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特表2023-534625多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを導出する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2023-08-10
(54)【発明の名称】多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを導出する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0793 20100101AFI20230803BHJP
A61K 35/30 20150101ALI20230803BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20230803BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20230803BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20230803BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20230803BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0793
A61K35/30
A61P25/16
A61P25/28
A61P25/14
A61P25/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2022580313
(86)(22)【出願日】2021-06-28
(85)【翻訳文提出日】2023-02-22
(86)【国際出願番号】 US2021039431
(87)【国際公開番号】W WO2021263241
(87)【国際公開日】2021-12-30
(31)【優先権主張番号】63/044,683
(32)【優先日】2020-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/045,432
(32)【優先日】2020-06-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/051,455
(32)【優先日】2020-07-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507081094
【氏名又は名称】ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バムダッド，シンシア
(72)【発明者】
【氏名】イー，ケビン，アール．
(72)【発明者】
【氏名】モエ，スコット，ティー．
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，トーマス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BD25
4B065BD39
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB45
4C087BB64
4C087NA14
4C087ZA02
4C087ZA16
(57)【要約】
【解決手段】本出願は、多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンへ分化させるプロトコルの２０±３日目頃に、神経基礎培地にビタミンを添加するか、またはビタミン濃度を増加させることによって、ヒト幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを産生する方法を開示する。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを産生する方法であって、多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンへ分化させるプロトコルの２０±３日目頃に、神経基礎培地にビタミンを添加するか、またはビタミン濃度を増加させる工程を含む、方法。
【請求項2】
前記プロトコルは、プロトコルＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ビタミンは、ビタミンＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ビタミンＡは、レチノールの形態である、請求項３に記載方法。
【請求項5】
前記ビタミンＡは、酢酸レチニルの形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項6】
前記ビタミンＡは、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、またはオールトランス型レチノイン酸の形態である、請求項３に記載の方法。
【請求項7】
前記ビタミンＡは、脂質に富んだ製剤中に可溶化される、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記脂質に富んだ製剤は、ヒト血清アルブミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記脂質に富んだ製剤は、Ａｌｂｕｍａｘである、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記脂質に富んだ製剤は、非ヒト血清アルブミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項11】
前記ビタミンＡの最終濃度は、１ｕＭ～３ｕＭである、請求項３に記載の方法。
【請求項12】
前記ビタミンは、ビタミンＢ６である、請求項１記載の方法。
【請求項13】
前記ビタミンＢ６は、ピリドキシンの形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ビタミンＢ６は、ピリドキサルの形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記ビタミンＢ６は、ＰＬＰとしても知られているピリドキサル－５’－ホスフェートの形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項16】
前記ビタミンＢ６の最終濃度は、１０ｕＭ～３０ｕＭである、請求項１２に記載の方法。
【請求項17】
前記ビタミンは、ビタミンＣである、請求項１記載の方法。
【請求項18】
前記ビタミンＣは、２－ホスホ－アスコルビン酸の形態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記ビタミンＣは、Ｌ－アスコルビン酸の形態である、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記ビタミンＣの最終濃度は、２００ｎＭ～１１０ｕＭである、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
分化される前記多能性幹細胞は、ＮＭＥ７－ＡＢ中で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
分化される前記多能性幹細胞は、ＷＮＴ３Ａ中で培養される、請求項１に記載の方法た。
【請求項23】
分化される前記多能性幹細胞は、未処理状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより３０％多くのドーパミンを発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより１００％多くのドーパミンを発現することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより５００％多くのドーパミンを発現することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより１０００％多くのドーパミンを発現することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより３０％多くの神経突起を形成することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項29】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより１００％多くの神経突起を形成することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより５００％多くの神経突起を形成することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルによって産生されたドーパミン作動性ニューロンより１０００％多くの神経突起を形成することを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
必要とする対象へのドーパミン作動性ニューロンの移植の成功の可能性を増加させる方法であって、請求項１に記載の方法で得られたドーパミン作動性ニューロンを対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項33】
ドーパミン産生神経細胞の生着が望ましい患者において中枢神経系疾患を処置する方法であって、請求項１に記載の方法で得られたドーパミン作動性ニューロンを必要とする個人に生着させる工程を含む、方法。
【請求項34】
前記中枢神経系疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、またはアルツハイマー病である、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンへ分化させる方法に関する。本出願はさらに、それによって得られたドーパミン作動性神経細胞を患者に移植することに関連する疾患の治療または予防に関する。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病を処置するための幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンの開発は、再生医療の主要な分野として注目されている。これまでに１件の臨床試験（高橋純、日本）が行われているが、技術的に大きな課題が残っており、これまで米国ではＦＤＡによるヒト試験の承認が得られなかった。これらの技術的課題は、幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンによるパーキンソン病の処置を非現実的にする可能性がある。
【0003】
その一つは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）よりも所望の細胞型に分化しやすいという問題である。胚性幹細胞は、ｉＰＳＣ由来の細胞よりも機能的な最終分化した細胞を産生ことが多い。しかしながら、規制当局の承認には、実験データを可能にするすべての治験用新薬を生成するために使用され、その後患者を処置するために使用される、マスター細胞バンクである同じＥＳＣの大量のストックを作成することが必要とされる。これまでの取り組みでは、源細胞バンクを生成し、必要な実験を行い、ヒトでの臨床試験に使用するために必要とされる多くの継代を経て、ＥＳＣは核型異常を得て、不安定になることが明らかにされた。加えて、現在、多くの国では、胚性幹細胞を研究または処置に使用することが禁止されている。
【0004】
ｉＰＳＣは、各処置が患者固有のものであり、典型的に、患者自身の細胞から生成されるため、規制当局の承認の観点からより実用的である。したがって、マスター細胞バンクは存在しない。しかしながら、これまでのｉＰＳＣは、胚性幹細胞と同様に機能的細胞に分化していなかった。クローン制限は、ｉＰＳＣを所望の細胞型に分化させるには大きな問題となる。言い換えると、あるｉＰＳＣクローンは神経細胞を形成することができても、別のクローンはできない場合がある。さらに細かいことを言えば、あるクローンは実に優れた神経細胞または肝細胞を形成する場合があるが、他のクローンは特徴的な分子マーカーを発現していても、他のクローンまたは自然発生細胞と同じようには機能しないこともある。多くの場合、どのクローンが特定の細胞型に分化できるかを判断するために、多くのクローンをテストする必要がある。クローン形成の制限は、プライミング状態の幹細胞がすでに行った細胞運命の決定に起因するという考えを支持する重要な科学的根拠がある。多能性になるように誘導された細胞は、その細胞クローンが成熟できるものを制限するメチル化またはアセチル化などの分子マークをまだ保持する。
【0005】
幹細胞由来の治療法開発におけるこれらの基本的な課題は、パーキンソン病処置のためのドーパミン作動性ニューロンの開発においてさらなる問題となる。
【0006】
パーキンソン病の患者は、平均して６５歳の時に、初めて処置を必要とする。ドーパミン作動性ニューロンがドナーの胚性幹細胞に由来する場合、患者はドナー細胞の拒絶反応を防ぐために、ある期間、免疫抑制剤を服用することが必要とされる。この年齢は、免疫抑制剤を投与することに適していない。
【0007】
加えて幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを生成する現在の方法では、非常に低い生着率のニューロンが産生される。パーキンソン病の場合、治療効果を得るには１００，０００個の細胞が生着する必要があると考えられる。生着率が低いため、治療効果を得るためには、１０倍～１００倍の細胞ニューロンを移植することが必要とされる。つまり、１，０００，０００～１０，０００，０００個の細胞を移植する必要があり、幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させる既存の方法では技術的に難しい課題である。ヒトｉＰＳ細胞からドーパミン作動性ニューロンを生成した場合、真のドーパミン作動性ニューロンが得られるのは収量の３％程度であることが報告されている。ｉＰＳＣからドーパミン作動性ニューロンの純粋な集団を得るために、研究者は分化の初期段階でＣｏｒｉｎおよびＬＲＴＭ１などの特定の分子マーカーによって細胞を選別する必要があった。これらの研究者は、Ｃｏｒｉｎ＋およびＬＲＴＭ１＋について選別されたドーパミン作動性ニューロンまたはその前駆体は、ＴＨ陽性細胞の割合が高く、また、選別されていない細胞より純粋な集団に比べて約１０倍の生着能を示した（Ｓａｍａｔａ ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ２０１６，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３０９７）。それでも、ドーパミン作動性ニューロンまたはその前駆体は、２８日目という早い時期に移植する必要があり、その場合にも移植後３カ月では約１０％しか存在しなかった。
【0008】
幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンの生着率が低いという問題を克服するために、ドーパミン作動性ニューロンが前駆段階にある分化１５日目から３２日目の早い時期に移植される。未熟なニューロンを生着させると、生着率が大幅に向上することが実験で明らかにされているが、これは、効率的な生着に必要な未知の因子が宿主の脳から提供されるためと思われる。しかし、初期前駆細胞の移植は、ＵＳＦＤＡなどの規制当局に懸念される。
【0009】
他国の規制当局と同様にＵＳＦＤＡは、移植用細胞の特性評価を必要とする。例えば、パーキンソン病の処置のためのドーパミン作動性ニューロンの特性評価には、その細胞がドーパミンを産生することを実証することが期待される。しかし、適切な生着かつ拡大を確保するために移植される初期の細胞（約１５～２０日目）は、まだドーパミン、またはドーパミン作動性ニューロンとして識別する最終的な分子マーカーさえも分泌していない。さらに、初期の細胞集団は、多能性幹細胞を含み得、レシピエントの脳にテラトーマ腫瘍を発生させる可能性がある。
【0010】
ＵＳＦＤＡがパーキンソン病の処置のための細胞に、他の細胞療法と同じ受け入れ基準を適用する場合、ドーパミン作動性ニューロンまたはその前駆体の早期移植が受け入れられるとは到底思えない。ＦＤＡは、治療用細胞が一定のリリース基準を満たすことを要求することが予想され得る。言い換えると、製造された細胞は、特定の分子マーカーを再現性よく発現し、例えば、特定の範囲のドーパミンを分泌するなど、効力を発揮することが必要とされる。幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンを生成する現在の方法、と早期の移植では、移植前に細胞産生物の特性を十分に把握し、力価を示すことは不可能である。
【0011】
したがって、効率的かつ再現性よく幹細胞を誘導して、生存率が向上し、生着能が向上し、収率が向上し、さらにドーパミンの分泌量が増加するドーパミン作動性ニューロンまたはその前駆体に分化させる、製剤を含む方法を開発することは、当技術分野の改善となるであろう。効率、純度、収量および／またはヒトｉＰＳ細胞から分泌されるドーパミンのそのいずれかを向上させる方法が開発されれば、現状から大きく改善されると考えられる。ｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、患者を免疫抑制剤で処置する必要をなくし、胚性ドナー細胞のマスターセルバンクの必要性をなくす。
【0012】
現在、パーキンソン病の細胞治療では、幹細胞をドーパミン作動性ニューロンの前駆体に分化させ、最終的にドーパミン産生ニューロンへと成熟する前に脳の適切な部位に移植する戦略がとられている。ドーパミン作動性ニューロンまたはその前駆体を早期に移植する理由は、脳内の局所環境によって、前駆体が神経輸送能力を有し、生着し、ドーパミンを産生および分泌する機能的ドーパミン作動性ニューロンに最終成熟するステップに必要な未知の因子が提供されるからである。
【0013】
現在、幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロン、より具体的にその前駆体は、完全に発達する前に脳に生着される必要がある。実験によると、早期に移植することで生着率が高くなり、より多くの利益が得られるが、これはおそらくドーパミンの産生が増加するためだと考えられる。ドーパミン作動性ニューロンまたは前駆体は、脳の局所環境における未知の因子がドーパミン産生段階への適切な成熟を誘導するように、ドーパミン産生以前の段階で移植される。
【0014】
