特表 2023-533938 ＨＰＫ１阻害剤およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-07

(54)【発明の名称】ＨＰＫ１阻害剤およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07D 401/14 20060101AFI20230731BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20230731BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230731BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20230731BHJP

【ＦＩ】

C07D401/14 CSP

A61K31/506

A61P35/00

A61P43/00 111

A61P43/00 121

A61K45/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023500011

(86)(22)【出願日】2021-07-02

(85)【翻訳文提出日】2023-03-03

(86)【国際出願番号】 CN2021104206

(87)【国際公開番号】W WO2022002237

(87)【国際公開日】2022-01-06

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2020/100134

(32)【優先日】2020-07-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｓｐａｎ

２．ＴＷＥＥＮ

３．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521220895

【氏名又は名称】キル・レガー・セラピューティクス・インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(72)【発明者】

【氏名】チョン，ウェンジ

(72)【発明者】

【氏名】チュー，シャオティアン

(72)【発明者】

【氏名】フェン，ソン

(72)【発明者】

【氏名】ウー，レイ

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ハオ

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ロンチャン

(72)【発明者】

【氏名】ウェン，ケイト・シン

(72)【発明者】

【氏名】チョウ，フア

【テーマコード（参考）】

4C063

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C063AA03

4C063BB02

4C063CC31

4C063DD06

4C063EE01

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZC201

4C084ZC751

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086BC42

4C086GA07

4C086GA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC20

4C086ZC75

(57)【要約】

本発明は、ＨＰＫ１活性を阻害することにより処置可能な疾患（例えば、がん）の処置に有用である、構造式（Ｉ）または式（ＩＩ）：

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式Ｉ

【化1】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。

【請求項2】

式ＩＡ

【化2】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項3】

式ＩＢ

【化3】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項4】

式ＩＩ

【化4】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体。

【請求項5】

式ＩＩＡ

【化5】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項6】

式ＩＩＢ

【化6】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩。

【請求項7】

治療有効量の請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

【請求項8】

治療有効量の請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体と、１つ以上の治療活性作用剤とを含む、組合せ物。

【請求項9】

がんを有する対象を処置する方法であって、対象に有効量の請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を投与するステップを含む、方法。

【請求項10】

がんが、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、および膵がんから選択される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

ＨＰＫ１活性の阻害を必要とする対象においてＨＰＫ１活性を阻害する方法であって、対象に有効量の請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を投与するステップを含む、方法。

【請求項12】

対象が、がんを有し、がんが処置される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

がんが、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、および膵がんから選択される、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月３日に出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ／２０２０／１００１３４号の優先権の利益を主張する。前述の出願の全ての内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

造血前駆体キナーゼ１（ＨＰＫ１）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼキナーゼ１（ＭＡＰ４Ｋ１）としても知られており、ＭＡＰ２Ｋ（ＭＡＰキナーゼキナーゼ）を活性化し、その次に二重ＴｈｒおよびＴｙｒ ＭＡＰＫファミリーメンバーＪＮＫ（ｃ－Ｊｕｎ Ｎ末端キナーゼ）を活性化するＭＡＰ３Ｋ（ＭＡＰキナーゼキナーゼキナーゼ）を含む古典的３段ＭＡＰＫ経路の上流で作用する、プロテインキナーゼである。造血前駆細胞において最初にクローンされたＨＰＫ１／ＭＡＰ４Ｋ１は、骨髄、胎生期肝臓、リンパ節、胎盤、脾臓、および胸腺が含まれるリンパ系器官／組織に主に発現する（Ｈｕら、Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．１０（１８）：２２５１～２２６４、１９９６；Ｋｉｅｆｅｒら、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．１５（２４）：７０１３～７０２５、１９９６）。細胞レベルでは、ＨＰＫ１は、造血前駆細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、好中球、およびマスト細胞が含まれる造血区画中の全ての細胞タイプにおいて発現する（Ｈｕ、上記；Ｋｉｅｆｅｒ、上記）。

【0003】

ＨＰＫ１／ＭＡＰ４Ｋ１は、ＨＰＫ１（ＭＡＰ４Ｋ１）、ＧＣＫ（ＭＡＰ４Ｋ２）、ＧＬＫ（ＭＡＰ４Ｋ３）、ＨＧＫ／ＮＩＫ（ＭＡＰ４Ｋ４）、ＫＨＳ／ＧＣＫＲ（ＭＡＰ４Ｋ５）、およびＭＩＮＫ（ＭＡＰ４Ｋ６）を含む６個のＭＡＰ４Ｋのうちの１つである。これらのＭＡＰ４Ｋは、まとめて、現在まで確認されている約２６個の哺乳類Ｓｔｅ２０様セリン／トレオニンキナーゼのメンバーであり、酵母フェロモンシグナル伝達経路においてＭＡＰ３Ｋを活性化する推定ＭＡＰ４Ｋである酵母ステライル２０プロテイン（Ｓｔｅ２０ｐ）の相同体である。これらの哺乳類Ｓｔｅ２０様キナーゼは、ドメイン構造に基づいて２つのサブファミリーに分けられ、ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）および胚中心キナーゼ（ＧＣＫ）である。ＧＣＫサブファミリーのなかで、これらのうちのいくつかは、ＭＡＰ３Ｋキナーゼカスケードを活性化して、ＪＮＫ活性化をもたらすことができる。

【0004】

ＭＡＰ４Ｋは、構造的に極めて類似しており、Ｎ末端キナーゼドメイン（ＫＤ）の後ろに、２～４個のプロリンリッチモチーフおよびＣ末端シトロン相同ドメイン（ＣＮＨ）が続いている。

【0005】

ＨＰＫ１のキナーゼドメインのＡＴＰ結合部位は、Ｌｙｓ－４６を含む。この残基からＭｅｔへの突然変異（ＨＰＫ１－Ｍ４６）は、ＨＰＫ１の触媒活性化を消失させる（Ｈｕ、上記）。

【0006】

ＨＰＫ１のキナーゼドメイン内に複数の保存Ｓｅｒ／Ｔｈｒリン酸化部位、および最初の２個のプロリンリッチモチーフの間に保存Ｔｙｒリン酸化部位が存在する。ＬＣＫ／ＺＡＰ７０によるＴｙｒ３７９（マウス、またはヒトのＴｙｒ３８１）のリン酸化は、ＨＰＫ１活性化にとって必要であると思われ、それは、ＬＣＫまたはＺＡＰ７０の欠乏が、抗ＣＤ３刺激によるジャーカットＴ細胞におけるＨＰＫ１のＴｙｒ－３７９リン酸化およびキナーゼ活性を消失させるからである（Ｌｉｎｇら、ＪＢＣ ２７６（２２）：１８９０８～１８９１４、２００１；Ｌｉｏｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １２（４）：３９９～４０８、２０００；Ｓａｕｅｒら、ＪＢＣ ２７６（４８）：４５２０７，４５２１６、２００１）。一方、Ｔｈｒ－３５５自己リン酸化は、ＨＰＫ１のユビキチン化および分解を制御する。Ｔｈｒ－３５５は、ＰＰ４標的脱リン酸化部位であり、この脱リン酸化は、活性化ＨＰＫ１のＣＵＬ７／Ｆｂｘｗ８媒介ユビキチン化およびプロテアソーム分解を防止し（Ｗａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６９（３）：１０６３～１０７０、２００９）、したがってＨＰＫ１は、また、プロテインホスファターゼ４（ＰＰ４）によって安定化および活性化される（Ｚｈｏｕら、ＪＢＣ ２７９（４７）：４９５５１～４９５６１、２００４）。

【0007】

Ｔｙｒリン酸化部位は、また、カスパーゼ切断部位（ＤＤＶＤ）に隣接している。完全長ＨＰＫ１は、アポトーシス細胞中のこの部位においてカスパーゼ－３により切断され、Ｎ末端ＨＰＫ１断片の高められた触媒活性を生じ得ることが示されている（Ｃｈｅｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８：７３７０～７３７７、１９９９）。

【0008】

ＨＰＫ１の４個のプロリッチモチーフは、ＨＰＫ１と多くのＳＨ３ドメイン含有タンパク質との相互作用を媒介する（Ｂｏｏｍｅｒ ＆ Ｔａｎ、ＪＣＢ ９５（１）：３４～４４、２００５）。

【0009】

ＨＰＫ１のＣＮＨドメインは、ＨＰＫ１媒介リンパ球接着に関与することがあり、それは、別のＳｔｅ２０様キナーゼＴＮＩＫにおけるシトロン相同性ドメインがＲａｐ２に結合し、アクチン細胞骨格を制御するからである（Ｔａｉｒａら、ＪＢＣ ２７９（４７）：４９４８８～４９４９６、２００４）。

【0010】

ＭＡＰ４Ｋは、細胞シグナル伝達、免疫細胞活性化、細胞形質転換、および細胞遊走を制御することによって、免疫系において、特にリンパ球において重要な役割を果たす。ＨＰＫ１ノックアウト（ＫＯ）マウスは、ＫＬＨ免疫化の後に高められたＴ細胞活性化、増加したサイトカイン酸性、および増加した抗体産生を示す。ＨＰＫ１ ＫＯマウスは、また、ＥＡＥ誘導により多くの感受性がある。ＨＰＫ１ ＫＯのＴ細胞およびＢ細胞は、高められた細胞活性化および抗原受容体シグナル伝達を示す。ＨＰＫ１ ＫＯの樹状細胞は、より高いレベルの共刺激性分子および炎症促進性サイトカインを示す（Ａｌｚａｂｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（１０）：６１８７～６１９４、２００９；Ｓｈｕｉら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（１）：８４～９１、２００７）。

【0011】

細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ－１細胞、ならびに造血ジャーカットＴ細胞および白血病ＨＬ－６０細胞）における過剰発現は、ＨＰＫ１が、全てＭＡＰ２ＫのＭＫＫ４およびＭＫＫ７を活性化し、その次にＪＮＫを活性化する複数のＭＡＰ３Ｋ（ＴＡＫ１、ＭＥＫＫ１、およびＭＬＫ３を含む）を介してＭＡＰＫ ＪＮＫを活性し得る（しかし、ｐ３８またはＥＲＫ ＭＡＰキナーゼを活性化しない）ことを実証した。

【0012】

興味深いことに、免疫細胞におけるＭＡＰ４Ｋの制御機能は、ほとんどがＪＮＫ非依存的機構によって媒介されると思われる。ＨＰＫ１キナーゼ活性化がＩＫＫ－ＮＦ－κＢ活性化に必要であることが実証されており、ＨＰＫ１はＣＡＲＭＡ１の制御を介して行っていると思われる。ＣＡＲＭＡ１は、抗ＣＤ３刺激によりジャーカットＴ細胞においてＩＫＫβ活性化を促進する、いわゆるＣＢＭ（ＣＡＲＭＡ１／ＢＣＬ１０／ＭＡＬＴ１）複合体中のアダプタータンパク質である。活性化されたＩＫＫは、ＩκＢを切断し、関連ＮＦ－κＢ核転写因子を放出する。特に、ＨＰＫ１は、ＣＡＲＭＡ１と誘導的に会合し、ＮＦ－κＢ活性化に必要であるＳｅｒ－５５１においてＣＡＲＭＡ１を直接リン酸化する（Ｂｒｅｎｎｅｒら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，１９６（３４）：１４５０８～１４５１３、２００９）。

【0013】

Ｔ細胞では、ＴＣＲ刺激により、リンパ球タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）がＴＣＲ／ＣＤ３複合体の細胞基質側の免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化する。次いでＺａｐ－７０がＴＣＲ／ＣＤ３複合体に動員され、そこでリン酸化および活性化される。活性化されたＺＡＰ－７０は、ＳＬＰ－７６と呼ばれるアダプタータンパク質をリン酸化し、これを細胞膜に転位置させ、ＨＰＫ１を含む多数のタンパク質に結合させることによって、多タンパク質シグナルソーム複合体の形成を促進する。これらのタンパク質は、まとまってＴＣＲシグナル伝達を異なるエフェクター分子に伝達し、Ｔリンパ球の活性化、生存、および増殖をもたらす。

【0014】

このプロセスの際に、ＨＰＫ１はＳＬＰ－７６のＳＨ２ドメインに直接結合し、ＴＣＲシグナル伝達の負の制御因子として主に機能する。例えば、ＴＣＲシグナル伝達は、ＨＰＫ１ ＫＯ初代Ｔ細胞において高められ、すなわち、Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＣＲライゲーションにより過剰増殖およびＩＬ－２産生を示す（Ｓｈｕｉ、上記）。ＨＰＫ１は、Ｓｅｒ－３７６でＳＬＰ－７６アダプタータンパク質をリン酸化することによって、負のフィードバックを介してＴＣＲシグナル伝達を下降制御することができると考えられる。ＨＰＫ１によるＳｅｒ－３７６リン酸化によって、ＳＬＰ－７６は、リン酸化されたＳｅｒ－３７６残基を介して１４－３－３に結合し、後にプロテアソーム分解の標的になるＳＬＰ－７６のＬｙｓ－３０（Ｋ３０）残基におけるユビキチン化をもたらす。ＨＰＫ１は、また、ＧＡＤを含む他のアダプタータンパク質において同様の機構により（例えば、ＧＡＤＳのＴｈｒ－２５４をリン酸化し、１４－３－３相互作用を促進することにより）、ＴＣＲシグナル伝達を下方制御する。

【0015】

したがって、ＨＰＫ１は、ＪＮＫ活性化およびＴＣＲシグナル伝達において二重および逆の役割を果たす。ＨＰＫ１は、ＭＡＰ３Ｋ－ＭＡＰ２Ｋ－ＭＡＰＫ経路を介して異なる過剰発現系におけるＪＮＫ経路を直接活性化することが実証されているが、ＳＬＰ－７６活性化のＨＰＫ１媒介阻害は、また、ＴＣＲシグナル伝達におけるＪＮＫ活性の阻害をもたらす。このことは、ＨＰＫ１ノックアウト初代Ｔ細胞が、影響されないＪＮＫ活性を示すという観察と一致している（Ｓｈｕｉ、上記）。同様に、ＨＰＫ１は、一方では、ＨＰＫ１が、ＣＡＲＭＡ１を直接リン酸化してＩＫＫを活性化する、他方では、またＨＰＫ１が、ＳＬＰ－７６活性化を阻害してＩＫＫ活性化を負に制御するという２つの異なる対照的な機構により、ＩＫＫ活性化を制御すると思われる。このＨＰＫ１が果たしている一見して対照的な二重の役割は、ＨＰＫ１が、ＴＣＲシグナル伝達の初期段階ではＪＮＫおよびＩＫＫの活性化を促進するが、後期段階ではＴＣＲシグナル伝達を減衰する重要な役割を果たすというように理解することが最も適している。

【0016】

ＨＰＫ１は、また、細胞におけるＢＣＲ誘導性細胞活性化およびＢ細胞増殖における同様の負の制御にも役割を果たす。Ｂ細胞は、ＪＮＫおよびＩＫＫの活性化を含むＢＣＲシグナル伝達を形質導入するために、ＢＬＮＫと呼ばれるＳＬＰ－７６様アダプタータンパク質を使用する。Ｂ細胞では、ＴｙｒキナーゼのＳｙｋおよびＬｙｎは、ＨＰＫ１のＴｙｒリン酸化および活性化を促進し、ＨＰＫ１の得られたｐＹ３７９は、ＨＰＫ１－ＢＬＮＫ結合を媒介する。ＢＬＮＫのＨＰＫ１による負のフィードバックは、ＢＬＮＫのＴｈｒ－１５２を介するものである。１４－３－３によるｐＴ１５２結合は、複数のＬｙｓ残基にＢＬＮＫユビキチン化をもたらし、続いてＢＬＮＫのプロテアソーム分解（したがって、ＢＣＲシグナル伝達の減衰）をもたらす。

【0017】

興味深いことに、ＨＰＫ１は、制御性Ｔ細胞（Ｔ_ｒｅｇ）の抑制機能の正の制御因子であると思われる（Ｓａｗａｓｄｉｋｏｓｏｌら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８（付録１）：１６３、２０１２）。ＨＰＫ１欠乏マウスＦｏｘｐ３^＋のＴｒｅｇは、ＴＣＲ誘導性エフェクターＴ細胞増殖の抑制に欠陥があり、逆説的に、ＴＣＲ会合の後にＩＬ－２を産生する能力を得た（Ｓａｗａｓｄｉｋｏｓｏｌ、上記）。したがって、ＨＰＫ１は、Ｔｒｅｇ機能および末梢性自己寛容にとって重要な制御因子である。

【0018】

ＨＰＫ１は、また、ＣＤ４^＋のＴ細胞活性化のＰＧＥ２媒介阻害にも関与する（Ｉｋｅｇａｍｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（７）：４６８９～４６９６、２００１）。ＵＳ２００７／００８７９８は、ＨＰＫ１キナーゼ活性が、ＰＧＥ２誘導性ＰＫＡ活性化を介して、ＣＤ４^＋のＴ細胞中の生理学的濃度のＰＧＥ２に暴露されると増加したことを示す。ＨＰＫ１欠乏Ｔ細胞の増殖は、ＰＧＥ２の抑制効果に対して抵抗力を示した（ＵＳ２００７／００８７９８８）。したがって、ＨＰＫ１のＰＧＥ２媒介活性化は、免疫応答を調節する新規の制御経路を表すことができる。

【0019】

ＴＣＲおよびＢＣＲの他に、ＨＰＫ１は、また、ＴＧＦ－Ｒ（形質転換増殖因子受容体）（Ｗａｎｇら、ＪＢＣ ２７２（３６）：２２７７１～２２７７５、１９９７）またはＧ共役ＰＧＥ２受容体（ＥＰ２およびＥＰ４）（Ｉｋｅｇａｍｉら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６（７）：４６８９～４６９６、２００１）の下流にシグナルを伝達する。

【0020】

ＨＰＫ１は、免疫細胞接着を負に制御する。Ｔ細胞では、ＴＣＲ活性化は、また、インテグリン活性化も誘導し、Ｔ細胞接着および免疫シナプス形成を生じる。このことは、ＴＣＲ誘導性インテグリン活性化に必要である脱顆粒化促進アダプタータンパク質（ＡＤＡＰ）のＳＬＰ－７６結合によって達成されるが（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００（８）：１０６３～１０７４、２００４）、活性化小ＧＴＰアーゼＲａｐ１を細胞膜に向けて標的化する構成的に会合されたＳＫＡＰ５５タンパク質は、インテグリン活性をもたらす（Ｋｌｉｃｈｅら、ＭＣＢ ２６（１９）：７１３０～７１４４、２００６）。換言すると、ＳＬＰ－７６／ＡＤＡＰ／ＳＫＡＰ５５三元複合体は、ＴＣＲシグナル伝達をインテグリンファミリーの接着分子に中継し、それによってＴ細胞接着を促進する。ＨＰＫ１はこの経路を、ＳＬＰ－７６の下方制御（上記）のみならず、ＳＬＰ－７６の同じＳＨ２結合部位をＡＤＡＰと競合し、次にＡＤＡＰ下流エフェクターＲａｐ１の活性を減衰させることによっても負に制御する（Ｐａｔｚａｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０（１１）：３２２０～３２２５、２０１０）。

【0021】

ＨＰＫ１は、同様にＢ細胞においてインテグリン活性化および細胞接着を負に制御する。そこでは、ＨＰＫ１は、ＳＫＡＰ－ＨＯＭと呼ばれるＳＫＡＰ５５相同体と会合し（Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇｅｒら、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ５（９）．ｐｉｉ：ｅ１２４６８、２０１０）、このことは、Ｂ細胞接着にとって必要である（Ｔｏｇｎｉら、ＭＣＢ ２５（１８）：８０５２～８０６３、２００５）。ＨＰＫ１は、ＳＫＡＰ－ＨＯＭにネガティブリン酸化部位を誘導し、次にＲａｐ１活性化を抑制すると考えられる。

【0022】

しかし好中球では、ＨＰＫ１は接着を正に制御する。遅い転がり、密接な結合、細胞の伸展、および血管外遊出を含む好中球輸送は、β２インテグリン活性化のアウトサイドイン（ｏｕｔｓｉｄｅ－ｉｎ）シグナル伝達により制御され、このことは、アクチンとＨＩＰ－５５（５５ｋＤａのＨＰＫ１相互作用タンパク質）との相互作用を誘導する。このことは、β２インテグリンの高親和性立体配座を補強し、好中球接着に寄与する（Ｈｅｐｐｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８（９）：４５９０～４６０１、２０１２；Ｓｃｈｙｍｅｉｎｓｋｙら、Ｂｌｏｏｄ １１４（１９）：４２０９～４２２０、２００９）。ＨＰＫ１は、β２インテグリン媒介接着により好中球のラメリポディウムにＨＩＰ－５５およびアクチンと共局在化する（Ｊａｋｏｂら、Ｂｌｏｏｄ １２１（２０）：４１８４～４１９４、２０１３）。ＣＸＣＬ１媒介好中球接着は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＰＫ１の欠乏またはＨＩＰ－５５の欠乏のいずれかによって消失する（Ｊａｋｏｂ、上記；Ｓｃｈｙｍｅｉｎｓｋｙ、上記）。

【0023】

ＴＣＲおよびＢＣＲ機能の下方制御における役割と一致して、ＨＰＫ１は、適応免疫応答を負に制御し、Ｔ細胞活性化および免疫応答のＨＰＫ１媒介制御の損失は、自己免疫性病理発生にとって重要な機構であり得る。ＨＰＫ１ ＫＯマウスでは、ＴおよびＢ細胞の発生は影響されないように思われるが（Ｓｈｕｉ、上記）、これらの動物のＴ細胞は、ＴＣＲ近位シグナル伝達および下流ＥＲＫの劇的に増加された活性化を示し、抗ＣＤ３刺激によるｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるこれらの細胞の過剰増殖をもたらした（Ｓｈｕｉ、上記）。免疫化されたＨＰＫ１欠乏マウスのＴ細胞は、抗原特異的刺激によって応答性亢進であり、有意に高いレベルの炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－４を産生する。そのようなマウスは、また、はるかに高いレベルのＩｇＭおよびＩｇＧアイソフォームも産生し、ＨＰＫ１ノックアウトＢ細胞の高められた機能を示唆している（Ｓｈｕｉ、上記）。

【0024】

ＨＰＫ１は、また、マウスの自己免疫を負に制御し、それは、ＨＰＫ１ ＫＯマウスが実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の誘導への感受性がより高い（Ｓｈｕｉ、上記）からである。ＨＰＫ１の減弱は、また、ヒト患者における異常なＴおよびＢ細胞活性化、ならびに自己免疫にも寄与する。ＨＰＫ１は、乾癬性関節炎患者の末梢血単核球または全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者のＴ細胞を下方制御する。

【0025】

ＨＰＫ１の生理学的機能はリンパ球に限定されず、ＨＰＫ１では、不明の機構を介して樹状細胞（ＤＣ）の成熟および活性化も負に制御する（Ａｌｚａｂｉｎ、上記）。ＨＰＫ１ ＫＯマウスでは、骨髄誘導性樹状細胞（ＢＭＤＣ）が、共刺激性分子ＣＤ８０／ＣＤ８６の高められたレベル、および炎症促進性サイトカインの増加された産生を示す（Ａｌｚａｂｉｎ、上記）。したがって、樹状細胞の抗原提示活性は、ＨＰＫ１ ＫＯマウスにおいてより効率的である（Ａｌｚａｂｉｎ、上記）。より重要なことに、ＨＰＫ１ ＫＯ ＢＭＤＣ媒介ＣＴＬ応答による腫瘍消滅は、野生型ＢＭＤＣより有効である（Ａｌｚａｂｉｎ、上記）。更に、ＨＰＫ１は、また、ＴおよびＢリンパ球依存性機構によって抗腫瘍免疫も制御する。ＨＰＫ１欠乏Ｔ細胞の養子移入は、野生型Ｔ細胞より腫瘍増殖および転移を有効に制御することが示されている（Ａｌｚａｂｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５９（３）：４１９～４２９、２０１０）。同様に、ＨＰＫ１ノックアウトマウスのＢＭＤＣは、野生型ＢＭＤＣと比較して、ルイス肺癌を消滅させるＴ細胞応答を開始するのにより効率的であった（Ａｌｚａｂｉｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８２（１０）：６１８７～６１９４、２００９）。

【0026】

したがって、ＨＰＫ１活性の調節を介して疾患または障害を処置するための、ＨＰＫ１阻害化合物の必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0027】

本明細書に記載されるものは、ＨＰＫ１の活性を阻害する、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩＡ）、および（ＩＩＢ）の化合物、ならびにそれらの薬学的に許容される塩または立体異性体（まとめて「本発明の化合物」と称される）である。

【0028】

本明細書に提供されるものは、有効量の本開示の化合物、その薬学的に許容される塩またはその立体異性体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
また提供されるものは、治療有効量の本開示の化合物またはその薬学的に許容される塩と、１つ以上の治療活性作用剤（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃｏ－ａｇｅｎｔ）とを含む組合せである。

【0029】

本開示は、それを必要とする対象においてＨＰＫ１活性を阻害する方法であって、対象に治療有効量の本開示の化合物、その薬学的に許容される塩または立体異性体を投与することを含む方法を更に提供する。

【0030】

本開示は、本明細書に記載される疾患または状態、例えば、がん（例えば、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、および膵がん）を有する対象を処置する方法であって、対象に治療有効量の本開示の化合物、その薬学的に許容される塩または立体異性体を投与することを含む方法を更に提供する。

【0031】

ある特定の実施形態は、医薬として、例えばＨＰＫ１阻害剤として作用する医薬として使用するための、本開示の化合物、その薬学的に許容される塩または立体異性体を開示する。

【0032】

本開示は、また、上記に記載された本開示の方法にいずれかにおける、本開示の化合物、その薬学的に許容される塩もしくは立体異性体、またはこれらを含む医薬組成物の使用も提供する。一実施形態において、提供されるものは、本明細書に記載される本開示の方法にいずれかに使用するための、本開示の化合物、その薬学的に許容される塩もしくは立体異性体、またはこれらを含む医薬組成物である。別の実施形態において、提供されるものは、記載される本開示の方法にいずれかにおける医薬の製造のための、本開示の化合物、その薬学的に許容される塩もしくは立体異性体、またはこれらを含む医薬組成物の使用である。

【発明を実施するための形態】

【0033】

１．概観
本明細書に記載される開示は、ＨＰＫ１／ＭＡＰ４Ｋ１阻害剤、その薬学的に許容されるまたは立体異性体、その医薬組成物、およびこれらを使用してＨＰＫ１／ＭＡＰ４Ｋ１活性を調節（例えば、阻害）する方法を提供し、前記方法は、本開示のＨＰＫ１／ＭＡＰ４Ｋ１阻害化合物またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者／対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、本開示の化合物、その薬学的に許容される塩または立体異性体は、がんの処置において免疫を高める、刺激する、および／または増加するための治療的投与に有用である。

【0034】

例えば、ＨＰＫ１相互作用の阻害に関連する疾患または障害の処置方法は、治療有効量の本明細書に提供される化合物、その薬学的に許容される塩または立体異性体を、それを必要とする患者に投与することを含むことができる。本開示の化合物を、がんを含む疾患または障害の処置のために、単独で、他の薬剤もしくは療法と組み合わせて、またはアジュバントもしくはネオアジュバント（ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ）として、使用することができる。
２．定義
本明細書で使用される場合、本発明の文脈において（とりわけ特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」および類似の用語は、本明細書において別途示されるか、または文脈と明らかに矛盾するのでない限り、単数および複数の両方を含むと解釈される。

【0035】

上記式のいずれか１つの化合物は、１種または複数の異性（例えば、光学、幾何、または互変異の異性）を示し得る。そのような変異形態は、その構造特徴を参照して、そうであると定義される上記式のいずれか１つの化合物に暗に含まれ、したがって、本開示の範囲内に暗に含まれる。

【0036】

１つまたは複数のキラル中心を有する化合物は、種々の立体異性形態を示し得る、すなわち、各キラル中心は、ＲもしくはＳ配置を有し得、またはその両方の混合物であり得る。立体異性体は、その空間配置のみが異なる化合物である。立体異性体は、化合物の全てのジアステレオマーおよび鏡像異性形態を含む。鏡像異性体は、互いの鏡像である立体異性体である。ジアステレオマーは、同一（ｉｄｅｎｔｉｆｃａｌ）ではなく、互いの鏡像でもない２つ以上のキラル中心を有する立体異性体である。

【0037】

実験の節の「ピーク１」とは、同じ先行する反応からの第２の目的の反応生成物化合物よりも速く溶出するクロマトグラフィー分離／精製から得られた目的の反応生成物化合物をいう。第２の目的の反応生成化合物は、「ピーク２」と称される。

