異体、例えば抗－ＣＬＥＣ９Ａ Ｆｖ、抗－ＤＥＣ２０５ Ｆｖからなる、またはそれを含む、請求項１～４の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項12】

ＡＰＣ標的化単位がリガンド、例えばＣＥＬＣ９ペプチドリガンドからなる、またはそれを含む、請求項１～４の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項13】

ＡＰＣ標的化単位が、Ｘｃｌ１、ＧＭ－ＣＳＦ、抗－ＤＥＣ－２０５ Ｆｖ、抗－ＣＬＥＣ９ Ｆｖ、およびＣＬＥＣ９リガンドから選択される、請求項１～４の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項14】

ＡＰＣ標的化単位が、サイトカイン、例えばＧＭ－ＣＳＦ、例えばＣＤ１１６に結合するＡＰＣ標的化単位である、請求項１～４の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項15】

抗原単位が、リンカー、例えばＧＳリンカー、例えばアミノ酸配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３）を持つリンカー、または免疫グロブリン分子（Ｉｇ）、例えばＩｇＧに由来するリンカー、例えば鎖間共有結合の形成を介して多量体化に寄与する、および／または非共有結合もしくは相互作用の形成を介して多量体化に寄与するリンカー、を介して標的化単位に連結される、前述の請求項の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項16】

リンカーが、ヒンジ領域、例えばＩｇ、例えばＩｇＧ由来ヒンジ領域、ｄＨＬＸタンパク質、ｈＭＨＤ２、コラーゲン三量体化ドメイン、ｐ５３合成タンパク質、またはフィブリチンＴ４三量体化ドメインである、またはそれを含む、およびリンカーが１）鎖間共有結合、例えばジスルフィド架橋の形成を介して、または２）非共有相互作用を介して多量体化に寄与する、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項17】

リンカーが、カルボキシル末端Ｃドメイン（ＣＨ３ドメイン）、例えばＩｇのカルボキシル末端Ｃドメイン（Ｃγ３ドメイン）、または該Ｃドメインに実質的に相同である配列、例えばＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む、請求項１５～１６の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項18】

ヒンジおよびＣＨ３ドメインがアミノ酸配列ＧＧＧＳＳ（配列番号６６）によって、例えばアミノ酸ＧＧＧＳＳの３重配列（配列番号７２）によって連結されている、またはここでヒンジおよびＣＨ３ドメインがアミノ酸配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号７０）を介して連結されている、請求項１７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項19】

リンカーが、疎水性相互作用を介して、例えばＣＨ３ドメインを介して多量体化に参加する、二量体化モチーフまたは任意のその他の多量体化ドメインを含む、請求項１５～１８の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項20】

リンカーがＩｇＧ、例えばＩｇＧ２またはＩｇＧ３に由来するｈ１＋ｈ４またはｈ４を含むヒンジ領域を含む、請求項１５～１９の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項21】

少なくとも１つの抗原単位が、少なくともまたは約５、例えば少なくともまたは約１０、少なくともまたは約１５、少なくともまたは約２０、少なくともまたは約２５、および少なくともまたは約３０個のエピトープからなる、またはそれを含む、前述の請求項の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項22】

少なくとも１つの抗原単位が、腫瘍細胞において同定されるエピトープ間の平均以上、例えば上位四分の一のＭＨＣ結合安定性を示す少なくとも１つのエピトープを含む、前述の請求項の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項23】

少なくとも１つの抗原単位が、細菌またはウイルス抗原であって、例えば各細菌またはウイルス抗原間の平均以上、例えば上位四分の一のＭＨＣ結合安定性を示す細菌またはウイルス抗原である、前述の請求項の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項24】

抗原単位が、β－コロナウイルス由来の（特にスパイクタンパク質由来）、例えばＳＡＲＳコロナウイルス由来の（特にスパイクタンパク質由来）および好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質由来のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項25】

アミノ酸配列が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質からのリボソーム結合タンパク質（ＲＢＤ）を含む、または構成する、請求項２４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項26】

アミノ酸配列が、ＮＣＢＩ参照配列番号：ＹＰ＿００９７２４３９０の残基３１９～５４１からなる、もしくはそれを含む、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、例えば、それに対して少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、もしくはそれを含む、請求項２５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項27】

多量体化単位、例えば二量体化単位が、二量体、三量体、四量体、五量体またはより高次の多量体の形成を可能にする、前述の請求項の何れか１項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項28】

請求項１～２６の何れか１項において規定される融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。

【請求項29】

ヌクレオチド配列がｃＤＮＡ配列である、請求項２８に記載の発現ベクター。

【請求項30】

ヌクレオチド配列が、請求項１～２７の何れか１項において規定される融合ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列である、請求項２８に記載の発現ベクター。

【請求項31】

配列が、少なくとも１つの免疫刺激配列（ＩＳＳ）をさらに含むかまたはコードする、請求項２８～３０の何れか１項に記載の発現ベクター。

【請求項32】

ＩＳＳが、少なくとも１つのＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）であり、ここでＯＤＮが好ましくはホスホロチオエート基を含む、請求項３１に記載の発現ベクター。

【請求項33】

ＩＳＳがオリゴリボヌクレオチドであるかまたはそれを含む、請求項３１に記載の発現ベクター。

【請求項34】

ｉ）少なくとも１つの抗原単位をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現構築物、およびｉｉ）樹状細胞を標的とする少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現構築物を含む、少なくとも２つの発現構築物の系。

【請求項35】

第１の発現構築物が、請求項２～４および２１～２６の何れか１項において規定される少なくとも１つの抗原単位をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の少なくとも２つの発現構築物の系。

【請求項36】

第２の発現構築物が、請求項５～１４の何れか１項において規定される樹状細胞を標的とする少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３４～３５の何れか１項に記載の少なくとも２つの発現構築物の系。

【請求項37】

少なくとも１つの抗原単位をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現構築物が、該少なくとも１つの抗原単位の多量体化をもたらす多量体化単位、例えば二量体化単位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３４～３７の何れか１項に記載の少なくとも２つの発現構築物の系。

【請求項38】

少なくとも２つの発現構築物が、同一の発現ベクター上で発現される、例えば２つの異なるプロモーターの制御下において発現される、請求項３４～３７の何れか１項に記載の少なくとも２つの発現構築物の系。

【請求項39】

少なくとも２つの発現構築物が、少なくとも２つの異なるベクターによって発現される、請求項３４～３７の何れか１項に記載の少なくとも２つの発現構築物の系。

【請求項40】

特異的な疾患抗原単位、例えば患者において通常の細胞によって発現されないエピトープまたは患者にとって外来のものであるエピトープを示す事によって特徴づけられる疾患の処置のための方法であって、ここで該方法は、請求項１～２７の何れか１項に規定される融合ポリペプチド、請求項２８～３３の何れか１項に規定される少なくとも１つの発現ベクター、または請求項３４～３９の何れか１項に記載の少なくとも２つの発現構築物の系を含む免疫原的有効量の組成物を投与し、それによって患者の体細胞が発現ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現するようになる工程を含み、およびここで該方法は、任意選択で、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を投与する工程をさらに含む、方法。

【請求項41】

哺乳類患者において、腫瘍、例えば悪性腫瘍を処置するための方法、または係る腫瘍に対する治療的または改善的な免疫応答を誘導する方法であって、ここで腫瘍は患者の非腫瘍性細胞が示さないエピトープ（ネオエピトープ）を示し、ここで該方法は、請求項１～２２および請求項１～２２に従属する限りにおける請求項２７の何れか１項において規定される融合ポリペプチド、または請求項１～２２の何れか１項に従属する限りにおける請求項２８～３３の何れか１項において規定される少なくとも１つの発現ベクター、または請求項１～２２の何れか１項に従属する限りにおける請求項３４～３９の何れか１項に記載の少なくとも２つの発現構築物の系を含む、免疫原的有効量の組成物を投与し、それによって患者の体細胞が発現ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現するようになる工程を含み、およびここで該方法は、任意選択で、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を投与する工程をさらに含む、方法。

【請求項42】

細菌またはウイルス感染症の処置のための方法であって、ここで細菌またはウイルスは該細菌またはウイルスに特異的な抗原単位を示す事によって特徴づけられ、ここで該方法は、請求項１～２７の何れか１項に規定される融合ポリペプチド、請求項２８～３３の何れか１項に規定される少なくとも１つの発現ベクター、または請求項３４～３９の何れか１項に記載の少なくとも２つの発現構築物の系を含む免疫原的有効量の組成物を投与し、それによって患者の体細胞が発現ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現するようになる工程を含み、ここで該方法は、任意選択で、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を投与する工程をさらに含み、ここで該ウイルス感染症が好ましくはβ－コロナウイルス、例えばＳＡＲＳコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症であり、およびここで該融合ポリペプチドが請求項２４～２６の何れか１項において規定される、方法。

【請求項43】

患者がヒトである、請求項４０～４２の何れか１項に記載の方法。

【請求項44】

免疫原的有効量の組成物が、非経口的、例えば筋肉内経路、皮内経路、経皮経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、髄腔内経路、骨髄内経路、髄腔内経路、脳室内経路、腹腔内、鼻腔内経路、膣経路、眼内経路、もしくは肺経路で投与される；または経口経路、舌下経路、頬経路、または肛門経路で投与される；または局所投与される、請求項４０～４２の何れか１項に記載の方法。

【請求項45】

薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤が水性緩衝液である、請求項４０～４４の何れか１項に記載の方法。

【請求項46】

水性緩衝液がタイロード緩衝液である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

タイロード緩衝液が、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）、ｐＨ７．４、および１０ｍＭ グルコースの組成を有する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

タイロード緩衝液の濃度が約３５％ｖ／ｖである、請求項４６～４７の何れか１項に記載の方法。

【請求項49】

緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項４５に記載の方法。

【請求項50】

請求項１０～１５の何れか１項において規定される少なくとも１つの発現ベクターを含む免疫原的有効量の組成物を、０．１μｇから２５ｍｇの発現ベクターの有効量で、例えば０．５μｇから２０ｍｇ、５μｇから１５ｍｇ、５０μｇから１０ｍｇ、および５００μｇから８ｍｇ、特に、約０．０００１、約０．０００５、約０．００１、約０．００５、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７および約８ｍｇで投与する事を含む、請求項４０～４９の何れか１項に記載の方法。

【請求項51】

免疫原的有効量の組成物が、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む、有効量の両親媒性ブロック共重合体、例えばＫｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}Ｐ１８８をさらに含む、請求項４０～５０の何れか１項に記載の方法。

【請求項52】

処置方法における使用のための請求項５～１４の何れか１項において規定される抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位であって、ここで該方法は、抗原単位、例えば選択のエピトープを含む抗原単位を哺乳類患者における樹状細胞へと向かわせる工程を含み、および例えば請求項１～２７の何れか１項において規定される構築物中のものである、抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、免疫療法、例えばがん免疫療法、または微生物による感染症、例えば細菌もしくはウイルス感染症のための免疫療法およびワクチンに関する。特に、本発明は特異的な融合ポリペプチドまたは当該融合ポリペプチドをコードする核酸を投与する事による、がんまたは微生物による感染症を処置または予防するための方法および物に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
患者における悪性腫瘍の処置は、伝統的に外科手術、放射線治療、および／または非悪性細胞の死滅に比して悪性細胞を優先的に死滅させることを狙いとした投与レジメンにおける、細胞傷害性薬剤を用いた化学療法によって、悪性組織の根絶／除去することに焦点を当ててきた。

【0003】

細胞傷害性薬剤の使用に加えて、より最近のアプローチでは、従来の化学療法によって現れる全身の副作用を軽減するために、がん細胞において特異的な生物学的なマーカーを標的とすることに焦点を当てている。がん関連抗原を標的としたモノクローナル抗体療法は、多くの悪性腫瘍において、平均余命の延長に非常に効果的であることを示した。成功した薬ではあるが、がん関連抗原を標的とするモノクローナル抗体は、その性質上、周知の、および複数の患者で見られる発現産物を標的とするようにのみ開発され得る、つまり、下記を参照するように、多くのがん特異的抗原は、一人の患者からの腫瘍のみに現れるため、がん特異的抗原の大多数はこの種の治療法で取り扱うことができない。

【0004】

早くも１９５０年代後半に、ＢｕｒｎｅｔおよびＴｈｏｍａｓによって提唱された免疫監視理論では、リンパ球が、変化した抗原決定基を示す自家細胞－がん細胞を含む－を認識および排除する事を示唆し、および今日では免疫系が高度に発がんを阻害することが一般的に受け入れられている。しかし、免疫監視は１００％有効ではなく、がん細胞を排除する免疫系の能力を改善する／刺激するような、がん療法を考案する事は継続的な課題である。

【0005】

１つのアプローチは、がん関連抗原に対する免疫を誘導する事であり、このアプローチは有効な可能性が有るが、限られた数の抗原しか取り扱えないという、抗体療法と同様の欠点を負っている。

【0006】

全てとは言わないが、多くの腫瘍は変異を発現している。これらの変異は、新規の標的抗原（ネオ抗原）を作りだす可能性があり、臨床的に適切な時間内にネオ抗原およびその抗原決定基を同定する事が可能であれば、ネオ抗原は、特異的Ｔ細胞免疫療法において有効である可能性がある。現代技術を用いれば、細胞のゲノムを完全にシーケンスする事、および変化したまたは新たな発現産物の存在を解析する事が可能であるため、ネオ抗原に基づく個別化ワクチンの設計が可能である。しかし、満足のいく臨床結果を提供しようとする試みは、今日のところほとんど失敗している。

【0007】

１９９０年代初頭から詳細に研究されてきたワクチン接種の１つの様式が、核酸ワクチン接種（またはＤＮＡワクチン接種と呼ばれる）であり、これにおいては、ＤＮＡは非ウイルス性のプラスミドの形態で哺乳類の体細胞に投与され、プラスミド内に含まれる遺伝子の発現をもたらす；ＤＮＡワクチン接種において、コードされる物質は免疫原性のポリペプチドであり、体細胞で産生された際、免疫反応を誘導することができる。このアプローチは、高価な組み換え発現システムを用いて、臨床グレードの純度でタンパク質免疫原を生産する必要を回避するため、魅力的である。しかし、投与されたＤＮＡから、ヒトにおいて満足のいく免疫応答を引き起こすのに十分な発現量を得る事が困難であることが示されてきた。

