特表 2023-534077 薬草組成物、その製造方法、およびそれを投与することによるウイルス感染の予防または治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2023-08-07

(54)【発明の名称】薬草組成物、その製造方法、およびそれを投与することによるウイルス感染の予防または治療方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/48 20060101AFI20230731BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 36/53 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 36/282 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 36/28 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 36/8968 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 36/78 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 36/484 20060101ALI20230731BHJP

   A61K 36/535 20060101ALI20230731BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20230731BHJP

【ＦＩ】

A61K36/48

A61P31/12

A61K36/53

A61K36/282

A61K36/28

A61K36/8968

A61K36/78

A61K36/484

A61K36/535

A61P43/00 121

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023517644

(86)(22)【出願日】2021-12-10

(85)【翻訳文提出日】2022-11-30

(86)【国際出願番号】 MY2021050118

(87)【国際公開番号】W WO2022131903

(87)【国際公開日】2022-06-23

(31)【優先権主張番号】63/124,939

(32)【優先日】2020-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522468261

【氏名又は名称】協力志業股分有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＸＩＥ ＬＩ ＰＲＯＤＵＣＴＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】１Ｆ．， Ｎｏ． １９， Ａｌｙ． ７， Ｌｎ．２１７， Ｓｅｃ． ３， Ｚｈｏｎｇｘｉａｏ Ｅ． Ｒｄ． ， Ｄａ’ａｎ Ｄｉｓｔ．， Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ， Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100137626

【弁理士】

【氏名又は名称】田代 玄

(72)【発明者】

【氏名】釋 證嚴

(72)【発明者】

【氏名】林 碧玉

(72)【発明者】

【氏名】林 欣榮

(72)【発明者】

【氏名】▲黄▼ 志揚

(72)【発明者】

【氏名】何 宗融

(72)【発明者】

【氏名】江 建儀

(72)【発明者】

【氏名】林 佑融

(72)【発明者】

【氏名】徐 布

(72)【発明者】

【氏名】林 慧玲

【テーマコード（参考）】

4C088

【Ｆターム（参考）】

4C088AB26

4C088AB29

4C088AB38

4C088AB60

4C088AB62

4C088AB85

4C088AC05

4C088AC11

4C088BA08

4C088CA05

4C088CA06

4C088MA07

4C088NA14

4C088ZB33

4C088ZC75

(57)【要約】

ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｒｇｙｉ）、オウィア・カウダータ（Ｏｈｗｉａ ｃａｕｄａｔａ）、アニソメレスインディカ（Ａｎｉｓｏｍｅｌｅｓ ｉｎｄｉｃａ （Ｌ．） Ｏ． Ｋｔｚｅ．）、ジャノヒゲ（Ｏｐｈｉｏｐｏｇｏｎ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ドクダミ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ）、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）及びキク（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）の少なくとも１つを含む薬草原料の抽出物を含む薬草組成物が提供される。また、薬草組成物を製造する方法、および薬草組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与することによってウイルス感染を予防または治療する方法も提供される。
【選択図】図１Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

薬草原料からの抽出物および薬学的に許容される担体を含むウイルス感染を予防または治療するための薬草組成物であって、前記薬草原料がオウィア・カウダータ（Ｏｈｗｉａ ｃａｕｄａｔａ）およびアニソメレスインディカ（Ａｎｉｓｏｍｅｌｅｓ ｉｎｄｉｃａ （Ｌ．） Ｏ． Ｋｔｚｅ．）の少なくとも１つを含む、薬草組成物。

【請求項2】

前記オウィア・カウダータは、オウィア・カウダータの根、オウィア・カウダータの葉、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の薬草組成物。

【請求項3】

前記薬草原料は、ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｒｇｙｉ）、ジャノヒゲ（Ｏｐｈｉｏｐｏｇｏｎ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ドクダミ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ）、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、及びキク（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の薬草組成物。

【請求項4】

前記薬草原料からの抽出物は、水抽出物またはエタノール抽出物である、請求項３に記載の薬草組成物。

【請求項5】

前記薬草原料は、その総重量に基づき、１８重量％～２５重量％のオウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつ１８重量％～２５重量％のヨモギ、１０重量％～１７重量％のジャノヒゲ、１０重量％～１７重量％のドクダミ、１０重量％～１７重量％のキキョウ、４重量％～１１重量％のカンゾウ、４重量％～１１重量％のエゴマ、および０．４重量％～１１重量％のキクの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の薬草組成物。

【請求項6】

前記薬草原料は、５ｇ～７ｇのオウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつ５ｇ～７ｇのヨモギ、３ｇ～５ｇのジャノヒゲ、３ｇ～５ｇのドクダミ、３ｇ～５ｇのキキョウ、１ｇ～３ｇのカンゾウ、１ｇ～３ｇのエゴマ、および０．１ｇ～３ｇのキクの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の薬草組成物。

【請求項7】

オウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含む薬草原料を提供すること、当該薬草原料を水及びエタノールの少なくとも一方を含む抽出液で抽出して粗抽出物を得ること、および当該粗抽出物から固体を除去して液体部分を得ることを含む、請求項１に記載の薬草組成物を製造する方法。

【請求項8】

前記薬草原料は、ヨモギ、ジャノヒゲ、ドクダミ、キキョウ、カンゾウ、エゴマ、及びキクの少なくとも１つをさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記抽出は、前記薬草原料を前記抽出液中で少なくとも５分間煮沸することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記抽出は、前記薬草原料をその沸点より低い温度の抽出液に少なくとも１０分間浸漬することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記薬草原料と前記抽出液の重量比が２：１～３０：１である、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記液体部分を濃縮して前記薬草原料の濃縮抽出物を得ることをさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

請求項１に記載の薬草組成物の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む、対象におけるウイルス感染を予防または治療するための方法。

【請求項14】

前記ウイルス感染はコロナウイルスによって引き起こされる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、または豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体である、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記薬草組成物中の前記薬草原料からの抽出物は、約２５ｍｇ／ｋｇ／日～約２５００ｍｇ／ｋｇ／日の有効量で前記対象に投与される、請求項１３に記載の方法。

【請求項18】

前記薬草組成物中の前記薬草原料からの前記抽出物は、約５０ｍｇ／ｋｇ／日～約５００ｍｇ／ｋｇ／日の有効量で前記対象に投与される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記薬草組成物は、ウイルスのスパイクタンパク質とアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体との結合を阻害する、請求項１３に記載の方法。

【請求項20】

前記薬草組成物は、３ＣＬプロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＴＲΜＭＳＳ２）、およびＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）のうちの少なくとも１つの発現を抑制する、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、薬草組成物に関し、特にウイルス感染を予防または治療するための薬草組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ウイルス感染は動物やヒトの重大な疾病として確立され、現在も続いている。コロナウイルス（ＣｏＶ）は、一般的な風邪からより深刻な病気に至るまでの病気を引き起こす可能性のあるウイルスの大きなファミリーである。例えば、ヒトコロナウイルス株であるＣｏＶ－２２９Ｅ、ＣｏＶ－ＯＣ４３、ＣｏＶ－ＮＬ６３、およびＣｏＶ－ＨＫＵ１に感染すると、通常、鼻水、くしゃみ、頭痛、咳、喉の痛み、発熱などの一般的な風邪など、軽度の自己制限的な上気道感染症を引き起こす。他の感染症は、より深刻な疾患を引き起こす可能性があり、例えば、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）などは、重症急性呼吸器症候群、腎不全、そして死亡を引き起こし、かつ世界的な公衆衛生上の緊急事態を引き起こす。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、世界中で１億９４００万人以上が感染し、４,１６０,０００人以上が死亡した。