【0038】

化合物が、単一の鏡像異性体を示すその化学名（例えば、配置が「Ｒ」または「Ｓ」による化学名で示される場合）またはその構造（例えば、配置が「ウェッジ」結合によって示される場合）によって示される場合、別途示されない限り、化合物は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または９９．９％光学的に純粋（「鏡像異性体として純粋」ともいわれる）である。光学純度は、混合物中の命名または図示された鏡像異性体の重量を、混合物中の両方の鏡像異性体の総重量で除算したものである。

【0039】

開示される化合物の立体化学が、命名または構造を図示され、その命名または図示された構造が、２種以上の立体異性体（例えば、ジアステレオマー対におけるように）を包含する場合、包含される立体異性のうちの１種または包含される立体異性の任意の混合物が含まれることが理解される。命名または図示された立体異性体の立体異性純度は、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％または９９．９重量％であることが更に理解される。この場合、立体異性純度は、混合物中のその名称または構造に包含される立体異性体の総重量を、混合物中の全ての立体異性体の総重量で除算することによって決定される。

【0040】

２種の立体異性体がその化学名または構造によって図示され、化学名または構造が「および」で接続される場合、２種の立体異性体の混合物が意図される。
２種の立体異性体がその化学名または構造によって図示され、化学名または構造が「または」で接続される場合、２種の立体異性体の一方または他方が意図されるが、両方ではない。

【0041】

キラル中心を有する開示される化合物が、そのキラル中心での配置を示さずに構造によって図示される場合、その構造は、そのキラル中心でＳ配置を有する化合物、そのキラル中心でＲ配置を有する化合物、またはそのキラル中心でＲおよびＳ配置の混合物を有する化合物を包含することが意味される。キラル中心を有する開示される化合物が、そのキラル中心での「Ｓ」または「Ｒ」による配置を示さずにその化学名によって図示される場合、その名称は、そのキラル中心でＳ配置を有する化合物、そのキラル中心でＲ配置を有する化合物、またはそのキラル中心でＲおよびＳ配置の混合物を有する化合物を包含することが意味される。

【0042】

ラセミ混合物は、５０％の１種の鏡像異性体および５０％の対応する鏡像異性体を意味する。１つのキラル中心を有する化合物が、キラル中心の立体化学を示さずに命名または図示される場合、その名称または構造は、化合物の可能な鏡像異性形態の両方を（例えば、鏡像異性体として純粋、鏡像異性体が濃縮された、またはラセミのいずれも）包含することが理解される。２つ以上のキラル中心を有する化合物が、キラル中心の立体化学を示さずに命名または図示される場合、その名称または構造は、化合物の全ての可能なジアステレオマー形態（例えば、ジアステレオマーとして純粋、ジアステレオマーが濃縮された、および１種または複数のジアステレオマーの等モル量混合物（例えば、ラセミ混合物））を包含することが理解される。

【0043】

用語「幾何異性体」とは、少なくとも１つの二重結合を有する化合物をいい、ここで、二重結合は、シス（一緒（ｓｙｎ）またはエントゲーゲン（ｅｎｔｇｅｇｅｎ）（Ｅ）とも呼ばれる）またはトランス（逆（ａｎｔｉ）またはツザメン（ｚｕｓａｍｍｅｎ）（Ｚ）とも呼ばれる）形態のほか、その混合物で存在し得る。

【0044】

幾何異性体が名称または構造により示される場合、命名または図示された異性体は、別の異性体よりも大きな度合いで存在し、つまり、命名または図示された幾何異性体の幾何異性純度は、５０重量％超、例えば、少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９９重量％または９９．９重量％純粋であることが理解される。幾何異性純度は、混合物中の命名または図示された幾何異性体の重量を、混合物中の全ての幾何異性体の総重量で除算することによって決定される。

【0045】

個々の鏡像異性体／ジアステレオマーの調製／単離のための従来の技術としては、好適な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、または例えば、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用する、ラセミ体（またはラセミ体の塩もしくは誘導体）の分割が挙げられる。あるいは、ラセミ体（またはラセミ前駆体）は、好適な光学活性化合物、例えば、アルコール、または上記式のいずれか１つの化合物が酸性もしくは塩基性部分を含有する場合には、１－フェニルエチルアミンもしくは酒石酸などの塩基もしくは酸と反応させてもよい。得られたジアステレオマー混合物は、クロマトグラフィーおよび／または分別結晶化によって分離でき、一方または両方のジアステレオ異性体は、当業者に周知の方法によって、対応する純粋な鏡像異性に変換される。上記式のいずれか１つのキラル化合物（およびそのキラル前駆体）は、０～５０体積％、典型的には２体積％～２０体積％のイソプロパノール、および０～５体積％のアルキルアミン、典型的には、０．１％のジエチルアミンを含有する炭化水素、典型的にはヘプタンまたはヘキサンでからなる移動相により非対称樹脂においてクロマトグラフィー、典型的にはＨＰＬＣを使用して、鏡像異性体が濃縮された形態で得ることができる。溶離液の濃度により、濃縮混合物が得られる。亜臨界流体および超臨界流体を使用するキラルクロマトグラフィーを用いてもよい。本開示の一部の実施形態で有用なキラルクロマトグラフィーの方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｍｉｔｈ、Ｒｏｇｅｒ Ｍ．、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ；Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｅｒｉｅｓ（１９９８）、７５（Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｐａｃｋｅｄ Ｃｏｌｕｍｎｓ）、２２３～２４９頁およびそこで引用される参考文献を参照されたい）。カラムは、Ｄａｉｃｅｌ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎの子会社であるＣｈｉｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｐａ．、ＵＳＡから得ることができる。

【0046】

上記式のいずれか１つの化合物は、本明細書において単一の互変異性形態で描かれているが、全ての可能な互変異性形態が本開示の範囲内に含まれることは強調されなくてはならない。

【0047】

本明細書で使用される場合、単数または複数の用語「塩」とは、本発明の化合物の酸付加塩または塩基付加塩をいう。「塩」は、特に、「薬学的に許容される塩」を含む。用語「薬学的に許容される塩」とは、生物学的効果、および典型的には、生物学的にまたは他に望ましくないものではない、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持する塩をいい、多くの場合、本発明の化合物は、アミノおよび／もしくはカルボキシル基、またはそれらに類似の基の存在によって酸および／または塩基を形成可能である。

【0048】

薬学的に許容される酸付加塩、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩（ｂｉｓｕｉｆａｆｅ／ｓｕｉｆａｆｅ）、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロロテオフィリオネート（ｃｈｌｏｒｔｈｅｏｐｈｙｌｉｏｎａｔｅ）、クエン酸塩、エタンジスルホネート、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素／ヨウ化物、イソチオン酸（ｉｓｏｔｈｉｏｎａｔｅ）塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩（ｌａｕｒｙｌｓｕｉｆａｔｅ）、リンゴ酸塩（ｍａｉａｔｅ）、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチルサルフェート、ナフトエ酸塩、ナプシレート、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｆｅ）／リン酸二水素、ポリガラクツロ酸塩（ｐｏｉｙｇａｉａｃｔｕｒｏｎａｆｅ）、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、次サリチル酸塩、酒石酸塩、トシレート（ｔｏｓｙｉａｔｅ）およびトリフルオロ酢酸塩は、無機酸および有機酸により形成できる。

【0049】

塩が誘導され得る無機酸としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。
塩が誘導され得る有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸などが挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基により形成できる。塩が誘導され得る無機塩基としては、例えば、アンモニウム塩および周期表のＩ～ＸＩＩ列からの金属が挙げられ、ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛および銅から誘導される。ある特定の実施形態では、好適な塩としては、アンモニウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩が挙げられる。

【0050】

塩が誘導され得る有機塩基としては、例えば、１級、２級および３級アミン、天然に生じ得る置換アミンを含む置換アミン、環式アミン、塩基性イオン交換樹脂などが挙げられる。特定の有機アミンとしては、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジンおよびトロメタミンが挙げられる。

【0051】

本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学法によって、塩基性または酸性部分から合成できる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸形態を、化学量論量の適切な塩基（例えば、水酸化、炭酸、重炭酸Ｎａ、Ｃａ、ＭｇもしくはＫなど）と反応させることによって、またはこれらの化合物の遊離塩基形態を、化学量論量の適切な酸と反応させることによって、調製できる。そのような反応は、典型的には、水中もしくは有機溶媒中、またはその２種の混合物中で実施される。一般に、実施可能な場合、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルのような非水性媒体の使用が望ましい。追加の好適な塩の一覧は、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、（１９８５）；および「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｕｓｅ」、ＳｔａｈｌおよびＷｅｒｍｕｔｈ（Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００２）に見出すことができる。

【0052】

用語「組成物」および「製剤」は、交換可能に使用される。
「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトであるが、また、獣医学的処置の必要のある動物、例えば、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。

【0053】

本明細書で使用される場合、対象は、そのような対象がそのような処置から生物学、医学または生活の質の利益を受けると考えられる場合、処置を「必要とする」。
用語「投与する」、「投与すること」または「投与」とは、本発明の化合物またはその組成物を、対象中または対象上に導入する方法をいう。これらの方法としては、これらに限定されないが、関節腔内（関節内）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、皮下、経口、局所、くも膜下腔内、吸入により、経皮、直腸などが挙げられる。本明細書に記載の作用剤および方法と共に用いることができる投与技術は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ， Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、現行版；Ｐｅｒｇａｍｏｎ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（現行版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａに見出される。

【0054】

本明細書で使用される場合、用語「阻害する」、「阻害」または「阻害すること」とは、所与の状態、徴候もしくは障害、もしく疾患の低減もしくは抑制、または生物活性またはプロセスのベースライン活性の大幅な低下をいう。

【0055】

用語「処置」、「処置する」および「処置すること」とは、本明細書に記載の疾患の進行を逆転、緩和または阻害することをいう。一部の実施形態では、処置は、疾患の１つまたは複数の兆しまたは徴候が発症または観察された後に投与され得る（すなわち、治療処置）。他の実施形態では、処置は、疾患の兆しまたは徴候の非存在下で投与され得る。例えば、処置は、徴候の開始前に疑いのある対象に投与されてもよい（すなわち、予防処置）（例えば、徴候の病歴に照らしておよび／または病原体への曝露に照らして）。処置はまた、徴候が消散した後も、例えば、再発を遅延または防止するために継続されてもよい。

【0056】

用語「状態」、「疾患」および「障害」は、交換可能に使用される。
一般に、本明細書で教示される化合物の有効量は、様々な要因、例えば、所与の薬物または化合物、医薬製剤、投与経路、疾患または障害の種類、処置されている対象または宿主の正体などに依存して様々であるが、いずれにしても、当業者であれば日常的な手段で決定することができる。本教示の化合物の有効量は、当技術分野で公知の日常的な方法によって、当業者によって容易に決定され得る。

【0057】

用語「有効量」は、対象に投与された場合に、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果をもたらす、例えば、対照と比較して、対象において処置されている状態の徴候を阻害、抑制または低減する量を意味する。例えば、有効量は、単位剤形（例えば、１日当たり１ｍｇ～約５０ｇ、例えば、１日当たり１ｍｇ～約５グラム）で与えられてもよい。

【0058】

本発明の化合物の用語「治療有効量」とは、対象の生物学または医学応答、例えば、酵素もしくはタンパク質活性の低減もしくは阻害、または徴候の改善、状態の緩和、疾患進行の鈍化もしくは遅延、または疾患の防止などを誘発する本発明の化合物の量をいう。非限定的な一実施形態では、用語「治療有効量」とは、対象に投与された場合、（１）（ｉ）ＨＰＫ１によって媒介される、もしくは（ｉｉ）ＨＰＫ１活性に関連する、もしくは（ｉｉｉ）ＨＰＫ１の活性（正常もしくは異常）によって特徴付けられる状態もしくは障害もしくは疾患を少なくとも部分的に緩和、阻害、防止および／もしくは改善する；または（２）ＨＰＫ１の活性を低減もしくは阻害する；または（３）ＨＰＫ１の発現を低減もしくは阻害する；または（４）ＨＰＫ１のタンパク質レベルを変更する、本発明の化合物の量をいう。別の非限定的な実施形態では、用語「治療有効量」とは、細胞、または組織、または非細胞性生物学材料、または媒体に投与された場合、ＨＰＫ１の活性を少なくとも部分的に低減もしくは阻害する；または部分的もしくは完全にＨＰＫ１の発現を低減もしくは阻害する、本発明の化合物の量をいう。

【0059】

本明細書に記載の全ての方法は、本明細書で別途示されるか、または他に文脈と明らかに矛盾するのでない限り、任意の好適な順序で実施されてもよい。本明細書における任意のおよび別の例、または例示語（例えば、「など」）の使用は、単に、本発明をより良好に明らかにすることを意図され、別途特許請求される本発明の範囲に限定を付するものではない。

【0060】

上記式において使用される一般化学用語は、その通常の意味を有する。
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、当業者に公知である通り、任意および全て（ａｉｌ）の溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存料（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素など、およびその組合せを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０、１２８９～１３２９頁を参照されたい）。任意の従来の担体が活性成分と非適合性である場合を除き、治療または医薬組成物におけるその使用が企図される。

【0061】

更に、その塩を含む本発明の化合物はまた、その水和物の形態で得られてもよく、またはその結晶化のために使用される他の溶媒を含んでもよい。本発明の化合物は、本来的にまたは設計により、薬学的に許容される溶媒（水を含む）との溶媒和物を形成し、したがって、本発明は、溶媒和および非溶媒和形態の両方を包含することが意図される。用語「溶媒和物」とは、本発明の化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）の１つまたは複数の溶媒分子との分子複合体をいう。そのような溶媒分子は、レシピエントに無害であることが公知の医薬分野で通常使用されるもの、例えば、水、エタノールなどである。用語「水和物」とは、溶媒分子が水である複合体をいう。

【0062】

本発明の化合物は、その塩、水和物および溶媒和物を含め、本来的にまたは設計により、多形を形成し、別の態様では、本発明は、本発明の化合物と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、特定の投与経路、例えば、経口投与、非経口投与および直腸投与などのために製剤化されてもよい。更に、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定なしに、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒、散剤もしくは坐剤を含む）、または液体形態（限定なしに、溶液、懸濁液もしくはエマルジョンを含む）で作製され得る。医薬組成物は、滅菌などの従来の薬学操作に供されてもよく、および／または不活性希釈剤、滑沢剤もしくは緩衝化剤、ならびに保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤および緩衝剤などのアジュバントなどを含有していてもよい。

【0063】

典型的には、医薬組成物は、ａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロールおよび／もしくはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、タルカン、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、および／もしくはポリエチレングリコール；錠剤についてはまた、ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロール、カルボキシメチルセルロールナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｆｈｙｌｃｅｉｌｕｉｏｓｅ）および／もしくはポリビニルピロリドン；所望の場合、ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、もしくは発泡性混合物；ならびに／またはｅ）吸収剤、着色料、香味料および甘味料と一緒に活性成分を含む錠剤またはゼラチンカプセル剤である。錠剤は、当技術分野で公知の方法によってフィルムコーティングされているか、または腸溶コーティングされていてもよい。

【0064】

経口投与に好適な組成物としては、錠剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性（ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｅ）粉末もしくは顆粒剤、エマルジョン、ハードもしくはソフトカプセル剤、またはシロップもしくはエリキシルの形態の、有効量の本発明の化合物が挙げられる。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で公知の任意の方法により調製され、そのような組成物は、薬学的にエレガントで口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、風味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１種または複数の作用剤を含有してもよい。錠剤は、錠剤の製造に好適である、非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合して、活性成分を含有してもよい。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア；ならびに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。錠剤は、コーティングされていないか、または崩壊および胃腸管での吸収を遅延し、それによってより長時間にわたる持続作用を提供するために、公知の技術によってコーティングされる。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料が用いられてもよい。経口使用のための製剤は、活性成分が不活性個体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合されたハードゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水もしくは油媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィンもしくはオリーブ油と混合されたソフトゼラチンカプセル剤として提示され得る。

【0065】

特定の注射用組成物は、等張水溶液または懸濁液であり、坐剤は、有利には、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調製される。上記組成物は、滅菌されてもよく、ならびに／または保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調製する塩および／または緩衝剤などのアジュバントを含有してもよい。更に、上記組成物はまた、他の治療のために価値のある物質を含有してもよい。上記組成物は、それぞれ従来の混合、造粒またはコーティング法によって調製され、約０．１～７５％の活性成分を含有するか、または約１～５０％の活性成分を含有する。経皮適用に好適な組成物としては、好適な担体を有する有効量の本発明の化合物が挙げられる。経皮送達に好適な担体としては、宿主の皮膚を通した通過を補助する、吸収性の薬理学的に許容される溶媒が挙げられる。例えば、経皮デバイスは、裏当て材、必要に応じて担体を含有するリザーバー、必要に応じて長時間にわたって、制御された所定の速度で化合物を送達するための宿主の皮膚の速度制御バリアおよびデバイスを皮膚に固定する手段を備える包帯の形態である。

【0066】

例えば、皮膚および眼への局所的適用に好適な組成物としては、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲルまたは例えばエアロゾルによる送達のための噴霧可能製剤などが挙げられる。そのような局所送達システムは、経皮適用、例えば、皮膚がんの処置、例えば、サンクリーム、ローション、スプレーなどの予防的使用に、特に適切である。それらは、したがって、当技術分野で周知の、化粧用を含む局所製剤における使用に特に適している。そのようなものは、可溶化剤、安定剤、張度強化剤、緩衝剤および保存料を含有し得る。

【0067】

本明細書で使用される場合、局所的適用はまた、吸入または経鼻適用に関係し得る。それらは、粉末吸入器からの乾燥粉末（単独で、混合物、例えばラクトースとの乾燥ブレンドとして、もしくは例えば、リン脂質との混合成分粒子としてのいずれか）、または好適な高圧ガスを使用したまたは使用しない、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザーもしくはネブライザーからのエアロゾルスプレーの体裁の形態で、好都合に送達され得る。

【0068】

本発明は、水は、特定の化合物の分解を促進し得るため、本発明の化合物を活性成分として含む無水医薬組成物および剤形を更に提供する。
本発明の無水医薬組成物および剤形は、無水または低含水成分および低水分または低湿度条件を使用して調製できる。無水医薬組成物は、その無水性が維持されるように調製および保存され得る。したがって、無水組成物は、それらが好適な処方キットに含まれ得るように、水への曝露を防ぐ公知の材料を使用して包装される。好適な包装の例としては、これらに限定されないが、密閉シールされた箔、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパックおよびストリップパックが挙げられる。

【0069】

本発明は、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を低減する１種または複数の作用剤を含む医薬組成物および剤形を更に提供する。そのような作用剤は本明細書において「安定剤」と呼ばれ、これらに限定されないが、アスコルビン酸などの酸化防止剤、ｐＨ緩衝剤または塩緩衝剤などが挙げられる。
３．化合物
本開示の第１の実施形態において、提供されるものは、式Ｉ

【0070】

【化1】

【0071】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体である。
本開示の第２の実施形態において、提供されるものは、式ＩＡ

【0072】

【化2】

【0073】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
本開示の第３の実施形態において、提供されるものは、式ＩＢ

【0074】

【化3】

【0075】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
本開示の第４の実施形態において、提供されるものは、式ＩＩ

【0076】

【化4】

【0077】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体である。
本開示の第５の実施形態において、提供されるものは、式ＩＩＡ

【0078】

【化5】

【0079】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
本開示の第６の実施形態において、提供されるものは、式ＩＩＢ

【0080】

【化6】

【0081】

により表される化合物、またはその薬学的に許容される塩である。
４．処置可能な疾患
ＨＰＫ１阻害剤、その薬学的に許容される塩、その医薬組成物は、ＨＰＫ１活性を調整（すなわち、阻害）する方法において使用でき、上記方法は、本明細書に記載される通り、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物またはその薬学的に許容される塩を、それを必要とする患者／対象に投与するステップを含む。

【0082】

特に、本発明は、疾患、特にがん（特に、造血器および固形腫瘍）、または免疫応答調節不全の状態、またはＭＡＰ４Ｋ１シグナル伝達異常と関連する他の障害の処置または予防に使用するための本発明の化合物、またはその立体異性体、互変異性体、Ｎ－オキシド、水和物、溶媒和物および塩、特に、その薬学的に許容される塩、またはその混合物の使用を提供する。本発明による化合物の薬学活性は、ＭＡＰ４Ｋ１阻害剤としてのその活性によって、少なくとも部分的に説明できる。

【0083】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、これらに限定されないが、良性の過形成、アテローム硬化性障害、敗血症、自己免疫障害、血管障害、ウイルス感染、神経変性障害、炎症性障害および男性の生殖能制御障害を含む疾患または適応症を処置するための、それを必要とする対象への治療投与に有用である。

【0084】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩は、がんの処置において、免疫を強化、刺激および／または増大するための治療投与に有用である。

【0085】

本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、単独で、または他の作用剤もしくは治療と組み合わせて、またはがんを含む疾患もしくは障害の処置のためのアジュバントもしくはネオアジュバントとして使用できる。

【0086】

ある特定の実施形態では、本発明の方法は、これらに限定されないが、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部のがん、皮膚または眼球内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管の癌、子宮内膜の癌、子宮内膜がん、子宮頸の癌、膣の癌、外陰部の癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿道のがん、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎軸腫瘍（ｓｐｉｎａｌ ａｘｉｓ ｔｕｍｏｒ）、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮細胞がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されたものを含む環境により誘発されたがん、および上記がんの組合せを含むがんを処置するのに使用され得る。

【0087】

一部の実施形態では、本発明の化合物により処置可能ながんとして、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺癌）、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がんおよび肺がん（例えば、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がん）が挙げられる。更に、本発明の化合物を使用してその成長が阻害され得る難治性または再発悪性腫瘍もまた、処置可能である。

【0088】

一部の実施形態では、本発明の化合物を使用して処置可能ながんとして、これらに限定されないが、固形腫瘍（例えば、前立腺がん、結腸がん、食道がん、子宮内膜がん、卵巣がん、子宮がん、腎臓がん、肝がん、膵臓がん、胃がん、乳がん、肺がん、呼吸器、脳がん、眼がん、甲状腺および副甲状腺がん、皮膚がん、頭頚部がん、生殖器のがん、消化管のがん、泌尿器のがん、神経膠芽腫、肉腫、膀胱がんなど）、血液がん（例えば、リンパ腫、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ＤＬＢＣＬ、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（再発または難治性ＮＨＬおよび再発性濾胞を含む）、ホジキンリンパ腫または多発性骨髄腫）、肉腫およびその遠隔転移が挙げられる。

【0089】

一部の実施形態では、本発明の化合物を使用して処置可能な疾患および適応症は、これらに限定されないが、血液がん、肉腫、肺がん、消化器がん、泌尿生殖器がん、肝臓がん、骨がん、神経系がん、婦人科系のがんおよび皮膚がんが挙げられる。

【0090】

例示的な血液がんとしては、リンパ腫および白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（再発または難治性ＮＨＬおよび再発性濾胞を含む）、ホジキンリンパ腫、骨髄増殖性疾患（例えば、原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、真性多血症（ＰＶ）、本態性血小板増加症（ＥＴ）、骨髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、Ｔ細胞急性リンパ腫（Ｔ－ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（Ｍａｃｒｏｇｌｕｂｕｌｉｎｅｍｉａ）、ヘアリー細胞リンパ腫、慢性骨髄性リンパ腫およびバーキットリンパ腫が挙げられる。

【0091】

例示的な肉腫としては、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、粘液腫、横紋筋腫、横紋肉腫、線維腫、脂肪腫、過誤腫（ｈａｒｍａｔｏｍａ）およびテラトーマが挙げられる。

【0092】

例示的な肺がんとしては、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん、気管支原性肺癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌、気管支腺腫、軟骨様過誤腫および中皮腫が挙げられる。

【0093】

例示的な消化器がんとしては、食道のがん（扁平上皮細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、および結腸直腸がんが挙げられる。

【0094】

例示的な泌尿生殖器がんとしては、腎臓のがん（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］）、膀胱および尿道（扁平上皮細胞癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、ならびに精巣（精上皮腫、テラトーマ、胚性癌腫、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）が挙げられる。

【0095】

例示的な肝臓がんとしては、肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫および血管腫が挙げられる。
例示的な骨がんとしては、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍、脊索腫、骨軟骨腫（ｏｓｔｅｏｃｈｒｏｎｆｒｏｍａ）（骨軟骨性外骨症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨筋線維腫（ｃｈｏｎｄｒｏｍｙｘｏｆｉｂｒｏｍａ）、類骨骨腫および巨細胞腫瘍が挙げられる。

【0096】

例示的な神経系がんとしては、頭蓋骨のがん（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫）、脳（星状細胞腫、髄芽腫（ｍｅｄｕｏｂｌａｓｔｏｍａ）、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫（松果体腫）、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）および脊髄（神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）、ならびに神経芽細胞腫およびレルミット・デュクロ病が挙げられる。

【0097】

例示的な婦人科系のがんとしては、子宮のがん（子宮内膜癌）、子宮頸（子宮頸癌、腫瘍前子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌（漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類の癌腫）、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性テラトーマ）、外陰（扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮細胞癌、ブドウ状横紋筋肉腫（胚性横紋筋肉腫）およびファロピウス管（癌腫）が挙げられる。

【0098】

例示的な皮膚がんとしては、黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、メルケル細胞皮膚がん、ほくろ異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫およびケロイドが挙げられる。一部の実施形態では、本発明の化合物を使用して処置可能な疾患および適応症として、これらに限定されないが、鎌状赤血球症（例えば、鎌状赤血球貧血）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、骨髄異形成症候群、精巣がん、胆管がん、食道がんおよび尿路上皮癌が挙げられる。

【0099】

例示的な頭頚部がんとしては、神経膠芽腫、黒色腫、横紋肉腫、リンパ肉腫、骨肉腫、扁平上皮細胞癌、腺癌、口腔がん、喉頭がん、上咽頭がん、鼻腔および副鼻腔がん、ならびに甲状腺および副甲状腺がんが挙げられる。

【0100】

一部の実施形態では、主題のＨＰＫ１阻害剤は、ＰＧＥ２（例えば、Ｃｏｘ－２過剰発現腫瘍）および／またはアデノシン（ＣＤ７３およびＣＤ３９過剰発現腫瘍）を産生する腫瘍を処置するために使用され得る。Ｃｏｘ－２の過剰発現は、結腸直腸、乳、膵臓および肺がんなどの多数の腫瘍で検出されており、これは、不良な予後と相関する。ＣＯＸ－２の過剰発現は、ＲＡＪＩ（バーキットリンパ腫）およびＵ９３７（急性前単球白血病）などの血液がんモデル、ならびに患者の芽細胞において報告されている。ＣＤ７３は、結腸、肺、膵臓および卵巣を含む種々のヒト癌において上方制御される。ＣＤ７３のより高い発現レベルは、腫瘍血管新生、浸潤性および転移、ならびに乳がんのより短い患者生存時間と関連している。

【0101】

処置可能な乳がんの例としては、これらに限定されないが、トリプルネガティブ乳がん、浸潤性乳管癌、浸潤性小葉癌、ｉｎ ｓｉｔｕの乳管癌およびｉｎ ｓｉｔｕの小葉癌が挙げられる。

【0102】

呼吸器のがんの例としては、これらに限定されないが、小細胞および非小細胞肺癌、ならびに気管支腺腫および胸膜肺芽腫が挙げられる。
処置可能な脳がんの例としては、これらに限定されないが、脳幹および視床下部（ｈｙｐｏｐｈｔａｌｍｉｃ）神経膠腫、小脳および大脳星状細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫、上衣腫、ならびに神経外胚葉および松果体腫瘍が挙げられる。

【0103】

男性生殖器の処置可能な腫瘍としては、これらに限定されないが、前立腺および精巣がんが挙げられる。
女性生殖器の処置可能な腫瘍としては、これらに限定されないが、子宮内膜、子宮頸、卵巣、膣および外陰がん、ならびに子宮の肉腫が挙げられる。

【0104】

処置可能な卵巣がんとしては、これらに限定されないが、漿液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、粘液性嚢胞腺癌、顆粒膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫および男性胚細胞腫が挙げられる。

【0105】

処置可能な子宮頸がんとしては、これらに限定されないが、扁平上皮細胞癌、腺癌、腺扁平上皮癌、小細胞癌、神経内分泌腫瘍、ガラス状細胞癌および絨毛腺腫癌が挙げられる。

【0106】

消化管の処置可能な腫瘍としては、これらに限定されないが、肛門、結腸、結腸直腸、食道、胆嚢、胃、膵臓、直腸、小腸および唾液腺がんが挙げられる。
処置可能な食道がんとしては、これらに限定されないが、食道細胞癌および腺癌、ならびに扁平上皮細胞癌、平滑筋肉腫、悪性黒色腫、横紋筋肉腫およびリンパ腫が挙げられる。

【0107】

処置可能な胃がんとしては、これらに限定されないが、腸型およびびまん型胃腺癌が挙げられる。
処置可能な膵臓がんとしては、これらに限定されないが、管状腺癌、腺扁平上皮癌および膵内分泌腫瘍が挙げられる。