【0008】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）は効果的な適応免疫応答に不可欠であり、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体化した抗原を自身の表面上に提示する細胞である。この細胞には、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞が含まれ、ヘルパーＴ細胞に外来抗原を提示する。また、ウイルスに感染した細胞またはがん細胞は細胞内部に由来する抗原を細胞障害性Ｔ細胞に提示する事ができる。結論として、抗原提示細胞を標的とする事で、優れた免疫応答を誘導する機会を得る事ができる。

【0009】

抗がんワクチンなどの腫瘍細胞（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ）に対するワクチンに加えて、細菌およびウイルスを含む微生物などの外来抗原に対する改善したかまたは効果的なワクチン、特に、ネオ抗原に加えて細菌およびウイルス抗原を効果的に標的とし得る、且つワクチン接種したヒトにおいて臨床的に顕著な免疫応答を誘導し得る核酸ワクチンを提供する必要性が存在する。

【0010】

発明の目的
本発明の実施形態の目的は、優れた抗微生物効果または抗腫瘍効果を有し、知られたワクチンよりも高いＴ細胞応答を誘導し得るポリペプチド構築物およびそのようなポリペプチド構築物をコードする核酸分子を提供する事である。

【0011】

本発明の実施形態のさらなる目的は、ＡＰＣへと向かい、ＡＰＣによる細菌もしくはウイルス由来の抗原単位またはがんのネオエピトープの取り込みを補助する、任意には、がん、細菌またはウイルスに対する非常に効果的な防御免疫の提供を可能にするサイトカインカスケードを伴うＡＰＣの活性化を補助するように設計されたポリペプチド構築物およびそのようなポリペプチド構築物をコードする核酸分子を提供することである。

【0012】

本発明の実施形態のさらなる目的は、ポリペプチド構築物およびそのようなポリペプチド構築物をコードする核酸の使用方法の提供する事である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0013】

発明の概要
本発明者らは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）－標的化単位を利用した次世代核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）免疫療法、例えばネオエピトープ免疫療法または感染性病原体を標的とする免疫療法を生み出す新規且つ改良されたポリペプチド構築物およびそのようなポリペプチド構築物をコードする核酸分子を設計した。

【0014】

本発明らによって、ＡＰＣの標的化を、ネオエピトープワクチンの抗腫瘍活性を維持したまま、免疫治療効果を向上させるために使用してもよく、これは知られるワクチンよりも高いＴ細胞応答を引き出す優れた抗腫瘍効果を可能にする事が見出された。また、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質などのウイルス抗原も、本質的に同じ技術によって成功裏に対処し得ることが見出されている。

【0015】

よって、第１の態様では、本発明は、
ｉ）少なくとも１つの抗原単位；
ｉｉ）樹状細胞を標的とする、少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位；
ｉｉｉ）任意選択で多量体化単位、例えば二量体化単位であって、２つ以上の抗原単位および２つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位を含むように該融合ポリペプチドの多量体化をもたらす多量体化単位；
を含む、融合ポリペプチドに関する。

【0016】

第２の態様では、本発明は、本発明の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターに関する。

【0017】

さらなる態様では、本発明は、ｉ）少なくとも１つの抗原単位をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現構築物、およびｉｉ）樹状細胞を標的とする少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現構築物、を含む少なくとも２つの発現構築物の系に関する。

【0018】

さらなる態様では、本発明は、特異的な疾患抗原単位、例えば患者において通常の細胞によって発現されないエピトープまたは患者にとって外来のものであるエピトープを示す事によって特徴づけられる疾患の処置のための方法であって、ここで該方法は、本発明の融合ポリペプチド、本発明の少なくとも１つの発現ベクター、または本発明の少なくとも２つの発現構築物の系を含む免疫原的有効量の組成物を投与し、それによって患者の体細胞が該発現ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現するようになる工程を含み、およびここで該方法は、任意選択で、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を投与する工程をさらに含む、方法に関する。

【0019】

さらなる態様では、本発明は、哺乳類患者において、腫瘍、例えば悪性腫瘍を処置するための方法、または係る腫瘍に対する治療的または改善的な免疫応答を誘導する方法であって、ここで腫瘍は患者の非腫瘍性細胞が示さないエピトープ（ネオエピトープ）を示し、ここで該方法は、本発明の融合ポリペプチド、または本発明の少なくとも１つの発現ベクター、または本発明の少なくとも２つの発現構築物の系を含む、免疫原的有効量の組成物を投与し、それによって患者の体細胞が該発現ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現するようになる工程を含み、およびここで該方法は、任意選択で、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を投与する工程をさらに含む、方法に関する。

【0020】

さらなる態様では、本発明は、細菌またはウイルス感染症の予防または処置のための方法であって、ここで細菌またはウイルスは該細菌またはウイルスに特異的な抗原単位および／またはエピトープのセットを示す事によって特徴づけられ、ここで該方法は、本発明の融合ポリペプチド、本発明の少なくとも１つの発現ベクター、または本発明の少なくとも２つの発現構築物の系を含む免疫原的有効量の組成物を投与し、それによって患者の体細胞が該発現ベクター内に含まれるヌクレオチド配列を発現するようになる工程を含み、ここで該方法は、任意選択で、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を投与する工程をさらに含む、方法に関する。好ましくは、該ウイルス感染症はβ－コロナウイルス、例えばＳＡＲＳコロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症であり、このような実施形態では、融合タンパク質は、抗原単位がβコロナウイルスに由来する、上記に開示する融合タンパク質の何れか１つであり得る。

【0021】

いくつかの実施形態では、患者はヒトである。いくつかの実施形態では、免疫原的有効量の組成物は、非経口的、例えば筋肉内経路、皮内経路、経皮経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、髄腔内経路（ｉｎｔｒａｔｅｃｈａｌ ｒｏｕｔｅ）、骨髄内経路（ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｒｏｕｔｅ）、髄腔内経路、脳室内経路、腹腔内、鼻腔内経路、膣経路、眼内経路、もしくは肺経路で投与される；または経口経路、舌下経路、頬経路、または肛門経路で投与される；または局所投与される。

【0022】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤は水性緩衝液である。いくつかの実施形態では、水性緩衝液はタイロード緩衝液である。いくつかの実施形態では、タイロード緩衝液は１４０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）、ｐＨ７．４、および１０ｍＭ グルコースの組成を有する。いくつかの実施形態では、タイロード緩衝液の濃度は約３５％ｖ／ｖである。いくつかの実施形態では、水性緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液である。

【0023】

いくつかの実施形態では、方法は、請求項１０～１５の何れか１項において規定される少なくとも１つの発現ベクターを含む免疫原的有効量の組成物を、０．１μｇから２５ｍｇの発現ベクターの有効量で、例えば０．５μｇから２０ｍｇ、５μｇから１５ｍｇ、５０μｇから１０ｍｇ、および５００μｇから８ｍｇ、特に、約０．０００１、約０．０００５、約０．００１、約０．００５、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７および約８ｍｇで投与する事を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、方法は、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む、有効量の両親媒性ブロック共重合体、例えばＫｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}Ｐ１８８、をさらに含む免疫原的有効量の組成物を投与する事を含む。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１：好適な融合ポリペプチドの１つの提案される設計およびそれをコードするＤＮＡの図。この例では、構築物はＣＣＬ３またはその他サイトカイン／ケモカインであるＡＰＣ標的化単位；ヒンジ（ｈ１およびｈ４）およびＩｇＧ３由来のＣＨ３を含む二量体化単位；ならびにネオエピトープである抗原単位を含む。

【0026】

【図2】図２：図１に示すようなＤＮＡワクチンの作用機序の図。

【0027】

【図3A】図３：本発明の融合ポリペプチドの設計のための異なるＡＰＣ標的化単位の図。Ａ）は実施例１の構築物を示し、一方、Ｂ）は実施例２の構築物を示す。

【図3B】同上。

【0028】

【図4】図４：Ａｌｄｅｖｒｏｎ社製のｐＵＭＶＣ４のプラスミドマップ。詳細は実施例および配列番号２９に記載する。

【0029】

【図5】図５：ＡＰＣ標的化の設計例として、ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａのプラスミドマップ。ｐＵＭＶＣ４ベクターは、ｋｏｚａｋ配列、ＡＰＣ標的化単位としてマウスＣＣＬ１９、ヒンジ１、ヒンジ４およびヒトＩｇＧ由来のＣｈ３、続いて５つのネオエピトープＣ２２、Ｃ２３、Ｃ３８、Ｃ２５、Ｃ３０をコードするインサートを含む。

【0030】

【図6】図６：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}およびワクチンプラスミドをワクチン接種したマウスにおける腫瘍容積の減少。ＡＰＣ標的化ワクチンをコントロール群（未処置マウスまたは空のモックプラスミドで処置したマウス）と比較した。＊：ｐ＜０．０５（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ｔｅｓｔ）。詳細は実施例１を参照。

【0031】

【図7】Ｃ２２ ＭＨＣＩ多量体の検出を示す図。グラフは実験ＤＮＡワクチンでマウスにワクチン接種した際の、Ｃ２２ペプチドに反応するマウスＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。詳細は実施例１を参照。

【0032】

【図8】図８：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}およびワクチンプラスミドでワクチン接種されたマウス由来のＴ細胞におけるＩＦＮ－γ産生。詳細は実施例１を参照。

【0033】

【図9】図９：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}およびワクチンプラスミドでワクチン接種したマウスにおける腫瘍容積の減少。詳細は実施例２を参照。

【0034】

【図10】図１０：Ｃ２２ ＭＨＣＩ多量体の検出を示す図。グラフは実験ＤＮＡワクチンでマウスにワクチン接種した際の、Ｃ２２ペプチドに反応するマウスＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。詳細は実施例２を参照。

【0035】

【図11】図１１：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}およびワクチンプラスミドでワクチン接種されたマウス由来のＴ細胞におけるＩＦＮ－γ産生。詳細は実施例２を参照。

【0036】

【図12】図１２：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}およびワクチンプラスミドでワクチン接種したマウスにおける腫瘍容積の減少。詳細は実施例３を参照。

【0037】

【図13】図１３：Ｃ２２ ＭＨＣＩ多量体の検出を示す図。グラフは実験ＤＮＡワクチンでマウスにワクチン接種した際の、Ｃ２２ペプチド－搭載ＭＨＣＩ 四量体に反応するマウスＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。詳細は実施例３を参照。

【0038】

【図14】図１４：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}およびワクチンプラスミドでワクチン接種されたマウス由来のＴ細胞におけるＩＦＮ－γ産生。詳細は実施例３を参照。

【0039】

【図15】図１５：本発明の融合タンパク質の別々の単位をコードするＤＮＡ設計の図。実施例４の構築物を示す。

【0040】

【図16】図１６：Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}およびワクチンプラスミドでワクチン接種したマウスにおける腫瘍容積の減少。詳細は実施例４を参照。

【0041】

【図17】図１７：Ｃ２２ ＭＨＣＩ多量体の検出を示す図。グラフは実験ＤＮＡワクチンでマウスにワクチン接種した際の、Ｃ２２ペプチド搭載ＭＨＣＩ四量体に反応するマウスＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す。詳細は実施例４を参照。

【0042】

【図18】図１８：本発明のＤＮＡ設計。

【0043】

【図19】図１９：選択されたＡＰＣ標的化候補の設計の模式図。

【0044】

【図20】図２０：本発明の融合タンパク質の模式図。

【0045】

【図21】図２１：本発明のベクターのプラスミドマップ。

【0046】

【図22】図２２：ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける、脾臓細胞からのＩＦＮ－γ放出を示す棒グラフ。

【0047】

【図23】図２３：本発明の構築物によって誘導された抗体の力価を示す散布図および棒グラフ。

【0048】

【図24】図２４：血清のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性の比較を示す棒グラフ。

【0049】

本発明の詳細な開示
ＤＮＡ免疫療法またはワクチン、例えば樹状細胞を標的とするＡＰＣ標的化エレメントを含むＤＮＡネオエピトープ免疫療法は、ｉ）ＡＰＣによるネオエピトープの取り込みの指向および補助、および／またはｉｉ）サイトカインカスケードが続くＡＰＣの活性化、の何れかによって、それを持たないＤＮＡ技術と比較して優れた効果、例えば抗腫瘍効果を有し、且つより高いＴ細胞応答を引き起こし得る事が期待される。

【0050】

本発明の融合ポリペプチド構築物は、抗原単位、例えばがん、細菌またはウイルス抗原の抗原単位、例えばこの微生物のエピトープを含む細菌またはウイルス抗原の抗原単位、またはエピトープ、ネオペプチド、例えば患者の非腫瘍細胞によって示されないＴ細胞エピトープを含む抗原単位を含む。

【0051】

抗原単位はウイルスまたは細菌に由来し得る。抗原単位が由来する、および本発明の融合ポリペプチドと共に使用するためのウイルスの例には、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、インフルエンザ、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコロナウイルス、コロナウイルスなどを含むがこれに限定されない。レトロウイルス抗原の非限定な例は、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、例えばｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素および他のＨＩＶ成分、に由来するレトロウイルス抗原である；肝炎ウイルス抗原は、例えばＢ型肝炎ウイルスのＳ、Ｍ、およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原、および他の肝炎ウイルス、例えばＡ型、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス成分、例えばＣ型肝炎ウイルスＲＮＡである；インフルエンザウイルス抗原は、例えばヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼおよび他のインフルエンザウイルス成分である；麻疹ウイルス抗原は、例えば麻疹ウイルス融合タンパク質および他の麻疹ウイルス成分である；風疹ウイルス抗原は、例えばＥ１およびＥ２タンパク質および他の風疹ウイルス成分である；ロタウイルス抗原は、例えばＶＰ７ｓｃおよび他のロタウイルス成分である；サイトメガロウイルス抗原は、例えばエンベロープ糖タンパク質Ｂおよび他のサイトメガロウイルス抗原成分である；呼吸器合胞体ウイルス抗原は、例えばＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質および他の呼吸器合胞体ウイルス抗原成分である；単純ヘルペスウイルス抗原は、例えば全初期タンパク質（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）、糖タンパク質Ｄおよび他の単純ヘルペスウイルス抗原成分である；水痘帯状疱疹ウイルス抗原は、例えばｇｐｌ、ｇｐｌｌおよび他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分である；日本脳炎ウイルス抗原は、例えば、タンパク質Ｅ、Ｍ－Ｅ、Ｍ－Ｅ－ＮＳｌ、ＮＳｌ、ＮＳ１－ＮＳ２Ａ、８０％Ｅおよび他の日本脳炎ウイルス抗原成分である；狂犬病ウイルス抗原は、例えば狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質および他の狂犬病ウイルス抗原成分である。ウイルス抗原のさらなる例は、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ａｎｄ Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照のこと。