【0003】

これまでのところ、命を救うための最速の治療法は、もともとＣＯＶＩＤ－１９の他の疾患を標的としていた既存のＦＤＡ承認薬の転用である。ただし、ほとんどの抗ウイルス薬は、吐き気、下痢、めまい、発熱などの深刻な副作用を引き起こし、また、対象のコロナウイルス感染を治療または予防するために、利用できるまたは効果的であることが証明された特定の抗ウイルス治療法はまだない。

【0004】

したがって、コロナウイルス感染を予防または治療するための効果的かつ安全な治療法を提供するという、満たされていないニーズが存在する。

【発明の概要】

【0005】

上記を考慮して、本開示は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質と宿主細胞表面のＡＣＥ２との間の相互作用を阻害し、ウイルスの侵入および複製に必要なタンパク質の発現を抑制し、それによってウイルス感染から宿主を保護することができる薬草組成物を提供する。

【0006】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草組成物は、薬草原料からの抽出物および薬学的に許容されるその担体を含み、前記薬草原料は、オウィア・カウダータ（Ｏｈｗｉａ ｃａｌｌｄａｔａ）とアニソメレスインディカ（Ａｎｉｓｏｍｅｌｅｓ ｉｎｄｉｃａ （Ｌ．） Ｏ． Ｋｔｚｅ．）の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、オウィア・カウダータは、オウィア・カウダータの根、オウィア・カウダータの葉、またはそれらの組み合わせである。

【0007】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草組成物は、オウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｒｇｙｉ）、ジャノヒゲ（Ｏｐｈｉｏｐｏｇｏｎ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ドクダミ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ）、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、及びキク（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）の少なくとも１つを含む薬草原料の抽出物を含む。いくつかの実施形態において、前記薬草組成物は、オウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつヨモギ、ジャノヒゲ、ドクダミ、キキョウ、カンゾウ、エゴマ、及びキクを含む薬草原料の抽出物を含む。いくつかの実施形態において、前記薬草原料からの抽出物は、水抽出物またはエタノール抽出物である。

【0008】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草組成物は、その総重量に基づき、１８重量％～２５重量％のオウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつ１８重量％～２５重量％のヨモギ、１０重量％～１７重量％のジャノヒゲ、１０重量％～１７重量％のドクダミ、１０重量％～１７重量％のキキョウ、４重量％～１１重量％のカンゾウ、４重量％～１１重量％のエゴマ（、および０．４重量％～１１重量％のキクの少なくとも１つを含む薬草原料からの抽出物を含む。

【0009】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草組成物は、前記薬草原料を提供すること、前記薬草原料を、水、エタノール、またはそれらの組み合わせを含む抽出液で抽出して粗抽出物を得えること、および前記粗抽出物から固体を除去して液体部分を得ることを含む方法によって製造される。

【0010】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草組成物を製造する方法は、前記薬草原料を粉末または小片に粉砕することをさらに含む。

【0011】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草原料を抽出することは、前記薬草原料を抽出液中で少なくとも５分間、例えば５分から２時間煮沸すること、および／または前記薬草原料をその沸点より低い温度の抽出液に少なくとも１０分間、例えば１０分間から１時間浸漬することを含む。いくつかの実施形態において、前記薬草原料と前記抽出液との重量比は、２：１～３０：１であり、例えば、２：１、３：１、５：１、８：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１および３０：１である。

【0012】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草組成物を製造する方法は、液体部分を濃縮して濃縮抽出物を得ることをさらに含む。

【0013】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、それを必要とする対象におけるウイルス感染を予防または治療するための方法が提供される。前記方法は、前記薬草組成物の少なくとも１つの有効量を対象に投与することを含む。

【0014】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記ウイルス感染はコロナウイルスによって引き起こされる。いくつの実施形態において、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、または豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。いくつの実施形態において、前記コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体であり、例えば、Ｄ６１４Ｇ変異株、Ｂ．１．１．７（α）変異株、Ｂ．１．３５１（β）変異株、およびＰ１変異株である。

【0015】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記薬草組成物中の薬草原料からの抽出物は、約２５ｍｇ／ｋｇ／日～約２,５００ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約３０ｍｇ／ｋｇ／日～約１,０００ｍｇ／ｋｇ／日、および約５０ｍｇ／ｋｇ／日～約５００ｍｇ／ｋｇ／日の有効量で前記対象に投与される。

【0016】

本開示において、抗ウイルス剤として本開示で提供される薬草組成物は、ウイルス複製を阻害し、宿主細胞中のウイルスの量を減少させることができる。さらに、本開示で提供される薬草組成物は安全であり、先行技術における副作用の問題を解決することができる。したがって、本開示は、ウイルス感染に対する有効な戦略を提供し、これはコロナウイルスの発生を制御するのに有用である。

【0017】

本開示は添付の図面を参照しながら、以下の実施形態の説明を読むことにより、より完全に理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A-G】本開示の薬草組成物で阻害されたウイルススパイクタンパク質のＡＣＥ２受容体への結合活性の棒グラフを示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｃｔｒｌ．１：２０ｍｇ／ｍＬのアルビドール。Ｃｔｒｌ．２：複合処方。Ｃｔｒｌ．３：連花清瘟カプセル。Ｃｔｒｌ．４：オリーブ葉エキス。Ｃｔｒｌ．５：エルダーベリーエキス。Ｃｔｒｌ．６：台湾花蓮慈済病院の漢方製剤。Ｅｘｐ．１～Ｅｘｐ．６：本開示の薬草組成物。

【図2A-C】本開示の薬草組成物で治療されたＣＴＸ、Ｈ９ｃ２、およびＨＦＬ－１の細胞生存率の棒グラフをそれぞれ示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。＊：ｐ値＜０．０５。＊＊：ｐ値＜０．０１。

【図3A-D】本開示の薬草組成物で治療されたマウスにおける血液パラメータの棒グラフを示す。図３Ａは、血液中のクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、およびアラニントランスアミナーゼ（ＧＰＴ）のレベルを示す。図３Ｂ～３Ｄは、血中のクレアチニン（ＣＲＥ）、総ビリルビン（Ｔ－Ｂｉｌ）、およびグルコース（Ｇｌｕ）のレベルをそれぞれ示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｅｘｐ．１：本開示の薬草組成物。

【図4A-B】ウエスタンブロッティングで解析した膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＴＲΜＭＳＳ２）の発現を示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｃｔｒｌ．１：２０ｍｇ／ｍＬのアルビドール。Ｃｔｒｌ．２：複合処方。Ｃｔｒｌ．３：連花清瘟カプセル。Ｅｘｐ．１：本開示の薬草組成物。Ｌ：低用量、５０μｇ／ｍＬ。Ｈ：高用量、１５０μｇ／ｍＬ。

【図5A-B】ウエスタンブロッティングで解析されたＦＫ５０６結合タンパク質５１（ＦＫＢＰ５１）の発現を示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｃｔｒｌ．２：複合処方。Ｃｔｒｌ．３：連花清瘟カプセル。Ｅｘｐ．１：本開示の薬草組成物。Ｌ：低用量、５０μｇ／ｍＬ。Ｈ：高用量、１５０μｇ／ｍＬ。