ドーパミン作動性ニューロンまたは前駆細胞を早期に生着させる方法の欠点は、細胞の特徴を完全に把握できないことである。細胞治療でヒトを処置する場合、米国ＦＤＡは、細胞の特性評価を行い、事前に定めた一定の基準を満たした場合のみ、ヒトへの投与のために「リリース」することを要求する。他の細胞療法に対するＦＤＡのリリース基準要件に基づき、特定の分子マーカーを発現する細胞の割合が定義されていること、１Ｍ細胞によるドーパミンの産生量が定義されていることなどの基準が期待される。
【0015】
したがって、幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンを、移植用細胞の高割合が確定的な分子マーカーを発現し、かつ相当量のドーパミンが産生される段階まで、信頼性および再現性が高くｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができれば、当技術分野の著しい進歩となる。最後に、これらの細胞は、脳への生着能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで実証するべきである。
【0016】
したがって、ドーパミン作動性ニューロンの成熟のステップを誘導する脳から提供される因子、ならびにドーパミン作動性ニューロン前駆体がそれらの因子と接触すべき時間枠を特定することは、当技術分野の現状に対する大きな改善となるであろう。
【発明の概要】
【0017】
本発明は、多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させるプロトコルの２０±３日目頃に、神経基礎培地にビタミンを添加するか、またはビタミン濃度を増加させる工程を含む、ヒト幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを産生する方法に関する。プロトコルは、プロトコルＡであってもよい。ビタミンは、レチノール、酢酸レチノール、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、またはオールトランス型レチノイン酸などのビタミンＡであってもよい。ビタミンＡは、ヒト血清アルブミン、Ａｌｂｕｍａｘ、非ヒト血清アルブミンなどの脂質に富んだ製剤中に可溶化されてもよい。１つの実施形態では、ビタミンＡの最終濃度は、１ｕＭ～３ｕＭであってもよい。
【0018】
代替的に、上記に従って、ビタミンはビタミンＢ６であってもよい。ビタミンＢ６は、ピリドキシン、ピリドキサール、またはＰＬＰとしても知られているピリドキサール－５’－ホスフェートの形態であってもよい。１つの実施形態では、ビタミンＢ６の最終濃度は、１０ｕＭ～３０ｕＭであってもよい。
【0019】
代替的に上記に従って、ビタミンはビタミンＣであってもよい。ビタミンＣは、２－ホスホ－アスコルビン酸またはＬ－アスコルビン酸の形態であってもよい。１つの実施形態では、ビタミンＣの最終濃度は、２００ｎＭ～１１０ｕＭであってもよい。
【0020】
上記のいずれの方法においても、分化される多能性幹細胞は、ＮＭＥ７－ＡＢ、またはＷＮＴ３Ａで培養されてもよい。他の態様では、分化される多分化能性幹細胞は未処理状態であってもよい。
【0021】
以上により、産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルで産生されたドーパミン作動性ニューロンと比較して、３０％以上、１００％以上、５００％以上または１０００％以上のドーパミンを発現することを特徴とする場合がある。
【0022】
以上により、産生されたドーパミン作動性ニューロンは、ビタミンを添加または増加させない分化プロトコルで産生されたドーパミン作動性ニューロンと比較して、３０％以上、１００％以上、５００％以上または１０００％以上の神経突起を形成することが特徴である。
【0023】
本発明はさらに、上記の方法で得られたドーパミン作動性ニューロンを対象に投与することを含む、必要とする対象へのドーパミン作動性ニューロンの生着の成功の可能性を向上させる方法にも対象とする。
【0024】
本発明はさらに、ドーパミン産生神経細胞の生着が望まれる患者の中枢神経系疾患を処置する方法であって、上記の方法で得られたドーパミン作動性ニューロンを、それを必要とする個人に生着させることを含む、方法にも対象とする。中枢神経系疾患は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、またはアルツハイマー病である。中枢神経系および末梢神経系の損傷はさらに、損傷部位にニューロンを生着させること、中枢神経系の疾病にドーパミン作動性ニューロン、および末梢神経の損傷には他の種類のニューロンを生着させることで処置されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0025】
特許または出願のファイルは、色つきで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を備えるこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な料金の支払い後に当該事務局によって提供される。
【0026】
本発明は、本明細書における所与の詳細な説明、および例示としてのみ与えられる添付図面からより完全に理解され、したがって、本発明を限定するものではない。
【図1A】多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させるために使用された４つの異なるプロトコルの模式図である。図１Ａは、（多能性幹細胞を作動性ニューロンに分化させる培地の開示に関して、その内容は本明細書に参照により組み込まれる）特許出願ＵＳ２０１８／００９４２４２Ａ１で公開されたプロトコルの模式図であり、本明細書ではプロトコルＡと称する。
【図1B】多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させるために使用しされた４つの異なるプロトコルの模式図である。図１Ｂは、本発明者らが開発した新規かつ改善されたプロトコルの模式図であり、ここではプロトコルＢと称し、該プロトコルでは、２１日目以降、最終濃度１１ｕＭでピリドキサールを添加し、培地中のピリドキサール濃度の合計を約２１ｕＭとする。
【図1C】多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させるために使用しされた４つの異なるプロトコルの模式図である。図１Ｃは、本発明者らによって開発された新規かつ改善されたプロトコルの模式図であり、ここではプロトコルＣと称し、該プロトコルでは、２１日目以降、基礎となる神経培地に様々な形態のビタミンＡ、ビタミンＢ、場合によってはビタミンＣが添加される。
【図1D】多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させるために使用しされた４つの異なるプロトコルの模式図である。図１Ｄは、プロトコルＣ．２の模式図を示し、該プロトコルでは、２１日目以降に、基礎となる神経培地は、ピリドキサールを含むことなく、代わりに最終濃度１６ｕＭのピリドキシンおよび最終濃度１．２ｕＭのレチノールおよび最終濃度０．１７ｕＭの酢酸レチニルを含むものに交換される。
【図1E】多能性幹細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させるために使用しされた４つの異なるプロトコルの模式図である。図１Ｅは、最適化されたプロトコルであるプロトコルＤの模式図であり、該プロトコルでは、２１日目以降、約１０ｕＭのピリドキサールを含む基礎となる培地が、さらに１１ｕＭのピリドキサール、１．２ｕＭのレチノール、０．１７ｕＭの酢酸レチニル、６１ｕＭの２－リン酸アスコルビン酸および１１ｕＭのＬ－アスコルビン酸で補充される。
【図2】Ａ～Ｌは、異なる培地中で培養された異なる３種類の多能性幹細胞を分化させ、ドーパミン作動性ニューロンの生成を試みたプロトコルＡの２４日目に撮影した蛍光写真を示す。Ａ～Ｄは、ＨＥＳ３市販細胞、ここではｈＥＳＥ８－ＨＥＳ３と称する、分化前にＥ８培地中で培養されたヒト胚性幹細胞の蛍光写真である。Ｅ～Ｈは、分化前にＥ８培地中で培養された、ここではｉＰＳＥ８－Ａ６と称するヒト人工多能性幹細胞の蛍光写真である。Ｉ～Ｌは、ここではｉＰＳＮＭＥ７－６Ｅと称する、分化前にＮＭＥ７ＡＢ未処理培地中で培養されたヒト人工多能性幹細胞の蛍光写真を示す。Ａ，Ｅ，Ｉは、ドーパミン作動性ニューロンに発現するＧＩＲＫ２（Ｇタンパク質制御型内向き整流性カリウムチャンネル２（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎｗａｒｄ－ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ２））の存在について染色された細胞を示す。Ｂ、Ｆ、Ｊは、ドーパミン作動性ニューロンの同定におけるゴールドスタンダードと考えられているＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）の存在について染色された細胞を示す。Ｃ、Ｇ、Ｋは、汎神経マーカーであるＴｕｊ１（ニューロン特異的クラスＩｌｌ Ｂ－チューブリン）の存在について染色された細胞を示す。Ｄ、Ｈ、Ｌは３つのマーカーを重ね合わせたものを示す。
【図3】Ａ～Ｌは、異なる培地において培養された異なる３種類の多能性幹細胞を分化させられ、ドーパミン作動性ニューロンの生成を試みたプロトコルＣ．２の２４日目に撮影した蛍光写真を示す。Ａ～Ｄは、ＨＥＳ３市販細胞、ここではｈＥＳＥ８－ＨＥＳ３と称する、分化前にＥ８培地中で培養されたヒト胚性幹細胞の蛍光写真を示す。Ｅ～Ｈは、分化前にＥ８培地中で培養された、ここではｉＰＳＥ８－Ａ６と称するヒト人工多能性幹細胞の蛍光写真を示す。Ｉ～Ｌは、ここではｉＰＳＮＭＥ７－６Ｅと称する、分化前にＮＭＥ７ＡＢ未処理培地中で培養されたヒト人工多能性幹細胞の蛍光写真を示す。Ａ、Ｅ、Ｉは、ドーパミン作動性ニューロンに発現するＧＩＲＫ２（Ｇ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎｗａｒｄ－ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ２）の存在について染色された細胞を示す。Ｂ、Ｆ、Ｊは、ドーパミン作動性ニューロンの同定におけるゴールドスタンダードと考えられているＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）の存在について染色された細胞を示す。Ｃ、Ｇ、Ｋは、汎神経マーカーであるＴｕｊ１（ニューロン特異的クラスＩｌｌ Ｂ－チューブリン）の存在について染色された細胞を示す。Ｄ、Ｈ、Ｌは３つのマーカーを重ね合わせたものを示す。
【図4】Ａ～Ｈは、プロトコルＡまたはプロトコルＣ．２のいずれかに従って、分化された多能性幹細胞の６０日目に撮影した蛍光写真を示す。一部の写真は、プロトコルＣ．２に従って分化されたが、分化開始前の４８時間多能性幹細胞培地にＷＮＴ３Ａを１００ｎｇ／ｍＬで添加された、細胞を示す。Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨは、エピソーム法で初期化されたｉＰＳＮＭＥ７－Ｎ７Ｂナイーブ幹細胞から分化された細胞の画像を示す。ＣおよびＤは、ｉＰＳＥ８－Ａ６幹細胞から分化された細胞の画像を示す。Ａ～ＢはプロトコルＡに従って分化された。Ｅ～ＦはプロトコルＣ．２に従って分化された。Ｃ～ＤおよびＧ～Ｈは、分化プロトコルを開始する前４８時間、それぞれの多能性培地にＷＮＴ３Ａを１００ｎｇ／ｍＬで添加した以外は、プロトコルＣ．２に従って分化された。Ａ、Ｅ、ＣおよびＧは、ＤＡＴ（ドーパミン活性輸送体）およびＴｕｊ１の存在について染色された細胞を示す。Ｂ、Ｆ、ＤおよびＨは、ＧＩＲＫ２、ＴＨおよびＴｕｊ１の存在について染色された細胞を示す。
【図5】Ａ～Ｆは、傷跡または創傷治癒アッセイとしても知られる、ニューロンの生着能力を評価するスクラッチアッセイの蛍光写真を示す。開始幹細胞は、ＮＭＥ７ＡＢ培地中で培養されたナイーブ幹細胞「ｉＰＳＮＭＥ７－６Ｅ」、またはＥ８培地中で培養されたプライミング状態の幹細胞「ｉＰＳＥ８－Ａ６」である。示された細胞は、プロトコルＣ．２に従ってドーパミン作動性ニューロンに分化され、１３日目または１５日目にコンフルエントになるまで増殖させられた。ギャップを作るために、細胞のフィールドを横切るように機械的なスクラッチがつけられた。神経突起の成長がそのギャップを架橋する速度は、モニタリングされ、生着能に関連づけられる。緑色の蛍光は、標識されたドーパミンからのドーパミンの取り込みの指標である。Ａ～Ｃは、ｉＰＳＮＭＥ７－６Ｅ由来のニューロンの写真を示す。Ｄ～Ｆは、ｉＰＳＥ８－Ａ６由来のニューロンの写真を示す。
【図6】Ａ～Ｄは、プロトコルの１１日目に蒔かれた８００，０００個／ｃｍ２の細胞からの、分化開始後の３０日目から６０日目にかけてドーパミンとその代謝物の分泌量グラフを示す。Ａ～Ｂは、プロトコルＡに従ってドーパミン作動性ニューロンに分化された細胞から分泌されたドーパミンを示す。Ｃ～Ｄは、プロトコルＣ．２に従ってドーパミン作動性ニューロンに分化された細胞から分泌されたドーパミンを示す。Ａ、Ｃは、ｉＰＳＥ８－Ａ６プライミング状態の幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンを示す。Ｂ、Ｄは、ｉＰＳＮＭＥ７－６Ｅ未処理状態の幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンを示す。
【図7】可変数の細胞によって分泌されたドーパミンおよびその代謝物の量であって、示される場合には６０日目、または４０日目に測定された量を示すグラフであり、横縞の棒はプロトコルＡに従って分化されたプライミング状態の幹細胞、クロスハッチの棒はプロトコルＣ．２に従って分化されたプライミング状態の幹細胞、縦縞の棒はプロトコルＡに従って分化されたナイーブ幹細胞、実線の黒い棒はプロトコルＣ．２に従って分化されたナイーブ幹細胞を示す。細胞数は、プロトコルの１１日目に蒔かれた細胞数を１ｃｍ２あたりで示したものであることに注意されたい。
【図8】様々な数のヒト幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンによって分泌されるドーパミンとその代謝物の量を示す表である。表は、開始幹細胞型に応じて整理されている。幹細胞は、プライミング状態の胚「ＨＥＳ３」細胞、プライミング状態の人工多能性幹細胞ｉＰＳＥ８－Ａ６細胞、センダイウイルスで生成された未処理状態の人工多能性幹細胞「ｉＰＳＮＭＥ７－６Ｅ」、またはエピソーム技術で生成された未処理状態の人工多能性幹細胞「ｉＰＳＮＭＥ７－Ｎ７Ｂ」のいずれかであった。場合によっては、表で示されるように、幹細胞は、１００ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ３Ａが添加されたそれぞれの培地中で、分化を開始する前に４８時間培養された。
【図9】エピソームナイーブクローンｉＰＳＮＭＥ７－Ｎ７Ｂによって分泌されるドーパミンおよびその代謝物の量を示す表である。１１日目に蒔かれた細胞数、およびドーパミン分泌を測定する日にちを変化させる。さらに、場合によっては、示される場合、ＷＮＴ３Ａは分化開始前の４８時間、１００ｎｇ／ｍＬで培地に添加された。
【図10】エピソームナイーブクローンｉＰＳＮＭＥ７－６Ｅによって分泌されるドーパミンおよびその代謝物の量を示す表である。１１日目に蒔かれた細胞数、およびドーパミン分泌を測定する日にちを変化させる。さらに、場合によっては、示される場合、ＷＮＴ３Ａは分化開始前の４８時間、１００ｎｇ／ｍＬで培地に添加された。
【図11-1】Ａ～Ｋは、プロトコルＡとして本明細書に記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンに分化して２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示すが、プロトコルの２０日目頃にレチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが細胞採取まで培地に導入されているという修正が加えられている。これらの細胞は、プロトコルの２０日目頃に様々な形態のビタミンＢ６を添加した場合の効果を調べるための対照として機能した。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは明視野像を示す。Ｆは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図11-2】Ａ～Ｋは、プロトコルＡとして本明細書に記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンに分化して２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示すが、プロトコルの２０日目頃にレチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが細胞採取まで培地に導入されているという修正が加えられている。これらの細胞は、プロトコルの約２０日目に様々な形態のビタミンＢ６を添加した場合の効果を調べるための対照として機能した。Ｇは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｊは明視野像を示す。Ｋは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図12-1】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ピリドキシンの形態のビタミンＢ６は、最終濃度１６ｕＭになるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。図１２－１のＥは明視野像を示す。Ｆは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図12-2】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ピリドキシンの形態のビタミンＢ６は、最終濃度１６ｕＭになるまで添加された。Ｇは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｊは明視野像を示す。Ｋは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図13-1】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ピリドキサールの形態のビタミンＢ６は、最終濃度１１ｕＭになるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは明視野像を示す。