特表 2023-534054 細胞透過性ペプチドおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-07

(54)【発明の名称】細胞透過性ペプチドおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20230731BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20230731BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20230731BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230731BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230731BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230731BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230731BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20230731BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20230731BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20230731BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20230731BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K14/00 ZNA

C07K19/00

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K47/64

A61K47/65

A61K47/68

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023503066

(86)(22)【出願日】2021-07-13

(85)【翻訳文提出日】2023-03-14

(86)【国際出願番号】 CN2021106043

(87)【国際公開番号】W WO2022012539

(87)【国際公開日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】202010692443.7

(32)【優先日】2020-07-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516118327

【氏名又は名称】養生堂有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＹＡＮＧ ＳＨＥＮＧ ＴＡＮＧ ＣＯＭＰＡＮＹ， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】ＲＯＯＭ ２０５， ＮＯ． １７ ＬＵＮＤＵ ＲＯＡＤ， ＳＨＵＡＮＧＰＵ ＴＯＷＮ， ＸＩＨＵ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＨＡＮＧＺＨＯＵ， ＺＨＥＪＩＡＮＧ ３１００００， ＰＥＯＰＬＥ’Ｓ ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＣＨＩＮＡ

(71)【出願人】

【識別番号】504458976

【氏名又は名称】厦▲門▼大学

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】袁 權

(72)【発明者】

【氏名】王 邵 娟

(72)【発明者】

【氏名】粘 晟

(72)【発明者】

【氏名】魏 敏

(72)【発明者】

【氏名】張 雅 麗

(72)【発明者】

【氏名】王 楷

(72)【発明者】

【氏名】陳 毅 ▲シン▼

(72)【発明者】

【氏名】張 天 英

(72)【発明者】

【氏名】葛 勝 祥

(72)【発明者】

【氏名】夏 寧 邵

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4H045AA10

4H045AA11

4H045BA19

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

タンパク質、抗体、核酸などの様々な生物学的高分子を膜を介して細胞内に送達することができる細胞透過性ペプチドを提供する。加えて、細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質、コンジュゲートおよび複合体、並びに細胞透過性ペプチドの使用がさらに提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞透過性ペプチドまたはその切断型であって、前記細胞透過性ペプチドは、式Ｉによって表される構造：
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＰＲＲＲＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＰＲＲＲＲＸ_２４ＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式Ｉ
を有し、式中、
Ｘ_１～Ｘ_３は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、ＫまたはＨ）から選択され、
Ｘ_４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_１０は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、ＫまたはＨ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_１８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_２４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_２６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３２は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～１０個（例えば、１～５個）のアミノ酸残基が切断され、および／またはＣ末端で１～１４個（例えば、１～８個）のアミノ酸残基が切断され、
前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）の細胞内への膜貫通送達を行うことができる、
細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項2】

（１）Ｘ_１～Ｘ_３が、各々独立して、アミノ酸残基Ｒ、ＫおよびＨからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１～Ｘ_３が、各々独立して、アミノ酸残基ＲおよびＫからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１～Ｘ_３が、各々独立して、アミノ酸残基Ｒである；
（２）Ｘ_４が、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_４が、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_４が、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、ＧおよびＫからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_４が、アミノ酸残基Ｒ、ＣおよびＧからなる群から選択される；
（３）Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、ＣおよびＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｒ、ＮおよびＧからなる群から選択される；
（４）Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＣおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、ＣおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、ＰおよびＳからなる群から選択される；
（５）Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択される；
（６）Ｘ_８が、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_８が、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｖ、ＬおよびＩからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_８が、アミノ酸残基ＲおよびＡからなる群から選択される；
（７）Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、ＳおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｇ、ＰおよびＴからなる群から選択される；
（８）Ｘ_１０が、アミノ酸残基Ｒ、ＫおよびＨからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１０が、アミノ酸残基ＲおよびＫからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１０が、アミノ酸残基Ｒである；
（９）Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択される；
（１０）Ｘ_１６が、アミノ酸残基Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１６が、アミノ酸残基Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＳおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１６が、アミノ酸残基ＴおよびＳからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１６が、アミノ酸残基Ｔである；
（１１）Ｘ_１７が、アミノ酸残基Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１７が、アミノ酸残基Ｐである；
（１２）Ｘ_１８が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８が、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８が、アミノ酸残基ＳおよびＱからなる群から選択される；
（１３）Ｘ_２４が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_２４が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_２４が、アミノ酸残基ＳおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_２４が、アミノ酸残基Ｓである；
（１４）Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、ＣおよびＱからなる群から選択される；
（１５）Ｘ_３２が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２が、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される；
（１６）Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＲからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、ＮおよびＲからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基ＱおよびＫからなる群から選択される；
（１７）Ｘ_３４が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３４が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３４が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３４が、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される；
（１８）Ｘ_３５が、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３５はアミノ酸残基Ｒ、Ｐ、ＫおよびＨからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３５が、アミノ酸残基Ｒ、ＰおよびＫからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３５が、アミノ酸残基ＲおよびＰからなる群から選択される；
（１９）Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択される；
（２０）Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、ＳおよびＣからなる群から選択される；
（２１）Ｘ_３８が、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３８が、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３８が、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、ＮおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３８が、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される；および
（２２）Ｘ_３９が、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３９が、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３９が、アミノ酸残基Ｃ、ＳおよびＮからなる群から選択される；
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項１に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項3】

前記細胞透過性ペプチドが、式ＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式ＩＩ
を有し、式中、
Ｘ_４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３２は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、と
Ｘ_３９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドが、式ＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式ＩＩ
を有し、式中、
Ｘ_４は、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇからなる群から選択され、
Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇからなる群から選択され、
Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓからなる群から選択され、
Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑからなる群から選択され、
Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａからなる群から選択され、
Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔからなる群から選択され、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｑからなる群から選択され、
Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃからなる群から選択され、
Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋからなる群から選択され、
Ｘ_３４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃからなる群から選択され、
Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐからなる群から選択され、
Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａからなる群から選択され、
Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃからなる群から選択され、
Ｘ_３８は、アミノ酸残基Ｑ、Ｓからなる群から選択され、
Ｘ_３９は、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎからなる群から選択される、
請求項１または２に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項4】

前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基（例えば、１～５個のアミノ酸残基）が切断され、および／またはＣ末端で１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１～８個のアミノ酸残基）が切断され、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基が切断され、例えば、Ｎ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基が切断され、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｃ末端で１～１４個のアミノ酸残基、例えば、Ｃ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸残基が切断され、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基（例えば、１～５個のアミノ酸残基）が切断され、Ｃ末端で１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１～８個のアミノ酸残基）が切断され、例えば、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で５または１０個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端で１～８個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６または８個のアミノ酸残基）が切断され、
例えば、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基（例えば、２、３、５または１０個のアミノ酸残基）が切断され、Ｃ末端では切断されていないか、または１～８個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６または８個のアミノ酸残基）が切断され、
例えば、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で５個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端で１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６、８または１４個のアミノ酸残基）が切断され、
例えば、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～５個のアミノ酸残基（例えば、２、３または５個のアミノ酸残基）が切断され、前記切断型は、Ｃ末端では切断されていないか、または１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６、８または１４個のアミノ酸残基）が切断されないか、または切断され、
例えば、前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｃ末端で１４個のアミノ酸残基が切断され、Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｃである、
請求項１～３のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項5】

前記細胞透過性ペプチドが、式ＩＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＧＸ_５Ｘ_６ＲＸ_８Ｘ_９ＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２ＱＸ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７ＳＮＣ
式ＩＩＩ
を有し、式中、
Ｘ_５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドまたはその前記切断型が、
（１）Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｎ、Ｇ、ＣおよびＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_５が、アミノ酸残基ＮおよびＧからなる群から選択される；
（２）Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基残基Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、ＣおよびＴからなる群から選択され、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｐ、ＳおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基ＰおよびＳからなる群から選択される；
（３）Ｘ_８が、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_８が、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｖ、ＬおよびＩからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_８が、アミノ酸残基ＲおよびＡからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_８が、アミノ酸残基Ａである；
（４）Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｐ、ＴおよびＳからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_９が、アミノ酸残基ＰおよびＴからなる群から選択される；
（５）Ｘ_３２およびＸ_３４が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２およびＸ_３４が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２およびＸ_３４が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２およびＸ_３４が、各々独立して、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２およびＸ_３４が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓである；
（６）Ｘ_３５が、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３５が、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、ＫおよびＨからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３５が、アミノ酸残基Ｒ、ＰおよびＫからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３５が、アミノ酸残基ＲおよびＰからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３５が、アミノ酸残基Ｐである；
（７）Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ａである；および
（８）Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、ＳおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基ＰおよびＳからなる群から選択される；
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有し、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドが、配列番号２０～２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項6】

前記切断型が、式ＩＶによって表される構造：
Ｘ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６
式ＩＶ
を含み、式中、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_２６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
好ましくは、前記切断型が、
（１）Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択される；
（２）Ｘ_１８が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８が、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８が、アミノ酸残基ＳおよびＱからなる群から選択される；ならびに
（３）Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、ＣおよびＱからなる群から選択される；
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有する、
請求項１または２に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項7】

式Ｖによって表される構造：
Ｘ_６Ｘ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＸ_３２
式Ｖ
を含み、式中、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｎ）から選択され、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ａ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３２は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
好ましくは、前記切断型が、
（１）Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、ＣおよびＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基ＲおよびＧからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒから選択される；
（２）Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒから選択される；
（３）Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される；
（４）Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立してアミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される；および
（５）Ｘ_３２が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２が、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される；
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有する、
請求項１または２に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項8】

前記切断型が、式ＶＩによって表される構造：
Ｘ_６Ｘ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＳＸ_３３ＳＲＸ_３６Ｘ_３７
式ＶＩ
を含み、式中、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｎ）から選択され、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ａ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
好ましくは、前記切断型が、
（１）Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、ＣおよびＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基ＲおよびＧからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒから選択される；
（２）Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒから選択される；
（３）Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される；
（４）Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される；
（５）Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＲからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、ＮおよびＲからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基ＱおよびＫからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑから選択される；
（６）Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅから選択される；および
（７）Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３７が、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される；
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有する、
請求項１または２に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項9】

前記切断型が、式ＶＩＩによって表される構造：
ＲＸ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４ＲＸ_３６Ｘ_３７ＱＸ_３９
式ＶＩＩ
を含み、式中、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ａ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
好ましくは、前記切断型が、
（１）Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_７が、アミノ酸残基ＲおよびＱからなる群から選択される；
（２）Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_１１が、アミノ酸残基ＡおよびＳからなる群から選択される；
（３）Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から各々独立して選択される。好ましくは、Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９が、各々独立して、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される；
（４）Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＲからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、およびＲからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３３が、アミノ酸残基ＱおよびＫからなる群から選択される；および
（５）Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択され、好ましくは、Ｘ_３６が、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択される；
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有し、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型が、配列番号１０～１３、１５、１７～１８、２０～２１、２３～２９および３２～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、
請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型および目的のペプチドを含む融合タンパク質であって、
好ましくは、前記目的のペプチドが、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に直接共有結合で連結されているか、またはペプチドリンカー（例えば、フレキシブルなペプチドリンカー）を介して共有結合で連結されており、
好ましくは、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型が、前記目的のペプチドのＮ末端に（任意選択によりペプチドリンカーを介して）またはＣ末端に（任意選択によりペプチドリンカーを介して）連結されており、
好ましくは、前記目的のペプチドが、抗体であり、好ましくは、前記抗体が、抗ＨＢＶ抗体（例えば、抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、抗ＨＢｅＡｇ抗体など）、抗インフルエンザウイルス抗体（例えば、抗ＨＡ１抗体、抗ＨＡ２抗体）、抗腫瘍抗原抗体（例えば、抗ｐ５３抗体、抗ｋｒａｓ抗体、抗ＰＲＬ－３抗体）、抗免疫チェックポイント抗体（例えば、抗ＰＤ１またはＰＤＬ１抗体）、抗メラニン合成関連抗体（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質ＴＹＲＰ１抗体）、抗新型コロナウイルス抗体（例えば、抗Ｓタンパク質ＲＢＤまたはＳ１もしくはＳ２抗体などの抗新型コロナウイルスＳタンパク質抗体）からなる群から選択され、
好ましくは、前記目的のペプチドが、遺伝子編集に関連するタンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＦｌｉｐリコンビナーゼからなる群から選択され、
好ましくは、前記目的のペプチドが、活性タンパク質または追跡可能なタンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、毒素タンパク質（例えば、エンドトキシン）、サイトカイン（例えば、ＩＬ１０またはＩＦＮγなどのインターロイキンまたはインターフェロン）、免疫調節タンパク質（例えば、ＰＤ１）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メチラーゼ、プロテインキナーゼなど）、シグナル伝達経路関連分子タンパク質（例えば、β－カテニンタンパク質）、サイクリン（例えば、サイクリンＤ１タンパク質）、転写活性化因子および転写阻害剤からなる群から選択され、
好ましくは、前記目的のペプチドが、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮタンパク質）からなる群から選択され、
好ましくは、前記目的のペプチドが、配列番号１、６～７、４３～４４および４６～５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記融合タンパク質が、追加のドメインをさらに含み、好ましくは、前記融合タンパク質が、タグドメイン（例えば、６^＊Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ハプテンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグなど）、および／または抗体重鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、前記追加のドメイン（例えば、タグドメイン）が、前記融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端に位置する、
融合タンパク質。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか一項に記載の前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型と、目的の分子（例えば、目的のタンパク質または目的の核酸）とを含むコンジュゲートであって、
好ましくは、前記目的の分子が、前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に直接共有結合で連結されているか、もしくはリンカー（例えば、二官能性リンカーまたはペプチドリンカー）を介して共有結合で連結されているか、または前記目的の分子が、前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に非共有結合で連結されており、
好ましくは、前記目的の分子が、検出可能な標識、例えば、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼまたはβ－Ｄガラクトシダーゼ）、安定同位体または放射性同位体、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または金であり、
好ましくは、前記目的の分子が、細胞傷害剤、例えば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、イペカミン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジケトン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、ｌ－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－メルカプトグアニン、シトシンアラビノシド、５－フルオロウラシルデクルブジン（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｃｒｂｚｉｎｅ））、アルキル化剤（例えば、ムスチン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＤＤＰ））、アントラサイクリン（例えば、イダルビシン（以前はダウノルビシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ゲンシャムマイシン（ｇｅｎｓｈａｍｍｙｃｉｎ）（以前はアクチノマイシンとして既知）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンチアマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）であり、
好ましくは、前記目的の分子が、タンパク質またはポリペプチドであり、
好ましくは、前記目的の分子が、抗体であり、好ましくは、前記抗体が、抗ＨＢＶ抗体（例えば、抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、抗ＨＢｅＡｇ抗体など）、抗インフルエンザウイルス抗体（例えば、抗ＨＡ１抗体、抗ＨＡ２抗体）、抗腫瘍抗原抗体（例えば、抗ｐ５３抗体、抗ｋｒａｓ抗体、抗ＰＲＬ－３抗体）、抗免疫チェックポイント抗体（例えば、抗ＰＤ１またはＰＤＬ１抗体）、抗メラニン合成関連抗体（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質ＴＹＲＰ１抗体）、抗新型コロナウイルス抗体（例えば、抗Ｓタンパク質ＲＢＤまたはＳ１もしくはＳ２抗体などの抗新型コロナウイルスＳタンパク質抗体）からなる群から選択され、
好ましくは、前記目的の分子が、遺伝子編集に関連するタンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＦｌｉｐリコンビナーゼからなる群から選択され、
好ましくは、前記目的の分子が、活性タンパク質または追跡可能なタンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、毒素タンパク質（例えば、エンドトキシン）、サイトカイン（例えば、ＩＬ１０またはＩＦＮγなどのインターロイキンまたはインターフェロン）、免疫調節タンパク質（例えば、ＰＤ１）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メチラーゼ、プロテインキナーゼなど）、シグナル伝達経路関連分子タンパク質（例えば、β－カテニンタンパク質）、サイクリン（例えば、サイクリンＤ１タンパク質）、転写活性化因子および転写阻害剤からなる群から選択され、
好ましくは、前記目的の分子が、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質であり、好ましくは、前記タンパク質が、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮタンパク質）からなる群から選択され、
好ましくは、前記目的の分子が、配列番号１、６～７、４３～４４および４６～５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである、
コンジュゲート。

【請求項12】

請求項１０に記載の融合タンパク質または請求項１１に記載のコンジュゲートを含む、多量体。

【請求項13】

請求項１０に記載の融合タンパク質または請求項１１に記載のコンジュゲートまたは請求項１２に記載の多量体と、前記融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体と非共有結合または複合体形成している成分とを含む複合体であって、
好ましくは、前記融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体が、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結されたＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質を含み、前記複合体が、前記ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質と非共有結合または複合体を形成しているＤＮＡ分子を含み、
好ましくは、前記ＤＮＡ分子に結合可能な前記タンパク質が、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に（任意選択によりリンカーを介して）共有結合で連結されているか、または（任意選択によりリンカーを介して）非共有結合で連結されており、
好ましくは、前記ＤＮＡ分子に結合可能な前記タンパク質が、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型のＮ末端またはＣ末端に連結されており、
好ましくは、前記ＤＮＡ分子が、前記ＤＮＡ分子に結合可能な前記タンパク質によって認識および結合されるヌクレオチド配列を含み、
好ましくは、前記ＤＮＡ分子に結合可能な前記タンパク質が、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮタンパク質）からなる群から選択され、好ましくは、前記ヌクレオチド配列が、ジンクフィンガータンパク質の結合配列（例えば、配列番号５４）である、
複合体。

【請求項14】

請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または請求項１０に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。

【請求項15】

請求項１４に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）。

【請求項16】

請求項１４に記載の単離された核酸分子または請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項17】

請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または請求項１０に記載の融合タンパク質を調製する方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または前記融合タンパク質を発現することができる条件下で培養すること、および培養された前記宿主細胞の培養物から前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または融合タンパク質を回収することを含む方法。

【請求項18】

請求項１０に記載の融合タンパク質、または請求項１１に記載のコンジュゲート、または請求項１２に記載の多量体、または請求項１３に記載の複合体、または請求項１４に記載の単離された核酸分子、または請求項１５に記載のベクターを含む、組成物。