【0108】

泌尿器の処置可能な腫瘍としては、これらに限定されないが、膀胱、陰茎、腎臓、腎盂、尿管、尿道およびヒト乳頭状腎がんが挙げられる。
処置可能な腎臓がんとしては、これらに限定されないが、腎細胞癌、尿路上皮細胞癌、傍糸球体細胞腫（腎腫）、血管筋脂肪腫、腎膨大細胞腫、ベリーニ管癌、腎臓の明細胞肉腫、中胚葉腎腫およびウィルムス腫瘍が挙げられる。

【0109】

処置可能な膀胱がんとしては、これらに限定されないが、移行上皮癌、扁平上皮細胞癌、腺癌、肉腫および小細胞癌が挙げられる。
処置可能な眼がんとしては、これらに限定されないが、眼球内黒色腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。

【0110】

処置可能な肝臓がんとしては、これらに限定されないが、肝細胞癌（線維層状変異体ありまたはなしの肝臓細胞癌腫）、胆管細胞癌（肝内胆管癌）および混合型肝細胞胆管癌が挙げられる。

【0111】

処置可能な皮膚がんとしては、これらに限定されないが、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、悪性黒色腫、メルケル細胞がんおよび非黒色腫皮膚がんが挙げられる。
処置可能な頭頚部がんとしては、これらに限定されないが、頭頚部の扁平上皮細胞がん、喉頭、下咽頭、鼻咽頭、中咽頭がん、唾液腺がん、口唇および口腔がん、ならびに扁平上皮細胞が挙げられる。

【0112】

処置可能なリンパ腫としては、これらに限定されないが、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキン病および中枢神経系のリンパ腫が挙げられる。

【0113】

処置可能な肉腫としては、これらに限定されないが、軟部組織の肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、リンパ肉腫および横紋筋肉腫が挙げられる。
処置可能な白血病としては、これらに限定されないが、急性骨髄性白血病、急性リンパ性（ｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ）白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病およびヘアリー細胞白血病が挙げられる。

【0114】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、ＭＡＰ４Ｋ１が関与する様々な他の障害、例えば、心血管および肺疾患を処置するために使用され得る。
ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、心血管、炎症性および線維性障害、腎障害、特に急性および慢性腎機能不全（ｒｅｎａｌ ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、ならびにまた急性および慢性腎不全（ｒｅｎａｌ ｆａｉｌｕｒｅ）の処置および／または予防のための医薬として使用され得る。

【0115】

ここで、用語「腎機能不全」は、腎機能不全の急性および慢性症状の両方を含み、また基礎的なまたは関連する腎障害、例えば、糖尿病性および非糖尿病性腎症、高血圧性腎症、虚血性腎障害、腎低灌流、透析による低血圧、閉塞性尿路疾患、腎狭窄、糸球体症、糸球体腎炎（例えば、原発性糸球体腎炎；微小変化型糸球体腎炎（リポイドネフローゼ）；膜性糸球体腎炎；巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）；膜性増殖性糸球体腎炎；半月体形成性糸球体腎炎；メサンギウム増殖性糸球体腎炎（ＩｇＡ腎炎、ベルジェ病）；感染後糸球体腎炎；続発性糸球体腎炎）、糖尿病、エリテマトーデス、アミロイドーシス、グッドパスチャー症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、顕微鏡的多発血管炎、急性糸球体腎炎、腎盂腎炎（例えば、尿路結石、良性の前立腺肥大、糖尿病、形成異常、鎮痛剤の乱用、クローン病の結果として生じたもの）、糸球体硬化症、腎臓の細動脈壊死、尿細管間質性疾患、腎障害、例えば、原発性および先天性または後天性腎障害、アルポート症候群、腎炎、免疫的腎障害、例えば、腎移植拒絶反応および免疫複合体により誘発された腎障害、有害物質によって誘発された腎症、造影剤によって誘発された腎症、糖尿病性および非糖尿病性腎症、腎嚢胞、腎硬化症、高血圧性腎硬化症およびネフローゼ症候群を含み、これは、診断により、例えば、クレアチニンおよび／もしくは水分排泄の異常な低下、尿素、窒素、カリウムおよび／もしくはクレアチニンの血中濃度の異常な上昇、腎臓酵素、例えばグルタミル合成酵素の活性の変化、尿浸透圧もしくは尿量の変化、高ミクロアルブミン尿、顕性アルブミン尿、糸球体および小動脈の病変、尿管拡張、高リン酸塩血症ならびに／または透析の必要性により特徴付けられ得る。

【0116】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、腎機能不全の後遺症、例えば、肺水腫、心不全、尿毒症、貧血症、電解質異常（例えば、高カリウム血症（ｈｙｐｅｒｃａｌｅｍｉａ）、低ナトリウム血症）、ならびに骨および糖代謝の乱れの処置および／または予防に使用され得る。

【0117】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、腎機能不全の後遺症、例えば、肺水腫、心不全、尿毒症、貧血症、電解質異常（例えば、高カリウム血症、低ナトリウム血症）、ならびに骨および糖代謝の乱れの処置および／または防止に使用され得る。

【0118】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、多発性嚢胞腎疾患（ＰＣＫＤ）および不適切ＡＤＨ分泌（ＳＩＡＤＨ）症候群の処置および／または防止に更に好適である。
ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、メタボリック症候群、高血圧、抵抗性高血圧、急性および慢性心不全、冠動脈性心疾患、安定および不安定狭心症、末梢および心血管障害、不整脈、心房性および心室性不整脈および伝達障害、例えば、房室ブロックｌ～ｌｌｌ度（ＡＢブロックｌ～ｌｌｌ）、上室性頻脈性不整脈、心房細動、心房粗動、心室細動、心室粗動、心室性頻脈性不整脈、多形性心室頻拍、心房性および心室性期外収縮、ＡＶ接合部期外収縮、洞不全症候群、卒倒、ＡＶ結節リエントリー性頻拍、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、自己免疫心臓障害（心膜炎、心内膜炎、弁膜炎（ｖａｌｖｏｌｉｔｉｓ）、大動脈炎、心筋症）、ショック、例えば、心原性ショック、敗血症性ショックおよびアナフィラキシーショック、動脈瘤、ボクサー心筋症（心室性期外収縮（ＰＶＣ））の処置および／または予防、血栓塞栓性障害および虚血、例えば、心筋虚血、心筋梗塞、卒中、心肥大、一過性の虚血発作、炎症性心血管障害、冠動脈および末梢動脈のけいれん、浮腫形成、例えば、肺水腫、脳浮腫、腎性浮腫または心不全によって引き起こされた浮腫、末梢循環障害、再灌流障害、動脈および静脈血栓、心筋不全、内皮機能障害の処置および／または予防、例えば、血栓溶解治療、経皮的血管形成術（ＰＴＡ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、心臓移植およびバイパス術の後の再狭窄、ならびにまた、微小および大血管損傷（血管炎）、高レベルのフィブリノーゲンおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および高濃度のプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ－１）の防止、ならびにまた勃起不全および女性性機能不全の処置および／または予防に好適である。

【0119】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、喘息障害、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）および左心疾患、ＨＩＶ、鎌状赤血球貧血、血栓塞栓症（ＣＴＥＰＨ）、サルコイドーシス、ＣＯＰＤまたは肺線維症関連肺高血圧を含む肺高血圧（ＰＨ）の他の形態、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、アルファ－１－アンチトリプシン欠乏（ＡＡＴＤ）、肺線維症、肺気腫（例えば、タバコの煙によって誘発された肺気腫）および嚢胞性繊維症（ＣＦ）の処置および／または予防に好適である。

【0120】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、ＮＯ／ｃＧＭＰ系の乱れによって特徴付けられる中枢神経系障害の制御に有効である。本発明の化合物は、特に、環境／疾患／症候群、例えば、軽度の認知障害、年齢に関連する学習および記憶障害、年齢に関連する記憶喪失、血管性認知症、頭蓋脳外傷、卒中、卒中後に生じる痴呆（卒中後痴呆症）、外傷後頭蓋脳外傷、全般的な集中力の欠失、学習および記憶の問題を伴う小児の集中力の欠失、アルツハイマー病、レビー小体病、ピック症候群、パーキンソン病を含む前頭葉の退化による痴呆、皮質基底核変性、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＡＬＳ）、ハンチントン病、髄鞘脱落、多発性硬化症、視床変性、クロイツフェルト・ヤコブ痴呆（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄ－ Ｊａｃｏｂ ｄｅｍｅｎｔｉａ）、ＨＩＶ痴呆、痴呆を伴う精神分裂病またはコルサコフ精神病による進行性痴呆に関連して生じるもののような認知障害後の知覚、集中力、学習または記憶を改善するのに特に好適である。

【0121】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、中枢神経系障害、例えば、不安、緊張および憂うつの状態、ＣＮＳ関連性機能不全および睡眠障害の処置および／または予防、ならびに食物、刺激物および習慣性物質の摂取の病的な乱れを制御するのに好適である。

【0122】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は更にまた、脳血流を制御するのに好適であり、したがって、片頭痛を制御するのに効果的な作用剤を表す。
ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、脳梗塞（脳卒中）の後遺症、例えば、卒中、脳虚血および頭蓋脳外傷の予防および制御に好適である。本発明による化合物は、同様に、疼痛および耳鳴の状態を制御するために使用され得る。

【0123】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、抗炎症作用を有し、したがって、敗血症（ＳＩＲＳ）、多臓器不全（ＭＯＤＳ、ＭＯＦ）、腎臓の炎症性障害、慢性腸炎症（ＩＢＤ、クローン病、ＵＣ）、膵炎、腹膜炎、リウマチ性障害、炎症性皮膚障害、および炎症性眼障害の処置および／または予防のための抗炎症剤として使用され得る。

【0124】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、自己免疫疾患の処置および／または予防のために使用され得る。
ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、内臓、例えば、肺、心臓、腎臓、骨髄および特に肝臓の線維性障害、ならびにまた皮膚の線維症および線維性眼障害の処置および／または予防に好適である。

【0125】

本明細書で使用される場合、用語「線維性障害」は、特に、肝線維症、肝臓の硬変、肺線維症、心内膜心筋線維症、腎症、糸球体腎炎、間質性腎線維症、糖尿病、骨髄線維症および同様の線維性障害から生じる線維傷害、強皮症、斑状強皮症、ケロイド、肥厚性瘢痕（また外科手技後）、母斑、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｖｉｔｒｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）および結合組織の障害（例えば、サルコイドーシス）を含む。

【0126】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、例えば、緑内障手術の結果としての術後の傷の制御に好適である。
ある特定の実施形態では、本発明の化合物はまた、老化および角化した皮膚に化粧用として使用できる。

【0127】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、肝炎、新生物、骨粗しょう症、緑内障および胃不全麻痺の処置および／または予防に好適である。
ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶおよびカポジ肉腫）、炎症性自己免疫疾患（例えば、大腸炎、関節炎、アルツハイマー病、糸球体腎炎および創傷治癒）、細菌、真菌および／または寄生虫感染；皮膚疾患（例えば、乾癬）、細胞数の増加によって特徴付けられる過形成に基づく疾患（例えば、線維芽細胞、肝細胞、骨および骨髄細胞、軟骨もしくは平滑筋細胞、または上皮細胞（例えば、子宮内膜増殖症））；骨疾患、ならびに心血管疾患（例えば、再狭窄および肥大）の処置および／または予防に好適である。

【0128】

別の実施形態では、本発明の化合物はまた、女性における子宮類線維症（子宮平滑筋腫または子宮筋腫）を処置または防止するために使用され得る。子宮類線維症は、子宮の平滑筋層である子宮筋の良性の腫瘍である。子宮類線維症は、女性の一生にわたってゆっくりと成長し、その成長は、女性ホルモンであるエストラジオールおよびプロゲステロンに依存する。したがって、白人およびアフリカ系アメリカ人女性においてそれぞれおよそ７０％および＞８０％の子宮類線維症の最高有病率が、３５歳から、ホルモンレベルの低下に起因して退縮する閉経期までにおいて見られる。白人およびアフリカ系アメリカ人女性のそれぞれおよそ３０％および４５％は、線維症に起因する臨床的に関連する徴候として、月経周期に関連する重度の月経出血および疼痛を示す（Ｄａｖｉｄら、Ｅｕｒ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｂｉｏｌ．１９９：１３７～１４０、２０１６）これに関して重度の月経周期は、月経出血期間における８０ｍＬ超の失血によって定義される。子宮類線維症の粘膜下の位置、例えば、子宮内膜の直下に位置するものは、子宮出血に対して更により重度の作用を有するようであり、これにより、罹患女性は貧血を生じ得る。更に、子宮類線維症は、その徴候に関して、罹患女性の生活の質に深刻な影響を及ぼす。

【0129】

ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、慢性腎障害、急性および慢性腎機能不全、糖尿病、炎症性または高血圧性腎症（ｎｅｐｈｒｏｐａｔｉｅｓ）、線維性障害、心機能不全、狭心症、高血圧、肺高血圧、虚血、血管障害、血栓塞栓性障害、動脈硬化症、鎌状赤血球貧血、勃起不全、良性前立腺肥大症、良性前立腺肥大症に関連する排尿障害、ハンチントン、認知症、アルツハイマーおよびクロイツフェルト・ヤコブの処置および／または予防に有用である。

【0130】

本発明は、慢性腎障害、急性および慢性腎機能不全、糖尿病、炎症性または高血圧性腎症（ｎｅｐｈｒｏｐａｔｉｅｓ）、線維性障害、心機能不全、狭心症、高血圧、肺高血圧、虚血、血管障害、血栓塞栓性障害、動脈硬化症、鎌状赤血球貧血、勃起不全、良性前立腺肥大症、良性前立腺肥大症に関連する排尿障害、ハンチントン、認知症、アルツハイマーおよびクロイツフェルト・ヤコブの処置および／または予防のための方法を提供する。

【0131】

本発明は、障害、特に上で挙げた障害の処置および／または予防のための本発明による化合物の使用を更に提供する。
本発明は、障害、特に上で挙げた障害の処置および／または予防のための方法であって、有効量の、本発明による化合物のうちの少なくとも１種を使用する方法を更に提供する。

【0132】

したがって、本発明の化合物は、腫瘍成長の低減および調節不全免疫応答の調整のための外因性および／または内因性リガンドを活性化させて、例えば、がんおよびがん免疫治療の文脈において、免疫抑制を遮断し、免疫細胞活性化および浸潤を増加させることによって、ＭＡＰ４Ｋ１活性を阻害、遮断、低減または低下するために利用できる。この方法は、ヒトを含むそれを必要とする哺乳動物に、障害を処置するのに有効である、ある量の本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩、異性体、多形、代謝産物、水和物、溶媒和物もしくはエステルを投与するステップを含む。

【0133】

本発明はまた、ＭＡＰ４Ｋ１が関与する様々な他の障害、例えば、これらに限定されないが、調節不全免疫応答、炎症、感染症＆がんのワクチン接種、ウイルス感染、肥満および食事性肥満、代謝障害、脂肪肝ならびに子宮類線維症による障害を処置する方法を提供する。これらの障害は、ヒトにおいて十分特徴付けられているが、また、他の哺乳動物においても同様の病因で存在し、本発明の医薬組成物を投与することによって処置できる。
５．併用療法
本発明の化合物は、主題化合物により処置可能な疾患または適応症を処置するのに好適な１種または複数の追加の／２次治療剤との併用療法で使用され得る。

【0134】

したがって、ある特定の実施形態では、例えば、本発明の化合物を使用する本発明の方法は、それを必要とする対象に更なる治療剤を投与するステップを含み得る。更なる治療剤は、（ｉ）ＮＦ－κＢ経路の成分であってもなくてもよい免疫系チェックポイントを遮断もしくは阻害する免疫調節剤、および／または（ｉｉ）免疫エフェクター応答を直接刺激する作用剤、例えばサイトカイン、もしくは腫瘍特異的養子移入Ｔ細胞集団、もしくは腫瘍細胞が発現するタンパク質に特異的な抗体；および／または（ｉｉｉ）腫瘍抗原もしくはその免疫原性断片を含む組成物；および／または（ｉｖ）化学療法剤であり得る。

【0135】

ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－ｍＴＯＲ経路の阻害剤、Ｒａｆ－ＭＡＰＫ経路の阻害剤、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路の阻害剤、ベータカテニン経路の阻害剤、ｎｏｔｃｈ経路の阻害剤、ヘッジホッグ経路の阻害剤、Ｐｉｍキナーゼの阻害剤、ならびに／またはタンパク質シャペロンおよび細胞周期進行の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、本発明の併用療法は、細胞集団において生じる薬物耐性の可能性を低減し、および／または処置の毒性を低減する。

【0136】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、がんの処置のための以下のキナーゼ、すなわち、Ａｋｔ１、Ａｋｔ２、Ａｋｔ３、ＴＧＦ－βΡν、ＰＫＡ、ＰＫＧ、ＰＫＣ、ＣａＭ－キナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、ＭＥＫＫ、ＥＲＫ、ＭＡＰＫ、ｍＴＯＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＩＮＳ－Ｒ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＲ－Ｒ、ＰＤＧＦαＲ、ＰＤＧＦβＲ、ＣＳＦＩＲ、ＫＩＴ、ＦＬＫ－ＩＩ、ＫＤＲ／ＦＬＫ－１、ＦＬＫ－４、ｆｌｔ－１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ｃ－Ｍｅｔ、Ｒｏｎ、Ｓｅａ、ＴＲＫＡ、ＴＲＫＢ、ＴＲＫＣ、ＦＬＴ３、ＶＥＧＦＲ／Ｆｌｔ２、Ｆｌｔ４、ＥｐｈＡｌ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ４、Ｔｉｅ２、Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｆｇｒ、Ｂｔｋ、Ｆａｋ、ＳＹＫ、ＦＲＫ、ＪＡＫ、ＡＢＬ、ＡＬＫおよびＢ－Ｒａｆのうちの１種または複数の阻害剤と併用され得る。

【0137】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、ＦＧＦＲ阻害剤（ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３またはＦＧＦＲ４、例えば、ＡＺＤ４５４７、ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＱ０８７、ＢＧＪ３９８、ＢＩＢＦ１１２０、ＴＫＩ２５８、ルシタニブ、ドビチニブ、ＴＡＳ－１２０、Ｊ Ｊ－４２７５６４９３、Ｄｅｂｉｏｌ３４７、ＩＮＣＢ５４８２８、ＩＮＣＢ６２０７９およびＩＮＣＢ６３９０４）、ＪＡＫ阻害剤（ＪＡＫ１および／またはＪＡＫ２、例えば、ルキソリチニブ、バリシチニブまたはイタシチニブ（ＩＮＣＢ３９１１０））、ＩＤＯ阻害剤（例えば、エパカドスタットおよびＮＬＧ９１９）、ＬＳＤ１阻害剤（例えば、ＧＳＫ２９７９５５２、ＩＮＣＢ５９８７２およびＩＮＣＢ６０００３）、ＴＤＯ阻害剤、ＰＩ３Ｋ－デルタ阻害剤（例えば、ＩＮＣＢ５０７９７およびＩＮＣＢ５０４６５）、ＰＩ３Ｋ－ガンマ阻害剤、例えば、ＰＩ３Ｋ－ガンマ選択的阻害剤、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤（例えば、ＰＬＸ３３９７およびＬＹ３０２２８５５）、ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼ（Ｔｙｒｏ－３、ＡｘｌおよびＭｅｒ）、アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）調節剤（例えば、ラキニモド、アミノフラボン、ＣＢ７９９３１１３、ＣＨ２２３１９１、６，２’，４’－トリメトキシフラボン（ＴＭＦ）、ＧＮＦ３５１（Ｎ－（２－（１Ｈ－インドール－３－イル）エチル）－９－イソプロピル－２－（５－メチルピリジン－３－イル）－９Ｈ－プリン－６－アミン）、アミノフラボン、ＮＫＩ１５０４６０、インドール－３－カルビノール、β－ナフトフラボンおよびその二量体、ジインドリルメタン（ＤＩＭ）、４－ヒドロキシタモキシフェン、レフルノミド、ラロキシフェン、トラニラスト、フルタミド、メキシレチン、ニモジピン（ｎｉｍｏｄｉｐｈｉｎｅ）、オメプラゾール、スリンダク、トラニラスト、ならびにＴＣＤＤ（２，３，７，８－テトラクロロジベンゾ－ｐ－ジオキシン））、血管新生阻害剤、インターロイキン受容体阻害剤、ブロモおよび特異的末端ファミリーメンバー阻害剤（例えば、ブロモドメイン阻害剤またはＢＥＴ阻害剤、例えば、ＯＴＸ０１５、ＣＰＩ－０６１０、ＩＮＣＢ５４３２９およびＩＮＣＢ５７６４３）、ならびにアデノシン受容体アンタゴニストまたはその組合せを含む、がんの処置のための阻害剤のうちの１種または複数と併用され得る。

【0138】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、ＨＤＡＣの阻害剤、例えば、パノビノスタットおよびボリノスタットと併用され得る。
ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、ｃ－Ｍｅｔの阻害剤、例えば、オナルツズマブ（ｏｎａｒｔｕｍｚｕｍａｂ）、チバンチニブ（ｔｉｖａｎｔｎｉｂ）およびカプマチニブ（ＩＮＣ－２８０）と併用され得る。

【0139】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、ＢＴＫの阻害剤、例えば、イブルチニブと併用され得る。
ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、ｍＴＯＲの阻害剤、例えば、ラパマイシン、シロリムス、テムシロリムスおよびエベロリムスと併用され得る。

【0140】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、ＭＥＫの阻害剤、例えば、トラメチニブ、セルメチニブおよびＧＤＣ－０９７３と併用され得る。
ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、Ｈｓｐ９０の阻害剤（例えば、タネスピマイシン）、サイクリン依存性キナーゼ（例えば、パルボシクリブ）、ＰＡＲＰ（例えば、オラパリブ）、ならびにＰｉｍキナーゼ（ＬＧＨ４４７、ＩＮＣＢ０５３９１４およびＳＧＩ－１７７６）と併用され得る。

【0141】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、ＤＮＡセンサーのアゴニスト（ｃ－ＧＡＳ）および／またはその下流アダプタータンパク質ＳＴＩＮＧと併用され得る。

【0142】

ｃＧＡＳ（環式ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ）－ＳＴＩＮＧ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｇｅｎｅｓ）経路は、サイトゾルＤＮＡの存在を検出し、応答時、炎症性遺伝子の発現を引き起こすように機能し、これにより老化または防御機構の活性化をもたらし得る、自然免疫系の成分である。通常の核局在化からサイトゾルへのＤＮＡの局在化は、腫瘍形成またはウイルス感染に関連する。ｃＧＡＳは、サイトゾルにおいて見出され、サイトゾルＤＮＡに直接結合すると、ｃＧＡＳは二量体を形成して、ＡＴＰおよびＧＴＰからの２’３’－ｃＧＡＭＰの生成を触媒する。生じたｃＧＡＭＰは、次いで、ＳＴＩＮＧと結合し、転写因子ＩＲＦ３の活性化を引き起こす第２のメッセンジャーとして作用する。ＩＲＦ３の活性化により、１型ＩＦＮ－βが転写され、多数の下流の標的遺伝子が、多様な生物学的応答、例えば、ウイルス応答、腫瘍監視、自己免疫および細胞性老化を開始する。多くの腫瘍細胞では、構成的に活性なＤＮＡ損傷応答は、核外ＤＮＡの蓄積およびｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の活性化につながる。リンパ腫細胞において、ＮＫＧ２ＤリガンドであるＲａｅ１は、ＳＴＩＮＧ／ＩＲＦ３依存式に上方制御されて、ＮＫ－媒介腫瘍クリアランスを助けたことが示されている。樹状細胞などの抗原提示細胞におけるｃ－ＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、その機能を強化し、抗腫瘍免疫をブースとすることが示されている。

【0143】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤化合物は、１種または複数の免疫チェックポイント阻害剤と併用され得る。
エフェクターＴ細胞の活性化は、通常、ＭＨＣ複合体により提示されるＴＣＲ認識抗原ペプチドによって引き起こされる。達成される活性化の種類およびレベルは、次いで、エフェクターＴ細胞応答を刺激するシグナルと、阻害するシグナルとの間のバランスにより決定される。「免疫系チェックポイント」は、本明細書において、エフェクターＴ細胞応答の阻害に利益となるようにバランスを変更する任意の分子相互作用をいうために使用される。つまり、生じると、エフェクターＴ細胞の活性化を負に調節する分子相互作用である。そのような相互作用は、阻害シグナルをエフェクターＴ細胞に伝達するリガンドと細胞表面受容体との間の相互作用などの直接的なものであり得る。または、相互作用は、そうでなければ活性シグナルをエフェクターＴ細胞に伝達するリガンドと細胞表面受容体との間の相互作用の遮断もしくは阻害、または阻害分子もしくは細胞の上方制御を促進する相互作用、またはエフェクターＴ細胞が必要とする代謝産物の酵素による枯渇、またはその任意の組合せなどの間接的なものであり得る。

【0144】

免疫系チェックポイントの例としては、ａ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）とその基質との間の相互作用；ｂ）ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ１とＰＤ－Ｌ２との間の相互作用；ｃ）ＣＴＬＡ－４とＣＤ８６および／またはＣＴＬＡ－４とＣＤ８０との間の相互作用；ｄ）Ｂ７－Ｈ３および／またはＢ７－Ｈ４とそのそれぞれのリガンドとの間の相互作用；ｅ）ＨＶＥＭとＢＴＬＡとの間の相互作用；ｆ）ＧＡＬ９とＴＩＭ３との間の相互作用；ｇ）ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとＬＡＧ３との間の相互作用；ならびにｈ）ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとＫＩＲとの間の相互作用；ｉ）ＯＸ４０（ＣＤ１３４）とＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）との間の相互作用；ｊ）ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）との間の相互作用；ｋ）４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）と４－１ＢＢＬを含むリガンドとの間の相互作用；ｌ）ＧＩＴＲとＧＩＴＲＬを含むリガンドとの間の相互作用が挙げられる。

【0145】

例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、免疫チェックポイント分子、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ１２２、ＣＤ９６、ＣＤ７３、ＣＤ４７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＳＦ１Ｒ、ＪＡＫ、ＰＩ３Ｋデルタ、ＰＩ３Ｋガンマ、ＴＡＭ、アルギナーゼ、ＣＤ１３７（４－１ＢＢとしても公知）、ＩＣＯＳ、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２に対する阻害剤が挙げられる。

【0146】

本発明の目的のための代表的なチェックポイントは、チェックポイント（ｂ）、すなわち、ＰＤ１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２いずれかとの間の相互作用である。ＰＤ１は、エフェクターＴ細胞において発現する。いずれかのリガンドとの係合の結果、活性化を下方制御するシグナルが生じる。リガンドは、一部の腫瘍により発現する。特にＰＤ－Ｌ１は、黒色腫を含む多くの固形腫瘍により発現する。これらの腫瘍は、したがって、Ｔ細胞での阻害ＰＤ－１受容体の活性化による免疫媒介抗腫瘍作用を下方制御し得る。ＰＤ１とそのリガンドの一方または両方との相互作用を遮断することにより、免疫応答のチェックポイントが除去され、抗腫瘍Ｔ細胞応答の増加がもたらされ得る。したがって、ＰＤ１およびそのリガンドは、本発明の方法における標的であり得る免疫系チェックポイントの成分の例である。

【0147】

本発明の目的のための別のチェックポイントは、チェックポイント（ｃ）、すなわち、Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ－４とそのリガンドであるＢ７タンパク質（Ｂ７－１およびＢ７－２）との間の相互作用である。ＣＴＬＡ－４は、通常、初期活性化後、Ｔ細胞表面で上方制御され、リガンド結合の結果、更なる／連続活性化を阻害するシグナルが生じる。ＣＴＬＡ－４は、Ｂ７タンパク質への結合に関して、やはりＴ細胞表面で発現するが、活性化を上方制御する受容体ＣＤ２８と競合する。したがって、Ｂ７タンパク質とのＣＴＬＡ－４相互作用を遮断するが、Ｂ７タンパク質とのＣＤ２８相互作用は遮断しないことで、正常な免疫応答のチェックポイントの１つが除去され、抗腫瘍Ｔ細胞応答の増加がもたらされ得る。したがって、ＣＴＬＡ－４およびそのリガンドは、本発明の方法における標的であり得る免疫系チェックポイントの成分の例である。

【0148】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲおよびＣＤ１３７から選択される刺激チェックポイント分子である。

【0149】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩΜ３、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９およびＶＩＳＴＡ、ならびにその結合パートナー（例えば、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）から選択される阻害チェックポイント分子である。

【0150】

一部の実施形態では、本明細書で提供される化合物は、ＫＩＲ阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、ＬＡＩＲ１阻害剤、ＣＤ１６０阻害剤、２Ｂ４阻害剤およびＴＧＦＲベータ阻害剤から選択される１種または複数の作用剤と組み合わせて使用され得る。