Ｆは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図13-2】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ピリドキサールの形態のビタミンＢ６は、最終濃度１１ｕＭになるまで添加された。Ｇは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｊは明視野像を示す。Ｋは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図14-1】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ＰＬＰとしても知られているピリドキサール－５’－ホスフェートの形態のビタミンＢ６は、最終濃度２０ｕＭになるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは明視野像を示す。Ｆは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図14-2】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ＰＬＰとしても知られているピリドキサール－５’－ホスフェートの形態のビタミンＢ６は、最終濃度２０ｕＭになるまで添加された。Ｇは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｊは明視野像を示す。Ｋは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図15-1】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ビタミンＢ６の３つの形態はすべて、ピリドキシン－ＨＣＬ、ピリドキサールおよびＰＬＰとしても知られているピリドキサール－５’－ホスフェートとして添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは明視野像を示す。は、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図15-2】Ａ～Ｋは、２０日目頃に、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが、細胞採取まで培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。この実験では、ビタミンＢ６の３つの形態はすべて、ピリドキシン－ＨＣＬ、ピリドキサールおよびＰＬＰとしても知られているピリドキサール－５’－ホスフェートとして添加された。Ｇは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｊは明視野像を示す。Ｋは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図16】Ａ～Ｅは、様々な形態のビタミンＢ６の添加効果を見られるように、２０日目頃にレチノールおよび酢酸レチニルが、分化培地に導入されていることを除いて、本明細書にプロトコルＡとして記載されるプロトコルに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞の共焦点顕微鏡で２０倍の倍率で撮影した蛍光写真を示す。図１６のＡは、２０日目からピリドキシン－ＨＣＬを最終濃度１６ｕＭになるまで添加したときの細胞の蛍光写真を示す。図１６のＢは、２０日目からピリドキサールを最終濃度１１ｕＭになるまで添加したときの細胞の蛍光写真を示す。図１６のＣは、２０日目からピリドキサール－５’－ホスフェートを最終濃度２０ｕＭになるまで添加したときの細胞の蛍光写真を示す。図１６のＤは、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサール－５’－ホスフェートを含む３種類のビタミンＢ６全てが添加された場合の細胞の蛍光写真を示す。図１６のＥは、レチノールおよび酢酸レチニルの形態のビタミンＡが２０日目に添加されたことを除いて、プロトコルＡに従った対照実験を示す。
【図17】３０日目、４０日目、５０日目または６０日目に採取された２００，０００個の細胞からの調整培地中に存在する、ＨＰＬＣで測定されたドーパミンおよびその代謝物の量を示すグラフである。培地は単一の細胞源から取り出されていない。培地は、分析のために培地を採取する日まで、別々の実験を進行させた。この実験では、２０日目頃以降にレチノールおよび酢酸レチニルが各条件で添加されたプロトコルＣを使用した。基礎となる神経培地に添加されたビタミンＢの形態は変更されていた。この実験では、基礎となる培地は約１０ｕＭのピリドキサールを含有していた。ピリドキシンを添加した条件では、基礎となる培地からピリドキサールが省かれている。
【図18-1】Ａ～Ｉは、ドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。これらの写真は、プロトコルＡに従って細胞を分化させた対照実験のものである。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図18-2】Ａ～Ｉは、ドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。これらの写真は、プロトコルＡに従って細胞を分化させた対照実験のものである。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図19-1】Ａ～Ｉは、ドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。これらの写真は、２０日目にピリドキサールが最終濃度１１ｕＭで培地に添加されたことを除いて、プロトコルＡに従って細胞が分化された別の対照実験のものであり、この修正プロトコルはここではプロトコルＢと称する。このように、さまざまな形態のビタミンＡを添加することによって付加的な効果が見られる。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図19-2】Ａ～Ｉは、ドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。これらの写真は、２０日目にピリドキサールが最終濃度１１ｕＭで培地に添加されたことを除いて、プロトコルＡに従って細胞が分化された別の対照実験のものであり、この修正プロトコルはここではプロトコルＢと称する。このように、さまざまな形態のビタミンＡを添加することによって付加的な効果が見られる。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図20-1】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降、培地にピリドキサールが添加されたことに加え、２つの形態のビタミンＡが添加された。レチノールは最終濃度０．７ｕＭになるまで、酢酸レチニルは最終濃度０．６ｕＭになるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図20-2】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降、培地にピリドキサールが添加されたことに加え、２つの形態のビタミンＡが添加された。レチノールは最終濃度０．７ｕＭになるまで、酢酸レチニルは最終濃度０．６ｕＭになるまで添加された。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図21-1】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降、培地にピリドキサールが添加されたことに加え、以下の、ビタミンＡの形態が９－シスレチノイン酸が最終濃度０．４４６ｕＭになるまで、１３－シスレチノイン酸が最終濃度０．４４６ｕＭになるまで、オールトランス型レチノイン酸が最終濃度０．４４６ｕＭになるまで、が添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図21-2】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降、培地にピリドキサールが添加されたことに加え、以下の、ビタミンＡの形態が９－シスレチノイン酸が最終濃度０．４４６ｕＭになるまで、１３－シスレチノイン酸が最終濃度０．４４６ｕＭになるまで、オールトランス型レチノイン酸が最終濃度０．４４６ｕＭになるまで添加された。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図22-1】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降、培地にピリドキサールが添加されることに加え、オールトランス型レチノイン酸が最終濃度１．３３ｕＭになるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図22-2】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降、培地にピリドキサールが添加されることに加え、オールトランス型レチノイン酸が最終濃度１．３３ｕＭになるまで添加された。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図23】Ａ～Ｅは、ドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。Ａは、プロトコルＡに従って分化された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、プロトコルＢに従って分化された細胞の蛍光写真を示すが、２０日目に、ピリドキサール添加に加えて、レチノール（０．７ｕＭ）および酢酸レチニル（０．６ｕＭ）の形態のビタミンＡが添加された。Ｃは、プロトコルＢに従って分化された細胞の蛍光写真を示すが、２０日目に、ピリドキサールの添加に加えて、９－シスレチノイン酸、１３－シスレチノイン酸、オールトランス型レチノイン酸の形態のビタミンＡがそれぞれ最終濃度０．４４６ｕＭで添加された。Ｄは、プロトコルＢに従って分化された細胞の蛍光写真を示すが、２０日目に、ピリドキサールに加えて、オールトランス型の形態のビタミンＡは最終濃度１．３３ｕＭで添加された。Ｅは、プロトコルＢに従って細胞を分化された対照実験であり、プロトコルＡとは、２０日目以降に、ピリドキサールが最終濃度１１ｕＭまで添加された点が異なっている。
【図24-1】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降の培地にはピリドキサールを添加することに加え、２ｍｇ／ｍＬでアルブマックスに可溶化させた２種類のビタミンＡは添加された。レチノールは１．２ｕＭの最終濃度になるまで添加され、および酢酸レチニルは０．１７ｕＭの最終濃度になるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図24-2】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降の培地にはピリドキサールを添加することに加え、２ｍｇ／ｍＬでアルブマックスに可溶化させた２種類のビタミンＡは添加された。レチノールは１．２ｕＭの最終濃度になるまで添加され、および酢酸レチニルは０．１７ｕＭの最終濃度になるまで添加された。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図25-1】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降に培地にピリドキサールの添加に加え、２つの形態のビタミンＡと２つの形態のビタミンＣが添加された。ビタミンＡは２ｍｇ／ｍＬでＡｌｂｕｍａｘに可溶化された。レチノールは最終濃度１．２ｕＭまで、酢酸レチニルは最終濃度０．１７ｕＭまで添加された。ビタミンＣは、２－ホスホ－アスコルビン酸を６１ｕＭ、Ｌ－アスコルビン酸として１１０ｕＭで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図25-2】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。この実験では、２０日目以降に培地にピリドキサールの添加に加え、２つの形態のビタミンＡと２つの形態のビタミンＣが添加された。ビタミンＡは２ｍｇ／ｍＬでＡｌｂｕｍａｘに可溶化された。レチノールは最終濃度１．２ｕＭになるまで、酢酸レチニルは最終濃度０．１７ｕＭになるまで添加された。ビタミンＣは、２－ホスホ－アスコルビン酸を６１ｕＭ、Ｌ－アスコルビン酸として１１０ｕＭで添加された。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図26-1】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。本実験では、２０日目以降の培地にピリドキサールが添加されたことに加え、Ａｌｂｕｍａｘに２ｍｇ／ｍＬで可溶化されていたビタミンＡはオールトランス型レチノイン酸として、最終濃度１．３３ｕＭになるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図26-2】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。本実験では、２０日目以降の培地にピリドキサールが添加されたことに加え、Ａｌｂｕｍａｘに２ｍｇ／ｍＬで可溶化されていたビタミンＡはオールトランス型レチノイン酸として、最終濃度１．３３ｕＭになるまで添加された。Ｆは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｇは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｈは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｉは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図27-1】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。本実験では、２０日目以降の培地にピリドキサールが添加されたことに加え、Ａｌｂｕｍａｘに２ｍｇ／ｍＬで可溶化されていたビタミンＡはオールトランス型レチノイン酸として、最終濃度１．３３ｕＭになるまで添加された。ビタミンＣは、２－ホスホ－アスコルビン酸が６１ｕＭ、Ｌ－アスコルビン酸が１１０ｕＭになるまで添加された。Ａは、ＧＩＲＫ２について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｂは、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼについて染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｃは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｄは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。Ｅは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【図27-2】Ａ～Ｉは、プロトコルＢに従ってドーパミン作動性ニューロンへの分化の２４日目のヒトｉＰＳ細胞を共焦点顕微鏡で２０倍に拡大して撮影した蛍光写真を示す。本実験では、２０日目以降の培地にピリドキサールが添加されたことに加え、Ａｌｂｕｍａｘに２ｍｇ／ｍＬで可溶化されていたビタミンＡはオールトランス型レチノイン酸として、最終濃度１．３３ｕＭになるまで添加された。ビタミンＣは、２－ホスホ－アスコルビン酸が６１ｕＭ、Ｌ－アスコルビン酸が１１０ｕＭになるまで添加された。図２７－２のＦは、ＤＡＴ、ドーパミン輸送タンパク質について染色された細胞の蛍光写真を示す。図２７－２のＧは、Ｔｕｊ１について染色された細胞の蛍光写真を示す。図２７－２のＨは、核が見えるようにヘキスト染色で染色された細胞の蛍光写真を示す。図２７－２のＩは、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１、およびヘキストを重ねた蛍光写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
定義
【0028】
本明細書で使用される用語一般的には、当該技術において、本発明の文脈内で、および、それぞれの用語が使用される特定の文脈において、通常の意味を備えている。特定の用語は、本発明の組成物および方法、ならびにそれらの製造方法および使用方法を説明する際に当業者に追加のガイダンスを提供するために、以下に、または明細書の他のところで説明される。
【0029】
本願において、「ａ」および「ａｎ」は、単一の対象および複数の対象の双方を指すために使用される。
【0030】
本明細書で使用されるように、「約」または「実質的に」は、一般的に、正確な数値に限定されない余地を与える。例えば、ポリペプチド配列の長さの文脈で使用されるように、「約」または「実質的に」は、ポリペプチドが言及されたアミノ酸の数に限定されるべきでないことを示す。結合活性などの機能活性が存在する限り、Ｎ－末端またはＣ－末端に付加または除去されたいくつかのアミノ酸が含まれていてもよい。用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの制限に部分的に依存している。例えば、「約」とは、当該技術分野での実践につき３つ以内または３つを超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、所定の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、例えば、５倍以内、または２倍以内を意味し得る。
【0031】
本明細書で使用されるように、用語「細胞の集団」または「細胞集団」は、少なくとも２つの細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００、少なくとも約１０００の細胞を含み得る。集団は、ドーパミン作動性ニューロンの集団のような１つの細胞型を含む純粋な集団であってもよく、未分化幹細胞の集団であってもよい。代替的に、集団は、例えば、混合細胞集団のように、１より多くの細胞型を含む場合がある。
【0032】