【請求項19】

請求項１０に記載の融合タンパク質、または請求項１１に記載のコンジュゲート、または請求項１２に記載の多量体、または請求項１３に記載の複合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む医薬組成物であって、前記融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体または複合体が、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結された治療的活性ポリペプチドを含み、
好ましくは、前記治療的活性ポリペプチドが、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に（任意選択によりリンカーを介して）共有結合で連結されているか、または（任意選択によりリンカーを介して）非共有結合で連結されており、
好ましくは、前記治療的活性ポリペプチドが、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型のＮ末端またはＣ末端に連結されている、
医薬組成物。

【請求項20】

目的の分子を細胞内に膜貫通送達するための方法であって、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型を前記目的の分子に連結させ、次いで前記目的の分子を前記細胞と接触させることを含み、
好ましくは、前記方法は、（１）前記目的の分子を前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に結合させてコンジュゲートを得ること、および（２）前記コンジュゲートを前記細胞と接触させ、それにより、前記目的の分子を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含み、
好ましくは、前記目的の分子が、共有結合、アフィニティー結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、結合、混合、または付加によって前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結され、
好ましくは、ステップ（１）において、前記目的の分子を前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に直接共有結合で連結させるか、または前記目的のペプチドを前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型にリンカー（例えば、二官能性リンカーまたはペプチドリンカー）を介して共有結合で連結させ、
好ましくは、ステップ（１）において、前記目的の分子を、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に非共有結合で連結させ、
好ましくは、前記目的の分子は、請求項１１に定義された通りであり、
好ましくは、前記目的の分子は、前記目的のペプチドであり、前記方法は、（１）前記目的の分子を細胞透過性ペプチドまたはその切断型と連結させて融合タンパク質を得ること、および（２）前記融合タンパク質を前記細胞と接触させ、それにより、前記目的の分子を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含み、
好ましくは、ステップ（１）において、前記目的のペプチドを前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に直接共有結合で連結させるか、または前記目的のペプチドを前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型にペプチドリンカー（例えば、フレキシブルなペプチドリンカー）を介して連結させて融合タンパク質を得、
好ましくは、ステップ（１）において、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型を前記目的のペプチドのＮ末端に（任意選択によりペプチドリンカーを介して）またはＣ末端に（任意選択によりペプチドを介して）に連結させ、
好ましくは、前記目的のペプチドは、請求項１０に定義された通りであり、
好ましくは、前記目的の分子は、目的の核酸であり、前記方法は、（１）前記目的の核酸に結合可能なタンパク質を前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結させること、（２）ステップ（１）の生成物を前記目的の核酸と接触させて複合体を得ること、および（３）前記複合体を細胞と接触させ、それにより、前記目的の核酸を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含み、
好ましくは、前記目的の分子は、目的の核酸であり、前記方法は、（１）前記目的の核酸に、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識および結合され得るヌクレオチド配列を付加すること、（２）前記ＤＮＡ結合タンパク質を前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結させること、（３）ステップ（１）の生成物をステップ（２）の生成物と接触させて複合体を得ること、および（４）前記複合体を前記細胞と接触させ、それにより、前記目的の核酸を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含む方法。

【請求項21】

目的の分子の細胞内への膜貫通送達のための、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型の使用。

【請求項22】

目的の分子の細胞内への膜貫通送達のためのキットの製造における、請求項１～９のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本出願は、生物学の技術分野、特に膜貫通送達の技術分野に関する。具体的には、本出願は、タンパク質、抗体、核酸などの様々な生物学的高分子の細胞内への膜貫通送達を効率的に行うことができる細胞透過性ペプチド（ｃｐｐ）に関する。さらに、本出願はまた、細胞透過性ペプチドを含む融合タンパク質、コンジュゲートおよび複合体、並びに細胞透過性ペプチドの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

現在の生物製剤、特に抗体は、遊離の標的および細胞膜表面上の標的を主に標的としている。しかしながら、実際には、細胞内に多くの潜在的な標的が存在する。生物学的高分子薬物（例えば、抗体）はこれらの細胞内標的にアクセスしづらいことから、これらの細胞内標的を標的とする現在の薬物は主に化学薬物である。しかしながら、化学薬物と、抗体または他の生物活性高分子との間には、特定の疾患における過剰発現した抗原の認識、タンパク質相互作用の遮断および特異性などの点で、未だ隔たりがある。例えば、活性な生物学的高分子を細胞内に効率的に導入してそのような標的に介入することができるのであれば、腫瘍形成および発達を促進する細胞内腫瘍関連抗原またはシグナル伝達経路は介入の潜在的な標的となる。

【0003】

細胞透過性ペプチド（ｃｐｐ）は、細胞膜または組織障壁を通過することができる短いペプチドの一クラスである。これらのペプチドは特定の受容体に結合せず、エネルギー依存性またはエネルギー非依存性の作用機序によって組織障壁および細胞膜を通過する。ｃｐｐは、主にエンドサイトーシスおよび直接浸透の２つの作用機序によって細胞内に入ることができ、膜貫通効率が高く、細胞毒性が低いという利点がある。ｃｐｐは、主に、カチオン性、両親媒性、および疎水性のタイプに分類することができる。１９８８年以来、２つの独立した研究グループが、ＨＩＶ－１トランス転写活性化因子（ＨＩＶ－１ ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＴＡＴ）がインビトロで効果的に細胞膜を通過して細胞内に入ることができることを報告しており、細胞透過性ペプチドの研究は大きな進歩を遂げた。ｃｐｐは、生物活性分子（タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡおよび小薬物など、纏めてカーゴとも称される）を細胞内に運搬することができることが見出されている。したがって、ｃｐｐを使用する送達システムは、ポリペプチド送達システムとも称される。細胞透過性ペプチドは、複数の細胞種を標的とするトランスフェクションツールなどの基礎研究に使用され、さらにトランスフェクション後翻訳の研究にも使用されている。さらに、ｃｐｐの膜貫通特性は、アクセスが困難な細胞および組織での薬物（抗生物質、抗炎症薬、抗腫瘍薬および一部の神経保護薬を含む）の送達および治療効果を改善するために利用されている。細胞透過性ペプチドに関する多数の前臨床研究により、様々な疾患モデルで有望な治療結果が示され、これらの薬物のうちの一部は臨床段階に進んでいる。これらの前臨床および臨床研究は、ヒト治療薬の前例のない開発をもたらしている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

しかしながら、臨床応用における現在の細胞透過性ペプチド／薬物は、送達効率が低く、標的化が不十分であるなどの問題を依然として抱えている。したがって、生物活性高分子（例えば、抗体、遺伝子編集システム関連タンパク質などのタンパク質分子、および核酸分子など）の細胞内への膜貫通送達の効率をさらに改善し、それによって生物活性高分子の生物学的機能を発揮するために、新しく効率的な細胞透過性ペプチドを開発する必要がある。この新しいクラスの効率の高い細胞透過性ペプチドにより、細胞内標的を標的とする治療薬のより効率的な送達手段が実現される。

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の概要
本発明の内容
本発明において、別段で明記しない限り、本願明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本願明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学および免疫学実験の操作ステップはすべて、対応する分野で広く使用される常法によるステップである。一方、本発明をよりよく理解するために、関連する用語の定義および説明を以下に提供する。

【0006】

本願明細書で使用する場合、「細胞透過性ペプチド」という用語は、ペプチドが結合されている目的の分子の細胞内への膜貫通送達を行うことができるペプチドを指す。例えば、本出願の細胞透過性ペプチドは、ペプチドが結合されている目的の生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）の細胞内への膜貫通送達を行うことができる。本出願において、細胞透過性ペプチドは、共有結合または非共有結合を介して目的の生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）に結合することができる。

【0007】

例えば、本出願の細胞透過性ペプチドは、目的のペプチドまたは目的の核酸に共有結合によって（任意選択により、リンカー、例えばペプチドリンカーを介して）連結させることができる。したがって、特定の実施形態では、本出願の細胞透過性ペプチドは、任意選択により、目的のペプチドにペプチドリンカーを介して融合させることもできる。特定の実施形態では、本出願の細胞透過性ペプチドは、任意選択により、目的のペプチドまたは目的の核酸にリンカー（例えば、ペプチドリンカーまたは二官能性リンカー）を介してコンジュゲートすることもできる。ペプチド分子を目的のペプチドまたは目的の核酸にコンジュゲートする方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、様々な既知の二官能性リンカーを使用する。

【0008】

さらに、本出願の細胞透過性ペプチドは、目的の生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）に非共有結合によって結合することもできる。したがって、特定の実施形態では、本出願の細胞透過性ペプチドは、目的の生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）に、特定の分子間相互作用／特異的結合（例えば、抗原と抗体との間の相互作用／結合、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ分子との間の相互作用／結合）を介して結合することもできる。

【0009】

本願明細書で使用する場合、「特異的結合」または「特異的相互作用」という用語は、抗体と抗原との間の反応、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ分子との間の反応など、２つの分子間の非無作為結合反応を指す。例えば、抗体と抗原の間の非無作為結合反応は、１０^－６Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）を有することができる。本出願において、ＫＤは、解離速度と会合速度との比（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）を指し、それは、例えばＢｉａｃｏｒｅなどの機器を使用した表面プラズモン共鳴などの方法によって決定することができる。

【0010】

本願明細書で使用する場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に悪影響を及ぼすことも、それを変更することもないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当該技術分野で既知の標準的な技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換には、対応するアミノ酸残基と物理的または機能的に類似するもの（例えば、類似する、サイズ、形状、電荷や、共有結合または水素結合などを形成する能力を含む化学的性質を有するもの）を含む、類似する側鎖を有するアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義付けられている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸ファミリー（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸ファミリー（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖を有するアミノ酸ファミリー（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸ファミリー（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸ファミリー（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸ファミリー（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、対応するアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｅｔ ＵＳＡ ９４：４１２－４１７（１９９７）を参照のこと）。本出願において、「保存的置換」という用語は、一般に、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置き換えることを指す。

【0011】

本願明細書で使用する場合、「Ｘ個のアミノ酸残基が切断されたＮ末端」という用語は、ペプチド／ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基１～Ｘ番目（Ｘは１以上の整数である）が欠失していることを意味する。例えば、「５個のアミノ酸残基が切断されたＮ末端」という表現は、ペプチド／ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基１～５番目が欠失していることを意味する。

【0012】

本願明細書で使用する場合、「Ｘ個のアミノ酸残基が切断されたＣ末端」という用語は、ペプチド／ポリペプチドのＣ末端の端からＸ個（Ｘは１以上の整数である）のアミノ酸残基が欠失していることを意味する。例えば、「８個のアミノ酸残基が切断されたＣ末端」という表現は、ペプチド／ポリペプチドのＣ末端の端から８個のアミノ酸残基が欠失していることを意味する。

【0013】

本出願において、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、同じ意味を有し、互換的に使用される。また、本出願において、アミノ酸は、一般に、当該技術分野で周知の１文字および３文字の略語によって表される。例えば、アラニンは、ＡまたはＡｌａによって表すことができる。

【0014】

本願明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、材料がその天然の状態から人工的に改変されていることを意味する。「分離された」物質または成分が天然に存在する場合、これは元の状態から変更されているかもしくは逸脱しているか、またはその両方が生じている。例えば、生きている動物において天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、これらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、これらが天然の状態で存在し、かつ、十分に純粋な状態で一緒に存在する物質から十分に分離されている場合、「単離された」とみなすことができる。

【0015】

本願明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸送達ビヒクルを指す。挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質をベクターが発現できる場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、該ベクターが運搬する遺伝物質の要素が宿主細胞で発現されるように、宿主細胞の形質転換、形質導入またはトランスフェクションに使用することができる。例えば、ベクターには、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが含まれる。ベクターとして使用される動物ウイルスの種類は、レトロウイルス（レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０））である。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択要素およびレポーター遺伝子を含む、発現を制御するための様々な要素を含んでもよい。さらに、ベクターはまた、複製起点部位を含んでもよい。ベクターはまた、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質シェルを含むがこれらに限定されない、細胞への侵入を促進するための成分を含んでもよい。

【0016】

本願明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入される細胞を指す。本出願に記載の宿主細胞には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの原核細胞、酵母細胞またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞またはＳｆ９などの昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞またはヒト細胞などの動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0017】

本願明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体または賦形剤」という用語は、対象および活性成分と薬理学的および／または生理学的に適合する担体または賦形剤を指し、該担体または賦形剤は、当該技術分野で周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ編、第１９版、ペンシルベニア州：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年を参照のこと）、ｐＨ調整剤、界面活性剤、補助剤、イオン強度増強剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤には、リン酸緩衝液が含まれるが、これに限定されず、界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ－８０などのカチオン性、アニオン性または非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されず、イオン強度増強剤には、塩化ナトリウムが含まれるが、これに限定されない。

【0018】

本出願において、徹底的な研究の後、本発明者らは、ＰＲＲＲ＊＊＊ＰＲＲＲＲ＊Ｑ＊ＰＲＲＲＲのモチーフを有する新しいクラスの細胞透過性ペプチドを開発した。そのようなモチーフを含む細胞透過性ペプチドは、目的の生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）を細胞内に膜を介して効率的に送達し、細胞内で生物学的分子の機能を発揮することができることが見出された。

【0019】

したがって、一態様では、本出願は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型であって、該細胞透過性ペプチドは、式Ｉによって表される構造：
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＰＲＲＲＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＰＲＲＲＲＸ_２４ＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式Ｉ
を有し、式中、
Ｘ_１～Ｘ_３は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、ＫまたはＨ）から選択され、
Ｘ_４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_１０は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、ＫまたはＨ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_１８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_２４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_２６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、Ｘ_３２は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で１～１０個（例えば、１～５個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸残基が切断され、および／またはＣ末端で１～１４個（例えば、１～８個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個）のアミノ酸残基が切断され、
細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）の細胞内への膜貫通送達を行うことができる、
細胞透過性ペプチドまたはその切断型を提供する。

【0020】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１～Ｘ_３は、各々独立して、アミノ酸残基Ｒ、ＫおよびＨからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１～Ｘ_３は、各々独立して、アミノ酸残基ＲおよびＫからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１～Ｘ_３は、各々独立して、アミノ酸残基Ｒである。

【0021】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_４は、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_４は、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_４は、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、およびＫからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_４は、アミノ酸残基Ｒ、ＣおよびＧからなる群から選択される。

【0022】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、ＣおよびＱからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、ＮおよびＧからなる群から選択される。

【0023】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、ＣおよびＴからなる群から選択される。Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、ＣおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、ＰおよびＳからなる群から選択される。

【0024】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択される。

【0025】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｖ、ＬおよびＩからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_８は、アミノ酸残基ＲおよびＡからなる群から選択される。

【0026】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、ＳおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、ＰおよびＴからなる群から選択される。

【0027】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１０は、アミノ酸残基Ｒ、ＫおよびＨからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１０は、アミノ酸残基ＲおよびＫからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１０は、アミノ酸残基Ｒである。

【0028】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基ＡおよびＳからなる群から選択される。

【0029】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１６は、アミノ酸残基Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１６は、アミノ酸残基Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＳおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１６は、アミノ酸残基ＴおよびＳからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１６は、アミノ酸残基Ｔである。

【0030】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１７は、アミノ酸残基Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１７は、アミノ酸残基Ｐである。

【0031】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基ＳおよびＱからなる群から選択される。

【0032】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２４は、アミノ酸残基ＳおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２４は、アミノ酸残基Ｓである。

【0033】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｓ、ＣおよびＱからなる群から選択される。

【0034】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される。

【0035】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＲからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、ＮおよびＲからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基ＱおよびＫからなる群から選択される。

【0036】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３４は、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される。

【0037】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、およびＨからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、およびＫからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基ＲおよびＰからなる群から選択される。

【0038】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択される。

【0039】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、ＳおよびＣからなる群から選択される。

【0040】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３８は、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３８は、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３８は、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、ＮおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３８は、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される。

【0041】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３９は、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３９は、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３９は、アミノ酸残基Ｃ、ＳおよびＮからなる群から選択される。

【0042】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドは、式ＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式ＩＩ
を有し、式中、
Ｘ_４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３２は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３４は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択される。

【0043】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９、Ｘ_１１、Ｘ_３２、Ｘ_３３、Ｘ_３４、Ｘ_３５、Ｘ_３６、Ｘ_３７、Ｘ_３８、Ｘ_３９は、各々独立して、上記で定義した通りである。

【0044】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドは、式ＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式ＩＩ
を有し、式中、
Ｘ_４は、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇからなる群から選択され、
Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇからなる群から選択され、
Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓからなる群から選択され、
Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑからなる群から選択され、
Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａからなる群から選択され、
Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔからなる群から選択され、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｑからなる群から選択され、
Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃからなる群から選択され、
Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋからなる群から選択され、
Ｘ_３４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃからなる群から選択され、
Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐからなる群から選択され、
Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａからなる群から選択され、
Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃからなる群から選択され、
Ｘ_３８は、アミノ酸残基Ｑ、Ｓからなる群から選択され、
Ｘ_３９は、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎからなる群から選択される。

【0045】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基（例えば、１～５個のアミノ酸残基）が切断され、および／またはＣ末端で１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１～８個のアミノ酸残基）が切断されている。特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基が切断され、例えば、Ｎ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基が切断されている。いくつかの好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｃ末端で１～１４個のアミノ酸残基が切断され、例えば、Ｃ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸残基が切断されている。特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基（例えば、１～５個のアミノ酸残基）が切断され、Ｃ末端で１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１～８個のアミノ酸残基）が切断されている。特定の実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で５または１０個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端で１～８個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６または８個のアミノ酸残基）が切断されている。特定の実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基（例えば、２、３、５、または１０個のアミノ酸残基）が切断されており、Ｃ末端では切断されていないか、または１～８個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６、または８個のアミノ酸残基）が切断されている。いくつかの好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で５個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端で１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６、８または１４個のアミノ酸残基）が切断されている。特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｎ末端で１～５個のアミノ酸残基（例えば、２、３または５個のアミノ酸残基）が切断されており、Ｃ末端では切断されていないか、または１～１４個のアミノ酸残基（例えば、１、３、６、８または１４個のアミノ酸残基）が切断されている。特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドと比較して、切断型は、Ｃ末端で１４個のアミノ酸残基が切断されており、Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｃである。特定の好ましい実施形態では、切断型は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有していない。

【0046】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドは、式ＩＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＧＸ_５Ｘ_６ＲＸ_８Ｘ_９ＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２ＱＸ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７ＳＮＣ
式ＩＩＩ
を有し、式中、
Ｘ_５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_９は、（ｉ）アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３５は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択される。