【図6】本開示の薬草組成物（Ｅｘｐ．１）で阻害された３ＣＬプロテアーゼの活性の棒グラフを示す。＊：ｐ値＜０．０５。＊＊：ｐ値＜０．０１。＊＊＊：ｐ値＜０．００１。

【図7】本開示の薬草組成物（Ｅｘｐ．１）で阻害されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の活性の棒グラフを示す。＊：ｐ値＜０．０５。＊＊：ｐ値＜０．０１。＊＊＊：ｐ値＜０．００１。

【図8A-B】Ｃａｃｏ－２細胞およびＣａｌｕ－３細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、Ｄ６１４Ｇ変異体、Ｂ．１．１．７変異体、およびＢ．１．１３５１変異体の感染に対する本開示の薬草組成物の阻害効果をそれぞれ示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｅｘｐ．７～Ｅｘｐ．９：本開示の薬草組成物。

【図9A-D】マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型（図９Ａ）、Ｄ６１４Ｇ変異体（図９Ｂ）、Ｂ．１．１．７変異体（図９Ｃ）、およびＢ．１．１３５１変異体（図９Ｄ）の感染に対する本開示の薬草組成物の阻害効果を示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｃｔｒｌ．７：ウイルス治療のみ。Ｅｘｐ．１－Ｌ：低用量の本開示の薬草組成物。Ｅｘｐ．１－Ｈ：高用量の本開示の薬草組成物。

【図10A】Ｃａｃｏ－２細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＢ．１．１．７変異体の感染に対する本開示の異なる実施形態に係る薬草組成物の阻害効果を示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｅｘｐ．１、Ｅｘｐ．１０、およびＥｘｐ．１１：本開示の薬草組成物。

【図10B】マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＰ１変異体の感染に対する本開示の異なる実施形態に係る薬草組成物の阻害効果を示す。Ｃｔｒｌ．：無治療群。Ｃｔｒｌ．７：ウイルス治療のみ。Ｅｘｐ．１およびＥｘｐ．１０：本開示の薬草組成物。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、本開示の実施例に示される技術的解決法をより明確かつ完全に説明するが、説明される実施例は本開示の実施例の一部にすぎず、網羅的であることを意図していないことは明らかである。また、本開示は異なる実施例に記載されているように実施または適用することができる。当業者による創造的な作業なしに得られる他のすべての実施例は、本開示の範囲内にある。

【0020】

さらに、本開示で使用される場合、単数形「一つ（ａ）」、「一つ（ａｎ）」、および「当該（ｔｈｅ）」は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含む。用語「または」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、用語「および／または」と交換可能に使用される。

【0021】

本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、本開示に含まれる組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成要素に関して使用されるが、必須かどうかを問わず、不特定の要素またはステップを含むことを許容すると示す。

【0022】

本開示は、薬草組成物、薬草組成物の製造方法、および薬草組成物の使用でそれを必要とする対象におけるウイルス感染の予防または治療方法に関する。

【0023】

少なくとも１つの実施形態において、本開示の方法で治療されるウイルス感染は、コロナウイルス（ＣｏＶ）によって引き起こされてもよい。

【0024】

ＣｏＶの構造タンパク質はヌクレオキャプシド（Ｎ）、スモールエンベロープ（Ｅ）、マトリックス（Ｍ）、および三量体スパイク（Ｓ）糖タンパク質を含んでおり、これらは感染時にウイルスのライフサイクルを完了するためにビリオンのアセンブリと機能に不可欠である。いくつかの実施形態において、本開示のウイルス感染を予防または治療するための方法は、それを必要とする対象に薬草組成物を投与することを含み、コロナウイルスＳタンパク質とアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体との相互作用を遮断し、かつ宿主へのコロナウイルスの侵入および／または複製に必要なタンパク質の発現を抑制し得ることにより、ウイルス感染にかかるリスクや病気の進行を悪化させるリスクに影響を与える。したがって、本開示の薬草組成物は、抗ウイルス活性を有することができ、ウイルス感染を効果的に予防または治療するのに有用である。

【0025】

本明細書で使用する場合、用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、疾患または疾患の症状もしくは状態を予防または回避する手段を指し、これには、疾患または疾患の症状もしくは状態に苦しんでいる患者としてまだ診断されていないが、疾患にかかりやすいまたはかかりやすい可能性がある対象への１つまたは複数の活性剤を適用または投与することが含まれるが、これらに限定されない。本開示の予防手段は、疾患または疾患の症状もしくは状態の発生を回避、予防、または延期するために提供される。

【0026】

本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、所望の薬理学的および／または生理学的効果、例えば、宿主におけるウイルス侵入および／または複製の阻害を得ることを指す。その効果は、疾患またはその症状もしくは状態を完全または部分的に予防するという点で予防的なものであってもよいし、疾患や疾患またはその疾患もしくは状態に起因する悪影響を完全または部分的に治癒、緩和、軽減、修復、または改善するという点で治療的なものであってもよい。

【0027】

本明細書で使用される場合、用語「患者」および「対象」は、交換可能に使用される。用語「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。対象の例としては、ヒト、サル、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、ハムスター、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、イヌ、ネコ、キツネ、オオカミ、ニワトリ、エミュー（ｅｍｕ）、ダチョウおよび魚を含むが、これらに限らない。本開示のいくつかの実施形態において、対象は哺乳動物、例えばヒトなどの霊長類である。

【0028】

本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、それを必要とする対象に所望の予防効果または治療効果を付与する（例えば、宿主中のウイルスの量を減少させる）ために必要とされる活性剤の量を指す。当業者によって認識されるように、有効用量は、投与経路、賦形剤の使用、他の治療処置との同時使用の可能性、および治療される状態に応じて変化されてもよい。

【0029】

本明細書で使用される場合、用語「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」は、活性剤を所望の部位に少なくとも部分的に局在化させて所望の効果を生み出すために、方法または経路による対象への活性剤の配置を指す。本明細書に記載の活性剤は、当技術分野で知られている任意の適切な経路によって投与することができる。例えば、本開示の薬草組成物は、経口投与で対象に投与される。

【0030】

少なくとも１つの実施形態において、本開示の薬草組成物は、薬草原料からの抽出物および薬学的に許容されるその担体を含み、当該薬草原料は、オウィア・カウダータおよびアニソメレスインディカの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、薬草原料は、ヨモギ、ジャノヒゲ、ドクダミ、キキョウ、カンゾウ、エゴマ、キク、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。

【0031】

少なくとも１つの実施形態において、前記薬草原料は、当該薬草原料の総重量に基づき、１８重量％～２５重量％（例えば、１８重量％、１９重量％、２０重量％、２１重量％、２２重量％、２３重量％、２４重量％、および２５重量％）のオウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつ、１８重量％～２５重量％（例えば、１８重量％、１９重量％、２０重量％、２１重量％、２２重量％、２３重量％、２４重量％、および２５重量％）のヨモギ、１０重量％～１７重量％（例えば、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、１６重量％、および１７重量％）のジャノヒゲ、１０重量％～１７重量％（例えば、１０重量％、１１重量％、１２重量％、１３重量％、１４重量％、１５重量％、１６重量％、および１７重量％）のドクダミ、１０重量％～１７重量％のキキョウ、４重量％～１１重量％（例えば、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、および１１重量％）のカンゾウ、４重量％～１１重量％（例えば、４重量％、５重量％、６重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、および１１重量％）のエゴマ、および０．４重量％～１１重量％（例えば、０．４重量％、０．６重量％、０．８重量％、１重量％、３重量％、５重量％、７重量％、８重量％、９重量％、１０重量％、および１１重量％）のキクを含む。