【0052】

本発明の融合ポリペプチドに組み込まれる抗原単位は、アデノウイルス、レトロウイルス、ピコロナウイルス、ヘルペスウイルス、ロタウイルス、ハンタウイルス、コロナウイルス、トガウイルス、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｒｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ブニヤウイルス、アレナウイルス、レオウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス、ヘプタドナウイルス、またはスポンジフォームウイルス由来であり得る。ある特定の非限定的な例では、ウイルス抗原は、ＨＩＶ、ＣＭＶ、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎、インフルエンザ、麻疹、ポリオ、天然痘、風疹；呼吸器合胞体、単純ヘルペス、水痘帯状疱疹、エプスタイン－バー、日本脳炎、狂犬病、インフルエンザ、および／または風邪ウイルスの少なくとも一つから得られたペプチドである。

【0053】

用語「抗原単位」とは、物質中の領域、例えば免疫系の特異的認識成分（抗体、Ｔ細胞）によって認識される外来生物の一部などを示す。

【0054】

「ネオエピトープ」は、ネオエピトープをコードする遺伝子の欠失によって、個体における通常の体細胞由来の発現産物として存在しないが、同個体の変異した細胞（例えばがん細胞）において発現産物として存在する、抗原決定基（典型的にはＭＨＣクラスＩまたはＩＩに拘束されるエピトープ）である。その結果、ネオエピトープは免疫学的な観点からみて、自己起源にも関わらず真に非自己であって、およびそのためネオエピトープが発現産物を構成する個体において、ネオエピトープは腫瘍特異的抗原として特徴づけられ得る。非自己であるため、ネオエピトープは、個体において特異的な適応免疫応答を引き起こし得る可能性があり、その際、誘発される免疫応答はネオエピトープを有する抗原および細胞に対して特異的である。一方、ネオエピトープは、同じネオエピトープが他の個体で発現産物となる可能性が最小限であるため、個体に対して特異的である。よってネオエピトープは例えば腫瘍特異的抗原のエピトープとは異なるいくつかの特徴がある：後者は典型的には同じ種類の複数のがんに見られる（活性化されたがん遺伝子からの発現産物である可能性があるため）、および／または、がん細胞における関連遺伝子の過剰発現によって、わずかな量ではあるが、非悪性細胞において存在し得る。

【0055】

「ネオペプチド」は自身の配列内に本文中で規定されるネオエピトープを含むペプチド（すなわち約５０アミノ酸残基までのポリアミノ酸）である。ネオペプチドは典型的には「天然」である、すなわち該ネオペプチドのアミノ酸配列全体が個体から単離され得る発現産物のフラグメントを構成するが、しかしネオペプチドはまた、「人工的」なもので有り得る、つまり、ネオペプチドは、ネオエピトープの配列および少なくとも１つが該ネオエピトープの配列と天然に関連していない１つまたは２つの付加アミノ酸配列によって構成される。後者の場合において、付加アミノ酸配列は、単にネオエピトープの担体として働くか、またはさらにネオエピトープの免疫原性を向上させ得る（例えば、抗原提示細胞によるネオペプチドの処理を促進したり、ネオペプチドの生物学的な半減期を改善したり、または溶解度を変える事によって）。

【0056】

「ネオ抗原」とはネオエピトープを含む任意の抗原である。典型的にはネオ抗原はタンパク質から構成されるが、ネオ抗原はまた、その長さによってネオエピトープまたはネオペプチドと同一で有り得る。

【0057】

「アミノ酸配列」という用語は、ペプチドおよびタンパク質の鎖中で、ペプチド結合によって連結したアミノ酸残基の順番である。配列は慣習的にＮ末端からＣ末端の方向に記載される。

【0058】

本発明の融合ポリペプチド構築物は、少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位をさらに含む。

【0059】

抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、腫瘍組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体化した抗原をその細胞表面に提示する細胞であり、この過程は抗原提示として知られる。分化した抗原提示細胞にはマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞を含み、ウイルス感染細胞（またはがん細胞）がその細胞内由来の抗原を細胞障害性Ｔ細胞に提示し得るのに対して、これらは外来抗原をヘルパーＴ細胞に提示する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位は、ＡＰＣ上の異なる表面分子を特異的に標的とする事などによって、これらのＡＰＣを特異的に標的化するために好適な任意の分子またはリガンドである。

【0060】

本発明において使用される好適な標的化単位は以下および対応するヒト配列を含む：

【表1】

【0061】

本発明において使用される好適な標的化単位は、Ｔａｋａｓｈｉ Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１ Ｍａｒ ２４；１１７（１２）：３２８６－３２９３；Ｃａｇａｎ Ｇｕｒｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００８ Ａｕｇ １５；１１２（４）：１２３１－１２３９；Ｗａｎ－Ｌｕｎ Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１７）９（４），３４７－３６０ ；Ｇｅｒｔｙ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｌｔ ｅｔ ａｌ．ＢＬＯＯＤ，８ ＭＡＲＣＨ ２０１２，ＶＯＬＵＭＥ １１９， ＮＵＭＢＥＲ １０；およびＺｈｏｎｇｙｉ Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２６，Ｍａｙ ２０１６，ｐ．４０４３７の内の何れか１つにおいて開示されている。

【0062】

定義
本明細書で使用する場合、「未成熟樹状細胞（ｉｍＤＣ）」とは、１つ以上の古典的な樹状細胞表面マーカー、ＣＤ１ａ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４０、ＨＬＡＤＲおよび主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）の発現によって特徴づけられる原始的な未成熟樹状細胞のサブタイプを示す。

【0063】

本明細書で使用する場合、「成熟樹状細胞（ｍＤＣ）」とは、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６などの表面成熟マーカーの上方制御のレベルによって特徴付けられる樹状細胞のサブタイプを示す。

【0064】

本明細書の文脈において、「発現構築物」とは、必要な遺伝子エレメントを含むヌクレオチド配列であって、これにより宿主細胞は発現構築物中に存在するコード配列を発現する事ができる－このようなものとして、発現構築物は発現ベクター、典型的にはプラスミドまたはウイルス中に組み込まれる。発現構築物は最小限として、プロモーター／エンハンサー領域、ならびに、開始コドンによって開始する、および終止コドンによって終結するコード配列を含む。さらに、発現構築物は、リボソーム結合部位および転写終結配列を含み得る。さらに、様々な調節エレメントが発現構築物中に含まれ得る。

【0065】

本明細書に使用される場合、「リンカー」とは、２つ以上の異なるまたは同一の直鎖状ペプチド配列またはサブユニットを多量体ポリペプチドへと組み立てるために好適な任意の化合物を示す。この用語は、ペプチド化学において有用とされる任意のリンカーを含む。多量体ポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、直鎖状に標準的なペプチド結合で組み立てまたは連結され得るため、リンカーという用語はまた、「ペプチドスペーサー」（「スペーサー」とも呼ばれる）を含む。リンカーが本発明の融合ポリペプチドにおけるコードされるネオエピトープ同士を分離するため、または融合ポリペプチドのネオエピトープを融合ポリペプチドの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位から分離するための両方に使用され得る事が理解されるはずである。

【0066】

リンカーは「リジッド」であってよく、これはリンカーが接続する２つのアミノ酸配列が、互いに自由に動くことを実質的に許さないことを意味する。同様に「フレキシブル」なリンカーでは、リンカーを介して接続された２つの配列が互いに実質的に自由に動くことが可能である。１つ以上のネオエピトープを含むコードされた発現産物において、どちらの型のリンカーも有用である。

【0067】

本発明において使用される発現ベクターにコードされ得る、関心のあるリンカーを以下の表に示す：

【表2】

【0068】

いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド配列である。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチド配列ではない。いくつかの実施形態では、リンカーは分岐ペプチド配列ではない。

【0069】

いくつかの実施形態では、リンカーは、それ自身、ネオエピトープ配列および／または抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位に由来するかまたは同一であるペプチド配列を含まない。

【0070】

いくつかの実施形態では、リンカーはＩｇＧ由来など、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）に由来する。

【0071】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ヒンジ領域、例えばフレキシブルなヒンジ領域、例えばＩｇＧ由来などの免疫グロブリン分子（Ｉｇ）に由来するヒンジ領域であるかまたはこれを含む。

【0072】

本発明に従って使用される代替の好適なリンカーは以下である：

【表3】

【0073】

したがって、いくつかの実施形態では、リンカーはＩｇＭに由来するヒンジ領域を含むかまたはそれからなる、および／または配列番号５１にコードされる配列に由来する二量体化モチーフを含むかまたはそれからなる。

【0074】

いくつかの実施形態では、リンカーは、三量体化ドメイン、例えばコラーゲン三量体化ドメイン、例えば配列番号５２にコードされる配列に由来する三量体化ドメインを含むかまたはそれからなる。

【0075】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ｈＭＨＤ２またはｄＨＸＬに由来する二量体化を含むかまたはそれからなり、任意には、本明細書に記載のＨ１などのヒンジ領域をさらに含み得る。

【0076】

いくつかの実施形態では、リンカーは、四量体化ドメイン、例えばｐ５３に由来するドメイン、例えば配列番号５３にコードされる配列に由来する四量体化ドメインを含むかまたはそれからなり、任意には、本明細書に記載のＨ１などのヒンジ領域をさらに含む。

【0077】

本発明に従って使用するために好適なリンカーはまた、以下の何れか１つにも記載されている：Ａｎａ Ａｌｖａｒｅｚ－Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ ｅｔ ａｌ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１６、６：２８６４３｜ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ２８６４３；Ｖｉｃｔｏｒ Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ａｒｅｖａｌｏ Ｌｏｂｏ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：１１９、４５５－４６２（２００６）；Ｏｌｉｖｅｒ Ｓｅｉｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．２５ｎｏ．１０ｐｐ．６０３－６１２、２０１２；およびＪｏｒｇ Ｗｉｌｌｕｄａ ｅｔ ａｌ．ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖｏｌ．２７６、Ｎｏ．１７、Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒｉｌ ２７、 ｐｐ．１４３８５－１４３９２、２００１。

【0078】

本明細書で使用される場合、「免疫原性の担体」または「薬学的に許容できる担体」は免疫原／ハプテンに対する免疫応答を増強するまたは誘発を可能にするために、免疫原またはハプテンと結合し得る分子または部分である。免疫原性の担体は、従来的には、自身の権能では免疫原性が不十分な免疫原／ハプテンに融合またはコンジュゲートし得る比較的大きな分子（例えば、破傷風トキソイド、ＫＬＨ、ジフテリアトキソイドなど）であって、典型的には、免疫原性の担体は、免疫原および免疫原性の担体によって構成される結合物質に対する強力なＴヘルパーリンパ球の応答を誘発し得る、よってこれはＢリンパ球および細胞傷害性リンパ球による免疫原に対しての増強した応答を供する。より最近では、大きな担体分子は、無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｔヘルパーエピトープと呼ばれる、すなわち、集団のＨＬＡハプロタイプの大部分に認識される、およびＴヘルパーリンパ球の応答を誘発する、より短いペプチドにある程度代替されている。

【0079】

「Ｔヘルパーリンパ球応答」は、ペプチドによって誘発される免疫応答であって、該ペプチドは、抗原提示細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子）に結合する事ができ、および該ペプチドおよび該ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子の複合体をＴ細胞受容体が認識する結果として、動物種においてＴヘルパーリンパ球を刺激する。

【0080】

「免疫原」はその免疫系が免疫原に直面している宿主において、適応免疫応答を誘導し得る物質である。このように、免疫原はより大きな「抗原」属のサブセットであって、免疫系によって特異的に認識され得る物質（例えば、抗体によって結合される、または代わりにＭＨＣ分子に結合した抗原のフラグメントが、Ｔ細胞受容体に認識される場合がある。）であるが、必ずしも免疫を誘導できない、しかし、抗原は常に免疫を誘発し得る、つまり抗原に対しての確立した免疫記憶を有する宿主は、該抗原に対して特異的な免疫応答を起こすことになる。

【0081】

「ハプテン」とは、免疫応答を誘導および誘発できない小分子であるが、免疫原性の担体とコンジュゲートすると、該ハプテンを認識する抗体またはＴＣＲが、免疫系とハプテン担体コンジュゲートの接触の際に誘導され得る。

【0082】

「適応免疫応答」とは抗原または免疫原との接触に対応した免疫応答であって、免疫応答は、抗原／免疫原の抗原決定基に特異的である。適応免疫応答の例は、抗原特異的抗体の生産の誘導、またはＴヘルパーリンパ球または細胞傷害性リンパ球の抗原特異的な誘導／活性化である。

【0083】

「防御的、適応免疫応答」とは抗原による免疫（人工的なまたは天然の）への反応として対象内で誘導される抗原特異的免疫応答であって、該免疫応答はその後の抗原、または抗原を含む病理関連物質の挑戦から対象を防御し得る。典型的には、予防接種は１つまたはいくつかの病原に対する防御的適応免疫応答を確立することを目的とする。

【0084】

「免疫系の刺激」とは、物質または物質の組成物が一般的な、非特異的な免疫刺激作用を示すことを意味する。多くのアジュバントおよび推定アジュバント（例えば特定のサイトカイン）は免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を使用した結果として、免疫系の「覚醒度（ａｌｅｒｔｎｅｓｓ）」が高まる、つまり、免疫原を単独で使用した場合と比較して、同時またはその後の免疫原による免疫が、顕著により効果的な免疫応答を誘導する。

【0085】

「ポリペプチド」という用語は、本願の文脈において、２から５０アミノ酸残基の短いペプチド、５０から１００アミノ酸残基のオリゴペプチド、および１００アミノ酸残基以上のポリペプチドのいずれも意味することを意図する。さらに、該用語はまた、タンパク質、すなわち、少なくとも１つのポリペプチドを含む機能性生体分子を含むことも意図しており、機能性生体分子が、少なくとも２つのポリペプチドを含む場合には、これらは複合体を形成していても、共有結合をしていても、非共有結合をしていてもよい。また、タンパク質中のポリペプチドは、グリコシル化され得る、および／または脂質化され得る、および／または、補欠分子族を含み得る。