【0047】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｎ、Ｇ、ＣおよびＱからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_５は、アミノ酸残基ＮおよびＧからなる群から選択される。

【0048】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、ＣおよびＴからなる群から選択される。Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｐ、ＳおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基ＰおよびＳからなる群から選択される。

【0049】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、およびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｖ、ＬおよびＩからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_８はアミノ酸残基ＲおよびＡからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_８は、アミノ酸残基Ａである。

【0050】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｐ、ＴおよびＳからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_９は、アミノ酸残基ＰおよびＴからなる群から選択される。

【0051】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓである。

【0052】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、ＫおよびＨからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、ＰおよびＫからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基ＲおよびＰからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｐである。

【0053】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ａである。

【0054】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、ＳおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基ＰおよびＳからなる群から選択される。

【0055】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号２０～２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

【0056】

特定の好ましい実施形態では、切断型は、式ＩＶによって表される構造：
Ｘ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６
式ＩＶ
を有し、式中、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１８は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_２６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択される。

【0057】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択される。

【0058】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８は、アミノ酸残基ＳおよびＱからなる群から選択される。

【0059】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、およびＱからなる群から選択される。

【0060】

特定の好ましい実施形態では、切断型は、式Ｖによって表される構造：
Ｘ_６Ｘ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＸ_３２
式Ｖ
を有し、式中、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｎ）から選択され、Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ａ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３２は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択される。

【0061】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、ＣおよびＱからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基ＲおよびＧからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒから選択される。

【0062】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒから選択される。

【0063】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される。

【0064】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される。

【0065】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２は、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される。

【0066】

特定の好ましい実施形態では、切断型は、式ＶＩによって表される構造：
Ｘ_６Ｘ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＳＸ_３３ＳＲＸ_３６Ｘ_３７
式ＶＩ
を有し、式中、
Ｘ_６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｎ）から選択され、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ａ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択され、
Ｘ_３７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択される。

【0067】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｃ、Ｑ、ＳおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、ＣおよびＱからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基ＲおよびＧからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒから選択される。

【0068】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒから選択される。

【0069】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｑ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される。

【0070】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、ＱおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される。

【0071】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＲからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、ＮおよびＲからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基ＱおよびＫからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑから選択される。

【0072】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅから選択される。

【0073】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３７は、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される。

【0074】

特定の好ましい実施形態では、切断型は、式ＶＩＩによって表される構造：
ＲＸ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４ＲＸ_３６Ｘ_３７ＱＸ_３９
式ＶＩＩ
を有し、式中、
Ｘ_７は、（ｉ）アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅ）から選択され、
Ｘ_１１は、（ｉ）アミノ酸残基Ａ、Ｓ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９は、各々独立して、（ｉ）アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ）から選択され、
Ｘ_３３は、（ｉ）アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈ）から選択され、
Ｘ_３６は、（ｉ）アミノ酸残基Ｅ、Ａ、および（ｉｉ）（ｉ）に対して保存的置換であるアミノ酸残基（例えば、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄ）から選択される。

【0075】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、ＴおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、ＮおよびＥからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_７は、アミノ酸残基ＲおよびＱからなる群から選択される。

【0076】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、ＴおよびＣからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_１１は、アミノ酸残基ＡおよびＳからなる群から選択される。

【0077】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９は、各々独立して、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される。

【0078】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＲからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、ＮおよびＲからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３３は、アミノ酸残基ＱおよびＫからなる群から選択される。

【0079】

特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＤからなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、Ｘ_３６は、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択される。

【0080】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドは、配列番号２０～２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

【0081】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、配列番号１０～１３、１５、１７～１８、２０～２１、２３～２９および３２～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

【0082】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドまたは切断型は単離されている。
別の態様では、本出願は、上記の細胞透過性ペプチドまたはその切断型および目的のペプチドを含む融合タンパク質を提供する。本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、これに結合されている目的のペプチド（融合タンパク質）の細胞内への膜貫通送達を行うことができる。

【0083】

特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に直接共有結合されている（すなわち、ペプチド結合を介して直接連結されている）。特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは、細胞透過性ペプチドまたはその切断型にペプチドリンカー（例えば、フレキシブルなペプチドリンカー）を介して共有結合されている。特定の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する。しかしながら、本出願において、目的のペプチドを細胞透過性ペプチドまたはその切断型に様々な既知のペプチドリンカーを使用して融合することができることは容易に理解される。

【0084】

特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、目的のペプチドのＮ末端に（任意選択により、ペプチドリンカーを介して）連結されている。特定の好ましい実施形態では、細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、目的のペプチドのＣ末端に（任意選択により、ペプチドリンカーを介して）連結されている。

【0085】

本出願における目的のペプチドが、任意の所望のタンパク質またはポリペプチドであり得ることは容易に理解される。例えば、特定の状況では、抗体を細胞（例えば、腫瘍細胞、免疫細胞など）に送達し、その機能を発揮すること（例えば、ウイルス感染、複製および／またはアセンブリを阻害すること、細胞内シグナル伝達を阻害または増強することなど）が望ましいものであり得る。この場合、本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型を目的の抗体に融合させて、抗体の膜貫通送達を容易にすることができる。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは抗体である。特定の好ましい実施形態では、抗体は、抗ＨＢＶ抗体（例えば、抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、抗ＨＢｅＡｇ抗体など）、抗インフルエンザウイルス抗体（例えば、抗ＨＡ１抗体、抗ＨＡ２抗体）、抗腫瘍抗原抗体（例えば、抗ｐ５３抗体、抗ｋｒａｓ抗体、抗ＰＲＬ－３抗体）、抗免疫チェックポイント抗体（例えば、抗ＰＤ１またはＰＤＬ１抗体）、抗メラニン合成関連抗体（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質ＴＹＲＰ１抗体）、抗コロナウイルス抗体（例えば、抗Ｓタンパク質ＲＢＤまたはＳ１もしくはＳ２抗体などの抗コロナウイルスＳタンパク質抗体）から選択される。

【0086】

いくつかの場合では、遺伝子編集関連タンパク質を細胞内に送達し、その機能を発揮すること（例えば、細胞中で目的の遺伝子を編集すること、または細胞中で遺伝子編集を阻害することなど）が望ましいものであり得る。この場合、本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型を遺伝子編集関連タンパク質に融合させて、タンパク質の膜貫通送達を促進することができる。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは、遺伝子編集に関連するタンパク質である。特定の好ましい実施形態では、タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＦｌｉｐリコンビナーゼからなる群から選択される。

【0087】

いくつかの場合では、活性タンパク質または追跡可能なタンパク質を細胞内に送達し、その機能を発揮すること（例えば、シグナル伝達経路を研究または変更すること、細胞を局在化することなど）が望ましいものであり得る。この場合、本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型をそのようなタンパク質に融合させて、タンパク質の膜貫通送達を促進してもよい。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは、活性タンパク質または追跡可能なタンパク質である。特定の好ましい実施形態では、タンパク質は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、毒素タンパク質（例えば、エンドトキシン）、サイトカイン（例えば、インターロイキンまたはインターフェロン、例えば、ＩＬ１０またはＩＦＮγ）、免疫調節タンパク質（例えば、ＰＤ１）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メチラーゼ、プロテインキナーゼなど）、シグナル伝達経路関連分子タンパク質（例えば、β－カテニンタンパク質）、サイクリン（例えば、サイクリンＤ１タンパク質）、転写活性化因子および転写抑制因子からなる群から選択される。

【0088】

特定の状況では、ＤＮＡ分子を細胞内に送達し、その機能を発揮すること（例えば、外来タンパク質を発現すること、内因性遺伝子発現を妨害することなど）が望ましいものであり得る。この場合、本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型をＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質（以下、ＤＮＡ結合タンパク質とも称される）に融合させて、タンパク質およびＤＮＡ分子の膜貫通送達を促進してもよい。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質である。特定の好ましい実施形態では、タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮタンパク質）からなる群から選択される。

【0089】

特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは、配列番号１、６～７、４３～４４および４６～５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

【0090】

特定の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、追加のドメインをさらに含む。特定の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質の調製および精製を容易にするために、タグドメイン（例えば、６^＊Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ハプテンタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＭＢＰタグ、ＧＳＴタグなど）をさらに含む。特定の好ましい実施形態では、融合タンパク質は、抗体重鎖定常領域をさらに含む。特定の好ましい実施形態では、追加のドメイン（例えば、タグドメイン）は、融合タンパク質のＮ末端に位置する。特定の好ましい実施形態では、追加のドメイン（例えば、タグドメイン）は、融合タンパク質のＣ末端に位置する。

【0091】

別の態様では、本出願は、上記の細胞透過性ペプチドまたはその切断型および目的の分子（例えば、目的のタンパク質または目的の核酸）を含むコンジュゲートを提供する。

【0092】

特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に直接共有結合で連結されている（すなわち、化学結合を介して直接結合されている）。特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドは、細胞透過性ペプチドまたはその切断型にリンカー（例えば、二官能性リンカーまたはペプチドリンカー）を介して共有結合で連結されている。特定の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する。しかしながら、本出願において、様々な既知のリンカーを使用して、目的の分子を細胞透過性ペプチドまたはその切断型に共有結合で連結させることができることは容易に理解される。特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に非共有結合で連結されている。

【0093】

本出願における細胞透過性ペプチドまたはその切断型を目的の様々な分子に連結させることができることは容易に理解される。これらの目的の分子は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に、共有結合、アフィニティー結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、結合、混合または付加などの他の手段によって連結させることができる。特定の実施形態では、本出願で開示される細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、１つまたは複数の目的の分子を結合するために使用することができる追加の特異的部位を含むように操作することができる。例えば、そのような部位は、目的の分子への共有結合を促進するために、システイン残基およびヒスチジン残基などの１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を含んでもよい。特定の実施形態では、細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、目的の分子に間接的に連結させることができる。例えば、細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、ビオチンに結合し、次いで、アビジンに連結された第２の目的の分子に間接的に結合することができる。

【0094】

本出願における目的の分子が任意の所望の分子であり得ることは容易に理解される。例えば、特定の実施形態では、目的の分子は、検出可能な標識であり得る。検出可能な標識の例には、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼまたはβ－Ｄガラクトシダーゼ）、安定同位体または放射性同位体、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、検出を容易にするためのＤＮＡ分子または金が含まれてもよい。特定の実施形態では、目的の分子は、細胞傷害剤であり得る。「細胞毒性剤」は、細胞に有害であるか、または細胞を損傷もしくは死滅させ得る任意の薬剤であり得る。細胞傷害剤の例には、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、イペカミン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジケトン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、ｌ－デヒドロ試験ステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－メルカプトグアニン、シトシンアラビノシド、５－フルオロウラシルデクレブジン（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ｄｃｒｂｚｉｎｅ）、アルキル化剤（例えば、ムスチン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ－ジクロロジアミン白金（ＤＤＰ））、アントラサイクリン（例えば、イダルビシン（以前はダウノルビシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ゲンシャマイシン（以前はアクチノマイシンとして既知）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンチアマイシン（ＡＭＣ））、並びに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスト）が含まれてもよいが、これらに限定されない。

【0095】

特定の実施形態では、目的の分子は、任意の所望のタンパク質またはポリペプチドであり得る。例えば、特定の状況では、抗体を細胞（例えば、腫瘍細胞、免疫細胞など）内に送達し、その機能を発揮すること（例えば、ウイルス感染、複製および／もしくはアセンブリを阻害すること、または細胞内シグナル伝達を阻害もしくは増強することなど）が望ましいものであり得る。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、抗体である。特定の好ましい実施形態では、抗体は、抗ＨＢＶ抗体（例えば、抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、抗ＨＢｅＡｇ抗体など）、抗インフルエンザウイルス抗体（例えば、抗ＨＡ１抗体、抗ＨＡ２抗体）、腫瘍抗原に対する抗体（抗ｐ５３抗体、抗ｋｒａｓ抗体、抗ＰＲＬ－３抗体など）、抗免疫チェックポイント抗体（抗ＰＤ１抗体またはＰＤＬ１抗体など）、抗メラニン合成関連抗体（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質ＴＹＲＰ１抗体）、抗コロナウイルス抗体（例えば、抗Ｓタンパク質ＲＢＤまたはＳ１もしくはＳ２抗体などの抗コロナウイルスＳタンパク質抗体）から選択される。

【0096】

いくつかの場合では、遺伝子編集関連タンパク質を細胞内に送達し、その機能を発揮すること（例えば、細胞中で目的の遺伝子を編集すること、または細胞中で遺伝子編集を阻害することなど）が望ましいものであり得る。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、遺伝子編集に関連するタンパク質である。特定の好ましい実施形態では、タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、ＡｃｒＩＩＡ４タンパク質、Ｃａｓ１３タンパク質、ＣｒｅリコンビナーゼおよびＦｌｉｐリコンビナーゼからなる群から選択される。

【0097】

いくつかの場合では、活性タンパク質または追跡可能なタンパク質を細胞内に送達し、その機能を発揮する（例えば、シグナル伝達経路を研究または変更すること、細胞を局在化することなど）ことが望ましいものであり得る。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、活性タンパク質または追跡可能なタンパク質である。特定の好ましい実施形態では、タンパク質は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、毒素タンパク質（例えば、エンドトキシン）、サイトカイン（例えば、インターロイキンまたはインターフェロン、例えば、ＩＬ１０またはＩＦＮγ）、免疫調節タンパク質（例えば、ＰＤ１）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、メチラーゼ、プロテインキナーゼなど）、シグナル伝達経路関連分子タンパク質（例えば、β－カテニンタンパク質）、サイクリン（例えば、サイクリンＤ１タンパク質）、転写活性化因子および転写抑制因子からなる群から選択される。

【0098】

特定の状況では、ＤＮＡ分子を細胞内に送達し、その機能を発揮すること（例えば、外来タンパク質を発現すること、内因性遺伝子発現を妨害することなど）が望ましいものであり得る。したがって、特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質である。特定の好ましい実施形態では、タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮタンパク質）からなる群から選択される。

【0099】

特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、配列番号１、６～７、４３～４４および４６～５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

【0100】

別の態様では、本出願は、上記の融合タンパク質またはコンジュゲートを２つ以上含む多量体を提供する。いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの場合では、融合タンパク質またはコンジュゲートの細胞内送達をさらに容易にすることができる多量体の形態が有利であり得る。

【0101】

別の態様では、本出願は、上記の融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体と、融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体と非共有結合または複合体形成している成分とを含む複合体を提供する。特定の好ましい実施形態では、融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体は、本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結されたＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質を含む。複合体は、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質と非共有結合または複合体形成しているＤＮＡ分子を含む。特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に（任意選択により、リンカーを介して）共有結合で連結されている。特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に（任意選択により、リンカーを介して）非共有結合で連結されている。特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型のＮ末端に連結されている。特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型のＣ末端に連結されている。特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質によって認識および結合されるヌクレオチド配列を含む。特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質は、ジンクフィンガータンパク質および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮタンパク質）からなる群から選択される。特定の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、ジンクフィンガータンパク質の結合配列（例えば、配列番号５４）である。

【0102】

別の態様では、本出願は、細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。

【0103】

別の態様では、本出願は、上記の単離された核酸分子を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）を提供する。特定の実施形態では、本出願のベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスなどから選択される。

【0104】

別の態様では、本出願は、上記の単離された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、宿主細胞は原核細胞であり、これには、グラム陰性菌またはグラム陽性菌、例えば、腸内細菌属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）（例えば、大腸菌、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えば、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、およびシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、およびバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、並びにストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、宿主細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはバチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である。

【0105】

特定の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、例えば、酵母細胞またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞、Ｓ２ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞またはＳｆ９などの昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞もしくはヒト細胞などの動物細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ヒト、マウス、ヒツジ、ウマ、イヌ、またはネコの細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。

【0106】

別の態様では、本出願は、細胞透過性ペプチドまたはその切断型または融合タンパク質を調製する方法であって、細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または融合タンパク質の発現を可能にする条件下で上記の宿主細胞を培養し、培養した宿主細胞の培養物から細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または融合タンパク質を回収することを含む、方法を提供する。

【0107】

別の態様では、本出願は、上記の融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体または複合体または核酸分子またはベクターを含む、組成物を提供する。

【0108】

別の態様では、本出願は、上記の融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体または複合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物であって、融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体または複合体は、本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結されている治療的に活性なポリペプチドを含む、医薬組成物を提供する。特定の好ましい実施形態では、治療的に活性なポリペプチドは、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に（任意選択により、リンカーを介して）共有結合で連結されている。特定の好ましい実施形態では、治療的に活性なポリペプチドは、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に（任意選択により、リンカーを介して）非共有結合で連結されている。特定の好ましい実施形態では、治療上活性なポリペプチドは、細胞透過性ペプチドまたはその切断型のＮ末端に連結されている。特定の好ましい実施形態では、治療上活性なポリペプチドは、細胞透過性ペプチドまたはその切断型のＣ末端に連結されている。治療的に活性なポリペプチドが、膜貫通送達によって細胞内に送達されることが所望される任意のポリペプチドであり得ることは容易に理解され、その例には、毒素タンパク質（例えば、エンドトキシン）、サイトカイン（例えば、ＩＬ１０またはＩＦＮγなどのインターロイキンまたはインターフェロン）、免疫調節性ポリペプチド（例えば、ＰＤ１抗体など）、抗体などが含まれる。特定の好ましい実施形態では、抗体は、抗ＨＢＶ抗体（例えば、抗ＨＢｓＡｇ抗体、抗ＨＢｃＡｇ抗体、抗ＨＢｅＡｇ抗体など）、抗インフルエンザウイルス抗体（例えば、抗ＨＡ１抗体、抗ＨＡ２抗体）、抗腫瘍抗原抗体（例えば、抗ｐ５３抗体、抗ｋｒａｓ抗体、抗ＰＲＬ－３抗体）、抗免疫チェックポイント抗体（例えば、抗ＰＤ１またはＰＤＬ１抗体）、抗メラニン合成関連抗体（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質ＴＹＲＰ１抗体）、抗コロナウイルス抗体（例えば、抗Ｓタンパク質ＲＢＤまたはＳ１もしくはＳ２抗体などの抗コロナウイルスＳタンパク質抗体）から選択される。

【0109】

別の態様では、本出願は、目的の分子を細胞内に膜貫通送達するための方法であって、上記の細胞透過性ペプチドまたはその切断型を目的の分子に連結させ、次いで目的の分子を細胞と接触させることを含む方法を提供する。