本明細書で使用されるように、「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」および「アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ）」は、天然に存在するすべてのＬ－α－アミノ酸を指す。この定義には、ノルロイシン、オルニチン、およびホモシステインが含まれることを意味する。
【0033】
本明細書で使用されるように、「担体」は、採用される投与量および濃度でそれに曝露される細胞または哺乳類に対して無毒である、薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤を含む。多くの場合、薬学的に許容可能な担体は、ｐＨ緩衝化された水溶液である。薬学的に許容可能な担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸を含む抗酸化剤、低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）などの非イオン界面活性剤を限定されることなく含む。
【0034】
本明細書で使用されるように、細胞（複数可）を化合物（例えば、１つ以上の阻害剤、活性化剤、および／または誘導剤）に「接触させる」という用語は、細胞（複数可）が化合物にアクセス可能な位置に化合物を提供することを意味する。接触は、いずれかの適切な方法を使用して遂行されてもよい。例えば、所望の濃度を達成するために、接触は、濃縮された形態の化合物を、例えば、細胞培養の文脈で、細胞または細胞の集団に添加することによって遂行され得る。接触はさらに、化合物を製剤された培地の成分として含むことによって遂行され得る。
【0035】
本明細書で使用されるように、用語「培地」は、ペトリ皿、マルチウェルプレートなどの培養容器内の細胞を覆う液体であり、細胞に栄養を与え支持するための栄養素を含むものを指す。培地は、細胞に所望の変化をもたらすために添加される成長因子をさらに含んでもよい。
【0036】
本明細書で使用されるように、「ＮＭＥファミリーメンバータンパク質を阻害する有効量の薬剤」は、ＮＭＥファミリーメンバータンパク質とその同族受容体との間の活性化相互作用を阻害する際の薬剤の有効量を指す。
【0037】
本明細書で使用されるように、１つ以上のさらなる治療剤と「組み合わせて」投与することは、任意の順序で同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）および連続（ｃｏｎ ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ）投与を含む。
【0038】
本明細書で使用されるように、用語「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、特定の胚性遺伝子（ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子などではあるが、それらに限定されない）を体細胞に導入することによって形成される多能性幹細胞の一型を指す（例えば、参照することにより本明細書に組み込まれるＴａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６，６６３－６７６（２００６）を参照されたい）。
【0039】
本明細書で使用されるように、「多能性」幹細胞は、異なる細胞型の数が制限されている他の細胞型に分化し得る幹細胞を意味する。
【0040】
本明細書で使用されるように、「ナイーブ幹細胞」は、胚盤胞の内塊の細胞に類似し、定量的な特徴を共有するものである。ナイーブ幹細胞は、プライム幹細胞と比較して、特定の遺伝子の発現に定量的な差があり、胚盤胞のエピブラスト部分の細胞に類似した特徴や特性を共有する。女性由来のナイーブ幹細胞は、ＸａＸａと呼ばれる、２本の活性型Ｘ染色体を有するのに対し、女性由来の後期プライム化幹細胞はＸ染色体の片方が不活性化されていることに注目されたい。
【0041】
本明細書で使用されるように、「神経基礎培地」は、神経細胞の正常な表現型と成長を長期間維持することができ、アストロサイトフィーダー層を必要とされることなく神経細胞の純粋な集団を維持することができる培地を意味する。
【0042】
本明細書で使用されるように、「ＮＭＥファミリータンパク質」または「ＮＭＥファミリーメンバータンパク質」は、１～１０までの番号が付けられており、いずれも少なくとも１つのＮＤＰＫ（ヌクレオチド二リン酸キナーゼ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ））ドメインを有することからグループ化されているタンパク質である。場合によっては、ＮＤＰＫドメインは、ＡＴＰからＡＤＰへの変換を触媒することができる点で、機能しない。ＮＭＥタンパク質は、以前はＮＭ２３タンパク質として知られており、Ｈ１とＨ２という番号が付けられていた。近年、１０種類ものＮＭＥファミリーが同定された。本明細書において、用語ＮＭ２３、ＮＭＥは交換可能である。本明細書において、用語ＮＭＥ１、ＮＭＥ２、ＮＭＥ５、ＮＭＥ６、ＮＭＥ７、ＮＭＥ８およびＮＭＥ９は、天然タンパク質と同様にＮＭＥ変異体を指すために使用されている。場合によっては、これらの変異体は、可溶性が高く、大腸菌での発現が良好であり、または天然配列のタンパク質よりも溶解性が高い。例えば、本明細書で使用されるようなＮＭＥ７は、天然タンパク質、またはＮＭＥ７ＡＢなどの変異体を意味し得、該変異体は、大腸菌において可溶性で適切に折り畳まれたタンパク質の高収率発現を可能にするため、優れた商業的適用性を有する。ＮＭＥ７ＡＢは、主にＮＭＥ７ ＡドメインおよびＢドメインから構成されるが、天然タンパク質のＮ末端にあるＤＭ１０ドメインの大部分は欠落している。本明細書で言及される「ＮＭＥ１」は「ＮＭ２３－Ｈ１」と交換可能である。本発明は、ＮＭＥタンパク質の正確な配列によって制限されないことがさらに意図される。本明細書で言及されるようなＮＭＥ７は、約４２ｋＤａの分子量を有する天然ＮＭＥ７を意味することが意図される。本明細書で言及されるようなＮＭＥ７ＡＢは、ＤＭ－１０ドメインを欠いた、分子量約３３ｋＤａの天然または組み換えのＮＭＥ７、あるいは同じくＤＭ－１０ドメインを欠いた、分子量約３１ｋＤａの代替天然変異体ＮＭＥ７－Ｘ１のいずれかを意味することが意図される。
【0043】
本明細書で使用されるように、用語「ＮＭＥ７ＡＢ」、「ＮＭＥ７ＡＢ」、および「ＮＭＥ－ＡＢ」は、交換可能に使用される。
【0044】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容可能な担体および／または希釈液」は、全ての溶媒和物、分散媒体、コーティング、抗菌剤と抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。医薬品の有効物質のためのこうした媒体と薬剤の使用は当該技術分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と適合しない限り、治療用組成物中にそれらの使用が企図される。補足の活性成分も組成物に組み込むことが可能である。
【0045】
投与を容易にするために、および、用量を均一にするために、投与単位剤形で非経口組成物を製剤化することは特に利点がある。本明細書で使用されるような投与単位剤形は、処置される哺乳動物対象用の単位投与量（ｕｎｉｔａｒｙ ｄｏｓａｇｅｓ）として適した物理的に個別の単位を指し、単位はそれぞれ、必要とされる医薬担体に関連する望ましい治療効果をもたらすように計算された、あらかじめ決められた量の活物質を含有している。本発明の投与単位剤形に関する仕様は、（ａ）活物質の固有の特性および達成される特定の治療効果、ならびに、（ｂ）身体の健康が損なわれている疾病を有する生きる対象の疾患の処置のためにそのような活性質を配合する技術における固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【0046】
主要な有効成分は、便利かつ有効な投与のために、有効量を適切な薬学的に許容可能な担体とともに、投与単位の形態で配合される。単位剤形は、例えば、０．５μｇ～約２０００ｍｇの範囲の量の主要な活性化合物を含み得る。割合で表すと、活性化合物は一般的に約０．５μｇ／ｍｌから担体中に存在する。補助的な有効成分を含有する組成物の場合、投与量は、当該成分の通常の用量および投与方法を参照して決定される。
【0047】
本明細書で使用されるように、「多能性マーカー」は、細胞が最初の細胞より成熟度の低い状態に戻ったときに発現が増加する遺伝子およびタンパク質である。多能性マーカーは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ２、Ｔｒａ １－６０、Ｔｒａ １－８１、ＳＳＥＡ４、およびＲＥＸ－１、ならびに以前に記載されたものおよび現在発見されているものを含む。例えば、線維芽細胞は、これらの多能性マーカーを検出できないか、または低レベルで発現するが、ＣＤ１３と呼ばれる線維芽細胞分化マーカーを発現する。細胞が最初の細胞よりも成熟度が低下しているか否かを判断するために、最初の細胞と得られた細胞との間の多能性マーカーの発現レベルの差を測定することができる。
【0048】
本明細書で使用されるように、「多能性」幹細胞は、内胚葉、外胚葉、中胚葉の３つの生殖細胞すべてに分化し、体内のあらゆる細胞型に分化できるが、完全な生物を生み出すことはできない幹細胞を指す。全能性幹細胞は、ヒトのような完全な生物に分化または成熟することができる細胞である。胚性多能性幹細胞に関して、胚盤胞の内部細胞塊に由来する細胞である。典型的な多能性マーカーは、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、Ｔｒａ １－６０、Ｔｒａ １－８１、およびＳＳＥＡ４である。
【0049】
本明細書で使用されるように、「刺激された幹細胞」は、胚盤胞の上胚葉部分の細胞に類似し、その形質および特徴を共有する細胞である。
【0050】
本明細書で使用されるように、細胞集団の「半ドーパミン作動性ニューロン状態」、もしくは「前ドーパミン作動性ニューロン状態」、または「ドーパミン作動性ニューロン前駆体」は、細胞の一部または全部がドーパミン作動性ニューロンの形態的特徴およびドーパミン発現レベルを有するが、細胞の集団は完全に成熟したドーパミン作動性ニューロンではない細胞を少なくともいくつか含有する細胞集団を指す。
【0051】
本明細書で使用されるように、用語「幹細胞」は、培養下で不定期に分裂し、特殊な細胞を生み出す能力を有する細胞を指す。
【0052】
本明細書で使用されるように、「処置」は、有益か、または所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益または所望の臨床結果は、検出可能または検出不可能なものにかかわらず、限定されないが、症状の緩和、疾患の範囲の減少、疾患の安定（例えば、悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状況の改善または軽減、および寛解（部分的または全体的のいずれか）を含む。「処置」はさらに、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを意味し得る。「処置」は、治療用処置および予防的または再発防止の措置の両方を指す。処置を必要とするものは、すでに障害を有する人同様に障害が予防される人を含む。疾患を「軽減する」ことは、処置を行わない場合と比較して、疾患状態の程度および／または望ましくない臨床症状が軽減されること、および／または進行の時間経過が遅くなるもしくは長くなることを意味する。
【0053】
多能性幹細胞のドーパミン作動性ニューロンへの分化
【0054】
研究のこの部分では、発明者は、１）ナイーブ幹細胞とプライミング状態幹細胞のドーパミン機能的ニューロンへの分化能の比較、および２）発育中の胚の脳内で産生されるビタミンを含む様々な因子の時間依存的添加が、機能的ドーパミン作動性ニューロンの分化に及ぼす影響の２つの主要な研究テーマを探求した。
【0055】
本発明者らはまず、本明細書にプロトコルＡと称する、ＵＳ２０１８／００９４２４２Ａ１由来のプロトコルを使用して、ヒトｉＰＳ細胞をドーパミン作動性ニューロンに分化させた（図１Ａおよび実施例１）。これらの実験では、開始のｉＰＳＣは、ＮＭＥ７－ＡＢ未処理培地で培養した最も初期の未処理状態（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１６）、またはＦＧＦ２含有Ｅ８培地で培養した後期のプライミング状態のいずれかであった。プロトコルＡを使用して、ＦＧＦ２含有Ｅ８培地で培養したプライミング状態のｈＥＳＣまたはｈｉＰＳＣのいずれかから開始した場合、得られたドーパミン作動性ニューロンは、プロトコルの６０日目に細胞８０万個／ｃｍ２あたり約２～３ｎｇ／ｍＬのみのドーパミンまたはその代謝物を分泌した。これに対して、プロトコルＡを使用したが、未処理状態のｈｉＰＳＣから開始した場合、６０日目には、ある場合では細胞４０万個／ｃｍ２あたり８．４５ｎｇ／ｍＬのドーパミンと代謝物が分泌され、別の場合では細胞８０万個／ｃｍ２あたり５．８５ｎｇ／ｍＬのドーパミンと代謝物が分泌された。これらの結果は、未処理状態でＮＭＥ７－ＡＢで培養した細胞は、プライミング状態の幹細胞よりもドーパミン作動性ニューロンへの分化が良いという観念と一致する。
【0056】
これまでの研究で、ドーパミン作動性ニューロン前駆体を分化開始後約１６日目～２８日目に脳に移植すると、完全に成熟してから４０～６０日目に移植するよりも良好に生着し、より高い治療効果が得られることが示された。これらの結果は、脳の環境中で、前駆細胞が機能的なドーパミン作動性ニューロンに成熟することができたことを示唆する。これらの結果はさらに、脳から供給される成熟因子は、ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化の初期段階には必要とされないという観念と一致する。したがって、脳内で産生されるどの因子がドーパミン作動性ニューロンの発生に重要になり得るかを決定し、さらにドーパミン作動性ニューロン前駆体にそれらの因子を接触させる時間枠を決定することを目指した。研究者が経験的にドーパミン作動性ニューロンの前駆細胞を脳に移植する必要があると判断したのとほぼ同じ時点に、分化プロトコルの１６日目と２８日目の間に候補因子を添加した（Ｓａｍａｔａ ａｎｄ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ２０１６，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３０９７）。個別に、または組み合わせて添加された候補、分子マーカーの発現、生着、ドーパミン分泌に及ぼす影響は評価された。
【0057】
神経分化には、脳内で産生されるいくつかの因子が重要であることが示唆されている。ドーパミン作動性ニューロンへの成熟の最終段階を誘導し得る脳から供給される候補因子の一部としては、ビタミンＡ ［Ｑｉｎｇ ｍｕ ｅｔ ａｌ ２０１８，ＤＯＩ：１０．１０８０／２１６９１４０１．２０１８．１４３６５５２；Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０１０；２８：１４９８－１５０９；ＪＤ Ｂｒｅｍｎｅｒ，００７，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｎｐｂｐ．２００７．０７．００１］、ビタミンＢ ［Ｃａｒｌｏｓ Ａｌｂｅｒｔｏ Ｃａｌｄｅｒｏｎ－Ｏｓｐｉｎａ，Ｍａｕｒｉｃｉｏ Ｏｒｌａｎｄｏ Ｎａｖａ－Ｍｅｓａ，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｎｓ．１３２０７，Ｇｕｉｌａｒｔｅ，２００６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＤＯＩ：１０．１１１１／ｊ．１４７１－４１５９．１９８７．ｔｂ０４１１１．ｘ，Ｐｅｒａｚａ ｅｔ ａｌ，２０１８，ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ］、ビタミンＣ ［Ｖ．Ｂａｇｇａ ｅｔ ａｌ ２００８，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；Ｘｉ－Ｂｉａｏ Ｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１５，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，ｄｏｉ：１０．１００２／ｓｔｅｍ．１９３２］、およびビタミンＤ ［Ｌｕａｎ ｅｔ ａｌ ２０１８，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３５－０１７－０４９７－３］が挙げられる。これらのビタミンにはさまざまな形態があり、いくつかは神経の発達期に脳内でレベルが上昇することが報告されている。しかしながら、試験結果はしばしば矛盾している。ビタミンＡ、またはその誘導体であるレチノイン酸は、神経分化を遮断すると結論付けた学術研究がいくつかある一方、神経分化に必要である可能性を示唆する研究もある。同様に、各種ビタミンＢも、神経分化に有効であると報告される一方、神経分化を抑制するとの報告もある。
【0058】
本発明者らは、様々な形態のビタミンＢ群、特に神経刺激性のビタミンＢであるＢ１、Ｂ６、Ｂ１２、ビタミンＡの形態、およびビタミンＣがｈｉＰＳ細胞由来のドーパミン作動性ニューロンの発生に及ぼす影響を評価した。かなり難溶性のビタミンＡに加え、市販のアルブマックスを含む血清アルブミンや血清アルブミン代替物など、ビタミンＡを可溶化するための様々な高脂質密度添加物の効果を評価した。
【0059】
本発明者らは、技術水準と本発明の方法および組成物とを比較する一連の実験を行った。一方、標準的なプライミング状態の幹細胞と、ドーパミン作動性ニューロンに分化するＮＭＥ７－ＡＢ培養したナイーブ幹細胞とを比較した。一方、プロトコルＡと、プロトコルの２０±３日目頃から各種ビタミンや他の成分を添加した改善されたプロトコルである、プロトコルＢ、プロトコルＣ、プロトコルＣ．２、プロトコルＤ（図１のＡ～図１Ｅ）を比較した。得られた細胞は、適切な分子マーカーの存在、特徴的な形態、生着の可能性の指標となる神経突起の伸長、そして最も重要なドーパミンの生成と分泌量について、さまざまな時点で分析された。
【0060】