【0086】

「融合ポリペプチド」という用語は、本願の文脈において、意図された異なる機能を有するポリペプチドエレメントまたはアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する事を意図する。異なるポリペプチドエレメントもしくはアミノ酸配列はリンカー、これは単なる別のアミノ酸配列であり得る、を介して連結されるか、または融合ポリペプチドの異なるポリペプチドエレメントもしくはアミノ酸配列は、単に標準的なペプチド結合によって直鎖状に連結され得る。

【0087】

本発明に従って使用される発現ベクターは、典型的におよび好ましくは、プラスミドを含む、またはプラスミドから構成されるが、その他の発現ベクターを採用することもできる。本発明の組成物は、「裸の」ＤＮＡ、すなわち、ＤＮＡ発現ベクターであり、標的細胞への発現ベクターの導入に影響を与え得る細菌またはウイルスの一部ではない発現ベクターを細胞へ確実に送達する事を目的としている。よって、本発明の組成物および方法において有用なベクターは、環状または直鎖状、一本鎖または二本鎖であり、およびプラスミドに加えて、例えばコスミド、ミニ染色体またはエピソームでもあり得る。

【0088】

各コード（および発現可能な）領域は、同一または別々のベクター上に存在し得るが、しかし、１つ以上のコード領域は単一のベクター上に存在し得る事、およびこれらのコード領域は単一または複数のプロモーターの制御下に置かれ得る事は理解されるべきである。これは、発現ベクターが、各コードされた融合ポリペプチドについて別々のペプチド発現産物をコードし得る事、または発現ベクターが、複数のペプチド発現産物をコードし得る事を意味し、ここで、少なくともいくつかの発現産物はコードされた複数の融合ポリペプチドを示し、その融合ポリペプチドのうちの少なくともいくつかは任意にはペプチドリンカーによって分離される。

【0089】

言い換えると、いくつかの場合では１つの単一発現ベクターのみが投与および発現され、およびこの発現ベクターは複数の別々のタンパク質性発現産物をコードしてもよく、またはたった２つもしくは１つの単一発現産物をコードしてもよい、本願の文脈では、コードされた融合ポリペプチドが満足に免疫系に提示されるかどうかのみが関係しており、よってそれらが別々の発現産物中または結合した発現産物中に存在するかの選択はあまり関係していない。好ましい実施形態では、発現ベクターは、少なくともまたは約５個、例えば少なくともまたは約１０、少なくともまたは約１５、少なくともまたは約２０、少なくともまたは約２５、少なくともまたは約３０個のタンパク質性発現産物を発現する。これ以上の数について考慮すると、限界値は主に、特定の腫瘍から同定し得る融合ポリペプチドのネオエピトープの数によって設定される。言うまでもなく、発現ベクター中にコードされる融合ポリペプチドのネオエピトープの数は、関連する悪性組織で見つかるネオエピトープの数を超えることはできない。

【0090】

コードされたネオエピトープ発現産物を分離するためにペプチドリンカーを使用することで、融合タンパク質の発現産物内でエピトープ同士を空間的に分離することができる。これはいくつかの利点を含み得る：リンカーによって、確実に各ネオエピトープを最適化された配座で免疫系に提示し得る、また、適切なリンカーを使用することで、複数のエピトープを含む発現産物において、１つのネオエピトープのＣ末端と隣接する次のネオエピトープのＮ末端から構成される領域に生じる「接合部エピトープ（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）」に対しての無関係な免疫応答が誘導されるという問題を最小化し得る。

【0091】

コードされたペプチドリンカーは「フレキシブル」または「リジッド」、好ましいコードされたペプチドリンカーが記載される上記の定義を参照、の何れかで有り得る。また、いくつかの実施形態において本発明に用いられるリンカーは切断可能で有り得る、すなわち、エンドペプチダーゼ、例えば、フーリン、カスパーゼ、カテプシンなどのエンドペプチダーゼのための認識部位を含むことが想定される。

【0092】

発現ベクターにコードされるネオエピトープはそれ自体が知られた手法で同定し得る：同一個体における悪性細胞のゲノム、および健康な細胞のゲノム、または標準健康ゲノムの「ディープシーケンシング」によって、悪性細胞に固有の潜在的な免疫原性発現産物を提供する、発現ＤＮＡ部分を同定し得る。同定されたＤＮＡ配列はその後、コドン最適化（典型的にはヒト細胞による発現のために）され、および大きなキメラ構築物の一部で有る個別の発現領域のいずかとして発現ベクターに含まれ得る。

【0093】

ベクターによって発現される細菌およびウイルスエピトープまたはがんネオエピトープの同定と選択を最適化するために、この目的のために利用できる任意の予測方法が実際に有効である。最先端の予測アルゴリズムの１例は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０／；Ｊｕｒｔｚ Ｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１７），ｊｉ１７００８９３；ＤＯＩ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１７００８９３）である。この方法は、従来のＭＳ由来リガンドおよびｐＭＨＣ親和性データの組み合わせにおいて学習される。他の例は、ＮｅｔＭＨＣｓｔａｂｐａｎ－１．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｓｔａｂｐａｎ－１．０／；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃｅｐｔｅｄ ｆｏｒ Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｊｕｎｅ ２０１６）である。この方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで各ペプチドを合成する、およびＭＨＣ分子に複合体化させるアッセイを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐＭＨＣ安定性測定のデータセットで学習される。このアッセイにおいて細胞処理は行われず、およびｐＭＨＣ安定性が測定される環境は幾分か人工的である。本方法は、一般的にはＮｅｔＭＨＣｐａｎ－４．０よりも精度が低い。米国特許第１０，０５５，５４０号は従来のＭＳで検出されたリガンドを用いたネオエピトープの同定のための方法を記載する。同様の技術を用いたその他の特許出願は、国際公開第２０１９／１０４２０３号、国際公開第２０１９／０７５１１２号、国際公開第２０１８／１９５３５７号（ＭＨＣクラスＩＩ特異的）、および国際公開第２０１７ １０６６３８号である。最後に、ＭＨＣｆｌｕｒｒｙ：（ＤＯＩ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｓ．２０１８．０５．０１４；ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｏｐｅｎｖａｘ／ｍｈｃｆｌｕｒｒｙ）は、ＭＳで検出されたリガンドデータとｐＭＨＣ親和性で学習されたＮｅｔＭＨＣｐａｎのようなものである。また、ペプチド－ＭＨＣクラスＩＩ相互作用予測法は、最近の出版物であるＧａｒｄｅ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＤＯＩ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／ｓ００２５１－０１９－０１１２２－ｚに開示される。この出版物では、ＭＨＣクラスＩＩから溶出した天然処理ペプチドを学習のセットの一部として使用し、およびリガンドとして確認された場合は１の、ネガティブな場合は０の結合対象値を割り当てる。

【0094】

一般的に、これらの予測システムは人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）を採用している：ＡＮＮは非線形の相関関係を同定し得る：非線形の相関関係の定量化は、単純な計算では計算が困難であるため、容易な仕事ではない。これは主に、非線形の相関関係が線形の相関関係よりも多くのパラメーターで記述され、およびおそらく全ての特徴をまとめて考慮した際に初めて現れるためである。よって、特徴間の依存関係を捉えるためには、全ての特徴を考慮に入れる必要がある。

【0095】

選択され、コードされたネオエピトープが効果的な免疫応答を供する可能性をさらに向上させるために、どちらも２０１９年９月１３日に出願された欧州特許出願第１９１９７２９５．９号および第１９１９７３０６．４号に開示される技術を好ましくは使用し得る。これらの出願は、ペプチドとＭＨＣ分子間の結合の安定性が決定され得ることを可能にする、およびネオエピトープの検出および選択の一部として、ネオエピトープのＭＨＣ結合安定性を決定することを可能にする技術を開示する。簡単に言うと、安定性の決定から得られたデータは、例えばＡＮＮの学習セットに用いる、およびＡＮＮはその後、関連したＭＨＣ分子に対する予測された結合安定性にしたがって、同定されたペプチドを順位付けし得る。

【0096】

核酸ワクチンを患者に投与した際、対応する遺伝子産物（例えば、所望の抗原）が患者の体内で産生される。いくつかの実施形態では、治療的または予防的な免疫応答を誘導するために、最適化された組み換えポリヌクレオチドを含む核酸ワクチンベクターをヒトに送達し得る。

【0097】

プラスミドおよびその他のＤＮＡベクターは、典型的には筋肉組織への遺伝子導入においてより効率的である。経口投与による粘膜表面へのＤＮＡベクターの送達の可能性がまた報告されており、およびＤＮＡプラスミドは、筋肉以外の組織への遺伝子の直接的な導入に用いられている。ＤＮＡワクチンは主に筋肉内注射、遺伝子銃による送達、ジェット注射（ＰｈａｒｍａＪｅｔ社のＳｔｒａｔｉｓ^{（登録商標）}デバイスなどのデバイスを使用）、またはエレクトロポレーション法によって動物に導入され、これらの各投与様式は本開示の方法に適用する。導入後、プラスミドは一般的に複製されることなくエピソーム性で維持される。コードされたタンパク質の発現は長時間持続し、Ｂ細胞およびＴ細胞の両者を刺激することが示されている。

【0098】

本明細書に開示される処置方法において投与するベクターの有効量の決定のために、医師は、ベクターの毒性、処置されるがんの進行度、および、存在する場合には、抗ベクター抗体の生産量を評価する。投与は単回または分割投与によってなされ、典型的には時間差の有る一連の投与（ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ ｔｉｍｅ ｓｅｐａｒａｔｅｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）であり得る。本明細書に開示される方法において、時間差のある一連の免疫における免疫あたりの有効ヒト投与用量は０．１μｇから５００ｍｇの間であり、０．１μｇから２５ｍｇの間の発現ベクターの投与量が好ましい。すなわち、本明細書で開示された方法の実施において、ヒトにおける０．５μｇから２０ｍｇの間の投与量が典型的に使用され、および投与量は通常、５μｇから１５ｍｇの間、５０μｇから１０ｍｇの間、および５００μｇから８ｍｇの間であり、および特に関心のある投与量は約０．０００１、約０．０００５、約０．００１、約０．００５、約０．０１、約０．０５、約０．１、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７および約８ｍｇである。

【0099】

有効量を用いた一連の免疫は、典型的には２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上の一連の投与を形成する。例えば悪性腫瘍を長時間抑制するためには、複数回（例えば６回以上）の投与が関係し得る、およびこのような状況では、ワクチンベクター内のコードされたネオエピトープの正確な選択は、悪性細胞のゲノムおよびプロテオームの変化に応じて、経時的に変更し得る。悪性細胞によって、新規のネオエピトープが生産される場合は、これらのネオエピトープは都合によってワクチンの標的として含めることができる。

【0100】

本明細書に開示される方法において使用されるワクチンは、１以上の発現ベクターを含む；例えば、ワクチンは、少なくとも１つの免疫原性のポリペプチドを生産するために、それぞれが哺乳類細胞においてヌクレオチドのコード領域を自律的に発現し得る複数の発現ベクターを含んでいてよい。発現ベクターはしばしば真核生物のプロモーター配列、例えば、１つ以上のコード領域と作動可能に連結した強力な真核生物のプロモーターのヌクレオチド配列を含む。本明細書の組成物および方法は任意の特定の真核生物プロモーターの使用を含んでいてよく、多種多様なものが知られている；例えば、ＣＭＶまたはＲＳＶプロモーター。プロモーターは、宿主細胞に対して異種のもので有り得る。使用されるプロモーターは構成的プロモーターであってもよい。使用されるプロモーターは、エンハンサー領域およびイントロン領域を含むことで、発現量を向上させ得るが、これには例えばＣＭＶプロモーターを用いる場合などがある。

【0101】

当分野で知られている数多くのプラスミドを、核酸ワクチンの生産に使用し得る。核酸ワクチンの好適な実施形態では、ベクターとしてプラスミドＶＲ１０１２（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｃａｌｉｆ．）、ｐＣＭＶＩ．ＵＢＦ３／２（Ｓ．Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ）、ｐＴＶＧ４（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４（３）；２９３－３０３）、ｐＶＡＸ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，上記および以下の実施例を参照）、またはｐｃＤＮＡ３．１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）を用いた構築物を採用する。

【0102】

さらに、ベクター構築物は、本発明に従って有利に免疫刺激配列（ＩＳＳ）を含み得る。ワクチンベクター内にかかる配列を用いる目的はコードされたネオエピトープに対するＴ細胞応答、特に、Ｔｈ１細胞応答を増強する事であり、この応答は、トール様受容体ＴＬＲ３、ＴＬＲ７－ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９のアゴニスト、および／または細胞質ＲＮＡ受容体、例えば、ＲＩＧ－１、ＭＤＡ５およびＬＧＰ２などを含むがこれに限定されない、のアゴニストを組み込んだアジュバントによって誘発される（Ｄｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ．１２（７），４７９－４９１）。

【0103】

ＩＳＳを採用する事の１つの可能性は、６塩基の一般的な配列ＮＮＣＧＮＮ（哺乳類ＤＮＡに比べて細菌ＤＮＡでは２０倍の頻度で出現する）をもつ非メチル化ＣＧリッチモチーフ（ＣｐＧモチーフと呼ばれる）を用いて、部分的または完全にホスホロチオエート化したバックボーンを含む小さな合成ＤＮＡオリゴ（ＯＤＮ）として直接投与するか、またはＣｐＧモチーフをＤＮＡベクターバックボーンに組み込むことのいずれかによって刺激することで、ＴＬＲ９を活性化する細菌の感染を模倣する事である。免疫刺激性ＣｐＧは、ＤＮＡバックボーンの一部であるか、またはＩＳＳに濃縮されていてもよく、ＣｐＧ配列は典型的に、ネオエピトープをコードする配列の終止コドンとポリＡテイルをコードする配列の間に位置する（すなわち、ＩＳＳは終止コドンとポリアデニル化シグナルの間に位置する）。しかし、ＣｐＧ配列は、長いＤＮＡ分子内におけるそれらの位置とは無関係に効力を発揮するため、ＣｐＧモチーフの存在が、ワクチン抗原のコード領域を発現するというベクターの能力を妨げない限り、その位置は原理的にはワクチンベクター内の任意の場所で有り得る。