【0110】

特定の好ましい実施形態では、この方法は、（１）目的の分子を細胞透過性ペプチドまたはその切断型と連結させてコンジュゲートを得ること、および（２）コンジュゲートを細胞と接触させ、それにより、目的の分子を膜貫通送達によって細胞内に送達することを含む。

【0111】

本出願において、細胞透過性ペプチドまたはその切断型を様々な方法で目的の分子に連結させることができることは容易に理解できる。例えば、目的の分子を共有結合、アフィニティー結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、結合、混合または付加などの他の手段によって、細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結させることができる。特定の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、目的の分子を細胞透過性ペプチドまたはその切断型に直接共有結合で連結させる（すなわち、化学結合によって直接連結させる）。特定の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、目的のペプチドを細胞透過性ペプチドまたはその切断型にリンカー（例えば、二官能性リンカーまたはペプチドリンカー）を介して共有結合で連結させる。特定の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、目的の分子を細胞透過性ペプチドまたはその切断型に非共有結合で連結させる。特定の好ましい実施形態では、目的の分子および細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、それぞれ上記で定義した通りである。

【0112】

特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、目的のペプチドであり、方法は、（１）目的の分子を細胞透過性ペプチドまたはその切断型と連結させて融合タンパク質を得ること、および（２）融合タンパク質を細胞と接触させ、それにより、目的の分子を膜貫通送達によって細胞内に送達することを含む。

【0113】

本出願において、融合タンパク質を得るために、細胞透過性ペプチドまたはその切断型を様々な方法で目的のペプチドと連結させることができることを理解するのは容易である。特定の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、目的のペプチドを細胞透過性ペプチドまたはその切断型に直接共有結合で連結させて（すなわち、ペプチド結合によって直接連結させて）、融合タンパク質を得る。特定の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、目的のペプチドを細胞透過性ペプチドまたはその切断型にペプチドリンカー（例えば、フレキシブルなペプチドリンカー）を介して共有結合で連結させて、融合タンパク質を得る。特定の好ましい実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有する。しかしながら、本出願において、様々な既知のペプチドリンカーを使用して、目的のペプチドを細胞透過性ペプチドまたはその切断型に融合させることができることは容易に理解される。特定の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、細胞透過性ペプチドまたはその切断型を目的のペプチドのＮ末端に（任意選択により、ペプチドリンカーを介して）連結させる。特定の好ましい実施形態では、ステップ（１）において、細胞透過性ペプチドまたはその切断型を目的のペプチドのＣ末端に（任意選択により、ペプチドリンカーを介して）連結させる。特定の好ましい実施形態では、目的のペプチドおよび細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、それぞれ上記で定義した通りである。

【0114】

特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、目的の核酸であり、方法は、（１）目的の核酸に結合可能なタンパク質を細胞透過性ペプチドまたはその切断型と連結させること、（２）ステップ（１）の生成物を目的の核酸と接触させて複合体を得ること、および（３）複合体を細胞と接触させ、それにより、目的の核酸を膜貫通送達によって細胞内に送達することを含む。

【0115】

特定の好ましい実施形態では、目的の分子は、目的の核酸であり、方法は、（１）目的の核酸に、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識および結合され得るヌクレオチド配列を付加すること、（２）ＤＮＡ結合タンパク質を細胞透過性ペプチドまたはその切断型と連結させること、（３）ステップ（１）の生成物をステップ（２）の生成物と接触させて複合体を得ること、および（４）複合体を細胞と接触させ、それにより、目的の核酸を膜貫通送達によって細胞内に送達することを含む。本出願において、様々な既知のＤＮＡ結合タンパク質並びにそれらが認識および結合するヌクレオチド配列を使用することできることは容易に理解される。特定の好ましい実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質、それが認識および結合するヌクレオチド配列、並びに細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、それぞれ上記で定義した通りである。

【0116】

別の態様では、本出願は、目的の分子の細胞内への膜貫通送達のための、上記の細胞透過性ペプチドまたはその切断型の使用に関する。別の態様では、本出願は、目的の分子の細胞内への膜貫通送達のためのキットの製造における、上記の細胞透過性ペプチドまたはその切断型の使用に関する。

【発明の効果】

【0117】

本発明の有益な効果
本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、目的の生物学的分子（例えば、目的のペプチドまたは目的の核酸）を膜貫通送達によって細胞内に送達し、細胞内で生物学的分子の機能を発揮することができる。先行技術と比較して、本出願の細胞透過性ペプチドまたはその切断型の送達効率は高く（ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチドよりも有意に高い）、良好な応用展望および価値がある。

【0118】

本発明の実施形態は、図面および実施例を参照して以下に詳細に説明されるが、当業者は、以下の図面および実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明を説明するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の様々な目的および有利な態様は、添付の図面および以下の好ましい実施形態の詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0119】

【図1】図１Ａは、実施例１で構築されたレポーティングシステムの動作原理を概略的に示す。図１Ｂは、実施例１で構築されたプラスミドＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧに含まれる主な構造要素を模式的に示す。図１Ｃは、ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＦＰプラスミドまたは陰性対照プラスミドをトランスフェクトした操作された細胞株の蛍光顕微鏡観察結果を示す。

【図2】図２は、精製した標的タンパク質（ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８、ＧＦＰ－ＴＡＴ）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果を示す。Ｍ：タンパク質分子量マーカー。

【図3A】図３Ａ～３Ｂは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用して、目的タンパク質（ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８またはＧＦＰ－ＴＡＴ）を含む培地または含まない培地中で３６時間培養した２９３β５細胞を観察した結果（図３Ａ）、および細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の定量分析の結果（図３Ｂ）を示し、ここでは、２９３β５細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトした。

【図3B】図３Ａ～３Ｂは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用して、目的タンパク質（ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８またはＧＦＰ－ＴＡＴ）を含む培地または含まない培地中で３６時間培養した２９３β５細胞を観察した結果（図３Ａ）、および細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の定量分析の結果（図３Ｂ）を示し、ここでは、２９３β５細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトした。

【図4A】図４Ａ～４Ｂは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８（３０、１０、５、２．５μｇ／ｍＬ）を含む培地中で３６時間培養した２９３β５細胞を観察した結果（図４Ａ）、および細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の定量分析の結果（図４Ｂ）を示し、ここでは、２９３β５細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトした。

【図4B】図４Ａ～４Ｂは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８（３０、１０、５、２．５μｇ／ｍＬ）を含む培地中で３６時間培養した２９３β５細胞を観察した結果（図４Ａ）、および細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の定量分析の結果（図４Ｂ）を示し、ここでは、２９３β５細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトした。

【図5】図５は、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムおよびルシフェラーゼ検出システムをそれぞれ使用した、標的タンパク質（ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８またはＧＦＰ－ＴＡＴ）を含む培地中で３６時間培養した様々な種類の細胞（ＭＤＣＫ、ＶＥＲＯおよびＨａｃａｔ細胞）およびその培養上清の分析結果を示し、ここでは、様々な種類の細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトした。

【図6A】図６Ａは、共焦点顕微鏡を使用した、示された時点でのＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の観察結果を示し、ここでは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞をＧＦＰ－ＣＰＰ２８（６０μｇ／ｍＬ）を含む培地中で培養した。

【図6B】図６Ｂは、二重抗体サンドイッチアッセイを使用した、示された時点でのＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞におけるＧＦＰタンパク質含有量の検出結果を示し、ここでは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞をＧＦＰ－ＣＰＰ２８（６０μｇ／ｍＬ）を含む培地中で培養した。

【図7A】図７Ａ～７Ｂは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図７Ａ）およびＧＦＰ蛍光強度分析結果（図７Ｂ）を示し、ここでは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞を、最初に、示されたエンドサイトーシス経路阻害剤または低温（４℃）で２時間処理し、次いで、３０μｇ／ｍｌのＧＦＰ－ｃｐｐ２８タンパク質で１時間処理した。

【図7B】図７Ａ～７Ｂは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図７Ａ）およびＧＦＰ蛍光強度分析結果（図７Ｂ）を示し、ここでは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞を、最初に、示されたエンドサイトーシス経路阻害剤または低温（４℃）で２時間処理し、次いで、３０μｇ／ｍｌのＧＦＰ－ｃｐｐ２８タンパク質で１時間処理した。

【図8A】図８Ａ～８Ｂは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、示された濃度の様々な組換えタンパク質を含む培地中で３６時間培養した２９３β５細胞の観察結果を示し、ここでは、２９３β５細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトした。

【図8B】図８Ａ～８Ｂは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、示された濃度の様々な組換えタンパク質を含む培地中で３６時間培養した２９３β５細胞の観察結果を示し、ここでは、２９３β５細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトした。

【図9A】図９Ａ～９Ｂは、示された時点でのＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞のＧＦＰ蛍光強度分析の結果（図９Ａ）および共焦点顕微鏡観察結果（図９Ｂ）を示し、ここでは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞をＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄおよびＧＦＰ－ＴＡＴ（６０μｇ／ｍＬ）を含む培地中で培養した。

【図9B】図９Ａ～９Ｂは、示された時点でのＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞のＧＦＰ蛍光強度分析の結果（図９Ａ）および共焦点顕微鏡観察結果（図９Ｂ）を示し、ここでは、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞をＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄおよびＧＦＰ－ＴＡＴ（６０μｇ／ｍＬ）を含む培地中で培養した。

【図10A】図１０Ａ～１０Ｂは、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＳ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂおよびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣ（６０μｇ／ｍＬ）を含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の細胞内ＧＦＰ蛍光点計数の結果（図１０Ａ）および共焦点顕微鏡観察結果（図１０Ｂ）を示す。

【図10B】図１０Ａ～１０Ｂは、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＳ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂおよびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣ（６０μｇ／ｍＬ）を含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の細胞内ＧＦＰ蛍光点計数の結果（図１０Ａ）および共焦点顕微鏡観察結果（図１０Ｂ）を示す。

【図11A】図１１Ａ～１１Ｂは、異なる濃度（６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＲＥＣおよびＧＦＰ－ｃｐｐ－ｏＳを含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図１１Ａ）および細胞内ＧＦＰ蛍光強度結果（図１１Ｂ）を示す。

【図11B】図１１Ａ～１１Ｂは、異なる濃度（６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＲＥＣおよびＧＦＰ－ｃｐｐ－ｏＳを含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図１１Ａ）および細胞内ＧＦＰ蛍光強度結果（図１１Ｂ）を示す。

【図12A】図１２Ａ～１２Ｂは、異なる濃度（６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－１、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－２およびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－３を含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図１２Ａ）および細胞内ＧＦＰ蛍光強度結果（図１２Ｂ）を示す。

【図12B】図１２Ａ～１２Ｂは、異なる濃度（６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－１、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－２およびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－３を含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図１２Ａ）および細胞内ＧＦＰ蛍光強度結果（図１２Ｂ）を示す。

【図13A】図１３Ａ～１３Ｂは、異なる濃度（６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ１、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ２、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ３、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＮＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣＮＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃＣＮＴおよびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＣＮＴを含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図１３Ａ）および細胞内ＧＦＰ蛍光強度結果（図１３Ｂ）を示す。

【図13B】図１３Ａ～１３Ｂは、異なる濃度（６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ１、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ２、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ３、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＮＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣＮＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃＣＮＴおよびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＣＮＴを含む培地中で１時間培養したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞の共焦点顕微鏡観察結果（図１３Ａ）および細胞内ＧＦＰ蛍光強度結果（図１３Ｂ）を示す。

【図14A】図１４Ａは、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅ、ＧＦＰおよびＧＦＰ－ＴＡＴの高速液体蛍光クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分析結果を示す。

【図14B】図１４Ｂは、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰおよびＧＦＰ－ＴＡＴの分析用超遠心機ＯｐｔｉｍａＸＬ－１００（ＡＵＣ）分析結果を示す。

【図15A】図１５Ａは、ＧＦＰ－ＴＡＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｇ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｈ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｊの分取モレキュラーシーブ精製の結果を示す。

【図15B】図１５Ｂは、分取モレキュラーシーブ精製法により得られた様々なタンパク質画分（多量体画分および単量体画分）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す。

【図15C】図１５Ｃは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、２９３β５細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度の定量分析の結果を示し、ここでは、細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトし、示された濃度の示されたタンパク質画分（多量体画および単量体画）を含む培地中で培養した。

【図16A】図１６Ａは、実施例６で構築されたレポータープラスミドに含まれる主な構造要素を示す。

【図16B】図１６Ｂ～１６Ｃは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、示されたプラスミドまたはプラスミドの組み合わせをトランスフェクトした２９３β５細胞のイメージング結果（図１６Ｂ）および蛍光強度分析結果（図１６Ｃ）を示す。

【図16C】図１６Ｂ～１６Ｃは、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、示されたプラスミドまたはプラスミドの組み合わせをトランスフェクトした２９３β５細胞のイメージング結果（図１６Ｂ）および蛍光強度分析結果（図１６Ｃ）を示す。

【図17A】図１７Ａは、共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した、２９３β５細胞の観察結果を示しており、示されたプラスミドまたはプラスミドの組み合わせを細胞にトランスフェクトし、該細胞を示された濃度の様々な組換えタンパク質を含むまたは含まない培地で１２時間処理した。

【図17B】図１７Ｂは、ネイティブＰＡＧＥ（ネイティブゲル電気泳動）によって細胞内ＥＧＦＰタンパク質含有量を測定した結果を示し、ここで、示されたプラスミドまたはプラスミドの組み合わせを細胞にトランスフェクトし、該細胞を示された濃度の様々な組換えタンパク質を含むまたは含まない培地で１２時間処理した。

【図17C】図１７Ｃは、ウェスタンブロットによる細胞内ＥＧＦＰタンパク質含有量の検出結果を示しており、ここでは、示されたプラスミドまたはプラスミドの組み合わせを細胞にトランスフェクトし、該細胞を示された濃度の様々な組換えタンパク質を含むまたは含まない培地で１２時間処理した。

【図17D】図１７Ｄは、実施例６で得られたＰＣＲ増幅産物の配列決定分析の結果を示す。Ｃａｓ９：Ｃａｓ９タンパク質を発現するプラスミド；ベクターｃｏｎ：対照ベクター（空のプラスミド）；ａＣＲＩＳＰＲ－ｐｌ：：抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を発現するプラスミド；ａＣＲＩＳＰＲ－ｐｒｏ：抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質；ａＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８－ｐｒｏ：抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質。

【図18】図１８は、実施例７で精製した抗体または組換えタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果（図１８Ａ）およびウェスタンブロット分析の結果（図１８Ｂ）を示す。

【図19】図１９は、１００μｇ／ｍｌの示された抗体または組換えタンパク質を含む培地で６時間処理された細胞（ＨｅｐＧ２－Ｎ１０、ＨｅｐＧ２－Ｃ３Ａ、Ｈｅｌａ、ＭＮＴ－１およびＡ３７５）の免疫蛍光検出の結果を示す。

【図20】図２０は、ＭＮＴ－１細胞の溶解物中のＴＹＲＰ－１抗原のウェスタンブロット検出の結果を示し、ここでは、ＭＮＴ－１細胞を示された濃度の２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、ＴＡ９９またはＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉで６時間処理した。

【図21A】図２１Ａは、ＨＢｃＡｇ、ＴＲＩＭ２１のウェスタンブロット検出およびＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞の溶解物中の抗体レベルの結果を示し、ここでは、ＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞を１００μｇ／ｍｌの２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、２Ａ７、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５、ＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉまたはＴＡ９９抗体で６時間処理した。

【図21B】図２１Ｂは、ＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞の培養上清中のＨＢｅＡｇ抗原およびＨＢＶ ＤＮＡレベルの検出結果を示し、ここでは、ＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞を１００μｇ／ｍｌの２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、２Ａ７、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５、ＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉまたはＴＡ９９抗体で６時間処理した。

【図22】図２２は、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用して、２９３β５細胞におけるｍＲｕｂｙ３蛍光を観察した結果を示し、ここでは、ＺＦ－ｃｐｐ２８ｏｒｉまたはＰＥＩトランスフェクション試薬を用いて、細胞にプラスミドｐＴＴ５－ｍＲｕｂｙ３－ＺＦモチーフをトランスフェクトした。