【0032】

少なくとも１つの実施形態において、前記薬草原料は約２０ｇ～約８０ｇの範囲に５ｇ～７ｇのオウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつ、５ｇ～７ｇのヨモギ、３ｇ～５ｇのジャノヒゲ、３ｇ～５ｇのドクダミ、３ｇ～５ｇのキキョウ、１ｇ～３ｇのカンゾウ、１ｇ～３ｇのエゴマ、および０．１ｇ～３ｇのキクを含む。いくつかの実施形態において、薬草原料は約２０ｇ～約７０ｇ、約２０ｇ～約６０ｇ、約２０ｇ～約５０ｇ、または約２０ｇ～約４０ｇの範囲に含んでもよい。

【0033】

少なくとも１つの実施形態において、薬草組成物中の薬学的に許容される担体は、希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、界面活性剤、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。組成物中の担体は、組成物の活性剤と適合し（例えば、活性剤を安定化することができる）、投与される対象に有害でないという意味で「許容可能」である。活性成分を送達するための医薬賦形剤として、１つまたは複数の可溶化剤を利用することができる。他の担体の例には、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが含まれる。いくつかの実施形態において、薬草組成物は、水、エタノール、マルトデキストリン、結晶セルロース、およびそれらの任意の組み合わせから選択される薬学的に許容される担体を含む。

【0034】

本開示を説明するために多くの実施例が使用される。以下の実施例は、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0035】

実施例
本開示のより詳細な説明のために、薬草組成物、製造方法、および組成物の使用が提供され、以下の実施例を参照して詳細に説明される。本開示で使用されるが、本明細書で注釈が付けられていない材料は、市販されている。

【0036】

製造実施例１－１
６ｇのヨモギ、６ｇのオウィア・カウダータ、４ｇのジャノヒゲ、４ｇのドクダミ、４ｇのキキョウ、２ｇのカンゾウ、２ｇのエゴマ、および０．２ｇのキクを採取し、粉末または小片に砕いた。６００ｍＬの水を加えてすべての薬草材料を混合した後、混合物を５～１０分間煮沸した。濾過（定性濾紙１号、東洋アドバンテック）で５５０ｍＬの濾液を取得し、０．２２μｍ無菌シリンジフィルターで濾過することにより、薬草茶を得た。乾燥後、得られた薬草茶中の薬草材料の抽出物の含有量を測定したところ、約２０～４０ｍｇ／ｍＬであった。

【0037】

製造実施例１－２
６ｇのヨモギ、６ｇのオウィア・カウダータ、４ｇのジャノヒゲ、４ｇのドクダミ、４ｇのキキョウ、２ｇのカンゾウ、２ｇのエゴマ、および０．２ｇのキクを採取し、粉末または小片に砕いた。６００ｍＬの水を加えてすべての薬草材料を混合した後、混合物を約６０ｍＬまで煮詰めた。濾過（定性濾紙１号、東洋アドバンテック）で濾液を取得し、０．２２μｍ滅菌シリンジフィルターで濾過することにより、薬草茶濃縮物を得た。乾燥後、得られた薬草茶濃縮物中の薬草材料の抽出物の含有量を測定したところ、約１５０～２００ｍｇ／ｍＬであった。

【0038】

製造実施例２
２０重量％のヨモギ、２０重量％のオウィア・カウダータ、１３．３３重量％のジャノヒゲ、１３．３３重量％のドクダミ、１３．３３重量％のキキョウ、６．６７重量％のカンゾウ、６．６７重量％のエゴマ、および６．６７重量％のキクを採取し、薬草材料の総重量は約１４ｇであった。その薬草材料を小片に砕いてティーバッグに詰めた。ティーバッグを３００ｍＬの熱湯（１００℃前後）に１５～２０分間浸漬し、薬草茶を得た。

【0039】

製造実施例３
２０重量％のヨモギ、２０重量％のオウィア・カウダータ、１３．３３重量％のジャノヒゲ、１３．３３重量％のドクダミ、１３．３３重量％のキキョウ、６．６７重量％のカンゾウ、６．６７重量％のエゴマ、および６．６７重量％のキクを採取し、薬草材料の総重量は約２８ｇであった。その薬草材料を小片に砕いてティーバッグに詰めた。ティーバッグを６００ｍＬの３７％アルコールに３０分間浸漬して、５～１０分間煮沸することにより、エタノール抽出物を得た。

【0040】

製造実施例４
６ｇのヨモギ、６ｇのオウィア・カウダータ、４ｇのジャノヒゲ、４ｇのドクダミ、４ｇのキキョウ、２ｇのカンゾウ、２ｇのエゴマ、および０．２ｇのキクを採取し、粉末または小片に砕いた。６００ｍＬの水を加えてすべての薬草材料を混合した後、混合物を６０分間煮沸した。濾過（定性濾紙１号、東洋アドバンテック）で濾液を取得し、０．２２μｍ滅菌シリンジフィルターで濾過した後、煮沸かつ濃縮することにより水抽出物（３０ｍＬ、約５ｇ）を得た。

【0041】

製造実施例５
６ｇのヨモギ、６ｇのオウィア・カウダータ、４ｇのジャノヒゲ、４ｇのドクダミ、４ｇのキキョウ、２ｇのカンゾウ、２ｇのエゴマ、および０．２ｇのキクを採取し、粉末または小片に砕いた。２２５．６ｍＬの水（薬草材料の総重量の８倍）を加えてすべての薬草材料を混合した後、混合物を６０分間煮沸し、次いで濾過で第１濾液を得た。残留物に水１４１．０ｍＬ（薬草材料の総重量の５倍）を加え、さらに６０分間煮沸後、濾過で第２濾液を得た。第１濾液と第２濾液を合わせて、０．２２μｍ滅菌シリンジフィルターで濾過した後、煮沸かつ濃縮することにより水抽出物（３６．６６ｍＬ、約５ｇ）を得た。

【0042】

製造実施例６
本実施例では、製造実施例４または５で使用したオウィア・カウダータの葉を、本実施例で使用したオウィア・カウダータの根に置き換えた以外、製造実施例４または５に記載の方法により水抽出物を製造した。

【0043】

製造実施例７
本実施例では、オウィア・カウダータをアニソメレスインディカに置き換えた以外、製造実施例４または５に記載の方法により水抽出物を製造した。

【0044】

製造実施例８
本実施例では、使用した薬草原料は、６ｇのヨモギのみであること以外、製造実施例４または５に記載の方法によりヨモギの水抽出物を製造した。

【0045】

製造実施例９
本実施例では、使用した薬草原料は、６ｇのオウィア・カウダータのみであること以外、製造実施例４または５に記載の方法によりオウィア・カウダータの水抽出物を製造した。

【0046】

薬理実施例１：材料および方法
コロナウイルス感染の予防または治療のための本開示で提供される薬草組成物の治療効果は、以下の薬理実施例２～７で決定された。試験されるサンプルは製造実施例１～９から得られ、対照群としての比較サンプルは次のように表列された。