プロトコルＣ．２では、２０日目頃、神経基盤培地を、ピリドキサールを含まない代わりに、ピリドキシンと２つの形態のビタミンＡを含むものに交換した。以下の実験では、プロトコルＡまたはプロトコルＣ．２に従ってドーパミン作動性ニューロンになるように分化させた幹細胞が比較される。２４日目に、プロトコルＡ（図２のＡ～Ｌ）またはプロトコルＣ．２（図３のＡ～Ｌ）を使用して生成されたドーパミン作動性ニューロン前駆細胞の分子マーカーの存在を検出するために免疫蛍光染色が行われた。ＧＩＲＫ２（Ｇタンパク質共役型内向き整流性カリウムチャネル２）はドーパミン作動性ニューロンに発現し、Ｔｕｊ１（神経特異的ＩＩＩ型Ｂチューブリン）（ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌａｓｓ Ｉｌｌ Ｂ－ｔｕｂｕｌｉｎ）は汎神経マーカーである。ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）は、ドーパミン合成における律速段階であるＬ－チロシンからＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）への変換する酵素であるので、ドーパミン作動性ニューロンの同定におけるゴールドスタンダードと見なされる。ＤＡＴ（ドーパミン活性輸送体）も同様に重要で、シナプスから細胞質へとドーパミンを送り戻す膜貫通タンパク質である。両方の分化プロトコルで、適切な分子マーカーがすべて陽性である細胞が産生された。しかしながら、プロトコルＣ．２を使用して産生された細胞は、プロトコルＡから産生された細胞よりも長い突起および良好な連結性を有する、相互に結合したニューロンネットワークを形成した。
【0061】
この形態の違いは、６０日目に遂行され免疫蛍光法試験でさらに明らかである。事前にＮＭＥ７ＡＢで培養し、プロトコルＡに従って分化されたｉＰＳＣＳは、機能性ニューロンの軸索突起および相互接続ネットワークの特性を欠く一方、プロトコルＣ．２に従って分化された同じ細胞は望ましい形態を有する（図４のＡ～Ｂおよび図４のＥ～Ｆ）。この実験では、第２のナイーブクローンであるｉＰＳＣＮＭＥ７－Ｎ７Ｂが使用されたことに注意されたい。この第２の未処理状態のクローンは、ＮＭＥ７－ＡＢ培地においてコア多能性因子であるＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ－Ｍｙｃを使用してエピソーム再プログラム化により生成された。これらの実験で使用した別のクローンであるｉＰＳＣＮＭＥ７－６Ｅは、センダイウイルスを使用して生成され（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１６）、機能的な心筋細胞および肝細胞に分化し得ることが以前に証明された。ｉＰＳＥ８－Ａ６のようなプライミング状態の幹細胞の分化にプロトコルＡを使用すると、６０日目に到達する前に細胞が繰り返し失敗した。しかし、Ｅ８で増殖したｉＰＳＣをＥ８＋βカテニン、ＷＮＴ３Ａなどのアゴニストで４８時間培養してから分化を開始すると、６０日目の生存率が上がり、形態も改善される可能性があることを示した。しかし、ＤＡＴ、ＴＨ、およびＧＩＲＫ２の形態ならびに発現パターンは、ＮＭＥ７ＡＢとＷＮＴ３Ａで４８時間培養され、プロトコルＣ．２に従って分化されたｉＰＳＣよりも劣っている（図４のＣ～Ｄおよび図４のＧ～Ｈ）。プロトコルＣ．２に従って分化されたナイーブ幹細胞は、所望の形態を有するネットワークを形成した。ニューロンの分岐密度およびグループ化パターンなどの形態の複雑さは、ニューロンの機能と高い相関がある。
【0062】
幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンの治療利用を妨げる要因の一つは、現在の低い生着率である。治療効果を得るためには、少なくとも１００，０００個の機能的なドーパミン作動性ニューロンが患者の脳に生着される必要があると推定されている。生着率を評価するための１次のｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、スクラッチテストとしても知られる創傷治癒アッセイであろう。ＮＭＥ７ＡＢまたはＥ８のいずれかで培養したｉＰＳＣを、プロトコルＣ．２を使用して細胞がコンフルエントになるまで分化され、その後スクラッチ、または傷が作製された。事前にＮＭＥ７ＡＢ培地で事前に培養したｉＰＳＣ由来のドーパミン作動性ニューロンは、６日以内に神経、軸索突起が発生し、ギャップを埋めることができたが、Ｅ８培地で培養した細胞は突起が少なく、より短かった（図５のＡ～Ｆ）。緑色の蛍光は、標識されたドーパミンの模倣品からのドーパミンの取り込みの指標である。
【0063】
ドーパミン作動性ニューロン機能の最も重要な指標のひとつは、ドーパミンを作り出し分泌する能力である。分泌されたドーパミンおよびその代謝物を定量するためのＨＰＬＣ分析は、様々な細胞密度、および分化プロトコルの様々な段階において実施された。プロトコルＡに従ってドーパミン作動性ニューロンに分化されたプライミング状態のヒトｉＰＳＣ細胞は、６０日目までに１０ｎｇ／ｍＬものドーパミンとその代謝物を分泌する（図６のＡ）一方、プロトコルＡを使用して分化させた未処理状態の幹細胞はその時点で約７ｎｇ／ｍＬ程度しか分泌していなかった（図６のＢ）。対照的に、プロトコルＣ．２を使用して分化されたプライミング状態の幹細胞は、６０日目にほぼ４０ｎｇ／ｍＬのドーパミンとその代謝物を分泌し（図６のＣ）、および未処理状態の幹細胞は、ほぼ６０ｎｇ／ｍＬのドーパミンとその代謝物（図６のＤ）を分泌した。図６に示される実験では、測定されたドーパミンとその代謝物の量は、１ｃｍ２あたり４０万個の細胞から分泌され、分化開始後６０日目に測定された。図７は、可変数の細胞によって分泌された６０日目、または４０日目に測定されたドーパミンおよびその代謝物の量のグラフを示し、示されている場合には、横縞および縦縞の棒はプロトコルＡを使用して分化された細胞を示し、クロスハッチおよび塗り潰された棒はプロトコルＣ．２を使用して分化された細胞を示す。横縞とクロスハッチの棒はプライミング状態の幹細胞が使用されたことを示し、縦縞と塗り潰された棒は未処理状態の幹細胞が使われたことを示す。プロトコルＣ．２と比較してプロトコルＡを使用して実施された４０以上の実験（図８、図９、図１０）では、プロトコルＣ．２を使用してドーパミン作動性ニューロンに分化された細胞は、プロトコルＡを使用して産生された細胞に比べて平均１０倍以上のドーパミンを分泌する細胞が産生したことが示される。さらに、ＮＭＥ７ＡＢナイーブ細胞から分化された細胞が再現性よく最も多くのドーパミンを産生した。
【0064】
次に、ドーパミン作動性ニューロンへの幹細胞分化に対する様々な形態のビタミンＢ６の効果をさらに調査しようとした。前の一連の実験では、プライミング状態の幹細胞または未処理状態の幹細胞のいずれかを、プロトコルＡまたはプロトコルＣ．２のいずれかに従ってドーパミン作動性ニューロンになるように分化させられ、該プロトコルでは、約２０日目に、神経基礎となる培地を、もはやピリドキサールを含まず、代わりにピリドキシンおよびレチノールならびに酢酸レチニルを含むように交換したことを想起されたい。
【0065】
この次の一連の実験では、２０日目頃に神経基礎となる培地を、約１．２ｕＭのレチノールと０．１７ｕＭの酢酸レチニルを含む培地に交換し、その後様々な他の形態のビタミンＢ６を添加した以外は、プロトコルＡを従った（図１、実施例２）。結果として生じた細胞は、細胞形態、Ｔｕｊ１陽性に対するＴＨおよびＤＡＴ陽性細胞の収量、生着の可能性の指標としての神経突起の数および長さについて分析された。
【0066】
ビタミンＢ亜群、Ｂ１（チアミン）、Ｂ６（ピリドキシン）、およびＢ１２（コバラミン）は、向神経性ビタミンＢ群と名付けられる。Ｂ６のレベルは、妊娠中の脳の発達で増加する。ピロドキシンは食物性形態のＢ６の一種である。ビタミンＢ６のＰＬＰ型（リン酸ピリドキサール）は、Ｌ－ドーパからドーパミンを合成するなど、神経伝達物質の合成に必要な生物学的活性型ビタミンＢ６である。培地中では、ピリドキシンはピリドキサール－５’－ホスフェートを形成するために代謝され得る。Ｂ１２は、ミエリンの合成に関与することが報告されている。
【0067】
本発明者らは、基礎的神経分化培地にある形態のビタミンＢ６を添加すると、幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンの質が大幅に向上し、分泌するドーパミン量が大幅に増加し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ創傷治癒実験における生着率が大幅に向上することを発見した。ビタミンＢの摂取時期、濃度、および様々な形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンの分化と成熟の重要な要因である。
【0068】
本発明者らは、ヒトｉＰＳ細胞からのドーパミン作動性ニューロンへの分化に及ぼす様々な形態のビタミンＢ６の影響を評価した。最初の実験で、ナイーブＮＭＥ７－ＡＢヒトｉＰＳ細胞は、ＦＧＦ２を含むＥ８培地で培養したｈｉＰＳＣよりもドーパミン作動性ニューロンによく分化することが示されたため、これらの実験は未処理状態の幹細胞のみで行われ、後にプライミング状態の幹細胞を使って繰り返された。プロトコルＡ（図１）と呼ばれる分化プロトコルに２０日目まで従った。２１日目以降、基礎培地にビタミンＡをレチノールの形態で１．２ｕＭ、酢酸レチニルの形態で０．１７ｕＭ、ビタミンＣをアスコルビン酸－２－リン酸の形態で最終濃度約２００ｎＭで添加した。追加のビタミンＢを添加しない陰性対照は図１１のＡ～Ｋで示される。ここで重要なのは、すべての条件において使用された神経基礎培地には１０ｕＭのピリドキサールが含まれており、この低濃度のピリドキサールが分化の開始から存在していたことに注意されることである。
【0069】
すべての条件下で一定であるビタミンＡとＣに加え、１６ｕＭのピリドキシン（図１２のＡ～Ｋ）、１１ｕＭのピリドキサール（図１３のＡ～Ｋ）、またはＰＬＰとして知られる２０ｕＭのピリドキサール－５’－ホスフェート（図１４のＡ～Ｋ）、またはすべてのビタミンＢが添加された。対照培地に添加された追加のビタミンＢ群の全ては、図１５のＡ～Ｋに示される。対照培地と各種ビタミンＢ６の形態の添加との比較は、図１６のＡ～Ｅに示される。結果として生じたドーパミン作動性ニューロンの質を評価するために、我々は以下のことを検査した。ａ）ＧＩＲＫ２陽性細胞のうち、ドーパミン合成の速度制限段階であるＬ－チロシンからＬ－３，４－ジヒドロキシフェニルアラニンへの変換を媒介する酵素である、ＴＨ、チロシンヒドロキシラーゼに対しても陽性であった細胞の割合であって、この割合は、所望の細胞型であるドーパミン作動性ニューロンの収量を示す指標として高くあるべきである。ｂ）ＴＨ陽性でもあったＴＵＪ陽性ニューロンの割合。ＴＵＪは、ニューロンの多面発現性マーカーであり、ＴＨ陽性のもののみが真のドーパミン作動性ニューロンである。ｃ）ＴＵＪ陽性細胞のうち、ドーパミン輸送タンパク質であるＤＡＴにも陽性である細胞の割合。ｄ）細胞体の形状は、ニューロンに特徴的な細長い三角形であるべき。そして、ｅ）ＴＨ陽性およびＤＡＴ陽性に関連する神経突起の長さと数である。生着には、神経突起の長さと数が最も重要な因子であると考えらる。図１２～図１６の写真を検討すると、分化プロトコルの２１日目頃に各種形態のビタミンＢの量が増加すると、形態および収率に基づいてドーパミン作動性ニューロンへの分化が大きく促進されることが示される。図１６のＥに示される対照群では、ビタミンＡとＣの２つの形態が添加されることを想起されたい。図１６のＡ～Ｅを参照すると、ヘキスト色素によって可視化された、多数の相互接続した長い神経突起を有するＴＨ陽性およびＤＡＴ陽性の細胞の割合は、分化プロトコルの２１日目当たりから生理活性形態のビタミンＢ６、ピロドキサール－５－ホスフェートを添加すること、または生理活性形態の即時前駆体のピリドキサール、もしくはすべてのビタミンＢ６形態の組み合わせを添加することが、多くの長く相互接続した神経突起を生成してドーパミン収率および生着能を大幅に増加させることを表している。図１７は、３０日目、４０日目、５０日目、または６０日目に採取された２００，０００個の細胞のみからの調整培地中に存在する、ＨＰＬＣによって測定したドーパミンおよびその代謝物の量を示すグラフである。培地は、単一の細胞源から取り出されていなかった。より正確に言えば、分析のために培地が取り出された日まで、別々の実験を続行する可能であった。この実験では、２０日目頃以降に、すべての条件にレチノールと酢酸レチニルが添加されたプロトコルＣを使用した。基礎となる神経培地に添加されたビタミンＢの形態は様々であった。この実験では、基礎となる培地に約１０ｕＭのピリドキサールが含まれていた。ピリドキシンを添加した条件、プロトコルＣ．２では、基礎培地からピリドキサールが省略される。図１７では、「ＮＢＭ」は神経基礎となる培地を指すが、レチノールおよび酢酸レチニルの形態でビタミンＡも添加されたので、２０日目以降に様々な形態でビタミンＢをさらに添加した効果だけを比較できることに注意することが重要である。２００，０００個／ｃｍ２の細胞には、３０日目、４０日目、５０日目、６０日目に培地に分泌されたドーパミンとその代謝物の量はＨＰＬＣによって測定された（図１７）。このグラフは、分化プロトコルの５０日目あたりにドーパミンの分泌のピークがあることを示す。図から見えるように、神経基礎培地に２０日目頃にレチノール、酢酸レチニル、ビタミンＣが添加されたもの、または１１ｕＭのピリドキサールを添加したもの、あるいはピリドキサールを１１ｕＭで、ピリドキサール－５’－ホスフェートを２０ｕＭで、ピリドキシンを１６ｕＭで添加した３種類のＢ６形態を全て一緒に添加されたものが最も多量のドーパミンをもたらすことが明らかになる。なお、ドーパミンの産生量と、生きている脳のある領域に生着する能力は、移植に適したドーパミン作動性ニューロンの２つの異なる尺度であると思われる。対照、神経基礎媒体ならびにレチノールおよび酢酸レチニルは、大量のドーパミンを産生するが、生着に重要な多くの長く相互接続した突起を備えたドーパミン作動性ニューロンは生成されない。
【0070】
本発明の一態様では、ピリドキシンまたはピリドキシン－ＨＣＬは、１６日目頃から始まり３０日目まで分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。本発明の他の態様では、ピリドキシンまたはピリドキシン－ＨＣｌは、２０±３日目頃から分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。一態様では、ピリドキシンは、２０＋／－３日目で最終濃度が５．０ｕＭ～２５．０ｕＭになるまで分化培地に添加される。他の態様では、ピリドキシンは最終濃度が１０．０ｕＭ～３０．０ｕＭになるまで添加される。他の態様では、ピリドキシンは最終濃度が１０．０ｕＭ～２０．０ｕＭになるまで添加される。さらに別の態様では、ピリドキシンは最終濃度が１５．０ｕＭになるまで添加される。本発明の他の態様では、ピリドキシンは、分化の開始時から５．０ｕＭ～１５．０ｕＭの濃度で存在する。他の態様では、ピリドキシンは、１６日目～３０日目頃に１０ｕＭ～３０ｕＭの最終濃度に増加し、細胞の採取まで継続される。本発明の他の態様では、ピリドキサールは、１６日目～３０日目頃に分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。本発明の他の態様では、ピリドキサールは、２０±３日目頃から分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。一態様では、ピリドキサールは、分化培地中の最終濃度が１０ｕＭ～４０ｕＭとなるように添加される。他の態様では、ピリドキサールは、最終濃度が１０ｕＭ～３０ｕＭになるまで添加される。他の態様では、ピリドキサールは、最終濃度が１５ｕＭ～３０ｕＭになるまで添加される。さらに別の態様では、ピリドキサールは、最終濃度が２１ｕＭになるまで添加される。本発明の他の態様では、ピリドキサールは、分化の開始時から５．０ｕＭ～１５．０ｕＭの濃度で存在する。他の態様では、ピリドキサールは、１６日目～３０日目頃に１０ｕＭ～３０ｕＭの最終濃度に増加し、細胞の採取まで継続される。本発明の他の態様では、ビタミンＢ６の生体活性形態であるピリドキサール－５’－ホスフェートは、１６日目～３０日目頃から分化培地に添加され、２５日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。本発明の他の態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、２０±３日目頃から分化培地に添加され、３０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。一態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、最終濃度が５．０ｕＭ～５０．０ｕＭになるまで添加される。他の態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、最終濃度が１０．０ｕＭ～３０．０ｕＭになるまで添加される。さらに別の態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、最終濃度が２０．０ｕＭになるまで添加される。本発明の他の態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、分化の開始時から５．０ｕＭ～１５．０ｕＭの濃度で存在する。他の態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、分化の開始時から５．０ｕＭ～２５．０ｕＭの濃度で存在する。他の態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、１６日目～３０日目頃に１０ｕＭ～３０ｕＭの最終濃度に増加し、細胞の採取まで継続される。他の態様では、ピリドキサール－５’－ホスフェートは、１６日目～３０日目頃に１０ｕＭ～４０ｕＭの最終濃度に増加し、細胞の採取まで継続される。
【0071】
さらに本発明の他の態様では、これらのビタミンＢ群は、１６日目～３０日目頃に、より好ましくは２０±３日目頃にまとめて分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続され、ビタミンＢ群の合計最終濃度は５ｕＭ～１４０ｕＭである。本発明の他の態様では、ビタミンＢ群の合計最終濃度は１５ｕＭ～１００ｕＭである。本発明の他の態様では、ビタミンＢ群の合計最終濃度は４０ｕＭ～７０ｕＭである。本発明の他の態様では、ビタミンＢ群の合計最終濃度は５０ｕＭ～５５ｕＭである。本発明の他の態様では、ビタミンＢ群の合計最終濃度は１０ｕＭ～３０ｕＭである。一面では、ピリドキサールは、開始時からドーパミン作動性ニューロン分化培地中に約１０ｕＭで存在し、２０±３日目に最終合計濃度２０ｕＭに増加し、これとともにピリドキシンは２０±３日目頃に最終濃度１５ｕＭになるまで添加され、ピリドキサール－５’－ホスフェートは２０±３日目頃に最終濃度２０ｕＭになるまで添加される。