【発明を実施するための形態】

【0120】

配列情報
本出願に関与する配列に関する情報を表１に要約する。

【0121】

【表1-1】

【0122】

【表1-2】

【0123】

１．ＧＦＰのアミノ酸配列（配列番号１）
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
２．Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列（配列番号２）
MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKNNWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVESRLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDNVNKDAVTDRLASVETDMPLTLRQHRISATSSSEESSNKGQRQLTVS
３．抗ＧＦＰ ＶＨＨ２のアミノ酸配列（配列番号３）
MADVQLQESGGGSVQAGEALRLSCVGSGYTSINPYMAWFRQAPGKEREGVAAISSGGQYTYYADSVKGRFTISRDNAKNTMYLQMPSLKPDDSAKYYCAADFRRGGSWNVDPLRYDYQHWGQGTQVTVSS
４．ＶＰ１６活性化ドメインのアミノ酸配列（配列番号４）
APPTDVSLGDELHLDGEDVAMAHADALDDFDLDMLGDGDSPGPGFTPHDSAPYGALDMADFEFEQMFTDALGIDEYGG
５．抗ＧＦＰ ＶＨＨ６のアミノ酸配列（配列番号５）
MADVQLQESGGGSVQTGGSLRLSCAVSPYIGSRISLGWFRQAPGKVREGVALINSRDGSTYYADTVKGRFTISQGDANTVYLQMNSLKPEDTAIYYCAARWGQITDIQALAVASFPDWGQGTQVTVSS
６．ＲＦＰのアミノ酸配列（配列番号６）
MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDGCTS
７．ルシフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号７）
MGVKVLFALICIAVAEAKPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKELEANARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGIGEAIVDIPEIPGFKDLEPLEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGD
８．ＵＡＳ配列（配列番号８）
AGCTTGCATGCCTGCAGGTCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGTACTGTCCTCCGAGCGGAGACTCTAGCGAGCGCCGGAGTATAAATAGAGGCGCTTCGTCTACGGAGCGACAATTCAATTCAAACAAGCAAAGTGAACACGTCGCTAAGCGAAAGCTAAGCAAATAAACAAGCGCAGCTGAACAAGCTAAACAATCTGCAGTAAAGTGCAAGTTAAAGTGAATCAATTAAAAGTAACCAGCAACCAAGTAAATCAACTGCAACTACTGAAATCTGCCAAGAAGTAATTATTGAATACAA
９．ｉＲＦＰ６７０のアミノ酸配列（配列番号９）
MARKVDLTSCDREPIHIPGSIQPCGCLLACDAQAVRITRITENAGAFFGRETPRVGELLADYFGETEAHALRNALAQSSDPKRPALIFGWRDGLTGRTFDISLHRHDGTSIIEFEPAAAEQADNPLRLTRQIIARTKELKSLEEMAARVPRYLQAMLGYHRVMLYRFADDGSGMVIGEAKRSDLESFLGQHFPASLVPQQARLLYLKNAIRVVSDSRGISSRIVPEHDASGAALDLSFAHLRSISPCHLEFLRNMGVSASMSLSIIIDGTLWGLIICHHYEPRAVPMAQRVAAEMFADFLSLHFTAAHHQR
１０．ｃｐｐ２８のアミノ酸配列（配列番号１０）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
１１．ｃｐｐ２８ａのアミノ酸配列（配列番号１１）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRES
１２．ｃｐｐ２８ｂのアミノ酸配列（配列番号１２）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQS
１３．ｃｐｐ２８ｃのアミノ酸配列（配列番号１３）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRS
１４．ｃｐｐ２８ｄのアミノ酸配列（配列番号１４）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQS
１５．ｃｐｐ２８ｅのアミノ酸配列（配列番号１５）
RRRDRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
１６．ｃｐｐ２８ｆのアミノ酸配列（配列番号１６）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSKSPRRRRSKSRESQC
１７．ｃｐｐ２８ｇのアミノ酸配列（配列番号１７）
RQRGRAPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRASQC
１８．ｃｐｐ２８ｈのアミノ酸配列（配列番号１８）
RCRGRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSKSRESQC
１９．ｃｐｐ２８ｉのアミノ酸配列（配列番号１９）
RRRGGARASRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRSANC
２０．ｃｐｐ２８ｊのアミノ酸配列（配列番号２０）
RRRGNPRAPRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPAPSNC
２１．ｃｐｐ２８ｋのアミノ酸配列（配列番号２１）
RRRGGSRATRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSPASSNC
２２．ｃｐｐ２８Ｌのアミノ酸配列（配列番号２２）
RRRPASRRSTPSPRRRRSQSPRRRRSPSPRPASNC
２３．ｃｐｐ２８－Ｏｓのアミノ酸配列（配列番号２３）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQS
２４．ｃｐｐ２８ａＣのアミノ酸配列（配列番号２４）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREC
２５．ｃｐｐ２８ｂＣのアミノ酸配列（配列番号２５）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQC
２６．ｃｐｐ２８ｃＣのアミノ酸配列（配列番号２６）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRC
２７．ｃｐｐ２８ｄＣのアミノ酸配列（配列番号２７）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQC
２８．ｃｐｐ２８ｄＲＥＣのアミノ酸配列（配列番号２８）
RRRGRSPRRRTPSPRRRRSQRREC
２９．ｃｐｐ２８ｏＮＴ－１のアミノ酸配列（配列番号２９）
SPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
３０．ｃｐｐ２８ｏＮＴ－２のアミノ酸配列（配列番号３０）
SPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
３１．ｃｐｐ２８ｏＮＴ－３のアミノ酸配列（アミノ酸配列３１）
SPRRRRSQSRESQC
３２．ｃｐｐ２８ａＣＱ１のアミノ酸配列（アミノ酸配列３２）
RRRGRQPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREC
３３．ｃｐｐ２８ａＣＱ２のアミノ酸配列（アミノ酸配列３３）
RRRGRQPRRRTPQPRRRRSQSPRRRRSQSREC
３４．ｃｐｐ２８ａＣＱ３のアミノ酸配列（アミノ酸配列３４）
RRRGRQPRRRTPQPRRRRSQQPRRRRSQSREC
３５．ｃｐｐ２８ａＣＮＴのアミノ酸配列（アミノ酸配列３５）
SPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREC
３６．ｃｐｐ２８ｂＣＮＴのアミノ酸配列（アミノ酸配列３６）
SPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQC
３７．ｃｐｐ２８ｃＣＮＴのアミノ酸配列（アミノ酸配列３７）
SPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRC
３８．ｃｐｐ２８ｄＣＮＴのアミノ酸配列（アミノ酸配列３８）
SPRRRTPSPRRRRSQC
３９．フレキシブルペプチドリンカーのアミノ酸配列（配列番号３９）
GGGGSGGGGSGGGGS
４０．ＧＦＰ－ｃｐｐ２８のアミノ酸配列（配列番号４０）
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGGGSGGGGSGGGGSRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
４１．ＧＦＰ－ＴＡＴのアミノ酸配列（配列番号４１）
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGGGSGGGGSGGGGSGRKKRRQRRRPPQ
４２．細胞透過性ペプチドＴＡＴのアミノ酸配列（配列番号４２）
GRKKRRQRRRPPQ
４３．ｍＲｕｂｙ３タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４３）
MVSKGEELIKENMRMKVVMEGSVNGHQFKCTGEGEGRPYEGVQTMRIKVIEGGPLPFAFDILATSFMYGSRTFIKYPADIPDFFKQSFPEGFTWERVTRYEDGGVVTVTQDTSLEDGELVYNVKVRGVNFPSNGPVMQKKTKGWEPNTEMMYPADGGLRGYTDIALKVDGGGHLHCNFVTTYRSKKTVGNIKMPGVHAVDHRLERIEESDNETYVVQREVAVAKYSNLGGGMDELYK
４４．抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４４）
MNINDLIREIKNKDYTVKLSGTDSNSITQLIIRVNNDGNEYVISESENESIVEKFISAFKNGWNQEYEDEEEFYNDMQTITLKSELN
４５．抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４５）
MNINDLIREIKNKDYTVKLSGTDSNSITQLIIRVNNDGNEYVISESENESIVEKFISAFKNGWNQEYEDEEEFYNDMQTITLKSELNGGGGSGGGGSGGGGSRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQC
４６．ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４６）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD
４７．抗体２Ａ７の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４７）
DIQMTQTSSSLSASPGDRVTISCRASQGINNYLNWYKQKTDGTFKLLIYYTSYLHSGVPSRFSGRGSGTDYSLTISNLEPEDVATYYCQQYGKLPWTFGGGTKLEIK
４８．抗体２Ａ７の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４８）
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTRYWMHWVMQRPGQDLEWIGEINPINGRTNYNEKFRRKATLTVDKSSSTVYIQFSSLTSEDSAVYFCTREGYRNDYYYAMDFWGRGTSVTVSS
４９．抗体１６Ｄ５の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号４９）
DIVLTQSPGSLAVFLGQRATISCRASQSVSGSIYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKFASNLESGVPARFSGGGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSWEIPYTFGGGTKLEIK
５０．抗体１６Ｄ５の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５０）
EVQLQQSGAEVVKPGASVKLSCTASGFKIEDTYIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNSRYDPNFQGKATIIADTSSYTIYLQLSSLTSEDTAVYYCSSPLSLLRLGGFAYWGQGTLITVSA
５１．抗体ＴＡ９９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５１）
AIQMSQSPASLSASVGETVTITCRASGNIYNYLAWYQQKQGKSPHLLVYDAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKISSLQTEDSGNYYCQHFWSLPFTFGSGTKLEIK
５２．抗体ＴＡ９９の重鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号５２）
VQLQQSGAELVRPGALVKLSCKTSGFNIKDYFLHWVRQRPDQGLEWIGWINPDNGNTVYDPKFQGTASLTADTSSNTVYLQLSGLTSEDTAVYFCTRRDYTYEKAALDYWGQGASVIVSS
５３．ＺＦタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５３）
VSRPGERPFQCRICMRNFSDKTKLRVHTRTHTGEKPFQCRICMRNFSVRHNLTRHLRTHTGEKPFQCRICMRNFSQSTSLQRHLKTHLRGS
５４．ＺＦタンパク質の結合配列（配列番号５４）
tGTAGATGGAg

【実施例】

【0124】

本発明を実施するための特定のモデル
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、該実施例は本発明を例示することを意図しているが、本発明を限定するものではない。

【0125】

別途明記しない限り、本発明で使用される分子生物学実験方法およびイムノアッセイは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｒｅｆｉｎｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５に記載の方法を基本的に参照して行い、製品の製造業者が推奨する条件に従って制限酵素を使用した。当業者は、実施例が本発明を例示として説明するものであり、本発明による保護を得ようとする範囲を限定することを意図していないと理解する。

【0126】

実施例１：細胞内へのタンパク質の送達における細胞透過性ペプチドの効率を評価するためのレポーターシステムの確立
本実施例では、標的タンパク質の細胞内への侵入を媒介することにおける細胞透過性ペプチドの効率を簡単かつ効率的に評価するために、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；配列番号１）をモデルタンパク質として使用して、細胞内へのタンパク質の送達における細胞透過性ペプチドの効率を定量化することができるレポーターシステムを確立した。

【0127】

本実施例で構築されたレポーティングシステムの動作原理を図１Ａに示した。簡単に述べると、試験する細胞透過性ペプチドと融合されるカーゴ分子として、ＧＦＰを使用した。さらに、転写調節因子Ｇａｌ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ；配列番号２）を抗ＧＦＰ ＶＨＨ２（第１の抗ＧＦＰ単一ドメイン抗体；配列番号３）と融合させて、第１の融合タンパク質ＤＢＤ－ＶＨＨ２を形成し、ＶＰ１６活性化ドメイン（ＡＤ；配列番号４）を抗ＧＦＰ ＶＨＨ６（第２の抗ＧＦＰ単一ドメイン抗体；配列番号５）と融合させて、第２の融合タンパク質ＡＤ－ＶＨＨ６を形成し、赤色蛍光タンパク質をコードするｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子（ＲＦＰ；配列番号６）およびルシフェラーゼをコードするＬｕｃ遺伝子（Ｌｕｃ；配列番号７）をＧａｌ４によって認識されるＵＡＳ配列（上流の活性化配列；配列番号８）の制御下に置いた。したがって、試験対象の細胞透過性ペプチドが、カーゴ分子であるＧＦＰを細胞内に送達することができる場合、細胞中で発現しているＤＢＤ－ＶＨＨ２およびＡＤ－ＶＨＨ６は、細胞内に侵入したＧＦＰ分子を特異的に認識してそれに結合し、ＤＢＤとＡＤとを互いに接近させて、ＵＡＳ配列を認識し転写を開始することができる複合体を形成するであろう。この複合体は、ＵＡＳ配列によって調節される下流の遺伝子（ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子およびＬｕｃ遺伝子）の転写および発現を開始するであろう（Ｃｅｌｌ．２０１３ Ａｕｇ１５；１５４（４）：９２８－９３９）。したがって、ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が発する蛍光の強度および／またはルシフェラーゼＬｕｃの活性レベルを検出することにより、細胞内に侵入したＧＦＰ分子の数を決定することができ、それにより、細胞内へのタンパク質の送達におけるＧＦＰと融合した細胞透過性ペプチドの効率を決定することができる。このレポーターシステムでは、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子およびＬｕｃ遺伝子の転写活性化は細胞内ＧＦＰの存在に依存しており、したがって、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の強度および／またはルシフェラーゼＬｕｃの活性を検出することによって、細胞内ＧＦＰレベルを決定することができた。ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質が発する蛍光が強いほど、またはルシフェラーゼＬｕｃの活性が高いほど、細胞中のＧＦＰ分子が多くなり、試験される細胞透過性ペプチドの送達効率が高くなる。

【0128】

簡単かつ効率的な評価のために、本発明者らは、上記のシステムに関与する要素を同じプラスミド内に構築し、それをＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧと命名した。プラスミドＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧに含まれる主な構造要素を図１Ｂに示した。ＵＡＳ：Ｇａｌ４によって認識される上流の活性化配列；ＲＦＰ：赤色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列；２Ａ：ライゲーションヌクレオチド配列；Ｌｕｃ：ルシフェラーゼをコードするヌクレオチド配列；ＢＧＨ：転写終結配列；ＴＭＰ／ＣＡＧ／ＥＦ１ｐ：プロモーター配列；ＤＢＤ：ＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド配列；ＡＤ：ＶＰ１６活性化ドメインをコードするヌクレオチド配列；ＶＨＨ２／ＶＨＨ６：抗ＧＦＰ単一ドメイン抗体ＶＨＨ２／ＶＨＨ６をコードするヌクレオチド配列；Ｈ２Ｂ：核局在化シグナルをコードするヌクレオチド配列。ｉＲＦＰ６７０：遠赤色蛍光タンパク質６７０をコードするヌクレオチド配列（配列番号９）；ＰｕｒＲ：ピューロマイシン耐性遺伝子；ｉｎｓ：インスレーション（ｉｎｓｕｌａｔｉｏｎ）配列；ＴＲ：転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）配列。

【0129】

プラスミドＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンシステムおよびピューロマイシン耐性遺伝子（ＰｕｒＲ）を有していた。プラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした後、ピューロマイシンを耐性スクリーニングに使用して、上記の構造要素をゲノム中に安定に組み込んだ操作された細胞株を得ることができた。ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＦＰプラスミド（ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１）または陰性対照プラスミドを操作された細胞株にトランスフェクトし、蛍光顕微鏡で観察した。結果は、ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした細胞では、ＧＦＰが発する緑色の蛍光およびｍＣｈｅｒｒｙが発する赤色の蛍光が観察され、陰性対照群の細胞では、緑色蛍光シグナルおよび赤色蛍光シグナルが検出されなかったことを示した（図１Ｃ）。

【0130】

したがって、本実施例で構築されたレポーターシステムおよび操作された細胞株を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙの赤色蛍光シグナルおよびその強度を検出することによって細胞内ＧＦＰタンパク質の存在および量を決定することができた。

【0131】

実施例２：細胞透過性ペプチドｃｐｐ２８の設計並びにｃｐｐ２８およびＧＦＰを含む組換えタンパク質の調製
本実施例では、本発明者らは、新しい細胞透過性ペプチドを設計し、細胞透過性ペプチドおよび緑色蛍光タンパク質を含む組換えタンパク質を調製した。

【0132】

本実施例で設計した細胞透過性ペプチドｃｐｐ２８は、以下のアミノ酸配列：ＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号１０）を有した。これに基づき、組換えタンパク質ＧＦＰ－ＣＰＰ２８（配列番号４０）を設計し、ここでは、ＧＦＰのＣ末端をフレキシブルなリンカーＧＧＧＧＳ－ＧＧＧＧＳ－ＧＧＧＧＳ（配列番号３９）を介して細胞透過性ペプチドｃｐｐ２８に連結させた。ＧＦＰ－ＣＰＰ２８をコードするヌクレオチド配列を、ｐＴＯ－Ｔ７原核生物発現ベクター（６×Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチド配列を有する；Ｌｕｏ Ｗｅｎｘｉｎら、Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０００，１６：５３－５７）にクローニングし、これにより、発現プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＧＦＰ－ＣＰＰ２８を得た。

【0133】

さらに、組換えタンパク質ＧＦＰ－ＴＡＴ（配列番号４１）を設計し、ここでは、ＧＦＰのＣ末端をフレキシブルなリンカー（配列番号３９）を介して細胞透過性ペプチドＴＡＴ（ＨＩＶ由来細胞透過性ペプチド；配列番号４２）に連結させた。ＧＦＰ－ＴＡＴをコードするヌクレオチド配列をｐＴＯ－Ｔ７原核発現ベクターにクローニングして、発現プラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ＧＦＰ－ＴＡＴを得た。

【0134】

上記で構築した発現プラスミドをそれぞれ大腸菌Ｓｈｕｆｆｌｅ Ｔ７株に形質転換し、組換えタンパク質を発現させた。続いて、大腸菌中で発現した組換えタンパク質をニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、精製された標的タンパク質ＧＦＰ－ＣＰＰ２８およびＧＦＰ－ＴＡＴを得た。さらに、ＧＦＰタンパク質もまた、同様の方法によって発現および精製した。精製された標的タンパク質（ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８およびＧＦＰ－ＴＡＴ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出し、その結果を図２に示した。結果は、得られた精製タンパク質がすべて９５％より大きい純度を有することを示した。

【0135】

実施例３：細胞内へのタンパク質の送達におけるｃｐｐ２８の効率の評価
本実施例では、実施例１で構築されたレポーターシステムを使用して、緑色蛍光タンパク質の細胞内への送達における細胞透過性ペプチドｃｐｐ２８の効率を評価した。

【0136】

２９３β５細胞を９６ウェルプレート中に１ウェルあたり２０，０００個の細胞密度で接種した。１２時間後、実施例１で構築したＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１６６８０１９）トランスフェクション試薬を用いて細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、培地を除去し、異なる組換えタンパク質（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）を含む培地を添加し、組換えタンパク質（ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８またはＧＦＰ－ＴＡＴ）の濃度は６０μｇ／ｍＬであった。３６時間培養した後、細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を撮影し、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムによって分析した。さらに、陰性対照および陽性対照もまた、次のように設定した：陰性対照群では、細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドをトランスフェクトしたが、組換えタンパク質は培地に添加せず、陽性対照群では、細胞にＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧおよびｐｃＤＮＡ３．１－ＧＦＰプラスミドを同時にトランスフェクトし、組換えタンパク質を培地に添加しなかった。

【0137】

実験結果を図３Ａ～３Ｂに示す。結果は、（１）細胞の各群では、ｉＲＦＰ６７０によって発せられた蛍光を観察することができ、これは、ＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドが細胞に正常にトランスフェクトされたことを示している；（２）陰性対照群では、ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光は基本的に検出することができず（図３Ｂ）、陽性対照群では、最も強いｍＣｈｅｒｒｙ蛍光が検出された（図３Ａ～３Ｂ）；（３）ＧＦＰは単独では基本的に膜を横切って細胞内に侵入することができず、細胞にｍＣｈｅｒｒｙを発現させることを誘導することができなかった（ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光は基本的にこの群の細胞では検出することができなかった）；（４）ｃｐｐ２８およびＴＡＴの両方がＧＦＰを細胞内に送達することができ、次いで、蛍光レポーターシステムを介して下流のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現が活性化され、その結果、細胞がｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発する；（５）細胞内への膜貫通送達によるＧＦＰの送達におけるｃｐｐ２８の効率は、ＴＡＴの効率よりも有意に高かった。