【0047】

対照群（Ｃｔｒｌ．）：無治療群。
対照群１（Ｃｔｒｌ．１）：一部のエンベロープおよび非エンベロープウイルスに使用されるロシア製の広域スペクトル抗ウイルス薬であって、ウミフェノビルとしても知られるアルビドール。
対照群２（Ｃｔｒｌ．２）：ラクトフェリン、コロイド銀、オリーブ葉エキス、およびエルダーベリーを含む、複合処方。
対照群３（Ｃｔｒｌ．３）：インフルエンザの治療に使用される伝統的な漢方製剤であって、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、ロニセラ・ジャポニカ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、エフェドラ・シニカ（Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｉｎｉｃａ）、ビター・アーモンド（ｂｉｔｔｅｒ ａｌｍｏｎｄ）、石膏、インディゴティカ（Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ）の根、オシダ（Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ ｃｒａｓｓｉｒｈｉｚｏｍａ）、ドクダミ、パチョリ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ）、ルバーブ（ｒｈｕｂａｒｂ）、イワベンケイ（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ）、メントールおよびカンゾウを含む、連花清瘟カプセル。
対照群４（Ｃｔｒｌ．４）：オリーブの葉の抽出物。
対照群５（Ｃｔｒｌ．５）：エルダーベリーの抽出物。
対照群６（Ｃｔｒｌ．６：－ジャノヒゲ、ドクダミ、キキョウ、キク、カンゾウ、およびエゴマを含む、花蓮慈済病院（台湾）からの漢方製剤。

【0048】

さらに、これらの実施例で使用された実験方法は、以下のように記載された。
（１）アンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体へのウイルススパイクタンパク質結合の阻害アッセイ
製造元の指示に従って、ＣＯＶＩＤ－１９スパイク－ＡＣＥ２結合アッセイキットＩＩ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を使用することにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のヒトＡＣＥ２受容体への結合を阻害する試験サンプルの効果を測定した。

【0049】

簡単に言うと、すべての試薬は使用前に室温（約１８℃～２５℃）に戻した。次に、各試験サンプル１００μＬを取り外し可能な８ウェルストリップのウェルに加え、プレートシーリングフィルムで覆い、室温で２．５時間、または４℃で一晩、穏やかに振盪しながらインキュベートした。その後、ウェル内の溶液を捨て、各ウェルを１×洗浄液で４回洗浄した。さらに、マルチチャンネルピペットまたはオートウォッシャーを使用して、各ウェルを１×洗浄バーファー（３００μＬ）を充填し、洗浄した。最後の洗浄後、残りの１ｘ洗浄緩衝液を吸引またはデカントによって除去し、１００μＬの１ｘマウス二次西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ＩｇＧを各ウェルに加え、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートした。その後、ウェル内の溶液を捨て、上記と同様に各ウェルを洗浄した。その後、１００μＬの３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ワンステップ基質試薬（Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ）を各ウェルに加え、室温、暗所で穏やかに振盪しながら３０分間インキュベートした。最後に、５０μＬの停止溶液を各ウェルに加え、４５０ｎｍでの吸光度をすぐに読み取った。

【0050】

（２）ウイルスの３Ｃ様（３ＣＬ）プロテアーゼの阻害アッセイ
製造元の指示に従って、ＳｅｎｓｏＬｙｔｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２３ＣＬプロテアーゼ活性アッセイキット（蛍光）を使用することにより、試験サンプルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３ＣＬプロテアーゼを阻害して、ヒト細胞でのウイルス複製を抑制する効果を測定した。

【0051】

簡単に言うと、まずワーキング溶液を用意した。具体的には、１×アッセイ緩衝液は、１０ｍＬの脱イオン水に１０ｍＬの２×アッセイ緩衝液を添加することによって調製した。３ＣＬプロテアーゼ基質溶液は、３ＣＬプロテアーゼ基質をアッセイ緩衝液で１００倍に希釈して調製した。３ＣＬプロテアーゼ希釈液は、３ＣＬプロテアーゼをアッセイ緩衝液で８０倍に希釈して調製した。阻害剤（ＧＣ３７６）希釈剤は、１０μｍの阻害剤溶液をアッセイ緩衝液で１００倍に希釈して調製した。

【0052】

次に、酵素反応のために、マイクロプレートのウェルに試験サンプルを１０μＬ／ウェル、３ＣＬプロテアーゼ希釈液を４０μＬ／ウェルでそれぞれ添加した。同時に、次の対照群ウェルを設定した。試験サンプルを含まないが３ＣＬプロテアーゼを含むポジティブ対照群、３ＣＬプロテアーゼおよび阻害剤ＧＣ３７６を含む阻害剤対照群、３ＣＬプロテアーゼおよび試験サンプルの送達に使用されるビヒクルを含むビヒクル対照群（濃度が１％を超えないジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）など）、アッセイ緩衝液と試験サンプルを含む試験サンプル対照群、およびアッセイ緩衝液を含む基質対照群。すべての対照群の総容量は、アッセイ緩衝液を使用して５０μＬになった。

【0053】

続いて、３ＣＬプロテアーゼ基質溶液５０μＬを各ウェルに添加し、カイネティックリーディングまたはエンドポイントリーディングにより蛍光シグナルを測定した。カイネティックリーディングのために、蛍光強度を励起／発光（Ｅｘ／Ｅｍ）＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍで連続的に測定し、データを５分ごとに３０～６０分間記録した。エンドポイントリーディングのために、反応溶液を３７℃で３０～６０分間インキュベートし、直射光を避けた後、蛍光強度をＥｘ／Ｅｍ＝４９０ｎｍ／５２０ｎｍで測定した。

【0054】

（３）ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の阻害アッセイ
製造元の指示に従って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）アッセイキット（ＰｒｏＦｏｌｄｉｎ）を使用することにより、試験サンプルがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡポリメラーゼを阻害して、ヒト細胞でのウイルス複製に抵抗する効果を測定した。

【0055】

簡単に言うと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ＲｄＲｐアッセイは９６ウェルプレートフォーマットで実施された。まず、ＤＭＳＯ中の試験サンプル１μＬを９６ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した。さらに、４１μＬのＨ₂Ｏ、５μＬの１０ｘ緩衝液、１μＬの５０ｘテンプレート、および１μＬの５０ｘＲｄＲｐを添加し、５分間インキュベートした。その後、１μＬの５０×ＮＴＰを添加し、さらに３４℃で６０～１２０分間インキュベートした。反応後、１×蛍光色素溶液１５０μＬをインキュベートした反応混合物に添加し、蛍光強度を４５０ｎｍで５分間測定した。

【0056】

（４）膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＴＲΜＭＳＳ２）およびＦＫ５０６結合タンパク質５１（ＦＫＢＰ５１）の阻害アッセイ
試験サンプルが宿主細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の付着および浸潤に抵抗するためのＴＲΜＭＳＳ２の阻害、およびストレス応答に抵抗するためのＦＫＢＰ５１の減少に対する効果は、４ｘｌ０⁵Ｃａｃｏ－２細胞を１０ｃｍのペトリディッシュで２４時間培養し、５０μｇ／ｍＬ（低用量）または１５０μｇ／ｍＬ（高用量）の濃度で試験サンプルを添加し、１２時間後に細胞を回収し、ＴＲΜＭＳＳ２およびＦＫＢＰ５１のレベルをウエスタンブロッティングで分析することによって測定した。