【0072】
ビタミンＡ
【0073】
ビタミンＡが神経分化を阻害するとともに神経分化を促進することは、実質的に同数の文献に報告されている［２０１１ Ｇｕｄａｓ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２０１１ Ｆｅｂ；２２６：３２２－３３０；Ｋｈｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ ２０１４ ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎｕ６０３１２０９；Ｏｌｅ Ｉｓａｃｓｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ ４５，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１０；２５８－２６６］。レチノイン酸は、核内の特定のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）に結合し、幹細胞分化、より具体的には神経分化に関与する遺伝子の発現を誘導する。ＲＡＲαは、ドーパミン作動性ニューロンの発達を促すレチノイン酸受容体である。したがって、ＢＭＳ７５３などのＲＡＲαのアゴニストは、各種ビタミンＡの代わりに、またはそれらに加えて、後期培地に添加されてもよい。
【0074】
本発明者らは、ビタミンＡの形態がドーパミン作動性ニューロンの成熟に有益であるが、基礎となる培地に添加されるビタミンＡの添加時期、濃度、および種類が大きな要因となることを発見した。本発明者らは、基礎的神経分化培地に様々な形態のビタミンＡを２０日±３日目頃から添加することによってプロトコルＡを修正し、３０日目、４０日目、５０日目、６０日目のいずれかで細胞を採取するまで継続した。ビタミンＡ、レチノール、その活性代謝物であるレチノイン酸（ＲＡ）、９シス－ＲＡ、オール－トランスＲＡ（ａｔＲＡ）、１３シス－ＲＡ、および／または酢酸レチニルを基礎的神経分化培地に添加した。本発明者らは、ビタミンＡおよび／またはその活性代謝物の添加によって、幹細胞からのドーパミン作動性ニューロンの生成が、表現型、適切な分子マーカーの発現、生着、産生されるドーパミン量の観点において大幅に改善することを見いだした。
【0075】
この一連の実験では、未処理状態のヒトｉＰＳ細胞を使用した。これらの多能性幹細胞は、唯一の成長因子としてＮＭＥ７－ＡＢを添加した最小培地中で培養された（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１６）。対照はプロトコルＡ（図１８のＡ～Ｉ）であり、添加されたビタミンＡの効果のみを確認するために、本発明者らは、プロトコルＢと名付けて改変したプロトコルＡを採用し、このプロトコルでは、分化開始時から基礎となる培地に約１０ｕＭのピリドキサールが存在するが、さらに２＋／－３日目から細胞の採取まで１０～１１ｕＭのピリドキサールまたはピリドキサールＨＣＬが添加される（図１９のＡ～Ｉ）。２０日目±３日頃のプロトコルＢの分化幹細胞に、最終濃度０．７ｕＭのレチノールおよび最終濃度０．６ｕＭの酢酸レチニルの形態でビタミンＡが添加された（図２０のＡ～Ｉ）。別の実験群では、２０日目頃に添加されたビタミンＡの形態は、９－シス、１３－シス、オールトランス型レチノイン酸であり、それぞれ最終濃度は０．４４６ｕＭであった（図２１のＡ～Ｉ）。他の実験群では、オールトランス型レチノイン酸のみを最終濃度が１．３３ｕＭになるまで添加した（図２２のＡ～Ｉ）。図２３のＡ～Ｅは、２つの対照として、２０日目頃にビタミンＢ６もビタミンＡも添加されなかったプロトコルＡ（図２３のＡ）および２０日目頃にビタミンＢ６のピリドキサール形態がさらに１１ｕＭの添加により増加したプロトコルＢ（図２３のＥ）と、レチノールと酢酸レチニルの形態でビタミンＡを添加したもの（図２３のＢ）、もしくは９－シス、１３－シス、オールトランス型レチノイン酸の形態でビタミンＡを添加したもの（図２３のＣ）、またはオールトランス型レチノイン酸の形態でビタミンＡを添加したもの（図２３のＤ）との比較を示す。図に見られるように、レチノールおよび酢酸レチニルの添加（図２３のＢ）、または９－シス、１３－シス、オールトランス型レチノイン酸の添加（図２３のＣ）では、それぞれ対照（図２３のＡ、図２３のＥ）と比較すると、神経突起の数、長さ、相互接続性が増加した。しかし、ＧＩＲＫ２で染色した神経細胞体の形態を、ＴＨ陽性でＤＡＴ陽性でもある高割合のＴＵＪ陽性細胞と組み合わせると、レチノールおよび酢酸レチニルの添加により生着率が高くなることが認められる。
【0076】
本発明の一態様では、レチノール、酢酸レチニル、および／またはレチノイン酸は、１６日目頃から３０日目頃まで分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。本発明の他の態様では、これらは、２０±３日目頃から分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。一態様では、ビタミンＡおよび／またはその誘導体は、組合せの最終濃度が０．５ｕＭ～５．０ｕＭになるまで基礎となる培地に添加される。他の態様では、ビタミンＡおよび／またはその誘導体は、組合せの最終濃度が１．０ｕＭ～３．０ｕＭになるまで基礎となる培地に添加される。他の態様では、レチノールは、最終濃度０．５ｕＭ～５．０ｕＭで基礎となる培地に添加される。さらに別の態様では、レチノールは最終濃度１．０ｕＭ～２．０ｕＭで基礎となる培地に添加され、酢酸レチニルは最終濃度０．１ｕＭ～１．０ｕＭで添加される。さらに別の態様では、レチノールは最終濃度１．０ｕＭ～３．０ｕＭで基礎となる培地に添加され、酢酸レチニルは最終濃度０．１ｕＭ～１．２ｕＭで添加される。ビタミンＡおよび／またはその誘導体が添加される基礎となる培地は、Ｎｅｕｒａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）やＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などを含むがこれらに限定されない神経分化の基礎となる培地とすることができる。
【0077】
ビタミンＡは脂溶性であるため、任意選択で、ビタミンＡまたはその誘導体が添加されると、脂質またはアルブミンが基礎となる培地に添加される場合がある。本発明者らが使用した基礎となる神経培地にはＢＳＡがいくらか含まれていたが、ヒトに使用する場合、ＢＳＡの代わりにウシ以外のものを求めた。追加のビタミンＡには、溶解性を補助するのに追加の脂質が必要になることが予想される。この一連の実験では、先ずビタミンＡをＡｌｂｕｍａｘで可溶化し、その後、プロトコルＢに記載されるように、２０±３日目頃から分化培地に添加した。プロトコルＢは、２０＋／－３日目頃からさらに１１ｕＭのピリドキサールの追加を含むことを想起されたい。図２４のＡ～Ｉは２４日目に得られた細胞の共焦点顕微鏡画像を示し、２ｍｇ／ｍＬのＡｌｂｕｍａｘ中で可溶化された、レチノール（１．２ｕＭ）と酢酸レチニル（０．１７ｕＭ）の形態にあるビタミンＡは、２０日目頃から培地に添加される。図２５のＡ～Ｉは、前述のレチノールおよび酢酸レチニルに加えて、２０日目頃に、最終濃度が６１ｕＭになるまで２－ホスホ－アスコルビン酸の形態で、および最終濃度が１１０ｕＭになるまでＬ－アスコルビン酸の形態でビタミンＣを分化培地に添加したときに得られる細胞の共焦点顕微鏡画像を示す。別の実験群では、２０日目頃にプロトコルＢの培地に、Ａｌｂｕｍａｘ中で可溶化されたオールトランス型レチノイン酸の形態のビタミンＡを最終濃度が１．３３ｕＭになるまで添加した（図２６のＡ～Ｉ）。図２７のＡ～Ｉは、前述のオールトランス型レチノイン酸および酢酸レチニルに加えて、２０日目頃に、最終濃度が６１ｕＭになるまで２－ホスホ－アスコルビン酸の形態で、および最終濃度が１１０ｕＭになるまでＬ－アスコルビン酸の形態でビタミンＣを分化培地に添加したときに得られる細胞の共焦点顕微鏡画像である。
【0078】
本発明の一態様では、ビタミンＣは、分化の１６日目～３０日目頃に分化培地に添加される。他の態様では、ビタミンＣは、２０日目頃に分化培地に添加される。一態様では、ビタミンＣは、最終濃度が２００ｎＭ～１１０ｕＭになるまで添加される。他の態様では、ビタミンＣは、最終濃度が１ｕＭ～１００ｕＭになるまで添加される。さらに他の態様では、ビタミンＣは、最終濃度が５０ｕＭ～７５ｕＭになるまで添加される。一態様では、ビタミンＣは２－ホスホ－アスコルビン酸の形態にある。他の態様では、ビタミンＣはＬ－アスコルビン酸の形態にある。さらに別の態様では、両形態のビタミンＣが添加される。本発明の他の態様では、ビタミンＣは、分化の開始時から最終濃度１００ｎＭ～５００ｎＭで分化培地中に存在する。本発明の他の態様では、ビタミンＣは、分化開始時から１００ｎＭ～５００ｎＭの濃度で存在し、１６日目～３０日目頃、または２０日目頃から５０ｕＭ～７０ｕＭに増加する。
【0079】
図５は、ｉｎ ｖｉｖｏ生着におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ代用物とされる、スクラッチテストとも呼ばれる創傷治癒アッセイの写真を示す。幹細胞は、プロトコルＣ．２に従い、ドーパミン作動性ニューロンになるように分化された。ある場合では、開始幹細胞は、ＦＧＦ２または他の成長因子を一切含まないＮＭＥ７－ＡＢ未処理培地において成長された未処理状態の幹細胞であった（図５のＡ～Ｃ）。別の場合では、開始幹細胞は、ＦＧＦ２を含有するＥ８培地中で成長された、プライミング状態の幹細胞であった（図５のＤ～Ｆ）。傷を付けてから６日後である２１日目に、得られた細胞の神経突起の数と神経突起の長さを分析した。２１日目、未処理状態の幹細胞由来のニューロンは、プライミング状態の幹細胞に比べて１０～１２倍、すなわち１０００～１２００％多くの突起を生成した。それらの突起の長さは、プライミング状態の幹細胞で生成された突起の５～７倍、すなわち５００～７００％の増加であった。したがって、未処理状態の幹細胞に変更したことのみに起因して、シミュレートされた生着は、５００％～１２００％向上する。
【0080】
さらに、最先端技術に対する向上は、得られた集団の収量と純度の観点から測定される。パーキンソン病の治療のために幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンを取得する、従来知られている方法は、半純粋な集団を得るために１４日目に細胞の選別を必要とすることを想起されたい。このような従来の方法では、精製された集団は純粋でない集団に比べて１０倍も良好にラット脳に生着することが示された。図４は、プロトコルＡを使用してドーパミン作動性ニューロンに分化されたナイーブ幹細胞の収量と純度を、プロトコルＣ．２を使用したものと比較する。ＧＩＲＫ２、ＴＨ、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１の４つのキーマーカーが陽性であって神経形態を呈する細胞の割合により、集団の純度が決定される。ヘキスト色素はすべての細胞の核を染め、Ｔｕｊ１は多くの種類のニューロンの一般的な染色剤であるが、Ｔｕｊ１、ＧＩＲＫ２（Ａ９ニューロンのマーカー）、ＴＨ（ドーパミンを生成する反応を触媒する）、ＤＡＴ（ドーパミン輸送タンパク質）が陽性であるものだけが、実際にドーパミン作動性ニューロンである。プロトコルＡに従って分化された細胞のうち、ＧＩＲＫ２とＴＨの両方が陽性となるのは、赤に緑を重ねた部分が黄色であることから、約５％しかない（図４のＢ）。これに対して、プロトコルＣ．２に従って分化された細胞は神経形態を呈し、Ｔｕｊ１陽性細胞の８０％～９０％がＤＡＴ陽性であり（図４のＥ）、約７０％がＧＩＲＫ２とＴＨの両方に陽性である（図４のＦ）。プロトコルＣ．２によって、ドーパミン作動性ニューロンの収量と純度が１０倍（１０００％）より多く増加した。
【0081】
別の実験では、ナイーブ幹細胞をプロトコルＡに従って分化した（図１８のＡ～Ｉ）。ここでは、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１が陽性であって神経形態を呈する細胞の割合は、３５％未満であった。図２４Ａ～図２４Ｉは、同じ開始細胞がプロトコルＣに従って分化され、２１日目にピリドキサールが添加され、さらにレチノールと酢酸レチニルが添加されたものを示す。ＧＩＲＫ２、ＴＨ、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１が陽性である細胞の割合は９０％～１００％であった。図２５は、同じ開始細胞がプロトコルＤに従って分化された写真を示すが、本プロトコルＤは、２１日目以降にビタミンＣが２－ホスホ－アスコルビン酸とＬ－アスコルビン酸の形態でさらに添加されるという点で図２４に示されたプロトコルと相違する。図２５Ａ～図２５Ｉで見られるように、事実上１００％の細胞が神経形態を呈し、ＧＩＲＫ２、ＴＨ、ＤＡＴ、Ｔｕｊ１が陽性である。したがって、プロトコルＡと図２４の説明に記載されるプロトコルと間の改善率は２５０％である。プロトコルＡとプロトコルＤ（図２５）と間の改善率は２９０％である。
【0082】
パーキンソン病の処置における治療薬として有用性に重要なドーパミン作動性ニューロンの別の特徴は、ドーパミンを分泌できるということである。ドーパミンとその代謝物の産生量の直接比較は、１）ナイーブ幹細胞対プライミング状態の幹細胞と、２）最先端技術のプロトコルＡ、およびプロトコルＡの約２４日目以降に基礎となる培地中のピリドキサールがピリドキシンと交換され、ビタミンＡがレチノールおよび酢酸レチニルの形態で添加される本発明のプロトコルＣ．２との間で定量化された。ＨＰＬＣ（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって測定された、分化開始後の特定の日数で条件培地に分泌されるドーパミンおよびその代謝物の量についてのグラフを、図６および図７に示す。先ずプロトコルＡを使用して、プライミング状態の幹細胞から始めて１ｃｍ２あたり４０万個の細胞密度でプレーティングし、ドーパミンとその代謝物の測定値は４０日目で１．３４ｎｇ／ｍＬ、６０日目で１３．４ｎｇ／ｍＬであった（図６Ａ）。未処理状態の幹細胞に対しプロトコルＡを使用すると、４０日目に１．３ｎｇ／ｍＬ、６０日目に５．８５ｎｇ／ｍＬを測定した（図６のＢ）。これに対して、プライミング状態の幹細胞にプロトコルＣ．２を使用すると、ドーパミンおよびその代謝物の測定値は４０日目で３３．４ｎｇ／ｍＬ、６０日目で１５．６ｎｇ／ｍＬであった（図６のＣ）。未処理状態の幹細胞にプロトコルＣ．２を使用すると、ドーパミンおよびその代謝物の測定値は４０日目で４３．０ｎｇ／ｍＬ、６０日目で５４．１ｎｇ／ｍＬであった（図６のＤ）。プロトコルＣ．２を用いたときの４０日目のドーパミンおよびその代謝物の分泌量は、プロトコルＡを用いたときと比べて、プライミング状態の幹細胞を使用した場合は２５倍すなわち２５００％、未処理状態の幹細胞を使用した場合は３３倍すなわち３３００％増加する。図７では、示されている６０日目または４０日目で様々な数の細胞から分泌されたドーパミンの量が、グラフ化されている。１ｃｍ２あたり８００，０００個の密度でプレーティングされた未処理状態の幹細胞を使用すると、６０日目、プロトコルＣ．２に従って分化された細胞は、プロトコルＡに従って分化された同細胞に比べて約１０倍のドーパミン（５４ｎｇ／ｍＬ対５．８ｎｇ／ｍＬ）を産生した。そのうち半分の細胞を４００，０００個／ｃｍ２でプレーティングすると、プロトコルＣ．２により分化された細胞は、プロトコルＡにより分化された同細胞に比べて約２．０～２．６倍のドーパミンを産生した。現在の最先端技術、プライミング状態の細胞、およびプロトコルＡに従って産生されたドーパミンの量（６０日目で８００Ｋ細胞から３ｎｇ／ｍＬ）と、本発明の組成物および方法、プロトコルＣ．２に従って未処理状態の幹細胞によって産生されたドーパミンの量（６０日目で８００Ｋ細胞から５４ｎｇ／ｍＬ）とを比較すると、ナイーブ細胞およびプロトコルＣ．２では、最先端技術の１８倍すなわち１８００％多くのドーパミンが産生された。
【0083】
本発明の一態様では、プロトコルＢは、分化プロトコルの２０±３日目頃から、最終濃度が０．５ｕＭ～２．０ｕＭになるまで添加されたレチノール、および最終濃度が０．１～１．５ｕＭになるまで添加された酢酸レチニルが分化培地に補足されるように改変される。本発明の他の態様では、レチノールは最終濃度が０．７～１．２ｕＭになるまで、酢酸レチニルは最終濃度が０．１７～０．６ｕＭになるまで添加される。本発明のさらに別の態様では、レチノールと酢酸レチニルの組合せは、組合せの最終濃度が１．０ｕＭ～２．５ｕＭとなるように添加される。本発明のさらに別の態様では、組合せの最終濃度は１．３３ｕＭである。
【0084】
一態様では、ウシ血清アルブミンが添加される。他の態様では、ヒト血清アルブミンが添加される。さらに別の態様では、脂質に富んだヒト血清アルブミンは添加される。まだ別の態様では、Ａｌｂｕｍａｘ、すなわち脂質に富んだウシアルブミンまたは同様の脂質に富んだヒトアルブミンが添加される。脂質に富んだアルブミンは、最終モル濃度が１０．０ｕＭ～４０．０ｕＭになるまで添加される場合がある。最終モル濃度は１０．０ｕＭ～１５．０ｕＭの場合がある。一態様では、ビタミンＡおよび／またはその誘導体は、アルコール／水混合物に溶解され、真空下で蒸発ささると、薄膜を形成する。その後、この薄膜をＢＳＡまたはＨＳＡの溶液と３７℃で３０分間混合して、脂質を溶解させる。
【0085】