【0104】

ワクチン内に個別のＯＤＮとして存在する場合であって、ＯＤＮが免疫学的なアジュバントとして機能する場合、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、典型的には選択された送達技術によって、ＤＮＡワクチンと共に投与／製剤化され、および典型的には配列ＮＮＣＧＮＮまたはその逆相補的な配列を含む６塩基またはそれ以上の多塩基のＤＮＡを構成する。この目的のために有用なＯＤＮは、例えば、ＩｎｉｖｏＧｅｎ社（５ Ｒｕｅ Ｊｅａｎ Ｒｏｄｉｅｒ，Ｆ－３１４００，Ｔｏｕｌｏｕｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から市販されており、クラスＡ、Ｂ、Ｃの範囲のＯＤＮが販売されている。例を以下に示す：

【表4】

【0105】

これら１２個のＯＤＮにおいて、大文字のヌクレオチドは、ホスホジエステルであり、小文字のヌクレオチドはホスホロチオエートであり、下線部はパリンドローム配列である。

【0106】

ＣｐＧ配列が、プラスミドバックボーンに存在する（それによって「自己アジュバント」となる）場合、同一配列として、またはＣｐＧモチーフに非同一な配列の形態で、またはステムループ構造を形成し得るパリンドローム配列の形態で、任意の数の可能なＮＮＧＣＮＮまたはＮＮＣＧＮＮ配列が本発明に従って存在し得る。例えば、以下のＣｐＧモチーフが関心の的である：ＡＡＣＧＡＣおよびＧＴＣＧＴＴ、さらにはＣＴＣＧＴＴ、およびＧＣＴＧＴＴ。このようなＣｐＧをコードする配列の使用例は市販のｐＴＶＧ４ワクチンベクターバックボーンから抜粋し以下の配列である：

【化1】

【0107】

もう１つの可能性は、ポリＩ：Ｃ（ポリイノシン酸－ポリシチジル酸）、ポリＩＣ：Ｕ１２（ウリジン置換ポリＩ：Ｃ）などの合成ＲＮＡオリゴとして、または合成ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）の形態で、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを加えることにより、ＴＬＲ３を活性化するＲＮＡウイルス感染を模倣することであり、これらのＲＮＡ分子のワクチンへの添加は、ＯＤＮアプローチと同様に、アジュバント活性を獲得する方法である。あるいは、ｄｓＲＮＡはＤＮＡベクターバックボーンにコードされることもでき、これはワクチン接種後にＲＮＡに転写される－この場合、ＤＮＡワクチンは免疫学的アジュバントをコードしていることになる。このアプローチでは、１００塩基対までの長さのヘアピンＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むことができ、ここで、配列は非特異的である。また、ＤＮＡは同時に、既知配列のＯＤＮを含み、既知配列のＯＲＮをコードし得る；よってＤＮＡはＴＬＲ３および／またはＲＩＧ－１、ＭＤＡ５、およびＬＧＰ２などの細胞質ＲＮＡ受容体を活性化し得る二本鎖ＲＮＡに転写されると共に、ＴＬＲ９を活性化するＯＤＮを含み得る。免疫刺激性ＣｐＧおよびｄｓＲＮＡを含む／コードする、特異的ＤＮＡ配列の例は、例えば、５’－ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡ ＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ－３’（配列番号２７）および５’－ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡ ＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ ＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡ ＴＴＧＡＧＧＡＣＡＧ ＧＴＴＡＡＧＣＴＣＣ ＣＣＣＣＡＧＣＴＴＡ ＡＣＣＴＧＴＣＣＴＴ ＣＡＡＴＡＴＡＴＡ ＴＡＴＡ－３’（配列番号２８）である（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．２０１１、Ｖａｃｃｉｎｅ ２９（４４）：７６２４－３０を参照）。

【0108】

ＩＳＳが、ＤＮＡワクチンベクター内に存在する場合、ＴＬＲ９を活性化するＣｐＧを用いるアプローチと、ＴＬＲ３ならびに／またはＲＩＧ－１、ＭＤＡ５、およびＬＧＰ２などの細胞質ＲＮＡ受容体を活性化する免疫刺激性ＲＮＡをコードする配列の存在とを組み合わせることが可能、および有利である；Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．２００９，ＢＭＣ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １０：４３およびＤｅｓｍｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１２．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍ．１２（７），４７９－４９１を参照。同様に、ＯＲＮおよびＯＤＮをワクチン中に別々のアジュバントとして（単独または組み合わせて）組み込むことは、ＤＮＡワクチンベクターに両方の種類のＩＳＳを組み込む事と組み合わせてよい。

【0109】

ＣｐＧモチーフの場合と同様に、免疫刺激性ＲＮＡ ＩＳＳをコードするＤＮＡは、終止コドンとポリアデニル化シグナルの間に位置することが好ましいが、しかしこれが意図したポリペプチド発現産物の産生を損なわない限り、ベクターの任意の部分に存在し得る。

【0110】

いくつかの特定の実施形態において、ＩＳＳはワクチン組成物に含まれる、および、特定の実施形態において、これは免疫学的に活性があるおよび医薬的に許容される量のポリＩ：Ｃおよび／またはポリＩＣ：Ｕ１２を組み込むことによって達成される。ポリＩ：Ｃは、一方の鎖がイノシン酸の重合体であり、もう一方の鎖がシチジル酸の重合体であるミスマッチ二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）から構成される。ポリＩＣ：Ｕ１２は、ウリジンがポリＩ：Ｃ鎖の中に導入されたポリＩ：Ｃのバリアントである。これら２つの物質は、その文脈では免疫学的アジュバント、すなわち、それ自身は特異的な適応免疫応答を誘発しないが、ワクチン抗原（または本願の場合、コードされた抗原）への特異的な適応免疫応答を増強する物質、として機能する。

【0111】

ポリＩ：ＣまたはポリＩＣ：Ｕ１２（例えば、Ａｍｐｌｉｇｅｎ^{（登録商標）}）は、好ましくは、発現ベクターの有効量の投与あたり、０．１から２０ｍｇの間の投与用量になるように組成物中に存在する。すなわち、組成物中の存在量はこの投与あたりの用量になるように調節される。好ましくは、ポリＩ：ＣまたはポリＩＣ：Ｕ１２の投与量は、発現ベクターの有効量の投与あたり０．２から１５ｍｇの間、例えば０．３ｍｇから１２ｍｇ、０．４ｍｇから１０ｍｇ、および０．５ｍｇから８ｍｇの間であり、好ましくは約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９および４．０ｍｇである。特に好ましくは、投与あたり０．５から２．０ｍｇの範囲である。

【0112】

ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む両親媒性ブロック共重合体、例えばポロキサマー、すなわち、２つの親水性のポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））鎖に挟まれた中央の疎水性のポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））鎖からなる非イオン性のトリブロック共重合体、を含み得る。１つの特定の好ましい両親媒性ブロック共重合体は、ポロキサマー１８８（ＢＡＳＦ社のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}Ｐ１８８）である。両親媒性ブロック共重合体の投与量は、発現ベクターの有効投与量あたり、０．２％ｗ／ｖから２０％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから１８％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから１６％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから１４％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから１２％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから１０％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから８％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから６％ｗ／ｖ、例えば０．２％ｗ／ｖから４％ｗ／ｖ、例えば０．４％ｗ／ｖから１８％ｗ／ｖ、例えば０．６％ｗ／ｖから１８％ｗ／ｖ、例えば０．８％ｗ／ｖから１８％ｗ／ｖ、例えば１％ｗ／ｖから１８％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖから１８％ｗ／ｖ、例えば１％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖから４％ｗ／ｖである。特に好ましくは、１投与あたり、０．５％ｗ／ｖから５％ｗ／ｖである。

【0113】

したがって、本発明のワクチン組成物、例えばＤＮＡワクチン組成物は、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレンオキシド）のブロックを含む、薬理学的に許容される両親媒性ブロック共重合体を含み、これは以下に詳細に記載される：

【0114】

両親媒性ブロック共重合体は定義の見出しにおいてより一般的に説明されているが、しかし、好ましい両親媒性ブロック共重合体はポロキサマーまたはポロキサミンである。ポロキサマーは、その性質に関してわずかに異なるのみであるが、好ましくはポロキサマー４０７および１８８であり、特にポロキサマー１８８である。

【0115】

両親媒性ブロック共重合体がポロキサミンである場合、好ましい種類は式（ＰＥＯ－ＰＰＯ）４－ＥＤの逐次的ポロキサミンであり、ここで、ＰＥＯはポリ（エチレンオキシド）、ＰＰＯはポリ（プロピレンオキシド）およびＥＤはエチレンジアミニル基である。これらの分子はＰＥＯ－ＰＰＯ基が中心のエチレンジアミニル基から突き出たＸ字様の形状を得ている。特に好ましいポロキサミンは、それぞれ^{（登録商標）}Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^{（登録商標）}９０４、７０４、および３０４で販売されているものである。これらのポロキサミンの特著は以下の通りである：Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^{（登録商標）}９０４の総平均分子量は６７００であり、ＰＰＯ単位の総平均重量は４０２０、およびＰＥＯの割合は約４０％である。Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^{（登録商標）}７０４の総平均分子量は５５００であり、ＰＰＯ単位の総平均重量は３３００、およびＰＥＯの割合は約４０％である。Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^{（登録商標）}３０４総平均分子量は１６５０であり、ＰＰＯ単位の総平均重量は９９０、およびＰＥＯの割合は約４０％である。

【0116】

本明細書に開示される方法において使用される場合、ワクチン組成物中の両親媒性ブロック共重合体の濃度は好ましくは２％から５％ｗ／ｖ、例えば約３％ｗ／ｖである。

【0117】

本明細書で使用される場合、「ＰＥＯ－ＰＰＯ」両親媒性ブロック共重合体は、ポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）のブロックおよびポリ（プロピレンオキシド）（「ＰＰＯ」）のブロックを含むか、またはそれからなる直鎖状または分枝状の共重合体である。有用なＰＥＯ－ＰＰＯ両親媒性ブロック共重合体の典型例は、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ（「ポロキサマー」）、ＰＰＯ－ＰＥＯ－ＰＰＯ、（ＰＥＯ－ＰＰＯ－）４ＥＤ（「ポロキサミン」）、および（ＰＰＯ－ＰＥＯ－）４ＥＤ（「逆ポロキサミン」）の一般的な構造を有し、ここで、「ＥＤ」はエチレンジアミニル基である。

【0118】

「ポロキサマー」とは、ポリ（エチレンオキシド）（「ＰＥＯ」）の１つのブロックと連結したポリ（プロピレンオキシド）（「ＰＰＯ」）の１つのブロックにさらにＰＥＯの１つのブロックが連結した構成である、すなわち式ＥＯａ－ＰＯｂ－ＥＯａの構造を持つ直鎖状の両親媒性ブロック共重合体であり、ここで、ＥＯはエチレンオキシド、ＰＯはプロピレンオキシド、ａは２から１３０の間の整数、およびｂは１５から６７の整数である。ポロキサマーは伝統的に３桁の識別子を用いて表され、最初の２桁に１００を掛けたものがＰＰＯ含有量のおおよその分子量を表し、および最後の桁に１０を掛けたものがＰＥＯ含有量のおおよその割合を示す。例えば、「ポロキサマー１８８」は、Ｍｗ：約１８００（ｂ：約３１のＰＰＯに対応）のＰＰＯブロック、および約８０％（ｗ／ｗ）のＰＥＯ（ａ：約８２に対応）を含む重合体を指す。しかし、この値はある程度変化する事が知られており、研究用グレードのＬｕｔｒｏｌ^{（登録商標）}Ｆ６８および臨床用グレードのＫｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}Ｐ１８８などの市販製品は、製造元のデータシートでは両者共にポロキサマー１８８であるが、分子量に大きな違いがあり（７６８０から９５１０の間）、これら特定の製品について提供されたａおよびｂの値は、それぞれ約７９および約２８であることが示されている。これはブロック共重合体の不均一な性質を反映しており、ａおよびｂの値は最終製剤中の平均値である事を意味する。

【0119】

「ポロキサミン」または「逐次的ポロキサミン」（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ^{（登録商標）}の商品名で市販されている）は、４本のＰＥＯ－ＰＰＯの腕が、ＰＥＯ－ＰＰＯ－基の遊離ＯＨ基とエチレンジアミンの１級アミン基との結合を介して、中心のエチレンジアミンに接続されたＸ字型のブロック共重合体であり、および「逆ポロキサミン」も同様に、４本のＰＰＯ－ＰＥＯの腕が、ＰＰＯ－ＰＥＯ－基の遊離ＯＨ基とエチレンジアミンの１級アミン基との間の結合を介して、中心のエチレンジアミンに接続されたＸ字型のブロック共重合体である。

【0120】

核酸ワクチンはまた、ネオエピトープを含む１つ以上の免疫原性ポリペプチドを含む融合産物をコードし得る。プラスミドＤＮＡはまた、弱毒性細菌を送達システムとして使用することで送達され得、この方法は経口投与されるＤＮＡワクチンにとって好適である。細菌は独立して複製するプラスミドで形質転換され、プラスミドは宿主細胞内で弱毒化細菌が死んだ後、宿主細胞の細胞質に放出される。

【0121】

所望の抗原をコードするＤＮＡを含むＤＮＡワクチンは、フラグメント単独、直鎖状プラスミド、環状プラスミド、複製可能プラスミド、エピソーム、ＲＮＡなどを含む、任意の適した形態で宿主細胞に導入され得る。好ましくは、遺伝子はプラスミドに含まれる。特定の実施形態では、プラスミドは発現ベクターである。遺伝子物質を発現し得る個別の発現ベクターは、標準的な組み換え技術を用いて生産され得る。

【0122】

投与経路には、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼球内および経口、加えて吸入または座薬によって局所的、経皮的に、または洗浄によって、例えば膣、直腸、尿道、頬および舌下組織などの粘膜組織への投与を含むが、これらに限定しない。言い換えると、投与経路は、筋肉内経路、皮内経路、経皮経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、髄腔内経路（ｔｈｅ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｒｏｕｔｅ）、骨髄内経路（ｔｈｅ ｉｎｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｒｏｕｔｅ）、髄腔内経路、心室内経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、膣内経路、眼内経路、または肺内経路などを介した任意の非経口経路の１つから選択されてよく；経口経路、舌下経路、頬経路、または肛門経路を介して投与される；または局所投与される。