【0057】

（５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプレンチウイルスのアッセイ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプレンチウイルスは、中央研究院（台湾）のＲＮＡｉコアによって提供された。これは、ゲノムに緑色蛍光タンパク質遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子を持ち、その表面エンベロープにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を発現するレンチウイルスである。試験サンプルが生体外でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防に対する効果を測定するために、ヒト腸管上皮細胞株Ｃａｃｏ－２およびヒト肺細胞株Ｃａｌｕ－３を１２時間培養し、そして１０μｇ／ｍＬまたは３０μｇ／ｍＬの試験サンプルを２４時間共培養した。その後、培養細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプレンチウイルスの野生型、Ｄ６１４Ｇ変異体、α変異体（Ｂ．１．１．７）、またはβ変異体（Ｂ．１．３５１）を感染させた。２４時間後、感染細胞を蛍光顕微鏡で観察した。

【0058】

一方、生体内アッセイのために、ＳＫＨ２／Ｊマウスは連続７日胃管栄養法（１６．２２ｍｇまたは４８．６６ｍｇ／０．３ｍＬ／マウス／日）により試験サンプルで治療した。４日目から６日目に、マウスにＡｅｒｏｇｅｎＳｏｌｏネブライザー（１０μＬの１．２×１０⁶粒子／マウス／日）を用いてシュードタイプレンチウイルスを鼻腔内送達によりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の野生型、Ｄ６１４Ｇ変異体、α変異体（Ｂ．１．１．７）、β変異体（Ｂ．１．３５１）、またはＰｌ変異体（ブラジル変異体）を感染させた。８日目に、マウスのウイルス感染は、生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）によって決定された。

【0059】

Ａｅｒｏｇｅｎ Ｓｏｌｏネブライザーのパラメータは次のとおりであった。流量：０．２ｍＬ／分以上（平均：約０．３８ｍＬ／分）。粒子径：（１）規格範囲：１μｍ～５μｍ、平均値：３．１μｍ、アンダーセンカスケードインパクトサンプラーで測定された。（２）規格範囲：１．５μｍから６．２μｍ、平均値：３．９μｍ、Ｍａｒｐｌｅ２９８カスケードインパクトサンプラーで測定された。標準ＥＮ１３５４４－１によると、開始用量は２ｍＬで、エアロゾル出力速度は０．３０ｍＬ／ｍｉｎであった。さらに、エアロゾルの排出量は1 回あたり１．０２ｍＬであり、残留量は３ｍＬの投与量あたり０．１ｍＬ未満であった。

【0060】

（６）細胞毒性および細胞生存率のアッセイ
生体外での試験サンプルの毒性を測定するために、ＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイを実施して、細胞活性および増殖を評価した。具体的には、星状細胞ＣＴＸ、心筋細胞Ｈ９ｃ２、および肺線維芽細胞ＨＦＬ－１を、３１．２５μｇ／ｍＬ～４０００μｇ／ｍＬの濃度で試験サンプルと２４時間共培養した。その後、ＭＴＴを培養物に加え、２時間インキュベートした。ＭＴＴ結晶をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することにより、５９０ｎｍでの吸光度を酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）リーダーで測定した。

【0061】

一方、生体内での試験サンプルの毒性を測定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを胃管栄養法により試験サンプルで５２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量で治療した。２４時間後、マウスの血液中のクレアチンホスホキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、クレアチニン、総ビリルビン、およびグルコースのレベルを測定した。

【0062】

薬理実施例２：ウイルススパイクタンパク質のＡＣＥ２受容体への結合の阻害
製造実施例４または５（Ｅｘｐ．１、６～３０ｍｇ／ｍＬ）から製造された薬草組成物について、ヒトＡＣＥ２受容体に結合するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の阻害に対する効果を測定し、また、アルビドール（Ｃｔｒｌ．１、２０ｍｇ／ｍＬ）、配合処方（Ｃｔｒｌ．２）、連花清瘟カプセル（Ｃｔｒｌ．３）、オリーブ葉エキス（Ｃｔｒｌ．４）、エルダーベリーの抽出物（Ｃｔｒｌ．５）、および花蓮慈済病院の漢方製剤（Ｃｔｒｌ．６）の効果と比較した。

【0063】

それらの結果を図１Ａ～１Ｆに示し、Ｅｘｐ．１は、Ｃｔｒｌ．２～Ｃｔｒｌ．６と比較して、ＡＣＥ２受容体に結合するウイルススパイクタンパク質に対して大幅に改善された遮断活性を示した。さらに、図１Ｂおよび図１Ｃを参照すると、Ｅｘｐ．１の６ｍｇ／ｍＬおよび１２ｍｇ／ｍＬで処理されたスパイクタンパク質の結合活性は、２４ｍｇ／ｍＬおよび３０ｍｇ／ｍＬのＣｔｒｌ．３で処理されたもののそれぞれと同等であった。すなわち、同じ投与量で、本願の薬草組成物の遮断活性は、連花清瘟カプセルよりも約２．５～４倍高かった。さらに、図１Ｃは、１８ｍｇ／ｍＬのＥｘｐ．１が２０ｍｇ／ｍＬのアルビドールよりも高い遮断効果を達成し得ることを示し、本開示の薬草組成物の低用量がウイルススパイクタンパク質間の相互作用を効果的に遮断することができ、従来の抗ウイルス薬（アルビドールなど）の投与によって引き起こされる吐き気、下痢、めまいなどの重篤な副作用を避けることができるということを示唆している。

【0064】

また、図１Ｇは、ヒトＡＣＥ２受容体へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質結合の阻害効果を考慮して、異なる抽出方法によって製造された薬草組成物の比較を示し、ここで、製造実施例４または５から製造された水抽出物は、Ｅｘｐ．１と記されていた。製造実施例１で製造された薬草茶をＥｘｐ．２とした。製造実施例２で製造された薬草茶をＥｘｐ．３とした。製造実施例３で製造されたエタノール抽出物をＥｘｐ．４とした。製造実施例８で製造されたヨモギの抽出物をＥｘｐ．５と表記した。製造実施例９で製造されたオウィア・カウダータの抽出物をＥｘｐ．６とした。これらの結果は、異なる抽出方法によって製造された本開示の薬草組成物が、ウイルススパイクタンパク質とＡＣＥ２受容体との間の相互作用も遮断し得ることを実証した。

【0065】

薬理実施例３：本開示の薬草組成物の安全性
製造例４または５（Ｅｘｐ．１）で製造された薬草組成物の毒性は、ＭＴＴアッセイおよび動物モデルによって測定された。

【0066】

細胞株ＣＴＸ、Ｈ９ｃ２、およびＨＦＬ－１のＭＴＴアッセイの結果は、それぞれ図２Ａ～２Ｃに示され、１,０００μｇ／ｍＬ未満の量の本開示の薬草組成物は、脳、心臓、肺の生理活動への影響はないことを示した。製造実施例１－１で提供される飲用薬草茶とする本開示の薬草組成物は、薬草原料の抽出物を２０～４０ｍｇ／ｍＬの量で含むので、本開示の薬草組成物は、７０ｋｇの成人が５．６Ｌの薬草組成物を飲み込んだとしても、毒性を引き起こすことはないということを示唆している。