ビタミンＣは、神経発達の後期に胎児の脳中、高レベルで発現される。ビタミンＣはＮｕｒｒ１の発現上昇に関与することが報告されており、Ｎｕｒｒ１は中脳の神経分化に重要で、ドーパミン作動性ニューロンの成熟に重要な因子となる可能性がある。本発明の一態様では、ビタミンＣ ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩は、１６日目～３０日目頃に分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。本発明の他の態様では、ビタミンＣ ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩は、２０＋／－３日目頃に分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。一態様では、ビタミンＣ ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩は、最終濃度が４０．０ｕＭ～１００．０ｕＭになるまで分化培地に添加される。他の態様では、ビタミンＣ ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩は最終濃度が５０．０ｕＭ～７０．０ｕＭになるまで添加される。さらに他の態様では、ビタミンＣ ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩は最終濃度が６０．０ｕＭ～６５．０ｕＭになるまで添加される。本発明の他の態様では、ビタミンＣアスコルビン酸は、１６日目～２１日目頃に分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。本発明のさらに他の態様では、ビタミンＣアスコルビン酸は、２０＋／－３日目頃に分化培地に添加され、４０日目～６０日目になり得る移植または最終試験の日まで継続される。一態様では、アスコルビン酸は、最終濃度が５．０ｕＭ～２０．０ｕＭになるまで分化培地に添加される。他の態様では、アスコルビン酸は最終濃度が１０．０ｕＭ～１５．０ｕＭになるまで添加される。さらに他の態様では、アスコルビン酸は最終濃度が１２．０ｕＭ～１４．０ｕＭになるまで添加される。
【0086】
本発明の一態様では、２－ホスホ－アスコルビン酸の形態にあるビタミンＣは、最終濃度が２５ｕＭ～１００ｕＭになるまで２０日目頃に分化培地に添加される。本発明の他の態様では、ビタミンＣは最終濃度が４０～７５ｕＭになるまで添加される。好ましい実施形態では、ビタミンＣは最終濃度が６１ｕＭになるまで添加される。本発明の一態様では、Ｌ－アスコルビン酸の形態にあるビタミンＣは、最終濃度が１ｕＭ～１２０ｕＭになるまで２０日目頃に分化培地に添加される。本発明の他の態様では、ビタミンＣは最終濃度が５～１００ｕＭになるまで添加される。好ましい実施形態では、ビタミンＣは最終濃度が１１ｕＭになるまで添加される。好ましい実施形態では、ビタミンＣの１つ以上の形態は、最終濃度が５０～７５ｕＭになるまで２０＋／－３日目頃にプロトコルＢの培地に添加される。より好ましい実施形態では、ビタミンＣの２つの形態は、２－ホスホ－アスコルビン酸とＬ－アスコルビン酸である。
【0087】
本発明の一態様では、前述のビタミンは、脂質に富んだアルブミンとともに、所与の濃度で基礎となる神経培地に添加され、幹細胞にはドーパミン作動性ニューロンへの分化が行われ、この培地中で約１６日目～３０日目、具体的に２０±３日目から、分化開始後３０日目～６０日目の間になり得る最終分化または移植の日まで培養される。
【0088】
分化幹細胞に添加されるとドーパミン作動性ニューロンへの分化を増加かつ促進させる主要なビタミン、その代謝物、および脂質に富んだアルブミンが発見されたことに加え、未処理状態の幹細胞の使用によりドーパミン作動性ニューロンへの分化がさらに増加かつ促進されることが発見された。
【0089】
好ましい実施形態では、幹細胞はプロトコルＣに従ってドーパミン作動性ニューロンに分化される。
【0090】
より好ましい実施形態では、幹細胞は、プロトコルＤに従ってドーパミン作動性ニューロンに分化され、このとき、好ましくはＮＭＥ７－ＡＢに培養されたナイーブ幹細胞である幹細胞は神経基礎となる培地中にあり、この培地は、２０±３日目頃に、１１ｕＭのピリドキサールまたは２０ｕＭのピリドキサール－５’－ホスフェート、１．２ｕＭのレチノール、および０．１７ｕＭの酢酸レチニルを脂質に富んだ製剤中で可溶化して添加し、６１ｕＭの２－ホスホ－アスコルビン酸と１１ｕＭのＬ－アスコルビン酸を添加することで補足される。
【0091】
本発明のさらに別の態様では、プロトコルＢ、プロトコルＣ、プロトコルＣ．２、またはプロトコルＤを含む本発明のプロトコルは、ＮＭＥ７－ＡＢを含有する多能性幹細胞培地で培養された多能性幹細胞に適用される。
【0092】
本発明のさらに別の態様では、プロトコルＢ、プロトコルＣ、プロトコルＣ．２、またはプロトコルＤを含む本発明のプロトコルは、ＷＮＴ３Ａを含有する多能性幹細胞培地で培養された多能性幹細胞に適用される。
【0093】
本明細書に記載する最先端技術の改善点は、基礎となる神経分化培地に、様々な形態で特定の濃度の特定のビタミン、およびその他の因子を添加することである。本発明の一態様では、ビタミンＡ、ビタミンＢ、および／もしくはビタミンＣの添加または濃度上昇は、分化の開始とともに始まり、分化過程全体にわたって継続される。本発明の他の態様では、それらは分化開始後１６～３０日目に添加され、細胞採取まで継続される。本発明のさらに他の態様では、それらは分化開始後１８～２３日目頃に添加され、細胞採取まで継続される。有効な一実施形態では、候補となる因子は２０日目または２１日目に添加された。ドーパミン作動性成熟因子であると見出されたこれらのビタミンＡ、Ｂ６、およびＣは、Ｎｅｕｒａｌ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ），ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むがこれに限定されない、いくつかの異なる基礎的神経分化培地に添加することができる。
【0094】
本明細書に示す例の一部では、プロトコルＡ（図１、実施例１）の基礎は、特定のビタミンが基礎となる神経分化培地に添加される２０±３日目頃まで利用された。これらの因子を２０±３日目頃に添加すると、生着率とドーパミン分泌量の上昇を含め、幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンの収量と機能性が大きく向上し、同時に、完全に機能的なドーパミン作動性ニューロンがｉｎ ｖｉｔｒｏで成熟することができた。
【0095】
神経変性障害、疾病、または傷害を処置する方法
【0096】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで分化されたドーパミン作動性ニューロンは、神経変性障害の処置に使用されてもよい。本明細書に明示される組成物と方法は、幹細胞から他のタイプのニューロンを生成するのに適用可能である。分化されたドーパミン作動性ニューロンは、中枢神経系でのドーパミン作動性ニューロンの生着成功により利益を得る神経変性疾患状態などの疾病の処置に使用されてもよい。脊髄などへの損傷によるものといった他の疾病の処置のために、本発明の方法を利用して幹細胞から他のタイプのニューロンを生成することができる。感覚ニューロン、運動ニューロン、または介在ニューロンなどのニューロンは、本発明の方法に従って幹細胞から生成される場合がある。これらのニューロンはさらに末梢神経損傷の処置に使用されてもよく、末梢神経損傷としては、神経の伸張、切断（裂傷）、圧迫、剪断、または圧壊による神経の全体または一部の切断が挙げられる場合がある。本開示の発明特定事項は、神経変性障害を処置する方法であって、神経変性障害を患っている対象に本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンを有効量で投与する工程を含む方法を提供する。
【0097】
神経変性障害の非限定的な例には、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症が挙げられる。本明細書に記載されるプロトコルには、他の神経栄養ビタミンＢ群が追加される場合がある。例えば、多発性硬化症の処置用ニューロンが生成される際に、ミエリンの生成を補助するビタミンＢ１２が分化培地に添加されてもよい。
【0098】
具体的には、神経変性疾患はパーキンソン病である。パーキンソン病の主な運動症状には、手、腕、脚、顎、および顔の振戦、運動の緩徐化もしくは緩慢化、四肢や躯幹の強直もしくは硬直、および姿勢の不安定、またはバランスや協調性の喪失などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0099】
ある実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン症候群病（ｐａｒｋｉｎｓｏｎｉｓｍ ｄｉｓｅａｓｅ）であり、動作を制御する脳の一部である基底核中のドーパミンが不足していることに関連する疾患を指す。ある実施形態では、症状として、振戦、運動緩徐化（運動の極端な緩慢化）、屈曲姿勢、姿勢の不安定、強直が挙げられる。パーキンソン症候群病の非限定的な例として、大脳皮質基底膜変性症、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺が挙げられる。
【0100】
本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンは、神経変性障害を処置または予防するために、対象に全身的にもしくは直接投与または提供される場合がある。ある実施形態では、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンは、対象の器官（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）や末梢神経系（ＰＮＳ））に直接注射される。ある実施形態では、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンは、線条体に直接注射される。
【0101】
本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンは、あらゆる生理学的に容認可能なビヒクルに入れて投与することができる。本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンと薬学的に許容可能なビヒクルとを含む医薬組成物も提供される。本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロン、および当該細胞を含む医薬組成物は、局所注射、同所（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与によって投与できる。ある実施形態では、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンは、神経変性障害を患っている対象に同所（ＯＴ）注射を介して投与される。
【0102】
本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロン、および当該細胞を含む医薬組成物は、滅菌液体製剤、例えば、等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供するのが都合の良い可能性があり、これらは選択されたｐＨにまで緩衝化される場合がある。液体調製物は、通常、ゲル、その他の粘性組成物、および固形組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与する方が、幾分都合が良い。一方、粘性組成物は、特定の組織との接触期間を更に長くするために、適切な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は担体を含むことができ、この担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。滅菌注射溶液は、本開示の発明特定事項の組成物、例えば、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンを含む組成物を、所望により様々な量の他の成分を含む必要量の適切な溶媒に取り込むことによって調製することができる。そのような組成物は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの適切な担体、希釈剤、または賦形剤と混和されてもよい。組成物は、さらに凍結乾燥することもできる。組成物は、投与経路および所望の調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または粘度上昇添加剤、防腐剤、香料、着色料などの補助物質を含有できる。「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ」の１９８５年の第１７版などの、参照により本明細書に援用される標準テキストは、過度の実験を必要とすることなく適切な調製物を調製するために閲覧される場合がある。
【0103】
抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝液を含む、組成物の安定性や無菌性を増強する各種添加剤を添加することができる。微生物作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤によって確実にすることができる。注射可能な医薬品形態の長期間吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを使用することによってもたらすことができる。しかし、本開示の発明特定事項によれば、使用されるいずれかのビヒクル、希釈剤、または添加剤が、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンと適合可能でなければならない。
【0104】
組成物の粘度は、所望により、薬学的に許容可能な増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持することができる。容易にかつ経済的に入手可能であり、ともに作用するのが容易であるという理由で、メチルセルロースが使用できる。他の適切な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に左右され得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。適切な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路、および特定の剤形、例えば、液体剤形の性質（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲル、または時間放出形態や液体充填形態などの別の液体形態に製剤化される否か）に依存するであろう。
【0105】
当業者は、組成物の成分が化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンの生存率または効力に影響を与えないことを認識するであろう。このことは、化学的および薬学的専門分野の当業者にとって、本開示および本明細書に引用された文書から、標準的なテキストを参照することによって、または（過度の実験を伴わない）簡単な実験によって、問題を容易に回避することができるであろう。
【0106】
ある非限定的な実施形態では、本明細書に記載される細胞および前駆体は、生体適合性スキャフォールドまたはマトリックス、例えば、細胞が対象に移植または生着されたときに組織再生を促進する生体適合性３次元スキャフォールドをさらに含む組成物中に構成される。ある非限定的な実施形態では、生体適合性スキャフォールドは、細胞外マトリックス材料、合成高分子、サイトカイン類、コラーゲン、ポリペプチドまたはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノーゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガローズまたはゼラチンを含む多糖類、および／またはヒドロゲルを含む。（例えば、米国公報第２０１５／０１５９１３５号、第２０１１／０２９６５４２号、第２００９／０１２３４３３号、第２００８／０２６８０１９号を参照、これらの各内容は参照によりその全体が組み込まれる。）ある実施形態では、組成物は、移植／生着された細胞の中脳ＤＡ細胞への成熟を促進するための成長因子をさらに含む。
【0107】
本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンの治療用使用に関する一つの考察は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適な効果は、神経変性障害を患う対象のＣＮＳおよび／またはＰＮＳ領域の再増殖、および／または対象のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能向上を含むが、これらに限定されない。
【0108】
ある実施形態では、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンの有効量は、神経変性障害を患っている対象のＣＮＳおよび／またはＰＮＳ領域を再増殖させるのに十分な量である。ある実施形態では、本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンの有効量は、神経変性障害を患っている対象のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能を改善するのに十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常者のＣＮＳおよび／またはＰＮＳの機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％になり得る。
【0109】
投与される細胞の量は、処置される対象によって変動する。ある実施形態では、約１×１０４～約１×１０１０、約１×１０４～約１×１０５、約１×１０５～約１×１０９、約１×１０５～約１×１０６、約１×１０５～約１×１０７、約１×１０６～約１×１０７、約１×１０６～約１×１０８、約１×１０７～約１×１０８、約１×１０８～約１×１０９、約１×１０８～約１×１０１０、または約１×１０９～約１×１０１０の本明細書に開示される分化されたドーパミン作動性ニューロンは対象に投与される。ある実施形態では、約１×１０５～約１×１０７の本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンは、神経変性障害を患う対象に投与される。ある実施形態では、約１×１０６～約１×１０７の本開示の分化されたドーパミン作動性ニューロンは、神経変性障害を患う対象に投与される。有効量とみなされるものの厳密な決定は、特定の対象のサイズ、年齢、性別、体重、状態など、各対象に個別の要因に基づく場合がある。投与量は、本開示および当業者の知識から当業者が容易に把握することができる。
【実施例】
【0110】
実施例１―プロトコルＡ
【0111】