【0123】

典型的な投与経路には、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子銃型遺伝子銃」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などのその他の物理的方法を含むが、これらに限定されない手段によって投与され得る。ＤＮＡワクチンは、細胞内でＤＮＡが発現され、および所望の抗原が生成される限りにおいて、ＤＮＡの送達に用いられ得る任意の方法で送達され得る。

【0124】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＤＮＡワクチン組成物は、カチオン性リポソーム、フルオロカーボンエマルジョン、蝸牛殻状、細管、金粒子、生分解性マイクロスフェア、またはカチオン性ポリマーなどの既知のトランスフェクション試薬を介して、またはそれらと組み合わせて送達される。蝸牛殻状送達ビヒクルはフォスファチジルセリン、コレステロール、およびカルシウムからなる安定なリン脂質カルシウム沈殿剤であり、この無毒で非炎症性のトランスフェクション試薬は消化器系に存在し得る。生分解性マイクロスフェアはトランスフェクションのためのＤＮＡマイクロカプセルの製造に使用できるポリエステルであるポリ（ラクチド－コ－グリコリド）などの重合体を含む。脂質ベースのマイクロチューブはしばしば螺旋状に巻かれた２層の脂質からなり、それらの端が互いに結合することでパックされている。細管が用いられる場合、核酸は、動物の体内への送達および放出制御のために、その中央の中空部へ配置され得る。

【0125】

ＤＮＡワクチンは、マイクロスフェアを介して、粘膜表面へと送達され得る。生体接着性マイクロスフェアは様々な技術を用いて調製され、目、鼻腔、尿路、結腸および胃腸などに見られる任意の粘膜組織に付着するように調製され得るため、ワクチンの全身的な放出制御に加えて局所的な放出制御の可能性を供する。特定の粘膜組織への生体接着性マイクロスフェアの適用は、局所的なワクチン作用にも使用し得る。いくつかの実施形態では、粘膜ワクチンの送達のための代替アプローチは、特異的タンパク質抗原の遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ発現ベクターを、粘膜表面に直接投与することである。

【0126】

開示されるＤＮＡプラスミドワクチンは、用いられる投与様式に従って製剤化される。典型的には、ＤＮＡプラスミドワクチンは、注射可能な組成物であって、それらは無菌であり、および／またはパイロジェンフリーおよび／または粒子フリーである。いくつかの実施形態では、等張性剤が好ましく使用される。一般的に、等張性のための添加剤には、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれ得る、いくつかの実施形態では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張液が好ましい；１つの好ましい溶液はタイロード緩衝液である。いくつかの実施形態では、安定化剤にゼラチンおよびアルブミンを含む。いくつかの実施形態では、ＬＧＳまたは他のポリカチオンもしくはポリアニオンなどの、製剤が室温または周囲の温度で長時間安定である事を可能にする安定化剤が製剤に添加される。

【0127】

本明細書に開示される組成物中の第２の構成要素は、医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤であって、これは好ましくは緩衝溶液の形態である。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロースおよび塩化ナトリウム、ラクトリンゲル液、または不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルとしては、水分および栄養分補給剤、リンゲルデキストロースをベースにしたものなどの電解質補給剤などを含む。防腐剤、抗菌剤には、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどを含む。好ましい保存剤には、ホルマリン、チメロサール、ネオマイシン、ポリミキシンＢ、およびアンフォテリシンＢを含む。

【0128】

好ましい実施形態では、緩衝溶液は「タイロード緩衝液」として知られるものであり、および好ましい実施形態では、このタイロード緩衝液は１４０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（Ｈｅｐｅｓ）（ｐＨ７．４）、および１０ｍＭ グルコースの組成を有する。タイロード緩衝液（またはその代替）の濃度は、典型的には約３５％ｖ／ｖであるが、懸濁したプラスミドの水分量に依存して、この濃度は大きく変化し得る－というのも、この緩衝液は生理学的に許容されるため、組成物の水相の任意の割合を構成し得る。

【0129】

さらに、好ましい実施形態では緩衝溶液はＰＢＳであり、好ましい実施形態ではＰＢＳは、１ｍｌ溶液あたり、０．２８ｍｇのリン酸二水素カリウム、１．１２ｍｇのリン酸水素二ナトリウム・二水和物および９．０の塩化ナトリウムの組成を有する。

【0130】

追加的な担体物質が含まれていてもよく、これにはタンパク質、糖などを含み得る。かかる担体は、水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンであってよい。非水性の担体の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性の担体には、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含み、生理食塩水を含む。

【0131】

本発明の特定の実施形態
上記のように、本発明は、
ｉ）少なくとも１つの抗原単位；
ｉｉ）樹状細胞を標的とする、少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位；
ｉｉｉ）任意選択で多量体化単位、例えば二量体化単位であって、２つ以上の抗原単位および２つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位を含むように該融合ポリペプチドの多量体化をもたらす多量体化単位；
を含む、融合ポリペプチドに関する。

【0132】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は、患者からの腫瘍細胞のネオエピトープである少なくとも１つのエピトープのアミノ酸配列からなる、またはそれを含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は、患者からの腫瘍細胞のネオエピトープを含まない。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は細菌またはウイルス抗原である、例えば少なくとも１つの細菌またはウイルスエピトープのアミノ酸配列を含む抗原単位である。

【0135】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を標的とする。

【0136】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は、例えばヒト型の、ＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１から選択される。

【0137】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は受容体ＣＣＲ７を標的とする。

【0138】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は、例えばヒト型の、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ２０、またはＸＣＬ１から選択される。

【0139】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は未成熟樹状細胞（ｉｍＤＣ）を標的とする。

【0140】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、およびＸＣＲ１から選択される受容体を標的とする。

【0141】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は、抗原提示細胞上の標的表面分子、例えばＣＬＥＣ９Ａ またはＤＥＣ２０５に対する特異性を有する抗体結合領域、例えば抗－ＣＬＥＣ９Ａ、抗－ＤＥＣ２０５、またはその変異体、例えば抗－ＣＬＥＣ９Ａ Ｆｖ、抗－ＤＥＣ２０５Ｆｖからなる、またはそれを含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位はリガンド、例えばＣＥＬＣ９ペプチドリガンドからなる、またはそれを含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位は、Ｘｃｌ１、ＧＭ－ＣＳＦ、抗－ＤＥＣ－２０５Ｆｖ、抗－ＣＬＥＣ９Ｆｖ、およびＣＬＥＣ９リガンドから選択される。

【0144】

いくつかの実施形態では、ＡＰＣ標的化単位はサイトカイン、例えばＧＭ－ＣＳＦ、例えばＣＤ１１６に結合するＡＰＣ標的化単位である。

【0145】

いくつかの実施形態では、抗原単位は、リンカー、例えばＧＳリンカー、例えばアミノ酸配列ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１３）を持つリンカー、または免疫グロブリン分子（Ｉｇ）、例えばＩｇＧに由来するリンカー、例えば鎖間共有結合の形成を介して多量体化に寄与するリンカー、を介して標的化単位に連結される。いくつかの実施形態では、リンカーは、ヒンジ領域、例えばＩｇ、例えばＩｇＧ由来ヒンジ領域であるかまたはそれを含み、および鎖間共有結合、例えばジスルフィド架橋の形成を介して多量体化に寄与する、および／または非共有相互作用（ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用および極性相互作用およびイオン結合を含む親水性相互作用）の形成を介して多量体化に寄与する。いくつかの実施形態では、リンカーは、カルボキシル末端Ｃドメイン（ＣＨ３ドメイン）、例えばＩｇのカルボキシル末端Ｃドメイン（Ｃγ３ドメイン）、または該Ｃドメインに実質的に相同である配列、例えばＩｇＧ３のＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ヒンジおよびＣＨ３ドメインは、アミノ酸配列ＧＧＧＳＳ（配列番号６６）によって、例えばアミノ酸ＧＧＧＳＳの３重配列（すなわち、配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳＧＧＧＳＳ；配列番号７２）によって連結されている。ヒンジとＣＨ３間の代替的な連結はアミノ酸配列ＧＧＧＳＳＧＧＧＳＧ（配列番号７０）を介し得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、疎水性相互作用を介して、例えばＣＨ３ドメインを介して多量体化に参加する、二量体化モチーフまたは任意のその他の多量体化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンカーはＩｇＧ、例えばＩｇＧ２またはＩｇＧ３に由来するｈ１＋ｈ４またはｈ４を含むヒンジ領域を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原単位は、少なくともまたは約５、例えば少なくともまたは約１０、少なくともまたは約１５、少なくともまたは約２０、少なくともまたは約２５、および少なくともまたは約３０個のエピトープからなる、またはそれを含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原単位は、腫瘍細胞において、または感染性細菌もしくはウイルスにおいて同定されるエピトープ／抗原間の平均以上、例えば上位四分の一のＭＨＣ結合安定性を示す少なくとも１つのエピトープを含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの抗原単位は細菌またはウイルス抗原である。

【0149】

このような実施形態では、抗原単位は、β－コロナウイルス由来の（特にスパイクタンパク質由来）、例えばＳＡＲＳコロナウイルス由来の（特にスパイクタンパク質由来）および好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来の、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質由来のアミノ酸配列を含み得る。特に関心のある（および本明細書において例示される）実施形態は、アミノ酸配列がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質からのリボソーム結合タンパク質（ＲＢＤ）である事を伴う。したがって、重要な実施形態では、アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号：ＹＰ＿００９７２４３９０の残基３１９～５４１からなる、もしくはそれを含む、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、それに対して少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、もしくはそれを含む。

【0150】

いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体またはより高次の多量体の形成を可能にする多量体化単位、例えば二量体化単位を含む。好適な多量体化単位の例は、上記の本発明において有用なリンカーについての議論において提供され、配列番号４９、５１、５２、５３、および６９のアミノ酸配列を有するものを含む。

【0151】

本発明はさらに、ｉ）少なくとも１つの抗原単位をコードするヌクレオチド配列を含む第１の発現構築物、およびｉｉ）樹状細胞を標的とする少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位をコードするヌクレオチド配列を含む第２の発現構築物、を含む少なくとも２つの発現構築物の系に関する。

【0152】

いくつかの実施形態では、第１の発現構築物は本発明において規定される少なくとも１つの抗原単位をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、第２の発現構築物は、本発明において規定される樹状細胞を標的とする少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）標的化単位をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、第１の発現構築物は、少なくとも１つの抗原単位をコードするヌクレオチド配列を含み、および少なくとも１つの抗原単位の多量体化をもたらす多量体化単位、例えば二量体化単位をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの発現構築物は、同一の発現ベクター上で発現される、例えば２つの異なるプロモーターの制御下において発現される。

【0156】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの発現構築物は、少なくとも２つの異なるベクターによって発現される。

【実施例】

【0157】

［実施例１］
ネオエピトープ送達のためのＡＰＣ標的化単位としてのケモカインの評価
本研究の目的は、本発明であるＡＰＣ標的化ＤＮＡワクチンによるネオペプチド特異的Ｔ細胞を誘導し、腫瘍増殖を低減する能力を試験する事、およびワクチン接種したマウス健康状態に対するワクチンの影響を観察する事である。

【0158】

ＤＮＡワクチン接種のためのプラスミドはＡｌｄｅｖｒｏｎ社から入手可能な市販のｐＵＭＶＣ４^（商標）に基づく。

【0159】

ｐＵＭＶＣ４^（商標）は、製造元の書類によると、４４７９ｋｂのプラスミドベクターであって、Ｅ．ｃｏｌｉにおける高コピー数の複製、およびほとんどの哺乳類細胞におけるコードされた目的タンパク質の高レベルな一過性発現を可能にする。このベクター（図４を参照）は以下のエレメントを含む：
１）広範囲な哺乳類細胞における高レベル発現のためのヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ）プロモーター、
２）効率的な転写終結およびｍＲＮＡのポリアデニル化のためのウサギベータ－グロブリン ポリアデニル化シグナル、
３）Ｅ．ｃｏｌｉの選別のためのカナマイシン耐性遺伝子、および
４）ｉｎ ｖｉｖｏでの免疫応答誘導に適したものとする、アンピシリン耐性遺伝子由来の免疫刺激配列（ＩＳＳ）。

【0160】

ｐＵＭＶＣ４^（商標）プラスミドの全配列を配列番号２９に記載する。

【0161】

ｐＵＭＶＣ４をバックボーンとして用い、且つＳ１６ＡにおけるネオエピトープをガイドするＡＰＣ標的化単位を用いて生成した５つの発現ベクターを構築した。ＡＰＣ標的化単位として使用した種々のケモカインを以下の表に示す：

【表5】

【0162】

５つのＳ１６Ａネオエピトープは、マウス結腸がん株ＣＴ２６およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の正常組織サンプルの全エキソームシーケンシング、およびがん細胞でのみ見られたペプチドを選択する事によって初めに同定された。この実験では、同定されたネオエピトープに対するマウスの免疫応答生成能力を評価した。

【0163】

ｐＵＭＶＣ４ ＡＰＣ標的化Ｓ１６Ａを、ＡＰＣ標的化単位（配列番号３６～４３）、ヒトＩｇＧ３ヒンジ１、ヒンジ４およびＣＨ３ドメイン（配列番号３１、３２および３４）ならびに、連続的に連結された５つのネオエピトープＣ２２、Ｃ２３、Ｃ２５、Ｃ３０、およびＣ３８（配列番号６１～６５）を含むペプチドをコードするコドン最適化された（例えばマウスにおける発現のため）ＤＮＡ、を含むＤＮＡインサートをｐＵＭＶＣ４発現カセットにライゲーションする事で構築した（図５を参照）。コントロールとして、ＡＰＣ標的化単位を含まないが、ヒトＩｇＧ３ヒンジ１、ヒンジ４およびＣＨ３ドメイン、ならびに同じ５つのネオエピトープＣ２２、Ｃ２３、Ｃ２５、Ｃ３０、およびＣ３８（配列番号６１～６５）をコードするインサートを含むｐＵＭＶＣ４プラスミドを使用した。ｐＵＭＶＣ４ ＡＰＣ標的化Ｓ１６Ａベクターにおいて、インサートはまた効率的な翻訳開始のためにＫｏｚａｋコンセンサス配列を含む。この実験において（および以下の実施例においても）使用された５つのネオエピトープのアミノ酸配列を以下の表に示す：