【0067】

動物モデルでは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、人の１日の推奨摂取量の２０倍である５,２００ｍｇ／ｋｇ／マウス／日の用量で本開示の薬草組成物を与えた。その結果、マウスの血液中のクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＧＰＴ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、総ビリルビン（Ｔ－Ｂｉｌ）、およびグルコース（Ｇｌｕ）のレベルは、以下の表１と図３Ａおよび図３Ｂに示した。ＣＰＫとＬＤＨは心臓と脳の機能の指標である。ＧＯＴとＧＰＴは肝機能の指標である。ＣＲＥは腎機能の指標である。Ｔ－Ｂｉｌは、胆嚢機能の指標となる直接ビリルビンと間接ビリルビンが含まれる。これらの結果は、薬草組成物で治療したマウスと薬草組成物なしで治療したマウスとの間で血液パラメータに有意な差がないことを示し、本開示の薬草組成物が非常に高用量であっても悪影響をもたらさないことを示唆している。

【0068】

【表1】

【0069】

薬理実施例４：ＴＲΜＭＳＳ２およびＦＫＢＰ５１の発現の抑制
製造実施例４または５（Ｅｘｐ．１）から製造された薬草組成物について、ＴＲΜＭＳＳ２およびＦＫＢＰ５１の発現を抑制するための効果を測定し、また、アルビドール（Ｃｔｒｌ．１、２０ｍｇ／ｍＬ）、複合処方（Ｃｔｒｌ．２）、および連花清瘟カプセル（Ｃｔｒｌ．３）による効果と比較した。

【0070】

ＴＲΜＭＳＳ２発現の抑制の結果を図４Ａおよび４Ｂに示し、Ｅｘｐ．１がＣｔｒｌ．２とＣｔｒｌ．３．と比較してＴＲΜＭＳＳ２発現を有意に抑制したことを示した。さらに、Ｅｘｐ．１の投与量を５０μｇ／ｍＬ（低用量、Ｌ）から１５０μｇ／ｍＬ（高用量、Ｈ）に増加させると、ＴＲΜＭＳＳ２の発現が７０％減少した。Ｃｔｒｌ．３を５０μｇ／ｍＬ（低用量、Ｌ）から１５０μｇ／ｍＬ（高用量、Ｈ）に増加しても、ＴＲΜＭＳＳ２の発現は１０％しか減少しなかった。すなわち、本開示の薬草組成物は、連花清瘟カプセルと比較して、７倍優れた有効性でＴＲΜＭＳＳ２の発現を抑制する可能性があり、宿主細胞へのウイルス侵入を遮断するための本開示の薬草組成物の強力な効果を示唆している。

【0071】

ＦＫＢＰ５１発現の抑制の結果を図５Ａおよび５Ｂに示し、Ｅｘｐ．１の投与量を５０μｇ／ｍＬ（低用量、Ｌ）から１５０μｇ／ｍＬ（高用量、Ｈ）に増加させると、ＦＫＢＰ５１発現は４０％減少し、ＦＫＢＰ５１はストレスへの分子的リンクであるため、これらの結果は、本開示の薬草組成物が、ＣＯＶＩＤ－１９によって引き起こされる可能性がある感情的ストレス、不安およびうつ病に対して効果を有することを示唆している。

【0072】

薬理実施例５：３ＣＬプロテアーゼおよびＲｄＲｐの活性の抑制
製造実施例４または５（Ｅｘｐ．１）から製造された薬草組成物について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の３ＣＬプロテアーゼおよびＲｄＲｐの活性を抑制するための効果を測定した。

【0073】

結果をそれぞれ図６（３ＣＬ）および図７（ＲｄＲｐ）に示し、本開示の薬草組成物がＲｄＲｐおよび３ＣＬプロテアーゼの活性を用量依存的に３５％～４０％低下させたことを示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の場合、３ＣＬはポリタンパク質の切断に関与し、ウイルスのライフサイクルに不可欠なウイルスタンパク質を生成し、ＲｄＲｐはウイルスゲノムの複製とウイルス遺伝子の転写に使用される。したがって、これらの結果は、本開示の薬草組成物がＣＯＶＩＤ－１９の治療に効果があることを示唆している。

【0074】

薬理実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防のための本開示の薬草組成物の効果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプレンチウイルスの野生型および変異体を使用することによって測定した。

【0075】

生体外アッセイのために、試験される薬草組成物は以下の通りであった。Ｅｘｐ．７：製造実施例４または５から製造された水抽出物１．５ｇおよび賦形剤（マルトデキストリンおよび結晶セルロースの混合物）１．５ｇを含む（水抽出物の濃度：１０μｇ／ｍＬ）。試験例８：製造実施例４または５から製造された水抽出物３ｇおよび賦形剤（マルトデキストリンおよび結晶セルロースの混合物）３ｇを含む（水抽出物の濃度：３０μｇ／ｍＬ）。Ｅｘｐ．９：製造実施例４または５製造された水抽出物３ｇを含む（水抽出物の濃度：３０μｇ／ｍＬ）。各組成物をＣａｃｏ－２細胞またはＣａｌｕ－３細胞に添加した。２４時間後、野生型シュードタイプレンチウイルスとその３つの変異体（すなわち、Ｄ６１４Ｇ変異体、Ｂ．１．１．７変異体、およびＢ．１．３５１変異体）を加えた。

【0076】

結果は図８Ａ（Ｃａｃｏ－２）および図８Ｂ（Ｃａｌｕ－３）に示され、本開示の薬草組成物がＣａｃｏ－２について野生型および変異体の両方のウイルス感染を５１％～７４％減少させ、Ｃａｌｕ－３について６４％～８６％減少させ得ることを示している。

【0077】

生体内アッセイのために、製造実施例４または５から製造された薬草組成物を、１６．２２ｍｇ／０．３ｍＬ／マウス／日（Ｅｘｐ．１－Ｌ）または４８．６６ｍｇ／０．３ｍＬ／マウス／日（Ｅｘｐ．１－Ｈ）の用量で７日間連続で胃管栄養法によってＳＫＨ２／Ｊマウスに投与し、４日目から６日目で鼻腔内送達により野生型シュードタイプレンチウイルスとその３つの変異体（すなわち、Ｄ６１４Ｇ変異体、Ｂ．１．１．７変異体、およびＢ．１．３５１変異体）をマウスに投与した。

【0078】

結果を図９Ａ（野生型）、図９Ｂ（Ｄ６１４Ｇ変異体）、図９Ｃ（Ｂ．１．１．７変異体）および図９Ｄ（Ｂ．１．３５１変異体）に示され、その中、Ｃｔｒｌ．は、薬物やウイルスの治療を受けていないマウス群であり、Ｃｔｒｌ．７は、シュードタイプのレンチウイルスのみで治療されたマウス群であった。図９Ａに示されるように、本開示の薬草組成物で治療されたマウスは、それらの組織においてより低い輝度レベルを示し、本開示の薬草組成物が野生型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染を効果的に予防し得ることを示唆している。

【0079】

さらに、図９Ｂに示されるように、マウスにおけるＤ６１４Ｇ変異体の感染は、Ｅｘｐ．１－ＬおよびＥｘｐ．１－Ｈでそれぞれ５倍および２５倍減少し、本開示の薬草組成物がＤ６１４Ｇ変異体の感染を効果的に予防し得ることを示唆している。

【0080】

図９Ｃに示すように、Ｃｔｒｌ．７のマウスはＢ．１．１．７変異体による重度の肺感染症を患っているが（矢印で示されているように）、Ｅｘｐ．１－ＬおよびＥｘｐ．１－Ｈは、Ｂ．１．１．７変異体が肺に強く感染するのを効果的に防ぐことができる（円の領域で示されているように）。