【0151】

一部の実施形態では、本明細書で提供される化合物は、典型的には、低有機分子である、低分子阻害剤（ＳＭＩ）である免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。例えば、ある特定の実施形態では、ＩＤＯ１の阻害剤は、エパカドスタット（ＩＮＣＢ２４３６０）、インドキシモッド（Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ）、ＧＤＣ－０９１９（ＮＬＧ９１９）およびＦ００１２８７を含む。ＩＤＯ１の他の阻害剤としては、１－メチルトリプトファン（１ＭＴ）が挙げられる。

【0152】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、「免疫調節剤」としても公知であり、これには、対象に投与された場合に、免疫系チェックポイントの作用を遮断または阻害して、対象における免疫エフェクター応答、典型的には、抗腫瘍Ｔ細胞エフェクター応答を含んでもよいＴ細胞エフェクター応答を上方制御する任意の作用剤が含まれる。

【0153】

本発明の方法において使用される免疫調節剤は、上記の免疫系チェックポイントのいずれかを遮断または阻害し得る。作用剤は、抗体、または上記遮断もしくは阻害をもたらす任意の他の好適な作用剤であってもよい。したがって、作用剤は、一般に、上記チェックポイントの阻害剤と呼ばれる。

【0154】

本明細書で使用される場合、「抗体」は、全抗体および任意の抗原結合性断片（すなわち、「抗原結合性部分」）またその一本鎖を含む。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよく、任意の好適な方法により産生され得る。抗体の用語「抗原結合性部分」に包含される結合性断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ_ｄ断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片および単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。ｓｃＦｖなどの一本鎖抗体、ならびにＶＨＨおよびラクダ抗体などの重鎖抗体もまた、抗体の用語「抗原結合性部分」に包含されることが意図される。

【0155】

ある特定の実施形態では、本発明のＨＰＫ１阻害剤と共に使用される免疫調節剤は、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体である。
一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤ－１の阻害剤、例えば、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ニボルマブ（ＭＤＸ－１１０６）、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ３４７５またはランブロリズマブ）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、チスレリズマブ（ＢＧＢ－Ａ３１７）、カムレリズマブ（ＳＨＲ－１２１０）、スパルタリズマブ（ＰＤＲ００１）またはＡＭＰ－５１４（ＭＥＤＩ０６８０）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ニボルマブまたはペンブロリズマブである。一部の実施形態では、抗ＰＤ１抗体はペンブロリズマブである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、カムレリズマブ（ＳＨＲ－１２１０）である。ある特定の実施形態では、ＰＤ－１の阻害剤は、ＡＭＰ－２２４（ＰＤ－１に結合するＰＤ－Ｌ２ Ｆ_ｃ融合タンパク質）またはＡＵＮＰ－１２（抗ＰＤ－１ペプチド）である。

【0156】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１の阻害剤、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、ＢＭＳ－９３５５５９、ＢＭＳ－９３６５５９（ＭＤＸ－１１０５）、ＭＥＤＩ－４７３６（デュルバルマブ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（ＲＧ７４４６としても公知）、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（ＨＰＡＢ－０３８１－ＷＪ）またはＭＳＢ００１０７１８Ｃである。一部の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体は、ＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＭＥＤＩ－４７３６である。ある特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブまたはＭＥＤＩ－４７３６およびＭＰＤＬ３２８０Ａを含む。

【0157】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＣＴＬＡ－４の阻害剤、例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、イピリムマブ、トレメリムマブまたはＷＯ２０１４／２０７０６３（参照により本明細書に組み込まれる）に開示される抗体の任意のものである。他の分子としては、ポリペプチド、または可溶性変異体ＣＤ８６ポリペプチドが挙げられる。ある特定の実施形態では、抗体はイピリムマブ（Ｉｐｉｌｕｍｕｍａｂ）である。

【0158】

ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、本明細書に記載の調節剤のうちの２種以上の組合せ、例えば、２種以上の異なる標的（例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）を標的とする組合せである。例示的な組合せとしては、α－ＰＤ－１およびα－ＰＤ－Ｌ１；α－ＣＴＬＡ－４、α－ＰＤ－Ｌ１およびα－ＣＤ２０などが挙げられる。

【0159】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ウトミルマブを含む、４－１ＢＢとそのリガンドとの間の相互作用を遮断または阻害する抗体である。
一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＣＳＦＩＲの阻害剤、例えば、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体は、ＩＭＣ－ＣＳ４またはＲＧ７１５５である。

【0160】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＬＡＧ３の阻害剤、例えば、抗ＬＡＧ３抗体である。一部の実施形態では、抗ＬＡＧ３抗体は、ＢＭＳ－９８６０１６、ＬＡＧ５２５、ＩＭＰ３２１またはＧＳＫ２８３１７８１である。

【0161】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＧＩＴＲの阻害剤、例えば、抗ＧＩＴＲ抗体である。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＴＲＸ５１８、ＭＫ－４１６６、ＭＫ１２４８、ＢＭＳ－９８６１５６、ＭＥＤＩ１８７３またはＧＷＮ３２３である。

【0162】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＯＸ４０の阻害剤、例えば、抗ＯＸ４０抗体またはＯＸ４０Ｌ融合タンパク質である。一部の実施形態では、抗ＯＸ４０抗体は、ＭＥＤＩ０５６２、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＯＸＲ０９１６、ＰＦ－０４５１８６００またはＧＳＫ３１７４９９８である。一部の実施形態では、ＯＸ４０Ｌ融合タンパク質は、ＭＥＤＩ６３８３である。

【0163】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＴＩＭ３の阻害剤、例えば、抗ＴＩＭ３抗体である。一部の実施形態では、抗ＴＩＭ３抗体はＭＢＧ－４５３である。

【0164】

一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、ＣＤ２０の阻害剤、例えば、抗ＣＤ２０抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＤ２０抗体は、オビヌツズマブまたはリツキシマブである。

【0165】

一部の実施形態では、本発明の化合物は、１種または複数の代謝酵素阻害剤と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、代謝酵素阻害剤は、ＩＤＯ１、ＴＤＯまたはアルギナーゼの阻害剤である。ＩＤＯ１阻害剤の例としては、エパカドスタットおよびＮＧＬ９１９が挙げられる。アルギナーゼ阻害剤の例は、ＣＢ－１１５８である。

【0166】

一部の実施形態では、本発明の化合物は、二特異性抗体と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、二特異性抗体のドメインの１つは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ３またはＴＧＦβ受容体を標的とする。

【0167】

一部の実施形態では、本発明の化合物は、がんなどの疾患の処置のための１種または複数の作用剤と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、作用剤は、アルキル化剤、プロテアソーム阻害剤、コルチコステロイドまたは免疫調節剤である。アルキル化剤の例としては、ベンダムスチン、ナイトロジェンマスタード、エチレンアミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼン、ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン－メラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミドが挙げられる。一部の実施形態では、プロテアソーム阻害剤はカーフィルゾミブである。一部の実施形態では、コルチコステロイドはデキサメタゾン（ＤＥＸ）である。一部の実施形態では、免疫調節剤は、レナリドミド（ＬＥＮ）またはポマリドミド（ＰＯＭ）である。

【0168】

本開示の化合物は、更に、例えば、化学療法、放射線療法、腫瘍標的化治療、アジュバント治療、免疫療法または手術による、がんを処置する他の方法と組み合わせて使用できる。免疫療法の例としては、サイトカイン処置（例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２）、ＣＲＳ－２０７免疫療法、がんワクチン、モノクローナル抗体、養子Ｔ細胞移入、腫瘍溶解性ウイルス療法およびサリドマイドまたはＪＡＫ１／２阻害剤などを含む免疫調節低分子が挙げられる。

【0169】

本発明の化合物は、化学療法薬などの１種または複数の抗がん薬物と組み合わせて投与できる。化学療法薬の例としては、アバレリックス、アビラテロン、アファチニブ、アフリベルセプト、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アキシチニブ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、バリシチニブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｂｉ）、ボルテゾミブ、ブリバニブ、ブパリシブ、ブスルファン静脈内、ブスルファン経口、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セジラニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダコミチニブ、ダクチノマイシン、ダルテパリンナトリウム、ダサチニブ、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デガレリクス、デニロイキン、デニロイキンディフティトックス、デオキシコホルマイシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エクリズマブ、エンザルタミド、エピドフィロトキシン（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシド、エキセメスタン、クエン酸フェンタニル、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、酢酸ヒストレリン、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンアルファ２ａ、イリノテカン、ジトシル酸ラパチニブ、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、酢酸リュープロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン（ｍｅｃｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、酢酸メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、メトキサレン、ミスラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ネシツムマブ、ネララビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニルタミド、ノフェツモマブ、ゴセレリン（ｏｓｅｒｅｌｉｎ）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、パニツムマブ、パゾパニブ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ピララリシブ、ピポブロマン、プリカマイシン、ポナチニブ、プレドニゾン、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、レゴラフェニブ、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、リツキシマブ、ルキソリチニブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、マレイン酸スニチニブ、タモキシフェン、テガフール、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、トリプトレリン、ウラシルマスタード、バルルビシン、バンデタニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ボリノスタットおよびゾレドロネートのうちの任意のものが挙げられる。

【0170】

他の抗がん剤としては、抗体療法薬、例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン）、共刺激分子に対する抗体、例えば、ＣＴＬＡ－４（例えば、イピリムマブもしくはトレメリムマブ）、４－１ＢＢ、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対する抗体、またはサイトカイン（ＩＬ－１０、ＴＧＦ－βなど）に対する抗体が挙げられる。がんまたは感染、例えばウイルス、細菌、真菌および寄生中感染の処置のために本開示の化合物と併用され得るＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１に対する抗体の例としては、これらに限定されないが、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ－４７３６およびＳＨＲ－１２１０が挙げられる。

【0171】

他の抗がん剤としては、キナーゼ関連細胞増殖障害の阻害剤が挙げられる。これらのキナーゼとしては、これらに限定されないが、オーロラＡ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ５、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、エフリン受容体キナーゼ、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、ＳＲＣ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｆｅｒ、Ｆｅｓ、Ｓｙｋ、Ｉｔｋ、Ｂｍｘ、ＧＳＫ３、ＪＮＫ、ＰＡＫ１、ＰＡＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＫ４、ＰＤＫ１、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＲｓｋおよびＳＧＫが挙げられる。

【0172】

他の抗がん剤としてはまた、免疫細胞遊走を遮断するもの、例えば、ＣＣＲ２およびＣＣＲ４を含むケモカイン受容体のアンタゴニストが挙げられる。本開示の化合物は、更に、１種または複数の抗炎症剤、ステロイド、免疫抑制剤または治療抗体と組み合わせて使用され得る。

【0173】

一部の実施形態では、本発明の化合物は、免疫エフェクター応答を直接刺激する更なる治療剤、例えば、サイトカイン、または腫瘍特異的養子移入Ｔ細胞集団、または腫瘍細胞が発現するタンパク質に特異的な抗体と組み合わせて使用され得る。

【0174】

本明細書で使用される場合、「免疫エフェクター応答を直接刺激する作用剤」は、任意の好適な作用剤を意味するが、典型的には、サイトカインまたはケモカイン（またはそれらのいずれかの産生を刺激する作用剤）、腫瘍特異的養子移入Ｔ細胞集団、または腫瘍細胞が発現するタンパク質に特異的な抗体をいう。

【0175】

サイトカインは、ＩＦＮα、ΙΡΝβ、ＩＦＮγおよびＩＦＮＡから選択されるインターフェロン、またはＩＬ－２などのインターロイキンであり得る。ケモカインは、例えば、ＣＸＣＬ９、１０および１１から選択される炎症メディエーターであってもよく、これは、ＣＸＣＲ３を発現するＴ細胞を誘引する。サイトカインまたはケモカインの産生を刺激する作用剤は、ヒトへの投与に好適なアジュバントであり得る。一例は、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）であり、これは、典型的には、膀胱がんの処置のために膀胱内（すなわち、尿道カテーテルにより）投与される。膀胱がんのためのＢＣＧの典型的な投与量レジメンは、１週間に１回を６週間であるが、その安全性が長い間確認されていることを考慮し、それはまた、維持のために無期限で投与される。ＢＣＧは、膀胱がんへの免疫応答を刺激することが示されている。ＢＣＧはまた、典型的には皮内投与される場合、特に結腸がん用の腫瘍抗原を含む組成物（すなわち、がんワクチン）との組合せのアジュバントとして使用されている。ＢＣＧのそのような使用もまた、本発明において想定される。腫瘍特異的養子移入Ｔ細胞集団は、個体において腫瘍特異的Ｔ細胞集団のサイズを直接増加させ、任意の好適な手段で生成され得る。しかしながら、典型的には、その方法は、患者から得た腫瘍試料から腫瘍特異的Ｔ細胞を単離し、それらの細胞を選択的に培養した後、腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖させた集団を患者に戻すことを含む。あるいは、腫瘍特異的Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞受容体遺伝子座の遺伝子操作の後、変性細胞の増殖によって生成され得る。

【0176】

腫瘍細胞が発現するタンパク質に特異的な抗体は、典型的には、腫瘍細胞に結合し、抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を介して細胞の破壊を促進することによって免疫活性を刺激する。この種類の抗体の例としては、抗ＣＤ２０抗体、例えば、オファツムマブまたはリツキシマブ、および抗ＣＤ５２抗体、例えば、アレムツズマブが挙げられる。

【0177】

したがって、ある特定の例示的な実施形態では、本発明の化合物は、カルシニューリン阻害剤、例えば、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６；ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、ラパマイシン、４０－０－（２－ヒドロキシエチル）－ラパマイシン、バイオリムス－７またはバイオリムス－９；免疫抑制特性を有するアスコマイシン、例えば、ＡＢＴ－２８１、ＡＳＭ９８１；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン；メトトレキセート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸または塩；ミコフェノール酸モフェチル；ＩＬ－１β阻害剤と組み合わせて使用され得る。

【0178】

別の実施形態では、本発明の化合物は、ＰＩ３キナーゼ阻害剤である共作用剤と併用される。
別の実施形態では、本発明の化合物は、ＢＴＫ（ブルトンチロシンキナーゼ）に影響を及ぼす共作用剤と併用される。

【0179】

腫瘍学的疾患の処置のために、本発明の化合物は、Ｂ細胞調節剤、例えば、リツキシマブ、ＢＴＫまたはＳｙｋ阻害剤、ＰＫＣ、ＰＩ３キナーゼ、ＰＤＫ、ＰＩＭ、ＪＡＫおよびｍＴＯＲの阻害剤、ならびにＢＨ３模倣物と組み合わせて使用され得る。

【0180】

一部の実施形態では、その塩を含む本発明の化合物は、別の免疫原性作用剤、例えば、がん性細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチドおよび炭水化物分子を含む）、細胞および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞と併用され得る。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定例としては、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴＩおよび／もしくはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトした腫瘍細胞が挙げられる。

【0181】

一部の実施形態では、本発明の化合物またはその塩はまた、がんの処置のためのワクチン接種プロトコールと組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、ＧＭ－ＣＳＦを発現するように形質導入される。一部の実施形態では、腫瘍ワクチンは、ヒトがんに関連するウイルス、例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）、ならびにカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）由来のタンパク質を含む。一部の実施形態では、本開示の化合物は、腫瘍特異的抗原、例えば、腫瘍組織自体から単離されたヒートショックタンパク質と組み合わせて使用され得る。一部の実施形態では、本発明の化合物またはその塩は、強力な抗腫瘍応答を活性化する樹状細胞免疫化と併用され得る。

【0182】

一部の実施形態では、本発明の化合物は、腫瘍細胞に対するＦｅαまたはＦｅγ受容体発現エフェクター細胞を標的とする二特異的大環状ペプチドと組み合わせて使用され得る。本発明の化合物はまた、宿主免疫応答性を活性化する大環状ペプチドとも併用できる。

【0183】

一部の実施形態では、本発明の化合物は、造血性起源の種々の腫瘍の処置のために骨髄移植と組み合わせて使用され得る。
本発明の化合物と組み合わせて使用することが企図される好適な抗ウイルス剤は、ヌクレオシドおよびヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、ならびに他の抗ウイルス薬を含む。好適なＮＲＴＩの例としては、ジドブジン（ＡＺＴ）；ジダノシン（ｄｄｌ）；ザルシタビン（ｄｄＣ）；スタブジン（ｄ４Ｔ）；ラミブジン（３ＴＣ）；アバカビル（１５９２Ｕ８９）；アデホビルピボキシル［ビス（ＰＯＭ）－ＰＭＥＡ］；ロブカビル（ＢＭＳ－１８０１９４）；ＢＣＨ－１０６５２；エムトリシタビン（ｅｍｉｔｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）［（－）－ＦＴＣ］；ベータ－Ｌ－ＦＤ４（ベータ－Ｌ－Ｄ４Ｃとも呼ばれ、ベータ－Ｌ－２’，３’－ジデオキシ－５－フルオロ－シチジン（ｂｅｔａ－Ｌ－２’，３’－ｄｉｃｌｅｏｘｙ－５－ｆｌｕｏｒｏ－ｃｙｔｉｄｅｎｅ）と命名される）；ＤＡＰＤ（（－）－ベータ－Ｄ－２，６，－ジアミノ－プリンジオキソラン）；およびロデノシン（ＦｄｄＡ）が挙げられる。典型的な好適なＮＮＲＴＩとしては、ネビラピン（ＢＩ－ＲＧ－５８７）；デラビルジン（ｄｅｌａｖｉｒａｄｉｎｅ）（ＢＨＡＰ、Ｕ－９０１５２）；エファビレンツ（ＤＭＰ－２６６）；ＰＮＵ－１４２７２１；ＡＧ－１５４９；ＭＫＣ－４４２（１－（エトキシ－メチル）－５－（１－メチルエチル）－６－（フェニルメチル）－（２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン）；ならびに（＋）－カラノリドＡ（ＮＳＣ－６７５４５１）およびＢが挙げられる。典型的な好適なプロテアーゼ阻害剤としては、サキナビル（Ｒｏ３１－８９５９）；リトナビル（ＡＢＴ－５３８）；インジナビル（ＭＫ－６３９）；ネルフィナビル（ｎｅｌｆｎａｖｉｒ）（ＡＧ－１３４３）；アンプレナビル（１４１Ｗ９４）；ラシナビル（ｌａｓｉｎａｖｉｒ）（ＢＭＳ－２３４４７５）；ＤＭＰ－４５０；ＢＭＳ－２３２２６２３；ＡＢＴ－３７８；およびＡＧ－１５４９が挙げられる。他の抗ウイルス剤としては、ヒドロキシウレア、リバビリン、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ペンタフシドおよびＹｉｓｓｕｍ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．１１６０７が挙げられる。

【0184】

本発明の方法において使用される更なる治療剤の多くは、静脈内、腹腔内またはデポー剤投与を必要とする生物学的製剤であり得ることが認識される。更なる実施形態では、本発明の化合物は経口投与され、更なる治療剤は、非経口、例えば、静脈内、腹腔内またはデポー剤として投与される。

【0185】

本明細書に記載の併用療法の任意のものにおいて、２種以上の医薬品が患者に投与される場合、それらは、同時に、別々に、逐次、または組み合わせて（例えば、３種以上の作用剤の場合）投与されてもよい。

【0186】

一実施形態では、本発明は、治療において同時に、別々にまたは逐次使用するための組合せ調製物として、本発明の化合物、例えば、主題化合物またはその任意のサブグループ、および少なくとも１種の他の治療剤を含む製品を提供する。組合せ調製物として提供される製品は、本発明の化合物もしくはその任意のサブグループおよび他の治療剤を、同じ医薬組成物中に一緒に、または主題化合物またはその任意のサブグループおよび他の治療剤を、別々の形態で、例えばキットの形態で含む組成物を含む。

【0187】

一実施形態では、本発明は、２種以上の別々の医薬組成物を含むキットであって、その少なくとも１種は主題化合物を含有し、別のものは本明細書で論じた第２の治療剤を含有する、キットを提供する。一実施形態では、キットは、上記組成物を別々に保持する手段、例えば、容器、分割ボトルまたは分割箔包を含む。そのようなキットの例は、錠剤、カプセル剤などの包装に典型的に使用されるブリスターパックである。本発明のキットは、例えば、経口および非経口の異なる剤形を投与するため、別々の組成物を異なる投薬間隔で投与するため、または別々の組成物を互いに用量調節するために使用され得る。コンプライアンス補助のために、本発明のキットは、典型的には、投与指示を含む。
６．化合物スクリーニング／アッセイ法
本発明の化合物は、ＨＰＫ１のキナーゼ活性を阻害し、このキナーゼ活性は、多数の生化学アッセイ、例えば、実施例１に記載のアッセイを使用して直接アッセイできる。任意の化合物のＩＣ５０値が、阻害剤濃度の範囲にわたって、これに従って決定できる。更に、化合物の阻害効果もまた、生物学アッセイを使用して評価でき、ＴＣＲおよびＣＤ２８刺激後のＴ細胞によるサイトカイン分泌に対する化合物の効果が決定される。

【0188】

例えば、実施例５は、汎Ｔ細胞の刺激時のＩＬ－２＆ＩＦＮ－γ放出に対するＨＰＫ１阻害剤の効果を決定するためのそのような機能性アッセイを記載している。分泌されたＩＬ－２＆ＩＦＮ－γは、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにより測定／定量化できる。簡潔には、汎Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ）汎Ｔ単離キット（カタログ番号１３０－０９６－５３５）などの市販のキットを使用して、末梢血（ＰＢ）単核細胞（ＭＮＣ）またはＰＢＭＣから単離できる。１次ヒト汎Ｔ細胞は、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞、ならびにいくつかのガンマ／デルタＴ細胞サブセットを含む。汎Ｔ細胞は、カラムを使用しないネガティブ免疫磁気分離技術を使用して単離できる。

【0189】

単離された汎Ｔ細胞は、９６ウェルプレートに１００，０００個の細胞／ウェルで投入し、固定抗ＣＤ３抗体および可溶性抗ＣＤ２８抗体、または陽性対照としてＰＭＡ／イオノマイシン（または陰性対照として培養培地）により刺激され得る。異なる濃度の試験化合物を細胞に添加して、ＴＣＲ刺激／ＣＤ２８共刺激後のサイトカイン分泌に対する化合物の効果を評価され得る。刺激細胞は、更に２日間インキュベートした後、ＥＬＩＳＡアッセイならびにＩＬ－２およびＩＦＮ－γの定量化のために上清（汎Ｔ細胞によって分泌されたサイトカインを含有する）を各ウェルから収集する。

【0190】

追加のアッセイを、ＨＰＫ１を阻害する任意のＨＰＫ１阻害剤の能力を評価するため、またはＨＰＫ１阻害活性を有する化合物をスクリーニングするために使用され得る。
例えば、１つのアッセイでは、ＨＰＫ１キナーゼ活性の阻害を、以下に記載される通りのＴｒｅｇアッセイ（調節性Ｔ細胞増殖アッセイ）を使用してアッセイできる。詳細には、１次ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－ Ｔ細胞およびＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号１１３６３Ｄ）からのものなどの好適なキットを使用して、ヒト由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から単離する。ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－ Ｔ細胞を、ベンダーにより提供されるプロトコールに従ってＣＦＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃ３４５５４）で標識する。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞およびＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０培地中に１×１０^６個の細胞／ｍＬの濃度で再懸濁する。１００μＬのＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、５０μＬのＣＤ４^＋／ＣＤ２５^＋調節性Ｔ細胞ありまたはなしで混合し、５μＬの抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１１１３２Ｄ）および５０μＬのＲＰＭＩ－１６４０培地中で希釈された様々な濃度の化合物で処理する。混合された細胞集団を、５日間（３７℃、５％ＣＯ_２）培養し、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖を、ＦＩＴＣチャンネルを使用してＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０により、５日目に分析する。主題化合物によるＨＰＫ１の阻害は、Ｔｒｅｇ機能を強化し、ＣＦＳＥ標識１次ＣＤ４^＋／ＣＤ２５^－ Ｔ細胞の増殖を阻害することが予想される。

【0191】

別の例では、ＨＰＫ１キナーゼ活性の阻害を、以下に記載の通り、ｐ－ＳＬＰ－７６ Ｓ３７６ ＨＴＲＦアッセイ（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用してアッセイできる。このＨＴＲＦ細胞に基づくアッセイにより、ＨＰＫ１によりセリン３７６でリン酸化されたＳＬＰ－７６の迅速な定量的検出が可能になる。ホスホ－ＳＬＰ－７６は、重要なシグナル複合体が構築されるスキャフォールドを創出し、Ｔリンパ球活性化のマーカーである。製造元によると、ホスホ－ＳＬＰ－７６（Ｓｅｒ３７６）アッセイは、一方はドナーフルオロフォアで、他方はアクセプターで標識された２つの抗体を使用する。第１の抗体は、ＳＬＰ－７６でのリン酸化Ｓ３７６モチーフへの結合に特化し、第２の抗体は、そのリン酸化状態に依存することなくＳＬＰ－７６を認識する能力に特化する。タンパク質リン酸化により、両方の標識抗体が関与する免疫複合体形成が可能になり、これは、ドナーフルオロフォアをアクセプターに近接させ、それによってＦＲＥＴシグナルが生じる。その強度は、試料中に存在するリン酸化タンパク質の濃度に直接比例し、非洗浄アッセイ形式でのタンパク質のリン酸化状態を評価する手段を提供する。

【0192】

簡潔には、Ｊｕｒｋａｔ細胞（１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養）を収集し、遠心分離し、続いて、３×１０^６個の細胞／ｍＬで適切な培地に再懸濁する。Ｊｕｒｋａｔ細胞（３５μＬ）を次いで、３８４ウェルプレートの各ウェルに投入する。試験化合物を、細胞培養培地で４０倍希釈に希釈する（１μＬの化合物に３９μＬ細胞培養培地を添加する）。ウェルプレート中のＪｕｒｋａｔ細胞を、様々な濃度（５μＬ希釈化合物を３５μＬ Ｊｕｒｋａｔ細胞に添加し、１：３希釈で３μΜから開始する）の試験化合物で、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間、処理し、続いて、抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ、ＯＫＴ３クローン）で３０分間処理して、ＴＣＲおよびＨＰＫ１を活性化させる。４×溶解緩衝液（ＬＢ）を含む１００×ブロッキング試薬（ｐ－ＳＬＰ７６ ｓｅｒ３７６ＨＴＲＦキットから）の１：２５希釈物を調製し、ブロッキング試薬を含む１５μＬの４×ＬＢ緩衝液を各ウェルに添加し、穏やかに振とうしながら室温で４５分間インキュベートする。細胞溶解物（１６μＬ）をＧｒｅｉｎｅｒ白色プレートに添加し、ｐ－ＳＬＰ７６ Ｓｅｒ３７６ ＨＴＲＦ試薬（２μＬドナー、２μＬアクセプター）で処理し、４℃で終夜インキュベートする。翌日、均一時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーで測定する。ＩＣ５０の決定を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ソフトウェアを使用して、パーセント阻害対阻害剤濃度の対数曲線を一致させることによって実施する。

【0193】

上記のアッセイはいずれも、より大きな規模または高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）に拡張できる。上記のアッセイの任意のものを使用して、主題化合物のＩＣ５０値を決定できる。
７．医薬組成物
本発明は、本明細書に記載の化合物のいずれか１つまたはその薬学的に許容される塩と、１種または複数の薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0194】

「薬学的に許容される賦形剤」および「薬学的に許容される担体」とは、活性剤の製剤化および／または対象への投与および／または対象による吸収を助ける物質をいい、対象に重大な有害毒性作用を引き起こすことなく本開示の組成物に含まれ得る。薬学的に許容される担体および賦形剤の非限定例としては、水、ＮａＣｌ、生理食塩液、乳酸リンゲル液、通常のスクロース、通常のグルコース、結合剤、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、コーティング、甘味料、香味料、塩溶液（例えば、リンゲル溶液）、アルコール、油、ゼラチン、炭水化物、例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリジンおよび着色料などが挙げられる。そのような調製物は、滅菌されてもよく、所望の場合、本明細書で提供される化合物の活性と有害に反応せず、それに干渉もしない補助剤、例えば、滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を調節するための塩、緩衝剤、着色および／または芳香物質などと混合されてもよい。当業者であれば、他の医薬担体および賦形剤が、開示される化合物との使用に好適であることを認識するであろう。

【0195】

これらの組成物は、必要に応じて、１種または複数の追加の治療剤を更に含む。あるいは、本発明の化合物は、それを必要とする患者に、１つまたは複数の他の治療レジメン（例えば、グリベックまたは他のキナーゼ阻害剤、インターフェロン、骨髄移植、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ビスホスホネート、サリドマイド、がんワクチン、ホルモン療法、抗体、放射線など）の投与と組み合わせて投与されてもよい。例えば、共投与または本発明の化合物を含む医薬組成物への包含のための追加の治療剤は、別の１種または複数の抗がん剤であってもよい。