【表6】

【0164】

滅菌水に溶かしたプラスミドｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ３ Ｓ１６Ａ、ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ４ Ｓ１６Ａ、ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ５ Ｓ１６Ａ、ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ、ｐＵＭＶＣ４ ｍＸｃｌ１ Ｓ１６Ａ および（空の）ｐＵＭＶＣ４をそれぞれポロキサマー１８８（ＢＡＳＦ社のＫｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}）およびタイロード緩衝液と混合し、タイロード緩衝液中に３％ｗ／ｖ ポロキサマー１８８および０．０５μｇ／μｌプラスミドの組成物を得た。

【0165】

ＤＮＡと組み合わせて試験する両親媒性ブロック共重合体は、以下の一般式を有するＫｏｌｌｉｐｈｏｒ^{（登録商標）}Ｐ１８８（もしくは本開示では単にＫｏｌｌｉｐｈｏｒと称する、またはＬｕｔｒｏｌ^{（登録商標）}Ｆ６８）である：

【化2】

【0166】

研究計画
マウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を移植し、－１６日目、－９日目、－３日目、５日目、１２日目に試験ワクチンで免疫した。各免疫は、左右の脛骨におけるそれぞれ５０μｌのワクチンの注射によって構成された。腫瘍の移植から７日後に、四量体アッセイにおけるＣ２２ ＭＨＣＩの試験のための血液サンプルを試験動物から採取した。

【0167】

各１４匹の６つの群はそれぞれ以下のワクチン組成物を受けた：
１．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ３ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
２．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ４ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
３．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ５ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
４．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
５．ｐＵＭＶＣ４ ｍＸＣＬ１ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
６．ｐＵＭＶＣ４５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
７．未処置
ナイーブマウスの８群目は５匹の動物を含む。

【0168】

四量体アッセイは、以下のように行った：
ＭＨＣクラスＩ分子を製造し、この分子にＵＶ光を照射することでＣ２２エピトープと交換される安定化ペプチドを搭載させた。このＭＨＣＩ分子を蛍光標識したストレプトアビジンと結合させることで多量体化した。ネオエピトープにポジティブなＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するために、細胞を多量体および蛍光色素を結合させた抗ＣＤ３、抗ＣＤ４および抗ＣＤ８抗体で共染色した。そしてサンプルをフローサイトメトリーで分析し、ＭＨＣ：Ｃ２２ポジティブなＣＤ８＋の割合を算出した。

【0169】

Ｔ細胞の活性化を測るために、以下の再刺激実験を行った：
脾臓細胞を５つのネオペプチド含有ワクチンで刺激した。脾臓細胞のサンプル中において、抗原提示細胞はネオエピトープを処理し、その後それらをＴ細胞へと提示することで、同種のＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化がもたらされる。活性化Ｔ細胞はインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）を含む、サイトカインの合成を増加させる。ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞はＥＬＩＳｐｏｔ解析によって検出された。

【0170】

結果
免疫の腫瘍増殖に対する効果を図６に示す。予防免疫によって、共重合体Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと共に５μｇのｐＵＭＶＣ４ ＡＰＣ標的化Ｓ１６Ａプラスミドベクターを受けたマウスにおいて５０～１００％の腫瘍容積の減少がもたらされた。Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと共にＡＰＣ標的化Ｓ１６Ａを含まない５μｇのｐＵＭＶＣ４で処置された群と比べて、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと共に５μｇのｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａで処置された群において腫瘍の減少は顕著に向上した。

【0171】

腫瘍移植後７日目に全てのマウスから全血を回収し、蛍光標識したＣ２２ ＭＨＣＩ四量体で染色した。Ｃ２２をコードするｐＵＭＶＣ４ ＡＰＣ標的化Ｓ１６Ａワクチンを用いた免疫は、高頻度でＣ２２ネオエピトープ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（平均０．３～０．６頻度）。図７を参照。

【0172】

Ｓ１６Ａプラスミドを用いたワクチン接種は、続くネオペプチドによる刺激に応答してＩＦＮγを産生可能なＴ細胞を誘導し、一方で、Ｓ１６Ａで免疫しなかった動物由来サンプルは、該ネオペプチドによる刺激に際してサイトカインシグナルを示さなかった。図８を参照。

【0173】

さらに、ＤＮＡワクチンはマウスおいて十分に忍容性があった；副作用の徴候は観察されず、体重変化の増加から示されるようにマウスの体重は研究を通して継続的に増加し、健康且つ影響を受けていないマウスである事が示された。

【表7】

【表8】

【0174】

結論
異なるＡＰＣ標的化単位およびＳ１６Ａネオエピトープを含む、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと送達されるｐＵＭＶＣ４プラスミドベクターは、ＣＴ２６抗腫瘍効果をもたらした。５μｇという低用量のＤＮＡはコントロール群と比較して非常に顕著な腫瘍容積ＡＵＣの減少をもたらし、ＡＰＣ標的化ＤＮＡワクチンの高い有効性を実証した。Ｓ１６Ａネオペプチドの再刺激では、脾臓細胞において、ＡＰＣ標的化単位に依らずＳ１６Ａプラスミドベクターを受けた群間で類似のＴ細胞免疫原性プロファイルを示した。

【0175】

ワクチンはマウスおいて十分に忍容性があった；副作用の徴候は観察されず、マウスの体重は研究を通して継続的に増加し、健康且つ影響を受けていないマウスである事が示された。

【0176】

［実施例２］
ネオエピトープの送達のためのＡＰＣ標的化単位として、その他のケモカイン、サイトカイン、Ｆｖフラグメントおよびペプチドの評価。
この研究では、本発明者らは、その他のケモカインおよびサイトカイン、ならびにケモカインファミリー外のＡＰＣ標的化分子、例えばＡＰＣ上の受容体を認識する抗体またはＡＰＣ上の表面受容体に結合する小ペプチドリガンドが、以前の研究で見られたものと同程度に、ネオペプチド特異的なＴ細胞を誘導し、および腫瘍増殖を減少させ得るかを試験する事を意図した。さらに本発明者らはワクチン接種したマウスの健康状態に対するワクチンの影響を観察する事を意図した。

【0177】

ＤＮＡワクチン接種のためのプラスミドはＡｌｄｅｖｒｏｎ社から入手可能な市販のｐＵＭＶＣ４^（商標）に基づく。

【0178】

ｐＵＭＶＣ４をバックボーンとして用い、且つＳ１６ＡにおけるネオエピトープをガイドするＡＰＣ標的化単位を用いて生成した８つの発現ベクターを構築した。ＡＰＣ標的化単位として使用した種々のケモカイン、Ｆｖフラグメントおよびペプチドリガンドを以下の表に示す：

【表9】

【0179】

研究計画
マウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を移植し、－１５日目、－８日目、－１日目、６日目、１３日目に試験ワクチンで免疫した。各免疫は、左右の脛骨におけるそれぞれ５０μｌのワクチンの注射で構成された。腫瘍の移植から－２日後および８日後に、四量体アッセイにおけるＣ２２ ＭＨＣＩの試験のための血液サンプルを試験動物から採取した。

【0180】

各１３匹の９つの群はそれぞれ以下のワクチン組成物を受けた：
１．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
２．ｐＵＭＶＣ４（空） ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
３．ｐＵＭＶＣ４ 抗ｍＣＬＥＣ９ Ｆｖ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
４．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＬＥＣ－９リガンド Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
５．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ２０ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
６．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ２１ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
７．ｐＵＭＶＣ４ 抗ｍＤＥＣ－２０５ Ｆｖ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
８．ｐＵＭＶＣ４ ｍＦＬＴ３Ｌ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
９．ｐＵＭＶＣ４ ｍＧＭ－ＣＳＦ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
ナイーブマウスの１０群目は５匹の動物を含む。

【0181】

実験の読み出し（Ｒｅａｄ－ｏｕｔ）は腫瘍容積、循環するネオエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および脾臓から単離された機能的なネオエピトープ特異的Ｔ細胞の測定、である。

【0182】

結果
免疫の腫瘍増殖に対する効果を図９に示す。予防免疫によって、共重合体Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと共に５μｇのｐＵＭＶＣ４ ＡＰＣ標的化 Ｓ１６Ａプラスミドベクターを受けたマウスにおいて、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと併用する５μｇのｐＵＭＶＣ４に比して、５０～１００％の腫瘍サイズの減少がもたらされた。

【0183】

－２日目に全てのマウスから全血を回収し、蛍光標識したＣ２２ ＭＨＣＩ四量体で染色した。Ｃ２２をコードするｐＵＭＶＣ４ ＡＰＣ標的化Ｓ１６Ａワクチンを用いた免疫は、高頻度でＣ２２ネオエピトープ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（平均０．３～０．６頻度）。図１０を参照。この効果は、ネオエピトープを含まないコントロールの空ベクター（平均０．１頻度以下）よりも際立って優れていた。

【0184】

終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）では、全てのＳ１６Ａを含むプラスミドを用いたワクチン接種は、続くネオペプチドによる刺激に応答してＩＦＮγを産生可能な脾臓由来のＴ細胞を誘導した。Ｓ１６Ａで免疫しなかった動物由来のサンプル（空のプラスミドおよびナイーブマウス）はネオペプチドによる刺激に際してサイトカインシグナルを示さなかった。図１１を参照。

【0185】

さらに、ＤＮＡワクチンはマウスおいて十分に忍容性があった；副作用の徴候は観察されず、体重変化の増加から示されるように、マウスの体重は研究を通して継続的に増加し、健康且つ影響を受けていないマウスである事が示された。

【表10】

【表11】

【0186】

結論
異なるＡＰＣ標的化単位およびＳ１６Ａネオエピトープを含む、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと送達されるｐＵＭＶＣ４プラスミドベクターは、ＣＴ２６抗腫瘍効果および循環するＣ２２ネオエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をもたらした。５μｇという低用量のＤＮＡはコントロール群と比較して腫瘍容積の減少をもたらし、ＡＰＣ標的化ＤＮＡワクチンの高い有効性を実証した。Ｓ１６Ａネオエピトープ再刺激は、脾臓細胞において、ＡＰＣ標的化単位に依らずＳ１６Ａプラスミドベクターを受けた群間で類似のＴ細胞免疫原性プロファイルを示した。さらに、実験中の体重変化から評価されるように、ＤＮＡワクチンはマウスにおいて十分に忍容性があった。

【0187】

［実施例３］
ネオエピトープの送達のためのＡＰＣ標的化技術のための種々の多量体化単位の評価
この研究では、本発明者らは、ヒトＩＧｇ３由来フラグメント以外の多量体化単位、例えばその他の免疫グロブリン（Ｉｇ）、合成タンパク質またはコラーゲンフラグメントを用いたＡＰＣ標的化ネオエピトープワクチンが、ネオエピトープ特異的なＴ細胞を誘導し、且つ腫瘍増殖を減少させ得るかを試験する事を意図した。マウスＣＣＬ１９をＡＰＣ標的化単位として使用した。さらに、本発明者らはワクチン接種したマウスの健康状態に対するワクチンの影響を観察する事を意図した。

【0188】

ＤＮＡワクチン接種のためのプラスミドはＡｌｄｅｖｒｏｎ社から入手可能な市販のｐＵＭＶＣ４^（商標）に基づく。

【0189】

ｐＵＭＶＣ４をバックボーンとして用い、且つＳ１６ＡにおけるネオエピトープをガイドするＡＰＣ標的化単位としてＣＣＬ１９を用いて生成した５つの新たな発現ベクターを構築した。種々の構築物に用いた種々の多量体化単位を以下の表に示す：

【表12】

【0190】

新たなＤＮＡ構築物を、ＩｇＧ３二量体化ドメインを持つｍＣＣＬ１９ Ｈ１Ｈ４ＣＨ３ Ｓ１６Ａ構築物と比較した（配列番号５９、６０、および３４）。図１８および１９の概要を参照。

【0191】

研究計画
マウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を移植し、－１４日目、－７日目、１日目、８日目および１５日目に試験ワクチンで免疫した。各免疫は、左右の脛骨におけるそれぞれ５０μｌのワクチンの注射で構成された。腫瘍の移植から７日後に、四量体アッセイにおけるＣ２２ ＭＨＣＩの試験のための血液サンプルを試験動物から採取した。

【0192】

各１３匹の７つの群はそれぞれ以下のワクチン組成物を受けた：
１．ｐＵＭＶＣ４（空） ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
２．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ単量体 ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
３．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｈ１Ｈ４ＣＨ３ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
４．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｈ１ｄＨＬＸ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
５．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｈ１ｐ５３ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
６．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ ｈＭＨＤ２ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
７．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ ｍＣｏｌｌａｇｅｎＸＶＩＩＩ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
ナイーブマウスの８群目は４匹の動物を含む。

【0193】

実験の読み出し情報は、初回免疫時の重さと比べての体重の変化、腫瘍容積の減少、循環するネオエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および脾臓から単離された機能的なネオエピトープ特異的Ｔ細胞の測定、である。

【0194】

結果
免疫の腫瘍増殖に対する効果を図１２に示す：予防免疫によって、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと共にネオエピトープＳ１６Ａを含む５μｇのプラスミドベクターｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ を受けた全ての群のマウスにおいて、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと併用する５μｇの空のプラスミドに比して、５０～１００％の腫瘍サイズの減少がもたらされた。Ｉｇ由来またはコラーゲンの多量体化単位を持つＤＮＡ設計を受けた群が最も優れていた。

【0195】

７日目に全てのマウスから全血を回収し、蛍光標識したＣ２２ ＭＨＣＩ四量体で染色した。Ｃ２２をコードするｐＵＭＶＣ４ ＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａワクチンは全て検出可能なレベルのＣ２２ネオペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じた（平均で０．３～５％頻度）。図１３を参照。この効果はＩｇＧを含む設計（Ｈ１Ｈ４ＣＨ３およびｈＭＨＤ２、平均で約２％頻度）において最も顕著であり、単量体および三量体（単量体およびｈＣｏｌｌａｇｅｎＸＶＩＩＩ、平均で１％強の頻度）では中程度の応答があり、合成タンパク質の設計（Ｈ１ｄＨＬＸおよびＨ１ｐ５３、平均で０．５％弱の頻度）および空のプラスミドコントロールよりも顕著に優れていた。