【0081】

図９Ｄに示すように、Ｂ．１．３５１変異体の感染は、Ｅｘｐ．１－ＬおよびＥｘｐ．１－Ｈで減少した。特に、円の領域で示されるように、Ｂ．１．３５１変異体によって引き起こされる鼻と腸の感染は、Ｅｘｐ．１－ＬとＥｘｐ．１－Ｈで大幅に減少した。

【0082】

これらの上記の結果は、本開示の薬草組成物が、野生型および変異体の両方のウイルス感染を有意に防止できることを示した。

【0083】

薬理実施例７：交換可能な成分を含む本開示の薬草組成物の効果
この実施例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防のための製造実施例４または５から製造された薬草組成物（すなわち、オウィア・カウダータの葉の抽出物を含むもの）の効果を、製造実施例６から製造されたもの（すなわち、オウィア・カウダータ根の抽出物を含むもの）と比較した。また、オウィア・カウダータとアニソメレスインディカは一般的に同一の漢方原料として識別される可能性があるため、製造実施例４または５から製造された薬草組成物の効果も製造実施例７から製造されたもの（すなわち、アニソメレスインディカの抽出物を含むもの）と比較した。当該比較は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプレンチウイルスの感染を防ぐためのこれらの薬草組成物の効果を測定することによって行われた。

【0084】

その結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示した。オウィア・カウダータ葉の抽出物を含む薬草組成物をＥｘｐ．１と表記した。オウィア・カウダータ根の抽出物を含む薬草組成物は、Ｅｘｐ．１０と表記した。アニソメレスインディカの抽出物を含む薬草組成物は、Ｅｘｐ．１１と表記した。また、Ｃｔｒｌ．７は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプレンチウイルスのＰ１変異体のみで治療されたマウス群であった。

【0085】

図１０Ａでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプレンチウイルスのＢ．１．１．７変異体を使用して、３０μＬ／ｍＬの試験サンプルで治療されたＣａｃｏ－２細胞を感染させた。結果は、Ｅｘｐ．１と同様に、Ｅｘｐ．１０およびＥｘｐ．１１は、ウイルス感染をそれぞれ約４８％および約６４％減少させ得ることを示した。

【0086】

図１０Ｂでは、Ｐ１変異体の感染前に、ＳＫＨ２／Ｊマウスに４８．６６ｍｇ／０．３ｍＬ／マウス／日の用量で試験サンプルを与えられ、結果は、マウスのＰ１突然変異体の感染が、Ｅｘｐ．１では２５倍、Ｅｘｐ．１０のでは４０倍減少したことを示した。

【0087】

これらの上記の結果は、オウィア・カウダータ根の抽出物またはアニソメレスインディカの抽出物を含む薬草組成物が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有意に予防する可能性があることを示している。

【0088】

本開示のいくつかの実施形態が上記で詳細に説明されたが、当業者は、本開示の教示および利点から実質的に逸脱することなく、本開示に示された実施形態に対して様々な修正および変更を行うことが可能である。したがって、そのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲に記載されている本開示の範囲に包含される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【手続補正書】

【提出日】2022-11-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

薬草原料からの抽出物および薬学的に許容される担体を含むウイルス感染を予防または治療するための薬草組成物であって、前記薬草原料がオウィア・カウダータ（Ｏｈｗｉａ ｃａｕｄａｔａ）およびアニソメレスインディカ（Ａｎｉｓｏｍｅｌｅｓ ｉｎｄｉｃａ （Ｌ．） Ｏ． Ｋｔｚｅ．）の少なくとも１つを含む、薬草組成物。

【請求項2】

前記オウィア・カウダータは、オウィア・カウダータの根、オウィア・カウダータの葉、またはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の薬草組成物。

【請求項3】

前記薬草原料は、ヨモギ（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｒｇｙｉ）、ジャノヒゲ（Ｏｐｈｉｏｐｏｇｏｎ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ドクダミ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）、キキョウ（Ｐｌａｔｙｃｏｄｏｎ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒｕｓ）、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、エゴマ（Ｐｅｒｉｌｌａ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）、及びキク（ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の薬草組成物。

【請求項4】

前記薬草原料からの抽出物は、水抽出物またはエタノール抽出物である、請求項３に記載の薬草組成物。

【請求項5】

前記薬草原料は、その総重量に基づき、１８重量％～２５重量％のオウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつ１８重量％～２５重量％のヨモギ、１０重量％～１７重量％のジャノヒゲ、１０重量％～１７重量％のドクダミ、１０重量％～１７重量％のキキョウ、４重量％～１１重量％のカンゾウ、４重量％～１１重量％のエゴマ、および０．４重量％～１１重量％のキクの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の薬草組成物。

【請求項6】

前記薬草原料は、５ｇ～７ｇのオウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含み、かつ５ｇ～７ｇのヨモギ、３ｇ～５ｇのジャノヒゲ、３ｇ～５ｇのドクダミ、３ｇ～５ｇのキキョウ、１ｇ～３ｇのカンゾウ、１ｇ～３ｇのエゴマ、および０．１ｇ～３ｇのキクの少なくとも１つを含む、請求項３に記載の薬草組成物。

【請求項7】

オウィア・カウダータとアニソメレスインディカの少なくとも１つを含む薬草原料を提供すること、当該薬草原料を水及びエタノールの少なくとも一方を含む抽出液で抽出して粗抽出物を得ること、および当該粗抽出物から固体を除去して液体部分を得ることを含む、請求項１に記載の薬草組成物を製造する方法。

【請求項8】

前記薬草原料は、ヨモギ、ジャノヒゲ、ドクダミ、キキョウ、カンゾウ、エゴマ、及びキクの少なくとも１つをさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記抽出は、前記薬草原料を前記抽出液中で少なくとも５分間煮沸することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記抽出は、前記薬草原料をその沸点より低い温度の抽出液に少なくとも１０分間浸漬することを含む、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記薬草原料と前記抽出液の重量比が２：１～３０：１である、請求項７に記載の方法。

【請求項12】

前記液体部分を濃縮して前記薬草原料の濃縮抽出物を得ることをさらに含む、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

前記ウイルス感染はコロナウイルスによって引き起こされる、請求項１に記載の薬草組成物。

【請求項14】

前記コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、または豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である、請求項１３に記載の薬草組成物。

【請求項15】

前記コロナウイルスはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異体である、請求項１４に記載の薬草組成物。

【請求項16】

前記薬草原料からの抽出物は、約２５ｍｇ／ｋｇ／日～約２５００ｍｇ／ｋｇ／日の有効量で投与される、請求項１に記載の薬草組成物。

【請求項17】

前記薬草原料からの前記抽出物は、約５０ｍｇ／ｋｇ／日～約５００ｍｇ／ｋｇ／日の有効量で投与される、請求項１６に記載の薬草組成物。

【請求項18】

ウイルスのスパイクタンパク質とアンギオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体との結合を阻害する、請求項１に記載の薬草組成物。

【請求項19】

３ＣＬプロテアーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、膜貫通型セリンプロテアーゼ２（ＴＲΜＭＳＳ２）、およびＦＫ５０６結合タンパク質５（ＦＫＢＰ５）のうちの少なくとも１つの発現を抑制する、請求項１に記載の薬草組成物。

【国際調査報告】