プロトコルＡでは、細胞を、Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆されたプレート上に、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃ ２１１０３０４９）、ビタミンＡなしのＢ－２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃１２５８７０１０）、Ｎ２サプリメント（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃０７１５６）、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、２５０ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＃Ｓ７５０７）、１０．８μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＃Ｓ１０６７）、５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｓｅｍｓ ＃ ４６４－ＳＨ－２００）、０．７μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＃４４２３）、１０μＭ Ｙ２７６３２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＃Ｓ１０４９）、中に蒔いた。１日目および３日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、Ｎ２サプリメント、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭ ＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．７μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有する新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。４日目および６日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、Ｎ２サプリメント、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭ ＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、７．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有すると新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。７日目および９日目に、培地は、ビタミンＡなしのＢ－２７、Ｎ２サプリメント、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、７．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有している新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。１０日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃４５０－０２）、２００ｎＭ アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ４４０３）、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃４５０－１０）、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１００－３６Ｅ）、５００ｎＭ ｃＡＭＰ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１６９８９５０）を含有している新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。１１日目に、細胞を、１５μｇのポリＬ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｐ４９５７）／１μｇのラミニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｌ２０２０）／１μｇのフィブロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃３３０１６－０１５）によって被覆されたプレート上に、１０μＭ Ｙ２７６３２を備えた１０日目の培地に再度蒔いた。１２～６０日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭ アスコルビン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３、５００ｎＭ ｃＡＭＰ、１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ ＃Ｓ２２１５）を含有しているＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に毎日取り換えた。
【0112】
ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃２１１０３０４９）は、グリシン、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン塩酸塩、Ｌ－アスパラギン－Ｈ２Ｏ、Ｌ－システイン、Ｌ－ヒスチジン塩酸塩－Ｈ２Ｏ、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン塩酸塩、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、Ｌ－バリンのアミノ酸、０．０２８５７１４２０ｍＭ 塩化コリン、０．００８３８５７４４ｍＭ Ｄパントテン酸カルシウム、０．００９０７０２９５ｍＭ 葉酸、０．０３２７８６８８３ｍＭ ナイアシンアミド、０．０１９６０７８４４ｍＭ 塩酸塩ピリドキサール、０．００１０６３８２９８ｍＭ リボフラビン、０．０１１８６９４３６ｍＭ 塩酸塩チアミン、５．０１８４５０３Ｅ－６ｍＭ ビタミンＢ１２、０．０４ｍＭ ｉ－イノシトールのビタミン群、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）（無水）、硝酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ＮＯ３）３”９Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム（無水）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、リン酸ナトリウム一塩基（ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏ）硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４－７Ｈ２Ｏ）の無機塩類、その他の成分としてＤ－グルコース（デキストロース）、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッド、ピルビン酸ナトリウムを含有するように示される。
【0113】
実施例２－プロトコルＡにビタミンＢ６の形態を添加する効果の調査
【0114】
この一連の実験では、２０日目頃からスタートして、１０ｕＭピリドキサール、１．２ｕＭレチノールおよび０．１７ｕＭ酢酸レチニルを含有している基礎となる神経培地を使用していた。増加したレベルの様々なビタミンＢを、宿主脳中への移植は生着が増大させることを研究者が発見した時点である２０日目頃に添加した。２０日目＋／－３に、５～２５ｕＭの間の最終濃度になるまでのピリドキシン、５～２０ｕＭの間の最終濃度になるまでのピリドキサール、１０～４０の間の最終濃度になるまでの生体活性形態のピリドキサール－５’－ホスフェート、または、組み合わせた３つのすべてのビタミンＢを添加した。ピリドキシンの最適濃度が約１０～２０ｕＭであることは経験的に決定した。図１２のＡ～Ｋは、１６ｕＭの最終濃度になるまでに添加されたピリドキシンの効果を示す。ピリドキサールの最適濃度が約５～２０ｕＭであることは経験的に決定した。図１３のＡ～Ｋは、１１ｕＭの最終濃度になるまでに添加されたピリドキサールの効果を示す。ピリドキサール－５’－ホスフェートの最適濃度が約１０～４０ｕＭであることは経験的に決定した。図１４のＡ～Ｋは、２０ｕＭの最終濃度になるまでに添加されたピリドキサール－５’－ホスフェートの効果を示す。図１５のＡ～Ｋは、ともに添加された３つのすべてのビタミンＢの効果を示す。
【0115】
実施例３－プロトコルＢ
【0116】
実施例２の結果に基づいて、２０日目頃に添加するビタミンＢ６の種類および濃度を制限し、次に、純度／収量、生着率、または幹細胞由来のドーパミン作動性ニューロンが分泌するドーパミン量を改善する可能性のあるビタミンＡの種類および濃度を検討することができるようにした。
【0117】
プロトコルＢでは、細胞を、Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆されたプレート上の、ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地、ビタミンＡなしのＢ－２７、Ｎ２サプリメント、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭ ＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．７μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ Ｙ２７６３２、中に蒔いた。１日目および３日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、Ｎ２サプリメント、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭ ＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、０．７μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有すると新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。４日目および６日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、Ｎ２サプリメント、２ｍＭＧｌｕｔａｍａｘ、２５０ｎＭ ＬＤＮ１９３１８９、１０．８μＭ ＳＢ４３１５４２、５００ｎｇ／ｍｌのＳＨＨ、７．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有する新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。７日目および９日目に、培地は、ビタミンＡなしのＢ－２７、Ｎ２サプリメント、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、７．５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有している新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。１０日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃４５０－０２）、２００ｎＭ アスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ａ４４０３）、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃４５０－１０）、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１００－３６Ｅ）、５００ｎＭ ｃＡＭＰ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＃１６９８９５０）を含有している新鮮なＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に交換した。１１日目に、細胞を、１５μｇのポリＬ－オルニチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｐ４９５７）／１０μｇのラミニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ ＃Ｌ２０２０）／１μｇのフィブロネクチン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＃３３０１６－０１５）によって被覆されたプレート上の、１０μＭ Ｙ２７６３２を備えた１０日目の培地に再度蒔いた。１２～２０日目に、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭ アスコルビン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３、５００ｎＭ ｃＡＭＰ、１０μＭ ＤＡＰＴ（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ ＃Ｓ２２１５）を含有しているＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に毎日取り換えた。２１～６０日目に、または細胞採取まで、培地を、ビタミンＡなしのＢ－２７、２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ、２０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、２００ｎＭ アスコルビン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ３、５００ｎＭ ｃＡＭＰ、１０μＭ ＤＡＰＴ、プラス１１μＭピリドキサール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｐ１９３０）を含有しているＮｅｕｒｏＢａｓａｌ培地に毎日取り換えた。
【0118】
実施例４－プロトコルＢに様々な形態のビタミンＡを添加する効果を検討する
【0119】
プロトコルＢに従って分化の２０日目に、または２０日目頃、様々な形態のビタミンＡを濃度範囲にわたって添加した。レチノールを、２０日目頃から０．１～１．５ｕＭの濃度範囲で添加した。酢酸レチニルを、２０日目頃から０．１～１．５ｕＭの濃度範囲で添加した。９－シス、１３－シス、および／またはオール－トランス型のレチノイン酸を、個別にまたはともに添加されたとしても、最終濃度が約１．５～２．０ｕＭになるまで添加した。結果は図１８～図２３として示される。経験的に、ドーパミン作動性ニューロンの分化に最適な条件は、２０日目以降にレチノールと酢酸レチニルをともに組合せの最終濃度２ｕＭ程度まで添加することであると決定した。
【0120】
実施例５－プロトコルＢに、ビタミンＣを追加するまたは追加することなく、脂質に富んだ製剤中に可溶化された様々な形態のビタミンＡを添加する効果を検討する
【0121】
ビタミンＡは極めて不溶性であることが知られている。したがって、脂質に富んだ製剤中に可溶化された後、ビタミンＡの様々な形態を添加することを試験した。ビタミンＡを、２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、またはヒト血清アルブミンに置換され得るＡｌｂｕｍａｘ中に可溶化することを試験した。可溶化されたビタミンＡの様々な形態を添加することに加えて、２－ホスホ－アスコルビン酸またはＬ－アスコルビン酸の形態のビタミンＣをさらに添加することを試験した。これらの試験の結果は、図２４～図２７に示される。
【0122】
実施例６－プロトコルＣ
【0123】
プロトコルＣでは、その１１日目に、分化する細胞が再度蒔かれる表面が１ｕｇ／ｍＬの代わりに１０ｕｇ／ｍＬのラミニンを含むという例外を除いて、プロトコルＡに２０日目＋／－３日までに従った。プロトコルＣに応じて、２０日目頃、培地を、１６ｕＭでのピリドキシン、１１ｕＭでのピリドキサール、２０ｕＭでのピリドキサール－５’－ホスフェートのいずれかの形態、またはそれらすべてを合わせたビタミンＢ６、およびレチノール０．７～１．２ｕＭと酢酸レチニル０．１７～０．６ｕＭ、またはそれぞれが０．４４６ｕＭでの９－シスレチノイン酸と１３－シスレチノイン酸とオールトランス型レチノイン酸、あるいはオールトランス型レチノイン酸１．３３ｕＭの形態のビタミンＡ、および２－ホスホ－アスコルビン酸６１ｕＭとＬ－アスコルビン酸１１０ｕＭの形態のビタミンＣで補足した。
【0124】
実施例７―プロトコルＣ．２
【0125】
プロトコルＣ．２では、その１１日目に、分化する細胞が再度蒔かれる表面が１ｕｇ／ｍＬの代わりに１０ｕｇ／ｍＬのラミニンを含むという例外を除いて、プロトコルＡに２０日目＋／－３日までに従った。プロトコルＣ．２に従って、２０日目頃に、神経基礎となる培地を、ピリドキサールを含有することなく、代わりにピリドキシンの形態のビタミンＢ６を１６ｕＭ、レチノール１．２ｕＭおよび酢酸レチニル０．１７ｕＭの形態のビタミンＡを含有するものに交換する。
【0126】
実施例８－プロトコルＤ
【0127】
プロトコルＤでは、その１１日目に、分化する細胞が再度蒔かれる表面が１ｕｇ／ｍＬの代わりに１０ｕｇ／ｍＬのラミニンを含むという例外を除いて、プロトコルＡに２０日目＋／－３日までに従った。プロトコルＤに応じて、２０日目頃から続けて、培地を、１１ｕＭでのピリドキサール、１．２ｕＭでのレチノールならびに０．１７ｕＭでの酢酸レチニル、および６１ｕＭでの２－ホスホ－アスコルビン酸ならびに１１ｕＭでのＬ－アスコルビン酸の形態のビタミンＣで補足した。プロトコルＣ．２に従ってドーパミン作動性ニューロンに分化された幹細胞の定量化に関しては、図３～図１０を参照する。
【0128】
当業者は、本明細書に特定に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、または日常的な実験以上のことを用いずに、上記同等物を確認することができるであろう。そのような同等物は、請求項の範囲に包含されることが意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13-1】
【図13-2】
【図14-1】
【図14-2】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【図21-1】
【図21-2】
【図22-1】
【図22-2】
【図23】
【図24-1】
【図24-2】
【図25-1】
【図25-2】
【図26-1】
【図26-2】
【図27-1】
【図27-2】
【国際調査報告】