【0196】

本明細書に記載されるように、本発明の組成物は、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に合わせて、任意および全ての溶媒、希釈剤または他のビヒクル、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存料、固体結合剤、滑沢剤などを含む薬学的に許容される担体と一緒に本発明の化合物を含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９７５）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な担体およびその調製のための公知の技術を開示している。任意の望ましくない生物学的効果が生じるまたは他に医薬組成物の任意の他の成分と有害に相互作用するなど、任意の従来の担体媒体が本発明の化合物と非適合性である場合を除き、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例としては、これらに限定されないが、糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、カカオ脂および坐剤ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；寒天；緩衝化剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；アルギン酸；パイロジェン不含水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコールおよびリン酸緩衝液が挙げられ、他の非毒性適合性滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味、香味および芳香剤、保存料および酸化防止剤も、組成物中に存在してもよい。
８．製剤
本発明は、本発明の活性化合物を、１つ以上の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバント（まとめて「担体」物質と本明細書において称される）、ならびに望ましい場合に他の活性成分と合わせて含むあるクラスの組成物も包含する。

【0197】

ある特定の実施形態において、本発明は、がん、特に本明細書に記載されているがんを処置するための医薬製剤であって、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬製剤を提供する。

【0198】

ある特定の実施形態において、本発明は、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、卵巣がん、および膵がんからなる群から選択されるがんを処置するための医薬製剤であって、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩を薬学的に許容される担体と一緒に含む医薬製剤を提供する。

【0199】

本発明の化合物は、任意の適切な経路により、好ましくはそのような経路に適合された医薬組成物の形態、および意図される処置に有効な用量で投与され得る。本発明の化合物および組成物は、例えば、経口的、経粘膜的、局所的、直腸内、例えば吸入スプレーにより肺内、または血管内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経皮、眼窩内、鞘内、脳室内、腫瘍内、鼻腔内、胸骨内、移植、吸入および注入技術を含む非経口的に、従来の薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与量単位製剤で投与され得る。

【0200】

典型的には、医薬組成物は、活性成分を、ａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑沢剤、例えば、シリカ、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｉｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）；錠剤にはまた、ｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミウニムマグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルビロリドン；望ましい場合は、ｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡混合物；ならびに／あるいはｅ）吸収剤、着色料、風味料、および甘味料と一緒に含む、錠剤またはゼラチンカプセル剤である。錠剤は、当該技術に既知の方法に従ってフィルムコーティングまたは腸溶コーティングされ得る。

【0201】

経口投与に適した組成物は、有効量の本発明の化合物を、錠剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性（ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｉｅ）散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤の形態で含む。経口使用が意図される組成物は、医薬組成物の製造における当該技術に既知の任意の方法に従って調製され、そのような組成物は、薬学的に洗練された口当たりのよい調合剤を提供するため、甘味剤、風味剤、着色剤、および防腐剤からなる群から選択される１つ以上の作用物質を含有することができる。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合して含有してもよい。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；造粒剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプン、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、またはアカシア；ならびに滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。錠剤はコーティングされていない、または消化管での崩壊および吸収を遅延させ、それにより長期間にわたって持続的作用を提供するために、既知の技術によりコーティングされている。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの時間遅延物質を用いることができる。経口用途の製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル剤として、または活性成分が水もしくは油媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセル剤として存在し得る。

【0202】

特定の注射用組成物は、水性等張液剤また懸濁剤であり、坐剤は、有利には脂肪乳剤または懸濁剤から調製される。この記組成物は、滅菌され得る、ならびに／あるいは防腐剤、安定剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節する塩、および／または緩衝液などのアジュバントを含有することができる。加えて、これらは他の治療上貴重な物質を含有することもできる。この組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング方法によりそれぞれ調製され、活性成分を約０．１～７５％含有する、または約１～５０％含有する。経皮適用に適した組成物は、有効量の本発明の化合物を適切な担体と共に含む。経皮送達に適した担体には、宿主の皮膚を通過するのを助けるための、薬学的に許容される吸収性溶媒が含まれる。例えば、経皮デバイスは、裏部材と、任意選択で担体を有する化合物を含有するリザーバーと、任意選択で、長時間にわたって制御された所定の速度で宿主の皮膚に化合物を送達するための速度制御バリアと、デバイスを皮膚に固定する手段とを含む包帯の形態である。

【0203】

例えば皮膚および眼への局所適用に適した組成物には、水性液剤、懸濁剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、または例えばエアロゾルによる送達用の噴霧製剤などが含まれる。そのような局所送達系は、例えば皮膚がんの処置のため、例えばサンクリーム、ローション、スプレーなどによる予防的使用のための皮膚適用に特に適している。したがって、これらは、化粧品を含む当該技術に周知の局所用製剤における使用に特に適している。そのような製剤は、可溶化剤、安定剤、張性向上剤、緩衝液、および防腐剤を含有することができる。

【0204】

本明細書において使用されるとき、局所適用は、吸入または鼻腔内適用に関することもある。これらは、適切な噴射剤の使用を伴う、または伴わない、乾燥散剤吸入器からの乾燥散剤（単独、混合物、例えばラクトースとの乾燥ブレンド、もしくは例えばリン脂質との混合成分粒子のいずれか）の形態、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからのエアロゾル噴霧の提示形態によって、都合よく送達され得る。

【0205】

本発明は、水が特定の化合物の分解を促進し得るので、本発明の化合物を活性成分として含む無水の医薬組成物および剤形を更に提供する。
本発明の無水の医薬組成物および剤形は、無水または低水分含有成分、および低水分または低湿度条件を使用して調製され得る。無水の医薬組成物は、無水の性質が維持されるように調製および保存され得る。したがって、無水組成物は、適切な製剤化キットに含まれ得るように、水への曝露を防止することが知られている材料を使用して包装される。適切な包装の例には、密閉箔、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパックおよびストリップパックが含まれるが、これらに限定されない。

【0206】

本発明は、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を低減する１つ以上の作用物質を含む、医薬組成物および剤形を更に提供する。本明細書において「安定剤」と称されるそのような作用物質には、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸、ｐＨ緩衝液、または塩緩衝液などが含まれるが、これらに限定されない。

【0207】

本発明の薬学的に活性な化合物を、薬学における従来の方法に従って加工して、ヒトおよび他の哺乳動物を含む患者に投与される医薬剤を生成することができる。
投与される化合物の量、ならびに本発明の化合物および／または組成物により疾患状態を処置するための投与量レジメンは、対象の年齢、体重、性別および医学的状態、疾患のタイプ、疾患の重症度、投与の経路および頻度、ならびに用いられる特定の化合物を含む様々な要因によって左右される。したがって、投与量レジメンは、広範囲に変わり得るが、標準的な方法を使用して日常的に決定することができる。前述の通り、１日用量を１回の投与で与えることができる、または２、３、４回、もしくはそれ以上回数の投与に分けてもよい。

【0208】

治療の目的において、本発明の活性化合物は、通常、指定された投与経路に適した１つ以上のアジュバント、賦形剤または担体と組み合わされる。経口投与される場合、化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、ゼラチン、アカシアゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリビニルアルコールと混合され、次いで都合の良い投与のために錠剤化またはカプセル化され得る。そのようなカプセル剤または錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース中の活性化合物の分散体で提供され得る制御放出製剤を含有してもよい。

【0209】

皮膚の状態の場合では、本発明の化合物の局所調合剤を罹患域に１日２～４回適用することが好ましいことがある。局所投与に適した製剤には、皮膚への浸透に適した液体または半液体調合剤（例えば、リニメント剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、またはペースト剤）、および目、耳または鼻への適用に適した滴下剤が含まれる。局所投与では、活性成分は、製剤の０．００１％～１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％～２重量％を構成してもよく、製剤の１０％ｗ／ｗまで構成してもよいが、好ましくは５％ｗ／ｗ以下、より好ましくは０．１％～１％を構成し得る。

【0210】

本発明の化合物は、経皮デバイスにより投与することもできる。好ましくは、経皮投与は、リザーバーおよび多孔質膜タイプ、または固体マトリックス型のいずれかのパッチを使用して達成される。いずれの場合でも、活性剤は、リザーバーまたはマイクロカプセルから、膜を介して、レジピエンの皮膚または粘膜に接触する活性剤透過性接着剤に連続的に送達される。活性剤が皮膚を介して吸収される場合、制御された所定の活性剤流がレシピエントに投与される。マイクロカプセルの場合、カプセル化剤は、膜として機能することもできる。本発明の乳剤の油相は、既知の成分から既知の方法によって構成され得る。

【0211】

相は単に乳化剤のみを含有し得るが、少なくとも１つの乳化剤と脂肪もしくは油、または脂肪と油の両方との混合物を含むことができる。好ましくは、親水性乳化剤は、安定剤として作用する親油性乳化剤と一緒に含まれる。脂肪と油の両方を含むことも好ましい。まとめると、安定剤を伴う、または伴わない乳化剤は、いわゆる乳化ワックスを構成し、油および脂肪と一緒にしたワックスは、クリーム製剤の油状分散相を形成する、いわゆる乳化軟膏基剤を構成する。本発明の製剤における使用に適した乳化剤および乳剤の安定剤には、Ｔｗｅｅｎ ６０、Ｓｐａｎ ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、モノステアリン酸グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、ジステアリン酸グリセリンが単体で、またはワックスもしくは当該技術に周知の他の物質を伴って含まれる。

【0212】

製剤に適した油または脂肪の選択は、医薬乳剤製剤に使用される可能性のある大部分の油における活性成分の溶解度が非常に低いので、所望の化粧用特性を達成することに基づいている。したがって、クリーム剤は、好ましく、チューブまたは他の容器からの漏れを避けるのに適した粘度を有した、べたべたしない、汚さない、可洗性生成物であるべきである。直鎖または分岐酸一塩基または二塩基アルキルエステル、例えば、ジイソアジペート、ステアリン酸イソセチル、ヤシ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、ミリスチル酸イソプロピル、オレイン酸デシル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、２－エチルヘキシルパルミテート、または分岐鎖エステルのブレンドが使用され得る。これらは、必要とされる特性に応じて単独で、または組み合わせて使用され得る。

【0213】

あるいは、高融点脂質、例えば、白色液性パラフィンおよび／もしくは流動パラフィン、または他の鉱物油を使用することができる。
目への局所適用が適した製剤には、活性成分が適切な担体、とりわけ活性成分用の水性溶媒に溶解または懸濁されている点眼剤も含まれる。

【0214】

活性成分は、好ましくは０．５～２０％、有利には０．５～１０％、特に約１．５％ｗ／ｗの濃度で、そのような製剤中に存在する。
非経口投与用の製剤は、水性または非水性の等張滅菌注射液剤または懸濁剤の形態であり得る。これらの液剤または懸濁剤は、経口投与用の製剤における使用が記述された１つ以上の担体もしくは希釈剤を使用して、または他の適切な分散もしくは湿潤剤および懸濁化剤を使用して、滅菌粉末または顆粒から調製され得る。化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、トラガカントガム、および／または様々な緩衝液に溶解され得る。他のアジュバントおよび投与様式は、薬学技術において広範囲に良く知られている。食塩水、デキストロースもしくは水を含む適切な担体を伴う、またはシクロデキストリン（すなわち、Ｃａｐｔｉｓｏｌ）、共溶媒可溶化（すなわち、プロピレングリコール）もしくはミセル可溶化（すなわち、Ｔｗｅｅｎ ８０）を伴う組成物として、活性成分を注射により投与することもできる。

【0215】

滅菌注射用調合剤は、また、非毒性の非経口的に許容され得る希釈剤または溶媒中の滅菌注射用液剤または懸濁剤、例えば１，３－ブタンジオールの液剤であってもよい。許容されるビヒクルおよび溶媒のうちで用いてもよいものは、水、リンゲル液および塩化ナトリウム等張液である。加えて、滅菌の固定油が溶媒または懸濁化媒体として慣用的に用いられる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激固定油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸には、注射剤の調製における用途が見出される。

【0216】

肺内投与では、医薬組成物をエアロゾルの形態で、または乾燥粉末エアロゾルを含む吸入器により投与することができる。
薬物の直腸内投与用の坐剤は、薬物を、常温で固体であるが、直腸内の温度で液体となり、したがって、直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤、例えばココアバターおよびプロピレングリコールと混合することによって調製され得る。

【0217】

医薬組成物を従来の薬学的操作、例えば滅菌に付すことができる、および／または慣用のアジュバント、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などを含有することができる。加えて錠剤および丸剤は、腸溶コーティングを用いて調製され得る。そのような組成物は、湿潤剤、甘味剤、風味剤および香味剤などのアジュバントを含むこともできる。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されている式の化合物またはその薬学的に許容される塩；キナーゼ阻害剤（小分子、ポリペプチド、抗体など）、免疫抑制剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗生物質、または抗血管過剰増殖化合物から選択される追加の作用物質；および任意の薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む。

【0218】

本発明の代替的組成物は、本明細書に記載されている式の化合物またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む。そのような組成物は、例えば、キナーゼ阻害剤（小分子、ポリペプチド、抗体など）、免疫抑制剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗生物質または抗血管過剰増殖化合物を含む１つ以上の追加の治療剤を、任意選択で含むことができる。

【0219】

用語「薬学的に許容される担体またはアジュバント」は、本発明の化合物と一緒に患者に投与することができ、本発明の化合物の薬理学的活性を壊さず、本発明の化合物の治療量を送達するのに十分な用量で投与されたときに非毒性である、担体またはアジュバントを指す本発明の医薬組成物に使用することができる薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルには、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化型薬物送達系（ＳＥＤＤＳ）、例えば、ｄ－α－トコフェロール（ｄ－ａｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）ポリエチレングリコール１０００スクシネート、医薬剤形に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎまたは他の同様のポリマー送達マトリックス、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、プロタミン硫酸塩、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づいた物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が含まれるが、これらに限定されない。シクロデキストリン、例えばｕ－、Ｐ－およびｙ－シクロデキストリン、または化学修飾誘導体、例えば、２および３－ヒドロキシプロピル－シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリン、または他の可溶化誘導体を、本明細書に記載されている式の化合物の送達を高めるために有利に使用することもできる。

【0220】

医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、乳剤、ならびに水性懸濁剤、分散剤および液剤が含まれるが、これらに限定されない任意の経口的に許容される剤形で経口投与され得る。経口用途の錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトースおよびトウモロコシデンプンが含まれる。ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も典型的に添加される。カプセル剤形態の経口投与では、有用な希釈剤にはラクトースおよび乾燥トウモロコシデンプンが含まれる。水性懸濁剤および／または乳剤が経口投与される場合には、油相に懸濁または溶解されていてもよい活性成分が乳化剤および／または懸濁化剤と組み合わされる。

【0221】

望ましい場合には、ある特定の甘味剤、風味剤および／または着色剤を添加することができる。医薬組成物は、リポソームまたはマイクロカプセル化技術を利用する製剤を含むことができ、様々な例が当該技術において知られている。

【0222】

医薬組成物は、鼻内エアロゾルまたは吸入に従ってより投与することができる。そのような組成物は、医薬製剤の分野で周知の技術により調製され、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、バイオアベイラビリティーを高める吸収促進剤、フルオロカーボン、および／またはその例が当該技術において周知でもある他の可溶化もしくは分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製することができる。
９．処置キット
本発明の一態様は、本発明に従って好都合および効果的に方法を実施または使用するためのキットに関する。一般に、医薬パックまたはキットは、本発明の医薬組成物の成分の１種または複数が充填された１つまたは複数の容器を含む。そのようなキットは、とりわけ、錠剤またはカプセル剤などの固体経口形態の送達に適している。そのようなキットは、好ましくは、いくつかの単位投与量を含み、また、目的の使用に向けた投与量を有するカードも含み得る。所望の場合、投与量が投与され得る処置スケジュールの日を示す、例えば、数、文字もしくは他の印の形態の、またはカレンダー挿入物による記憶補助物が提供され得る。そのような容器には、必要に応じて、医薬製品の製造、使用または販売を統制する政府機関により定められた形態の注意文書が付随し、注意文書は、ヒト投与のための製造、使用または販売の官庁による認可を反映している。

【0223】

以下の代表例は、様々な実施形態およびその等価物における本発明の実施に適合され得る重要な追加情報、適例および手引きを含有する。これらの例は、本発明の例示を助けることを意図され、その範囲を制限することは意図されず、その範囲を制限すると解釈されるべきでもない。実際、以下に続く例および本明細書で引用される科学および特許文献への参照を含む本文書を検討することで、当業者には、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な変更、およびその多くの更なる実施形態が、明らかになる。

【0224】

引用される参考文献の内容は、参照により本明細書に組み込まれて、最新技術を例示するのを助ける。
更に、本発明の目的で、化学元素は、元素周期表、ＣＡＳ版、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ、第７５版、見返しに従って特定される。更に、有機化学の一般原理、ならびに特定の官能部分および反応性は、いずれもその全内容が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ、Ｓａｕｓａｌｉｔｏ、１９９９および「Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ＆Ｂｏｙｄ（第３版）に記載されている。
１０．合成スキーム
本発明の化合物は、当技術分野で認識される技術および手順に従って、当業者により調製され得る。より詳細には、本発明の化合物は、以下に示されるスキーム、方法および例に示される通りに調製され得る。当業者であれば、以下のスキームにおける個々のステップは、本発明の化合物を提供するために変更されてもよいことを認識するであろう。試薬および出発材料は、当業者であれば容易に入手可能である。全ての置換基は、別途指定されない限り、既に定義した通りである。

【実施例】

【0225】

以下は本明細書で使用される略語およびその意味である。
Ａｃ：アセチル
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＭｅＯＨ：メタノール
ＥｔＯＨ：エタノール
ＤＭＡＰ：４－（ジメチルアミノ）ピリジン
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
ＢＣＲ：Ｂ細胞受容体
ｍＭ：ミリモル濃度
μＭ：マイクロモル濃度
ｍＬ：ミリリットル
ｎｇ：ナノグラム
ｎＭ：ナノモル濃度
ｎｍ：ナノメートル
ＩＣ_５０：５０％阻害濃度（Ｈａｌｆ ｍａｘｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
ＯＤ：光学密度
Ａ．生物学的実施例
生物学実施例１ ＨＰＫ１生化学アッセイ
この実施例はＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙを使用して潜在的なＨＰＫ１阻害剤化合物のＨＰＫ１キナーゼ活性に対する効果を測定した。

【0226】

ＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）はキナーゼ反応から形成されるＡＤＰを測定する。製品によると、キナーゼアッセイで形成されるＡＤＰが最初にＡＴＰに変換され、これが次いで使用されてルシフェラーゼ反応で光を発生する。生成された発光はキナーゼ活性と相互に関連する。代表的な実験的設定が以下に記載されるが、個々のアッセイにおいて多少の調整がなされることができる。
材料および機器
１．試薬

【0227】

【表1】

【0228】

２．機器および消耗品

【0229】

【表2】

【0230】

３．プレート設定
１０μＭ（最高濃度）～０．５０８ｎＭ（最低濃度）の化合物（ｃｏｍｐｏｏｕｎｄ）の連続３倍希釈。陽性対照は１０μＭ参照＋酵素＋基質である。陰性対照は１％ＤＭＳＯ＋酵素＋基質である。
４．手順
１．緩衝剤調製
４０ｍＭトリス ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ
緩衝剤ストック

【0231】

【表3】

【0232】

２０ｍＬの１Ｍトリスおよび１０ｍＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２を４７０ｍＬのｄｄＨ_２Ｏに加えて緩衝剤ストックを得、ＲＴで貯蔵する。
２．新鮮な１^＊アッセイ緩衝剤を調製する

【0233】

【表4】

【0234】

３．化合物調製
１）化合物は、１０ｍＭのそれぞれの化合物ストックの１０μＬを９０μＬのＤＭＳＯと混合することによって１ｍＭに希釈された。

【0235】

２）化合物は次いでＢＲＡＶＯにより１０用量用に３倍希釈された（５μＬ～１０μＬ希釈）。最高化合物濃度（ｃｏｎｃ．）は１ｍＭ（１００×）であり、ＤＭＳＯ濃度は１００％であった。

【0236】

３）１００ｎＬの各々の希釈された化合物試料をＥＣＨＯにより３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－４５１２）に移す。
４）プレートを１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0237】

４．２×ＡＴＰ－ＭＢＰ混合物の調製
キナーゼ緩衝剤中２０μＭ ＡＴＰ、０．２μｇ／μＬ ＭＢＰ（最終濃度：１０μＭ ＡＴＰ、０．１μｇ／μＬ ＭＢＰ）

【0238】

【表5】

【0239】

５．アッセイ緩衝剤を用いた２×ＨＰＫ１ワーキング溶液の調製
ＨＰＫ１最終濃度は０．６ｎｇ／μＬであった。効力が高い化合物では、より低い濃度のＨＰＫ１が使用された（０．２６ｎｇ／μＬ～０．０６５ｎｇ／μＬ）。

【0240】

６．５μＬ／ウェルの２×ＨＰＫ１ワーキング溶液を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。
７．５μＬ／ウェルの２×ＡＴＰ基質を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0241】

８．２５℃で１時間（または効力の高い化合物では６時間）インキュベートする。
９．５μＬ／ウェルのＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔを加えてキナーゼ反応を停止し、未消費のＡＴＰを枯渇させる。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0242】

１０．１０μＬのＫｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加えてＡＤＰをＡＴＰに変換する。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0243】

１１．発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（３８４－ＣＴＧ）に記録する。
５．データ分析
化合物の各々の濃度におけるパーセント（％）阻害は各々のアッセイプレート内に含有される高および低対照ウェルのシグナルに基づいて、それに対して計算される。高対照ウェルは０％阻害として役立ち、化合物を含有しないがＤＭＳＯ（最終濃度＝０．５％）を含有する低対照ウェルは１００％阻害として役立った。供試化合物に対する濃度および％阻害値がプロットされ、５０％阻害に必要とされる化合物の濃度（ＩＣ５０）が３パラメーターロジスティック用量応答式で決定された。参照ペプチド／化合物に対する終点値（ＩＣ５０）が各々の実験において品質管理の手段として評価された。終点値が期待値の３倍以内であれば、その実験は許容可能であるとみなされた。
生物学実施例２ ＰＫＣ－シータ生化学アッセイ
この実施例はＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙを使用して潜在的なＨＰＫ１阻害剤化合物のＰＫＣ－シータキナーゼ活性に対する効果を測定した。代表的な実験的設定が以下に記載されるが、個々のアッセイにおいて多少の調整がなされることができる。
材料および機器
１．試薬

【0244】

【表6】

【0245】

２．機器および消耗品

【0246】

【表7】

【0247】

３．プレート設定
１０μＭ（最高濃度）～０．５０８ｎＭ（最低濃度）の化合物（ｃｏｍｐｏｏｕｎｄ）の連続３倍希釈。陽性対照は１０μＭ参照＋酵素＋基質である。陰性対照は１％ＤＭＳＯ＋酵素＋基質である。
４．手順
１．緩衝剤調製
４０ｍＭトリス ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ
緩衝剤ストック

【0248】

【表8】

【0249】

２０ｍＬの１Ｍトリスおよび１０ｍＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２を４７０ｍＬのｄｄＨ_２Ｏに加えて緩衝剤ストックを得、ＲＴで貯蔵する。
２．新鮮な１^＊アッセイ緩衝剤を調製する

【0250】

【表9】

【0251】

３．化合物調製
１）化合物は、１０ｍＭのそれぞれの化合物ストックの１０μＬを９０μＬのＤＭＳＯと混合することによって１ｍＭに希釈された。

【0252】

２）化合物は次いでＢＲＡＶＯにより１０用量用に３倍希釈された（５μＬ～１０μＬ希釈）。最高化合物濃度は１ｍＭ（１００×）であり、ＤＭＳＯ濃度は１００％であった。

【0253】

３）５０ｎＬの各々の希釈された化合物試料をＥＣＨＯにより３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－４５１２）に移す。
４）プレートを１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0254】

４．キナーゼ緩衝剤中２×酵素ワーキング溶液の調製

【0255】

【表10】

【0256】

５．２×ＡＴＰ－ｓｕｂ混合物の調製

【0257】

【表11】

【0258】

６．２．５μＬ／ウェルの２×酵素ワーキング溶液を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。
７．２．５μＬ／ウェルの２×ＡＴＰ基質を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0259】

８．２５℃で６０ｍｉｎインキュベートする。
９．５μＬ／ウェルのＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔを加えてキナーゼ反応を停止し、未消費のＡＴＰを１時間後枯渇させる。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0260】

１０．１０μＬのキナーゼＫｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加えてＡＤＰをＡＴＰに変換する。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0261】

１１．発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（３８４－ＵＳＬ）に記録する。
５．データ分析
化合物の各々の濃度におけるパーセント（％）阻害は各々のアッセイプレート内に含有される高および低対照ウェルのシグナルに基づいて、それに対して計算される。高対照ウェルは０％阻害として役立ち、化合物を含有しないがＤＭＳＯ（最終濃度＝０．５％）を含有する低対照ウェルは１００％阻害として役立った。供試化合物に対する濃度および％阻害値がプロットされ、５０％阻害に必要とされる化合物の濃度（ＩＣ５０）が３パラメーターロジスティック用量応答式で決定された。参照ペプチド／化合物に対する終点値（ＩＣ５０）が各々の実験において品質管理の手段として評価された。終点値が期待値の３倍以内であれば、その実験は許容可能であるとみなされた。
生物学実施例３ ＴＢＫ１生化学アッセイ
この実施例はＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙを使用して潜在的なＨＰＫ１阻害剤化合物のＴＢＫ１キナーゼ活性に対する効果を測定した。代表的な実験的設定が以下に記載されるが、個々のアッセイにおいて多少の調整がなされることができる。
材料および機器
１．試薬

【0262】

【表12】

【0263】

２．機器および消耗品

【0264】

【表13】

【0265】

３．プレート設定
上記参照。
４．手順
１．緩衝剤調製
４０ｍＭトリス ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ
緩衝剤ストック

【0266】

【表14】

【0267】

２０ｍＬの１Ｍトリスおよび１０ｍＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２を４７０ｍＬのｄｄＨ_２Ｏに加えて緩衝剤ストックを得、ＲＴ（室温）で貯蔵する。
２．新鮮な１^＊アッセイ緩衝剤を調製する

【0268】

【表15】

【0269】

３．化合物調製
１）化合物は、１０ｍＭのそれぞれの化合物ストック１０μＬを９０μＬのＤＭＳＯと混合することによって１ｍＭに希釈された。

【0270】

２）化合物は次いでＢＲＡＶＯにより１０用量用に３倍希釈された（５μＬ～１０μＬ希釈）。最高化合物濃度は１ｍＭ（１００×）であり、ＤＭＳＯ濃度は１００％であった。

【0271】

３）５０ｎＬの各々の希釈された化合物試料をＥＣＨＯにより３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ－４５１２）に移す。
４）プレートを１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0272】

４．キナーゼ緩衝剤中２×酵素ワーキング溶液の調製

【0273】

【表16】

【0274】

５．２×ＡＴＰ－ｓｕｂ混合物の調製

【0275】

【表17】

【0276】

６．２．５μＬ／ウェルの２×酵素ワーキング溶液を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。
７．２．５μＬ／ウェルの２×ＡＴＰ基質を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0277】

８．２５℃で６０ｍｉｎインキュベートする。
９．５μＬ／ウェルのＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｒｅａｇｅｎｔを加えてキナーゼ反応を停止し、未消費のＡＴＰを１時間後枯渇させる。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0278】

１０．１０μＬのＫｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを加えてＡＤＰをＡＴＰに変換する。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0279】

１１．発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（３８４－ＵＳＬ）に記録する。
５．データ分析
化合物の各々の濃度におけるパーセント（％）阻害は各々のアッセイプレート内に含有される高および低対照ウェルのシグナルに基づいて、それに対して計算される。高対照ウェルは０％阻害として役立ち、化合物を含有しないがＤＭＳＯ（最終濃度＝０．５％）を含有する低対照ウェルは１００％阻害として役立った。供試化合物に対する濃度および％阻害値がプロットされ、５０％阻害に必要とされる化合物の濃度（ＩＣ５０）が３パラメーターロジスティック用量応答式で決定された。参照ペプチド／化合物に対する終点値（ＩＣ５０）が各々の実験において品質管理の手段として評価された。終点値が期待値の３倍以内であれば、その実験は許容可能であるとみなされた。
生物学実施例４ ＪＡＫ３生化学アッセイ
この実施例はＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙを使用して潜在的なＨＰＫ１阻害剤化合物のＪＡＫ３キナーゼ活性に対する効果を測定した。代表的な実験的設定が以下に記載されるが、個々のアッセイにおいて多少の調整がなされることができる。
材料および機器
１．試薬

【0280】

【表18】

【0281】

２．機器および消耗品

【0282】

【表19】

【0283】

３．手順
１．ＪＡＫ３キナーゼ緩衝剤を調製する
ＤＴＴおよびＢＳＡを新たに緩衝剤に加える（最終濃度：４０ｍＭトリス ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ）。