【0138】

さらに、ｃｐｐ２８に対して濃度勾配実験も行い、膜透過効率を評価した。簡単に述べると、２９３β５細胞を９６ウェルプレート中に１ウェルあたり２０，０００個の細胞密度で接種した。１２時間後、実施例１で構築したＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^（商標）２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１１６６８０１９）トランスフェクション試薬を用いて細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、培地を除去し、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８を含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）を添加し、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８の濃度は３０、１０、５、２．５μｇ／ｍＬであった。３６時間培養後、細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を撮影し、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムによって分析した。

【0139】

実験結果を図４Ａ～４Ｂに示す。結果は、ｃｐｐ２８がＧＦＰタンパク質を細胞内に効果的に送達することができ、下流のｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現が蛍光レポーターシステムを介して活性化され、その結果、細胞がｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を発し、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８タンパク質濃度の増加に伴い、ｍＣｈｅｒｒｙの発現量が徐々に増加し、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の蛍光強度が徐々に増加することを示した。

【0140】

さらに、ＧＦＰ分子を細胞内に送達することにおけるｃｐｐ２８の効率を複数の細胞種で評価した。簡単に述べると、示された種類の細胞（ＭＤＣＫ、ＶＥＲＯまたはＨａｃａｔ）を９６ウェルプレート中に１ウェルあたり２０，０００個の細胞密度で接種した。１２時間後、実施例１で構築したＥＨＩＰＳ－Ｕ２ＭＧプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ^（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１６６８０１９）トランスフェクション試薬を用いて細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、培地を除去し、異なる組換えタンパク質を含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）を添加し、組換えタンパク質（ＧＦＰ、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８またはＧＦＰ－ＴＡＴ）の濃度は６０μｇ／ｍＬであった。３６時間培養した後、細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を撮影し、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムによって分析し、細胞上清中に分泌されたｇＬｕｃタンパク質の酵素活性をＰｉｅｒｃ^（商標）Ｇａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅルシフェラーゼ検出システムによって測定した。

【0141】

実験結果を図５に示した。結果は、様々な細胞種（ＭＤＣＫ、ＶＥＲＯおよびＨａｃａｔ細胞）について、ＧＦＰ－ＣＰＰ２８を含む培地中で培養した細胞は、有意に高いｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度および有意に高いルシフェラーゼ活性を有することを示した。これにより、ｃｐｐ２８がＧＦＰ分子を様々な種類の細胞（ＭＤＣＫ、ＶＥＲＯ、およびＨａｃａｔ細胞）内に送達することができ、その送達効率がＴＡＴよりも有意に高いことが示された。

【0142】

実施例４：タンパク質の細胞内への送達におけるｃｐｐ２８の動的プロセスおよび経路
本実施例では、本発明者らは、タンパク質の細胞内への送達におけるｃｐｐ２８の動的プロセスおよび経路を研究した。

【0143】

タンパク質の細胞内への送達におけるｃｐｐ２８の動的プロセスを研究するために、本発明者らは、ｍＲｕｂｙ３タンパク質（配列番号４３；赤色蛍光を発する）を細胞膜上で発現し、核内でｉＲＦＰ６７０タンパク質（遠赤色蛍光を発する）を発現することができるＨｅｌａ細胞株（Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３と命名した）を構築した。レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用した細胞株のイメージング取得および分析により、細胞内緑色蛍光、赤色蛍光、遠赤色蛍光を検出、局在化および定量化することができ、その結果、細胞内ＧＦＰタンパク質、細胞質膜および核を直接観察、分析、および計算することができた。

【0144】

簡単に述べると、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２４ウェルブラックプレート中に１ウェルあたり１０，０００個の細胞密度で接種した。細胞が接着した後、培地を除去し、６０μｇ／ｍＬのＧＦＰ－ｃｐｐ２８を含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）を添加した。５分後、１０分後、２０分後、３０分後、４０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、および２４時間後に、５０μＭヘパリンで洗浄し（細胞膜に非特異的に吸着したＧＦＰタンパク質を除去するため）、次いで細胞を３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでレーザー共焦点顕微鏡で細胞を撮影して、緑色蛍光、赤色蛍光および遠赤色蛍光を観察し、ＧＦＰタンパク質の細胞内局在を決定した。実験結果を図６Ａに示した。

【0145】

さらに、細胞の別のアリコートを採取し、並行して同じ処理を行う前に、５０μＭヘパリンで洗浄し、細胞をＤＤＭ（ｎ－ドデシルβ－Ｄ－マルトシド（ｓｉｇｍａ）４ｍｇ／ｍＬ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で溶解し、次いで二重抗体サンドイッチ法を使用して、細胞中のＧＦＰタンパク質の含有量を検出した。簡単に述べると、４００ｎｇ／ウェルのＧＦＰ結合タンパク質ＧＢＰ４およびＨＲＰ標識抗ＧＦＰ抗体でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート使用して、段階希釈した細胞溶解物（１００μＬ）中のＧＦＰタンパク質を検出し、事前に作成した標準曲線に従って細胞溶解物中のＧＦＰタンパク質の含有量を計算した。実験結果を図６Ｂに示した。

【0146】

図６Ａの結果は、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８を細胞と数分間接触させた後、細胞内でＧＦＰタンパク質を検出することができ、細胞における緑色蛍光強度が１～４時間以内にピーク（プラトー期）に達したことを示した。時間の経過とともに、細胞内のＧＦＰタンパク質の量が減少した。さらに、緑色蛍光と赤色蛍光の共局在化の結果から、ＧＦＰタンパク質が細胞内に侵入した後の一定期間内に、ＧＦＰタンパク質のほとんどがｍＲｕｂｙ３で標識された細胞質膜と共局在することが分かり、これは、ｃｐｐ２８がＧＦＰを有し、かつ、細胞に侵入した後の一定期間内に、該ｃｐｐ２８は主にエンドソームに位置することを示した。時間の経過とともに、ＧＦＰおよびｍＲｕｂｙ３の共局在化シグナルが減少したが、これは、ＧＦＰタンパク質がエンドソームから出て、細胞質に侵入したことを示した。図６Ｂの検出結果は、共焦点顕微鏡による観察結果（図６Ａ）と一致した。

【0147】

さらに、上記のＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞を使用して、ＧＦＰタンパク質を細胞内に送達するｃｐｐ２８の経路を分析した。簡単に述べると、Ｈｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２４ウェルブラックプレート中に１ウェルあたり１０，０００個の細胞密度で接種した。細胞が接着した後、様々なエンドサイトーシス経路阻害剤（アミロリド、クロルプロマジン、フィリピン、サイトカラシンＤ、ダンシルカダベリン、ダイナソール、ナイスタチン）または４℃のみを使用して、細胞を２時間処理した。その後、３０μｇ／ｍｌのＧＦＰ－ｃｐｐ２８タンパク質を添加し、１時間処理した。処理後、細胞をヘパリンで３回洗浄し、次いで３．７％パラホルムアルデヒドで固定し、写真撮影し、レーザー共焦点顕微鏡で観察した。実験結果を図７Ａ～図７Ｂに示す。

【0148】

蛍光写真（図７Ａ）および細胞内ＧＦＰ蛍光強度の分析（図７Ｂ）の結果から、低温（４℃）処理によってＧＦＰ－ｃｐｐ２８の細胞内への侵入が有意に阻害されることが分かり、これは、ｃｐｐ２８がＧＦＰタンパク質を有し、かつ、細胞に侵入することがエネルギー依存性のプロセスであることを示している。さらに、サイトカラシンＤおよびダンシルカダベリンの２つの阻害剤もｃｐｐ２８の膜貫通送達をある程度阻害したが、阻害効果は低温処理よりも弱かった。これにより、ｃｐｐ２８の膜貫通送達がクラスリンを介したエンドサイトーシスを伴うことが示唆された。

【0149】

実施例５：ｃｐｐ２８変異体および細胞内へのタンパク質の送達におけるその効率の評価
本実施例では、本発明者らは、複数のｃｐｐ２８変異体（本出願ではｃｐｐ２８ｏｒｉとも称される）を設計し（ｃｐｐ２８変異体を表２に列挙した）、タンパク質の細胞内への送達におけるこれらの変異体の効率を評価した。

【0150】

【表2】

【0151】

表２に列挙されているｃｐｐ２８変異体の中で、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃおよびｃｐｐ２８ｄはすべて、ｃｐｐ２８の切断型であり、それらのＣ末端は、ｃｐｐ２８と比較してそれぞれ２、５、７および１３個のアミノ酸残基だけ切断され；ｃｐｐ２８ｅ、ｃｐｐ２８ｈ、ｃｐｐ２８ｉ、ｃｐｐ２８ｊおよびｃｐｐ２８ｋは、ｃｐｐ２８と比較して、Ｎ末端に２～５個のアミノ酸残基の付加を有し；ｃｐｐ２８ｏＮＴ－１、ｃｐｐ２８ｏＮＴ－２およびｃｐｐ２８ｏＮＴ－３はすべて、ｃｐｐ２８のＮ末端切断型であり、それらのＮ末端は、ｃｐｐ２８と比較してそれぞれ５、１２および２０アミノ酸だけ切断され；ｃｐｐ２８ａＣ、ｃｐｐ２８ｂＣ、ｃｐｐ２８ｃＣ、ｃｐｐ２８ｄＣは、それぞれｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃ、ｃｐｐ２８ｄの変異体であり、ここでは、Ｃ末端のセリンＳがシステインＣに変異しており；ｃｐｐ２８ｄＲＥＣは、らせん構造を生成する傾向がある２つの正電荷を帯びたアルギニンＲおよび１つのグルタミン酸ＥをＣ末端のシステインの前に付加することにより、ｃｐｐ２８ｄＣに基づいて得られた変異体であり；ｃｐｐ２８ｏＳは、ｃｐｐ２８のＣ末端のシステインＣをセリンＳに変異させることによって得られた変異体であり；ｃｐｐ２８ａＣＱ１、ｃｐｐ２８ａＣＱ２およびｃｐｐ２８ａＣＱ３は、それぞれｃｐｐ２８ａＣのＳＰＲＲＲ構造において無秩序な構造を生成する傾向がある１、２、または３つのセリンＳを、らせん構造を生成する傾向があるグルタミンＱに変異させた変異体であり；ｃｐｐ２８ａＣＮＴ、ｃｐｐ２８ｂＣＮＴ、ｃｐｐ２８ｃＣＮＴおよびｃｐｐ２８ｄＣＮＴは、それぞれｃｐｐ２８ａＣ、ｃｐｐ２８ｂＣ、ｃｐｐ２８ｃＣおよびｃｐｐ２８ｄＣのＮ末端で５個のアミノ酸だけ切断された変異体である。

【0152】

実施例２に記載の方法に従い、表２における設計されたｃｐｐ２８変異体に基づいて、様々な組換えタンパク質（ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｆ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｇ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｈ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｉ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｊ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｋ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８Ｌ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＳ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＲＥＣ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－１、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－２、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｏＮＴ－３、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ１、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ２、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＱ３、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ａＣＮＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｂＣＮＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｃＣＮＴおよびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｄＣＮＴ）を構築、発現および精製し、各ｃｐｐ２８変異体をリンカーを介してＧＦＰのＣ末端に連結させた（配列番号３９）。

【0153】

次いで、実施例３で記載のように、実施例１で構築したレポーターシステムを使用して、緑色蛍光タンパク質の細胞内への送達におけるｃｐｐ２８変異体（ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃ、ｃｐｐ２８ｄ、ｃｐｐ２８ｅ、ｃｐｐ２８ｆ、ｃｐｐ２８ｇ、ｃｐｐ２８ｈ、ｃｐｐ２８ｉ、ｃｐｐ２８ｊ、ｃｐｐ２８ｋおよびｃｐｐ２８Ｌ）の送達効率を評価した。実験結果を図８Ａ～８Ｂに示す。

【0154】

図８Ａの結果は、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂおよびｃｐｐ２８ｃはすべて、ＧＦＰを細胞内に送達する能力を有するが、それらの送達効率はｃｐｐ２８のものよりも低いことを示した。さらに、ｃｐｐ２８ｄは、本質的にＧＦＰを細胞内に送達する能力を喪失した。これらの結果により、ｃｐｐ２８がＣ末端の欠失をある程度許容でき、Ｃ末端で１～７個のアミノ酸残基が切断されたｃｐｐ２８切断型が依然として膜貫通送達によってＧＦＰ分子を送達することができることが示唆された。

【0155】

図８Ｂの結果は、ｃｐｐ２８、ｃｐｐ２８ｅ、ｃｐｐ２８ｇ、ｃｐｐ２８ｈ、ｃｐｐ２８ｊおよびｃｐｐ２８ｋはすべて、細胞内にＧＦＰを送達する能力を有し、ｃｐｐ２８ｅ、ｃｐｐ２８ｇ、ｃｐｐ２８ｈおよびｃｐｐ２８ｊの送達効率は、ｃｐｐ２８の送達効率よりも良好であり、ｃｐｐ２８ｆ、ｃｐｐ２８ｉおよびｃｐｐ２８Ｌは、細胞内にＧＦＰを送達する能力を本質的に喪失したことを示した。

【0156】

さらに、図８Ａ～８Ｂの結果はまた、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃ、ｃｐｐ２８ｅ、ｃｐｐ２８ｇ、ｃｐｐ２８ｈ、ｃｐｐ２８ｊおよびｃｐｐ２８ｋがすべて、用量依存的にＧＦＰを細胞内に送達することができることを示した。

【0157】

さらに、構築したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞モデルを使用して、ｃｐｐ２８、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃ、ｃｐｐ２８ｄおよびＴＡＴがＧＦＰタンパク質を細胞内に送達するプロセスも実施例４に記載の方法によって観察した。実験結果を図９Ａ～９Ｂに示す。

【0158】

図９Ａ～９Ｂの結果は、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂおよびｃｐｐ２８ｃがすべて、ＧＦＰを細胞内に送達する能力を有し、その送達効率はｃｐｐ２８の送達効率よりも低いが、ｃｐｐ２８ｄおよびＴＡＴの送達効率よりもすべて有意に高いことを示した。この結果は基本的に図８Ａの結果と一致した。

【0159】

さらに、実施例４に記載の方法により、構築したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞モデルを使用して、ｃｐｐ２８、ｃｐｐ２８－ｏＳ、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ａＣ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｂＣ、ｃｐｐ２８ｃＣ、ｃｐｐ２８ｄＣおよびｃｐｐ２８ｄＲＥＣがＧＦＰタンパク質を細胞内に送達するプロセスを観察し、タンパク質の細胞内への送達におけるそれらの効率および用量依存特性を評価した。実験結果を図１０Ａ～１０Ｂおよび図１１Ａ～１１Ｂに示す。

【0160】

図１０Ａ～１０Ｂおよび図１１Ａ～１１Ｂの結果は、ｃｐｐ２８のＣ末端システインをセリンに変異させた後、ｃｐｐ２８－ｏＳは依然としてＧＦＰを細胞内に送達することができたが、送達効率はある程度低下し、さらに、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃおよびｃｐｐ２８ｄのＣ末端セリンをシステインに変異させた後、ＧＦＰタンパク質を細胞内に送達するｃｐｐ２８ａＣ、ｃｐｐ２８ｂＣ、ｃｐｐ２８ｃＣ、およびｃｐｐ２８ｄＣの活性が有意に増強されたことを示した。これらの結果により、Ｃ末端システインがｃｐｐ２８の膜貫通送達機能に有益であることが示唆された。さらに、図１１Ａ～１１Ｂは、ＧＦＰタンパク質の細胞内への送達におけるｃｐｐ２８ｄＲＥＣの活性がｃｐｐ２８ｄＣと比較してある程度改善され、該ｃｐｐ２８ｄＲＥＣは１２．５μｇ／ｍＬの低濃度で良好な膜貫通活性を依然として維持したことを示した。

【0161】

同時に、実施例４に記載の方法により、構築したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞モデルを使用して、ｃｐｐ２８、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃ、ｃｐｐ２８ｄ、ｃｐｐ２８ｏＮＴ－１、ｃｐｐ２８ｏＮＴ－２およびｃｐｐ２８ｏＮＴ－３がＧＦＰタンパク質を細胞内に送達するプロセスを観察し、タンパク質の細胞内への送達におけるそれらの効率および用量依存特性を評価した。実験結果を図１２Ａ～１２Ｂに示す。

【0162】

図１２Ａ～１２Ｂの結果は、ｃｐｐ２８ａ、ｃｐｐ２８ｂ、ｃｐｐ２８ｃおよびｃｐｐ２８ｏＮＴ－１はすべて、用量依存効果を伴ってＧＦＰを細胞内に送達する能力を有し、ｃｐｐ２８ｏＮＴ－１およびｃｐｐ２８の送達効率が基本的に同等であったことを示した。さらに、ｃｐｐ２８ｄ、ｃｐｐ２８ｏＮＴ－２およびｃｐｐ２８ｏＮＴ－３は、ＧＦＰを細胞内に送達する能力を本質的に喪失した。これらの結果により、ｃｐｐ２８がＮ末端またはＣ末端の欠失をある程度許容することができることが示唆され、Ｃ末端で１～７個のアミノ酸残基が切断されたｃｐｐ２８切断型は、依然として膜を横切ってＧＦＰ分子を送達することができ、Ｎ末端での１～５個のアミノ酸の欠失は基本的にその膜貫通送達効率に影響を与えなかったが、１つまたは２つのＳＰＲＲＲ構造を欠くｃｐｐ２８ｏＮＴ－２およびｃｐｐ２８ｏＮＴ－３は、基本的にＧＦＰを細胞内に送達する能力を喪失した。

【0163】

さらに、実施例４に記載の方法により、構築したＨｅｌａ－ｐ６３ｍＲｂ３細胞モデルを使用することにより、ｃｐｐ２８、ｃｐｐ２８ａＣＱ１、ｃｐｐ２８ａＣＱ２、ｃｐｐ２８ａＣＱ３、ｃｐｐ２８ａＣＮＴ、ｃｐｐ２８ｂＣＮＴ、ｃｐｐ２８ｃＣＮＴおよびｃｐｐ２８ｄＣＮＴがＧＦＰタンパク質を細胞内に送達するプロセスを観察し、タンパク質の細胞内への送達におけるそれらの効率および用量依存特性を評価した。実験結果を図１３Ａ～１３Ｂに示す。