【0196】

終点では、全てのＳ１６Ａを含むプラスミドを用いたワクチン接種は、ネオペプチドによる続く刺激に応答してＩＦＮγを産生可能な脾臓由来のＴ細胞を誘導した。Ｓ１６Ａで免疫しなかった動物由来のサンプル（空のプラスミドおよびナイーブ）はネオペプチドによる刺激に際してサイトカインシグナルを示さなかった。図１４を参照。

【0197】

さらに、ＤＮＡワクチンはマウスおいて十分に忍容性があった；副作用の徴候は観察されず、体重変化の増加から示されるように、マウスの体重は研究を通して継続的に増加し、健康且つ影響を受けていないマウスである事が示された。

【表13】

【表14】

【0198】

結論
ｍＣＣＬ１９、異なる多量体化単位およびＳ１６Ａネオエピトープを含む、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと送達されるｐＵＭＶＣ４プラスミドベクターは、５０～１００％のＣＴ２６抗腫瘍効果をもたらした。Ｉｇ由来またはコラーゲンの多量体化単位を持つＤＮＡ設計を受けた群が最も優れていた。７日目におけるネオエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は抗腫瘍効果に相当し、および終点における機能性Ｔ細胞のレベル（ＩＦＮγ分泌によって測定）は、ネオエピトープを含むＤＮＡ設計を受けた群間で同程度であった。さらに実験中の体重変化から評価されるように、ＤＮＡワクチンはマウスにおいて十分に忍容性があった。

【0199】

［実施例４］
ネオエピトープの送達のためのＡＰＣ標的化技術のための、別々の単位の組合せ／分離の評価
この研究では、本発明者らは、最適に機能するためには３つのモジュール：ＡＰＣ標的化ドメイン、多量体化ドメインおよびネオエピトープ、の全てが融合タンパク質産物として物理的に一体に結合されている必要があるのか、またはケモカインがアジュバントとして存在するのみで十分なのか、およびネオエピトープの二量体／分泌がＡＰＣ標的化ネオエピトープワクチンの抗腫瘍効果およびＴ細胞応答に寄与するか試験する事を意図した。全てのＤＮＡ構築物について、ケモカインとしてマウスＣＣＬ１９を使用した。図１５の概要を参照。

【0200】

ＤＮＡワクチン接種のためのプラスミドはＡｌｄｅｖｒｏｎ社から入手可能な市販のｐＵＭＶＣ４^（商標）に基づく。

【0201】

ｐＵＭＶＣ４をバックボーンとして用い、ｍＣＣＬ１９のみ（配列番号３９）、ネオエピトープＳ１６Ａのみ、または分泌シグナル（ＳｅｃＳｉｇ）、ＩｇＧ３の二量体化ドメインＨ１Ｈ３ＣＨ３（配列番号５９、６０および３４）およびＳ１６Ａネオエピトープ、の何れかを含む３つの新たな発現ベクターを生成した。図１５に示した。

【0202】

新たなＤＮＡ構築物およびその組み合わせを、融合タンパク質をコードするｍＣＣＬ１９ Ｈ１Ｈ４ＣＨ３ Ｓ１６Ａ構築物（以下ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ二量体と称する）、およびｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ単量体と比較した。

【0203】

研究計画
マウスに、０日目にＣＴ２６腫瘍を移植し、－１４日目、－７日目、１日目、８日目および１５日目に試験ワクチンで免疫した。各免疫は、左右の脛骨におけるそれぞれ５０μｌのワクチンの注射で構成された。腫瘍の移植から９日後に、四量体アッセイにおけるＣ２２ ＭＨＣＩの試験のための血液サンプルを試験動物から採取した。

【0204】

各１３匹の８つの群はそれぞれ以下のワクチン組成物を受けた：
１．ｐＵＭＶＣ４（空） １０μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
２．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ 二量体 ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
３．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ 単量体
４．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ ５μｇ ＋ｐＵＭＶＣ４ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
５．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ ５μｇ ＋ｐＵＭＶＣ４ ＳｅｃＳｉｇ Ｈ１Ｈ４ＣＨ３Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
６．ｐＵＭＶＣ４ ＳｅｃＳｉｇ Ｈ１Ｈ４ＣＨ３ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
７．ｐＵＭＶＣ４ ｍＣＣＬ１９ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
８．ｐＵＭＶＣ４ Ｓ１６Ａ ５μｇ ＋Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ
ナイーブマウスの９群目は４匹の動物を含む。

【0205】

実験の読み出し情報は、初回免疫時の重さと比べての体重の変化、腫瘍容積、循環するネオエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の測定である。

【0206】

結果
免疫による腫瘍増殖に対する効果を図１６に示す：予防免疫によって、ｍＣＣＬ１９およびネオエピトープを受けた全ての群のマウスにおいて、成分が融合タンパク質としてコードされたかまたは別々のタンパク質産物としてコードされたかに関わらず、腫瘍サイズの減少がもたらされた。ＳｅｃＳｉｇ、Ｈ１Ｈ４ＣＨ３二量体化ドメインおよびネオエピトープを含む非標的化融合タンパク質もまた顕著な抗腫瘍効果を有し、ネオエピトープの分泌および二量体化が抗腫瘍効果を向上させる事が示された。

【0207】

９日目に全てのマウスから全血を回収し、蛍光標識したＣ２２ ＭＨＣＩ四量体で染色した。Ｓ１６Ａの一部であるエピトープＣ２２を含む全てのワクチンによる免疫は検出可能なレベルのＣ２２ネオペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じた（平均で０．５～１５％頻度）。図１７を参照。この効果は融合タンパク質の設計（ｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ二量体およびｍＣＣＬ１９ Ｓ１６Ａ単量体、平均で約４％頻度）において最も顕著であり、また個別のｍＣＣＬ１９産物とＳｅｃＳｉｇ、Ｈ１Ｈ４ＣＨ３二量体化ドメインおよびネオエピトープを含む非標的化融合タンパク質との組み合わせも高いＴ細胞レベル（平均で１．５％強の頻度）を生じ、単一成分（ｍＣＣＬ１９およびＳ１６Ａ、平均で０．５％弱の頻度）および空のプラスミドコントロールの効果よりも顕著に優れていた。

【0208】

さらに、ＤＮＡワクチンはマウスおいて十分に忍容性があった；副作用の徴候は観察されず、体重変化の増加から示されるように、マウスの体重は研究を通して継続的に増加し、健康且つ影響を受けていないマウスである事が示された。

【表15】

【表16】

【0209】

結論
ｍＣＣＬ１９、異なる多量体化単位およびＳ１６Ａネオエピトープを含む、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと送達されるｐＵＭＶＣ４プラスミドベクターは、５０～１００％のＣＴ２６抗腫瘍効果をもたらした。Ｉｇ由来またはコラーゲンの多量体化単位を持つＤＮＡ設計を受けた群がもっともすぐれていた。７日目のネオエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は抗腫瘍効果に相当し、および終点における機能性Ｔ細胞のレベル（ＩＦＮγ分泌によって測定）は、ネオエピトープを含むＤＮＡ設計を受けた群間で同程度であった。さらに、ＤＮＡワクチンはマウスにおいて十分に忍容性があった。

【0210】

［実施例５］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質を用いたＡＰＣ標的化
この研究の目的は、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒと共に送達したスパイク受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を使用したＡＰＣ（ＣＣＬ１９）標的化ＤＮＡプラスミドの性能を、水酸化アルミニウムでアジュバント化された組み換えＲＢＤの性能と比較する事であった。目標は、マイクロ中和アッセイにおいて、Ｔ細胞応答の大きさ、液性の抗原特異的な抗体応答、および生成された抗体のウイルスによる細胞への感染を阻止する能力を決定する事であった。

【0211】

多数のベクター設計が作られ、そのうちＰＯ００５５（以下を参照）を本研究において評価した。選択されるＲＢＤは、全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ スパイクタンパク質 （Ａｃｃ ＩＤ： ＹＰ＿００９７２４３９０．１）から、Ａｒｇ３１９からＰｈｅ５４１までのアミノ酸を切り出して取得した。ベクター設計を図２０に模式的に示す。

【0212】

試験構築物Ｐ００５５と比較して、Ｐ００６９は発現レベルを増加する事を目的として構築された。同様に、Ｐ００７２は１）発現レベルを増加する事、および２）発現産物の二量体ではなく三量体を形成する事を目的として構築されたが、まだ検証されていない。

【0213】

Ｐ００７５およびＰ００８３はコントロールであり、それぞれ多量体化およびＣＣＬ１９標的化の効果を調べるために設計された。

【0214】

発現ベクターＰ００５５は図２１にプラスミドマップとして示されており、および配列番号６７に記載されている。このプラスミドによってコードされるＲＢＤ配列は配列番号６８に提供される。

【0215】

動物実験の詳細
マウスを０日目、７日目、１４日目、２１日目および２８日目に試験ＤＮＡプラスミドで免疫した。各免疫は、左右の脛骨におけるそれぞれ５０μｌのＤＮＡプラスミドの筋肉内注射で構成された。組み換えＲＢＤワクチンの投与レジメンは、初回免疫として２０μｇのタンパク質を投与し、続いて、１４日目と２８日目に２０μｇのブースト免疫を２回行った。各免疫は、１００μｌのＲＢＤ＋水酸化アルミニウムのワクチンの皮下投与で構成された。動物は３５日目にサクリファイスした。

【0216】

４群（１～４）のマウス（それぞれ５匹、７匹、７匹および５匹の個体）を以下の処置に割り当てた：
群１：プラスミドＰ００５３－ｐＴＧＶ４－ＣＣＬ１９（モック、すなわちスパイクタンパク質を持たないＤＮＡプラスミド、２５μｇ。
群２：プラスミドＰ００５５（すなわち、標的化単位ＣＣＬ１９およびスパイクタンパク質由来のＲＢＤを持つＤＮＡプラスミドｐＴＧＶ４）、２５μｇ。
群３．２％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ中のＲＢＤタンパク質、２０μｇ。
群４．Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ ２％。

【0217】

読み出し情報は、体重変化（３週間の測定に基づく）および血液サンプル採取（１９日目および３５日目）および脾臓サンプル採取（３５日目）に基づく測定である。実施された測定は、血中の抗ＲＢＤ ＩｇＧの測定、脾臓Ｔ細胞の活性化（ペプチドで再刺激された脾臓細胞におけるＩＦＮ－γ放出ＥＬＩＳＰＯＴ）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＡＲ－ＣｏＶ－２の中和であった。

【0218】

結果
図２２は、群２のマウスのＴ細胞からのＩＦＮ－γ放出を可視化した棒グラフを示す。Ｔ細胞は、ペプチドまたはコンカナバリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ）（ｃｏｎＡ、ＩＦＮ－γ放出のポジティブコントロール）のどちらかで再刺激された。左端の２つのバーは、刺激されない細胞および無関係なペプチドで刺激された細胞からの放出を示す。プール１、２および３は、以下の分布に従って、ＲＢＤタンパク質からの重複するペプチドによって構成された：
プールＲＢＤ１：ＣｏＶ２＿ｓ－３１９、ＣｏＶ２＿ｓ－３２５、ＣｏＶ２＿ｓ－３３１、ＣｏＶ２＿ｓ－３３７、ＣｏＶ２＿ｓ－３４３、ＣｏＶ２＿ｓ－３４９、ＣｏＶ２＿ｓ－３５５、ＣｏＶ２＿ｓ－３６１、ＣｏＶ２＿ｓ－３６７、ＣｏＶ２＿ｓ－３７３、ＣｏＶ２＿ｓ－３７９、ＣｏＶ２＿ｓ－３８５；
プールＲＢＤ２：ＣｏＶ２＿ｓ－３９１、ＣｏＶ２＿ｓ－３９７、ＣｏＶ２＿ｓ－４０３、ＣｏＶ２＿ｓ－４０９、ＣｏＶ２＿ｓ－４１５、ＣｏＶ２＿ｓ－４２１、ＣｏＶ２＿ｓ－４２７、ＣｏＶ２＿ｓ－４３９、ＣｏＶ２＿ｓ－４４５、ＣｏＶ２＿ｓ－４５１、ＣｏＶ２＿ｓ－４５７；
プールＲＢＤ３：ＣｏＶ２＿ｓ－４６３、ＣｏＶ２＿ｓ－４６９、ＣｏＶ２＿ｓ－４７５、ＣｏＶ２＿ｓ－４８１、ＣｏＶ２＿ｓ－４８７、ＣｏＶ２＿ｓ－４９３、ＣｏＶ２＿ｓ－４９９、ＣｏＶ２＿ｓ－５０５、ＣｏＶ２＿ｓ－５１１、ＣｏＶ２＿ｓ－５１７、ＣｏＶ２＿ｓ－５２３、ＣｏＶ２＿ｓ－５２９

【0219】

プール２およびプール３で刺激された細胞は、刺激無しまたは無関係なペプチドで刺激された２つの群に比して顕著に高いＩＦＮ－γの放出を示した。

【0220】

図２３は、３５日目からのマウスの血清中の全ＲＢＤ特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡ測定を示し、ここで群１および群４についてはプールしたプラセボ血清とし、群２および群３については個々のマウスをアッセイした。結果的な終点の力価を図２３に棒グラフとして示す。Ｐ００５５ ＣＣＬ－１９ ＲＢＤを用いた免疫は、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄ）を用いた組み換えスパイクＲＢＤと同等の抗体力価が達成されるため、免疫したマウスにおいてＲＢＤタンパク質の細胞外発現に成功した事を示し、その結果、強力な体液性応答が得られる事を示した。

【0221】

最後に、図２４は、４つの試験群における抗体、および回復期の患者の血清からの抗体の中和効果を可視化した棒グラフを示す。明らかなように、群２からのマウスは、群３および回復期の患者が産生する抗体と中和効果において同等である抗体を産生する。これは、スパイクタンパク質またはその断片を用いたＡＰＣ標的化の応用を支持する。

【0222】

結論
本発明の構築物は、スパイクＲＢＤ設計を使用して、強力なＴ細胞応答を誘導する。さらに、本発明のスパイクＲＢＤ設計によって、組み換えスパイクＲＢＤ＋２％Ａｌｕｍによるものと同程度に、体液性応答を誘導し得る。最後に、誘導された抗体力価は、回復期の患者の血清に匹敵する中和効果を示した。

【0223】

本発明のＡＰＣ標的化単位：

【表17】

【表18-1】

【表18-2】

【表18-3】

【表18-4】

【表18-5】

【表18-6】

【表18-7】

【表18-8】

【表18-9】

【表18-10】

【表18-11】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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【国際調査報告】