【0284】

【表20】

【0285】

２．化合物調製
供試化合物の場合、化合物は、１０ｍＭの化合物ストック５μＬを４５μＬのＤＭＳＯに混合することにより１ｍＭに希釈された。化合物溶液は次いで１０用量用に連続的に３倍希釈された。最高化合物濃度は１ｍＭ（１００×）であり、ＤＭＳＯ濃度は１００％であった。

【0286】

５０ｎＬの各々の１０用量の希釈された化合物がＥＣＨＯにより３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃４５１２）に加えられた。
陽性対照の場合、５０ｎＬの１ｍＭ参照化合物がＥＣＨＯにより３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃４５１２）に加えられた。

【0287】

陰性対照の場合、５０ｎＬのＤＭＳＯが陰性対照として３８４ウェルアッセイプレートに移された。
アッセイプレートは１，５００ｒｐｍで１分遠心分離された。

【0288】

３．化合物は次のレイアウトに従ってＥＣＨＯにより移された。
参照および供試化合物１～１５：１０μＭ～０．５０８ｎＭの連続３倍希釈（１０用量）；陰性対照は０．７８ｎｇのＪＡＫ３、４μＭのＡＴＰおよび０．２μｇ／μＬのポリ、１％のＤＭＳＯであり、陽性対照は最高用量の参照化合物、０．７８ｎｇのＪＡＫ３、０．２μｇ／μＬのＰｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）、４μＭのＡＴＰ、１％のＤＭＳＯである。

【0289】

４．ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ、３０μＬマルチチャンネル）を用いて２．５μＬ／ウェルの２×ＪＡＫ３ワーキング溶液を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。
５．ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ、３０μＬマルチチャンネル）を用いて２．５μＬ／ウェルの２×ＡＴＰ－Ｐｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）ワーキング混合物を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0290】

６．アッセイプレートを２５℃で６０ｍｉｎインキュベートする。
７．５μＬ／ウェルのＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） ＲｅａｇｅｎｔをＢＲＡＶＯにより加えてキナーゼ反応を停止し、未消費のＡＴＰを１時間後枯渇させる。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0291】

８．１０μＬのＫｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔをＢＲＡＶＯにより加えてＡＤＰをＡＴＰに変換する。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0292】

９．発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（３８４－ＵＳＬ）に記録する。
１０．ＸＬ－フィットを用いてデータを処理する。阻害％＝［１－（試験ウェル－陰性対照）／（陽性対照－陰性対照）］×１００％。
５．データ分析
化合物の各々の濃度におけるパーセント（％）阻害は各々のアッセイプレート内に含有される陰性および陽性対照ウェルのシグナルに基づいて、それに対して計算される。陰性対照ウェルは０％阻害として役立ち、陽性対照ウェルは１００％阻害として役立った。供試化合物に対する濃度および％阻害値がプロットされ、５０％阻害に必要とされる化合物の濃度（ＩＣ５０）が３パラメーターロジスティック用量応答式で決定される。参照ペプチド／化合物に対する終点値（ＩＣ５０）が各々の実験において品質管理の手段として評価される。終点値が期待値の３倍以内であればその実験は許容可能であるとみなされた。
生物学実施例５ ＺＡＰ７０生化学アッセイプロトコル
この実施例はＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙを使用して潜在的なＨＰＫ１阻害剤化合物のＺＡＰ７０キナーゼ活性に対する効果を測定した。代表的な実験的設定が以下に記載されるが、個々のアッセイにおいて多少の調整がなされることができる。
材料および機器
１．試薬

【0293】

【表21】

【0294】

２．機器および消耗品

【0295】

【表22】

【0296】

３．手順
１．ＺＡＰ７０キナーゼ緩衝剤調製
ＤＴＴおよびＢＳＡを新たに緩衝剤に加える（最終濃度：４０ｍＭトリス ｐＨ７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｎＣｌ_２）。

【0297】

【表23】

【0298】

２．化合物調製
供試化合物の場合、化合物は最初に、１０ｍＭの化合物ストック５μＬを４５μＬのＤＭＳＯに混合することにより１ｍＭに希釈された。これらの化合物は次いで１０用量用に３倍希釈された。最高化合物濃度は１ｍＭ（１００×）であり、ＤＭＳＯ濃度は１００％であった。

【0299】

５０ｎＬの化合物溶液がＥＣＨＯにより３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃４５１２）に移された。
陽性対照の場合、５０ｎＬの１ｍＭスタウロスポリンが陽性対照として３８４ウェルアッセイプレートに移された。

【0300】

陰性対照の場合、５０ｎＬのＤＭＳＯが陰性対照として３８４ウェルアッセイプレートに移された。アッセイプレートを１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。
３．化合物は以下のレイアウトに従ってＥＣＨＯにより移された。

【0301】

スタウロスポリンおよび供試化合物１－１５：１０μＭ～０．５０８ｎＭの連続３倍希釈（１０用量）；陰性対照は６．２５ｎｇのＺＡＰ７０、１０μＭのＡＴＰおよび０．４μｇ／μＬのポリ、１％ＤＭＳＯであり、陽性対照は１０μＭのスタウロスポリン、６．２５ｎｇのＺＡＰ７０、１０μＭのＡＴＰおよび０．４μｇ／μＬのポリ、１％ＤＭＳＯである。

【0302】

４．キナーゼ緩衝剤中で２×ＡＴＰ－Ｐｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）混合物：２０μＭのＡＴＰ、０．８μｇ／μＬのＰｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）を調製する（最終濃度：１０μＭのＡＴＰ、０．４μｇ／μＬのＰｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）。

【0303】

５．キナーゼ緩衝剤中で２×ＺＡＰ７０ワーキング溶液：（２．５ｎｇ／μＬ）を調製する（最終濃度は１．２５ｎｇ／μＬであった）。
６．ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ、３０μＬマルチチャンネル）を用いて２．５μＬ／ウェルの２×ＺＡＰ７０ワーキング溶液を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0304】

７．ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ、３０μＬマルチチャンネル）を用いて２．５μＬ／ウェルの２×ＡＴＰ－Ｐｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）ワーキング混合物を加え、１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0305】

８．アッセイプレートを２５℃で６０ｍｉｎインキュベートする。
９．５μＬ／ウェルのＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） ＲｅａｇｅｎｔをＢＲＡＶＯにより加えてキナーゼ反応を停止し、未消費のＡＴＰを１時間後枯渇させる。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0306】

１０．１０μＬのＫｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔをＢＲＡＶＯにより加えてＡＤＰをＡＴＰに変換する。１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0307】

１１．発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（３８４－ＵＳＬ）に記録する。
１２．ＸＬ－フィットを用いてデータを処理する。阻害％＝［１－（試験ウェル－陰性対照）／（陽性対照－陰性対照）］×１００％。
５．データ分析
化合物の各々の濃度におけるパーセント（％）阻害は各々のアッセイプレート内に含有される陰性および陽性対照ウェルのシグナルに基づいて、それに対して計算される。陰性対照ウェルは０％阻害として役立ち、陽性対照ウェルは１００％阻害として役立った。供試化合物に対する濃度および％阻害値がプロットされ、５０％阻害に必要とされる化合物の濃度（ＩＣ５０）が３パラメーターロジスティック用量応答式で決定される。参照ペプチド／化合物に対する終点値（ＩＣ５０）が各々の実験において品質管理の手段として評価される。終点値が期待値の３倍以内であればその実験は許容可能であるとみなされた。
生物学実施例６ ＬＣＫ生化学アッセイプロトコル
この実施例はＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） Ｋｉｎａｓｅ Ａｓｓａｙを使用して潜在的なＨＰＫ１阻害剤化合物のＬｃｋキナーゼ活性に対する効果を測定した。代表的な実験的設定が以下に記載されるが、個々のアッセイにおいて多少の調整がなされることができる。
材料および機器
１．試薬

【0308】

【表24】

【0309】

２．機器および消耗品

【0310】

【表25】

【0311】

３．手順
１．ＬＣＫキナーゼ緩衝剤調製
ＤＴＴおよびＢＳＡを新たに緩衝剤に加える（最終濃度：４０ｍＭトリス ｐＨ７．５；２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、５０μＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＭｎＣｌ_２）。

【0312】

【表26】

【0313】

２．化合物調製
供試化合物の場合、化合物は最初に１０ｍＭの化合物ストック５μＬを４５μＬのＤＭＳＯに混合することにより１ｍＭに希釈された。化合物溶液は次いで１０用量用に連続的に３倍希釈された。最高化合物濃度は１ｍＭ（１００×）であり、ＤＭＳＯ濃度は１００％であった。

【0314】

陽性対照の場合、スタウロスポリンが３μＬの１０ｍＭストックを９７μＬのＤＭＳＯに混合することにより３００μＭに希釈された。
５０ｎＬの化合物溶液および３００μＭスタウロスポリンがＢＲＡＶＯにより３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃４５１２）に移された。

【0315】

陰性対照の場合、５０ｎＬのＤＭＳＯが陰性対照として３８４ウェルアッセイプレートに移された。アッセイプレートを１，５００ｒｐｍで１分遠心分離する。
３．化合物はＥＣＨＯにより以下のレイアウトに従って移された。

【0316】

スタウロスポリンおよび供試化合物１－１５：１０μＭ～０．５０８ｎＭの連続３倍希釈（１０用量）；陰性対照は７ｎｇのＬＣＫ、２０μＭのＡＴＰおよび０．４μｇ／μＬのポリ、１％ＤＭＳＯであり、陽性対照は３μＭのスタウロスポリン、７ｎｇのＬＣＫ、２０μＭのＡＴＰおよび０．４μｇ／μＬのポリ、１％ＤＭＳＯである。

【0317】

４．キナーゼ緩衝剤中で２×ＡＴＰ－Ｐｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）混合物：４０μＭのＡＴＰ、０．８μｇ／μＬポリ（Ｅ４Ｙ１）を調製する（最終濃度：２０μＭのＡＴＰ、０．４μｇ／μＬのポリ（Ｅ４Ｙ１）。

【0318】

５．キナーゼ緩衝剤中で２×ＬＣＫワーキング溶液（２．８ｎｇ／μＬ）を調製する（最終濃度は１．４ｎｇ／μＬであった）。
６．ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ、３０μＬマルチチャンネル）を用いて２．５μＬ／ウェルの２×ＬＣＫワーキング溶液を加え、１，０００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0319】

７．ピペット（Ｔｈｅｒｍｏ、３０μＬマルチチャンネル）を用いて２．５μＬ／ウェルの２×ＡＴＰ－Ｐｏｌｙ（Ｅ４Ｙ１）ワーキング混合物を加え、１，０００ｒｐｍで１分遠心分離する。

【0320】

８．アッセイプレートを２５℃で６０ｍｉｎインキュベートする。
９．５μＬ／ウェルのＡＤＰ－ＧＬＯ（商標） ＲｅａｇｅｎｔをＢＲＡＶＯにより加えてキナーゼ反応を停止し、未消費のＡＴＰを１時間後枯渇させる。１，０００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で４０ｍｉｎインキュベートする。

【0321】

１０．１０μＬのＫｉｎａｓｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＲｅａｇｅｎｔをＢＲＡＶＯにより加えてＡＤＰをＡＴＰに変換する。１，０００ｒｐｍで１分遠心分離する。２５℃で３０ｍｉｎインキュベートする。

【0322】

１１．発光シグナルをＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（３８４－ＵＳＬ）に記録する。
１２．ＸＬ－フィットを用いてデータを処理する。阻害％＝（陰性対照－試験ウェル）／（陰性対照－陽性対照）×１００％。
４．データ分析
化合物の各々の濃度におけるパーセント（％）阻害は各々のアッセイプレート内に含有される陰性および陽性対照ウェルのシグナルに基づいて、それに対して計算される。陰性対照ウェルは０％阻害として役立ち、陽性対照ウェルは１００％阻害として役立った。供試化合物に対する濃度および％阻害値がプロットされ、５０％阻害に必要とされる化合物の濃度（ＩＣ５０）が３パラメーターロジスティック用量応答式で決定される。参照ペプチド／化合物に対する終点値（ＩＣ５０）が各々の実験において品質管理の手段として評価される。終点値が期待値の３倍以内であればその実験は許容可能であるとみなされた。
生物学実施例７ ＭＡＰ４Ｋ３タンパク質キナーゼアッセイ
この実施例はタンパク質キナーゼＭＡＰ４Ｋ３によるペプチド基質のリン酸化を測定するためのアッセイプロトコルを提供する。

【0323】

簡単に言うと、ＭＡＰ４Ｋ３、その基質、および補因子（ＡＴＰおよびＭｇ^２＋）がマイクロタイタープレートのウェル内で混合され、５時間２５℃でインキュベートされる。インキュベーションの終了時、ＥＤＴＡを含有する緩衝剤の添加により反応がクエンチされる。基質および産物が分離され、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓのマイクロ流体に基づくＬａｂＣｈｉｐ ３０００ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍを用いて電気泳動的に定量化される。

【0324】

このアッセイの場合、ＭＡＰ４Ｋ３基質はＦＡＭ－ＧＡＧＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ－ＮＨ２である（ＦＡＭはカルボキシフルオレセインである）。ペプチド基質は好ましくはＣａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓにより＞９８％純粋である。

【0325】

典型的なアッセイ設定および条件が以下に提供される。
１．３８４ウェルプレートのウェルに５μＬの２×酵素緩衝剤（または対照）を加える。

【0326】

２．１００ｎＬの１００×化合物を加える。所望であればこの時点で酵素および化合物はプレインキュベートされてもよい。
３．５μＬの２×基質緩衝剤を加える。

【0327】

４．プレートを２５℃で５時間インキュベートする。
５．４０μＬの１．２５×停止緩衝剤を加えることにより反応を終了させる。
６．下記表の値を用いてＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）３０００ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍでジョブを作成する。

【0328】

１２ Ｓｉｐｐｅｒ Ｃｈｉｐのための分離条件

【0329】

【表27】

【0330】

７．プレートをロードし、励起用に青色レーザー（４８０ｎｍ）を、検出用に緑色ＣＣＤ（５２０ｎｍ）（ＣＣＤ２）を用いて電気泳動を始める。
上記アッセイは次の反応条件で行われる：５合計時間；２５℃、２０ｍＭの１００％阻害剤ＥＤＴＡの存在下。

【0331】

最終アッセイ反応混合物は１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１％ＢＳＡ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０μＭオルトバナジン酸ナトリウム、１０μＭベータグリセロリン酸 ２０μＭのＡＴＰ、１％ＤＭＳＯ（化合物由来）、０．５μＭのＦＡＭ－ＧＡＧＲＬＧＲＤＫＹＫＴＬＲＱＩＲＱ－ＮＨ２、０．５ｎＭのＭＡＰ４Ｋ３酵素である。

【0332】

ＭＡＰ４Ｋ３の比活性はロット間で変化し、酵素濃度は基質から産物への約１０～２０％の変換を得るように調節される必要があり得ることに注意するべきである。
各々の試料中に存在する基質および産物ペプチドはＬａｂＣｈｉｐ ３０００キャピラリー電気泳動機器を用いて電気泳動的に分離される。基質および産物ペプチドが分離されると２つの蛍光のピークが観察される。基質および産物ピークの相対蛍光強度の変化が測定されるパラメーターであり、酵素活性を反映する。キャピラリー電気泳動図（ＲＤＡ取得ファイル）はＨＴＳ Ｗｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析される。各々の試料のキナーゼ活性は産物対総和比（ＰＳＲ）、すなわちＰ／（Ｓ＋Ｐ）として決定され、ここでＰは産物ペプチドのピーク高さであり、Ｓは基質ペプチドのピーク高さである。

【0333】

各々の化合物に対して、酵素活性が様々な濃度（３×希釈間隔で離れた１２の化合物濃度）で測定される。陰性対照試料（０％－阻害剤の不在下での阻害）および陽性対照試料（１００％－２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下での阻害）が４回繰り返して集められ、各々の濃度の各々の化合物に対する％阻害値を計算するのに使用される。

【0334】

パーセント阻害（Ｐ_ｉｎｈ）は次の式を用いて決定される。
Ｐ_ｉｎｈ＝（ＰＳＲ_０％－ＰＳＲ_ｉｎｈ）／（ＰＳＲ_０％－ＰＳＲ_１００％）×１００
ここで、ＰＳＲ_ｉｎｈは阻害剤の存在下での産物総和比であり、ＰＳＲ_０％は阻害剤の不在下での平均の産物総和比であり、ＰＳＲ_１００％は１００％阻害対照試料の平均の産物総和比である。

【0335】

阻害剤のＩＣ５０値はＸＬ－フィット４ソフトウェア（ＩＢＤＳ）を用いて４パラメーターＳ字状用量応答モデルにより阻害曲線（Ｐｉｎｈ対阻害剤濃度）をフィットさせることにより決定される。

【0336】

アッセイに使用されたいくつかの材料および緩衝剤が参考値として以下に示される。

【0337】

【表28】

【0338】

生物学実施例８ ヒト汎Ｔ細胞により放出されるＩＬ２およびＩＦＮ－γに関する化合物有効性研究
この実施例は汎Ｔ細胞およびＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いてＩＬ２およびＩＦＮ－γ放出に対する化合物の効果を決定するのに使用されることができるアッセイ方法である。
材料および機器
１．試薬

【0339】

【表29】

【0340】

２．機器および消耗品

【0341】

【表30】

【0342】

３．手順
汎Ｔ単離および試薬調製のための手順（０日目）
１．細胞増殖培地
ＲＰＭＩ１６４０：ＡＴＣＣ、Ｃａｔ＃３０－２００１
１０％ＦＢＳ：Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１００９９１４１
１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ：Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１５１４０１２２
１％非必須アミノ：Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１１１４００５０
ベータ－メルカプトエタノール：Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃２１９８５０２３
２．汎Ｔ単離緩衝剤調製
ＭＡＣＳ（登録商標）ＢＳＡストック溶液（＃１３０－０９１－３７６）を自動ＭＡＣＳ（登録商標）濯ぎ溶液で２０倍に希釈することによりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．２、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および２ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液を調製する。緩衝剤を４℃に保つ。気泡がカラムを塞ぐ可能性があるので使用前に緩衝剤を脱気する。

【0343】

【表31】

【0344】

３．冷凍ＰＢＭＣを解凍する
１）培地を３７℃の水浴で予熱する。
２）細胞を３７℃の水浴中で急速に解凍する。

【0345】

３）予め温めた培地を１５ｍＬのチューブに加える。細胞をチューブに移す。
４）３００×ｇで８ｍｉｎ遠心分離する（遠心分離増大０、減少０）。
５）濯ぎ緩衝剤を用いてＰＢＭＣを洗浄する。

【0346】

６）ＰＢＭＣを３００×ｇで８ｍｉｎ遠心分離し、２回洗浄する（遠心分離増大９、減少１）。
７）細胞を汎Ｔ細胞単離緩衝剤で再懸濁し、細胞数をカウントする。

【0347】

４．汎Ｔ細胞単離
マイクロビーズカクテルで細胞染色する
１）細胞を調製し、細胞数を決定する。細胞を７０μｍセルストレーナーにより濾過する。

【0348】

２）細胞ペレットを１０^７の総細胞当たり４０μＬの緩衝剤に再懸濁する。
３）１０^７の総細胞当たり１０μＬの汎Ｔ細胞ビオチン－抗体カクテルを加える。
４）よく混合し、１０分間冷凍機（氷）内でインキュベートする。

【0349】

５）１０^７の総細胞当たり３０μＬの緩衝剤を加える。
６）１０^７の総細胞当たり２０μＬの汎Ｔ細胞マイクロビーズカクテルを加える。
７）よく混合し、１５分間冷凍機（氷）内でインキュベートする。

【0350】

８）その後の磁気細胞分離に進む。
注意：ａ．速やかに作業し、細胞を冷たく保ち、予冷された溶液（２～８℃）を使用する。ｂ．所与の磁気標識の容積は最大１０^７の総細胞に対する。少なめの細胞で作業する場合は示したのと同じ容積を使用する。ｃ．多めの細胞数で作業する場合は全ての試薬容積、従って総容積をスケールアップする。ｄ．最適な性能のためには磁気標識の前に単細胞懸濁液を得ることが重要である。

【0351】

その後の手動の細胞分離
１）ＬＳカラムを適切なＭＡＣＳ Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場内に入れる。詳細については、それぞれのＭＡＣＳ Ｃｏｌｕｍｎデータシートを参照すること。

【0352】

２）３ｍＬの緩衝液で濯ぐことによりカラムを準備する。
３）細胞懸濁液をカラムにアプライする。富化されたＴ細胞を表すフロースルーを集める。

【0353】

４）カラムを５ｍＬの緩衝液で洗浄する。通過する、富化されたＴ細胞を表す未標識細胞を集める。
注意：次のステップに進む前に、カラムリザーバーが空になるまで必ず待つこと。

【0354】

５．汎Ｔ細胞ＦＡＣＳ
１）５０μＬのＰＢＭＣおよび汎Ｔ細胞をそれぞれＦＡＣＳチューブに取る。
２）細胞を抗ヒトＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８抗体（１μＬ／１μＬ／１μＬ／チューブ）と共に２０ｍｉｎ４℃でインキュベートする。未染色対照では、細胞をＦＡＣＳ染色緩衝液と共にインキュベートする。

【0355】

３）冷たい染色緩衝液（０．２％ＢＳＡおよび１ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で２回洗浄する。
４）ＦＡＣＳを行う。ＣＤ３^＋、ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋、およびＣＤ３^＋ＣＤ８^＋集団％分析用にゲートする。

【0356】

５）汎Ｔ細胞の純度が９０％より高ければ、適当な容積の細胞培養培地で細胞懸濁液を百万細胞／ｍＬに希釈する。
６）細胞懸濁液を後の使用のために無菌の使い捨てリザーバーに分注する。
化合物および抗ヒトＣＤ３／ＣＤ２８の調製手順（０日目）
１．化合物調製
化合物連続希釈（ソースプレート１０００×）
化合物が１００％ＤＭＳＯ中で１０ｍＭの濃度に可溶化される。次いでそれらは８点用量に３倍連続希釈された。

【0357】

４×化合物用量調製（インタープレート：Ｃｏｒｎｉｎｇ－３５９９）
培養培地中４×化合物溶液を調製する。ピペットで上下させる。ＺＰＥ対照では、培養培地中０．４％ＤＭＳＯ（４×）を調製する。ＨＰＥ対照では、０．４μＭの培養培地中ＲＧＴ００３－０２６（４×）を調製する。

【0358】

２．抗ヒトＣＤ３（ストック濃度６．７６ｍｇ／ｍｌ）：４℃で貯蔵。
１）抗ヒトＣＤ３をＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬの最終濃度に希釈する。
２）陽性および陰性対照ウェルを除き各々のウェルに５０μＬ／ウェルのＣＤ３を加える。陽性および陰性対照ウェルはＣＤ３／ＣＤ２８刺激を有さない。

【0359】

３）５％ＣＯ_２インキュベーター内３７℃で２時間インキュベートする。
４）５０μＬの抗体溶液を細胞培養プレートから取り出す。各回２００μＬの無菌ＰＢＳで各々のウェルを２回濯ぐ。

【0360】

３．抗ヒトＣＤ２８（４×）調製
抗体は培養培地により１１．０７ｍｇ／ｍＬのストック濃度から２μｇ／ｍＬ（４×）に希釈された。

【0361】

４．ＰＭＡ／イノマイシン（Ｉｎｏｍｙｃｉｎ）調製（４×）
１）ＰＭＡを培地中４００ｎｇ／ｍＬ（８×）に希釈する。
２）イノマイシンを培地中８μＭ（８×）に希釈する。

【0362】

３）等量のＰＭＡをイオノマイシンと混合して４×混合物を得る。
細胞を刺激する手順（０日目）
１．１×１０^５細胞／ウェル（１００μＬ／ウェル）の細胞懸濁液を９６ウェルプレート（細胞プレート：ｇｒｅｉｎｅｒ－６５５１８０）に移す。

【0363】

２．供試化合物およびＺＰＥ／ＨＰＥ対照では５０μＬ／ウェルの抗ヒトＣＤ２８を加える。陽性または陰性対照では、それぞれ５０μＬ／ウェルの４×ＰＭＡ／イノマイシン溶液または培養培地を加える。

【0364】

３．５０μＬ／ウェルの化合物を以下に示すプレートマップに従って細胞プレートに加える。ＺＰＥ／ＨＰＥ対照では、それぞれ５０μＬ／ウェルの０．４％ＤＭＳＯ溶液または０．４μＭのＲＧＴ００３－０２６（４×）を加える。陽性または陰性対照では、５０μＬ／ウェルの培養培地を加える。

【0365】

４．プレートを４８時間インキュベートする。
ＩＬ－２およびＩＦＮ－γＥＬＩＳＡの手順
１日目：コーティングプレート
１）マイクロウェルをウェル当たり１００μＬの、コーティング緩衝液に希釈されたＩＬ－２およびＩＦＮ－γ捕捉抗体で覆う。推奨される抗体コーティング希釈については、ロット特定のＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ／Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ参照。プレートをシールし、一晩４℃でインキュベートする。
２日目：試料収集
１）３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４８時間インキュベーション後、細胞プレートを１，０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離する。１００μＬ／ウェルの上清を集め、次いでＩＬ－２およびＩＦＮ－γＥＬＩＳＡアッセイを行う。上清は－８０℃で貯蔵されることができ、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γＥＬＩＳＡアッセイは翌日行われることができる。上清は、アッセイがＩＬ－２およびＩＦＮ－γ標準曲線の直線範囲を越えないように保証するため３０～４０倍希釈される必要があり得る。
２）新しい培地（抗ＣＤ２８、Ｐ／Ｉおよび化合物を含有する）をプレートに１００μＬ／ウェル加える。
３）プレートマップ：
３～４日目：ＩＬ－２およびＩＦＮ－γＥＬＩＳＡ：
１）ウェルを吸引し、≧３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄する。最後の洗浄後、プレートを逆さにし、吸収紙で吸い取って残留する緩衝液を除く。
２）プレートを≧２００μＬ／ウェルのアッセイ希釈剤でブロックする。ＲＴで１時間インキュベートする。
３）ステップ２と同様に吸引／洗浄する。
４）アッセイ希釈剤中の標準を調製する。
ＩＬ－２標準ストック調製
１ｍＬの脱イオン水をバイアルに加え（２３５ｎｇ／バイアル）、ストック濃度は２３５ｎｇ／ｍＬである。標準ストックを１０μＬ／バイアルで採り、－８０℃で凍結する。
ＩＦＮ－γ標準ストック調製
１ｍＬの脱イオン水をバイアルに加え（１４５ｎｇ／バイアル）、ストック濃度は１４５ｎｇ／ｍＬである。標準ストックを１０μＬ／バイアルで採り、－８０℃で凍結する。
ＩＬ－２／ＩＦＮγの標準曲線の調製
標準試料を５００ｐｇ／ｍＬの最高濃度に希釈する。次いで２倍連続希釈を１０点用量（ブランク対照を含む）に行う。いろいろな濃度の標準をＥＬＩＳＡプレート、１００μＬ／ウェルに移す。
１）ピペットで１００μＬの各々の標準、試料、および対照を適当なウェルに入れる。プレートをシールし、２時間ＲＴでインキュベートする。
２）ステップ２と同様に吸引／洗浄するが、合計５回洗浄する。
３）１００μＬのＷｏｒｋｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ＋ＳＡｖ－ＨＲＰ試薬）を各々のウェルに加える。プレートをシールし、１時間ＲＴでインキュベートする。
４）ステップ２と同様に吸引／洗浄するが、合計７回洗浄する。注意：この最終洗浄ステップでは、各々の洗浄に対してウェルを洗浄緩衝液に３０秒～１分浸すこと。
５）１００μＬの基質溶液を各々のウェルに加える。プレートを（プレートシーラーなしで）３０分室温で暗所においてインキュベートする。
６）５０μＬの停止溶液を各々のウェルに加える。
７）反応を停止してから３０分以内に４５０ｎｍで吸光度を読む。ＯＤ４５０ｎｍは５７０ｎｍのＯＤ値に規格化された。
４．データ分析
生化学アッセイの場合、化合物の各々の濃度におけるパーセント（％）阻害は各々のアッセイプレート内に含有されるＨＰＥおよびＺＰＥウェルのシグナルに基づいて、それに対して計算される。ＨＰＥウェルは１００％有効と思われ、化合物を含有しないがＤＭＳＯ（最終濃度＝０．１％）を含有するＺＰＥウェルは０％有効とみなされた。