【0164】

図１３Ａ～１３Ｂの結果は、ｃｐｐ２８ａＣＱ１、ｃｐｐ２８ａＣＱ２およびｃｐｐ２８ａＣＱ３がすべて、ＧＦＰを細胞内に送達する能力を有し、それらの送達効率はｃｐｐ２８の送達効率に匹敵するか、またはそれよりも幾分良好であることを示した。さらに、Ｎ末端切断およびＣ末端切断を組み合わせたｃｐｐ２８ａＣＮＴ、ｃｐｐ２８ｂＣＮＴ、ｃｐｐ２８ｃＣＮＴおよびｃｐｐ２８ｄＣＮＴもすべて、ＧＦＰを細胞内に送達する能力があり、ｃｐｐ２８ａＣＮＴ、ｃｐｐ２８ｂＣＮＴおよびｃｐｐ２８ｃＣＮＴの送達効率は、低濃度（１２．５μｇ／ｍＬ）のｃｐｐ２８の送達効率と同等であった。

【0165】

実施例６：ＧＦＰおよびｃｐｐ２８またはその変異体を含む組換えタンパク質の分析
ＧＦＰおよびｃｐｐ２８またはその変異体を含む組換えタンパク質について、高速液体蛍光クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。結果を図１４Ａに示した。結果は、ＧＦＰ単独およびＧＦＰ－ＴＡＴタンパク質のピーク時間は約１４分であったが、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅを例として取り上げると、組換えタンパク質は、それぞれ約１１分および１４分のピーク時間で２つのピークがあり、蛍光検出分析は、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅの蛍光ピークもそれぞれのピーク時間に現れ、約１１分におけるタンパク質ピークがより強い蛍光値を有したことを示した。この結果は、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅが多量体を生成したことを示している。

【0166】

さらに、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰおよびＧＦＰ－ＴＡＴを例として取り上げると、これらのタンパク質を分析用超遠心機Ｏｐｔｉｍａ ＸＬ－１００（ＡＵＣ）によって分析し、これらのタンパク質の沈降係数を決定した。結果を図１４Ｂに示した。結果は、多量体の形成を伴うＧＦＰ－ｃｐｐ２８が、約３４Ｓの沈降係数および約２２００ｋＤの相対分子量を有し、純粋なＧＦＰおよびＧＦＰ－ＴＡＴタンパク質が、約２．４Ｓの沈降係数および約３０ｋＤの相対分子量を有することを示した。この結果は、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８が、純粋なＧＦＰタンパク質分子に対して約７０の凝集体の巨大分子を形成したことを示した。

【0167】

上記の結論に基づいて、本発明者らは、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ^（商標）Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ樹脂ＨｉＰｒｅｐ^（商標）Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ＨＲカラム、２６／６０（３２０ｍｌ）分取モレキュラーシーブを使用して、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーによって得られた組換えタンパク質（ＧＦＰ－ＴＡＴ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｇ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｈ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｊ）をさらに精製した。結果を図１５Ａに示した。結果は、タンパク質ＧＦＰ－ＴＡＴの場合、これは主に単量体の形で存在し、タンパク質ＧＦＰ－ｃｐｐ２８、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｅ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｇ、ＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｈおよびＧＦＰ－ｃｐｐ２８ｊの場合、標的タンパク質は２つの異なるピーク時間で収集することができ、ピーク時間の短いタンパク質（多量体）の割合は、ピーク時間の長いタンパク質（モノマー）の割合よりもはるかに高かったことを示した。この結果は、図１４Ａおよび１４Ｂに示した結果と一致した。さらに、回収した様々なタンパク質画分（多量体画分および単量体画分）をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。結果を図１５Ｂに示した。結果は、変性（すなわち、多量体が単量体に解離した）後、これらのタンパク質はすべて約３０ｋｄのサイズであったことを示した。さらに、実施例３に記載されるように、実施例１で構築されたレポーターシステムを使用して、緑色蛍光タンパク質の細胞内への送達における効率について、収集された様々なタンパク質画分（多量体画分および単量体画分）を評価した。実験結果を図１５Ｃに示した。結果は、多量体タンパク質の細胞侵入効率が単量体タンパク質の細胞侵入効率よりも有意に高いことを示した。

【0168】

実施例６：抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質の細胞侵入効率の評価
本実施例では、本発明者らは、ｃｐｐ２８ｏｒｉが抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質（ＡｃｒＩＩＡ４）を細胞内に送達し、Ｃａｓ９の遺伝子編集を阻害する効果を発揮することができるかどうかを検証した。

【0169】

ＣＲＩＳＰＲ－ｃａｓ９システムは現在、非常にポピュラーな遺伝子編集システムであり、その高い遺伝子編集効率はまた、研究者を悩ませるオフターゲット効果を伴う。２０１７年にＣｅｌｌに公表された文献（Ｃｅｌｌ．２０１７ Ｊａｎ１２；１６８（１－２）：１５０－１５８．ｅ１０）では、タンパク質ＡｃｒＩＩＡ４（本出願では抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質とも呼ばれる。配列番号４４）はＣＲＩＳＰＲタンパク質の作用を阻害することができ、このタンパク質は哺乳動物細胞でも阻害効果を発揮することができることが報告されている。本実施例では、本発明者らは、原核発現システムにより、細胞透過性ペプチドｃｐｐ２８に融合された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質（抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉ；配列番号４５）を調製および精製し、その細胞侵入効率を評価した。

【0170】

簡単に述べると、本発明者らは、抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質の膜貫通効果を検証するために蛍光レポーターシステムを構築した。図１６Ａに示すように、蛍光レポーターシステムは、赤色蛍光ｍＲｕｂｙ３遺伝子、ＥＧＦＰタンパク質のｓｇＲＮＡ配列、およびＴＲＥプロモーターによって促進されるＥＧＦＰ遺伝子を有するプラスミド（以下、レポータープラスミドと称する）を使用した。ＥＦ１ｐ／Ｕ６／ＴＲＥｐ：プロモーター配列；Ｈ２Ｂ：核局在化シグナルをコードするヌクレオチド配列；ｍＲｕｂｙ３：ｍＲｕｂｙ３遺伝子のヌクレオチド配列；２Ａ：連結ヌクレオチド配列；ＢＧＨ：転写終結配列；ｓｇＲＮＡ：ｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；ＥＧＦＰ：ＥＧＦＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列；ＰｕｒＲ：ピューロマイシン耐性遺伝子；ｉｎｓ：インスレーション配列；ＴＲ：転位配列。

【0171】

レポータープラスミドおよびｃａｓ９遺伝子（ａｄｄｇｅｎｅＩＤ：５２９６１）を含むプラスミド（以下、ｃａｓ９プラスミドと称する）を細胞に同時トランスフェクトしたとき、細胞はＣａｓ９タンパク質（配列番号４６）を発現し、Ｃａｓ９タンパク質はＥＧＦＰタンパク質のｓｇＲＮＡ配列を介してＥＧＦＰ遺伝子を編集し、その結果、細胞はＥＧＦＰタンパク質を正常に発現できなかった。したがって、細胞は、緑色蛍光を発しないか、または非常に弱い緑色蛍光のみを発する。

【0172】

さらに、本発明者らは、ｐＴＴ５－抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉプラスミド（真核細胞にトランスフェクトし、真核細胞において抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質を発現するために使用された）、並びにプラスミドｐＴＯ－Ｔ７－ｈｉｓ－抗ＣＲＩＳＰＲおよびｐＴＯ－Ｔ７－ｈｉｓ－抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉ（原核細胞にトランスフェクトし、原核細胞において６^＊Ｈｉｓタグを有する抗ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質を発現するために使用され、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびｃｐｐ２８ｏｒｉは配列番号３９によって表されるフレキシブルなリンカーによって連結されている）を構築した。

【0173】

上記のように構築されたレポータープラスミド、ｃａｓ９プラスミドおよびｐＴＴ５－抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉプラスミドを使用して、２９３β５細胞において蛍光レポーターシステムの機能を検証した。簡単に述べると、２９３β５細胞に、示されたプラスミドまたはプラスミドの組み合わせをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をドキソルビシンを含むＤＭＥＭ培地中で１２時間培養し、次いで細胞内ＥＧＦＰ蛍光を撮影し、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムを使用して分析した。実験結果を図１６Ｂ～１６Ｃに示す。結果は、レポータープラスミドのみをトランスフェクトした細胞では、明らかなＥＧＦＰ蛍光発現を観察することができた。レポータープラスミドおよびｃａｓ９プラスミドを同時にトランスフェクトした細胞では、非常に弱い緑色の蛍光のみが観察され、レポータープラスミド、ｃａｓ９プラスミドおよびｐＴＴ５空のプラスミドを同時にトランスフェクトした細胞では、非常に弱い緑色の蛍光のみが観察され、ｐＴＴ５－抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉプラスミド、レポータープラスミドおよびｃａｓ９プラスミドを同時にトランスフェクトした細胞では、より明白な緑色の蛍光が観察された。これらの結果は、Ｃａｓ９タンパク質が細胞中で遺伝子編集機能を果たし、ＥＧＦＰタンパク質の発現を阻害した一方、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質の遺伝子編集機能を阻害することができ、ＥＧＦＰタンパク質の発現を回復させたことを示した。平均蛍光強度分析の結果（図１６Ｃ）は、抗ＣＲＩＳＰＲがＥＧＦＰ蛍光の約４０％を回復させたことを示した。したがって、構築された蛍光レポーターシステムは、ＥＧＦＰ蛍光強度によって抗ＣＲＩＳＰＲの機能を示すことができる。

【0174】

実施例２に記載の方法に従って、抗ＣＲＩＳＰＲおよび抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質を大腸菌中で発現させ、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、精製された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質が９５％以上の純度を有し、精製された抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質が次の細胞実験で使用することができる９０％以上の純度を有することを示した。

【0175】

２９３β５細胞にレポータープラスミドおよびｃａｓ９プラスミドを同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、タンパク質を指定濃度（２０、４０、８０または１００μｇ／ｍｌ）の抗ＣＲＩＳＰＲまたは抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉを含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）に培地を交換し、細胞を３７℃で１２時間連続して培養した。その後、培地を通常の培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）に交換し、トランスフェクションの４８時間後、培地を、ドキソルビシンを含むＤＭＥＭ培地に交換した。さらに１２時間培養した後、２９３β５細胞のＥＧＦＰ蛍光を撮影し、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムによって分析した。実験結果を図１７Ａに示した。結果は、抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質を培地に添加することにより、細胞内ＥＧＦＰ蛍光強度を部分的に回復することができ、タンパク質濃度の増加に伴い、ＥＧＦＰ蛍光回復率が増加することを示した。対照的に、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を培地に添加しても、細胞内ＥＧＦＰ蛍光強度は回復しなかった。この結果は、ｃｐｐ２８ｏｒｉが抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を細胞内に送達し、細胞中でＣａｓ９の機能を阻害することができることを示している。

【0176】

別の実験では、２９３β５細胞にレポータープラスミドおよびｃａｓ９プラスミドを同時にトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、示された濃度（１００、５０または２５μｇ／ｍｌ）の抗ＣＲＩＳＰＲまたは抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉまたはｃｔｒｌ－タンパク質－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質を含む培地（ＤＭＥＭ、ギブコ＋１０％ギブコＦＢＳ）に培地を交換し、細胞を３７℃で１２時間連続して培養した。その後、培地を通常の培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）に交換し、トランスフェクションの４８時間後、培地をドキソルビシンを含むＤＭＥＭ培地に交換し、１２時間培養を続けた。この実験では、陰性対照および陽性対照もまた、次のように設定した：陰性対照では、使用した培地は組換えタンパク質を含まず、レポータープラスミド、またはレポータープラスミドおよびｃａｓ９プラスミド、またはレポータープラスミドおよび抗ＣＲＩＳＰＲを発現するプラスミド、またはレポータープラスミドおよび空のプラスミド、またはレポータープラスミド、ｃａｓ９プラスミドおよび空のプラスミドを細胞にトランスフェクトし、陽性対照群では、使用した培地は組換えタンパク質を含まず、レポータープラスミド、ｃａｓ９プラスミドおよび抗ＣＲＩＳＰＲを発現するプラスミドを細胞にトランスフェクトした。

【0177】

インキュベーション後、細胞をＤＤＭ溶解物で溶解し、細胞内ＥＧＦＰタンパク質の含有量をネイティブＰＡＧＥ（ネイティブゲル電気泳動）およびウェスタンブロットで検出した。ネイティブＰＡＧＥ分析では、レポータープラスミド上に有するｍＲｕｂｙ３蛍光遺伝子を内部参照標準として使用し、ウェスタンブロット分析では、遺伝子チューブリンを内部参照標準として使用した。実験結果を図１７Ｂ～１７Ｃに示す。

【0178】

ネイティブＰＡＧＥ分析の結果（図１７Ｂ）は、抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉプラスミドをトランスフェクションに使用したとき、または抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質を細胞培養培地に添加したときに、細胞において有意なＥＧＦＰタンパク質シグナル（緑色蛍光）を検出することができ、抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質濃度の増加に伴い、ＥＧＦＰタンパク質シグナル（緑色蛍光）が増強したことを示した。しかしながら、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質またはｃｔｒｌ－タンパク質－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質を細胞培養培地に添加したとき、ＥＧＦＰタンパク質シグナルは基本的に検出されないか、または非常に弱いＥＧＦＰタンパク質シグナルが検出された。ウェスタンブロット分析の結果（図１７Ｃ）は、ネイティブＰＡＧＥ分析の結果と一致した。図１７Ｂ～１７Ｃの結果は、ｃｐｐ２８ｏｒｉが抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を細胞内に送達することができ、その結果、それが細胞中でＣａｓ９の機能を阻害することができることを示した。

【0179】

さらに、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、細胞から細胞ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ増幅を行い、使用した２つのプライマーは、それぞれＥＧＦＰ遺伝子配列のｓｇＲＮＡ結合位置の上流および下流の約２００ｂｐの位置を標的とした。ＰＣＲ増幅産物を回収し、第二世代配列決定技術に基づいて配列決定および分析した。実験結果を図１７Ｄに示した。結果は、次のことを示した：（１）元のＥＧＦＰ遺伝子配列と比較して、Ｃａｓ９の遺伝子編集機能は標的配列（ＥＧＦＰ遺伝子配列）の変異を誘発することができ、変異率は約１５％であった；（２）抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉプラスミドの同時トランスフェクションまたは培地への抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質の添加は、Ｃａｓ９の機能を阻害し、標的配列の変異率を低下することができた（１０％未満）、（３）抗ＣＲＩＳＰＲ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質の効果は、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の効果よりも有意に良好であった（ｐ＜０．００１）。この結果は、ｃｐｐ２８ｏｒｉが抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を細胞内に送達することができ、その結果、それが細胞中でＣａｓ９の機能を阻害することができることを示した。

【0180】

実施例７：ｃｐｐ２８ｏｒｉが抗体を細胞内に送達する効率の評価
この実施例において、本発明者らは、ｃｐｐ２８ｏｒｉが抗体を細胞内に送達し、抗体機能を発揮することができるかどうかを検証した。

【0181】

フレキシブルなリンカー（配列番号３９）を介して、ｃｐｐ２８ｏｒｉを抗ＨＢｅＡｇキメラ抗体２Ａ７（そのＶＬおよびＶＨ配列は、それぞれ配列番号４７および４８に示した）、抗ＨＢｃＡｇキメラ抗体１６Ｄ５（そのＶＬおよびＶＨ配列をそれぞれ配列番号４９および５０に示した）、および抗チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＹＲＰ１）キメラ抗体ＴＡ９９（そのＶＬおよびＶＨ配列を配列番号５１および５２に示した）のＦｃのＣ末端にライゲートし、それにより、組換えタンパク質２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉおよびＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉを得られた。それらの中で、抗体ＴＡ９９は、細胞内ＴＹＲＰ－１抗原を特異的に標的とし、その発現を低下することができ、１６Ｄ５抗体は、細胞内ＨＢｃＡｇ抗原を特異的に標的にして除去し、ＨＢＶ ＤＮＡのレベルを低下させることができ、２Ａ７抗体は、ＨＢｅＡｇを特異的に標的にすることができた（しかし、ＨＢｃＡｇは標的とすることはできなかった）。

【0182】

抗体２Ａ７、１６Ｄ５およびＴＡ９９、並びに組換えタンパク質２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉおよびＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉを一過性トランスフェクションによりＥｘｐｉＣＨＯ細胞において発現させた。１２日後、細胞上清を回収し、細胞によって発現された抗体または組換えタンパク質をプロテインＡカラムによって精製した。精製された抗体または組換えタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット（抗ヒトＩｇＧ）によって検出した。実験結果を図１８に示した。結果は、精製された抗体または組換えタンパク質が９５％より大きい純度を有し、次の細胞実験に使用することができることを示した。

【0183】

ＨｅｐＧ２－Ｎ１０、ＨｅｐＧ２－Ｃ３Ａ、Ｈｅｌａ、ＭＮＴ－１およびＡ３７５細胞の５つの株を９６ウェルプレートに接種した。１２時間後、培地を除去し、１００μｇ／ｍｌの２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、２Ａ７、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５、ＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉまたはＴＡ９９を含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）を添加し、細胞を３７℃で６時間連続して培養した。その後、細胞をヘパリンで３回洗浄し、細胞内抗体を免疫蛍光法により検出した。実験結果を図１９に示した。結果は、ｃｐｐ２８ｏｒｉと融合した抗体（２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、ＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉ）を様々な種類の細胞中で検出することができた一方、ｃｐｐ２８ｏｒｉと融合していない抗体（２Ａ７、１６Ｄ５、ＴＡ９９）を細胞中に検出することができなかったことを示した。これにより、ｃｐｐ２８ｏｒｉが様々な種類の細胞に抗体を効果的に運搬することができたことが示された。

【0184】

ｃｐｐ２８ｏｒｉによって細胞内に送達された抗体が依然として機能することができるかどうかを検証するために、次の実験も行った。

【0185】

ＭＮＴ－１細胞を２４ウェルプレート中に１ウェルあたり３０，０００個の細胞密度で接種した。翌日、培地を除去し、２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ（１００μｇ／ｍｌ；対照抗体として使用）、ＴＡ９９（１００μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬ）、またはＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉ（１００μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬ）を含む培地（ＤＭＥＭを添加、１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳを含むまたは含まない、Ｇｉｂｃｏ）を添加し、細胞を３７℃で６時間連続的にインキュベートした。その後、培地を通常の培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）に交換し、細胞を４８時間連続して培養した。次いで、細胞をＤＤＭ溶解物で溶解し、溶解物をウェスタンブロット分析に供して、その中のＴＹＲＰ－１抗原のレベルを検出した。実験結果を図２０に示した。結果は、ＴＹＲＰ－１抗原の発現が、ＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉで処理された細胞において有意に減少したことを示した。これにより、ｃｐｐ２８ｏｒｉがＴＡ９９抗体を細胞内に送達することができること、および細胞に侵入したＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉがその生物学的機能を正常に発揮することができること（すなわち、細胞内ＴＹＲＰ－１抗原を特異的に標的とし、その発現を低下させることができること）が示された。

【0186】

ＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞を２４ウェルプレート中に１ウェルあたり３０，０００個の細胞密度で接種した。翌日、培地を除去し、１００μｇ／ｍｌの２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、２Ａ７、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５、ＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉまたはＴＡ９９抗体を含む培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）を添加し、細胞を３７℃で６時間連続して培養した。その後、培地を通常の培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）に交換し、細胞を４８時間連続して培養した。次いで、細胞をＤＤＭ溶解物で溶解し、溶解物をウェスタンブロット分析に供して、ＨＢｃＡｇ、ＴＲＩＭ２１および抗体のレベルを検出した。さらに、細胞培養上清を回収し、ＨＢｅＡｇ抗原およびＨＢＶ ＤＮＡのレベルを検出した。実験結果を図２１Ａ～２１Ｂに示す。

【0187】

図２１Ａの結果は、２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉ、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉおよびＴＡ９９－ｃｐｐ２８ｏｒｉが細胞溶解物中で検出されたことを示し、これにより、これらのタンパク質が細胞内に送達されたことが示された。さらに、図２１Ａの結果は、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉがＨｅｐＧ２－Ｎ１０細胞においてＨＢｃＡｇ抗原を有意に除去し、その細胞内レベルを低下させることができることを示した。以前の研究では、ＴＲＩＭ２１が細胞内抗体の受容体であり、抗体のＦｃに結合することによって抗体のユビキチン化および分解を媒介することが示されている。細胞溶解物中のＴＲＩＭ２１タンパク質のレベルを検出することにより、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉが細胞内ＴＲＩＭ２１を減少させて、細胞に侵入した後にＨＢｃＡｇクリアランスを達成し得ることが分かった（図２１Ａ）。さらに、図２１Ａの結果はまた、２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉが基本的に細胞内ＨＢｃＡｇレベルに対して影響を及ぼさなかったが、それでもＴＲＩＭ２１のレベルを有意に低下させたことを示した。

【0188】

図２１Ｂの結果は、細胞上清中のＨＢｅＡｇレベルが２Ａ７－ｃｐｐ２８ｏｒｉの作用下で有意に低下し、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉ処理もＨＢｅＡｇレベルをある程度阻害したことを示した。さらに、図２１Ｂの結果はまた、１６Ｄ５－ｃｐｐ２８ｏｒｉでの処理によって細胞上清中のＨＢＶ ＤＮＡレベルを抑制することができることを示し、これは、１６Ｄ５抗体がＨＢＶトランスジェニックマウスにおいてＨＢＶ ＤＮＡレベルを低下させることができるという以前の発見と一致した。

【0189】

図２１Ａ～２１Ｂの結果は、ｃｐｐ２８ｏｒｉが様々な抗体の細胞内への膜貫通送達が可能であるだけでなく、各抗体の特定の機能を正確に発揮することもできることを示した。例えば、送達された抗体は、特定の抗原（高度に重複する配列を有する２つの抗原であるＨＢｅＡｇとＨＢｃＡｇでも）を正確に認識して標的にすることができた。

【0190】

実施例８：ｃｐｐ２８ｏｒｉがＤＮＡを細胞内に送達する効率の評価
本実施例では、本発明者らは、ｃｐｐ２８ｏｒｉがＤＮＡに結合し、それを細胞内に送達してその機能を発揮することができるかどうかを検証した。

【0191】

以前の研究（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５Ｎｏｖ；１２（１１）：１０８５－９０）は、ジンクフィンガータンパク質（以下、ＺＦと称する）がＤＮＡに効率的に結合することができることを示した。したがって、ｃｐｐ２８ｏｒｉをフレキシブルなリンカー（配列番号３９）を介してＺＦタンパク質（配列番号５３）のＣ末端にライゲートすることにより、組換えタンパク質ＺＦ－ｃｐｐ２８ｏｒｉを構築した。

【0192】

実施例２に記載の方法に従って、ＺＦ－ｃｐｐ２８ｏｒｉを大腸菌中で発現させ、ニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、精製されたＺＦ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質が９０％より大きい純度を有し、次の細胞実験で使用することができることを示した。さらに、ｐＴＴ５－ｍＲｕｂｙ３プラスミドのｍＲｕｂｙ３遺伝子の下流にジンクフィンガータンパク質の結合配列（配列番号５４）を挿入し、プラスミドｐＴＴ５－ｍＲｕｂｙ３－ＺＦモチーフを得た。

【0193】

２９３β５細胞を９６ウェルプレート中に１ウェルあたり２０，０００個の細胞密度で接種した。翌日、ＺＦ－ｃｐｐ２８ｏｒｉタンパク質（６０μｇ／ｍＬ）およびプラスミドｐＴＴ５－ｍＲｕｂｙ３－ＺＦモチーフ（０．８μｇ）をインビトロで培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）で希釈し、３７℃で１時間事前反応させた。次いで、９６ウェルプレートの培地を除去し、事前反応混合物を細胞に添加した。６時間後、事前反応混合物を除去し、通常の培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ＋１０％ＧｉｂｃｏＦＢＳ）を添加し、培養を４８時間続けた。さらに、ＰＥＩトランスフェクション試薬を使用して、プラスミドｐＴＴ５－ｍＲｕｂｙ３－ＺＦモチーフも２９３β５細胞にトランスフェクトし、これを陽性対照として使用した。次いで、２９３β５細胞中のｍＲｕｂｙ３の蛍光を撮影し、レーザー共焦点ハイコンテントイメージング分析システムによって分析した。実験結果を図２２に示した。結果は、ＺＦ－ｃｐｐ２８ｏｒｉがｐＴＴ５－ｍＲｕｂｙ３－ＺＦモチーフプラスミドを２９３β５細胞内に効果的に送達して、赤色蛍光タンパク質ｍＲｕｂｙ３を発現させることができ、その送達効率は、ＰＥＩトランスフェクション試薬の送達効率よりも高かった。

【0194】

本発明の特定の実施形態を詳細に説明したが、当業者は、開示されたすべての教示に照らして詳細に様々な修正および変更を行うことができること、およびこれらの変更がすべて本願明の範囲内であることを理解するであろう。本発明の完全な範囲は、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって与えられる。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図17C】

【図17D】

【図18A】

【図18B】

【図19】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【配列表】

2023534054000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-03-17

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞透過性ペプチドまたはその切断型であって、前記細胞透過性ペプチドは、式Ｉによって表される構造：
Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＰＲＲＲＸ_１６Ｘ_１７Ｘ_１８ＰＲＲＲＲＸ_２４ＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式Ｉ
を有し、式中、
Ｘ_１～Ｘ_３は、各々独立して、アミノ酸残基Ｒ、ＫおよびＨからなる群から選択され、
Ｘ_４は、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、
Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_１０は、アミノ酸残基Ｒ、Ｋ、およびＨからなる群から選択され、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_１６は、アミノ酸残基Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｓ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_１７は、アミノ酸残基Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_１８は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_２４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_２６は、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択され、
Ｘ_３４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択され、
Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３８は、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３９は、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～１０個のアミノ酸残基が切断され、および／またはＣ末端で１～１４個のアミノ酸残基が切断され、
前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型は、生物学的分子の細胞内への膜貫通送達を行うことができる、
細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項2】

（１）Ｘ_１～Ｘ_３が、アミノ酸残基Ｒである；
（２）Ｘ_４が、アミノ酸残基Ｒ、ＣおよびＧからなる群から選択される；
（３）Ｘ_５が、アミノ酸残基Ｒ、ＮおよびＧからなる群から選択される；
（４）Ｘ_６が、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、ＰおよびＳからなる群から選択される；
（５）Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、ＤおよびＱからなる群から選択される；
（６）Ｘ_８が、アミノ酸残基ＲおよびＡからなる群から選択される；
（７）Ｘ_９が、アミノ酸残基Ｇ、ＰおよびＴからなる群から選択される；
（８）Ｘ_１０が、アミノ酸残基Ｒである；
（９）Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、ＱおよびＳからなる群から選択される；
（１０）Ｘ_１６が、アミノ酸残基Ｔである；
（１１）Ｘ_１７が、アミノ酸残基Ｐである；
（１２）Ｘ_１８が、アミノ酸残基ＳおよびＱからなる群から選択される；
（１３）Ｘ_２４が、アミノ酸残基Ｓである；
（１４）Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、ＣおよびＱからなる群から選択される；
（１５）Ｘ_３２が、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される；
（１６）Ｘ_３３が、アミノ酸残基ＱおよびＫからなる群から選択される；
（１７）Ｘ_３４が、アミノ酸残基ＳおよびＣからなる群から選択される；
（１８）Ｘ_３５が、アミノ酸残基ＲおよびＰからなる群から選択される；
（１９）Ｘ_３６が、アミノ酸残基ＥおよびＡからなる群から選択される；
（２０）Ｘ_３７が、アミノ酸残基Ｐ、ＳおよびＣからなる群から選択される；
（２１）Ｘ_３８が、アミノ酸残基ＱおよびＳからなる群から選択される；
（２２）Ｘ_３９が、アミノ酸残基Ｃ、ＳおよびＮからなる群から選択される；および
（２３）前記生物学的分子は、目的のペプチドまたは目的の核酸である、
からなる群から選択される１つまたは複数の特徴を有する、請求項１に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項3】

前記細胞透過性ペプチドが、式ＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＸ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９ＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７Ｘ_３８Ｘ_３９Ｃ
式ＩＩ
を有し、式中、
Ｘ _４ は、アミノ酸残基Ｒ、Ｃ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗからなる群から選択され、
Ｘ_５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗからなる群から選択され、
Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍからなる群から選択され、
Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｅからなる群から選択され、
Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍからなる群から選択され、
Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍからなる群から選択され、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｑ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｗからなる群から選択され、
Ｘ_３２は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗからなる群から選択され、
Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ｒ、Ｈからなる群から選択され、
Ｘ_３４は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗからなる群から選択され、
Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍからなる群から選択され、
Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｄからなる群から選択され、
Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗからなる群から選択され、
Ｘ_３８は、アミノ酸残基Ｑ、Ｓ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗからなる群から選択され、
Ｘ_３９は、アミノ酸残基Ｃ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗからなる群から選択される、
請求項１に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項4】

（１）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～５個のアミノ酸残基が切断され、および／またはＣ末端で１～１４個のアミノ酸残基が切断される；
（２）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～５個のアミノ酸残基が切断され、および／またはＣ末端で１～８個のアミノ酸残基が切断される；
（３）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸残基が切断される；
（４）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｃ末端で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４個のアミノ酸残基が切断される；
（５）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で２、３、５、または１０個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端では切断されていないか、または１～８個のアミノ酸残基が切断される；
（６）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で２、３、５または１０個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端では切断されていないか、または１、３、６もしくは８個のアミノ酸残基が切断される；
（７）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で２、３または５個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端では切断されていないか、または１～１４個のアミノ酸残基が切断される；
（８）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で１～５個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端では切断されていないか、または１、３、６、８もしくは１４個のアミノ酸残基が切断される；
（９）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｎ末端で２、３または５個のアミノ酸残基が切断され、Ｃ末端では切断されていないか、または１、３、６、８もしくは１４個のアミノ酸残基が切断される；および
（１０）前記細胞透過性ペプチドと比較して、前記切断型は、Ｃ末端で１４個のアミノ酸残基が切断され、Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｃである、
のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項１に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項5】

前記細胞透過性ペプチドが、式ＩＩＩによって表される構造：
ＲＲＲＧＸ_５Ｘ_６ＲＸ_８Ｘ_９ＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２ＱＸ_３４Ｘ_３５Ｘ_３６Ｘ_３７ＳＮＣ
式ＩＩＩ
を有し、式中、
Ｘ _５ は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_６は、アミノ酸残基Ｒ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_８は、アミノ酸残基Ｒ、Ａ、Ｋ、Ｈ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_９は、アミノ酸残基Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｃ、Ｙ、Ｗ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_３２およびＸ_３４は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３５は、アミノ酸残基Ｒ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩおよびＭからなる群から選択され、
Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択され、
Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｐ、Ｓ、Ｃ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される、
請求項１に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項6】

（１）前記切断型が、式ＩＶによって表される構造：
Ｘ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６
式ＩＶ
を含み、式中、
Ｘ _１１ が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_１８が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_２６が、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択される；
（２）前記切断型が、式Ｖによって表される構造：
Ｘ_６Ｘ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＸ_３２
式Ｖ
を含み、式中、
Ｘ _６ が、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_７が、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、
Ｘ_１１が、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_１８およびＸ_２６が、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３２が、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される；
（３）前記切断型が、式ＶＩによって表される構造：
Ｘ_６Ｘ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＸ_１８ＰＲＲＲＲＳＱＸ_２６ＰＲＲＲＲＳＸ_３３ＳＲＸ_３６Ｘ_３７
式ＶＩ
を含み、式中、
Ｘ _６ は、アミノ酸残基Ｒ、Ｎ、Ｇ、Ｋ、Ｈ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_７は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_１８およびＸ_２６は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択され、
Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択され、
Ｘ_３７は、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択される；および
（４）前記切断型が、式ＶＩＩによって表される構造：
ＲＸ_７ＲＧＲＸ_１１ＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＸ_３２Ｘ_３３Ｘ_３４ＲＸ_３６Ｘ_３７ＱＸ_３９
式ＶＩＩ
を含み、式中、
Ｘ _７ は、アミノ酸残基Ｒ、Ｄ、Ｑ、Ｋ、Ｈ、Ｎ、Ｇ、Ｃ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、ＷおよびＥからなる群から選択され、
Ｘ_１１は、アミノ酸残基Ａ、Ｓ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３２、Ｘ_３４、Ｘ_３７およびＸ_３９は、各々独立して、アミノ酸残基Ｓ、Ｃ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ｔ、ＹおよびＷからなる群から選択され、
Ｘ_３３は、アミノ酸残基Ｑ、Ｋ、Ｎ、Ｓ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｙ、Ｗ、ＲおよびＨからなる群から選択され、
Ｘ_３６は、アミノ酸残基Ｅ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＭおよびＤからなる群から選択される、
のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項１に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項7】

前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型が、配列番号１０～１３、１５、１７～１８、２０～２１、２３～２９および３２～３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型および目的のペプチドを含む、融合タンパク質。

【請求項9】

（１）前記目的のペプチドが、前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に直接共有結合で連結されているか、または前記目的のペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に共有結合で連結されている；
（２）前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型が、前記目的のペプチドのＮ末端にまたはＣ末端に連結されている；
（３）前記目的のペプチドが、抗体である、遺伝子編集に関連するタンパク質である、活性タンパク質もしくは追跡可能なタンパク質である、またはＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質である；
（４）前記融合タンパク質が、追加のドメインをさらに含む；および
（５）前記融合タンパク質が、タグドメインおよび／または抗体重鎖定常領域をさらに含む、
のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項８に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

請求項１～７のいずれか一項に記載の前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型と、目的の分子とを含む、コンジュゲート。

【請求項11】

（１）前記目的の分子が、目的のタンパク質または目的の核酸である；
（２）前記目的の分子が、前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に直接共有結合で連結されているか、または前記目的の分子がリンカーを介して前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に共有結合で連結されているか、または前記目的の分子が、前記細胞透過性ペプチドもしくはその切断型に非共有結合で連結されている；および
（３）前記目的の分子が、検出可能な標識、細胞傷害剤、抗体、遺伝子編集に関連するタンパク質、活性タンパク質もしくは追跡可能なタンパク質、またはＤＮＡ分子に結合可能なタンパク質である、
のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項１０に記載のコンジュゲート。

【請求項12】

請求項８～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１０～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含む、多量体。

【請求項13】

請求項８～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質または請求項１０～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲートまたは請求項１２に記載の多量体と、前記融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体と非共有結合または複合体形成している成分とを含む、複合体。

【請求項14】

請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドもしくはその切断型または請求項８～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。

【請求項15】

請求項１４に記載の単離された核酸分子を含む、ベクター。

【請求項16】

請求項１４に記載の単離された核酸分子または請求項１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項17】

請求項８～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項１０～１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、または請求項１２に記載の多量体、または請求項１３に記載の複合体と、薬学的に許容される担体または賦形剤と、を含む医薬組成物であって、前記融合タンパク質またはコンジュゲートまたは多量体または複合体が、前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結された治療的活性ポリペプチドを含む、医薬組成物。

【請求項18】

目的の分子を細胞内に膜貫通送達するための方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型を前記目的の分子に連結させ、次いで前記目的の分子を前記細胞と接触させることを含む、方法。

【請求項19】

（ａ）前記方法が、（１）前記目的の分子を前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に結合させてコンジュゲートを得ること、および（２）前記コンジュゲートを前記細胞と接触させ、それにより、前記目的の分子を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含む；
（ｂ）前記目的の分子が、目的のペプチドであり、前記方法が、（１）前記目的の分子を細胞透過性ペプチドまたはその切断型と連結させて融合タンパク質を得ること、および（２）前記融合タンパク質を前記細胞と接触させ、それにより、前記目的の分子を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含む；
（ｃ）前記目的の分子が、目的の核酸であり、前記方法が、（１）前記目的の核酸に結合可能なタンパク質を前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結させること、（２）ステップ（１）の生成物を前記目的の核酸と接触させて複合体を得ること、および（３）前記複合体を細胞と接触させ、それにより、前記目的の核酸を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含む；および
（ｄ）前記目的の分子が、目的の核酸であり、前記方法が、（１）前記目的の核酸に、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識および結合され得るヌクレオチド配列を付加すること、（２）前記ＤＮＡ結合タンパク質を前記細胞透過性ペプチドまたはその切断型に連結させること、（３）ステップ（１）の生成物をステップ（２）の生成物と接触させて複合体を得ること、および（４）前記複合体を前記細胞と接触させ、それにより、前記目的の核酸を膜貫通送達によって前記細胞内に送達することを含む、
のうちの１つ以上によって特徴付けられる、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

目的の分子の細胞内への膜貫通送達のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞透過性ペプチドまたはその切断型の使用。

【国際調査報告】