【0366】

細胞アッセイでは、化合物の各々の濃度におけるＩＬ－２またはＩＦＮ－γ（データは示さない）のＤＭＳＯ対照と比較した応答が計算される。ＥＣ２ｘは２００％応答（２倍）を与える化合物の濃度（ｃｏｎｃｅｒｔａｔｉｏｎ）を表し、ＥＣ５０はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算される。
生物学的実施例９ 動的溶解度アッセイ
このプロトコールは、試験物のアッセイ緩衝剤への動的溶解度を測定するために設計する。この研究は国際生命倫理基準「Ｗｏｒｌｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉに従って行われる。
１．試薬
対照：
ＤＭＳＯ中１０ｍＭプロプラノロール
ＤＭＳＯ中１０ｍＭケトコナゾール
ＤＭＳＯ中１０ｍＭタモキシフェン
脱イオン１８．２ＭΩ－ｃｍ ＭＱ超純水
リン酸、８５％（Ｈ_３ＰＯ_４）
ジメチルスルホキシド
アッセイ緩衝剤
１００ リン酸緩衝液、ｐＨ７．４
２．手順
較正曲線調製：
３００μＭ化合物溶液：６μＬの化合物ストック溶液を１９２μＬのＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）に加える。

【0367】

ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１：１）中ワーキング溶液を調製する。

【0368】

【表32】

【0369】

１）１０ｍＭ濃度でＤＭＳＯ中試験化合物用ストック溶液を調製する。１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中、ストック溶液を１００ｍＭリン酸緩衝液に３連で、１％の最終ＤＭＳＯ濃度の１００μＭの標的濃度に希釈する。

【0370】

２）４μＬの１０ｍＭ ＤＭＳＯストック溶液を３９６μＬのアッセイ緩衝剤に。
３）試料管を室温で１時間振とう（１０００ｒｐｍ）したままにする。
４）試料管を１２０００ｒｐｍ（Ｅｐｐｅｎｄｒｏｆ－５４２４、約１３５００ｇ）で１０分遠心分離して未溶解粒子を沈殿させる。

【0371】

５）上清を様々な希釈（未希釈、１０倍希釈、１００倍希釈または他の希釈倍率）で新しい管に移す。
６）５μＬのワーキング溶液および希釈した上清を９５μＬ ＡＣＮ（ＩＳを含有）に加える。

【0372】

試料を較正曲線に対してＬＣ－ＭＳ－ＭＳにより分析する。
３．データ分析
標準較正曲線をメタノール／Ｈ_２Ｏ（１：１）中で調製する。１時間のインキュベーション後の上清中の試験化合物濃度は、ピーク面積を０．０２μＭ～６０μＭの動作範囲で名目濃度に対してプロットすることにより構築した較正曲線から決定し、試験化合物の水溶液を評価するために使用する。
生物学的実施例１０ ＭＤＣＫ透過性アッセイ
このアッセイは、スクリーニングデータのみを生成し、薬物候補の腸管吸収能を推定するためのものである。この研究は国際生命倫理基準「Ｗｏｒｌｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｓｉｎｋｉに従って行われる。
機器
◆２４ウェル細胞培養プレート（ＰＥＴ膜）：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
◆２４ウェルフィーダートレイ：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
◆ピペッターおよび管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
◆Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＲＳ Ｓｙｓｔｅｍ
◆９６ウェルＵ型プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
◆９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
◆３７℃ ＣＯ_２インキュベーター
◆ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
試薬
細胞系：
・ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ）またはＭＤＣＫ ＭＤＲ１（ＮＫＩ）。

【0373】

細胞培養増殖培地（ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＮＥＡＡ）：
５０ｍＬ ＦＢＳおよび５ｍＬ ＮＥＡＡを４４５ｍＬのＭＥＭに加えることにより増殖培地を調製する、または実際の必要に従って最終体積を調節する。

【0374】

Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ＃ ２５２００－０７２）
アッセイおよび投薬溶液緩衝剤：
２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，）、ｐＨ７．４
Ｈａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）

【0375】

【表33】

【0376】

ドナー緩衝液の調製：
ＡからＢ方向について：
レ０．３％ＤＭＳＯおよび５μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（ＬＹ）を含むＨＢＳＳ緩衝液：１５０μＬ ＤＭＳＯおよび１２５μＬ ＬＹ（２ｍＭ）を５０ｍＬ ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加える。

【0377】

レ０．１％ＤＭＳＯおよび５μＭＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（ＬＹ）を含むＨＢＳＳ緩衝液：５０μＬ ＤＭＳＯおよび１２５μＬ ＬＹ（２ｍＭ）を５０ｍＬ ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加える。

【0378】

レ５μＭ Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ（ＬＹ）を含むＨＢＳＳ緩衝液：１２５μＬ ＬＹ（２ｍＭ）を５０ｍＬ ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加える。
ＢからＡ方向について：
レ０．３％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＳ：１５０μＬ ＤＭＳＯを５０ｍＬ ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加える。

【0379】

レ０．１％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＳ緩衝液：５０μＬ ＤＭＳＯを５０ｍＬ ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加える。
レＤＭＳＯを含まないＨＢＳＳ緩衝液。
レシーバー緩衝液の調製：
ＡからＢ方向について：０．４％ＤＭＳＯを含むＨＢＳＳ緩衝液を調製する：２００μＬ ＤＭＳＯを５０ｍＬ ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加える。

【0380】

ＢからＡ方向について：０．４％ＤＭＳＯおよび５μＭ ＬＹを含むＨＢＳＳ緩衝液を調製する：２００ｕＬ ＤＭＳＯおよび１２５μＬ ＬＹ（２ｍＭ）を５０ｍＬ ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に加える。
対照：
以下の式：
（実際の重量／分子量）／溶媒のｍＬ＝１０ｍＭ
を使用してアッセイ緩衝剤中ＤＭＳＯおよびＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ中の１０ｍＭストック濃度の化合物を調製する。

【0381】

参照化合物：エリスロマイシン、メトプロロール、アテノロール
ドナー溶液の調製（化合物について１０μＭおよびＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗについて５μＭ）：

【0382】

【表34】

【0383】

希釈溶液を４０００ｒｐｍで５分遠心分離する。上清を化合物投薬のために収集する。
標準曲線で化合物溶液を調製する（３μＭ／１μＭ／０．２μＭ／０．０４μＭ／０．０１μＭ／０．００５μＭ）：
２０×溶液：
≫１５ μＬ（１０ｍＭ）＋４８５μＬ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）－－－５００μＬ（３００μＭ）
≫２００μＬ（３００μＭ）＋８００μＬ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）－－－１０００μＬ（６０μＭ）
≫２００μＬ（６０μＭ）＋４００μＬ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）－－－６００μＬ（２０μＭ）
≫２００μＬ（２０μＭ）＋８００μＬ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）－－－１０００μＬ（４μＭ）
≫２００μＬ（４μＭ）＋８００μＬ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）－－－１０００μＬ（０．８μＭ）
≫２００μＬ（０．８μＭ）＋６００μＬ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）－－－８００μＬ（０．２μＭ）
≫２００μＬ（０．２μＭ）＋２００μＬ（ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ＝１：１）－－－４００μＬ（０．１μＭ）
１×溶液：３μＬの２０×溶液（０．１～６０μＭ）＋５７μＬ ０．４％ＤＭＳＯ ＨＢＳＳ＋ＩＳ（２００ｎｇ／ｍＬオサルミド）を含む６０μＬ ＡＣＮ。
研究設計
◆試験濃度：治験依頼者により決定される
◆インキュベーション温度および時点：３７℃で０および６０分
◆試料サイズ：１～３
手順
日常的な培養および維持
◆ストック培養物は、ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ＮＥＡＡ中で維持し、７５ｃｍ^２組織培養物処理フラスコ中で増殖させ、週に２回分割（継代）して、所望のコンフルーエンスを維持する。

【0384】

◆維持継代について：トリプシン処理した細胞を新しいフラスコに１：２０の標準継代比で日常的に分布させる。
◆副次培養プロトコール：
レ培養培地を除去し、廃棄する。

【0385】

レ細胞層を０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン － ０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で２回濯いで、トリプシン阻害剤を含有する全ての微量の血清を除去する。
レ２．０～３．０ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ溶液をフラスコに加え、細胞層が分散するまで（通常５～１５分以内）倒立顕微鏡下で細胞を観察する。

【0386】

（注意：集塊を回避するため、フラスコを叩いたり揺らしたりすることによって細胞をかき混ぜず、細胞が剥離するのを待つ。剥離するのが困難な細胞は、３７℃で静置して分散を促進する。）
レ６．０～８．０ｍｌの完全増殖培地を加え、優しくピペッティングすることによって細胞を吸引する。

【0387】

レ細胞懸濁液の適切なアリコートを新しい培養容器に加える。
レ培養物を３７℃でインキュベートする。
播種アッセイプレート
ＭＤＣＫアッセイプレートに、アッセイを行う２～４日前に播種する。２４ウェルプレートに、４００μＬの頂部チャンバー容積（２．２×１０^５／ｍＬ）中０．８８×１０^５／ウェルの細胞密度で、２４ウェル基部チャンバーへの２５ｍＬ体積の増殖培地で播種する。アッセイプレートは、一般に、アッセイ２４時間前に増殖培地を交換する。
アッセイプレートの調製および経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定
ＭＤＣＫアッセイプレートを、アッセイを行う前にＨＢＳＳ＋緩衝液で濯ぐ。濯いだ後、新鮮なＨＢＳＳ＋を、４００μＬ頂部チャンバー容積および０．８ｍＬ ＨＢＳＳ＋基部チャンバー容積中、アッセイプレートに加える。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＥＲＳシステムオームメーターを使用して単層にわたる電気抵抗を測定する。（ＴＥＥＲが１００オーム＊ｃｍ^２超である場合細胞が使用される）。
標準曲線の調製
細胞プレートの調製：
◆緩衝液を頂部側および基底側から除去する。６００μＬのドナー溶液（ＡからＢについて）または５００μＬのレシーバー溶液（ＢからＡについて）をプレートマップに基づいて頂部ウェルに加える。

【0388】

◆新鮮な基底プレートを、８００μＬのレシーバー溶液（ＡからＢについて）または９００μＬのドナー溶液（ＢからＡについて）を新しい２４ウェルプレートのウェルに加えることによって調製する。

【0389】

◆頂部プレートおよび基底プレートを３７℃インキュベーターに入れる。
分析プレートの調製：
◆５分後、１００μＬの試料を全てのドナー（ＡからＢおよびＢからＡの両方について）からＤ０の試料プレートの適切なウェルに移す。そして、１００μＬの試料を全ての頂部チャンバー（ＡからＢのドナーおよびＢからＡのレシーバー）からＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ Ｄ０（Ｄ０ ＬＹ）のマイクロプレートの適切なウェル中に移す。

【0390】

◆頂部プレートを基底プレートに積んで、輸送プロセスを開始する。
◆９０分の時点で、頂部および基底プレートを分離し、１００μＬの試料を全てのドナー（ＡからＢおよびＢからＡの両方について）からＤ９０の新しい試料プレートの適切なウェル中に移し、２００μＬの試料を全てのレシーバーからＲ９０の試料プレートの適当なウェル中に移す。１００μＬの試料を全ての基底チャンバー（ＡからＢのレシーバーおよびＢからＡのドナー）からＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ Ｒ９０（Ｒ９０ ＬＹ）の新しいマイクロプレートの適切なウェル中に移す。

【0391】

◆Ｄ０ ＬＹおよびＲ９０ ＬＹを、蛍光プレートリーダーを使用して、４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長で読みとることによってＬＹ透過性を決定する。
◆試料調製：
≫レシーバー溶液について：６０μＬの試料＋ＩＳ（２００ｎｇ／ｍＬオサルミド）を含む６０μＬ ＡＣＮ
≫ドナー溶液について：６μＬの試料＋５４μＬ ０．４％ＤＭＳＯ／ＨＢＳＳ＋ＩＳ（２００ｎｇ／ｍＬオサルミド）を含む６０μＬ ＡＣＮ
計算
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＝（抵抗_{ｓａｍｐｌｅ}－抵抗_{ｂｌａｎｋ}）×有効膜面積
Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ透過性：
Ｐ_ａｐｐ＝（Ｖ_Ａ／（面積×時間））×（［ＲＦＵ］_{ａｃｃｅｐｔｅｒ}－［ＲＦＵ］_{ｂｌａｎｋ}）／（（［ＲＦＵ］_{ｉｎｉｔｉａｌ，ｄоｎоｒ}－［ＲＦＵ］_{ｂｌａｎｋ}）×希釈係数）×１００
７．１ 以下の式を使用するプレート薬物輸送アッセイ：
経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）＝
（抵抗_{ｓａｍｐｌｅ}－抵抗_{ｂｌａｎｋ}）×有効膜面積
Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ透過性：
Ｐ_ａｐｐ＝（Ｖ_Ｒ／（面積×時間））×（［ＲＦＵ］_{ａｃｃｅｐｔｅｒ}－［ＲＦＵ］_{ｂｌａｎｋ}）／（（［ＲＦＵ］_{ｉｎｉｔｉａｌ，ｄоｎоｒ}－［ＲＦＵ］_{ｂｌａｎｋ}）×希釈係数）
薬物透過性：
Ｐ_ａｐｐ＝（Ｖ_Ｒ／（面積×時間））×（［薬物］_{ｒｅｃｅｉｖｅｒ}／（（［薬物］_{ｉｎｉｔｉａｌ，ｄоｎоｒ}）×希釈係数）
式中、Ｖ_Ｒはレシーバーウェルの容積（ＡからＢについて０．８ｍＬおよびＢからＡについて０．４ｍＬ）であり、面積は膜の表面積（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－２４細胞培養プレートについて０．７ｃｍ^２）であり、時間は、単位秒の総輸送時間である。

【0392】

パーセンテージ回収＝１００×（９０分におけるドナー中の総化合物×希釈係数＋９０分におけるレシーバー中の総化合物）／（０分における総化合物×希釈係数）
データ分析
試験化合物の見かけ浸透係数（Ｐ_ａｐｐ）を、以下の式を使用して計算する：
Ｐ_ａｐｐ＝（Ｖ_Ｒ／（面積×時間））×（［薬物］_{ｒｅｃｅｉｖｅｒ}／（（［薬物］_{ｉｎｉｔｉａｌ，ｄоｎоｒ}）×希釈係数）
式中、Ｖ_Ｒはレシーバーウェルの容積（ＡからＢについて０．８ｍＬおよびＢからＡについて０．４ｍＬ）であり、面積は膜の表面積（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ－２４細胞培養プレートについて０．７ｃｍ^２）であり、時間は、単位秒の総輸送時間である。レシーバー側およびドナー側の試験化合物濃度は、ピーク面積を名目濃度に対してプロットすることによって構築した標準較正曲線から決定する。

【0393】

流出率（ｒａｔｉｏｎ）は、平均頂部から基底（Ａ－Ｂ）Ｐ_ａｐｐデータおよび基底から頂部（Ｂ－Ａ）Ｐ_ａｐｐデータから計算する：流出率＝Ｐ_{ａｐｐ（Ｂ－Ａ）}／Ｐ_{ａｐｐ（Ａ－Ｂ）}。

【0394】

経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）測定を使用して、細胞間のタイトジャンクション形成を決定し、ＴＥＥＲ値が１００Ω・ｃｍ^２超の場合、細胞単層を使用する。細胞単層の完全性を評価するために、５μＭのＬｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗを、ドナーコンパートメント中で試験化合物と共に共処理する。共処理したＬｕｃｉｆｅｒ ＹｅｌｌｏｗのＰ_ａｐｐは５×１０^－６ｃｍ／秒超の場合、データ点は計算から除外する。
生物学的実施例１１ 肝ミクロソームにおける代謝安定性アッセイ
このアッセイは、肝ミクロソームにおける試験化合物の安定性を決定するためのものである。この研究は、国際生命倫理基準「Ｗｏｒｌｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ｏｆに従って行われる。
肝ミクロソーム試料
ＢＤ ＧｅｎｔｅｓｔまたはＲＩＬＤから購入したヒト、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット、ＣＤ－１マウス、ビーグル犬およびカニクイザル肝ミクロソーム試料。
機器
インキュベーター（３７℃）
遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８１０）
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆピペットおよび管
９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
試薬
化合物ストック溶液：
ＤＭＳＯ中１０ｍＭ試験化合物、－８０℃で保存
アッセイ緩衝剤
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４：
－ 緩衝液Ａ：１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ第一リン酸カリウム緩衝液の１．０Ｌ
－ 緩衝液Ｂ：１．０ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ第二リン酸カリウム緩衝液の１．０Ｌ
－ 緩衝液Ｃ（リン酸Ｋ緩衝液）：０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨメーターでモニタリングしながら７００ｍＬの緩衝液Ｂを緩衝液Ａで滴定することによりｐＨ７．４
スパイク溶液
－ ３×試験化合物または陽性対照溶液を調製する：
５００μＭスパイク溶液：１０μＬの１０ｍＭ ＤＭＳＯストック溶液を１９０μＬ ＡＣＮに加える。

【0395】

－ ミクロソーム（０．７５ｍｇ／ｍＬ）中１．５μＭスパイク溶液：１．５μＬの５００μＭスパイク溶液および１８．７５μＬの２０ｍｇ／ｍＬ肝ミクロソームを４７９．７５μＬのリン酸Ｋ緩衝液に加える。
他の溶液
－ ０．１Ｍリン酸Ｋ緩衝液中６ｍＭ ＮＡＤＰＨ：
－ ２５．１ｍｇのＮＡＤＰＨテトラナトリウム塩を５ｍＬのリン酸Ｋ緩衝液に溶解する。
手順
０．７５ｍｇ／ｍｌミクロソーム溶液を含有する１．５μＭスパイク溶液の３０μＬを、４５分、３０分、１５分、５分および０分と表示されたウェルに加える。プレートを３７℃で５分間予備インキュベートする。

【0396】

１５μＬのＮＡＤＰＨストック溶液（６ｍＭ）を全てのウェルに加え、時間調整を開始する。直ちに、ＩＳを含有するＡＣＮの１３５μＬを時間０と表示されたウェルに加える。

【0397】

５分、１５分、３０分および４５分の時点で、ＩＳを含有するＡＣＮの１３５μＬをそれぞれウェルに加える。
インキュベーションの終了時、１５μＬのＮＡＤＰＨストック溶液（６ｍＭ）を時間０と表示されたウェルに加える。

【0398】

クエンチした後、反応混合物を３２２０×ｇで１０分遠心分離する。
５０μＬの上清を各ウェルから、ＬＣ／ＭＳ分析のために５０μＬの超純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有する９６ウェル試料プレート中に移す。

【0399】

【表35】

【0400】

計算
結果は、各時点における試験化合物の％残留として表される：
％残留＝ピーク面積比ｔ_ｘ／ピーク面積比ｔ_０（式中、
ｔ_０＝０分インキュベーション
ｔ_ｘ＝所与のインキュベーション時間）
ｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期は、単位分で報告され、以下の通り計算される：
Ｔ_１／２＝－（０．６９３／スロープ）
スロープ＝ｘ＝０分でｙ切片＝１００％のときのｌｎ（％残留）対インキュベーション時間。

【0401】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ固有クリアランス、Ｃｌ’_ｉｎｔは、以下の通りＴ_１／２から計算した。
Ｃｌ’_ｉｎｔ＝（０．６９３／Ｔ_１／２）×（１／（ミクロソームタンパク質濃度（０．５ｍｇ／ｍＬ））×倍率
各種に使用した倍率は、表１１－２に列挙される。

【0402】

各種についての肝クリアランス予想値は、十分撹拌されたモデルを使用して半減期から計算した。
ＣＬ_ｈｅｐ＝（Ｑ_Ｈ×Ｃｌ’_ｉｎｔ×ｆ_ｕｂ）／（Ｑ_Ｈ＋Ｃｌ’_ｉｎｔ×ｆ_ｕｂ）（式中、
Ｑ_Ｈは、肝血流（ｍＬ／分／ｋｇ）（表１１－２）であり、
ｆ_ｕｂは、血漿中の未結合薬物の分率であり、
Ｃｌ’_ｉｎｔは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ固有クリアランスである）。

【0403】

【表36】

【0404】

データ分析
各インキュベーション時点における％パーセント残留は、Ｔ_０（０分インキュベーション）におけるピーク面積比（化合物ピーク面積／内部標準ピーク面積）と比較することによって計算する。ｌｎピーク面積比を、時間に対してプロットし、線の勾配を決定する。化合物の半減期および代謝は、相対ピーク面積対時間の自然対数線形回帰に基づいて計算する。ミクロソーム中の半減期および固有クリアランス（Ｃｌ_ｉｎｔ）は、以下の式を使用して計算する。

【0405】

Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔ_１／２（分）＝０．６９３／消失速度定数（ｋ）
Ｃｌ_ｉｎｔ（μＬ／分／ミクロソームタンパク質のｍｇ）＝（０．６９３／Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔ_１／２）（インキュベーション体積／ミクロソームのｍｇ）
十分撹拌されたモデルを使用して、半減期計算値から各種についての試験化合物のクリアランス予想値を決定する。

【0406】

陽性対照をアッセイに含む。陽性対照が指定の限度内ではない場合、化合物の値は除く。
生物学的実施例１２ 本開示の化合物およびアナログの比較
本開示で提供されるプロトコールに基づいて、本開示の化合物および複数の化合物アナログの生物学的特性を試験した。試験結果を、以下の表１２－１および表１２－２にまとめる。表１によると、本開示の化合物（実施例１、２、４および５）は、優れたＨＰＫ１阻害活性（１ｎＭ未満）を示した。それらはまた、ＩＬ－２産生を誘導する良好な有効性も示した。更に、表１２－２は、これらの化合物が、溶解度、透過性および代謝安定性を考慮した場合、近いアナログ（化合物７～１０）よりも予想外に全体として良好な特性を有し、全体として良好な特性を有することを示す。

【0407】

【表37-1】

【0408】

【表37-2】

【0409】

【表38-1】

【0410】

【表38-2】

【0411】

Ｂ．合成実施例
機器の説明
ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚ（^１Ｈ）、３７６ＭＨｚ（^１９Ｆ）または７５ＭＨｚ（^１３Ｃ）で作動するＶａｒｉａｎ Ｍｅｒｃｕｒｙ分光計で測定した。試料に使用される溶媒は、各化合物について実験手順に明示している。化学シフトは百万分率（ｐｐｍ、δ単位）で表現される。カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）の単位である。分裂パターンは見かけ上の多重度を示し、ｓ（一重項）、ｄ（二重項）、ｔ（三重項）、ｑ（四重項）、ｑｕｉｎｔ（五重項）、ｍ（多重項）、ｂｒ（幅広）として表される。

【0412】

以下のシステムをＬＣＭＳに使用した：Ａｇｉｌｅｎｔ ６１２０（Ｂｉｎａｒｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍｏｄｕｌｅポンプ）、ＸＢｒｉｄｇｅ分析カラムＣ_１８、５μｍ、４．６×５０ｍｍ、２５℃、注入体積５μＬ、２ｍＬ／分、以下のタイミングに従う０．１％酢酸アンモニウム水溶液中アセトニトリルの勾配：

【0413】

【表39】

【0414】

実験手順：全ての反応は、特に指定しない限り、乾燥窒素の雰囲気下で行った。ＴＬＣプレートは紫外光で可視化した。フラッシュクロマトグラフィーは、ガラス製カラムを使用するシリカゲル（４０～６０μｍ）上でのカラムクロマトグラフィーを指す。あるいは、自動化クロマトグラフィーは、２２０または２５４ｎｍにおける紫外検出でＢｉｏｔａｇｅ ＳＰ１またはＢｉｏｔａｇｅ Ｉｓｏｌｅｒａシステムを使用しておよびＢｉｏｔａｇｅ順相または逆相シリカカートリッジを使用して実行した。適切な実験手順下でさらなる詳細を見ることができる。

【0415】

一般的方法および調製
本開示の化合物および中間体は、本明細書に記載される合成法により調製される。実験手順において、温度、溶液の濃度、溶媒の体積、マイクロ波条件の適用、反応時間またはそれらの組合せ等の反応条件の変更は本発明の一部として認識され、具体的に記述される酸、塩基、試薬、カップリング試薬、溶媒等の他、代替の好適な酸、塩基、試薬、カップリング試薬、溶媒等を使用でき、本開示の範囲内に含まれる。全ての可能な幾何異性体、立体異性体、塩形態は、本開示の範囲内と認識される。
中間体０

【0416】

【化7】

【0417】

１－（ｔｅｒｔ－ブチル）３－メチル３－メチルインドリン－１，３－ジカルボキシレート

【0418】

【化8】

【0419】

ステップ１：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）３－メチルインドリン－１，３－ジカルボキシレート（３２０ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）およびヨードメタン（４９１．３６ｍｇ、３．４６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（８ｍＬ）中溶液に、２５℃で水素化ナトリウム（５０．７７ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を加えた。混合物を２５℃で２時間撹拌し、ＥＡ（２００ｍＬ）で希釈し、次いで水（２０ｍＬ×３）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥＡ／ＰＥ：１５％）により精製して、１－（ｔｅｒｔ－ブチル）３－メチル３－メチルインドリン－１，３－ジカルボキシレートを薄黄色の油状物として得た（２４４ｍｇ、収率７０％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２３６［Ｍ＋Ｈ－５６］^＋。
中間体１

【0420】

【化9】

【0421】

メチル２－（３－メチルインドリン－３－イル）アセテート

【0422】

【化10】

【0423】

ステップ１：１－（ｔｅｒｔ－ブチル）３－メチル３－メチルインドリン－１，３－ジカルボキシレート（７３０ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）中溶液に、水酸化ナトリウム（３．０１ｇ、７５．１７ｍｍｏｌ）の水（１．４１ｍＬ）中水溶液を加えた。混合物を室温で１６時間撹拌し、１Ｍ ＨＣｌ水溶液で酸性化し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。有機相をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮して、粗製の１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３－メチルインドリン－３－カルボン酸を黄色の油状物として得た（６２０ｍｇ、収率８５％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２２２［Ｍ＋Ｈ－５６］^＋。

【0424】

ステップ２：１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－３－メチルインドリン－３－カルボン酸（６３０ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１５ｍＬ）中混合物に、０℃で二塩化オキサリル（８６５．１ｍｇ、６．８２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（８．３ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。混合物を室温で１６時間撹拌し、真空で濃縮した。残渣（６７０ｍｇ、１．１３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）およびＭｅＣＮ（５．００ｍＬ）に溶解し、ジアゾメチル（トリメチル）シラン（２５８．７５ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）（ジエチルエーテル中２Ｍ溶液）を上記溶液にゆっくり加えた。反応混合物をＮ_２下２時間撹拌し、１０％クエン酸（１０ｍＬ）を用いてクエンチし、ＤＣＭ（５０ｍＬ）と水（５０ｍＬ）との間で分配した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥＡ／ＰＥ＝０～１０％）により精製して、ｔｅｒｔ－ブチル３－（２－ジアゾアセチル）－３－メチルインドリン－１－カルボキシレートを黄色の油状物として得た（２００ｍｇ、収率５６％）。

【0425】

ステップ３：ｔｅｒｔ－ブチル３－（２－ジアゾアセチル）－３－メチルインドリン－１－カルボキシレート（２００ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）中溶液に、安息香酸銀（７６．０ｍｇ、０．３３２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をＮ_２下室温で１．５時間撹拌し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で希釈した。有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＥＡ／ＰＥ＝０～１５％）により精製して、ｔｅｒｔ－ブチル３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－３－メチルインドリン－１－カルボキシレートを無色の油状物として得た（１００ｍｇ、収率４２％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２５０［Ｍ＋Ｈ－５６］^＋。

【0426】

ステップ４：ｔｅｒｔ－ブチル３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－３－メチルインドリン－１－カルボキシレート（１００ｍｇ、０．２７８ｍｍｏｌ）およびＨＣｌ／ＥＡ（４Ｍ、１．５ｍＬ）のＤＣＭ（３ｍＬ）中混合物を、室温で２時間撹拌し、真空で濃縮して、粗製のメチル２－（３－メチルインドリン－３－イル）アセテートを得、更には精製しなかった。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２０６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0427】

代替合成方法：

【0428】

【化11】

【0429】

ステップ１：３－メチルインドリン－２－オン（２０ｇ、１３５．８９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）中溶液に、０℃でＮａＨ（６．５２ｇ、１６３．０９ｍｍｏｌ、鉱油中６０％懸濁）を３０分かけて加えた。反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、続いてジ－ｔｅｒｔ－ブチルカルボネート（２９．０７ｇ、１３３．１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）中溶液を滴下添加した。反応混合物を１時間撹拌し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（５０ｍＬ）で希釈し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機相を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝９／１）により精製して、ｔｅｒｔ－ブチル３－メチル－２－オキソインドリン－１－カルボキシレート（３０ｇ、収率７４％）を黄色の油状物として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0430】

ステップ２：ｔｅｒｔ－ブチル３－メチル－２－オキソインドリン－１－カルボキシレート（３０ｇ、１０３．１２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３００ｍＬ）中溶液に、０℃でＮａＨ（４．９５ｇ、１２３．７４ｍｍｏｌ、鉱油中６０％）を３０分かけて加えた。反応混合物を０℃で３０分間撹拌し、続いてメチル２－ブロモアセテート（１８．９３ｇ、１２３．７４ｍｍｏｌ）を滴下添加した。反応混合物を１時間撹拌し、飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１００ｍＬ）を用いてクエンチし、ＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ×２）で抽出した。合わせた有機相を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝８／２）により精製して、ｔｅｒｔ－ブチル３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－３－メチル－２－オキソインドリン－１－カルボキシレート（２８ｇ、収率８３％）を白色の固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２６４［Ｍ＋Ｈ－５６］^＋。

【0431】

ステップ３：１，４－ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌ（３５ｍＬ）およびｔｅｒｔ－ブチル３－（２－メトキシ－２－オキソエチル）－３－メチル－２－オキソインドリン－１－カルボキシレート（２８ｇ、８７．６８ｍｍｏｌ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）中混合物を、室温で２時間撹拌し、真空で濃縮した。残渣をＣＨ_２Ｃｌ_２（２００ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５０ｍＬ）との間で分配した。分離した水性層をＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ×３）で抽出し、合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮して、メチル２－（３－メチル－２－オキソインドリン－３－イル）アセテート（１７．６ｇ、収率８２％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２２０［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0432】

ステップ４：メチル２－（３－メチル－２－オキソインドリン－３－イル）アセテート（１５．６ｇ、７１．１６ｍｍｏｌ）およびローソン試薬（１４．７１ｇ、３６．３８ｍｍｏｌ）のトルエン（２２０ｍＬ）中混合物を、１３０℃で１．５時間撹拌し、真空で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥＡ＝８０：２０）により精製して、メチル２－（３－メチル－２－チオキソインドリン－３－イル）アセテート（１５．５ｇ、収率７４％）を白色の固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２３６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0433】

ステップ５：メチル２－（３－メチル－２－チオキソインドリン－３－イル）アセテート（９．５ｇ、４０．３７ｍｍｏｌ）および塩化ニッケル（１０．４６ｇ、８０．７５ｍｍｏｌ）の混合したＴＨＦ（７０ｍＬ）およびメタノール（７０ｍＬ）中混合物に、０℃でＮａＢＨ_４（９．１６ｇ、２４２．２４ｍｍｏｌ）を１時間かけて一部ずつ加えた。得られた混合物を１０分間撹拌し、セライトのパッドに通して濾過した。固体のケーキをＭｅＯＨ（１００ｍＬ）で洗浄し、濾液を真空で濃縮した。残渣をＥＡ（２００ｍＬ）に溶解し、水（６０ｍＬ×３）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２：メタノール＝９５：５）により精製して、メチル２－（３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（６．５ｇ、収率７５％）を黄色の油状物として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２０６［Ｍ＋Ｈ］^＋。
中間体２

【0434】

【化12】

【0435】

６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－アミン

【0436】

【化13】

【0437】

ステップ１：２－（３－メトキシフェニル）エタンアミン（２０．０ｇ、１３２．２７ｍｍｏｌ、１９．２３ｍＬ）のＨＣｌ水溶液（１Ｎ、１９２ｍＬ、１９２ｍｍｏｌ）中混合物に、ホルムアルデヒドの水溶液（３７重量％、４１．６４ｇ、５２９．０８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６０℃で１時間撹拌し、０℃に冷却し、５０％ＮａＯＨ水溶液（１７．４４ｇ、２１８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下添加することにより塩基性化した。得られた混合物を室温で終夜撹拌し、濾過した。濾液を濃縮して、ビス（６－メトキシ－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）メタンを白色の固体として得た（２３ｇ、収率１００％）。

【0438】

ステップ２：ビス（６－メトキシ－３，４－ジヒドロイソキノリン－２（１Ｈ）－イル）メタン（２８ｇ、８２．７３ｍｍｏｌ）のｉ－ＰｒＯＨ（２００ｍＬ）中懸濁液に、０℃で濃ＨＣｌ（１５．２０ｇ、１８２．０１ｍｍｏｌ、１５．３ｍＬ）を滴下添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。ＭＴＢＥ（７０ｍＬ）を上記混合物に加え、懸濁液を室温で更に４時間撹拌した。濾過した後、ケーキをＭＴＢＥ／ｉ－ＰｒＯＨの混合物（１００ｍＬ、１／１ｖ／ｖ）で洗浄し、乾燥して、６－メトキシ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン塩酸塩を白色の固体として得、これをＤＣＭ（３００ｍＬ）に懸濁した。混合物に飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（５００ｍＬ）を加え、混合物を室温で２時間撹拌した。分離した後、水性層をＤＣＭ（５０ｍＬ×４）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、濃縮して、６－メトキシ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリンを黄色の油状物として得た（１０ｇ、収率７５％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１６４［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0439】

ステップ３：６－メトキシ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（１．６３ｇ、９．９９ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）中溶液に、室温でホルムアルデヒド水溶液（３７％ｗ／ｗ、４．８ｇ、５９．９２ｍｍｏｌ、１．６７ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１５分間撹拌し、０℃に冷却し、これにＮａＢＨ_４（１．１３ｇ、２９．９６ｍｍｏｌ）を一部ずつ加えた。混合物を室温で３時間撹拌し、氷水（１０ｍＬ）を用いてクエンチし、ＤＣＭ（２０ｍＬ×５）で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１ｖ／ｖ）で精製して、６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリンを黄色の油状物として得た（１．７ｇ、収率９６％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１７８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0440】

ステップ４：予め冷却した（０℃）濃硫酸の溶液（４ｍＬ）に、０℃で６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（２ｇ、１１．２８ｍｍｏｌ）およびグアニジン硝酸塩（１．１７ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）を順次加えた。得られた混合物を０℃で３０分間撹拌し、氷水（２０ｍＬ）を用いてクエンチし、ＮａＯＨ水溶液（４Ｎ）でｐＨ１０～１１に塩基性化し、ＤＣＭ（５０ｍＬ×４）で抽出した。合わせた有機層を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＰＥ１００％ｖ／ｖ、ＰＥ／ＥＡ＝１／１ｖ／ｖ、ＥＡ１００％ｖ／ｖ、次いでＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０／１、ｖ／ｖ）で精製して、６－メトキシ－２－メチル－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリンを黄色の固体として得た（０．９ｇ、収率３６％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２２３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0441】

ステップ５：６－メトキシ－２－メチル－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（－ｔｅｔｒｏｈｙｄｒｏｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（４．２ｇ、１４．４０ｍｍｏｌ）のＥＡ（３２ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（１６ｍＬ）およびＥｔＯＨ（１４４ｍＬ）中溶液に、Ｆｅ粉（５．５ｇ、９３．９９ｍｍｏｌ）および塩化アンモニア（７９３．９６ｍｇ、１３．０８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６０℃で４８時間撹拌し、室温に冷却し、濾過した。ケーキをメタノール（３０ｍＬ×３）で洗浄し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０／１から１０／１ｖ／ｖ）で精製して、６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－アミン塩酸塩を黄色の固体として得た（４．５ｇ、収率１００％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0442】

代替合成方法：

【0443】

【化14】

【0444】

ステップ１：トリエチルアミン（１３．３８ｇ、１３２．２７ｍｍｏｌ、１８．４４ｍＬ）、２－（３－メトキシフェニル）エタンアミン（１０ｇ、６６．１３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（８０７．９６ｍｇ、６．６１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）中溶液に、０℃でＢｏｃ_２Ｏ（１５．８８ｇ、７２．７５ｍｍｏｌ、１６．７０ｍＬ）をゆっくり加えた。次いで混合物を室温で１６時間撹拌し、氷水（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、真空で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、石油エーテル／酢酸エチル＝１０／１）で精製して、ｔｅｒｔ－ブチル（３－メトキシフェネチル）カルバメート（１４．６ｇ、収率７９．０６％、純度９０％）を無色液体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９６［Ｍ＋Ｈ－５６］^＋。

【0445】

ステップ２：ｔｅｒｔ－ブチル（３－メトキシフェネチル）カルバメート（７ｇ、２７．８５ｍｍｏｌ）および２－クロロピリジン（４．７４ｇ、４１．７８ｍｍｏｌ、３．９２ｍＬ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（５０ｍＬ）中溶液に、－７８℃でＴｆ_２Ｏ（８．６４ｇ、３０．６４ｍｍｏｌ、５．１５ｍＬ）のＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）中溶液を加えた。２０分後、ＢＨ_３・Ｅｔ_２Ｏ（１９．７７ｇ、１３９．２６ｍｍｏｌ）を上記溶液に滴下添加した。次いで反応混合物を室温に加温し、２時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液を用いて注意深くクエンチした。得られた混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で脱水し、濾過し、真空で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、石油エーテル／酢酸エチル／メタノール＝５／１／０から１０／１０／１）で精製して、６－メトキシ－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（３．４ｇ、収率６８．８９％）を灰白色の固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１７８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0446】

ステップ３：６－メトキシ－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（３．８ｇ、２１．４４ｍｍｏｌ、９．６２ｍＬ）の濃Ｈ_２ＳＯ_４（５０ｍＬ）中溶液に、－２０℃でＨＮＯ_３（２．１６ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ、純度６５％）を滴下添加した。混合物を－２０℃～－２５℃で３時間撹拌し、氷水（３００ｍＬ）中に注ぎ入れた。水性層をジクロロメタン（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を真空で濃縮し、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２、石油エーテル／酢酸エチル／メタノール＝１０／１／０～１０／１０／１）で精製して、６－メトキシ－７－ニトロ－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（２．０２ｇ、収率４０．７８％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２２３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0447】

ステップ４：６－メトキシ－７－ニトロ－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン（２．０２ｇ、９．０９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）中溶液に、１Ｍ ＢＨ_３／ＴＨＦ（４５．４６ｍｍｏｌ、４５．５ｍＬ）を加えた。混合物を還流下で２０時間撹拌し、メタノール（３０ｍＬ）を用いて注意深くクエンチした。得られた溶液を真空で濃縮した。残渣を２Ｎ ＨＣｌ（５０ｍＬ）中８０℃で３時間加熱し、冷却し、水酸化アンモニウム水溶液で塩基性化し、ジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮して、６－メトキシ－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（１．８９ｇ、収率１００．００％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２０９［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0448】

ステップ５：６－メトキシ－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（１．８９ｇ、９．０８ｍｍｏｌ、９．６２ｍＬ）のメタノール（３０ｍＬ）中溶液に、室温でホルムアルデヒド（１．６４ｇ、５４．４６ｍｍｏｌ、１．５１ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１５分間撹拌し、０℃に冷却した。次いでＮａＢＨ_４（１．０３ｇ、２７．２３ｍｍｏｌ）を上記混合物に一部ずつ加えた。得られた混合物を室温で３時間撹拌し、氷水（１０ｍＬ）を用いてクエンチし、ＤＣＭ（２０ｍＬ×５）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１、ｖ／ｖ）で精製して、６－メトキシ－２－メチル－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（１．４ｇ、収率６９．４０％）を黄色の油状物として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：２２３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0449】

ステップ６：６－メトキシ－２－メチル－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（１．３ｇ、５．８５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＡｃ（２ｍＬ）、Ｈ_２Ｏ（１ｍＬ）およびＥｔＯＨ（１０ｍＬ）中溶液に、Ｆｅ（２．１９ｇ、３９．１９ｍｍｏｌ）および塩化アンモニア（２８４．７４ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を６０℃で１６時間撹拌し、室温に冷却し、濾過した。ケーキをメタノール（３０ｍＬ×３）で洗浄し、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０／１から１０／１ｖ／ｖ）で精製して、６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－アミン塩酸塩を黄色の固体として得た（０．８５ｇ、収率７５．６％）。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：１９３［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0450】

中間体３

【0451】

【化15】

【0452】

６－フルオロ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－アミン

【0453】

【化16】

【0454】

ステップ１：６－フルオロ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－イソキノリン－１－オン（２０．０ｇ、１２１．０９ｍｍｏｌ）のＨ_２ＳＯ_４（１６０ｍＬ）中混合物を－５℃に冷却し、硝酸カリウム（１２．８５ｇ、１２７．１５ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。得られた混合物を同じ温度で４時間撹拌し、氷水中に注ぎ入れた。固体を濾過により収集し、水で洗浄し、真空で乾燥して、６－フルオロ－７－ニトロ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－イソキノリン－１－オン（２５．２ｇ、１１９．９１ｍｍｏｌ、収率９９．０％）を白色固体として得た。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.46 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.33 (d, J = 27.5 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.43 (td, J = 6.6, 2.8 Hz, 2H), 3.04 (t, J = 6.5 Hz, 2H).ＬＣＭＳ（ＥＳＩ^＋）［（Ｍ＋Ｈ）^＋］：２１１。

【0455】

ステップ２：６－フルオロ－７－ニトロ－３，４－ジヒドロ－２Ｈ－イソキノリン－１－オン（２５．２ｇ、１１９．９１ｍｍｏｌ）に１Ｍボランテトラヒドロフラン（５９９．５４ｍｍｏｌ、６００ｍＬ）を加えた。混合物を還流下で２０時間撹拌し、室温に冷却し、メタノール（１５０ｍＬ）を用いて注意深くクエンチした。得られた溶液を真空で濃縮した。残渣を２Ｎ ＨＣｌ水溶液（５００ｍＬ）中８０℃で３時間撹拌し、室温に冷却し、水酸化アンモニウム溶液でｐＨ８～９に塩基性化し、ジクロロメタン（５００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を真空で濃縮して、６－フルオロ－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（２２．３ｇ、１１３．６７ｍｍｏｌ、収率９４．８％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ^＋）［（Ｍ＋Ｈ）^＋］：１９７。

【0456】

ステップ３：６－フルオロ－７－ニトロ－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン（２２．３ｇ、１１３．６７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（５００ｍＬ）中溶液にホルムアルデヒド（２０．４８ｇ、６８２．０３ｍｍｏｌ）を室温で加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、０℃に冷却した。この混合物をトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（９６．３７ｇ、４５４．６９ｍｍｏｌ）を一部ずつ加えた。得られた混合物を室温で３６時間撹拌し、氷水（４００ｍＬ）を用いてクエンチし、ＤＣＭ（６００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１ ｖ／ｖ）で精製して、６－フルオロ－２－メチル－７－ニトロ－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン（２１．３ｇ、１０１．３３ｍｍｏｌ、収率８９．１％）を黄色油状物として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ^＋）［（Ｍ＋Ｈ）^＋］：２１１。

【0457】

ステップ４：６－フルオロ－２－メチル－７－ニトロ－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン（２１．３ｇ、１０１．３３ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２１３ｍＬ）およびＨ_２Ｏ（４０ｍＬ）中溶液に、塩化アンモニウム（３７．２２ｇ、７０９．３１ｍｍｏｌ）および鉄粉末（５６．５９ｇ、１．０１ｍｏｌ、７．２０ｍＬ）を加えた。混合物を６０℃で３時間撹拌し、室温に冷却し、濾過した。固体ケーキをメタノール（１００ｍＬ×２）で洗浄し、濾液を真空で濃縮した。残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０／１～１０／１ ｖ／ｖ）で精製して、６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－アミン（１７．３ｇ、９５．９９ｍｍｏｌ、収率９４．７％）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ^＋）［（Ｍ＋Ｈ）^＋］：１８１。

【0458】

実施例１

【0459】

【化17】

【0460】

２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸
ステップ１：中間体１（６７ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）のｎ－ＢｕＯＨ（３ｍＬ）中混合物に２，４，５－トリクロロピリミジン（４５．５ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９６．１９ｍｇ、０．７４４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。混合物を１００℃で１６時間撹拌し、氷冷水（２０ｍＬ）を用いてクエンチし、ＥＡ（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＰＥ＝０から１００％）で精製して、メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（８０ｍｇ、収率８３．３％）を黄色固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３５２［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0461】

ステップ２：メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（８０ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）のｉ－ＰｒＯＨ（５ｍＬ）中混合物に、中間体２（５１．５ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）およびＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ（４３．２ｍｇ、０．２２７ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。混合物を１００℃で１６時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）を用いてクエンチし、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ＝１０／１、３０ｍＬ×３）で抽出した。有機相をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝０から１５％）で精製して、メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（７０ｍｇ、収率４２．５％）を黄色固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０８［Ｍ＋Ｈ］^＋。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.26 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.59 (s, 1H), 7.30 (t, J = 8.8 Hz, 2H), 7.12 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 4.38 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.05 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.50 (s, 3H), 3.27 (s, 2H), 2.78 (dd, J = 10.3, 4.8 Hz, 3H), 2.68 (s, 1H), 2.55 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.30 (s, 3H), 1.36 (s, 3H).
ステップ３：メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（７０ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）およびＬｉＯＨ水溶液（２Ｎ、１ｍＬ）のＴＨＦ（５ｍＬ）中混合物を、室温で１６時間撹拌し、ギ酸でｐＨ約５に調整し、ＤＣＭ（３０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ／１０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３、０．０２５％ＮＨ_３・Ｈ_２Ｏ）により精製して、２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸（２３．０ｍｇ、収率４６．２％）を白色の固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４９４［Ｍ＋Ｈ］^＋。¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8.25 (s, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.29 (dd, J = 17.2, 7.6 Hz, 2H), 7.11 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 4.42 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.30 (s, 2H), 2.78 (s, 2H), 2.69 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 2.58 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.34 (s, 3H).
実施例２および３

【0462】

【化18】

【0463】

（Ｒ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸および（Ｓ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸
方法１：
ステップ１：メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（１５７ｍｇ）をＳＦＣキラル分離して、（Ｒ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートおよび（Ｓ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（６７ｍｇ、６３ｍｇ）を各々得た。立体化学は完全には決定されなかった。

【0464】

成分はピーク１に対応する：（Ｒ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートまたは（Ｓ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０８［Ｍ＋Ｈ］^＋。キラル－ＨＰＬＣ保持時間：１．８２９分；ｅｅ値：９８．３％。

【0465】

成分はピーク１に対応する：（Ｓ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートまたは（Ｒ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０８［Ｍ＋Ｈ］^＋。キラルＨＰＬＣ保持時間：３．４２７分；ｅｅ値：＞９９％。

【0466】

ＳＦＣ分離条件：
装置：ＳＦＣ－８０（Ｔｈａｒ、Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：ＡＤ－Ｈ ２０^＊２５０ｍｍ、１０μｍ（Ｄａｉｃｅｌ）
カラム温度：３５℃
移動相：ＣＯ_２／ＥｔＯＨ（０．２％メタノール／アンモニア）＝５０／５０
流速：８０ｇ／分
逆圧：１００ｂａｒ
検出波長：２１４ｎｍ
サイクル時間：６．９分
ステップ２：（Ｒ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートおよび（Ｓ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートを、実施例１のステップ３と同様の条件下で各々加水分解して、（Ｒ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸および（Ｓ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸（各々１７．６ｍｇ、３３．８ｍｇ）を得た。

【0467】

実施例２：（（Ｒ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸または（Ｓ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸）は、方法１のステップ１におけるＳＦＣ分離のピーク１に由来する生成物に対応する。

【0468】

ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４９４［Ｍ＋Ｈ］^＋。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.25 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.57 (s, 1H), 7.30 (dd, J = 13.7, 7.7 Hz, 2H), 7.11 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 6.97 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 4.42 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.30 (s, 2H), 2.78 (s, 2H), 2.69 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 2.62-2.54 (m, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.34 (s, 3H).
キラルＨＰＬＣ保持時間：１．３８４分；ｅｅ値：＞９９％。

【0469】

実施例３：（（Ｓ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸または（Ｒ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸）は、方法１のステップ１におけるＳＦＣ分離のピーク２に由来する生成物に対応する。

【0470】

ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４９４［Ｍ＋Ｈ］^＋。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.25 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.29 (dd, J = 13.6, 7.4 Hz, 2H), 7.10 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 6.97 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.75 (s, 1H), 4.41 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.02 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.29 (s, 2H), 2.77 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.69 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 2.57 (dd, J = 13.1, 7.1 Hz, 3H), 2.30 (d, J = 11.1 Hz, 3H), 1.34 (s, 2H).
キラルＨＰＬＣ保持時間：１．１３２分；ｅｅ値：＞９９％。

【0471】

方法２：
ステップ１：メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートをＳＦＣキラル分離して、（Ｒ）－メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートおよび（Ｓ）－メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートを得た。

【0472】

成分はピーク１に対応する：ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３５２［Ｍ＋Ｈ］^＋。キラル－ＨＰＬＣ保持時間：１．１９１分（ピーク１）；ｅｅ値：＞９９％。
成分はピーク２に対応する：ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：３５２［Ｍ＋Ｈ］^＋。キラル－ＨＰＬＣ保持時間：１．５１９分（ピーク２）；ｅｅ値：＞９９％。

【0473】

ＳＦＣ分離条件：
装置：ＳＦＣ－８０（Ｔｈａｒ、Ｗａｔｅｒｓ）
カラム：ＡＤ－Ｈ ２０^＊２５０ｍｍ、１０μｍ（Ｄａｉｃｅｌ）
カラム温度：３５℃
移動相：ＣＯ_２／イソプロパノール（０．２％メタノール／アンモニア）＝８７／１３
流速：８０ｇ／分
逆圧：１００ｂａｒ
検出波長：２１４ｎｍ
サイクル時間：２．８分
（Ｒ）－メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートおよび（Ｓ）－メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートを得るためのメチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートのＳＦＣキラル分離の追加の大きなバッチを、同様または同一の条件下で行った。
（ステップ２および３の代表例としての１つの立体異性体）
ステップ２：中間体２（１．３６ｇ、５．９６ｍｍｏｌ）、（Ｓ）－メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートまたは（Ｒ）－メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（２．１ｇ、５．９６ｍｍｏｌ、方法２のステップ１のＳＦＣ分離のピーク２に由来した）、およびＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ（１．１３ｇ、５．９６ｍｍｏｌ）のｔ－ブタノール（２５ｍＬ）中混合物を１００℃で１２時間撹拌し、室温で冷却し、飽和ａＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）中に注ぎ入れ、ＥＡ（３０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝２０：１）で精製して、（Ｓ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートまたは（Ｒ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（１．８ｇ、収率５６．３％）を明黄色固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：５０８［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0474】

ステップ３：水酸化リチウム水和物（２６４ｍｇ、６．３ｍｍｏｌ）の水（５ｍＬ）中溶液および（Ｓ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートまたは（Ｒ）－メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（１．６ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）中混合物を室温で１６時間撹拌し、酢酸でｐＨ約３に酸性化した。得られた混合物を分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ／１０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）で精製して、実施例３：（（Ｓ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸または（Ｒ）－２－（１－（５－クロロ－２－（（６－メトキシ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸）（８３９．３ｍｇ、収率５３．９％）を淡黄色固体として得、これは、方法２のステップ１のＳＦＣ分離のピーク２に由来した。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４９４［Ｍ＋Ｈ］^＋。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.30 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.16 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.48 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.08 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.83 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.74 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 2.66-2.59 (m, 3H), 2.37 (s, 3H), 1.40 (s, 3H).
キラルＨＰＬＣ保持時間：１．１３２分；ｅｅ値：＞９９％。

【0475】

実施例４

【0476】

【化19】

【0477】

２－（１－（５－クロロ－２－（（６－フルオロ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸
ステップ１：メチル２－（１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテート（１９５．４ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、中間体３（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）およびＴｓＯＨ・Ｈ_２Ｏ（１０５．５ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）のｉ－ＰｒＯＨ（４ｍＬ）中溶液を、１２０℃で１６時間撹拌し、室温に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液でｐＨ約８に中和した。混合物をＤＣＭ／ＭｅＯＨ（ｖ／ｖ、１０／１、２０ｍＬ×３）で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝１０／１）により精製して、メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－フルオロ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートおよびイソプロピル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－フルオロ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートの混合物（４４０ｍｇ）を薄黄色の固体として得、これを更には精製せずに次のステップに使用した。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４９６（メチルエステル）、５２４（イソプロピルエステル）［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【0478】

ステップ３：メチル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－フルオロ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートおよびイソプロピル２－（１－（５－クロロ－２－（（６－フルオロ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）アセテートの混合物（２２０ｍｇ）ならびにＬｉＯＨ水溶液（２Ｎ、４ｍＬ）のＴＨＦ（４ｍＬ）中混合物を、室温で５時間および５０℃で１６時間撹拌し、ギ酸でｐＨ約５に調整し、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０／１、２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣ（ＭｅＣＮ／１０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３）により精製して、２－（１－（５－クロロ－２－（（６－フルオロ－２－メチル－１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリン－７－イル）アミノ）ピリミジン－４－イル）－３－メチルインドリン－３－イル）酢酸（２６．５ｍｇ、収率１２．４％）を白色の固体として得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：４８２［Ｍ＋Ｈ］^＋。¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 8.93 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.35-7.24 (m, 3H), 7.07-6.92 (m, 3H), 4.41 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.03 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 3.36 (s, 2H), 2.78 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 2.68 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 2.60-2.54 (m, 3H), 2.32 (s, 3H), 1.33 (s, 3H).
実施例５および６

【0479】

【化20】

【0480】

実施例２および３の方法２が続いた。
ステップ１：実施例２および３の方法２のステップ１に記載される（（Ｒ）－メチル２－［１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチル－インドリン－３－イル］アセテートまたは（Ｓ）－メチル２－［１－（２，５－ジクロロピリミジン－４－イル）－３－メチル－インドリン－３－イル］アセテート）（２７．８ｇ、７８．９３ｍｍｏｌ）の第１の溶離液（ピーク１）のｎ－ブタノール（無水、９９．９％、６００ｍＬ）中溶液に、６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－アミン（中間体３、１７．０７ｇ、９４．７１ｍｍｏｌ）および４－メチルベンゼンスルホン酸（１４．９５ｇ、８６．８２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０℃で２０時間撹拌した。ＬＣＭＳで判断して反応の完了後、反応混合物を室温に冷却し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）を用いてクエンチし、ＤＣＭ（６００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝５０／１から１０／１ ｖ／ｖ）で精製して、（Ｒ）－メチル２－［１－［５－クロロ－２－［（６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－イル）アミノ］ピリミジン－４－イル］－３－メチル－インドリン－３－イル］アセテートまたは（Ｓ）－メチル２－［１－［５－クロロ－２－［（６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－イル）アミノ］ピリミジン－４－イル］－３－メチル－インドリン－３－イル］アセテート（２２．６ｇ、４５．５７ｍｍｏｌ、収率５７．７％、ブチルエステルと混合）を黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ^＋）［（Ｍ＋Ｈ）^＋］：４９６。

【0481】

ステップ２：（Ｒ）－メチル２－［１－［５－クロロ－２－［（６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－イル）アミノ］ピリミジン－４－イル］－３－メチル－インドリン－３－イル］アセテートまたは（Ｓ）－メチル２－［１－［５－クロロ－２－［（６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－イル）アミノ］ピリミジン－４－イル］－３－メチル－インドリン－３－イル］アセテート（２２．６ｇ、４５．５７ｍｍｏｌ）および水酸化リチウム水溶液（５．４６ｇ、２２７．８３ｍｍｏｌ）（Ｈ_２Ｏ中１Ｎ）のＴＨＦ（２００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１００ｍＬ）中混合物を、ＬＣＭＳにより示される通り反応が完了するまで２５℃で６時間撹拌した。ｐＨを０℃で、ＦＡで５～６に調節し、ＤＣＭ（５００ｍＬ×３）中１０％ＭｅＯＨで抽出した。有機相を無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、濾過した。濾液を真空で濃縮し、残渣を（２０ｇ、純度８０～９０％）を分取ＨＰＬＣ（ＮＨ_４ＨＣＯ_３）で精製して、実施例５（（Ｒ）－２－［１－［５－クロロ－２－［（６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－イル）アミノ］ピリミジン－４－イル］－３－メチル－インドリン－３－イル］酢酸または（Ｓ）－２－［１－［５－クロロ－２－［（６－フルオロ－２－メチル－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－イソキノリン－７－イル）アミノ］ピリミジン－４－イル］－３－メチル－インドリン－３－イル］酢酸）（９．６ｇ、１９．９２ｍｍｏｌ、収率４３．７％）を明黄色固体として得た。ＬＣＭＳ（ＥＳＩ^＋）［（Ｍ＋Ｈ）^＋］：４８２。旋光度：－７．２４（溶媒：ＣＡＮ中１％ＤＥＡ：水＝５０：５０；濃度：０．３ｇ／１００ｍＬ；温度：２５℃）。キラル－ＨＰＬＣ保持時間：１３．９６２分（カラム条件：ＣｏｌｕｍｎＩＧ（４．６×２５０ｍｍ ５μｍ）；移動相：ｎ－ヘキサン（０．１％ＤＥＡ）：ＥｔＯＨ（０．１％ＤＥＡ）＝８０：２０；波長：２２５ｎｍ；流量：１．０ｍｌ／分；温度：４０℃）。実施例５は、より強力な生成物をもたらした実施例２および３の方法２におけるステップ１のＳＦＣ分離のピーク１に由来した生成物に対応する。

【国際調査報告】